ES2825708T3 - Métodos para usar exosomas para monitorizar el estado de órgano trasplantado - Google Patents

Abstract

Método in vitro para monitorizar el estado de órgano trasplantado en un sujeto, que comprende: aislar, purificar o identificar microvesículas derivadas de órgano de donante a partir de una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto que ha recibido un trasplante de un donante detectando una proteína de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) específica para el donante en las microvesículas derivadas de órgano de donante.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para usar exosomas para monitorizar el estado de órgano trasplantado

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional estadounidense con n.° de serie 62/025.858, presentada el 17 de julio de 2014.

Antecedentes

El trasplante de un tejido u órgano injertado de un donante a un paciente huésped es una característica de determinados protocolos de tratamiento y procedimientos médicos y puede mejorar significativamente la supervivencia y calidad de vida del paciente. A pesar de esfuerzos por evitar el rechazo de injerto haciendo coincidir el tipo de tejido de huésped-donante, en los procedimientos de trasplante, en los que se introduce un órgano de donante en un huésped, generalmente se requiere terapia inmunosupresora para mantener la viabilidad del órgano de donante en el receptor. Sin embargo, a pesar del amplio uso de terapia inmunosupresora, muchos pacientes experimentan complicaciones asociadas con el órgano trasplantado, tales como rechazo agudo y crónico, exceso de inmunosupresión e infección.

La detección temprana de rechazo de órgano es una preocupación clínica en el cuidado de receptores de trasplantes. La detección de rechazo antes de la aparición de disfunción de injerto permite un tratamiento satisfactorio de este estado con inmunosupresión agresiva. Además, es igualmente importante reducir la inmunosupresión en pacientes que no tienen rechazo de órgano para minimizar la toxicidad farmacológica. Muchos episodios de rechazo de trasplante de riñón se detectan midiendo periódicamente la función del riñón trasplantado, por ejemplo, usando pruebas bioquímicas tales como ensayos que miden las concentraciones de creatinina en suero. Adicionalmente, en el trasplante de hígado, se usa la monitorización de enzimas hepáticas en el suero del receptor para monitorizar el estado del hígado trasplantado.

Pequeñas microvesículas liberadas por células se conocen como exosomas (Thery et al., 2002). Los exosomas son microvesículas (30-200 nm) específicas de tejido y de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) con cargamento de ARN estable que refleja el estado condicional del tejido que los libera. Los exosomas también participan en la comunicación entre células funcionando como vehículos de transporte para proteínas, ARN, ADN, virus y priones. Desde su descubrimiento, se encuentra en desarrollo un número creciente de aplicaciones terapéuticas que usan exosomas derivados de diversas células productoras, tales como células dendríticas (DC), linfocitos T, células tumorales y líneas celulares (Thery et al., 2002 y Delcayre et al., 2005). Por ejemplo, los exosomas derivados de DC (también denominados dexosomas) pulsados con péptidos derivados de antígenos tumorales provocan respuestas antitumorales en un modelo de animal para el tumor coincidente (Zitvogel et al., 1998). Recientemente, se han completado dos ensayos clínicos de fase I que usan dexosomas autólogos para el tratamiento de cáncer de pulmón (Morse et al., 2005) y melanoma (Escudier et al., 2005), respectivamente. Existe una necesidad crítica de un método para monitorizar el estado de órgano trasplantado.

Sumario

La presente invención proporciona un método in vitro para monitorizar el estado de órgano trasplantado en un sujeto que comprende aislar, purificar o identificar una o más microvesículas derivadas de órgano de donante a partir de una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto que ha recibido un trasplante de un donante detectando una proteína de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) específica para el donante en las microvesículas derivadas de órgano de donante. En determinadas realizaciones, el método puede incluir además el aislamiento de microvesículas específicas de tejido.

La presente invención proporciona un método in vitro para el aislamiento, la identificación o la purificación de microvesículas derivadas de órgano de donante que comprende aislar, purificar o identificar microvesículas derivadas de órgano de donante a partir de la muestra biológica obtenida a partir de un sujeto que ha recibido un trasplante de un donante mediante la detección de una proteína de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) específica para el donante en las microvesículas derivadas de naranja de donante.

La proteína puede ser una proteína de superficie celular que es específica para el tipo de célula del órgano de donante.

En determinadas realizaciones no limitativas, la muestra biológica puede ser un líquido corporal tal como sangre, orina, saliva, secreciones nasotraqueales, líquido amniótico, leche materna o ascitis. En determinadas realizaciones, la muestra biológica puede ser una muestra de sangre. En realizaciones no limitativas específicas, las microvesículas pueden purificarse, aislarse y/u obtenerse en una o más muestras biológicas a partir de un sujeto. El uso de un líquido corporal como muestra biológica hace posible eliminar la invasividad del procedimiento de diagnóstico o pronóstico y reduce drásticamente la carga de la exploración sobre el sujeto.

La divulgación también se refiere a kits para monitorizar el estado de un órgano trasplantado de un sujeto, en los que el kit que contiene reactivos útiles para aislar, purificar y/o identificar las microvesículas derivadas de órgano de donante en una muestra biológica.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A-C. Trasplante de xenoislotes. (A) Dispositivo Nanosight en modo de dispersión de la luz y fluorescente para xenotrasplante. (B) Dispositivo Nanosight para control negativo. (C) Inmunotransferencia de tipo Western de microvesículas con anticuerpo anti-CD63 humano de 3 xenotrasplantes (carriles 1-3) y control negativo (carril 4).

Figura 2. Se muestra análisis con dispositivo Nanosight en modo fluorescente para análisis de puntos cuánticos de anticuerpo específico para BALB/c (donante) y B6 (receptor) para coincidencia errónea completa y control negativo.

Figuras 3A-E. Detección y purificación de exosomas a partir de receptores de trasplantes renales humanos. (A) Se muestran perfiles de antígenos de leucocitos humanos (HLA) de donante-receptor relevantes. (B) En el dispositivo Nanosight, se observaron exosomas positivos para HLA-A2 y HLA-B27 en el plasma de donante (i), y el plasma de receptor en el día 4 tras el trasplante (iii), pero no en el plasma de receptor antes del trasplante (ii). (C) En inmunotransferencia de tipo Western, las fracciones de exosomas en plasma unidos a HLA-A2 a partir del receptor antes del trasplante y tras la implantación de riñón, pero antes de la perfusión del órgano de donante fueron negativas para acuaporina 2 (marcador epitelial renal), pero la muestra de receptor en el día 4 tras el trasplante fue positiva para acuaporina 2. (D) Se analizaron exosomas en orina para determinar la presencia de HLA-A2. (E) Las fracciones de exosomas en orina unidos a HLA-A2 a partir del día 4 y día 30 posoperatorios mostraron expresión de marcador glomerular renal, podocalixina 1, pero tal expresión no se observó en la muestra antes del trasplante.

Figuras 4A-D. Detección de señal de islote humano de trasplante en exosomas en plasma de ratón receptor en un modelo de trasplante de xenoislotes. (A) Se analizaron exosomas en el modo de fluorescencia del dispositivo NanoSight NS300 usando puntos cuánticos anti-HLA-A. Se detectó la señal positiva de HLA-A en exosomas de xenoislotes (i), exosomas en plasma humanos (control positivo) (ii), pero no en exosomas en plasma de ratón no sometido a tratamiento (iii) (p<0,0001). Los exosomas aislados a partir de sobrenadante de cultivo de islotes humanos in vitro también presentaron tinción positiva para señal de HLA-A (iv). (B) Se obtuvieron resultados similares cuando se marcaron exosomas con otro MHC específico de ser humano, punto cuántico de HLA-C. (C) El análisis por inmunotransferencia de tipo Western confirmó la expresión de HLA-A y HLA-C en combinación de exosomas en plasma totales de muestra de ratón de xenoislotes, exosomas en sobrenadante de cultivo de islotes in vitro, exosomas en plasma humanos, pero no en exosomas en plasma de ratón no sometido a tratamiento. (D) Se realizó una escisión de injerto de islotes en 6 animales con xenoislotes. En muestra de exosomas en plasma del día 21 después de la escisión de injerto de islotes, la señal de puntos cuánticos de HLA-A no pudo detectarse en el dispositivo NanoSight.

Descripción detallada

La presente divulgación proporciona técnicas relacionadas con el uso de microvesículas, identificadas en el presente documento, para monitorizar el estado de un órgano trasplantado en un sujeto. La presente divulgación, en determinadas realizaciones, proporciona además métodos para aislar, purificar y/o identificar microvesículas derivadas de órgano de donante liberadas en los líquidos corporales de un sujeto. En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos y kits para aislar, purificar y/o identificar una o más microvesículas derivadas de órgano de donante en una muestra biológica de un sujeto.

Las prácticas médicas se basan en parámetros histológicos o clínicos para monitorizar el estado y/o la función de corazones y pulmones trasplantados, y no existe ningún método de detección y monitorización no invasiva de corazones o pulmones trasplantados. Por ejemplo, para pacientes que se someten a trasplante cardiaco, se extraen biopsias de endomiocardio de vigilancia a intervalos semanales hasta las 6 semanas, después a intervalos de 2 semanas hasta los 3 meses. Además, se realiza un seguimiento de cualquier biopsia positiva mediante una biopsia repetida una semana después para asegurarse de que la terapia anti-rechazo ha sido satisfactoria. Los pacientes también se someten a biopsias adicionales cuando está clínicamente indicado, dando como resultado que un paciente se somete a múltiples biopsias dentro del plazo del primer año de trasplante. Por tanto, la detección de microvesículas derivadas de órgano de donante que circulan en un líquido biológico de un receptor, tal como se describe en el presente documento, proporciona un ensayo no invasivo y urgente para monitorizar el estado de un órgano trasplantado, especialmente, en el caso de corazón y pulmones trasplantados.

Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, “trasplante” se refiere al procedimiento de tomar una célula, tejido u órgano, denominado “trasplante” o “injerto”, de un sujeto y colocarlo o colocarlos en un sujeto (habitualmente) diferente. El sujeto que proporciona el trasplante se denomina “donante” y el sujeto que recibe el trasplante se denomina “receptor”. Un órgano, o injerto, trasplantado entre dos sujetos genéticamente diferentes de la misma especie se denomina “aloinjerto”. Un injerto trasplantado entre sujetos de especies diferentes se denomina “xenoinjerto”. Los ejemplos de órganos trasplantados que pueden monitorizarse mediante los métodos dados a conocer en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, corazón, pulmones, riñón, hígado, islotes y páncreas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra biológica” se refiere a una muestra de material biológico obtenida a partir de un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, incluyendo un líquido biológico, por ejemplo, sangre, plasma, suero, orina, esputo, líquido espinal, líquido pleural, aspirados de pezón, líquido linfático, líquido de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, líquido lacrimal, saliva, leche materna, líquido del sistema linfático, semen, líquido cerebroespinal, líquido de sistema intra-orgánico, líquido ascítico, líquido de quiste tumoral, líquido amniótico, líquido bronquioalveolar, líquido biliar y combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones no limitativas, las microvesículas derivadas de órgano de donante se aíslan y/o purifican a partir de una muestra de sangre obtenida a partir de un sujeto. En determinadas realizaciones no limitativas, las microvesículas derivadas de órgano de donante se aíslan y/o a partir de una muestra de orina obtenida a partir de un sujeto.

El término “paciente” o “sujeto”, tal como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a cualquier animal de sangre caliente, por ejemplo, un ser humano. Los ejemplos no limitativos de sujetos no humanos incluyen primates no humanos, perros, gatos, ratones, ratas, cobayas, conejos, aves, cerdos, caballos, vacas, cabras, ovejas, etc.

El término “microvesícula” tal como se usa en el presente documento, se refiere a vesículas que se liberan a partir de una célula. En determinadas realizaciones, la microvesícula es una vesícula que se libera a partir de una célula mediante exocitosis de cuerpos multivesiculares intracelulares. En determinadas realizaciones, las microvesículas pueden ser exosomas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “rechazo de trasplante” se define como deterioro funcional y/o estructural de un órgano. El rechazo de trasplante puede incluir deterioro funcional y/o estructural debido a una respuesta inmunitaria activa expresada por el receptor, e independiente de causas no inmunológicas de disfunción de órgano. El rechazo de trasplante puede incluir lesión de órgano de donante, tal como una infección del órgano de trasplante.

Métodos

La presente divulgación, en determinadas realizaciones, proporciona un método para monitorizar el estado de un órgano trasplantado monitorizando las microvesículas liberadas a partir del órgano de donante. En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para aislar, detectar o purificar microvesículas derivadas de un órgano de donante trasplantado en un receptor para monitorizar el estado condicional de un órgano trasplantado. En determinadas realizaciones, los métodos de la presente divulgación pueden incluir además la detección de uno o más marcadores específicos para el órgano de donante para confirmar el aislamiento o la purificación de microvesículas derivadas de órgano de donante, por ejemplo, exosomas.

En determinadas realizaciones, el método para monitorizar el estado de órgano trasplantado en un sujeto, que comprende aislar, purificar o identificar microvesículas derivadas de órgano de donante a partir de una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto que ha recibido un trasplante de un donante detectando una proteína de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) específica para el donante en las microvesículas derivadas de órgano de donante. En determinadas realizaciones, el método puede incluir enriquecer microvesículas derivadas de órgano de donante para microvesículas que se originan a partir de un tipo de célula y/o tejido específico. En determinadas realizaciones, el método puede incluir confirmar que las microvesículas derivadas de órgano de donante se originaron a partir de un tipo de célula y/o tejido específico.

El método para aislar, identificar o purificar microvesículas derivadas de donante puede comprender aislar, purificar o identificar una o más microvesículas derivadas de órgano de donante a partir de la muestra biológica mediante la detección de un marcador específico para el órgano que se trasplantó en el receptor. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el marcador puede ser una proteína de superficie de microvesícula que es específica para las células del órgano de donante, por ejemplo, una proteína específica para una célula de riñón, tal como se detalla a continuación.

La muestra de microvesículas puede incluir microvesículas derivadas del órgano donado (o células del mismo) y/o microvesículas derivadas de un órgano de receptor (o células del mismo).

En determinadas realizaciones, las microvesículas derivadas de órgano de donante pueden ser exosomas. En determinadas realizaciones, las microvesículas pueden estar en el intervalo de tamaño de desde aproximadamente 30 nm hasta 1000 nm. Por ejemplo, y no a modo de limitación, las microvesículas pueden tener un tamaño de desde aproximadamente 30 nm hasta aproximadamente 900 nm, desde aproximadamente 30 nm hasta aproximadamente 800 nm, desde aproximadamente 30 nm hasta aproximadamente 700 nm, desde aproximadamente 30 nm hasta aproximadamente 600 nm, desde aproximadamente 30 nm hasta aproximadamente 500 nm, desde aproximadamente 30 nm hasta aproximadamente 400 nm, desde aproximadamente 30 nm hasta aproximadamente 300 nm, desde aproximadamente 30 nm hasta aproximadamente 200 nm, desde aproximadamente 30 nm hasta aproximadamente 100 nm o desde aproximadamente 30 nm hasta aproximadamente 50 nm.

En determinadas realizaciones, y tal como se indicó anteriormente, los métodos para evaluar el estado de órgano trasplantado en el sujeto, y/o el aislamiento o la purificación de microvesículas derivadas de donante a partir de un sujeto, pueden incluir obtener al menos una muestra biológica a partir del sujeto. En determinadas realizaciones, las microvesículas pueden detectarse en sangre (incluyendo plasma o suero) o en orina, o alternativamente al menos una microvesícula puede detectarse en una muestra, por ejemplo, la sangre, plasma o suero, y al menos otra microvesícula se detecta en otra muestra, por ejemplo, en orina. La etapa de recoger una muestra biológica puede llevarse a cabo o bien directa o bien indirectamente mediante cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, y no a modo de limitación, una extracción de muestra de sangre a partir de un sujeto puede llevarse a cabo mediante flebotomía o cualquier otra técnica adecuada, procesándose adicionalmente la muestra de sangre para proporcionar una muestra de suero u otra fracción de sangre adecuada.

En determinadas realizaciones, la información proporcionada por los métodos descritos en el presente documento puede usarse por el médico en la determinación del curso de tratamiento más eficaz (por ejemplo, preventivo o terapéutico). Un curso de tratamiento se refiere a las medidas tomadas para un paciente después de realizarse la evaluación del riesgo aumentado de rechazo de órgano. Por ejemplo, cuando se identifica que un sujeto tiene un riesgo aumentado de rechazo de órgano, el médico puede determinar si se requiere una monitorización frecuente de microvesículas derivadas de órgano de donante como medida profiláctica.

Técnicas de aislamiento de microvesículas

Pueden aislarse microvesículas derivadas de órgano de donante en circulación a partir de un sujeto mediante cualquier medio conocido en la técnica y actualmente disponible. Pueden aislarse microvesículas derivadas de órgano de donante en circulación a partir de una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto, tal como una muestra de sangre u otro líquido biológico. En determinadas realizaciones, las microvesículas derivadas de órgano de donante en circulación pueden aislarse a partir de la orina del receptor. En determinadas realizaciones, las microvesículas pueden ser exosomas.

Hay varias plataformas de captura y enriquecimiento que se conocen en la técnica y están actualmente disponibles. Por ejemplo, pueden aislarse microvesículas mediante un método de centrifugación diferencial tal como se describe por Raposo et al., 1996. Los métodos adicionales incluyen cromatografía de intercambio de aniones y/o de permeación en gel tal como se describe en las patentes estadounidenses n.os 6.899.863 y 6.812.023. Se describen métodos de gradientes de densidad de sacarosa o electroforesis de orgánulos en la patente estadounidense n.° 7.198.923. Se describe un método de clasificación celular activada magnéticamente (MACS) en Taylor y Gercel-Taylor, 2008. Se describe un método de concentrador por ultrafiltración en nanomembrana en Cheruvanky et al., 2007. Pueden identificarse y aislarse microvesículas a partir de una muestra biológica de un sujeto mediante una tecnología de microchip recién desarrollada que usa una plataforma microfluídica única para separar de manera eficaz y selectiva microvesículas (Nagrath et al., 2007). Esta tecnología puede adaptarse para identificar y separar microvesículas usando principios similares de captura y separación.

En determinadas realizaciones, las microvesículas derivadas de órgano de donante pueden purificarse, aislarse y/o identificarse mediante la detección de un marcador específico para el órgano de donante y/o para el tipo de célula del órgano donado. En determinadas realizaciones, el marcador puede ser ácidos nucleicos y/o proteínas que residen en la superficie o dentro de las microvesículas. Las microvesículas, por ejemplo, exosomas, pueden aislarse a partir de una muestra biológica y analizarse usando cualquier método conocido en la técnica. Las secuencias de ácido nucleico, fragmentos de las mismas y proteínas y fragmentos de las mismas pueden aislarse y/o identificarse en una muestra biológica usando cualquier método conocido en la técnica, tal como se describe a continuación.

En determinadas realizaciones, las microvesículas aisladas a partir de una muestra biológica pueden enriquecerse para las liberadas a partir del órgano de donante mediante el uso de las proteínas de MHC (complejo mayor de histocompatibilidad) que residen en la superficie de las microvesículas. Por ejemplo, y no a modo de limitación, las microvesículas derivadas de órgano de donante pueden aislarse mediante la detección de proteínas de MHC específicas para el donante microvesículas en comparación con las microvesículas liberadas por el receptor, por ejemplo, mediante la detección de un alelo específico de los genes HLA-A y/o HLA-B en comparación con el receptor. En determinadas realizaciones, los métodos de la presente divulgación pueden incluir identificar las proteínas de MHC específicas presentes en la superficie de microvesículas derivadas de donante en comparación con microvesículas derivadas de órgano de receptor, seguido por el aislamiento de microvesículas derivadas de donante mediante la detección de una proteína de MHC específica identificada. Por ejemplo, y no a modo de limitación, pueden aislarse microvesículas derivadas de órgano de donante mediante el uso de perlas, por ejemplo, perlas magnéticas, que están conjugadas a anticuerpos que son específicos para una proteína presente en la superficie de microvesículas específicas de órgano de donante.

En determinadas realizaciones no limitativas, puede usarse cromatografía en gel basado en agarosa de alto límite de exclusión para aislar microvesículas a partir del plasma de un receptor (Taylor et al., 2005). Por ejemplo, y no a modo de limitación, para aislar la fracción de vesículas totales, puede fraccionarse la muestra de plasma usando una columna de Sepharose 2B de 2,5 x 30 cm, hacerse pasar de manera isocrática con PBS y puede monitorizarse la elución mediante absorbancia a 280 nm. Las fracciones que comprenden microvesículas pueden concentrarse hasta 2 ml usando una celda de ultrafiltración con agitación de Amicon con una membrana con un punto de corte de 500 K Dalton y puede usarse para la separación por afinidad de subpoblaciones de microvesículas específicas de órgano. Dado que las microvesículas dentro de la circulación se generan a partir de múltiples tipos de células, pueden usarse enfoques basados en afinidad para purificar específicamente subconjuntos de microvesículas (Taylor et al., 2005). Para el aislamiento por inmunoadsorción de poblaciones de microvesículas derivadas de órgano de trasplante, pueden incubarse de manera selectiva microvesículas en plasma de receptor con anticuerpos específicos para el perfil de MHC del donante acoplados con microperlas magnéticas. Después de la incubación durante 2 horas a 4°C, pueden colocarse los complejos de perlas magnéticas en el campo magnético del separador y pueden retirarse las microvesículas no unidas con el sobrenadante. Los subconjuntos de microvesículas derivadas de donante unidas pueden recuperarse y diluirse en tampón de elución de IgG (Pierce Chemical Co), centrifugarse y volver a suspenderse en PBS. La concentración de microvesículas de donante y la distribución de tamaño pueden determinarse usando el dispositivo NanoSight NS300. Los métodos adicionales para aislar microvesículas incluyen, pero no se limitan a, ultracentrifugación y ultracentrifugación basada en gradiente de sacarosa. En determinadas realizaciones, puede usarse el kit de aislamiento de microvesículas, EXOQUICK™, y/o el sistema EXO-FLOW™ de System Bioscience, Inc.

En determinadas realizaciones, las microvesículas aisladas a partir de una muestra biológica pueden enriquecerse para las que se originan a partir de un tipo de célula específico, por ejemplo, pero sin limitarse a, células de pulmón, páncreas, estómago, intestino, vejiga, riñón, ovarios, testículos, piel, colorrectales, de mama, próstata, cerebro, esófago, hígado, placenta o feto. Además, las microvesículas portan con frecuencia moléculas de superficie tales como antígenos a partir de sus células de donante, pueden usarse superficie moléculas, por ejemplo, proteínas, para identificar, aislar y/o enriquecer para microvesículas a partir de un tipo de célula específico (Al-Nedawi et al., 2008; Taylor y Gercel-Taylor, 2008). En determinadas realizaciones, las microvesículas pueden aislarse a partir de una muestra biológica de un sujeto y enriquecerse para las que se originan a partir de la célula del órgano que se trasplantó en el sujeto.

En determinadas realizaciones, pueden aislarse microvesículas basándose en las proteínas que residen en la superficie de las microvesículas, que son específicas del tipo de célula del que se originaron. Por ejemplo, y no a modo de limitación, puede usarse el antígeno de superficie puede ser molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM), que es específica para microvesículas de células de pulmón, colorrectales, de mama, próstata, cabeza y cuello y de origen hepático, pero no de origen de células hematológicas para aislar microvesículas (Balzar et al., 1999; Went et al., 2004). En determinadas realizaciones, el antígeno de superficie puede ser CD24, que es una glicoproteína específica para microvesículas de orina, y puede usarse para aislar y/o purificar microvesículas a partir del riñón (Keller et al., 2007). En determinadas realizaciones, el antígeno de superficie puede ser el marcador glomerular renal, podocalixina 1, que puede usarse para aislar y/o purificar microvesículas a partir del riñón. En determinadas realizaciones, el antígeno de superficie puede ser el marcador epitelial renal, acuaporina 2, que puede usarse para aislar y/o purificar microvesículas a partir del riñón.

El aislamiento de microvesículas a partir de tipos de células y/u órganos de donante específicos puede lograrse, por ejemplo, usando anticuerpos, aptámeros, análogos de aptámeros o polímeros molecularmente impresos específicos para un antígeno de superficie deseado. En determinadas realizaciones, el antígeno de superficie es específico para un tipo de célula de un órgano específico. Se proporciona un ejemplo no limitativo de un método de separación de microvesículas basándose en antígeno de superficie celular en la patente estadounidense n.° 7.198.923. Tal como se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 5.840.867 y 5.582.981, documento WO 2003/050290 y una publicación de Johnson et al., 2008, los aptámeros y sus análogos se unen específicamente a moléculas de superficie y pueden usarse como herramienta de separación para recuperar microvesículas específicas de tipo de célula. Los polímeros molecularmente impresos también reconocen específicamente moléculas de superficie tal como se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 6.525.154, 7.332.553 y 7.384.589 y Bossi et al., 2007 y son una herramienta para recuperar y aislar microvesículas específicas de tipo de célula. En determinadas realizaciones, pueden aislarse microvesículas basándose en el complejo de MHC que reside en la superficie de las microvesículas.

Técnicas de detección de proteínas

En determinadas realizaciones, los métodos de la presente divulgación pueden incluir la detección de uno o más marcadores específicos para el donante o el órgano de donante para confirmar el aislamiento y/o la purificación apropiados de exosomas derivados de órgano de donante. En determinadas realizaciones, el marcador para exosomas derivados de órgano de donante puede ser una proteína presente en la superficie y/o dentro de las microvesículas aisladas específicas de órganos de donante, por ejemplo, exosomas. Pueden aislarse proteínas a partir de una microvesícula usando cualquiera de varios métodos, que se conocen bien en la técnica, siendo el procedimiento de aislamiento particular elegido apropiado para la muestra biológica particular. En determinadas realizaciones, la proteína puede detectarse en la superficie de la microvesícula.

Los expertos en la técnica conocen bien métodos para la detección de proteínas e incluyen, pero no se limitan a, técnicas de espectrometría de masas, sistemas de análisis basados en gel en 1D o 2D, cromatografía, ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA), inmunotransferencia de tipo Western, inmunoprecipitación e inmunohistoquímica. Estos métodos usan anticuerpos, o equivalentes de anticuerpos, para detectar la proteína. También pueden usarse matrices de anticuerpos o chips de proteínas, véanse, por ejemplo, las solicitudes de patente estadounidense n.os: 2003/0013208A1; 2002/0155493A1, 2003/0017515 y las patentes estadounidenses n.os 6.329.209 y 6.365.418.

Pueden llevarse a cabo procedimientos de ELISA y RIA de tal manera que se marca un patrón de proteína (con un radioisótopo tal como 125I o 35S, o una enzima que puede someterse a ensayo, tal como peroxidasa del rábano o fosfatasa alcalina), y, junto con la muestra sin marcar de microvesículas, se pone en contacto con el anticuerpo correspondiente, en el que se usa un segundo anticuerpo para unirse al primero, y se somete a ensayo la radiactividad o la enzima inmovilizada (ensayo de competencia). Alternativamente, se deja que la proteína presente en y/o dentro de las microvesículas reaccione con el anticuerpo inmovilizado correspondiente, se deja que anticuerpo anti-marcador marcado con radioisótopo o enzima reaccione con el sistema, y se somete a ensayo la radiactividad o la enzima (ensayo ELISA tipo sándwich). También pueden emplearse otros métodos convencionales según sea adecuado.

Las técnicas anteriores pueden llevarse a cabo esencialmente como ensayo de “una etapa” o de “dos etapas”. Un ensayo de “una etapa” implica poner en contacto antígeno con anticuerpo inmovilizado y, sin lavado, poner en contacto la mezcla con anticuerpo marcado. Un ensayo de “dos etapas” implica lavar antes de poner en contacto la mezcla con anticuerpo marcado. También pueden emplearse otros métodos convencionales según sea adecuado. En determinadas realizaciones, la detección de un marcador de proteína a partir de una muestra de microvesículas derivadas de órgano de donante incluye las etapas de: poner en contacto la muestra de microvesículas con un anticuerpo o variante (por ejemplo, fragmento) del mismo que se une de manera selectiva al marcador de proteína, y detectar si el anticuerpo o variante del mismo se une a la muestra. El método puede incluir además poner en contacto la muestra con un segundo anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo marcado. El método puede incluir además una o más etapas de lavar, por ejemplo, para retirar uno o más reactivos.

Puede ser deseable inmovilizar un componente del sistema de ensayo en un soporte, permitiendo de ese modo que otros componentes del sistema se pongan en contacto con el componente y se retiren fácilmente sin trabajo excesivo y que requiere mucho tiempo. Es posible inmovilizar una segunda fase alejada de la primera, pero habitualmente una fase es suficiente.

Es posible inmovilizar la propia enzima en un soporte, pero si se requiere enzima en fase sólida, entonces generalmente esto se logra mejor mediante unión a anticuerpo y fijando el anticuerpo a un soporte, para lo cuales se conocen bien modelos y sistemas en la técnica. El polietileno simple puede proporcionar un soporte adecuado. Las enzimas que pueden emplearse para el marcaje no están particularmente limitadas, pero pueden seleccionarse de los miembros del grupo de oxidasas, por ejemplo. Estos catalizan la producción de peróxido de hidrógeno mediante reacción con sus sustratos, y con frecuencia se usa glucosa oxidasa por su buena estabilidad, facilidad de disponibilidad y precio económico, así como la fácil disponibilidad de su sustrato (glucosa). La actividad de la oxidasa puede someterse a ensayo midiendo la concentración de peróxido de hidrógeno formado tras la reacción del anticuerpo marcado con enzima con el sustrato en condiciones controladas bien conocidas en la técnica.

Pueden usarse otras técnicas para detectar un marcador de proteína según una preferencia del profesional basándose en la presente divulgación. Una técnica de este tipo es la inmunotransferencia de tipo Western (Towbin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 (1979)), en la que se hace pasar una muestra tratada de manera adecuada en un gel de SDS-PAGE antes de transferirse a un soporte sólido, tal como un filtro de. Después se ponen en contacto anticuerpos (sin marcar) con el soporte y se someten a ensayo mediante un reactivo inmunológico secundario, tal como proteína A marcada o anticuerpo anti-inmunoglobulina (incluyendo las etiquetas adecuadas 125I, peroxidasa del rábano y fosfatasa alcalina). También puede usarse detección cromatográfica.

También pueden usarse otros sistemas de máquinas o de obtención de imágenes automática para medir los resultados de inmunotinción para el marcador. Tal como se usa en el presente documento, inmunohistoquímica “cuantitativa” se refiere a un método automatizado de exploración y puntuación de muestras que se han sometido a inmunohistoquímica, para identificar y cuantificar la presencia de un marcador especificado, tal como un antígeno u otra proteína. La puntuación asignada a la muestra es una representación numérica de la intensidad de la tinción inmunohistoquímica de la muestra y representa la cantidad de marcador objetivo presente en la muestra. Tal como se usa en el presente documento, la densidad óptima (DO) es una puntuación numérica que representa la intensidad de tinción. Tal como se usa en el presente documento, inmunohistoquímica semicuantitativa se refiere a la puntuación de resultados inmunohistoquímicos a simple vista, en la que un operario con formación clasifica los resultados numéricamente (por ejemplo, como 1, 2 ó 3).

Hay diversos sistemas de procesamiento, exploración y análisis de muestras automatizados adecuados para su uso con inmunohistoquímica disponibles en la técnica. Tales sistemas pueden incluir tinción automatizada (véase, por ejemplo, el sistema Benchmark, Ventana Medical Systems, Inc.) y exploración con microscopio, análisis de imágenes computerizado, comparación de secciones en serie (para controlar la variación en la orientación y el tamaño de una muestra), generación de informes digitales y archivado y seguimiento de muestras (tales como portaobjetos en los que se colocan secciones de tejido). Hay sistemas de obtención de imágenes celulares comercialmente disponibles que combinan microscopios ópticos convencionales con sistemas de procesamiento de imágenes digitales para realizar análisis cuantitativo en células y tejidos, incluyendo muestras sometidas a inmunotinción. Véase, por ejemplo, el sistema CAS-200 (Becton, Dickinson & Co.).

Otro método que puede usarse para detectar marcadores de proteína es la inmunotransferencia de tipo Western. Puede realizarse la inmunodetección con anticuerpo frente a un marcador de proteína usando el sistema de quimioluminiscencia potenciada (por ejemplo, de PerkinElmer Life Sciences, Boston, Mass.). Después puede separarse la membrana y volver a someterse a transferencia con un anticuerpo de control, por ejemplo, anticuerpo policlonal anti-actina (A-2066) de Sigma (St. Louis, Mo.).

También pueden usarse anticuerpos contra marcadores de proteína con fines de obtención de imágenes, por ejemplo, para detectar la presencia de microvesículas derivadas de órgano de donante en una muestra de microvesículas obtenida a partir de la sangre de un receptor. Las etiquetas adecuadas incluyen radioisótopos, yodo (125I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (112In) y tecnecio (99mTc), etiquetas fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina y biotina. Pueden visualizarse interacciones inmunoenzimáticas usando diferentes enzimas tales como peroxidasa, fosfatasa alcalina o diferentes cromógenos tales como DAB, AEC o Fast Red.

Con fines de obtención de imágenes in vivo, los anticuerpos no pueden detectarse, como tales, desde el exterior del organismo, y por tanto deben marcarse, o modificarse de otro modo, para permitir la detección. Las etiquetas para este fin pueden ser cualquiera que no interfiere sustancialmente con la unión de anticuerpo, pero que permite la detección externa. Las etiquetas adecuadas pueden incluir las que pueden detectarse mediante radiografía de rayos X, RMN o IRM. Para técnicas de radiografía de rayos X, las etiquetas adecuadas incluyen cualquier radioisótopo que emite radiación detectable pero que no es excesivamente perjudicial para el sujeto, tal como bario o cesio, por ejemplo. Las etiquetas adecuadas para RMN e IRM incluyen generalmente aquellas con un espín característico detectable, tales como deuterio, que puede incorporarse en el anticuerpo mediante marcaje adecuado de nutrientes para el hibridoma relevante, por ejemplo.

El tamaño del sujeto y el sistema de obtención de imágenes usado determinarán la cuantidad de resto de obtención de imágenes necesario para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de un resto de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radiactividad inyectada oscilará normalmente entre aproximadamente 5 y 20 milicurios de tecnecio-99 m.

Después, el anticuerpo marcado o fragmento de anticuerpo se acumulará preferiblemente en la ubicación de la muestra que contiene un marcador de proteína. Después puede detectarse el anticuerpo marcado o variante del mismo, por ejemplo, fragmento de anticuerpo, usando técnicas conocidas. Los anticuerpos para su uso en la presente divulgación incluyen cualquier anticuerpo, ya sea natural o sintético, de longitud completa o un fragmento del mismo, monoclonal o policlonal, que se une de manera suficientemente fuerte y específica al marcador que va a detectarse. Un anticuerpo puede tener una Kd de cómo máximo aproximadamente 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10­ 10 M, 10-11 M, 10-12 M. La frase “se une específicamente” se refiere a la unión, por ejemplo, de un anticuerpo a un epítopo o antígeno o determinante antigénico de tal manera que la unión puede someterse a desplazamiento o competencia con una segunda preparación de epítopo, antígeno o determinante antigénico idéntico o similar.

Los anticuerpos y derivados de los mismos que pueden usarse abarcan anticuerpos policlonales o monoclonales, anticuerpos quiméricos, humanos, humanizados, primatizados (con injerto de CDR), revestidos o de cadena sencilla, anticuerpos producidos en fase (por ejemplo, a partir de bibliotecas de presentación en fagos), así como fragmentos de unión funcionales, de anticuerpos. Por ejemplo, pueden usarse fragmentos de anticuerpos que pueden unirse a un marcador, o porciones del mismo, incluyendo, pero sin limitarse a, fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab')². Tales fragmentos pueden producirse mediante escisión enzimática o mediante técnicas recombinantes. Por ejemplo, la escisión con papaína o pepsina puede generar fragmentos Fab o F(ab')², respectivamente. También pueden usarse otras proteasas con la especificidad de sustrato requerida para generar fragmentos Fab o F(ab')². También pueden producirse anticuerpos en una variedad de formas truncadas usando genes de anticuerpos en los que se han introducido uno o más codones de terminación en el sentido de 5' del sitio de terminación natural. Por ejemplo, puede diseñarse un gen quimérico que codifica para una porción de cadena pesada de F(ab')² para incluir secuencias de ADN que codifican para el dominio CH y la región bisagra de la cadena pesada.

Se describen anticuerpos sintéticos y modificados por ingeniería, por ejemplo, en Cabilly et al., patente estadounidense n.° 4.816.567; Cabilly et al., patente europea n.° 0.125.023 B1; Boss et al., patente estadounidense n.° 4.816.397; Boss et al., patente europea n.° 0.120.694 B1; Neuberger, M. S. et al., documento WO 86/01533; Neuberger, M. S. et al., patente europea n.° 0.194.276 B1; Winter, patente estadounidense n.° 5.225.539; Winter, patente europea n.° 0.239.400 B1; Queen et al., patente europea n.° 0451216 B1; y Padlan, E. A. et al., documento EP 0519596 A1. Véase también, Newman, R. et al., BioTechnology, 10: 1455-1460 (1992), con respecto a anticuerpo primatizado, y Ladner et al., patente estadounidense n.° 4.946.778 y Bird, R. E. et al., Science, 242: 423­ 426 (1988)) con respecto a anticuerpos de cadena sencilla.

En determinadas realizaciones, se usan agentes que se unen específicamente a un polipéptido distintos de anticuerpos, tales como péptidos. Pueden identificarse péptidos que se unen específicamente mediante cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, bibliotecas de presentación de péptidos en fagos. Generalmente, puede usarse un agente que puede detectar un polipéptido de marcador, de tal manera que se detecta y/o se cuantifica la presencia de un marcador. Tal como se define en el presente documento, un “agente” se refiere a una sustancia que puede identificar o detectar un marcador de proteína en una muestra (por ejemplo, identifica o detecta el ARNm de un marcador, el ADN de un marcador, la proteína de un marcador). En determinadas realizaciones, el agente es un anticuerpo marcado o que puede marcarse que se une específicamente a un polipéptido de marcador. Además, puede detectarse un marcador de proteína usando espectrometría de masas tal como MALDI/TOF (tiempo de vuelo), SELDI/TOF, cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (CL-EM), cromatografía de gasesespectrometría de masas (CG-EM), cromatografía de líquidos de alta resolución-espectrometría de masas (HPLC-^{e M ) ,} electroforesis capilar-espectrometría de masas, espectrometría por resonancia magnética nuclear o espectrometría de masas en tándem (por ejemplo, EM/EM, EM/EM/EM, ESI-EM/EM, etc.). Véanse, por ejemplo, las solicitudes de patente estadounidense n.os: 2003/0199001, 2003/0134304, 2003/0077616.

Los métodos de espectrometría de masas se conocen bien en la técnica y se han usado para detectar biomoléculas, tales como proteínas (véase, por ejemplo, Li et al. (2000) Tibtech 18:151-160; Rowley et al. (2000) Methods 20: 383­ 397; y Kuster y Mann (1998) Curr. Opin. Structural Biol. 8: 393-400). Además, se han desarrollado técnicas de espectrometría de masas que permiten una secuenciación de novo al menos parcial de proteínas aisladas. Chait et al., Science 262:89-92 (1993); Keough et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:7131-6 (1999); revisado en Bergman, EXS 88:133-44 (2000).

En determinadas realizaciones, puede usarse un espectrofotómetro de iones en fase de gas. En otras realizaciones, se usa espectrometría de masas con desorción/ionización por láser para analizar la muestra. Puede ponerse en práctica espectrometría de masas con desorción/ionización por láser moderna (“LDI-EM”) en dos variaciones principales: espectrometría de masas con desorción/ionización por láser asistida por matriz (“MALDI”) y desorción/ionización por láser potenciada en superficie (“SELDI”). En MALDI, se mezcla el analito con una disolución que contiene una matriz y se coloca una gota del líquido en la superficie de un sustrato. Después se cristaliza conjuntamente la disolución de matriz con las moléculas biológicas. Se inserta el sustrato en el espectrómetro de masas. Se dirige energía de láser a la superficie de sustrato en la que desorbe e ioniza las moléculas biológicas sin fragmentarlas significativamente. Sin embargo, MALDI tiene limitaciones como herramienta analítica. No proporciona medios para fraccionar la muestra y el material de matriz puede interferir con la detección, especialmente para analitos de bajo peso molecular. Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.118.937 (Hillenkamp et al.), y la patente estadounidense n.° 5.045.694 (Beavis y Chait).

Para información adicional referente a espectrómetros de masas, véase, por ejemplo, Principles of Instrumental Analysis, 3a edición. Skoog, Saunders College Publishing, Filadelfia, 1985; y Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4a ed. vol. 15 (John Wiley & Sons, Nueva York 1995), págs. 1071-1094.

La detección de la presencia de un marcador u otras sustancias puede implicar la detección de intensidad de señal. Esto, a su vez, puede reflejar la cantidad y el carácter de un polipéptido unido al sustrato. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, puede compararse la intensidad de señal de valores pico de espectros de una primera muestra y una segunda muestra (por ejemplo, visualmente, mediante análisis informático, etc.), para determinar las cantidades relativas de un marcador particular. Pueden usarse programas de software tales como el programa Biomarker Wizard (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.) para ayudar en el análisis de espectros de masas. Los expertos en la técnica conocen bien los espectrómetros de masas y sus técnicas.

Cualquier experto en la técnica entiende que cualquiera de los componentes de un espectrómetro de masas (por ejemplo, fuente de desorción, analizador de masas, elemento de detección, etc.) y preparaciones de muestra variadas pueden combinarse con otros componentes o preparaciones adecuados descritos en el presente documento o con los conocidos en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones una muestra de control puede contener átomos pesados (por ejemplo, 13C) permitiendo así mezclar la muestra de prueba con la muestra de control conocida en la misma serie de espectrometría de masas.

En determinadas realizaciones, se usa un espectrómetro de masas con tiempo de vuelo de desorción por láser (TOF). En la espectrometría de masas con desorción por láser, se introduce un sustrato con un marcador unido en un sistema de entrada. Se desorbe el marcador y se ioniza para formar la fase de gas mediante láser a partir de la fuente de ionización. Los iones generados se recogen mediante un conjunto de óptica de iones y después, en un analizador de masas de tiempo de vuelo, se aceleran los iones a través de un campo de alta tensión orto y se dejan a la deriva en una cámara de alto vacío. En el extremo alejado de la cámara de alto vacío, los iones acelerados golpean contra una superficie de detector sensible a un tiempo diferente. Dado que el tiempo de vuelo es una función de la masa de los iones, el tiempo transcurrido entre la formación de iones y el impacto en el detector de iones puede usarse para identificar la presencia o ausencia de moléculas con una razón de masa con respecto a carga específica.

Técnicas de detección de ARN

Los métodos de la presente divulgación pueden incluir la detección de uno o más marcadores específicos para el donante y/o el órgano de donante para confirmar el aislamiento y/o la purificación apropiados de exosomas derivados de órgano de donante. El marcador puede ser un ácido nucleico, incluyendo ^{A d N} y/o ARN, contenido dentro de las microvesículas aisladas específicas de órgano de donante, por ejemplo, exosomas. Las moléculas de ácido nucleico pueden aislarse a partir de una microvesícula usando cualquiera de varios métodos, que se conocen bien en la técnica, siendo el procedimiento de aislamiento particular elegido apropiado para la muestra biológica particular. En determinados casos, con algunas técnicas, también puede ser posible analizar el ácido nucleico sin extracción a partir de la microvesícula.

La detección de ácidos nucleicos presentes en las microvesículas puede ser cuantitativa y/o cualitativa. Puede usarse cualquier método para detectar de manera cualitativa o cuantitativa un marcador de ácido nucleico. La detección de transcritos de ARN puede lograrse, por ejemplo, mediante transferencia de tipo Northern, en la que se hace pasar una preparación de ARN en un gel de agarosa desnaturalizante, y se transfiere a un soporte adecuado, tal como celulosa activada, nitrocelulosa o membranas de vidrio o nailon. Después se hibrida ADNc o ARN radiomarcado con la preparación, se lava y se analiza mediante autorradiografía.

La detección de transcritos de ARN puede lograrse además usando métodos de amplificación. Por ejemplo, se encuentra dentro del alcance de la presente divulgación someter ARNm a transcripción inversa para dar ADNc seguido por reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR); o usar una única enzima para ambas etapas tal como se describe en la patente estadounidense n.° 5.322.770, o someter ARNm a transcripción inversa para dar ADNc seguido por reacción en cadena de la ligasa con huecos simétricos (RT-AGLCR) tal como se describe por R. L. Marshall, et al., PCR Methods and Applications 4: 80-84 (1994). Puede usarse reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) para detectar ARN.

Otros métodos de amplificación conocidos que pueden usarse en el presente documento incluyen, pero no se limitan а, la denominada técnica “NASBA” o “3^s R” descrita en PNAS USA 87: 1874-1878 (1990) y también descrita en Nature 350 (n.° 6313): 91-92 (1991); la amplificación Q-beta tal como se describe en la solicitud de patente europea publicada (EPA) n.° 4544610; la amplificación por desplazamiento de cadena (tal como se describe en G. T. Walker et al., Clin. Chem. 42: 9-13 (1996) y la solicitud de patente europea n.° 684315; y la amplificación mediada por diana, tal como se describe en la publicación PCT WO9322461.

También puede emplearse visualización de hibridación in situ. Otro método para detectar ARNm en una muestra de microvesículas es detectar niveles de ARNm de un marcador mediante hibridación in situ fluorescente (FISH). FISH es una técnica que puede identificar directamente una secuencia específica de ADN o ARN en una célula, muestra de microvesículas o muestra biológica y por tanto permite la determinación visual de la presencia y/o expresión de marcador en muestras de tejido. La hibridación in situ por fluorescencia es una técnica in situ directa que es relativamente rápida y sensible. La prueba de FISH también puede automatizarse. Puede combinarse inmunohistoquímica con un método de FlSH cuando el nivel de expresión del marcador es difícil de determinar mediante inmunohistoquímica sola.

Alternativamente, puede detectarse ARN en una matriz, chip o micromatriz de ADN. Los oligonucleótidos correspondientes al/a los marcador(es) se inmovilizan en un chip que después se hibrida con ácidos nucleicos marcados de una muestra de prueba obtenida a partir de un sujeto. Se obtiene una señal de hibridación positiva con la muestra que contiene transcritos de marcador. En la técnica se conocen bien métodos de preparación de matrices de ADN y su uso. (Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.618.6796; 6.379.897; 6.664.377; б. 451.536; 548,257; documento U.S. 20030157485 y Schena et al. 1995 Science 20:467-470; Gerhold et al. 1999 Trends in Biochem. Sci. 24, 168-173; y Lennon et al. 2000 Drug discovery Today 5: 59-65). También puede realizarse análisis en serie de expresión génica (SAGE) (véase, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense 20030215858).

Para detectar moléculas de ARN, por ejemplo, puede extraerse ARNm a partir de la muestra de microvesículas que va a someterse a prueba, someterse a transcripción inversa y se generan sondas de ADNc marcadas por fluorescencia. Entonces, pueden analizarse con sonda las micromatrices que pueden hibridarse un ADNc de marcador con las sondas de ADNc marcado, se exploran los portaobjetos y se mide la intensidad de fluorescencia. Esta intensidad se correlaciona con los niveles de expresión y la intensidad de hibridación.

Los tipos de sondas para la detección de ARN incluyen ADNc, ribosondas, oligonucleótidos sintéticos y sondas genómicas. El tipo de sonda usado vendrá dictado generalmente por la situación particular, tal como ribosondas para la hibridación in situ, y ADNc para transferencia de tipo Northern, por ejemplo. En determinadas realizaciones, la sonda se dirige a regiones de nucleótidos únicas para el ARN de marcador particular. Las sondas pueden ser tan cortas como se requiera para reconocer de manera diferencial los transcritos de ARN de marcador particulares y puede ser de tan sólo, por ejemplo, 15 bases; sin embargo, pueden usarse sondas de al menos 17 bases, por ejemplo, 18 bases o mejor 20 bases. En determinadas realizaciones, los cebadores y las sondas se hibridan específicamente en condiciones rigurosas a un fragmento de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos correspondiente al gen diana. Tal como se usa en el presente documento, el término “condiciones rigurosas” significa que sólo se producirá hibridación si hay una identidad de al menos el 95% y al menos el 97% entre las secuencias.

La forma de marcaje de las sondas puede ser cualquiera que sea apropiada, tal como el uso de radioisótopos, por ejemplo, 32P y 35S. Puede lograrse el marcaje con radioisótopos, tanto si la sonda se sintetiza químicamente como biológicamente, mediante el uso de bases marcadas de manera adecuada.

Kits

La presente divulgación proporciona un kit para evaluar el estado condicional de un órgano trasplantado en un sujeto que comprende unos medios para aislar, purificar y/o detectar una o más microvesículas derivadas de órgano de donante.

Los tipos de kits incluyen, pero no se limitan a, conjuntos de sonda y cebador envasados (por ejemplo, conjuntos de sonda/cebador TaqMan), matrices/micromatrices, anticuerpos específicos de órgano de donante y/o marcador de donante y perlas conjugadas a anticuerpo, que contienen además una o más sondas, cebadores u otros reactivos de detección para detectar una o más microvesículas derivadas de órgano de donante, dadas a conocer en el presente documento.

Un kit puede comprender un par de cebadores de oligonucleótidos adecuados para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o secuenciación de ácidos nucleicos, para detectar uno o marcadores de las microvesículas derivadas de órgano de donante. Un par de cebadores puede comprender secuencias de nucleótidos complementarias a un marcador y tener una longitud suficiente para hibridarse de manera selectiva con dicho marcador. Alternativamente, los nucleótidos complementarios pueden hibridarse de manera selectiva con una región específica en proximidad suficientemente estrecha en 5' y/o 3' a la posición de marcador como para realizar PCR y/o secuenciación. Pueden incluirse múltiples cebadores específicos de marcador en el kit para someter a ensayo de manera simultánea un gran número de marcadores. El kit también puede comprender una o más polimerasas, transcriptasa inversa y bases de nucleótido, en el que las bases de nucleótido pueden estar marcadas adicionalmente de manera detectable.

Un cebador puede tener al menos aproximadamente 10 nucleótidos o al menos aproximadamente 15 nucleótidos o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud y/o hasta aproximadamente 200 nucleótidos o hasta aproximadamente 150 nucleótidos o hasta aproximadamente 100 nucleótidos o hasta aproximadamente 75 nucleótidos o hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud.

Los cebadores de oligonucleótidos pueden inmovilizarse sobre una superficie o soporte sólido, por ejemplo, sobre una micromatriz de ácido nucleico, en el que la posición de cada cebador de oligonucleótidos unido a la superficie o soporte sólido se conoce y puede identificarse.

Un kit puede comprender al menos una sonda de ácido nucleico, adecuada para la hibridación in situ o hibridación in situ fluorescente, para detectar el marcador y/o las microvesículas derivadas de órgano de donante. Tales kits comprenderán generalmente una o más sondas de oligonucleótidos que tienen especificidad por diversos marcadores.

Un kit puede comprender al menos un anticuerpo para la inmunodetección del marcador y/o las microvesículas derivadas de órgano de donante y/o para el aislamiento de las microvesículas derivadas de órgano de donante. Pueden prepararse anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, específicos para un marcador, usando técnicas de inmunización convencionales, tal como conocerán generalmente los expertos en la técnica. Los reactivos de inmunodetección del kit pueden incluir etiquetas detectables que están asociadas con el, o unidas al, anticuerpo dado o al propio antígeno. Tales etiquetas detectables incluyen, por ejemplo, moléculas quimioluminiscentes o fluorescentes (rodamina, fluoresceína, proteína verde fluorescente, luciferasa, Cy3, Cy5 o ROX), radiomarcadores (3H, 35S, 32P, 14C, 131I) o enzimas (fosfatasa alcalina, peroxidasa del rábano).

El anticuerpo puede proporcionarse unido a un soporte sólido, tal como una matriz de columna, una matriz o pocillo de una placa de microtitulación. Alternativamente, el soporte puede proporcionarse como un elemento independiente del kit.

Un kit puede comprender uno o más cebadores, sondas, micromatrices o anticuerpos adecuados para detectar uno o más marcadores.

Cuando los medios de medición en el kit emplean una matriz, el conjunto de marcadores expuesto anteriormente puede constituir al menos el 10 por ciento o al menos el 20 por ciento o al menos el 30 por ciento o al menos el 40 por ciento o al menos el 50 por ciento o al menos el 60 por ciento o al menos el 70 por ciento o al menos el 80 por ciento de las especies de marcadores representadas en la micromatriz.

Un kit de detección de marcador puede comprender uno o más reactivos de detección y otros componentes (por ejemplo, un tampón, enzimas tales como ADN polimerasas o ligasas, nucleótidos de extensión de cadena tales como trifosfatos de desoxinucleótido, y en el caso de reacciones de secuenciación de ADN de tipo Sanger, nucleótidos de terminación de cadena, secuencias de control positivo, secuencias de control negativo y similares) necesarios para llevar a cabo un ensayo o una reacción para detectar un marcador. Un kit también puede incluir componentes o reactivos adicionales necesarios para la detección de un marcador, tal como anticuerpos secundarios para su uso en inmunohistoquímica. Un kit puede incluir además uno o más de otros marcadores o reactivos para evaluar otros factores de pronóstico, por ejemplo, estadio de rechazo.

Un kit de detección de marcador puede comprender uno o más reactivos y/o herramientas para aislar microvesículas específicas de órgano de donante a partir de una muestra biológica. Un kit también puede incluir reactivos necesarios para aislar la proteína y/o ácidos nucleicos a partir de las microvesículas aisladas.

Informes, ordenadores programados y sistemas

La monitorización del estado condicional de un órgano trasplantado en un sujeto basándose en el aislamiento, la purificación y/o la detección de microvesículas derivadas de órgano de donante, puede denominarse “informe” en el presente documento. Opcionalmente puede generarse un informe tangible como parte de un procedimiento de pruebas (que puede denominarse de manera intercambiable en el presente documento “notificación”, o “proporcionar” un informe, “producir” un informe o “generar” un informe).

Los ejemplos de informes tangibles pueden incluir, pero no se limitan a, informes en papel (tales como copias impresas generadas por ordenador de resultados de prueba) o formatos equivalentes e informes almacenados en medio legible por ordenador (tal como un CD, memoria USB u otro dispositivo de almacenamiento extraíble, disco duro informático o servidor de red informático, etc.). Los informes, particularmente los almacenados en un medio legible por ordenador, pueden formar parte de una base de datos, que puede ser accesible opcionalmente a través de Internet (tal como una base de datos de registros de pacientes o información genética almacenada en un servidor de red informático, que puede ser una “base de datos segura” que tiene características de seguridad que limitan el acceso al informe, tales como para permitir que sólo el paciente y los profesionales médicos del paciente vean el informe al tiempo que se impide que otros individuos no autorizados vean el informe, por ejemplo). Además de, o como alternativa a, generar un informe tangible, también pueden visualizarse informes en una pantalla de ordenador (o el elemento de visualización de otro instrumento o dispositivo electrónico).

Un informe puede incluir, por ejemplo, la historia clínica de un individuo, o puede incluir simplemente el tamaño, presencia, ausencia o niveles de uno o más marcadores (por ejemplo, un informe en medio legible por ordenador tal como un servidor informático puede incluir hipervínculo(s) a una o más publicaciones de revista o sitios web que describen las implicaciones médicas/biológicas). Por tanto, por ejemplo, el informe puede incluir información de significación médica/biológica, así como incluir también opcionalmente información referente a la detección de microvesículas derivadas de órgano de donante, o el informe puede incluir simplemente información referente a la detección de microvesículas derivadas de órgano de donante sin otra significación médica/biológica.

Además, un informe puede “transmitirse” o “comunicarse” (estos términos pueden usarse en el presente documento de manera intercambiable), tal como al individuo que se sometió a prueba, a un profesional médico (por ejemplo, un médico, enfermera, profesional de laboratorio clínico, asesor genético, etc.), una organización de atención sanitaria, un laboratorio clínico y/o cualquier otra parte o peticionario que se pretende que vea o disponga del informe. La acción de “transmitir” o “comunicar” un informe puede realizarse mediante cualquier medio conocido en la técnica, basándose en el formato del informe. Además, “transmitir” o “comunicar” un informe puede incluir suministrar un informe (“envío”) y/o recuperar (“extracción”) un informe. Por ejemplo, pueden transmitirse/comunicarse informes mediante diversos medios, incluyendo transferirse físicamente entre partes (tal como para informes en formato en papel) tal como suministrándose físicamente de una parte a otra, o transmitiéndose electrónicamente o en forma de señales (por ejemplo, mediante correo electrónico o a través de Internet, mediante fax y/o mediante cualquier método de comunicación cableado o inalámbrico conocido en la técnica) tal como recuperándose a partir de una base de datos almacenada en un servidor de red informático, etc.

El objeto dado a conocer proporciona ordenadores (u otros aparatos/dispositivos tales como dispositivos biomédicos o instrumentación de laboratorio) programados para llevar a cabo los métodos descritos en el presente documento. El sistema puede controlarse por el individuo y/o su profesional médico ya que el individuo y/o su profesional médico pide la prueba, recibe de vuelta los resultados de prueba y (opcionalmente) actúa con respecto a los resultados de prueba para reducir el riesgo de enfermedad del individuo, tal como implementando un sistema de gestión de enfermedad.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más completamente la divulgación, pero no deben interpretarse como limitativos del alcance de la misma.

EJEMPLO 1: detección de microvesículas específicas de órgano de donante en el torrente sanguíneo del receptor.

Hay una contribución de microvesículas significativa en la sangre a partir de células inmunitarias, plaquetas y células endoteliales, lo cual da como resultado una gran relación señal-ruido cuando se realiza un enfoque de determinación de perfil de microvesículas general. Existe un problema similar con estudios que analizan marcadores de ácidos nucleicos y proteínas libres en circulación. Además, los marcadores de ácidos nucleicos y proteínas libres son inestables en la circulación, requiriendo por tanto un alto estado estacionario para la detección, y cambios menores a lo largo del tiempo (esencial para la monitorización) son difíciles de cuantificar. Sin embargo, las microvesículas y su cargamento de ARN son extremadamente estables en la circulación. Por tanto, se aislaron microvesículas específicas de órgano de trasplante a partir del torrente sanguíneo del receptor para definir estados de rechazo y/o lesión de un órgano trasplantado.

Se aislaron exosomas de donante liberados a partir del órgano trasplantado en un modelo de trasplante de islotes xenogénico, en el que se trasplantaron islotes humanos a un ratón desnudo (n = 8). Se sacrificaron receptores normoglucémicos en diversos puntos de tiempo (intervalo de 31 a 198 días), y se tiñó la masa de islotes humanos de donante para detectar insulina para confirmación histológica. Se analizaron exosomas a partir de plasma de receptor en un dispositivo NanoSight NS300 con análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) tras el mareaje con puntos cuánticos fluorescentes con anticuerpo anti-CD63 específico de ser humano (marcador de exosoma). En los 8 animales receptores, se observó señal de anticuerpo anti-CD63 humana (ausente en controles negativos) (p = 0,006) (figuras 1A, B). El análisis por inmunotransferencia de tipo Western confirmó la detección de proteína c D63 humana (figura 1C). Se confirmaron hallazgos similares usando anticuerpo específico anti-HLA-C. También se sometió a prueba este concepto en el entorno alogénico de tolerancia (islotes de BALB/c en ratón B6 diabético, n = 3), manteniendo los receptores la normoglucemia >300 días. Los exosomas de plasma de receptor mostraron señal de exosoma de donante (anticuerpo específico de BALB/c anti-H2-Kd - punto cuántico), señal mediante dispositivo NanoSight, lo cual se confirmó mediante análisis por inmunotransferencia de tipo Western (ausente en controles negativos).

En experimentos adicionales, se aislaron exosomas a partir de plasma de ratón receptor y se analizaron para determinar señal de exosomas específicos de islotes de donante en el detector de nanopartículas NanoSight NS300 usando anticuerpo específico anti-MHC humano - punto cuántico. En todos los puntos de tiempo tras el trasplante sometidos a prueba, Se detectó señal de exosoma específico de HLA en el dispositivo NanoSight de fluorescencia (intervalo de 14 a 198 días, n = 20) (figuras 4A, B). Esta señal estaba ausente en ratón no sometido a tratamiento (n = 5) y en muestras de exosoma de plasma de trasplante de islotes de ratón alogénico (n = 5) (p<0,0001). El análisis por inmunotransferencia de tipo Western mostró la presencia de HLA en muestras de xenoislotes (figura 4C). Para validar la especificidad de señal de exosoma de trasplante, se realizó una escisión de injerto de islotes en animales con xenoislotes y esto condujo a la pérdida de la señal de HLA-A (n = 6, p<0,001) (figura 4D).

Para determinar si este concepto es aplicable con otros trasplantes de órganos, se realizaron trasplantes de corazón heterotópicos de coincidencia errónea completa alogénicos en el ratón, en los que se trasplantó un corazón de BALB/c en un receptor B6 (n = 10). En este modelo de rechazo agudo, se sacrificaron los animales receptores de las 4 horas tras el trasplante hasta 11 días. Se aisló una combinación de exosomas de plasma a partir de sangre de receptor usando cromatografía por filtración en gel de Sepharose, y se evaluó a diferentes puntos de tiempo tras el trasplante para determinar la señal de exosoma específica de corazón de donante usando la tecnología de análisis de seguimiento de nanopartículas NanoSight con anticuerpos específicos anti-MHC de donante marcados con puntos cuánticos. En todos los puntos de tiempo, se observó la señal de exosoma específica de corazón de donante (punto cuántico específico de BALB/c anti-H2-Kd) mediante análisis con dispositivo NanoSight, lo cual se confirmó mediante inmunotransferencia de tipo Western (p = 0,003). También se realizó inmunotransferencia de tipo Western para confirmación. Trasplantes de B6 sinérgicos sirvieron como control negativo (n = 3) y la señal estaba ausente en los animales de control (figura 2).

Estos estudios en modelos de ratón establecieron que el órgano/tejido trasplantado libera una combinación de exosomas específicos de tejido de donante detectable y estable en la sangre de receptor que puede someterse a seguimiento en serie a lo largo de un seguimiento a largo plazo. También pudieron detectarse exosomas específicos de donante en el entorno clínico con seres humanos.

EJEMPLO 2: caracterización de microvesículas derivadas de donante aisladas a partir de muestras de sangre y de orina del paciente receptor en el entorno clínico de trasplante renal de donante vivo humano.

Para someter a prueba si la plataforma de exosomas específicos de tejido de trasplante puede trasladarse a otros tejidos y líquidos corporales de trasplante, se aislaron exosomas específicos de riñón de donante en plasma y orina de paciente receptor en el entorno de trasplante renal de donante vivo humano.

Para el análisis de microvesículas en el plasma de un receptor de riñón de donante, se obtuvieron 0,5-2 ml de plasma mediante venopunción y se almacenaron a -80°C. Para el análisis de microvesículas en la orina de un receptor de riñón de donante, se recogieron muestras de orina (40 ml) en vasos estériles, se trataron con cóctel de inhibidores de proteasa 1x (Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, MO) y se congelaron a -80°C hasta el análisis. Se realizó el aislamiento de exosomas a partir de muestras de plasma humano usando de 500 pl a 1 ml de plasma obtenido tras la centrifugación de la muestra de sangre a 500 g durante 10 minutos. Se añadió directamente la muestra de plasma a una columna de Sepharose 2B y se recogió el eluyente en fracciones de 1 ml. Se combinó la fracción de exosomas tras la monitorización de la absorbancia a 280 nm. Se sometió la fracción combinada a ultracentrifugación a 110.000 g durante 2 horas a 4°C y volvió a suspenderse la fracción de exosomas sedimentada en PBS para su análisis posterior. Se realizó el aislamiento de microvesículas urinarias tal como se describe en otra parte con una ligera modificación (Rood et al. (2010), Pisitkun et al. (2004)). En resumen, se retiraron residuos celulares urinarios a partir de 20 ml de material de partida mediante centrifugación a 17.000 g durante 15 minutos. Después se sometió el sobrenadante a ultracentrifugación a 200.000 g durante 120 minutos a 4°C. Volvió a suspenderse el sedimento en PBS y se cargó en una columna de exclusión molecular de Sepharose 2B y se combinaron las fracciones eluidas que representaban exosomas. Se concentraron las fracciones combinadas en un filtro Amicon (Merck Millipore Ltd., Irlanda) con una membrana con un punto de corte de 100 kDa. Después se analizó la combinación de microvesículas aisladas en el dispositivo NanoSight NS300.

Se usó la combinación de microvesículas aisladas para la separación por afinidad del subconjunto de microvesículas específicas de riñón de donante a partir del plasma de receptor. Se realizó una separación por afinidad similar del subconjunto de microvesículas de donante con las muestras de orina. La coincidencia cruzada de HLA de todos los trasplantes renales de donante vivo proporcionó un panel de anticuerpos anti-HLA específico de donante para usar para el aislamiento por afinidad de la combinación de microvesículas de donante. Se centró el estudio en la coincidencia errónea de clase I (HLA-A, B o C) que dio la señal más fuerte en la coincidencia cruzada de HLA (el anticuerpo de serotipado se une a célula de donante, pero no a célula de receptor). En primer lugar, se sometió a prueba anticuerpo anti-HLA de donante en combinaciones de microvesículas totales a partir de muestras usando los modos de dispersión de la luz y fluorescencia (anticuerpo anti-HLA de donante-punto cuántico) en el dispositivo NanoSight NS300. Esto confirmó qué anticuerpo puede usarse para el aislamiento con perlas magnéticas basado en afinidad de combinación de microvesículas de donante. Después se analizó el subconjunto de microvesículas en el dispositivo NanoSight NS300 NTA en el modo de dispersión de la luz para cuantificar la señal de microvesículas específicas de donante y en el modo fluorescente (anticuerpo anti-HLA de donante - punto cuántico) para confirmar el enriquecimiento de la población de microvesículas de donante. También se analizó la fracción no unida a partir del aislamiento por afinidad, que representa la combinación de microvesículas de receptor, para confirmar la ausencia de señal de HLA de donante en el modo fluorescente.

Se aislaron microvesículas en orina y plasma basándose estrictamente en la coincidencia errónea de HLA y se analizó el subconjunto de microvesículas específicas de donante para determinar proteínas específicas de órgano, por ejemplo, proteína de células epiteliales renales, acuaporina 2. Además, se usó anticuerpo anti-HLA de donante para confirmar el enriquecimiento del subconjunto de microvesículas específicas de donante, y el anticuerpo específico anti-HLA de receptor confirmó la ausencia del receptor microvesícula en el subconjunto de microvesículas de donante aisladas por afinidad. Se adquirieron anticuerpos específicos de alelo de HLA sin conjugar (anticuerpo anti-HLA-A2, HLA-B27, HLA-B13, HLA-B8 de ratón) de One Lambda (CA, EE.UU.), para el aislamiento de exosomas específicos de tipo de donante de HLA de clase I de donante y el análisis a partir de plasma y orina de receptor.

Tal como se muestra en la figura 3A, el donante era positivo para HLA-A2, HLA-B27 y el receptor era positivo para HLA-A29, HLA-31, HLA-B31 y HLA-B44. Por tanto, se usaron anticuerpos específicos anti-donante, HLA-A2 y ^{H l A -}B27, para la detección y purificación de exosomas específicos de donante a partir de plasma de receptor. Se purificaron exosomas específicos de donante mediante el uso de perlas magnéticas conjugadas con anticuerpo. En resumen, se conjugó de manera covalente un anticuerpo específico de MHC a perlas magnéticas de N-hidroxisuccinimida (Pierce) según el protocolo del fabricante. Se incubaron de 50 a 100 pg de equivalente de proteína de exosomas con perlas con anticuerpo durante la noche a 4°C. Se separaron las fracciones de exosomas unidas y no unidas a perlas según el protocolo del fabricante. Se eluyeron los exosomas unidos a perlas usando trisglicina y se usaron para su análisis posterior.

Tal como se muestra en la figura 3B, exosomas específicos de riñón de donante positivos para HLA-A2 y HLA-B27 estaban presentes en el plasma de paciente receptor y en la muestra de plasma de donante tal como se analizó mediante el dispositivo NanoSight. Se analizaron exosomas purificados en el dispositivo NanoSight NS300 (diodo de láser de 405 nm) en el modo de dispersión de la luz para determinar la cuantificación de exosomas y la distribución de dispersión según protocolos del fabricante (Malvern instruments Inc., MA, EE.UU.). Antes de cada serie experimental, se calibró la máquina para la cantidad y el tamaño de nanopartículas usando nanopartículas y diluciones normalizadas proporcionadas por el fabricante. Se realizó la detección de marcador de superficie en exosomas usando el modo de fluorescencia en el dispositivo NanoSight NS300. Se usaron anticuerpos secundarios conjugados con puntos cuánticos con emisión a 605 nm para la detección de fluorescencia de anticuerpos primarios que se unen contra proteínas de superficie específicas ^{( H l A - A ,} B, C, B27, A2, B13; FXYD2; CD3, CD4, CD8, CD14, CD56, CD19, MHC I de ratón) tal como se describió anteriormente (Gardiner et al. (2013), Dragovic et al. (2011)). Cada serie experimental se realizó por duplicado y se realizó una fluorescencia de control de isotipo de IgG apropiada para evaluar el fondo.

Para determinar si los exosomas se derivaban del órgano apropiado, se analizaron proteínas específicas de tejido presentes en o dentro de los exosomas mediante inmunotransferencia de tipo Western. El análisis por inmunotransferencia de tipo Western se realizó de la siguiente manera: se aislaron exosomas y proteínas totales de lisado celular mediante sedimentación de los exosomas y lisado del sedimento en tampón RIPA 1X con una concentración 1X de cóctel de inhibidores de proteasa (Sigma-Aldrich Co., MO). Se separaron las proteínas aisladas en geles de poliacrilamida y se transfirieron a membrana de poli(fluoruro de vinilideno) (Life Technologies, NY, EE.UU.). Se bloqueó la membrana, se incubó con el anticuerpo deseado a una concentración según el protocolo del fabricante. Se añadió anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa del rábano (Santa Cruz Biotechnologies Inc.) según el protocolo del fabricante y se detectó mediante quimioluminiscencia usando el sistema de detección y cuantificación de la radiactividad Image quant LAS 400 (GE Health, EE.UU.). Se observó la expresión de la proteína de células epiteliales renales, acuaporina 2, en el exosoma específico de riñón de donante mediante inmunotransferencia de tipo Western en el día 4 tras el trasplante (figura 3C). Las fracciones de exosomas de plasma unidos a HLA-A2 a partir del receptor antes del trasplante y después de la implantación de riñón, pero antes de la perfusión del órgano de donante fueron negativas para acuaporina 2 (figura 3C). Estos hallazgos también se validaron en exosomas de orina de receptor (figuras 3D, E). Tal como se muestra en la figura 3D, una señal de HLA-A2 estaba ausente en la muestra previa al trasplante, pero la mayor parte de los exosomas a partir de la muestra del día 4 tras el trasplante fueron positivos para HLA-A2. Mediante inmunotransferencia de tipo Western, las fracciones de exosomas de orina unidos a HLA-A2 a partir del día 4 y día 30 posoperatorios mostraron expresión de marcador glomerular renal, podocalixina 1, pero los exosomas a partir de la muestra previa al trasplante no lo mostraron (figura 3E).

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Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   i. Método in vitro para monitorizar el estado de órgano trasplantado en un sujeto, que comprende:

   aislar, purificar o identificar microvesículas derivadas de órgano de donante a partir de una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto que ha recibido un trasplante de un donante detectando una proteína de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) específica para el donante en las microvesículas derivadas de órgano de donante.
2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que el sujeto es ser humano.
3. 3. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en una muestra de sangre o una muestra de orina.
4. 4. Método según la reivindicación 1, en el que el órgano de donante se selecciona del grupo que consiste en un corazón, riñón e islote pancreático.
5. 5. Método in vitro para aislar, purificar o identificar microvesículas derivadas de órgano de donante, que comprende:

   aislar, purificar o identificar microvesículas derivadas de órgano de donante a partir de una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto que ha recibido un trasplante de un donante detectando una proteína de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) específica para el donante en las microvesículas derivadas de órgano de donante.
6. 6. Método según la reivindicación 1 o 5, en el que la proteína de MHC se detecta mediante un anticuerpo.
7. 7. Método según la reivindicación 6, en el que el anticuerpo está conjugado a perlas magnéticas.
8. 8. Método según la reivindicación 1 o 5, en el que la proteína de MHC es una proteína de HLA.
9. 9. Método in vitro para aislar, purificar o identificar microvesículas derivadas de órgano de donante, que comprende:

   (a) aislar, purificar o identificar microvesículas derivadas de órgano de donante obtenidas a partir de una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto que ha recibido un trasplante de un donante detectando una proteína de complejo mayor de histocompatibilidad específica para el donante en las microvesículas derivadas de órgano de donante; y

   (b) enriquecer las microvesículas derivadas de órgano de donante para microvesículas que se originan a partir de una célula del órgano de donante detectando un marcador específico para la célula.
10. 10. Método según la reivindicación 9, en el que el marcador es acuaporina 2.
11. 11. Método según la reivindicación 5 o 9, en el que el órgano de donante se selecciona del grupo que consiste en un corazón, riñón e islote pancreático.