JP3727667B2

JP3727667B2 - 血液試料中の核酸の増幅および検出

Info

Publication number: JP3727667B2
Application number: JP22539593A
Authority: JP
Inventors: ブルクハルトジャン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1992-09-11
Filing date: 1993-09-10
Publication date: 2005-12-14
Anticipated expiration: 2020-12-14
Also published as: DE69332852D1; CA2105944C; ES2194843T3; EP0590327A3; US5501963A; EP0590327B1; DE69332852T2; CA2105944A1; JPH06277062A; DK0590327T3; EP0590327A2

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、核酸の同定および血液試料からの核酸の増幅に関する。
本発明の主題は、或る塩濃度を有する酵素的増幅方法による血液試料からの核酸配列、ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅方法である。この方法は、他の方法では増幅すべき核酸配列を予備精製することが必要な血液試料の準備を全く行わず、且つ増幅方法に用いる反応混合物中の試料の比率が５容量％以上、好ましくは10容量％以上であることを特徴とする。
【０００２】
【従来の技術】
生物学的研究や更に特別には診断医学において、核酸の同定および特徴付けの必要性が継続的に高まってきている。「核酸」とは、この場合、天然に存在する形であるかまたは実質的に任意の配列と長さの現代化学および生物学合成法により製造することができるようなデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）とリボース核酸（ＲＮＡ）であると解釈すべきである。
【０００３】
分子生物学において血液から核酸を調製するのに使われている従来の方法は複雑であり、遠心、試料のフェノール／クロロホルム抽出または有機溶媒を使った核酸の沈澱といった段階を含み、これらは実質的消費を伴わない迅速で且つ潜在的に自動化可能である核酸の酵素的増幅には無駄である。そのような方法の最近の編集物は、V.N. Loparevら、J. Vir. Methods 34, 105-112 (1991)による「感染物質を同定するための全血または細胞系からの効率的で且つ単純なＤＮＡ抽出法（An efficient and simple method of DNA extraction from whole blood and cell-lines to identify infectious agents）」およびP.S. Walshら、BioTechniques 10(4), 506-513 (1991) による「法医学的材料からのＰＣＲ型決定用ＤＮＡの単純な抽出のための媒質としてのChelex 100（Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material ）」中に見つかる。
【０００４】
全血は反応混合物中に非常に少量、即ち１容量％で存在する時であっても、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を阻害することが報告されており、この理由はホルフィリン環から成るヘム誘導体であると考えられている（R. Higuchi, PCR Technology, H. Ehrlich編, Stochton Oress 1989,「ＰＣＲ用の試料の単純且つ迅速な調製（Simple and rapid preparation of samples for PCR ）」の章、31〜38頁）。
【０００５】
Higuchi （前掲）によれば、ＰＣＲ用の血液試料の細胞ＤＮＡを調製する方法は、フィコール勾配を使って単核血液細胞（ＭＣ）を単離しまたは赤血球の溶解後に遠心により白血球を単離し、そしてＭＣをプロテイナーゼＫと共にインキュベートすることである。消化後にプロテイナーゼＫを95℃で不活性化し、試料のアリコートをＰＣＲに使用する。
【０００６】
Mercier らは、新鮮な血液または凍結した血液からの染色体ＤＮＡの種々の断片をＰＣＲ反応混合物中１〜２容量％の濃度でＰＣＲ増幅することを記載している〔Nucleic Acids Research 18, 5908 (1990)〕。この方法では、血液試料を含む増幅溶液（Taq ポリメラーゼは含まない）を３分間繰り返し95℃と55℃にした。この段階はその後の増幅を促進した。
【０００７】
Panaccioら〔Nucleic Acids Research 19, 1151 (1991) 〕は、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）からの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使った全血からのＤＮＡの増幅を記載している。彼らは、100 μl の反応混合物中４μl の血液（４容量％）からのＤＮＡはまだ増幅可能であるが、１容量％ほどの少ない血液はテルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus ）（Taq ）からのＤＮＡポリメラーゼを使った増幅を完全に阻害することを示している。
【０００８】
Beutler ら〔BioTechniques 9 , 166 (1990)〕は、血液試料からのＤＮＡのＰＣＲにおける抗凝固剤の効果を詳細に記載している。核酸抽出物を使ってヘパリン血液から濃縮されたＤＮＡでさえも増幅することが不可能であった。この方法で単離したＤＮＡを使ったＰＣＲを促進するＤＮＡの精製方法（ヘパリナーゼIIでのＤＮＡの処理を含む）が記載されている。EDTA血液から単離したＤＮＡを使っても何ら問題なかった。
【０００９】
Israeli ら〔Nucleic Acids Research 19, 6501 (1991) 〕は、ＲＮＡからｃＤＮＡへの変換後の抽出によるヘパリン処理全血から単離されたＲＮＡのＰＣＲによる増幅を記載している。彼らは、ＰＣＲを実施する際の難点がヘパリンによるものであったことを証明している。単離したＲＮＡをｃＤＮＡに翻訳する前にヘパリナーゼで処理した時にのみ、ＰＣＲが成功した。
【００１０】
Franchisら〔Nucleic Acids Research 16, 10355 (1988)〕もまた、ヒト血液から単離したゲノムＤＮＡ試料を増幅する時にTaq ポリメラーゼを使ったＰＣＲ方法の阻害を記載している。文献中では詳しく同定されなかった阻害剤は、該ＤＮＡを煮沸および濾過することにより除去することができた。
【００１１】
Ravaggi ら〔PCR Methods and Applications 4, 291-292 (1992) 〕は、ＰＣＲを使ったヒト血清からのＨＣＶＲＮＡの増幅を記載している。予備精製を行わずに逆転写酵素を使って直接該ＲＮＡを血清からｃＤＮＡに翻訳した。次いで約３容量％のＤＮＡを含むアリコートをＰＣＲ混合物に導入した。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の１つの目的は、核酸の酵素的増幅方法、例えばＰＣＲ、特に血液を抗凝固剤で処理した時のＰＣＲにおいて増加量の血液を直接使用するために、従来の技術の項目に記載した難点を克服することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の主題は、酵素的増幅方法による血液試料からの核酸配列、ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅方法であって、増幅反応混合物中の５容量％以上である血液試料を、前記増幅を実施する条件下で前記増幅を実施するのに必要な試薬にさらすことを含んで成り、前記増幅試薬が少なくとも１つの塩を含んで成る方法である。この方法は、血液試料を増幅前に処理して標的核酸配列を単離または精製する必要がないという点で有利である。増幅反応混合物中の試料の量は５容量％以上、好ましくは10容量％以上である。
【００１４】
本発明は、血液から例えばヒトの遺伝子配列を決定するため、および細菌由来の核酸、ＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスまたは真核生物の核酸を含む血液中の微生物の外来核酸を同定するためにも用いることができる。本発明の方法は、血液試料中の少量の感染性微生物の検出に特に有用である。
【００１５】
【具体的説明】
本明細書中の「血液試料」なる用語は、その起源を血液から誘導することができる任意の種類の試料を意味すると解釈すべきである。それは例えば、液状の血液、例えば全成分を有する新鮮な全血、または血漿であることができる。この用語は、例えば血痕中に存在するような乾燥血液、凝固した血液もしくはそこから得られた血清、およびR. Ramanujanら〔Clin. Chem. 39, 737 (1993)〕により記載されたようなガラス化により安定化された血液をも包含する。
【００１６】
天然形態の血液は液体成分、いわゆる血漿と、血球成分、即ち血液細胞（赤血球、白血球、血小板等）とから成る。血漿は遠心後に残る抗凝固血液の部分である。それはアルブミンに加えて凝固剤と血漿タンパク質、糖、ミネラルおよび他の代謝産物を含有する透明な淡黄色液体である。血清は、凝固後に遠心分離によって得ることができ、もはやフィブリノーゲンのような凝固因子を含まない血液の液体部分である。
【００１７】
成人の全血は、白血球を無視すれば、141.7 〜148.8 mMのナトリウムとカリウムを有する血漿55％と90.4〜106 mMのナトリウムとカリウムを有する赤血球45％とから成る。ナトリウムとカリウムの平均値は約124 mMである（Documenta Geigy 1973, 560-564 頁）。
【００１８】
本明細書中で使用する「一価イオン」なる用語は、単一の正電荷を有する血液中に存在するイオンのみ、すなわち主としてNa⁺およびＫ⁺を意味する。塩化物含有物は無視される。対応して、「二価イオン」なる用語は、２つの正電荷を有するイオン、即ち主にMg²⁺およびCa²⁺を意味する。
【００１９】
新鮮な血液は典型的には早期凝固を防止するために抗凝固剤で処理される。最もよく知られている抗凝固剤はヘパリン、クエン酸塩およびエチレンジアミン四酢酸の塩（この塩は以後EDTAと略記される）である。
【００２０】
或る血液試料収集用試験管の製造業者、例えばSherwood Medicalにより与えられる情報によれば、EDTA、クエン酸塩およびヘパリンは、次のように血液試料に添加される：
EDTAは三カリウム塩として血液に添加される（血液10 ml あたり15％溶液 0.1 ml ）。これは、血液試料に約10 mM の追加カリウム濃度をもたらす。
【００２１】
クエン酸塩は三ナトリウム塩として血液に添加される（通常、血液4.5 mlあたり3.8 ％溶液 0.5 ml ）。これは血液試料に対して約36 mM のナトリウムの追加を与える。
ヘパリンは血液１mlあたり14.3 USP単位の最終濃度でリチウム塩として使用され、これは血液１mlあたり約0.1 mgのヘパリンまたは5 〜15μＭの塩に相当する。
【００２２】
上記に基づくと、典型的な血液試料調製物はほぼ次の最終濃度の一価イオンを有する：(a) EDTA処理血液：135 mM；(b) クエン酸塩処理血液：160 mM；および (c)ヘパリン処理血液：124 mM。抗凝固剤として推奨される塩およびそれらの濃度に関する更なる詳細は、“N.S. Evacuated Tubes for Blood Sample Collection"、第３版(1991)、第11巻、第９号、６頁(NCCLS Document A1-A3)において与えられている。
【００２３】
標的核酸増幅用の反応混合物中の一価イオン（主にカリウムイオンとナトリウムイオン）の最終濃度は、緩衝液、試料の容量、および全血中の抗凝固剤の種類に依存する。抗凝固剤の濃度は種々の製造元によって異なり得るので、一価イオンの濃度についての下記の記載では、血液のみからの塩の量（約124 mM）と、限定された塩濃度を有する溶液の添加から生じる追加の量だけが考慮されることに注意されたい。抗凝固剤からくる一価イオン濃度は無視されるだろう。例えばヘパリンの場合には、この値はとにかく取るに足らない。
【００２４】
本発明の方法によって増幅することができる核酸は、血液細胞中（例えばゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ）、血漿中および血清中に存在することができる。
血漿または血清中では、核酸は細胞自身のＤＮＡであるかまたは細胞溶解により遊離されたＲＮＡであることができ、あるいはまた、細菌またはウイルスにより導入された外来核酸であることができる。或る種のＲＮＡウイルスはＤＮＡを転写せず、その場合にはＲＮＡからＤＮＡへの転写後に最初の増幅を行うことができる。下記の実施例により記載されるように、ＤＮＡ段階のみでまたは新たなＲＮＡ中間体段階を経由して更なる増幅サイクルを行うことができる。
【００２５】
上述したように、他の核酸の混合物を含有する血液試料から特定の核酸を同定することは現在は困難である。非常に多量の異なる配列の存在下で特異的に作用することができる増幅方法を使う時でさえも、或る標的核酸、例えば非反復遺伝子の標的核酸を増幅前に濃縮しなければならない。診断目的では、増幅方法は、所望の核酸配列、例えば合計3.1 ×10⁷個の同じ大きさの別の配列の中に１回だけどのヒト細胞にも存在する長さ100 bpのＤＮＡ断片、のみを選択的に増幅しなければならない（ヒトゲノムは3.1 ×10⁹塩基対または3.4 ×10^-12g のＤＮＡから成る）。
【００２６】
現在では、最も良く知られている酵素的増幅方法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用できるためには、増幅前に試料を予備調製する比較的面倒な工程を実施することが必要である。通常使わなければならないそれらの追加の段階の目的は、核酸の予備精製により血液中の疑わしい阻害剤を除去または中和し、それにより着目の核酸配列の無妨害の増幅を促進することである。増幅すべき標的核酸のための試料調製操作は、試料が細胞、血漿／血清、または全血のいずれに由来するかに従って互いに異なる。
【００２７】
本発明より前には、ＰＣＲ増幅は典型的には多量の血液成分を有する試料中の過剰な塩濃度により阻害された。計算の結果、約124 mMの一価イオンの平均平常濃度を有する血液がTaq ポリメラーゼを使って行われる増幅に悪影響を及ぼすだろうことが示された。50 mM Ｋ⁺の調製反応混合物中の最終濃度を与えるように工夫された（例えば10×緩衝液として）常用のＰＣＲ緩衝液を考慮すると、10容量％の血液含量を有する反応混合物中の一価イオン（Ｋ⁺，Na⁺）の濃度は合計約63 mM であり、そして50容量％の血液含量では既に合計約113 mMである。上述したように、それらの値は試料中に使われた抗凝固剤の塩の寄与を含まない。
【００２８】
他方、ＰＣＲで最もよく使われるポリメラーゼであるテルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）のＤＮＡポリメラーゼ（Taq ポリメラーゼ）は約50 mM KCl あたりに最適な合成を有する（PCR Technology 1989 ; 第２章：Taq ＤＮＡポリメラーゼ、D.H. Gelfand著）。通常のＰＣＲ緩衝液が参考文献中に言及されたKCl 濃度を有するのはこのためである。75 mM KCl より大きい濃度での常用の配列決定反応においてまたは200 mM KClより大きい濃度での10分間取り込みアッセイにおいては、Taq ポリメラーゼの活性が全く検出できない。
【００２９】
驚くべきことに、本発明者らは、合計塩濃度を制御すれば、即ち反応混合物中の合計塩濃度を調整すれば、未処理の血液試料から直接核酸を増幅できることを発見した。高い容量の試料、例えば≧10容量％の血液試料が反応混合物中に存在すると増加量の初期核酸が明らかに利用可能である。血液試料の塩濃度、即ち血液によって増幅反応を行う反応混合物に与えられる一価および二価イオンの塩濃度を知ることによって、反応混合物中の塩濃度を、おそらく適当な濃縮塩溶液の使用により、予め決められた領域に維持しそして使用予定の酵素の必要条件に適合させることができる。周期表の第ＩＡおよび第IIＡ族の元素の塩をこの目的に用いることができ、Na⁺，Ｋ⁺およびMg²⁺が好ましい。
【００３０】
反応混合物全体の中の血液試料の量に依存して、適当な濃縮塩溶液または希釈塩溶液を使って反応混合物中の塩濃度を容易に調節することができる。このことは、反応混合物中の高血液比率が存在すれば、もはや一価の塩が添加されないこと、即ち血液の比率が十分な程高ければ、試料中の一価または二価イオンの塩含量および緩衝能が或る状況下で特異的な増幅を促進するのに十分であり、即ち更なる塩溶液の使用は不要であることを意味する。
【００３１】
塩溶液は、塩の他に、緩衝剤および特定の増幅方法に必要および／または有利な他の成分も含むことができる。それらの成分は、例えば、Tricine （＝Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン〕〕、Tris（＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩）、イオン性または非イオン性界面活性剤、例えばTriton X-100（アルキルフェニルポリエチレングリコール）またはTween （ポリオキシエチレンソルビトールモノラウレート）、および特定の増幅方法に使用する特定の酵素の活性に重要である別の元素（例えばMnまたはCo等）の塩であることができる。
【００３２】
本発明はいずれの酵素に基づいた増幅方法にも適用することができる。多数の酵素的増幅方法が文献中に記載されている。１つの方法は、例えば特にEP-A 320 308またはEP-A 336 731に記載されたようなリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）である。この方法の詳しい説明および用途はWuおよびWallace, Genomics 4, 560-569 (1989) により記載されている。
【００３３】
別の酵素的増幅方法は、それぞれEP-A 310 229およびEP-A 373 960に記載されたような転写経路経由のＴＡＳ法または３ＳＲ法である。他の記載はそれぞれGuatelliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990) およびKwokら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177 (1989) 中に見つかる。それらの方法では、多数の酵素、例えばＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ並びに他の酵素が増幅工程において同時または連続的のいずれかで使われる。
【００３４】
別の増幅方法はＲＮＡバクテリオファージＱβのレプリカーゼの使用に基づいたものである。この方法の操作は、例えばEP-A 361 983またはLizardi ら、TIBTECH 9, 53-58 (1991) 中に記載されている。
本発明の適用に好ましい他の酵素的増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、これは米国特許第4,683,195 号および同第4,683,201 号に記載された方法の１つである。好ましい態様では、耐熱性ポリメラーゼを使って核酸が増幅される。
【００３５】
様々な耐熱性細菌由来の有用なポリメラーゼとしては、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）（米国特許第4,889,818 号および同第5,079,352 号）、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）（WO 91/09950 ）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）（WO 92/9688）およびテルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）（EP-A 455 430）が挙げられる。それらの酵素は精製された天然形態または組換え形態のいずれかで有用であり、商業的に入手可能でもある。テルムス属から単離することができるポリメラーゼが好ましい。テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（“Taq" ポリメラーゼ）が本発明において特に好ましい。
【００３６】
ＲＮＡを最初にＤＮＡに転写することによりＲＮＡベースの核酸標的を増幅および検出するためにＰＣＲを使うことができる。そのような方法は例えばWO 91/09944 中に記載されている。この場合例えばいわゆる逆転写酵素を酵素として使うこともでできる。ＤＮＡポリメラーゼ、例えばTaq ポリメラーゼの逆転写酵素活性をこの目的に使うこともできる。別の二価イオン（この場合例えばMn²⁺）の対応する存在が、適用可能ならば、この活性を最大限に利用することを保証するだろう。
【００３７】
ＰＣＲまたはＴＡＳを使って実施する時の本発明の方法のプラクチスは様々な温度で使用され、便利には、変性、プライマーのハイブリダイゼーションおよび重合反応の温度を精密に制御することができる自動化方法において実施される。この目的に適する装置は米国特許第 5,038,852号に記載されている。この種の装置は商業的に入手可能でもある。
【００３８】
核酸の酵素的増幅またはその後の検出を行うためのオリゴヌクレオチドは、既知の方法で、例えば固相合成法〔Oligonucleotide Synthesis: A practical Approach, IRL Press, Oxford, UK, M.J. Gasit編 (1984) 〕により、調製することができる。多数のそのようなオリゴヌクレオチドが商業的に入手可能である。
【００３９】
上記に言及した酵素的増幅方法は全て、使用する特定酵素の必要条件に最も良く合った特定の塩濃度および／または緩衝液を使用する。種々の方法において、増幅すべきＤＮＡまたはＲＮＡは、しばしば予備精製段階により試料中の他の成分から単離されるかまたは少なくとも高度に濃縮される。よって、酵素緩衝液は、試料により導入されるいずれかの添加剤に合わせて変える必要はない。しかしながら、そのような予備精製が行われる場合には、特に試料の汚染の危険性があるために、対応して作り上げた準備段階も必要である。
【００４０】
本発明をどのように操作するかを説明するために、ＰＣＲに関連して血液試料中の標的核酸を増幅することを実証する。
本発明の特別な特徴は、ヘパリン処理血液からの核酸の増幅に存する。現時点では、抗凝固剤としてヘパリンで試料を予め処理すると血液試料中の核酸のＰＣＲが阻害されることが知られている。この事実は、ＤＮＡ結合タンパク質は基質である核酸に対してよりもヘパリンに対してより大きい親和力を有するため、ヘパリンをＤＮＡ結合タンパク質の特異的阻害剤として使用した初期の酵素学の研究結果と一致する（T.A. Bickle ら、Nucleic Acid Res. 4, 2561, 1977 ; J. Leis ら、Methods in Enzymology XXIX, 153, 1974 ）。
【００４１】
そのような前の研究結果は、反応混合物中でのＰＣＲによるヘパリン処理済血液試料からのＤＮＡの増幅が不可能であるという偏見を当業者に植えつけただろう。しかしながら、本発明者らは、意外にも、高い血液含有率（例えば≧10容量％）から非常に高い血液含有率（例えば≧50容量％）ではＤＮＡの増幅が可能であることを発見した。これは常用のＰＣＲ緩衝液を使った場合でも可能である。
【００４２】
即ち常用のＰＣＲ緩衝液中のKCl 濃度（約50 mM のKCl ）を、試料成分により導入される塩濃度に合わせて特別に変える必要はない（例えば実施例２を参照のこと）。別の選択肢は、試料の塩含有率が非常に高い時は緩衝液を使って塩の追加量を中和することである。反応混合物中の一価イオンの塩濃度は約10〜160 mMである。好ましくは、一価イオン濃度は約10〜90 mM である。
【００４３】
本発明のもう１つの特別な特徴は、EDTA処理血液からの核酸の増幅である。この種類の血液では、ＰＣＲ緩衝液中50 mM KCl の通常濃度を使うと、高められた量（約30容量％から上）の血液試料を用いて特異的なＤＮＡ合成を全く行うことができない。これは、約135 mMの一価イオンの最大塩濃度に相当する（それぞれ実施例１の表１、実施例２の表２を参照のこと）。
【００４４】
血液成分の影響を防ぐために予め精製されているＤＮＡを基質として使った時でさえも、ＰＣＲ酵素に対する塩の効果が認められる。反応混合物中10 mM KCl 以上でのみ所望の標的核酸の特異的増幅が可能である（実施例１、表１）。相応して、例えば20容量％より高いEDTA処理血液成分では、試料自体が約25 mM の一価イオンを提供しているため反応混合物へのKCl の添加は不要である（表１）。結果として、EDTA処理血液からのＤＮＡまたはＲＮＡの増幅のためには、反応混合物中の一価イオンの塩濃度が10〜135 mM、好ましくは30〜80 mM であるべきである。
【００４５】
本発明の更に別の目的は、クエン酸塩加血液からの核酸の増幅である。抗凝固剤としてクエン酸塩で処理された血液を酵素的増幅の試料材料として使った時、試料濃度に依存して異なる結果が得られる。例えば、50mM KClを含む常用緩衝液をＰＣＲにおいて使う場合、反応混合物中約20容量％までの試料濃度で増幅が可能である。
【００４６】
しかしながら、最適化されたマグネシウム濃度の場合には一般的により一層高いKCl 濃度が得策であり、これは例えばＰＣＲ緩衝液を使って供給することができる。例えば、50容量％までおよびそれ以上の濃度を有する血液試料を増幅するためには、反応混合物中100 〜150 mMの追加のKCl 濃度が適当である（実施例２）。これはまた、試料中の約70 mM 以上の一価イオン濃度にほぼ該当する。従って、反応混合物中30〜200 mMの一価イオンの塩濃度が酵素的増幅に必要とされる。好ましくは、約60〜約150 mMの一価イオンの塩濃度が使われる。
【００４７】
クエン酸塩加血液では、ある状況下では二価イオンの濃度を適合させることが有利な場合があることが認められる。効率的なＰＣＲのために、例えば、特に反応混合物中に非常に高い血液濃度（例えば≧20容量％）が存在する時、Mg²⁺の量を反応混合物中1.5 〜2 mMの正常値よりも高めるべきである。典型的には3 mM Mg²⁺より高い濃度が必要であり、この濃度は損害を与えることなく40 mM ほどに高くすることができる。従って、Mg²⁺濃度が臨界最小値より上であることを前提として、Mg²⁺濃度の選択は相当自由である。
【００４８】
血液中のMg²⁺濃度を無視すると、血液試料中に抗凝固剤としてEDTAが存在する時、反応混合物中のMg²⁺濃度が非常に重要である。約0.35〜0.4 mMのMg²⁺が10容量％のEDTA処理血液により、約1.75〜2.0 mMのMg²⁺が50容量％のEDTA処理血液により、そして約3.5 〜4.0 mMのMg²⁺が80容量％のEDTA処理血液により結合される。従って、EDTAに結合するMg²⁺の量は常に等モル量である。
【００４９】
しかしながら、好結果の増幅には遊離Mg²⁺濃度が必要であるため、反応混合物中の結合したMg²⁺を考慮に入れなければならない。最適なＰＣＲのためには１mMより高い遊離Mg²⁺が存在しなければならない。遊離Mg²⁺濃度が１mM以下であれば、多くて50％の最大可能増幅収率しか得られない。上限は約20 mM の遊離Mg²⁺である。それより高い値は最適より下の増幅収率を生じる。
【００５０】
最適なＰＣＲのためには、10容量％のEDTA処理血液の存在下では1.4 mMのMg²⁺濃度が必要最小濃度であることがわかり、50容量％のEDTA処理血液の存在下では3.0 mMのMg²⁺が必要最小濃度であることがわかり、そして80容量％のEDTA処理血液の存在下では5.0 mMのMg²⁺が必要最小濃度であることがわかった。それらの数値の中で特に驚くべきことは、80容量％ほどの高い濃度のEDTA処理血液量の遊離Mg²⁺濃度を、何ら前処理なしに増幅用の反応混合物として使用できることである。
【００５１】
種々の抗凝固剤で処理された10〜50容量％の濃度の未精製の血液試料を有する反応液中でのＤＮＡの増幅用に最適化されたMgCl₂濃度の場合に反応混合物中にＰＣＲ緩衝液により供給される追加のKCl 濃度（mMで）は、次の表に与える結果をもたらした。この表は、例えば、反応混合物中の試料濃度を後述のようにして増加させるにつれて、添加されるＰＣＲ緩衝液の一価イオン（ここでは例えばKCl による）の最適濃度がどのように変化するかの概要を与える。
【００５２】
【表１】

【００５３】
効率的増幅を保証する追加の段階として、試料貯蔵の性質によって既にこれを行ってしまったならば使用前に血液試料を凍結することができる。増幅を増加させる別の可能なやり方は、まず試料のみまたは調製した反応混合物を熱循環器中で加熱と冷却により数回変性させることである。約85〜95℃への加熱と約40〜60℃への冷却による約５〜20回のそのようなサイクルが十分である。
【００５４】
温度はそれぞれのレベルに短時間にのみ維持することが必要であり、１〜２分で十分である。しかしながら、維持時間はそれより長くても短くてもよい。増幅用の成分（プライマー、トリホスフェート、酵素）を有する混合物は既に含まれているか、または保護するためにそれらの変性サイクル後にのみ酵素を添加することができる（例えばＰＣＲ混合物として）。
【００５５】
試料の変性後の酵素の添加は、例えば、酵素が感熱性であるＴＡＳのような等温増幅方法を使用する時に必要である。実際の増幅前のこの種の準備は、従来技術において様々な類似の方法で使用されている。例えば、Mercier ら（前掲）は、事前の反復熱変性がその後のＰＣＲを改善することを記載している。
【００５６】
この変性は、どの場合でも酵素的方法（例えばＰＣＲ，ＬＣＲ）がＤＮＡ増幅に変性段階を必要とするならば、一般的増幅反応の最中の幾つかの追加のサイクルにより簡単に行うことができる。試料または反応混合物の前処理のこの変更は、全ての血液試料に一般的に適用することができる。
【００５７】
試料の予備凍結または加熱による増幅効率の増加は、ＰＣＲ阻害剤の中和により起こるのではなくて細胞またはウイルスの溶解の改善により起こると思われる。従ってＰＣＲの開始前に核酸が遊離されて増幅試薬に一層近づきやすくなる。
【００５８】
下記の本発明の説明は、標的核酸の増幅方法としてＰＣＲをそして酵素としてTaq ポリメラーゼを使用した特定の選択下で行われる。標的含有試料は全血、血漿または血清であることができる。本発明はまた、Taq ポリメラーゼ以外の幾つかの他のポリメラーゼ（ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ）、例えばテルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）またはピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の上述した耐熱性ポリメラーゼのうちの１つの使用も期待する。各場合、特に酵素に依存して、反応混合物中の一価および／または二価イオンの濃度の個々の適合が必要かもしれない。
【００５９】
幾つかの他の酵素の手順についての詳細は実施例６に与えられる。試験する酵素の操作の範囲は、約10〜160 mMの一価イオンの濃度範囲内で（これはTaq ポリメラーゼに関して前に記載した濃度でもある）且つヘパリン処理試料を使った時、高い血液濃度（例えは≧10容量％）と非常に高い血液濃度（例えば≧40容量％）のところである。本開示を鑑みれば、他のポリメラーゼについての特定の限界を発見することは当業者にとって比較的単純なことである。上記に論じたのと同様な考察が、他の酵素、例えば標的がＲＮＡでありそして増幅方法がＰＣＲまたはＴＡＳである時に使われる様々な逆転写酵素に適用される。
【００６０】
次の実施例は上述した本発明を更に説明するためであってそれを限定するためのものではない。
新規方法により提供される効率的増幅が実施例３と１１に示され、そしてそれの再現性が実施例４に示される。
新規方法の他の可能な利用についての証拠は、実施例５の非常に多量の血液の分析および実施例８の乾燥血液試料の分析により与えられる。実施例１２は未精製の血清および血漿試料からのＰＣＲによるＲＮＡ標的の増幅の証拠を提供する。
【００６１】
【実施例】
本明細書中で使用および報告するＰＣＲ条件に関する一般的観察
特記しない限り、全ての反応は50μl の合計容量で、いわゆる「反応混合物」中で実施した。その中の試料濃度が高いため、必要な塩を含有する、対応して非常に濃厚な10×ＰＣＲ緩衝液を使った（特定のＰＣＲ緩衝液の組成については下記の項目２を参照のこと）。
【００６２】
また、ヌクレオシド三リン酸、プライマー、緩衝液およびポリメラーゼを含有する標準的ＰＣＲ混合物を使った。特記しない限り、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のＤＮＡポリメラーゼを使った。
【００６３】
１）反応混合物 50 μl は次のものから成った：
(a) 10×濃縮ＰＣＲ緩衝液 4.5μl
(b) ＰＣＲ混合物 5.0μl
(c) 必要な試料容量（μl ）
(d) 加熱滅菌済再蒸留水適量で50μl にする。
【００６４】
２）ＰＣＲ緩衝液（Ａ）の組成
(1) いわゆるＬシリーズの10×ＰＣＲ緩衝液は次のものを含んだ：
・50 mM Tricine (pH 8.8)（25℃）
・15 mM MgCl₂
・0.5% Tween 20 （ポリオキシエチレンソルビトールモノラウレート）および
・様々な濃度のKCl ：
緩衝液10×Ｌ０＝ 0 mM KCl
緩衝液10×Ｌ１＝ 100 mM KCl
緩衝液10×Ｌ２＝ 200 mM KCl
…
緩衝液10×Ｌ15 ＝ 1500 mM KCl 。
【００６５】
(2) ＬｘＭシリーズの10×緩衝液はＬシリーズに対応するが15 mM MgCl₂の代わりに150 mM MgCl₂を含んだ。例えばＬｘＭシリーズの10×ＰＣＲ緩衝液は次のものを含んだ：
・50 mM Tricine, pH 8.8 （25℃）
・150 mM MgCl₂
・0.5% Tween 20
・次のような種々の濃度のKCl ：
緩衝液10×Ｌ０Ｍ＝ 0 mM KCl
緩衝液10×Ｌ１Ｍ＝ 100 mM KCl
緩衝液10×Ｌ２Ｍ＝ 200 mM KCl
…
緩衝液10×Ｌ15Ｍ＝ 1500 mM KCl
【００６６】
(3) 10×Ｔ溶液は次のものから成った：
・15 mM MgCl₂
・0.5% Tween 20
（Tricine 、TrisまたはKCl を全く含まない）
【００６７】
３）増幅用のＰＣＲ混合物（Ｂ）の組成：
・100 mM溶液として各dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 0.5 μl
・対応する10×ＰＣＲ緩衝液 0.5 μl
・各プライマー（50μＭ） 0.5μl
・ＤＮＡポリメラーゼ 1.25〜2.5 単位
・水適量で 5μl の最終容量にする。
【００６８】
特記しない限り、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のＤＮＡポリメラーゼを使った。
有利には、10×ＰＣＲ緩衝液（Ａ）4.5 μl を使って段階１）に従った増幅を実施し、試料容量（１(c) ）を加熱滅菌済H₂O （１(d) ）で45μl に満たした。試料を必要により熱変性せしめた。ＰＣＲの開始の直前にＰＣＲ混合物(b) 5 μl を加えた。変性前に反応混合物を２滴（30〜40μl に相当）の鉱油により被膜した。
【００６９】
４）ＤＮＡ増幅のためのサイクルあたりの熱循環器条件は次のようであった：
段階１ 93℃で30秒（ＤＮＡ鎖の分離）
段階２Ｘ℃で30秒（プライマーのハイブリダイゼーション）
段階３ 72℃で90秒（ポリメラーゼ反応）
上記温度変化（段階１〜３）の各々の前に20秒を置いた。従って１サイクルは３分30秒要した。通常合計約35〜40サイクルが運転された。
【００７０】
多くの実験では、ＰＣＲ前に試料を熱変性させた。変性サイクルについての熱循環器条件は下記のようであった：
段階１ 90℃で90秒
段階２ 50℃で90秒
【００７１】
典型的には変性のために20サイクル行ったが、幾つかの場合には５サイクルのみ行った。変性サイクル後、試料を室温に戻し、ＰＣＲ混合物を添加し、記載のようにして標的核酸を増幅せしめた。
【００７２】
下記の項目５）に記載したプライマーには次のハイブリダイゼーション温度（上記の段階２のＸ℃）を使った：
ＨＬＡプライマー GH26/27： 60℃
第IX因子プライマー JR3/JR4： 55℃
Ｂ型肝炎プライマー MD122/MD123： 50℃
風疹プライマー Ru2/Ru3： 60℃
【００７３】
５）ＰＣＲプライマーの配列と増幅される断片のサイズ
ａ）ＨＬＡＤＱα遺伝子（242 塩基対）
GH 26 : GTG CTG CAG GTG TAA ACT TGT ACC AG（配列番号１）
GH 27 : CAC GGA TCC GGT AGC AGC GGT AGA GTT G （配列番号２）
（プライマーと配列についてはH. Ehrlichら、PCR Protocols, Acad Press., 261-271, 1990 を参照のこと）。
【００７４】
ｂ）第IX因子遺伝子（234 塩基対）
JR 3 : AGG ACC GGG CAT TCT AAG CAG TTT A（エクソンＤ）（配列番号３）
JR 4 : CAG TTT CAA CTT GTT TCA GAG GGA A（配列番号４）
（プライマーと配列についてはJ. Reissら、Blut 60, 31-36, 1990 を参照のこと）。
【００７５】
ｃ）Ｂ型肝炎（151 塩基対）
MD 122 : CTC TCA ATT TTC TAG GGG GA （配列番号５）
MD 123 : AGC AGC AGG ATG AAG AGG AA （配列番号６）
それらのプライマーはＢ型肝炎ウイルスの長さ153 bpの断片を増幅する。プライマーMD122 はＨＢＶゲノムのbp 267-286にあり、プライマーMD123 はbp 401-420にある（配列のナンバリングはH. Okamotoら、J. Gen. Virol. 67, 2305-2314, 1986 に従った）。
【００７６】
ｄ）風疹（321 塩基対）
Ru 2 : TGC TTT GCC CCA TGG GAC CTC GAG（bp 1990-2013）（配列番号７）
Ru 3 : GGC GAA CAC GCT CAT CAC GGT（bp 2290-2310）（配列番号８）
（プライマーの配列についてはEggerding F.ら、J. Clin. Microb. 29, 945-952, 1991 を参照のこと）。
【００７７】
６）使用するＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ
ａ）テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のTaq ポリメラーゼ：20mM Tris (pH 8.0), 1mM EDTA, 1mM DTT および50％グリセリン中５単位／μl としての Super Taq（Stehelin Switzerland）。
【００７８】
ｂ）テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来のＤＮＡポリメラーゼ：Vent（Biolabs New Enbland の商標）, 100mM KCl, 0.1mM EDTA, 10mM Tris-HCl (pH 7.4), 1mM DTT, 0.1 ％Triton X-100, 100 μg/mlのBSA および50％グリセロール中1000単位／ml。
【００７９】
ｃ）ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のPfu ＤＮＡポリメラーゼ (Stratagenes)： 50mM Tris-HCl (pH 8.2), 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 0.1 ％Tween 20, 0.1 ％ NP-40および50％グリセロール中2500単位／ml。
【００８０】
ｄ）テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）由来の rTth ＤＮＡポリメラーゼ (Perkin Elmer) ：100mM KCl, 20mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.5 ％Tween 20および50％グリセロール中2500単位／ml。
【００８１】
ｅ）モロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素 (BRL)：20mM Tris-HCl, 1mM DTT, 0.01％ NP-40, 0.1mM EDTA, 0.1M NaCl および50％グリセロール中 200単位。
【００８２】
７）増幅生成物の分析
増幅後、血液試料を12,000 gで５分間遠心し、その後で残渣 5〜7 μl をアガロースゲルに適用した。≧40容量％の全血を含む試料を遠心前に30μl の水で希釈した。２％アガロースゲル上での電気泳動後に臭化エチジウムで染色することによってアンプリコンを同定した（これはアンプリコン感受性同定方法ではない）。よって弱いＰＣＲ結果は陰性と評価される。
【００８３】
実施例１： KCl 依存性のＰＣＲ
EDTA処理血液を使った最初の実験は、変性後に容量で10％の血液を有する反応液中での染色体ＤＮＡ断片の特異的増幅が可能であることを示す。
Taq ポリメラーゼの臨界KCl 濃度を決定する試験を、線形放射能取込みアッセイ（D. GelfandによるChapter 2: Taq DNA Polymerase, PCR Technology, Stockton Press 1989, Henry Ehrlich 編を参照のこと）の代わりにＰＣＲを使って繰り返した。精製ＤＮＡまたは20容量％の変性EDTA処理血液を基質として使った。
【００８４】
10μl の変性EDTA処理血液または20 ng の精製ＤＮＡを用いて、ＨＬＡ遺伝子ＤＱαの断片をＰＣＲ緩衝液中0.0mM 〜150mM のKCl 濃度において増幅せしめた。緩衝液の他の成分は一定に維持した。血液試料はＰＣＲ前に熱循環器中で20サイクルで変性せしめた。アンプリコンの合成は35サイクルにおいて行った。次いで７μl の生成物をアガロースゲル上での電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色した。ＨＬＡ遺伝子ＤＱαの長さ242 bpのアンプリコンの量を測定した。すると一価イオンの濃度がTaq ポリメラーゼによる合成の効率および特異性の決定的要因の１つであることがわかった。下記のKCl 値は、試料は無視されるのだからＰＣＲ緩衝液中の塩の濃度を指すのであって反応混合物中の合計KCl を反映するのではない。
【００８５】
精製ＤＮＡの場合にはアンプリコンは10mM〜150mM KCl の濃度で検出され、そして20容量％の血液の場合には0 〜110mM KCl の濃度で検出が可能であった。最大合成は、精製ＤＮＡについては約70〜80mM KClのところで、20容量％血液については0mM と 50mM の間で起こった。
【００８６】
（精製ＤＮＡを含む）反応混合物中40mM KCl以下の濃度では、Taq ポリメラーゼは異なる長さの非特異的配列を合成する傾向があり、これはアガロースゲル上のＤＮＡスメアとして現れる。この非特異的配列のバックグラウンドは、緩衝液中40mM KClでは弱いが、≦30mM KClでは非常に顕著であり、所望の特異的合成を明らかに妨害した。
【００８７】
この非特異的ＤＮＡ合成（「バックグラウンド」）は基質として精製ＤＮＡを使った場合のみ検出可能であった。20容量％の血液では、血液溶液の塩濃度は試験した全てのKCl 濃度において反応の特異性を保証するのに十分であり、増幅をまだ観察することができた。過剰のKCl 濃度はアンプリコン合成を減少させ、20容量％の血液の存在下での150 mM KClはＰＣＲ増幅を完全に阻害した。
【００８８】
20容量％の血液中での特異的合成は、ＰＣＲ緩衝液中 KClの不在下だけでなくTricine またはTrisの不在下でも可能であった（表２）。この場合、ＰＣＲ緩衝液を、MgCl₂とTween 20のみを含有する溶液Ｔで置き換えた（この溶液の組成は「ＰＣＲ条件に関する一般的観察」を参照のこと）。従って、ＰＣＲ混合物中の血液濃度が十分に高ければ、試料の一価イオンの塩含量と緩衝能が特異的ＤＮＡ合成をもたらすのに十分である。
【００８９】
【表２】

【００９０】
実施例２：変性血液またはヘパリン、 EDTA もしくはクエン酸で処理した血液の存在下でのＰＣＲ
この実施例では、異なる塩濃度における5 〜50容量％の変性血液の存在下での増幅の効率を試験する。Taq ポリメラーゼによるＤＱα配列の増幅を再び測定した。
【００９１】
種々の起源の特定濃度の血液を種々の塩濃度を有する50μl 反応液中で変性せしめた。その後で各試料中のＤＱα特異的断片を40サイクルに渡りＰＣＲ増幅せしめた。2.5 〜25μl の血液（全反応容量の約 5〜50容量％に相当する）の存在下でＰＣＲを実施した。アガロースゲル上での残渣７μl の電気泳動後、臭化エチジウムによりアンプリコンを同定した。ＰＣＲ緩衝液の完全組成は実施例１において記載されている。アッセイの際のＬｘＭ緩衝液の最終Mg²⁺濃度は、Ｌシリーズの緩衝液の通常の1.5 mMの代わりに15 mM であった。結果を表２に要約する。
【００９２】
ａ）ヘパリン処理血液
ヘパリン処理血液は、異なるKCl 濃度に対して最小の反応感度を有することがわかった。特異的ＤＮＡ合成は、Ｌ５緩衝液の使用では 5〜50容量％の血液の存在下で、そして溶液Ｔ〔上記の２）(3) 〕では10〜50容量％の血液の存在下で達成された。40容量％と50容量％の血液では、Ｌ５緩衝液処理後よりもＴ溶液処理後の方がより多量のアンプリコンが認められた。このことは、一価イオンの不在下でが増幅がより一層効率的であったことを示す。どの増幅においても妨害バックグラウンド（望ましくない合成）は全く観察されなかった。
【００９３】
ｂ）EDTA 処理血液
Taq ポリメラーゼの活性に対するKCl 含量の影響はEDTA処理血液を用いるとより明白に認められる。Ｌ５緩衝液中では 5〜30容量％の血液、そしてＴ溶液中では10〜50容量％の血液の特異的ＤＮＡ配列の増幅が可能であった。Ｔ溶液中20容量％未満の血液レベルでは非特異的ＤＮＡ合成が起こった。５容量％の血液では非特異的バックグラウンド合成だけが起こり、特異的合成は全く検出できなかった。
ＤＱαアンプリコンの最大合成は、Ｌ５緩衝液では約10容量％の血液、そしてＴ溶液では約30容量％の血液である。
【００９４】
ｃ）クエン酸塩添加血液
Taq ポリメラーゼは、クエン酸塩加血液の存在下ではEDTA処理またはヘパリン処理血液の存在下とは全く異なって振る舞う。Ｌ０緩衝液とＴ溶液のいずれを用いても全く合成は不可能であった。Ｌ５緩衝液では５容量％と10容量％の血液中で増幅が可能であり、20容量％の変性血液中では非常に弱かった。比較的多量の血液中での合成は、高MgCl₂およびKCl 濃度を使った時に可能であった。
【００９５】
100mM KCl と15mM MgCl₂を含むＬ10Ｍ緩衝液では、5 〜50容量％の血液の存在下でアンプリコンが形成された。Ｌ５Ｍ緩衝液中では20〜50容量％の血液の存在下で増幅が観察された。Ｌ０Ｍ緩衝液中では40容量％と50容量％のクエン酸塩加血液の存在下で増幅が観察された。比較的少量の血液の存在下での最後の２つの緩衝液では非常に強い望ましくないバックグラウンド合成が観察された。
【００９６】
この実施例は、ＰＣＲによる特異的ＤＮＡ増幅が、上記の汎用される３つの抗凝固剤の全てにおいて、Taq ポリメラーゼと適当な緩衝液を用いて5 〜50容量％の変性血液の存在下で可能であったことを示す。ヘパリン処理血液からの増幅反応が異なる濃度の一価イオンに対して最低の感受性であり、最も特異的な合成を提供することがわかった。
【００９７】
【表３】

【００９８】
表３は、反応混合物中100mM KCl と15mM MgCl₂の濃度を与えるＬ10Ｍ緩衝液が、クエン酸塩加血液からのＤＮＡ−ＰＣＲ増幅に適当であることを示す。
必要 MgCl₂濃度を実施例２Ａにおいてより精密に限定する。
【００９９】
実施例２Ａ：クエン酸塩加血液中でのＰＣＲのための MgCl ₂ 濃度の最適化
ＨＬＡＤＱα配列を、種々のマグネシウム濃度において２人（ＡとＢ）のクエン酸塩加血液のそれぞれ10μl および25μl から増幅せしめた。反応液は、0.05％Tween, 5mM Tricine (pH 8.8) および50mM KClと20容量％のクエン酸塩加血液を含んだ。100mM KCl と50容量％濃度のクエン酸塩加血液（試料１〜７）、および80mM KClと50容量％のクエン酸塩加血液（試料８〜11）を含む溶液も試験した。試料中のＤＮＡを変性せしめた後、合計40回の増幅サイクルを実施した。他の点では、この試験の実施と評価は上記実施例２に記載のものと同様であった。結果を下の表４に示す。
【０１００】
【表４】

【０１０１】
最適MgCl₂濃度は、試料の起源およびサイズに依存して4.5 〜21.5 mM に見つかった。
【０１０２】
実施例３：全血中でのＤＮＡ試料のＰＣＲ増幅の効率の測定
成人の血液１μl は4000〜9000（平均5000）個の白血球を含む。実施例２に示されるように、3000個の細胞のゲノム材料にぼぼ相当する20 ng の精製ＤＮＡ（6.8 pgのＤＮＡ／二倍体細胞）が、ＰＣＲを使って明らかに目に見える量のアンプリコンを合成するのに十分である。白血球の定量的溶解があれば、ゲノムＤＮＡを最初にＰＣＲに適当な基質に変換し、そして未精製の血液試料の成分による増幅反応の阻害が全くないならば、全血１μl が効率的アンプリコン合成に十分であろう。
【０１０３】
従って、ＰＣＲ用の新規試料調製の効率を決定するための実験を次のように考案した。ヒトEDTA処理血液を、ＤＮＡがＨＬＡプライマー GH26 およびGH27と交差反応しないEDTA処理ヒツジ血液で希釈した。この実験では、凍結し変性させたEDTA処理ヒトおよびヒツジ血液各 10 μl を、未希釈のままと種々の希釈率の両方において上述のＰＣＲアッセイに使った。ヒトＨＬＡ遺伝子ＤＱαに特異的であるプライマー対GH26とGH27を使ってＬ２緩衝液中で40サイクルに渡り増幅を行った。結果を下の表５に要約する。40増幅サイクルでは50個ほどの少数のヒト細胞が検出可能なアンプリコンバンドに十分であることがわかった。
【０１０４】
【表５】

【０１０５】
実施例４：異なるヒトからの 20 容量％および 40 容量％の変性血液中でのＰＣＲ
20容量％または40容量％の血液中でのＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅方法を、小グループの異なる試料において調べた。10のEDTA処理血液、５つのヘパリン処理血液および４つのクエン酸塩処理血液試料からのＤＮＡを、最適条件下でＤＱα特異的ＰＣＲプライマーを用いて効率的に増幅せしめた。増幅は、様々なヒトの10μl および20μl の変性血液それぞれから50μl の反応液中で40サイクルに渡り増幅を行った。
【０１０６】
ＰＣＲ緩衝液は、EDTA処理血液とヘパリン処理血液にはＬ０〔5mM Tricine (pH 8.8), 1.5mM MgClおよび 0.05% Tween〕、そしてクエン酸塩加血液にはＬ10〔5mM Tricine (pH 8.8), 100mM KCl, 15mM MgClおよび 0.05% Tween〕であった。結果を下表６に与える。全ての試料が陽性であった。いずれのアッセイにおいてもTaq ポリメラーゼは著しくは阻害されず、非特異的配列の妨害増幅は全くなかった。
【０１０７】
【表６】

【０１０８】
実施例５：大規模反応におけるＰＣＲ
しばしば非常に低濃度で血液中に存在する感染性微生物の同定において特に注目されるのは、ＰＣＲアッセイにおいて特定配列を特異的且つ効率的に増幅することができる最大外来ＤＮＡ／ＲＮＡ量である。
【０１０９】
血液中では核不含有のまたはＤＮＡ不含有の赤血球と核を含む白血球との間で区別が行われる。単核血液細胞（ＭＺ）が白血球の約３分の１を構成する。成人の血液１μｌ中の平均含量は約5000個の白血球または血液60μl 中100,000 個のＭＺである。
【０１１０】
例えばＨＩＶ−ＤＮＡの同定のためには、ＰＣＲは通常約50,000〜1,000,000 個のＭＺを有する100 μl の反応混合物容量において実施される。これは約340 〜680 ngのＤＮＡに相当する（二倍体細胞あたり6.8 pgの含量と仮定して）。混合物あたり約１μl のＤＮＡの上限は通常大きくは超過しない。というのは、外来ＤＮＡの濃度が過剰であると特異的アンプリコン合成が減少するためである（M. Abbott ら、J. Infect. Disease 158, 1158-1169, 1988）。
【０１１１】
4,000,000 個以上のＭＺの存在下で特異的に配列を増幅させるための条件が発見された。
ＰＣＲ混合物あたりの試料容量を増加させる１つの単純なやり方が大規模ＰＣＲに存し、この場合反応容量は50-100μl から約500 μl に増加される。
500 μl の大規模反応に関する実験は、50μl 混合物に使ったものと同じ反応容器と同じ熱循環器を使って実施した。反応成分の比率は変わらなかった。
【０１１２】
ＰＣＲ混合物の組成：
・dATP, dCTP, dGTPおよびdTTP（10mM溶液）各５μl
・対応する10×ＰＣＲ緩衝液５μl
・各プライマー（50μＭ）５μl
・Taq ポリメラーゼ 12.5単位 (2.5 μl)
【０１１３】
反応混合物の組成：
・10×ＰＣＲ緩衝液 45μl
・試料 100 〜400 μl
・適量のH₂O で467.5 μl にする。
【０１１４】
実施例１に指定した条件下で20サイクルにおいて試料を変性せしめ、その後各反応液に32.5μl のＰＣＲ混合物を添加した。
大規模反応においてＤＱαを同定するのに使った熱循環器プログラムは次の通りであった：
段階１ 93℃で３分
段階２ 60℃で３分
段階３ 72℃で３分
各温度変化の間に20秒の間隔を置いた。従って１サイクルは10分間かかり、サイクル数は40であった。
【０１１５】
大規模法を使ってＨＬＡ遺伝子ＤＱαからの242 bp断片を増幅した。ＰＣＲを500 μl の反応容量で行い、100 〜400 μl の変性ヘパリン処理血液を含んだ。通常の50μl 混合物とは異なり、幾つかの大規模反応では30〜40μl の鉱油の代わりに80μl の鉱油を使って反応液を被膜した。他の点では、50μl ＰＣＲ混合物と500 μl ＰＣＲ混合物は同じ相対比率の種々の反応成分を有した。
【０１１６】
表６は、５人の異なる提供者からの200 μl のヘパリン処理血液の増幅の結果を要約する。各試料を使ってＤＱαアンプリコンの効率的且つ特異的合成が達成された。
【０１１７】
500 μl のＰＣＲ大規模反応液中40容量％濃度の試料では、200 μl の血液が約１×10⁶個の白血球と約6.8 μg のＤＮＡを含んだ。それらのうちの約３分の１の0.4 ×10⁶個が単核細胞である。
【０１１８】
より多量の血液、即ち250 〜400 μl （これは50〜80容量％に等しい）をヘパリン処理血液試料と共に実験的に使った。すると表７の(b) に見られるように、好結果に増幅された。
【０１１９】
【表７】

【０１２０】
実施例６：テルムス・アクアティカス以外の３種の細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた変性全血からのＤＱαアンプリコンの合成
前述の実施例は全てTaq ポリメラーゼを用いて変性全血からＤＮＡを増幅せしめた。従って異なる起源の３種のＤＮＡポリメラーゼについてＤＱα断片の増幅を試験した。
【０１２１】
Taq ポリメラーゼはテルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）から単離される一方、Pfu ポリメラーゼはピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）に由来し（Stratagene）、VentR ポリメラーゼはテルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）に由来し（New England Biolabs ）そしてTth ポリメラーゼはテルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）に由来する（Perkin-Elmer）。
【０１２２】
10容量％および40容量％のヘパリン処理血液それぞれを各酵素に付随の緩衝液中で変性せしめた。その後ＨＬＡ遺伝子の242 bp断片を増幅せしめた。３種の酵素全てについて10容量％または40容量％の全血の存在下でアンプリコンが効率的に形成する条件を次のようにして確かめた。即ち、Pfu およびVentについては酵素製造元のＰＣＲ緩衝液中そしてrTthについてはＬ９中での５μl または20μl の変性ヘパリン処理血液のホットスタート(hot start) 増幅、50μl の反応容量。
【０１２３】
Pfu を使って血液不含有の増幅により負の対照を実施した。即ちヘパリン処理血液５μl を５μl のH₂O により置き換えた。ホットスタート増幅は、変性およびＰＣＲ混合物（ポリメラーゼを含まない）の添加後、血液を60℃に加熱することによって行った。10分後にこの温度で酵素を添加し、ＰＣＲを40サイクル実施した。
【０１２４】
表８で使用する 10 ×緩衝液の組成：
緩衝液１：
・200mM Tris, pH 8.8
・100mM KCl
・60mM (NH₄)₂SO₄
・20mM MgCl₂
・1% Triton X-100
・1 mg/ml のヌクレアーゼ不含有ＢＳＡ
【０１２５】
緩衝液２：
・200mM Tris, pH 8.8
・100mM KCl
・60mM (NH₄)₂SO₄
・15mM MgCl₂
・1% Triton X-100
【０１２６】
Vent 緩衝液：
・200mM Tris, pH 8.8
・100mM KCl
・100mM (NH₄)₂SO₄
・20mM MgCl₂
・1% Triton X-100
【０１２７】
表８の結果は、変性されているが精製されていない血液試料中のＤＮＡを、４種の異なるＤＮＡポリメラーゼを使って増幅せしめることができること、および増幅がTaq ポリメラーゼの特別な性質に依存しないことを示す。
【０１２８】
【表８】

【０１２９】
実施例７：血液の遺伝性因子である第 IX 因子のからのＤＮＡ配列の増幅
今までに与えた全ての実施例はＨＬＡＤＱα遺伝子からの242 bpアンプリコンを同定することに基づいている。従って、血液第IX因子の遺伝子からの長さ234 bpの断片について全血からの増幅を成し遂げた。
【０１３０】
Ｘ染色体上の劣性遺伝子である第IX因子中の欠損は、Ｂ型血友病（クリスマス病）として知られる血液疾患を引き起こす。単一コピー遺伝子であるこの遺伝性因子の配列は当業界で既知である〔Yoshitake ら、Biochemistry 24: 3736-3750 (1985)〕。エクソンｄからの234 bp断片の増幅用のプライマーJR3 とJR4 の配列はJ. Reissら〔Blut 60: 31-36 (1990)〕から採用した。
【０１３１】
５人のヘパリン処理血液それぞれ10μl および20μl を緩衝液Ｌ５中で変性せしめ、そして50μl の反応容量においてプライマーJR3 とJR4 を使って増幅させた（表９参照）。試験した全ての血液試料において234 bpの大きさの所望のアンプリコンが検出された。期待のＤＮＡバンドは20μl の血液では余り強くなく、主バンドに加えて幾つかの不特定の弱い副バンドが出現した。精製したＤＮＡを用いたJR3/JR4 のアニーリング温度のおよその決定を除いて、アッセイのそれ以上の最適化は行わなかった。
【０１３２】
各々93℃で30秒、55℃で30秒および72℃で90秒から成る37サイクルにおいて変性全血を増幅させた。その結果を表９に要約する。
【０１３３】
【表９】

【０１３４】
実施例８：乾燥血液試料からの増幅
しばしば不十分な設備を有する遠隔地において血液試料を収集しそしてそれを輸送することは、幾つかの困難を提供することがある。簡単な解決策は、濾紙上で血液試料をドリップしそして乾燥した試料を保存することである。ガスリー(Guthrie) スポットとして知られるこの種の試料は、免疫学的およびウイルス学的試験用の出発材料としての使用目的に長い寿命を有する（NCCLS Document LA4-A2, 1992 年７月, 第２版）。
【０１３５】
濾紙上で乾燥した血液試料は既にＰＣＲにおいて利用されている。乾燥血液からＤＮＡを溶出せしめ、部分精製し、そしてそれから特定の配列を増幅させる〔I. Huangら、Hum. Genet. 84: 129-131 (1990)およびNelsonら、The Lancet 336: 1451-1452 (1990) 〕。
【０１３６】
ガスリースポットからの血液の直接増幅のために、５μl のEDTA血液とヘパリン血液を３種の異なる濾紙支持体上でドリップし、37℃で２時間乾燥し、次いで切り取り、その濾紙片をＬ５緩衝液を用いる50μl ＰＣＲアッセイに導入し、そして20回の変性サイクル後に増幅させた。ＤＱα遺伝子からの242 bpアンプリコンが検出可能であった。表10に示されるように、種々の濾紙を使った全ての試験試料が40回の増幅サイクル後に陽性結果を与えた。
【０１３７】
【表１０】

【０１３８】
実施例９：新鮮な血液からの増幅
記載する全ての実験は、採血２日後に調製され−70℃で保存されたBasle Cantonal Hospital の血液提供者からの凍結血液を使って実施した。更なる試験において、新鮮な血液─即ちまだ凍結されていないが抗凝固剤と混合されている血液─をＰＣＲアッセイに使用することが簡単であることが示されるだろう。
【０１３９】
試験条件は次のようであった：
各10μl の新鮮な血液、ヘパリン処理血液およびクエン酸塩加血液（各々室温で２時間保存したもの）並びにEDTA処理血液（室温で24時間保存したもの）のＰＣＲによる増幅を43サイクルに渡り実施した。指示した場合には−70℃での30分間の凍結が与えられた。10μl の血液をH₂O 、5 μl のＬ３緩衝液（ヘパリン処理血液とEDTA処理血液の場合）および5 μl のＬ10Ｍ緩衝液（クエン酸塩加血液の場合）で45μl に増量させ、指示した場合には上述のごとく熱変性せしめ、次いでＰＣＲ混合物(5μl)を添加し、ＰＣＲを開始した。
【０１４０】
表11はその結果を要約する。
何ら追加の変性または予備凍結段階を使わなくてもヘパリン処理血液およびクエン酸塩加血液試料に対してＰＣＲが効果的であることがわかった。EDTA処理血液らの細胞性ＤＮＡは直接増幅させることはできず、予備凍結段階が必要であった。ヘパリン処理血液およびクエン酸塩加血液の場合には、試料調製の異なる形態、即ち、凍結、凍結と変性（５サイクル）または凍結と20サイクルの変性（最後の形態の調製の結果は示していない）の間に全く相違を確認することができなかった。
【０１４１】
しかしながら、新鮮なEDTA処理血液では、５サイクルのみの後よりも20サイクルのＰＣＲ前変性サイクルの後の方が強いシグナルが観察された。室温で５日間のヘパリン処理血液およびクエン酸塩加血液の保存後、ＰＣＲ増幅は、調製を行わなかった試料または変性と凍結および変性なしの凍結を行った試料との間に全く相違を示さなかった。一方、EDTA処理血液の場合には顕著な相違が保持された（結果は示していない）。
【０１４２】
【表１１】

【０１４３】
実施例１０：変性血清または変性血漿の存在下でのＰＣＲ
ＲＮＡウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルスまたはＨＩＶについての血液試料のスクリーニングのために、この種の感染性病原体のＰＣＲアッセイが未精製の血液（または血清もしくは血漿）を使って直接実施できるとすれば技術的に有利であろう。これは、ＲＮＡの厄介な試料調製を排除し、試料の汚染の危険性を減らし、そして試料スクリーニングの自動化を容易にするだろう。
【０１４４】
それぞれ10容量％および40容量％の変性血清またはEDTA、ヘパリンもしくはクエン酸塩処理血漿中の20 ng のヒトＤＮＡの効率的増幅を与える緩衝液を探した。ＤＱαアンプリコンは、４種の試料全ておよび表１１に示すような本発明に従った条件を使って増幅された。40容量％の試料の場合、10容量％の試料の場合よりもＰＣＲ反応混合物中に高いマグネシウム濃度が必要であった。EDTA処理血液の場合のこの理由は、一般に、等モル量のマグネシウムがEDTAにより結合されるからである。即ち、1mM のEDTAは1mM のマグネシウムを結合する。遊離Mg²⁺濃度のみが増幅に効果を有する。EDTA処理血液のための好ましいMg²⁺濃度は、少なくとも1.4 mM（10容量％のEDTA処理血液）と約5.0 mM（80容量％のEDTA処理血液）の間のどこかである。
【０１４５】
各場合違った方法で血液を調製した提供者からの５μl （Ａ）または20μl （Ａ）の変性血漿中の20 ng のヒトＤＮＡの増幅を50μl の反応容量で実施した。血漿をH₂O 、5 μl の10×緩衝液１および１μl のＤＮＡで45μl に調整し、20サイクルにおいて変性させた。次いでこの溶液５μl をＰＣＲ混合物に添加し、40サイクルに渡りＤＱα断片を増幅せしめた。その結果を表１２に与える。
【０１４６】
【表１２】

【０１４７】
実施例１１：血清からのＨＢＶの増幅
タンパク質により取り囲まれたＤＮＡ─この場合はＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ─を、血清の存在下での精製ＤＮＡの増幅についての実施例１０に従って、適当な緩衝液を使って効率的に検出した。このために、１μl あたり1.5 ×10⁷個のＨＢウイルスのＨＢＶ計数を有する血清（Abbott試験No.2022: ウイルスＨＢＶ−ＤＮＡ検出および定量用キットを使った計数の測定）を様々な希釈後に、ＨＢＶ特異的プライマーMD122 およびMD123 を使って対照血清中で増幅せしめた。血清10μl を、Ｌ５緩衝液を有する50μl の反応容量中で変性させ、そしてＰＣＲ混合物を添加した後、40サイクルに渡り増幅させた。生成物をアガロースゲル上で分析した。その結果を表１３に要約する。
【０１４８】
【表１３】

【０１４９】
この方法を使うと、1500個以上のＨＢＶゲノムのＤＮＡ分子を含有する試料は、増幅されたＤＮＡをアガロースゲル中で臭化エチジウムにより染色した後で目に見えるアンプリコンバンドを与えた。高感度同定方法、例えばアンプリコンと放射性標識プローブとのハイブリダイゼーションを使えば、このＰＣＲアッセイはより一層感受性であることができる。
【０１５０】
実施例１２：未変性で且つ未精製の血清または血漿の存在下でのＲＮＡ−ＰＣＲ
ＲＮＡ−ＰＣＲ増幅の基質として風疹ウイルスを選択した。風疹ウイルスはＣ型肝炎作用物質を含むトガウイルス科に属するウイルスである。ゲノムは10 kb を越える一本鎖ＲＮＡである。風疹ウイルスは逆転写酵素を全く含まない。ＨＩＶとは異なり、風疹ウイルスは増幅のどの段階においてもＤＮＡから成ることはない。従って風疹ウイルスの調製物は全く風疹ウイルスＤＮＡを含まない。
【０１５１】
10μl のEDTA処理血漿または血清と反応混合物の最終容量の20容量％を変性させずにＲＮＡ−ＰＣＲ混合物に導入した。風疹ウイルス調製物を予備精製せずに直接逆転写酵素アッセイ（ＲＴＡ）に使用し、そして得られたｃＤＮＡを風疹ウイルス特異的ＰＣＲのための出発基質として使用した。この方法では、ＲＴＡ中のＲＮアーゼ阻害物質が重要である。
【０１５２】
深層凍結血清および血漿を解凍し、各々10μl を後述の混合物１（後述）で46μl に希釈した。反応２と４については、混合物１中のＲＮasinとＲＮase 遮断剤をH₂O により置き換えた。反応混合物を30〜40μl の鉱油で被膜し、そして42℃にて30分間インキュベートした。95℃に２分間加熱した後、４μl の混合物２（後述）を添加し、ＤＮＡを40サイクルに渡り増幅させた。生成物をアガロースゲル上で分析した。その結果を下の表１４に要約する。
【０１５３】
混合物１：
・Ｌ８緩衝液５μl
・50％グリセリン 20μl
・ランダムヘキサマー (1.65μg/μl) １μl
・ＲＮasin（40単位／μl ）（Serva ） 0.5 μl
・ＲＮase 遮断剤（１単位／μl ）（Stratagene） 0.5 μl
・dATP, dCTP, dGTPおよびdTTP（100 μＭ溶液）各0.1 μl
・逆転写酵素（MMLV; 200 単位／μl ） 0.8 μl
・H₂O 6.8 μl
・風疹ウイルス M-33 （未精製凍結細胞残渣、ATCC受注番号VR-315）１μl
【０１５４】
混合物２：
・風疹ウイルスプライマーRu2 およびRu3 （ＰＣＲ条件に関する一般的観察を参照のこと）各25ピコモル
・Ｌ８緩衝液 0.4 μl
・Taq ポリメラーゼ 1.25単位
・H₂O 適量で４μl にする。
【０１５５】
【表１４】

【０１５６】
この実施例は、未変性の血清または血漿中でのＰＣＲによりウイルスＤＮＡを検出できることを示す。
【０１５７】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列

【０１５８】
配列番号：２
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列

【０１５９】
配列番号：３
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列

【０１６０】
配列番号：４
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列

【０１６１】
配列番号：５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列

【０１６２】
配列番号：６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列

【０１６３】
配列番号：７
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列

【０１６４】
配列番号：８
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列

Claims

抗凝固剤であるヘパリン、クエン酸塩又はエチレンジアミン四酢酸（EDTA）のいずれかにより処理された血液試料中の標的核酸配列であるDNA又はRNAを、５容量％以上の血液試料を含む増幅反応混合物中で、酵素的に増幅する方法であって、
（ａ）前記抗凝固剤処理された血液試料中の正の一価イオン及び正の二価イオンの塩濃度を決定し；
（ｂ）前記増幅反応混合物中の正の一価イオン及び正の二価イオンの塩濃度を、使用する抗凝固剤に従って以下の定義される範囲内に確保し；そして
（ｃ）前記血液試料中の前記標的核酸配列を増幅する；
ことを含んで成り、
ここで、正の二価イオンの濃度が１〜20mMの範囲であり、
（イ）前記血液試料を抗凝固剤としてのヘパリンで処理する場合には、正の一価イオン濃度が10〜160mMの範囲であり、
（ロ）前記血液試料を抗凝固剤としてのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）で処理する場合には、正の一価イオン濃度が10〜135mMの範囲であり、そして
（ハ）前記血液試料を抗凝固剤としてのクエン酸塩で処理する場合には、正の一価イオンの濃度が30〜200mMの範囲である、
ことを特徴とする方法。
前記血液試料を抗凝固剤としてのへパリンで処理し、そして前記正の一価イオンの濃度が10〜90mMの範囲である、請求項１に記載の方法。
前記血液試料を抗凝固剤としてのEDTAで処理し、そして前記正の一価イオンの濃度が30〜80mMの範囲である、請求項１に記載の方法。
前記血液試料を抗凝固剤としてのクエン酸塩で処理し、そして前記正の一価イオンの濃度が60〜150mMの範囲である、請求項１に記載の方法。
正の一価イオンを前記反応混合物に添加する場合、当該正の一価イオンがK⁺又はNa⁺である、請求項１に記載の方法。
前記正の二価イオンの濃度を、Mg⁺⁺の添加により調節する、請求項１に記載の方法。
前記血液試料の量が、前記増幅反応混合物の10容量％以上である、請求項１に記載の方法。
前記の増幅が、ポリメラ−ゼ連鎖反応（PCR）により実施される、請求項１に記載の方法。
前記PCRに使用される酵素が耐熱性ポリメラーゼである、請求項８に記載の方法。
前記耐熱性ポリメラ−ゼがテルムス（Thermus）属の細菌から単離されたポリメラ−ゼである、請求項９に記載の方法。
前記酵素がテルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）のポリメラ−ゼである、請求項10に記載の方法。
前記試料の量が10容量％〜80容量％である、請求項１に記載の方法。
前記血液試料が、工程（ａ）の前に凍結されている、請求項１に記載の方法。