JPH04300000A - 核酸の定量方法 - Google Patents
核酸の定量方法Info
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸の検出方法に関する
。さらに詳しくは、微量の検体を内部標準の存在下で増
幅し、核酸を定量的に検出する方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】１９８７年米国のカイロン社によって輸
血性非Ａ非Ｂ型肝炎の原因ウイルスの一種と考えられる
Ｃ型肝炎ウイルスが発表された（ヨーロッパ特許０３１
８２１６、１９８９年５月３１日公開）。該発表による
と輸血性非Ａ非Ｂ型肝炎を発症せしめたチンパンジーの
血清より抽出した核酸を遺伝子工学的手法により分離増
幅しタンパク質を発現せしめ、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清
と反応するものを選抜することにより原因ウイルスのＣ
型肝炎ウイルス（以後“ＨＣＶ”と略称する）を特定し
、特定の抗原タンパク質を用いて血清と反応するものは
Ｃ型肝炎と判定されるとしている。さらにカイロン社発
表の具体例のＣ型肝炎診断キットにおいてはＨＣＶの非
構造タンパク抗原を用いて患者血清中に存在するＣ型肝
炎ウイルス抗体を検出するシステムによっている。しか
しながらかかる方法においてはウイルス量そのものを測
定することはできない。 【０００３】ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１４４３６号公
報にはＣ型肝炎ウイルスのプライマーＤＮＡセットを用
いた増幅検出法が開示されている。ＤＮＡの核酸増幅方
法についてはＵＳＰ４，６８３，１９５号明細書および
ＵＳＰ４，６８３，２０２号明細書に開示されている。 しかし、この方法においては検出可能ではあるが定量法
はない。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】以上のように従来は、
微量の核酸の存在の有無を定性的に測定するのみで定量
的な検出は不可能であった。従って、本発明は検体中に
存在する微量な核酸を定量的に検出する方法を提供する
ことを目的とする。本発明はまたＣ型肝炎ウイルス核酸
を検出する際に有効な内部標準核酸を提供することを目
的とする。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明は、核酸を内部標
準核酸の存在下で増幅することからなる核酸の定量方法
である。本発明の検出対象となる核酸は、ＤＮＡおよび
ＲＮＡを包含する。これらは一本鎖あるいは二本鎖のど
ちらでもよい。本発明の検出対象となる核酸は、特に制
限はなく核酸であればよい。例えば、ウイルス由来、病
原菌由来の核酸、動植物由来の核酸が挙げられる。なか
でも特に肝炎ウイルス関連核酸、すなわちＡ、Ｂ、Ｃ、
Ｄ、Ｅ型およびそれ以外の肝炎ウイルス、特にＣ型肝炎
ウイルス関連核酸の定量に有効である。 【０００６】内部標準核酸は、一本鎖であっても二本鎖
であってもよく、検出対象となる核酸において、プライ
マー核酸セットの結合部位にはさまれた核酸配列中の一
部を削除、一部外来の核酸を挿入したまたは一部置換し
た核酸を用いる。削除あるいは挿入する長さは、検出対
象核酸において増幅される部位と内部標準核酸の増幅部
位が分子量サイズの違いにより区別できればよく、好ま
しくはゲル電気泳動法により明確に区別できればよい。 削除されたものは公知の方法で作成しうる。例えば適当
な制限酵素によって行ってもよい。挿入されたものは、
任意の核酸配列の断片で前記プライマー以外の配列を挿
入したものであればよく、公知の方法で作成しうる。こ
れらは合成してもよいことはいうまでもない。 【０００７】また、内部標準核酸は、プライマー核酸セ
ットの結合部位の外側に外来の他の核酸が付加していて
もよい。また、必ずしも両末端にプライマー核酸結合部
位が存在しなくてもよいが、少なくとも一組のプライマ
ー核酸結合部位を有していなければならない。すなわち
、内部標準核酸は、検出対象となる核酸と共通のプライ
マー核酸結合部位を有し、検出対象となる核酸の増幅さ
れる部位と内部標準核酸の増幅される部位が分子量の違
いによって区別され得るものであればよい。 【０００８】本発明においては、かかる内部標準核酸を
一定量、検出対象となる核酸と同一液中に存在せしめ、
両者を同様の倍率で増幅させるとにより検出対象となる
核酸の量を測定できるものである。より具体的には、数
水準の濃度の内部標準核酸の溶液を調製し、それぞれを
検体中に一定量存在せしめ、核酸の増幅を行い、その後
アガロースゲル電気泳動などにより、核酸のバンドを検
出し、内部標準核酸とバンドの濃さを比較することによ
り検体中の核酸量を定量するものである。 【０００９】増幅は、必要により、検体を除タンパク処
理して得られた核酸を内部標準核酸の存在下、ポリメラ
ーゼおよびプライマー核酸セットを用いて核酸を増幅す
ることにより行う。ポリメラーゼとしては、ＤＮＡ依存
型ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラー
ゼ、ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存型Ｒ
ＮＡポリメラーゼなどを挙げることができる。 【００１０】プライマー核酸セットとしては、検出対象
核酸および内部標準核酸に結合しうるＤＮＡまたはＲＮ
Ａの１組の断片を用いることができる。該プライマー核
酸の長さは８塩基以上、好ましくは１２塩基以上、一般
に２０塩基前後が好ましい。 【００１１】以下、検出対象となる核酸としてＣ型肝炎
ウイルス（ＨＣＶ）を定量する方法を例にして説明する
。かかる方法は検出対象がかわっても本質において異な
ることなく適用し得るものである。ＨＣＶ関連核酸の存
在を診断しようとする対象検体は一般に血清または肝臓
組織である。 【００１２】まず、微量検体をタンパク変性剤あるいは
タンパク分解酵素にて処理後、除タンパクした水溶液を
調製する。タンパク変性剤処理法としては、塩酸グアニ
ジンあるいはグアニジンチオシアネートの如き変性剤に
よる処理法、デオキシコール酸ナトリウム塩、ラウリル
硫酸ナトリウム塩、あるいはＮ−ラウロイルサルコシン
ナトリウム塩の如きイオン性の界面活性性の変性剤によ
る変性処理、さらにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ポリ
エチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエ
ーテル）、Ｂｒｉｊｉ−５８（ポリオキシエチレンセチ
ルアルコールエーテル）の如き中性の界面活性剤による
変性処理方法がある。 【００１３】塩酸グアニジンあるいはグアニジンチオシ
アネートの如き変性剤による処理の場合は、これらの変
性剤の検体処理溶液で終濃度０．１〜１０Ｍ、好ましく
は１〜６Ｍとなるように添加する。デオキシコール酸ナ
トリウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム塩、あるいはＮ−
ラウロイルサルコシンナトリウム塩の如きイオン性の界
面活性性の変性剤による変性処理の場合は、これらの界
面活性性の変性剤を検体処理溶液での終濃度が０．０５
〜２０％、好ましくは０．５〜１０％となるように添加
する。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ポリエチレングリ
コールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル）、Ｂ
ｒｉｊｉ−５８（ポリオキシエチレンセチルアルコール
エーテル）の如き中性の界面活性剤による変性処理の場
合、これらの界面活性剤の終濃度を０．２〜３０％、好
ましくは０．５〜２０％となるようにする。 【００１４】また検体からのタンパク成分の変性をより
効果的にするために、上記の各種の変性剤の単独使用の
外、二種以上の併用は好ましいものである。さらにタン
パク変性溶液にβ−メルカプトエタノールの如きタンパ
ク変性剤の添加もまた好ましいものであり、かかる変性
剤の好ましい添加量は終濃度０．１〜２％である。また
、タンパク分解酵素を使用する場合、例えばプロナーゼ
、プロテネスＫなどを使用することができる。 【００１５】また検体からのタンパク成分の変性処理温
度は、核酸、特に一本鎖のＲＮＡが化学的な変性を受け
ない条件であれば何ら特別な制限を受けないが、１０〜
９８℃で行える。変性処理時間としては、１秒〜２時間
、好ましくは１０秒〜３０分間である。 【００１６】タンパク変性剤にて処理後、次に除タンパ
クを行う。除タンパクはフェノールまたはフェノール／
クロロフォルム混合液さらに必要な場合イソアミルアル
コールをフェノールの１／１０〜１／２０程度添加した
混合液にて１回以上抽出操作を行い、水相を回収し３Ｍ
酢酸ナトリウムの如き適当な塩溶液を１０分の１容量添
加後、エタノールを２〜３倍容量またはイソプロパノー
ルを等容量加えて遠心し沈澱として核酸（１）を得るこ
とができる。本発明においては、上記のフェノールある
いはフェノール／クロロフォルムによる抽出除タンパク
操作後、得られた水相に対して、クロロフォルムまたは
ジエチルエーテルの如き難水溶性の溶剤にて水相からフ
ェノールを除去するのみでも核酸の水溶液として得るこ
とができる。 【００１７】このようにして得た核酸に対してＤＮＡオ
リゴマーまたはＤＮＡオリゴマーの混合物、好ましくは
ＤＮＡのテトラ〜オクタマーの混合物、さらに好ましく
はＤＮＡのヘプタマー〜ペンタマーの混合物、特に好ま
しくはＤＮＡヘキサマーの混合物、例えばベーリンガー
・マンハイム山之内（株）の“ランダム”ｐ（ｄＮ）６
の如きものを用いてｃＤＮＡを合成する。該ｃＤＮＡ
を合成するに際して逆転写酵素を使用する。 【００１８】逆転写酵素としては一般市販のものが使用
でき、特定の制限はないが、ＡＭＶ（エイビアン・ミエ
ロブラストシ・ウイルス）の逆転写酵素、ＲＳＶ（ラウ
ス・サルコーマ・ウイルス）の逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ
（モロニー・ミュリーン・リュウケミア・ウイルス）の
逆転写酵素などが使用可能である。このなかでもＭ−Ｍ
ＬＶの逆転写酵素は合成されたｃＤＮＡに対してエンド
ヌクレアーゼ活性がなくかつＲＮａｓｅＨ酵素活性が低
いので好ましく使用される。これらの逆転写酵素は各々
の酵素の供給者の使用能書に従って使用しｃＤＮＡを調
製することができる。ｃＤＮＡを合成する際に使用した
ランダムなＤＮＡオリゴマーの過剰量を必要ならば、一
般に知られたアルコール沈澱やゲル濾過の如き操作によ
り除去する。 【００１９】次にＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡ
の増幅を行う。使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
、あるいは耐熱ＤＮＡポリメラーゼで知られるＴｔｈＤ
ＮＡポリメラーゼまたはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
などを挙げることができる。これらのＤＮＡポリメラー
ゼは夫々供給者の使用能書に従って使用し得る。これら
のＤＮＡポリメラーゼのうち、耐熱ＤＮＡポリメラーゼ
で知られるＴｔｈＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。使用するＴｔｈＤＮＡ
ポリメラーゼは東洋紡製（Ｎｏ．ＴＴＨ−１０３）、Ｔ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼはＰｒｏｍｅｇａ社（例え
ばｎｏ．１０１４２３）、ボクスイ・ブラウン社、ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリー社、宝酒造社などから夫
々販売されているものを使用できる。これらのＤＮＡポ
リメラーゼのうちＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｒｏｍ
ｅｇａ社のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが酵素活性が
高いので一層好ましい。 【００２０】本発明において、ＤＮＡポリメラーゼを用
いてＤＮＡの増幅を行うに際して使用するプライマー核
酸セットとしてオリゴＤＮＡセットを用いる。オリゴＤ
ＮＡセットとしては、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１
４４３６号公報Ｆｉｇ．１８−１からＦｉｇ．１８−２
５の塩基番号−３４１から９０６０中のものおよびこの
相補配列の中から、それぞれ選んだ任意の一組の核酸配
列断片を用いることができる。またＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡｖｏｌ．８７，ｐ．９５２
６〜９５２７のＦｉｇ．２に記載される塩基配列１〜９
４１３中のものおよびこの相補配列の中からそれぞれ選
んだ任意の一組の核酸配列断片を用いることができる。 【００２１】該核酸配列断片の大きさは８塩基以上、好
ましくは１２塩基以上、さらに好ましくは２０塩基以上
である。これらの核酸断片のうち、好ましくは、本願明
細書記載の配列番号２〜５のＤＮＡを組合せた一組の核
酸配列断片を用いることができる。特に、配列番号２お
よび３を組み合わせたセット、配列番号４および５を組
み合わせたセットが好適である。さらに本発明において
は、これらのオリゴＤＮＡのセットの２セット以上の組
合せで核酸増幅反応を実施することは一層核酸の検出を
よくするので好ましい。 【００２２】核酸を増幅させる際に存在させる内部標準
核酸は、分子数が数水準例えば１００ 、１０１ 、１
０２ 、１０３ 、１０４ 、１０５ 個となるように
検体中に加える。内部標準核酸は前記オリゴＤＮＡセッ
トにはさまれる核酸配列を有する核酸断片を使用するこ
とができる。好ましくは配列番号１の核酸配列を有する
断片またはそのプライマー結合部位以外の任意の塩基配
列部分が一部削除されたもの、一部に外来の塩基配列を
挿入されたもの、削除、挿入されたものにおいて、一部
の塩基が他の塩基と置換されたものあるいはこれらを混
合したものを使用することができる。必ずしも両末端に
プライマー結合部位が存在しなくてもよいが、少なくと
も一組のプライマー結合部位を有するものであることが
必要である。 【００２３】配列番号１の核酸配列はＰｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ．８７，ｐ．
９５２６のＦｉｇ．２記載の塩基番号３２〜２５４と類
似した配列であり、一本鎖でも二本鎖でもよい。両末端
がプライマーとして使用する配列番号２および３の塩基
配列となっている。すなわち、配列番号２は配列番号１
の２２３〜２０２の塩基配列であり、配列番号３は配列
番号１の１〜１９の塩基配列である。また配列番号５は
配列番号１の２０〜３９の配列と一致している。配列番
号４は配列番号１の１６４〜１４５の塩基配列である。 【００２４】検出は増幅させたＤＮＡをアガロースゲル
電気泳動し、次いでエチジウムブロマイドにて染色した
ものをＵＶ照射して発色せしめ特定核酸バンドを検出す
る。ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動・エチジウムブロ
マイドによる染色・ＵＶ照射による発色・特定核酸バン
ドの検出の操作は当業界一般公知の方法で実施できる。 【００２５】特定ＤＮＡバンドが発色で見られないとき
は、再度核酸の増幅を行うか、あるいは特定の化合物に
て標識された既知のＨＣＶの増幅核酸のサザーンハイブ
リダイゼーションを行う。再度の核酸増幅は、前記１回
目の核酸増幅で得られた水溶液の一部（例えば１／５〜
１／２０）に対してプライマーとしてのオリゴＤＮＡは
１回目増幅で使用したと同じオリゴＤＮＡセットまたは
該オリゴＤＮＡのそれぞれ３′側下流に位置するオリゴ
ＤＮＡを使用できる。 【００２６】サザーンハイブリダイゼーションを行って
検出する場合、使用するプローブ核酸としてはジゴキシ
ゲニンあるいはビオチンにて標識されたＨＣＶの増幅核
酸を用いる。ここで用いるプローブ用核酸はさきに記載
したと同様の方法でも調製できるが、検出しようとする
ＤＮＡと同じ領域内の塩基配列であって１５塩基以上で
あればよく、供給者の使用マニュアルに従って行うこと
ができる。 【００２７】本発明によれば、Ｃ型肝炎ウイルス関連核
酸を配列番号１の核酸の改変体の存在下で核酸を増幅す
るＣ型肝炎ウイルス関連核酸の定量方法が提供される。 該核酸の改変体としては、配列番号１の両末端のプライ
マー結合部位以外の部位が一部削除されたもの、一部外
来のＤＮＡを挿入または付加したもの、削除、挿入、付
加されたものが一部他の塩基と置換されたものを使用す
ることができる。増幅はプライマー核酸セットとして配
列番号２〜５のオリゴＤＮＡを用い、ＤＮＡポリメラー
ゼにより増幅させることが好適である。 【００２８】 【実施例】以下実施例を挙げて更に具体的に述べるが、
本発明はこれらの実施例に限るものではない。 参考例１〔内部標準核酸溶液（Ｉ）の調製〕米国オーソ
社製ＨＣＶ抗体（ＥＬＩＳＡ）テストシステムで抗体陽
性者の血清５０μｌにグアニジンチオシアネート水溶液
（５Ｍグアニジンチオシアネート／２５ｍＭクエン酸ナ
トリウム／０．５％サルコシル／０．２Ｍβ−メルカプ
トエタノール）２００μｌを添加し、３７℃・３０分間
・１００ｒｐｍで振とう後、フェノール／クロロフォル
ム（４／１）混合液４００μｌで３回抽出した。この水
相に１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）
、１μｇグリコーゲン、２．５倍容のエタノールを添加
し、−８０℃・３０分間保持後、遠心して得られたペレ
ットを７０％エタノール、次いで１００％エタノールで
洗浄後、核酸を得、これを２０μｌＴＥ〔１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ７．５）］水
溶液に溶解した。 【００２９】このようにして得られた核酸のＴＥ溶液１
０μｌに対して ５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．
３）／７５ｍＭ ＫＣｌ／１０ｍＭジチオスレイトール
／５ｍＭ ＭｇＣｌ２／４ｍＭリン酸ナトリウム／１ｍ
ＭｄＮＴＰｓ（Ｎ＝Ａ、Ｃ 、Ｇ 、Ｔ）／１．６μｇ
ランダムプライマー（ベーリンガー・マンハイム社製
ｎｏ１０３４７３１）、０．２ｕ／ μｌ ＡＭＶ 逆
転写酵素（総量２０μｌ）となるように各成分を加え、
４２℃で１時間ｃＤＮＡの合成反応を行った。 【００３０】このようにして得られたｃＤＮＡ溶液に対
して耐熱ＤＮＡポリメラーゼ反応溶液（０．５Ｍ ＫＣ
ｌ、０．１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２
、０．１ ％ゼラチン、０．１ ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００ の水溶液）５μｌ、滅菌水２９μｌ、ｄＮＴ
Ｐｓミクスチャー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＴＴＰ各々の１．２５ｍＭ溶液） の８μｌ、配列番号
２および配列番号３の各ＤＮＡ水溶液（濃度０．１μｇ
／μｌ）を各々２．５μｌ、さらにＴａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ｎｏ１０１４２３）１
．２５ユニット、さらに流動パラフィン５０μｌを加え
、９５℃で１分間、次いで５７℃・２分間、次いで７２
℃・３分間、さらにこの３段階の温度・時間変化の操作
を３０回繰り返し、最後に７２℃・７分間ポリメラーゼ
反応を行った。 【００３１】この反応溶液２０μｌを４％アガロースゲ
ル上で電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、Ｕ
Ｖ照射し大きさ約２２０ｂｐのＤＮＡバンド部分のゲル
を切り出した。このゲルに蒸留水５００μｌおよびフェ
ノール／クロロフォルム（４／１）混合溶液４００μｌ
を加え、−８０℃・３０分間放置、次いで３７℃・２０
分間激しく振とう後、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心
して水相を得た。この水相に対して常法通りフェノール
／クロロフォルム（４／１）混合溶液抽出、次いでエタ
ノール沈澱を行いＤＮＡを得た。 【００３２】このＤＮＡを供給者の使用能書に従い、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製２０４０Ｂ）およびｄ
ＮＴＰｓミクスチャー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
、ｄＴＴＰ） を用いてＤＮＡの末端を平滑末端化処理
し、さらに供給者の使用能書に従い、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（宝酒造製Ｎｏ．２０２１Ｂ） を用いて
５′末端をリン酸化した。次に常法通りフェノール／ク
ロロフォルム（４／１）混合溶液抽出、次いでエタノー
ル沈澱を行いＤＮＡを得た。次にこのＤＮＡを制限酵素
ＲｓａＩ（宝酒造Ｎｏ．１１１６Ｂ）およびＳｍａＩ（
宝酒造Ｎｏ．１０８５Ｂ） にて供給者の能書に従い完
全分解し、以下常法通りフェノール／クロロフォルム（
４／１）混合溶液抽出、次いでエタノール沈澱を行い、
得られたＤＮＡをＴＥ水溶液２０μｌに溶解しＤＮＡ溶
液（１）を得た。 【００３３】一方、大腸菌ベクタープラスミッドＤＮＡ
ｐＵＣ１８の０．１５μｇを制限酵素ＳｍａＩにて
完全分解し、次いでアルカリホスファターゼ（宝酒造製
Ｎｏ．２１２０Ｂ） にて常法に従い脱リン酸処理を行
い、以下常法通りフェノール／クロロフォルム（４／１
）混合溶液抽出、次いでエタノール沈澱を行い、得られ
たＤＮＡをＴＥ水溶液１０μｌに溶解しＤＮＡ溶液（２
）を得た。 【００３４】ＤＮＡ溶液（１）の３μｌおよびＤＮＡ溶
液（２）の１μｌをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製Ｎｏ
．２０１１Ｂ） にて供給者の能書に従って結合して全
反応量２０μｌの８μｌを大腸菌ＨＢ１０１株のコンピ
テントセル（宝酒造製Ｎｏ．９０５１）１００μｌに添
加し、供給者の使用能書に従って形質転換を行い得られ
たアンピシリン耐性株数百個から組み換えプラスミッド
ＤＮＡ１５株を“ミニプレパレーション”で知られる常
法に従い分離した。 【００３５】得られた各組み換えプラスミッドＤＮＡ溶
液１μｌに対して耐熱ＤＮＡポリメラーゼ反応溶液（０
．５Ｍ ＫＣｌ、０．１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、１５ｍＭ
ＭｇＣｌ２、０．１ ％ゼラチン、０．１％Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００の水溶液） １０μｌ、滅菌水５６μ
ｌ、ｄＮＴＰｓミクスチャー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＴＴＰ各々の１．２５ｍＭ溶液） の１６μ
ｌ、配列番号２および配列番号３の各ＤＮＡ水溶液（濃
度０．１μｇ／μｌ）を各々８μｌ、さらにＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ｎｏ１０１４
２３）１ユニット、さらに流動パラフィン５０μｌを加
え、９５℃・１分間、次いで５７℃・２分間、次いで７
２℃・３分間、さらにこの３段階の温度・時間変化の操
作を３０回繰り返し、最後に７２℃・７分間ポリメラー
ゼ反応を行った。この反応溶液４μｌを４％アガロース
ゲル上で電気泳動しエチジウムブロマイドで染色後、Ｕ
Ｖ照射し大きさ約１９０ｂｐのＤＮＡバンドを示す株ｐ
ＵＨＣ１０１を得た。この約１９０ｂｐのＤＮＡは配列
表１番の８８位〜１２１位の核酸３４ケが削除されたも
のである。 【００３６】この大きさ約１９０ｂｐの増幅ＤＮＡ溶液
９６μｌを４％のアガロースゲル電気泳動し大きさ約１
９０ｂｐのＤＮＡバンド部分のゲルを切取り、前記ゲル
からのＤＮＡの抽出精製法と同様にして蒸留水およびフ
ェノール／クロロフォルム（４／１）混合溶液で−８０
℃・３０分間放置、次いで３７℃・２０分間激しく振と
う後、１２，０００ｒｐｍ・５分間遠心して水相を得、
この水相に対してフェノール／クロロフォルム（４／１
）混合溶液抽出、次いでエタノール沈澱を行いＤＮＡを
得た。このＤＮＡのＴＥ溶液を内径約１０ｍｍのカラム
にてＤＥＡＥセファクリルＡ−２５（０．５ＭＮａＣｌ
／１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌにて予め平衡化）の約４ｍｌ
に吸着せしめ、０．５ＭＮａＣｌ／１０ｍＭＴｒｉｓＨ
Ｃｌ水溶液３０ｍｌにて洗浄後、２ＭＮａＣｌ／１０ｍ
ＭＴｒｉｓＨＣｌ水溶液にてＤＮＡを溶出し、次いで得
られた溶出液に２．５倍量のエタノールにてエタノール
沈澱を行いＤＮＡを得た。 【００３７】このＤＮＡを蒸留水１００μｌに溶解し光
学吸光度Ａ２６０の測定によりＤＮＡ濃度（２０μｇ／
ｍｌ）とわかった。このＤＮＡ溶液の１０５ 倍、１０
６ 倍、１０７ 倍、１０８ 倍、１０９ 倍、１０１
０倍、１０１１倍、１０１２倍の各々の希釈溶液を夫々
内部標準核酸溶液Ｉ−７、Ｉ−６、Ｉ−５、Ｉ−４、Ｉ
−３、Ｉ−２、Ｉ−１、Ｉ−０とする。 【００３８】（ＰＣＲ）これらの１μｌに対して耐熱Ｄ
ＮＡポリメラーゼ反応溶液（０．５Ｍ ＫＣｌ、０．１
Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１
％ゼラチン、０．１ ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の水
溶液） ２．５μｌ、滅菌水１３μｌ、ｄＮＴＰミクス
チャー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各々
の１．２５ｍＭ溶液） の４μｌ、アプライドバイオシ
ステムズ社製ＤＮＡシンセサイザーモデル３８０Ａで合
成した配列番号２のＤＮＡ水溶液（濃度０．１μｇ／μ
ｌ）および同様に合成した配列番号３のＤＮＡの水溶液
（濃度０．１μｇ／μｌ）を各々１．２５μｌ、さらに
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ｎ
ｏ１０１４２３）０．５ユニットを加え、さらに流動パ
ラフィン５０μｌを加え、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは始
めに９４℃・４分間前処理し次いで９４℃・３０秒間→
５３℃・３０秒間→７２℃・１分間の３段階の温度・時
間変化の操作を２０回繰り返し、最後に７２℃・７分間
反応を行った。 【００３９】次に、反応溶液１μｌに対して耐熱ＤＮＡ
ポリメラーゼ反応溶液（０．５Ｍ ＫＣｌ、０．１Ｍ
ＴｒｉｓＨＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ ％ゼ
ラチン、０．１ ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の水溶液
） ２．５μｌ、滅菌水１４μｌ、ｄＮＴＰｓミクスチ
ャー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各々の
１．２５ｍＭ溶液） の４μｌ、配列番号４のＤＮＡ水
溶液（濃度０．１μｇ／μｌ）および配列番号５のＤＮ
Ａの水溶液（濃度０．１μｇ／μｌ）を各々１．２５μ
ｌ、さらにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ社製ｎｏ１０１４２３）０．５ユニットを加え、さ
らに流動パラフィン５０μｌを加え、二段目のＰＣＲを
行った。始めに９４℃・２分間前処理し、次いで９４℃
・３０秒間→５０℃・３０秒間→７２℃・１分間の３段
階の温度・時間変化の操作を３０回繰り返し、最後に７
２℃・７分間反応を行った。 【００４０】第二段階ＰＣＲを行った８本の反応溶液５
μｌを４％アガロースゲル上で電気泳動しエチジウムブ
ロマイドで染色後、ＵＶ照射し、増幅したＤＮＡをバン
ドとして観察し図１が得られた。 【００４１】図１から内部標準核酸溶液Ｉ−０（レーン
１）およびＩ−１（レーン２）についてはＤＮＡの増幅
が全く見られず、内部標準核酸溶液Ｉ−２（レーン３）
で始めて大きさ約１１１ｂｐのＤＮＡが増幅しているこ
とがわかる。このことから内部標準核酸溶液Ｉ−１〜Ｉ
−７の中の標準核酸の分子数は夫々１００ 、１０１
、１０２ 、１０３ 、１０４ 、１０５ 、１０６
ケのオーダーと考えられる。図１中、レーン１〜８は内
部標準核酸溶液Ｉ−０〜Ｉ−７の各１μｌをＰＣＲした
もので、レーン９はＤＮＡサイズマーカー（φＸ１７４
複製型ＤＮＡのＨａｅＩＩＩ 分解物）である。 【００４２】実施例１ 〔患者（１）の検体からの核酸抽出およびｃＤＮＡ化〕
非Ａ非Ｂ型慢性肝炎の患者（１）の血清１００μｌにグ
アニジンチオシアネート水溶液（５Ｍグアニジンチオシ
アネート／２５ｍＭクエン酸ナトリウム／０．５％サル
コシル／０．２Ｍβ−メルカプトエタノール）２００μ
ｌを添加し、３７℃・３０分間・１００ｒｐｍで振とう
後、フェノール／クロロフォルム（４／１）混合液４０
０μｌで３回抽出した。この水相に１０分の１容の３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）、１μｇのグリコーゲン
、２．５倍容のエタノールを添加し、−８０℃・３０分
間保持後、遠心して得られたペレットを７０％エタノー
ル、次いで１００％エタノールで洗浄後、核酸を得た。 【００４３】この核酸に対して５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣ
ｌ（ｐＨ８．３）／７５ｍＭ ＫＣｌ／１０ｍＭ ジチ
オスレイトール／５ｍＭ ＭｇＣｌ２／４ｍＭリン酸ナ
トリウム／１ｍＭ ｄＮＴＰｓ（Ｎ＝Ａ、Ｃ 、Ｇ 、
Ｔ）／１．６μｇ ランダムプライマー（ ベーリンガ
ー・マンハイム社製ｎｏ１０３４７３１）、０．２ ｕ
／ μｌ ＡＭＶ 逆転写酵素（総量２０μｌ）となる
ように各成分を加え、４２℃で１時間ｃＤＮＡの合成反
応を行った。 【００４４】（ＰＣＲ）得られたｃＤＮＡ溶液１μｌに
対して耐熱ＤＮＡポリメラーゼ反応溶液（０．５ＭＫＣ
ｌ、０．１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２
、０．１ ％ゼラチン、０．１ ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００の水溶液） ２．５μｌ、滅菌水１３μｌ、ｄＮ
ＴＰｓミクスチャー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、
ｄＴＴＰ各々の１．２５ｍＭ溶液） の４μｌ、配列番
号２のＤＮＡ水溶液（濃度０．１μｇ／μｌ）および配
列番号３のＤＮＡの水溶液（濃度０．１μｇ／μｌ）を
各々１．２５μｌ、さらにＴａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ｎｏ１０１４２３）０．５ユニ
ットを加え、さらに流動パラフィン５０μｌを加えた。 【００４５】このようなＰＣＲ反応溶液６本の各々に、
内部標準核酸溶液Ｉ−２〜Ｉ−７の各々１μｌを添加し
てＰＣＲを行った。ＰＣＲは始めに９４℃・４分間前処
理し、次いで９４℃・３０秒間→５３℃・３０秒間→７
２℃・１分間の３段階の温度・時間変化の操作を２０回
繰り返し、最後に７２℃・７分間反応を行った。 【００４６】次に、反応溶液０．５μｌに対して耐熱Ｄ
ＮＡポリメラーゼ反応溶液（０．５Ｍ ＫＣｌ、０．１
Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１
％ゼラチン、０．１ ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の水
溶液） ２．５μｌ、滅菌水１４μｌ、ｄＮＴＰｓミク
スチャー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各
々の１．２５ｍＭ溶液） の４μｌ、配列番号４のＤＮ
Ａ水溶液（濃度０．１μｇ／μｌ）および配列番号５の
ＤＮＡの水溶液（濃度０．１μｇ／μｌ）を各々１．２
５μｌ、さらにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ社製ｎｏ１０１４２３）０．５ユニットを加え
、さらに流動パラフィン５０μｌを加え、二段目のＰＣ
Ｒを行った。始めに９４℃・２分間前処理し、次いで９
４℃・３０秒間→５０℃・３０秒間→７２℃・１分間の
３段階の温度・時間変化の操作を３０回繰り返し、最後
に７２℃・７分間反応を行った。 【００４７】６本の二段階ＰＣＲを行った反応溶液５μ
ｌを４％アガロースゲル上で電気泳動しエチジウムブロ
マイドで染色後、ＵＶ照射し増幅したＤＮＡをバンドと
して観察し図２が得られた。 【００４８】図２中、レーン１は患者（１）の血清ｃＤ
ＮＡに内部標準核酸溶液Ｉ−２を添加したものの電気泳
動により得られたバンドである。レーン２〜６は患者（
１）の血清ｃＤＮＡに内部標準核酸溶液Ｉ−３〜Ｉ−７
を夫々添加したもののバンドである。レーン７はＤＮＡ
サイズマーカー（φＸ１７４複製型ＤＮＡのＨａｅＩＩ
Ｉ 分解物）の電気泳動によるバンドを示す。 【００４９】図２から、レーン２にて内部標準核酸（大
きさ１１１ｂｐ）のＤＮＡの増幅がみられ始め、レーン
３で１４５ｂｐのＤＮＡとほぼ同じ程度の増幅を示し、
レーン４以降では内部標準核酸のＤＮＡのみ増幅してい
ることがわかった。このことから本実施例１にて使用し
た患者（１）の血清から抽出した核酸のｃＤＮＡ溶液１
μｌには内部標準核酸液Ｉ−４と同じオーダーのＨＣＶ
核酸が存在するといえる。すなわち患者（１）の血清１
００μｌ中に存在するＨＣＶ核酸は２×１０４ ケのオ
ーダーといえる。 【００５０】実施例２〜４ 〔患者（２〜４）の検体からの核酸抽出およびｃＤＮＡ
化〕非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者（２）、（３）、（４）の
各々の血清１００μｌから実施例１の場合と同様にｃＤ
ＮＡを調製した。 【００５１】〔ＰＣＲ〕得られたｃＤＮＡ溶液１μｌに
対して実施例１と全く同様にして第一段階のＰＣＲを実
施し、さらに第二段階のＰＣＲも実施例１と全く同様に
実施した。第二段階ＰＣＲを行った反応溶液５μｌを４
％アガロースゲル上で電気泳動しエチジウムブロマイド
で染色後、ＵＶ照射し増幅したＤＮＡをバンドとして観
察し図３〜５が得られた。 【００５２】図３は実施例２（患者２）の核酸定量結果
を示すものであり、図３において、レーン１は患者（２
）の血清ｃＤＮＡに内部標準核酸液Ｉ−２を添加したも
の、レーン２〜６は患者（２）の血清ｃＤＮＡに夫々内
部標準核酸液Ｉ−３〜Ｉ−７を添加したもの、レーン７
はＤＮＡサイズマーカー（φＸ１７４複製型ＤＮＡのＨ
ａｅＩＩＩ 分解物）である。 【００５３】図３から、レーン２にて内部標準核酸（大
きさ１１１ｂｐ）のＤＮＡの増幅が見られ始め、レーン
３で１４５ｂｐのＤＮＡとほぼ同じ程度の増幅を示し、
レーン４以降では内部標準核酸のＤＮＡのみ増幅してい
ることがわかった。このことから本実施例２にて使用し
た患者（２）の血清から抽出した核酸のｃＤＮＡ溶液１
μｌには内部標準核酸液Ｉ−４と同じオーダーのＨＣＶ
核酸が存在するといえる。すなわち本患者（２）の血清
１００μｌ中に存在するＨＣＶ核酸は２×１０４ ケの
オーダーといえる。 【００５４】図４は実施例３（患者３）の核酸定量結果
を示すものであり、図４において、レーン１は患者（３
）の血清ｃＤＮＡに内部標準核酸液Ｉ−２を添加したも
の、レーン２〜６は患者（３）の血清ｃＤＮＡに夫々内
部標準核酸液Ｉ−３〜Ｉ−７を添加したもの、レーン７
はＤＮＡサイズマーカー（φＸ１７４複製型ＤＮＡのＨ
ａｅＩＩＩ 分解物）である。 【００５５】図４から、レーン２にて内部標準核酸（大
きさ１１１ｂｐ）のＤＮＡの増幅が見られ始め、レーン
３で１４５ｂｐのＤＮＡとほぼ同じ程度の増幅を示し、
レーン４以降では内部標準核酸のＤＮＡのみ増幅してい
ることがわかった。このことから本実施例３にて使用し
た患者（３）の血清から抽出した核酸のｃＤＮＡ溶液１
μｌには内部標準核酸液Ｉ−４と同じオーダーのＨＣＶ
核酸が存在するといえる。すなわち本患者（３）の血清
１００μｌ中に存在するＨＣＶ核酸は２×１０４ ケの
オーダーといえる。 【００５６】図５は実施例４（患者４）の核酸定量結果
を示すものであり、図５において、レーン１は患者（４
）の血清ｃＤＮＡに内部標準核酸液Ｉ−２を添加したも
の、レーン２〜６は患者（４）の血清ｃＤＮＡに夫々内
部標準核酸液Ｉ−３〜Ｉ−７を添加したもの、レーン７
はＤＮＡサイズマーカー（φＸ１７４複製型ＤＮＡのＨ
ａｅＩＩＩ 分解物）である。 【００５７】図５から、レーン１にて内部標準核酸（大
きさ１１１ｂｐ）のＤＮＡの増幅が見られ始め、レーン
２で１４５ｂｐのＤＮＡとほぼ同じ程度の増幅を示し、
レーン３以降では内部標準核酸のＤＮＡのみ増幅してい
ることがわかった。このことから本実施例４にて使用し
た患者（４）の血清から抽出した核酸のｃＤＮＡ溶液１
μｌには内部標準核酸液Ｉ−３と同じオーダーのＨＣＶ
核酸が存在するといえる。すなわち本患者（４）の血清
１００μｌ中に存在するＨＣＶ核酸は２×１０３ ケの
オーダーといえる。 【００５８】 【発明の効果】本発明によれば、核酸の定量的な検出が
可能となる。本発明の方法は肝炎ウイルス関連核酸、特
にＣ型肝炎ウイルス関連核酸の定量に有効である。 【００５９】 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡ ＡＣＴＡＣＴＧＴＣＴ ＴＣＡ
ＣＧＣＡＧＡＡ ＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣ ＣＡＴＧＧＣ
ＧＴＴＡ ＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴ ６０ ＧＧＡ
ＣＡＣＴＣＣＴ ＴＧＡＴＧＡＣＡＧＡ ＡＧＴＧＣＧ
ＴＣＴＴ ＴＣＧＣＡＧＡＴＣＧ ＧＴＡＣＣＧＣＡＡ
Ｔ ＣＡＴＡＣＴＣＡＣＡ ＣＧＴＧＣＡＧＣＣＴ Ｃ
ＣＡＧＧＡＣＣＣＣ ＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧ ＡＧＡＧ
ＣＣＡＴＡＧ ＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧ ＡＡＣＣＧＧＴ
ＧＡＧ １２０ＧＣＡＣＧＴＣＧＧＡ ＧＧＴＣＣ
ＴＧＧＧＧ ＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣ ＴＣＴＣＧＧＴＡ
ＴＣ ＡＣＣＡＧＡＣＧＣＣ ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣ
ＴＡＣＡＣＣＧＧＡＡ ＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣ ＧＡＣ
ＣＧＧＧＴＣＣ ＴＴＴＣＴＴＧＧＡＴ ＡＡＡＣＣＣ
ＧＣＴＣ ＡＡＴＧＣＣＴＧＧＡ １８０ＡＴＧＴ
ＧＧＣＣＴＴ ＡＡＣＧＧＴＣＣＴＧ ＣＴＧＧＣＣＣ
ＡＧＧ ＡＡＡＧＡＡＣＣＴＡ ＴＴＴＧＧＧＣＧＡＧ
ＴＴＡＣＧＧＡＣＣＴ ＧＡＴＴＴＧＧＧＣＧ ＣＧ
ＣＣＣＣＣＧＣＡ ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧ ＣＣＧＡＧ
ＴＡＧＴＧ ＴＴＧ
２２３ＣＴＡＡＡＣＣＣＧＣ ＧＣＧＧＧＧ
ＧＣＧＴ ＴＣＴＧＡＣＧＡＴＣ ＧＧＣＴＣＡＴＣＡ
Ｃ ＡＡＣ 【００６０】配列番号：２ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＣＡＡＣＡＣＴＡＣＴ ＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧ ＴＣ
２２【００６１】配列番号：３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡ ＡＣＴＡＣＴＧＴＣ
１９【００６２】配列番号
：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＧＴＴＴＡＴＣＣＡＡ ＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣ
２０【００６３】配列番号
：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡ ＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ
２０
。さらに詳しくは、微量の検体を内部標準の存在下で増
幅し、核酸を定量的に検出する方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】１９８７年米国のカイロン社によって輸
血性非Ａ非Ｂ型肝炎の原因ウイルスの一種と考えられる
Ｃ型肝炎ウイルスが発表された（ヨーロッパ特許０３１
８２１６、１９８９年５月３１日公開）。該発表による
と輸血性非Ａ非Ｂ型肝炎を発症せしめたチンパンジーの
血清より抽出した核酸を遺伝子工学的手法により分離増
幅しタンパク質を発現せしめ、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清
と反応するものを選抜することにより原因ウイルスのＣ
型肝炎ウイルス（以後“ＨＣＶ”と略称する）を特定し
、特定の抗原タンパク質を用いて血清と反応するものは
Ｃ型肝炎と判定されるとしている。さらにカイロン社発
表の具体例のＣ型肝炎診断キットにおいてはＨＣＶの非
構造タンパク抗原を用いて患者血清中に存在するＣ型肝
炎ウイルス抗体を検出するシステムによっている。しか
しながらかかる方法においてはウイルス量そのものを測
定することはできない。 【０００３】ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１４４３６号公
報にはＣ型肝炎ウイルスのプライマーＤＮＡセットを用
いた増幅検出法が開示されている。ＤＮＡの核酸増幅方
法についてはＵＳＰ４，６８３，１９５号明細書および
ＵＳＰ４，６８３，２０２号明細書に開示されている。 しかし、この方法においては検出可能ではあるが定量法
はない。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】以上のように従来は、
微量の核酸の存在の有無を定性的に測定するのみで定量
的な検出は不可能であった。従って、本発明は検体中に
存在する微量な核酸を定量的に検出する方法を提供する
ことを目的とする。本発明はまたＣ型肝炎ウイルス核酸
を検出する際に有効な内部標準核酸を提供することを目
的とする。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明は、核酸を内部標
準核酸の存在下で増幅することからなる核酸の定量方法
である。本発明の検出対象となる核酸は、ＤＮＡおよび
ＲＮＡを包含する。これらは一本鎖あるいは二本鎖のど
ちらでもよい。本発明の検出対象となる核酸は、特に制
限はなく核酸であればよい。例えば、ウイルス由来、病
原菌由来の核酸、動植物由来の核酸が挙げられる。なか
でも特に肝炎ウイルス関連核酸、すなわちＡ、Ｂ、Ｃ、
Ｄ、Ｅ型およびそれ以外の肝炎ウイルス、特にＣ型肝炎
ウイルス関連核酸の定量に有効である。 【０００６】内部標準核酸は、一本鎖であっても二本鎖
であってもよく、検出対象となる核酸において、プライ
マー核酸セットの結合部位にはさまれた核酸配列中の一
部を削除、一部外来の核酸を挿入したまたは一部置換し
た核酸を用いる。削除あるいは挿入する長さは、検出対
象核酸において増幅される部位と内部標準核酸の増幅部
位が分子量サイズの違いにより区別できればよく、好ま
しくはゲル電気泳動法により明確に区別できればよい。 削除されたものは公知の方法で作成しうる。例えば適当
な制限酵素によって行ってもよい。挿入されたものは、
任意の核酸配列の断片で前記プライマー以外の配列を挿
入したものであればよく、公知の方法で作成しうる。こ
れらは合成してもよいことはいうまでもない。 【０００７】また、内部標準核酸は、プライマー核酸セ
ットの結合部位の外側に外来の他の核酸が付加していて
もよい。また、必ずしも両末端にプライマー核酸結合部
位が存在しなくてもよいが、少なくとも一組のプライマ
ー核酸結合部位を有していなければならない。すなわち
、内部標準核酸は、検出対象となる核酸と共通のプライ
マー核酸結合部位を有し、検出対象となる核酸の増幅さ
れる部位と内部標準核酸の増幅される部位が分子量の違
いによって区別され得るものであればよい。 【０００８】本発明においては、かかる内部標準核酸を
一定量、検出対象となる核酸と同一液中に存在せしめ、
両者を同様の倍率で増幅させるとにより検出対象となる
核酸の量を測定できるものである。より具体的には、数
水準の濃度の内部標準核酸の溶液を調製し、それぞれを
検体中に一定量存在せしめ、核酸の増幅を行い、その後
アガロースゲル電気泳動などにより、核酸のバンドを検
出し、内部標準核酸とバンドの濃さを比較することによ
り検体中の核酸量を定量するものである。 【０００９】増幅は、必要により、検体を除タンパク処
理して得られた核酸を内部標準核酸の存在下、ポリメラ
ーゼおよびプライマー核酸セットを用いて核酸を増幅す
ることにより行う。ポリメラーゼとしては、ＤＮＡ依存
型ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラー
ゼ、ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存型Ｒ
ＮＡポリメラーゼなどを挙げることができる。 【００１０】プライマー核酸セットとしては、検出対象
核酸および内部標準核酸に結合しうるＤＮＡまたはＲＮ
Ａの１組の断片を用いることができる。該プライマー核
酸の長さは８塩基以上、好ましくは１２塩基以上、一般
に２０塩基前後が好ましい。 【００１１】以下、検出対象となる核酸としてＣ型肝炎
ウイルス（ＨＣＶ）を定量する方法を例にして説明する
。かかる方法は検出対象がかわっても本質において異な
ることなく適用し得るものである。ＨＣＶ関連核酸の存
在を診断しようとする対象検体は一般に血清または肝臓
組織である。 【００１２】まず、微量検体をタンパク変性剤あるいは
タンパク分解酵素にて処理後、除タンパクした水溶液を
調製する。タンパク変性剤処理法としては、塩酸グアニ
ジンあるいはグアニジンチオシアネートの如き変性剤に
よる処理法、デオキシコール酸ナトリウム塩、ラウリル
硫酸ナトリウム塩、あるいはＮ−ラウロイルサルコシン
ナトリウム塩の如きイオン性の界面活性性の変性剤によ
る変性処理、さらにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ポリ
エチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエ
ーテル）、Ｂｒｉｊｉ−５８（ポリオキシエチレンセチ
ルアルコールエーテル）の如き中性の界面活性剤による
変性処理方法がある。 【００１３】塩酸グアニジンあるいはグアニジンチオシ
アネートの如き変性剤による処理の場合は、これらの変
性剤の検体処理溶液で終濃度０．１〜１０Ｍ、好ましく
は１〜６Ｍとなるように添加する。デオキシコール酸ナ
トリウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム塩、あるいはＮ−
ラウロイルサルコシンナトリウム塩の如きイオン性の界
面活性性の変性剤による変性処理の場合は、これらの界
面活性性の変性剤を検体処理溶液での終濃度が０．０５
〜２０％、好ましくは０．５〜１０％となるように添加
する。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ポリエチレングリ
コールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル）、Ｂ
ｒｉｊｉ−５８（ポリオキシエチレンセチルアルコール
エーテル）の如き中性の界面活性剤による変性処理の場
合、これらの界面活性剤の終濃度を０．２〜３０％、好
ましくは０．５〜２０％となるようにする。 【００１４】また検体からのタンパク成分の変性をより
効果的にするために、上記の各種の変性剤の単独使用の
外、二種以上の併用は好ましいものである。さらにタン
パク変性溶液にβ−メルカプトエタノールの如きタンパ
ク変性剤の添加もまた好ましいものであり、かかる変性
剤の好ましい添加量は終濃度０．１〜２％である。また
、タンパク分解酵素を使用する場合、例えばプロナーゼ
、プロテネスＫなどを使用することができる。 【００１５】また検体からのタンパク成分の変性処理温
度は、核酸、特に一本鎖のＲＮＡが化学的な変性を受け
ない条件であれば何ら特別な制限を受けないが、１０〜
９８℃で行える。変性処理時間としては、１秒〜２時間
、好ましくは１０秒〜３０分間である。 【００１６】タンパク変性剤にて処理後、次に除タンパ
クを行う。除タンパクはフェノールまたはフェノール／
クロロフォルム混合液さらに必要な場合イソアミルアル
コールをフェノールの１／１０〜１／２０程度添加した
混合液にて１回以上抽出操作を行い、水相を回収し３Ｍ
酢酸ナトリウムの如き適当な塩溶液を１０分の１容量添
加後、エタノールを２〜３倍容量またはイソプロパノー
ルを等容量加えて遠心し沈澱として核酸（１）を得るこ
とができる。本発明においては、上記のフェノールある
いはフェノール／クロロフォルムによる抽出除タンパク
操作後、得られた水相に対して、クロロフォルムまたは
ジエチルエーテルの如き難水溶性の溶剤にて水相からフ
ェノールを除去するのみでも核酸の水溶液として得るこ
とができる。 【００１７】このようにして得た核酸に対してＤＮＡオ
リゴマーまたはＤＮＡオリゴマーの混合物、好ましくは
ＤＮＡのテトラ〜オクタマーの混合物、さらに好ましく
はＤＮＡのヘプタマー〜ペンタマーの混合物、特に好ま
しくはＤＮＡヘキサマーの混合物、例えばベーリンガー
・マンハイム山之内（株）の“ランダム”ｐ（ｄＮ）６
の如きものを用いてｃＤＮＡを合成する。該ｃＤＮＡ
を合成するに際して逆転写酵素を使用する。 【００１８】逆転写酵素としては一般市販のものが使用
でき、特定の制限はないが、ＡＭＶ（エイビアン・ミエ
ロブラストシ・ウイルス）の逆転写酵素、ＲＳＶ（ラウ
ス・サルコーマ・ウイルス）の逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ
（モロニー・ミュリーン・リュウケミア・ウイルス）の
逆転写酵素などが使用可能である。このなかでもＭ−Ｍ
ＬＶの逆転写酵素は合成されたｃＤＮＡに対してエンド
ヌクレアーゼ活性がなくかつＲＮａｓｅＨ酵素活性が低
いので好ましく使用される。これらの逆転写酵素は各々
の酵素の供給者の使用能書に従って使用しｃＤＮＡを調
製することができる。ｃＤＮＡを合成する際に使用した
ランダムなＤＮＡオリゴマーの過剰量を必要ならば、一
般に知られたアルコール沈澱やゲル濾過の如き操作によ
り除去する。 【００１９】次にＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡ
の増幅を行う。使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
、あるいは耐熱ＤＮＡポリメラーゼで知られるＴｔｈＤ
ＮＡポリメラーゼまたはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
などを挙げることができる。これらのＤＮＡポリメラー
ゼは夫々供給者の使用能書に従って使用し得る。これら
のＤＮＡポリメラーゼのうち、耐熱ＤＮＡポリメラーゼ
で知られるＴｔｈＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。使用するＴｔｈＤＮＡ
ポリメラーゼは東洋紡製（Ｎｏ．ＴＴＨ−１０３）、Ｔ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼはＰｒｏｍｅｇａ社（例え
ばｎｏ．１０１４２３）、ボクスイ・ブラウン社、ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリー社、宝酒造社などから夫
々販売されているものを使用できる。これらのＤＮＡポ
リメラーゼのうちＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｒｏｍ
ｅｇａ社のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが酵素活性が
高いので一層好ましい。 【００２０】本発明において、ＤＮＡポリメラーゼを用
いてＤＮＡの増幅を行うに際して使用するプライマー核
酸セットとしてオリゴＤＮＡセットを用いる。オリゴＤ
ＮＡセットとしては、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１
４４３６号公報Ｆｉｇ．１８−１からＦｉｇ．１８−２
５の塩基番号−３４１から９０６０中のものおよびこの
相補配列の中から、それぞれ選んだ任意の一組の核酸配
列断片を用いることができる。またＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡｖｏｌ．８７，ｐ．９５２
６〜９５２７のＦｉｇ．２に記載される塩基配列１〜９
４１３中のものおよびこの相補配列の中からそれぞれ選
んだ任意の一組の核酸配列断片を用いることができる。 【００２１】該核酸配列断片の大きさは８塩基以上、好
ましくは１２塩基以上、さらに好ましくは２０塩基以上
である。これらの核酸断片のうち、好ましくは、本願明
細書記載の配列番号２〜５のＤＮＡを組合せた一組の核
酸配列断片を用いることができる。特に、配列番号２お
よび３を組み合わせたセット、配列番号４および５を組
み合わせたセットが好適である。さらに本発明において
は、これらのオリゴＤＮＡのセットの２セット以上の組
合せで核酸増幅反応を実施することは一層核酸の検出を
よくするので好ましい。 【００２２】核酸を増幅させる際に存在させる内部標準
核酸は、分子数が数水準例えば１００ 、１０１ 、１
０２ 、１０３ 、１０４ 、１０５ 個となるように
検体中に加える。内部標準核酸は前記オリゴＤＮＡセッ
トにはさまれる核酸配列を有する核酸断片を使用するこ
とができる。好ましくは配列番号１の核酸配列を有する
断片またはそのプライマー結合部位以外の任意の塩基配
列部分が一部削除されたもの、一部に外来の塩基配列を
挿入されたもの、削除、挿入されたものにおいて、一部
の塩基が他の塩基と置換されたものあるいはこれらを混
合したものを使用することができる。必ずしも両末端に
プライマー結合部位が存在しなくてもよいが、少なくと
も一組のプライマー結合部位を有するものであることが
必要である。 【００２３】配列番号１の核酸配列はＰｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ．８７，ｐ．
９５２６のＦｉｇ．２記載の塩基番号３２〜２５４と類
似した配列であり、一本鎖でも二本鎖でもよい。両末端
がプライマーとして使用する配列番号２および３の塩基
配列となっている。すなわち、配列番号２は配列番号１
の２２３〜２０２の塩基配列であり、配列番号３は配列
番号１の１〜１９の塩基配列である。また配列番号５は
配列番号１の２０〜３９の配列と一致している。配列番
号４は配列番号１の１６４〜１４５の塩基配列である。 【００２４】検出は増幅させたＤＮＡをアガロースゲル
電気泳動し、次いでエチジウムブロマイドにて染色した
ものをＵＶ照射して発色せしめ特定核酸バンドを検出す
る。ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動・エチジウムブロ
マイドによる染色・ＵＶ照射による発色・特定核酸バン
ドの検出の操作は当業界一般公知の方法で実施できる。 【００２５】特定ＤＮＡバンドが発色で見られないとき
は、再度核酸の増幅を行うか、あるいは特定の化合物に
て標識された既知のＨＣＶの増幅核酸のサザーンハイブ
リダイゼーションを行う。再度の核酸増幅は、前記１回
目の核酸増幅で得られた水溶液の一部（例えば１／５〜
１／２０）に対してプライマーとしてのオリゴＤＮＡは
１回目増幅で使用したと同じオリゴＤＮＡセットまたは
該オリゴＤＮＡのそれぞれ３′側下流に位置するオリゴ
ＤＮＡを使用できる。 【００２６】サザーンハイブリダイゼーションを行って
検出する場合、使用するプローブ核酸としてはジゴキシ
ゲニンあるいはビオチンにて標識されたＨＣＶの増幅核
酸を用いる。ここで用いるプローブ用核酸はさきに記載
したと同様の方法でも調製できるが、検出しようとする
ＤＮＡと同じ領域内の塩基配列であって１５塩基以上で
あればよく、供給者の使用マニュアルに従って行うこと
ができる。 【００２７】本発明によれば、Ｃ型肝炎ウイルス関連核
酸を配列番号１の核酸の改変体の存在下で核酸を増幅す
るＣ型肝炎ウイルス関連核酸の定量方法が提供される。 該核酸の改変体としては、配列番号１の両末端のプライ
マー結合部位以外の部位が一部削除されたもの、一部外
来のＤＮＡを挿入または付加したもの、削除、挿入、付
加されたものが一部他の塩基と置換されたものを使用す
ることができる。増幅はプライマー核酸セットとして配
列番号２〜５のオリゴＤＮＡを用い、ＤＮＡポリメラー
ゼにより増幅させることが好適である。 【００２８】 【実施例】以下実施例を挙げて更に具体的に述べるが、
本発明はこれらの実施例に限るものではない。 参考例１〔内部標準核酸溶液（Ｉ）の調製〕米国オーソ
社製ＨＣＶ抗体（ＥＬＩＳＡ）テストシステムで抗体陽
性者の血清５０μｌにグアニジンチオシアネート水溶液
（５Ｍグアニジンチオシアネート／２５ｍＭクエン酸ナ
トリウム／０．５％サルコシル／０．２Ｍβ−メルカプ
トエタノール）２００μｌを添加し、３７℃・３０分間
・１００ｒｐｍで振とう後、フェノール／クロロフォル
ム（４／１）混合液４００μｌで３回抽出した。この水
相に１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）
、１μｇグリコーゲン、２．５倍容のエタノールを添加
し、−８０℃・３０分間保持後、遠心して得られたペレ
ットを７０％エタノール、次いで１００％エタノールで
洗浄後、核酸を得、これを２０μｌＴＥ〔１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ７．５）］水
溶液に溶解した。 【００２９】このようにして得られた核酸のＴＥ溶液１
０μｌに対して ５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．
３）／７５ｍＭ ＫＣｌ／１０ｍＭジチオスレイトール
／５ｍＭ ＭｇＣｌ２／４ｍＭリン酸ナトリウム／１ｍ
ＭｄＮＴＰｓ（Ｎ＝Ａ、Ｃ 、Ｇ 、Ｔ）／１．６μｇ
ランダムプライマー（ベーリンガー・マンハイム社製
ｎｏ１０３４７３１）、０．２ｕ／ μｌ ＡＭＶ 逆
転写酵素（総量２０μｌ）となるように各成分を加え、
４２℃で１時間ｃＤＮＡの合成反応を行った。 【００３０】このようにして得られたｃＤＮＡ溶液に対
して耐熱ＤＮＡポリメラーゼ反応溶液（０．５Ｍ ＫＣ
ｌ、０．１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２
、０．１ ％ゼラチン、０．１ ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００ の水溶液）５μｌ、滅菌水２９μｌ、ｄＮＴ
Ｐｓミクスチャー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＴＴＰ各々の１．２５ｍＭ溶液） の８μｌ、配列番号
２および配列番号３の各ＤＮＡ水溶液（濃度０．１μｇ
／μｌ）を各々２．５μｌ、さらにＴａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ｎｏ１０１４２３）１
．２５ユニット、さらに流動パラフィン５０μｌを加え
、９５℃で１分間、次いで５７℃・２分間、次いで７２
℃・３分間、さらにこの３段階の温度・時間変化の操作
を３０回繰り返し、最後に７２℃・７分間ポリメラーゼ
反応を行った。 【００３１】この反応溶液２０μｌを４％アガロースゲ
ル上で電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、Ｕ
Ｖ照射し大きさ約２２０ｂｐのＤＮＡバンド部分のゲル
を切り出した。このゲルに蒸留水５００μｌおよびフェ
ノール／クロロフォルム（４／１）混合溶液４００μｌ
を加え、−８０℃・３０分間放置、次いで３７℃・２０
分間激しく振とう後、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心
して水相を得た。この水相に対して常法通りフェノール
／クロロフォルム（４／１）混合溶液抽出、次いでエタ
ノール沈澱を行いＤＮＡを得た。 【００３２】このＤＮＡを供給者の使用能書に従い、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製２０４０Ｂ）およびｄ
ＮＴＰｓミクスチャー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
、ｄＴＴＰ） を用いてＤＮＡの末端を平滑末端化処理
し、さらに供給者の使用能書に従い、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（宝酒造製Ｎｏ．２０２１Ｂ） を用いて
５′末端をリン酸化した。次に常法通りフェノール／ク
ロロフォルム（４／１）混合溶液抽出、次いでエタノー
ル沈澱を行いＤＮＡを得た。次にこのＤＮＡを制限酵素
ＲｓａＩ（宝酒造Ｎｏ．１１１６Ｂ）およびＳｍａＩ（
宝酒造Ｎｏ．１０８５Ｂ） にて供給者の能書に従い完
全分解し、以下常法通りフェノール／クロロフォルム（
４／１）混合溶液抽出、次いでエタノール沈澱を行い、
得られたＤＮＡをＴＥ水溶液２０μｌに溶解しＤＮＡ溶
液（１）を得た。 【００３３】一方、大腸菌ベクタープラスミッドＤＮＡ
ｐＵＣ１８の０．１５μｇを制限酵素ＳｍａＩにて
完全分解し、次いでアルカリホスファターゼ（宝酒造製
Ｎｏ．２１２０Ｂ） にて常法に従い脱リン酸処理を行
い、以下常法通りフェノール／クロロフォルム（４／１
）混合溶液抽出、次いでエタノール沈澱を行い、得られ
たＤＮＡをＴＥ水溶液１０μｌに溶解しＤＮＡ溶液（２
）を得た。 【００３４】ＤＮＡ溶液（１）の３μｌおよびＤＮＡ溶
液（２）の１μｌをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製Ｎｏ
．２０１１Ｂ） にて供給者の能書に従って結合して全
反応量２０μｌの８μｌを大腸菌ＨＢ１０１株のコンピ
テントセル（宝酒造製Ｎｏ．９０５１）１００μｌに添
加し、供給者の使用能書に従って形質転換を行い得られ
たアンピシリン耐性株数百個から組み換えプラスミッド
ＤＮＡ１５株を“ミニプレパレーション”で知られる常
法に従い分離した。 【００３５】得られた各組み換えプラスミッドＤＮＡ溶
液１μｌに対して耐熱ＤＮＡポリメラーゼ反応溶液（０
．５Ｍ ＫＣｌ、０．１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、１５ｍＭ
ＭｇＣｌ２、０．１ ％ゼラチン、０．１％Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００の水溶液） １０μｌ、滅菌水５６μ
ｌ、ｄＮＴＰｓミクスチャー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＴＴＰ各々の１．２５ｍＭ溶液） の１６μ
ｌ、配列番号２および配列番号３の各ＤＮＡ水溶液（濃
度０．１μｇ／μｌ）を各々８μｌ、さらにＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ｎｏ１０１４
２３）１ユニット、さらに流動パラフィン５０μｌを加
え、９５℃・１分間、次いで５７℃・２分間、次いで７
２℃・３分間、さらにこの３段階の温度・時間変化の操
作を３０回繰り返し、最後に７２℃・７分間ポリメラー
ゼ反応を行った。この反応溶液４μｌを４％アガロース
ゲル上で電気泳動しエチジウムブロマイドで染色後、Ｕ
Ｖ照射し大きさ約１９０ｂｐのＤＮＡバンドを示す株ｐ
ＵＨＣ１０１を得た。この約１９０ｂｐのＤＮＡは配列
表１番の８８位〜１２１位の核酸３４ケが削除されたも
のである。 【００３６】この大きさ約１９０ｂｐの増幅ＤＮＡ溶液
９６μｌを４％のアガロースゲル電気泳動し大きさ約１
９０ｂｐのＤＮＡバンド部分のゲルを切取り、前記ゲル
からのＤＮＡの抽出精製法と同様にして蒸留水およびフ
ェノール／クロロフォルム（４／１）混合溶液で−８０
℃・３０分間放置、次いで３７℃・２０分間激しく振と
う後、１２，０００ｒｐｍ・５分間遠心して水相を得、
この水相に対してフェノール／クロロフォルム（４／１
）混合溶液抽出、次いでエタノール沈澱を行いＤＮＡを
得た。このＤＮＡのＴＥ溶液を内径約１０ｍｍのカラム
にてＤＥＡＥセファクリルＡ−２５（０．５ＭＮａＣｌ
／１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌにて予め平衡化）の約４ｍｌ
に吸着せしめ、０．５ＭＮａＣｌ／１０ｍＭＴｒｉｓＨ
Ｃｌ水溶液３０ｍｌにて洗浄後、２ＭＮａＣｌ／１０ｍ
ＭＴｒｉｓＨＣｌ水溶液にてＤＮＡを溶出し、次いで得
られた溶出液に２．５倍量のエタノールにてエタノール
沈澱を行いＤＮＡを得た。 【００３７】このＤＮＡを蒸留水１００μｌに溶解し光
学吸光度Ａ２６０の測定によりＤＮＡ濃度（２０μｇ／
ｍｌ）とわかった。このＤＮＡ溶液の１０５ 倍、１０
６ 倍、１０７ 倍、１０８ 倍、１０９ 倍、１０１
０倍、１０１１倍、１０１２倍の各々の希釈溶液を夫々
内部標準核酸溶液Ｉ−７、Ｉ−６、Ｉ−５、Ｉ−４、Ｉ
−３、Ｉ−２、Ｉ−１、Ｉ−０とする。 【００３８】（ＰＣＲ）これらの１μｌに対して耐熱Ｄ
ＮＡポリメラーゼ反応溶液（０．５Ｍ ＫＣｌ、０．１
Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１
％ゼラチン、０．１ ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の水
溶液） ２．５μｌ、滅菌水１３μｌ、ｄＮＴＰミクス
チャー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各々
の１．２５ｍＭ溶液） の４μｌ、アプライドバイオシ
ステムズ社製ＤＮＡシンセサイザーモデル３８０Ａで合
成した配列番号２のＤＮＡ水溶液（濃度０．１μｇ／μ
ｌ）および同様に合成した配列番号３のＤＮＡの水溶液
（濃度０．１μｇ／μｌ）を各々１．２５μｌ、さらに
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ｎ
ｏ１０１４２３）０．５ユニットを加え、さらに流動パ
ラフィン５０μｌを加え、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは始
めに９４℃・４分間前処理し次いで９４℃・３０秒間→
５３℃・３０秒間→７２℃・１分間の３段階の温度・時
間変化の操作を２０回繰り返し、最後に７２℃・７分間
反応を行った。 【００３９】次に、反応溶液１μｌに対して耐熱ＤＮＡ
ポリメラーゼ反応溶液（０．５Ｍ ＫＣｌ、０．１Ｍ
ＴｒｉｓＨＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ ％ゼ
ラチン、０．１ ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の水溶液
） ２．５μｌ、滅菌水１４μｌ、ｄＮＴＰｓミクスチ
ャー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各々の
１．２５ｍＭ溶液） の４μｌ、配列番号４のＤＮＡ水
溶液（濃度０．１μｇ／μｌ）および配列番号５のＤＮ
Ａの水溶液（濃度０．１μｇ／μｌ）を各々１．２５μ
ｌ、さらにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ社製ｎｏ１０１４２３）０．５ユニットを加え、さ
らに流動パラフィン５０μｌを加え、二段目のＰＣＲを
行った。始めに９４℃・２分間前処理し、次いで９４℃
・３０秒間→５０℃・３０秒間→７２℃・１分間の３段
階の温度・時間変化の操作を３０回繰り返し、最後に７
２℃・７分間反応を行った。 【００４０】第二段階ＰＣＲを行った８本の反応溶液５
μｌを４％アガロースゲル上で電気泳動しエチジウムブ
ロマイドで染色後、ＵＶ照射し、増幅したＤＮＡをバン
ドとして観察し図１が得られた。 【００４１】図１から内部標準核酸溶液Ｉ−０（レーン
１）およびＩ−１（レーン２）についてはＤＮＡの増幅
が全く見られず、内部標準核酸溶液Ｉ−２（レーン３）
で始めて大きさ約１１１ｂｐのＤＮＡが増幅しているこ
とがわかる。このことから内部標準核酸溶液Ｉ−１〜Ｉ
−７の中の標準核酸の分子数は夫々１００ 、１０１
、１０２ 、１０３ 、１０４ 、１０５ 、１０６
ケのオーダーと考えられる。図１中、レーン１〜８は内
部標準核酸溶液Ｉ−０〜Ｉ−７の各１μｌをＰＣＲした
もので、レーン９はＤＮＡサイズマーカー（φＸ１７４
複製型ＤＮＡのＨａｅＩＩＩ 分解物）である。 【００４２】実施例１ 〔患者（１）の検体からの核酸抽出およびｃＤＮＡ化〕
非Ａ非Ｂ型慢性肝炎の患者（１）の血清１００μｌにグ
アニジンチオシアネート水溶液（５Ｍグアニジンチオシ
アネート／２５ｍＭクエン酸ナトリウム／０．５％サル
コシル／０．２Ｍβ−メルカプトエタノール）２００μ
ｌを添加し、３７℃・３０分間・１００ｒｐｍで振とう
後、フェノール／クロロフォルム（４／１）混合液４０
０μｌで３回抽出した。この水相に１０分の１容の３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）、１μｇのグリコーゲン
、２．５倍容のエタノールを添加し、−８０℃・３０分
間保持後、遠心して得られたペレットを７０％エタノー
ル、次いで１００％エタノールで洗浄後、核酸を得た。 【００４３】この核酸に対して５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣ
ｌ（ｐＨ８．３）／７５ｍＭ ＫＣｌ／１０ｍＭ ジチ
オスレイトール／５ｍＭ ＭｇＣｌ２／４ｍＭリン酸ナ
トリウム／１ｍＭ ｄＮＴＰｓ（Ｎ＝Ａ、Ｃ 、Ｇ 、
Ｔ）／１．６μｇ ランダムプライマー（ ベーリンガ
ー・マンハイム社製ｎｏ１０３４７３１）、０．２ ｕ
／ μｌ ＡＭＶ 逆転写酵素（総量２０μｌ）となる
ように各成分を加え、４２℃で１時間ｃＤＮＡの合成反
応を行った。 【００４４】（ＰＣＲ）得られたｃＤＮＡ溶液１μｌに
対して耐熱ＤＮＡポリメラーゼ反応溶液（０．５ＭＫＣ
ｌ、０．１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２
、０．１ ％ゼラチン、０．１ ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００の水溶液） ２．５μｌ、滅菌水１３μｌ、ｄＮ
ＴＰｓミクスチャー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、
ｄＴＴＰ各々の１．２５ｍＭ溶液） の４μｌ、配列番
号２のＤＮＡ水溶液（濃度０．１μｇ／μｌ）および配
列番号３のＤＮＡの水溶液（濃度０．１μｇ／μｌ）を
各々１．２５μｌ、さらにＴａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ｎｏ１０１４２３）０．５ユニ
ットを加え、さらに流動パラフィン５０μｌを加えた。 【００４５】このようなＰＣＲ反応溶液６本の各々に、
内部標準核酸溶液Ｉ−２〜Ｉ−７の各々１μｌを添加し
てＰＣＲを行った。ＰＣＲは始めに９４℃・４分間前処
理し、次いで９４℃・３０秒間→５３℃・３０秒間→７
２℃・１分間の３段階の温度・時間変化の操作を２０回
繰り返し、最後に７２℃・７分間反応を行った。 【００４６】次に、反応溶液０．５μｌに対して耐熱Ｄ
ＮＡポリメラーゼ反応溶液（０．５Ｍ ＫＣｌ、０．１
Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１
％ゼラチン、０．１ ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の水
溶液） ２．５μｌ、滅菌水１４μｌ、ｄＮＴＰｓミク
スチャー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各
々の１．２５ｍＭ溶液） の４μｌ、配列番号４のＤＮ
Ａ水溶液（濃度０．１μｇ／μｌ）および配列番号５の
ＤＮＡの水溶液（濃度０．１μｇ／μｌ）を各々１．２
５μｌ、さらにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ社製ｎｏ１０１４２３）０．５ユニットを加え
、さらに流動パラフィン５０μｌを加え、二段目のＰＣ
Ｒを行った。始めに９４℃・２分間前処理し、次いで９
４℃・３０秒間→５０℃・３０秒間→７２℃・１分間の
３段階の温度・時間変化の操作を３０回繰り返し、最後
に７２℃・７分間反応を行った。 【００４７】６本の二段階ＰＣＲを行った反応溶液５μ
ｌを４％アガロースゲル上で電気泳動しエチジウムブロ
マイドで染色後、ＵＶ照射し増幅したＤＮＡをバンドと
して観察し図２が得られた。 【００４８】図２中、レーン１は患者（１）の血清ｃＤ
ＮＡに内部標準核酸溶液Ｉ−２を添加したものの電気泳
動により得られたバンドである。レーン２〜６は患者（
１）の血清ｃＤＮＡに内部標準核酸溶液Ｉ−３〜Ｉ−７
を夫々添加したもののバンドである。レーン７はＤＮＡ
サイズマーカー（φＸ１７４複製型ＤＮＡのＨａｅＩＩ
Ｉ 分解物）の電気泳動によるバンドを示す。 【００４９】図２から、レーン２にて内部標準核酸（大
きさ１１１ｂｐ）のＤＮＡの増幅がみられ始め、レーン
３で１４５ｂｐのＤＮＡとほぼ同じ程度の増幅を示し、
レーン４以降では内部標準核酸のＤＮＡのみ増幅してい
ることがわかった。このことから本実施例１にて使用し
た患者（１）の血清から抽出した核酸のｃＤＮＡ溶液１
μｌには内部標準核酸液Ｉ−４と同じオーダーのＨＣＶ
核酸が存在するといえる。すなわち患者（１）の血清１
００μｌ中に存在するＨＣＶ核酸は２×１０４ ケのオ
ーダーといえる。 【００５０】実施例２〜４ 〔患者（２〜４）の検体からの核酸抽出およびｃＤＮＡ
化〕非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者（２）、（３）、（４）の
各々の血清１００μｌから実施例１の場合と同様にｃＤ
ＮＡを調製した。 【００５１】〔ＰＣＲ〕得られたｃＤＮＡ溶液１μｌに
対して実施例１と全く同様にして第一段階のＰＣＲを実
施し、さらに第二段階のＰＣＲも実施例１と全く同様に
実施した。第二段階ＰＣＲを行った反応溶液５μｌを４
％アガロースゲル上で電気泳動しエチジウムブロマイド
で染色後、ＵＶ照射し増幅したＤＮＡをバンドとして観
察し図３〜５が得られた。 【００５２】図３は実施例２（患者２）の核酸定量結果
を示すものであり、図３において、レーン１は患者（２
）の血清ｃＤＮＡに内部標準核酸液Ｉ−２を添加したも
の、レーン２〜６は患者（２）の血清ｃＤＮＡに夫々内
部標準核酸液Ｉ−３〜Ｉ−７を添加したもの、レーン７
はＤＮＡサイズマーカー（φＸ１７４複製型ＤＮＡのＨ
ａｅＩＩＩ 分解物）である。 【００５３】図３から、レーン２にて内部標準核酸（大
きさ１１１ｂｐ）のＤＮＡの増幅が見られ始め、レーン
３で１４５ｂｐのＤＮＡとほぼ同じ程度の増幅を示し、
レーン４以降では内部標準核酸のＤＮＡのみ増幅してい
ることがわかった。このことから本実施例２にて使用し
た患者（２）の血清から抽出した核酸のｃＤＮＡ溶液１
μｌには内部標準核酸液Ｉ−４と同じオーダーのＨＣＶ
核酸が存在するといえる。すなわち本患者（２）の血清
１００μｌ中に存在するＨＣＶ核酸は２×１０４ ケの
オーダーといえる。 【００５４】図４は実施例３（患者３）の核酸定量結果
を示すものであり、図４において、レーン１は患者（３
）の血清ｃＤＮＡに内部標準核酸液Ｉ−２を添加したも
の、レーン２〜６は患者（３）の血清ｃＤＮＡに夫々内
部標準核酸液Ｉ−３〜Ｉ−７を添加したもの、レーン７
はＤＮＡサイズマーカー（φＸ１７４複製型ＤＮＡのＨ
ａｅＩＩＩ 分解物）である。 【００５５】図４から、レーン２にて内部標準核酸（大
きさ１１１ｂｐ）のＤＮＡの増幅が見られ始め、レーン
３で１４５ｂｐのＤＮＡとほぼ同じ程度の増幅を示し、
レーン４以降では内部標準核酸のＤＮＡのみ増幅してい
ることがわかった。このことから本実施例３にて使用し
た患者（３）の血清から抽出した核酸のｃＤＮＡ溶液１
μｌには内部標準核酸液Ｉ−４と同じオーダーのＨＣＶ
核酸が存在するといえる。すなわち本患者（３）の血清
１００μｌ中に存在するＨＣＶ核酸は２×１０４ ケの
オーダーといえる。 【００５６】図５は実施例４（患者４）の核酸定量結果
を示すものであり、図５において、レーン１は患者（４
）の血清ｃＤＮＡに内部標準核酸液Ｉ−２を添加したも
の、レーン２〜６は患者（４）の血清ｃＤＮＡに夫々内
部標準核酸液Ｉ−３〜Ｉ−７を添加したもの、レーン７
はＤＮＡサイズマーカー（φＸ１７４複製型ＤＮＡのＨ
ａｅＩＩＩ 分解物）である。 【００５７】図５から、レーン１にて内部標準核酸（大
きさ１１１ｂｐ）のＤＮＡの増幅が見られ始め、レーン
２で１４５ｂｐのＤＮＡとほぼ同じ程度の増幅を示し、
レーン３以降では内部標準核酸のＤＮＡのみ増幅してい
ることがわかった。このことから本実施例４にて使用し
た患者（４）の血清から抽出した核酸のｃＤＮＡ溶液１
μｌには内部標準核酸液Ｉ−３と同じオーダーのＨＣＶ
核酸が存在するといえる。すなわち本患者（４）の血清
１００μｌ中に存在するＨＣＶ核酸は２×１０３ ケの
オーダーといえる。 【００５８】 【発明の効果】本発明によれば、核酸の定量的な検出が
可能となる。本発明の方法は肝炎ウイルス関連核酸、特
にＣ型肝炎ウイルス関連核酸の定量に有効である。 【００５９】 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡ ＡＣＴＡＣＴＧＴＣＴ ＴＣＡ
ＣＧＣＡＧＡＡ ＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣ ＣＡＴＧＧＣ
ＧＴＴＡ ＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴ ６０ ＧＧＡ
ＣＡＣＴＣＣＴ ＴＧＡＴＧＡＣＡＧＡ ＡＧＴＧＣＧ
ＴＣＴＴ ＴＣＧＣＡＧＡＴＣＧ ＧＴＡＣＣＧＣＡＡ
Ｔ ＣＡＴＡＣＴＣＡＣＡ ＣＧＴＧＣＡＧＣＣＴ Ｃ
ＣＡＧＧＡＣＣＣＣ ＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧ ＡＧＡＧ
ＣＣＡＴＡＧ ＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧ ＡＡＣＣＧＧＴ
ＧＡＧ １２０ＧＣＡＣＧＴＣＧＧＡ ＧＧＴＣＣ
ＴＧＧＧＧ ＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣ ＴＣＴＣＧＧＴＡ
ＴＣ ＡＣＣＡＧＡＣＧＣＣ ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣ
ＴＡＣＡＣＣＧＧＡＡ ＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣ ＧＡＣ
ＣＧＧＧＴＣＣ ＴＴＴＣＴＴＧＧＡＴ ＡＡＡＣＣＣ
ＧＣＴＣ ＡＡＴＧＣＣＴＧＧＡ １８０ＡＴＧＴ
ＧＧＣＣＴＴ ＡＡＣＧＧＴＣＣＴＧ ＣＴＧＧＣＣＣ
ＡＧＧ ＡＡＡＧＡＡＣＣＴＡ ＴＴＴＧＧＧＣＧＡＧ
ＴＴＡＣＧＧＡＣＣＴ ＧＡＴＴＴＧＧＧＣＧ ＣＧ
ＣＣＣＣＣＧＣＡ ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧ ＣＣＧＡＧ
ＴＡＧＴＧ ＴＴＧ
２２３ＣＴＡＡＡＣＣＣＧＣ ＧＣＧＧＧＧ
ＧＣＧＴ ＴＣＴＧＡＣＧＡＴＣ ＧＧＣＴＣＡＴＣＡ
Ｃ ＡＡＣ 【００６０】配列番号：２ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＣＡＡＣＡＣＴＡＣＴ ＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧ ＴＣ
２２【００６１】配列番号：３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡ ＡＣＴＡＣＴＧＴＣ
１９【００６２】配列番号
：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＧＴＴＴＡＴＣＣＡＡ ＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣ
２０【００６３】配列番号
：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡ ＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ
２０
【図１】内部標準核酸溶液の増幅結果を示したものであ
る。
る。
【図２】実施例１（患者１）の核酸定量結果を示したも
のである。
のである。
【図３】実施例２（患者２）の核酸定量結果を示したも
のである。
のである。
【図４】実施例３（患者３）の核酸定量結果を示したも
のである。
のである。
【図５】実施例４（患者４）の核酸定量結果を示したも
のである。
のである。
Claims (4)
- 【請求項１】 核酸を内部標準核酸の存在下で増幅す
ることからなる核酸の定量方法。 - 【請求項２】 増幅をポリメラーゼおよびプライマー
核酸セットを用いて行う請求項１記載の核酸の定量方法
。 - 【請求項３】 核酸が肝炎ウイルス関連核酸である請
求項１記載の核酸の定量方法。 - 【請求項４】 内部標準核酸が、検出対象となる核酸
と共通のプライマー核酸結合部位を有し、検出対象とな
る核酸の増幅される部位と内部標準核酸の増幅部位が分
子量の違いによって区別されうるものである請求項１記
載の核酸の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8597291A JPH04300000A (ja) | 1991-03-27 | 1991-03-27 | 核酸の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8597291A JPH04300000A (ja) | 1991-03-27 | 1991-03-27 | 核酸の定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04300000A true JPH04300000A (ja) | 1992-10-23 |
Family
ID=13873643
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8597291A Pending JPH04300000A (ja) | 1991-03-27 | 1991-03-27 | 核酸の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04300000A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002083948A1 (en) * | 2001-04-12 | 2002-10-24 | Biocore Co., Ltd. | Oligonucleotide chip composition for analyzing hepatitis c virus (hcv) genotype and detecting method thereof |
| JP2008247913A (ja) * | 1995-05-08 | 2008-10-16 | Immuno Ag | １以上の血漿誘導体を含む、品質保証された薬物 |
| WO2019103122A1 (en) * | 2017-11-24 | 2019-05-31 | Ricoh Company, Ltd. | Detection determining method, detection determining device, detection determining program, and device |
| JP2019092505A (ja) * | 2017-11-24 | 2019-06-20 | 株式会社リコー | 検出判定方法、検出判定装置、検出判定プログラム、及びデバイス |
-
1991
- 1991-03-27 JP JP8597291A patent/JPH04300000A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PROC NATL ACAD SCI=1990US * |
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| US7179600B2 (en) | 2001-04-12 | 2007-02-20 | Biocore Co., Ltd. | Oligonucleotide chip composition and a method for analyzing a hepatitis C virus genotype using the composition |
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