JPH09121862A - ヒトｂ型肝炎ウイルスｄｎａ - Google Patents
ヒトｂ型肝炎ウイルスｄｎａInfo
- Publication number
- JPH09121862A JPH09121862A JP7285699A JP28569995A JPH09121862A JP H09121862 A JPH09121862 A JP H09121862A JP 7285699 A JP7285699 A JP 7285699A JP 28569995 A JP28569995 A JP 28569995A JP H09121862 A JPH09121862 A JP H09121862A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- region
- hbv
- seq
- mutation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトＢ型肝炎ウイルスゲノムのＰｒｅ−Ｃ領
域における変異のジェノタイピングと各ジェノタイプの
定量を同時に行い得る方法及びそのためのプライマー、
スタンダードＤＮＡ断片を提供する。 【解決手段】 例えば，配列番号：１及び：２で示され
る，ヒトＢ型肝炎ウイルスＤＮＡの１７０１−１７９４
領域を選択的に増幅するように設定したＰＣＲプライマ
ー対，及び例えば，配列番号：３〜：８で示される，ヒ
トＢ型肝炎ウイルスＤＮＡの１７０１−１７９４領域か
らなる各ＤＮＡ断片（スタンダード）。
域における変異のジェノタイピングと各ジェノタイプの
定量を同時に行い得る方法及びそのためのプライマー、
スタンダードＤＮＡ断片を提供する。 【解決手段】 例えば，配列番号：１及び：２で示され
る，ヒトＢ型肝炎ウイルスＤＮＡの１７０１−１７９４
領域を選択的に増幅するように設定したＰＣＲプライマ
ー対，及び例えば，配列番号：３〜：８で示される，ヒ
トＢ型肝炎ウイルスＤＮＡの１７０１−１７９４領域か
らなる各ＤＮＡ断片（スタンダード）。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はヒトＢ型肝炎ウイル
ス（ＨＢＶ）の検査方法，更に詳しくはＨＢＶのプレコ
ア（Ｐｒｅ−Ｃ）領域のジェノタイピングと定量を同時
に行う方法及びそのためのＤＮＡ試薬に関する。
ス（ＨＢＶ）の検査方法，更に詳しくはＨＢＶのプレコ
ア（Ｐｒｅ−Ｃ）領域のジェノタイピングと定量を同時
に行う方法及びそのためのＤＮＡ試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】１９７６年に，グリーンバーグらが初め
てＢ型慢性肝炎に対して，インターフェロン（ＩＦＮ）
による治療を報告〔Greenberg, H.B., N. Engl. J. Me
d., 295, 517-522(1975)〕して以来，ＨＢｅ抗原陽性の
Ｂ型慢性活動性肝炎に対するＩＦＮの有効性について多
数の報告がなされ，一定の評価がなされている。一般
に，Ｂ型慢性肝炎の経過においては，ＨＢｅ抗原陽性期
にはＨＢＶの増殖が活発で，血中のＨＢＶ ＤＮＡ，Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性が高値を示し，組織学的には活動
性の肝炎を示し，肝病変の進展を認める場合が多い。一
方，ＨＢｅ抗原が消失し，ＨＢｅ抗体が出現する（セロ
コンバージョン）と，ＨＢＶの増殖は低下し，肝病変の
悪化も鎮静化する。この事実より，ＨＢｅ抗原陽性，Ｈ
ＢＶ ＤＮＡ，ＤＮＡポリメラーゼ陽性の慢性活動性肝
炎に対し，ＨＢｅ抗原の消失，ＨＢｅ抗体へのセロコン
バージョンを期待して，ＩＦＮによる治療が施行されて
いる。
てＢ型慢性肝炎に対して，インターフェロン（ＩＦＮ）
による治療を報告〔Greenberg, H.B., N. Engl. J. Me
d., 295, 517-522(1975)〕して以来，ＨＢｅ抗原陽性の
Ｂ型慢性活動性肝炎に対するＩＦＮの有効性について多
数の報告がなされ，一定の評価がなされている。一般
に，Ｂ型慢性肝炎の経過においては，ＨＢｅ抗原陽性期
にはＨＢＶの増殖が活発で，血中のＨＢＶ ＤＮＡ，Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性が高値を示し，組織学的には活動
性の肝炎を示し，肝病変の進展を認める場合が多い。一
方，ＨＢｅ抗原が消失し，ＨＢｅ抗体が出現する（セロ
コンバージョン）と，ＨＢＶの増殖は低下し，肝病変の
悪化も鎮静化する。この事実より，ＨＢｅ抗原陽性，Ｈ
ＢＶ ＤＮＡ，ＤＮＡポリメラーゼ陽性の慢性活動性肝
炎に対し，ＨＢｅ抗原の消失，ＨＢｅ抗体へのセロコン
バージョンを期待して，ＩＦＮによる治療が施行されて
いる。
【０００３】しかしながら，ＨＢｅ抗原陰性，あるいは
ＨＢｅ抗体陽性にもかかわらず，血中ＨＢＶ ＤＮＡ，
ＤＮＡポリメラーゼが高値を示し，進行が早く，予後が
悪いＢ型慢性肝炎が存在する。この肝炎時に検出される
ＨＢＶのＤＮＡは，ＨＢｅ抗原の血中分泌に関与するＰ
ｒｅ−Ｃ（プレコア）領域の８３番目のＧがＡに変異し
ており，従って該ＨＢＶは，ＨＢｅ抗原が産生されない
ウイルスとなっている〔Carman W.J., et al., Lancet,
ii, 588-591(1989)〕。
ＨＢｅ抗体陽性にもかかわらず，血中ＨＢＶ ＤＮＡ，
ＤＮＡポリメラーゼが高値を示し，進行が早く，予後が
悪いＢ型慢性肝炎が存在する。この肝炎時に検出される
ＨＢＶのＤＮＡは，ＨＢｅ抗原の血中分泌に関与するＰ
ｒｅ−Ｃ（プレコア）領域の８３番目のＧがＡに変異し
ており，従って該ＨＢＶは，ＨＢｅ抗原が産生されない
ウイルスとなっている〔Carman W.J., et al., Lancet,
ii, 588-591(1989)〕。
【０００４】このようなＰｒｅ−Ｃ変異株が存在した場
合，ＨＢｅ抗体，抗原の測定ではセロコンバージョンを
起こし肝病変の悪化が終息に向かうであろうと判断され
てしまう。このことから，Ｂ型慢性肝炎のＩＮＦ治療に
於て，上記領域の各種の変異を検出し，定量すること
は，治療のスケジュールを発展させていく上で，あるい
は治療後の予後を推測する上で重要な指標となると考え
られる。
合，ＨＢｅ抗体，抗原の測定ではセロコンバージョンを
起こし肝病変の悪化が終息に向かうであろうと判断され
てしまう。このことから，Ｂ型慢性肝炎のＩＮＦ治療に
於て，上記領域の各種の変異を検出し，定量すること
は，治療のスケジュールを発展させていく上で，あるい
は治療後の予後を推測する上で重要な指標となると考え
られる。
【０００５】しかして，現在，ＨＢＶのＰｒｅ−Ｃ領域
における変異を検出・定量する方法としては，Ｐｒｅ−
Ｃ領域の８３番目の変異と同じ配列を持つプライマーを
用いたＭＳＳＡ法により競合的に定量する方法が知られ
ている〔Kinoshita, M., etal., ＣＣＡ, 228, 83-90(1
994)〕。
における変異を検出・定量する方法としては，Ｐｒｅ−
Ｃ領域の８３番目の変異と同じ配列を持つプライマーを
用いたＭＳＳＡ法により競合的に定量する方法が知られ
ている〔Kinoshita, M., etal., ＣＣＡ, 228, 83-90(1
994)〕。
【０００６】しかしながら上記方法には以下の点で問題
がある。
がある。
【０００７】（１）１０1コピーから１０8コピーまでの
８種類の標準物質と競合的に反応させるため，１検体に
つき８回の測定が必要となり，多数の試料の測定を行う
には操作が繁雑である。
８種類の標準物質と競合的に反応させるため，１検体に
つき８回の測定が必要となり，多数の試料の測定を行う
には操作が繁雑である。
【０００８】（２）Ｐｒｅ−Ｃ領域の８３番目の変異株
に限定された定量であり，正常株やその他の変異株を同
時に測定することは不可能である。
に限定された定量であり，正常株やその他の変異株を同
時に測定することは不可能である。
【０００９】一方，ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリア
クション）−ＳＳＣＰ（Single strand conformation p
olymorphism：単鎖高次構造多型分析法）解析は，１本
鎖ＤＮＡの高次構造の変化に伴う移動度の変化を利用し
た突然変異検出法として知られている〔例えば，Orita
M., et al., Genomics, 5, 874-879(1989)等〕が，この
ＳＳＣＰ解析においては，理想的には被検ＤＮＡはそれ
ぞれに固有な１種類だけの立体構造をとり，その結果１
本の泳動バンドとなることが好ましいが，実際にはいく
つかの準安定構造（metastable structure）をとり，数
本の泳動バンドが観察されることも知られており，これ
がその利用において制限となっている〔分析化学，43,
731-743(1994)〕。
クション）−ＳＳＣＰ（Single strand conformation p
olymorphism：単鎖高次構造多型分析法）解析は，１本
鎖ＤＮＡの高次構造の変化に伴う移動度の変化を利用し
た突然変異検出法として知られている〔例えば，Orita
M., et al., Genomics, 5, 874-879(1989)等〕が，この
ＳＳＣＰ解析においては，理想的には被検ＤＮＡはそれ
ぞれに固有な１種類だけの立体構造をとり，その結果１
本の泳動バンドとなることが好ましいが，実際にはいく
つかの準安定構造（metastable structure）をとり，数
本の泳動バンドが観察されることも知られており，これ
がその利用において制限となっている〔分析化学，43,
731-743(1994)〕。
【００１０】また，上記ＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析を利用す
るＨＢＶ Ｐｒｅ−Ｃ領域の変異株の定性乃至同定は，
現在もなお報告されておらず，勿論かかる変異の検出と
同時に変異株を定量する方法は知られていない。
るＨＢＶ Ｐｒｅ−Ｃ領域の変異株の定性乃至同定は，
現在もなお報告されておらず，勿論かかる変異の検出と
同時に変異株を定量する方法は知られていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】従って，本発明の目的
は，ＨＢＶ Ｐｒｅ−Ｃ領域における変異株及び正常株
について，１回の反応により，ジェノタイピングとタイ
ピングされたそれぞれの株の定量を同時に行うためのＤ
ＮＡ試薬及びその方法を提供することにある。
は，ＨＢＶ Ｐｒｅ−Ｃ領域における変異株及び正常株
について，１回の反応により，ジェノタイピングとタイ
ピングされたそれぞれの株の定量を同時に行うためのＤ
ＮＡ試薬及びその方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは，ＰＣＲ−
ＳＳＣＰ解析を利用するＨＢＶ Ｐｒｅ−Ｃ領域の変異
株の測定につき，上記目的より鋭意研究の結果，測定対
象であるＨＢＶ Ｐｒｅ−Ｃ領域の変異株の全ての変異
部位を包含する特定の領域であり，また該変異を有する
ＤＮＡ及び正常株のＤＮＡのそれぞれに固有な１種類だ
けの立体構造をとり得，その結果ＳＳＣＰ解析において
１本の泳動バンドを与える領域であり，更にそれらＤＮ
ＡがＳＳＣＰ解析において区別されるに十分な移動度の
差異を与える特有の領域を見出し，かくして下記要旨の
本発明に到達した。
ＳＳＣＰ解析を利用するＨＢＶ Ｐｒｅ−Ｃ領域の変異
株の測定につき，上記目的より鋭意研究の結果，測定対
象であるＨＢＶ Ｐｒｅ−Ｃ領域の変異株の全ての変異
部位を包含する特定の領域であり，また該変異を有する
ＤＮＡ及び正常株のＤＮＡのそれぞれに固有な１種類だ
けの立体構造をとり得，その結果ＳＳＣＰ解析において
１本の泳動バンドを与える領域であり，更にそれらＤＮ
ＡがＳＳＣＰ解析において区別されるに十分な移動度の
差異を与える特有の領域を見出し，かくして下記要旨の
本発明に到達した。
【００１３】即ち，本発明は，ＨＢＶ ＤＮＡの１７０
１−１７９４領域からなるＤＮＡ断片を提供するもので
ある。 また，上記ＨＢＶが野生株又はＰｒｅ−Ｃ領域
の３８番目のＧがＡに置換した変異，同４２番目のＴが
Ｃに置換した変異，同８０番目のＴがＣに置換した変
異，同８３番目のＧがＡに置換した変異及び同８６番目
のＧがＡに置換した変異から選択される少なくともひと
つの変異を有する変異株であるものである上記ＤＮＡ断
片を提供するものである。更に，配列番号：３，：
４，：５，：６，：７及び：８から選択される配列で示
されるかかるＤＮＡ断片を提供するものである。
１−１７９４領域からなるＤＮＡ断片を提供するもので
ある。 また，上記ＨＢＶが野生株又はＰｒｅ−Ｃ領域
の３８番目のＧがＡに置換した変異，同４２番目のＴが
Ｃに置換した変異，同８０番目のＴがＣに置換した変
異，同８３番目のＧがＡに置換した変異及び同８６番目
のＧがＡに置換した変異から選択される少なくともひと
つの変異を有する変異株であるものである上記ＤＮＡ断
片を提供するものである。更に，配列番号：３，：
４，：５，：６，：７及び：８から選択される配列で示
されるかかるＤＮＡ断片を提供するものである。
【００１４】また本発明は，ＨＢＶ ＤＮＡの１７０１
−１７９４領域を選択的に増幅するように設定したこと
を特徴とするＰＣＲプライマー対，好ましくは，配列番
号：１又は：２で示されるプライマー対をも提供するも
のである。
−１７９４領域を選択的に増幅するように設定したこと
を特徴とするＰＣＲプライマー対，好ましくは，配列番
号：１又は：２で示されるプライマー対をも提供するも
のである。
【００１５】更に本発明は，かかるプライマー対を利用
し，またかかるＤＮＡ断片をスタンダードとして利用し
た，ＨＢＶの検査方法をも提供するものである。
し，またかかるＤＮＡ断片をスタンダードとして利用し
た，ＨＢＶの検査方法をも提供するものである。
【００１６】尚，上記Ｐｒｅ−Ｃ領域の３８番目のＧが
Ａに置換した変異，４２番目のＴがＣに置換した変異，
８０番目のＴがＣに置換した変異及び８６番目のＧがＡ
に置換した変異は，本発明によって提供される新規な変
異株と考えられる。
Ａに置換した変異，４２番目のＴがＣに置換した変異，
８０番目のＴがＣに置換した変異及び８６番目のＧがＡ
に置換した変異は，本発明によって提供される新規な変
異株と考えられる。
【００１７】本明細書に於て，アミノ酸，ペプチド，塩
基配列，核酸，制限酵素，その他に関する略号はＩＵＰ
ＵＣ及びＩＵＰＵＣ−ＩＵＢによる命名法乃至規定及び
「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のた
めのガイドライン」（平成２年１１月，特許庁調整課審
査基準室）に従うものとする。
基配列，核酸，制限酵素，その他に関する略号はＩＵＰ
ＵＣ及びＩＵＰＵＣ−ＩＵＢによる命名法乃至規定及び
「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のた
めのガイドライン」（平成２年１１月，特許庁調整課審
査基準室）に従うものとする。
【００１８】また，本明細書において，ＨＢＶの核酸配
列番号は公知の核酸配列のそれに従う〔Gene, 30, 227-
232(1984)参照〕。
列番号は公知の核酸配列のそれに従う〔Gene, 30, 227-
232(1984)参照〕。
【００１９】
【発明の実施の態様】本発明のプライマー対は，ＨＢＶ
ＤＮＡの１７０１−１７９４領域を選択的に増幅する
ように設定されていることにより特徴付けられる。かか
るプライマーの設定は，上記増幅領域を与える限りにお
いて，常法に従い行うことができる。
ＤＮＡの１７０１−１７９４領域を選択的に増幅する
ように設定されていることにより特徴付けられる。かか
るプライマーの設定は，上記増幅領域を与える限りにお
いて，常法に従い行うことができる。
【００２０】かかるプライマー設定の好適な例は，後述
の実施例において示される配列番号：１及び：２で示さ
れるプライマー対である。
の実施例において示される配列番号：１及び：２で示さ
れるプライマー対である。
【００２１】配列番号：１で示される本発明プライマー
（オリゴＤＮＡ）は，本発明にかかる上記特定領域の増
幅を可能とする，ＨＢＶ ＤＮＡのＰｒｅ−Ｃ領域のプ
ラス鎖の配列を有している。
（オリゴＤＮＡ）は，本発明にかかる上記特定領域の増
幅を可能とする，ＨＢＶ ＤＮＡのＰｒｅ−Ｃ領域のプ
ラス鎖の配列を有している。
【００２２】配列番号：２で示される本発明プライマー
（オリゴＤＮＡ）は，同じく該領域のマイナス鎖の配列
を有している。
（オリゴＤＮＡ）は，同じく該領域のマイナス鎖の配列
を有している。
【００２３】これらは，本発明におけるプライマー対と
して良好に利用でき，一般的なホスホアミダイド法等の
化学合成法等により製造できる。尚，このような化学合
成法に加えて，本発明において利用され得る各種の操
作，例えば，ＤＮＡの切断，削除，付加乃至結合を目的
とする酵素処理，ＤＮＡの単離，精製，複製，選択等は
いずれも常法に従うことができる〔分子遺伝学実験法，
共立出版（株）１９８３年発行；ＰＣＲテクノロジー，
宝酒造（株）１９９０年発行等〕。
して良好に利用でき，一般的なホスホアミダイド法等の
化学合成法等により製造できる。尚，このような化学合
成法に加えて，本発明において利用され得る各種の操
作，例えば，ＤＮＡの切断，削除，付加乃至結合を目的
とする酵素処理，ＤＮＡの単離，精製，複製，選択等は
いずれも常法に従うことができる〔分子遺伝学実験法，
共立出版（株）１９８３年発行；ＰＣＲテクノロジー，
宝酒造（株）１９９０年発行等〕。
【００２４】例えばＤＮＡの単離精製は，アガロースゲ
ル電気泳動法等に従い得，ＤＮＡ配列の決定は，例えば
ジデオキシ法〔Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson,
A.R., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 5463-54
67 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Maxam, A. M.
and Gilbert, W., Method in Enzymology, 65, 499-560
(1980)〕等に従い得る。上記ＤＮＡ塩基配列の決定
は，市販のシークエンスキット等を用いることによって
も容易に行ない得る。これら各種の基本的操作は，例え
ば本明細書に引用の各種文献においても採用されてお
り，後述の実施例と共に，之等文献が参照される。
ル電気泳動法等に従い得，ＤＮＡ配列の決定は，例えば
ジデオキシ法〔Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson,
A.R., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 5463-54
67 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Maxam, A. M.
and Gilbert, W., Method in Enzymology, 65, 499-560
(1980)〕等に従い得る。上記ＤＮＡ塩基配列の決定
は，市販のシークエンスキット等を用いることによって
も容易に行ない得る。これら各種の基本的操作は，例え
ば本明細書に引用の各種文献においても採用されてお
り，後述の実施例と共に，之等文献が参照される。
【００２５】本発明によって提供されるＨＢＶ ＤＮＡ
の１７０１−１７９４領域からなるＤＮＡ断片は，ＰＣ
Ｒ−ＳＳＣＰ解析を利用するＨＢＶ Ｐｒｅ−Ｃ領域の
変異株の測定において，測定対象であるＨＢＶ Ｐｒｅ
−Ｃ領域の変異株の全ての変異部位を包含する特定の領
域であって，該変異を有するＤＮＡ及び正常株のＤＮＡ
のそれぞれに固有な１種類だけの立体構造をとり得，そ
の結果ＳＳＣＰ解析において１本の泳動バンドを与える
領域であり，しかもそれらＤＮＡがＳＳＣＰ解析におい
て区別されるに十分な移動度の差異を与える特有の領域
である。
の１７０１−１７９４領域からなるＤＮＡ断片は，ＰＣ
Ｒ−ＳＳＣＰ解析を利用するＨＢＶ Ｐｒｅ−Ｃ領域の
変異株の測定において，測定対象であるＨＢＶ Ｐｒｅ
−Ｃ領域の変異株の全ての変異部位を包含する特定の領
域であって，該変異を有するＤＮＡ及び正常株のＤＮＡ
のそれぞれに固有な１種類だけの立体構造をとり得，そ
の結果ＳＳＣＰ解析において１本の泳動バンドを与える
領域であり，しかもそれらＤＮＡがＳＳＣＰ解析におい
て区別されるに十分な移動度の差異を与える特有の領域
である。
【００２６】かかる本発明ＤＮＡ断片は，ＨＢＶ野生株
又はＰｒｅ−Ｃ領域の３８番目のＧがＡに置換した変
異，同４２番目のＴがＣに置換した変異，同８０番目の
ＴがＣに置換した変異，同８３番目のＧがＡに置換した
変異及び同８６番目のＧがＡに置換した変異から選択さ
れる少なくともひとつの変異を有する同変異株における
同領域からなるものであり，より好ましくは該断片とし
て以下に挙げる配列番号：３，：４，：５，：６，：７
及び：８に示される配列のものを挙げることができる。
又はＰｒｅ−Ｃ領域の３８番目のＧがＡに置換した変
異，同４２番目のＴがＣに置換した変異，同８０番目の
ＴがＣに置換した変異，同８３番目のＧがＡに置換した
変異及び同８６番目のＧがＡに置換した変異から選択さ
れる少なくともひとつの変異を有する同変異株における
同領域からなるものであり，より好ましくは該断片とし
て以下に挙げる配列番号：３，：４，：５，：６，：７
及び：８に示される配列のものを挙げることができる。
【００２７】配列番号：３で示される本発明ＤＮＡ断片
は，ＨＢＶ Ｐｒｅ−Ｃ領域の配列において，８３番目
のＧがＡに及び４２番目のＴがＣに変異していることを
特徴とする。
は，ＨＢＶ Ｐｒｅ−Ｃ領域の配列において，８３番目
のＧがＡに及び４２番目のＴがＣに変異していることを
特徴とする。
【００２８】配列番号：４で示される本発明ＤＮＡ断片
は，同じくＰｒｅ−Ｃ領域の配列において，８６番目の
ＧがＡに変異していることを特徴とする。
は，同じくＰｒｅ−Ｃ領域の配列において，８６番目の
ＧがＡに変異していることを特徴とする。
【００２９】配列番号：５で示される本発明ＤＮＡ断片
は，同じくＰｒｅ−Ｃ領域の配列において，８３番目の
ＧがＡに変異していることを特徴とする。
は，同じくＰｒｅ−Ｃ領域の配列において，８３番目の
ＧがＡに変異していることを特徴とする。
【００３０】配列番号：６で示される本発明ＤＮＡ断片
は，同じくＰｒｅ−Ｃ領域の野生株の配列を有すること
を特徴とする。
は，同じくＰｒｅ−Ｃ領域の野生株の配列を有すること
を特徴とする。
【００３１】配列番号：７で示される本発明ＤＮＡ断片
は，同じくＰｒｅ−Ｃ領域の配列において，８３番目の
ＧがＡに及び８０番目のＴがＣに変異していることを特
徴とする。
は，同じくＰｒｅ−Ｃ領域の配列において，８３番目の
ＧがＡに及び８０番目のＴがＣに変異していることを特
徴とする。
【００３２】配列番号：８で示される本発明ＤＮＡ断片
は，同じくＰｒｅ−Ｃ領域の配列において，８３番目の
ＧがＡに及び３８番目のＣがＴに変異していることを特
徴とする。
は，同じくＰｒｅ−Ｃ領域の配列において，８３番目の
ＧがＡに及び３８番目のＣがＴに変異していることを特
徴とする。
【００３３】これらのＤＮＡ断片はいずれも，本発明に
かかるＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析を利用するＨＢＶ測定法に
おいて，Ｐｒｅ−Ｃ領域のジェノタイピングと当該ウイ
ルス定量のためのスタンダードとして好適に利用でき
る。
かかるＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析を利用するＨＢＶ測定法に
おいて，Ｐｒｅ−Ｃ領域のジェノタイピングと当該ウイ
ルス定量のためのスタンダードとして好適に利用でき
る。
【００３４】以下，かかる測定法をより詳細に説明す
る。
る。
【００３５】該測定法は，ＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析を利用
するものであり，その手法等はかかる常法に従うことが
できこれを参照することができる。例えば，ＤＮＡの特
定領域の増幅のためのＰＣＲ法としては次の文献が参照
される〔Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F. A.,
Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A. and Arnh
eim, N., Science, 230, 1350-1354 (1985)等〕。ま
た，ＳＳＣＰ解析については次の文献が参照される〔Ma
kino R., et al., Cold Spring Harbor Lab., 2,10-13
(1992)等]。
するものであり，その手法等はかかる常法に従うことが
できこれを参照することができる。例えば，ＤＮＡの特
定領域の増幅のためのＰＣＲ法としては次の文献が参照
される〔Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F. A.,
Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A. and Arnh
eim, N., Science, 230, 1350-1354 (1985)等〕。ま
た，ＳＳＣＰ解析については次の文献が参照される〔Ma
kino R., et al., Cold Spring Harbor Lab., 2,10-13
(1992)等]。
【００３６】かかる測定法は，より具体的には，ＰＣＲ
−ＳＳＣＰ解析に従う一本鎖ＤＮＡの分析法であって，
以下の工程を含むことを特徴とする，被検試料中のＨＢ
Ｖの測定方法である。
−ＳＳＣＰ解析に従う一本鎖ＤＮＡの分析法であって，
以下の工程を含むことを特徴とする，被検試料中のＨＢ
Ｖの測定方法である。
【００３７】(1) 本発明プライマー対を用いる被検試
料中のＨＢＶＤＮＡのＰＣＲ増幅工程，及び(2) 工程
(1)の増幅物のＳＳＣＰ解析工程。
料中のＨＢＶＤＮＡのＰＣＲ増幅工程，及び(2) 工程
(1)の増幅物のＳＳＣＰ解析工程。
【００３８】該測定法においては，既知段階量に設定し
た本発明ＤＮＡ断片をスタンダードとして利用すること
ができる。該スタンダードのＳＳＣＰ解析により測定さ
れた移動度及びピーク領域と，工程(1)の増幅物として
の被検試料における移動度及びピーク領域とを対比する
ことにより，ＨＢＶ ＤＮＡのＰｒｅ−Ｃ領域における
変異の検出（ジェノタイピング）と当該ウイルスのそれ
ぞれの定量を同時に行うことができる。
た本発明ＤＮＡ断片をスタンダードとして利用すること
ができる。該スタンダードのＳＳＣＰ解析により測定さ
れた移動度及びピーク領域と，工程(1)の増幅物として
の被検試料における移動度及びピーク領域とを対比する
ことにより，ＨＢＶ ＤＮＡのＰｒｅ−Ｃ領域における
変異の検出（ジェノタイピング）と当該ウイルスのそれ
ぞれの定量を同時に行うことができる。
【００３９】上記において，測定対象であるＨＢＶ Ｄ
ＮＡを含む被検試料は，該ＤＮＡを含むものであれば特
に限定なく採用でき，例えば，血液，血清，汗，尿，切
除組織等の生体成分材料を例示できる。ＨＢＶ ＤＮＡ
は，これら被検試料より常法に従い抽出，精製乃至調製
することができる。
ＮＡを含む被検試料は，該ＤＮＡを含むものであれば特
に限定なく採用でき，例えば，血液，血清，汗，尿，切
除組織等の生体成分材料を例示できる。ＨＢＶ ＤＮＡ
は，これら被検試料より常法に従い抽出，精製乃至調製
することができる。
【００４０】本発明測定法によれば，被検試料中のＨＢ
Ｖ ＤＮＡは，本発明にかかるプライマー対を用いるＰ
ＣＲ法により，その１７０１−１７９４領域からなる特
定領域が特異的に増幅される。この増幅された特定領域
は，ＨＢＶ Ｐｒｅ−Ｃ領域の３８番，同４２番，同８
０番，同８３番及び同８６番を包含し，これらの位置に
おける変異を含む領域である。そしてこの特定領域から
なる上記増幅物（ＤＮＡ断片）は，それらの位置におけ
る変異を有するか有さないに関らず，いずれも各ＤＮＡ
のそれぞれに固有な１種類だけの立体構造をとり，その
結果，引き続く工程(2)におけるＳＳＣＰ解析において
１本の泳動バンドを与え，またそれらＤＮＡが該解析に
おいて区別されるに十分な移動度の差異を与える。
Ｖ ＤＮＡは，本発明にかかるプライマー対を用いるＰ
ＣＲ法により，その１７０１−１７９４領域からなる特
定領域が特異的に増幅される。この増幅された特定領域
は，ＨＢＶ Ｐｒｅ−Ｃ領域の３８番，同４２番，同８
０番，同８３番及び同８６番を包含し，これらの位置に
おける変異を含む領域である。そしてこの特定領域から
なる上記増幅物（ＤＮＡ断片）は，それらの位置におけ
る変異を有するか有さないに関らず，いずれも各ＤＮＡ
のそれぞれに固有な１種類だけの立体構造をとり，その
結果，引き続く工程(2)におけるＳＳＣＰ解析において
１本の泳動バンドを与え，またそれらＤＮＡが該解析に
おいて区別されるに十分な移動度の差異を与える。
【００４１】従って，本発明にかかる上記スタンダード
としてのＤＮＡ断片について予め測定された移動度と工
程(1)の増幅物としての被検試料における移動度とを対
比することにより，ＨＢＶ ＤＮＡのＰｒｅ−Ｃ領域に
おける変異の検出（ジェノタイピング）を簡便かつ良好
に行うことができる。
としてのＤＮＡ断片について予め測定された移動度と工
程(1)の増幅物としての被検試料における移動度とを対
比することにより，ＨＢＶ ＤＮＡのＰｒｅ−Ｃ領域に
おける変異の検出（ジェノタイピング）を簡便かつ良好
に行うことができる。
【００４２】更に，既知段階量に設定したスタンダード
を用いる場合には，そのピーク領域と工程(1)の増幅物
としての被検試料におけるピーク領域との対比により，
被検試料のウイルスの定量を同時に行うことができる。
を用いる場合には，そのピーク領域と工程(1)の増幅物
としての被検試料におけるピーク領域との対比により，
被検試料のウイルスの定量を同時に行うことができる。
【００４３】従って，本発明は，かかる測定により，被
検試料中のＨＢＶ ＤＮＡのＰｒｅ−Ｃ領域の変異の検
出（ジェノタイピング）とその定量を同時におこなう簡
便な検査方法をも提供するものである。
検試料中のＨＢＶ ＤＮＡのＰｒｅ−Ｃ領域の変異の検
出（ジェノタイピング）とその定量を同時におこなう簡
便な検査方法をも提供するものである。
【００４４】以下，本発明測定法の１実施態様に基き，
これをより詳細に説明するが，該方法において使用され
るプライマー対，スタンダード，ＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析
及びその検出手段等の改変等は，本明細書の開示に基い
て，当業者にとり適宜なし得るものであり，本発明は勿
論それらの改変等をも包含する。
これをより詳細に説明するが，該方法において使用され
るプライマー対，スタンダード，ＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析
及びその検出手段等の改変等は，本明細書の開示に基い
て，当業者にとり適宜なし得るものであり，本発明は勿
論それらの改変等をも包含する。
【００４５】上記本発明測定法の１実施態様において
は，例えば，まずＢ型肝炎患者血清からアルカリ，酸処
理等の常法によってＤＮＡを抽出し，得られたＤＮＡ溶
液に，配列番号：２及び蛍光標識した配列番号：１のプ
ライマー対と，熱耐性ＤＮＡポリメラーゼとを作用させ
て，標識されたＤＮＡ断片を増幅させる。
は，例えば，まずＢ型肝炎患者血清からアルカリ，酸処
理等の常法によってＤＮＡを抽出し，得られたＤＮＡ溶
液に，配列番号：２及び蛍光標識した配列番号：１のプ
ライマー対と，熱耐性ＤＮＡポリメラーゼとを作用させ
て，標識されたＤＮＡ断片を増幅させる。
【００４６】一方，配列番号：３，：４，：５，：
６，：７及び：８のＤＮＡ断片を，プラスミドベクター
にそれぞれ組み込み，大腸菌に形質転換して大量培養
後，精製した組換え体プラスミドを用いて，例えば１０
3コピー，１０4コピー，１０5コピー，１０6コピー，１
０7コピー及び１０8コピーのスタンダードを調製し，こ
れに配列番号：２及び蛍光標識した配列番号：１のプラ
イマー対と熱耐性ＤＮＡポリメラーゼとを作用させて，
標識されたＤＮＡ断片を増幅させる。
６，：７及び：８のＤＮＡ断片を，プラスミドベクター
にそれぞれ組み込み，大腸菌に形質転換して大量培養
後，精製した組換え体プラスミドを用いて，例えば１０
3コピー，１０4コピー，１０5コピー，１０6コピー，１
０7コピー及び１０8コピーのスタンダードを調製し，こ
れに配列番号：２及び蛍光標識した配列番号：１のプラ
イマー対と熱耐性ＤＮＡポリメラーゼとを作用させて，
標識されたＤＮＡ断片を増幅させる。
【００４７】上記で増幅されたＤＮＡ溶液を，９５℃程
度で５分程度加熱し，直ちに氷中で冷却し，自動シーク
エンサーによるＳＳＣＰ解析を行うことにより，蛍光ピ
ークを検出できる。尚，該ＳＳＣＰ解析における泳動
は，好ましくは約３０±１℃にて行われる。
度で５分程度加熱し，直ちに氷中で冷却し，自動シーク
エンサーによるＳＳＣＰ解析を行うことにより，蛍光ピ
ークを検出できる。尚，該ＳＳＣＰ解析における泳動
は，好ましくは約３０±１℃にて行われる。
【００４８】かくして，患者血清より得られたＤＮＡの
ピーク（移動度）をスタンダードのピーク（移動度）と
比較し，その泳動時間からスタンダードと一致するピー
クを確認することにより，患者のＨＢＶのジェノタイピ
ングを行うことができる。また，スタンダードのピーク
領域を算出し，これより標準曲線を作成することによ
り，患者ＤＮＡにおけるピーク領域の計算値より，当該
ＨＢＶ ＤＮＡの定量を行うことができる。
ピーク（移動度）をスタンダードのピーク（移動度）と
比較し，その泳動時間からスタンダードと一致するピー
クを確認することにより，患者のＨＢＶのジェノタイピ
ングを行うことができる。また，スタンダードのピーク
領域を算出し，これより標準曲線を作成することによ
り，患者ＤＮＡにおけるピーク領域の計算値より，当該
ＨＢＶ ＤＮＡの定量を行うことができる。
【００４９】
【発明の効果】本発明によれば，ＨＢＶ ＤＮＡのＰｒ
ｅ−Ｃ領域をＰＣＲ法で増幅できるプライマー対であっ
て，その増幅物がＳＳＣＰ解析により１本のピークとし
て検出できることにより特徴付けられる，特定のプライ
マー対が提供される。また本発明によれば，ＨＢＶ野生
株及び同変異株についてのスタンダードとして有用な上
記増幅物と同一の領域からなるＤＮＡ断片が提供され
る。これらのプライマー対とスタンダードとを組み合わ
せて利用することにより，一段階のＰＣＲを行うのみ
で，ＨＢＶ ＤＮＡのＰｒｅ−Ｃ領域のジェノタイピン
グと該ウイルスＤＮＡの定量を同時に行うことができ
る。
ｅ−Ｃ領域をＰＣＲ法で増幅できるプライマー対であっ
て，その増幅物がＳＳＣＰ解析により１本のピークとし
て検出できることにより特徴付けられる，特定のプライ
マー対が提供される。また本発明によれば，ＨＢＶ野生
株及び同変異株についてのスタンダードとして有用な上
記増幅物と同一の領域からなるＤＮＡ断片が提供され
る。これらのプライマー対とスタンダードとを組み合わ
せて利用することにより，一段階のＰＣＲを行うのみ
で，ＨＢＶ ＤＮＡのＰｒｅ−Ｃ領域のジェノタイピン
グと該ウイルスＤＮＡの定量を同時に行うことができ
る。
【００５０】
【実施例】以下，本発明を更に詳しく説明するため実施
例を挙げるが，本発明はこれらの実施例に限るものでは
ない。
例を挙げるが，本発明はこれらの実施例に限るものでは
ない。
【００５１】
【実施例１】 １−１．プライマーの調製 本例に用いた２種類のプライマーは，ＨＢＶ Ｅ−１と
ＨＢＶ Ｅ−２である。ＨＢＶ Ｅ−１は配列番号：１
の配列に従い化学合成したオリゴＤＮＡであり，ＨＢＶ
Ｅ−２は配列番号：２の配列に従い化学合成したオリ
ゴＤＮＡである。
ＨＢＶ Ｅ−２である。ＨＢＶ Ｅ−１は配列番号：１
の配列に従い化学合成したオリゴＤＮＡであり，ＨＢＶ
Ｅ−２は配列番号：２の配列に従い化学合成したオリ
ゴＤＮＡである。
【００５２】上記各プライマーは，いずれもＤＮＡ合成
装置（ファルマシア社：PharmaciaLKB Gene Assembler
Plus）にて合成した。
装置（ファルマシア社：PharmaciaLKB Gene Assembler
Plus）にて合成した。
【００５３】１−２．スタンダードの調製 スタンダードとしてのＤＮＡ断片は，後述の方法に従
い，慢性Ｂ型患者血清より得たＤＮＡの配列解析により
変異株を確認し，配列番号：３，：４，：５，：６，：
７及び：８の各配列を有するＤＮＡ断片よりＰＣＲによ
り増幅して調製した。これらスタンダードとしての増幅
されたＤＮＡ断片は，配列番号：３，：４，：５，：
６，：７及び：８の各配列を有している。
い，慢性Ｂ型患者血清より得たＤＮＡの配列解析により
変異株を確認し，配列番号：３，：４，：５，：６，：
７及び：８の各配列を有するＤＮＡ断片よりＰＣＲによ
り増幅して調製した。これらスタンダードとしての増幅
されたＤＮＡ断片は，配列番号：３，：４，：５，：
６，：７及び：８の各配列を有している。
【００５４】上記各ＤＮＡ断片をプラスミドベクター
（PT7 Blue T-Vector：宝酒造）に組み込み，大腸菌に
形質転換して大量培養後，精製した組換え体プラスミド
を用いて，配列番号：３のＤＮＡ断片を１０3コピー／
μｌ，配列番号：４のＤＮＡ断片を１０4コピー／μ
ｌ，配列番号：５のＤＮＡ断片を１０5コピー／μｌ，
配列番号：６のＤＮＡ断片を１０6コピー／μｌ，配列
番号：７のＤＮＡ断片を１０7コピー／μｌ及び配列番
号：８のＤＮＡ断片を１０8コピー／μｌとなるよう
に，２００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む滅菌
水により調製した。
（PT7 Blue T-Vector：宝酒造）に組み込み，大腸菌に
形質転換して大量培養後，精製した組換え体プラスミド
を用いて，配列番号：３のＤＮＡ断片を１０3コピー／
μｌ，配列番号：４のＤＮＡ断片を１０4コピー／μ
ｌ，配列番号：５のＤＮＡ断片を１０5コピー／μｌ，
配列番号：６のＤＮＡ断片を１０6コピー／μｌ，配列
番号：７のＤＮＡ断片を１０7コピー／μｌ及び配列番
号：８のＤＮＡ断片を１０8コピー／μｌとなるよう
に，２００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む滅菌
水により調製した。
【００５５】１−３．Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡの抽出 慢性Ｂ型肝炎患者の血液より血清を分離し，その１０μ
ｌをチューブに取り，０．２Ｎ ＮａＯＨを１０μｌ加
え，激しく５分撹拌後，３７℃で２０分間静置してＤＮ
Ａを抽出した。次いで，このＤＮＡ溶液に０．２Ｎ Ｈ
Ｃｌを１０μｌ加えて中和した後，ＰＣＲに用いた。
ｌをチューブに取り，０．２Ｎ ＮａＯＨを１０μｌ加
え，激しく５分撹拌後，３７℃で２０分間静置してＤＮ
Ａを抽出した。次いで，このＤＮＡ溶液に０．２Ｎ Ｈ
Ｃｌを１０μｌ加えて中和した後，ＰＣＲに用いた。
【００５６】１−４．ＰＣＲ 前記１−２で調製した各スタンダード溶液１μｌ及び前
記１−３で調製した患者血清からのＤＮＡ溶液５μｌ
を，それぞれ新しいチューブにとり，これにＦＩＴＣ標
識（ファルマシア社）したＨＢＶ Ｅ−１溶液（１０μ
Ｍ ＦＩＴＣ標識ＨＢＶ Ｅ−１を含む滅菌蒸留水）及
びＨＢＶ Ｅ−２溶液（１０μＭ ＨＢＶＥ−２を含む
滅菌蒸留水）を各５μｌ加え，更にＰＣＲ酵素溶液３０
μｌを添加し，滅菌蒸留水により全量を５０μｌとした
後，ミネラルオイルを添加して，ＰＣＲ反応装置（スト
ラタジーン社製）を用いて，９４℃で１分間，５８℃で
１．５分間，７２℃で１．５分間のサイクルを３０サイ
クル行って反応させた。
記１−３で調製した患者血清からのＤＮＡ溶液５μｌ
を，それぞれ新しいチューブにとり，これにＦＩＴＣ標
識（ファルマシア社）したＨＢＶ Ｅ−１溶液（１０μ
Ｍ ＦＩＴＣ標識ＨＢＶ Ｅ−１を含む滅菌蒸留水）及
びＨＢＶ Ｅ−２溶液（１０μＭ ＨＢＶＥ−２を含む
滅菌蒸留水）を各５μｌ加え，更にＰＣＲ酵素溶液３０
μｌを添加し，滅菌蒸留水により全量を５０μｌとした
後，ミネラルオイルを添加して，ＰＣＲ反応装置（スト
ラタジーン社製）を用いて，９４℃で１分間，５８℃で
１．５分間，７２℃で１．５分間のサイクルを３０サイ
クル行って反応させた。
【００５７】１−５．ＳＳＣＰ解析によるジェノタイピ
ングと定量 前記１−４で増幅したＰＣＲ反応液１μｌを新しいチュ
ーブに移し，これに停止変性溶液（８０％脱イオン化ホ
ルムアミド，０．０１％ブルーデキストラン）１０μｌ
を加えて，９５℃で３分間加熱し，直ちに氷中で冷却
後，ＡＬＦ自動シークエンサー（ファルマシア社製）を
用いた５％グリセロールを含む７％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により，ＳＳＣＰ解析を行った。
ングと定量 前記１−４で増幅したＰＣＲ反応液１μｌを新しいチュ
ーブに移し，これに停止変性溶液（８０％脱イオン化ホ
ルムアミド，０．０１％ブルーデキストラン）１０μｌ
を加えて，９５℃で３分間加熱し，直ちに氷中で冷却
後，ＡＬＦ自動シークエンサー（ファルマシア社製）を
用いた５％グリセロールを含む７％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により，ＳＳＣＰ解析を行った。
【００５８】その結果を図１に示す。該図において縦軸
は蛍光強度を，横軸は移動度を示す。図１上段（Standa
rd）は，スタンダードを混合して泳動した場合の結果を
示し，矢印で示した６個の変異タイプ由来のピーク（Ｐ
ｅａｋ）１，２，３，４，５及び６は，順次，配列番
号：３，：４，：５，：６，：７及び：８で示されるＤ
ＮＡ断片に相当する。
は蛍光強度を，横軸は移動度を示す。図１上段（Standa
rd）は，スタンダードを混合して泳動した場合の結果を
示し，矢印で示した６個の変異タイプ由来のピーク（Ｐ
ｅａｋ）１，２，３，４，５及び６は，順次，配列番
号：３，：４，：５，：６，：７及び：８で示されるＤ
ＮＡ断片に相当する。
【００５９】該図より，これら各スタンダードのピーク
が，それぞれ完全に分離された１本のピークとして得ら
れ，各スタンダードの濃度に応じたピーク領域が示され
ることが判る。
が，それぞれ完全に分離された１本のピークとして得ら
れ，各スタンダードの濃度に応じたピーク領域が示され
ることが判る。
【００６０】一方，図１下段（Patient）は，患者血清
由来のＰＣＲ増幅物の結果を示しており，この患者では
矢印で示す２本のピーク（Ｐｅａｋ）１，２が得られ
た。この２本のピークの移動度を，上記スタンダードの
移動度と比較することにより，患者のピーク１はスタン
ダードのピーク３（配列番号：５）に一致し，従ってこ
れはＰｒｅ−Ｃ領域の８３番目のＧがＡに変異したジェ
ノタイプであると決定された。また同じく，患者のピー
ク２はスタンダードのピーク４（配列番号：６）に一致
し，従ってこれは野生株であると決定された。
由来のＰＣＲ増幅物の結果を示しており，この患者では
矢印で示す２本のピーク（Ｐｅａｋ）１，２が得られ
た。この２本のピークの移動度を，上記スタンダードの
移動度と比較することにより，患者のピーク１はスタン
ダードのピーク３（配列番号：５）に一致し，従ってこ
れはＰｒｅ−Ｃ領域の８３番目のＧがＡに変異したジェ
ノタイプであると決定された。また同じく，患者のピー
ク２はスタンダードのピーク４（配列番号：６）に一致
し，従ってこれは野生株であると決定された。
【００６１】また上記図１より，スタンダードの各ピー
クエリアをそれぞれ算出（フラグメントマネージャー：
ファルマシア社）した結果，ピーク１は３７，ピーク２
は４６，ピーク３は６０，ピーク４は２１２，ピーク５
は３７５及びピーク６は７１３であった。これより作成
した標準曲線を図２（縦軸；ピークエリア，横軸；ピー
ク番号）に示す。
クエリアをそれぞれ算出（フラグメントマネージャー：
ファルマシア社）した結果，ピーク１は３７，ピーク２
は４６，ピーク３は６０，ピーク４は２１２，ピーク５
は３７５及びピーク６は７１３であった。これより作成
した標準曲線を図２（縦軸；ピークエリア，横軸；ピー
ク番号）に示す。
【００６２】患者のピーク１とピーク２の各ピークエリ
アを同様に算出し（ピーク１：２２０，ピーク２：１３
７２），上記標準曲線よりそれらの量を求めた結果，患
者のピーク１は３×１０6コピー，同ピーク２は１×１
０12コピーであると判定された。
アを同様に算出し（ピーク１：２２０，ピーク２：１３
７２），上記標準曲線よりそれらの量を求めた結果，患
者のピーク１は３×１０6コピー，同ピーク２は１×１
０12コピーであると判定された。
【００６３】以上より，本試験で用いた患者血清にはＨ
ＢＶ Ｐｒｅ−Ｃ領域の８３番目のＧがＡに変異したタ
イプのＨＢＶが３×１０6コピー，正常タイプＨＢＶが
１×１０12コピー存在すると判定された。
ＢＶ Ｐｒｅ−Ｃ領域の８３番目のＧがＡに変異したタ
イプのＨＢＶが３×１０6コピー，正常タイプＨＢＶが
１×１０12コピー存在すると判定された。
【００６４】
【００６５】配列番号：１ 配列の長さ：２２ 鎖の数：１ トポロジー：直線状 配列の種類：合成ＤＮＡ 起源：ヒトＢ型肝炎ウイルス核酸 配列の特徴：１７０１−１７２２ 配列： ACCTCTGCCT AATCATCTCA TG 22
【００６６】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 鎖の数：１ トポロジー：直線状 配列の種類：合成ＤＮＡ 起源：ヒトＢ型肝炎ウイルス核酸 配列の特徴：１７７５−１７９４ 配列： TTATACGGGT CAATGTCCAT 20
【００６７】配列番号：３ 配列の長さ：９４ 鎖の数：２ トポロジー：直線状 配列の種類：ＰＣＲ産物 起源：ヒトＢ型肝炎ウイルス核酸 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ 存在位置：１７０１−１７９４ 配列： ＡＣＣＴＣＴＧＣＣＴ ＡＡＴＣＡＴＣＴＣＡ ＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣ ＣＴＡ
ＣＴＧＴＴＣＡ ＡＧＣＣＴＣＣＡＡＧ ＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧ ６０ ＧＧＴＧＧＣＴＴＴＡ ＧＧＧＣＡＴＧＧＡＣ ＡＴＴＧＡＣＣＣＧＴ ＡＴＡ
Ａ ９４
ＣＴＧＴＴＣＡ ＡＧＣＣＴＣＣＡＡＧ ＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧ ６０ ＧＧＴＧＧＣＴＴＴＡ ＧＧＧＣＡＴＧＧＡＣ ＡＴＴＧＡＣＣＣＧＴ ＡＴＡ
Ａ ９４
【００６８】配列番号：４ 配列の長さ：９４ 鎖の数：２ トポロジー：直線状 配列の種類：ＰＣＲ産物 起源：ヒトＢ型肝炎ウイルス核酸 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ 存在位置：１７０１−１７９４ 配列： ＡＣＣＴＣＴＧＣＣＴ ＡＡＴＣＡＴＣＴＣＡ ＴＧＴＴＣＡＴＧＴＣ ＣＴＡ
ＣＴＧＴＴＣＡ ＡＧＣＣＴＣＣＡＡＧ ＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧ ６０ ＧＧＴＧＧＣＴＴＴＧ ＧＧＡＣＡＴＧＧＡＣ ＡＴＴＧＡＣＣＣＧＴ ＡＴＡ
Ａ ９４
ＣＴＧＴＴＣＡ ＡＧＣＣＴＣＣＡＡＧ ＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧ ６０ ＧＧＴＧＧＣＴＴＴＧ ＧＧＡＣＡＴＧＧＡＣ ＡＴＴＧＡＣＣＣＧＴ ＡＴＡ
Ａ ９４
【００６９】配列番号：５ 配列の長さ：９４ 鎖の数：２ トポロジー：直線状 配列の種類：ＰＣＲ産物 起源：ヒトＢ型肝炎ウイルス核酸 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ 存在位置：１７０１−１７９４ 配列： ACCTCTGCCT AATCATCTCA TGTTCATGTC CTACTGTTCA AGCCTCCAAG CTGTGCCTTG 60 GGTGGCTTTA GGGCATGGAC ATTGACCCGT ATAA 94
【００７０】配列番号：６ 配列の長さ：９４ 鎖の数：２ トポロジー：直線状 配列の種類：ＰＣＲ産物 起源：ヒトＢ型肝炎ウイルス核酸 配列の特徴：１７０１−１７９４ 配列： ACCTCTGCCT AATCATCTCA TGTTCATGTC CTACTGTTCA AGCCTCCAAG CTGTGCCTTG 60 GGTGGCTTTG GGGCATGGAC ATTGACCCGT ATAA 94
【００７１】配列番号：７ 配列の長さ：９４ 鎖の数：２ トポロジー：直線状 配列の種類：ＰＣＲ産物 起源：ヒトＢ型肝炎ウイルス核酸 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ 存在位置：１７０１−１７９４ 配列： ACCTCTGCCT AATCATCTCA TGTTCATGTC CTACTGTTCA AGCCTCCAAG CTGTGCCTTG 60 GGTGGCCTTA GGGCATGGAC ATTGACCCGT ATAA 94
【００７２】配列番号：８ 配列の長さ：９４ 鎖の数：２ トポロジー：直線状 配列の種類：ＰＣＲ産物 起源：ヒトＢ型肝炎ウイルス核酸 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ 存在位置：１７０１−１７９４ 配列： ACCTCTGCCT AATCATCTCA TGTTTATGTC CTACTGTTCA AGCCTCCAAG CTGTGCCTTG 60 GGTGGCCTTA GGGCATGGAC ATTGACCCGT ATAA 94
【図１】実施例１に従うヒトＢ型肝炎ウイルス核酸Ｐｒ
ｅ−Ｃ領域のＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析の結果を示すグラフ
である。
ｅ−Ｃ領域のＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析の結果を示すグラフ
である。
【図２】実施例１に従うヒトＢ型肝炎ウイルス核酸Ｐｒ
ｅ−Ｃ領域のＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析の標準曲線を示すグ
ラフである。
ｅ−Ｃ領域のＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析の標準曲線を示すグ
ラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92）
Claims (5)
- 【請求項１】 ヒトＢ型肝炎ウイルスＤＮＡの１７０１
−１７９４領域を選択的に増幅するように設定したこと
を特徴とするＰＣＲプライマー対。 - 【請求項２】 配列番号：１又は：２で示される請求項
１に記載のプライマー対。 - 【請求項３】 ヒトＢ型肝炎ウイルスＤＮＡの１７０１
−１７９４領域からなるＤＮＡ断片。 - 【請求項４】 ヒトＢ型肝炎ウイルスが野生株又はプレ
コア領域の３８番目のＧがＡに置換した変異，同４２番
目のＴがＣに置換した変異，同８０番目のＴがＣに置換
した変異，同８３番目のＧがＡに置換した変異及び同８
６番目のＧがＡに置換した変異から選択される少なくと
もひとつの変異を有する変異株である請求項３に記載の
ＤＮＡ断片。 - 【請求項５】 配列番号：３，：４，：５，：６，：７
及び：８から選択される配列で示される請求項３に記載
のＤＮＡ断片。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7285699A JPH09121862A (ja) | 1995-11-02 | 1995-11-02 | ヒトｂ型肝炎ウイルスｄｎａ |
| EP96935435A EP0860505A1 (en) | 1995-11-02 | 1996-10-24 | Human hepatitis b virus dna |
| PCT/JP1996/003108 WO1997016551A1 (fr) | 1995-11-02 | 1996-10-24 | Adn du virus de l'helpatite b humaine |
| AU73362/96A AU7336296A (en) | 1995-11-02 | 1996-10-24 | Human hepatitis b virus dna |
| KR1019980703253A KR19990067282A (ko) | 1995-11-02 | 1996-10-24 | 인간 비형 간염 바이러스 디엔에이 |
| CA002234667A CA2234667A1 (en) | 1995-11-02 | 1996-10-24 | Human hepatitis b virus dna |
| CN96198072A CN1201490A (zh) | 1995-11-02 | 1996-10-24 | 人乙型肝炎病毒dna |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7285699A JPH09121862A (ja) | 1995-11-02 | 1995-11-02 | ヒトｂ型肝炎ウイルスｄｎａ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09121862A true JPH09121862A (ja) | 1997-05-13 |
Family
ID=17694891
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7285699A Pending JPH09121862A (ja) | 1995-11-02 | 1995-11-02 | ヒトｂ型肝炎ウイルスｄｎａ |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0860505A1 (ja) |
| JP (1) | JPH09121862A (ja) |
| KR (1) | KR19990067282A (ja) |
| CN (1) | CN1201490A (ja) |
| AU (1) | AU7336296A (ja) |
| CA (1) | CA2234667A1 (ja) |
| WO (1) | WO1997016551A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7015317B2 (en) | 2002-05-02 | 2006-03-21 | Abbott Laboratories | Polynucleotides for the detection and quantification of hepatitis B virus nucleic acids |
| KR100647277B1 (ko) * | 2003-08-14 | 2006-11-17 | 삼성전자주식회사 | Ｂ형 간염 검사용 ｐｃｒ 프라이머 세트 및 이를 포함하는 ｂ형 간염 검사 키트 |
| CN101177715B (zh) * | 2006-11-09 | 2010-12-29 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 检测乙型肝炎病毒前c/bcp区基因突变的方法和试剂盒 |
| KR101401710B1 (ko) * | 2012-12-28 | 2014-07-04 | 서울대학교산학협력단 | HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 마커 |
-
1995
- 1995-11-02 JP JP7285699A patent/JPH09121862A/ja active Pending
-
1996
- 1996-10-24 CA CA002234667A patent/CA2234667A1/en not_active Abandoned
- 1996-10-24 AU AU73362/96A patent/AU7336296A/en not_active Abandoned
- 1996-10-24 WO PCT/JP1996/003108 patent/WO1997016551A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1996-10-24 CN CN96198072A patent/CN1201490A/zh active Pending
- 1996-10-24 EP EP96935435A patent/EP0860505A1/en not_active Withdrawn
- 1996-10-24 KR KR1019980703253A patent/KR19990067282A/ko not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0860505A1 (en) | 1998-08-26 |
| CN1201490A (zh) | 1998-12-09 |
| KR19990067282A (ko) | 1999-08-16 |
| CA2234667A1 (en) | 1997-05-09 |
| AU7336296A (en) | 1997-05-22 |
| WO1997016551A1 (fr) | 1997-05-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yaginuma et al. | Analysis of the p53 gene in human uterine carcinoma cell lines | |
| Buetow et al. | Low frequency of p53 mutations observed in a diverse collection of primary hepatocellular carcinomas. | |
| US5789153A (en) | Method of quantitating nucleic acid | |
| CN112981011B (zh) | 一种检测SARS-CoV-2的引物组合物及其应用 | |
| JPH05308999A (ja) | Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅ−Ｃ変異の判定法 | |
| JP2005505289A (ja) | Ｂ型肝炎ウイルスｄｎａの捕獲、検出および定量のためのオリゴヌクレオチドの同定 | |
| JPH09121862A (ja) | ヒトｂ型肝炎ウイルスｄｎａ | |
| AU772819B2 (en) | An in vitro activity assay for human hepatitis B virus (HBV) DNA polymerase, and its use for screening for inhibitors of HBV DNA polymerase | |
| US20060257850A1 (en) | Methods of treatment and diagnosis of patients with hepatitis c infection | |
| JPH07184695A (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスの簡易検出法 | |
| JPH09107970A (ja) | Ｃ型肝炎ウイルス由来核酸、該核酸を用いたウイルスの検出方法 | |
| EP0839911B1 (en) | Method for identifying attenuated varicella virus oka strain or a strain derived therefrom | |
| JPWO2005085436A1 (ja) | Ｂ型肝炎ウィルスによる発癌の検出法 | |
| JP2016189746A (ja) | プライマー対、プローブ、薬剤耐性ｃ型肝炎ウイルスの検出キット、薬剤耐性ｃ型肝炎ウイルスの検出方法およびｃ型肝炎の予後予測方法 | |
| JP2869759B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスの検査方法およびそれに用いるプライマーセット | |
| JP2001238687A (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型の判定方法 | |
| JPH04300000A (ja) | 核酸の定量方法 | |
| JP2004298011A (ja) | インターフェロンの治療効果を予測するための新規多型マーカー、プライマー、プローブおよびインターフェロンの治療効果を予測する方法 | |
| WO2001046469A1 (fr) | Procede d'etude du genotype du virus de l'hepatite c | |
| RU2180922C1 (ru) | Способ определения аллелей гена хемокинового рецептора ccr2 по полиморфному сайту v64i | |
| de Souza Kindermann et al. | Performance of the tetra-primer PCR technique compared to PCR-RFLP in the search for rs12979860 (C/T) and rs8099917 (T/G) single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the IFNL4 gene | |
| CN111424094A (zh) | 一种检测人tert基因启动子热点突变的方法 | |
| JP3909889B2 (ja) | 新規核酸断片から成るプライマーを用いた非ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ型肝炎ウイルスの検出方法 | |
| JPH1066597A (ja) | Ｇ型肝炎ウイルスの定量法 | |
| JP2004129655A (ja) | 新規な一塩基多型を含むＨＮＦ−１α遺伝子の変異体及びこれによりコードされる蛋白質の変異体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060316 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Effective date: 20080424 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20080527 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A521 | Written amendment |
Effective date: 20080728 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090120 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Effective date: 20090205 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120220 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Year of fee payment: 3 Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120220 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130220 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Year of fee payment: 5 Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140220 |