JP2007252373A - インバースpcr方法に用いる鋳型dna鎖の生産方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】インバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖の生産方法を提供する。
【解決手段】標的DNA配列を有するDNA鎖、DNAポリメラーゼ、少なくとも1残基のLNAを有するオリゴヌクレオチドおよび4種のdNTPを少なくとも含む系において、上記DNA鎖を鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして、プライマー伸長反応をさせる工程、を包含することを特徴とする方法により、インバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖を生産する。
【選択図】図1
【解決手段】標的DNA配列を有するDNA鎖、DNAポリメラーゼ、少なくとも1残基のLNAを有するオリゴヌクレオチドおよび4種のdNTPを少なくとも含む系において、上記DNA鎖を鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして、プライマー伸長反応をさせる工程、を包含することを特徴とする方法により、インバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖を生産する。
【選択図】図1
Description
本発明は、遺伝子工学の分野に関し、より詳しくはインバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖の生産方法に関する。
有用な酵素や化合物を生態系から取得する場合、通常はまず、目的の酵素や化合物を産生する微生物の分離および培養を行う。しかし、生態系中の微生物群は、複雑に相互作用しており、分離および培養が困難な場合が多い。そこで、未知微生物を分離および培養することなく、未知微生物を含む土壌または海水などから直接DNAを回収し、当該環境試料中に含まれる生物のゲノムDNAを網羅する環境DNA(eDNA(Environmental DNA)またはメタゲノムとも呼ばれる)を調製し、これから直接目的とする酵素などの遺伝子を取得する環境DNAの利用に関する技術が近年注目を集めている。
環境DNAなどの試料中に含まれるDNAを利用する場合、まず目的とするDNA配列を増幅する必要があるが、このための方法としてはポリメラーゼ連鎖反応(以下、「PCR」と略す。例えば、特許文献1および2を参照のこと)を利用する方法が有用である。
PCR方法については種々の改良が試みられており、PCR方法に使用するプライマーは従来DNAのみから構成されていたが、近年では、相補鎖に対する熱安定性に優れたLNA(Locked nucleic acid)残基を有するプライマーの使用が試みられている。LNA残基を有するプライマーは、等温核酸増幅反応でのバックグラウンドシグナルを抑制するための方法において利用できることが開示されている(例えば、特許文献3を参照のこと)。
PCR方法については種々の改良が試みられており、PCR方法に使用するプライマーは従来DNAのみから構成されていたが、近年では、相補鎖に対する熱安定性に優れたLNA(Locked nucleic acid)残基を有するプライマーの使用が試みられている。LNA残基を有するプライマーは、等温核酸増幅反応でのバックグラウンドシグナルを抑制するための方法において利用できることが開示されている(例えば、特許文献3を参照のこと)。
環境DNAなどの試料から有用な遺伝子などを取得する際に、既知のDNA配列の周辺領域の未知のDNA配列について、増幅が必要とされる場合がある。このような場合、PCRを用いる方法の中でも、既知のDNA配列領域から、当該領域に隣接する未知のDNA配列領域の方向に、伸長反応するように設計されたプライマーを用いて、未知のDNA配列を増幅するインバースPCR方法(例えば、非特許文献1を参照のこと)が特に有用である。
しかし、インバースPCR方法は、選択的増幅の対象とするDNA配列(本発明中において、「標的DNA配列」と略す)を増幅するために、鋳型として用いる標的DNA配列を有するDNA鎖(「標的DNA鎖」と略す)を、DNA試料中に大量に必要とするという問題点を有している。
なお、本発明において「DNA試料」というときは、インバースPCR方法または本発明のインバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖の生産方法に用いる標的DNA鎖を含む試料のことを意味するものとする。
なお、本発明において「DNA試料」というときは、インバースPCR方法または本発明のインバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖の生産方法に用いる標的DNA鎖を含む試料のことを意味するものとする。
前記の環境DNAは、環境中のさまざまな生物のゲノムDNAを網羅する非常に有用な資源であるが、その中に含まれる標的DNA鎖のコピー数はごくわずかであることが多い。このため、環境DNAにインバースPCR方法を適用し標的DNA配列を増幅させることは非常に困難であり、環境DNAにインバースPCR方法を適用して未知遺伝子を取得する試みはほとんど行われていない。また、環境DNA以外の試料をDNA試料として使用する場合においても、その中に含まれる標的DNA鎖のコピー数に制限されずに、インバースPCR方法を適用して未知遺伝子などの標的DNA配列を増幅することが望まれている。
従って、本発明の目的は、DNA試料中に含まれる標的DNA鎖のコピー数が従来のインバースPCR方法により標的DNA配列を増幅できる下限値よりも少ない場合であっても、インバースPCR方法により標的DNA配列を増幅することを可能とするために、当該標的DNA鎖から、インバースPCR方法に用いる標的DNA配列を有する鋳型DNA鎖の生産方法およびそれに用いるキットを提供することにある。また、当該生産方法により生産されたDNA鎖をインバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖として使用し、標的DNA配列を増幅させる方法もまた、本発明の目的である。
具体的には、本発明は、以下に掲げるものである。すなわち、本発明は、標的DNA鎖、DNAポリメラーゼ、少なくとも1残基のLNAを有するオリゴヌクレオチドおよび4種のdNTPを少なくとも含む系において、上記標的DNA鎖を鋳型とし、該オリゴヌクレオチドをプライマーとして、プライマー伸長反応をさせる工程を包含することを特徴とするインバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖の生産方法を提供する。
上記本発明の生産方法においては、前記標的DNA鎖が、環状DNAであること;前記DNAポリメラーゼが、鎖置換活性を有すること;前記オリゴヌクレオチドが、2〜4残基のLNAを有し、6〜12塩基長であること;および前記標的DNA鎖が、環境DNAから得られるものであることが好ましい。さらに前記鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼは、Phi29 DNAポリメラーゼまたはBst DNAポリメラーゼであることが、特に好ましい。
また、本発明は、Phi29 DNAポリメラーゼ、少なくとも1残基のLNAを有するオリゴヌクレオチドおよび4種のdNTPを少なくとも含むことを特徴とする、前記本発明の生産方法に用いるキットを提供する。
また本発明は、(a)標的DNA配列を有する標的DNA鎖、DNAポリメラーゼおよび少なくとも1残基のLNAを有するオリゴヌクレオチドを少なくとも含む系において、上記標的DNA鎖を鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして、プライマー伸長反応をさせる工程、および(b)工程(a)で得られたプライマー伸長反応産物を鋳型として、インバースPCR方法により上記標的DNA配列を増幅する工程を包含することを特徴とする、試料中の標的DNA配列を増幅する方法を提供する。
また本発明は、(a)標的DNA配列を有する標的DNA鎖、DNAポリメラーゼおよび少なくとも1残基のLNAを有するオリゴヌクレオチドを少なくとも含む系において、上記標的DNA鎖を鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして、プライマー伸長反応をさせる工程、および(b)工程(a)で得られたプライマー伸長反応産物を鋳型として、インバースPCR方法により上記標的DNA配列を増幅する工程を包含することを特徴とする、試料中の標的DNA配列を増幅する方法を提供する。
本発明者らは、DNA試料中に含まれる標的DNA鎖のコピー数が従来のインバースPCR方法により標的DNA配列を増幅できる下限値よりも少ない場合であっても、インバースPCR方法により標的DNA配列を増幅することを可能とする方法について鋭意検討を行った。その過程で本発明者らは、図1(a)に示す従来のインバースPCR方法のようにDNA試料中に含まれる標的DNA鎖を、インバースPCR方法による増幅反応のための鋳型として直接用いるのではなく、図1(b)に示すように、まず、第1の増幅工程でDNA試料中の標的DNA鎖(第1の鋳型DNA鎖)を増幅し、次いで第2の増幅工程でその増幅産物をインバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖(第2の鋳型DNA鎖)として使用することにより標的DNA配列を増幅するという方法を想到するに至った。この方法を達成するため、使用するDNAポリメラーゼやプライマー等について種々の検討を行った。
本発明者らは、まず、第1の増幅工程において使用するプライマー(第1のプライマー)について検討した。従来のPCR方法でプライマーとして用いられる20〜40塩基長のDNAオリゴマーは、環状DNAを鋳型とし、鎖置換活性を持つポリメラーゼによる増幅を行う際のプライマーとして用いる場合、増幅効率はあまり高くないという報告がある。また、環状DNAを鋳型としPhi29 DNAポリメラーゼのような鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して増幅する場合、通常6塩基長のDNAからなるランダムオリゴマーがプライマーとして用いられるが、この6塩基長のDNAオリゴマーは、鋳型DNA鎖に対するアニーリング効率が極めて低いという問題点がある。
そこで、本発明者らは、第1のプライマーとして、少なくとも1残基のLNAを有するオリゴヌクレオチドを使用して、インバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖を生産し、次いで当該DNA鎖をインバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖として用いて標的DNA配列を増幅する方法を開発し、本発明の完成に至った。
本発明の鋳型DNA鎖の生産方法を用いれば、DNA試料中の標的DNA鎖のコピー数が、従来のインバースPCR方法により増幅できる下限値よりも少ない場合であっても、当該試料から、インバースPCR方法により標的DNA鎖中の標的DNA配列を増幅することが可能な、インバースPCR用の鋳型DNA鎖を提供することができる。
また、本発明の応用として、環境DNA中から未知の有用遺伝子を培養を介さずに直接取得することができる。
また、本発明の応用として、環境DNA中から未知の有用遺伝子を培養を介さずに直接取得することができる。
次に、好ましい実施の形態を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
なお、本発明において「標的DNA配列」とは、特に明記されない限り、通常のPCR方法またはインバースPCR方法により選択的に増幅されるDNA配列のことを意味する。通常のPCR方法では、図2(b)に示すように2つのプライマーで挟まれた領域が標的DNA配列となるが、インバースPCR方法では、図2(c)に示すように、既知の配列領域から未知の配列領域に向かって伸長するように設計したプライマーを使用するため、未知の配列領域を標的DNA配列として増幅することができる。
なお、本発明において「標的DNA配列」とは、特に明記されない限り、通常のPCR方法またはインバースPCR方法により選択的に増幅されるDNA配列のことを意味する。通常のPCR方法では、図2(b)に示すように2つのプライマーで挟まれた領域が標的DNA配列となるが、インバースPCR方法では、図2(c)に示すように、既知の配列領域から未知の配列領域に向かって伸長するように設計したプライマーを使用するため、未知の配列領域を標的DNA配列として増幅することができる。
また、本発明において「標的DNA鎖」とは、上記したように標的DNA配列を増幅するために鋳型として用いる、標的DNA配列を有するDNA鎖のことをいう。本発明において、本発明のインバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖の生産方法に使用する標的DNA鎖とインバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖とを区別するために、前者を「第1の鋳型DNA鎖」、後者を「第2の鋳型DNA鎖」と呼ぶことがある。同様に、本発明の生産方法に用いるDNAポリメラーゼおよびプライマーとインバースPCR方法に用いるDNAポリメラーゼおよびプライマーとを区別するために、前者をそれぞれ「第1のDNAポリメラーゼ」、「第1のプライマー」と呼ぶことがある(図1を参照のこと)。
また、本明細書中において「通常のPCR方法」という用語は、インバースPCR方法ではないPCR方法という意味で用いるものとする。
さらに、本明細書中において、標的DNA鎖を「複製」するという場合、1つの標的DNA鎖から1つの標的DNA鎖を複製する場合だけでなく、標的DNA鎖の塩基配列が複数つながったDNA鎖を得ることも含むものとする。
また、本明細書中において「通常のPCR方法」という用語は、インバースPCR方法ではないPCR方法という意味で用いるものとする。
さらに、本明細書中において、標的DNA鎖を「複製」するという場合、1つの標的DNA鎖から1つの標的DNA鎖を複製する場合だけでなく、標的DNA鎖の塩基配列が複数つながったDNA鎖を得ることも含むものとする。
本発明の第1の増幅工程では、標的DNA鎖を高い精度(正確さ)で複製することが必要である。このため、本発明の第1の増幅工程で用いる第1のプライマーとして、少なくとも1つのLNA残基を有するオリゴヌクレオチドを使用する。当該オリゴヌクレオチドは、同じ長さのDNAのみからなるオリゴヌクレオチドよりも、相補的なDNAまたはRNAに対する結合安定性に優れている。また、上記オリゴヌクレオチドは、相補鎖にミスマッチ塩基対が存在すると、Tm値が著しく低下する。すなわち、相補鎖に対する特異性が高く、誤った配列を増幅する危険性が少ないという利点を備えている。このため、DNA試料中に含まれる標的DNA鎖のコピー数が極めて少ない場合であっても、インバースPCR用の鋳型DNA鎖を得ることができ、また、当該DNA鎖を第2の鋳型DNA鎖として用いて、インバースPCR方法により標的DNA配列を増幅することができる。
上記少なくとも1残基のLNAを有するオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの製造受託会社(例えば、グライナー・ジャパン社、東京都)に製造を委託して入手することができる。
上記少なくとも1残基のLNAを有するオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの製造受託会社(例えば、グライナー・ジャパン社、東京都)に製造を委託して入手することができる。
標的DNA鎖が図3に示すような環状DNA鎖である場合、通常のDNAポリメラーゼによる伸長反応は、環状DNA鎖を1周した時点で終了する。しかし、鎖置換活性を持つDNAポリメラーゼを使用すると、当該ポリメラーゼは、合成された鎖を置換しながらローリングサークル型増幅と呼ばれる態様で伸長反応を進めるため、図4(a)に示すように、標的DNA鎖が直列に多数つながったDNA鎖を得ることができる。この直鎖状の反応産物は、図4(b)に示すようにプライマー伸長反応の起点を複数有しているため、そこからもプライマー伸長反応が起こり(ブランチング)、標的DNA配列を多数有する、本発明のインバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖を得ることができる。
本発明に使用される第1のDNAポリメラーゼは特に制限されず、市販のDNAポリメラーゼを好適に使用することができるが、本発明においては、上記の理由から、環状DNAである標的DNA鎖と組合わせて、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを第1のDNAポリメラーゼとして使用することが好ましい。
本発明において、第1のDNAポリメラーゼとして鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを使用する場合、当該DNAポリメラーゼとしてPhi29 DNAポリメラーゼまたはBst DNAポリメラーゼのいずれかを使用することが好ましい。特に、Phi29 DNAポリメラーゼはプライマー伸長反応の際のエラー率が低く(例えば、Esteban J.Aら、J.Biol.Chem.、268、2719−2726頁、1993年を参照のこと)、3’−5’エキソヌクレアーゼのプルーフリーディング活性を備えていることから(例えば、Blanco L.およびSalas M.、Nucleic Acids Research、13、1239−1249頁、1985年を参照のこと)、本発明で使用する第1のDNAポリメラーゼとしてもっとも好ましい。
プライマー伸長反応には、上記した標的DNA鎖、プライマーおよびDNAポリメラーゼのほかに、4種のdNTP(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)が必要である。当該プライマー伸長反応の系には、必要に応じて、BSAおよび/または塩化マグネシウムなどを含む緩衝液を使用することができる。このような緩衝液は、当業者に公知である。
DNAポリメラーゼを用いて、プライマー伸長反応を行う場合、まず、二本鎖の鋳型DNA鎖を変性して、1本鎖DNAにする必要がある。DNA鎖の変性は、物理的方法、化学的方法または酵素を用いる方法などの種々の方法によって行うことができるが、加熱による熱変性または溶液をアルカリ性とするアルカリ処理が好ましい。
第1の鋳型DNA鎖を熱変性させる場合、第1のDNAポリメラーゼは、当該熱変性条件により酵素活性を失わないものであれば熱変性の前に試料中に加えてよい。しかし、Phi29 DNAポリメラーゼのように鋳型DNA鎖の熱変性温度で不活性化するDNAポリメラーゼを用いる場合には、当該DNAポリメラーゼは熱変性の後に試料中に加える必要がある。このような場合、サーマルサイクラー装置を用いて鋳型DNA鎖を熱変性させた後、当該溶液を所望の温度に冷却し、この溶液にDNAポリメラーゼを添加する。このような方法は当業者に公知である。
第1の鋳型DNA鎖を熱変性させる場合、第1のDNAポリメラーゼは、当該熱変性条件により酵素活性を失わないものであれば熱変性の前に試料中に加えてよい。しかし、Phi29 DNAポリメラーゼのように鋳型DNA鎖の熱変性温度で不活性化するDNAポリメラーゼを用いる場合には、当該DNAポリメラーゼは熱変性の後に試料中に加える必要がある。このような場合、サーマルサイクラー装置を用いて鋳型DNA鎖を熱変性させた後、当該溶液を所望の温度に冷却し、この溶液にDNAポリメラーゼを添加する。このような方法は当業者に公知である。
プライマー伸長反応は、通常、使用するDNAポリメラーゼの酵素活性発現に適した条件にて行われる。また、反応条件の好適化のための種々の条件が当業者に知られており、本発明においても、そのような条件を適用することができる。DNAポリメラーゼとしてPhi29 DNAポリメラーゼを使用する場合、プライマー伸長反応は通常30℃にて8〜16時間行い、その後65℃に加熱してPhi29 DNAポリメラーゼを失活させるが、これらの条件に限定されない。
本発明において第1のプライマーとして使用する、少なくとも1残基のLNAを有するオリゴヌクレオチドの好ましい塩基長は、相補的なDNA鎖との結合の安定性にも左右されるが、6〜12塩基長であることが好ましい。5塩基長以下の場合は相補鎖DNAとの結合力が弱すぎ、また、13塩基より長い場合は相補鎖DNAとの結合力が強すぎて、プライマーとして適切ではなくなるためである。より好ましい塩基長は7〜10塩基長であり、もっとも好ましくは8塩基長である。
上記第1のプライマーにおいて、LNA残基の数は特に制限されないが、LNA残基のみから構成されるものよりも、LNA以外のDNA等を含むものの方がPCRにおける増幅効率が高い傾向があり好ましい。好ましいLNA残基の数は、オリゴヌクレオチドの塩基長にもよるが1〜6であり、より好ましくは2〜4である。また、同数のLNA残基を有する場合、LNA残基が3’側にあるものよりも、5’側にあるほうがPCRにおける増幅効率が高くなり好ましい。PCRにおける増幅効率の点から、LNA残基の塩基はアデニンまたはチミンであることが好ましく、チミンであることが最も好ましい。
本発明に使用するDNA試料の由来は特に限定されない。例えば、大腸菌、酵母、放線菌、ウイルスまたはプラスミドなどの当業者に周知の試料を、DNA試料として使用することができる。また、従来は培養を介さずに利用することが困難だった土壌、海水または廃水などに由来する環境DNAも、本発明におけるDNA試料として好適に用いることができる。環境DNAをDNA試料として使用する場合、標的DNA鎖を本発明の使用に適する環状DNA鎖とするために、下記の前処理に供してから本発明に用いることが好ましい。
環境DNAを本発明においてDNA試料として好適に使用するための前処理工程は、(1)制限酵素処理工程および(2)セルフライゲーション反応(自己環状化反応)工程からなる。前処理工程の模式図を、図5に示す。
(1)制限酵素処理工程
まず、標的DNA鎖を本発明に好適に使用できる塩基長とするために、DNA試料を制限酵素で処理する。この処理に用いる制限酵素は、配列特異的な切断を行うクラスIIの制限酵素が好ましい。DNAの切断面が、平滑末端となる制限酵素を用いてもよいが、付着末端を与える制限酵素を用いることがより好ましい。
まず、標的DNA鎖を本発明に好適に使用できる塩基長とするために、DNA試料を制限酵素で処理する。この処理に用いる制限酵素は、配列特異的な切断を行うクラスIIの制限酵素が好ましい。DNAの切断面が、平滑末端となる制限酵素を用いてもよいが、付着末端を与える制限酵素を用いることがより好ましい。
図2(a)に制限酵素処理前の標的DNA鎖の模式図を示す。制限酵素処理によって生成したDNA断片のうち増幅対象とするDNA配列を含むものが標的DNA鎖となる。上記したように、標的DNA配列は、インバースPCR方法で用いるプライマーの設計に応じて任意に設定し得るが、図2(a)に示されるように、既知の配列領域に隣接する未知の配列領域をインバースPCR方法によって増幅する場合、インバースPCR方法に用いるプライマー(第2のプライマー)は、図2(c)に示すように、既知の配列領域から未知の配列領域に向かって伸長するように設計したものを使用し、図中に示した部分が標的DNA配列となる。
上記制限酵素の選択に当たっては、増幅対象とするDNA配列が標的DNA鎖に含まれるようにするために、予備実験が必要となることがある。
上記制限酵素の選択に当たっては、増幅対象とするDNA配列が標的DNA鎖に含まれるようにするために、予備実験が必要となることがある。
(2)セルフライゲーション反応工程
本発明において環状の標的DNA鎖を用いる場合、上記制限処理工程(1)で得た標的DNA鎖にDNAリガーゼを作用させ、セルフライゲーションを反応させることにより、図3に示すような環状の標的DNA鎖を得ることができる。
当該セルフライゲーション反応工程後の試料中には、図5に示すように、様々な大きさの環状および直鎖状のDNA鎖が存在する。
本発明において環状の標的DNA鎖を用いる場合、上記制限処理工程(1)で得た標的DNA鎖にDNAリガーゼを作用させ、セルフライゲーションを反応させることにより、図3に示すような環状の標的DNA鎖を得ることができる。
当該セルフライゲーション反応工程後の試料中には、図5に示すように、様々な大きさの環状および直鎖状のDNA鎖が存在する。
本発明のインバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖の生産方法により得られた反応溶液中には、標的DNA配列を有する様々な長さのDNA鎖が含まれるが、標的DNA配列を有するものであれば第2の鋳型DNA鎖として使用することができ、DNA鎖の長さによっては制限されない。当該産物は、必要に応じて当業者に周知のDNAの精製方法による精製後、インバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖として使用することができる。
インバースPCR方法の条件は、市販の成書を参考にすることができる(例えば、「PCRテクノロジー」、Henry A.Erlich編、加藤郁之進 監訳、宝酒造株式会社、1997年、147−155頁を参照のこと)。
以下に実施例および比較例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[実施例1]
<前処理工程>
以下の手順により、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)W3110(λ)(以下λ−リソゲン(lysogen)と呼ぶ)の抽出DNA溶液を調製した。
λ−リソゲンをLB培地100ml中(トリプトン1g、酵母エキス0.5g、NaCl 1g、pH7.2)で一晩培養し、この培養液を遠心分離(4,000×g、10分)することによりλ−リソゲンを回収した。回収したλ−リソゲンを9.5mlのTE緩衝液(10mMトリス塩酸、1mM EDTA、pH8.0)に懸濁し、次いで0.5mlの10%SDS溶液および50μlのプロテイナーゼK溶液(20mg/ml)を添加し、37℃にて1時間インキュベートした。その後1.8mlのNaCl溶液(5M)および10mlの0.5Mトリス塩酸(pH8.0)飽和フェノールを加え、この溶液を振盪機にて45分間振盪した。振盪後の溶液を遠心分離(3,300×g、10分)し、上層のDNA溶液を新たなチューブに移した。このDNA溶液に等量のイソプロパノールを加え、DNAを沈殿させλ−リソゲンのゲノムDNAを回収した。
得られたλ−リソゲンのゲノムDNAは、Microcon(登録商標)−100(ミリポア社)を用いて精製した。
<前処理工程>
以下の手順により、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)W3110(λ)(以下λ−リソゲン(lysogen)と呼ぶ)の抽出DNA溶液を調製した。
λ−リソゲンをLB培地100ml中(トリプトン1g、酵母エキス0.5g、NaCl 1g、pH7.2)で一晩培養し、この培養液を遠心分離(4,000×g、10分)することによりλ−リソゲンを回収した。回収したλ−リソゲンを9.5mlのTE緩衝液(10mMトリス塩酸、1mM EDTA、pH8.0)に懸濁し、次いで0.5mlの10%SDS溶液および50μlのプロテイナーゼK溶液(20mg/ml)を添加し、37℃にて1時間インキュベートした。その後1.8mlのNaCl溶液(5M)および10mlの0.5Mトリス塩酸(pH8.0)飽和フェノールを加え、この溶液を振盪機にて45分間振盪した。振盪後の溶液を遠心分離(3,300×g、10分)し、上層のDNA溶液を新たなチューブに移した。このDNA溶液に等量のイソプロパノールを加え、DNAを沈殿させλ−リソゲンのゲノムDNAを回収した。
得られたλ−リソゲンのゲノムDNAは、Microcon(登録商標)−100(ミリポア社)を用いて精製した。
上記の手順により得た、λ−リソゲンの抽出DNAに制限酵素HindIIIを50ユニット加え、37℃にて5時間制限酵素反応を行った(反応溶液は50μlで、10mM トリス塩酸、10mM 塩化マグネシウム、1mM ジチオトレイトール、50mM 塩化ナトリウムを含む、pH7.5)。反応後、溶液を70℃にて15分間保ち制限酵素を失活させた。次いで反応後の溶液を、Microcon(登録商標)−100(ミリポア社)に加え、これを遠心分離することにより試料中のDNAを精製した。
次に、精製したDNAをTE緩衝液に溶解し20μlとし、この溶液にDNA Ligation Kit(Mighty Mix)(タカラバイオ社)を20μl加え、16℃にて一晩保ち、セルフライゲーション反応をさせた。反応終了後、溶液をMicrocon(登録商標)−100に加え、上記と同様にして反応産物を精製した。
次いで、DNA定量用キット(PicoGreen dsDNA Quantation Kit、Molecular Probe社)を用いて、精製後の試料中のDNAの濃度を算出した。当該DNA濃度および以下の式1を用いて、試料中のλ−リソゲンのゲノムDNAのコピー数を求めた。
[式1]
ゲノムDNAのコピー数=溶液中の抽出DNAの質量[g]×6×1023÷ゲノムDNAの分子量
上記の式1中、ゲノムDNAの分子量は、4×106×330×2を用いた。λ−リソゲンはゲノムDNA1コピーあたりλDNA領域を1コピー有し、本実施例ではλDNA領域の一部からなる約7kbpの環状DNA鎖を標的DNA鎖として用いたため、式1にて求めたゲノムDNAのコピー数はλDNA領域のコピー数および標的DNA鎖のコピー数と等しい。
[式1]
ゲノムDNAのコピー数=溶液中の抽出DNAの質量[g]×6×1023÷ゲノムDNAの分子量
上記の式1中、ゲノムDNAの分子量は、4×106×330×2を用いた。λ−リソゲンはゲノムDNA1コピーあたりλDNA領域を1コピー有し、本実施例ではλDNA領域の一部からなる約7kbpの環状DNA鎖を標的DNA鎖として用いたため、式1にて求めたゲノムDNAのコピー数はλDNA領域のコピー数および標的DNA鎖のコピー数と等しい。
<第1の増幅工程>
標的DNA鎖に対するプライマーとして、LNAモノマーのみからなる8塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。当該プライマーは以下の配列、
配列番号1:5’−cgaatcag−3’
を有する。当該プライマーの製造は、グライナー・ジャパン社(東京都)に委託した。当該プライマーのTmは、60℃である(インターネット上のサイト、http://lna−tm.comにて計算した)。
標的DNA鎖に対するプライマーとして、LNAモノマーのみからなる8塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。当該プライマーは以下の配列、
配列番号1:5’−cgaatcag−3’
を有する。当該プライマーの製造は、グライナー・ジャパン社(東京都)に委託した。当該プライマーのTmは、60℃である(インターネット上のサイト、http://lna−tm.comにて計算した)。
前記のDNA精製物中の標的DNA鎖を第1の鋳型DNA鎖として、下記の条件にてプライマー伸長反応に供した。DNAポリメラーゼとしては、Phi29 DNAポリメラーゼ(NewEngland Biolabs社)を用いた。当該DNAポリメラーゼに添付の緩衝液(25℃におけるpH7.5、いずれも終濃度として50mM トリス塩酸、10mM 塩化マグネシウム、10mM 硫酸アンモニウムおよび4mM ジチオトレイトールを含む)を用いて、標的DNA鎖を102コピー、103コピー、104コピー、105コピー、106コピーおよび107コピー含む6種の溶液を調製した。これらの溶液に、上記のLNAプライマーを終濃度2.5μMとなるように加え、滅菌蒸留水を加え10μlにメスアップした。次いで、これらの溶液を、サーマルサイクラー(LightCycler(登録商標)、ロシュ ダイアグノスティックス社)を用いて95℃にて3分間加熱し、DNA鎖を熱変性させた。その後、当該溶液を1分間に1℃の割合で徐冷し、30℃になった時点でそれぞれの溶液にリアクションミックス(上記の緩衝液中にPhi29 DNAポリメラーゼ10ユニット、4種のdNTP(終濃度各0.2mM)、BSA(終濃度0.2mg/ml))を10μl添加した。リアクションミックスを添加後、各溶液を30℃にて16時間保ち、プライマー伸長反応をさせた。反応終了後、反応産物を65℃にて10分間加熱し、Phi29 DNAポリメラーゼを失活させた。当該反応産物をMicrocon(登録商標)−100にて精製し、第2の増幅工程に使用するまで4℃にて保管した。
<第2の増幅工程>
上記の精製後の試料の全量をインバースPCR方法の鋳型として用いて、標的DNA配列の増幅を行った。第2の増幅工程に用いる反応溶液は、上記反応産物の全量に、DNAポリメラーゼとしてTaKaRa LA Taq(5ユニット/μl;タカラバイオ社)0.5μl、2×GC Buffer I(タカラバイオ株式会社) 25μl、dNTP混合物(4種のdNTPを2.5mMずつ含む)8μlならびに配列番号2および3のプライマー(終濃度0.2μM)を添加し、滅菌蒸留水で50μlにメスアップすることにより調製した。
上記の精製後の試料の全量をインバースPCR方法の鋳型として用いて、標的DNA配列の増幅を行った。第2の増幅工程に用いる反応溶液は、上記反応産物の全量に、DNAポリメラーゼとしてTaKaRa LA Taq(5ユニット/μl;タカラバイオ社)0.5μl、2×GC Buffer I(タカラバイオ株式会社) 25μl、dNTP混合物(4種のdNTPを2.5mMずつ含む)8μlならびに配列番号2および3のプライマー(終濃度0.2μM)を添加し、滅菌蒸留水で50μlにメスアップすることにより調製した。
上記プライマーは、フォワードプライマーとして以下の配列
配列番号2:5’−CCGGTACTGATGTGATGGCTGCTATGG−3’
を持ち、リバースプライマーとして以下の配列
配列番号3:5’−GGGTTTATTTCTGGTGCGTTTCGTTGG−3’
を持つものを使用した。プライマーDNA鎖の合成は、シグマアルドリッチジャパン社に委託した。上記のプライマーを使用する場合、インバースPCR方法により増幅される標的DNA配列の長さは4,898bpである。
配列番号2:5’−CCGGTACTGATGTGATGGCTGCTATGG−3’
を持ち、リバースプライマーとして以下の配列
配列番号3:5’−GGGTTTATTTCTGGTGCGTTTCGTTGG−3’
を持つものを使用した。プライマーDNA鎖の合成は、シグマアルドリッチジャパン社に委託した。上記のプライマーを使用する場合、インバースPCR方法により増幅される標的DNA配列の長さは4,898bpである。
上記反応溶液をサーマルサイクラーGeneAmp(登録商標) PCR System 9700(Applied Biosystems社)を用いて以下のインバースPCR反応に供した。
(1)熱変性工程:94℃、60秒間
(2)熱変性工程:94℃、10秒間
(3)アニーリングおよび伸長工程:68℃、180秒間
(4)最終伸長工程:72℃、10分間
(1)の熱反応工程の後、工程(2)および(3)を30サイクル繰り返し、最後に(4)の最終伸長工程を行い、反応を終了した。
(1)熱変性工程:94℃、60秒間
(2)熱変性工程:94℃、10秒間
(3)アニーリングおよび伸長工程:68℃、180秒間
(4)最終伸長工程:72℃、10分間
(1)の熱反応工程の後、工程(2)および(3)を30サイクル繰り返し、最後に(4)の最終伸長工程を行い、反応を終了した。
<増幅確認試験>
インバースPCR方法による増幅反応後の溶液を、Microcon(登録商標)−100(ミリポア社)に加え、前記第1の増幅工程と同様の手順で、試料中のDNAを精製した。λDNA領域の増幅を確認するために、精製後の試料をTE緩衝液で10倍に希釈し、当該希釈溶液1μlをDNA7500 LabChipキット(Agilent Technologies社)を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的DNA配列に該当するバンドの有無を検出装置(2100バイオアナライザ(Agilent Technologies社)をデフォルト設定で使用した。)および目視により判定した。その結果、標的DNA鎖のコピー数が103以上であった試料においては、インバースPCR方法による増幅後に標的DNA配列のバンドを確認することができた。このアガロースゲル電気泳動の結果を図6に示す(なお、上記キットおよび検出装置を用いて1,500〜7,500bpの試料を泳動する場合、サイズ決定誤差は最大で±20%となることがある)。左端のMと記したレーンには分子量マーカーを流し、左から2番目のレーンから右側に向かって、それぞれ、標的DNA鎖を102コピー、103コピー、104コピーおよび105コピー含む試料から調製したインバースPCR産物を電気泳動した。また、検出装置でバンドが確認された試料を○、検出装置ではバンドを確認できなかったが目視ではバンドを確認できたものを△、検出装置および目視ともにバンドが確認できなかった試料を×として、バンドの判定結果を比較例1、2、3および4の結果とともに表1に示す。
インバースPCR方法による増幅反応後の溶液を、Microcon(登録商標)−100(ミリポア社)に加え、前記第1の増幅工程と同様の手順で、試料中のDNAを精製した。λDNA領域の増幅を確認するために、精製後の試料をTE緩衝液で10倍に希釈し、当該希釈溶液1μlをDNA7500 LabChipキット(Agilent Technologies社)を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的DNA配列に該当するバンドの有無を検出装置(2100バイオアナライザ(Agilent Technologies社)をデフォルト設定で使用した。)および目視により判定した。その結果、標的DNA鎖のコピー数が103以上であった試料においては、インバースPCR方法による増幅後に標的DNA配列のバンドを確認することができた。このアガロースゲル電気泳動の結果を図6に示す(なお、上記キットおよび検出装置を用いて1,500〜7,500bpの試料を泳動する場合、サイズ決定誤差は最大で±20%となることがある)。左端のMと記したレーンには分子量マーカーを流し、左から2番目のレーンから右側に向かって、それぞれ、標的DNA鎖を102コピー、103コピー、104コピーおよび105コピー含む試料から調製したインバースPCR産物を電気泳動した。また、検出装置でバンドが確認された試料を○、検出装置ではバンドを確認できなかったが目視ではバンドを確認できたものを△、検出装置および目視ともにバンドが確認できなかった試料を×として、バンドの判定結果を比較例1、2、3および4の結果とともに表1に示す。
[比較例1]
<前処理工程>
実施例1と同様の手順および条件を用いて、λ−リソゲンの抽出DNAをHindIII処理し、当該処理後の試料をMicrocon(登録商標)−100を用いて精製した後、セルフライゲーション反応をさせ、次いでセルフライゲーション反応後の産物を精製した。溶液中のゲノムDNAのコピー数は、上記の式1により、実施例1と同様に計算した。
<前処理工程>
実施例1と同様の手順および条件を用いて、λ−リソゲンの抽出DNAをHindIII処理し、当該処理後の試料をMicrocon(登録商標)−100を用いて精製した後、セルフライゲーション反応をさせ、次いでセルフライゲーション反応後の産物を精製した。溶液中のゲノムDNAのコピー数は、上記の式1により、実施例1と同様に計算した。
<第1の増幅工程>
前記の実施例1と同様に、λDNA領域の一部からなる約7kbpの環状DNA鎖を標的DNA鎖として、DNAモノマーのみからなる26塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。当該プライマーは、以下の配列、
配列番号4:5’−GAACCGCGAACGAATCAGCAACTCAA−3’
を有する。当該プライマーの製造は、シグマアルドリッチジャパン社に委託した。当該プライマーのTmは、70℃である(インターネット上のサイト、http://lna−tm.comにて計算した)。
前記の実施例1と同様に、λDNA領域の一部からなる約7kbpの環状DNA鎖を標的DNA鎖として、DNAモノマーのみからなる26塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。当該プライマーは、以下の配列、
配列番号4:5’−GAACCGCGAACGAATCAGCAACTCAA−3’
を有する。当該プライマーの製造は、シグマアルドリッチジャパン社に委託した。当該プライマーのTmは、70℃である(インターネット上のサイト、http://lna−tm.comにて計算した)。
実施例1と同様の手順および条件を用いて、標的DNA鎖を102コピー、103コピー、104コピー、105コピー、106コピーおよび107コピー含む6種の溶液を調製し、Phi29 DNAポリメラーゼ(NewEngland Biolabs社)によるプライマー伸長反応を行った。反応終了後、反応産物を65℃にて10分間加熱しPhi29 DNAポリメラーゼを失活させた。当該反応産物をMicrocon(登録商標)−100にて精製し、インバースPCR方法による増幅に使用するまで、4℃にて保管した。
<第2の増幅工程>
上記の反応産物の全量を第2の鋳型DNA鎖とし、実施例1で使用したものと同じ配列番号2および3のプライマーを使用して、実施例1と同様の手順および条件を用いてインバースPCR方法により標的DNA配列の増幅を行った。
上記の反応産物の全量を第2の鋳型DNA鎖とし、実施例1で使用したものと同じ配列番号2および3のプライマーを使用して、実施例1と同様の手順および条件を用いてインバースPCR方法により標的DNA配列の増幅を行った。
<増幅確認試験>
インバースPCR方法による増幅反応後の溶液をMicrocon(登録商標)−100(ミリポア社)に加え、試料中のDNAを精製した。実施例1と同様に、精製後の試料をTE緩衝液にて10倍希釈し、当該希釈溶液1μlをDNA7500 LabChipキット(Agilent Technologies社)を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的DNA配列に該当するバンドの有無を検出装置(2100バイオアナライザ(Agilent Technologies社)をデフォルト設定で使用した)および目視により判定した。その結果、標的DNA鎖のコピー数が106以上であった試料においては、インバースPCR方法による増幅後に標的DNA配列のバンドを確認することができた。105であった試料では検出装置ではバンドの存在は確認されなかったが、目視ではバンドの存在が確認された。104以下であった試料では、目視および検出装置のいずれによってもバンドの存在は確認されなかった。
インバースPCR方法による増幅反応後の溶液をMicrocon(登録商標)−100(ミリポア社)に加え、試料中のDNAを精製した。実施例1と同様に、精製後の試料をTE緩衝液にて10倍希釈し、当該希釈溶液1μlをDNA7500 LabChipキット(Agilent Technologies社)を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的DNA配列に該当するバンドの有無を検出装置(2100バイオアナライザ(Agilent Technologies社)をデフォルト設定で使用した)および目視により判定した。その結果、標的DNA鎖のコピー数が106以上であった試料においては、インバースPCR方法による増幅後に標的DNA配列のバンドを確認することができた。105であった試料では検出装置ではバンドの存在は確認されなかったが、目視ではバンドの存在が確認された。104以下であった試料では、目視および検出装置のいずれによってもバンドの存在は確認されなかった。
[比較例2]
<前処理工程>
実施例1と同様に、λ−リソゲンの抽出DNAをHindIII処理し、当該処理後の試料をMicrocon(登録商標)−100を用いて精製した後、セルフライゲーション反応をさせ、次いでセルフライゲーション反応後の産物を精製した。溶液中のゲノムDNAのコピー数は、上記の式1により、実施例1と同様に計算した。
<前処理工程>
実施例1と同様に、λ−リソゲンの抽出DNAをHindIII処理し、当該処理後の試料をMicrocon(登録商標)−100を用いて精製した後、セルフライゲーション反応をさせ、次いでセルフライゲーション反応後の産物を精製した。溶液中のゲノムDNAのコピー数は、上記の式1により、実施例1と同様に計算した。
<第1の増幅工程>
前記の実施例1と同様に、λDNA領域の一部のみからなる約7kbpの環状DNA鎖を標的DNA鎖として、DNAモノマーのみからなる8塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。当該プライマーは、以下の配列、
配列番号5:5’−CGAATCAG−3’
を有する。なお、該配列は、実施例1で使用した配列番号1に示されるLNAプライマーと同一の塩基配列を有し、比較例1で使用した配列番号4に示されるDNAプライマーの一部である。当該オリゴヌクレオチドの製造は、シグマアルドリッチジャパン社に委託した。当該プライマーのTmは、25℃である(インターネット上のサイト、http://lna−tm.comにて計算した)。
前記の実施例1と同様に、λDNA領域の一部のみからなる約7kbpの環状DNA鎖を標的DNA鎖として、DNAモノマーのみからなる8塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。当該プライマーは、以下の配列、
配列番号5:5’−CGAATCAG−3’
を有する。なお、該配列は、実施例1で使用した配列番号1に示されるLNAプライマーと同一の塩基配列を有し、比較例1で使用した配列番号4に示されるDNAプライマーの一部である。当該オリゴヌクレオチドの製造は、シグマアルドリッチジャパン社に委託した。当該プライマーのTmは、25℃である(インターネット上のサイト、http://lna−tm.comにて計算した)。
前記の実施例1と同様の手順および条件を用いて、標的DNA鎖を102コピー、103コピー、104コピー、105コピー、106コピーおよび107コピー含む6種の溶液を調製し、Phi29 DNAポリメラーゼ(NewEngland Biolabs社)によるプライマー伸長反応を行った。反応終了後、反応産物を65℃にて10分間加熱しPhi29 DNAポリメラーゼを失活させた。当該反応産物をMicrocon(登録商標)−100にて精製し、インバースPCR方法による増幅に使用するまで、4℃にて保管した。
<第2の増幅工程>
上記の反応産物の全量を第2の鋳型DNA鎖とし、実施例1で使用したものと同じ配列番号2および3のプライマーを使用して、実施例1と同様の手順および条件を用いてインバースPCR方法により標的DNA配列の増幅を行った。
上記の反応産物の全量を第2の鋳型DNA鎖とし、実施例1で使用したものと同じ配列番号2および3のプライマーを使用して、実施例1と同様の手順および条件を用いてインバースPCR方法により標的DNA配列の増幅を行った。
<増幅確認試験>
インバースPCR方法による増幅反応後の溶液をMicrocon(登録商標)−100(ミリポア社)に加え、試料中のDNAを精製した。実施例1と同様に、精製後の試料をTE緩衝液にて10倍希釈し、当該希釈溶液1μlをDNA7500 LabChipキット(Agilent Technologies社)を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的DNA配列に該当するバンドの有無を検出装置(2100バイオアナライザ(Agilent Technologies社)をデフォルト設定で使用した)および目視により判定した。その結果、標的DNA鎖のコピー数が、106以上であった試料においては、インバースPCR方法による増幅後に標的DNA配列のバンドを確認することができた。105であった試料では検出装置ではバンドの存在は確認されなかったが、目視ではバンドの存在が確認された。104以下であった試料では、目視および検出装置のいずれによっても、バンドの存在は確認されなかった。このアガロースゲル電気泳動の結果を、図7に示す。左端のレーンには分子量マーカーを流し、左から2番目のレーンから右側に向かって、それぞれ標的DNA鎖を107コピー、106コピー、105コピー、104コピー、103コピーおよび102コピー含む試料から調製したインバースPCR産物を電気泳動した。
インバースPCR方法による増幅反応後の溶液をMicrocon(登録商標)−100(ミリポア社)に加え、試料中のDNAを精製した。実施例1と同様に、精製後の試料をTE緩衝液にて10倍希釈し、当該希釈溶液1μlをDNA7500 LabChipキット(Agilent Technologies社)を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的DNA配列に該当するバンドの有無を検出装置(2100バイオアナライザ(Agilent Technologies社)をデフォルト設定で使用した)および目視により判定した。その結果、標的DNA鎖のコピー数が、106以上であった試料においては、インバースPCR方法による増幅後に標的DNA配列のバンドを確認することができた。105であった試料では検出装置ではバンドの存在は確認されなかったが、目視ではバンドの存在が確認された。104以下であった試料では、目視および検出装置のいずれによっても、バンドの存在は確認されなかった。このアガロースゲル電気泳動の結果を、図7に示す。左端のレーンには分子量マーカーを流し、左から2番目のレーンから右側に向かって、それぞれ標的DNA鎖を107コピー、106コピー、105コピー、104コピー、103コピーおよび102コピー含む試料から調製したインバースPCR産物を電気泳動した。
[比較例3]
<前処理工程>
実施例1と同様に、λ−リソゲンの抽出DNAをHindIII処理し、当該処理後の試料をMicrocon(登録商標)−100を用いて精製した後、セルフライゲーション反応をさせ、次いでセルフライゲーション反応後の産物を精製した。溶液中のゲノムDNAのコピー数は、上記の式1により、実施例1と同様に計算した。
<前処理工程>
実施例1と同様に、λ−リソゲンの抽出DNAをHindIII処理し、当該処理後の試料をMicrocon(登録商標)−100を用いて精製した後、セルフライゲーション反応をさせ、次いでセルフライゲーション反応後の産物を精製した。溶液中のゲノムDNAのコピー数は、上記の式1により、実施例1と同様に計算した。
<第2の増幅工程>
実施例1と同様にTakara LA Taq(登録商標) with GC Buffer(タカラバイオ社)を使用して、配列番号2および3のプライマーを終濃度0.2μM、TaKaRa LA Taq(5ユニット/μl)0.5μl、2×GC Buffer I 25μlおよびdNTP混合物(4種のdNTPを2.5mMずつ含む)8μlならびに上記精製後の標的DNA鎖を102コピー、103コピー、104コピー、105コピー、106コピーまたは107コピー含む6種の溶液(いずれも50μl)を調製し、実施例1と同様の手順および条件を用いてインバースPCR方法により標的DNA配列の増幅を行った。
実施例1と同様にTakara LA Taq(登録商標) with GC Buffer(タカラバイオ社)を使用して、配列番号2および3のプライマーを終濃度0.2μM、TaKaRa LA Taq(5ユニット/μl)0.5μl、2×GC Buffer I 25μlおよびdNTP混合物(4種のdNTPを2.5mMずつ含む)8μlならびに上記精製後の標的DNA鎖を102コピー、103コピー、104コピー、105コピー、106コピーまたは107コピー含む6種の溶液(いずれも50μl)を調製し、実施例1と同様の手順および条件を用いてインバースPCR方法により標的DNA配列の増幅を行った。
<増幅確認試験>
インバースPCR方法による増幅反応後の溶液をMicrocon(登録商標)−100(ミリポア社)に加え、試料中のDNAを精製した。実施例1と同様に、精製後の試料をTE緩衝液にて10倍希釈し、当該希釈溶液1μlをDNA7500 LabChipキット(Agilent Technologies社)を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的DNA配列に該当するバンドの有無を検出装置(2100バイオアナライザ(Agilent Technologies社)をデフォルト設定で使用した)および目視により判定した。その結果、標的DNA鎖のコピー数が、107であった試料においては、インバースPCR方法による増幅後に標的DNA配列のバンドを確認することができた。106であった試料では検出装置ではバンドの存在は確認されなかったが、目視ではバンドの存在が確認された。105以下であった試料では、目視および検出装置のいずれによっても、バンドの存在は確認されなかった。
インバースPCR方法による増幅反応後の溶液をMicrocon(登録商標)−100(ミリポア社)に加え、試料中のDNAを精製した。実施例1と同様に、精製後の試料をTE緩衝液にて10倍希釈し、当該希釈溶液1μlをDNA7500 LabChipキット(Agilent Technologies社)を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的DNA配列に該当するバンドの有無を検出装置(2100バイオアナライザ(Agilent Technologies社)をデフォルト設定で使用した)および目視により判定した。その結果、標的DNA鎖のコピー数が、107であった試料においては、インバースPCR方法による増幅後に標的DNA配列のバンドを確認することができた。106であった試料では検出装置ではバンドの存在は確認されなかったが、目視ではバンドの存在が確認された。105以下であった試料では、目視および検出装置のいずれによっても、バンドの存在は確認されなかった。
[比較例4]
通常のPCR方法において、標的DNA配列を増幅するために必要なDNA試料中に含まれる標的DNA鎖のコピー数について知見を得るために、配列番号6および7で示されるプライマーを使用して、通常のPCR方法による標的DNA配列の増幅実験を行った。なお、本比較例4の標的DNA配列と、実施例1および比較例1〜3のインバースPCR方法における標的DNA配列とは異なるものとなる。上記のプライマーを使用して、通常のPCR方法により増幅される標的DNA配列の長さは762bpである。
配列番号6:5’−CTGGAATCGATGGTGTCTCCGGTGTGA−3’
配列番号7:5’−CGGCATCCCACTGAGCAGACGTGAG−3’
通常のPCR方法において、標的DNA配列を増幅するために必要なDNA試料中に含まれる標的DNA鎖のコピー数について知見を得るために、配列番号6および7で示されるプライマーを使用して、通常のPCR方法による標的DNA配列の増幅実験を行った。なお、本比較例4の標的DNA配列と、実施例1および比較例1〜3のインバースPCR方法における標的DNA配列とは異なるものとなる。上記のプライマーを使用して、通常のPCR方法により増幅される標的DNA配列の長さは762bpである。
配列番号6:5’−CTGGAATCGATGGTGTCTCCGGTGTGA−3’
配列番号7:5’−CGGCATCCCACTGAGCAGACGTGAG−3’
<前処理工程>
実施例1と同様に、λ−リソゲンの抽出DNAをHindIII処理し、当該処理後の試料をMicrocon(登録商標)−100を用いて精製した。溶液中のゲノムDNAのコピー数を、上記の式1により、実施例1と同様に計算した。
実施例1と同様に、λ−リソゲンの抽出DNAをHindIII処理し、当該処理後の試料をMicrocon(登録商標)−100を用いて精製した。溶液中のゲノムDNAのコピー数を、上記の式1により、実施例1と同様に計算した。
<通常のPCR方法による増幅工程>
上記HindIII処理により得られたλDNA領域の一部からなる約7kbpの直鎖状DNAを標的DNA鎖とし、配列番号6および7のプライマーを使用して、通常のPCR方法により、標的DNA配列の増幅を行った。反応溶液として、上記標的DNA鎖を102コピー、103コピー、104コピー、105コピー、106コピーおよび107コピー含む6種の溶液を調製した。各反応溶液は、標的DNA鎖のほかに、DNAポリメラーゼとしてTaKaRa LA Taq(5ユニット/μl;タカラバイオ社)0.5μl、2×GC Buffer I(タカラバイオ株式会社)25μl、dNTP混合物(4種のdNTPを2.5mMずつ含む)8μlならびに配列番号6および7のプライマー(終濃度0.2μM)を含み、滅菌蒸留水で50μlにメスアップすることにより調製した。
上記HindIII処理により得られたλDNA領域の一部からなる約7kbpの直鎖状DNAを標的DNA鎖とし、配列番号6および7のプライマーを使用して、通常のPCR方法により、標的DNA配列の増幅を行った。反応溶液として、上記標的DNA鎖を102コピー、103コピー、104コピー、105コピー、106コピーおよび107コピー含む6種の溶液を調製した。各反応溶液は、標的DNA鎖のほかに、DNAポリメラーゼとしてTaKaRa LA Taq(5ユニット/μl;タカラバイオ社)0.5μl、2×GC Buffer I(タカラバイオ株式会社)25μl、dNTP混合物(4種のdNTPを2.5mMずつ含む)8μlならびに配列番号6および7のプライマー(終濃度0.2μM)を含み、滅菌蒸留水で50μlにメスアップすることにより調製した。
上記反応溶液をサーマルサイクラーGeneAmp(登録商標) PCR System 9700(Applied Biosystems社)を用いて以下のPCR反応に供した。
(1)熱変性工程:94℃、60秒間
(2)熱変性工程:94℃、10秒間
(3)アニーリングおよび伸長工程:68℃、180秒間
(4)最終伸長工程:72℃、10分間
(1)の熱反応工程の後、工程(2)および(3)を30サイクル繰り返し、最後に(4)の最終伸長工程を行い、反応を終了した。
(1)熱変性工程:94℃、60秒間
(2)熱変性工程:94℃、10秒間
(3)アニーリングおよび伸長工程:68℃、180秒間
(4)最終伸長工程:72℃、10分間
(1)の熱反応工程の後、工程(2)および(3)を30サイクル繰り返し、最後に(4)の最終伸長工程を行い、反応を終了した。
<増幅確認試験>
上記増幅反応後の溶液をMicrocon(登録商標)−100(ミリポア社)に加え、試料中のDNAを精製した。実施例1と同様に、精製後の試料をTE緩衝液にて10倍希釈し、当該希釈溶液1μlをDNA7500 LabChipキット(Agilent Technologies社)を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的DNA配列に該当するバンドの有無を検出装置(2100バイオアナライザ(Agilent Technologies社)をデフォルト設定で使用した)および目視により判定した。その結果、標的DNA鎖のコピー数が、103以上であった試料では目視および検出装置の両方で、バンドの存在を確認することができた。
上記増幅反応後の溶液をMicrocon(登録商標)−100(ミリポア社)に加え、試料中のDNAを精製した。実施例1と同様に、精製後の試料をTE緩衝液にて10倍希釈し、当該希釈溶液1μlをDNA7500 LabChipキット(Agilent Technologies社)を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的DNA配列に該当するバンドの有無を検出装置(2100バイオアナライザ(Agilent Technologies社)をデフォルト設定で使用した)および目視により判定した。その結果、標的DNA鎖のコピー数が、103以上であった試料では目視および検出装置の両方で、バンドの存在を確認することができた。
上記の結果より、DNA試料中の標的DNA鎖のコピー数が従来のインバースPCR方法(比較例3)では標的DNA配列を増幅できないほど少数であっても、当該DNA試料から本発明の生産方法により生産したDNA鎖を第2の鋳型DNA鎖としてインバースPCR方法に用いることにより、標的DNA配列を増幅できることが理解される。
また、上記の結果より、第1の増幅工程によりインバースPCR方法に使用する鋳型DNA鎖を生産し、次いで当該DNA鎖をインバースPCR方法の鋳型DNA鎖として使用する場合であっても、第1のプライマーとして少なくとも1残基のLNAを有するプライマーを使用(実施例1)することにより、DNAのみからなるプライマーを第1のプライマーとして使用(比較例1および2)する場合と比べて、当該方法により標的DNA配列を増幅できるDNA試料中に含まれる標的DNA鎖の数の下限値が、100分の1以下となることが示された。
また、上記の結果より、第1の増幅工程によりインバースPCR方法に使用する鋳型DNA鎖を生産し、次いで当該DNA鎖をインバースPCR方法の鋳型DNA鎖として使用する場合であっても、第1のプライマーとして少なくとも1残基のLNAを有するプライマーを使用(実施例1)することにより、DNAのみからなるプライマーを第1のプライマーとして使用(比較例1および2)する場合と比べて、当該方法により標的DNA配列を増幅できるDNA試料中に含まれる標的DNA鎖の数の下限値が、100分の1以下となることが示された。
本発明の方法により標的DNA配列を増幅するために必要なDNA試料中の標的DNA鎖のコピー数の下限値は、比較例4に示された通常のPCR方法の下限値と同程度であり、本発明の方法により、標的DNA鎖を通常のPCR方法で増幅可能な下限値程度しか含んでいないDNA試料についても、インバースPCR方法を適用して標的DNA配列を増幅できることが理解される。
[実施例2]
<キシラナーゼ遺伝子および塩基配列情報の取得>
西表島で10個のタカサゴシロアリ(Nasutitermes takasagoensis)の巣を採取し、それぞれの巣のタカサゴシロアリ(約100匹分)から腸管を分離、回収し、土壌DNA抽出キットISOIL(株式会社ニッポンジーン)を用いて付属のマニュアルに従いDNAを抽出した。また、2種類のウマの虫垂(北海道畜産公社道央事業所より入手)から上述のキットを用いてDNAを抽出した。得られた12種のDNAのうち、それぞれ1.5μgを制限酵素EcoRI(タカラバイオ社)を用いて、37℃にて5時間処理した。その後、当該溶液を70℃にて15分間保ち、制限酵素を失活させ、次いで、当該溶液を、MontagePCR50(ミリポア社)に加え、これを遠心分離することにより試料中のDNAを精製した。
<キシラナーゼ遺伝子および塩基配列情報の取得>
西表島で10個のタカサゴシロアリ(Nasutitermes takasagoensis)の巣を採取し、それぞれの巣のタカサゴシロアリ(約100匹分)から腸管を分離、回収し、土壌DNA抽出キットISOIL(株式会社ニッポンジーン)を用いて付属のマニュアルに従いDNAを抽出した。また、2種類のウマの虫垂(北海道畜産公社道央事業所より入手)から上述のキットを用いてDNAを抽出した。得られた12種のDNAのうち、それぞれ1.5μgを制限酵素EcoRI(タカラバイオ社)を用いて、37℃にて5時間処理した。その後、当該溶液を70℃にて15分間保ち、制限酵素を失活させ、次いで、当該溶液を、MontagePCR50(ミリポア社)に加え、これを遠心分離することにより試料中のDNAを精製した。
キシラナーゼが属する糖質加水分解酵素ファミリー10に特異的な配列に対するプライマー(配列番号8および9)を用いて、上記ISOILを用いて抽出したウマの虫垂由来のDNAを通常のPCR方法による増幅反応に供した。得られた増幅産物をMicrocon(登録商標)−100を用いて精製し、当業者に周知の方法により、クローニングおよび塩基配列解析を行った。
配列番号8(フォワードプライマー):5’−CATACKTTKGTTTGGCA−3’
配列番号9(リバースプライマー):5’−TMGTTKACMACRTCCCA−3’
なお、上記配列中、KはGまたはTを意味し、MはAまたはCを意味し、RはGまたはAを意味する。
配列番号8(フォワードプライマー):5’−CATACKTTKGTTTGGCA−3’
配列番号9(リバースプライマー):5’−TMGTTKACMACRTCCCA−3’
なお、上記配列中、KはGまたはTを意味し、MはAまたはCを意味し、RはGまたはAを意味する。
塩基配列解析の結果、得られた産物は、配列番号10の塩基配列を持つことが分かった。
配列番号10:5’−CATACGTTTGTTTGGCACCAGCAAACTCCGTCATGGCTGACTGCCGGCAGTAAAACAGAAGTCCTTGGCAATCTGGAAAAATATGTTACCGATGTTACAACTCATTTTAGGGGGAAACTTATTTCCTGGGATGTAGTCAACGA−3’
配列番号10の塩基配列を周知のデータベースにより照合した結果、既知の遺伝子の塩基配列との相同性などから、当該配列はキシラナーゼの一部であると同定された。
配列番号10:5’−CATACGTTTGTTTGGCACCAGCAAACTCCGTCATGGCTGACTGCCGGCAGTAAAACAGAAGTCCTTGGCAATCTGGAAAAATATGTTACCGATGTTACAACTCATTTTAGGGGGAAACTTATTTCCTGGGATGTAGTCAACGA−3’
配列番号10の塩基配列を周知のデータベースにより照合した結果、既知の遺伝子の塩基配列との相同性などから、当該配列はキシラナーゼの一部であると同定された。
<前処理工程>
前記精製後の12種のDNAをTE緩衝液に溶解しそれぞれ40μlとし、このうちの5μlにDNA Ligation Kit(Mighty Mix)(タカラバイオ社)を20μl加え、16℃にて一晩保ち、セルフライゲーション反応をさせた。反応終了後、溶液をMicrocon(登録商標)−100に加え、前記と同様にして反応産物を精製し、精製後のDNA溶液にTE緩衝液を加え25μlとし、第1の増幅工程に使用するまで4℃にて保管した。
前記精製後の12種のDNAをTE緩衝液に溶解しそれぞれ40μlとし、このうちの5μlにDNA Ligation Kit(Mighty Mix)(タカラバイオ社)を20μl加え、16℃にて一晩保ち、セルフライゲーション反応をさせた。反応終了後、溶液をMicrocon(登録商標)−100に加え、前記と同様にして反応産物を精製し、精製後のDNA溶液にTE緩衝液を加え25μlとし、第1の増幅工程に使用するまで4℃にて保管した。
<第1の増幅工程>
上記DNA試料からキシラナーゼ遺伝子全長を取得するために、上記前処理工程で得た環状DNA鎖のうち、キシラナーゼ遺伝子全長を有する環状DNA鎖を標的DNA鎖として、本発明の生産方法により、インバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖の生産を行った。
第1のプライマーとして、上記配列番号10の一部と同じ塩基配列を持ち、2個のLNA残基を有する8塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。当該プライマーは、以下の配列、
配列番号11:5’−GtTtGGCA−3’
を有する。上記配列中、LNA残基を小文字で示す。当該プライマーの製造は、グライナー・ジャパン社(東京都)に委託した。
上記DNA試料からキシラナーゼ遺伝子全長を取得するために、上記前処理工程で得た環状DNA鎖のうち、キシラナーゼ遺伝子全長を有する環状DNA鎖を標的DNA鎖として、本発明の生産方法により、インバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖の生産を行った。
第1のプライマーとして、上記配列番号10の一部と同じ塩基配列を持ち、2個のLNA残基を有する8塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。当該プライマーは、以下の配列、
配列番号11:5’−GtTtGGCA−3’
を有する。上記配列中、LNA残基を小文字で示す。当該プライマーの製造は、グライナー・ジャパン社(東京都)に委託した。
前記精製後のDNA溶液3.7μlに、配列番号11のプライマー32pmolおよびPhi29 DNAポリメラーゼ(NewEngland Biolabs社)に添付の緩衝液(25℃におけるpH7.5)を所定量添加し、滅菌蒸留水を加え10μlにメスアップした。なお、当該溶液は、いずれも終濃度として50mM トリス塩酸、10mM 塩化マグネシウム、10mM 硫酸アンモニウムおよび4mM ジチオトレイトールを含む。
次いで、この溶液を、サーマルサイクラー(LightCycler(登録商標)、ロシュ ダイアグノスティックス社)を用いて95℃にて3分間加熱し、DNA鎖を熱変性させた。その後、当該溶液を1分間に1℃の割合で徐冷し、30℃になった時点でリアクションミックス(上記の緩衝液中にPhi29 DNAポリメラーゼ10ユニット、4種のdNTP(終濃度各0.2mM)、BSA(終濃度0.2mg/ml)を含む。)を10μl添加した。リアクションミックスを添加後、溶液を30℃にて16時間保ち、プライマー伸長反応をさせた。反応終了後、反応産物を65℃にて10分間保ち、Phi29 DNAポリメラーゼを失活させた。当該反応産物をMicrocon(登録商標)−100にて精製し、第2の増幅工程に使用するまで4℃にて保管した。
<第2の増幅工程>
上記の精製後の試料をインバースPCR方法の鋳型として用いて、第2の増幅工程で前記配列番号10の塩基配列を一部に有するキシラナーゼ遺伝子の増幅を試みた。第2の増幅工程で使用する第2のプライマーは、配列番号10の塩基配列に基づき、フォワードプライマーとして以下の配列
配列番号12:5’−TCTGGAAAAATATGTTACCGATGTT−3’
を持ち、リバースプライマーとして以下の配列
配列番号13:5’−CCAAGGACTTCTGTTTTACTGCC−3’
を持つものを使用した。プライマーDNA鎖の合成は、シグマアルドリッチジャパン社に委託した。
上記の精製後の試料をインバースPCR方法の鋳型として用いて、第2の増幅工程で前記配列番号10の塩基配列を一部に有するキシラナーゼ遺伝子の増幅を試みた。第2の増幅工程で使用する第2のプライマーは、配列番号10の塩基配列に基づき、フォワードプライマーとして以下の配列
配列番号12:5’−TCTGGAAAAATATGTTACCGATGTT−3’
を持ち、リバースプライマーとして以下の配列
配列番号13:5’−CCAAGGACTTCTGTTTTACTGCC−3’
を持つものを使用した。プライマーDNA鎖の合成は、シグマアルドリッチジャパン社に委託した。
第2の増幅工程に用いる反応溶液は、上記精製後の反応産物にTE緩衝液を加え25μlにメスアップし、このうちの1μlに、DNAポリメラーゼとしてTaKaRa LA Taq(5ユニット/μl;タカラバイオ社)0.5μl、2×GC Buffer I(タカラバイオ株式会社)25μl、dNTP混合物(4種のdNTPを2.5mMずつ含む)8μlならびに配列番号12および13のプライマーを各20pmol添加し、滅菌蒸留水で50μlにメスアップすることにより調製した。
上記反応溶液をサーマルサイクラーGeneAmp(登録商標) PCR System 9700(Applied Biosystems社)を用いて以下のインバースPCR反応に供した。
(1)熱変性工程:94℃、60秒間
(2)熱変性工程:94℃、30秒間
(3)アニーリングおよび伸長工程:68℃、10分間
(4)最終伸長工程:72℃、10分間
(1)の熱反応工程の後、工程(2)および(3)を40サイクル繰り返し、最後に(4)の最終伸長工程を行い、反応を終了した。
(1)熱変性工程:94℃、60秒間
(2)熱変性工程:94℃、30秒間
(3)アニーリングおよび伸長工程:68℃、10分間
(4)最終伸長工程:72℃、10分間
(1)の熱反応工程の後、工程(2)および(3)を40サイクル繰り返し、最後に(4)の最終伸長工程を行い、反応を終了した。
<増幅確認試験>
インバースPCR方法による増幅反応後の溶液を、Microcon(登録商標)−100(ミリポア社)に加え、前記と同様の手順で、試料中のDNAを精製した。キシラナーゼ遺伝子の増幅を確認するために、精製後の試料をTE緩衝液で10倍に希釈し、当該希釈溶液1μlをDNA7500 LabChipキット(Agilent Technologies社)を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的DNA配列に該当するバンドの有無を検出装置(2100バイオアナライザ(Agilent Technologies社))および目視により判定した。このアガロースゲル電気泳動の結果を図8に示す。左端のLと記したレーンには分子量マーカーを流し、レーン1〜10には上記シロアリ由来の増幅産物を、レーン11および12には、ウマ由来の増幅産物を電気泳動した。この結果、全12試料中11試料について数キロ塩基長の増幅産物を確認できた。なお、各レーン中、最上部と最下部(約50bp)のラインは、それぞれアッパーマーカーおよびローアーマーカーのラインである。
インバースPCR方法による増幅反応後の溶液を、Microcon(登録商標)−100(ミリポア社)に加え、前記と同様の手順で、試料中のDNAを精製した。キシラナーゼ遺伝子の増幅を確認するために、精製後の試料をTE緩衝液で10倍に希釈し、当該希釈溶液1μlをDNA7500 LabChipキット(Agilent Technologies社)を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的DNA配列に該当するバンドの有無を検出装置(2100バイオアナライザ(Agilent Technologies社))および目視により判定した。このアガロースゲル電気泳動の結果を図8に示す。左端のLと記したレーンには分子量マーカーを流し、レーン1〜10には上記シロアリ由来の増幅産物を、レーン11および12には、ウマ由来の増幅産物を電気泳動した。この結果、全12試料中11試料について数キロ塩基長の増幅産物を確認できた。なお、各レーン中、最上部と最下部(約50bp)のラインは、それぞれアッパーマーカーおよびローアーマーカーのラインである。
また、ウマ由来のDNA試料から得た上記増幅産物について、当業者に周知の方法によりクローニングおよび塩基配列解析を行った結果、1203塩基長の新規なキシラナーゼ遺伝子の全長を取得することができた。
また、当該遺伝子をプラスミドpQE30−UA(キアゲン社)に組み込み、当該プラスミドを用いて大腸菌(E.coli strain M15/pREP4(キアゲン社))を形質転換した。当該大腸菌を周知の方法により培養し、Ni−NTA Fast Start Kit(キアゲン社)およびSDS−PAGEにより菌体抽出物を分離、精製し、精製物をキシランに作用させ、遊離した還元糖を周知の方法で定量することにより、当該精製物がキシラナーゼ活性を有することを確認した。
また、当該遺伝子をプラスミドpQE30−UA(キアゲン社)に組み込み、当該プラスミドを用いて大腸菌(E.coli strain M15/pREP4(キアゲン社))を形質転換した。当該大腸菌を周知の方法により培養し、Ni−NTA Fast Start Kit(キアゲン社)およびSDS−PAGEにより菌体抽出物を分離、精製し、精製物をキシランに作用させ、遊離した還元糖を周知の方法で定量することにより、当該精製物がキシラナーゼ活性を有することを確認した。
[実施例3]
<前処理工程>
実施例2と同様にして、第1の増幅工程に使用する12種のDNA試料を調製した。
<前処理工程>
実施例2と同様にして、第1の増幅工程に使用する12種のDNA試料を調製した。
<第1の増幅工程>
プライマーとして、実施例2で使用した配列番号11のプライマーと同じ塩基配列を持ち、LNA残基のみからなる8塩基長のオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号14)を使用したこと以外は実施例2と同様に第1の増幅工程を行い、インバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖を調製した。
配列番号14:5’−gtttggca−3’
上記配列中、LNA残基を小文字で示す。当該プライマーの製造は、グライナー・ジャパン社(東京都)に委託した。
プライマーとして、実施例2で使用した配列番号11のプライマーと同じ塩基配列を持ち、LNA残基のみからなる8塩基長のオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号14)を使用したこと以外は実施例2と同様に第1の増幅工程を行い、インバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖を調製した。
配列番号14:5’−gtttggca−3’
上記配列中、LNA残基を小文字で示す。当該プライマーの製造は、グライナー・ジャパン社(東京都)に委託した。
<第2の増幅工程>
上記の精製後の試料をインバースPCR方法の鋳型として用いて、実施例2と同様にして、インバースPCR方法によりキシラナーゼ遺伝子の増幅を試みた。
上記の精製後の試料をインバースPCR方法の鋳型として用いて、実施例2と同様にして、インバースPCR方法によりキシラナーゼ遺伝子の増幅を試みた。
<増幅確認試験>
インバースPCR方法による増幅反応後の溶液を、実施例2と同様にしてアガロースゲル電気泳動に供した。このアガロースゲル電気泳動の結果を図9に示す。左端のLと記したレーンには分子量マーカーを流し、レーン1〜10には上記シロアリ由来の増幅産物を、レーン11および12には、ウマ由来の増幅産物を電気泳動した。この結果、得られた増幅産物は、ほとんどが非特異的増幅産物であった。
インバースPCR方法による増幅反応後の溶液を、実施例2と同様にしてアガロースゲル電気泳動に供した。このアガロースゲル電気泳動の結果を図9に示す。左端のLと記したレーンには分子量マーカーを流し、レーン1〜10には上記シロアリ由来の増幅産物を、レーン11および12には、ウマ由来の増幅産物を電気泳動した。この結果、得られた増幅産物は、ほとんどが非特異的増幅産物であった。
実施例2および実施例3の結果から、LNA残基のみからなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて第1の増幅工程を行い、次いでインバースPCR方法により第2の増幅工程を行って標的DNA配列を取得できない場合であっても、第1の増幅工程においてDNAおよびLNAから構成されるキメラプライマーを使用することにより、標的DNA配列を取得し得ることが明らかにされた。この結果は、LNAのみから構成されるプライマーよりも、DNAおよびLNAから構成されるキメラプライマーのほうが、第1のプライマーとしてより優れていることを示唆するものである。
本発明により、標的DNA配列を増幅するためのインバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖の生産方法が提供される。本発明の生産方法によれば、DNA試料中に含まれる標的DNA配列を有する標的DNA鎖が、従来のインバースPCR方法では増幅できないほど微量であっても、インバースPCR方法により上記標的DNA配列を増幅することができる、インバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖を提供である。また、当該生産方法を実施するために有用なキットを提供することも、本発明の範疇にある。
Claims (9)
- 標的DNA鎖、DNAポリメラーゼ、少なくとも1残基のLNAを有するオリゴヌクレオチドおよび4種のdNTPを少なくとも含む系において、上記標的DNA鎖を鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして、プライマー伸長反応をさせる工程を包含することを特徴とするインバースPCR方法に用いる鋳型DNA鎖の生産方法。
- 標的DNA鎖が、環状DNAである請求項1に記載の生産方法。
- DNAポリメラーゼが、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼである請求項1または2に記載の生産方法。
- DNAポリメラーゼが、Phi29 DNAポリメラーゼおよびBst DNAポリメラーゼからなる群から選択される少なくとも1種である請求項1〜3のいずれか1項に記載の生産方法。
- オリゴヌクレオチドが、6〜12塩基長である請求項1〜4のいずれか1項に記載の生産方法。
- オリゴヌクレオチドが、2〜4残基のLNAを有するものである請求項1〜5のいずれか1項に記載の生産方法。
- 標的DNA鎖が、環境DNAから得られるものである請求項1〜6のいずれか1項に記載の生産方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の鋳型DNA鎖の生産方法に用いるキットであって、Phi29 DNAポリメラーゼ、少なくとも1残基のLNAを有するオリゴヌクレオチドおよび4種のdNTPを少なくとも含むことを特徴とするキット。
- 以下の工程(a)および(b)を包含することを特徴とする試料中の標的DNA配列を増幅する方法。
(a)標的DNA配列を有する標的DNA鎖、DNAポリメラーゼおよび少なくとも1残基のLNAを有するオリゴヌクレオチドを少なくとも含む系において、上記標的DNA鎖を鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして、プライマー伸長反応をさせる工程、
(b)工程(a)で得られたプライマー伸長反応産物を鋳型として、インバースPCR方法により上記標的DNA配列を増幅する工程。
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---|---|---|---|
JP2007046046A JP2007252373A (ja) | 2006-02-27 | 2007-02-26 | インバースpcr方法に用いる鋳型dna鎖の生産方法 |
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JP2006049825 | 2006-02-27 | ||
JP2007046046A JP2007252373A (ja) | 2006-02-27 | 2007-02-26 | インバースpcr方法に用いる鋳型dna鎖の生産方法 |
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
JP2014103948A (ja) * | 2012-11-29 | 2014-06-09 | Hiroshima Univ | 標的dnaの特異的増幅方法 |
-
2007
- 2007-02-26 JP JP2007046046A patent/JP2007252373A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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