JP3090100B2 - ホウ素化ヌクレオチドを用いた鎖置換増幅 - Google Patents
ホウ素化ヌクレオチドを用いた鎖置換増幅Info
- Publication number
- JP3090100B2 JP3090100B2 JP09225999A JP22599997A JP3090100B2 JP 3090100 B2 JP3090100 B2 JP 3090100B2 JP 09225999 A JP09225999 A JP 09225999A JP 22599997 A JP22599997 A JP 22599997A JP 3090100 B2 JP3090100 B2 JP 3090100B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- restriction endonuclease
- sda
- reaction
- polymerase
- borated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、制限エンドヌクレ
アーゼによってニッキングを誘導する方法、標的核酸配
列を増幅する方法、および特に鎖置換反応（Strand Dis
placement Amplification；ＳＤＡ）による増幅に関す
る。
アーゼによってニッキングを誘導する方法、標的核酸配
列を増幅する方法、および特に鎖置換反応（Strand Dis
placement Amplification；ＳＤＡ）による増幅に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】Ｉｎ ｖｉｔｒｏの核酸増幅技術は少量
の核酸の検出および分析のための効果的な手段であり、
これらの方法の高程度の感度は、感染および遺伝病の診
断、分析のための遺伝子の単離、並びに法医学における
特異的な核酸の検出のために、これらの方法を開発しよ
うという意欲をかきたててきた。核酸増幅方法は例えば
以下のものを含む：複製連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ
鎖反応（ＬＣＲ）、自己維持配列複製（Self Sustained
Sequence Replication）（３ＳＲ）、核酸配列基礎増
幅（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）
（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介複製（ＴＭＲ）および鎖置換
増幅（Strand Displacement Amplification）（ＳＤ
Ａ）。鎖置換増幅は、等温増幅反応の一種で、一定の温
度において３０分未満で標的配列の１０億倍以上の増幅
産物を製造することができる（Ｇ.Ｔ.Ｗａｌｋｅｒら、
１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ８９，３９２−３９６；Ｇ.Ｔ.Ｗａｌｋｅｒら、
１９９２．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ． ２０．１６
９１−１６９６；米国特許第５,４５５,１６６号；米国
特許第５,２７０,１８４号；欧州特許出願（ＥＰ）０
６８４ ３１５）。
の核酸の検出および分析のための効果的な手段であり、
これらの方法の高程度の感度は、感染および遺伝病の診
断、分析のための遺伝子の単離、並びに法医学における
特異的な核酸の検出のために、これらの方法を開発しよ
うという意欲をかきたててきた。核酸増幅方法は例えば
以下のものを含む：複製連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ
鎖反応（ＬＣＲ）、自己維持配列複製（Self Sustained
Sequence Replication）（３ＳＲ）、核酸配列基礎増
幅（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）
（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介複製（ＴＭＲ）および鎖置換
増幅（Strand Displacement Amplification）（ＳＤ
Ａ）。鎖置換増幅は、等温増幅反応の一種で、一定の温
度において３０分未満で標的配列の１０億倍以上の増幅
産物を製造することができる（Ｇ.Ｔ.Ｗａｌｋｅｒら、
１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ８９，３９２−３９６；Ｇ.Ｔ.Ｗａｌｋｅｒら、
１９９２．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ． ２０．１６
９１−１６９６；米国特許第５,４５５,１６６号；米国
特許第５,２７０,１８４号；欧州特許出願（ＥＰ）０
６８４ ３１５）。
【０００３】ＳＤＡ反応は、約３７℃と４２℃の間の一
定温度、あるいは、増幅の効率および特異性を上昇させ
るために、一定のより高温で（公開された欧州特許出願
第０６８４ ３１５号に記載されたような好熱性ＳＤＡ
またはｔＳＤＡ）行うことができる。どちらの形式にお
いても、ＳＤＡは１）半修飾された制限エンドヌクレア
ーゼ認識／切断部位をニッキングする制限エンドヌクレ
アーゼ、および２）標的配列を鋳型として用いて新しい
鎖を重合化しながら、標的配列のコピーをニックから伸
長させて、置換するポリメラーゼを採用する。ニッキン
グおよび置換の繰り返しサイクルが標的配列の新たなコ
ピーを製造する。
定温度、あるいは、増幅の効率および特異性を上昇させ
るために、一定のより高温で（公開された欧州特許出願
第０６８４ ３１５号に記載されたような好熱性ＳＤＡ
またはｔＳＤＡ）行うことができる。どちらの形式にお
いても、ＳＤＡは１）半修飾された制限エンドヌクレア
ーゼ認識／切断部位をニッキングする制限エンドヌクレ
アーゼ、および２）標的配列を鋳型として用いて新しい
鎖を重合化しながら、標的配列のコピーをニックから伸
長させて、置換するポリメラーゼを採用する。ニッキン
グおよび置換の繰り返しサイクルが標的配列の新たなコ
ピーを製造する。
【０００４】ＳＤＡ反応は、米国特許第５,４５５,１６
６号；米国特許第５,２７０,１８４号；欧州特許出願０
６８４ ３１５に記載されている。適用する温度および
酵素にかかわらず、ＳＤＡ反応の工程は同じであり、標
的配列を首尾よく増幅するためにはいくつかの特異的な
酵素活性が必要とされる。ＳＤＡポリメラーゼは、１）
天然に、または不活性化によって５'−３'エキソヌクレ
アーゼ活性を欠いており、２）ＳＤＡに必要な、誘導体
化されたデオキシヌクレオシドトリフォスフェート（ｄ
ＮＴＰｓ）（αチオ−ｄＮＴＰｓ等のヌクレオチド誘導
体）を取り込み、３）一本鎖ニックから開始する二本鎖
分子から下流の一本鎖を置換し、そして好ましくは４）
アンプリコンの汚染除去（ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉ
ｏｎ）を可能にするためにｄＵＴＰを取り込まなければ
ならない。ＳＤＡ制限エンドヌクレアーゼは、１）認識
／切断部位が半修飾されている場合に、二本鎖認識／切
断部位をニッキングし（即ち、二本鎖のうちの一本鎖を
切断する）、２）認識／切断部位から乖離して、ポリメ
ラーゼが結合して標的を増幅することを可能にし、そし
て、好ましくは３）認識／切断部位に取り込まれたｄＵ
ＴＰによって影響を受けない、ものでなくてはならな
い。ｄＮＴＰ類似体の制限エンドヌクレアーゼ認識部位
への取り込みは、制限エンドヌクレアーゼによるニッキ
ングを誘導する。チオール化されたｄＮＴＰはＳＤＡに
最も一般的に用いられるヌクレオチド類似体であるが、
しかしながら、メチル−置換ｄＮＴＰの取り込みもまた
ニッキングを誘導する。ＳＤＡのための適当な生物学的
活性を有するポリメラーゼおよび制限エンドヌクレアー
ゼは上述した特許文献に記載されている。ＳＤＡによる
増幅に関する用語は欧州特許出願０ ６８４ ３１５に定
義されている。
６号；米国特許第５,２７０,１８４号；欧州特許出願０
６８４ ３１５に記載されている。適用する温度および
酵素にかかわらず、ＳＤＡ反応の工程は同じであり、標
的配列を首尾よく増幅するためにはいくつかの特異的な
酵素活性が必要とされる。ＳＤＡポリメラーゼは、１）
天然に、または不活性化によって５'−３'エキソヌクレ
アーゼ活性を欠いており、２）ＳＤＡに必要な、誘導体
化されたデオキシヌクレオシドトリフォスフェート（ｄ
ＮＴＰｓ）（αチオ−ｄＮＴＰｓ等のヌクレオチド誘導
体）を取り込み、３）一本鎖ニックから開始する二本鎖
分子から下流の一本鎖を置換し、そして好ましくは４）
アンプリコンの汚染除去（ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉ
ｏｎ）を可能にするためにｄＵＴＰを取り込まなければ
ならない。ＳＤＡ制限エンドヌクレアーゼは、１）認識
／切断部位が半修飾されている場合に、二本鎖認識／切
断部位をニッキングし（即ち、二本鎖のうちの一本鎖を
切断する）、２）認識／切断部位から乖離して、ポリメ
ラーゼが結合して標的を増幅することを可能にし、そし
て、好ましくは３）認識／切断部位に取り込まれたｄＵ
ＴＰによって影響を受けない、ものでなくてはならな
い。ｄＮＴＰ類似体の制限エンドヌクレアーゼ認識部位
への取り込みは、制限エンドヌクレアーゼによるニッキ
ングを誘導する。チオール化されたｄＮＴＰはＳＤＡに
最も一般的に用いられるヌクレオチド類似体であるが、
しかしながら、メチル−置換ｄＮＴＰの取り込みもまた
ニッキングを誘導する。ＳＤＡのための適当な生物学的
活性を有するポリメラーゼおよび制限エンドヌクレアー
ゼは上述した特許文献に記載されている。ＳＤＡによる
増幅に関する用語は欧州特許出願０ ６８４ ３１５に定
義されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】アルファ−ホウ素化さ
れたデオキシヌクレオシドトリフォスフェートは、半修
飾された認識／切断部位を作成するために制限エンドヌ
クレアーゼの二本鎖制限エンドヌクレアーゼ認識／切断
部位に取り込まれた場合、制限エンドヌクレアーゼによ
るニッキング（二本鎖のうちの一本の切断）を誘導する
ことが、今や見いだされた。アルファ−ホウ素化された
デオキシヌクレオシドトリフォスフェート（ｄＮＴＰα
ＢＨ3）はＳＤＡにおいて増幅反応を継続させるのに必
要なニッキング可能な半修飾された制限エンドヌクレア
ーゼ認識／切断部位を生成するのに有用である。
れたデオキシヌクレオシドトリフォスフェートは、半修
飾された認識／切断部位を作成するために制限エンドヌ
クレアーゼの二本鎖制限エンドヌクレアーゼ認識／切断
部位に取り込まれた場合、制限エンドヌクレアーゼによ
るニッキング（二本鎖のうちの一本の切断）を誘導する
ことが、今や見いだされた。アルファ−ホウ素化された
デオキシヌクレオシドトリフォスフェート（ｄＮＴＰα
ＢＨ3）はＳＤＡにおいて増幅反応を継続させるのに必
要なニッキング可能な半修飾された制限エンドヌクレア
ーゼ認識／切断部位を生成するのに有用である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】ＳＤＡは、５'−３'エキ
ソヌクレアーゼ活性を欠き、二本鎖核酸における一本鎖
ニックからの重合を開始し、そして、ニッキングされて
いない鎖を鋳型として用いて新しい相補鎖を生成しなが
ら、ニックの下流の鎖を置換するポリメラーゼを必要と
する。鎖置換活性によって標的はさらなるコピーの合成
が可能となり、一本鎖伸長産物が生成され、指数関数的
増幅反応においてそれに第二増幅プライマーがハイブリ
ダイズする。ｄＮＴＰ類似体の取り込みが制限エンドヌ
クレアーゼによるニッキングを誘導するに際し、ポリメ
ラーゼは選択されたデオキシヌクレオチド類似体を取り
込むことができ、そしてそれを含む鎖を置換することが
できなければならない。
ソヌクレアーゼ活性を欠き、二本鎖核酸における一本鎖
ニックからの重合を開始し、そして、ニッキングされて
いない鎖を鋳型として用いて新しい相補鎖を生成しなが
ら、ニックの下流の鎖を置換するポリメラーゼを必要と
する。鎖置換活性によって標的はさらなるコピーの合成
が可能となり、一本鎖伸長産物が生成され、指数関数的
増幅反応においてそれに第二増幅プライマーがハイブリ
ダイズする。ｄＮＴＰ類似体の取り込みが制限エンドヌ
クレアーゼによるニッキングを誘導するに際し、ポリメ
ラーゼは選択されたデオキシヌクレオチド類似体を取り
込むことができ、そしてそれを含む鎖を置換することが
できなければならない。
【０００７】チオール化された、またはメチル化された
ｄＮＴＰを用いた場合にＳＤＡにおける使用に必要な性
質を有するいくつかのポリメラーゼが同定された：ｅｘ
ｏ-Ｋｌｅｎｏｗ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｈ
ｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ｅｘｏ- Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｅｘｏ- Ｄｅｅｐ
Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）、Ｂｓｔ（ＢｉｏＲａｄ）、ｅｘｏ- Ｐｆｕ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）および
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｔａｑ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）。ポリメラーゼＴｔｈ（Ｂｏｅｇｒｉｎｇｅ
ｒ）、Ｔｆｌ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、ＲＥＰＬＩＮＡ
ＳＥ（ＤｕＰｏｎｔ）およびＲＥＰＬＩＴＨＥＲＭ（Ｅ
ｐｉｃｅｎｔｒｅ）鎖は、ニックからの置換は行うが、
５'−３’エキソヌクレアーゼ活性も有する。これらの
ポリメラーゼは、例えば遺伝子工学によってエキソヌク
レアーゼ活性を除いた後に本発明の方法において有用で
ある。新たな置換を有するｄＮＴＰが望まれる場合に、
後述するような日常的なスクリーニングアッセイを用い
てポリメラーゼが必要な性質を有するか否かを決定して
もよい。
ｄＮＴＰを用いた場合にＳＤＡにおける使用に必要な性
質を有するいくつかのポリメラーゼが同定された：ｅｘ
ｏ-Ｋｌｅｎｏｗ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｈ
ｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ｅｘｏ- Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｅｘｏ- Ｄｅｅｐ
Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）、Ｂｓｔ（ＢｉｏＲａｄ）、ｅｘｏ- Ｐｆｕ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）および
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｔａｑ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）。ポリメラーゼＴｔｈ（Ｂｏｅｇｒｉｎｇｅ
ｒ）、Ｔｆｌ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、ＲＥＰＬＩＮＡ
ＳＥ（ＤｕＰｏｎｔ）およびＲＥＰＬＩＴＨＥＲＭ（Ｅ
ｐｉｃｅｎｔｒｅ）鎖は、ニックからの置換は行うが、
５'−３’エキソヌクレアーゼ活性も有する。これらの
ポリメラーゼは、例えば遺伝子工学によってエキソヌク
レアーゼ活性を除いた後に本発明の方法において有用で
ある。新たな置換を有するｄＮＴＰが望まれる場合に、
後述するような日常的なスクリーニングアッセイを用い
てポリメラーゼが必要な性質を有するか否かを決定して
もよい。
【０００８】反応を永続させ、そして続く標的増幅のラ
ウンドの開始を可能にするのはニッキングであり、ニッ
キング活性はＳＤＡに必須である。即ち、ＳＤＡに適当
な制限エンドヌクレアーゼは制限エンドヌクレアーゼの
二本鎖半修飾認識／切断部位の二本鎖のうちの一本のみ
を切断しなければならない（“ニッキング”）。そし
て、制限エンドヌクレアーゼは認識／切断部位から乖離
して、ポリメラーゼがニックに結合して伸長を始めるの
を可能にしなければならない。制限酵素は一般には二本
鎖破壊をもたらすので、二本鎖中の切断部位の二本鎖の
うちの一本の切断は選択的に抑制されなければならな
い。ＳＤＡでは、それは、重合化の際に制限エンドヌク
レアーゼ認識部位に少なくとも１種類の置換ヌクレオチ
ド（ヌクレオチド類似体）を導入し、半修飾部位を生成
することによって達成される。後述するような日常的な
スクリーニングアッセイを用いて、半修飾された制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位に新たなヌクレオチド類似体
が取り込まれた場合にニッキングが誘導されるか否かを
決定することができる。
ウンドの開始を可能にするのはニッキングであり、ニッ
キング活性はＳＤＡに必須である。即ち、ＳＤＡに適当
な制限エンドヌクレアーゼは制限エンドヌクレアーゼの
二本鎖半修飾認識／切断部位の二本鎖のうちの一本のみ
を切断しなければならない（“ニッキング”）。そし
て、制限エンドヌクレアーゼは認識／切断部位から乖離
して、ポリメラーゼがニックに結合して伸長を始めるの
を可能にしなければならない。制限酵素は一般には二本
鎖破壊をもたらすので、二本鎖中の切断部位の二本鎖の
うちの一本の切断は選択的に抑制されなければならな
い。ＳＤＡでは、それは、重合化の際に制限エンドヌク
レアーゼ認識部位に少なくとも１種類の置換ヌクレオチ
ド（ヌクレオチド類似体）を導入し、半修飾部位を生成
することによって達成される。後述するような日常的な
スクリーニングアッセイを用いて、半修飾された制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位に新たなヌクレオチド類似体
が取り込まれた場合にニッキングが誘導されるか否かを
決定することができる。
【０００９】デオキシヌクレオチドフォスフォロチオエ
ートおよびメチル化ヌクレオチドが、ＳＤＡにおいてニ
ッキングを誘導するために使用されてきた。ＳＤＡにお
いて有用な制限エンドヌクレアーゼ認識部位、並びにそ
れらの部位にニッキングを誘導するデオキチヌクレオチ
ド類似体が米国特許第５,４５５,１６６号および欧州特
許出願第０ ６８４ ３１５号に記載されている。本発明
は、ＳＤＡの際にポリメラーゼによって取り込まれ、制
限エンドヌクレアーゼによるニッキングを誘導して増幅
反応を継続させる、新たなグループのｄＮＴＰ類似体
（アルファ−ホウ素化ｄＮＴＰｓ）を提供する。対応す
るアルファ−ホウ素化ｄＮＴＰは、記載されたような適
当な制限エンドヌクレアーゼおよび認識部位を適用する
ＳＤＡ反応において、これらの文献において挙げられて
いるいかなるｄＮＴＰ類似体の代わりに用いてもよい。
ートおよびメチル化ヌクレオチドが、ＳＤＡにおいてニ
ッキングを誘導するために使用されてきた。ＳＤＡにお
いて有用な制限エンドヌクレアーゼ認識部位、並びにそ
れらの部位にニッキングを誘導するデオキチヌクレオチ
ド類似体が米国特許第５,４５５,１６６号および欧州特
許出願第０ ６８４ ３１５号に記載されている。本発明
は、ＳＤＡの際にポリメラーゼによって取り込まれ、制
限エンドヌクレアーゼによるニッキングを誘導して増幅
反応を継続させる、新たなグループのｄＮＴＰ類似体
（アルファ−ホウ素化ｄＮＴＰｓ）を提供する。対応す
るアルファ−ホウ素化ｄＮＴＰは、記載されたような適
当な制限エンドヌクレアーゼおよび認識部位を適用する
ＳＤＡ反応において、これらの文献において挙げられて
いるいかなるｄＮＴＰ類似体の代わりに用いてもよい。
【００１０】
【実施の形態】ホウ素化デオキチヌクレオシドトリフォ
スフェート化合物（Ｂｏｒｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｓから入手可能）は、それらのＳＤＡにおける有用性を
評価し予測する３つのアッセイにおいてスクリーニング
する。第一は、ポリメラーゼがホウ素化ｄＮＴＰを取り
込むことができるか否かを決定するのに用いられるポリ
メラーゼ活性アッセイである。あるポリメラーゼ活性ア
ッセイでは、活性化された胸腺ＤＮＡがポリメラーゼの
様々な希釈液の基質として用いられた。選択されたポリ
メラーゼは，２５ｍＭ リン酸カリウム、５ｍＭ 硫酸ア
ンモニウム、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよ
び１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む、酵素希釈液中に希釈さ
れた。１０μｌの希釈液をアッセイのための緩衝液（２
５ｍＭ リン酸カリウム、０．１５Ｍの各ｄＮＴＰおよ
びｄＮＴＰ類似体、４ｍＭの塩化マグネシウム、４.５
μｇの活性化ウシ胸腺ＤＮＡおよび０．３μｌの３００
０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ 32Ｐ−標識 ｄＮＴＰ）に加え
た。平衡化の後、反応物を反応温度で１５分間インキュ
ベートした。ある間隔毎に、１５μｌの反応物を取り除
き、反応を停止するたんに４５μｌの２５ｍＭ ＥＤＴ
Ａに加えた。停止された反応物の４０μｌをＤＥ−８１
フィルターディスク上にスポットし、１０ｍｌの０.３
Ｍ ギ酸アンモニウム ｐＨ８.０で各回５分間、最低４
回洗浄した。最終洗浄後、フィルターをメタノール中で
リンスし、吸収紙上で空乾し、シンチレーション液とと
もにシンチレーション用バイアルに入れ、そして計測し
た。
スフェート化合物（Ｂｏｒｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｓから入手可能）は、それらのＳＤＡにおける有用性を
評価し予測する３つのアッセイにおいてスクリーニング
する。第一は、ポリメラーゼがホウ素化ｄＮＴＰを取り
込むことができるか否かを決定するのに用いられるポリ
メラーゼ活性アッセイである。あるポリメラーゼ活性ア
ッセイでは、活性化された胸腺ＤＮＡがポリメラーゼの
様々な希釈液の基質として用いられた。選択されたポリ
メラーゼは，２５ｍＭ リン酸カリウム、５ｍＭ 硫酸ア
ンモニウム、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよ
び１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む、酵素希釈液中に希釈さ
れた。１０μｌの希釈液をアッセイのための緩衝液（２
５ｍＭ リン酸カリウム、０．１５Ｍの各ｄＮＴＰおよ
びｄＮＴＰ類似体、４ｍＭの塩化マグネシウム、４.５
μｇの活性化ウシ胸腺ＤＮＡおよび０．３μｌの３００
０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ 32Ｐ−標識 ｄＮＴＰ）に加え
た。平衡化の後、反応物を反応温度で１５分間インキュ
ベートした。ある間隔毎に、１５μｌの反応物を取り除
き、反応を停止するたんに４５μｌの２５ｍＭ ＥＤＴ
Ａに加えた。停止された反応物の４０μｌをＤＥ−８１
フィルターディスク上にスポットし、１０ｍｌの０.３
Ｍ ギ酸アンモニウム ｐＨ８.０で各回５分間、最低４
回洗浄した。最終洗浄後、フィルターをメタノール中で
リンスし、吸収紙上で空乾し、シンチレーション液とと
もにシンチレーション用バイアルに入れ、そして計測し
た。
【００１１】例えば、Ｂｃａポリメラーゼ（Ｔａｋａｒ
ａまたはＰａｎＶｅｒａ）の６０℃におけるｄＣＴＰα
ＢＨ3の取り込みは、ポリメラーゼ活性アッセイにおい
てｄＣＴＰおよびｄＣＴＰαＳを対照として参照して試
験した。ｄＣＴＰ対照は、１：３０,０００および１：
４０,０００希釈において測定した。ｄＣＴＰαＳ対照
は、１：２０,０００および１：３０,０００希釈におい
て測定し、ホウ素化ｄＣＴＰは、１：２０,０００、
１：３０,０００および１：４０,０００希釈において測
定した。結果は３点（５、１０および１５分）で測定
し、空フィルターについてのバックグラウンドの値と比
較した。Ｂｃａポリメラーゼによる非修飾ｄＣＴＰ取り
込みは、１５２単位／μｌの活性を与えた。ｄＣＴＰα
Ｓによる完全な置換によりポリメラーゼ活性は３９単位
／μｌに低下した。チオール化されたｄＮＴＰの存在に
よるポリメラーゼの活性の低下は以前から観察されてき
たが、ＳＤＡ効率には有意な阻害を与えないようであ
る。ｄＣＴＰαＢＨ3による完全な置換の結果、ｄＣＴ
ＰαＳの場合と同様にポリメラーゼ活性が低下した（４
０−５０単位／μｌ）。これらの結果に基づき、ポリメ
ラーゼ活性アッセイは、ｄＮＴＰのアルファ−ホウ素化
は重合化反応を阻害しないことを示しているので、ＳＤ
Ａポリメラーゼは他のホウ素化ｄＮＴＰｓ（例えば、ｄ
ＡＴＰαＢＨ3、ＴＴＰαＢＨ3またはｄＧＴＰαＢ
Ｈ3）の取り込みも行えると期待できるであろう。
ａまたはＰａｎＶｅｒａ）の６０℃におけるｄＣＴＰα
ＢＨ3の取り込みは、ポリメラーゼ活性アッセイにおい
てｄＣＴＰおよびｄＣＴＰαＳを対照として参照して試
験した。ｄＣＴＰ対照は、１：３０,０００および１：
４０,０００希釈において測定した。ｄＣＴＰαＳ対照
は、１：２０,０００および１：３０,０００希釈におい
て測定し、ホウ素化ｄＣＴＰは、１：２０,０００、
１：３０,０００および１：４０,０００希釈において測
定した。結果は３点（５、１０および１５分）で測定
し、空フィルターについてのバックグラウンドの値と比
較した。Ｂｃａポリメラーゼによる非修飾ｄＣＴＰ取り
込みは、１５２単位／μｌの活性を与えた。ｄＣＴＰα
Ｓによる完全な置換によりポリメラーゼ活性は３９単位
／μｌに低下した。チオール化されたｄＮＴＰの存在に
よるポリメラーゼの活性の低下は以前から観察されてき
たが、ＳＤＡ効率には有意な阻害を与えないようであ
る。ｄＣＴＰαＢＨ3による完全な置換の結果、ｄＣＴ
ＰαＳの場合と同様にポリメラーゼ活性が低下した（４
０−５０単位／μｌ）。これらの結果に基づき、ポリメ
ラーゼ活性アッセイは、ｄＮＴＰのアルファ−ホウ素化
は重合化反応を阻害しないことを示しているので、ＳＤ
Ａポリメラーゼは他のホウ素化ｄＮＴＰｓ（例えば、ｄ
ＡＴＰαＢＨ3、ＴＴＰαＢＨ3またはｄＧＴＰαＢ
Ｈ3）の取り込みも行えると期待できるであろう。
【００１２】ポリメラーゼ伸長アッセイを用いて、ポリ
メラーゼがホウ素化デオキシヌクレオシドトルホスフェ
ートの存在下で鎖置換を行う能力について評価できる。
あるポリメラーゼ伸長アッセイでは、ＳＤＡの維持に必
須なニックは、ＡｌｕＩ消化したＭ１３プラスミド上の
下流の非標識プライマーに近接する上流の標識プライマ
ーをアニールすることによって行う。プラスミドを消化
してポリメラーゼの指定された終始点を提供し、これに
よりゲル上で指定された大きさのバンドが得られる。こ
の例では、アッセイは、２５ｍＭ ＫiＰＯ4，ｐＨ７.
５、０．１μｇ／μｌ ＢＳＡ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、
２５０ｎｇの消化された標的プラスミド、ポリメラー
ゼ、並びにポリヌクレオチドキナーゼで放射活性的に末
端ラベルされた４０ｎＭの上流置換プライマー中で行わ
れた。チオール化またはホウ素化ｄＣＴＰは種々の量で
含ませ、そして各反応において４０ｎＭの下流プライマ
ーを含ませるか、あるいは含ませなかった。混合物を１
００℃で３分間変性し、ポリメラーゼに適当な反応温度
で２分間冷却した。そして試験されるポリメラーゼを添
加し、伸長反応を１０分間継続させた。伸長は２５ｍＭ
ＥＤＴＡ／９８％ホルムアミドの添加によって停止し
た。そして、試料を変性ゲル上で電気泳動し、オウトラ
ジオグラフィーで分析した。ポリメラーゼが下流プライ
マーを置換し、上流標識プライマーを完全に伸長した場
合、指定された大きさのバンドが観察されるであろう。
生成物バンドの量は、ポリメラーゼによるプライマー伸
長の効率を示唆した。
メラーゼがホウ素化デオキシヌクレオシドトルホスフェ
ートの存在下で鎖置換を行う能力について評価できる。
あるポリメラーゼ伸長アッセイでは、ＳＤＡの維持に必
須なニックは、ＡｌｕＩ消化したＭ１３プラスミド上の
下流の非標識プライマーに近接する上流の標識プライマ
ーをアニールすることによって行う。プラスミドを消化
してポリメラーゼの指定された終始点を提供し、これに
よりゲル上で指定された大きさのバンドが得られる。こ
の例では、アッセイは、２５ｍＭ ＫiＰＯ4，ｐＨ７.
５、０．１μｇ／μｌ ＢＳＡ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、
２５０ｎｇの消化された標的プラスミド、ポリメラー
ゼ、並びにポリヌクレオチドキナーゼで放射活性的に末
端ラベルされた４０ｎＭの上流置換プライマー中で行わ
れた。チオール化またはホウ素化ｄＣＴＰは種々の量で
含ませ、そして各反応において４０ｎＭの下流プライマ
ーを含ませるか、あるいは含ませなかった。混合物を１
００℃で３分間変性し、ポリメラーゼに適当な反応温度
で２分間冷却した。そして試験されるポリメラーゼを添
加し、伸長反応を１０分間継続させた。伸長は２５ｍＭ
ＥＤＴＡ／９８％ホルムアミドの添加によって停止し
た。そして、試料を変性ゲル上で電気泳動し、オウトラ
ジオグラフィーで分析した。ポリメラーゼが下流プライ
マーを置換し、上流標識プライマーを完全に伸長した場
合、指定された大きさのバンドが観察されるであろう。
生成物バンドの量は、ポリメラーゼによるプライマー伸
長の効率を示唆した。
【００１３】Ｂｃａポリメラーゼは（６０℃で実験）、
ホウ素化ｄＣＴＰまたはｄＣＴＰαＳのどちらの場合で
も伸長アッセイにおいて同様によく機能した。下流プラ
イマーが存在しない場合、種々のヌクレオチド類似体の
存在下で同量の伸長産物が観察され、これは同等の効率
で取り込みが行われたことを示唆する。下流プライマー
が存在する場合、全ての反応はより少ない完全伸長産物
を産生し、短い未完成の産物が現れた。ｄＣＴＰαＢＨ
3反応の方がｄＣＴＰαＳ反応より多くの未完成産物が
観察されたが、アッセイではホウ素化ｄＣＴＰはチオー
ル化ｄＣＴＰに匹敵しうると考えられた。これらの結果
に基づき、このアッセイは、ホウ素誘導体化はこれらの
重合化反応を阻害しないことを示しているので、ＳＤＡ
ポリメラーゼは他のホウ素化ｄＮＴＰｓ（例えば、ｄＡ
ＴＰαＢＨ3、ＴＴＰαＢＨ3またはｄＧＴＰαＢＨ3）
の存在下でも伸長および置換を行えると期待できるであ
ろう。
ホウ素化ｄＣＴＰまたはｄＣＴＰαＳのどちらの場合で
も伸長アッセイにおいて同様によく機能した。下流プラ
イマーが存在しない場合、種々のヌクレオチド類似体の
存在下で同量の伸長産物が観察され、これは同等の効率
で取り込みが行われたことを示唆する。下流プライマー
が存在する場合、全ての反応はより少ない完全伸長産物
を産生し、短い未完成の産物が現れた。ｄＣＴＰαＢＨ
3反応の方がｄＣＴＰαＳ反応より多くの未完成産物が
観察されたが、アッセイではホウ素化ｄＣＴＰはチオー
ル化ｄＣＴＰに匹敵しうると考えられた。これらの結果
に基づき、このアッセイは、ホウ素誘導体化はこれらの
重合化反応を阻害しないことを示しているので、ＳＤＡ
ポリメラーゼは他のホウ素化ｄＮＴＰｓ（例えば、ｄＡ
ＴＰαＢＨ3、ＴＴＰαＢＨ3またはｄＧＴＰαＢＨ3）
の存在下でも伸長および置換を行えると期待できるであ
ろう。
【００１４】全てのヌクレオチド類似体があらゆるエン
ドヌクレアーゼによるニッキングを誘導するわけではな
いであろう。そこで、選択されたヌクレオチド類似体の
存在下で制限エンドヌクレアーゼのニッキング特性を評
価するためのアッセイを、二本鎖制限エンドヌクレアー
ゼ認識／切断部位に取り込まれた修飾デオキシヌクレオ
シドトリホスフェートが、二本鎖のうちの一本をエンド
ヌクレアーゼによる切断から保護する活性に基づいて開
発した。これは、類似体−誘導ニッキングアッセイまた
は鎖保護アッセイと呼ばれる。鎖保護アッセイでは、選
択されたエンドヌクレアーゼ認識部位を有する一本鎖鋳
型、並びに鋳型の３’末端に相補的なプライマーを合成
する。そして鋳型とプライマーを、好ましくは放射性ラ
ベルで標識する。プライマーと鋳型をハイブリダイズ
し、選択された修飾ｄＮＴＰｓ（ヌクレオチド類似体）
をプライマーの伸長によって一本の鎖に取り込み、半修
飾された制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位を含む
完全に二本鎖の分子を産生する。この産物を切断につい
ての慣用化された条件下で制限エンドヌクレアーゼによ
って処理する。変性条件下での反応産物の電気泳動分析
を用いて、産生された断片の大きさによって、認識／切
断部位がニックされたか、両方の鎖が切断されたか、あ
るいは全く切断されなかったか否かを決定する。電気泳
動上の断片の長さはまた、認識／切断部位の二本鎖のう
ちどちらが（即ち、修飾された方か、または修飾されて
ない方か）切断から保護されたかを決定するために用い
ることもできる。
ドヌクレアーゼによるニッキングを誘導するわけではな
いであろう。そこで、選択されたヌクレオチド類似体の
存在下で制限エンドヌクレアーゼのニッキング特性を評
価するためのアッセイを、二本鎖制限エンドヌクレアー
ゼ認識／切断部位に取り込まれた修飾デオキシヌクレオ
シドトリホスフェートが、二本鎖のうちの一本をエンド
ヌクレアーゼによる切断から保護する活性に基づいて開
発した。これは、類似体−誘導ニッキングアッセイまた
は鎖保護アッセイと呼ばれる。鎖保護アッセイでは、選
択されたエンドヌクレアーゼ認識部位を有する一本鎖鋳
型、並びに鋳型の３’末端に相補的なプライマーを合成
する。そして鋳型とプライマーを、好ましくは放射性ラ
ベルで標識する。プライマーと鋳型をハイブリダイズ
し、選択された修飾ｄＮＴＰｓ（ヌクレオチド類似体）
をプライマーの伸長によって一本の鎖に取り込み、半修
飾された制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位を含む
完全に二本鎖の分子を産生する。この産物を切断につい
ての慣用化された条件下で制限エンドヌクレアーゼによ
って処理する。変性条件下での反応産物の電気泳動分析
を用いて、産生された断片の大きさによって、認識／切
断部位がニックされたか、両方の鎖が切断されたか、あ
るいは全く切断されなかったか否かを決定する。電気泳
動上の断片の長さはまた、認識／切断部位の二本鎖のう
ちどちらが（即ち、修飾された方か、または修飾されて
ない方か）切断から保護されたかを決定するために用い
ることもできる。
【００１５】例えば、ＢｓｏＢＩ部位（ＣＴＣＧＧＧ）
を含む４５マーの鋳型および鋳型の３’部分に相補的な
２１マーを合成した。鋳型またはプライマーのいずれか
をポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射活性的に末端
標識した。２１マーを鋳型にハイブリダイズさせ、以下
のようにα−ホウ素化ｄＣＴＰ（ｄＣＴＰαＢＨ3）の
存在下で２１マーを鋳型上を伸長させることによって、
半修飾ＢｓｏＢＩ制限部位を構築した。３５ｍＭのＫi
ＰＯ4，ｐＨ７.５；０．１μｇ／μｌのＢＳＡ；各１ｍ
ＭのＴＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ；ｄＣ
ＴＰαＢＨ3もしくはα−チオ−ｄＣＴＰ（ｄＣＴＰα
Ｓ）；５０ｎＭの鋳型（標識もしくは非標識）並びに５
０ｎＭのプライマー（標識もしくは非標識）を含む反応
物を作成した。ＤＮＡを１００℃で２分間変性し、反応
物を３７℃で２分間冷却した。８単位のｅｘｏ-クレノ
ーポリメラーゼを添加し、選択されたｄＣＴＰ剤の存在
下で伸長反応を３７℃で３０分間行わせた。ポリメラー
ゼを６０℃で１０分間熱不活性化し、１０μｌの反応物
を対照として用いるために回収した。３５ｍＭのＫiＰ
Ｏ4、０．１μｇ／μｌのＢＳＡ中の２０単位のＢｓｏ
Ｉを添加し、切断反応物を６０℃で１５分間インキュベ
ートした。切断反応を、２５ｍＭ ＥＤＴＡ／９８％ホ
ルムアミドの添加によって停止させた。そして、反応物
を８％変性ゲル上を電気泳動し、オートラジオグラフィ
ーにより結果を可視化した。ＢｓｏＢＩの半修飾制限部
位の修飾された鎖は、ｄＣＴＰαＢＨ3またはｄＣＴＰ
αＳのいずれの取り込みによっても完全に保護され、一
方、非修飾鎖は有効に切断された（ニッキング）。鎖保
護アッセイにおけるニッキング活性の観察は、試験され
たヌクレオチド類似体／制限エンドヌクレアーゼの組は
ＳＤＡを持続させるであろうという指標となる。
を含む４５マーの鋳型および鋳型の３’部分に相補的な
２１マーを合成した。鋳型またはプライマーのいずれか
をポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射活性的に末端
標識した。２１マーを鋳型にハイブリダイズさせ、以下
のようにα−ホウ素化ｄＣＴＰ（ｄＣＴＰαＢＨ3）の
存在下で２１マーを鋳型上を伸長させることによって、
半修飾ＢｓｏＢＩ制限部位を構築した。３５ｍＭのＫi
ＰＯ4，ｐＨ７.５；０．１μｇ／μｌのＢＳＡ；各１ｍ
ＭのＴＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ；ｄＣ
ＴＰαＢＨ3もしくはα−チオ−ｄＣＴＰ（ｄＣＴＰα
Ｓ）；５０ｎＭの鋳型（標識もしくは非標識）並びに５
０ｎＭのプライマー（標識もしくは非標識）を含む反応
物を作成した。ＤＮＡを１００℃で２分間変性し、反応
物を３７℃で２分間冷却した。８単位のｅｘｏ-クレノ
ーポリメラーゼを添加し、選択されたｄＣＴＰ剤の存在
下で伸長反応を３７℃で３０分間行わせた。ポリメラー
ゼを６０℃で１０分間熱不活性化し、１０μｌの反応物
を対照として用いるために回収した。３５ｍＭのＫiＰ
Ｏ4、０．１μｇ／μｌのＢＳＡ中の２０単位のＢｓｏ
Ｉを添加し、切断反応物を６０℃で１５分間インキュベ
ートした。切断反応を、２５ｍＭ ＥＤＴＡ／９８％ホ
ルムアミドの添加によって停止させた。そして、反応物
を８％変性ゲル上を電気泳動し、オートラジオグラフィ
ーにより結果を可視化した。ＢｓｏＢＩの半修飾制限部
位の修飾された鎖は、ｄＣＴＰαＢＨ3またはｄＣＴＰ
αＳのいずれの取り込みによっても完全に保護され、一
方、非修飾鎖は有効に切断された（ニッキング）。鎖保
護アッセイにおけるニッキング活性の観察は、試験され
たヌクレオチド類似体／制限エンドヌクレアーゼの組は
ＳＤＡを持続させるであろうという指標となる。
【００１６】前述した全てのアッセイにおいて、ｄＣＴ
ＰαＢＨ3の性能はｄＣＴＰαＳの性能と実質的に同等
であることが観察された。ホウ素化ｄＮＴＰ上の修飾部
位はチオール化ｄＮＴＰ上の修飾部位と同じであり、そ
して、２つの基は類似する大きさであり、かつ類似する
電荷を有するため、ほとんどのα−ホウ素化ｄＮＴＰ
は、ＳＤＡに関する実質的に面において対応するα−チ
オール化ｄＮＴＰを模倣するであろう。従って、以前か
らＳＤＡにおける使用が同定されていた、あらゆる制限
エンドヌクレアーゼ認識部位におけるニッキングを誘導
することが知られているｄＮＴＰαＳのいずれも、対応
するｄＮＴＰαＢＨ3が置換できるであろうと確信され
る。即ち、以下のアルファ−ホウ素化ｄＮＴＰｓの示さ
れた半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位への取り込
みは、対応するｄＮＴＰαＳのようにＳＤＡ反応に必要
なニッキングを誘導するであろう。
ＰαＢＨ3の性能はｄＣＴＰαＳの性能と実質的に同等
であることが観察された。ホウ素化ｄＮＴＰ上の修飾部
位はチオール化ｄＮＴＰ上の修飾部位と同じであり、そ
して、２つの基は類似する大きさであり、かつ類似する
電荷を有するため、ほとんどのα−ホウ素化ｄＮＴＰ
は、ＳＤＡに関する実質的に面において対応するα−チ
オール化ｄＮＴＰを模倣するであろう。従って、以前か
らＳＤＡにおける使用が同定されていた、あらゆる制限
エンドヌクレアーゼ認識部位におけるニッキングを誘導
することが知られているｄＮＴＰαＳのいずれも、対応
するｄＮＴＰαＢＨ3が置換できるであろうと確信され
る。即ち、以下のアルファ−ホウ素化ｄＮＴＰｓの示さ
れた半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位への取り込
みは、対応するｄＮＴＰαＳのようにＳＤＡ反応に必要
なニッキングを誘導するであろう。
【００１７】
【表１】
【００１８】
【表２】
【００１９】ＳＤＡにおいて最も慣用的に使用されてい
る修飾ｄＮＴＰはチオール化ｄＮＴＰなので、これらの
試薬を用いた場合に最も高い効率の増幅を得るようにＳ
ＤＡを最適化した。チオール化ｄＮＴＰについて最適化
されたＳＤＡ反応へのホウ素化ｄＮＴＰの直接的な置換
が、最適な結果を与えるとは期待できないが、これはホ
ウ素化ｄＮＴＰの存在下におけるＳＤＡを示すのに最も
簡便な方法である。そこで、一般にｄＮＴＰαＳを用い
て行われているように、Ｂｓｔ（New EnglandBioLabs）
およびＢｃａポリメラーゼを用いて、ｄＣＴＰαＢＨ3
をＳＤＡ反応について試験した。Ｂｓｔ反応物は、以下
のものを含んだ：２５ｍＭ ＫiＰＯ4，ｐＨ７.５；０．
１μｇ／μｌ ＢＳＡ；０．０５μＭの各バンパープラ
イマー；０．５μＭ 各ＳＤＡ増幅プライマー；１．４
ｍＭ ｄＣＴＰαＳまたはｄＣＴＰαＢＨ3；各々０．５
ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＵＴＰおよびｄＡＴＰ；５００ｎｇ
のヒトＤＮＡ；４Ｘ１０5標的（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＩＳ６１１０挿入
要素）；１０％グリセロール；１２０単位のＢｓｏＢＩ
および６０単位のＢｓｔ。反応物はさらに６.９ｍＭ、
７.６ｍＭまたは８.４ｍＭ ＭｇＣｌ2を含み、これらは
４ｍＭ、４.７ｍＭまたは５.５ｍＭの遊離マグネシウム
を意味する。Ｂｃａ反応物も同様であるが、代わりに３
５ｍＭ ＫiＰＯ4，ｐＨ７.５；各々０．２ｍＭのｄＧＴ
ＰおよびｄＡＴＰ；１６０単位のＢｓｏＢＩおよび８単
位のＢｃａを用いた。Ｂｃａ反応物は、５.５ｍＭ、６
ｍＭまたは６.５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含み、これらは３．
２ｍＭ、３.７ｍＭまたは４.２ｍＭの遊離マグネシウム
を意味する。酵素およびＭｇＣｌ2以外の全ての試薬を
含むＳＤＡ反応物を調製し、そして１００℃で３分間変
性させた。次いで、反応物を５５℃で２分間冷却し、ポ
リメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼおよびＭｇＣｌ2
を加えて混合した。５５℃で３０分間増幅を進行させ
た。試料をドライアイス上で素早く冷凍させることによ
り反応を終了させた。
る修飾ｄＮＴＰはチオール化ｄＮＴＰなので、これらの
試薬を用いた場合に最も高い効率の増幅を得るようにＳ
ＤＡを最適化した。チオール化ｄＮＴＰについて最適化
されたＳＤＡ反応へのホウ素化ｄＮＴＰの直接的な置換
が、最適な結果を与えるとは期待できないが、これはホ
ウ素化ｄＮＴＰの存在下におけるＳＤＡを示すのに最も
簡便な方法である。そこで、一般にｄＮＴＰαＳを用い
て行われているように、Ｂｓｔ（New EnglandBioLabs）
およびＢｃａポリメラーゼを用いて、ｄＣＴＰαＢＨ3
をＳＤＡ反応について試験した。Ｂｓｔ反応物は、以下
のものを含んだ：２５ｍＭ ＫiＰＯ4，ｐＨ７.５；０．
１μｇ／μｌ ＢＳＡ；０．０５μＭの各バンパープラ
イマー；０．５μＭ 各ＳＤＡ増幅プライマー；１．４
ｍＭ ｄＣＴＰαＳまたはｄＣＴＰαＢＨ3；各々０．５
ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＵＴＰおよびｄＡＴＰ；５００ｎｇ
のヒトＤＮＡ；４Ｘ１０5標的（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＩＳ６１１０挿入
要素）；１０％グリセロール；１２０単位のＢｓｏＢＩ
および６０単位のＢｓｔ。反応物はさらに６.９ｍＭ、
７.６ｍＭまたは８.４ｍＭ ＭｇＣｌ2を含み、これらは
４ｍＭ、４.７ｍＭまたは５.５ｍＭの遊離マグネシウム
を意味する。Ｂｃａ反応物も同様であるが、代わりに３
５ｍＭ ＫiＰＯ4，ｐＨ７.５；各々０．２ｍＭのｄＧＴ
ＰおよびｄＡＴＰ；１６０単位のＢｓｏＢＩおよび８単
位のＢｃａを用いた。Ｂｃａ反応物は、５.５ｍＭ、６
ｍＭまたは６.５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含み、これらは３．
２ｍＭ、３.７ｍＭまたは４.２ｍＭの遊離マグネシウム
を意味する。酵素およびＭｇＣｌ2以外の全ての試薬を
含むＳＤＡ反応物を調製し、そして１００℃で３分間変
性させた。次いで、反応物を５５℃で２分間冷却し、ポ
リメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼおよびＭｇＣｌ2
を加えて混合した。５５℃で３０分間増幅を進行させ
た。試料をドライアイス上で素早く冷凍させることによ
り反応を終了させた。
【００２０】１０％非変性ゲル上を電気泳動し、臭化エ
チジウムで染色することにより増幅を検出した。あるい
は、以下のように、放射活性的に末端標識した検出プロ
ーブを増幅産物にハイブイダイズさせ、伸長させた：３
５ｍＭ ＫiＰＯ4、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、４−６ｍＭの
ＭｇＣｌ2中の１μＭ検出プローブの５μｌを増幅産物
に加え、混合物を１００℃で２分間変性させた。試料を
３７℃で１分間平衡化し、１単位のｅｘｏ-Ｋｌｅｎｏ
ｗポリメラーゼを添加した。伸長反応物を３７℃で１０
分間インキュベートし、１１μｌのホルムアルデヒドの
添加により停止し、そして８％配列決定ゲル上を電気泳
動した。オートラジオグラフィーによって伸長された検
出プローブを可視化した。
チジウムで染色することにより増幅を検出した。あるい
は、以下のように、放射活性的に末端標識した検出プロ
ーブを増幅産物にハイブイダイズさせ、伸長させた：３
５ｍＭ ＫiＰＯ4、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、４−６ｍＭの
ＭｇＣｌ2中の１μＭ検出プローブの５μｌを増幅産物
に加え、混合物を１００℃で２分間変性させた。試料を
３７℃で１分間平衡化し、１単位のｅｘｏ-Ｋｌｅｎｏ
ｗポリメラーゼを添加した。伸長反応物を３７℃で１０
分間インキュベートし、１１μｌのホルムアルデヒドの
添加により停止し、そして８％配列決定ゲル上を電気泳
動した。オートラジオグラフィーによって伸長された検
出プローブを可視化した。
【００２１】標的はｄＣＴＰαＢＨ3の存在下で首尾良
く増幅され、増幅係数は約１０4から３Ｘ１０5であっ
た。これらの増幅係数は、ｄＣＴＰαＳ反応において得
られる増幅係数の約１／１０００であるが、しかしなが
ら、前述したように、反応はホウ素化ｄＮＴＰの取り込
みについて最適化されていたわけではないので、増幅効
率の減少は予想外というわけではない。この実験は、ｄ
ＮＴＰαＢＨ3のＳＤＡにおける取り込みは標的増幅を
維持させるということを、明確に証明している。
く増幅され、増幅係数は約１０4から３Ｘ１０5であっ
た。これらの増幅係数は、ｄＣＴＰαＳ反応において得
られる増幅係数の約１／１０００であるが、しかしなが
ら、前述したように、反応はホウ素化ｄＮＴＰの取り込
みについて最適化されていたわけではないので、増幅効
率の減少は予想外というわけではない。この実験は、ｄ
ＮＴＰαＢＨ3のＳＤＡにおける取り込みは標的増幅を
維持させるということを、明確に証明している。
【００２２】
【００２３】(2) 配列情報 SEQ ID NO:1: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 12 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:1: CCAAAACCCT GG 12
【００２４】(2) 配列情報 SEQ ID NO:2: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 11 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:2: CCAGGTTTTG G 11
【００２５】(2) 配列情報 SEQ ID NO:3: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 12 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:3: GGTCTCTTTT TT 12
【００２６】(2) 配列情報 SEQ ID NO:4: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 11 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:4: CCAGGTTTTG G 11
【００２７】(2) 配列情報 SEQ ID NO:5: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 14 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:5: GGTGAGGATC GTTT 14
【００２８】(2) 配列情報 SEQ ID NO:6: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 11 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:6: GGATCGTTTT T 11
【００２９】(2) 配列情報 SEQ ID NO:7: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 19 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:7: GGATGGCATG TCTTTTGGG 19
【００３０】(2) 配列情報 SEQ ID NO:8: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 11 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:8: CCCGAGGAAG G 11
【００３１】(2) 配列情報 SEQ ID NO:9: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 10 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:9: GTCTCCAATC 10
【００３２】(2) 配列情報 SEQ ID NO:10: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 13 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:10: GGGTCTCCAG GAA 13
【００３３】(2) 配列情報 SEQ ID NO:11: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 11 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:11: GCAATGGCGG C 11
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲ ＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩ ＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲ ＩＣＡ (72)発明者 ジョージ・テランス・ウォーカー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27514，チャペル・ヒル，マウント・ボ ラス・ロード 209 (56)参考文献 特開 平５−192195（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (10)
- 【請求項１】ＳＤＡによって標的核酸配列を増幅する方
法であって、アルファ−ホウ素化デオキシヌクレオシド
トリフォスフェートを制限エンドヌクレアーゼの二本鎖
認識部位に導入し、よってＳＤＡ反応中に制限エンドヌ
クレアーゼによってニックを入れられる半修飾された制
限エンドヌクレアーゼ認識部位を生じさせる、ＳＤＡ反
応において標的核酸配列を増幅することを含む、前記方
法。 - 【請求項２】アルファ−ホウ素化デオキシヌクレオシド
トリフォスフェートが２'−デオキシシチジン−α−ホ
ウ素化トリフォスフェートである、請求項１の方法。 - 【請求項３】制限エンドヌクレアーゼがＢｓｏＢＩであ
る、請求項２の方法。 - 【請求項４】認識部位がＣＴＣＧＧＧである、請求項２
の方法。 - 【請求項５】制限エンドヌクレアーゼが、ＨｉｎｃＩ
Ｉ、ＡｖａＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＮｉｃｉＩおよびＢｓｒ
Ｉからなるグループから選択される、請求項１の方法。 - 【請求項６】制限エンドヌクレアーゼによる二本鎖ＤＮ
Ａのニッキングを誘導する方法であって、アルファ−ホ
ウ素化デオキシヌクレオシドトリフォスフェートを制限
エンドヌクレアーゼの二本鎖認識部位に導入して半修飾
された認識部位を生じさせ、よって、制限エンドヌクレ
アーゼによって半修飾された認識部位のニッキングを誘
導させることを含む、前記方法。 - 【請求項７】ホウ素化デオキシヌクレオシドトリフォス
フェートが２'−デオキシシチジン−α−ホウ素化トリ
フォスフェートである、請求項６の方法。 - 【請求項８】制限エンドヌクレアーゼがＢｓｏＢＩであ
る、請求項７の方法。 - 【請求項９】認識部位がＣＴＣＧＧＧである、請求項８
の方法。 - 【請求項１０】制限エンドヌクレアーゼが、ＨｉｎｃＩ
Ｉ、ＡｖａＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＮｉｃｉＩおよびＢｓｒ
Ｉからなるグループから選択される、請求項６の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US701270 | 1996-08-22 | ||
| US08/701,270 US5702926A (en) | 1996-08-22 | 1996-08-22 | Nicking of DNA using boronated nucleotides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1066589A JPH1066589A (ja) | 1998-03-10 |
| JP3090100B2 true JP3090100B2 (ja) | 2000-09-18 |
Family
ID=24816680
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09225999A Expired - Fee Related JP3090100B2 (ja) | 1996-08-22 | 1997-08-22 | ホウ素化ヌクレオチドを用いた鎖置換増幅 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5702926A (ja) |
| EP (1) | EP0826779A1 (ja) |
| JP (1) | JP3090100B2 (ja) |
| AU (1) | AU718135B2 (ja) |
| CA (1) | CA2207065C (ja) |
| MX (1) | MX9705364A (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6376178B1 (en) * | 1993-09-03 | 2002-04-23 | Duke University | Method of nucleic acid sequencing |
| CA2222769C (en) * | 1997-01-17 | 2001-06-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Primers for the detection of hiv-1 |
| CA2492007A1 (en) * | 2001-07-15 | 2003-01-30 | Keck Graduate Institute | Amplification of nucleic acid fragments using nicking agents |
| CA2491995A1 (en) * | 2001-07-15 | 2003-01-30 | Lori K. Van Ness | Exponential nucleic acid amplification using nicking endonucleases |
| WO2003008624A2 (en) * | 2001-07-15 | 2003-01-30 | Keck Graduate Institute | Nucleic acid amplification using nicking agents |
| WO2005014796A2 (en) * | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for seamless cloning of nucleic acid molecules |
| EP1645640B1 (en) | 2004-10-05 | 2013-08-21 | Affymetrix, Inc. | Method for detecting chromosomal translocations |
| WO2008002920A2 (en) * | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Epoch Biosciences, Inc. | Methods for generating target nucleic acid sequences |
| US7501254B2 (en) | 2006-07-20 | 2009-03-10 | Ghc Technologies, Inc. | Methods and compositions for amplification and capture of nucleic acid sequences |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5455166A (en) * | 1991-01-31 | 1995-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification |
| US5434143A (en) * | 1991-05-10 | 1995-07-18 | Boron Biologicals, Inc. | Pharmaceutical compositions comprising phosphite-borane compounds |
| US5270184A (en) * | 1991-11-19 | 1993-12-14 | Becton, Dickinson And Company | Nucleic acid target generation |
| US5422252A (en) * | 1993-06-04 | 1995-06-06 | Becton, Dickinson And Company | Simultaneous amplification of multiple targets |
| AU7679394A (en) * | 1993-09-03 | 1995-03-22 | Duke University | A method of nucleic acid sequencing |
| US5518884A (en) * | 1994-02-28 | 1996-05-21 | Becton, Dickinson And Company | Nucleic acid sequences specific for mycbacterium kansasii |
-
1996
- 1996-08-22 US US08/701,270 patent/US5702926A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-07-15 MX MX9705364A patent/MX9705364A/es not_active IP Right Cessation
- 1997-07-22 CA CA002207065A patent/CA2207065C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-15 AU AU34220/97A patent/AU718135B2/en not_active Ceased
- 1997-08-19 EP EP97114273A patent/EP0826779A1/en not_active Withdrawn
- 1997-08-22 JP JP09225999A patent/JP3090100B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MX9705364A (es) | 1998-02-28 |
| US5702926A (en) | 1997-12-30 |
| AU718135B2 (en) | 2000-04-06 |
| JPH1066589A (ja) | 1998-03-10 |
| CA2207065C (en) | 2000-05-02 |
| AU3422097A (en) | 1998-02-26 |
| EP0826779A1 (en) | 1998-03-04 |
| CA2207065A1 (en) | 1998-02-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6063604A (en) | Target nucleic acid sequence amplification | |
| US5547861A (en) | Detection of nucleic acid amplification | |
| KR100231383B1 (ko) | Rna 레플리카제의 dna-의존성 rna 폴리머라제 활성을 이용한 핵산 증폭 | |
| AU674211B2 (en) | Method for generating single-stranded DNA molecules | |
| JP3140937B2 (ja) | 好熱酵素を用いる鎖置換増幅法 | |
| US5824517A (en) | Method for amplifying nucleic acid sequences by strand displacement using DNA/RNA chimeric primers | |
| AU647411B2 (en) | Enhanced nucleic acid amplification process | |
| US6001558A (en) | Amplification and detection of HIV-1 and/or HIV 2 | |
| US5849547A (en) | Method for nucleic acid amplification by transcription using displacement, and reagents and kit therefor | |
| US5550025A (en) | Detection of hydrophobic amplification products by extraction into an organic phase | |
| EP0549107A1 (en) | Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification and phosphorothioate-containing oligonucleotides as primers in nucleic acid amplification | |
| CA2087256A1 (en) | Circular extension for generating multiple nucleic acid complements | |
| JPH06319599A (ja) | 核酸増幅反応の汚染除去方法 | |
| AU2002210862A1 (en) | Method for the amplification and optional characterisation of nucleic acids | |
| WO2002036821A2 (en) | Method for the amplification and optional characterisation of nucleic acids | |
| US6100024A (en) | Methods and compositions for nucleic acid detection by target extension and probe amplification | |
| US5605824A (en) | Composition for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein | |
| EP0585660B1 (en) | Exonuclease decontamination method | |
| JP3090100B2 (ja) | ホウ素化ヌクレオチドを用いた鎖置換増幅 | |
| WO1991006679A1 (en) | An improved method for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein | |
| US20070122827A1 (en) | Target nucleic acid signal detection | |
| JP4104657B2 (ja) | ポリヌクレオチド増幅の陽性コントロール | |
| JP3145169B2 (ja) | 核酸検出法及びキット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |