JP3140937B2 - 好熱酵素を用いる鎖置換増幅法 - Google Patents
好熱酵素を用いる鎖置換増幅法Info
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Description
特に核酸標的配列の増幅のための等温法に関するもので
ある。
検出および分析するための有力な道具を提供した。それ
らの方法の著しい感度により、感染症および遺伝病の検
出、分析のための遺伝子の単離、ならびに法医学におけ
る特定の核酸の検出のためにそれらを発展させる試みが
なされた。核酸増幅技術はその方法の温度要件に従って
分類することができる。ポリメラーゼ連鎖反応(PC
R;サイキ(R.K.Saiki)ら.1985.Sc
ience 230,1350−1354)、リガーゼ
連鎖反応(LCR;ウー(D.Y.Wu)ら.198
9.Genomics4,560−569;バリンガー
(K.Barringer)ら.1990.Gene
89,117−122;;バラニー(F.Baran
y)ら.1991.Pro.Natl.Acad.Sc
i.USA 88,189−193)、転写に基づく増
幅(クー(D.Y.Kwoh)ら.1989.Pro.
Natl.Acad.Sci.USA 86,1173
−1177)、および制限増幅(米国特許第5,10
2,784号明細書)は温度循環を必要とする。これに
対し鎖置換増幅(Strand Displaceme
nt Amplification)(SDA;ウォー
カー(G.T.Walker)ら.1992.Pro.
Natl.Acad.Sci.USA 89,392−
396およびウォーカー(G.T.Walker)ら.
1992.Nuc.Acids.Res.20,169
1−1696、ならびに欧州特許第0 497 272
号明細書;3者すべての記載を本明細書に参考として引
用する)、自己持続型配列複製(3SR;グアテリ
(J.C.Guatelli)ら.1990.Pro.
Natl.Acad.Sci.USA 87,1874
−1878)、およびQβレプリカーゼ系(リザルディ
(P.M.Lizardi)ら.1988.BioTe
chnology 6,1197−1202)などの方
法は等温反応である。さらに国際特許出願公開90/1
0064および90/03573号明細書には、核酸の
等温複製のためにバクテリオファージphi29複製起
点を用いることが記載されている。国際特許出願公開9
2/05287号明細書には配列特異的オリゴヌクレオ
チドの等温製造法が記載され、その場合1本の鎖におけ
る修飾によって切断試薬が対向鎖を選択的に開裂するこ
とが可能となる。一本鎖状の相補的オリゴヌクレオチド
が放出され、さらに相補的オリゴヌクレオチドの再重合
が可能となる。等温増幅は、PCRなどの増幅反応に特
徴的な高温と低温の間での循環に対比して、一定の温度
で行われる。
の温度で行われる。これはexo-クレノウDNAポリ
メラーゼ、特に制限エンドヌクレアーゼ(たとえばHi
ncII)が熱不安定性(温度感受性)だからである。
従って増幅を駆動する酵素は反応温度が上昇するのに伴
って失活する。しかし従来可能であったものより高い温
度で等温増幅反応、たとえばSDAを実施し得たとすれ
ば、幾つかの利点があるであろう。高い温度での増幅
は、増幅プライマーと鋳型DNAとの、よりストリンジ
ェントなアニーリングを可能にし、これにより増幅法の
特異性を向上させる。このように向上した増幅特異性の
結果として、バックグラウンド反応も減少するであろ
う。SDAの場合、重大なバックグラウンド反応源は増
幅プライマーが互いに相互作用した際に生成する短い
“プライマー二量体”である。プライマー二量体の形成
は、目的とする標的配列の特異的増幅の効率を著しく損
なう可能性がある。このようなプライマー二量体の形成
は、温度が低いほど起こりやすい。反応のストリンジェ
ンシーが低下するため、相同性が限定された配列間での
一過性ハイブリダイゼーションが増大する可能性がある
からである。高い温度でSDAを実施しうるほど、潜在
的にプライマー二量体の相互作用が減少し、バックグラ
ウンドが減少し、特異的な標的増幅の効率が向上する。
さらに、高い温度で増幅させるほど、ポリメラーゼによ
る鎖置換を促進しうる。鎖置換活性の向上は標的増幅の
効率を高め、その結果増幅生成物の収率を高めるであろ
う。十分に熱安定性である酵素を使用すると、SDA反
応に必要なすべての試薬を最初の熱変性工程の前に添加
することも可能になる。通常のSDAでは、二本鎖状の
標的配列が加熱により変性されたのちに酵素を反応混合
物に添加する必要がある。
NA中に取り込ませることができる。これによって、先
行する増幅からのアンプリコン(その後の増幅反応に混
入する可能性がある)をウラシルDNAグリコシダーゼ
(UDG)で処理することにより増幅不可能にすること
ができる。この脱混入(decontaminatio
n)法自体は、SDA反応においてアンプリコンが生成
した温度に関係なく使用しうる。しかし低い温度(すな
わち37−42℃)で生成したSDA増幅生成物は、高
い水準の非特異的バックグラウンド生成物を含有する可
能性がある。大量のバックグラウンドアンプリコンの混
入は、混入する標的配列アンプリコンの除去を遅延また
は阻害し、従って脱混入処理の効率を低下させる可能性
がある。従ってより高い温度でSDAを実施しうるなら
ば、生成する非特異的バックグラウンドアンプリコンの
量が抑制されることによってUDG脱混入法の効率を高
めることができるであろう。
列の増幅に成功するためには幾つかの極めて特異的な酵
素活性を必要とする。好熱性ポリメラーゼは文献に広く
報告されている。しかし他の核酸増幅系はSDAの酵素
活性を組み合わせる必要がないので、本発明以前にはS
DAに必要な生物学的活性に関連するものとしての好熱
酵素の活性および反応要件に関しては、ほとんど知られ
ていなかった。さらにSDAは2種類の酵素(制限エン
ドヌクレアーゼおよびポリメラーゼ)による同時活性を
必要とするので、適合性のあるこのような好熱酵素の対
が存在するか否かは本発明以前には知られていなかっ
た。すなわち好熱性ポリメラーゼおよび好熱性制限エン
ドヌクレアーゼの両方が要求される。これら2酵素は、
両方が同一のSDA反応混合物中で効率的に機能するた
めには互いに、およびSDAと適合する温度条件および
反応条件(たとえば塩)の要件をもたなければならな
い。さらにポリメラーゼは、1)自然に、または失活に
より5′−3′エキソヌクレアーゼ活性を欠如し、2)
SDAに必要な修飾ヌクレオチド(αチオ−dNTPま
たは他の修飾dNTP)を取り込み、3)一本鎖ニック
に始まる下流の一本鎖を二本鎖分子から置換し、かつ好
ましくは4)アンプリコン脱混入を可能にするためにd
UTPを取り込まなければならない。ポリメラーゼは遊
離3′−OHにdNTPを付加することにより鋳型上に
相補鎖を伸長させなければならない。ポリメラーゼは高
いプロセシビティーをもつことも好ましい。すなわちポ
リメラーゼは伸長生成物を解離および終止させる前に可
能な限り多数のヌクレオチドを付加し得なければならな
い。制限エンドヌクレアーゼは、1)それの二本鎖認識
/開裂部位を、その認識/開裂部位が半修飾された(h
emimodified)時点でニックし(すなわちそ
の一本鎖を開裂し)、2)ポリメラーゼが、標的に効率
的に結合し、そして増幅させうるのに十分なほど速やか
にその認識/開裂部位から解離し、かつ好ましくは3)
その認識/開裂部位に取り込まれたdUTPにより影響
を受けないものでなければならない。さらに制限エンド
ヌクレアーゼはこれらの活性を、ポリメラーゼと適合性
の温度および反応条件下で示さなければならない。
より広い温度範囲で実施しうる等温鎖置換増幅法(37
−70℃、“好熱SDA”)を提供する。好熱SDAに
好ましい温度範囲は50−70℃である。特定の好熱性
制限エンドヌクレアーゼがSDAに要求される半修飾さ
れた制限エンドヌクレアーゼ認識/開裂部位をニック
し、次いでその部位から解離しうることが見出された。
さらに特定の好熱性ポリメラーゼはそのニックから伸長
させ、一方では下流の鎖を置換しうることが見出され
た。これらの知見から、従来可能であったものより高い
温度で実施しうることによって、向上した特異性および
効率、減少した非特異的バックグラウンド増幅、ならび
に潜在的に向上した増幅生成物収率を有するSDA法の
開発が可能になった。さらに、変性温度で安定な酵素を
用いる場合、二本鎖標的の初期の熱変性後に別個の工程
で酵素を添加する必要性が除かれた。非特異的バックグ
ラウンドアンプリコンの量が減少すると、SDA反応に
おける標的特異性アンプリコンのUDG脱混入も、より
効率的に行われる。
句は下記のとおり定義される:増幅プライマーは、プラ
イマー伸長により標的配列を増幅するためのプライマー
である。SDAについては、増幅プライマーの3′末端
(標的結合配列)が標的配列の3′末端にハイブリダイ
ズする。SDA増幅プライマーは、さらにその5′末端
付近に制限エンドヌクレアーゼに対する認識/開裂部位
を含む。制限エンドヌクレアーゼを効率的に結合させる
ために、認識/開裂部位の5′側にさらにヌクレオチド
が存在してもよい。認識/開裂部位は、ウォーカー(W
alker)ら(1992.PNAS、前掲)に記載さ
れるように、認識/開裂部位が半修飾された場合にDN
A二重らせんの一方の鎖をニックする制限エンドヌクレ
アーゼに対するものである。半修飾された認識/開裂部
位は、制限エンドヌクレアーゼに対する二本鎖状の認識
/開裂部位であって、一方の鎖が少なくとも1個の誘導
ヌクレオチドを含むものであり、これは2本のうち1本
の鎖が制限エンドヌクレアーゼにより切断されるのを阻
止する。大部分の場合、半修飾された認識/開裂部位
の、誘導ヌクレオチドを最初に含まない鎖が制限エンド
ヌクレアーゼによりニックされる。ただし1回目のSD
Aサイクルののちには、ニックされた鎖の認識/開裂部
位の半分が誘導ヌクレオチドを含むが、これにより後続
のニッキングが阻止されることはない。通常のSDAの
ための好ましい半修飾された認識/開裂部位は、制限エ
ンドヌクレアーゼHincII、HindII、Ava
I、NciI、およびFnu4HIに対するヘミホスホ
ロチオエート化された認識/開裂部位である。増幅プラ
イマーは3′−OH基をも含み、これは増幅プライマー
の標的結合配列が標的配列にハイブリダイズした場合に
DNAポリメラーゼにより伸長しうる。大部分のSDA
反応につき、増幅プライマーが標的配列の増幅に関与す
る。
マーの一部)、およびプライマー結合部位の下流の標的
配列の相補体である新たに合成された鎖からなる核酸で
ある。伸長生成物は、標的配列へのプライマーのハイブ
リダイゼーション、および標的配列を鋳型として用いる
ポリメラーゼによるプライマーの伸長によって得られ
る。
はエクスターナル(external)プライマーは、
増幅プライマーより上流で標的配列にアニールし、従っ
てバンパープライマーの伸長によって下流の増幅プライ
マーおよびその伸長生成物が置換される。バンパープラ
イマーの伸長は、増幅プライマーの伸長生成物を置換す
るための1方法であるが、加熱も適している。
にハイブリダイズする。実質的に同一の配列とは、それ
らが一部相補的な同じヌクレオチド配列に同様にハイブ
リダイズするのに十分なほどそれらのヌクレオチド配列
が類似するものである。
き核酸配列を意味する。これらには増幅すべき元の核酸
配列、その相補的第2鎖、および増幅反応において生成
する、元の配列のいずれかのコピー鎖が包含される。標
的配列は、ハイブリダイズした増幅プライマーの伸長の
ための鋳型とも呼ぶことができる。
リコンは、標的配列のコピーを含み、増幅プライマーの
ハイブリダイゼーションおよび伸長により生成する。こ
の語は、元の標的配列のコピーを含む一本鎖および二本
鎖両方の増幅プライマー伸長生成物を意味し、これには
増幅反応の中間体も包含される。
法であって、その場合プライマーの伸長、半修飾された
制限エンドヌクレアーゼ認識/開裂部位のニッキング、
一本鎖状の伸長生成物の置換、伸長生成物(または元の
標的配列)へのプライマーのアニーリング、および後続
のプライマー伸長が、反応混合物中で同時に起こる。こ
れは、反応の温度循環性の結果として反応の各段階が別
個の時期またはサイクルで起こるPCRと対照的であ
る。SDAは、1)制限エンドヌクレアーゼがその二本
鎖状の認識/開裂部位のヘミホスホロチオエート形の非
修飾鎖をニックしうること、および2)特定のポリメラ
ーゼがニックにおいて複製を開始し、下流の非鋳型鎖を
置換しうることに基づく。プライマーのアニーリングの
ために二本鎖標的配列を変性する高い温度(約95℃)
における最初のインキュベーションののち、後続の重合
および新たに合成された鎖の置換が一定の温度で行われ
る。標的配列の新たなコピーそれぞれの産生は下記の5
工程からなる:1)元の標的配列、または先に重合して
置換された一本鎖状の伸長生成物への増幅プライマーの
結合、2)α−チオデオキシヌクレオシドトリホスフェ
ート(αチオ dNTP)を取り込む、5′−3′エキ
ソヌクレアーゼ欠如ポリメラーゼによるプライマーの伸
長、3)半修飾された二本鎖制限部位のニッキング、
4)ニック部位からの制限酵素の解離、ならびに5)ニ
ックの3′末端からの5′−3′エキソヌクレアーゼ欠
如ポリメラーゼによる伸長、およびこれに伴う下流の新
たに合成された鎖の置換。ニックからの伸長により他の
ニック可能な制限部位が再形成されるので、ニッキン
グ、重合および置換が一定の温度で同時かつ連続的に起
こる。それぞれが二本鎖標的配列の2本の鎖のうち1本
にハイブリダイズする一対の増幅プライマーを用いる場
合、増幅は指数的である。これは、センス鎖およびアン
チセンス鎖が後続ラウンドの増幅に際して対向プライマ
ーの鋳型として作用するからである。単一の増幅プライ
マーを用いる場合、1本の鎖がプライマー伸長のための
鋳型として作用するにすぎないので、増幅は直線的であ
る。α−チオ dNTPが取り込まれた場合に自身の二
本鎖状の認識/開裂部位をニックする制限エンドヌクレ
アーゼの例は、HincII、HindII、Ava
I、NciI、およびFnu4HIである。これらすべ
ての制限エンドヌクレアーゼ、および要求されるニッキ
ング活性を示す他のものが、通常のSDAに用いるのに
は適している。しかしそれらは比較的、熱不安定性であ
り、約40℃を越えると活性を失う。
的配列を切断しないエンドヌクレアーゼで、より大型核
酸をフラグメント化することによって調製しうる。しか
し一般に、SDA反応におけるニッキングのために選ば
れる制限エンドヌクレアーゼ認識/開裂部位を有する標
的核酸を、ウォーカー(Walker)ら(1992.
Nuc.Acids.Res.、前掲、および米国特許
第5,270,184号明細書(本明細書に参考として
引用する)の記載に従って製造することが好ましい。簡
単に述べると、標的配列が二本鎖である場合、4つのプ
ライマーがそれにハイブリダイズする。2つのプライマ
ー(S1およびS2)はSDA増幅プライマーであり、2
つのプライマー(B1およびB2)はエクスターナルまた
はバンパープライマーである。S1およびS2は、標的配
列をフランキングする二本鎖核酸の対向鎖に結合する。
B1およびB2は、それぞれS1およびS2の5′側(すな
わち上流)の標的配列に結合する。次いでエキソヌクレ
アーゼ欠如ポリメラーゼを用いて、3種類のデオキシヌ
クレオシドトリホスフェートおよび少なくとも1種類の
修飾デオキシヌクレオシドトリホスフェート(たとえば
2′−デオキシアデノシン−5′−O−(1−チオトリ
ホスフェート)“dATPαS”)の存在下に、4つの
プライマーすべてを同時に伸長させる。これによりS1
およびS2の伸長生成物は、B1およびB2の伸長によっ
て元の標的配列鋳型から置換される。置換された増幅プ
ライマーの一本鎖伸長生成物は対向する増幅およびバン
パープライマーの結合の標的となり(たとえばS1の伸
長生成物はS2およびB2に結合する)、次の伸長および
置換のサイクルの結果、それぞれの末端に半修飾された
制限エンドヌクレアーゼ認識/開裂部位を備えた2つの
二本鎖核酸フラグメントが得られる。これらはSDAに
よる増幅に適した基質である。SDAの場合と同様に、
標的生成反応の各段階は同時かつ連続的に起こり、SD
Aにおける制限酵素によるニッキングに必要な認識/開
裂部位を末端に備えた標的配列が生成する。SDA反応
のすべての成分が既に標的生成反応に存在するので、標
的配列は自動的に生成し、かつ連続的にSDAサイクル
に入り、そして増幅される。
成物が交差混入するのを防止するために、増幅反応を阻
害することなくdTTPの代わりにdUTPをSDA増
幅DNA中へ取り込ませることができる。次いでこのウ
ラシル修飾された核酸をUDGを用いる処理によって特
異的に認識し、不活性化することができる。従って先行
反応においてdUTPがSDA増幅DNA中へ取り込ま
れた場合、二本鎖標的の増幅前に後続SDA反応物をU
DGで処理すると、先に増幅された反応からのdU含有
DNAはいずれも増幅不可能となるであろう。後続反応
において増幅されるべき標的DNAはdUを含有しない
ので、UDG処理により影響されないであろう。次いで
標的増幅の前にUDGをUgi処理により阻害すること
ができる。あるいはUDGを熱失活させることができ
る。好熱SDAの場合、より高い反応温度自体(>50
℃)を、UDGの失活および標的の増幅に同時に利用す
ることができる。
活性を欠如するポリメラーゼを必要とし、二本鎖核酸中
の一本鎖ニックにおいて重合を開始し、ニックの下流の
鎖を置換し、一方ではニックされていない鎖を鋳型とし
て用いて新たな相補鎖を生成する。ポリメラーゼはヌク
レオチドを遊離3′−OHに付加することにより伸長さ
せなければならない。SDA反応を最適化するために
は、ポリメラーゼが高度にプロセシブであって、増幅可
能な標的配列の長さを最大限となしうることも望まし
い。高度にプロセシブなポリメラーゼは、伸長生成物の
解離および合成終止の前にかなりの長さの新たな鎖を重
合しうる。置換活性は増幅反応にとって必須である。こ
れによって、指数的増幅反応において標的が追加のコピ
ーの合成に利用され、一本鎖状の伸長生成物が生成し、
これに第2の増幅プライマーがハイブリダイズするのが
可能になるからである。ニッキング活性も極めて重要で
ある。反応を持続させ、後続ラウンドの標的増幅を開始
させうるのはニッキングだからである。
ラーゼの活性についてはこれまでほとんど知られていな
かったので、候補となる好熱性ポリメラーゼが存在する
場合にそれを同定するために、ポリメラーゼスクリーニ
ング系を開発した。このスクリーニング系は、ポリメラ
ーゼが二本鎖鋳型中の一本鎖ニックから始まる下流の鎖
を置換する効力を試験する伸長アッセイ法である。ポリ
メラーゼ置換活性の存在はSDAにとって必須である。
しかし、他の点では適切な好熱性ポリメラーゼ中に5′
−3′エキソヌクレアーゼ活性が存在した場合、それを
当技術分野で知られているルーティン法により失活させ
ることができる(国際特許出願公開92/06200号
明細書)。ポリメラーゼ中のエキソヌクレアーゼ活性を
選択的に失活させるための一般的方法の1つは、ポリメ
ラーゼに対する遺伝子をクローニングし、エキソヌクレ
アーゼ活性に関与する蛋白質ドメインをコードする部分
の遺伝子配列を同定し、それをインビトロ突然変異誘発
により不活性化するものである。あるいはエキソヌクレ
アーゼ活性は、ポリメラーゼをプロテアーゼで処理し
て、目的とする重合および置換活性のみを示すフラグメ
ントを単離することにより失活させることができる。従
って伸長アッセイにおいて同定された好熱性ポリメラー
ゼであって、適温で活性であり、ニックにおいて伸長を
開始し、修飾された、すなわち通常のものでないdNT
Pを取り込むが、5′−3′エキソヌクレアーゼ活性を
もつものは、好熱SDAに関する考察から除外されな
い。
て、二本鎖核酸からの一本鎖の置換、およびニックにお
ける開始は、2種類のプライマーを両プライマーに相補
的な無傷の配列上に互いに隣接してアニールさせること
により企画することができる。これらのプライマーはそ
れらの5′末端において標識されている。ポリメラーゼ
が鎖置換活性をもち、隣接プライマーにより形成された
“ニック”において重合を開始することができ、かつ
5′−3′エキソヌクレアーゼ活性を欠如する場合、両
プライマーが伸長され、2種類の伸長生成物が検出され
るであろう。ポリメラーゼが5′−3′エキソヌクレア
ーゼ活性を欠如するが、ニックにおいて伸長を開始する
ことができず(たとえばギャップを必要とする)、また
は置換活性をも欠如する場合、下流のプライマーの伸長
生成物のみが検出されるであろう。ニックにおいて開始
するが、5′−3′エキソヌクレアーゼ活性をもつポリ
メラーゼは、上流プライマーの伸長生成物のみを生成す
るであろう。
必要な特性をすべて備えたものとして同定された:ex
o-Vent(ニュー・イングランド・バイオラボ
ズ)、exo-Deep Vent(ニュー・イングラ
ンド・バイオラボズ)、Bst(バイオラド)、exo
-Pfu(ストラタジーン)、Bca(パンベラ)、お
よび配列決定用Taq(プロメガ)。他は、以上の伸長
アッセイ法を利用して、発明的手腕を行使することなし
にルーティンに同定することができ、それらのポリメラ
ーゼすべてが好熱SDAに用いるのに適している。ポリ
メラーゼTth(ベーリンガー)、Tfl(エピセンタ
ー)、レプリナーゼ(REPLINASE、デュポ
ン)、およびレプリサーム(REPLITHERM、エ
ピセンター)はニックから鎖置換するが、5′−3′エ
キソヌクレアーゼ活性をも備えている。これらのポリメ
ラーゼは、たとえば遺伝子工学的方法でエキソヌクレア
ーゼ活性を除去したのちには本発明方法に有用である。
これまでに同定された大部分の好熱性ポリメラーゼは、
65−75℃で最適活性をもち、50−60℃で活性が
著しく低下する。しかし好熱性制限エンドヌクレアーゼ
の熱安定性は一般に65℃未満に限定されているので、
低い温度で最適活性をもつ好熱性ポリメラーゼ(たとえ
ばBstおよびBca)ほど、この反応において好熱性
制限エンドヌクレアーゼとの適合性が高く、従って好ま
しい。
果的な増幅が可能であるのに十分なほど速やかに認識/
開裂部位から解離し、ポリメラーゼを直ちにニックに結
合させ、伸長を開始し得なければならない。またSDA
に適した制限エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレ
アーゼに対する二本鎖状の半修飾された認識/開裂部位
のプライマー鎖のみを開裂しなければならない(“ニッ
キング”)。制限酵素は一般に二本鎖破断を生じるの
で、開裂部位の二重らせんにおける2本の鎖のうち1本
の開裂は選択的に阻止されなければならない。これは通
常は、合成に際してDNAの一方の鎖中へヌクレオチド
類似体(たとえばデオキシヌクレオシドホスホロチオエ
ート)を導入し、従ってこの修飾された鎖がもはや開裂
を受けないことにより達成される。場合により、ヌクレ
オチド類似体の導入により非修飾鎖がもはや開裂を受け
ない結果となる可能性もある。非修飾鎖が開裂から保護
される場合は、ヌクレオチド類似体はニッキングを引き
起こすプライマーの合成に際して取り込ませてもよく、
これにより増幅反応にヌクレオチド類似体を添加する必
要性、およびポリメラーゼがそれらのヌクレオチド類似
体を取り込みうるという要件が除かれる。
ー鎖をすべての制限エンドヌクレアーゼから保護するわ
けではない。従って、利用しうる多数の好熱性制限エン
ドヌクレアーゼ中に適切な酵素が存在するとすれば、そ
れらの酵素を同定するために制限エンドヌクレアーゼの
ニッキング特性を評価する手段が必要である。従って二
本鎖状の制限エンドヌクレアーゼ認識/開裂部位の一方
の鎖に取り込まれた修飾デオキシヌクレオチドが2本の
鎖のうち1本を保護しうることに基づいて、目的特性を
備えた好熱性制限エンドヌクレアーゼを同定するための
スクリーニング系が考案された。これは類似体誘導ニッ
キングアッセイ、または鎖保護アッセイと呼ばれる。
補的プライマーを合成する。次いでこの鋳型およびプラ
イマーを、好ましくは放射性標識で標識する。プライマ
ーおよび鋳型をハイブリダイズし、修飾されたdNTP
をプライマーの伸長により取り込ませ、半修飾された制
限エンドヌクレアーゼ認識/開裂部位を含む完全二本鎖
分子を産生させる。この生成物を開裂に適した条件下に
制限エンドヌクレアーゼで処理する。変性条件下での反
応生成物の電気泳動分析を利用して、認識/開裂部位が
ニックされたか、開裂したか、または切断されていない
かを、生成フラグメントの大きさにより判定する。認識
/開裂部位の2本の鎖のうちいずれ(すなわち修飾され
たもの、または修飾されていないもの)が開裂から保護
されたかということも、電気泳動におけるフラグメント
の大きさを利用して判定された。
lker)ら(1992.PNASおよびNuc.Ac
ids.Res.、前掲)が述べた通常のSDAと同様
にして、ただし目的とする熱安定性ポリメラーゼおよび
熱安定性制限エンドヌクレアーゼに交換して実施され
る。もちろん反応温度は交換された酵素に適した、より
高い温度に調整され、HincII制限エンドヌクレア
ーゼ認識/開裂部位は選ばれた熱安定性エンドヌクレア
ーゼに適した制限エンドヌクレアーゼ認識/開裂部位に
交換されるであろう。また専門家は、酵素が変性温度で
十分に安定である場合にはウォーカーらと異なり最初の
変性工程の前に酵素を反応混合物に含有させるであろ
う。好熱SDAに用いるのに好ましい制限エンドヌクレ
アーゼは、BsrI、BstNI、BsmAI、Bsl
I、およびBsoBI(ニュー・イングランド・バイオ
ラボズ)、ならびにBstOI(プロメガ)である。好
ましい好熱性ポリメラーゼはBcaおよびBstであ
る。
得られる最適SDA系を開発するためには、緩衝系を評
価し、最適化することが推奨される。これは好熱SDA
に用いる新規な制限酵素/ポリメラーゼ対を評価する際
にも適用される。製造業者は制限エンドヌクレアーゼに
推奨される緩衝液を供給しており、これは通常は10m
M MgCl2を含有するトリスである。それは50−
150mMのNaClおよび/またはKClをも含有し
うる。これらの条件は必ずしも好熱SDAに最適ではな
いが、その代わり推奨された温度で100%の核酸二本
鎖開裂を提供する。SDAにおいては、制限エンドヌク
レアーゼはその二本鎖部位を認識するが、誘導dNTP
に交換することによって、両鎖を開裂するのではなくプ
ライマー鎖をニックするようにエンドヌクレアーゼを誘
発する。従って製造業者が推奨する緩衝液は、この修飾
された制限エンドヌクレアーゼ挙動の発現に最適な緩衝
液ではないかも知れない。さらに、制限エンドヌクレア
ーゼはSDAにおけるポリメラーゼと協調して機能しな
ければならない。従ってSDA反応が起こるためには、
緩衝系は制限酵素によるニッキング、およびポリメラー
ゼによる伸長/置換の両方を支持しなければならない。
に用いる緩衝系を評価する際には、一般にその制限酵素
に推奨される緩衝液を評価することにより緩衝液の最適
化に着手することが有用である。消去法を採用して、エ
ンドヌクレアーゼのニッキング作用にはいずれの成分が
必須であるかを判定することができる。この情報とSD
Aにおいてポリメラーゼ活性を高めることが知られてい
る緩衝液条件とを合わせると、原型となる緩衝液を開発
することができる。前記で述べたように、緩衝液の最適
化の重要な観点は成分の相互作用性である。このため、
1成分を一定に維持して他を一度に1つずつ変化させる
より、むしろ種々の濃度の異なる成分を試験する方が望
ましい。たとえばKPO4を一定に維持した状態で種々
のMgCl2濃度を試験すると、そのKPO4濃度におい
て最良のMgCl2濃度が求められる。しかし種々の組
み合わせのMgCl2およびKPO4濃度を試験すると、
最良の結果を与えるMgCl2およびKPO4の組み合わ
せ濃度が求められる。従って成分の協調効果によって確
実に最適増幅を得るためには、緩衝液の各成分を同時に
試験すべきである。この方法はドクターペリー・ハーラ
ンド(PerryHaaland)によるExperi
mental Design in Biotechn
ology(マーセル・デッカー、ニューヨーク、19
89)に詳述されている。
が、好熱SDAに有用である。通常のSDA(Hinc
II/exo−クレノウを用いる)のための緩衝液は下
記により開発された:制限エンドヌクレアーゼに用いら
れる市販の緩衝液それぞれを用いてSDAを実施した。
これらの緩衝液は、20−50mMトリス、pH7.4
−8、50−150mM NaClおよび/またはKC
l(または酢酸塩)ならびに5−12mM MgCl2
を含有していた。HincIIに関するSDAを最も良
く支持した緩衝液はジブコ−BRLからのリアクト(R
EACT)6であったが、製造業者は二本鎖開裂のため
にHincIIと共に用いるためにはリアクト4を推奨
している(20mMトリス、pH7.4、5mM Mg
Cl2、および50mM KCl)。リアクト6緩衝液
は、50mMトリス、pH7.4、6mM MgC
l2、50mM NaCl、および50mM KClを
含有する。さらに実験を行い、その際MgCl2および
K+が最も重要な緩衝液成分であると判定された。従っ
てK+源としてトリスの代わりにKPO4緩衝液を使用し
た。この緩衝液は制限エンドヌクレアーゼ活性およびポ
リメラーゼ活性の両方を支持し、その結果通常のSDA
反応において高水準の増幅を与えた。KPO4緩衝液を
制限エンドヌクレアーゼと共に用いることは一般的では
ないが、SDAにおける制限エンドヌクレアーゼ/ポリ
メラーゼの組み合わせに適していることが、緩衝液成分
の分析に際して証明された。より一般的な緩衝液(すな
わちトリス)を同様な様式で試験したが、増幅をこれ以
上高めない。
ヌクレアーゼ/ポリメラーゼの組み合わせに適した緩衝
液を判定するために、同様な最適化法を適用することが
でき、これには発明的手腕を行使しないルーティン試験
を必要とするにすぎない。多くの場合、通常のSDAに
一般に用いられるKPO4/MgCl2緩衝液が、文献記
載のままで、またはこれらの成分の濃度をルーティンに
若干変更して、好熱SDAに適している(実施例5参
照)。
スミド上で互いに隣接してアニールする2種類のプライ
マーを合成した。プライマーPBR1は上流プライマー
であり、pBR322の塩基3661−3690に対応
した。プライマーPBR2はPBR1の下流にハイブリ
ダイズし、塩基3691−3720に対応した。これら
の30−merオリゴヌクレオチドはアプライド・バイ
オシステムズDNA合成装置、モデル380を用いて合
成され、変性用アクリルアミドゲルからの電気溶出によ
り精製された。これらのプライマーを別個に、10μM
プライマー、50mMトリス、pH7.5、10mM
MgCl2、70μCi32P−ATP、および10単位
のポリヌクレオチドキナーゼを用いるキナーゼ反応にお
いて、反応容量10μLで37℃において30分間標識
した。標識プライマーを200ngのPstI/Hin
cII消化pBR322と、最終濃度0.2μM(各プ
ライマー)で混和した。標識pBR322 DNAは、
25mM KPO4、pH7.4、2−8mM MgC
l2、および0.2−1mM dNTPを含有する緩衝
液中で98℃において3分間、変性された。次いでこの
混合物を選ばれた反応温度(50−70℃)に2分間冷
却した。1単位のポリメラーゼを添加し、反応を10分
間進行させた。等容量の95%ホルムアミド/50mM
EDTA/ブロモフェノールブルー色素の添加により反
応を停止した。25μLの反応物を6%変性用ゲル上で
電気泳動し、そしてこのゲルでオートラジオグラフフィ
ルム(コダック、XAR5)を露光した。
70℃でポリメラーゼの活性を試験するアッセイに用い
た。それぞれの場合、ポリメラーゼはすべて通常のデオ
キシヌクレオチド(dNTP)の存在下で、または通常
のdNTPおよび1種類のチオ置換デオキシヌクレオチ
ド(αチオdCTP、“dCTPαSミックス”)の存
在下で試験された。被験ポリメラーゼおよび反応条件を
次表に示す:
置換しうるポリメラーゼは、オートラジオグラフ上に2
本のバンドを形成した。大きい方のバンドは消化された
標的プラスミドのHincII部位に対するPBR1の
伸長生成物を表し、244ヌクレオチドの長さである。
小さい方のバンドはHincII部位に対して伸長され
たPBR2の伸長生成物であり、214ヌクレオチドの
長さである。1種類の伸長生成物のみが生成した場合、
オートラジオグラフ上に1本のバンドのみが検出され
た。この唯一のバンドが2本のうち小さい方である場
合、下流のプライマー(PBR2)のみが伸長されてい
る。このようなポリメラーゼはSDAに適していない。
それらはニックにおいて伸長を開始することによって上
流プライマーを伸長させることができないか、またはそ
れらはニックから下流の鎖を置換することができないか
らである。大きい方のバンドのみが検出された場合、重
合はニックにおいて開始したが、ポリメラーゼが5′−
3′−エキソヌクレアーゼ活性をも示したのである。
DAに有用なポリメラーゼの活性プロフィルを次表にま
とめる:
ラーゼ(パンベラ、タカラ;ラダーマンポリメラーゼと
しても知られている)はアッセイに際して両方の伸長生
成物を生成した。この実施例において試験したポリメラ
ーゼのうち、これら2種類のみが、要求されるすべての
特性(ニックにおける開始、鎖置換、およびチオ置換デ
オキシヌクレオチドの取り込み)を50−70℃の温度
範囲全体にわたって示した。従ってBcaおよびBst
ポリメラーゼは、50−70℃の全範囲にわたって普通
の緩衝液条件下で好熱SDA反応に有用である。第2群
のポリメラーゼ(exo-Vent、exo-Deep
Vent、およびexo-Pfu)はこの温度範囲にわ
たってPBR2伸長生成物を生成したが、70℃より低
い温度では有意量のPBR1伸長生成物の生成を行わな
かった。これら3種類のポリメラーゼを用いた場合、5
0℃では244ヌクレオチドのPBR1伸長生成物は検
出されず、60℃では少量が検出されたにすぎない。し
かし70℃ではこれら2種類の伸長生成物がそれぞれ有
意量検出された。これらの結果は、exo-Vent、
exo-Deep Vent、およびexo-Pfuにつ
いては活性および/またはニックにおける開始が温度依
存性の活性であることを示す。しかしそれらはチオ置換
デオキシヌクレオチドを取り込むことができ、かつSD
Aに要求される他のすべての活性を備えていた。この第
2群のポリメラーゼは70℃以上で機能する制限エンド
ヌクレアーゼ、好ましくは約70℃に最適温度を有する
制限エンドヌクレアーゼと組み合わせた場合に好熱SD
Aに有用である。あるいはそれらの置換活性は低温で、
溶剤、たとえば約15%グリセリンまたは約15%DM
SOを添加することによって高めることができる。
h、Tfl、レプリナーゼおよびレプリサームをアッセ
イにおいて試験した場合、PBR1伸長生成物のみが認
められた。これらの結果は、これらのポリメラーゼがニ
ックにおいて重合を開始しうるが、それらは5′−3′
−エキソヌクレアーゼ活性をもつことを示す。当技術分
野で知られている方法で5′−3′−エキソヌクレアー
ゼ活性を選択的に除去すると、この群のポリメラーゼも
好熱SDAに有用である。
護アッセイ 制限エンドヌクレアーゼに対する半修飾された認識/開
裂部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを構築した。こ
れらの二本鎖オリゴヌクレオチドは、まず長さ16ヌク
レオチドの共通プライマー(配列番号(SEQ ID
NO):1または配列番号:2)、および長さ44−5
7ヌクレオチドの種々の鋳型鎖を合成することにより構
築された。それぞれの鋳型鎖は多数の認識/開裂部位を
縦列に(in tandem)含み、通常は充填配列
(filler sequence)を各部位の間に含
む。開裂部位はオリゴヌクレオチド上に、各部位のニッ
キングまたは開裂の結果、ゲル上でサイズにより識別し
うるフラグメントを生じるように配置された。エンドヌ
クレアーゼが縮重(degenerate)認識/開裂
部位を示す場合、これらの幾つかを試験した。合成され
た鋳型は下記のものであった:
配列番号:2は配列番号:3−4をプライミングする。
これらの鋳型は下記の制限エンドヌクレアーゼに対する
認識/開裂部位を含む:AccI、AspI、Bsa
I、BsaBI、BsiYI、BslI、BsmI(2
つの縮重部位)、BsmAI、BsmFI、BsmH
I、BspWI、BsoBI(4つの縮重部位)、Bs
oFI、BsrI(2つの縮重部位)、BsrBRI、
BsrDI(2つの縮重部位)、Bst7lI、Bst
NI(2つの縮重部位)、BstOI、BstXI、D
pnI、HaeII、MamI、MboII、Mva
I、MwoI、SfiI、およびTth111I。
ゲル電気泳動により精製し、標準法によりゲルスライス
から電気溶出した。次いでそれらをのちにオートラジオ
グラフ検出するために、T4ポリヌクレオチドキナーゼ
およびγ−[32P]−アデノシントリホスフェートを用
い5′−末端標識した。一般的キナーゼ反応物は2μL
の10×キナーゼ緩衝液(ニュー・イングランド・バイ
オラボズ)、10μLのγ−[32P]−ATP(300
0Ci/mmol、NEN−デュポン)、最終濃度1μ
Mとなる量のプライマーまたは鋳型、20単位のT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ(ニュー・イングランド・バイ
オラボズ)、および全反応容量20μLとなる量の水を
含有していた。キナーゼ反応を37℃で30分間実施
し、次いで沸騰水中で5分間加熱することにより停止し
た。次いでプライマーをそれぞれの鋳型にハイブリダイ
ズさせ、ポリメラーゼおよび種々のホスホロチオエート
置換ヌクレオチドを用いて伸長させ、認識/開裂部位が
半修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドを生成させた。
ニッキング活性に対する影響を調べるために、種々の実
験において誘導dNTPを認識/開裂部位の2本の鎖の
うちのいずれか一方に取り込ませた。次いで放射性標識
されたプライマーおよび鋳型を、それらの各2μL、1
μLのリアクト−1緩衝液(ライフ・テクノロジー
ズ)、および11.5μLの脱イオン蒸留水を密閉式の
0.5mLポリプロピレン製微量遠心管(microf
uge tube)中で混合することによりアニールさ
せた。この混合物を沸騰水浴中で3分間加熱し、次いで
水浴を熱源から取り出すことにより、徐々に37℃に放
冷した。次いで遠心管を37℃のインキュベーターに移
し、ハイブリダイズしたプライマーを鋳型上で、1μL
のデオキシヌクレオシドトリホスフェート(dNTP)
(少なくとも1種類のチオ−dNTPを含有)、2μL
の10mMジチオトレイトール(DTT)、および0.
5μLのエキソヌクレアーゼ欠如クレノウポリメラーゼ
10単位/μL溶液(U.S.バイオケミカルズ)の添
加により伸長させた。伸長反応における各dNTPの最
終濃度は250μMであった。プライマー伸長反応を2
0分間進行させ、次いで75℃に10分間加熱すること
により停止した。
アーゼの供給業者が推奨する、制限エンドヌクレアーゼ
活性に適した緩衝液中へ10倍希釈した。アッセイにお
けるDNA分子の最終濃度は10nMであった。それぞ
れの反応混合物に5−10単位の適宜な制限エンドヌク
レアーゼを添加することにより、鎖保護アッセイを開始
した。反応物を制限エンドヌクレアーゼの供給業者が推
奨する温度でインキュベートした。試料を一定間隔で取
り出し、等容量の配列決定反応停止用ホルムアミド溶液
(U.S.バイオケミカルズ)に添加して、反応を停止
した。停止した試料をすべてが採集されるまで氷上に保
存した。次いで試料を沸騰水浴中で3分間加熱し、トリ
ス−硼酸緩衝液中の8%ポリアクリルアミド、7M尿素
からなるDNA配列決定用ゲル(ジブコ−BRL)上に
装填した。電気泳動を57Wの一定の電力水準で1時間
実施した。放射性標識DNAバンドをフジRX用X線フ
ィルムにより視覚化した。
うち、完全またはほぼ完全に半修飾認識/開裂部位をニ
ックした11種類をこの実験で確認した。それらを次表
に挙げる。場合により、鎖保護アッセイにおいて半修飾
した際に、制限エンドヌクレアーゼに対する1つの縮重
部位のみがニックされた。種々のホスホロチオエート置
換の結果と共に、鋳型中の認識/開裂部位の位置をヌク
レオチドの位置により示す。dNTPαSの取り込みに
よって完全またはほぼ完全に誘導鎖が保護された場合
(すなわち非修飾鎖がニックされた)、そのヌクレオチ
ド置換を挙げる。“無”はニッキングを生じるヌクレオ
チド置換が認められなかったことを示す。
表す。
mIに対する認識部位が非修飾鎖の保護を示す点、すな
わち修飾鎖がニックされる点に注目すると興味深い。こ
れは、通常の非修飾プライマーの代わりにこの認識部位
をチオ誘導プライマーと組み合わせて、好熱SDAに利
用しうることを示唆する。この系においては、誘導dN
TPの不在下でニッキングおよび置換が進行し、ポリメ
ラーゼが誘導dNTPを取り込みうる必要性は除かれ
る。
ゼをさらに、50−65℃の範囲におけるそれらの熱安
定性につき試験した。AccIのみがこの範囲において
不満足な安定性を示し、一般的な安定剤、たとえば二本
鎖DNAおよびBSAの添加によって安定化し得なかっ
た。残り9種類の制限エンドヌクレアーゼを実施例3の
場合と同様に直線的SDA反応において試験した。Mw
oI以外のすべてが増幅生成物を生成した。この酵素は
そのニックした認識/開裂部位からの解離が遅すぎる
か、または1回目の伸長工程でチオール化ヌクレオチド
を認識/開裂部位の両鎖に取り込んだのちにその部位を
再びニックすること(すなわち後続の増幅サイクルを開
始すること)ができないという可能性がある。あるいは
MwoIニッキング活性は上記の緩衝系と不適合であっ
て前記に従って最適化することができ、これによりMw
oIも好熱SDAに有用となるのかも知れない。
mAI、およびBslIを使用し、TTPをdUTPに
交換して、実施例3の場合と同様な直線的SDAを実施
した。これはこれらの制限エンドヌクレアーゼとUDG
脱混入法との適合性を確認するためのものであった。B
soBI、BstNI、およびBsmAIはそれらの認
識/開裂部位においてdUにより負の影響を受けなかっ
たが、BsrIおよびBslIについてはこれらの条件
下で直線的SDAの効率が低下した。BstおよびBc
aポリメラーゼはdNTP交換により影響されないと思
われるので、BsrIおよびBslIについてニッキン
グ活性が低下したのは恐らくdUを酵素の認識/開裂部
位に取り込んだためであろう。BslIについての開裂
部位は縮重配列中に生じるので、この部位を変更してこ
の酵素のニッキング活性に対するdUの影響を克服しう
ると考えられる。
下で部分的な、または低いニッキング活性をもつ幾つか
の好熱性制限エンドヌクレアーゼが同定された(たとえ
ばTth111I、BsiYI、およびBsoFI)。
反応条件を最適化することにより(たとえば緩衝液を最
適化し、または反応温度を調整することにより)これら
のエンドヌクレアーゼのニッキング活性を最適化して、
それらを好熱SDAに対してより有用なものにすること
ができる。さらに、制限エンドヌクレアーゼ認識/開裂
部位をフランキングする配列がエンドヌクレアーゼ活性
に影響を及ぼす可能性のあることが知られているので、
鋳型のフランキング配列を変更することによっても、部
分的にニックしたにすぎないエンドヌクレアーゼのニッ
キング活性が改良され、またはこの実施例の条件下では
ニックしなかったエンドヌクレアーゼのニッキング活性
が向上する可能性がある。
rIを、60℃で実施された直線的SDA反応により試
験した。標的配列の増幅に成功したことは、このポリメ
ラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼの両方が好熱SD
A反応の条件下で機能することだけでなく、SDA“代
謝回転”が起こっていること、すなわち制限エンドヌク
レアーゼが半修飾された認識/開裂部位をニッキングし
たのち解離し、これにより重合の開始が可能となり、重
合に続くサイクルが反復することをも示す。
NAオリゴマーを合成した:
一本鎖5′末端が突出した(protruding)状
態で、互いにハイブリダイズする。BsrI認識/開裂
部位を配列番号:11に下線付きイタリック体で示す。
ンキュベートすることによりアニールさせたのち、60
℃に徐冷した。次いでBstポリメラーゼ、3種類の通
常のデオキシヌクレオチド(dCTP、dTTP、およ
びdGTP、それらのうち1種類はα−32P標識を保有
する)、および2′−デオキシアデノシン5′−O−
(1−チオトリホスフェート)(dATPαS)を用い
てそれらを伸長させ、完全二本鎖フラグメントを形成さ
せた。この二重らせんは92ヌクレオチドの長さであっ
た。次いでBsrIエンドヌクレアーゼを添加して増幅
反応を開始した(時間=0)。BsrIは、相補鎖が修
飾アデノシンを含む場合に2個のC間で認識/開裂部位
の非修飾鎖をニックする。次いでポリメラーゼはニック
において開始し、5′−3′方向に重合を行い、長さ7
0ヌクレオチドの一本鎖オリゴマーを置換する。第1サ
イクルの重合後にエンドヌクレアーゼ認識/開裂部位は
再生されるが、予め修飾されていない認識/開裂部位の
鎖は、ニックに対して3′側でdAαSにより部分交換
される。しかしこれはSDAを妨害しない。ニッキング
および重合の反復サイクルにより、反応に最初に存在し
ていた二重らせんそれぞれの70ヌクレオチド伸長生成
物の多数のコピーが生成する。
7.6;6mM MgCl2;50mM KCl、0.
5mM dCTP、TTP、dGTPおよびdATPα
S;100μCi[α−32P]dCTP(3000Ci
/mmol);50nMの各オリゴマー;50単位のB
srIエンドヌクレアーゼおよび2単位のBstポリメ
ラーゼを含有する緩衝液20μL中で60℃において実
施された。5、10および20分後に反応物からアリコ
ート(5μL)を取り出した。標識生成物を変性用ポリ
アクリルアミドゲル上での電気泳動により分離し、オー
トラジオグラフィーにより視覚化した。第1系列のSD
A反応は完全な上記試薬リストを含有していた。第2系
列のSDA反応においては、BsrIを排除した。第3
系列のSDA反応においては、二重らせんの形成後、制
限エンドヌクレアーゼの添加前に、加熱(100℃、5
分間)によりBstポリメラーゼを失活させた。
第1反応系列において第1時点(5分)以後に検出され
た。長さ92ヌクレオチドの無傷の相補鎖の対応するバ
ンドも見られた。第2系列の反応は、BsrIのニッキ
ング活性なしでは70ヌクレオチド伸長生成物は生成し
得ないので92ヌクレオチドの反応生成物のみを示し
た。第3系列の反応は二重らせんのニッキングのみを示
した。これは長さ70ヌクレオチドのかすかなバンドお
よび長さ92ヌクレオチドのかすかなバンドにより立証
された。両者とも反応に最初に存在した非増幅二重らせ
んにより生じるものである。この実験におけるSDAサ
イクルの代謝回転速度は、フィルムの濃度から約1mi
n-1であると推定された。
りバチルス属(Bacillus)菌種から単離)およ
びBcaポリメラーゼ(パンベラ・コーポレーション、
バチルス・カルドテナックス(Bacillus ca
ldotenax)からクローン化)を用いて、好熱S
DAによる標的配列の指数的増幅を証明した。二本鎖標
的配列(配列番号:13)の2本の一本鎖として作用す
る相補的オリゴマーを合成した。種々の濃度のこの標的
配列を含有する5μLをそれぞれの反応混合物に添加し
た。若干の反応には標的配列を添加しなかった。同様に
増幅プライマーを合成した。プライマーXBsoB1−
1(配列番号:14)はBsoBI制限エンドヌクレア
ーゼ認識/開裂部位を一本鎖状で含み、プライマーXB
soB1−2(配列番号:15)も同様であった。
一方の鎖にハイブリダイズして、突出した一本鎖5′末
端を含む17塩基対のオーバーラップを形成する。退出
した(recessed)二本鎖3′末端がポリメラー
ゼによって伸長することにより、二本鎖状の半修飾Bs
oBI認識/開裂部位を含む長さ103ヌクレオチドの
完全二本鎖状のフラグメントが得られる。同様にプライ
マーXBsoB1−2は標的配列の他方の鎖にハイブリ
ダイズして、突出した一本鎖5′末端を含む17塩基対
の二本鎖オーバーラップを形成する。この構造もポリメ
ラーゼによりフィルドインされて、二本鎖状の半修飾B
soBI認識/開裂部位を含む二本鎖103merを生
成する。
除いたものを3分間加熱して標的DNAを変性させ、次
いで60℃の反応温度に冷却した。3分間平衡化したの
ち、4単位のBcaおよび16単位のBsoBIを全容
量5μL中に添加した。反応混合物(最終容量50μ
L)中の試薬の最終濃度は下記のとおりであった:25
mM KiPO4 pH7.6;それぞれ1.375mM
のdCTPαS、dATP、dGTPおよびdTTP;
100μg/mlのアセチル化ウシ血清アルブミン;
6.5mM MgCl2;0.05μM XBsoB1
−1;0.05μMXBsoB1−2;16単位のBs
oBI;4単位のBca,+/−標的配列。増幅反応を
1時間進行させ、次いで試験管を沸騰水浴に5分間装入
することにより停止した。
10μLアリコートの各反応物を取り出し、32P−標識
プライマー(配列番号:16)を添加した。存在するい
ずれかの増幅生成物にプライマーをハイブリダイズさせ
たのち、ウォーカー(Walker)ら.1992.N
uc.Acids Res.(前掲)に従ってポリメラ
ーゼを添加することによりプライマーを検出可能な長さ
にまで伸長させた。10μLの変性用装填溶液を上記ア
リコートに添加し、次いでこれを加熱した。分析のため
に10μLを変性用ポリアクリルアミドゲル上で電気泳
動した。
オチドの推定長さは下記のとおりであった:1)58ヌ
クレオチド;ニックされ、置換された増幅生成物上での
プライマーの伸長により生成したもの、2)81ヌクレ
オチド;無傷の全長標的上でのプライマーの伸長により
生成したもの。本方法は、反応条件が最適化されていな
くても増幅反応物に150程度のわずかな分子が付加さ
れた場合に増幅生成物を検出するのに十分なほど感度が
高い。
的好熱SDAを、HincIIを用いる通常の直線的S
DAと比較した。増幅反応は下記の条件下で実施され
た: HincII(反応条件A) 45mM KiPO4,pH7.6 10% DMSO 各0.25mM dATPαS,dCTP,dGTP,
dTTP 100μg/ml アセチル化ウシ血清アルブミン 6mM MgCl2 50nM プライマー/標的コンプレックス(配列番
号:17および配列番号:18) 150単位 HincII 10USB単位 exo-クレノウポリメラーゼ 0.01mCi α−32P−dCTP BsoBI(反応条件B) 25mM KiPO4,pH8.3 各0.25mM dCTPαS,dATP,dGTP,
dTTP 100μg/ml アセチル化ウシ血清アルブミン 15mM MgCl2 50nM プライマー/標的コンプレックス(配列番
号:15および配列番号:13相補鎖) 16単位 BsoBI 4単位 Bcaポリメラーゼ 0.01mCi α−32P−dATP BsoBI(反応条件C) 25mM KiPO4,pH8.3 各0.25mM dCTPαS,dATP,dGTP,
dTTP 100μg/ml アセチル化ウシ血清アルブミン 6mM MgCl2 50nM プライマー/標的コンプレックス(配列番
号:15および配列番号:13相補鎖) 16単位 BsoBI 4単位 Bcaポリメラーゼ 0.01mCi α−32P−dATP 反応混合物(酵素を除いたもの)を3分間加熱して標的
DNAを変性させ、プライマーをアニールさせる増幅の
ための目的温度(HincIIについては40℃、Bs
oBIについては60℃)に冷却した。3分間平衡化し
たのち、2μLのポリメラーゼを添加し、伸長反応を2
0分間進行させて、HincII系については長さ85
ヌクレオチド、BsoBIについては長さ103ヌクレ
オチドの相補的二本鎖標的を生成させた。次いで伸長反
応の対照として3.5μLアリコートを5μLの停止溶
液に取り出した。次いで適宜な制限エンドヌクレアーゼ
を添加した(2μL)。HincIIについては5、2
0および60分の時点が採用された。BsoBIについ
ては1、3および6分の時点が採用された。各時点につ
いてのアリコートを直接に5μLの停止溶液に添加し
た。次いで試料を2分間加熱沸騰させ、5μLを電気泳
動のために変性用ポリアクリルアミドゲルに装填した。
ゲルをオートラジオグラフィーにより分析した。
いての予想反応生成物は、全長の無傷標的分子(長さ8
5ヌクレオチド)、および長さ60ヌクレオチドのニッ
クされ、置換された増幅生成物であった。BsoBI反
応についての予想反応生成物は、全長の標的(長さ10
3ヌクレオチド)、および81mer増幅生成物であっ
た。これらの生成物はすべて検出された。しかし通常の
HincII/exo-クレノウ系とBsoBI/Bc
a系との間には反応速度に著しい相違があった。Hin
cII反応は、検出可能な水準のニックされ、置換され
た増幅生成物を生成するために約60分を要した。これ
に対しBsoBI系は、検出可能な水準の標的配列増幅
を生成するために約6分を要したにすぎない。BsoB
I系につき試験した2反応条件のうち、低い方の濃度の
MgCl2を用いる反応条件Cは、反応条件Bと比較し
て向上した速度の増幅を生じた。
uc.Acids Res.前掲)のSDA標的生成方
式を示す。
対するSDA反応サイクル(指数的増幅)を示す。1種
類の増幅プライマーを用いる反応サイクルを示す図2の
部分は直線的SDAを示す。
Claims (10)
- 【請求項1】 標的配列を増幅するための下記を含む方
法: a)標的配列を含む一本鎖核酸フラグメントを用意し、
該フラグメントは5′末端および3′末端を有し; b)SDAのための増幅プライマーを該フラグメントの
3′末端に、該プライマーが5′側一本鎖オーバーハン
グを形成するように結合させ、該増幅プライマーは標的
核酸配列を切断しない好熱性制限エンドヌクレアーゼに
対する認識/開裂部位を含み; c)フラグメント上の増幅プライマーを約50℃−60
℃において下記の存在下に伸長させ: i)好熱性DNAポリメラーゼ;該ポリメラーゼは約6
5℃−75℃の重合化活性の最適温度を有し、鎖置換活
性を有し、かつ5′−3′エキソヌクレアーゼ活性を欠
如する、 ii)デオキシヌクレオシドトリホスフェート、 iii)少なくとも1種類の誘導デオキシヌクレオシド
トリホスフェート、および iv)前記の認識/開裂部位が誘導デオキシヌクレオシ
ドトリホスフェートの取り込みにより半修飾された場合
に該部位をニックする、好熱性制限エンドヌクレアー
ゼ;該エンドヌクレアーゼは約50℃−65℃の二本鎖
DNAの切断の最適温度を有する、 これにより、標的配列に対して相補的な新たに合成され
た第1鎖、および二本鎖状の半修飾された制限エンドヌ
クレアーゼ認識/開裂部位を含む、増幅プライマーの第
1伸長生成物を産生させ; d)この二本鎖状の半修飾された制限エンドヌクレアー
ゼ認識/開裂部位を制限エンドヌクレアーゼによりニッ
クし; e)このニックからDNAポリメラーゼにより伸長さ
せ、これにより前記の新たに合成された第1鎖をフラグ
メントから置換し、そして新たに合成された第2鎖を含
む第2伸長生成物を生成させ、そして; f)このニッキング、伸長および置換の工程を反復し
て、これにより標的配列を増幅する。 - 【請求項2】 DNAポリメラーゼがBcaポリメラー
ゼおよびBstポリメラーゼよりなる群から選ばれる、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 制限エンドヌクレアーゼがBsrI、B
stNI、BsmAI、BslI、BsoBIおよびB
stOIよりなる群から選ばれる、請求項2に記載の方
法。 - 【請求項4】 標的配列を増幅するための下記を含む方
法: a)標的配列を含む第1および第2一本鎖フラグメント
を用意し、第1および第2一本鎖フラグメントはそれぞ
れ5′末端および3′末端を有し; b)SDAのための第1増幅プライマーを第1一本鎖フ
ラグメントの3′末端に、かつSDAのための第2増幅
プライマーを第2一本鎖フラグメントの3′末端に、第
1および第2増幅プライマーがそれぞれ第1および第2
一本鎖フラグメント上に5′側一本鎖オーバーハングを
形成するように結合させ、第1および第2増幅プライマ
ーはそれぞれ標的核酸配列を切断しない好熱性制限エン
ドヌクレアーゼに対する認識/開裂部位を含む5′末端
を含み; c)フラグメント上の第1および第2増幅プライマーを
約50℃−60℃においてそれぞれ下記の存在下に伸長
させ: i)好熱性DNAポリメラーゼ;該ポリメラーゼは約6
5℃−75℃の重合化活性の最適温度を有し、鎖置換活
性を有し、かつ5′−3′エキソヌクレアーゼ活性を欠
如する、 ii)デオキシヌクレオシドトリホスフェート、 iii)少なくとも1種類の誘導デオキシヌクレオシド
トリホスフェート、および iv)前記の認識/開裂部位が誘導デオキシヌクレオシ
ドトリホスフェートの取り込みにより半修飾された場合
に該部位をニックする、好熱性制限エンドヌクレアー
ゼ;該エンドヌクレアーゼは約50℃−65℃の二本鎖
DNAの切断の最適温度を有する、 これにより、i)第1一本鎖フラグメントに対して相補
的な新たに合成された第1鎖、および第1の二本鎖状の
半修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む、
第1増幅プライマーの第1伸長生成物、ならびにii)
第2一本鎖フラグメントに対して相補的な新たに合成さ
れた第2鎖、および第2の二本鎖状の半修飾された制限
エンドヌクレアーゼ認識/開裂部位を含む第2伸長生成
物を産生させ; d)第1および第2の半修飾された制限エンドヌクレア
ーゼ認識/開裂部位を好熱性制限エンドヌクレアーゼに
よりニックし; e)これらのニックからDNAポリメラーゼにより伸長
させ、これにより前記の新たに合成された第1鎖を第1
一本鎖フラグメントから置換し、かつ新たに合成された
第2鎖を第2一本鎖フラグメントから置換し、これによ
りそれぞれ新たに合成された第3鎖および第4鎖を生成
させ; f)このニッキング、伸長および置換の工程を反復し
て、これにより標的配列を増幅する。 - 【請求項5】 標的配列を含む二本鎖フラグメントが下
記を含む方法により生成する、請求項4に記載の方法: a)標的配列を含む核酸フラグメントに第1および第2
増幅プライマーを結合させ、第1および第2増幅プライ
マーは核酸フラグメントの対向鎖上の標的配列の3′側
に結合し; b)フラグメント上の第1および第2増幅プライマーを
伸長させ、これにより、第1増幅プライマーの第1伸長
生成物および第2増幅プライマーの第2伸長生成物を産
生させ; c)第1および第2バンパープライマーを伸長させるこ
とにより第1および第2伸長生成物を置換し、そして; d)置換された第1および第2伸長生成物に対する相補
鎖を誘導デオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在
下に合成し、これによりSDAによって増幅しうる標的
配列を含む二本鎖フラグメントが生成する。 - 【請求項6】 DNAポリメラーゼがBcaポリメラー
ゼおよびBstポリメラーゼよりなる群から選ばれる、
請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】 制限エンドヌクレアーゼがBsrI、B
stNI、BsmAI、BslI、BsoBIおよびB
stOIよりなる群から選ばれる、請求項6に記載の方
法。 - 【請求項8】 標的配列を増幅するための下記を含む方
法: a)標的配列を含む一本鎖核酸フラグメントにSDAの
ための増幅プライマーを結合させ、該フラグメントは
5′末端および3′末端を有し、増幅プライマーは標的
核酸配列を切断しない好熱性制限エンドヌクレアーゼに
対する認識/開裂部位を含み、かつ標的配列の3′側で
フラグメントに結合し; b)フラグメント上の増幅プライマーを約50℃−60
℃において下記の存在下に伸長させ: i)好熱性DNAポリメラーゼ;該ポリメラーゼは約6
5℃−75℃の重合化活性の最適温度を有し、鎖置換活
性を有し、かつ5′−3′エキソヌクレアーゼ活性を欠
如する、 ii)デオキシヌクレオシドトリホスフェート、 iii)少なくとも1種類の誘導デオキシヌクレオシド
トリホスフェート、および iv)前記の認識/開裂部位が誘導デオキシヌクレオシ
ドトリホスフェートの取り込みにより半修飾された場合
に該部位をニックする、好熱性制限エンドヌクレアー
ゼ;該エンドヌクレアーゼは約50℃−65℃の二本鎖
DNAの切断の最適温度を有する、 これにより、新たに合成された第1鎖を含む、増幅プラ
イマーの第1伸長生成物を産生させ; c)この第1伸長生成物をフラグメントから置換し; d)第1伸長生成物に対する相補鎖を少なくとも1種類
の誘導デオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下
に合成し、これにより二本鎖状の半修飾された制限エン
ドヌクレアーゼ認識/開裂部位を生成させ; e)この二本鎖状の半修飾された制限エンドヌクレアー
ゼ認識/開裂部位を好熱性制限エンドヌクレアーゼによ
りニックし; f)このニックからポリメラーゼにより伸長させ、これ
により前記の新たに合成された第1鎖をフラグメントか
ら置換して、新たに合成された第2鎖を含む第2の伸長
生成物を生成させ、そして; g)このニッキング、伸長および置換の工程を反復し
て、これにより標的配列を増幅する。 - 【請求項9】 DNAポリメラーゼがBcaポリメラー
ゼおよびBstポリメラーゼよりなる群から選ばれる、
請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】 制限エンドヌクレアーゼがBsrI、
BstNI、BsmAI、BslI、BsoBIおよび
BstOIよりなる群から選ばれる、請求項9に記載の
方法。
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