KR0156290B1 - 호열성 효소를 사용한 사슬 치환 증폭방법 - Google Patents
호열성 효소를 사용한 사슬 치환 증폭방법Info
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Abstract
본 발명은 넓은 온도범위(37-70℃)에 걸쳐 수행가능한 사슬 치환 증폭방법(호열성 SDA)에 관한다. 호열성 SDA에 바람직한 온도 범위는 50-70℃이다. 혹종의 호열성 제한 엔도누클레아제는 SDA에 요구되는 바와같이 완전히 조절되지 않은 제한 엔도누클레아제 인지/절단부위를 니킹시켜 그 부위로부터 치환시킬수 있음이 알려져 있다. 또한 혹종의 호열성 중합효소는 하향 사슬을 치환시키면서 닉에서 증대시킬수 있다는 것도 알려져 있다. 반응 온도가 종래 SDA 효소 시스템에서 예전에 가능했던 것보다 더 높기 때문에, 호열성 SDA는 특이성 및 효율성이 개선되고, 비특이 기준치 증폭은 감소되었으므로 증폭 생성물의 수율은 잠재적으로 증대되었다. 게다가 변성온도를 견딜 수 있는 효소를 사용하는 경우 이본쇄 타겟의 초기 열변성후에 별도의 단계로 효소를 가해야 할 필요성이 없어졌다.
Description
제1도에서는 Walker 등 (1992. Nuc. Acids Res.)의 SDA타겟 생성을 예시하고 있다.
제2도에서는 두개의 증폭 프라이머를 가진 이본쇄 타겟에 대한 SDA 반응 회로(지수적 증폭)를 예시하고 있다. 하나의 증폭 프라이머를 사용한 반응 회로를 나타내는 제2도의 일부분은 직선적 SDA를 예시하고 있다.
본 발명은 핵산 타겟 서열의 증폭에 대한 방법, 특히 핵산 타겟 서열의 증폭에 대한 등온 방법에 관한다.
생체외 핵산 증폭 기술은 소량의 핵산 검출 및 분석용으로 강력한 수단을 제공해왔다. 이러한 방법은 극히 고감도이므로 이를 전염병 및 유전병의 진단, 분석용 유전자의 분리 및 법의학에서와 같이 특정 핵산 검출용으로 발전시켜 보려는 시도가 행해져 왔다. 핵산 증폭기술은 공정에 요구되는 온도에 따라 분류할 수 있다. 중합효소 연쇄반응(PCR로 칭해짐 : R. K. Saiki 등, 1985. Science 230, 1350-1354), 리가제 연쇄반응(LCR로 칭해짐 : D. Y. Wu 등, 1989. Genomics 4, 560-569 : K. Barringer 등, 1990. Gene 89, 117-122 : F. Barany. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189-193), 전사에 의한 증폭(D. Y. Kwoh 등, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177) 및 제한 증폭(미국 특허 제5102784호)에서는 온도 순환이 요구된다. 대조적으로, 사슬 치환 증폭(SDA : G. T. Walker 등, 1992. Proc. Natl. Sci. USA 89, 392-396, G. T. Walker 등, 1992. Nuc. Acids. Res. 20, 1691-1696 및 EP 0497272, 이 세 문헌들을 참고자료로서 본원에 합체되어 있다), 자기-지속형 서열 복제(3SR ; J. C. Guatelli 등, 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878) 및 Qβ 리플리카제 시스템(P. M. Lizardi 등, 1988. BioTechnology 6, 1197-1202)과 같은 방법은 등온 반응이다. 부가적으로, WO 90/10064호 및 WO 91/03573호에서는 핵산 등온 복제용 박테리오파아지 phi29 복제 기원의 용법에 대하여 기술하고 있다. WO 92/05287호에서는 하나의 사슬에서의 수식(modification)에 의해 절단시약이 마주보는 사슬을 선택적으로 절단할 수 있는 서열-특이적 올리고누클레오타이드의 등온 생산 방법에 대하여 기술하고 있다. 일본쇄의 상보적 올리고누클레오타이드는 방출되어 부가적인 상보적 올리고누클레오타이드가 재중합되도록 해준다. PCR과 같은 증폭반응의 특색인 고온 및 저온 사이를 순환하는 것과는 대조적으로 등온 증폭은 항온에서 수행된다.
종래 SDA 반응은 약 37∼42의 항온에서 실시되었다. 이는 엑소-클레노우(exo-klenow) DNA 중합효소 및 특히 제한 엔도누클레아제(예를들어, Hinc Ⅱ) 가 비내열성(감온성)이기 때문이다.
따라서 증폭을 유도하는 효소는 반응온도가 올라감에 따라 불활성이 된다. 그러나 예전에 가능했던 것보다 더 높은 온도에서 SDA와 같은 등온 증폭반응을 수행할 수 있는 능력은 몇가지 이점을 가질 수 있다. 고온에서의 증폭은 증폭 프라이머 및 주형 DNA간에 훨씬 엄격하게 어닐링(annealing)이 일어나도록 함으로써 증폭 공정의 특이성을 향상시킬 것이다. 상기 향상된 증폭 특이성의 결과로서, 빽그라운드의 반응은 또한 감소될 것이다. SDA에서, 빽그라운드 반응의 주요한 공급원은 증폭 프라이머가 서로 상호 작용하는 경우 생성되는 짧은 프라이머 이량체이다. 프라이머 이량체의 형성을 목적으로 하는 타겟 서열의 특이적 증폭의 효율을 상당히 손상시킨다.
이러한 프라이머 이량체의 형성은 더 낮은 온도에서 일어나기가 더 쉬운데, 이는 반응의 엄격성이 감소되어 제한된 상동성을 지닌 서열들간에 일시적 하이브리다이제이션(hibridization)이 증가하기 때문이다. 더 높은 온도에서 SDA를 수행할 수 있는 능력은 프라이머 이량체의 상호작용을 잠재적으로 감소시키고 빽그라운드를 감소시키며 특이적 타겟 증폭의 효율을 증대시킬 것이다. 게다가, 고온에서의 증폭은 중합효소에 의한 사슬 치환을 용이하게 해줄 것이다. 개선된 사슬 치환활성은 타겟 증폭의 효율을 증대시켜 증폭 생성물의 수율을 증대시키게 할 것이다. 충분히 열에 안정한 효소를 사용하면 SDA 반응에 요구되는 모든 시약들이 초기 열변성 단계전에 가해지도록 할 수 있다. 종래 SDA는 이본쇄 타겟 서열이 열에 의해 변성된 후에 효소를 그 반응혼합물에 가할 것을 요한다.
dUTP는 SDA에 의해 증폭된 타겟 DNA에 첨합될(incorporated) 수 있다. 이는 선행 증폭으로 얻어진 앰플리콘(이후의 증폭반응물에 혼입될 가능성이 있음)이 우라실 DNA 글리코실라제(UDG)로 처리되어 증폭할 수 없도록 한다. 이러한 탈혼입법(decontamination) 자체는 SDA 반응에서 앰플리콘이 생성되는 온도에 무관하게 이용될 수 있다. 그러나 저온(즉 37∼42℃)에서 생성된 SDA 증폭 생성물은 높은 레벨의 비특이적 빽그라운드 생성물을 함유할 것이다. 다량의 빽그라운드 앰플리콘의 탈혼입은 혼입된 타겟-특이적 앰플리콘 제거를 상당히 방해하므로 탈혼입 공정의 효율이 감소할 것이다. 따라서 생성된 비특이적 빽그라운드 앰플리콘의 양을 억제시킴으로써 보다 높은 온도에서 SDA를 수행할 수 있는 능력은 UDG 탈혼입 공정 효율을 증대시킬 수 있다.
SDA 반응은 타겟 서열을 성공적으로 증폭시키기 위하여 몇몇의 매우 특이적 효소활성을 요구한다. 호열성 중합효소는 문헌에 광범위하게 보고된 바 있다. 그러나, 다른 핵산 증폭 시스템은 SDA의 효소적 활성의 조합을 요구하는 것은 아니므로, SDA에 필요한 생물학적 활성과 관련되는 것으로서의 호열성 효소의 반응 요건 및 활성에 대해서는 본 발명 이전에는 거의 공지되지 않았다. 더욱이, SDA는 두개의 상위효소(제한 엔도누클레아제 및 중합효소) 동시 활성을 요구하므로 이러한 적합성이 있는(compatible) 호열성 효소쌍이 존재하는지 아닌지에 대해서는 본 발명 이전에는 공지된 것이 없다. 즉, 호열성 중합효소 및 호열성 제한 엔도누클레아제 양자가 요구된다. 이러한 두 개의 효소는, 양자가 동일한 SDA 반응 혼합물 내에서 효과적으로 작용하기 위해서, 또한 SDA와 적합성이 있는 온도 및 반응조건(예를들면, 염)의 요건을 가져야만 한다. 게다가, 중합효소 1) 천연적으로 또는 불활성시켜 5'-3' 엑소누클레아제 활성이 없고, 2) SDA에 요구되는 수식된 누클레오타이드(α 티오-dNTP 또는 기타 수식된 dNTP)를 첨합시키고 3) 일본쇄 닉에서 시작하는 하류(downstream) 일본쇄를 이본쇄 분자로부터 치환하고, 더욱이 바람직하게는 4) 앰플리콘을 탈혼입시키기 위하여 dUTP를 첨합시켜야만 한다. 상기 중합효소는 유리 3'-OH에 dNTP를 가하여 주형상의 상보적 사슬을 신장(extend)시켜야만 한다. 또한 중합효소는 고도의 처리능력을 갖는 것이 바람직하다. 즉, 중합효소는 신장 생성물을 해리 및 종결시키기 전에 가능한 한 많은 누클레오타이드를 부가시킬 수 있어야 할 것이다. 제한 엔도누클레아제는 1) 인지/절단부위가 반수식된(hemimodified) 경우 이본쇄 인지/절단부위를 니킹(즉, 일본쇄로 절단)시키고, 2) 중합효소가 타겟에 효과적으로 결합하여 증폭시킬 수 있도록 충분히 신속하게 인지/절단부위로부터 해리하고, 바람직하게는 3) 인지/절단부위에 첨합된 dUTP에 의해 영향을 받지 않아야 한다. 게다가, 제한 엔도누클레아제는 중합효소와 적합성인 온도 및 반응 조건하에서 활성을 나타내어야 한다.
본 발명은 종래의 사슬 치환 증폭(SDA) 보다 더 넓은 온도 범위(37∼70 호열성 SDA)에 걸쳐 수행될 수 있는 등온 SDA에 대한 방법을 제공한다. 호열성 SDA에 바람직한 온도범위는 50∼70℃이다. 특정의 호열성 제한 엔도누클레아제는 SDA에 요구되는 반수식된 제한 엔도누클레아제 인지/절단부위를 니킹하고, 이 부위로부터 해리할 수 있음이 알려져 있다. 또한 특정의 호열성 중합효소는 하류의 사슬을 치환시키면서 닉으로부터 신장시킬 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 발견들로부터, 예전에 가능했던 것보다 더 높은 온도에서 수행할 수 있기 때문에 특이성 및 효율성이 향상, 비특이적 빽그라운드 증폭은 감소, 및 증폭 생성물의 잠재적인 수율이 신장된 SDA 방법의 개발이 가능하게 되었다. 게다가 변성온도에서 안정한 효소를 사용할 경우 초기 이본쇄 타겟의 열변성 후 별도의 단계에서 효소를 가해야 할 필요가 없어질 것이다. 비특이적 빽그라운드 앰플리콘의 양이 감소될 경우 SDA 반응내 타겟-특이적 앰플리콘의 UDG 탈혼입 또한 훨씬 효율적이 된다.
본원에서는 다음과 같이 정의한 용어 및 문구를 사용한다.
증폭 프라이머란 프라이머 신장에 의한 타겟 서열 증폭용 프라이머이다. SDA에 있어서, 증폭 프라이머의 3'말단(타겟 결합서열)은 타겟 서열의 3'말단에서 하이브리다이즈한다. SDA 증폭 프라이머는 또한 5'말단 부근에서 제한 엔도누클레아제에 대한 인지/절단부위를 포함한다. 인지/절단부위에 제한 부가적인 누클레오타이드 5'는 제한 엔도누클레아제의 효과적인 결합을 제공하기 위하여 존재할 수 있다. Walker 등(1992. PNAS. 상기참조)이 기술한 바와 같이, 인지/절단부위는, 인지/절단부위가 반수식된 경우 DNA 이중 나선의 하나의 사슬은 니킹하는 제한 엔도누클레아제에 대한 것이다. 반수식된 인지/절단부위는 하나의 사슬이 제한 엔도누클레아제에 의해 두개의 사슬 중 하나가 절단되는 것을 막아주는 최소한 하나의 유도합성된 누클레오타이드를 함유하는 제한 엔도누클레아제에 대한 이본쇄 인지/절단부위이다. 대부분의 경우, 초기에는 유도합성된 누클레오타이드를 함유하지 않는 반수식된 인지/절단부위의 사슬은 제한 엔도누클레아제에 의해 니킹된다. 그러나, 일차 SDA 순환후 니킹된 사슬의 인지/절단부위의 절반은 유도합성된 누클레오타이드를 함유할 것이나 이는 연속적인 니킹을 방해하지는 않는다. 통상의 SDA에 대한 바람직한 반수식된 인지/절단부위는 제한 엔도누클레아제 HincII, HindII, AvaI, NciI 및 Fnu4hI에 대한 반수식된 인지/절단부위이다. 증폭 프라이머의 타겟 결합서열이 타겟 서열과 하이브리다이즈하는 경우 증폭 프라이머는 또한 DNA 중합효소에 의해 신장가능한 3'-OH 그룹을 포함한다. 대부분의 SDA 반응에 있어서, 증폭 프라이머에 의해 타겟 서열이 증폭된다.
신장 생성물은 프라이머 결합부위의 하류의 타겟 서열에 상보적인, 새로 합성된 사슬 및 프라이머(또는 프라이머의 일부)를 포함하는 핵산이다. 신장 생성물은 프라이머를 타겟 서열과 하이브리다이즈시키고 주형으로 타겟 서열을 사용한 중합효소에 의해 프라이머를 증폭시켜 얻는다.
완충 프라이머 또는 외부 프라이머는 증폭 프라이머의 상류에서 타겟 서열에 어닐(anneal)되고, 따라서 완충 프라이머가 신장되어 증폭 프라이머 및 이의 신장 생성물이 치환된다. 완충 프라이머의 신장은 증폭 프라이머의 신장 생성물을 치환시키는 한 방법이나, 가열시키는 것 또한 적당하다.
동일 서열이 동일한 상보적 누클레오타이드 서열에 하이브리다이즈될 것이다. 거의 동일한 사열은 또한 동일한 부분적으로 상보적인 누클레오타이드 서열과 하이브리다이즈될 수 있을 정도로 누클레오타이드 서열과 충분히 유사하다.
타겟(들)이란 증폭될 핵산서열을 뜻한다. 이는 증폭될 원래의 핵산서열, 이의 상보적 이차 사슬 및 증폭반응에서 생성되는 원래 서열의 카피의 사슬이다. 타겟 서열은 또한 하이브리다이즈된 증폭 프라이머의 신장을 위한 주형으로도 언급될 수 있다.
증폭 생성물, 증폭될 생성물 또는 앰플리콘은 타겟 서열의 카피를 포함하고, 증폭 프라이머의 하이브리다이즈 및 신장에 의해 생성된다.
이 용어는 증폭반응의 중간물을 포함하여 원래 타겟 서열의 카피를 함유하는 일본쇄 및 이본쇄 증폭 프라이머 신장 생성물 둘다를 의미한다.
사슬 치환 증폭(SDA)은, 프라이머의 신장, 반수식된 제한 엔도누클레아제 인지/절단부위의 니킹, 일본쇄 신장 생성물의 치환, 프라이머의 신장 생성물(또는 원래 타겟서열)에의 어닐링 및 프라이머의 연속적인 신장이 반응 혼합물내에서 동시에 일어나는 등온의 핵산 증폭방법이다. 이는 반응의 온도 순환 특색의 결과 반응 단계들이 별도의 상 또는 회로에서 일어나는 PCR과는 대조적이다. SDA는 1) 이본쇄 인지/절단 부위의 헤미포스포로티오에이트 형태의 비수식된 사슬을 니킹시킬 수 있는 제한 엔도누클레아제의 능력 및 2) 닉에서 복제를 개시시키고 하류의 비주형 사슬을 치환시킬 수 있는 특정의 중합효소의 능력에 기초하고 있다. 프라이머의 어닐링을 위한 이본쇄 타겟 서열을 변성시킬 고온(약 95℃)에서의 초기 인큐베이션 후, 새로 합성된 사슬의 연속적 중합 및 치환은 항온에서 일어난다. 타겟서열의 각각의 새로운 카피의 생성은 다음과 같은 5단계로 이루어진다 ; 1) 증폭 프라이머를 원래 타겟 서열 또는 미리 중합시킨 치환된 일본쇄 신장 생성물에 결합시키는 단계, 2) 5'-3' 엑소누클레아제 결핍 중합효소를 α-티오데옥시누클레오사이드 트리포스페이트(α 티오, dNTP)에 첨합시켜 프라이머를 신장시키는 단계, 3) 반수식된 이본쇄 제한 부위를 니킹시키는 단계, 4) 닉부위로부터 제한효소를 해리시키는 단계, 및 5) 5'-3' 엑소누클레아제 결핍 중합효소로 닉의 3'말단으로부터 신장시키면서 새로 합성된 하류의 사슬을 치환시키는 단계. 닉으로부터 신장이 일어나 다른 니킹가능한 제한부위를 재생시키기 때문에 니킹, 중합 및 치환은 항온에서 동시에 또 연속적으로 일어난다. 각각이 이본쇄 타겟 서열의 두개의 사슬 중 하나와 하이브리다이즈하는 한쌍의 증폭 프라이머가 사용될 경우, 증폭은 지수적으로 일어난다.
이는 센스 및 안티센스 사슬이 연속 증폭시 마주보는 프라이머에 대한 주형으로 작용하기 때문이다. 단일 증폭 프라이머가 사용된 경우, 단지 하나의 사슬이 프라이머 신장용 주형으로 착용하기 때문에 증폭은 직선적이다. α-티오 dNTP가 첨합되는 경우 이본쇄 인지/절단부위를 니킹시키는 제한 엔도누클레아제의 보기는 HinII, HindII, AvaI, NciI 및 Fun4HⅠ이다. 상기한 제한 엔도누클레아제 모두 및 요구되는 니킹 활성을 나타내는 기타의 제한 엔도누클레아제들은 통상적인 SDA에 사용하기에 적당하다. 그러나, 이들은 비교적 비내열성이고 약 40℃ 이상에서는 활성이 손실된다.
SDA에 의한 증폭용 타겟은 타겟 서열을 절단하지 않는 엔도누클레아제로써, 대형 핵산을 단편화시킴으로써 제조될 것이다. 그러나, 일반적으로 SDA 반응에서 니킹용으로 선별된 제한 엔도누클레아제 인지/절단부위를 갖는 타겟 핵산이 Walker 등(1992. Nuc. Auc. Acids Res., 상기참조)이 기술한 바와 같이, 또는 미합중국 특허 제 5, 270, 184호(본원에 참고용으로 합체된)에서 기술한 바와 같이 생성되는 것이 바람직하다. 요약하자면, 타겟 서열이 이본쇄일 경우 4개의 프라이머가 이와 하이브리다이즈된다. 프라이머들 중 두개(S1및 S2)는 SDA 증폭 프라이머이고 나머지 두개(B1및 B2)는 외부 또는 완충 프라이머이다. S1및 S2는 타겟 서열에 측면을 접한 이본쇄 핵산의 마주보는 사슬에 결합된다. B1및 B2는 각각 S1및 S2의 타겟 서열 5'측(즉, 상류)에 결합된다. 엑소누클레아제 결핍 중합효소는 3개의 데옥시누클레오사이드 트리포스페이트 및 최소한 하나의 수식된 데옥시누클레오사이드 트리포스페이트(예를들면, 2'-데옥시아데노신 5'-0-(1-티오트리포스페이트), dATPαS) 존재하에 모두 4개의 프라이머를 동시에 신장시키는데 사용된다. S1및 S2및 의 신장 생성물은 B1및 B2의 신장에 의해 본래 타겟 서열 주형으로부터 치환된다. 치환된 증폭 프라이머의 일본쇄 신장 생성물은 마주보는 증폭 및 완충 프라이머(예를들어, S2및 B2와 결합한 S1의 신장 생성물)의 결합을 위한 타겟으로 작용한다. 그 다음 신장 및 치환을 순환시켜 각 말단에 반수식된 제한 엔도누클레아제 인지/절단 부위를 지닌 두개의 이본쇄 핵산 단편을 얻게 된다. 이는 SDA에 의한 증폭용으로 적당한 기질이다. SDA에서와 같이, 타겟 생성 반응의 개개의 단계는 동시에 또한 연속적으로 일어나, SDA에서의 제한효소에 의한 니킹에 필요한 인지/절단 서열을 말단에 지닌 타겟 서열을 생성시킨다. SDA 반응의 모든 성분들은 타겟 생성반응에 이미 존재하고 있으므로, 자동적으로 또한 연속적으로 생성된 타겟 서열은 SDA 회로로 들어가 증폭된다.
SDA 반응에 다른 증폭 생성물이 교차혼입하는 것을 방지하기 위하여, dUTP는 증폭 반응을 방해하지 않으면서 dTTP 대신 SDA- 증폭된 UDG로 첨합될 수 있다. 우라실-수식된 핵산은 특별히 인지되어 UDG로 처리시킴으로써 불활성화된다. 따라서 dUTP가 선행반응에서 SDA-증폭된 DNA로 첨합되는 경우, 특정의 연속 SDA 반응은 이본쇄 타겟의 증폭전에 UDG로 처리시킬 수 있고 미리 증폭된 반응물로부터 얻은 특정의 dU 함유한 DNA는 증폭될 수 없도록 할 수 있을 것이다. 연속 반응에서 증폭될 타겟 DNA는 dU를 함유하지 않으며 UDG 처리에 영향받지 않을 것이다. UDG는 타겟의 증폭전에 Ugi로 처리시켜 억제시킬 수 있을 것이다. 이와는 다르게, UDG는 열에 의해 불활성될 것이다. 호열성 SDA에서, 반응 자체의 온도가 높을수록(50℃ 이상) UDG를 불활성시킴과 동시에 타겟을 증폭시키는데 사용할 수 있다.
SDA는 5'-3' 엑소누클레아제 활성이 없고, 이본쇄 핵산내 일본쇄 닉에서 중합을 개시시키고, 주형으로서 니킹되지 않은 사슬을 사용하여 새로운 상보적 사슬을 생성시키면서 닉의 하류의 사슬을 치환시키는 중합효소를 필요로 한다. 중합효소는 누클레오타이드를 유리 3'-OH에 가함으로써 신장될 것이다. 최적의 SDA 반응을 수행하기 위해서, 중합효소가 증폭될 수 있는 타겟 서열의 길이를 최대화할 수 있도록 고도의 가공성을 지닌 중합효소는 신장 생성물의 해리 및 종결전에 상당한 길이의 새로운 사슬을 중합시킬 수 있다. 치환활성은 증폭반응에 필수적인데, 이에 의해서 부가적 카피의 합성에 유용한 타겟을 만들고, 지수적 증폭반응에서 이차 증폭 프라이머가 하이브리다이즈하게 될 일본쇄 신장 생성물을 생성시키기 때문이다. 니킹활성 또한 매우 중요한데, 이는 니킹이 반응을 지속시키고 타겟 증폭의 연속적 순환이 개시되도록 해주기 때문이다.
SDA에 적당한 온도에서 호열성 중합효소의 활성에 대하여 과거에 알려진 바가 거의 없기 대문에, 후보(candidate) 호열성 중합효소가 존재하는 경우, 그 중합효소를 동정할 수 있는 중합효소 스크리닝 시스템이 개발되었다. 이러한 스크리닝 시스템은 이본쇄 주형내 일본쇄 닉에서 개시되는 하류의 사슬을 치환시킬 수 있는 중합효소의 능력을 테스트하는 신장 검정방법(extension assay)이다. 중합효소 치환활성의 존재는 SDA에 필수적이다. 그러나, 다른 적당한 호열성 중합효소내에 5'-3' 엑소누클레아제 활성이 존재하는 경우 업계에 공지된 일상적 방법들(WO 92/06200)에 의해 불활성화시킬 수 있다.
중합효소내 엑소누클레아제 활성을 선택적으로 불활성시키는 가장 일반적인 방법들 중 하나는 중합효소에 대한 유전자를 클로닝하고, 엑소누클레아제 활성에 관한 단백질 도메인을 코드하는 유전자 서열의 일부를 동정하고, 생체의 돌연변이 유발시켜 상기 유전자를 불활성시키는 것이다.
이와는 다르게, 엑소누클레아제 활성은 중합효소를 프로테아제로 처리시켜 목적하는 중합 및 치환 활성만을 나타내는 단편들을 분리시킴으로써 불활성화시킬 수 있을 것이다. 따라서, 적당한 온도에서 활성화되고, 닉에서의 신장을 개시하고, 수식된, 말하자면, 비통상적인 dNTP가 첨합되었지만 5'-3' 엑소누클레아제 활성을 갖는, 신장 검벙방법에서 동정된 호열성 중합효소는 호열성 SDA에 관한 고찰로부터 제외되지 않는다.
중합효과에 관한 신장 검정방법에 있어서, 이본쇄 핵산으로부터의 일본쇄의 치환 및 닉서의 개시는 양쪽 프라이머에 상보적인 완전(intact) 서열상에서 서로 인접하게 두개의 프라이머를 어닐링시켜 수행된다. 이 프라이머들은 5'말단에서 라벨된다. 사슬 치환 활성을 갖는 중합효소는 인접한 프라이머에 의해 형성된 닉에서 중합을 개시할 수 있고, 5'-3' 엑소누클레아제 활성을 갖지 않는 경우에 두 프라이머들은 신장되고 두개의 신장 생성물은 검출될 것이다. 중합효소가 5'-3' 엑소누클레아제 활성이 없으면서 닉에서의 신장도 개시시킬 수 없거나(예를 들면 간극이 요구된다) 또는 치환활성이 없는 경우, 단지 하류의 프라이머의 신장 생성물만 검출될 것이다. 닉에서 개시되나 5'-3' 엑소누클레아제 활성을 갖는 중합효소는 단지 상류의 프라이머의 신장 생성물만을 생성시킬 것이다.
다음의 중합효소는 본 발명용으로 요구되는 모든 특색을 가지는 것으로 동정되었다 ; 엑소-베트(exo-Vent)[뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Bioabs)], 엑소-딥 벤트(exo-Deep Vent)[뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)], 비에스티(Bst)[바이오랫(Biorad)], 엑소-Pfu[스트라타젠(Stratagene)], 비씨에이(Bca)[판베라(Panvera)], 및 시퀀싱 그레이드 태크(Sequencing Grade Taq)[프로메가(Promega)]. 기타는 당업자들이 직접 실시하지 않고도 전술한 신장 검정방법을 이용하여 일상적으로 동정할 수 있으며 이러한 모든 중합효소는 호열성 SDA 용으로 적당할 것이다. 중합효소 티티에치(Tth)(뵈링거사 제품), 티에프엘(Tfl)(에피센터사 제품), 리플리나제(REPLINASE)(듀퐁사 제품) 및 리플리섬(REPLITHERM)(에피센터사 제품)은 닉에서 사슬을 치환시키나 또한 5'-3' 엑소누클레아제 활성을 갖는다. 이러한 중합효소는, 예를 들면 유전공학에 의해 엑소누클레아제 활성을 제거한 후에는 본 발명 방법에 유용하다. 이제, 동정한 대부분의 호열성 중합효소는 65∼75℃에서는 최적의 활성을 갖고 50∼60℃에서는 현저히 감소된 활성을 갖는다. 그러나 호열성 제한 엔도누클레아제의 열안정성이 일반적으로 65℃ 미만으로 제한되기 때문에, 저온에서 최적의 활성을 지닌 호열성 중합효소(예를들면 비에스티 및 비씨에이)가 반응물 내의 호열성 제한 엔도누클레아제와 보다 적합성이 높으므로 바람직하다.
제한 엔도누클레아제는 인지/절단부위에서 충분히 빨리 해리되어 타겟 서열이 효율적으로 증폭되도록 함으로써 중합효소가 닉에 적절히 결합하여 신장을 개시시킬 수 있도록 해야 한다. 적당한 제한 엔도누클레아제는 또한 제한 엔도누클레아제(니킹)용의 이본쇄이고 반수식된 인지/절단부위의 프라이머 사슬만을 절단시켜야만 한다. 제한효소는 일반적으로 이본쇄 분해물을 생성시키기 때문에, 절단부위의 이중 나선내 두개의 사슬 중 하나의 절단은 선택적으로 억제되어야 한다. 이는 통상 합성시 DNA의 하나의 사슬 중에 누클레오타이드 유사물(analog, 예를 들면, 데옥시누클레오사이드 포스포로티오에이트)을 도입시켜 수식된 사슬이 더 이상 절단되지 않도록 함으로써 달성된다. 때때로, 누클레오타이드 유사물을 도입시키면 더 이상 절단 가능하지 않은 비수식된 사슬이 얻어질 수 있을 것이다. 비수식된 사슬이 절단으로부터 보호되는 경우, 누클레오타이드 유사물을 프라이머 합성 중에 첨합시켜 니킹이 일어나게 하여 누클레오타이드 유사물을 증폭 반응물에 가해야 할 필요성과 중합효소가 상기 누클레오타이드 유사물을 첨합시킬 수 있어야 하는 요구를 없애준다.
그러나 누클레오타이드 유사물 치환은 모든 제한 엔도누클레아제로부터 프라이머 사슬을 보호하지는 않는다. 따라서, 많은 유용한 호열성 제한 엔도누클레아제 중에서 적당한 효소를(그러한 효소가 존재하는 경우) 동정하기 위하여, 제한 엔도누클레아제의 니킹 특색을 평가하는 수단이 필요하였다. 따라서, 이본쇄 제한 엔도누클레아제 인지/절단부위 중 하나의 사슬에 첨합된 수식 데옥시누클레오타이드가 엔도누클레아제에 의한 절단으로부터 두개의 사슬 중 하나를 보호하는 능력에 기초하여, 목적하는 특성을 지닌 호열성 제한 엔도누클레아제를 동정하기 위한 스크리닝 시스템이 고안되었다. 이는 유사물-유도 니킹 검정방법 또는 사슬 보호 검정방법으로 불리워진다.
검정시, 일본쇄 주형 및 상보적 프라이머를 합성한다. 이 주형 및 프라이머를 라벨, 바람직하게는 방사성 물질로 라벨한 다음 프라이머와 주형을 하이브리다이즈시키고 수식된 dNTP를 프라이머의 신장에 첨합시키고, 반수식된 제한 엔도누클레아제 인지/절단 부위를 함유하는 전부 이본쇄인 분자를 생성시킨다. 이 생성물은 절단에 적당한 조건하에서 제한 엔도누클레아제로 처리시킨다. 변성 조건하에서의 이 반응생성물의 전기 영동적 분석법은 인지/절단부위의 니킹, 절단여부를 생성된 단편의 크기에 의해 측정하는데 이용된다. 전기 영동법상의 단편 크기는 또한 인지/절단부위의 두개의 사슬의 어느것이 절단으로부터 보호되었는지(즉, 수식되었는지 아닌지)를 측정하는데 이용된다.
호열성 SDA는 목적하는 열안정성 중합효소 및 열안정성 제한 엔도누클레아제를 치환시키는 Walker 등(1992. PNAS 및 Nuc. Acids Res., 상기 참조)이 기술한 종래 SDA로서 실질적으로 수행된다. 물론, 반응 온도는 치환된 효소에 적당한 더 높은 온도로 조정되고, HincII 제한 엔도누클레아제 인지/절단 부위는 선택된 열안정성 엔도누클레아제에 적당한 제한 엔도누클레아제 인지/절단부위로 치환될 것이다. 또한 Walker 등과는 대조적으로, 개업자는 변성온도에 충분히 안정하다면 초기 변성 단계전에 반응 혼합물내에 상기 효소를 포함시킬 수 있을 것이다.
호열성 SDA용으로 바람직한 제한 엔도누클레아제는 비에스알I(BsrI), 비에스티엔I(BstNI), 비에스엠에이I(BsmAI), 비에스엘I(BslI) 및 비에스오비I(BstOI)[뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs)사 제품] 및 비에스티오Ⅰ(BsoBI)[프로메가(Promega)]이다. 바람직한 호열성 중합효소는 비씨에이(BCa) 및 비에스티(Bst)이다. 고증폭인자(예를들면 108-109)를 가능하게 하는 최적화한 SDA 시스템을 발전시키기 위하여, 완충계를 평가하고 최적화하는 것을 추천한다. 이는 또한 호열성 SDA용의 새로운 제한 효소/중합효소 쌍을 평가할 때도 적당하다. 제조자는 통상 10mM MgCl2를 함유한 트리스 완충용액인, 제한 엔도누클레아제용으로 추천된 완충용액을 제공한다. 이는 또한 50∼150mM의 NaCl 및/또는 KCl을 함유할 것이다. 이 조건은 호열성 SDA에 필수적으로 최적인 것은 아니지만 대신 추천된 온도에서 핵산의 이본쇄 절단을 100% 제공한다.
SDA에서, 제한 엔도누클레아제는 이본쇄 부위를 인지하나, 유도 합성된 dNTP의 치환에 의하여, 두개의 사슬을 절단시키지 않고 프라이머 사슬을 니킹시키는 엔도누클레아제를 도입시킨다. 따라서, 제조업자들이 추천하는 완충용액은 이러한 수식된 제한 엔도누클레아제의 거동 발현에 최적인 완충용액이 아닐지도 모른다. 게다가, 제한 엔도누클레아제는 SDA에서 중합효소와 협조하여 작용해야만 한다. SDA 반응이 일어날 수 있게 하기 위해서는, 완충용액 시스템은 제한효소에 의한 니킹 및 중합효소에 의한 신장/치환 모두를 지지하여야만 한다.
새로운 SDA 제한 엔도누클레아제와 함께 사용할 완충용액 시스템을 평가할 경우, 일반적으로 제한효소용으로 추천된 완충용액을 평가함으로써 완충용액 최적화에 착수하는 것이 유용하다. 소거법(subtractive method)을 사용하여 어떠한 성분이 엔도누클레아제의 니킹작용에 필수적인지를 측정할 수 있다. 상기 정보와 SDA에서 중합효소의 활성을 개선시킨다고 알려진 완충용액 조건을 결합시키면, 표준 완충용액 시스템을 개발할 수 있다. 전기에서 논의한 바와 같이, 완충용액 최적화의 중요한 관점은 성분들의 상호작용 특성이다. 이러한 이유로, 한 성분은 일정하게 유지시키고 다른 것들은 한번에 하나씩 변화시키는 것보다, 다양한 농도의 다른 성분들을 테스트하는 것이 바람직하다. 예를 들면, KPO4의 농도를 일정하게 유지시키면서 MgCl2농도를 시험하면, 그 KPO4의 농도에서 최적인 MgCl2의 농도를 얻게 된다. 그러나 MgCl2및 KPO4농도들의 여러 조합들을 시험하는 경우, 최적의 결과를 부여하는 MgCl2및 KPO4의 조합된 농도가 구해진다. 따라서 각각의 완충용액 성분의 협조효과에 의한 최적의 증폭을 얻기 위해서는 완충계의 각 성분을 동시에 검사하여야 한다. 이 방법은 Dr. Perry Haaland의 Experimental Design in Biotechnology(Marcell Dekker, NY, 1989)에 상세히 기술되어 있다.
통상의 SDA에 최적인 완충용액을 구하는 방법은 호열성 SDA에 유용하다. 통상의 SDA용 완충용액(HincII/엑소-클레노우를 사용한)은 다음과 같이 발전했다 ; SDA는 각각 제한 엔도누클레아제 용으로 시판되는 완충용액들을 사용하여 수행되었다. 이러한 완충용액들은 20∼50mM의 트리스(pH 7.4∼8), 50∼150mM의 NaCl 및/또는 KCl(또는 아세테이트염) 및 5∼12mM의 MgCl2를 함유하였다. 제조업자들은 이본쇄 절단을 위해, HinII와 함께 사용할 수 있는 리액트 4(REACT 4)(20mM의 트리스(pH 7, 4, 5), 5mM의 MgCl2및 50mM의 KCl)를 추천하였지만 HincII에 대하여 SDA를 가장 우수하게 지지시켜주는 완충용액은 리액트 6(REACT 6)[집코-비알엘(GIBCO-BRL)사 제품]였다. MgCl2및 K+가 가장 중요한 완충용액 성분인지를 측정하는 추가 실험을 수행하였다. 따라서 트리스 대신 K+공급원으로서 KPO4완충용액으로 치환하였다. 이 완충용액은 제한 엔도누클레아제 활성 및 중합효소 활성 둘다를 지지하여 통상의 SDA 반응에서 높은 레벨의 증폭을 얻었다. 제한 엔도누클레아제와 함께 KPO4완충용액을 사용하는 것은 전형적인 것은 아니지만 완충용액 검정시 SDA에서의 제한 엔도누클레아제/중합효소 조합에 적합한 것으로 입증되었다. 더 일반적인 완충용액(즉, 트리스)을 유사한 방식으로 시험하였지만, 더이상 증폭을 개선시키지는 않는다.
호열성 SDA용의 특정의 제한 엔도누클레아제/중합효소 조합에 적당한 완충용액을 판정하기 위해, 유사한 최적화 방법을 적용할 수 있고, 이에는 발명적 수완을 행사하지 않은 일상적 시험이 필요함에 불과하다. 많은 경우, 일반적으로 통상의 SDA에 사용되는 KPO4/MgCl2완충용액은, 상기한 성분들의 농도를 상기에서 기술한 바와 같게 하거나 또는 얼마쯤은 일상적인 변경을 가하면(실시예 5 참조), 호열성 SDA에 적당하다.
[실시예 1]
중합효소의 신장 검정 스크리닝
타겟으로서 플라스미드 pBR322를 사용하여, 플라스미드상에서 서로 인접하여 어니일링된 두개의 프라이머를 합성하였다. 프라이머 PBR1은 상류 프라이머였으며 pBR322 내 3661-3690 염기에 대응하였다. 프라이머 PBR2는 하류의 PBR1에서 하이브리다이즈되었고 3691-3720 염기에 대응하였다. 이러한 30-mer 올리고누클레오타이드 Applied Biosystems DNA 합성장치, Model 380을 사용하여 합성하였고 변성 아크릴아미드 겔로부터 전기 용출법에 의해 정제시켰다. 이 프라이머들을 10μL 반응용기내 37℃에서 30분동안 10μM 프라이머, 50mM Tris, pH 7.5, 10mM MgCl2, 70μCi 32P-ATP 및 10 단위 폴리누클레오타이드키나제를 사용한 키나제 반응에서 따로따로 라벨하였다. 라벨된 프라이머들을 최종 농도 0.2μM(각 프라이머)에서 200ng의 PstI/HincII 소화된(digest) pBR322와 결합시켰다. 타겟 pBR322 DNA를 25mM KPO4pH 7.4-8mM MgCl2및 0.2-1mM dNTPs를 함유하는 완충용액 98℃에서 3분동안 변성시켰다. 그리고 나서 이 혼합물을 2분동안 선택 반응온도(50∼70℃)까지 냉각시켰다. 중합효소 1단위를 첨가시키고 반응을 10분동안 진행시켰다. 같은 체적의 95% 포름아미드/50mM EDTA/ 브로모페놀블루 다이(blue dye)를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 25μL의 반응물을 6% 변성 겔상에서 전기 영동시키고 겔을 방상선 사진 필름(Kodak, XAR5)에 노출시켰다.
상기 반응 조건을 50℃, 60℃ 및 70℃에서 중합효소의 활성을 테스트하기 위한 검정에 사용하였다. 각 경우에, 중합효소는 통상의 데옥시누클레오타이드(dNTPs)의 존재하 또는 통상의 dNTPS및 하나의 티오-치환된 데옥시누클레오타이드(α티오 dCTP, dCTPαS mix)의 존재하에 테스트하였다.
하류의, 신규 합성된 사슬을 치환시키면서 프라이머를 신장시킬 수 있었던 중합효소는 방사선 사진상에서 두 개의 밴드를 형성하였다.
보다 큰 밴드는 소화된 타겟 플라스미드 HincII 부위에 대하여 신장된 PBR1의 신장 생성물이고, 길이가 244인 누클레오타이드이다. 보다 작은 밴드는 HincII 부위에 대하여 신장된 PBR2의 신장 생성물이고 길이기 214인 누클레오타이드이다. 하나의 신장 생성물만이 생성되었을 때에는 방사선 사진상에 하나의 밴드만이 검출되었다. 전기 하나의 밴드가 둘 중 더 작은 쪽인 경우 하류의 프라이머(PBR2)만이 신장되었다. 이러한 중합효소 SDA에 적당하지 않은데, 이는 닉에서의 초기 신장에 의해 상류 프라이머를 신장시킬 수 없거나, 또는 닉으로부터 하류의 사슬을 치환할 수 없기 때문이다. 더 큰 밴드만이 검출되었을 때는 중합은 닉에서 시작되었으나 중합효소는 5'-3' 엑소누클레아제 활성을 또한 보였다.
호열성 SDA에 유용한 신장 검정에서 동정된 중합효소에 대한 활성 프로파일을 다음 표에 요약하였다.
Bst 중합효소(BioRad) 및 Bca 중합효소(또한 Ladderman 중합효소로서 알려진 Panvera, Takara)는 검정해보니 모두 신장 생성물을 생성하였다. 이 실시예에서, 테스트된 중합효소 중에서 이들 둘만이 50∼70℃ 전온도 영역에 걸쳐 모든 요구 특성(닉에서의 개시, 티오-치환된 누클레오타이드의 사슬 치환 및 첨합)을 보였다. 그러므로 Bca 및 Bst 중합효소는 정상 완충조건하 호열성 SDA 반응에서 50∼70℃의 전 영역에 걸쳐 유용하다. 중합효소의 제2그룹(Exo-Vent, exo-Deep Vent 및 exo-Pfu)은 상기 온도영역에 걸쳐 PBR2 신장 생성물을 생성하였으나 70℃ 이하에서 유의량의 PBR1 신장 생성물을 생성하지 못하였다. 이러한 세 개의 중합효소를 사용하여, 50℃에서는 244 누클레오타이드 PBR1 신장 생성물 중 어떤것도 검출하지 못했다. 60℃에서 단지 소량만을 검출할 수 있었다. 그러나 70℃에서 두 신장 생성물 각각은 상당한 양으로 생성되었다. 이러한 결과는 닉에서의 치환활성 및/또는 개시가 Exo-Vent, exo-Deep Vent 및 exo-Pfu에 대한 온도 의존 활성임을 의미한다. 그러나 이들은 티오-치환된 데옥시누클레오타이드를 첩합할 수 있었고 SDA에 대해 요구되는 다른 모든 활성을 가졌다.이 제2그룹에서 중합효소는 약 70℃ 이상에서 기능적인 제한 엔도누클레아제, 바람직하게는 약 70℃에서 최적온도를 갖는 제한 엔도누클레아제와의 컨주게이션시 호열성 SDA에 유용하다. 이와는 다르게, 약 15% 글리세롤 또는 약 15% DMSO과 같은 용매를 첨가하여 이들의 치환활성을 더 낮은 온도에서 높일 수 있다.
Squencing Grade Taq, Tth, Tfl, REPLINASE 및 REPLITHERM 중합효소를 검정하여 테스트하였을 때 단지 PBR1 신장 생성물만이 나타났다. 이러한 결과는 이들의 중합효소가 닉에서 중합을 개시할 수 있으나 5'-3' 엑소누클레아제 활성을 가짐을 의미한다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여 5'-3' 엑소누클레아제 활성을 선택적으로 제거하면 이러한 중합효소 그룹도 또한 호열성 SDA에서 유용하다.
[실시예 2]
제한 엔도누클레아제의 스크리닝용 사슬 보호 검정
제한 엔도누클레아제에 대한 반수식된 인지/절단부위를 함유하는 이본쇄 올리고누클레오타이드를 제조하였다. 먼저, 길이 16인 누클레오타이드인 공통 프라이머(서열번호 : 1 또는 서열번호 : 2) 및 길이 44∼57의 누클레오타이드의 다양한 주형쇄를 합성하여 이본쇄 올리고누클레아타이드를 제조하였다. 각 주형쇄는 직렬로(in tandem) 다수 인지/절단부위를 함유하고, 보통은 각 부위 사이에 충전 서열(filler sequence)을 갖는다. 절단 부위는, 각 부위의 니킹 또는 절단 결과, 겔상에서 크기로 구별할 수 있는 단편들이 생길 수 있도록 올리고 누클레오타이드상에 위치하였다. 엔도누클레아제가 축퇴된(degenerate) 인지/절단부위를 보이는 경우에 이들 중 몇 개를 테스트하였다. 합성된 주형은 다음과 같았다.
서열번호 : 1은 서열번호 : 5∼10을 프라임하고 서열번호 : 2는 서열번호 : 2∼4를 프라임한다. 이 주형은 다음의 제한 엔도누클레아제에 대한 인지/절단부위를 함유한다 : AccI, AspI, BsaI, BsaBI, BsiYI, BslI, BsmI (두개의 축퇴부위), BsrBRI, BsrDI (두개의 축퇴부위), Bst71I, BstNI(두개의 축퇴부위), BstOI, BstXI, DpnI, HaeII, ManI, MboII, MvaI, MwoI, SfiI 및 Tth111I.
프라이머 및 주형을 합성한 후 겔 전기영동법으로 정제시켰고 표준 방법을 사용하여 겔 슬라이스로부터 전기 용출시켰다. 그후 나중의 방사선 사진 검출을 위하여 T4 폴리누클레오타이드키나제 및 γ-[32P]-아데노신 트리포스페이트를 사용하여 이들을 5' 말단-라벨링시켰다. 전형적인 키나제 반응은 2μL의 10×키나제 완충액(New England Biolabs), 10μL의 γ-[32P]-ATP (3000 퀴리/mmol, NEN-DuPont), 최종농도 1μm인 프라이머 또는 주형, 20 단위 T4 폴리누클레오타이드 키나제(New England BioLabs), 및 총반응 용적을 20μL로 만들어주는 물을 함유하였다. 37℃에서 30분동안 키나제 반응을 행한 후 끓는 물내에서 5분동안 가열시켜 끝마쳤다. 그후 프라이머를 각 주형에 하이브리다이즈시키고 중합효소 및 다양한 포스포로티오에이트-치환된 누클레오타이드를 사용하여 신장시켜 인지/절단부위가 반수식된 이본쇄 올리고누클레오타이드를 생성하였다. 니킹 활성 효과를 테스트하기 위하여 다양한 실험에서 인지/절단부위의 이본쇄 중 하나 또는 다른 하나에 유도된 dNTPs를 첨합시켰다. 방사성 원소로 식별된 프라이머 및 주형을, 폐쇄된 0.5mL 폴리프로필렌 마이크로퓨즈 튜브(micorfuge tube)내에서 각각 2μL, REACT-1 완충액(Life Technologies) 1μL, 및 탈이온화되고 증류된 물 11.5μL를 혼합시켜 어니일링시켰다. 이 혼합물을 3분동안 끓는 수조내에서 가열시킨 후 열원으로부터 수조를 제거하여 37℃까지 천천히 냉각시켰다. 그후 튜브를 37℃ 인큐베이터로 옮긴 후 최소한 하나의 티오-dNTP 포함한 데옥시누클레오타이드 트리포스페이트(dNTPs) 1μL, 10mM 디티오트레이톨(DTT) 2μL, 및 엑소누클레아제 결핍성 클레노우 중합효소(U.S. Biochemicals) 용액 10unit/μL 0.5μL 의 적절한 혼합물을 첨가하여 하이브리다이즈된 프라이머를 주형상에서 신장시켰다.
신장 반응에서 각 dNTP의 최종 농도는 250μM이었다. 프라이머 신장 반응을 20분동안 진행시킨 후 75℃에서 10분동안 가열시켜 종결시켰다.
신장 후, 제한 엔도누클레아제가 공급자가 추천하는, 제한 엔도누클레아제 활성에 적절한 완충액 내에서 부분 표본(aliquot)을 10배 희석시켰다. 검정시 DNA 분자의 최종 농도는 10nM이었다. 각 반응 혼합물에 적절한 제한 엔도누클레아제 5∼10 단위를 첨가시켜 사슬 보호 검정을 개시하였다. 제한 엔도누클레아제 공급자에 의해 추천된 온도에서 이 반응물을 인큐베이트시켰다. 샘플들을 일정한 간격으로 취하고, 반응을 정지시키기 위하여 등용량의 포름아미드 서열 결정 반응 정지 용액을 첨가하였다. 정지된 샘플들을 모두 수거할 때까지 얼음상에서 저장하였다. 그 후 이 샘플들을 끓는 수조내에서 3분 동안 가열시키고 Tris-borate 완충액(Gibco-BRL)내 8% 폴리아크릴아미드, 7M 우레아 DNA 배열결정용 겔상에 충전(load)시켰다. 일정한 전력 수준의 57W에서 1시간 동안 전기영동을 행하였다. 방사성 동위원소로 표지된 DNA 밴드를 Fuji RX grade X-ray film을 사용하여 방사선 사진술로 시각화하였다.
테스트된 호열성 제한 엔도누클레아제 중, 완전히 또는 거의 완전히 반수식된 인지/절단부위를 니킹한 11종을 이 실험에서 확인하였다. 이들을 다음 표에 열거하였다. 경우에 따라서는, 사슬 보호검정에서 반수식 동안, 제한 엔도누클레아제에 대한 하나의 축퇴된 부위만이 니킹되었다. 다양한 포스포로티오에이트 치환제들의 결과와 함께, 주형내 인지/절단부위의 위치를 누클레오타이드 위치에 의해 나타내었다.
dNTPαS의 첨합에 의해, 완전히 또는 부분적으로 완전히 유도 사슬을 보호하는 경우(즉, 비수식 사슬이 니킹됨), 누클레오타이드 치환을 열거하고 있다. 없음은 닉이 생긴 티오누클레오타이드 치환체가 없었음을 가리킨다.
5번 서열내에 10-15 위치에서 BsmI에 대한 인지부위가 비수식된 사슬의 보호를 나타내는 것, 즉 수식된 사슬이 니킹된 것에 주목하는 것은 흥미롭다. 이는 호열성 SDA내 이러한 인지부위를 통상의 비수식된 프라이머 대신 티오-유도된 프라이머와 조합시켜 호열성 SDA에 이용할 수 있음을 시사한다. 이러한 시스템에서, 니킹 및 치환은 유도 dNTPs의 부존재 하에서 진행되고, 중합효소가 유도 dNTPs를 첨합시킬 수 있어여할 필요성이 제거된다.
후보로 된 이러한 제한 엔도누클레아제를, 55∼65℃ 범위 내에서의 열적 안정성에 대해 추가로 테스트하였다. AccI만이 이 온도 범위내에서 불만족스러운 안정성을 보였고 이본쇄 DNA 및 BSA와 같은 통상의 안정화제를 첨가시켜 안정화시킬 수 없었다. 남은 9개의 제한 엔도누클레아제를 실시예 3에서와 같이 직선적 SDA 반응에서 테스트하였다. MwoI를 제외하고는 모두 증폭 생성물을 생성하였다. 이러한 효소는 그의 니킹된 인지/절단부위로부터 너무 느리게 해리되거나, 또는 1회째의 신장 단계에서 티올화된 누클레오타이드를 인지/절단부위의 양 사슬에 첨합시킨 후에 이 부위를 다시 니킹(즉, 후속의 증폭 순환을 개시) 시킬 수 없을 가능성이 있다. 택일적으로, MwoI니킹 활성은 완충 시스템과 비적합성이어서, 상기 기술한 바와 같이 최적화할 수도 있고, 이에 의하여 MwoI또한 호열성 SDA에 유용하게 만들 수도 있다.
BsoBI, BsrI, BstNI, BsmAI 및 BslI를 사용하고 TTP를 dUTP로 치환하여, 실시예 3에서와 같은 직선적 SDA를 행하였다.이는 이러한 제한 누클레아제와 UDG 탈혼입법과의 적합성을 확인하기 위한 것이었다. BsoBI, BstNI 및 BsmAI는 이들의 인지/절단부위에서 dU에 의해 부정적인 영향받지 않았으나, BsrI 및 BslI에 대해서는 이러한 조건하에서 직선적 SDA의 효율이 감소되었다. 왜냐하면 Bst 및 Bca 중합효소는 dUTP 치환에 의해 영향을 받지 않는 것으로 보이고, BsrI 및 BslI에 대한 니킹 활성이 감소는 아마도 dU를 효소의 인지/절단부위로 첨합시키기 때문일 것이다. BslI에 대한 절단부위가 축퇴된 서열내에서 발생하기 때문에 이 부위를 변경하여 이 효소의 니킹 활성에 대한 dU의 효과를 극복할 수 있을 것으로 생각된다.
사슬 보호 검정의 초기 스크리닝 조건하에서 부분적인 또는 낮은 활성을 가진 몇 개의 호열성 제한 엔도누클레아제가 동정되었다(예를들어, Tth111I, BsiYI 및 BsoFI). 이러한 엔도누클레아제의 니킹 활성은 반응조건(예를들어, 완충액 최적화 또는 반응온도 조절)을 최적화시켜 최적화시킬 수 있고 이들을 호열성 SDA에 대해 보다 유용하도록 할 수 있다. 게다가, 제한 엔도누클레아제 인지/절단부위 서열이 측면을 접한 서열이 엔도누클레아제 활성에 영향을 미칠 수 있음이 알려져 있기 때문에, 주형에 측면을 접한 서열을 변경시키는 것에 의해서도, 부분적으로만 니킹했던 엔도누클레아제 활성을 개선할 수 있거나 이 실시예의 조건하에서 니킹하지 못했던 엔도누클레아제의 니킹 활성을 향상시킬 수 있다.
[실시예 3]
직선적 호열성 SDA
중합효소 Bst 및 제한 누클레아제 BsrI를 60℃에서 행한 직선적 SDA 반응에서 테스트하였다. 타겟 서열의 성공적인 증폭은 중합효소 및 제한 엔도누클레아제가 호열성 SDA 반응 조건하에서 기능하고 있을 뿐아니라, SDA 반복(turnover)이 일어나고 있음(즉, 제한 엔도누클레아제가 반수식된 인지/절단 부위를 니킹시킨 후 해리하고, 이에 의해 중합의 개시가 가능하게 되고, 중합에 연이은 사이클의 반복)을 의미한다.
다음의 누클레오타이드 서열을 갖는 두개의 DNA를 합성하였다.
(서열 번호 : 11)
(서열 번호 : 12)
이러한 올리고머들은 일본쇄 5'말단을 밀어내면서 21번 염기 오버랩으로 서로서로 하이브리다이즈된다. BsrI 인지/절단부위는 서열번호 11에서 밑줄 그어진 이탤릭체로 표시하였다.
올리고머를 100℃에서 3시간동안 인큐베이팅시키고 60℃까지 느리게 냉각시켜 어니일링시켰다. 이후 Bst 중합효소, 세개의 통상의 데옥시누클레오타이드(dCTP, dTTP 및 dGTP, 이중 하나는 α-32P라벨을 보유함) 및 2'-데옥시아데노신 5'-0-(1-티오트리포스페이트)(dATPαS)를 사용하여 이들을 신장시켜, 완전한 이본쇄 조각을 형성하였다. 이 이중나선은 길이가 92인 누클레오타이드였다. 이후 BsrI 엔도누클레아제를 첨가시켜 증폭 반응을 개시하였다(시간=0).
BsrI는, 상보적 사슬이 수식된 아데노신을 함유할 때, 두개의 C' 사이에서 인지/절단 부위의 비수식된 사슬을 니킹시킨다. 이후, 중합효소는 닉에서 개시하여, 5'-3' 방향으로 중합을 행하고, 길이 70인 누클레오타이드 일본쇄 올리고머를 치환한다. 제1회 사이클의 중합후 엔도누클레아제 인지/절단부위는 재생성되지만, 미리 수식되지 않은 인지/절단부위의 사슬은 닉에 대하여 3' 측에서 dATPαS에 의해 부분적으로 치환된다. 그러나 이는 SDA를 방해하지 않는다. 니킹 및 중합의 반복 사이클에 의해, 반응 초기에 존재하는 이중나선으로부터 70 누클레오타이드 신상 생성물의 다수의 카피가 생성된다.
SDA 반응은, 25mM KiPO4pH 7.6 ; 6mM MgCl2 ; 50mM KCl, 0.5mM dCTP, TTP, dGTP 및 dATPαS ); 50μCi[α-32P]dCTP (3000/Ci/mmol) ; 50nM 각 올리고머 ; 50단위 BsrI 엔도누클레아제 및 2단위 Bst 중합효소를 포함하는 완충액 20μL 중에서 60℃에서 실시되었다.
5, 10 및 20분 후에 반응물로부터 부분표본(5μL)을 취하였다.
라벨된 생성물을 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시켜 분리시키고 방사선 사진술로 시각화하였다. 제1계열의 SDA 반응은 완전한 상기 시약의 리스트를 함유하였다. 제2계열의 SDA 반응에서는 BsrI가 배제되었다. 제3계열의 반응에서는 이중나선 형성 후, 제한 엔도누클레아제의 첨가전에, Bst 중합효소를 가열(100℃, 5분)시켜 비활성시켰다.
예상했던 70 누클레오타이드 신장 생성물은, 제1반응 계열에서, 제1시점(5분) 및 이후에 검출하였다. 길이 92 누클레오타이드의 완전한 상보적 사슬에 대응하는 밴드도 또한 발견할 수 있었다. BsrI의 니킹 활성없이는 70 누클레오타이드 신장 생성물을 생성할 수 없기 때문에, 제2계열의 반응은 단지 92 누클레오타이드 반응 생성물만을 보였다. 제3계열의 반응은 단지 이중나선의 니킹만을 보였는데, 이는 길이 70 누클레오타이드의 희미한 밴드 및 길이 92 누클레오타이드의 희미한 밴드에 의해 입증되는데, 양자 모두 반응시 최초에 존재하는 증폭되지 않은 이중나선으로부터 생성되는 것이다. 본 실험에서 SDA 사이클의 반복 속도는 필름의 밀도로부터 약 1min-1인 것으로 추정되었다.
[실시예 4]
지수적 호열성 SDA
BsoBI(New England BioLabs사가 Bacilus 종으로부터 분리) 및 Bca 중합효소(PanVera Corporation, Bacillus Caldotenas 로부터 클로닝됨)를 사용하여 호열성 SDA에 의해 타겟서열의 지수적 증폭을 증명하였다. 이본쇄 타겟 서열(서열번호 : 13)의 2개의 일본쇄로서 작용하는 상보적 올리고머를 합성하였다. 반응 혼합물 각각에 다양한 농도의 이러한 타겟 서열을 함유하는 5μL를 첨가하였다. 특정의 반응물에는 타겟 서열을 가하지 않았다. 유사하게 증폭 프라이머를 합성하였다. 프라이머 XBsoB1-1 (서열번호 : 14)은 BsoBI 제한 엔도누클레아제 인지/절단부위를 일본쇄 형태에서 함유하였고, XBsoB1-2 (서열번호 : 15)도 유사하다.
프라이머 XBsoB1-1은 타겟 서열 중 하나의 사슬에 하이브리다이즈되어 돌출된 일본쇄 5 말단을 가진 17 염기쌍의 오버랩을 형성한다.
휴식 중인(recessed) 이본쇄 3 말단이 중합효소에 의하여 신장하는 것에 의하여, 이본쇄 상의 반수식된 BsoBI 인지/절단부위를 함유하는 길이 103 누클레오타이드의 완전한 이본쇄 상의 조각이 얻어졌다. 유사하게, 프라이머 XBsoB1-2는 타겟 서열 중 마주보는 사슬에 하이브리다이즈하여, 돌출된 일본쇄 5' 말단을 가진 17 염기쌍 이본쇄 오버랩을 형성하였다. 이 구조는 또한 중합효소에 의해 채워져서, 이본쇄 상의 반수식된 BsoBI 인지/절단부위를 함유하는 이본쇄 103-mer를 생성한다.
반응 혼합물에서 Bca 및 BsoBI를 제외한 것을 3분동안 가열시켜 타겟 DNA를 변성시킨 후 반응온도 60까지 냉각시켰다. 3분동안 평형화시킨 후, 4단위 Bca 중합효소 및 16단위 BsoBI를 총용적 5μL내에 첨가하였다. 반응 혼합물(최종 용적 50μL)내 반응물의 최종 농도는 25mM KiPO4pH 7.6 ; 1.375mM 각 dCTPαS, dATP, dGTP 및 dTTP ; 100μg/ml 아세틸화된 소 혈청 알부민 ; 6.5mM MgCl2; 0.05μM XBsOB1-1 ; 0.05μM XBsoB1-2 ; 16단위 BsoBI, 4단위 Bca, +/- 타겟 서열이었다. 증폭 반응을 1시간동안 진행시킨 후 5분동안 끓는 수조내에 튜브를 놓아두어 중단시켰다.
증폭 생성물을 다음과 같이 검출하였다. 각 반응물에서 10μL 부분표본을 취하고,32P- 라벨된 프라이머(서열번호 : 16)을 첨가하였다. 이 프라이머를, 존재하는 특정의 증폭 생성물에 의해 하이브리다이즈시킨후 Walker 등 1992. Nuc. Acids Res., supra에 의해 기술된 바와 같이 중합효소를 첨가시켜 검출가능한 길이까지 신장시켰다.
10μL의 변성용 충전 용액을 상기 부분표본에 가한 후 이것을 가열시켰다. 검정을 위해 10μL를 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시켰다.
이 실험에서 검출할 수 있는 올리고누클레오타이드의 추정길이는 1) 58 누클레오타이드 ; 니킹되고, 치환된 증폭 생성물상에서 프라이머 신장에 의해 생성되는 것, 및 2) 18 누클레오타이드 ; 완전한 전(full) 길이 타겟상에서의 프라이머 신장에 의해 생성된 것이다. 이 방법은 충분히 감도가 높아서 반응 조건이 최적화되지 않았을지라도 150 정도의 약간의 분자가 첨가된 경우에 증폭 생성물을 검출하였다.
[실시예 5]
통상의 SDA와 호열성 SDA의 비교
제한 엔도누클레아제로서 BsoBI를 사용한 호열성 직선적 SDA를, HincII를 사용한 통상의 직선적 SDA와 비교하였다.
HincII(반응 조건A) 45mM KiPO4, pH 7.6 10% DMSO 0.25mM each dATPαS, dCTP, dGTP, dTTP 100μg/mL 아세틸화된 소혈청 알부민 6mM MgCl250nM 프라이머/타겟 착물(서열번호 : 17 및 서열번호 : 18) 150 units HincII 10 USB 단위 엑소-클레노우 중합효소 0.01 mCi α-32P-dCTP
BsoBI (반응 조건B) 24mM KiPO4, pH 8.3 0.25mM each dATPαS, dCTP, dGTP, dTTP 100μg/mL 아세틸화된 소 혈청 알부민 15mM MgCl250nM 프라이머/타겟 착물(서열번호 : 15 및 서열번호 : 13 상보적 사슬) 16 units BsoBI 4 units Bca 중합효소 0.01 mCi α-32P-dCTP
BsoBI (반응 조건C) 25mM KiPO4, pH 8.3 0.25mM each dATPαS, dCTP, dGTP, dTTP 100μg/mL 아세틸화된 소 혈청 알부민 6mM MgCl2
50nM 프라이머/타겟 착물(서열번호 : 15 및 서열번호 : 13 상보적 사슬) 16 units BsoBI 4 units Bca 중합효소 0.01 mCi α-32P-dCTP
반응 혼합물(효소제외)을 3분동안 가열시켜 타겟 DNA를 변성시키고 증폭을 위한 목적 온도(HincⅡ에 대하여 40℃ 및 BsoBI에 대하여 60℃)까지 냉각시켜 프라이머를 어니일링시켰다. 3분동안 평형화한 후, 2μL의 중합효소를 첨가시키고 신장반응을 20분동안 진행시켜 HincII 시스템에 대하여는 길이 85 누클레오타이드 및 BsoBI 시스템에 대하여는 길이 103 누클레오타이드의 완전 이본쇄 타겟을 생성하였다. 그후 신장 반응의 대조용으로, 3.5μL의 부분표본을 5μL의 정지용액에 취하였다. 그후 적절한 제한 엔도누클레아제를 첨가시켰다(2μL). HincII에 대하여는, 시점을 5, 20 및 60분으로 택하였다.
BsoBI에 대하여는, 시점을 1, 3 및 6분으로 택하였다. 각 시점에 대한 부분표본을 직접 5μL의 정지용액에 첨가하였다. 그후 샘플들을 2분동안 끓여서 가열시키고 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서의 전기영동을 위해 5μL를 충전하였다. 이 겔을 방사선 사진술로 검정하였다.
HincII에 의한 통상의 SDA 반응의 에상 반응 생성물은 전(全) 길이의 완전 타겟 분자(길이 85 누클레오타이드) 및 니킹되고 치환된 길이 60 누클레오타이드의 증폭 생성물이었다. BsoBI 반응의 예상 생성물은 전 길이 타겟(길이 103 누클레오타이드) 및 81-mer 증폭 생성물이었다.
이 생성물 모두를 검출하였다. 그러나 통상의 HincⅡ/엑소-클레노우 시스템 및 BsoBI/Bca 시스템 사이에는 반응속도에 있어 현저한 상위점이 있었다. HincII 반응은 검출가능한 수준의 니킹되고 치환된 증폭 생성물을 생성하기 위해 약 60분을 요하였다. 반면, BsoBI 시스템은 검출가능한 수준의 타겟 서열 증폭을 생성시키기 위해 단지 약 6분을 요하였다. BsoBI 시스템을 위해 테스트된 두 가지 반응 조건 중에서 낮은 농도의 MgCl2를 사용하는 반응 조건 C는 반응 조건 B와 비교하여 개선된 증폭 속도를 보였다.
서열 목록
(1) 일반적인 정보
(ⅰ) 출원인 : 프레이저, 멜린다 에스.
스파고, 캐더린 에이.
월커, 조지 티.
반 클레브, 마크.
라이드, 데이비드 제이.
(ⅱ) 발명의 명칭 : 호열성 효소를 사용한 사슬 검출 증폭방법
(ⅲ) 서열수 : 19
(ⅳ) 해당 주소
(A) 수신인 : 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니, 리차드 제이. 로드릭
(B) 거리 : 1벡톤 드라이브
(C) 시 : 플랭클린 레이크스
(D) 주 : 뉴저지
(E) 국명 : 미합중국
(F) 우편번호 : 07417
(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 형태 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIm Relese #1.0, Version #1.25
(ⅵ) 현재의 출원 데이타
(A) 출원번호 :
(B) 출원날짜 :
(C) 분류 :
(ⅶ) 대리인에 관한 정보
(A) 성명 : 푸기트, 도나 알.
(B) 등록번호 : 32, 135
(C) 관련/일련번호 : p-2961
(2) 1번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 16개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 1번 서열의 열거 :
(3) 2번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 21개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 2번 서열의 열거 :
(4) 3번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 45개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 3번 서열의 열거 :
(5) 4번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 45개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 4번 서열의 열거 :
(6) 5번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 56개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 5번 서열의 열거 :
(7) 6번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 36개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 6번 서열의 열거 :
(8) 7번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 54개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 7번 서열의 열거 :
(9) 8번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 52개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 8번 서열의 열거 :
(10) 9번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 29개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 9번 서열의 열거 :
(11) 10번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 50개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 10번 서열의 열거 :
(12) 11번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 56개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 11번 서열의 열거 :
(13) 12번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 57개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 12번 서열의 열거 :
(14) 13번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 70개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 이본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 13번 서열의 열거 :
(15) 14번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 50개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 14번 서열의 열거 :
(16) 15번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 50개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 15번 서열의 열거 :
(17) 16번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 23개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 16번 서열의 열거 :
(18) 17번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 49개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 17번 서열의 열거 :
(19) 18번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 57개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 18번 서열의 열거 :
(20) 19번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징
(A) 길이 : 55개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 분포상태 : 선형
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 11번 서열의 열거 :
Claims (1)
- a) 타겟서열을 함유하는 일본쇄 핵산 단편(핵산 단편은 5' 말단 및 3' 말단을 가짐)을 제공하는 단계 ; b) SDA을 위한 증폭 프라이머를 상기 단편의 3' 말단에 결합시켜 프라이머 5' 일본쇄 돌출부(overhang)를 형성하고, 해당 증폭프라이머는 타겟 핵산 서열을 절단하지 않는 호열성 제한 엔도누클레아제용 인지/절단부위를 포함하는 단계 ; c) ⅰ) 약 50-70℃에서 활성이고 사슬치환 활성을 가지며 5'-3' 엑소누클레아제 활성은 없는 호열성 DNA 중합효소, ⅱ) 데옥시 누클레오사이드 트리포스페이트, ⅲ) 최소한 하나의 유도합성된 데옥시 누클레오사이드 트리포스페이트, 및 ⅳ) 유도합성된 데옥시누클레오사이드 트리포스페이트가 첨합되어 인지/절단부위가 반수식된 경우 그 부위를 니킹시키며, 50-70℃에서 활성인 호열성 제한 엔도누클레아제의 존재하에 단편 상에서 증폭 프라이머를 신장시키고, 그에 의하여, 타겟 서열에 상보적인 새로 합성된 제1 일본쇄 및 이본쇄 상(狀)의 반수식된 제한 엔도누클레아제 인지/절단부위를 포함하는, 증폭 프라이머의 제1 신장 생성물을 생성시키는 단계 ; d) 제한 엔도누클레아제에 의해 이본쇄 상(狀)의 반수식된 제한 엔도누클레아제 인지/절단부위를 니킹시키는 단계 ; e) 그 닉으로부터에서 DNA 중합효소를 사용하여 신장시키고, 그에 의하여 전기의 새로이 합성된 제1 사슬을 단편으로부터 치환하고, 그 새로이 합성된 제2의 사슬을 포함하는 제2 신장 생성물을 생성시키는 단계, 및 ; f) 니킹, 신장 및 치환 단계를 반복하여 타겟서열을 증폭시키는 단계를 포함하는 타겟 서열 증폭방법.
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