KR20030071854A - 증폭 핵산 및 그의 고정화물 - Google Patents

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KR20030071854A KR10-2003-7009833A KR20037009833A KR20030071854A KR 20030071854 A KR20030071854 A KR 20030071854A KR 20037009833 A KR20037009833 A KR 20037009833A KR 20030071854 A KR20030071854 A KR 20030071854A
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Abstract

올리고뉴클레오티드 프라이머들을 사용하는 핵산 증폭 반응을 통해 대량으로 제공되는 핵산을 고체상에 상기 핵산을 고정화시키기 위한 변현된 데오시리보뉴클레오티드를 포함하는 상태로 작제한 후 고효율로 고체상에 고정화시켜 고품질의 핵산 고정화물을 제공하는 것이다.

Description

증폭 핵산 및 그의 고정화물{Amplified nucleic acids and immobilized products thereof}
핵산이 고정화된 기질(예: DNA 칩)은 유전자 기능 분석 프로젝트를 신속하게 진행시키기 위한 도구로서 개발되어 왔다. 모든 효모 유전자 및 배양된 세포 및 조직내 유전자의 발현을 분석하기 위하여 광범위하게 사용되어 왔다. DNA 칩(또는 DNA 어레이)을 제조하는 공지된 방법은 예를 들면, 싱글-스트랜드 DNA를 칩 고체상의 미리 정해진 영역에서 합성하는 방법, 및 미리 제조된 싱글-스트랜드 또는 더블-스트랜드 DNA를 칩 고체상의 미리 정해진 영역에 스팟팅(spot)시키는 방법을 포함한다. 전자의 방법에 따라 제조된 DNA 칩은 미국 특허 제 5,445,934,5,744,305, 및 5,700,637호에 기술된 고밀도 올리고뉴크레오티드 어레이에 의해 예시된다. 후자의 방법에 따라 제조된 DNA 칩은 미국 특허 제 5,807,522 호 및 WO 98/18961 호에 기술된 스팟팅(spotting) 어레이에 의해 예시된다. DNA 칩은 이 방법을 사용하여 칩 고체상의 미리 정해진 영역에 DNA를 스팟팅하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 폴리-L-리신-코팅 또는 실란화(silanization)와 같이 특별히 공정화된 슬라이드 글래스와 같은 고체상 기질상에 핀 팁을 사용하여 DNA 단편을물리적으로 스팟팅시킨다. 이러한 경우, DNA 단편은 고체상 기질에 정전기적으로 결합한다. 따라서, 결합 효율은 고체상 기질의 코팅된 상태에 따라 달라질 수 있다. 반면, 고밀도의 고체상 합성을 위한 대용량 기기가 상기 언급된 고밀도 올리고뉴클렐오티드 어레이의 제조를 위해 요구된다. 추가로, 그의 합성 수득율 때문에 이 방법에 따라 장쇄의 뉴틀레오티드 쇄를 합성하는 것은 어렵다.
두개의 제조 방법에서, 대량으로 고정화되는 핵산을 합성하는 것이 필요하다. 올리고뉴클레오티드와 같은 단쇄 DNA를 합성하는 것을 제외한 대부분의 핵산 증폭 방법은 DNA 폴리머라제를 사용하는 효소적 방법에 의해 수행된다. 이러한 방법의 예는 미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202 호 및 제 4,800,159 호에 상세히 기술된 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법이다. 또다른 예는 [Trends in Biotechnology, 10:146-152 (1992)]에 기술된 PCR 및 역전사효소 반응의 병용법인 역전사-PCR (RT-PCR) 방법이다. 상기 언급된 방법의 개발로 DNA 또는 RNA로부터 관심의 대상이 되는 부위를 증폭시킬 수 있었다.
상기 언급된 DNA 합성법은 예를 들면, 3단계로 구성된 반응을 사용하여 수행된다. 상기 3단계는 더블-스트랜드 DNA를 싱글-스트랜드 DNAs로 분해(변성)시키는 단계, 프라이머를 싱글-스트랜드 DNA에 어닐링하는 단계 및 프라이머로부터 상보적인 스트랜드로 합성(신장)시켜 관심의 대상이 되는 DNA 부위를 증폭시키는 단계이다. 다르게는, 3개의 단계중 2개, 즉, 프라이머의 어닐링 단계 및 신장 단계를 동일한 온도에서 수행하는 "셔틀 PCR("the shuttle PCR")("PCR hou saizensen" (Recent advances in PCR methodology), Tanpakushitsu Kakusan Kouso, Bessatsu,(Protein, nucleic acid and Enzyme, Supplement), 41(5):425-428 (1996)이라 불리는 반응을 사용하여 수행된다.
다르게는, 1989년 6월 14일 공개된 EP 320,308에 기술된 리가아제 연쇄반응 (LCR) 방법 또는 [PCR Protocols, Academic press Inc., 1990, pp. 245-252]에 기술된 전사-기초 증폭 시스템(transcription-based amplification system (TAS) 방법을 사용할 수 있다. 상기 언급된 바와 같은 4개의 방법은 다음 증폭 사이클을 위한 싱글-스트랜드 표적 분자를 재생시키기 위하여 고온 및 저온에서의 반응을 수회 반복하는 것을 필요로 한다. 반응이 상기 기술된 바와 같은 온도에 의해 제한되기 때문에 반응 시스템은 불연속적인 상 또는 사이클을 사용하여 수행되어야 한다. 따라서, 상기 방법은 시간에 따라 광범위한 온도 범위를 엄격하게 조절할 수 있는 값비싼 써머 사이클러(thermal cycler)를 사용할 것을 필요로 한다. 또한, 온도를 2 또는 3개의 미리 정해진 것으로 조절하기 위한 시간을 필요로 한다. 시간 손실은 사이클 수에 비례하여 증가하다.
상기 문제점을 해결하기 위하여 등온적으로 수행될 수 있는 핵산 증폭 방법을 개발하였다. 그의 예로 일본 특허 제 2,076,096 호 및 제 2,087,487 호에 기술된 스트랜드 치환 증폭 (SDA) 방법, 자립복제(self-sustained sequence replicaiotn(3SR) 방법, 일본 특허 제 2650159 호에 기재된 핵산서열 기초 증폭(NASBA) 방법, 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification(TMA) 방법, 일본 특허 제 2710159호에 기재된 Qβ레플리카아제(replicase) 방법 및 미국 특허 제 5,824,517 호, WO 99/09211, WO 95/25180 및 WO 99/49081에 기재된 다양한개량 SDA 방법을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드의 등온 효소적 합성 방법은 미국 특허 제 5,916,777호에 기재되어 있다. 프라이머로부터의 신장 및/또는 프라이머로부터의 신장후 싱글-스트랜드 신장 산물(또는 원 표적 서열)로의 프라이머의 어닐링은 올리고뉴클레오티드의 등온적 핵산 증폭 또는 합성 방법 반응에서 일정한 온도에서 인큐베이션된 반응 혼합물에서 동시에 발생한다.
등온 핵산 증폭 방법중 SDA 방법은 DNA가 최종적으로 증폭되는 시스템의 한 예인다. SDA 방법은 DNA 폴리머라제 및 및 제한 엔도뉴틀레아제를 사용하여 더블 스트랜드를 치환하여 샘플중에서 표적 핵산 서열(및 그의 상보적인 스트랜드)를 증폭시키는 방법이다. 이 방법은 증폭을 위해 4개의 프라이머를 필요로 하고, 이중 2개는 제한 엔도뉴틀레아제를 위한 인식 부위를 포함하도록 고안되어야 한다. 이 방법은 대량의 DNA 합성을 위해 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 사용을 요한다. 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 예는 α-위치의 인산 그룹의 산소 원자가 황원자(S)로 치환된 (α-S) 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트이다. 예를 들면 유전자 시험을 위해 반응을 일상적으로 수행하는 경우 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 사용과 관련되는 운영비 문제가 심각하다. 추가로, 예를 들면, 제한 효소 단편 장다형(restriction enzyme fragment length polymorphism(RELP) 분석시 본 방법에서 (α-S) 데옥시리보뉴클레오티드와 같은 변형된 뉴클레오티드를 증폭된 DNA 단편내로 도입하여 제한 효소를 사용하여 증폭된 DNA 단편을 분해하는 것을 생략할 수 있다.
미국 특허 제 5,824,517 호에 기술된 변형된 SDA 방법은 RNA 및 DNA 로 구성되고 필수 요소로서 DNA가 적어도 3' 말단에 위치하는 구조를 갖는 키메라성 프라이머를 사용하는 DNA 증폭 방법이다. WO 99/09211에 기술된 변형된 SDA 방법은 3'-팽창형 말단(protruding)생성하는 제한 효소의 사용을 요한다. WO 95/25180에 기술된 변형된 SDA 방법은 적어도 두쌍의 프라이머 사용을 요한다. WO 99/49081에 기술된 변형된 SDA 방법은 적어도 두쌍의 프라이머 및 적어도 하나의 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 사용을 요한다. 반면, 미국 특허 제 5,916,777 호에 기술된 올리고뉴클레오티드 합성법은 3' 말단에 리보뉴클레오티드를 갖는 프라이머를 사용하여 DNA를 합성하고 프라이머를 사용하여 반응을 종결시키고, 엔도뉴클레아제를 사용하여 프라이머-신장 스트랜드중 프라이머 및 신장된 스트랜드 사이에 닉을 도입하여 그를 분리시키고, 주형을 분해하고 프라이머를 재생시켜(recover) 재사용하는 것을 포함한다. 반응 시스템으로부터 프라이머를 분리시킨 후 그를 다시 주형에 어닐링하여 이 방법에서 프라이머를 재사용하는 것이 요구된다. 추가로, WO 00/28082에 기술된 LAMP 방법은 증폭을 위해 4개의 프라이머를 필요로 하고 이 방법을 사용하여 증폭된 산물은 증폭을 위한 표적 부위가 반복되는 다양한 크기를 갖는 DNAs이다.
상기 기술된 바와 같이, 통상의 핵산 증폭 방법에 따라 대량으로 고정된 핵산을 갖는 기질을 위해 사용하기 위한 핵산을 생산하고 공급하는 것은 어려웠다. WO 00/56877에 기술된 ICAN 방법을 사용하여 대량으로 핵산을 생산할 수 있고 저렴한 비용으로 고정된 핵산을 갖는 물질을 생산할 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 하기와 같은 문제점을 안고 있다. 리보뉴크레오티드는 이 방법에 따라 증폭된 단편중에 포함될 수 있다. 증폭된 단편을 고체상에 고정시키는 경우, 고정된 핵산은 특정 후처리후 분해되고 분리될 수 있다.
발명의 목적
본 발명의 주요 목적은 고체상위에서 핵산이 고정화를 위해 변형된 데옥시리노뉴클레오티드를 포함하도록 하기 위하여 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 핵산 증폭 반응에 의해 대량으로 공급되는 핵산을 제조하고, 고 효율로 고체상위에 핵산을 고정시켜 고품질의 고정된 핵산을 갖는 핵산 고정화물을 수득하는 것이다.
발명의 요약
집중적으로 연구한 결과, 본 발명자들은 핵산을 등온성 및 키메라성 프라이머-개시 증폭법(isothermal and chimeric primer-initiated amplification)(ICAN) 을 사용하여 핵산 고정화물 제조용 핵산 제조 방법을 구축하였다. ICAN 방법은 리보뉴클레오티드가 3'-말단 또는 3'-말단측상에 위치하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 엔도리보뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제의 존재하에서 DNA중 관심의 대상이 되는 부위를 증폭시키는 핵산 증폭 방법이다.
추가로, 본 발명자들은 프라이머를 사용하여 ICAN 방법을 수행하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 고체상위에 증폭 핵산을 고정시키기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하는 ICAN 반응 산물을 수득할 수 있었다. 본 발명자들은 그렇게 수득한 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 ICAN 반응 산물을 고체상위에 고정화시켜 핵산 고정화물을 생산하는 방법을 구축하였다. 따라서, 본 발명은 완성되었다.
본 발명의 제 1면은
(a) 주형으로서의 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고, 여기에서 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 일부는 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트이고/거나 데옥시리보뉴클레오티드는 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드이고;
b) 반응 혼합물을 반응 산물이 생성될 수 있는 충분한 시간동안 인큐베이션시키는 것을 포함하는 핵산 증폭 방법에 의해 수득된, 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 증폭 핵산에 관한 것이다.
제 1면에 따라, 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드는 고체상위의 작용 그룹에 공유결합할 수 있는 작용 그룹을 갖는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 추가로 반응 혼합물은 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상동성인 서열을 갖는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함할 수 있다. 제 1면에 사용하기 위한 핵산 증폭 방법은
(a) 주형으로서의 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고, 여기에서 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고, 데옥시리보뉴클레오티드는 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드이고;
b) 반응 혼합물을 반응 산물이 생성될 수 있는 충분한 시간동안 인큐베이션시키는 것을 포함할 수 있다.
다르게는, 제 1면에 사용하기 위한 핵산 증폭 방법은
(a) 주형으로서의 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고, 여기에서 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트는 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트이고;
b) 반응 혼합물을 반응 산물이 생성될 수 있는 충분한 시간동안 인큐베이션시키는 것을 포함할 수 있다.
리보뉴틀레오티드를 포함하거나 포함하지 않는 증폭 핵산은 바람직하게 제 1면에 따라 제조될 수 있다.
본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 제 1면에서 사용되는 RNase H는 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase H, 써모토가(Thermotoga) 속 세균으로부터의 RNase H, 써무스(Thermus) 속 세균으로부터의 RNase H, 피로코쿠스(Pyrococcus)속 세균으로부터의 RNase H 및 바실러스 (Bacillus) 속 세균으로부터의 RNase H으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 이들 중, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 I형 RNase H, 또는 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 또는 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii)로부터의 II형 RNase H를 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 제 2면은 제 1면에 따라 수득된 증폭 핵산이 고체상위의 미리 정해진 영역에 고정되고 배열된 고정화된 증폭 핵산을 갖는 물질에 관한 것이다. 고정화된 증폭 핵산을 갖는 물질에서 증폭 핵산은 공유 결합에 의해 고체상위의 미리 정해진 영역에 고정될 수 있다.
제 2면의 고정화된 증폭 핵산을 갖는 물질은 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 고체상위에서 고정되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및, 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상동성이고 고체상위에서 고정되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하지 않는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 수득된 제 1면의 증폭 핵산을 고체상위의 미리 정해진 영역에 고정시키고 배열한 후; 고체상위에서 고정되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하지 않는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 신장된 스트랜드만을 분리시켜 수득된 것일 수 있다.
제 2면의 고정화된 증폭 핵산을 갖는 물질은 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 고체상위에서 고정되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및, 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상동성이고 고체상위에서 고정되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하지 않는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 수득된 제 1면의 증폭 핵산을 고체상위의 미리 정해진 영역에 공유 결합에 의해 고정시키고 배열한 후; 고체상위에서 고정되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하지 않는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 신장된 스트랜드만을 분리시켜 수득된 것일 수 있다.
본 발명의 제 3면은 하기 일반식을 갖는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이다:
일반식: 5'-dNa-Nb-dNc-3'
(a: 11이상의 정수; b: 1이상의 정수; c: 0 또는 1이상의 정수; dN: 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드 유사체; 여기에서, dNa중 적어도 하나는 고체상위에서 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드이고; N: 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드(여기에서, dNa중 일부의 dNs는 Ns로 대체될 수 있다).
제 3면에 따라, 일반식에서 c는 0이고 데옥시뉴클레오티드 유사체는 데옥시리보이노신 뉴클레오티드이고 변형된 리보뉴클레오티드는 (α-S) 리보뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 제 4면은 제 1면의 증폭 핵산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 5면은 제 2면의 고정화된 증폭 핵산을 갖는 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 유전자 분석 분야에서 유용한 고감도 DNA 칩에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바, 데옥시리보뉴클레오티드(또한 dN으로서 언급됨)는 당 부위가 D-2-데옥시리보오스로 구성된 뉴클레오티드를 언급한다. 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드는 염기 부위로서 아데닌, 사이토신, 구아닌 또는 티민을 갖는 것들을 포함한다. 추가로, 데옥시리보뉴클레오티드는 또한 7-데아자구아노신과 같이 변형된 염기를 갖는 데옥시리보뉴클레오티드 및 데옥시이노신 뉴클레오티드와 같은 데옥시리보뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 고체상위에서 고정화되기 위해 변형된 데옥시리보뉴클레오티드는 고체상위에서 고정화되기에 적절한 추가의 변형을 갖는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 유사체를 언급한다. 그의 예는 아미노 그룹, 알데히드 그룹 또는 아실 그룹과 같은 작용 그룹을 가하거나 바이오틴을 가하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 데옥시리보뉴클레오티드는 고체상위에서 고정화되기 위해 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 리보뉴클레오티드(또한 N으로서 언급됨)는 당부위가 D-리보오스로 구성된 뉴클레오티드를 언급한다. 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드는 염기 부위로서 아데닌, 사이토신, 구아닌 또는 우라실 갖는 것들을 포함한다. 또한 리보뉴클레오티드는 α-위치의 인산 그룹의 산소 원자가 황원자로 치환된(또한 ( α-S)로서 언급됨) 변형된 리보뉴클레오티드와 같은 변형된 리보뉴클레오티드 또는 다른 유도체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 언급한다. 프라이머는 리보뉴클레오티드 유사체 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드를 갖고, 본 발명의 방법에서 핵산 스트랜드를 신장시키기 위하여 사용할 수 있고, 엔도뉴클레아제로 절단될 수 있고, 스트랜드 치환 반응을 위해 사용될 수 있는 어느 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 3'-말단측은 예를 들면, 프라이머와 같이 핵산의 중심으로부터 3'-말단까지의 부위를 언급한다. 또한, 5'-말단측은 핵산의 중심으로부터 5'-말단까지의 부위를 언급한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 엔도뉴클레아제는 주형으로서의 핵산에 어닐링된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 DNA를 신장시켜 제조된 더블-스트랜드 DNA에 작용하고, 특히 리보뉴클레오티드를 포함하는 프라이머의 부위에서 그것을 절단하는 어느 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, DNA 폴리머라제는 주형으로서 DNA 스트랜드를 사용하여 새롭게 DNA 스트랜드를 합성하는 효소를 언급한다. DNA 폴리머라제는 자연발생적 DNA 폴리머라제 및 상기 언급한 활성을 갖는 변이체 효소를 포함한다. 예를 들면, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라제 및 역전사효소 활성을 갖거나 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 포함한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명할 것이다.
(1) 본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머
본 발명의 방법에서 사용되는 프라이머는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이다. 그러한 프라이머는 또한 변형되지 않는 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 및 변형되지 않는 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다. 추가로, 상기 프라이머는 데옥시리보뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 프라이머는 주형으로서의 핵산의 일부의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 키메라성 올리고뉴크레오티드 프라이머이다. 3'-말단으로부터 DNA 스트랜드를 신장시킬 수 있다. 또한, 리보뉴클레오티드는 키메라성 올리고뉴크레오티드 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치한다. 프라이머는 일반적으로 증폭되는 영역의 상류,즉, 주형으로서의 핵산중에 증폭되는 부위에 대응하는 뉴클레오티드 서열의 3' 부위에 상보적으로 작제된다. 본 명세서에서 사용되는 바, "실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열"은 사용되는 반응 조건하에서 주형으로서의 핵산(DNA)에 어닐링할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
"실질적으로 상동성인 뉴클레오티드 서열"은 주형으로서의 핵산(DNA)에 상동성이어서 사용되는 반응 조건하에서 주형으로서의 핵산(DNA)의 상보적인 스트랜드에 어닐링할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하나 이상의 변형된 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 리보뉴클레오티드는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치할 수 있고 엔도뉴클레아제에 의해 인식되거나 절단되는 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 또는 변형된 리보뉴클레오티드중 어느 하나일 수 있다. 리보뉴클레오티드는 상기 언급된 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및 변형된 리보뉴클레오티드 둘 모두를 포함할 수 있다. 변형되지 않은 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드 또는 그의 혼합물이 프라이머의 기능을 없애지 않는 한 본 발명의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 위해 사용할 수 있다. 변형된 리보뉴클레오티드의 예로는 제한되는 것은 아니지만, 인산 그룹에 결합된 산소원자가 황 원자로 치환된 (α-S) 리보뉴클레오티드, 및 리보오스의 2번-위치에 하이드록시 그룹이 메톡시 그룹으로 치환된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 그러한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 예를 들면, 황화반응제(Glen Research), 또는 2-OMe-RNA-CE 포스포르아미다이트제(Glen Research)를 사용하는 방법에 의해 제조된 (α-S) 리보뉴클레오티드를 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 길이는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게 약 12 뉴클레오티드 내지 약 100 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 약 15뉴클레오티드 내지 약 40뉴클레오티드이다. 키메라성 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 사용되는 반응 조건하에서 주형으로서의 핵산에 어닐링할 수 있도록 실질적으로 주형으로서의 핵산과 상보적인 것이 바람직할 수 있다. 프라이머는 하기에 기재된 단계에서 사용되는 엔도뉴클레아제에 의해 3'-말단 또는 3'-말단측에서 인식되는 서열을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 엔도뉴클레아제가 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드를 포함하는 위치에서 DNA 폴리머라제(프라이머-신장 스트랜드)를 사용하여 프라이머로부터 신장된 DNA 스트랜드를 인식하거나 절단하는 구조를 갖는다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만 예를 들면, 주형으로서의 핵산에 어닐링된 일반식에 의해 표시된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 DNA 신장에 의해 제조된 더블-스트랜드 DNA에 RAas H를 작용시키는 경우, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 리보뉴클레오티드 부위에서 절단된다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 신장에 의해 합성된 DNA 스트랜드 사이에 닉(nick)이 도입된 더블-스트랜드가 제조된다. 이어서, 닉 부위로부터 DNA 폴리머라제로 스트랜드 치환 반응을 수행한다. 따라서, 프라이머의3'-말단으로부터 핵산 스트랜드를 신장시키기 위해 사용될 수 있고, 엔도뉴클레아제로 절단될 수 있고, 그것과 함께 DNA 폴리머라제로 스트랜드 치환시킬 수 있는 어느 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하나 이상의 변형된 데옥시리보뉴클레오티드(들) 또는 리보뉴클레오티드 위치에 대하여 5'에 위치하는 데옥시리보뉴클레오티드 유사체(들)를 포함할 수 있다. 즉, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 유사체는 프라이머의 작용이 제거되지 않는 한 본 발명의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 포함될 수 있다. 여러 형태의 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 유사체가 조합되어 사용될 수 있다. 제한하는 것은 아니지만, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드의 예로 도입된 아미노 그룹을 갖는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 데옥시리보뉴클레오티드 유사체의 예는 제한하는 것은 아니지만, 7-데아자구아닌과 같이 변형된 염기를 갖는 데옥시리보뉴클레오티드 유사체 및 데옥시이노신 뉴클레오티드를 포함한다.
예를 들면, 본 발명을 제한하는 것은 아니지만 하기 일반직으로 표현되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 프라이머로서 본 발명의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로서 바람직하게 사용된다:
일반식: 5'-dNa-Nb-dNc-3'
(a: 11이상의 정수; b: 1이상의 정수; c: 0 또는 1이상의 정수; dN: 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드 유사체; 여기에서, dNa중 적어도 하나는 고체상위에서 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드이고; N: 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드(여기에서, dNa중 일부의 dNs는 Ns로 대체될 수 있다).
본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 예를 들면, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5'-DNA-RNA-DNA-3'(단, b는 1 이상의 정수이고 c는 1이상의 정수이다)의 형태로 존재하다.
키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에서, 일반식에서 c는 0일 수 있고, 데옥시리보뉴클레오티드 유사체는 데옥시리보이노신 뉴클레오티드일 수 있고 변형된 리보뉴틀레오티드는 (α-S) 리보뉴틀레오티드일 수 있다.
첨가될 수 있는 작용 그룹(예: 아미노 그룹, 알데히드 그룹 또는 아실 그룹) 또는 바이오틴 그룹을 갖는 dNa 부위 및/또는 dNc 부위의 뉴클레오티드를 기질상에 고정화시키기 위해 사용되는 작용 그룹 또는 바이오틴을 가하기 위하여 바람직하게 사용할 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 5' 측상의 dNa 부위중 어느 하나의 뉴클레오티드에 아미노 그룹이 첨가된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 3' 측상의 dNc 부위중 어느 하나의 뉴클레오티드에 아미노 그룹이 첨가된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 5' 측상의 dNa 부위중 어느 하나의 뉴클레오티드 및 3' 측상의 dNc 부위중 어느 하나의 뉴클레오티드에 아미노 그룹이 첨가된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이 바람직하게 사용될 수 있다.
예를 들면, 포스포르아미다이트 방법에 따라 어플라이드 바이오시스템사(Appliced Biosystems Inc. (ABI)의 394형 DNA 합성기를 사용하여 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 어느 뉴클레오티드 서열을 갖도록 합성할 수 있다. 또한, 포스페이트 트리에스테르 방법, H-포스포네이트 방법 및 티오포스포네이트 방법을 사용하여 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성할 수 있다.
(2) 본 발명에서 사용되는 엔도뉴클레아제
상기 (1)에 기재된 바와 같은 주형으로서의 핵산에 어닐링되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 DNA 신장에 의해 제조된 더블-스트랜드 DNA상에 작용하고 스트랜드를 치환시키기 위해 신장된 스트랜드를 절단하는 어느 엔도뉴클레아제를 본 발명에서 사용할 수 있다. 즉, 엔도뉴클레아제는 더블-스트랜드 DNA의 키메라성 올리보뉴클레오티드 부위에 닉을 제조하는 효소이다. 예들 들면, 리보뉴클레아제를 사용할 수 있다. 이들중에서, DNA 및 RNA로 구성된 더블-스트랜드 핵산의 RNA 부분에 작용하는 엔도리보뉴클레아제 H(RNase H)를 바람직하게 사용할 수 있다. 중온성 및 열-내성의 것을 포함하고, 상기 언급된 활성을 갖는 어느 리보뉴클레아제를 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다. 예를 들면, E.Coli로부터의 RNase H, 써모토가(Thermotoga) 속 세균으로부터의 RNase H, 써무스(Thermus) 속 세균으로부터의 RNase H, 피로코쿠스(Pyrococcus)속 세균으로부터의 RNase H 및 바실러스 (Bacillus) 속 세균으로부터의 RNase H를 바람직하게 사용할 수 있다. I형, II형 또는 III형 RNase H를 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다.
본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 피로코쿠스(Pyrococcus) 속 세균으로부터의 대표적인 RNase H로서 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 또는 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii)로부터의 II형 RNase H는 RNA의 수가 한개일지라도 RNA-DNA 정션(junction)에서 RNA에 5' 위치에서 키메라성 이중-스트랜드 핵산을 절단한다. 키메라성 더블-스트랜드 핵산은 상기 (1)에 기술된 바와 같은 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 실질적으로 상보적인 핵산에 어닐링시키고 신장시켜 수득한다. 상기 (1)에 기술된 바와 같은 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 포함된 RNAs는 ICAN 반응에서 3' 말단으로부터 하나씩 절단되고 RNA를 포함하지 않는 ICAN 산물이 최종적으로 수득된다. 본 발명의 핵산 고정화물용 고정화를 위한 핵산으로서 증폭 산물을 바람직하게 사용할 수 있다.
(3) 본 발명에서 사용되는 DNA 폴리머라제
본 발명에서 DNA상에 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다. 특히, 실질적으로 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라제가 바람직하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, "스트랜드 치환 활성"은 스트랜드를 치환시킬 수 있는, 즉, DNA 스트랜드를 치환하여 주형 스트랜드에 어닐링된 상보적인 스트랜드를 분리시키면서 주형으로서 뉴클레오티드 서열에 기초하여 DNA 복제를 수행할 수 있는 활성을 언급한다.
본 발명에서 스트랜드 치환 활성을 갖는 어느 DNA 폴리머라제를 사용할 수 있다. 그의 예는 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)(이하, B. ca로서 언급함) 및 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)(이하, B. st로서 언급함)와 같은 바실러스 속의 고온성 세균으로부터 유래된, 그들의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라제, 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라제 I의 거대 단편(클레나우 단편)의 변이체를 포함한다. 중온성 및 열-내성 DNA 폴리머라제 둘 모두를 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다.
B. ca는 약 70℃의 최적 성장 온도를 갖는 고온성 세균이다. 이 세균으로부터의 Bca DNA 폴리머라제가 DNA-의존 DNA 폴리머라제 활성, RNA-의존 DNA 폴리머라제 활성(역전사 활성), 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다고 공지되어 있다. 효소는 그의 기원으로부터의 정제된 효소 또는 유전 공학 기술에 의해 생산된 재조합 단백질일 수 있다. 효소를 유전 공학 기술 또는 다른 방법을 사용하여 치환, 결실, 첨가 또는 삽입에 의해 변형시킬 수 있다. 변형된 효소의 예는 그의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 Bca DNA 폴리머라제인 Bca BEST DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 포함한다.
일부 DNA 폴리머라제는 특정 조건하에서 RNase H 활성과 같은 엔도뉴클레아제 활서을 갖는 것으로 공지되어 있다. 그러한 DNA 폴리머라제를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 일면으로, Mn+2의 존재하에서와 같이 RNase H의 활성을 발현시킬 수 있는 조건하에서 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 방법은 RNase H를 가하지 않고 수행될 수 있다. 본 발명자는 최초로 Mn+2을 포함하는 완충액에서 Bca DNA 폴리머라제가 RNase 활성을 보였고, 본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법은 Bca DNA 폴리머라제외의 다른 효소는 포함하지 않는 반응 혼합물중에서 수행될 수 있다는 것을 입증하였다. 상기 언급한 면은 Bca DNA 폴리머라제의 사용을 제한하지 않는다. 써무스 써모필러스(Thermus stearothermophilus)로부터의 Tth DNA 폴리머라제와 같이 RNase H 활성을 갖는 것으로 공지된 DNA 폴리머라제를 본 발명에서 사용할 수 있다.
(4) 본 발명에서 사용되는 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트
PCR 방법에 사용되는 dNTPs 등(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP의 혼합물)은 신장 반응에서 기질로서 뉴클레오티드 트리포스페이트로서 본 발명에 따라 바람직하게 사용할 수 있다. dNTPs는 그것이 사용되는 DNA 폴리머라제에 대한 기질로서 작용하는 한 7-데자(deaza)-dGTP와 같은 dNTP 유사체를 포함할 수 있다. 또한, 고체상위에 ICAN 반응에 의해 수득된 ICAN 산물을 고정화시키기 위하여 변형된 뉴클레오티드 트리포스페이트는 그것이 사용되는 DNA 폴리머라제에 대한 기질로서 작용하는 한 포함될 수 있다. 그의 예로서 아미노알릴 dUTP 및 바이오틴-표지된 데옥시뉴클레오티드(모두 Sigma로부터 입수)를 포함한다.
(5) 본 발명의 핵산 증폭 방법
본 발명의 핵산 증폭 방법은 상기 (1)에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 상기 (2)에 기재된 바와 같은 엔도뉴클레아제, 상기 (3)에 기재된 바와 같은 DNA 폴리머라제 및 상기 (4)에 기술된 바와 같은 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트와 조합하여 사용함으로써 수행될 수 있다.
ICAN 방법에 따른 방법에서 사용되는 약 100%의 프라이머를 사용한다. 관심의 대상이 되는 증폭된 부위의 양은 PCR과 같은 통상의 증폭 반응에서의 것보다 몇배 높을 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법은 시간에 따라 온도를 조절하기 위한 장치를 필요로 하지 않는다. 따라서, 증폭 반응은 대량의 반응 혼합물에서 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에서 주형으로서 사용되는 핵산 (DNA 또는 RNA)는 제조되거나 핵산을 포함할 수 있는 모든 샘플로부터 분리될 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 핵산 증폭 반응에서 샘플을 직접 사용할 수 있다. 제한하는 것은 아니지만 핵산을 포함할 수 있는 샘플의 예는 전체 혈액, 혈청, 백혈구층, 소변, 대변, 뇌척수액, 정액, 침, 조직(예: 종양 조직 또는 림프절) 및 세포 배양액(예: 포유류 세포 배양액 또는 박테리아성 세포 배양액)과 같은 유기체로부터의 샘플, 비로이드, 바이러스, 박테리아, 균류, 효모, 식물 및 동물과 같은 핵산을 포함하는 샘플, 바이러스 또는 박테리아와 같은 미생물로 오염되거나 감염된 샘플(예; 식품 또는 생물학적 제제), 및 토양 및 폐수와 같은 유기체를 포함할 수 있는 샘플을 포함한다. 예를 들면, 샘플중의 비로이드, 바이러스, 박테리아, 균류 또는 다른 미생물은 표적으로서 비로이드, 바이러스, 박테리아, 진균 또는 다른 미생물로부터 유래된 특이적 유전자의 존재 또는 함량에 기초하여 검출 또는 측량화될 수 있다. 특히 병원성 미생물을 검출하는 방법이 위생 및 환경 분야에서 유용하다. 또한, 본 발명의 방법을 사용하여 유기체의 유전자형을 식별하거나 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있다. 특히, 질병-관련 유전자, 예로서 세포의 암 유발과 관련된 유전자의 발현 상태를검출하거나 확인하는 것이 의약 분야에서 유용하다. RNA 및 DNA 둘 모두를 검출 방법에서 주형으로서의 핵산으로 바람직하게 사용할 수 있다.
핵산을 포함하는 샘플을 제한하지 않고, 예를 들면, 세제를 사용하는 세포 용해, 초음파 처리, 글래스 비드 또는 프렌치 프레스(French press)를 사용하는 진탕/교반을 사용하여 상기 언급된 물질로부터 제조할 수 있다. 일부 경우에는, 추가로 샘플을 공정하여 핵산을 정제하는 것이 유리하다(예: 엔도뉴클레아제가 존재하는 경우). 그러한 경우에, 핵산은 공지된 방법, 예를 들면, 페놀 추출, 크로마토그래피, 이온 교환, 겔 전기 영동 또는 밀도-구배 농축에 의해 정제된다.
RNA로부터 유래된 서열을 갖는 핵산을 증폭시켜야 하는 경우, 주형으로서 RNA를 사용하는 역전사반응에 의해 합성된 cDNA를 주형으로서 사용하여 본 발명의 발명을 수행할 수 있다. 샘플중에 총 RNA, tRNA 및 rRNA와 같은 RNA 분자 및 특이 RNA 종을 포함하여, 역전사 반응용 프라이머를 제조할 수 있는 어느 RNA도 본 발명의 방법에 적용될 수 있다.
사용된 반응 조건하에서 주형으로서 RNA에 어닐링하는 어느 프라이머가 역전사 반응에서 사용될 수 있다. 프라이머는 주형으로서 특이 RNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머(특이적 프라이머), 올리고-dT 프라이머(데옥시티민)프라이머 및 무작위 프라이머를 갖는 프라이머(무작위 프라이머) 일 수 있다. 특이적인 어닐링과 관련하여, 역전사용 프라이머의 길이는 바람직하게 6 뉴클레오티드 이상, 더욱 바람직하게 9 뉴클레오티드 이상이다. 올리고뉴클레오티드 합성과 관련하여, 길이는 바람직하게 100 뉴클레오티드 이하, 더욱 바람직하게 30 뉴클레오티드 이하이다. 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 역전사용 프라이머로서 사용될 수 있다. 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 또한 본 발명의 주형으로서 역전사후 수득된 cDNA를 사용하여 핵산을 증폭시키는 방법에서 스트랜드 치환 반응용 프라이머로서 사용될 수 있다. 그러한 프라이머는 상기 (1)에 기재된 특성을 갖고 RNA로부터 역전사 반응에 사용될 수 있는 어느 것일 수 있다.
주형으로서 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하는 활성을 갖는 어느 효소가 역전사 반응에서 사용될 수 있다. 그의 예는 다양한 원으로부터 기원한 역전사효소, 예를 들면, 조류 골수아세포증바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase(AMV RTase), 마우스 백혈병 바이러스-유래된 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase(MMLV RTase) 및 라우스=관련 바이러스 2 역전자 효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase(RAV-2 RTase)를 포함한다. 또한, 역전사효소 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용할 수 있다. 써모스속 박테리아로부터의 DNA 폴리머라제(예: Tth DNA 폴리머라제) 및 바실러스(Bacillus)속의 고온성 박테리아로부터의 DNA 폴리머라제와 같이 고온에서 역전사 활성을 갖는 어느 효소가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, B. st로부터의 DNA 폴리머라제(Bst DNA 폴리머라제) 및 B. ca로부터의 DNA 폴리머라제(Bca DNA 폴리머라제)와 같은 바실러스(Bacillus)속의 고온성 박테리아로부터의 DNA 폴리머라제가 바람직할 수 있지만, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 예를 들면, Bca DNA 폴리머라제는 역전사 반응을 위해 마그네슘 이온을 필요로 하지 않는다.또한, 그것은 고온 조건하에서 주형으로서 RNA의 2차 구조 형성을 억제시키면서 cDNA를 합성할 수 있다. 역전사 효소활성을 갖는 천연의 것 및 상기 효소의 변이체는 그들이 상기 활성을 갖는 한 사용될 수 있다.
또다른 일면에서 앞서 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA을 복제한 후 본 발명의 방법에서 복제된 산물을 주형으로서의 핵산으로서 사용할 수 있다. 복제 방법의 예로서 제한하는 것은 아니지만, 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 단편이 삽입된 벡터를 사용하여 적절한 숙주 세포를 형질전환시키고, 생성된 형질전환주를 배양하고, 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 단편이 삽입된 벡터를 그로부터 추출하고 사용하는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 벡터는 숙주내에서 안정하게 복제되는 한 어느 것을 사용할 수 있다. 예로서, pUC 시리즈, pBluescript 시리즈, pGEM 시리즈, 코스미드형 벡터 및 파지형 벡터가 바람직하게 사용된다. 숙주는 사용되는 벡터를 유지할 수 있는 한 어느 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 용이하게 배양되는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 들 수 있다.
복제 방법의 다른 일면으로 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA를 RNA 폴리머라제 및 주형으로서 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 단편을 사용하여 전사시킨 후 직접 또는 역전사 반응에 의해 cDNA로 전환시킨 후 RNA를 본 발명의 방법을 위한 주형으로서 사용할 수 있다. 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 단편은 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 갖는 한 특정의 것으로 제한하지 않는다. RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 갖는 벡터내로삽입되고, 그의 말단에 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 갖는 아댑터 또는 카세트로 결찰되거나 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 갖는 프라이머 및 적절한 주형을 사용하여 효소적으로 합성될 수 있다. 따라서 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 단편은 상기 기재된 바와 같이 위치하는 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 사용하여 RNA 형태로 복제되거나 증폭될 수 있다. RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 갖는 한 모든 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들면, pUC 시리즈, pBluescript 시리즈, pGEM 시리즈, 코스미드형 벡터 및 파지형 벡터가 바람직하게 사용된다. 환상 형태로 또는 선형화된 후 바람직하게 사용될 수 있다. RNA 폴리머라제는 복제 또는 증폭법을 위해 사용될 수 있다. 예로서 SP6 RNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제 등을 바람직하게 사용할 수 있다.
주형으로서의 핵상을 본 발명에 따라 증폭 핵산을 수득하기 위하여 사용하고자 하는 상기 기술된 바와 같은 형태로 제조하여 상기(1)에 기술된 바와 같은 제한된 수의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 다양한 증폭 핵산을 수득할 수 있다. 즉, DNA 칩상에 고정화되기 위하여 사용되는 것과 같은 다양한 DNA 단편을 본 발명에 따라 증폭 핵산으로서 대량 수득할 수 있다.
주형의 적절한 길이는 전체 표적 서열 또는 단편중 표적 서열의 충분한 부분에 기인하여 상기 (1)에 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열에 충분히 결합하다록 하는 것이다.
게놈 DNA 또는 증폭 핵산 단편과 같은 더블-스트랜드 DNA 및 전체 RNA 또는mRNA로부터의 역전사 반응에 의해 제조된 cDNA와 같은 싱글-스트랜드 DNA 둘 모두를 본 발명에 따라 증폭 핵산을 수득하기 위하여 주형 DNA로서 바람직하게 사용할 수 있다. 더블-스트랜드 DNA를 싱글-스트랜드 DNAs로 변성시킬 수 있다. 또한, 변성 단계를 불필요하게 하는 RNase H는 조합하여 사용될 수 있다. 그러한 RNase H의 예는 P. fu 또는 P. ho II형 RNase H이다.
제한하지 않고, 주형으로서 DNA가 더블-스트랜드 DNA인 경우, DNA를 싱글-스트랜드 DNA로 변성시켜 본 발명의 방법에서 프라이머가 주형으로서 DNA 스트랜드에 결합할 수 있도록 한다. 더블-스트랜드 DNA가 변성되는 온도(예: 약 95℃)에서 그것을 인큐베이션시키는 것이 변성을 위해 바람직할 수 있다. 다른 방법은 증가된 pH를 사용하는 것을 포함한다. 이러한 경우, pH를 감소시켜 올리고뉴클레오티드 프라이머가 표적에 결합할 수 있도록 하여야 한다. 더블-스트랜드 DNA를 싱글-스트랜드 DNAs로 변성시키거나, RNA를 주형으로서 사용하는 경우, 역전사 반응에 의해 cDNA(싱글-스트랜드 DNA)를 제조한 후, 순차적으로 등온 조건하에서 핵산을 증폭시킨다. "순차적으로"는 반응 온도 또는 반응 혼합물의 조성을 변화시키지 않고 반응을 수행하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "등온"은 실직적으로 그 온도하에서 각 단계에서 효소 및 핵산 스트랜드가 작용하는 상온(constant temper본 발명의 핵산 증폭 반응은 클레나우 단편과 같은 중온성 DNA 폴리어라아제를 사용하여 표준 온도(예: 37℃)에서 수행할 수 있다. 또한, 그것은 열-내성 효소(엔도뉴클레아제 또는 DNA 폴리어라아제)를 사용하여 고온 온도(예: 50℃ 이상, 또는 60℃ 이상)에서 수행할 수 있다. 이러한 경우, 프라이머의 비특이적 어닐링은 억제되어 DNA 증폭의 특이성은 증가한다. 또한, 주형으로서 DNA의 2차 구조 형성의 문제점을 해결함으로써, DNA 폴리머라제의 신장 능력을 증가시킨다. 본 발명에서 역전사 반응 및 핵산 증폭을 순차적으로 수행할 수 있다. 이러한 경우, 역전사 효소를 상기 언급된 반응과 사용하거나 역전사 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 RNA로부터 유래된 서열을 갖는 DNA를 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 상기 언급된 각각의 일면에서, 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 주형으로서 싱글-스트랜드 DNA에 상보적인 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 DNA에 어닐링시킨다. 이어서, DNA 폴리머라제의 작용에 의해 프라이머의 3'-말단으로부터 주형으로서 DNA의 잔존 서열을 따라 주형으로서 DNA에 상보적인 DNA(프라이머-신장된 스트랜드)를 신장시켜 더블-스트랜드 DNA를 합성한다. 엔도뉴클레아제는 더블-스트랜드 DNA에 작용하고 다시 프라이머-신장 스트랜드의 프라이머 부위로부터의 DNA 재신장을 시작한다. 본 발명의 일면으로, 엔도뉴클레아제는 더블-스트랜드 DNA에 닉을 도입시키는 닉 효소로서 작용하거나 본 발명으로 이론으로서 제한하는 것은 아니지만, 엔도뉴클레아제는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 주형으로서 DNA로 구성된 더블-스트랜드 DNA의 구조를 변경시킬 수 있다. 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제는 닉의 3'-말단의 하류에서 DNA를 분리시키면서 더블-스트랜드 DNA중에 도입된 닉의 3'-말단으로부터 DNA 스트랜드를 재-신장시켜 신규의 프라이머-신장된 스트랜드를 제조한다.
본 발명에 따라 증폭된 증폭 핵산을 수득하기 위한 핵산 증폭 방법은 두개의 프라이머, 즉, 주형으로서의 핵산에 상보적인 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 치환된 스트랜드에 상보적인 또하나의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 경우, 하나의 프라이머는 주형으로서의 DNA 스트랜드에 결합하여 스트랜드를 치환시키는 반면, 또다른 프라이머는 스트랜드 치환 반응 결과 유리된 치환된 스트랜드에 결합하여 또다른 스트랜드 치환 반응을 개시한다. 이를 사용하는 경우 하나의 프라이머를 포함하는 반응 산물이 또다른 프라이머에 대한 주형으로서 작용할 수 있음은 자명하다. 따라서, 따라서, 비-선형 방법에서 주형의 양이 증가함에 따라 증폭산물의 양이 증가한다. 본 발명에 따라 증폭 핵산은 키메라성 올리고뉴클레오티드의 일부로서 고체상위에서 고정화되기 위해 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 사용하여 수득될 수 있다.
주형으로서 더블-스트랜드 DNA를 사용하여 본 발명의 핵산의 증폭 방법을 수행하는 경우, 두개의 스트랜드는 각각 두개의 스트랜드에 어닐링하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머을 사용하여 증폭 반응에서 주형으로서 작용할 수 있다. 반응을 더블-스트랜드 DNA의 변성후에 개시하는 경우, 더블-스트랜드 DNA의 변성 전후로 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 4개의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTPs), DNA 폴리머라제 및 엔도뉴클레아제를 반응 혼합물에 첨가한다. 더블-스트랜드 DNA를 변성시키기 위해 열처리를 사용하고 열-내성 효소를 사용하지 않는 경우, 변성 후 효소를 첨가하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따라 증폭 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 일부로서 고체상위에서 고정화되기 위해 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 사용하여 수득될 수 있다.
주형으로서 더블-스트랜드 DNA 및 두개의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 본 발명의 핵산 증폭 방법에서 반응 조건 등에 따라 신장 반응동안 주형-신장된 스트랜드 중간체중 프라이머로부터 주형의 변환(switching)이 발생하여 서로 어닐링되는 합성 프라이머-신장 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 생성할 수 있다. 더블-스트랜드 핵산은 양쪽 끝에 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 갖는다. 이어서 스트랜드 치환을 포함하는 상보적 스트랜드를 신장하는 반을 양쪽 끝으로부터 다시 시작할 수 있다. 반응 결과, 한쪽 끝에서 프라이머 서열을 갖는 증폭 산물을 생산된다. 추가로, 반응시 주형의 변환이 발생하는 경우 상기 기술된 것과 유사한 더블-스트랜드 핵산을 다시 생산된다.
스트랜드 치환 반응시 주형 변환 반응시킬 수 있는 DNA 폴리머라제가 본 발명에서 바람직하게 사용될 수 있다. 예로서, 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 Bca DNA 폴리머라제의 다양한 효소가 특히 바람직하게 사용된다. 그러한 효소는 상업적으로 BcaBEST DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)로서 이용할 수 있다. 일본 특허 2978001에 기술된 방법에 따른 효소에 대한 유전자를 포함하는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)HB101/pU1205 (FERM BP-3720)으로부터 제조될 수 있다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)HB101/pU1205 (FERM BP-3720)는 1991년 5월 10일(기탁일)에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science 및 Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1℃home, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁되었다.
본 발명의 증폭 방법에서, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머-신장 스트랜드는 리보뉴클레오티드를 포함하는 부위에서 분해되어 분해로부터 생성된 5' 단편 (프라이머 부위)는 리보뉴클레오티드를 포함하지 않을 수 있다. 그렇게 생성된 프라이머 부위로부터 신장된 프라이머-신장된 스트랜드는 엔도뉴클레아제에 의해 더이상 분해되지 않는다. 결과 끝에 프라이머 서열을 갖는 증폭 산물이 생성된다.
상기 기재된 바와 같이, 양쪽 끝에 프라이머 서열을 갖지 않는 증폭 산물 및 프라이머 서열(들)을 갖는 산물이 본 발명의 핵산 증폭 방법에서 생산될 수 있다. 이들 산물이 본 명세서에서 증폭 산물로 포함된다.
본 발명에 따라 증폭 핵산을 수득하는 방법에서 사용되는 DNA 폴리머라제는 앞서 신장된 DNA 스트랜드를 치환하면서 닉킹된 부위로부터 하뷰 방향으로 신장되는 스트랜드를 합성하여야 한다. DNA 폴리머라제는 치환된 스트랜드을 분해할 수 있는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내지 않는 것이 중요하다. 예를 들면,E. coli로부터의 DNA 폴리머라제 I의 에고뉴클레아제-결핍 변이체인 클레나우 단편, Bst DNA 폴리머라제로부터 유래된 유사한 단편(New Engl및 Biolabs), 및 B. ca로부터의 Bca BEST DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 그러한 DNA 폴리머라제로서 사용한다. 시쿼나아제(Sequenase) 1.0 및 시쿼나아제 2.0(United States Biochemical), 및 (Gene, 97:13-19(1991)에 기재된 T5 DNA 폴리머라제 및 φ29 DNA 폴리머라제를 또한 사용할 수 있다. 적절한 억제제를 첨가하여 활성을 억제시키는 경우, 일반적으로 5'-> 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라제를 본 발명에 따라 증폭 핵산을 수득하기 위한 DNA 합성 방법에서 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 증폭되는 핵산을 수득하기 위한 핵산 증폭 방법은 다양한 온도 또는 등온에서 수행될 수 있다. 다양한 온도는 각 단계에서의 변화가 반응을 방해하지 않도록 각 단계를 위해 반응 온도를 변화시키는 것을 의미한다. 특히, 다양한 온도는 예를 들면, 프라이머의 어닐링, 상보적 스트랜드의 합성 반응, 상보적 스트랜드의 닉킹(nicking) 및 치환 반응의 각각에 적절한 온도의 변화를 언급한다.
한편, 등온은 각 단계에 대한 반응 온도는 불변하고 각 단계를 실질적으로 상온(constant temperature)에서 수행하는 것을 의미한다. 둘 모두의 경우에서 반응 조건을 최적화하기 위해 온도를 선택하는 것이 적절하다.
본 발명에 따라 증폭되는 핵산을 수득하기 위한 증폭 방법의 하나의 특성은 상기 방법은 핵산 합성동안 온도를 상하로 조정할 필요가 없다는 것이다. 다수의 통상적인 핵산 증폭 방법은 합성된 스트랜드로부터 표적을 해리시키기 위하여 온도를 상하로 조절하는 것을 필요로 한다. 이들 방법은 이 목적을 위해 열 싸이클러(thermal cycler)와 같은 특별한 반응 장치를 필요로 한다. 그러나, 본 발명의 방법은 단지 온도를 일정하게 유지시킬 수 있는 장치만을 사용하여 수행된다. 상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 단일 온도에서 수행될 수 있다. 바람직하게, 프라이머의 비-특이적인 어닐링을 감소시키고 프라이머가 특이적으로 주형으로서 뉴클레오티드 서열에 어닐링할 수 있도록 반응 온도 및 엄격한(stringency) 수준을 선택하여 수행한다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 본 발명의 방법은 상기 기재된 열-내성 효소를 사용하여 고온 조건하에서 수행될 수 있다. 또한, 사용되는 효소의 활성을 충분히 유지하기 위한 적절한 온도에서 본 발명의 방법을 수행하여 반응 효율을 고수준으로 유지시키는 겻이 바람직할 수 있다. 따라서, 반응 온도는 사용되는 효소에 따라 달라질 수 있지만, 바람직하게, 20℃ 내지 약 80℃,더욱 바람직하게 약 30 ℃ 내지 약 75℃, 가장 바람직하게 약 50℃ 내지 약 70℃이다. 특히 고온 조건하에서 반응을 수행하는 경우, 표준 온도에서의 반응을 위한 것보다 더욱 긴 프라이머를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 반응 온도에 적절한 프라이머의 서열 및 길이는 예를 들면, 그의 Tm 값을 참고로하여 결정될 수 있다. 또한, OLIGOTM프라이머 어날리시스 소프트웨어(Takara Shuzo)와 같이 프라이머를 다자인하기 위한 상업적으로 시용가능항 소프트웨어를 사용할 수 있다. 예를 들면, 55℃ 내지 60℃ 또는 65℃의 반응 온도를 사용하는 경우, 본 발명의 방법에서 사용되는 프라이머의 길이는 에를 들면, 제한하지 않고, 12-1000 뉴클레오티드, 바람직하게 14-50 뉴틀레오티드, 더욱 바람직하게 15-40 뉴클레오티드이다. 반응 온도를 승온시킴으로써 얻은 효과의 예는 주형으로서 DNA의 2차 구조 형성의 문제를 해결한 것이다. 높은 GC 함량을 갖는 핵산을 주형으로서 사용하여도, 반응 온도를 승온시킴으로써 원하는 핵산을 증폭시킬 수 있다. 또한, 그것은 유사하게 장쇄의 영역을 증폭시키는데 효과적이다. 그러한 효과는 약 60bp 내지 약 20 kbp 사이, 특히 약 110bp 내지 약 4.3 kbp 사이, 더욱 바람직하게 약 130bp 내지 약 1500 bp 사이 범위에서 관찰된다.
증폭 효능은 주형으로서의 핵산의 GC 함량에 따라 반응 온도를 조절하여 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 낮은 GC 함량을 갖는 핵산을 주형으로서 사용하는 경우 온도는 증폭하고자 하는 쇄의 길이 및 프라이머의 Tm 값에 따라 달라질 수 있지만 본 발명의 증폭 반응은 50 내지 55℃에서 수행될 수 있다.
RNA로부터 cDNA를 제조하는 단계 (역전사 반응)를 통상적으로 수행하는 것을 포함하여, 본 발명의 방법에서 역전사 효소 활성을 갖는 DNA 폴리머라제(예: Bca BEST DNA 폴리머라제)를 사용하여 RNA로부터 핵산을 증폭시킨다. 또한, RNA로부터 핵산을 증폭시키는 단계를 독립적으로 수행하여 수득한 산물, 즉, cDNA를 본 발명의 방법에서 주형으로서 DNA로서 사용할 수 있다.
관심의 대상이 되는 핵산 서열 부위는 인산, Bicine, Tricine, HEPES, 포스페이트 또는 트리스 완충액의 존재하에서 본 발명에 따라 증폭되는 핵산을 수득하기 위한 방법을 수행하여 증폭될 수 있다.
또한, 핵산 증폭 방법은 시간동안 온도를 조정할 수 있는 반응 장치의 사용을 필요로 하지 않는다. 그러므로, 증폭 반응은 대량의 반응 혼합물중에서 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 증폭되는 핵산(예: 의료용)을 대량으로 산업적으로 생산할 수 있다.
본 발명에 따라 증폭되는 핵산을 수득하기 위한 증폭 방법에서 사용되는 프라이머의 사용 효율은 PCR 방법과 같은 통상의 방법에서 것보다 5- 내지 10배 높은 약 100%이다.
(6) 본 발명의 증폭 핵산을 제조하는 방법
상기 기재된 바와 같이, 본 발명에 따라 증폭되는 핵산은 주형으로서의 핵산, 고체상위에 고정화되기 위해 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하는 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고; 반응 산물을 생성하기에 충분한 시간동안 반응 혼합물을 인큐베이션시켜 수득할 수 있다.
다시 말해, 고체상위에 고정화되기 위해 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트와 관련하여 그것이 본 발명의 방법에서 사용되는 DNA 폴리머라제를 사용하여 기질로서 도입될 수 있는 한 특별히 제한하지 않는다. 본 발명의 방ㅂ버에 따라 제조되는 핵산을 고정화시킬 수 있는 작용 그룹을 갖는 것은 바람직하게 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트로서 사용될 수 있다. 제한하는 것은 아니지만, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 포스페이트의 예로서 하이드록실 그룹, 아미노 그룹, 티올 그룹, 알데히드 그룹, 카복실 그룹, 에폭시 그룹 아실 그룹을 갖는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 포스페이트, 및 바이오틴-표지된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함한다. 아미노알릴 dUTP를 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트로서 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 또다른 일면으로, 증폭 핵산을 생산사는 방법은 고체상위에서 고정화되기 위해 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 고체상위에서 고정화되기 위해 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 도입하는 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 증폭 핵산을 생산하는 방법의 실례는 주형으로서의 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고; 반응 산물을 생성하기에 충분한 시간동안 반응 혼합물을 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 이러한 경우, 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고, 데옥시리보뉴클레오티드 일부는 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드이다.
본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 예를 들면, 본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 프라이머의 5'-말단측 및/또는 3'-말단측상에 고체상위에 고정화를 위한 작용 그룹을 가질 수 있다. 이러한 경우, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 작용 그룹 및 프라이머의 5'-말단측 및/또는 3'-말단측 사이의 스페이서(spacer)를 가질 수 있다. 작용 그룹과 관련하여 고체상위에 고정화시킬 수 있고 본 발명에 따른 증폭을 저해하지 않는 한 특별히 제한하지 않는다. 본 발명에 따라 제조된 핵산을 고정화시킬 수 있는 작용 그룹을 갖는 것은 바람직하게 변형된 프라이머로서 사용될 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 그의 예는 5' 말단에 하이드록실 그룹, 아미노 그룹, 티올 그룹, 알데히드 그룹, 카복실 그룹, 에폭시 그룹 또는 아실 그룹을 갖는 변형된 프라이머를 포함한다. 아미노 그룹를 도입하기 위하여 시약을 사용하여 수득된 5'-Amino Link 프라이머(Perkin Elmer)를 바람직하게 변형된 프라이머로서 사용할 수 있다.
PCR 방법은 시간동안 반응 혼합물의 온도를 변화시켜야 하기 때문에, 온도를 조정할 수 있는 반응 용량(일반적으로, 200㎕ 이하)의 것으로 제한한다. 그러므로, 용량을 증가시키는 것은 어렵다. 한편, 본 발명의 방법에는 그러한 제한은 없다.반응 혼합물의 용량을 증가시켜 다량의 핵산을 생산할 수 있다. 본 발명의 방법에서 다수의 상보적 스트랜드 분자를 하나의 주형 분자로부터 합성한다. 또한, 주형들로서 이들 상보적 스트랜드 분자들을 사용하여 핵산을 합성할 수 있다. 따라서, 적절하게 주형 및 프라이머를 선택하여 원하는 핵산을 효율적으로 다량 생산할 수 있다. 또한, PCR 방법과는 달리, 본 발명의 방법은 특정 장치 또는 복잡한 온도 변화를 요구하지 않는다는 사실이 장치 및 에너지 비용과 관련하여 그것을 이롭게 한다. 그러므로, 상기 방법은 핵산을 다량 생산하는 산업상 우수한 방법이다.
본 발명의 생산 방법은 DNA 칩상에 고정하고자 하는 것과 같은 다양한 DNA 단편을 다량 공급하는 방법으로서 유용하다. 특히, 일례에서 DNA 단편을 단순 반응 단계에서 다량 수득할 수 있다.
(7) 본 발명의 고정화된 증폭 핵산을 갖는 물질
DNA 칩(또는 DNA 마이크로어레이 또는 DNA 어레이로서 언급함)은 다양한 유전자 단편 또는 DNAs가 슬라이드 글래스와 같은 고체 기질상의 미리 정해진 영역 또는 미리 정해진 위치에 배열되고 고정화된, 핵산 고정화물이다. 미리 정해진 영역, 미리 정해진 위치 또는 미리 결정된 영역은 영역 또는 위치에 고정화되는 증폭 핵산이 공지되어 있음을 의미한다. 이러한 경우, 그 위치에 고정화되는 증폭 핵산은 증폭 핵산의 뉴클레오티드 서열이 공지되거나 공지되지 않았는지가 알려져 있다.
DNA 칩은 DNA 칩상에 미리 정해진 영역에 배열되고 고정화된 DNA에 상보적인 서열을 갖는 핵산의 핵산 샘플중의 존재 여부를 조사하기 위해 사용된다. 조사는하이브리드제이션시키기 위해 DNA 칩을 샘플, 바람직하게 표지된 핵산 샘플로부터 제조된 핵산 샘플과 접촉시켜 수행된다. 하나의 방법에서 DNA 칩을 사용하여 샘플중의 핵산을 검출하거나 핵산의 수를 측량할 수 있기 때문에, 그것은 유전자 발현 분석, 또는 돌연 변이 또는 다형(polymorphism)의 분석을 매우 효과적으로 촉진시키는 유용한 방법이다. 더블-스트랜드 핵산이 미리 정해진 영역에 배열되고 고정화된 DNA 칩은 적절히 변성시킨 후에 하이브리드제이션을 위해 사용한다. 검출되는 표적 핵산에 상보적인 싱글-스트랜드 DNA가 미리 정해진 영역에 배열되고 고정화된 DNA 칩이 표적 핵산 검출용으로 특히 바람직할 수 있다.
어느 불용성 기질도 그렇게 수득한 DNA를 그것위에 미리 정해진 영역에 배열하고 고정화하는 기질로서 사용할 수 있지만, 글래스 또는 플라스틱으로부터 제조된 프레이트-형태의 기질, 및 니트로셀룰로오스 또는 나일론으로부터 제조된 막-형태의 기질을 바람직하게 사용한다. 고정화시키는 공지된 방법을 사용하여 핵산을 고정화시킬 수 있다. DNA는 직접 기질상에 고정화될 수 있다. 또한, DNA는 적절한 링커(linker)를 통해 고정화될 수 있거나 다수의 DNA 분자를 결찰(ligating)시킨 후 고정화될 수 있다.
본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 유리 기질을 사용하는 경우, 유리 자체는 덜 하전되고 DNA에 약하게 결합하기 때문에 코팅시킨 후 사용한다. 폴리-L-리신-코팅 또는 실릴렌-코팅, 실란화, 글루타르알데히드-코팅, 아민화 등으로 제한하지 않고 코팅을 위해 사용할 수 있다. 정전기력에 의해 상기와 같이 코팅된 유리 글래스상에 DNA를 고정화시킬 수 있다.
본 발명에 따라 증폭 핵산은 고체상위에서 고정화되기 위해 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 그러므로, 예를 들면, 상기 기재된 바와 같이 정전기력에 의해 유리 글래스상에 고정화시킨 것과 상이한 방식으로 기질상에서 고정화될 수 있다. 특히, 유리 글래스상에서 코팅된 작용 그룹과 고정화를 위해 본 발명에 따라 증폭 핵산에 포함된 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 사이의 화학 반응으로부터 형성된 공유결합을 이용할 수 있다.
공유결합을 이용하여, 싱글-스트랜드 DNA가 기질에 결합되어 있는 핵산 고정화물을 하기와 같이 수득할 수 있다. 본 발명에 따라 증폭되는 핵산은 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 고체상위에 고정화되기 위해 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상동성이고 고체상위에 고정화되기 위해 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하지 않는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 제조된다. 화학 반응에 의한 공유 결합을 형성하여 작용 그룹으로 코팅된 유리 글래스중 미리 정해진 영역에 증폭 핵산은 배열되고 고정된다. 이어서 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 프라이머를 포함하지 않는 신장된 스트랜드만이 변성에 의해 분리된다.
예를 들면, 리보뉴틀레오티드 부위는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터 RNase H를 사용하여 본 발명에 따라 증폭되는 핵산중에 남아있기 때문에 리보뉴틀레오티드의 결합은 변성후 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 프라이머를 포함하지 않는 신장된 스트랜드만의 분리시 절단될 수 있다. 그러나, 더블-스트랜드 핵산중 수소 결합을 절단되도록 하기 위하여 변성을 수행할 수 있지만, 동일한 스트랜드중 리보뉴틀레오티드의 결합은 하기 기술하는 본 발명에 따른 변성 조건하에서의 변성에 의해서는 절단되지 않는다. 결과적으로, 리보뉴틀레오티드를 포함하는 싱글-스트랜드 핵산이 증폭 핵산중 변형된 데옥시리보뉴클레오티드에 의해 공유결합을 이용하여 기질상에 결합된 고정된 핵산을 갖는 물질을 수득할 수 있다.
증폭 핵산을 변성시키는 조건과 관련하여 특별히 제한하는 것을 아니지만 5분 내지 30분동안 0.1N 내지 2.0N의 농도의 알칼리를 포함하는 용액중에서 10℃ 내지 65℃의 온도에서 변성하는 것이 바람직할 수 있다. 특히, 증폭 핵산을 그의 말단에서 고체상위에 고정시키는 경우 5분동안 20℃에서 0.2 NaOH, 또는 5분동안 20℃에서 0.5 N NaOH중에서의 변성이 바람직할 수 있다.
예를 들면, 증폭 핵산을 증폭 핵산중 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 사용하여 고체상위에 고정화시키는 경우 30분동안 60℃에서 0.2 N NaOH중에서의 변성이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따라 증폭 핵산을 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 또는 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshi)로부터의 II형 RNase H를 사용하여 수득하는 경우, 리보뉴틀레오티드 부위를 포함하지 않는 증폭 핵산은 효소의 특성에 기인하여 수득할 수 있다. 따라서, 이러한 경우, 더블-스트랜드 핵산중 수소 결합이 절단되지만 동일한 스트랜드중 리보뉴틀레오티드가 절단되지 않는 조건보다 더욱 강력한 변성 조건을 사용하여도 싱글-스트랜드 핵산이 기질에 결합된 고정된 핵산을 갖는 물질을 수득할 수 있다.
예를 들면, 30분동안 60℃에서 0.2 N중 증폭 핵산의 변성이 바람직할 수 있다.
본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 열 변성과 같은 상기 언급된 알칼리 변성이외의 방법을 수행할 수 있다. 예를 들면, 열변성은 3분동안 95℃에서 수행된다.
핵산에 포함된 변형된 핵산의 말단 또는 그 위치에서 싱글-스트랜드 핵산이 고체상위에 고정된 본 발명의 증폭 핵산이 고정된 물질은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli),피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 또는 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshi)로부터의 II형 RNase H를 사용하여 수득할 수 있다.
더블-스트랜드 핵산이 핵산 고정화물중 미리 결정되고 미리 정해진 영역에 배열되고 고정된 경우, 상기 물질을 적절하게 변성시킨 후 하이브리드제이션을 위해 사용한다. 반면, 검출하고자 하는 표적 핵산에 상보적인 싱글-스트랜드 DNA는 본 발명의 물질상의 미리 정해진 영역에 배열하고 고정화시키기 때문에 변성시키지 않고 표적 핵산을 검출하는데 사용할 수 있다. 따라서, 싱글-스트랜드 DNA가 기질에 결합되어 있는 본 발명에 따라 증폭된 산물을 사용하여 제조된 DNA 칩을 사용하여 통상의 것보다 더욱 고감도 및 재현성을 갖고 용이하게 표적 핵산을 검출할 수 있다.
또한, 5'-DNA-RNA-DNA-3' 형태의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 이러한 경우, 고정화되는 핵산의 이용률은 고체상위에 고정화시키기 위한 작용 그룹을 5' 말단측 및/또는 3'-말단측상의 DNA 부위중 어느 하나의 뉴클레오티드에 도입시켜 증가시킬 수 있다. 즉, 고정시키고자 하는 핵산의 이용을 감소시킬 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하며, 그의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
참고 실시예 1
(1) 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 게놈 DNA 제조
1% 트립톤(Difco Laboratories), 0.5% 효모 추출물(Difco Laboratories), 1% 가용성 전분 (Nacalai Tesque), 3.5% Jamarine S Solid (Jamarine Laboratory), 0.5% Jamarine S Liquid (Jamarine Laboratory), 0.003% MgSO4, 0.001% NaCl, 0.0001% FeSO4·7H20, 0.0001% CoSO4, 0.0001% CaCl2·7H20, 0.0001% ZnSO4, 0.1ppm CuSO4·5H20, 0.1ppm KAI(SO4)2, 0.1ppm H3BO4, 0.1ppm Na2MoO4·2H20, 및 0.25mM NiCl2·6H20를 포함하는 2L 배지를 2L 배지용 병에 놓고, 20분동안 120℃에서 멸균하고 질소 가스로 버블링하여 산소를 제거한 후 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)(Deutsche Sammlung von Migrooranismen; DSM3638)을 배지내 접종하고 진탕하지 않고 16시간동안 95℃에서 배양하였다. 배양 후 세포를 원심분리에 의해 회수하였다. 생성된 세포를 4㎖의 25% 수크로오스, 및 50mM tris-HCl(pH 8.0)에 현탁시켰다. 물중 0.4㎖의 10mg/㎖의 리소자임 클로라이드(Nacalai Tesque)를 가하였다. 혼합물을 1시간동안 20℃에서 반응시켰다. 반응 후, 150mM NaCl, 1mM EDTA 및 20mM tris-HCl(pH 8.0), 0.2㎖의 20mg/㎖ 프로테이나제 K(Takara Shuzo) 및 2㎖을 10% 소듐 라우릴 설페이트 수용액을 포함하는 24㎖의 혼합물을 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 1시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 후 혼합물을 페놀-클로로포름 추출후 에탄올 침전시켜 1mg의 게놈 DNA를 제조하였다.
(2) RNase HII 유전자 클로닝
피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshi)의 전장 게놈 서열이 공개되었다[DNA Research, 5:55-76 (1998)]. 게놈중 RNase HII(PH1650)의 동족체를 코딩하는 하나의 유전자의 존재가 공지되었다(서열번호:1, the home page of National Institute of Technology 및 Evaluation: http://www.nite.go.jp/).
PH1650 유전자 및 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)의 일부 공개된 게놈 서열 (the home page of University of Utah, Utah Genome Center: http://www.genome.utah.edu/서열.html)의 상동성을 조사하였다. 결과 고도의 상동성 서열을 발견하였다. 프라이머 1650Nde (서열번호:2) 및 1650Bam (서열번호:3)을 상동 서열에 기초하여 합성하였다.
주형으로서 200ng의 (1)에서 수득한 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 게놈 DNA, 및 프라이머로서 20pmol의 1650Nde 및 20pmol 1650Bam을 사용하여 100㎕의 용량으로 PCR을 수행하였다. Takara EX Taq(Takara Shuzo)를 첨부된 프로토콜에 따라 PCR를 위해 DNA 폴리머라제로서 사용하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 30초동안 94℃, 30초동안 55℃, 1분동안 72℃에서 30싸이클. 약0.7kb의 증폭된 DNA 단편을 NdeI 및 BamHI(Takara Shuzo)로 분해하였다. 생성된 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pET3a(Novagen)중 NdeI 및 BamHI 사이트 사이에 삽입하여 플라스미드 pPFU220을 제조하였다.
(3) RNase HII 유전자를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열의 확인
(2)에서 수득한 pPFU220 내로 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 디데옥시 방법에 의해 확인하였다. 확인된 뉴클레오티드 서열을 분석하여 RNase HII를 코딩하는 것으로 가정된 오픈 리딩 프레임의 존재를 밝혀냈다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 4에 나타낸다. 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 RNase H의 아미노산 서열을 서열번호 5에 나타낸다.
플라스미드 pPFU220로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)JM109을 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)JM109/pPFU220로 명명하고 2000년 월 5일(원기탁일)에 기탁번호 FERM P-18020하에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science 및 Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1℃home, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁되고 2001년 7월 9일 수탁번호 BP-7654하에 국제 기탁기관에 이관되었다.
(4) 정제된 RNase HII 샘플의 제조
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)HMS174(DE3) (Novagen)을 (2)에서 수득한 pPFU220으로 형질전환시켰다. pPFU220을 포함하는 생성된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)HMS174(DE3)을 100μg/㎖의 앰피실린을 포함하는 2L의 LB배지내로 접종하고 37℃에서 16시간동안 진탕시키면서 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 66.0㎖의 초음파 처리 완충액[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 2mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파처리하였다. 10분동안 12000rpm에서 초음파 처리된 현탁액을 원심분리하여 수득한 상층액을 15분동안 60℃에서 가열하였다. 10분동안 다시 12000rpm에서 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 따라서, 61.5㎖의 가열된 상층액을 수득하였다.
가열된 상층액을 완충액 A[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA]으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 결과, RNase H는 RESOURSE Q 칼럼을 통해 이동하였다. 60.0㎖의 이동(flow-through) RNase H 분획을 완충액 A으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 0 내지 500mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 150mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다. 2.0㎖의 RNase H 분획을 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA을 포함하는 50mM tris-HCl(pH 8.0)으로 평형화된 Superdex 200 겔 여과 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 결과 RNase HII가 분자량 17킬로달톤에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 모노머 형태의 RNase HII의 것과 일치한다. 용리된 RNase HII를 Pfu RNase HII 샘플로서 사용하였다.
수득한 Pfu RNase HII 샘플의 효소 활성을 참고 실시예 3에 기술된 방법과 같이 측정하였다. 결과, Pfu RNase HII 샘플에 대하여 RNase H 활성을 관찰하였다.
참고 실시예 2: 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii) RNase HII 유전자 클로닝
(1) 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii)로부터 게놈 DNA 제조
1% 트립톤(Difco Laboratories), 0.5% 효모 추출물(Difco Laboratories), 1% 가용성 전분 (Nacalai Tesque), 3.5% Jamarine S Solid (Jamarine Laboratory), 0.5% Jamarine S Liquid (Jamarine Laboratory), 0.003% MgSO4, 0.001% NaCl, 0.0001% FeSO4·7H20, 0.0001% CoSO4, 0.0001% CaCl2·7H20, 0.0001% ZnSO4, 0.1ppm CuSO4·5H20, 0.1ppm KAI(SO4)2, 0.1ppm H3BO4, 0.1ppm Na2MoO4·2H20, 및 0.25mM NiCl2·6H20를 포함하는 2L 배지을 2L 배지용 병에 놓고, 20분동안 120℃에서 멸균하고 질소 가스로 버블링하여 산소를 제거한 후 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii) OT3(Institute of Physical 및 Chemical Research(RIKEN); JCM9974)을 배지내 접종하고 진탕하지 않고 16시간동안 95℃에서 배양하였다. 배양 후 세포를 원심분리에 의해 회수하였다.
세포를 4㎖의 25% 수크로오스, 50mM tris-HCl(pH 8.0)에 현탁시켰다. 물중 0.4㎖의 10mg/㎖ 리조자임 클로라이드(Nacalai Tesque)를 가하였다. 혼합물을 20℃에서 1시간동안 반응시켰다. 반응 후, 150mM NaCl, 1mM EDTA 및 20mM tris-HCl(pH 8.0), 0.2㎖의 20mg/㎖의 프로테나제 K(Takara Shuzo) 및 2㎖의 10% 소듐 라우릴 설페이트 수용액을 포함하는 24㎖의 혼합물을 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 1시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다.
반응 후, 혼합물을 페놀-추출 후 에탄올 침전시켜 약 1mg의 게놈 DNA를 제조하였다.
(2) RNase HII 유전자 클로닝
피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii)의 전장 게놈 서열이 공개되어 있다[DNA Research, 5:55-76 (1998)]. RNase HII (PH1650) 동족체를 코딩하는 하나의 유전자의 존재가 공지되어 있다(서열번호:1, the home page of National Institute of Technology 및 Evaluation: http://www.nite.go.jp/).
프라이머 PhoNde (서열번호:2) 및 PhoBam (서열번호:3)를 PH1650 유전자 (서열번호:51) 서열에 기초하여 합성하였다.
주형으로서 참고 실시예 2-(1)에서 제조된 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii) 게놈 DNA 100ng, 및 프라이머로서 각각 20pmol의 PhoNde 및 PhoBam을 사용하여 100㎕의 용량으로 수행하였다. Takara EX Taq(Takara Shuzo)를 첨부된 프로토콜에 따라 PCR를 위해 DNA 폴리머라제로서 사용하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 30초동안 94℃, 30초동안 55℃, 1분동안 72℃에서 40싸이클. 약 0.7kb의 증폭된 DNA 단편을 NdeI 및 BamHI(Takara Shuzo)로 분해하였다. 이어서 플라스미드 pPHO238을 플라스미드 벡터 pET3a(Novagen)중 NdeI 및 BamHI사이의 생성된 DNA 단편에 삽입하여 작제하였다.
(3) RNase HII 유전자를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열의 확인
참고 실시예 2-(2)에서 수득한 pPHO238 내로 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 디데옥시 방법에 의해 확인하였다.
확인된 뉴클레오티드 서열을 분석하여 RNase HII를 코딩하는 것으로 가정된 오픈 리딩 프레임의 존재를 밝혀냈다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 51에 나타낸다. 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 RNase HII의 아미노산 서열을 서열번호 52에 나타낸다.
플라스미드 pPHO238로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)JM109을 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)JM109/pPHO238로 명명하고 2000년 월 5일(원기탁일)에 FERM P-18222하에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science 및 Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1℃home, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁되고 2001년 8월 2일에 기탁번호 BP-7692하에 국제 기탁기관에 이관되었다.
(4) 정제된 RNase HII 샘플 제조
참고 실시예 2-(2)에서 수득한 pPHO238로 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)HMS174(DE3)(Novagen)을 형질전환시켰다. pPHO238을 포함하는 생성된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)HMS174(DE3)을 100μg/㎖의 앰피실린을 포함하는 1L의 LB 배지내로 접종하고 37℃에서 16시간동안 진탕시키면서 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 34.3㎖의 초음파 처리 완충액[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 2mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파처리하였다. 10분동안 12000rpm에서 초음파 처리된 현탁액을 원심분리하여 수득한 상층액을 15분동안 70℃에서 가열하였다. 10분동안 다시 12000rpm에서 다시 원심분리하여 수득한 상층액을 15분동안 80℃에서 가열하였다. 이어서 다시 10분동안12000rpm에서 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 따라서, 33.5㎖의 가열된 상층액을 수득하였다.
가열된 상층액을 완충액 A[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA]으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 결과, RNase H는 RESOURSE Q 칼럼을 통해 이동하였다.
35.0㎖의 이동(flow-through) RNase H 분획을 2L의 완충액 B[50mM tris-HCl(pH 7.0), 1mM EDTA]을 2시간동안 투석하였다. 투석을 2회 더 반복하였다. 34.5㎖의 투석 효소 용액을 완충액 B로 으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 0 내지 500mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 155mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다.
완충액 B를 4.0㎖의 분획에 가하여 최종 농도를 50mM으로 하였다. 혼합물을 50mM NaCl을 포함하는 완충액 B로 평형화된 HiTrap-heparin 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 50 내지 550mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 160mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다.
6.9㎖의 RNase HIII 분획을 한외여과에 의해 Centricon-10(Amicon)을 사용하여 농축시켰다. 250㎕의 농축액으로 각각 분리된 2분량을 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA를 포함하는 50mM Tris-HCl(pH 7.0)로 평형화된 Superose 6 겔 여과칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 결과 RNase HIII가 분자량 24.5 킬로달톤에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 모노머 형태의 RNase H의 것과 일치한다.
수득한 Pho RNase HIII 샘플로서 사용하였다.
그렇게 수득한 Pho RNase HIII 샘플의 효소 활성을 참고 실시예 3에 기술된 바와 같이 측정하였다. 결과 Pho RNase HIII 샘플에 대하여 RNase H 활성을 관찰하였다.
참고 실시예 3: 열-내성 RNase H 활성 측정
1 mg의 poly(rA) 또는 poly(dT) (Amersham Pharmacia Biotech로부터 모두 입수)를 1 mM EDTA를 포함하는 1 ml의 40 mM tris-HCl (pH 7.7)에 용해시켜 poly(rA) 용액 및 poly(dT) 용액을 제조하였다.
poly(rA) 용액(20μg/㎖의 최종 농도) 및 poly(dT)(30μg/㎖의 최종 농도)을 이어서 4mM MgCl2, 1mM DTT, 0.003% BSA 및 4% 글리세롤를 포함하는 40mM tris-HCl 완충액(pH 7.7)에 가하였다. 혼합물을 10분동안 37℃에서 반응시킨 후 4℃으로 냉각시켜 켜 poly(rA) 용액-poly(dT) 용액을 제조하였다.
1㎕의 효소 용액을 100㎕의 poly(rA) 용액-poly(dT) 용액에 가하였다. 혼합물을 40℃에서 10분동안 반응시켰다. 10㎕의 0.5M EDTA를 가하여 반응을 종결시켰다. 260nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로서 10㎕의 0.5M EDTA를 가하고 생성된 혼합물을 10분동안 40℃에서 반응시킨 후 흡광도를 측정하였다. EDTA가 존재하지 않은 반응에서의 흡광도로부터 대조군의 흡광도를 감하여 값(흡광도 차)을 수득하였다. 따라서, 효소 반응에 의한 poly(rA) -poly 하이브리드로부터 유리된 뉴클레오티드의 농도를 흡광도 차에 기초하여 측정하였다. 1 유니트의 RNase H는 하기 식에서 계산되는 10분후 1nmol의 리보뉴클레오티드의 유리에 상응하여 A260를 증가시키는 효소의 양으로 정의된다. 희석된 효소 용액을 사용하는 경우 하기 식을 상요하여 얻은 값은 희석율에 기초하여 보정되었다:
유니트 = [흡광도 차 x 반응 용략(㎖)] / 0.0152
실시예 1
본 발명에 따른 리보뉴틀레오티드를 포함하는 더블-스트랜드 키메라성 올리고뉴클레오티드를 변성시키기 위한 조건을 조사하였다. 5' 말단에 아미노 그룹, ICAN(6)/M13-47 (서열번호:6), IACN(6)/R1/M13-47 (서열번호:7), ICAN(6)/R2/M13-47 (서열번호:8) 및 ICAN(6)/R3/M13-47 (서열번호:9) 각각을 갖는 키메라성 올리고뉴클레오티드(40-mer 내지 43-mer)을 합성하였다. 서열번호:7, 8 및 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 키메라성 올리고뉴클레오티드는 각각 중앙 부위에 1, 2 및 3개의 리보뉴틀레오티드(들)을 갖고 5'-말단측에 16 뉴클레오티드의 공통된 서열 및 3'-말단측에 24 뉴클레오티드의 공통된 서열을 갖는다. 서열번호:6의 올리고뉴클레오티드는 리보뉴틀레오티드를 포함하지 않는 이들 공통 서열의 조합물이다. 이하, 5' 서열 및 3' 서열을 ICAN(6) 서열 및 M13-47 서열로 각각 언급한다. 이들 올리고뉴클레오티드외에도, 음성 대조군으로서 DNA 합성기(ABI)를 사용하여 40-mer 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에서 아미노 그룹으로 변형되고 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)숙신에이트 데하이드로게나아제 유전자의 서열의 일부인 서열번호 10(GenBank accession no. X00980)의 서열을 갖는다.
각각의 키메라성 올리고뉴클레오티드를 0.2% 수크로오스 모노라울레이트 (Dojindo)를 포함하는 40 mM 카보네이트 완충액 (pH 9.5)중 0.1mM의 최종 농도로 용해시켰다. 각 샘플에 대하여 Affymetrix 417 Arrayer (Affymetrix)를 사용하여 WO 01/02538에 기술된 방법에 따라 제조된 도입된 활성 카복실 그룹을 갖는 슬라이드 글래스인 Mirus-E 슬라이드 글래스에 10개의 스팟을 스파팅하였다. 스파팅한 후, 슬라이드 글래스를 0.2% SDS 및 증류수에서 2회 세척하였다. 슬라이드 글래스를 하기와 같은 4개 유형의 변성 조건하에서 처리하였다:
1. 대조군: 증류수에서 세척한 슬라이드 글래스를 저속 원심분리에 의해 건조시켰다;
2. 0.2 N NaOH (20℃): 슬라이드 글래스를 0.2 N NaOH중 20℃에서 5분동안 처리하고 증류수에서 5분동안 세척한 후 건조시켰다;
3. 0.5 N NaOH (20℃): 슬라이드 글래스를 0.5 N NaOH중 20℃에서 5분동안 처리하고 증류수에서 5분동안 세척한 후 건조시켰다;
4. 0.2 N NaOH (65℃): 슬라이드 글래스를 0.2 N NaOH중 65℃에서 30 분동안 처리하고 증류수에서 5분동안 세척한 후 건조시켰다;
5. 0.5 N NaOH (65℃): 슬라이드 글래스를 0.5N NaOH중 65℃에서 30 분동안처리하고 증류수에서 5분동안 세척한 후 건조시켰다.
어레이상에서 올리고뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 프로브로서 올리고뉴클레오티드 프로브 1 (서열번호:11; 5' 말단에 Cy3 (Amersham Pharmacia Biotech)으로 표지됨) 및 올리고뉴클레오티드 프로브 2 (서열번호:12; 5' 말단에 Cy5(Amersham Pharmacia Biotech)로 표지됨)를 DNA 합성기를 사용하여 합성하였다. 올리고뉴클레오티드 프로브 1 및 2는 각각 ICAN(6) 서열 및 M13-47 서열과 상보적이다.
상업적으로 이용할 수 있는 제품인 IntelliGene (Takara Shuzo)에 첨부된 설명서에 따라 제조된 프리하이브리드제이션 용액 및 하이브리드제이션 용액을 사용하여 하이브리드제이션을 수행하였다. 어레이를 2시간동안 20℃에서 프리하이브리드제이션시켰다. 10 pmol/ul 농도의 표지된 프로브중 하나를 포함하는 하이브리드제이션 용액을 제조하고, 2분동안 95℃에서 가열하고 DNA 어레이상에 적가하였다. 어레이를 커버 글래스로 덮고 슬라이드 글래스를 종이 접착제(Kokuyo)로 실링하였다. 13시간동안 42℃에서 인큐베이션시킨 후, 커버 글래스를 제거하였다. 어레이를 2 x SSC 및 0.2% SDS를 포함하는 용액중 45℃에서 10분동안 세척하고 0.05 x SSC으로 20℃에서 세정하고 원심분리하여 건조시켰다. Cy3 (여기 파장: 532 nm; 방출 파장: 570 nm) 및 Cy5 (여기 파장: 635 nm; 방출 파장: 670 nm)에 대한 형광 이미지를 Affymetrix 418 Array Scanner (Affymetrix)를 사용하여 수득하였다. 각 스팟에 대한 시그날 세기를 표식(expression) 데이타 분석 소프트 웨어 ImaGene 4.0 (Biodiscovery)를 사용하여 측량하였다. 이어서, ICAN(6) 서열로부터의 시그날에대한 M13-47 서열로부터의 시그날 비, 즉, Cy3로부터의 형광 시그날에 대한 Cy5로부터의 형광 시그날 값의 비를 측정하였다. 이 결과를 표 1에 나타낸다. 표 1은 ICAN(6)/M13-47 올리고뉴클레오티드 (서열번호:6)에 대한 비를 100%로 정의한, 각 슬라이드 글래스상의 각 올리고뉴클레오티드의 10개의 스팟에 대한 평균 비를 나타낸다. 음성 대조군에 대해서는 형광 시그날이 검출되지 않았기 때문에 올리고뉴클레오티드의 스팟으로부터의 시그날은 서열 특이성에 기인함을 확인하였다.
표 1
표 1에 나타낸 바와 같이, 0.2 N NaOH중 20℃에서 5분 또는 0.5 N NaOH중 20℃에서 5분동안 처리된 슬라이드 글래스에 대하여 관찰된 리보뉴클레오티드 수의 증가에 따른 비의 감소는 처리되지 않은 슬라이드 글래스에 대하여 관찰된 것과 동일하였다. 이 결과에 기초하여, 0.1 N 내지 2.0 N 농도의 알칼리를 포함하는 용액중 10℃ 내지 40℃ 온도에서 5분 내지 30분동안 처리함으로써 리보뉴틀레오티드 부위에서 고체상에서의 키메라성 올리고뉴클레오티드는 거의 절단되지 않았음을 확인하였다. 특히, 0.2 N NaOH중 20℃에서 5분 또는 0.5 N NaOH중 20℃에서 5분동안의 알칼리 변성이 바람직할 수 있음이 확인되었다.
실시예 2
실시예 1에서 발견된 변성 조건을 사용하여 ICAN 방법에 의해 증폭된 실제 더블-스트랜드 핵산이 고정된 어레이에 대하여 조사하였다.
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K-12로부터의 2개의 오픈 리딩 프레임(ORFs)에 상응하는 증폭 산물을 본 실시예에서 제조하였다. ORFs, ORF ID No. 131#6 및 ORF ID NO. 214#1는 인터넷상의 GenoBase (http://ecoli.aist-nara.ac.jp/)에 공개되어 있다. 따라서, ORFs의 뉴클레오티드 서열 및 그의 발현 산물에 대한 정보를 데이타베이스로부터 수득하였다.
ICAN 방법에 의해 핵산을 증폭시키기 위해 사용되는 조건은 하기와 같았다. 간단히, 131#6 및 214#1에 대한 증폭된 단편을 주형으로서 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K-12 균주 W3110로부터의 게놈 DNA 및 한쌍의 서열번호:13 및 14 또는 서열번호:15 및 16의 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR 방법에 의해 제조하였다. 증폭된 단편 (300 bp)을 벡터 pUC19 (Takara Shuzo)내로 클로닝하고 서열번호:17 및 18의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR-증폭시켰다. 이어서 최종 농도 0.01%의 100 pmol의 각각 서열번호:19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머, 주형으로서 100 ng의 PCR 증폭 산물 및 프로필렌디아민을 포함하는 20㎕의 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 98℃에서 2분동안 인큐베이션시킨 후 얼음위에 놓았다. 상기 혼합물 및, 최종 농도 20 mM HEPES-수산화칼륨 완충액 (pH 7.8), 100 mM 아세트산칼륨, 0.01% 소 혈청 알부민 (BSA), 1% 디메틸 설폭시드, 4 mM 아세트산 마그네슘, 0.5 mM 각각의 dNTPs, 11 U의 BcaBEST DNA 폴리머라제 (Takara Shuzo) 및 60 U의 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) I형 RNase H (Takara Shuzo)을 포함하는 반응 혼합물 (최종 부피 100㎕)을 제조하였다. 반응 혼합물을 균일하게 혼합하고 60℃에서 60분동안 인큐베이션시켰다. 5'말단에서 변형되지 않거나 아미노 그룹으로 변형된 서열번호:19의 서열을 갖는 프라이머를 사용하였다. 결과, 프라이머중 아미노 그룹을 갖는 더블-스트랜드 핵산(ICAN 산물 1로 언급함) 및 아미노 그룹을 포함하지 않는 더블-스트랜드 핵산(ICAN 산물 2로 언급함)을 각 ORF에 대하여 수득하였다.
PCR 방법을 사용하여 더블-스트랜드 핵산을 증폭시켰다. 특히, 131#6 및 214#1에 대한 단편을 주형으로서 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K-12 균주 W3110로부터의 게놈 DNA 및 서열번호:13 및 14 또는 서열번호:15 및 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 한쌍의 프라이머를 사용하여 PCR-증폭시켰다. 증폭된 단편을 벡터 pUC19내로 클로닝하였다. 주형으로서의 클론 및 서열번호:21 및 22의 뉴클레오티드 서열을 갖는 한쌍의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 5' 말단에서 변형되지 않거나 아미노 그룹으로 변형된 서열번호:21 및 22의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머을 사용하였다. 결과, 프라이머중 아미노 그룹을 갖는 더블-스트랜드 핵산(PCR 산물 1로 언급함) 및 아미노 그룹을 포함하지 않는 더블-스트랜드 핵산(PCR 산물 2로 언급함)을 각 ORF에 대하여 수득하였다.
상기 언급된 4가지 형태의 더블-스트랜드 증폭 핵산을 그에 첨부된 프로토콜에 따라 QIAquick PCR 정제 Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 정제된 핵산 을 0.1% 수크로오스 모노라울레이트을 포함하는 40 mM 카보네이트 완충액 (pH 9.5)중 최종 농도 0.3μg/㎕로 용해시켰다. 각 샘플에 대하여 Affymetrix 417 Arrayer (Affymetrix)를 사용하여 도입된 활성 카복실 그룹을 갖는 슬라이드 글래스인 Mirus-E 슬라이드 글래스에 10개의 스팟을 스탓팅하였다. 스파팅한 후, 슬라이드 글래스를 0.2% SDS 및 증류수에서 2회 세척하였다. 건조시킨 후, 슬라이드 글래스를 하기와 같은 4개 유형의 조건하에서 처리하였다:
1. 비처리군;
2. 슬라이드 글래스를 0.2 N NaOH중 20℃에서 5분동안 처리하고 증류수에서 5분동안 세척한 후 건조시켰다;
3. 슬라이드 글래스를 0.5 N NaOH중 20℃에서 5분동안 처리하고 증류수에서 5분동안 세척한 후 건조시켰다;
4. 슬라이드 글래스를 0.2 N NaOH중 65℃에서 30 분동안 처리하고 증류수에서 5분동안 세척한 후 건조시켰다.
프로브로서 올리고뉴클레오티드를 사용하여 IntelliGene에 첨부된 설명서에 기술된 프로토콜에 따라 프리하이브리드제이션, 하이브리드제이션, 세척 및 건조를 수행하였다. 올리고뉴클레오티드를 5' 말단에서 Cy5로 표지하였고 이는 모든 증폭 산물에 공통적으로 포함되는 pUC19 부위의 서열에 상보적인 서열번호:23의 서열을 가졌다. 이어서 Cy5에 대한 파장에서 스캐닝하여 형광 이미지를 얻었다. 각 스팟에대한 시그날 및 주위 배경에 대한 세기를 ImaGene 4.0를 사용하여 측량하였다. 각 스팟에 대 한 시그날 세기 결과를 표 2에 나타낸다. 표의 각 값은 10개 스팟에 대한 평균값을 나타낸다.
표 2
우선, ICAN 산물 및 PCR 산물 사이의 시그날 세기를 비교하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 싱글 스트랜드 전환에 대하여 처리되지 않고, 0.2 N NaOH중 20℃에서 5분동안 알칼리 처리되거나 열처리된 슬라이드 글래스의 경우 ICAN 산물 1에 대하여 관찰된 시그날 세기는 PCR 산물 1에 대하여 관찰된 것과 일치하였다. 이 결과에 기초하여, 공유 결합형 마이크로어레이의 제조시 아미노 그룹으로 변형된 더블-스트랜드 ICAN 산물, 또는 부분적으로 싱글-스트랜드 ICAN 산물을 고정시키고자 하는 핵산으로서 바람직하게 사용할 수 있음을 확인하였다. 반면, 0.2 N NaOH중 65℃에서 30분동안 처리된 슬라이드 글래스의 경우 ICAN 산물 1에 대하여 관찰된 시그날 세기는 PCR 산물 1에 대하여 관찰된 것보다 실질적으로 낮았다. 이러한 저하는 실시예 1에서 입증된 변성 조건하에서 ICAN 산물중 포함된 리보뉴틀레오티드 부위의 분해에 기인하는 것으로 가정되었다.
두번째로, 처리되지 않은 슬라이드 글래스 및 ICAN 산물 1 및 PCR 산물 1과 관련하여 싱글 스트랜드 전환에 대한 처리를 갖는 슬라이드 글래스의 시그날 세기를 비교하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 0.2 N NaOH중 20℃에서 5분동안 알칼리 처리되고 열처리된 슬라이드 글래스에 대하여 관찰된 시그날 세기는 처리되지 않은 슬라이드 글래스에 대하여 관찰된 시그날 세기보다 높았다. 이 결과에 기초하여, 산물이 ICAN 산물이거나 PCR 산물이건 간에 싱글-스트랜드 형태의 산물의 고체상에서의 프로브를 포착하는 효율(즉, 하이브리드제이션 효율)은 더블-스트랜드 형태의 산물의 것보다 높은 것을 확인하였다. 또한, 0.2 N NaOH중 65℃에서 30분동안 처리된 슬라이드 글래스상의 PCR 산물 1 및 ICAN 산물 1의 스팟에 대하여 관찰된 시그날 세기가 비처리 슬라이드 글래스상에서의 것보다 높았다. 이는 리보뉴틀레오티드 부위의 분해(degradation)에 따른 분리에 기인한 핵산 양의 감소는 싱글 스트랜드로의 전환에 기인한 하이브리드제이션 효율의 증가에 의해 보상되기 때문이라고 가정되었다.
실시예 3
하이브리드제이션시 관찰된 시그날 세기를 실시예 2에 기술된 바와 같이 공유 결합에 의해 고체상위에 고정화된 싱글-스트랜드 또는 더블-스트랜드 ICAN 산물로 구성된 마이크로어레이 및 정전기 인력에 의해 고체상위에 고정화된 더블-스트랜드 PCR 산물을 갖는 통상의 마이크로어레이를 비교하였다.
통상의 마이크로어레이를 하기와 같이 제조하였다. 간단히, 실시예 2에서 증폭되고 정제된 각 ORFs에 대한 각각의 4가지 유형의 더블-스트랜드 핵산을 최종 농도 0.3μg/㎕로 0.05% 수크로오스 모노라울레이트를 포함하는 40 mM 카보네이트 완충액 (pH 9.5)에 용해시켰다. 각 샘플에 대하여 Affymetrix 417 Arrayer (Affymetrix)를 사용하여 도입된 활성 카복실 그룹을 갖는 슬라이드 글래스인 Mirus-E 슬라이드 글래스에 10개의 스팟을 스파팅하였다. 스파팅한 후, 슬라이드 글래스를 1시간동안 가습 인큐베이터내 37℃에서 인큐베이트한 후 60 mJ/cm2으로 UV 조사(irradiation)하였다. 슬라이드 글래스를 0.2% SDS 용액 이어서 증류수중에서 3회 세척하였다. 20분동안 차단액중 슬라이드 글래스를 적셔 유리 아미노 그룹을 차단하였다. 160 ml의 N-메틸-2-피롤리돈중 2.75 g의 숙신산 무수물을 용해시키고 그에 15 ml의 1 M 보레이트 완충액(pH 8.0)을 가하여 사용하기 직전에 차단액을 제조하였다. 최종적으로, 슬라이드 글래스를 증류수에서 2회 세척하고 원심분리하여 물을 제거하고 건조기에 저장하였다.
프로브로서 올리고뉴클레오티드를 사용하여 IntelliGene에 첨부된 설명서에 기술된 프로토콜에 따라 상기 기재된 바와 같이 제조된 통상의 마이크로어레이를 프리하이브리드제이션, 하이브리드제이션, 세척 및 건조시켰다. 올리고뉴클레오티드를 5' 말단에서 Cy5로 표지하고 이는 각 증폭 산물에 공통적으로 포함되는 pUC19 부위의 서열에 상보적인 서열번호:23의 서열을 가졌다. 이어서 Cy5에 대한 파장에서 스캐닝하여 형광 이미지를 얻었다. 각 스팟에 대한 시그날 및 주위 배경에 대한세기를 ImaGene 4.0를 사용하여 측량하였다. 배경 세기에 대한 시그날 세기의 비(이하, S/N 비로 언급함)를 계산하였다. Mirus-E 슬라이드 글래스와 MAS-코팅되 슬라이드 글래스를 비교하기 위하여 실시예 2중 표 2에 나타낸 결과에 대하여 계산하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.
표 3
표 3에 나타낸 바, 실시예 2에 기술된 바와 같이 싱글 스트랜드 전환을 위한 각각의 3가지 유형으로 처리되거나 처리되지 않은 슬라이드 글래스상의 ICAN 산물 1의 스팟에 대하여 관찰된 시그날 세기는 통상의 마이크로어레이상에서 PCR 산물의 스팟에 대하여 관찰된 것보다 단지 미세하게 낮았다. 이 결과에 기초하여, 공유 결합에 의해 싱글-스트랜드 또는 더블-스트랜드 ICAN 산물이 고정화된 고정된 핵산을 갖는 물질을 정전기 인력에 의해 더블-스트랜드 PCR 산물이 고정된 통상의 물질과 같은 마이크로어레이로서 바람직하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4
Pfu RNase HII 및 Pho RNase HII를 사용하여 수득한 ICAN 산물들의 성질을 연구하였다. ICAM 증폭을 하기와 같이 수행하였다. 간단히, 약 150-bp의 증폭된 단편을 수득하기 위하여 서열번호:49 및 50의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 "상부150" 및 "하부" 및 주형으로서 플라스미드 pUC19을 사용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 단편을 정제하고 플라스미드 pUC19내로 클로닝하여 ICAN 반응에서 주형으로서 사용된 플라스미드 DNA (pUC19-150으로 명명)을 수득하였다.
프라이머로서 프라이머들 ICAN(6)-M4 (서열번호:24) 및 ICAN(6)-RV (서열번호:25) 또는 ICANVFN3-M4 (서열번호:26) 및 ICANVFN3-RVM (서열번호:27)의 조합물을 사용하여 DNA 단편을 PCR 증폭시켰다. 주형으로서 상기 언급된 DNA 단편중 어느 하나 및 프라이머로서 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 ICAN(6) (서열번호:28) 또는 VFN3 (서열번호:29)를 사용하여 ICAN 반응을 하기와 같이 수행하였다.
(1) 100 pmol의 ICAN(6) 프라이머, 0.01% 프로필렌디아민, 및 프라이머들 ICAN(6)-M4 및 ICAN(6)-RV의 조합물을 사용하여 수득한 1㎕의 PCR 반응 혼합물 을 가하여 10㎕의 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 98℃에서 2분 및 60℃에서 1분동안 인큐베이션시킨 후 Thermal Cycler Personal (Takara Shuzo)을 사용하여 얼음위에 놓았다. 최종 농도 32 mM HEPES-수산화칼륨 완충액 (pH 7.8), 100 mM 아세트산칼륨, 1% 디메틸 설폭시드, 0.01% 소 혈청 알부민, 4 mM 아세트산 마그네슘, 500μM의 각각의 dNTPs, 및 0.0156μg의 Pfu RNase HII 및 2 U의 BcaBEST DNA 폴리머라제의 조합물 또는 5 U의 Pho RNase HII 및 8 U의 BcaBEST DNA 폴리머라제의 조합물을 포함하는 혼합물을 상기 언급된 혼합물에 가하여 혼합물 (최종 부피 50㎕)을 제조하였다. 반응 혼합물을 60℃으로 세팅된 Thermal Cycler에 놓고 60분동안 인큐베이션시켰다.
(2) 100 pmol의 프라이머 VFN3, 0.01% 프로필렌디아민, 및 프라이머들 ICANVFN3-M4 및 ICANVFN3-RVM의 조합물을 사용하여 수득한 1㎕의 PCR 반응 혼합물 을 가하여 10㎕의 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 98℃에서 2분 및 55℃에서 1분동안 인큐베이션시킨 후 Thermal Cycler Personal (Takara Shuzo)을 사용하여 얼음위에 놓았다. 최종 농도 32 mM HEPES-수산화칼륨 완충액 (pH 7.8), 100 mM 아세트산칼륨, 1% 디메틸 설폭시드, 0.01% 소 혈청 알부민, 4 mM 아세트산 마그네슘, 500μM의 각각의 dNTPs, 및 0.0312μg의 Pfu RNase HII 및 4 U의 BcaBEST DNA 폴리머라제의 조합물 또는 5 U의 Pho RNase HII 및 8 U의 BcaBEST DNA 폴리머라제의 조합물을 포함하는 혼합물을 상기 언급된 혼합물에 가하여 혼합물 (최종 부피 50㎕)을 제조하였다. 반응 혼합물을 55℃으로 세팅된 Thermal Cycler에 놓고 60분동안 인큐베이션시켰다.
(3) 또한, 대조군으로서 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) RNase H를 사용하여 반응을 수행하였다. 특히, 30 U의 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) RNase H 및 5.5 U의 BcaBEST DNA 폴리머라제를 사용한 것을 제외하고 상기 (1) 및 (2)의 것과 유사한 조성을 갖는 반응 혼합물을 제조하고 사용하였다.
반응 후, 1.5㎕의 각각의 반응 혼합물을 3% NuSieve 3:1 Agarose (TakaraShuzo)상에서 전기영동시켜 증폭 산물을 확인하였다. 증폭 산물의 예측 크기는 약 300 bp였다. 증폭 산물을 확인한 후, 반응 혼합물을 Microcon-100 스핀 칼럼(Takara Shuzo)을 사용하여 정제하고 흡광 광도계를 사용하여 정제된 용액중의 농도를 측정하였다.
그렇게 수득한 1μg의 정제된 ICAN 산물을 튜브에 놓고 알칼리 처리를 위해 NaOH 용액 (최종 농도 1 N으로)을 60℃에서 1시간동안 가하였다. 처리후, 6㎕ 의 각 혼합물을 4% 변성 아크릴아미드 겔상에서 전기영동시켰다.
전기영동시 ICAN 산물에 대하여 3개의 밴드, 즉, 양 말단에 프라이머들을 갖는 것, 한쪽 말단에는 프라이머를 갖는 것 및 프라이머를 갖지 않는 것이 관찰되었다. 알칼리 처리되지 않은 산물과 비교하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) RNase H 및 프라이머 ICAN(6) 또는 VFN3를 사용하여 수득된 양 말단에 프라이머들을 갖는 ICAN 산물은 알칼리 처리시 소멸되었음을 확인하였다. 한편, 비처리군와 산물과 비교하여 Pfu RNase HII 또는 Pho RNase HII 및 프라이머 ICAN(6) 또는 VFN3을 사용하여 수득한 ICAN 산물은 알칼리 처리시 변화가 없었다.
상기 기재된 바와 같이, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) RNase H를 사용하여 수득한 ICAN 산물은 ICAN을 위해 사용된 키메라성 프라이머로부터 유래된 RNA 부위를 포함하지만, Pfu RNase HII 또는 Pho RNase HII를 사용하여 수득한 ICAN 산물은 상기 RNA 부위를 포함하지 않음을 확인하였다.
실시예 5
(1) PCR에 의한 ICAN 반응을 위한 주형의 제조
마우스의 뇌 polyA+ RNA (OriGene) 및 cDNA 합성용 키트(Takara Shuzo)를 사용하여 더블-스트랜드 cDNA를 제조하였다. 서열번호:30 내지 43의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로부터 선택되는 프라이머의 조합물 및 주형으로서 더블-스트랜드 cDNA를 사용하여 증폭된 PCR 단편을 pT7 Blue T-벡터 (Takara Shuzo)내로 TA 클로닝하여 플라스미드 클론을 수득하였다. 1㎕의 플라스미드 클론 (1 ng), 서열번호:44 및 45의 뉴클레오티드 서열을 갖는 10 pmol의 각 프라이머들 MCS-F 및 MCS-R, 1.25 U의 Ex Taq (Takara Shuzo), 5㎕의 10 x Ex Taq 완충액(Takara Shuzo) 및 0.2 mM의 각 dNTPs를 포함하는 50㎕의 혼합물을 TaKaRa PCR Thermal Cycler Personal (Takara Shuzo)를 사용하여 하기와 같이 반응시켰다: 94℃에서 2분; 94℃에서 30 초, 55℃에서 30 초 및 72℃에서 1 분으로 30회. 그렇게 수득한 증폭된 DNA 단편을 ICAN 반응에서 주형으로서 사용하였다.
(2) 주형으로서 PCR 산물을 사용하여 ICAN 방법에 의한 DNA 단편의 증폭
아미노알릴 dUTP (Sigma)을 사용하여 ICAN 반응을 수행함으로써 아미노 그룹을 ICAN 증폭 산물에 도입하였다. 하기와 같이 아미노알릴 dUTP의 양에 대한 dTTP의 양의 비를 다양하게 하여 ICAN 반응을 수행함으로써 ICAN 증폭 산물내로 도입된 아미노 그룹의 비를 조사하였다: 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4. 반응을 하기와 같이 수행하였다.
상기 (1)에서 제조된 1㎕의 PCR 반응 혼합물, 서열번호:47 및 48의 뉴클레오티드 서열을 갖는 50 pmol의 각 프라이머들 MF2N3(24) 및 MR1N3(24) 및 2㎕의 0.05% 프로필렌디아민 수용액을 포함하는 10㎕의 혼합물을 제조하였다. TaKaRa PCRThermal Cycler Personal을 사용하여 혼합물을 98℃에서 2분 및 65℃에서 30초동안 가열한 후 얼음상에서 급속하게 냉각시켜 프라이머들을 주형에 어닐링하였다. 0.625 mM의 각 dATP, dCTP 및 dGTP, 0.625 mM의 dTTP + 아미노알릴 dUTP 혼합물, 32 mM Hepes-수산화칼륨 완충액 (pH 7.8), 5.0 mM 아세트산 마그네슘, 0.6 U의 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) RNase H (Takara Shuzo), 2.75 U의 BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하는 40㎕의 반응 혼합물을 가열된 혼합물에 가하였다. thermal cycler을 사용하여 반응 혼합물을 65℃에서 1시간동안 인큐베이션시켰다.
50㎕의 이소프로판올 및 5㎕의 3 M 아세트산 나트륨 용액 (pH5.2)을 50㎕의 반응 혼합물에 가하였다. -80℃에서 20분동안 방치한 후, 혼합물을 원심분리하고 현탁액을 제거하였다. 연속하여, 200㎕의 70% 에탄올 용액을 그에 가하고, 혼합물을 원심분리하고, 현탁액을 제거하고 침전물을 대기 건조시켰다. 그렇게 수득한 DNA를 물중에 재 용해시키고 산물의 양을 OD260/280에 의해 측정하였다.
(3) 아미노알릴 dUTP의 ICAN 증폭 산물내로의 도입 확인
5-카복시플루오레슨 숙신이미딜 에스테르(Molecular probes)를 사용하여 ICAN 산물중 아미노 그룹을 형광-표지하여 아미노알릴 dUTP의 ICAN 증폭 산물내로의 도입을 확인하였다. 일부의 DNA 용액을 2μg/50㎕의 농도를 희석시켰다. 20㎕의 1 M 탄산나트륨 완충액 (pH 9.0)을 가한 후 N,N-디메틸포름아미드중 10mM 농도의 FITC (Nacalai Tesque)을 포함하는 4㎕의 용액을 가하였다. 혼합물을 20℃에서 16시간동안 반응시켰다. 상업적으로 이용가능한 스핀 칼럼을 사용하여 과량 FITC를제거한 후, 10㎕의 혼합물을 2.0% 아가로스겔에 적용시키고 전기영동시켰다. 전기영동후, FM-BIO를 사용하여 형광 염색을 확인하고, EtBr로 염색한 후 ICAN-증폭된 단편을 확인하였다. 결과, 아미노알릴 dUTP를 사용하는 ICAN을 수행하여 ICAN 증폭 산물내로 아미노 그룹을 도입할 수 있음을 확인하였다.
(4) DNA 마이크로어레이내로 도입된 아미노알릴 dUTP를 갖는 ICAN 산물의 적용
도입된 아미노 그룹을 갖는 ICAN 산물을 HPRT 유전자에 대하여 상기 기술된 바와 유사한 방식으로 6개의 마우스 유전자(리보솜 유전자 S18, 트랜스페린 수용체, 간질세포 유도 인자 4, 세포질 베타-액틴, 오르니틴 데카복실라제, 티로신 3-모노옥시게나제)에 대하여 제조하였다. 9μg의 DNA에 상응하는 각 용액을 96-웰 에세이 블락(Advanced BIOTECHNOLOGIES)의 웰에 놓고 동결시켰다. ICAN 산물을 사용하여 DNA 마이크로어레이를 하기와 같이 제조하였다. 간단히, ICAN 산물을 0.1% 수크로오스 모노라울레이트을 포함하는 40 mM 카보네이트 완충액 (pH 9.5)중 0.3μg/㎕의 최종 농도로 용해시켰다. 각 샘플에 대하여 Affymetrix 417 Arrayer (Affymetrix)를 사용하여 도입된 활성 카복실 그룹을 갖는 슬라이드 글래스인 Mirus-E 슬라이드 글래스에 2개의 스팟을 스파팅하였다. 스파팅한 후, 슬라이드 글래스를 0.2% SDS 및 증류수에서 2회 세척하였다. 슬라이드 글래스를 하기와 같은 4개 유형의 조건하에서 처리하였다:
1. 대조군: 증류수에서 세척한 슬라이드 글래스를 저속 원심분리에 의해 건조시켰다;
2. 0.2 N NaOH (20℃): 슬라이드 글래스를 0.2 N NaOH중 20℃에서 5분동안 처리하고 증류수에서 5분동안 세척한 후 건조시켰다;
3. 0.2 N NaOH (65℃): 슬라이드 글래스를 0.2 N NaOH중 65℃에서 30 분동안 처리하고 증류수에서 5분동안 세척한 후 건조시켰다;
4. 슬라이드 글래스를 가열(비등수에서 3분동안)하고, 빙냉 99.5% 에탄올에서 신속하게 냉각시킨 후 건조시켰다.
변성 후 ICNA 산물의 DNA 마이크로어레이를 프로브로서 5'말단에서 Cy5로 표지된 올리고뉴클레오티드(서열번호 45)를 사용하여 IntelliGene에 첨부된 설멸ㅇ서에 기술된 바와 같은 프로토콜에 따라 프리하이브리드제이션, 하이브리드제이션, 세척 및 건조를 하였다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 ICAN 프라이머 MF2N3(24)로부터 신장된 ICAN 증폭 산물의 스트랜드중 공통적으로 포함된 벡터 부분에 상보적인 서열을 가졌다. 이어서 Cy5에 대한 파장에서 슬라이드 글래스 스캐닝을 수행하여 형광 이미지를 수득하였다. 각 스팟에 대한 시그날 세기를 ImaGene 4.0을 사용하여 측정하였다. 결과를 표 4 내지 10에 나타낸다. 표 4 내지 10은 혼합된 dTTP 및 아미노알릴 dUTP의 비, 각각의 처리후 측정된 DNA 마이크로어레이로부터의 형광 시그날(표중 "시그날") 및 NH2비(표 중 "NH2"; 아미노알릴 dUTP이 없는 혼합물을 사용하여 측정된 형광 시그날을 1로서 정의하고, 각각의 비의 혼합물을 사용하여 측정된 형광 시그날 값)을 나타낸다.
표 4
표 5
표 6
표 7
표 8
표 9
표 10
표 4 내지 10에 나타낸 바와 같이, 약한 시그날은 통상 변성이 없는 것에서 관찰되었고, 이는 프로브와 비효율적으로 하이브리제이션하였음을 확인하였다. 그러나 아미노알릴 dUTP를 사용하여 ICAN 반응을 수행함으로써 수득한 산물에 대하여 관찰된 시그날 세기는 아미노알릴 dUTP를 포함하지 않는 산물에 대하여 관찰된 것보다 높았다. 시그날 세기은 아미노알릴 dUTP의 함량이 증가됨에 따라 증가하였다. 이 결과는 도입된 아미노 그룹의 존재가 ICAN-증폭 핵산을 고체상에 고정화하는 효율을 증가시킨다는 것을 제안하였다.
변성이 있는 경우 관찰된 시그날 세기가 변성되지 않은 것에서의 것보다 높았다. 따라서, 프로브에 대한 하이브리드제이션의 효능은 변성에 의해 증가될 수 있음을 확인하였다. 시그날 세기는 하기 순서로 증가하였다: 0.2 N NaOH (20℃) < 열 처리 < 0.2 N NaOH (65℃). 0.2 N NaOH중 65℃에서 30분동안 알칼리 처리가 폴리뉴클레오티드에 대하여 바람직하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 변성이 없는경우 관찰된 바, 아미노알릴 dUTP를 사용하여 ICAN 반응을 수행함으로써 수득한 산물에 대하여 관찰된 시그날 세기는 아미노알릴 dUTP를 포함하지 않는 산물에 대하여 관찰된 것보다 높았다. 시그날 세기는 아미노알릴 dUTP의 함량이 증가됨에 따라 증가하였다. 결과에 기초하여 도입된 아미노 그룹의 존재가 ICAN-증폭 핵산을 슬라이드 글래스에 고정화시키는 효율을 증가시키고 고정 효율은 도입되는 아미노 그룹의 함량이 증가됨에 따라 증가한다는 것을 확인하였다.
실시예 6
실시예 1에서 발견한 변성 조건을 사용하여 ICAN 방법에 의해 증폭된 실제 더블 스트랜드 핵산이 고정된 어레이에 대하여 연구하였다. 5' 말단 측 및/또는 3' 말단측상의 DNA 부위(들)내로 도입된 아미노 그룹(들)을 갖는 5'-DNA-RNA-DNA-3'의 형태의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 연구에 사용하였다.
(1) PCR에 의한 ICAN 반응을 위한 주형의 제조
마우스의 뇌 polyA+ RNA (OriGene) 및 cDNA 합성용 키트(Takara Shuzo)를 사용하여 더블-스트랜드 cDNA를 제조하였다. 주형으로서 더블-스트랜드 cDNA 및 하기 3쌍의 PCR용 프라이머 마우스 리보솜 유전자 S18 F 및 R (서열번호: 53 및 54); 마우스 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 F 및 R (서열번호: 55 및 56); 및 마우스 β-액틴 F 및 R (서열번호: 57 및 58)중 하나를 사용하여 340-bp 증폭 산물을 PCR 방법에 의해 제조하였다. 이어서 주형으로서 증폭 산물 및 서열번호: 59 및 60의 뉴클레오티드 서열을 갖는 PCR용 한쌍의 프라이머를 사용하여 422-bp 증폭 산물을 제조하였다. 그렇게 수득한 증폭된 DNA 단편을 ICAN 반응에서 주형으로서 사용하였다.
(2) 주형으로서 PCR 산물을 사용하여 ICAN 방법에 의한 DNA 단편의 증폭
서열번호:61 및 62의 뉴클레오티드 서열을 갖는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머들 ICAN(2) 및 ICAN(6)6dN-M4를 합성하였다. 프라이머들 및 도입된 아미노 그룹의 위치를 표 11에 나타낸다.
표 11
예를 들면, 표 11에서 NH2-ICAN(6)6dN-M4 25T-NH2/ ICAN(2)는 5' 말단에 첨가된 아미노 그룹 및 25번째 위치에서 "T"를 갖는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 ICAN(2) 및 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 ICAN(6)6dN를 나타낸다. 100pmol의 각 쌍의 프라이머, 주형으로서 상기 (1)에 기술된 바와 같은 100 ng의 PCR 증폭 산물 및 프로필렌디아민을 포함하는 10㎕의 혼합물을 최종 농도 0.01%으로 제조하였다. 혼합물을 98℃에서 2분동인 인큐베이션시킨 후 얼음상에 놓았다. 상기 혼합물 및 최종 농도 28 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.8), 100 mM 아세트산칼륨, 0.01% 소 혈청 알부민 (BSA), 1% 디메틸 설폭시드, 4 mM 아세트산 마그네슘, 0.5 mM 각각의 dNTPs, 8 U의 BcaBEST DNA 폴리머라제 (Takara Shuzo) 및 참고 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된 5 U의 Pho RNase HII를 포함하는 반응 혼합물 (최종부피 50㎕)을 제조하였다. 반응 혼합물을 균일하게 혼합하고 60℃에서 60분동안 인큐베이션시켰다.
50㎕의 이소프로판올 및 5㎕의 3 M 아세트산 나트륨 용액 (pH5.2)을 50㎕의 반응 혼합물에 가하였다. 실온에서 20분동안 방치한 후, 혼합물을 원심분리하고 현탁액을 제거하였다. 연속하여, 200㎕의 70% 에탄올 용액을 그에 가하고, 혼합물을 원심분리하고, 현탁액을 제거하고 침전물을 대기 건조시켰다. 그렇게 수득한 DNA를 물중에 재 용해시키고 산물의 양을 OD260/280에 의해 측정하였다.
(3) ICAN 증폭 산물을 사용한 DNA 어레이의 제조
0.1% 수크로오스 모노라울레이트을 포함하는 40 mM 카보네이트 완충액 (pH 9.5)중 ICAN 산물을 0.3μg/㎕의 최종 농도로 용해시켰다. 각 샘플에 대하여 Affymetrix 417 Arrayer (Affymetrix)를 사용하여 도입된 활성 카복실 그룹을 갖는 슬라이드 글래스인 Mirus-E 슬라이드 글래스에 3개의 스팟을 스파팅하였다. 스파팅한 후, 슬라이드 글래스를 0.2% SDS 및 증류수에서 2회 세척하였다. 건조시킨 후 슬라이드 글래스를 실시예 2(2)에 기술된 바와 같이 처리하였다 .
(4) 하이브리드제이션 및 검출
형광-표지된 cDNA는 마우스 총 RNA 및 RNA Fluorescence Labeling Core Kit (M-MLV Version) (Takara Shuzo)를 사용하여 제조하였다. 프로브로서 올리고뉴클레오티드를 사용하여 IntelliGene에 첨부된 설명서에 기술된 프로토콜에 따라 프리하이브리드제이션, 하이브리드제이션, 세척 및 건조를 수행하였다. 이어서 Cy5에 대한 파장에서 스캐닝하여 형광 이미지를 얻었다. 각 스팟에 대한 시그날 및 주위 배경에 대한 세기를 ImaGene 4.0를 사용하여 측량하였다. 결과 고정시키고자 하는 핵산의 이용률은 아미노 그룹을 도입함으로써 증가될 수 있고, 이로써 고도의 높은 고정화 효율로 증폭 핵산을 고정화시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 특히, DNA-RNA-DNA 형태의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하고자 하는 경우 고정화되는 핵산의 이용률은 5'-말단 측 및 3'-말단측 상의 DNA 부위에 아미노 그룹을 도입하여 증가된다는 것을 확인하였다.
산업상 이용 가능성
본 발명에 따라 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 핵산 증폭 반응을 사용하여 고체상위에 고정화시키기 위한 증폭 핵산을 대량으로 제공할 수 있다. 증폭 핵산중 또는 그의 말단에 도입되는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 사용하여 고체상에 고정될 수 있는 증폭 핵산이 본 발명에 따라 제공될 수 있다. 추가로, 리보뉴틀레오티드를 포함하거나 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 고정된 싱글-스트랜드 핵산을 갖는 물질은 본 발명의 방법에 따라 제공될 수 있다. 증폭 핵산이 고정된 고감도의 물질을 저렴한 비용으로 본 발명의 방법에 따라 제공할 수 있다.
서열 목록 프리 텍스트
서열번호:2: 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)으로부터의 RNase H를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 1650Nde.
서열번호:3: 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)으로부터의 RNaseH를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 1650Bam
서열번호:6: 고안된 올리고뉴클레오티드.
서열번호:7: 고안된 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 19는 리보뉴틀레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호:8: 고안된 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 19 내지 20은 리보뉴틀레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호:9: 고안된 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴틀레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호:10: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 숙신네이트 데하이드로게나제-코딩 서열의 일부를 갖는 고안된 올리고뉴클레오티드.
서열번호:11: ICAN(6) 서열을 검출하기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프로브-1.
서열번호:12: M13-47 서열을 검출하기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프로브.
서열번호:13: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K-12 W3110으로부터 131#6 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호:14: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K-12 W3110으로부터 131#6 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호:15: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K-12 W3110으로부터 214#1 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호:16: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K-12 W3110으로부터 214#1 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호:17: pUC19 플라스미드 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:18: pUC19 플라스미드 DNA 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호:19: ICAN(6)로 명명되는 고안된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 20은 리보뉴틀레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호:20: ICAN(2)로 명명되는 고안된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 to 20 are 리보뉴틀레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호:21: pUC19 플라스미드 DNA를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호:22: pUC19 플라스미드 DNA를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호:23: pUC19 플라스미드 DNA를 검출시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호:24: ICAN(6)-M4로 명명되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호:25: ICAN(6)-RV로 명명되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호:26: ICANVFN3-M4로 명명되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호:27: ICANVFN3-RVM로 명명되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호:28: ICAN(6)로 명명되는 고안된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 20은 리보뉴틀레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호:29: VFN3로 명명되는 고안된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴틀레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호:30: 마우스로부터의 리보솜 유전자 S18-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:31: 마우스로부터의 리보솜 유전자 S18-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:32: 마우스로부터의 트랜스페린 수용체 (TFR)-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:33: 마우스로부터의 트랜스페린 수용체 (TFR)-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:34: 마우스로부터의 간질세포 유도 인자 4 (Sdf4)-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:35: 마우스로부터의 간질세포 유도 인자 4 (Sdf4)-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:36: 마우스로부터의 세포질 베타-액틴-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:37: 마우스로부터의 세포질 베타-액틴-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:38: 마우스로부터의 오르니틴 데카복실라제-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:39: 마우스로부터의 오르니틴 데카복실라제-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:40: 마우스로부터의 하이폭사틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(HPRT)-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:41: 마우스로부터의 하이폭사틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(HPRT)-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:42: 마우스로부터의 티로신 3-모노옥시게나제-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:43: 마우스로부터의 티로신 3-모노옥시게나제-코딩 서열 일부를 증폭시키기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:44: MCS-F로 명명되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호:45: MCS-R로 명명되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:46: MF2N3(24)로부터의 신장된 산물의 일부를 검출하기 위한 고안된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열번호:47: MF2N3(24)로 명명되는 고안된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 22 내지 24는 리보뉴크레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호:48: MR1N3(24)로 명명되는 고안된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 22 내지 24는 리보뉴크레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호:49: pUC19 플라스미드 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 상부150로 명명되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:50: pUC19 플라스미드 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 하부으로 명명되는 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호:53: 마우스로부터의 리보솜 유전자 S18 코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머
서열번호:54: 마우스로부터의 리보솜 유전자 S18 코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머
서열번호:55: 마우스로부터의 글루세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머
서열번호:56: 마우스로부터의 글루세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머
서열번호:57: 마우스로부터의 베타-액틴 코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머
서열번호:58: 마우스로부터의 베타-액틴 코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머
서열번호:59: ICAN용 주형을 제조하기 위한 PCR 프라이머
서열번호:60: ICAN용 주형을 제조하기 위한 PCR 프라이머
서열번호:61: ICAN(2)으로 명명되는 고안된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 20는 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호:62: ICAN(6) 6dN-M4으로 명명되는 고안된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 20는 리보뉴클레오티드이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".

Claims (20)

  1. (a) 주형으로서의 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고, 여기에서 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 일부는 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트이고/거나 데옥시리보뉴클레오티드는 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드이고;
    b) 반응 혼합물을 반응 산물이 생성될 수 있는 충분한 시간동안 인큐베이션시키는 것을 포함하는 핵산 증폭 방법에 의해 수득된, 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 증폭 핵산.
  2. 제 1항에 있어서, 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드는 고체상위에서 작용 그룹에 공유결합할 수 있는 작용 그룹을 갖는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드인 증폭 핵산.
  3. 제 1항에 있어서, 반응 혼합물이 추가로 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드서열에 실질적으로 상동성인 서열을 갖는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 증폭 핵산.
  4. 제 1항에 있어서, 데옥시리보뉴클레오티드의 일부가 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드인 증폭 핵산.
  5. 제 1항에 있어서, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 일부가 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트인 증폭 핵산.
  6. 제 1항에 있어서, 리보뉴클레오티드를 포함하는 증폭 핵산.
  7. 제 1항에 있어서, 리보뉴클레오티드를 포함하지 않는 증폭 핵산.
  8. 제 1항에 있어서, RNase H가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase H, 써모토가(Thermotoga) 속 세균으로부터의 RNase H, 써무스(Thermus) 속 세균으로부터의 RNase H, 피로코쿠스(Pyrococcus)속 세균으로부터의 RNase H 및 바실러스 (Bacillus) 속 세균으로부터의 RNase H으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 증폭 핵산.
  9. 제 1항에 있어서, RNase H가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 I형 RNase H인 증폭 핵산.
  10. 제 1항에 있어서, RNase H가 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 또는 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii)로부터의 II형 RNase H인 증폭 핵산.
  11. 제 1항에 정의된 증폭 핵산이 고체상위의 미리 정해진 영역에 고정화되고 배열된 고정화된 증폭 핵산을 갖는 물질.
  12. 제 11항에 있어서, 증폭 핵산이 공유 결합에 의해 고정화된 물질.
  13. (a) 주형으로서의 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 두개의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고, 여기에서 하나의 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고, 데옥시리보뉴클레오티드의 일부는 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드이고, 또 하나의 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상동성이고 고체상위에고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하지 않는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고;
    b) 반응 혼합물을 반응 산물이 생성될 수 있는 충분한 시간동안 인큐베이션시키고;
    (c) 단계 (b)에서 수득한 증폭 핵산을 고체상위의 미리 정해진 영역에 고정화하고 배열시키고;
    (d) 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하지 않는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 신장된 스트랜드만을 분리하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득된, 고정화된 증폭 핵산을 갖는 물질.
  14. 제 13항에 있어서, 단계 (c)에서 증폭 핵산이 공유 결합에 의해 결합되는 물질.
  15. 하기 일반식을 갖는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머:
    일반식: 5'-dNa-Nb-dNc-3'
    (a: 11이상의 정수; b: 1이상의 정수; c: 0 또는 1이상의 정수; dN: 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드 유사체; 여기에서, dNa중 적어도 하나는 고체상위에서 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드이고; N: 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드(여기에서, dNa중 일부의 dNs는 Ns로 대체될 수 있다)).
  16. 제 15항에 있어서, c가 0인 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  17. 제 15항에 있어서, 데옥시뉴클레오티드 유사체는 데옥시리보이노신 뉴클레오티드이고 변형된 리보뉴클레오티드는 (α-S) 리보뉴클레오티드인 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  18. (a) 주형으로서의 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고, 여기에서 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 일부는 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트이고/거나 데옥시리보뉴클레오티드는 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드이고;
    b) 반응 혼합물을 반응 산물이 생성될 수 있는 충분한 시간동안 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 증폭 핵산을 제조하는 방법.
  19. (a) 주형으로서의 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고, 여기에서 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 일부는 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트이고/거나 데옥시리보뉴클레오티드는 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드이고;
    b) 반응 혼합물을 반응 산물이 생성될 수 있는 충분한 시간동안 인큐베이션시키고;
    c) 단계 b)에서 수득한 증폭 핵산을 고체상위의 미리 정해진 영역에 고정화하고 배열시키는 것을 포함하는, 고정화된 증폭 핵산을 갖는 물질을 생산하는 방법.
  20. (a) 주형으로서의 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 두개의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고, 여기에서 하나의 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 리보뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하고, 데옥시리보뉴클레오티드의 일부는 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드이고, 또 하나의 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상동성이고 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하지 않는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고;
    b) 반응 혼합물을 반응 산물이 생성될 수 있는 충분한 시간동안 인큐베이션시키고;
    (c) 단계 (b)에서 수득한 증폭 핵산을 고체상위의 미리 정해진 영역에 고정화하고 배열시키고;
    (d) 고체상위에 고정화되기 위하여 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하지 않는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 신장된 스트랜드만을 분리하는 것을 포함하는, 고정화된 증폭 핵산을 갖는 물질을 제조하는 방법.
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