ES2611479T3 - Anticuerpos contra endoplasmina y su uso - Google Patents

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ES2611479T3 ES11796394.2T ES11796394T ES2611479T3 ES 2611479 T3 ES2611479 T3 ES 2611479T3 ES 11796394 T ES11796394 T ES 11796394T ES 2611479 T3 ES2611479 T3 ES 2611479T3
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Xinhui Wang
Thomas P. Conrads
Elvira Favoino
Brian Hood
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Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano aislado o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo, donde la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos establecida como aminoácidos 26-33 de SEC ID Nº: 1 (CDR1), aminoácidos 51-58 de SEC ID Nº: 1 (CDR2), aminoácidos 97-103 de SEC ID Nº: 1 (CDR3) y un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo comprende los aminoácidos 27-32 de SEC ID Nº: 2 (CDR1), aminoácidos 50-52 de SEC ID Nº: 2 (CDR2), y aminoácidos 89-97 de SEC ID Nº: 2 (CDR3), y donde el anticuerpo se une específicamente a la endoplasmina humana glicosilada.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos contra endoplasmina y su uso.
Campo
La presente invencion se refiere al campo de los anticuerpos, especfficamente anticuerpos totalmente humanos que se unen especfficamente a la endoplasmina.
Antecedentes
Los melanomas son tumores agresivos frecuentemente metastasicos, derivados de melanocitos o bien de celulas nevicas relacionadas con melanocitos («Cellular and Molecular Immunology» (1991) (eds.) Abbas A. K., Lechtman, A. H., Pober, J. S.; W. B. Saunders Company, Philadelphia: paginas 340-341). Los melanomas representan aproximadamente el tres por ciento de todos los canceres de piel, y el crecimiento del melanoma en todo el mundo es superior al de cualquier otra neoplasia, a excepcion del cancer de pulmon en mujeres («Cellular and Molecular Immunology» (1991) (eds.) Abbas, A. K., Lechtiman, A. H., Pober, J. S.; W. B. Saunders Company Philadelphia, paginas: 340-342; Kirkwood and Agarwala (1993) Principles and Practice of Oncology 7:1-16). Incluso cuando el melanoma esta aparentemente localizado en la piel, hasta el 30 % de los pacientes desarrollaran metastasis sistemicas y la mayorfa moriran (Kirkwood and Agarwala (1993) Principles and Practice of Oncology 7:1-16). Las modalidades clasicas del tratamiento del melanoma incluyen la cirugfa, la radioterapia y la quimioterapia. En la pasada decada, la inmunoterapia y otros metodos moleculares han emergido como nuevos y prometedores metodos para el tratamiento del melanoma.
La existencia de linfocitos en el interior de depositos de melanoma constituye una prueba solida de que existe una respuesta inmunitaria al cancer en humanos. Estos linfocitos, al ser aislados, son capaces de identificar antfgenos tumorales especfficos en melanomas autologos y alogenicos de manera restringida por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) (Itoh et al. (1986), Cancer Res. 46: 3011-3017; Muul et al. (1987), J. Immunol. 138:989-995); Topalian et al. (1989) J. Immunol. 142: 3714-3725; Darrow et al. (1989) J. Immunol. 142: 3329-3335; Horn et al. (1991) J. Immunother. 10:153-164; Kawakami et al. (1992j J. Immunol. 148: 638-643; Horn et al. (1993) J. Immunother. 13:18-30; O'Neil et al. (1993) J. Immunol. 151: 1410-1418). Los linfocitos infiltradores de tumores (TIL) de pacientes con melanoma metastasico reconocen antfgenos compartidos, incluyendo antfgenos de tejido especfficos del linaje del melanocito-melanoma in vitro (Kawakami et al. (1993) J. Immunother. 14: 88-93; Anichini et al. (1993) J. Exp. Med. 177: 989-998). El hecho de que muchos pacientes con melanoma presenten defensas celulares y humorales contra estos tumores y de que los melanomas expresen tanto antfgenos MHC como antfgenos asociados a tumores (TAA) sugiere que la identificacion y la caracterizacion de antfgenos de melanoma adicionales sera importante para la inmunoterapia de pacientes con melanoma. Sin embargo, continuan siendo necesarias nuevas modalidades para el tratamiento del melanoma y de otros canceres.
Resumen
La invencion se define por las reivindicaciones.
En la presente invencion se describen anticuerpos monoclonales aislados y fragmentos de union al antfgeno de dichos anticuerpos, que se unen especfficamente a la endoplasmina glicosilada (Grp94). En algunas realizaciones, estos anticuerpos son completamente humanos. Estos anticuerpos poseen una elevada afinidad a la endoplasmina humana y pueden utilizarse para tratar y/o diagnosticar el cancer. En un ejemplo, el mAb es un Fv monocatenario.
En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos son utiles para detectar tumores que expresan endoplasmina, tales como el melanoma, cancer de mama, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer renal, cancer de pulmon, glioma, cancer de vejiga, cancer de ovario o cancer de pancreas. En otras realizaciones, los anticuerpos descritos son utiles para tratar tumores, tales como el melanoma, cancer de mama, carcinoma de celulas escamosas en la cabeza y el cuello, cancer renal, cancer de pulmon, glioma, cancer de vejiga, cancer de ovario o cancer de pancreas.
En la presente divulgacion tambien se divulgan acidos nucleicos recombinantes que codifican estos anticuerpos, vectores de expresion que incluyen estos acidos nucleicos, y celulas hospedadoras transformadas con esos vectores de expresion.
Lo anteriormente expuesto y otras caracterfsticas y ventajas se pondran mas claramente de manifiesto a partir de la siguiente descripcion detallada, en la cual se hace referencia a las figuras acompanantes.
Descripcion breve de las figuras
Figura 1a. Inmunopurificacion de una biblioteca de expresion en fago de Fv monocatenario con la lfnea celular humana del melanoma WM1158. La biblioteca de expresion en fago de Fv monocatenario contiene una gran cantidad de fragmentos Fv monocatenarios que expresan fagos con diferentes especificidades. La biblioteca se anadio a un tubo que contenfa una suspension de celulas de melanoma WM1158. Despues de lavar el tubo para eliminar el fago no unido, se eluyo el fago unido a un pH elevado y se amplifico en el hospedador bacteriano E.coli TG1. Tras tres ciclos de inmunopurificacion, los clones
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aislados se absorbieron con celulas linfoides B humanas cultivadas LG2 para eliminar el fago unido a los antfgenos compartidos por las celulas del melanoma y linfoides humanas. A continuacion se ensayo con celulas WM1158 en ELISA la reactividad del fago aislado.
Figura 1b. Reactividad diferencial con la lfnea celular de melanoma WM1158 y con la lfnea celular linfoide B LG2 del Fv monocatenario W9 aislado mediante inmunopurificacion con celulas WM1158 una biblioteca de expresion de anticuerpos en fagos. Se sembraron celulas WM1158 en una placa de 96 pocillos y se incubaron con Fv monocatenario durante 3 horas a temperatura ambiente. La union de Fv monocatenario se detecto utilizando mAb 9E10 especffico de c-myc y estreptavidina-HPR. Como controles negativos se utilizaron el Fv monocatenario 119, que reconoce un antfgeno irrelevante, y celulas LG2. El Fv monocatenario W9 reacciona especfficamente con la lfnea celular WM1158.
Figura 2. Reactividad del Fv monocatenario W9 a multiples tipos de lfneas celulares humanas.
Se sembraron en una placa de 96 pocillos y se incubaron con Fv monocatenario W9 durante 2 horas a temperatura ambiente seis lfneas celulares de melanoma, cuatro de cancer de mama, una de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, tres de cancer de pancreas, una de cancer de vejiga, una de cancer de pulmon, una de cancer epitelial, una de cancer de colon, una de cancer renal, una de cancer de prostata y una de cancer de ovario. La union de Fv monocatenario se detecto utilizando mAb 9E10 especffico de c-myc y estreptavidina-HPR. El Fv monocatenario W9 reacciono con todas las lfneas celulares de melanoma, con dos lfneas celulares de cancer de mama y con lfneas celulares de cancer de celulas escamosas de cabeza y cuello, de pancreas, de vejiga, de pulmon, epitelial, renal, ovarico y glioma.
Figuras 3a y 3b. Identificacion de endoplasmina como el antfgeno reconocido por Fv monocatenario W9. Se inmunoprecipito con Fv monocatenario W9 un lisado de celulas de melanoma WM1158. Se utilizaron como controles el mAb especffico de HLA clase I TP25.99 y el Fv monocatenario C21 especffico de HMW- MAA. Las protefnas en los precipitados se resolvieron en un SDS-PAGE al 10 % reductor y se tineron con azul de Coomassie. La protefna de 94 KDa fue exclusiva del precipitado de W9 (A). Se obtuvieron los mismos resultados a partir de lisados de lfneas celulares T24 (cancer de vejiga), SUM149 (cancer de mama) y SLR21 (cancer renal). Se escindieron del gel SDS las bandas especfficas y se analizaron mediante espectrometrfa de masas. La protefna humana identificada en las bandas de 94 KDa es la endoplasmina.
Figura 4. Rol de los carbohidratos en la expresion del determinante reconocido por el Fv monocatenario W9. Se cultivaron celulas COLO38 durante 72 horas en presencia de 0,5 pg/ml de tunicamicina. Se utilizaron como controles celulas incubadas en medio exclusivamente con DMSO y el mAb TP25.99. Se ensayaron las celulas mediante ELISA para determinar la union de Fv monocatenario W9. Se incubaron las celulas con Fv monocatenario W9 durante 2 horas a 4 °C. La union de Fv monocatenario se detecto utilizando el mAb 9E10 y anticuerpos HPR de cabra anti IgG de raton. Se midio la absorbancia a 450 nm. El tratamiento con tunicamicina indujo una fuerte disminucion de la union de Fv monocatenario W9 a las celulas COLO38. Asf pues, los carbohidratos desempenan un papel en la expresion del determinante reconocido por el Fv monocatenario W9.
Figuras 5a y 5b. Especificidad de la reactividad del Fv monocatenario W9 a la endoplasmina canina recombinante (Grp94). Se inmovilizo endoplasmina canina recombinante (Grp94), que presenta una homologfa del 98,5 % en la secuencia de aminoacidos con la endoplasmina humana (Grp94), en una placa de 96 pocillos a razon de 20 pg/pocillo y se incubo con Fv monocatenario W9 durante 2 horas a temperatura ambiente. La union de Fv monocatenario se detecto utilizando el mAb 9E10 y anticuerpos HPR de cabra anti IgG de raton. Se midio la absorbancia a 450 nm. Como controles negativos se utilizaron el Fv monocatenario 119 y BSA. El Fv monocatenario W9 reconoce un determinante de la endoplasmina expresado en la membrana celular.
Figura 6. Inhibicion dependiente de la dosis de la union de Fv monocatenario W9 a las celulas COLO38 mediante endoplasmina canina recombinante (Grp94). Se preincubaron con Fv monocatenario W9 diluciones dobles de endoplasmina canina recombinante (Grp94). Se anadio la mezcla a una placa de 96 pocillos sembrada con celulas COLO38. La union de Fv monocatenario se detecto utilizando el mAb 9E10 y anticuerpos HPR de cabra anti IgG de raton. Se midio la absorbancia a 450 nm. Como control se utilizo B2m. La Grp94 canina recombinante inhibe especfficamente la union de Fv monocatenario W9 a las celulas COLO38.
Figuras 7a y 7b. Efecto de la transfeccion de celulas 293 con ADNc de endoplasmina (Grp94) sobre la union del Fv monocatenario W9. Se transfectaron celulas 293 con 3 pg de clon de ADNc Grp94 HSP90B1 mediante electroporacion. Se incubaron las celulas con Fv monocatenario W9 y mAb 9E10, seguido de incubacion con anticuerpos FITC de cabra anti IgG de raton. Se analizaron las celulas mediante citometrfa de flujo. Se utilizo como control el vector pCMV6-XL4. Se utilizaron como control celulas no transfectadas. La electroporacion incrementa la union de Fv monocatenario W9. La expresion del antfgeno reconocido por el Fv monocatenario esta regulada por choque termico.
Figuras 8a y 8b. Efecto de la transduccion de celulas FO-1 con ARNhc de endoplasmina (Grp94) sobre la union del Fv monocatenario W9. Se transdujeron celulas FO-1 con ARNhc de endoplasmina (Grp94) y un
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ARNhc de control (ABCB5). Se incubaron las celulas con de Fv monocatenario W9 y mAb 9E10, seguido de incubacion con anticuerpos FITC de cabra anti IgG de raton. A continuacion se analizaron las celulas mediante citometrfa de flujo. El ARNhc de endoplasmina (Grp94) inhibio la union del Fv monocatenario W9 en comparacion con el ARNhc de control.
Figura 9. Rol de los carbohidratos en la expresion del epftopo reconocido por el mAb W9. Se incubaron celulas MIAPaCa-2 (5x105) de adenocarcinoma pancreatico humano con o sin 2 pl de a-2(3,6,8.9)- neuraminidasa en 50 pl de medio RPM I1640 durante 24 horas a 37 °C en un incubador de CO2 al 5 %. A continuacion se tineron con mAb W9 las celulas tratadas y se analizaron mediante citometrfa de flujo. Se utilizaron como control celulas tratadas con mAb TP25.99.
Figura 10. Expresion del epftopo de endoplasmina extracelular (Grp94) reconocido por el mAb W9 en celulas cancerosas de adenocarcinoma pancreatico humano MIAPaCa-2. Se incubaron con ALDEFLUOR celulas de adenocarcinoma pancreatico humanas MIAPaCa-2 para detectar actividad ALDH (TEST) y se tineron con mAb W9. Se utilizaron como referencia (CONTROL) celulas incubadas con ALDEFLUOR + inhibidor DAEB y tenidas con mAb W9. Se utilizaron como control Ig humanas (IgH). Se indica el porcentaje de celulas cancerosas, identificadas como celulas ALDHbnght.
Figura 11. Tincion inmunohistoqufmica con mAb W9 de una lesion de adenocarcinoma pancreatico humano extirpada quirurgicamente. Se tineron con mAb W9 (1 pg/ml) criosecciones de una lesion de adenocarcinoma pancreatico humano extirpada quirurgicamente y tejido pancreatico normal del mismo paciente. (X200).
Figura 12. Analisis de tincion IHC de la expresion de endoplasmina (Grp94) en celulas MDA-MB-231 de cancer de mama basal humano y xenoinjerto de melanoma humano MV3 utilizando mAb W9. Se tineron con mAb W9 (5 pg/ml) (X200) celulas MDA-MB-231 de cancer de mama basal humano fijadas en formalina y embebidas en parafina, celulas MCF-7 de cancer de mama luminal humano y xenoinjerto de melanoma humano MV3. La tincion inmunohistoqufmica con mAb W9 revelo una intensa tincion de las celulas MDA-MB-231 y el xenoinjerto MV3 por el mAb W9 (5 pg/ml). No se detecto tincion en las celulas MCF-7.
Figura 13. El mAb W9 inhibio significativamente el crecimiento de celulas tumorales que expresaban endoplasmina (Grp94). Se sembraron celulas cancerosas humanas (1 x 104/ pocillo) en una placa de 96 pocillos (medio RPMI 1640 suplementado con un 1 % de FBS) y se trataron con mAb W9 (5 pg/ml) durante 72 horas. Se utilizaron como control Ig humanas (IgH). A continuacion se sometieron las celulas a ensayo MTT. Los resultados se expresan como % de inhibicion del crecimiento. Valor * p < 0,05; * * Valor
p < 0,01.
Figura 14. Induccion de apoptosis en celulas cancerosas mediante mAb W9. Se privo de nutrientes a celulas MV3 (melanoma) y MIAPaCa-2 (adenocarcinoma pancreatico) humanas (4 x 105/ml) durante 24 horas y 3 horas respectivamente, y a continuacion se incubaron con mAb W9 (50 pg/ml) en medio RPMI 1640 suplementado con un 1,5 % de FBS. Al cabo de 6 horas se determino, mediante tincion con anexina V/PI, el porcentaje de celulas apoptoticas. Se analizaron las celulas mediante citometrfa de flujo. Se utilizaron como control negativo Ig humanas (IgH).
Figura 15. Induccion PARP escindida en celulas de melanoma humanas M21 mediante mAb W9. Se incubaron durante 72 horas celulas de melanoma humanas M21 (4 x 105/ml) con mAb W9 (5 pg/ml) en medio RPMI 1640 suplementado con un 1,5 % de FBS. Se analizaron lisados celulares en un analisis Western blot para determinar PARP escindida. Se utilizo p-actina como control de carga. El mAb W9 incremento fuertemente la expresion de PARP escindida.
Figura 16. Induccion de caspasa-3 escindida en celulas de melanoma humanas MV3 mediante mAb W9. Se privo de nutrientes a celulas de melanoma humanas MV3 (4 x 105/ml) durante 24 horas, y a continuacion se incubaron con mAb W9 (50 pg/ml) en medio RPMI 1640 suplementado con un 1,5 % de FBS. Se ensayaron lisados celulares en Western blot para determinar caspasa-3 escindida. Se utilizo p- actina como control de carga. Las densidades de las bandas resultantes, indicadas bajo las respectivas bandas, se determinaron mediante el software IMAGJ® y se normalizaron con respecto a la de la p-actina. El mAb W9 incremento fuertemente la expresion de caspasa-3 escindida. No se detecto ningun efecto en las celulas tratadas con IgH.
Figura 17. Lisis de celulas de melanoma humanas MV3 dependiente de celulas y mediada por mAb W9. Se etiquetaron celulas de melanoma humanas MV3 con 50 pCi de 51Cr, se resuspendieron en una densidad de 0,4 x 106 celulas/ml y se combinaron con mAb W9 (50, 10, 2 pg/ml) en una placa de ensayo de cultivo celular de base en U de 96 pocillos. Se utilizaron como control Ig humanas (IgH). Tras 30 minutos de incubacion a 4 °C se anadieron PBMC (40:1 E:T) y se incubaron durante 4 horas a 37 °C en un incubador de CO2. Se determino la liberacion de 51Cr contando el sobrenadante libre de celulas en un contador de centelleo en microplaca Packard TOPCOUNT™.
Figura 18. Lisis de celulas de melanoma humanas MV3 dependiente del complemento y mediada por mAb W9. Se etiquetaron celulas de melanoma humanas MV3 con 50 pCi de 51Cr y se resuspendieron en una densidad de 1 x 106 celulas/ml. Se incubaron las celulas diana con mAb W9 (50, 10, 2 pg/ml) en presencia
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de complemento de suero humano. Se utilizaron como control Ig humanas (IgH). Tras 2 horas de incubacion a 37 °C en un incubador de CO2, se determino la liberacion de 51Cr contando el sobrenadante libre de celulas en un contador de centelleo en microplaca Packard TOPCOUNT™.
Figura 19. Inhibicion de la proliferacion in vitro de celulas iniciadoras de adenocarcinoma pancreatico humano MIAPaCa-2 mediante mAb W9. Se incubaron con mAb W9 (25 pg/ml) durante 48 horas a 37 °C celulas de adenocarcinoma pancreatico humano MIAPaCa-2. A continuacion se recogieron las celulas y se tineron con ALDEFLUOR® (TEST). Se utilizaron como referencia (CONTROL) celulas tenidas con ALDEFLUOR® + DAEB. Se utilizaron como control Ig humanas (IgH). Se indica el porcentaje de celulas cancerosas, identificadas como celulas ALDHbnght.
Figura 20. Inhibicion de las rutas de senalizacion RAS-MEK- ERK y AK en celulas pancreaticas MIAPaCa- 2 y PANC 1 mediante mAb W9. Se sembraron las celulas pancreaticas humanas MIAPaCa-2 y PANC 1 en una concentracion de 1,0 x 105 por pocillo en una placa de 6 pocillos en medio RPMI 1640 con un 5 % de FBS y se incubaron durante 48 horas a 37 °C con el sobrenadante W9, el sobrenadante de control o bien sin tratar. Los lisados celulares se ensayaron en Western blot con anticuerpos monoclonales contra RAS, C-Raf, (p)-ERK 1/2 fosforilado, ERK1/2, (p)-FAK (Tyr397). FAK, p-catenina, p-AKT (Ser473) y AKT. Como control de carga se utilizo calnexina y p-actina.
Figura 21. Inhibicion de las rutas de senalizacion en celulas de melanoma humanas M21 mediante mAb W9. Se sembraron las celulas de melanoma humanas M21 en una concentracion de 1,0 x 105 por pocillo en una placa de 6 pocillos en medio RPMI 1640 con un 5 % de FBS y se incubaron durante 72 horas con el mAb W9 (5 pg/ml). Los lisados celulares se ensayaron en Western blot con anticuerpos monoclonales contra (p)-AKT fosforilado, Bcl-2, C-Raf, (p)-ERK1/2, PKCa, p-catenina. Como control se utilizaron Ig humanas (IgH) y PBS. Como control de carga se utilizo calnexina.
Figura 22. Inhibicion de las rutas de senalizacion en celulas de melanoma humanas MV3 mediante mAb W9. Se incubaron durante 6 horas a 37 °C celulas de melanoma humanas MV3 con mAb W9 en RPMI 1640. A continuacion se prepararon los lisados celulares y se analizaron en Western blot con anticuerpos monoclonales contra RaS, Met, p-Met, p-catenina, Ras, C-RAF, p-AKT y p-ERK1/2, Thr202/Tyr204. Como control de carga se utilizo p-actina. Se utilizaron como control celulas incubadas con IgH.
Figura 23. Reduccion de metastasis pulmonar establecida en ratones tratados con mAb W9. Se inyectaron i.v. celulas de melanoma MV3 (1,4 x 108/raton). Al cabo de 15 dfas, los ratones fueron tratados con mAb W9 (100 pg/raton, i.v.) cada 48 horas. El dfa 25 se sacrificaron los ratones, se recogieron los pulmones, se fijaron con formalina y se tineron con H-E para el analisis de areas de tumor. Los valores mostrados son el area de tumor media de cada grupo.** indica un valor p < 0,01.
Figura 24. Incremento de la expresion de endoplasmina (Grp94) por celulas de melanoma UACC-257 mediante agentes quimioterapeuticos. Se incubaron durante 48 horas celulas de melanoma humanas UACC- 257 (2 x 107ml) en medio RPMI 1640 suplementado con un 10 % de FBS con 5-FU (300 pM), cisplatina (10 pM) y paclitaxel (20 nM). Se recogieron las celulas, se tineron con mAb W9 y se analizaron mediante citometrfa de flujo. Como control se utilizaron celulas no tratadas. Se indican el porcentaje de celulas tenidas y la intensidad media de fluorescencia (MFI).
Figuras 25a y 25b. Inhibicion de la proliferacion de celulas de adenocarcinoma pancreatico humano MIAPaCa-2 mediante mAb W9 en combinacion con 5-FU y ciclopamina. Se sembraron las celulas de adenocarcinoma pancreatico humanas MIAPaCa-2 (2,5 x 103 celulas por pocillo) en una placa de 96 pocillos (medio RPMI 1640 con un 5 % de FBS) y se trataron con mAb W9 (5 pg/ml) en combinacion con 5-FU (10 pM) (A.) o ciclopamina (20 pM) (B.) durante 1, 2, 3 a 37 °C en una atmosfera con un 5 % de CO2. A continuacion se sometieron las celulas a ensayo MTT. Los valores de densidad optica a 540 nm indican las celulas vivas.
Figura 26. Inhibicion de la proliferacion in vitro de celulas iniciadoras de adenocarcinoma pancreatico humanas MIAPaCa-2 mediante mAb W9 en combinacion con 5-FU y ciclopamina. Se incubaron celulas de adenocarcinoma pancreatico humanas MIAPaCa-2 durante 48 horas a 37 °C con mAb W9 (25 pg/ml), ciclopamina (20 pM) y 5-FU (10 pM). A continuacion se tineron las celulas con ALDEFLUOR con o sin inhibidor DeAb para identificar las celulas ALDHbnght® (TEST). Se utilizo como control el mAb TP25.99 contra HLA clase I. Se indica el porcentaje de celulas cancerosas, identificadas como celulas ALDHbnght.
Figura 27. Induccion de apoptosis en celulas de adenocarcinoma pancreatico humanas MIAPaCa-2 mediante mAb W9 en combinacion con 5-FU y ciclopamina. Se privo de nutrientes durante 3 horas a celulas de adenocarcinoma pancreatico humano (4 x 105/ml) y a continuacion se incubaron con mAb W9 (10 pg/ml), ciclopamina (20 pM) y 5-FU (10 pM) en medio RPMI 1640 suplementado con un 1,5 % de FBS. Al cabo de 24 horas se determino, mediante tincion con anexina V/PI, el porcentaje de celulas apoptoticas. Se analizaron las celulas mediante citometrfa de flujo. Se uso IgH como control negativo.
Figuras 28a y 28b. Inhibicion de la proliferacion in vitro de celulas iniciadoras de adenocarcinoma pancreatico humano MIAPaCa-2 mediante mAb W9 en combinacion con radiacion y ciclopamina. Se irradiaron celulas de adenocarcinoma pancreatico humanas MIAPaCa-2 (4 x 105/ml) con una dosis de
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20 Gy (panel A.) y se incubaron durante 72 horas a 37 °C con mAb W9 (10 pg/ml) y ciclopamina (20 pM). A continuacion se tineron las celulas con ALDEFLUOR con o sin inhibidor DEAb para identificar las celulas ALDHbright. Se utilizaron como control celulas ^ no irradiadas (panel B.). Se indica el porcentaje de celulas cancerosas, identificadas como celulas ALDHbnght.
Figura 29. Induccion de apoptosis en celulas de adenocarcinoma pancreatico humanas MIAPaCa-2 mediante mAb W9 en combinacion con radiacion y ciclopamina. Se irradiaron celulas de adenocarcinoma pancreatico humanas MiaPaCa-2 (4 x 105/ml) con una dosis de 20 Gy y se incubaron con mAb W9 (20 pg/ml) y ciclopamina (20 pM). Al cabo de 8 horas se determino, mediante tincion con anexina V/PI, el porcentaje de celulas apoptoticas. Se analizaron las celulas mediante citometrfa de flujo. Como control se utilizaron celulas no irradiadas e Ig humanas (IgH).
Figura30. Inhibicion de las rutas de senalizacion en celulas de adenocarcinoma pancreatico humanas MIAPaCa-2 mediante mAb W9 en combinacion con 5-FU y ciclopamina. Se incubaron durante 2 dfas a 37 °C (panel D) celulas de adenocarcinoma pancreatico humanas MIAPaCa-2 con mAb W9, ciclopamina (20 pM) y 5-FU (10 pM). A continuacion se prepararon lisados celulares y se ensayaron en Western blot con anticuerpos monoclonales contra RAS, C-Raf, (p)-MEK fosforilado (Ser217/221), MEK, pERK(Thr202/Tyr204), ERK, p-AKT (Ser473), AKT. Como control de carga se utilizo calnexina.
Como controles se utilizaron celulas incubadas exclusivamente con mAb W9 (panel A), con mAb W9 y ciclopamina (panel B) y con mAb W9 y 5 FU (panel C).
Figura 31. Inhibicion de las rutas de senalizacion en celulas de adenocarcinoma pancreatico humanas MIAPaCa-2 mediante mAb W9 en combinacion con radiacion y ciclopamina. Se irradiaron celulas de adenocarcinoma pancreatico humanas MIAPaCa-2 con una dosis de 20 Gy y se incubaron durante 48 horas a 37 °C con mAb W9 (10 pg/ml) y ciclopamina (20 pM). A continuacion se prepararon lisados celulares y se ensayaron en Western blot con anticuerpos monoclonales contra RAS, (p)- ERK(Thr202/Tyr204) fosforilado, ERK, p- AKT (Ser473), AKT, SHh, GLI1. Como control de carga se utilizo calnexina. Como control de carga se utilizaron calnexina y p-actina.
Listado de secuencias
Las secuencias de acido nucleico y de aminoacidos enumeradas en el listado de secuencias adjunto se muestran usando abreviaturas de letras estandar para las bases nucleotfdicas y codigos de tres letras para los aminoacidos, tal como se define en 37 C.F.R. 1.822. Solo se muestra una cadena de cada secuencia de acido nucleico, pero se entiende que la cadena complementaria esta incluida en cualquier referencia a la cadena mostrada. El listado de secuencias se presenta como archivo de texto ASCII [Sequence_Listing.txt, June 15, 2011, 19.4 KB],
La SEC ID N°: 1 es la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de un anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina.
La SEC ID N°: 2 es la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de un anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina.
La SEC ID N°: 3 es una secuencia de acido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina.
La SEC ID N°: 4 es una secuencia de acido nucleico de la cadena ligera de un anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina.
La SEC ID N°: 5 es una secuencia de aminoacidos de una endoplasmina humana.
La SEC ID N°: 6 es una secuencia de acido nucleico que codifica la endoplasmina humana.
Las SEC ID N°: 7 y 8 son secuencias de aminoacidos de polipeptidos de la endoplasmina.
Descripcion detallada
I.Abreviaturas 5-FU: 5-fluorouracilo
ADCC: citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos Ag: antfgeno
ALDHbnght: aldehfdo deshidrogenasa (bright)
Anexina V: anexina A5 p-catenina: protefna asociada a cadherina B-Raf: serina/treonina protefna quinasa B-Raf CDC: citotoxicidad dirigida por complemento
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CDR: region determinants de la complementariedad
C-Raf: serina/treonina protema quinasa protooncogenica RAF
DEAB: 4-(dietilamino)benzaldetndo
DMEM: medio de cultivo de aguila modificado de Dulbecco
ER: retmulo endoplasmico
ERK1/2: quinasa regulada por senal extracelular 1/2 FAK: quinasa de adhesion focal FBS: suero fetal bovino FR: region marco
GLI1: homologo de oncogen asociado a glioma 1 Grp: protema regulada por glucosa Gy: Gray
HRP: peroxidasa de rabano silvestre
Ig: inmunoglobulina
mAb: anticuerpo monoclonal
MEK: protema quinasa quinasa activada por mitogeno Met: factor de crecimiento de hepatocitos O.D.: densidad optica PBS: tampon fosfato salino
p-ERK1/2: quinasa fosforilada regulada por senal extracelular 1/2 p-FAK: quinasa fosforilada de adhesion focal PI: yoduro de propidio RAS: sarcoma de rata
scFv: regiones variables monocatenarias de Vh y Vl
SHH: homologo Sonic hedgehog
Vh: region de cadena pesada variable
Vl: region de cadena ligera variable
Il.Terminos
Salvo que se indique otra cosa, los terminos tecnicos se utilizan con arreglo al uso convencional.
Las definiciones de terminos comunes en la biologfa molecular pueden consultarse en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 87-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9) y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
A fin de facilitar la revision de las diversas realizaciones de esta divulgacion, se proporcionan las siguientes explicaciones de terminos espedficos:
Anticuerpo: un polipeptido ligando que comprende como mmimo una region variable de inmunoglobulina de cadena ligera o cadena pesada que reconoce espedficamente y se une espedficamente a un epftopo de un antfgeno, por ejemplo endoplasmina, o a un fragmento de este. Los anticuerpos se componen de una cadena ligera y una cadena pesada, cada una de las cuales posee una region variable, denominada region pesada variable (VH) y region ligera variable (VL). Conjuntamente, la region VH y la region VL son responsables de unirse al antfgeno reconocido por el anticuerpo.
Los anticuerpos incluyen inmunoglobulinas intactas y las variantes. Los fragmentos funcionales (fragmentos de union al antfgeno) de los anticuerpos, que se unen espedficamente a un antfgeno, por ejemplo endoplasmina, son bien conocidos en la tecnica, como fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, protemas Fv monocatenarias («scFv») y protemas Fv estabilizadas por disulfuro («dsFv») que se unen espedficamente al antfgeno diana. Una protema scFv es una protema de fusion en la que una region variable de cadena ligera de una inmunoglobuilina y una region variable de cadena pesada de una inmunoglobuilina estan unidas por un enlazador, mientras que en dsFvs las cadenas han
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sido mutadas para introducir un enlace disulfuro para estabilizar la asociacion de las cadenas. El termino tambien incluye formas creadas por ingenierfa genetica, tales como anticuerpos quimericos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos heteroconjugados (tales como anticuerpos biespecfficos). Vease tambien Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997. Los fragmentos funcionales se denominan tambien fragmentos «de union al antfgeno», puesto que se unen especfficamente al antfgeno diana, por ejemplo la endoplasmina humana.
Tfpicamente, una inmunoglobulina que se produce de forma natural tiene cadenas pesadas (H) cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. Hay dos tipos de cadena ligera: lambda (A) y kappa (k). Hay cinco clases principales (o isotopos) de cadena pesada que determinan la actividad funcional de una molecula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE.
Cada cadena pesada y ligera contiene una region constante y una region variable (las regiones tambien se denominan «dominios»). En combinacion, las regiones variables de cadena pesada y ligera se unen especfficamente al antfgeno. Las regiones variables de cadena pesada y ligera contienen una region «marco») interrumpida por tres regiones hipervariables, tambien denominadas «regiones determinantes de la complementariedad» o «CDR». La extension de la region marco y de las CDR ha sido definida (vease Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). La base de datos Kabat se mantiene ahora en lfnea, y permite determinar secuencias CDR; vease por ejemplo el programa IMGT/V-QUEST version: 3.2.18., 29 de marzo de 2011, disponible en Internet y Brochet, X. et al., Nucl. Acids Res. 36, W503-508, 2008). Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas se conservan relativamente dentro de una especie, como por ejemplo los humanos. La region marco de un anticuerpo, esto es, las regiones marco combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.
Las CDR son responsables principalmente de la union a un epftopo de un antfgeno. Las CDR de cada cadena se denominan tfpicamente CDR1, CDR2 y CDR3, estan numeradas secuencialmente empezando por el terminal N y tambien estan identificadas tfpicamente por la cadena en la cual esta ubicada la CDR concreta. Asf pues, una VH CDR3 esta ubicada en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el que se encuentra, mientras que una VL CDR1 es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el que se encuentra. Generalmente, un anticuerpo que se une a la endoplasmina tendra una region Vh especffica y la secuencia de la region VL, y por consiguiente secuencias CDR especfficas. Los anticuerpos con especificidades diferentes (esto es, diferentes sitios de combinacion para diferentes antfgenos) tienen CDR diferentes. Pese a que son las CDR las que varfan de un anticuerpo a otro, solo un numero limitado de posiciones de aminoacido dentro de las cDr estan implicadas directamente en una union a antfgeno. Estas posiciones dentro de las CDR se denominan residuos determinantes de la especificidad (SDR).
Las referencias a «Vh» o «VH» se refieren a la region variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo la de un Fv, scFv, dsFv o Fab. Las referencias a «Vh» o «VH» se refieren a la region variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo la de un Fv, scFv, dsFv o Fab. Un «anticuerpo monoclonal» es un anticuerpo producido por un unico clon de linfocitos B o por una celula en la que se han transfectado los genes de la cadena ligera y pesada de un unico anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales se producen mediante metodos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo produciendo celulas productoras de anticuerpos hfbridas a partir de una fusion de celulas de mieloma con celulas inmunitarias del bazo. Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos monoclonales humanizados.
Un «anticuerpo quimerico» tiene residuos marco de una especie, por ejemplo la humana, y CDR (las cuales generalmente confieren la union al antfgeno) de otra especie, por ejemplo un anticuerpo murino que se une especfficamente a la endoplasmina.
Un anticuerpo «humano» (tambien denominado anticuerpo «totalmente humano» es un anticuerpo que incluye regiones marco humanas y todas las CDR de una inmunoglobulina humana. En un ejemplo, el marco y las CDR son de la misma secuencia de aminoacidos de cadena pesada y/o ligera humana original. Sin embargo, los marcos de un anticuerpo humano pueden ser disenados para que incluyan CDR de un anticuerpo humano diferente. Una inmunoglobulina «humanizada» es una inmunoglobulina que incluye una region marco humana y una o varias CDR de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo de raton, rata o sintetica). La inmunoglobulina no humana que aporta las CDR se denomina «donante», y la inmunoglobulina humana que aporta el marco se denomina «aceptador». En una realizacion, todas las CDR proceden de la inmunoglobulina donante en una inmunoglobulina humanizada. No es necesaria la presencia de regiones constantes, pero si estan presentes deben ser sustancialmente identicas a las regiones constantes de la inmunoglobulina humana, esto es, identicas en como mfnimo un 85-90 %, por ejemplo en un 95 % o mas. Asf pues, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente identicas a las partes correspondientes de secuencias de inmunoglobulina humana natural. Un «anticuerpo humanizado» es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera humanizada y una inmunoglobulina de cadena pesada humanizada. Un anticuerpo humanizado se une al mismo antfgeno que el anticuerpo donante que aporta las CDR. El
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marco aceptador de una inmunoglobulina o un anticuerpo humanizados puede tener un numero limitado de sustituciones por aminoacidos tomados del marco donante. Los anticuerpos humanizados u otros anticuerpos monoclonales pueden tener sustituciones de aminoacidos conservativas adicionales, las cuales no afectan sustancialmente a la union al antfgeno u otras funciones de la inmunoglobulina. Es posible crear inmunoglobulinas humanizadas por medio de ingenierfa genetica (vease por ejemplo la Patente USA n° 5.585.089).
Antfgeno: un compuesto, una composicion o una sustancia capaz de estimular la produccion de anticuerpos o una respuesta de celulas T en un animal, incluyendo las composiciones inyectadas o absorbidas en un animal. Un antfgeno reacciona con los productos de la inmunidad humoral o celular especffica, incluidos los productos inducidos por inmunogenos heterologos. Un ejemplo de antfgeno es la endoplasmina. El termino «antfgeno» incluye todos los epftopos antigenicos relacionados. «Epftopo» o «determinante antigenico» se refiere a una posicion en un antfgeno a la cual responden celulas B y/o T. Los epftopos pueden formarse a partir de aminoacidos contiguos o aminoacidos no contiguos yuxtapuestos mediante plegamiento terciario de una protefna. Tfpicamente, los epftopos formados a partir de aminoacidos contiguos se conservan cuando se exponen a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epftopos formados mediante plegamiento terciario se pierden tfpicamente cuando se tratan con disolventes desnaturalizantes. Un epftopo incluye tfpicamente como mfnimo tres, y mas habitualmente como mfnimo cinco u ocho a diez aminoacidos en una conformacion espacial unica. Los metodos para determinar la conformacion espacial de los epftopos incluyen, por ejemplo, la cristalograffa de rayos X y la resonancia magnetica nuclear bidimensional.
Un antfgeno puede ser un antfgeno especffico de un tejido o un antfgeno especffico de una enfermedad.
Estos terminos no son excluyentes, dado que un antfgeno especffico de un tejido puede ser tambien un antfgeno especffico de una enfermedad. Un antfgeno especffico de un tejido se expresa en un numero limitado de tejidos, como por ejemplo un unico tejido. Ejemplos especfficos no limitativos de un antfgeno especffico de un tejido son un antfgeno especffico de melanoma, o un antfgeno especffico de glioma, mama, pulmon, prostata, rinon o vejiga. Un antfgeno especffico de una enfermedad se expresa coincidiendo con un proceso patologico, como por ejemplo un melanoma u otro tipo de cancer. Ejemplos especfficos no limitativos de un antfgeno especffico de una enfermedad son un antfgeno cuya expresion esta correlacionada con, o es predictiva de formacion tumoral, tales como melanoma y/o glioma, y/u otro tipo de cancer (por ejemplo, endoplasmina). Un antfgeno especffico de una enfermedad puede ser un antfgeno reconocido por celulas T o celulas B.
Amplificacion: de una molecula de acido nucleico (p. ej, una molecula de ADN o ARN) se refiere al uso de una tecnica que aumenta el numero de copias de una molecula de acido nucleico es una muestra. Un ejemplo de amplificacion es la reaccion en cadena de la polimerasa, en la que una muestra biologica tomada de un sujeto se pone en contacto con un par de cebadores oligonucleotidos, en condiciones que permiten la hibridacion de los cebadores para crear una plantilla de acido nucleico en la muestra. Los cebadores se extienden en las condiciones adecuadas, se disocian de la plantilla y a continuacion se realinean, se extienden y se disocian para amplificar el numero de copias del acido nucleico. El producto de la amplificacion puede caracterizarse mediante electroforesis, patrones de escision por endonucleasa de restriccion, hibridacion o ligadura de oligonucleotidos y/o secuenciacion de acido nucleico utilizando tecnicas estandar. Otros ejemplos de amplificacion incluyen la amplificacion por desplazamiento de cadena, como se describe en la Patente USA n° 5.744.311; amplificacion isotermica sin transcripcion, como se describe en la Patente USA n° 6.033.881; amplificacion por reaccion en cadena de reparacion, como se describe en el documento WO 90/01069; amplificacion por reaccion en cadena de ligasa, como se describe en el documento EP-A-320 308; amplificacion por reaccion en cadena de ligasa con rellenado de huecos, como se describe en la Patente USA n° 5.427.930; y amplificacion sin transcripcion de ARN NASBA™, como se describe en la Patente USA n° 6.025.134.
Animal: organismos vertebrados multicelulares vivos, una categorfa que incluye, por ejemplo, mamfferos y aves. El termino «mamffero» incluye a los mamfferos tanto humanos como no humanos, incluyendo los primates no humanos. Similarmente, el termino «sujeto» incluye tanto a humanos como a sujetos de veterinaria.
Afinidad de enlace: afinidad de un anticuerpo a un antfgeno. En una realizacion, la afinidad se calcula por la modificacion del metodo de Scatchard descrito por Frankel et al., Mol. Immunol., 16:101-106. En otra realizacion, la afinidad de enlace se mide mediante una tasa de disociacion antfgeno/anticuerpo. En otra realizacion, una afinidad de enlace elevada se mide por radioinmunoensayo de competicion. En otra realizacion, la afinidad de enlace se mide mediante ELISA. Un anticuerpo que «se une especfficamente» con una elevada afinidad a un antfgeno, como por ejemplo la endoplasmina, y no se une significativamente a otros antfgenos no relacionados.
Cancer de mama: una neoplasia del tejido mamario que puede ser benigna o maligna. El tipo de cancer de mama mas comun es el carcinoma ductal. El carcinoma ductal in situ es una neoplasia no invasiva de los conductos mamarios. El carcinoma lobular no es una enfermedad invasiva, pero es un indicador de que podrfa desarrollarse un carcinoma. El carcinoma infiltrante (maligno) de mama puede dividirse en las fases (I, IIA, IIB, III A, IIIB y IV).
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Agentes quimioterapeuticos: Cualquier agente qufmico con utilidad terapeutica en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por crecimiento celular anormal. Dichas enfermedades incluyen tumores, neoplasias y cancer asf como enfermedades caracterizadas por crecimiento hiperplasico, como la psoriasis. En algunas realizaciones, un agente quimioterapeutico es un agente utilizado en el tratamiento del cancer de mama, melanoma y/o gliomas. En una realizacion, un agente quimioterapeutico es un compuesto radioactivo. Un experto en la tecnica puede identificar facilmente un agente quimioterapeutico de uso (por ejemplo, vease Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, capftulo 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14a edicion; Perry et al., Chemotherapy, cap. 17 en Abeloff, Clinical Oncology 2.° ed., © 2000 Churchill Livingstone, Inc; Baltzer L, Berkery R (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer DS, Knobf MF, Durivage HJ (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993). La quimioterapia de combinacion es la administracion de mas de un agente para tratar el cancer, como por ejemplo la administracion a un sujeto de anticuerpos que se unen especfficamente a la endoplasmina en combinacion con un compuesto radioactivo o qufmico.
Anticuerpo quimerico: un anticuerpo que incluye secuencias derivadas de dos anticuerpos diferentes, que tfpicamente son de diferentes especies. Mas tfpicamente, los anticuerpos quimericos incluyen dominios de anticuerpos humanos y murinos, generalmente regiones constantes humanas y variables murinas, CDR murinas y/o SDR murinas.
ADNc (ADN complementario): una cadena de ADN que carece de segmentos internos no codificantes (intrones) y de secuencias reguladoras que determinan la transcripcion. El ADNc se sintetiza en el laboratorio mediante transcripcion inversa a partir de ARN mensajero extrafdo de celulas.
Agente quimioterapeutico: un agente qufmico con utilidad terapeutica en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por crecimiento celular anormal (p. ej., un agente antineoplasico). Dichas enfermedades incluyen tumores, neoplasias y cancer asf como enfermedades caracterizadas por crecimiento hiperplasico, como la psoriasis. En una realizacion, un agente quimioterapeutico es un agente utilizado en el tratamiento de neoplasias tales como tumores solidos. Los agentes quimioterapeuticos pueden ser agentes protefnicos o no protefnicos, tales como farmacos de moleculas pequenas, anticuerpos, peptidos, protefnas e inmunomoduladores. En una realizacion, un agente quimioterapeutico es una molecula radioactiva. Un especialista en la tecnica puede identificar facilmente un agente quimioterapeutico (por ejemplo, vease Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, capftulo 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14a edicion; Perry et al., Chemotherapy, cap. 17 en Abeloff, Clinical Oncology 2.° ed., © 2000 Churchill Livingstone, Inc; Baltzer L, Berkery R (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer Ds, Knobf MF, Durivage HJ (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993).
Variantes conservativas: Las sustituciones «conservativas» de aminoacidos son aquellas sustituciones que no afectan o disminuyen sustancialmente la afinidad de un anticuerpo a unirse especfficamente a la endoplasmina. Por ejemplo, un anticuerpo humano que se une especfficamente a la endoplasmina puede incluir como maximo aproximadamente 1, como maximo aproximadamente 2, como maximo aproximadamente 5 y como maximo aproximadamente 10 sustituciones conservativas y unirse especfficamente al polipeptido de endoplasmina original. La expresion variacion conservativa tambien incluye el uso de un aminoacido sustituido en lugar de un aminoacido precursor no sustituido, con la condicion de que el anticuerpo se una especfficamente a la endoplasmina. Las sustituciones no conservativas son aquellas que reducen una actividad o union a la endoplasmina.
Las tablas de sustitucion de aminoacidos conservativos que proporcionan aminoacidos similares son bien conocidas por los expertos en la tecnica. Los siguientes seis grupos son ejemplos de aminoacidos que estan considerados como sustituciones conservativas entre sf:
1. Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
2. Acido aspartico (D), Acido glutamico (E);
3. Asparagina (N), Glutamina (Q);
4. Arginina (R), Lisina (K);
5.Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V) y
6.Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).
Region determinante de la complementariedad (CDR): Secuencias de aminoacidos que, conjuntamente, definen la afinidad y la especificidad de enlace de la region Fv natural de un sitio de union de Ig nativa. Cada una de las cadenas ligera y pesada de una Ig tiene tres CDR, designadas como L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 y H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, respectivamente.
Puesta en contacto: puesta en asociacion ffsica directa, incluye las formas solida y lfquida.
Citotoxicidad: la toxicidad de una molecula, como una inmunotoxina, para las celulas diana, en contraposicion a las celulas del resto de un organismo. En otra realizacion, en contraste, el termino «toxicidad» se refiere a la toxicidad de una inmunotoxina para celulas distintas a las celulas diana de la fraccion de direccionamiento de la inmunotoxina, y el termino «toxicidad animal» se refiere a la toxicidad
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de la inmunotoxina para un animal debido a la toxicidad de una inmunotoxina para celulas distintas a las celulas diana de la inmunotoxina.
Variante degenerada: un polinucleotido que codifica un polipeptido de endoplasmina que incluye una secuencia que esta degenerada como resultado del codigo genetico. Existen 20 aminoacidos naturales, la mayorfa de los cuales estan especificados por mas de un codon. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleotidos degeneradas estan incluidas en esta divulgacion, siempre y cuando la secuencia de aminoacidos del polipeptido de endoplasmina codificado por la secuencia de nucleotidos este inalterada.
Diagnostico: Identificar la presencia o naturaleza de una afeccion patologica tal como, aunque sin caracter limitativo, un melanoma, cancer ovarico, cancer de mama o glioma.
Los metodos de diagnostico difieren en su sensibilidad y especificidad. La «sensibilidad» de un ensayo de diagnostico es el porcentaje de individuos enfermos que dan positivo en el test (porcentaje de verdaderos positivos). La «especificidad» de un ensayo de diagnostico es uno menos la tasa de falsos positivos, donde la tasa de falsos positivos se define como la proporcion de individuos sin la enfermedad que dan positivo en el test. Aunque un metodo de diagnostico concreto puede no proporcionar un diagnostico definitivo de una afeccion, es suficiente si el metodo proporciona una indicacion positiva que ayude en el diagnostico. «Pronostico» es la probabilidad de desarrollo (por ejemplo, gravedad) de una afeccion patologica, como por ejemplo cancer o metastasis.
Molecula efectora: la parte de una molecula quimerica que debe tener un efecto deseado en una celula a la que esta dirigida la molecula quimerica. La molecula efectora tambien se conoce como fraccion efectora (EM), agente terapeutico, agente diagnostico o terminos similares.
Los agentes terapeuticos incluyen compuestos tales como acidos nucleicos, protefnas, peptidos, aminoacidos o derivados, glicoprotefnas, radioisotopos, lfpidos, carbohidratos o virus recombinantes. Los grupos funcionales terapeuticos y diagnosticos de acidos nucleicos incluyen acidos nucleicos antisentido, oligonucleotidos derivatizados para entrelazamiento covalente con ADN simple o doble y oligonucleotidos inductores de triple helice. Alternativamente, la molecula ligada a una fraccion de direccionamiento, por ejemplo un anticuerpo contra endoplasmina, puede ser un sistema de encapsulacion, como por ejemplo un liposoma o una micela que contiene una composicion terapeutica como un farmaco, un acido nucleico (como un acido nucleico antisentido) u otra fraccion terapeutica que puede ser protegida contra la exposicion directa al sistema circulatorio. Los metodos para la preparacion de liposomas ligados a anticuerpos (vease, por ejemplo, la Patente USA n° 4.957.735; y Connor et al., Pharm. Ther. 28:341-365, 1985) son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Los agentes o grupos diagnosticos incluyen radioisotopos y otras etiquetas detectables. Tambien son bien conocidos por los expertos en la tecnica etiquetas detectables utiles para tales fines, que incluyen isotopos radioactivos tales como 35S, 11C, 13N, 150,18F, 19F, 99mTc, 1311,3H, 14C, 15N, 90Y, 99Tc, 111In y 125I, fluoroforos, agentes quimioluminiscentes y enzimas.
Epftopo: un determinante antigenico. Se trata de grupos qufmicos o secuencias de peptidos concretos en una molecula que son antigenicos, es decir, que provocan una respuesta inmunitaria especffica. Un anticuerpo se une especfficamente a un epftopo antigenico concreto en un polipeptido. Los epftopos pueden formarse a partir de aminoacidos contiguos o aminoacidos no contiguos yuxtapuestos mediante plegamiento terciario de una protefna. Tfpicamente, los epftopos formados a partir de aminoacidos contiguos se conservan cuando se exponen a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epftopos formados mediante plegamiento terciario se pierden tfpicamente cuando se tratan con disolventes desnaturalizantes. Un epftopo incluye tfpicamente como mfnimo tres, y mas habitualmente como mfnimo cinco u ocho a diez aminoacidos en una conformacion espacial unica. Los metodos para determinar la conformacion espacial de los epftopos incluyen, por ejemplo, la cristalograffa de rayos X y la resonancia magnetica nuclear bidimensional. Vease p. ej. Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996). Un epftopo puede ser glicosilado. Asf pues, un anticuerpo se puede unir especfficamente a una forma glicosilada (o a una forma no glicosilada) de una protefna.
Endoplasmina: una protefna tambien conocida como protefna regulada por glucosa (Grp) 94 (Grp94), que es el miembro residente en el retfculo endoplasmico (ER) de la familia de protefnas de choque termico 90 (Hsp90). En vivo, Hsp90 y la endoplasmina interactuan con protefnas cliente y funcionan para protegerlas contra la degradacion proteasomal dependiente de ubiquitina. Aunque la protefna endoplasmina se expresa constitutivamente en todos los tipos de celulas, su expresion aumenta en diversas condiciones de estres que incluyen niveles de glucosa bajos, pH extracelular bajo, expresion de protefnas mutadas e infecciones virales. Las protefnas de choque termico tienen una funcion citoprotectora y modulan la apoptosis directa o indirectamente.
Se ha demostrado que la expresion de endoplasmina en la superficie de la celula se incrementa en las celulas tumorales, incluyendo celulas de carcinoma hepatocelular, carcinoma colorrectal y cancer de pulmon, y que la endoplasmina tiene un efecto antiapoptotico en algunas celulas tumorales. Ademas, se observaron niveles aumentados de endoplasmina cuando una infeccion cronica por virus de la hepatitis B (HBV) desemboco en cirrosis y carcinoma hepatocelular (HCC). Se han investigado inhibidores de Hsp90 y endoplasmina (tales como la geldanamicina (GA) y su derivado menos toxico 17-AAG) para determinar su eficacia en el tratamiento del cancer.
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Ejemplos de acidos nucleicos que codifican endoplasmina (Grp94) incluyen, sin caracter limitativo: Numeros de registro GENBANK® NM_003299, BC066656 (Homo sapiens); NM_011631 (Mus musculus); NM_001045763: (Xenopus (Silurana) tropicalis); NM_214103 (Sus scrofa) NM_98210 (Danio rerio); NM_001012197 (Rattus norvegicus); NM_001134101: Pongo abelii; NM_001003327 (Canis lupus familiaris) protefna de choque termico 90 kDa beta (Grp94); NM_204289 (Gallus gallus).
Secuencias de control de expresion: las secuencias de acido nucleico que regulan la expresion de una secuencia de acido nucleico heterologa a la que estan unidas de forma funcional. Las secuencias de control de expresion estan unidas de forma funcional a una secuencia de acido nucleico cuando las secuencias de control de expresion controlan y regulan la transcripcion y, segun sea apropiado, la traduccion de la secuencia de acido nucleico. Por tanto, las secuencias de control de expresion pueden incluir promotores, potenciadores, terminadores de la transcripcion apropiados, un codon de inicio (es decir, ATG) delante del gen que codifica la protefna, la senal de corte y empalme para los intrones, el mantenimiento del marco de lectura correcto de ese gen para permitir la traduccion apropiada del ARNm, y codones de parada. Se pretende que la expresion «secuencias de control» incluya, como mfnimo, los componentes cuya presencia puede influir en la expresion, y tambien puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, como por ejemplo secuencias lfder y secuencias de elementos de fusion. Las secuencias de control de la expresion pueden incluir un promotor.
Un promotor es una secuencia minima suficiente para dirigir la transcripcion. Tambien se incluyen aquellos elementos promotores que son suficientes para hacer que la expresion del gen dependiente de promotor sea controlable de forma especffica de tipo celular, especffica de tejido, o inducible por senales o agentes externos; dichos elementos pueden estar localizados en las regiones 5' o 3' del gen. Se incluyen promotores tanto constitutivos como inducibles (vease por ejemplo Bitter et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987). Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como pL del bacteriofago lambda, plac, ptrp, ptac (promotor hfbrido ptrp-lac) y similares. En una realizacion, cuando se clona en sistemas celulares de mamffero, pueden usarse promotores derivados del genoma de celulas de mamffero (tales como el promotor de la metalotionefna) o de virus de mamffero (tales como la repeticion terminal larga de retrovirus; el promotor tardfo de adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia). Tambien pueden usarse promotores producidos por ADN recombinante o tecnicas sinteticas para proporcionar la transcripcion de las secuencias de acido nucleico.
Expresado: traduccion de un acido nucleico a una protefna. Las protefnas pueden ser expresadas y mantenerse intracelulares, convertirse en un componente de la membrana de la superficie de la celula o ser segregadas en la matriz o el medio extracelular.
Region marco: secuencias de aminoacidos interpuestas entre las CDR. Las regiones marco incluyen regiones marco ligeras variables y pesadas variables. Las regiones marco sirven para mantener las CDR en una orientacion apropiada para la union al antfgeno.
Glioma: un tumor compuesto por celulas gliales en cualquier estadio de desarrollo.
Los gliomas incluyen todas las neoplasias intrfnsecas del cerebro y de la medula espinal, tales como astrocitomas, ependimomas y oligodendrogliomas. Los gliomas «de bajo grado» estan bien diferenciados (no anaplasicos); son benignos y auguran un mejor pronostico para el paciente. Los gliomas «de alto grado» son indiferenciados o anaplasicos; son malignos y tienen un peor pronostico.
Glicosilacion: la union covalente de un carbohidrato a una protefna, por ejemplo un antfgeno. La glicosilacion incluye la N-glicosilacion, O-glicosilacion y C-glicosilacion.
Respuesta HAMA (anticuerpo antimurino humano): una respuesta inmunitaria en un sujeto humano a las regiones variable y constante de un anticuerpo murino que ha sido administrado al paciente. La administracion repetida de anticuerpos puede dar lugar a un aumento de la tasa de eliminacion del anticuerpo del suero del paciente y tambien puede provocar reacciones alergicas en el paciente.
Celulas hospedadoras: Celulas en las que puede propagarse un vector y expresarse su ADN. La celula puede ser procariota o eucariota. El termino tambien incluye cualquier descendencia de la celula hospedadora del sujeto. Se entiende que toda la descendencia puede no ser identica a la celula precursora ya que pueden producirse mutaciones durante la replicacion. Sin embargo, dicha descendencia se incluye cuando se usa la expresion «celula hospedadora».
Respuesta inmunitaria: una respuesta de una celula del sistema inmunitario, como por ejemplo una celula B, celula T o monocito, a un estfmulo. En una realizacion, la respuesta es especffica para un antfgeno concreto (una «respuesta antigenoespecffica»). En una realizacion, una respuesta inmunitaria es una respuesta de celulas T, tal como una respuesta CD4+ o una respuesta CD8+. En otra realizacion, la respuesta es una respuesta de celulas B, y provoca la produccion de anticuerpos especfficos.
Inmunoconjugado: un enlace covalente de una molecula efectora a un anticuerpo o a un fragmento funcional de este, que se une especfficamente a un antfgeno de interes, tal como endoplasma humano. La molecula efectora puede ser una etiqueta detectable, una inmunotoxina, una citoquina o una quimiocina. Ejemplos especfficos no limitativos de toxinas incluyen abrina, ricina, exotoxina de Pseudomonas (PE, tales como PE35, PE37, PE38 y PE40), toxina de la difteria (DT), toxina botulfnica o sus toxinas
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modificadas u otros agentes toxicos que inhiben directa o indirectamente el crecimiento celular o matan celulas. Por ejemplo, PE y DT son compuestos altamente toxicos que tfpicamente provocan la muerte por toxicidad hepatica. Sin embargo, es posible modificar PE y DT para crear una forma para su uso como inmunotoxina, eliminando el componente de direccionamiento nativo de la toxina (por ejemplo, el dominio la de PE y la cadena B de DT) y sustituyendolo por una fraccion de direccionamiento diferente, como por ejemplo un anticuerpo. Una «molecula quimerica» es una fraccion de direccionamiento, por ejemplo un ligando o un anticuerpo, conjugado (acoplado) con una molecula efectora. El termino «conjugado» o «enlazado» se refiere a convertir dos polipeptidos en una molecula polipeptida contigua. En una realizacion, un anticuerpo se une a una molecula efectora. En otra realizacion, un anticuerpo unido a una molecula efectora se une ademas a un lfpido u otra molecula (a una protefna o peptido) para incrementar su semivida en el organismo. El enlace puede tener lugar por medios qufmicos o recombinantes. En una realizacion, el enlace es qufmico, donde una reaccion entre la fraccion del anticuerpo y la molecula efectora ha provocado la formacion de un enlace covalente entre las dos moleculas para formar una sola molecula. Opcionalmente se puede incluir un enlazador peptido (secuencia peptfdica corta) entre el anticuerpo y la molecula efectora. Dado que los inmunoconjugados fueron preparados originalmente a partir de dos moleculas con funcionalidades separadas, como un anticuerpo y una molecula efectora, en ocasiones son denominados tambien «moleculas quimericas». A los efectos de la presente, el termino «molecula quimerica» se refiere a una fraccion de direccionamiento, por ejemplo un ligando o un anticuerpo, conjugado (acoplado) con una molecula efectora.
Peptido inmunogenico: un peptido que comprende un motivo especffico de alelo u otra secuencia, por ejemplo una repeticion de terminal N, de modo que el peptido se una a una molecula MHC e induzca una respuesta de linfocitos T citotoxicos («CTL») o una respuesta de celulas B (por ejemplo, produccion de anticuerpos) contra el antfgeno del que se obtiene el peptido inmunogenico.
En una realizacion, los peptidos inmunogenicos se identifican usando motivos de secuencia u otros metodos, tales como redes neurales o determinaciones polinomiales, conocidos en la tecnica. Tfpicamente, se usan algoritmos para determinar el «umbral de union» de peptidos para seleccionar aquellos con valores que les otorguen una elevada probabilidad de union a una cierta afinidad y seran inmunogenicos. Los algoritmos se basan en los efectos sobre la union a MHC de un aminoacido concreto en una posicion concreta, los efectos sobre la union al anticuerpo de un aminoacido concreto en una posicion concreta, o los efectos sobre la union de una sustitucion concreta en un peptido que contiene un motivo. En el contexto de un peptido inmunogenico, un «residuo conservado» es uno que aparece en una frecuencia significativamente mayor que la que se esperarfa por distribucion aleatoria en una posicion concreta en un peptido. En una realizacion, un residuo conservado es uno donde la estructura MHC puede proporcionar un punto de contacto con el peptido inmunogenico. En un ejemplo especffico no limitativo, un polipeptido inmunogenico incluye una region de endoplasmina o un fragmento de la misma, donde el polipeptido es expresado en la superficie de una celula hospedadora que expresa el polipeptido de endoplasmina completo.
Composicion inmunogenica: Una composicion que comprende un polipeptido por ejemplo un polipeptido de endoplasmina, que induce una respuesta CTL medible contra celulas que expresan polipeptido de endoplasmina, o induce una respuesta de celulas B medible (como la produccion de anticuerpos) contra un polipeptido de endoplasmina. Una composicion inmunogenica tambien puede inducir la produccion de citoquina. Asimismo, se refiere a acidos nucleicos aislados que codifican un polipeptido de endoplasmina que puede utilizarse para expresar el polipeptido de endoplasmina (y, por consiguiente, puede utilizarse para provocar una respuesta inmunitaria contra este polipeptido). Para uso in vitro, una composicion inmunogenica puede constar de la protefna aislada o del epftopo peptido. Para uso in vivo, la composicion inmunogenica tfpicamente comprendera la protefna o el peptido inmunogenico en vehfculos farmaceuticamente aceptables, y/u otros agentes. Todo peptido concreto, por ejemplo un polipeptido de endoplasmina o un acido nucleico que codifica el polipeptido, puede ensayarse facilmente en cuanto a su capacidad para inducir una respuesta CTL o de celulas B mediante ensayos reconocidos en la tecnica. Las composiciones inmunogenicas pueden incluir adyuvantes, que son bien conocidos por los expertos en la tecnica.
Condiciones inmunologicamente reactivas: incluye la referencia a condiciones que permiten que un anticuerpo activado contra un epftopo particular se una a ese epftopo en un grado detectablemente mayor que la union a sustancialmente todos los demas epftopos y/o excluyendo esta en un grado sustancial. Las condiciones inmunologicamente reactivas son dependientes del formato de la reaccion de union del anticuerpo y tfpicamente son las que se utilizan en protocolos de inmunoensayo o en condiciones que se encuentran in vivo. Vease Harlow & Lane, mas arriba, para obtener una descripcion de los formatos y las condiciones de los inmunoensayos. Las condiciones inmunologicamente reactivas empleadas en los metodos son «condiciones fisiologicas» que incluyen la referencia a condiciones (como temperatura, osmolaridad y pH) que son tfpicas en el interior de un mamffero vivo o de una celula de mamffero. A pesar de que se reconoce que algunos organos estan sujetos a condiciones extremas, por lo general el entorno intracelular y en el interior del organismo tiene aproximadamente un pH 7 (es decir, entre un pH 6,0 y un pH 8,0, mas tfpicamente entre un pH 6,5 y un pH 7,5), contiene agua como disolvente predominante y existe a una temperatura superior a 0 °C e inferior a 50 °C. La osmolaridad se encuentra dentro del rango que favorece la viabilidad y la proliferacion celular.
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Aislado: un componente biologico «aislado», por ejemplo, un acido nucleico, una protefna (incluyendo anticuerpos) u organulo se ha separado sustancialmente o purificado de otros componentes biologicos en el entorno (por ejemplo una celula) en el que el componente se da de forma natural, es decir, otro ADN y ARN cromosomico y extracromosomico, protefnas y organulos. Los acidos nucleicos y las protefnas que han sido «aislados» incluyen acidos nucleicos y protefnas purificados por metodos de purificacion estandar. El termino tambien engloba acidos nucleicos y protefnas preparados mediante expresion recombinante en una celula hospedadora, asf como acidos nucleicos sintetizados qufmicamente.
Etiqueta: un compuesto o composicion detectable que se conjuga directa o indirectamente con otra molecula, por ejemplo un anticuerpo o una protefna, para facilitar la deteccion de esa molecula. Ejemplos especfficos no limitativos de etiquetas incluyen marcadores fluorescentes, enlaces enzimaticos e isotopos radiactivos. En un ejemplo, un «anticuerpo etiquetado» se refiere a la incorporacion de otra molecula en el anticuerpo. Por ejemplo, la etiqueta es un marcador detectable, como la incorporacion de un aminoacido radiomarcado o la union a un polipeptido de fracciones de biotinilo que puede detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina conteniendo un marcador fluorescente o actividad enzimatica que puede detectarse empleando metodos opticos o colorimetricos). En la tecnica se conocen y se pueden utilizar varios metodos para el etiquetado de polipeptidos y glicoprotefnas. Ejemplos de etiquetas para polipeptidos incluyen pero sin limitacion: radioisotopos o radionucleotidos (como 35S, 11C, 13N, 150,18F, 19F, 9mTc, 1311,3H, 14C, 15N, 90Y, 99TC, 111In e 125I), etiquetas fluorescentes (como isotiocianato de fluorescefna (FITC), rodamina, fosforos lantanidos), etiquetas enzimaticas (como peroxidasa de rabano silvestre, beta- galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilos, epftopos polipeptidos predeterminados reconocidos por un reporter secundario (por ejemplo, secuencias de par de cremalleras de leucina, lugares de union para anticuerpos secundarios, dominios de union a metal, marcadores epitopicos) o agentes magneticos, como quelatos de gadolinio. En algunas realizaciones, las etiquetas estan sujetas por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento esterico potencial.
Enlazador: en algunos casos, un enlazador es un peptido dentro de un fragmento de union de un anticuerpo (como un fragmento Fv) que sirve para unir indirectamente la cadena pesada variable a la cadena ligera variable. «Enlazador» tambien se puede referir a un peptido que sirve para unir una fraccion de direccionamiento , como un anticuerpo, a una molecula efectora, como una citotoxina o una etiqueta detectable.
Los terminos «conjugar» «unir», «conectar» o «enlazar» se refieren a convertir dos polipeptidos en una molecula polipeptida contigua, o unir de forma covalente un radioisotopo u otra molecula a un polipeptido, como un Fv monocatenario. En el contexto especffico, los terminos se refieren tambien a la union de un ligando, como una fraccion de anticuerpo, a una molecula efectora. El enlace puede tener lugar por medios qufmicos o recombinantes. «Medios qufmicos» se refiere a una reaccion entre la fraccion del anticuerpo y la molecula efectora, de forma que se haya formado un enlace covalente entre las dos moleculas para formar una sola molecula.
Mamffero: este termino incluye a los mamfferos tanto humanos como no humanos. Similarmente, el termino «sujeto» incluye tanto a humanos como a sujetos de veterinaria.
Complejo principal de histocompatibilidad (MHC): denominacion generica que pretende abarcar los sistemas de antfgeno de histocompatibilidad descritos en diferentes especies, incluyendo los antfgenos de leucocitos humanos («HLA»). El termino «motivo» se refiere al patron de residuos en un peptido de longitud definida, habitualmente de aproximadamente 8 a aproximadamente 11 aminoacidos, que es reconocido por un alelo MHC concreto. Tfpicamente, los motivos peptidos son diferentes para cada alelo MHC y difieren en el patron de los residuos altamente conservados y los residuos de union negativa.
Melanoma: una forma de cancer que se origina en los melanocitos (celulas que producen el pigmento melanina). Los melanocitos estan presentes principalmente en la piel, pero tambien estan presentes en las vfsceras y en el ojo. El melanoma en la piel incluye el melanoma de extension superficial, el melanoma nodular, el melanoma lentiginoso acral y lentigo maligno (melanoma). Cualquiera de los tipos mencionados puede producir melanina o puede ser amelanotico. Similarmente, cualquier subtipo puede presentar desmoplasia (reaccion fibrosa densa con neurotropismo), que es un marcador de comportamiento agresivo y tendencia a la recurrencia local. Otros melanomas incluyen el de sarcoma de celulas claras, el melanoma mucoso y el melanoma uveal.
Las caracterfsticas que afectan al pronostico son el grosor del tumor en milfmetros (profundidad de Breslow), profundidad en relacion con las estructuras de la piel (nivel de Clark), tipo de melanoma, presencia de ulceracion, presencia de invasion linfatica/perineural, presencia de linfocitos infiltradores de tumores (si estan presentes, el pronostico es mejor), ubicacion de la lesion, presencia de lesiones satelite y presencia de metastasis regional o distante. Si los melanomas se han propagado a los ganglios linfaticos, uno de los principales factores es el numero de ganglios malignos. Tambien es importante el grado de malignidad dentro de un ganglio; las micrometastasis en las cuales la malignidad es solo microscopica tienen un pronostico mas favorable que las macrometastasis. Si existe metastasis distante, el fndice de supervivencia a cinco anos es inferior al 10 por ciento; el promedio de supervivencia se situa entre 6 y 12 meses.
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Las metastasis en piel y pulmones tienen un mejor pronostico. Las metastasis en cerebro, hueso e hfgado estan asociadas a un pronostico peor.
El melanoma puede dividirse en los siguientes estadios:
Estadio 0: melanoma in situ (nivel de Clark I), supervivencia del 100 %
Estadios I/II: melanoma invasivo, supervivencia del 85-95 %
T1a: menos de 1,00 mm primario, sin ulceracion, nivel de Clark II-NI
T1b: menos de 1,00 mm primario, con ulceracion o nivel de Clark IV-V
T2a: 1,00-2,00 mm primario, sin ulceracion
Estadio II: melanoma de alto riesgo, supervivencia del 40-85 %
T2b:1,00-2,00 mm primario, con ulceracion
T3a: 2,00-4,00 mm primario, sin ulceracion
T3b: 2,00-4,00 mm primario, con ulceracion
T4a: 4,00 mm o superior primario, sin ulceracion
T4b: 4,00 mm o superior primario, con ulceracion
Estadio III: metastasis regional, supervivencia del 25-60 %
N1: un solo ganglio linfatico positivo
N2: 2-3 ganglios linfaticos positivos O metastasis regional en la piel/en transito
N3: 4 ganglios linfaticos positivos O metastasis en ganglio linfatico y regional en la piel/en transito
Estadio IV: metastasis distante, supervivencia del 9-15 %
M1a: metastasis distante en la piel, lactato deshidrogenasa normal (LDH)
M2b: metastasis en el pulmon, LDH normal
M1c: otras metastasis distantes O cualquier metastasis distante con LDH elevada
Anticuerpo monoclonal: un anticuerpo producido por un unico clon de linfocitos B, por una celula en la que se han transfectado los genes de cadena ligera y pesada de un unico anticuerpo o por un fago especffico en un anticuerpo en una biblioteca de anticuerpos, de modo que el anticuerpo monoclonal incluye un conjunto definido de CDR y se une especfficamente a un antfgeno diana de interes. Los anticuerpos monoclonales se producen por los metodos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo (pero sin caracter limitativo) produciendo celulas productoras de anticuerpos hfbridas a partir de la fusion de celulas de mieloma con celulas inmunitarias del bazo o por seleccion de una biblioteca de expresion de secuencias de anticuerpos en fagos. Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos monoclonales humanizados y totalmente humanos. A efectos del presente documento, un fragmento funcional de un anticuerpo monoclonal incluye fragmentos de anticuerpo que se unen especfficamente a la protefna diana (union al antfgeno) para el anticuerpo monoclonal, como por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, scFv, Fv, dsRv o Fab. Los anticuerpos monoclonales se unen especfficamente a un epftopo antigenico, por ejemplo un epftopo glicosilado. Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos bifuncionales, donde uno o mas conjuntos de CDR se unen especfficamente a un antfgeno diana, como endoplasmina y un Fc con funcion efectora mejorada, y otros anticuerpos modificados con glicol.
Neoplasia, malignidad, cancer o tumor: el resultado del crecimiento anormal e incontrolado de celulas. Los terminos neoplasia, malignidad, cancer y tumor se utilizan a menudo indistintamente. El volumen de un tumor en un individuo es la «carga tumoral», que puede medirse como el numero, volumen o peso del tumor. Un tumor que no metastatiza se denomina «benigno». Un tumor que invade el tejido circundante y/o puede metastatizar se denomina «maligno». Ejemplos de tumores hematologicos incluyen leucemias, incluyendo las leucemias agudas (tales como leucemia aguda positiva para 1q23, leucemia linfocftica aguda, leucemia mielocftica aguda, leucemia mielogena aguda y leucemia mieloblastica, promielocftica, mielomonocftica, monocftica y eritroleucemia), leucemias cronicas (tales como leucemia mielocftica (granulocftica) cronica, leucemia mielogena cronica y leucemia linfocftica cronica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (formas indolente y de alto grado), mieloma multiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada, sfndrome mielodisplasico, leucemia de celulas pilosas y mielodisplasia.
Algunos ejemplos de tumores solidos, como sarcomas y carcinomas, incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, neoplasia maligna linfoide, cancer de pancreas, cancer de mama (incluyendo carcinoma de mama basal, carcinoma ductal y carcinoma de mama lobular), cancer de pulmon, cancer de ovarios, cancer de prostata, carcinoma
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hepatocelular, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de glandulas sudorfparas, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, feocromocitoma, carcinoma de glandulas sebaceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cancer cervical, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga y tumores CNS (como glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma).
En algunos ejemplos, un tumor es un melanoma, un cancer de mama, un cancer renal, un glioma o un carcinoma de celulas escamosas, como por ejemplo cancer de cabeza y cuello.
Acido nucleico: un polfmero compuesto por unidades nucleotidas (ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos, variantes estructurales existentes en la naturaleza relacionadas y sus analogos sinteticos no existentes en la naturaleza) unidas por enlaces fosfodiester, variantes estructurales existentes en la naturaleza relacionadas y sus analogos sinteticos no existentes en la naturaleza. Asf pues, el termino incluye polfmeros nucleotidos en los que los nucleotidos y los enlaces entre ellos incluyen analogos sinteticos no existentes en la naturaleza, tales como, por ejemplo y sin caracter limitativo, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirales, 2-O-metil ribonucleotidos, acidos peptido- nucleicos (PNA) y similares. Tales polinucleotidos pueden sintetizarse, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automatizado. El termino «oligonucleotido» se refiere tfpicamente a polinucleotidos cortos, generalmente de tamano no superior a aproximadamente 50 nucleotidos. Se entendera que cuando una secuencia de nucleotidos se represente por una secuencia de ADN (es decir, A, T, G, C), esto tambien incluye una secuencia de ARN (es decir, A, U, G, C) en la que «U» sustituye a «T».
En la presente se utiliza la notacion convencional para describir secuencias de nucleotidos: el extremo izquierdo de una secuencia de nucleotidos de cadena simple es el extremo 5'; la direccion a la izquierda de una secuencia de nucleotidos de doble cadena se denomina direccion 5'. La direccion de adicion 5' a 3' de nucleotidos a transcritos incipientes de ARN se conoce como direccion de transcripcion. La cadena de ADN que tiene la misma secuencia que un ARNm se denomina «cadena codificadora»; las secuencias en la cadena de ADN que tiene la misma secuencia que un ARNm transcrito desde dicho ADN y que estan ubicadas 5' al extremo 5' del transcritos de ARN se denominan «secuencias ascendentes»; las secuencias en la cadena de ADN que tiene la misma secuencia que el ARN y que estan ubicadas 3' al extremo 3' del transcrito de ARN codificador se denominan «secuencias descendentes».
«ADNc» se refiere a un ADN que es complementario o identico a un ARNm, ya sea en forma de cadena sencilla o de doble cadena.
«Codificador» se refiere a la propiedad inherente de secuencias especfficas de nucleotidos en un polinucleotido, como por ejemplo un gen, un ADNc o un ARNm, para servir como plantillas para la sfntesis de otros polfmeros y macromoleculas en procesos biologicos que tienen una secuencia de nucleotidos definida (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoacidos y las propiedades biologicas resultantes de ello. Asf pues, un gen codifica una protefna si la transcripcion y la traduccion del ARNm producido por ese gen produce la protefna en una celula o en otro sistema biologico.
Tanto la cadena codificadora, cuya secuencia de nucleotidos es identica a la secuencia de ARNm y habitualmente se proporciona en listas de secuencias, como la cadena no codificadora, utilizada como plantilla para la transcripcion de un gen o ADNc pueden ser denominadas como codificadora de la protefna u otro producto de ese gen o ADNc. Salvo que se especifique otra cosa, una «secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos» incluye todas las secuencias de nucleotidos que son versiones degeneradas unas de otras y codifican la misma secuencia de aminoacidos. Las secuencias de nucleotidos que codifican protefnas y ARN pueden incluir intrones.
«Acido nucleico recombinante» se refiere a un acido nucleico que tiene secuencias de nucleotidos que no estan unidas entre sf de forma natural. Esto incluye vectores de acido nucleico que comprenden un acido nucleico amplificado o ensamblado que puede utilizarse para transformar una celula hospedadora adecuada. Una celula hospedadora que comprende el acido nucleico recombinante se denomina «celula hospedadora recombinante». Posteriormente, el gen se expresa en la celula hospedadora recombinante para producir, por ejemplo, un «polipeptido recombinante». Un acido nucleico recombinante puede desempenar tambien una funcion no codificadora (como promotor, origen de la replicacion, lugar de union de ribosomas, etc.).
Una primera secuencia es un «antisentido» con respecto a una segunda secuencia si un polinucleotido cuya secuencia es la primera secuencia hibrida especfficamente con un polinucleotido cuya secuencia es la segunda secuencia.
Los terminos utilizados para describir relaciones entre dos o mas secuencias de nucleotidos o secuencias de aminoacidos incluyen «secuencia de referencia», «seleccionada de» «ventana de comparacion», «identica», «porcentaje de identidad de secuencia», «sustancialmente identica», «complementaria» y «sustancialmente complementaria».
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Para la comparacion de secuencias de acidos nucleicos, tfpicamente una secuencia actua como secuencia de referencia con la cual se comparan las secuencias de prueba. Al utilizar un algoritmo de comparacion de secuencias, se introducen en un ordenador secuencias de prueba y de referencia, se designan coordenadas de subsecuencia si fuera necesario y se definen los parametros del programa del algoritmo de secuencias. Se utilizan los parametros del programa por defecto. Los metodos de alineamiento de secuencias para la comparacion son bien conocidos en la tecnica. El alineamiento optimo de secuencias para la comparacion puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homologfa local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, mediante el algoritmo de alineamiento de homologfa de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante el metodo de busqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, mediante implementaciones computerizadas de dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software para genetica Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante alineamiento manual e inspeccion visual (vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 suplemento)).
Un ejemplo de un algoritmo util es PILEUP. PILEUP utiliza una simplificacion del metodo de alineamiento progresivo de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360, 1987. El metodo utilizado es similar al metodo descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989. Utilizando PILEUP, se compara una secuencia de referencia con otras secuencias de prueba para determinar el porcentaje de la relacion de identidad de las secuencias usando los siguientes parametros: peso del hueco por defecto (3,00), peso de la longitud del hueco por defecto (0,10), y huecos de los extremos ponderados. PILEUP puede obtenerse del paquete de software de analisis de secuencias GCG, por ejemplo la version 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395,1984).
Otro ejemplo de algoritmos adecuados para determinar el porcentaje de identidad de la secuencia y la similitud de la secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que son descritos por Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990 y Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1977. El software para realizar analisis BLAST esta disponible al publico a traves del Centro Nacional para Informacion Biotecnologica
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). El programa BLASTN (para secuencias de nucleotidos) utiliza de forma predeterminada una longitud de palabra (W) de 11, alineamientos (B) de 50, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparacion de ambas cadenas. El programa BLASTP (para secuencias de aminoacidos) utiliza de forma predeterminada una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989).
Oligonucleotido: una secuencia polinucleotfdica lineal con una longitud de hasta aproximadamente 100 bases nucleotfdicas.
Marco abierto de lectura (ORF): una serie de tripletes de nucleotidos (codones) que codifican para aminoacidos sin codones de terminacion. Habitualmente, estas secuencias son traducibles a un peptido.
Unida operativamente: una primera secuencia de acido nucleico esta unida operativamente a una segunda secuencia de acido nucleico cuando la primera secuencia de acido nucleico esta dispuesta en una relacion funcional con la segunda secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, un promotor, como pueda ser un promotor heterologo, esta unido operativamente a una secuencia codificadora si el promotor afecta a la transcripcion o la expresion de la secuencia codificadora. Por regla general, las secuencias de ADN unidas operativamente son contiguas y, allf donde sea necesario para unir dos regiones codificadoras de protefna, se encuentran en el mismo marco de lectura.
Agente farmaceutico: un compuesto o una composicion qufmica capaz de inducir un efecto terapeutico o profilactico deseado al ser administrado correctamente a un sujeto o una celula.
Vehfculos farmaceuticamente aceptables: los vehfculos farmaceuticamente aceptables de uso son convencionales. Remington's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a edicion (1975), describe composiciones y formulaciones apropiadas para la liberacion farmaceutica de las protefnas de fusion aquf divulgadas.
En general, la naturaleza del vehfculo dependera del modo concreto de administracion que se utilice. Por ejemplo, las formulaciones parenterales suelen comprender fluidos inyectables que incluyen como vehfculo fluidos farmaceutica y fisiologicamente aceptables tales como agua, suero fisiologico, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares. Para composiciones solidas (por ejemplo, en forma de polvo, pfldora, tableta o capsula), los vehfculos solidos no toxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmaceuticos de manitol, lactosa, almidon o estearato de magnesio. Ademas de los vehfculos biologicamente neutros, las composiciones farmaceuticas a administrar pueden contener pequenas cantidades de sustancias auxiliares no toxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes de tamponado de pH y similares, por ejemplo acetato de sodio o monolaurato de sorbitano.
Polinucleotido: el termino polinucleotido o secuencia de acido nucleico se refiere a una forma polimerica
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de nucleotido con una longitud minima de 10 bases. Un polinucleotido recombinante incluye un polinucleotido que no es inmediatamente contiguo a ambas secuencias codificadoras a las cuales es inmediatamente contiguo (una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma natural del organismo del que se deriva. Por consiguiente, el termino incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora a un vector, en un plasmido o virus que se replica de forma autonoma o en el ADN genomico de una procariota o eucariota, o que existe como molecula separada (por ejemplo, un ADNc) independiente de otras secuencias. Los nucleotidos pueden ser ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos o formas modificadas de ambos nucleotidos. El termino incluye formas de ADN de cadena sencilla y de doble cadena.
Polipeptido: cualquier cadena de aminoacidos, independientemente de su longitud o modificacion posttraduccional (por ejemplo, glicosilacion o fosforilizacion). En una realizacion, el polipeptido es el polipeptido de endoplasmina. Un «residuo» se refiere a un aminoacido o a un mimetico de aminoacido incorporado a un polipeptido por un enlace amida o un mimetico de enlace amida. Un polipeptido tiene un extremo terminal amino (terminal N) y un extremo terminal carboxilo (terminal C).
Prevenir, tratar o mitigar una enfermedad: «prevenir» una enfermedad se refiere a inhibir el pleno desarrollo de una enfermedad. «Tratar» se refiere a una intervencion terapeutica que mitiga un signo o sfntoma de una enfermedad o un estado patologico una vez que ha empezado a desarrollarse, como por ejemplo la reduccion de la carga tumoral o la reduccion del numero y el tamano de metastasis. «Mitigar» se refiere a la reduccion del numero o la gravedad de los signos o sfntomas de una enfermedad, como el cancer.
Sondas y cebadores: una sonda comprende un acido nucleico aislado ligado a una molecula marcadora o informadora detectable. Los cebadores son acidos nucleicos cortos, preferiblemente oligonucleotidos de ADN, con una longitud de 15 nucleotidos o mas. Los cebadores pueden emparejarse con una cadena de ADN diana complementaria mediante hibridacion de acido nucleico para formar un hfbrido entre el cebador y la cadena de ADN diana, y despues extenderse a lo largo de la cadena de ADN diana mediante una enzima ADN polimerasa. Los pares de cebadores se pueden utilizar para la amplificacion de una secuencia de acido nucleico, por ejemplo mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) u otros metodos de amplificacion de acido nucleico conocidos en la tecnica. Un experto en la tecnica apreciara que la especificidad de una sonda o de un cebador particular se incrementa a medida que crece su longitud. Asf, por ejemplo, un cebador de 20 nucleotidos consecutivos se emparejara con una diana con una mayor especificidad que un cebador correspondiente de solo 15 nucleotidos. Asi, a fin de lograr una mayor especificidad, se pueden seleccionar sondas y cebadores que comprendan como mfnimo 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas nucleotidos consecutivos.
Promotor: un promotor es una serie de secuencias de control de acido nucleico que dirige la transcripcion de un acido nucleico. Un promotor incluye las secuencias de acido nucleico necesarias cerca del lugar de inicio de la transcripcion, tal como un elemento TATA en el caso de un promotor de polimerasa tipo II. Un promotor tambien puede incluir opcionalmente elementos potenciadores o supresores distales que se pueden localizar tan lejos como varios miles de pares de bases del lugar de inicio de la transcripcion. Se incluyen promotores tanto constitutivos como inducibles (vease por ejemplo Bitter et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987).
Ejemplos especfficos no limitativos de promotores incluyen promotores derivados del genoma de celulas de mamffero (por ej. el promotor de la metalotionefna) o de virus de mamffero (por ej. la repeticion terminal larga de retrovirus, el promotor tardfo de adenovirus, el promotor del virus vaccinia 7.5K). Tambien se pueden utilizar promotores producidos mediante ADN recombinante o tecnicas sinteticas. Un polinucleotido puede insertarse en un vector de expresion que contiene una secuencia promotora que favorece la transcripcion eficiente de la secuencia genetica insertada del hospedador. Tfpicamente, el vector de expresion contiene un origen de replicacion, un promotor, asi como secuencias de acido nucleico especfficas que posibilitan la seleccion fenotfpica de las celulas transformadas.
Purificado: el termino «purificado» no requiere pureza absoluta, sino que debe entenderse como termino relativo. Asi, por ejemplo, un acido nucleico purificado es aquel en el que el acido nucleico esta mas enriquecido de lo que el acido nucleico lo esta en su entorno natural dentro de una celula. De forma similar, una preparacion peptfdica purificada es aquella en la que el peptido o la protefna esta mas enriquecido de lo que el peptido o la protefna lo esta en su entorno natural dentro de una celula. Purificacion sustancial denota la purificacion respecto de otras protefnas o componentes celulares. En una realizacion, se purifica (o afsla) una preparacion de tal manera que la protefna o el peptido represente como mfnimo el 50 % (por ejemplo, pero sin caracter limitativo, el 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %) del contenido total de peptido o de protefna de la preparacion. Los polipeptidos de endoplasmina aquf divulgados pueden ser purificados (y/o sintetizados) mediante cualquiera de los metodos conocidos en la tecnica (vease p. ej., Guide to Protein Purification, ed. Deutscher, Melh. Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, 1990; y Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, Nueva York, 1982).
Recombinante: un acido nucleico recombinante es aquel que tiene una secuencia que no se produce de forma natural o tiene una secuencia formada mediante una combinacion artificial de dos segmentos de
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secuencia normalmente separados. Esta combinacion artificial se logra a menudo por sfntesis qufmica o, mas habitualmente, por la manipulacion artificial de segmentos aislados de acidos nucleicos, por ejemplo, con tecnicas de ingenierfa genetica.
Toxinas recombinantes: protefnas quimericas en las que una fraccion de direccionamiento a la celula esta fusionada con una toxina (Pastan etal., Science, 254:1173-1177, 1991). Si la fraccion de direccionamiento a la celula es la porcion Fv de un anticuerpo, la molecula se denomina inmunotoxina recombinante (Chaudhary et al., Nature, 339:394-397, 1989). La fraccion de toxina esta alterada geneticamente de modo que no pueda unirse al receptor de toxinas presente en la mayorfa de celulas normales. Las inmunotoxinas recombinantes matan selectivamente celulas que son reconocidas por el dominio de union al antfgeno. Estas toxinas e inmunotoxinas recombinantes pueden utilizarse para tratar el cancer, por ejemplo, un cancer en el que se expresa endoplasmina.
Hibridar selectivamente: hibridacion en condiciones moderada o altamente restrictivas, que excluye las secuencias de nucleotidos no relacionadas.
En las reacciones de hibridacion de acido nucleico, las condiciones aplicadas para alcanzar un nivel de restriccion concreto variaran dependiendo de la naturaleza de los acidos nucleicos hibridados. Por ejemplo, la longitud, el grado de complementariedad, la composicion de la secuencia de nucleotidos (p. ej., contenido GC frente a contenido AT) y el tipo de acido nucleico (p. ej., ARN frente a ADN) de las regiones hibridantes de los acidos nucleicos pueden considerarse al seleccionar las condiciones de hibridacion. Una consideracion adicional es si uno de los acidos nucleicos esta inmovilizado, por ejemplo, en un filtro.
Un ejemplo especffico no limitativo de condiciones restrictivas progresivamente mas estrictas es el siguiente: 2 x sSc/0,1 % SDS a aproximadamente temperatura ambiente (condiciones de hibridacion); 0,2 x SSC/0,1 % SDS a aproximadamente temperatura ambiente (condiciones de baja restrictividad); 0,2 x SSC/0,1 % SDS a aproximadamente 42 °C (condiciones de restrictividad moderada) y 0,1 x SSC a aproximadamente 68 °C (condiciones de alta restrictividad). Un experto en la tecnica puede determinar facilmente variaciones de estas condiciones (p. ej., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 13, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). El lavado puede llevarse a cabo aplicando solo una de estas condiciones, p. ej., condiciones de alta restrictividad, o bien puede aplicarse cada una de las soluciones, p. ej., durante 10-15 minutos cada una, en el orden anteriormente expuesto, repitiendo uno o todos los pasos mencionados. Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, las condiciones optimas variaran dependiendo de la reaccion de hibridacion concreta implicada, y pueden determinarse empfricamente.
Identidad de secuencias: la similitud entre las secuencias de aminoacidos se expresa en terminos de la similitud entre secuencias, tambien conocida como identidad de secuencias. La identidad de secuencias se mide frecuentemente en terminos de porcentaje de identidad (o similitud u homologfa); cuanto mayor sea el porcentaje, mas similares son las dos secuencias. Los homologos o las variantes de un polipeptido de endoplasmina poseeran un grado relativamente elevado de identidad de secuencias cuando se alinean utilizando metodos estandar.
Los metodos de alineamiento de secuencias para la comparacion son bien conocidos en la tecnica.
Varios programas y algoritmos de alineamiento se describen en: Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman and Wunsch,./. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988; and Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988. Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994, presenta una consideracion detallada de los metodos de alineamiento de secuencias y calculos de homologfa.
La herramienta de alineamiento de secuencias NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al./. Mol. Biol. 215:403, 1990) esta disponible a traves de diversas fuentes, incluyendo el Centro Nacional para Informacion Biotecnologica (NCBI, Bethesda, MD) y en Internet, para usar en combinacion con los programas de analisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. En el sitio web de la NCBI en Internet hay disponible una descripcion del metodo para determinar la identidad de secuencias utilizando este programa.
Los homologos y las variantes de un polipeptido de endoplasmina se caracterizan tfpicamente por la posesion de al menos un 75 %, por ejemplo al menos un 80 %, de identidad de secuencia contada a lo largo del alineamiento de longitud completa con la secuencia de aminoacidos de la endoplasmina usando el NCBI Blast 2.0, blastp de huecos ajustado a los parametros por defecto. Para comparaciones de secuencias de aminoacidos de mas de aproximadamente 30 aminoacidos, se emplea la funcion Blast 2 secuencias usando la matriz por defecto BLOSUM62 ajustada a los parametros por defecto (la existencia de un hueco tiene una penalizacion de 11, y un hueco por residuo tiene una penalizacion de 1). Cuando se alinean peptidos cortos (menos de aproximadamente 30 aminoacidos), el alineamiento debe realizarse usando la funcion Blast 2 sequences, empleando la matriz PAM30 ajustada a los parametros por defecto (penalizaciones de apertura de hueco 9, extension de hueco 1). Protefnas con incluso mayor similitud a las secuencias de referencia mostraran porcentajes de identidad crecientes cuando se evaluan por este
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metodo, tales como al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencias. Cuando se compara menos de la secuencia completa para determinar la identidad de secuencias, los homologos y variantes tfpicamente tendran al menos un 80 % de identidad de secuencias a lo largo de ventanas cortas de 10-20 aminoacidos, y pueden tener identidades de secuencias de al menos el 85 % o al menos el 90 % o el 95 % dependiendo de su similitud con la secuencia de referencia. Los metodos para determinar la identidad de secuencias sobre dichas ventanas cortas estan disponibles en el sitio web del NCBI en Internet. Un experto en la tecnica apreciara que estos intervalos de identidad de secuencias se proporcionan meramente a modo de gufa; es perfectamente posible que pudieran obtenerse homologos muy significativos que esten fuera de los intervalos proporcionados.
Agente de union especffico: un agente que se une sustancialmente solo a una diana definida. Por tanto, un agente de union especffica a endoplasmina es un agente que se une sustancialmente a un polipeptido de endoplasmina. En una realizacion, el agente de union especffico es un anticuerpo monoclonal o policlonal que se une especfficamente a la endoplasmina.
Carcinoma de celulas escamosas: un tipo de cancer que se origina en las celulas escamosas (celulas delgadas y planas que forman la superficie de la piel, los ojos, varios organos internos, el revestimiento de organos huecos y conductos de algunas glandulas). El carcinoma de celulas escamosas tambien se conoce como carcinoma epidermoide. Un tipo de carcinoma de celulas escamosas es el carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello (HNSCC). El carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello incluye canceres de la cavidad nasal, los senos, los labios, la boca, las glandulas salivales, la garganta y la laringe.
El HNSCC puede dividirse en los siguientes estadios:
Estadio 0: no existe evidencia de tumor.
Estadio I: el tumor tiene 2 cm o menos en su mayor dimension; no existe evidencia de afectacion de ganglio linfatico regional o metastasis distante.
Estadio II: el tumor tiene mas de 2 cm pero no mas de 4 cm; no existe evidencia de afectacion de ganglio linfatico regional o metastasis distante.
Estadio III: el tumor tiene mas de 4 cm; en algunos casos, el tumor se ha propagado a los ganglios linfaticos; no existe evidencia de metastasis distante.
Estadio IV: el tumor se ha propagado a los ganglios linfaticos; en algunos casos hay metastasis distantes.
Sujeto: organismos vertebrados multicelulares vivos, una categorfa que incluye tanto a humanos como a sujetos de veterinaria, incluyendo mamfferos tanto humanos como no humanos.
Celula T: un globulo blanco fundamental para la respuesta inmunitaria. Las celulas T incluyen, sin caracter limitativo, las celulas T CD4+ y las celulas T CD8+. Un linfocito T CD4+ es una celula inmunitaria que lleva en su superficie un marcador denominado «cumulo de diferenciacion 4» (CD4). Estas celulas, a menudo denominadas celulas T «auxiliares», ayudan a orquestar la respuesta inmunitaria, incluyendo la respuesta de los anticuerpos asf como las respuestas de celulas T asesinas. Las celulas T CD8+ llevan el marcador «cluster de diferenciacion 8» (CD8). En una realizacion, una celula T CD8 es un linfocito T citotoxico. En otra realizacion, una celula CD8 es una celula T supresora.
Cantidad terapeuticamente efectiva: una cantidad de una sustancia especffica suficiente para conseguir el efecto deseado en un sujeto tratado. Por ejemplo, puede ser la cantidad necesaria para inhibir o suprimir el crecimiento de un tumor. En una realizacion, una cantidad terapeuticamente efectiva es la cantidad necesaria para eliminar un tumor o reducir el numero o el tamano de las metastasis. Al administrarla a un sujeto, por regla general se utilizara una dosis que alcanzara concentraciones en el tejido diana (por ejemplo, en tumores) que se ha demostrado que logran un efecto in vitro deseado.
Toxina: una molecula que es citotoxica para una celula. Las toxinas incluyen abrina, ricina, exotoxina de Pseudomonas (PE), toxina de la difteria (DT), toxina botulfnica, saporina, restrictocina o gelonina, o sus toxinas modificadas. Por ejemplo, PE y DT son compuestos altamente toxicos que tfpicamente provocan la muerte por toxicidad hepatica. Sin embargo, es posible modificar PE y DT para crear una forma para el uso como inmunotoxina, eliminando el componente director nativo de la toxina (como el dominio la de PE o la cadena B de DT) y sustituyendolo por una fraccion de direccionamiento diferente, como un anticuerpo.
Transducida: Una celula transducida es una celula en la que se ha introducido una molecula de acido nucleico empleando tecnicas de biologfa molecular. Tal como se entiende en el presente, el termino «transduccion» abarca todas las tecnicas mediante las cuales se podrfa introducir una molecula de acido nucleico en una celula, incluyendo la transfeccion con vectores vfricos, la transformacion con vectores plasmfdicos y la introduccion de ADN desnudo por electroporacion, lipofeccion y aceleracion por pistola de partfculas.
Vector: una molecula de acido nucleico que, introducida en una celula hospedadora, produce una celula
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hospedadora transformada. Un vector puede incluir secuencias de acido nucleico que le permiten replicarse en una celula hospedadora, como un origen de replicacion. Un vector tambien puede incluir uno o varios genes marcadores seleccionables y otros elementos geneticos conocidos en la tecnica.
Salvo que se defina de otra forma, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados aquf tienen el mismo significado que el comunmente entendido por un experto en la tecnica a la que pertenece esta divulgacion. Las formas singulares «un/a» y «el/la» incluyen referentes plurales, a no ser que el contexto dicte claramente lo contrario. Similarmente, se entiende que la palabra «o» incluye «y», a no ser que el contexto dicte claramente lo contrario. Asimismo, debe entenderse que todos los tamanos de bases o tamanos de aminoacidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular dados para los acidos nucleicos o polipeptidos son aproximados, y se proporcionan con fines descriptivos. Si bien para la practica o la prueba de la presente divulgacion pueden utilizarse metodos y materiales similares o equivalentes a los aquf descritos, a continuacion se describen metodos y materiales adecuados. El termino «comprende» significa «incluye». En caso de conflicto, prevalecera la presente especificacion, incluyendo las explicaciones de terminos. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos tienen caracter unicamente ilustrativo y no pretenden ser limitativos.
III.Anticuerpos monoclonales humanos que se unen especfficamente a la endoplasmina
Se han producido anticuerpos que se unen especfficamente a la endoplasmina (Grp94), incluyendo anticuerpos monoclonales tales como anticuerpos monoclonales totalmente humanos. Estos anticuerpos y/o sus fragmentos de union al antfgeno pueden utilizarse para aislar la endoplasmina, y pueden utilizarse para detectar y/o tratar tumores que expresan endoplasmina, como por ejemplo, pero sin limitacion, melanoma, cancer de mama, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer renal, cancer de pulmon, glioma, cancer de vejiga o cancer de pancreas. Estos anticuerpos pueden conjugarse con etiquetas detectables o moleculas efectoras.
En una realizacion, los anticuerpos se unen especfficamente a la endoplasmina glicosilada.
Asf pues, en esta realizacion, los anticuerpos no se unen especfficamente a la endoplasmina no glicosilada ni a antfgenos no relacionados.
En la presente invencion se divulgan anticuerpos monoclonales humanos aislados y fragmentos de union al antfgeno de dichos anticuerpos que se unen especfficamente a la endoplasmina. En un ejemplo, la endoplasmina humana tiene una secuencia de aminoacidos definida como:
MRALWVEGLCCVLLTFGSVRADDEVDVDGTVEEDLGKSREGSRTDDEVVQ
REEEAIQLDGLNASQIRELREKSEKFAFQAEVNRMMKLIINSLYKNKEIFLRELISNAS
DALDKIRLISLTDENALSGNEELTVKTKCDKEKNLLHVTDTGVGMTREELVKNLGTI
AKSGTSEFLNKMTEAQEDGQSTSELIGQFGVGFYSAFLVADKVIVTSKFINNDTQHIW
ESDSNEFSVIADPRGNTLGRGTTJTLVLKEEASDYLELDTIKNLVKKYSQFINFPIYVW
SSKTETVEEPMEEEEAAKEEKEESDDEAAVEEEEEEKKPKTKKVEKTVWDWELMND
IKPIWQRPSKEVEEDEYKAFYKSFSKESDDPMAYIHFTAEGEVTFKSILFVPTSAPRGL
FDEYGSKKSDYIKLYVRRVFITDDFHDMMPKYLNFVKGVVDSDDLPLNVSRETLQQ
HKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIADDKYNDTFWKEFGTNIKLGVIEDHSNRTRLAKLL
RFQSSHHPTDITSLDQYVERMKEKQDKIYFMAGSSRKEAESSPFVERLLKKGYEVIYL
TEPVDEYCIQALPEFDGKRFQNVAKEGVKFDESEKTKESREAVEKEFEPLLNWMKD
KALKDKIEKAVVSQRLTESPCALVASQYGWSGNMERIMKAQAYQTGKDISTNYYAS
QKKTFETNPRHPLTRDMLRRIKEDEDDKTVLDLAVVLFETATLRSGYLLPDTKAYGD
RIERMLRLSLNIDPDAKVEEEPEEEPEETAEDTTEDTEQDEDEEMDVGTDEEEETAKE
STAEKDEL
SEC ID N°: 5, vease tambien el n° de registro GENBANK® NM_003299 disponible el 16 de junio de 2010. En un ejemplo, la endoplasmina esta codificada por la secuencia de aminoacidos definida como:
gtgggcggac cgcgcggctg gaggtgtgag gatccgaacc caggggtggg gggtggaggc ggctcctgcg atcgaagggg acttgagact caccggccgc acgccatgag ggccctgtgg gtgctgggcc tctgctgcgt cctgctgacc ttcgggtcgg tcagagctga cgatgaagtt gatgtggatg gtacagtaga agaggatctg ggtaaaagta gagaaggatc aaggacggat gatgaagtag tacagagaga ggaagaagct attcagttgg atggattaaa tgcatcacaa ataagagaac ttagagagaa gtcggaaaag tttgccttcc aagccgaagt taacagaatg atgaaactta tcatcaattc attgtataaa aataaagaga ttttcctgag agaactgatt tcaaatgctt ctgatgcttt agataagata aggctaatat cactgactga tgaaaatgct ctttctggaa atgaggaact aacagtcaaa attaagtgtg ataaggagaa gaacctgctg catgtcacag acaccggtgt aggaatgacc agagaagagt tggttaaaaa ccttggtacc atagccaaat ctgggacaag cgagttttta aacaaaatga ctgaagcaca ggaagatggc cagtcaactt ctgaattgat tggccagttt ggtgtcggtt tctattccgc cttccttgta gcagataagg ttattgtcac ttcaaaacac aacaacgata cccagcacat ctgggagtct gactccaatg aattttctgt aattgctgac ccaagaggaa acactctagg acggggaacg acaattaccc ttgtcttaaa agaagaagca tctgattacc ttgaattgga tacaattaaa aatctcgtca aaaaatattc acagttcata aactttccta tttatgtatg gagcagcaag actgaaactg ttgaggagcc catggaggaa gaagaagcag ccaaagaaga gaaagaagaa tctgatgatg aagctgcagt agaggaagaa gaagaagaaa agaaaccaaa gactaaaaaa gttgaaaaaa ctgtctggga ctgggaactt atgaatgata tcaaaccaat atggcagaga ccatcaaaag aagtagaaga agatgaatac aaagctttct acaaatcatt ttcaaaggaa agtgatgacc ccatggctta tattcacttt actgctgaag gggaagttac cttcaaatca attttatttg tacccacatc tgctccacgt ggtctgtttg acgaatatgg atctaaaaag agcgattaca ttaagctcta tgtgcgccgt gtattcatca cagacgactt ccatgatatg atgcctaaat acctcaattt tgtcaagggt gtggtggact cagatgatct ccccttgaat gtttcccgcg agactcttca gcaacataaa ctgcttaagg tgattaggaa gaagcttgtt cgtaaaacgc tggacatgat caagaagatt gctgatgata aatacaatga tactttttgg aaagaatttg gtaccaacat caagcttggt gtgattgaag accactcgaa tcgaacacgt cttgctaaac ttcttaggtt ccagtcttct catcatccaa ctgacattac tagcctagac cagtatgtgg aaagaatgaa ggaaaaacaa gacaaaatct acttcatggc tgggtccagc agaaaagagg ctgaatcttc tccatttgtt gagcgacttc tgaaaaaggg ctatgaagtt atttacctca cagaacctgt ggatgaatac tgtattcagg cccttcccga atttgatggg aagaggttcc agaatgttgc caaggaagga gtgaagttcg atgaaagtga gaaaactaag gagagtcgtg aagcagttga gaaagaattt gagcctctgc tgaattggat gaaagataaa gcccttaagg acaagattga aaaggctgtg gtgtctcagc gcctgacaga atctccgtgt gctttggtgg ccagccagta cggatggtct ggcaacatgg agagaatcat gaaagcacaa gcgtaccaaa cgggcaagga catctctaca aattactatg cgagtcagaa gaaaacattt gaaattaatc ccagacaccc gctgatcaga gacatgcttc gacgaattaa ggaagatgaa
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SEC ID N°: 6, vease tambien el n° de registro GENBANK® NM_003299, 16 de junio de 2010. Un experto en la tecnica puede utilizar facilmente una secuencia de acido nucleico para producir un polipeptido, por
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ejemplo endoplasmina, empleando un metodo estandar en biologfa molecular (vease, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Con los agentes terapeuticos y anticuerpos aquf descritos, un experto en la tecnica puede construir facilmente diversos clones que contienen acidos nucleicos funcionalmente equivalentes, tales como acidos nucleicos que difieren en cuanto a su secuencia pero que codifican la misma EM o secuencia de anticuerpos. Asf pues, la presente invencion divulga acidos nucleicos que codifican anticuerpos y conjugados y sus protefnas de fusion.
En la presente invencion se describen anticuerpos monoclonales humanos aislados y fragmentos de dichos anticuerpos que se unen especfficamente a endoplasmina humana, como endoplasmina glicosilada. En algunas realizaciones, el fragmento de union al antfgeno del anticuerpo monoclonal humano es un Fv monocatenario. Tambien se describen composiciones, incluyendo anticuerpos monoclonales humanos divulgados o fragmentos funcionales de dichos anticuerpos (que se unen especfficamente a endoplasmina humana) y un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Tambien se divulgan acidos nucleicos que codifican estos anticuerpos, vectores de expresion que comprenden estos acidos nucleicos, y celulas hospedadoras aisladas que expresan los acidos nucleicos.
Tambien se describen inmunoconjugados que comprenden anticuerpos monoclonales humanos o fragmentos de union al antfgeno de dichos anticuerpos que se unen especfficamente a endoplasmina humana. Los inmunoconjugados pueden comprender cualquier agente terapeutico, toxina u otra fraccion. En un ejemplo, la toxina es PE o una variante o un fragmento de esta.
Tambien se describen composiciones que comprenden inmunoconjugados. Se pueden utilizar composiciones que comprenden anticuerpos monoclonales humanos que se unen especfficamente a endoplasmina o fragmentos de union al antfgeno de dichos anticuerpos para fines de cribado, investigacion, deteccion y terapeuticos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos o fragmentos de union al antfgeno de dichos anticuerpos se pueden utilizar para identificar otros anticuerpos que se unen especfficamente a la endoplasmina, por ejemplo en inmunoensayos competitivos.
Se pueden utilizar composiciones que comprenden anticuerpos monoclonales humanos que se unen especfficamente a endoplasmina o un fragmento de union al antfgeno de dichos anticuerpos para tratar a un sujeto diagnosticado con cancer, por ejemplo un cancer que presente un incremento de la expresion de endoplasmina con respecto a las celulas normales. Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse para tratar el melanoma, cancer de mama, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer renal, cancer de pulmon, glioma, cancer de vejiga, cancer de ovario o cancer de pancreas. El melanoma incluye el melanoma de extension superficial, el melanoma nodular, el melanoma lentiginoso acral y lentigo maligno (melanoma). Los carcinomas de celulas escamosas incluyen, pero sin limitarse a ellos, el carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello y canceres de pulmon de celulas escamosas.
Tambien pueden utilizarse composiciones que comprenden los anticuerpos contra endoplasmina para prevenir metastasis o reducir el numero de micrometastasis, tales como micrometastasis a ganglios linfaticos regionales. Tambien pueden utilizarse inmunoconjugados que comprenden anticuerpos contra endoplasmina para tratar a un paciente diagnosticado con cancer. Los anticuerpos monoclonales humanos tambien pueden utilizarse para diagnosticar cancer en un sujeto, incluyendo la deteccion de una metastasis. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos pueden ponerse en contacto con una muestra tomada del paciente, por ejemplo una muestra de suero, para detectar niveles elevados de endoplasmina. Los anticuerpos y las composiciones divulgados aquf tambien pueden utilizarse para detectar cancer en un sujeto o confirmar el diagnostico de cancer en un sujeto.
En la presente invencion se divulgan anticuerpos monoclonales totalmente humanos que se unen especfficamente a endoplasmina y fragmentos funcionales (fragmentos de union al antfgeno) de dichos anticuerpos que se unen especfficamente a endoplasmina humana. Una limitacion importante en el uso clfnico de anticuerpos monoclonales de raton es el desarrollo de una respuesta de anticuerpo antimurino humano (HAMA) en pacientes que reciben los tratamientos. La respuesta HAMA puede incluir reacciones alergicas y un aumento de la tasa de eliminacion del anticuerpo administrado del suero. Se han desarrollado varios tipos de anticuerpos monoclonales modificados para minimizar la respuesta HAMA, tratando de mantener al mismo tiempo la afinidad de union al antfgeno del anticuerpo monoclonal precursor. Un tipo de anticuerpo monoclonal modificado es una quimera humano-raton en la que una region variable de union al antfgeno murino esta acoplada a un dominio constante humano (Morrison and Schlom, Important Advances in Oncology, Rosenberg, S.A. (Ed.), 1989). Un segundo tipo de anticuerpo monoclonal modificado es el anticuerpo monoclonal injertado en la region determinante de la complementariedad (CDR) o humanizado (Winter and Harris, Immunol. Today 14:243-246, 1993). Sin embargo, los anticuerpos aquf divulgados son totalmente humanos; tanto la region marco como las CDR se derivan de secuencias humanas. Asf pues, no se induce una respuesta HAMA cuando se administran estos anticuerpos a un sujeto humano.
En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal humano o el fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo comprende como mfnimo una porcion de la region variable de la secuencia de aminoacidos de cadena pesada establecida como SEC ID N°: 1 y se une especfficamente a la endoplasmina.
Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal humano puede incluir los SDR (residuos determinantes de
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especificidad), las CDR o la region variable. En la secuencia de aminoacidos mostrada a continuacion, la region constante se muestra en negrita y las CDR estan subrayadas:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG YTF TS Y AM H W
VRQAPGQRLEWMGW I.N. A G..N G.N T KY SQKFQGRVTITR
D TS AS T A Y M ELS S LRS ED T A V Y YCAR A H F D Y W G Q G T L
VTVSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF
PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT
HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT
CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ
YNSTYRVVSVLTYLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT
CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV Met HEALHNHYT
QKSLSLSPGK
(SEC ID N°: 1)
En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal humano o el fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo comprende como mfnimo una porcion de la secuencia de aminoacidos de cadena pesada establecida como SEC ID N°: 1 y se une especfficamente a la endoplasmina. En algunos ejemplos, como mfnimo una de las CDR de cadena ligera del anticuerpo comprende una o mas de las secuencias de aminoacidos establecidas como aminoacidos 26-33 de SEC ID N°: (CDR1), aminoacidos 51-58 de SEC ID N°: 1 (CDR2) y aminoacidos 97-103 de SEC ID N°: 1 (CDR3). En ejemplos adicionales, la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoacidos establecida como aminoacidos 26-33 de SEC ID N°: (CDR1), aminoacidos 51-58 de SEC ID N°: 1 (CDR2) y aminoacidos 97-103 de SEC ID N°: 1 (CDR3).
En algunos ejemplos, la region variable de cadena pesada del anticuerpo puede incluir, o consistir en, los aminoacidos 1-113 de SEC ID N°: 1. La cadena pesada del anticuerpo puede incluir, o consistir en, SEC ID N°: 1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal humano o el fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo comprende como mfnimo una porcion de la region variable de la secuencia de aminoacidos de cadena ligera establecida como SEC ID N°: 2 y se une especfficamente a la endoplasmina.
En la secuencia de aminoacidos mostrada a continuacion, la region constante se muestra en negrita y las CDR estan subrayadas:
EIELTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS O S I S S Y L N W Y Q Q K PGKAPKLLIY A AS. SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCOOSYSTPPTFGQGTKVEIKTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEC ID N°: 2)
En algunos ejemplos, como mfnimo una de las CDR de la cadena ligera del anticuerpo comprende una o mas de las secuencias de aminoacidos establecidas como aminoacidos 27-32 de SEC ID N° 2: (CDR1), aminoacidos 50-52 de SEC ID N°: 2 (CDR2) y aminoacidos 89-97 de SEC ID N°: 2 (CDR3). En ejemplos adicionales, la cadena ligera del anticuerpo comprende los aminoacidos 27-32 de SEC ID N°: (CDR1), los aminoacidos 50-52 de SEC ID N°: 2 (CDR2) y los aminoacidos 89-97 de SEC ID N°: 2 (CDR3). La region variable de la cadena ligera del anticuerpo puede incluir, o consistir en, los aminoacidos 1-107 de SEC ID N°: 2. La cadena ligera del anticuerpo puede incluir, o consistir en, SEC ID N°: 2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal humano esta etiquetado. En algunos ejemplos, la etiqueta es una etiqueta fluorescente, enzimatica o radioactiva.
El anticuerpo monoclonal puede ser de cualquier isotipo. El anticuerpo monoclonal puede ser, por ejemplo, un anticuerpo IgA, IgM o IgG, tal como IgG1 o IgG2. La clase de un anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina puede cambiarse por otra. En un aspecto, una molecula de acido nucleico que codifica VL o VH se afsla utilizando metodos bien conocidos en la tecnica, de modo que no incluya secuencias de acido nucleico que codifican la region constante de la cadena ligera o pesada, respectivamente. Posteriormente, la molecula de acido nucleico que codifica VL o VH se une de forma
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funcional a una secuencia de acido nucleico que codifica un CL o CH de una clase diferente de molecula de inmunoglobulina. Esto puede conseguirse utilizando un vector o molecula de acido nucleico que comprende una cadena CL o CH, como se conoce en la tecnica. Por ejemplo, la clase de un anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina que originalmente era IgM puede cambiarse a una IgG. El cambio de clase puede utilizarse para convertir una subclase de IgG en otra, como por ejemplo de IgGi a IgG2.
Los anticuerpos monoclonales totalmente humanos incluyen regiones marco humanas. Las regiones marco humanas pueden incluir las regiones marco divulgadas en una o ambas de SEC ID N°: 1 o SEC ID N:° 2 (estas secuencias incluyen secuencias CDR asf como secuencias marco). Sin embargo, las regiones marco pueden proceder de otra fuente. Ejemplos adicionales de secuencias marco que pueden utilizarse incluyen las secuencias marco de aminoacidos de las cadenas pesada y ligera divulgadas en la Publicacion pCt N° WO 2006/074071 (vease, por ejemplo, SEC ID N:° 1-16).
Los fragmentos de anticuerpo estan englobados por la presente divulgacion, como Fab, F(ab')2, scFv y Fv, los cuales incluyen una region variable de cadena pesada y de cadena ligera y se unen al determinante epitopico en la endoplasmina. Estos fragmentos de anticuerpo conservan la capacidad de unirse especfficamente al antfgeno, concretamente la endoplasmina humana, y por consiguiente son fragmentos de union al antfgeno. Estos fragmentos incluyen:
1) Fab, el fragmento que contiene un fragmento de union al antfgeno monovalente de una molecula de anticuerpo, puede ser producido por la digestion del anticuerpo entero con la enzima papafna para obtener una cadena ligera intacta y una porcion de una cadena pesada;
2) Fab', el fragmento de una molecula de anticuerpo, puede obtenerse mediante tratamiento del anticuerpo entero con pepsina, seguido de reduccion, para obtener una cadena ligera intacta y una porcion de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por cada molecula de anticuerpo.
3)(Fab')2, el fragmento del anticuerpo que puede obtenerse mediante tratamiento del anticuerpo entero con la enzima pepsina sin posterior reduccion; F(ab')2 es un dfmero de dos fragmentos Fab' unidos por dos enlaces de disulfuro.
4) Fv, un fragmento creado por ingenierfa genetica que contiene la region variable de la cadena ligera y la region variable de la cadena pesada expresadas como dos cadenas, y
5) Anticuerpo monocatenario (por ejemplo, Fv monocatenario), definido como una molecula creada por ingenierfa genetica que contiene la region variable de la cadena ligera y la region variable de la cadena pesada, enlazadas por un enlazador polipeptido adecuado como molecula monocatenaria fusionada geneticamente.
6) Un dfmero de un anticuerpo monocatenario (SCFV2), definido como un dfmero de un Fv monocatenario. Este tambien se conoce como «minianticuerpo».
En la tecnica se conocen metodos para crear estos fragmentos (vease, por ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988).
En otro grupo de realizaciones, los anticuerpos son Fv monocatenarios, que tfpicamente tienen un tamano aproximado de 25 kDa y contienen un lugar completo de union al antfgeno con tres CDR por cada cadena pesada y cada cadena ligera. Para producir estos anticuerpos, la VH y la VL pueden expresarse a partir de dos estructuras de acido nucleico individuales en una celula hospedadora. Si la VH y la VL se expresan de forma no contigua, las cadenas del anticuerpo Fv estan tfpicamente unidas por interacciones no covalentes. Sin embargo, estas cadenas tienden a disociarse durante la dilucion, y por lo tanto se han desarrollado metodos para entrelazar las cadenas mediante glutaraldehfdo, disulfuros intermoleculares o un enlazador peptido. Asf, en un ejemplo, el Fv puede ser un Fv estabilizado con disulfuro (dsFv), donde la region variable de la cadena pesada y la region variable de la cadena ligera estan unidas qufmicamente por enlaces de disulfuro.
En un ejemplo adicional, los fragmentos de Fv comprenden cadenas VH y VL conectadas por un enlazador peptido. Estas protefnas de union al antfgeno monocatenarias (Fv monocatenario) se preparan construyendo un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican los dominios VH y VL conectados por un oligonucleotido. El gen estructural se inserta en un vector de expresion, que a continuacion se introduce en una celula hospedadora, como por ejemplo E. coli. Las celulas hospedadoras recombinantes sintetizan una unica cadena polipeptfdica con un peptido enlazador que enlaza los dos dominios V. En la tecnica se conocen metodos para producir FV monocatenarios (vease Whitlow et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, pagina 97, 1991; Bird et al., Science 242:423, 1988; Patente USA n° 4.946.778; Pack et al., Bio/Technology 11:1271, 1993; y Sandhu, supra).
Tambien se contemplan dfmeros de un anticuerpo monocatenario (SCFV2).
Los fragmentos de anticuerpo se pueden preparar mediante hidrolisis proteolftica del anticuerpo o mediante expresion en E. coli de ADN que codifique el fragmento. Los fragmentos de anticuerpo se pueden obtener mediante digestion por pepsina o papafna de anticuerpos enteros por metodos convencionales. Por ejemplo, se pueden producir fragmentos de anticuerpo mediante escision enzimatica de anticuerpos con pepsina para obtener un fragmento 5S representado como F(ab')2. Este fragmento puede escindirse aun mas utilizando un agente reductor de tiol, y opcionalmente un grupo de bloqueo
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para los grupos sulfhidrilos resultantes de la escision de enlaces de disulfuro, para producir fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Alternativamente, una escision enzimatica utilizando pepsina produce directamente dos fragmentos monovalentes Fab' y un fragmento Fc (vease la Patente uSa n° 4.036.945 y Patente USA n° 4.331.647 y las referencias allf incluidas; Nisonhoff et al.,Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al., Methods in Enzymology, Vol. 1, page 422, Academic Press, 1967; and Coligan et al. at secciones 2.8.1-2.8.10 y 2.10.1-2.10.4).
Tambien pueden utilizarse otros metodos para escindir anticuerpos, tales como la separacion de cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes, la escision adicional de fragmentos u otras tecnicas enzimaticas, qufmicas o geneticas, siempre y cuando los fragmentos se unan al antfgeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.
Un experto en la tecnica comprendera que pueden producirse variantes conservativas de los anticuerpos que se unan especfficamente a la endoplasmina humana. Tales variantes conservativas empleadas en fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos de dsFv o fragmentos de Fv monocatenario, conservaran los residuos de aminoacidos cruciales necesarios el plegamiento y la estabilizacion correctos entre las regiones VH y VL, y conservaran las caracterfsticas de carga de los residuos a fin de preservar el bajo pi y la baja toxicidad de las moleculas. Se pueden realizar sustituciones de aminoacidos (por ejemplo, como maximo una, como maximo dos, como maximo tres, como maximo cuatro o como maximo cinco sustituciones de aminoacidos) en las regiones VH y VL para aumentar la produccion. Los expertos en la tecnica conocen tablas de sustitucion de aminoacidos conservativos que proporcionan aminoacidos similares. Los siguientes seis grupos son ejemplos de aminoacidos que estan considerados como sustituciones conservativas entre si:
1. Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
2. Acido aspartico (D), Acido glutamico (E);
3. Asparagina (N), Glutamina (Q);
4. Arginina (R), Lisina (K);
5.Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V) y
6.Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).
IV.Uso en fracciones terapeuticas y diagnosticas
Los anticuerpos monoclonales humanos, o fragmentos funcionales de dichos anticuerpos que se unen especfficamente a la endoplasmina humana se pueden utilizar en metodos terapeuticos y diagnosticos, como el tratamiento y la deteccion de melanoma, cancer de mama, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer renal, cancer de pulmon, glioma, cancer de vejiga, cancer de ovario o cancer de pancreas. Para su uso terapeutico, los metodos pueden incluir la administracion a un sujeto de una cantidad terapeuticamente efectiva de un anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina, o de un fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo, por ejemplo para el tratamiento de melanoma, cancer de mama, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer renal, cancer de pulmon, glioma, cancer de vejiga, cancer de ovario o cancer de pancreas, como por ejemplo carcinoma pancreatico.
En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales humanos o fragmentos de union al antfgeno de dichos anticuerpos aquf descritos se pueden conjugar con un agente terapeutico. Los inmunoconjugados incluyen pero sin limitacion, moleculas en las que existe un enlace covalente de un agente terapeutico a un anticuerpo. Un agente terapeutico es un agente con una actividad biologica concreta dirigida contra una molecula diana concreta o una celula que porta una molecula diana. Un experto en la tecnica apreciara que los agentes terapeuticos pueden incluir varios farmacos, tales como vinblastina, daunomicina y similares, citotoxinas tales como exotoxina de Pseudomonas nativa o modificada o toxina de la difteria, agentes encapsuladores (como liposomas), que a su vez contienen composiciones farmacologicas, agentes radioactivos tales como 125I, 32P, 14C, 3H y 35S y otras fracciones diana y ligandos.
Las toxinas pueden utilizarse con los anticuerpos monoclonales humanos especfficos de la endoplasmina y fragmentos de union al antfgeno de dichos anticuerpos que se describen aquf, para producir inmunotoxinas. Ejemplos de toxinas incluyen ricina, abrina, toxina de la difteria y subunidades de estas, asf como las toxinas butilfnicas A hasta F. Estas toxinas estan facilmente disponibles a traves de canales comerciales (por ejemplo, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). Las toxinas contempladas incluyen tambien variantes de las toxinas aquf descritas (veanse, por ejemplo, las Patentes USA n° 5.079.163 y 4.689.401). En una realizacion, la toxina es la exotoxina de Pseudomonas (PE) (Patente USA n° 5.602.095). A efectos de la presente, «exotoxina de Pseudomonas» se refiere a una PE nativa (existente de forma natural) de longitud completa o a una PE que ha sido modificada. Tales modificaciones pueden incluir pero sin limitacion, la eliminacion del dominio la, varias deleciones de aminoacidos en los dominios lb, II y Ill, sustituciones de aminoacidos individuales y la adicion de una o mas secuencias en el terminal carboxilo (por ejemplo, vease Siegall et al., J. Biol. Chem. 264:14256-14261, 1989). En una realizacion, el fragmento citotoxico de PE conserva al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % de la citotoxicidad de la PE nativa En algunos ejemplos, el fragmento citotoxico es mas toxico que la PE nativa.
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La exotoxina de Pseudomonas nativa A (PE) es una protefna monomerica extremadamente activa (peso molecular de 66 kD) segregada por la especie bacteriana Pseudomonas aeruginosa, que inhibe la sfntesis de protefnas en celulas eucariotas. El metodo de accion de PE es la inactivacion de la ribosilacion de ADP del factor de elongacion 2 (EF-2). La exotoxina contiene tres dominios estructurales que actuan de forma concertada para provocar citotoxicidad. El dominio la media la union a la celula. El dominio II es responsable de la translocacion al citosol y el dominio II media la ribosilacion de ADP del factor de elongacion 2. La funcion del dominio lb es desconocida. La PE empleada con los anticuerpos monoclonales aquf descritos puede incluir la secuencia nativa, fragmentos citotoxicos de la secuencia nativa y variantes modificadas conservativamente de PE nativa y sus fragmentos citotoxicos. Los fragmentos citotoxicos de PE incluyen aquellos que son citotoxicos con o sin posterior procesamiento proteolftico o de otro tipo en la celula diana. Fragmentos citotoxicos de PE incluyen PE40, PE38 y PE35. Para una descripcion adicional de PE y sus variantes, veanse por ejemplo las Patentes USA n° 4.892.827; 5.512.658; 5.602.095; 5.608.039; 5.821.238; y 5.854.044; Publicacion PCT n° WO 99/51643; Pai et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:3358-3362, 1991; Kondo et al., J. Biol. Chem. 263:9470-9475, 1988; Pastan et al., Biochim. Biophys. Acta 1333:C1-C6, 1997.
Los anticuerpos y sus fragmentos de union al antfgeno aquf descritos tambien pueden utilizarse para dirigir cualquiera de diferentes compuestos diagnosticos o terapeuticos diferentes a celulas que expresan endoplasmina en su superficie. Asf pues, un anticuerpo de la presente divulgacion puede ligarse directamente o mediante un enlazador a un farmaco que se libera directamente a celulas que expresan endoplasmina en su superficie. Los agentes terapeuticos incluyen compuestos tales como acidos nucleicos, protefnas, peptidos, aminoacidos o derivados, glicoprotefnas, radioisotopos, lfpidos, carbohidratos o virus recombinantes. Los grupos funcionales terapeuticos y diagnosticos de acidos nucleicos incluyen acidos nucleicos antisentido, oligonucleotidos derivatizados para entrelazamiento covalente con ADN simple o doble y oligonucleotidos inductores de triple helice.
Alternativamente, la molecula ligada a un anticuerpo contra endoplasmina, puede ser un sistema de encapsulacion, como por ejemplo un liposoma o una micela que contiene una composicion terapeutica como un farmaco, un acido nucleico (por ejemplo, un acido nucleico antisentido) u otra fraccion terapeutica que este preferiblemente protegida contra la exposicion directa en el sistema circulatorio. Los expertos en la tecnica conocen metodos para la preparacion de liposomas ligados a anticuerpos (vease, por ejemplo, la Patente USA n° 4.957.735; Connor et al., Pharm. Ther. 28:341-365, 1985).
Los anticuerpos aquf divulgados pueden ser conjugados con un agente terapeutico adicional y/o pueden ser utilizados en combinacion con un agente de adicion, mediante administracion secuencial o simultanea. La eleccion de un agente terapeutico concreto depende de la molecula o celula diana concreta, y del efecto biologico deseado. Asf, por ejemplo, el agente terapeutico puede ser una citotoxina que se utiliza para provocar la muerte de una celula diana concreta. A la inversa, allf donde se desee inducir una respuesta biologica no letal se puede conjugar el agente terapeutico con un agente farmacologico no letal o con un liposoma que contenga un agente farmacologico no letal.
El agente terapeutico tambien puede ser una citoquina o una quimiocina. Una «citoquina» es una clase de protefnas o peptidos liberadas por una poblacion de celulas que actua sobre otras celulas como mediadores intercelulares. Las citoquinas pueden actuar como agente inmunomodulador. Ejemplos de citoquinas incluyen linfocinas, monocinas, factores de crecimiento y hormonas polipeptidas tradicionales. Asf pues, las realizaciones utilizan un interferon (p. ej., IFN-a, IFN-p, e IFN-y); miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFSF); hormona del crecimiento humana; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormona foliculoestimulante (FSH); hormona estimulante de la tiroides (TSH); hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepatico; prostaglandina, factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactogeno placentario, protefna OB; TNF-a; TNF-p; integrina; trombopoyetina (TPO); un factor de crecimiento nervioso como NGF-p; factor de crecimiento de plaquetas; TGF-a; TGF-p; factores de crecimiento similares a la insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores estimulantes de colonias (CSF) tales como CSF de macrofagos (M-CsF); CSF de granulocitos-macrofagos (GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); una interleucina (IL-1 a IL-21), ligando de kit o FLT-3, angiostatina, trombospondina o endostatina. Estas citoquinas incluyen protefnas procedentes de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biologicamente activos de las citoquinas de la secuencia nativa.
Las quimiocinas tambien pueden conjugarse con los anticuerpos aquf divulgados. Las quimiocinas son una superfamilia de citoquinas proinflamatorias pequenas (de entre aproximadamente 4 y aproximadamente 14 kDa), inducibles y segregadas que actuan primariamente como quimioatractivos y activadores de subtipos celulares especfficos de leucocitos. La produccion de quimiocina es inducida por citoquinas inflamatorias, factores de crecimiento y estfmulos patogenicos. Las protefnas de la quimiocina estan divididas en subfamilias (alfa, beta y delta) basadas en motivos de secuencia de aminoacidos conservados y estan clasificadas en cuatro grupos altamente conservados (CXC, CC, C y CX3C), basados en la posicion de las dos primeras cistefnas adyacentes al terminal amino. Hasta la fecha se han descubierto mas de 50 quimiocinas y existen por lo menos 18 receptores de quimiocina de dominio transmembrana siete (7TM) humanos. Las quimiocinas de uso incluyen, pero sin limitarse a estas, RANTES, MCAF, MCP-1 y fractalquina.
El agente terapeutico puede ser un agente quimioterapeutico. En una realizacion, el agente
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quimioterapeutico es una molecula radioactiva. Un experto en la tecnica puede identificar facilmente un agente quimioterapeutico de uso (por ejemplo, vease Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, capftulo 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14a edicion; Perry et al., Chemotherapy, cap. 17 en Abeloff, Clinical Oncology 2.° ed., © 2000 Churchill Livingstone, Inc; Baltzer L., Berkery R. (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer DS, Knobf MF, Durivage HJ (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993). Los agentes quimioterapeuticos incluyen aquellos conocidos por los expertos en la tecnica, incluyendo pero sin limitacion: 5-fluorouracilo (5-Fu), azatioprina, ciclopamina, ciclofosfamida, antimetabolitos (como fludarabina), antineoplasicos (como etoposido, doxorrubicina, metotrexato y vincristina), carboplatina, cisplatino, dacarbazina, temozolomida, inhibidores de PARP y los taxanos, tales como taxol. Tambien se ha utilizado la rapamicina como agente quimioterapeutico.
Moleculas efectoras tales como, sin caracter limitativo, radionucleotidos, citoquinas, quimiocinas y agentes quimioterapeuticos, pueden enlazarse con un anticuerpo de interes utilizando cualquier medio conocido por los expertos en la tecnica. Pueden utilizarse medios de enlace tanto covalentes como no covalentes. El procedimiento para enlazar una molecula efectora con un anticuerpo varfa en funcion de la estructura qufmica del efector. Tfpicamente, los polipeptidos contienen diversos grupos funcionales, como grupos de acido carboxflico (COOH), grupos aminos (-NH2) o sulfhidrilos (-SH) libres, que estan disponibles para la reaccion con un grupo funcional adecuado en un anticuerpo para provocar la union de la molecula efectora. Alternativamente, se derivatiza el anticuerpo para exponer o ligar grupos funcionales reactivos adicionales. La derivatizacion puede implicar el enlace de cualquier cantidad de moleculas enlazadoras, como las disponibles a traves de Pierce Chemical Company, Rockford, IL. El enlazador puede ser cualquier molecula utilizada para unir el anticuerpo a la molecula efectora. El enlazador puede formar enlaces covalentes tanto con el anticuerpo como con la molecula efectora. Los expertos en la tecnica conocen enlazadores adecuados que pueden incluir, sin limitarse a ellos, enlazadores de carbono de cadena recta o ramificada, enlazadores de carbono heterocfclicos o enlazadores peptidos. En caso de que el anticuerpo y la molecula efectora sean polipeptidos, los enlazadores pueden estar ligados a los aminoacidos constituyentes mediante sus grupos laterales (por ejemplo, mediante un enlace disulfuro a cistefna) o a los grupos aminos de carbono alfa y carboxilos de los aminoacidos terminales.
En algunas circunstancias, es deseable liberar la molecula efectora del anticuerpo cuando el inmunoconjugado ha alcanzado su punto diana. Por consiguiente, en estas circunstancias, los imnunoconjugados comprenderan enlaces escindibles en las proximidades del punto diana. La escision del enlazador para liberar la molecula efectora del anticuerpo puede inducirse mediante actividad enzimatica o condiciones a las que este sujeto el inmunoconjugado, ya sea dentro de la celula diana o en las proximidades del punto diana.
En vista del gran numero de metodos que se han descrito para ligar diversos compuestos radiodiagnosticos, compuestos radioterapeuticos, farmacos marcadores (tales como enzimas o moleculas fluorescentes), toxinas, polipeptidos y otros agentes a anticuerpos, un experto en la tecnica podra determinar un metodo adecuado para ligar un agente dado a un anticuerpo u otro polipeptido.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen especfficamente a la endoplasmina aquf divulgados pueden derivatizarse o ligarse a otras moleculas (por ejemplo, otro peptido o protefna). En general, los anticuerpos o partes de estos se derivatizan de tal manera que el enlace a la endoplasmina no se ve afectado adversamente por la derivatizacion o el etiquetado. Por ejemplo, el anticuerpo puede enlazarse funcionalmente (mediante acoplamiento qufmico, fusion genetica, asociacion no covalente u otras tecnicas) a una o mas entidades moleculares, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecffico o un diacuerpo), un agente de deteccion, un agente farmaceutico y/o una protefna o peptido que pueda mediar la asociacion del anticuerpo o de la porcion de anticuerpo a otra molecula (por ejemplo, una region central de estreptavidina o un marcador de polihistidina).
Un tipo de anticuerpo derivatizado se produce por entrelazamiento de dos o mas anticuerpos (del mismo tipo o de diferentes tipos, por ejemplo para crear anticuerpos biespecfficos). Entrelazadores especfficos incluyen aquellos que son heterobifuncionales, y que tienen dos grupos marcadamente reactivos separados por un espaciado apropiado (como ester de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifuncionales (como suberato de disuccinimidilo). Tales enlazadores estan disponibles a traves de Pierce Chemical Company, Rockford,
Ill. En la presente se divulgan metodos para la deteccion de endoplasmina, incluyendo metodos para detectar celulas que expresan endoplasmina, tales como celulas de melanoma, cancer de mama, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer renal, cancer de pulmon, glioma, cancer de vejiga, cancer de ovario o cancer de pancreas. Estos metodos pueden incluir poner en contacto una muestra de un sujeto con un anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina, o un fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo, tal como se divulga en la presente. Los metodos pueden utilizarse para detectar un tumor primario, o pueden utilizarse para detectar metastasis.
En algunas realizaciones, se divulgan metodos para detectar cancer o para confirmar el diagnostico de cancer en un sujeto. El metodo incluye poner en contacto una muestra de un sujeto con un anticuerpo aislado que se une especfficamente a la endoplasmina, o un fragmento de union al antfgeno de dicho
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anticuerpo, y detectar la union a la muestra del anticuerpo monoclonal humano aislado o del fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo. Un incremento en la union a la muestra del anticuerpo monoclonal humano aislado o del fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo en comparacion con la union del anticuerpo monoclonal humano aislado o del fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo a una muestra de control detecta cancer en el sujeto o confirma el diagnostico de cancer en el sujeto. El control puede ser una muestra procedente de un sujeto del que se sabe que no tiene cancer, o bien un valor estandar.
La muestra puede ser cualquier muestra, incluyendo sin limitacion, tejido de biopsias, autopsias y muestras de patologfa. Las muestras biologicas tambien incluyen secciones de tejidos, por ejemplo criosecciones tomadas con fines histologicos. Las muestras biologicas tambien incluyen fluidos corporales, tales como sangre, suero, plasma, esputo y lfquido cefalorraqufdeo.
En algunas realizaciones, el anticuerpo humano que se une especfficamente a la endoplasmina (el primer anticuerpo) no esta etiquetado y un segundo anticuerpo u otra molecula que puede unirse al anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina sf que esta etiquetado. Como bien conocen los expertos en la tecnica, se elige un segundo anticuerpo capaz de unirse especfficamente a la especie y la clase especfficas del primer anticuerpo. Por ejemplo, si el primer anticuerpo es una IgG humana, el anticuerpo secundario puede ser una IgG antihumana. Otras moleculas que pueden unirse a anticuerpos incluyen, sin caracter limitativo, la protefna A y la protefna G, las cuales estan disponibles comercialmente.
Un anticuerpo humano que se une especfficamente a la endoplasmina o un fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo puede ser etiquetado con una fraccion detectable. Agentes de deteccion utiles incluyen compuestos fluorescentes, incluyendo fluorescefna, isotiocianato de fluorescefna, rodamina, cloruro de 5-(dimetilamino)-nafaleno-1-sulfonilo, ficoeritrina, fosforos lantanidos y similares. Tambien se utilizan marcadores bioluminescentes, como luciferasa, protefna verde fluorescente (GFP), protefna amarilla fluorescente (YFP). Un anticuerpo tambien puede ser etiquetado con enzimas utiles para la deteccion, como peroxidasa de rabano silvestre, p- galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares. Cuando un anticuerpo esta etiquetado con una enzima detectable, puede detectarse anadiendo reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reaccion que puede ser observado. Por ejemplo, cuando esta presente el agente peroxidasa de rabano silvestre, la adicion de peroxido de hidrogeno y de diaminobencidina da lugar a un producto de reaccion coloreado que puede detectarse visualmente. Un anticuerpo tambien puede ser etiquetado con biotina y detectado mediante la medicion indirecta de la union de avidina o estreptavidina. Cabe senalar que la avidina puede, a su vez, ser etiquetada con una enzima o una etiqueta fluorescente.
Un anticuerpo puede ser etiquetado con un agente magnetico, por ejemplo gadolinio. Los anticuerpos tambien pueden ser etiquetados con lantanidos (como europio y disprosio) y manganeso. Tambien son utiles como etiquetas partfculas paramagneticas como el oxido de hierro superparamagnetico. Un anticuerpo tambien puede ser etiquetado con epftopos polipeptidos predeterminados reconocidos por un informador secundario (como secuencias de par de cremalleras de leucina, lugares de union para anticuerpos secundarios, dominios de union a metal, marcadores epitopicos). En algunas realizaciones, las etiquetas estan ligadas por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento esterico potencial.
Un anticuerpo tambien puede ser etiquetado con un aminoacido radioetiquetado. La radioetiqueta puede utilizarse para fines tanto diagnosticos como terapeuticos. Por ejemplo, la radioetiqueta puede utilizarse para detectar endoplasmina por rayos X, espectros de emision, imagen por resonancia magnetica (MRI), tomograffa computerizada (CT), tomograffa por emision de positrones (PET) u otras tecnicas diagnosticas. Ejemplos de etiquetas^ para^olipeptidos^ incluyen, pero sin Jimitarse a ellos, los siguientes radioisotopos o
radionucleotidos: 35S, "C, l3N, l5O
1311,3H,
4C, 15N, 90Y, 99Tc
111In e 125I.
Un anticuerpo tambien puede ser derivatizado con un grupo qufmico, como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo o un grupo carbohidrato. Estos grupos pueden ser utiles para mejorar las caracterfsticas biologicas del anticuerpo, como por ejemplo incrementar la semivida en suero o para aumentar la union tisular. Los anticuerpos aquf descritos tambien pueden estar unidos de forma covalente o no covalente a una etiqueta detectable. Las etiquetas detectables adecuadas para el uso incluyen cualquier composicion detectable por medios espectroscopicos, fotoqufmicos, bioqufmicos, inmunoqufmicos, electricos, opticos o qufmicos. Etiquetas utiles incluyen nanoperlas magneticas, tintes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluorescefna, Texas red, rodamina, protefna verde
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fluorescente y similares), radioetiquetas (por ejemplo, H, I, S, C, o P), enzimas (tales como peroxidasa de rabano silvestre, fosfatasa alcalina y otras utilizadas habitualmente en un ELISA) y etiquetas colorimetricas como nanoperlas de oro coloidal o cristal o plastico coloreado (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, latex y similares). Estos anticuerpos pueden utilizarse en diversos inmunoensayos, incluyendo la clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), la inmunohistoqufmica, los ensayos radioinmunologicos (RIA) y los ensayos por inmunoadsorcion ligados a enzimas (ELISA).
Medios de detectar tales etiquetas son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Asf, por ejemplo, las radioetiquetas se pueden detectar utilizando pelfcula fotografica o contadores de centelleo, y los
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marcadores fluorescentes se pueden detectar mediante un fotodetector para detectar la iluminacion emitida. Tfpicamente, las etiquetas enzimaticas se detectan proporcionando a la enzima un sustrato y detectando el producto de reaccion producido por la accion de la enzima sobre el sustrato, y las etiquetas colorimetricas se detectan por simple visualizacion de la etiqueta coloreada.
En una realizacion, se suministra un kit para detectar endoplasmina en una muestra biologica, por ejemplo una muestra de sangre. Los kits para detectar un polipeptido comprenderan tfpicamente un anticuerpo humano que se une especfficamente a la endoplasmina, como por ejemplo cualquiera de los anticuerpos aquf divulgados. En algunas realizaciones se incluye en el kit un fragmento de anticuerpo, por ejemplo un fragmento Fv. Para usos en vivo, el anticuerpo puede ser un fragmento de Fv monocatenario. En otra realizacion, el anticuerpo esta etiquetado (por ejemplo, con una etiqueta fluorescente, enzimatica o radioactiva).
En una realizacion, un kit incluye materiales instructivos que divulgan medios de uso de un anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina. Los materiales instructivos pueden ser escritos, en forma electronica (como un disquete de ordenador o disco compacto) o pueden ser visuales (como archivos de video). Los kits tambien pueden incluir componentes adicionales para facilitar la aplicacion especffica para la que esta disenado el kit.
Asf, por ejemplo, el kit puede contener adicionalmente medios para detectar una etiqueta (por ejemplo, sustratos de enzima para etiquetas enzimaticas, juegos de filtros para detectar etiquetas fluorescentes, etiquetas secundarias adecuadas como un anticuerpo secundario, o similares). Los kits pueden incluir adicionalmente tampones y otros reactivos utilizados rutinariamente para la implementacion de un metodo particular. Tales kits y los contenidos adecuados son bien conocidos por los expertos en la tecnica.
En una realizacion, el kit diagnostico comprende un inmunoensayo. Aunque los detalles de los inmunoensayos pueden variar en funcion del formato especffico empleado, el metodo para detectar endoplasmina en una muestra biologica incluye generalmente los pasos de poner la muestra biologica en contacto con un anticuerpo que reacciona especfficamente, en condiciones inmunologicamente reactivas, con la endoplasmina. Se deja que el anticuerpo se una especfficamente, en condiciones inmunologicamente reactivas, para formar un complejo inmunitario, y la presencia del complejo inmunitario (anticuerpo ligado) se detecta directa o indirectamente.
V. Polinucleotidos y polipeptidos del anticuerpo contra endoplasmina
Las moleculas de acido nucleico (tambien denominadas polinucleotidos) que codifican los polipeptidos aquf divulgados (incluyendo sin limitacion, anticuerpos, sus fragmentos de union al antfgeno, inmunoconjugados y protefnas de fusion) pueden ser producidos facilmente por un experto en la tecnica, utilizando las secuencias de aminoacidos aquf divulgadas, secuencias disponibles en la tecnica y el codigo genetico. Ademas, un experto en la tecnica puede construir facilmente diversos clones que contienen acidos nucleicos funcionalmente equivalentes, tales como acidos nucleicos que difieren en cuanto a su secuencia pero que codifican la misma molecula efectora o secuencia de anticuerpos. Asf pues, la presente invencion divulga acidos nucleicos que codifican anticuerpos, conjugados y protefnas de fusion.
En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales humanos contra endoplasmina tienen un dominio VH codificado por una secuencia de nucleotidos que comprende SEC ID N:°: 3. En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales humanos contra endoplasmina tienen un dominio VL codificado por la secuencia de nucleotidos que comprende SEC ID N:°: 4. A continuacion se presentan ejemplos de secuencias de acidos nucleicos:
secuencia W9 VH (region pesada constante hlgGI en negrita):
C AGGTGC AGCTGGTGC AGTCTGGGGCTG AGGTG AAG A AGCC TGGGGCCT CAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAGCTATGCT ATGCATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATGGGAT
GGATCAACGCTGGCAATGGTAACACAAAATATTCACAGAAGTTCCAGGG
CAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCGAGCACAGCCTACATGGAG
CTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGGG
CCC ATTTTG ACT ACTGGGGCCA AGGT ACCCTG GTC ACCGTCTCG G CT A G
CACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC
ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACT
TCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAG
CGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACT
CCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCA
GACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTG
GACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCC
ACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTC
TTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGA
GGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC
AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGA
CAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAG
CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC
AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA
CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACAC
CCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG
ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT
GGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCC
CGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCG
TGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGT
GATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCC
CTGTCTCCGGGTAAATGA
(SEC ID N°: 3)
secuencia W9 VH (region ligera constante kappa humana en negrita):
GAAATTGAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTACTTA
AATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATG
CTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGG
ATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATT
TTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTCCAACGTTCGGC
CAAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAACGGTGGCTGCACCATCTGTCTT
CATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTG
TTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAG
TGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTG
TCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCAC
CCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCC
TGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCT
TCAACAGGGGAGAGTGTTAG
5 (SEC ID N°: 4)
Secuencias de acido nucleico que codifican anticuerpos humanos que se unen especfficamente a la endoplasmina, o fragmentos de union al antfgeno de dichos anticuerpos que se unen especfficamente a la endoplasmina, pueden prepararse empleando cualquier metodo adecuado, incluyendo por ejemplo, la clonacion de las secuencias adecuadas o la sfntesis qufmica directa empleando metodos como el metodo 10 de fosfotriester de Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; el metodo de fosfodiester de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; el metodo de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862, 1981; el metodo fosforamidita triester de fase solida descrito por Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20): 1859-1862, 1981, usando un sintetizador automatizado, como el descrito en ejemplo, en Needham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res. 12:6159-6168, 1984; y el metodo de soporte solido de 15 la Patente USA n° 4.458.066. La sfntesis qufmica produce un oligonucleotido de una sola cadena. Este puede convertirse en un ADN de doble cadena mediante hibridacion con una secuencia complementaria, o mediante polimerizacion con una polimerasa de ADN que emplee la cadena unica como plantilla. Segun resultara evidente para los expertos en la tecnica, aunque la sfntesis qufmica de ADN este limitada generalmente a secuencias de aproximadamente 100 bases, pueden obtenerse secuencias mas largas 20 por la ligadura de secuencias mas cortas.
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Mediante tecnicas de clonacion se pueden preparar acidos nucleicos ejemplares que codifican anticuerpos humanos que se unen espedficamente a la endoplasmina, o fragmentos funcionales de dichos anticuerpos que se unen espedficamente a la endoplasmina. En Sambrook et al., supra, Berger and Kimmel (eds.), supra, y Ausubel, supra, hay ejemplos de tecnicas de clonacion y secuenciacion adecuadas, asf como instrucciones suficientes para guiar a aquellos versados a traves de numerosos ejercicios de clonacion. Tambien puede encontrarse informacion util en la informacion sobre el producto proporcionada por los fabricantes de reactivos biologicos y equipos de experimentacion. Tales fabricantes incluyen SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO), R&D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia Amersham (Piscataway, NJ), CLOnTeCH Laboratories, Inc. (Palo Alto, cA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, Md), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza), Invitrogen (Carlsbad, CA) y Applied Biosystems (Foster City, CA), asf como otras muchas fuentes comerciales conocidas por aquellos versados en la tecnica.
Los acidos nucleicos que codifican la molecula efectora (EM) nativa o anticuerpos contra endoplasmina pueden modificarse para formar la EM, los anticuerpos o los inmunoconjugados de la presente divulgacion. La modificacion por mutagenesis del punto dirigido es bien conocida en la tecnica. Los acidos nucleicos tambien pueden prepararse empleando metodos de amplificacion. Los metodos de amplificacion incluyen la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), la reaccion en cadena de la ligasa (LCR), el sistema de amplificacion basado en transcripcion (TAS), el sistema de replicacion de secuencias autosostenido (3SR). Aquellos versados en la tecnica conocen una gran variedad de metodos de clonacion, celulas hospedadoras y metodos de amplificacion in vitro.
En una realizacion, se preparan inmunoconjugados insertando el ADNc que codifica un anticuerpo monoclonal humano espedfico de la endoplasmina, o un fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo, en un vector que comprende el ADNc que codifica la EM. La insercion se realiza de tal manera que el anticuerpo y la EM se leen en marco, esto es, en un polipeptido continuo que contiene una region de anticuerpo funcional y una region EM funcional. En una realizacion, el ADNc que codifica una EM, etiqueta o enzima esta ligado a un anticuerpo de tal modo que la EM, etiqueta o enzima esta situada en el terminal carboxilo del anticuerpo. En otra realizacion, la EM, etiqueta o enzima esta situada en el terminal amino del anticuerpo. En otro ejemplo, el ADNc que codifica la EM, etiqueta o enzima esta ligado a una region variable de cadena pesada de un anticuerpo de tal modo que la EM, etiqueta o enzima esta situada en el terminal carboxilo de la region variable de cadena pesada. Posteriormente, la region variable de cadena pesada se puede ligar a una region variable de cadena ligera del anticuerpo usando enlaces disulfuro. En otro ejemplo, el ADNc que codifica una EM, etiqueta o enzima esta ligado a una region variable de cadena ligera de un anticuerpo, de tal modo que la EM, etiqueta o enzima esta situada en el terminal carboxilo de la region variable de cadena ligera. Posteriormente, la region variable de cadena ligera se puede ligar a una region variable de cadena pesada del anticuerpo usando enlaces de disulfuro.
Una vez que los acidos nucleicos que codifican una EM, un anticuerpo contra endoplasmina, un fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo, o un inmunoconjugado son aislados y clonados, la protema deseada puede expresarse en una celula disenada de forma recombinante, como por ejemplo bacterias, y celulas de plantas, levadura, insectos y mairnferos. Cabe esperar que los expertos en la tecnica conozcan los numerosos sistemas de expresion disponibles para la expresion de protemas, incluyendo E. coli, otros hospedadores bacterianos, levaduras y diversas celulas eucariotas superiores, como las lmeas celulares CoS, CHO, HeLa y mieloma.
Una o mas secuencias de ADN que codifican el anticuerpo o el fragmento de dicho anticuerpo pueden expresarse in vitro por transferencia de ADN a una celula hospedadora adecuada. La celula puede ser procariota o eucariota. El termino tambien incluye cualquier progenie de la celula hospedadora del sujeto. Se entiende que toda la descendencia puede no ser identica a la celula precursora ya que pueden producirse mutaciones durante la replicacion. En la tecnica se conocen metodos de transferencia estables, lo que significa que el aDn ajeno se mantiene continuamente en el hospedador. Esta divulgacion abarca tambien hibridomas que expresan los anticuerpos de interes.
La expresion de acidos nucleicos que codifican los anticuerpos aislados y los fragmentos de anticuerpo aqd descritos puede lograrse uniendo funcionalmente el ADN o ADNc a un promotor heterologo (que puede ser constitutivo o inducible), para su posterior incorporacion a un casete de expresion. Los casetes pueden ser adecuados para la replicacion y la integracion en procariotas o eucariotas. Los casetes de expresion tfpicos contienen secuencias espedficas utiles para la regulacion de la expresion del ADN que codifica la protema. Por ejemplo, los casetes de expresion pueden incluir los promotores, potenciadores, terminadores de la transcripcion y la traduccion apropiados, secuencias de iniciacion, un codon de inicio (es decir, ATG) delante del gen que codifica la protema, la senal de corte y empalme para los intrones, el mantenimiento del marco de lectura correcto de ese gen para permitir la traduccion apropiada del ARNm, y codones de parada.
Para obtener niveles de expresion elevados de un gen clonado, es deseable construir casetes de expresion que contengan, como minimo, un promotor fuerte para la transcripcion directa, un punto de union de ribosoma para la iniciacion de la traduccion y un terminador de transcripcion/traduccion. Para E. coli, esto incluye un promotor, como por ejemplo los promotores T7, trp, lac o lambda, un punto de union
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de ribosoma y preferiblemente una senal de terminacion de la transcripcion. Para celulas eucariotas, las secuencias de control pueden incluir un promotor y/o un potenciador derivado de, por ejemplo, un gen de inmunoglobulina, SV40 o citomegalovirus, y una secuencia de poliadenilacion, y ademas puede incluir secuencias donantes y aceptadoras de corte y empalme. Los casetes pueden transferirse a la celula hospedadora escogida empleando metodos bien conocidos, tales como transformacion o electroporacion para E. coli y tratamiento con fosfato de calcio, electroporacion o lipofeccion para celulas de mamffero. Las celulas transformadas por los casetes pueden seleccionarse segun la resistencia a antibioticos conferida por los genes contenidos en las casetes, como los genes amp, gpt, neo y hyg.
Cuando el hospedador es una eucariota, se pueden utilizar metodos de transfeccion de DNA tales como coprecipitados de fosfato de calcio, procedimientos mecanicos convencionales como microinyeccion, electroporacion, insercion de un plasmido encapsulado en liposomas, o vectores vfricos. Las celulas eucariotas tambien se pueden cotransformar con secuencias polinucleotfdicas que codifican el anticuerpo, el anticuerpo etiquetado o el fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo, y una segunda molecula de ADN que codifica un fenotipo seleccionable, como por ejemplo el gen de la timidina quinasa del herpes simplex. Otro metodo consiste en utilizar un vector vfrico eucariotico, como por ejemplo un virus del simio 40 (SV40) o virus del papiloma bovino, para infectar transitoriamente o transformar celulas eucariotas y expresar la protefna (vease, por ejemplo, Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). Los expertos en la tecnica podran utilizar facilmente un sistema de expresion, como por ejemplo plasmidos y vectores de uso en la produccion de protefnas en celulas, incluyendo celulas eucariotas superiores, como lfneas celulares COS, CHO, HeLa y mieloma.
Pueden realizarse modificaciones en un acido nucleico que codifica un polipeptido aquf descrito (es decir, un anticuerpo monoclonal humano especffico de la endoplasmina o un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo) sin merma de su actividad biologica. Pueden realizarse algunas modificaciones para facilitar la clonacion, la expresion o la incorporacion de la molecula de direccionamiento en una protefna de fusion. Tales modificaciones son bien conocidas por los expertos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, codones de terminacion, una metionina anadida en el terminal amino para proporcionar un punto de iniciacion, aminoacidos adicionales situados en cualquiera de los terminales para crear puntos de restriccion convenientemente ubicados, o aminoacidos adicionales (como polihistidina) para ayudar en los pasos de purificacion. Ademas de los metodos recombinantes, los inmunoconjugados, las fracciones efectoras y los anticuerpos de la presente divulgacion pueden construirse en su totalidad o en parte utilizando la sfntesis de peptidos estandar conocida en la tecnica.
Una vez expresados, los inmunoconjugados recombinantes, los anticuerpos y/o las moleculas efectoras pueden ser purificados conforme a procedimientos estandar de la tecnica, incluyendo la precipitacion de sulfato amonico, columnas de afinidad, cromatograffa en columna y similares (vease, en general, R. Scopes, PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, N.Y., 1982). No es preciso que los anticuerpos, los inmunoconjugados y las moleculas efectoras sean puros al 100 %. Una vez purificados, parcialmente o hasta la homogeneidad segun se desee, los polipeptidos deberfan estar sustancialmente libres de endotoxina si van a utilizarse terapeuticamente.
Se han descrito y son conocidos y aplicables a los anticuerpos aquf divulgados metodos para la expresion de anticuerpos monocatenarios y/o replegamiento a una forma activa adecuada, incluyendo anticuerpos monocatenarios procedentes de bacterias tales como E. coli. Vease Buchner et al., Anal. Biochem. 205:263-270, 1992; Pluckthun, Biotechnology 9:545, 1991; Huse et al., Science 246:1275, 1989 y Ward et al., Nature 341:544, 1989.
A menudo, protefnas heterologas funcionales de E. coli u otras bacterias son aisladas a partir de cuerpos de inclusion y requieren solubilizacion utilizando desnaturalizantes potentes, para su posterior replegamiento. Durante el paso de solubilizacion, como es bien conocido en la tecnica, debe estar presente un agente reductor para separar los enlaces de disulfuro. Un ejemplo de tampon con un agente reductor es: 0,1 M Tris pH 8, 6 M guanidina, 2 mM EDTA, 0,3 M DTE (ditioeritritol). Puede producirse reoxidacion de los enlaces de disulfuro en presencia de reactivos de tiol de bajo peso molecular en forma reducida y oxidada, como se describe en Saxena et al., Biochemistry 9: 5015-5021, 1970, y especialmente como describen Buchner et al., supra.
Tfpicamente, la renaturalizacion se consigue por dilucion (por ejemplo, centesimal) de la protefna desnaturalizada y reducida en tampon de replegamiento. Un ejemplo de tampon es 0,1 M Tris, pH 0,5 M L-arginina, 8 mM glutation oxidado (GSSG) y 2 mM EDTA.
Como modificacion del protocolo de purificacion del anticuerpo bicatenario, las regiones de cadenas pesada y ligera se solubilizan y reducen por separado y posteriormente se combinan en la solucion de replegamiento. Se obtiene una produccion ejemplar cuando estas dos protefnas se mezclan en una proporcion molar, de modo que no se supere un exceso molar quintuple de una protefna sobre la otra. El excedente de glutation oxidado u otros compuestos oxidantes de bajo peso molecular pueden anadirse a la solucion de replegamiento una vez completado el barajado de reduccion-oxidacion.
Ademas de los metodos recombinantes, los anticuerpos, los anticuerpos etiquetados y los fragmentos de union al antfgeno de dichos anticuerpos aquf divulgados tambien pueden construirse en su totalidad o en parte utilizando la sfntesis de peptidos estandar. La sfntesis de fase solida de los polipeptidos de menos
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de aproximadamente 50 aminoacidos de longitud puede lograrse ligando el aminoacido del terminal C de la secuencia a un soporte insoluble, seguido de la adicion secuencial de los aminoacidos remanentes en la secuencia. Tecnicas para la sfntesis de fase solida son descritas por Barany & Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A. pp. 3-284; Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156, 1963, and Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, 1984. Pueden sintetizarse protefnas de mayor longitud mediante condensacion de los terminales amino y carboxilo de fragmentos mas cortos. En la tecnica se conocen metodos para formar enlaces peptidos por activacion de un extremo terminal carboxilo (como el uso del reactivo de acoplamiento N, N'-diciclohexilcarbodiimida).
VI.Composiciones y metodos terapeuticos
En la presente se describen composiciones que incluyen un vehfculo y uno o mas de los anticuerpos que se unen especfficamente a la endoplasmina, o el fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina. Tambien se divulgan composiciones que comprenden inmunoconjugados o inmunotoxinas. Las composiciones pueden prepararse en formas de dosificacion unitarias para la administracion a un sujeto. La cantidad y el momento de administracion son a discrecion del responsable del tratamiento para lograr los propositos deseados. El anticuerpo puede ser formulado para la administracion sistemica o local (como intratumoral). En un ejemplo, el anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina esta formulado para la administracion parenteral, por ejemplo administracion intravenosa.
Las composiciones para administracion pueden incluir una solucion del anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina (o un fragmento funcional de dicho anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina) disuelto en un vehfculo farmaceuticamente aceptable, como por ejemplo un vehfculo acuoso. Se pueden utilizar diversos vehfculos acuosos, como por ejemplo un tampon salino y similares. Estas soluciones son esteriles y generalmente libres de sustancias indeseables. Estas composiciones pueden esterilizarse empleando tecnicas de esterilizacion convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables en la medida requerida para aproximarse a las condiciones fisiologicas, como agentes de ajuste de pH y de tampon, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo acetato de sorio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentracion de anticuerpo en estas formulaciones puede variar en gran medida, y se seleccionara principalmente sobre la base de volumenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares con arreglo al modo de administracion concreto seleccionado y las necesidades del sujeto.
Una composicion farmaceutica tfpica para la administracion intravenosa incluye aproximadamente 0,1 a 10 mg de anticuerpo por sujeto al dfa. Pueden utilizarse dosis desde 0,1 hasta aproximadamente 100 mg al dfa, particularmente si el agente se administra en un lugar aislado, como por ejemplo en una cavidad corporal o en el lumen de un organo, y no en el sistema circulatorio o linfatico. Metodos reales para preparar composiciones administrables seran conocidos u obvios para los expertos en la tecnica, y se describen con mayor detalle en publicaciones tales como Remington's Pharmaceutical Science, 19a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1995).
Los anticuerpos pueden suministrarse en forma liofilizada y rehidratados con agua esteril antes de la administracion, pese a que tambien se suministran en soluciones esteriles con concentracion conocida. A continuacion se anade la solucion de anticuerpos a una bolsa de infusion que contiene un 0,9 % de cloruro de sodio, USP, y se administra tfpicamente en una dosis de 0,5 a 15 mg/kg de peso corporal. En la tecnica se dispone de experiencia considerable en la administracion de farmacos con anticuerpos, que han sido comercializados en EE.UU. desde la aprobacion de Rituxan® en 1997. Los anticuerpos pueden administrarse por infusion lenta, en lugar de por presion o bolo intravenoso. En un ejemplo se administra una dosis de carga mayor, con administracion subsiguiente de dosis de mantenimiento menores. Por ejemplo, se puede administrar una dosis de 4 mg/kg por infusion durante un periodo de aproximadamente 90 minutos, seguida de dosis de mantenimiento de 2 mg/kg semanales durante 30 minutos a lo largo de 48 semanas si se tolero bien la dosis previa.
El anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina (o el fragmento de union al antfgeno o el inmunoconjugado de dicho anticuerpo) se puede administrar para ralentizar o inhibir el crecimiento de celulas, tales como celulas cancerosas. En estas aplicaciones, una cantidad terapeuticamente efectiva de un anticuerpo se administra a un sujeto en una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento, la replicacion o la metastasis de celulas cancerosas, o para inhibir un signo o sfntoma del cancer. En algunas realizaciones, los anticuerpos se administran a un sujeto para inhibir o prevenir el desarrollo de metastasis, como micrometastasis, por ejemplo micrometastasis a los ganglios linfaticos regionales (Goto et al., Clin. Cancer Res. 14(11):3401-3407, 2008).
Los sujetos indicados pueden incluir aquellos diagnosticados con un cancer que expresa endoplasmina, tales como, sin caracter limitativo, melanoma, cancer de mama, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer renal, cancer de pulmon, glioma, cancer de vejiga, cancer de ovario o cancer de pancreas. Una cantidad terapeuticamente efectiva de anticuerpo especffico de endoplasmina humana dependera de la gravedad de la enfermedad y del estado general de salud del paciente. Una cantidad
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terapeuticamente efectiva de anticuerpo es aquella que proporciona un alivio subjetivo de un sfntoma o sfntomas o una mejora objetivamente identificable constatada por el facultativo u otro observador cualificado. Estas composiciones pueden administrarse en combinacion con otro agente terapeutico, ya sea simultanea o secuencialmente.
Actualmente se conocen en la tecnica muchos agentes quimioterapeuticos. En una realizacion, el agente quimioterapeuticos se selecciona del grupo formado por inhibidores mitoticos, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibioticos intercalantes, inhibidores del factor de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de la topoisomerasa, agentes antisupervivencia, modificadores de la respuesta biologica, antihormonas, p. ej., antiandrogenos y agentes antiangiogenicos.
Pueden utilizarse agentes antiangiogenicos, como inhibidores de MMP-2 (metaloproteinasa de matriz 2), inhibidores de MMP-9 (metaloproteinasa de matriz 9) e inhibidores de COX-II (ciclooxigenasa II) en combinacion con un compuesto de la invencion. Ejemplos de inhibidores COX-II utiles incluyen CELEBREX™(alecoxib), valdecoxib y rofecoxib. Ejemplos de inhibidores de metaloproteinasa de matriz utiles se describen en la Publicacion PcT n° WO 96/33172 (publicada el 24 oct. 1996), Publicacion PCT n° WO 96/27583 (publicada el 7 mar. 1996), Solicitud de Patente Europea n° 97304971.1 (presentada el 8 jul. 1997), Solicitud de Patente Europea n° 99308617.2 (presentada el 29 oct. 1999), Publicacion PCT n° WO 98/07697 (publicada el 30 feb. 1998), Publicacion PCT n° WO 98/03516 (publicada el 29 en. 1998), Publicacion PCT n° WO 98/34918 (publicada el 13 ag. 1998), Publicacion PCT n° WO 98/34915 (publicada el 13 ag. 1998), Publicacion PCT n° WO 98/33768 (publicada el 6 ag. 1998), Publicacion PCT n° WO 98/30566 (publicada el 16 jul. 1998), Publicacion de Patente Europea n° 606.046 (publicada el 13 jul. 1994), Publicacion de Patente Europea n° 931.788 (publicada el 28 jul. 1999), Publicacion PCT n° WO 90/05719 (publicada el 31 may. 1990), Publicacion PCT n° WO 99/52910 (publicada el 21 oct. 1999), Publicacion PCT n° WO 99/52889 (publicada el 21 oct. 1999), Publicacion PCT n° WO 99/29667 (publicada el 17 jun. 1999), Solicitud Internacional PCT n° PCT/IB98/01113 (presentada el 21 jul. 1998), Solicitud de Patente Europea n° 99302232.1 (presentada el 25 mar. 1999), Patente USA n° 5.863.949 (emitida el 26 de enero, 1999), Patente USA n° 5.861.510 (emitida el 19 en. 1999) y Publicacion de Patente Europea n° 780.386 (publicada el 25 jun. 1997). En un ejemplo, los inhibidores de MMP no inducen artralgia al ser administrados. En otro ejemplo, el inhibidor de mMp inhibe selectivamente MMP-2 y/o MMP-9 con respecto a las demas metaloproteinasas de matriz (tales como MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 y mMp-13). Algunos ejemplos especfficos de inhibidores de MMP de uso son AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830, acido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)- bencenosulfonilo]-(1-hidroxicarbamoil-ciclopentil)-amino]-propionico; hidroxiamida de acido 3-exo-3-[4-(4- fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-8-oxa-biciclo[3.2.1]octano-3-carboxflico; hidroxiamida de acido (2R, 3R) 1-[4-(2-cloro-4-fluoro-benciloxi)-bencenosulfonil]-3-hidroxi-3-metil-piperidin-2-carboxflico; hidroxiamida de acido 4-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-piran-4-carboxflico; acido 3-[[4-(4-fluoro- fenoxi)-bencenosulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-ciclobutil)-amino]; hidroxiamida de acido 4-[4-(4-cloro-fenoxi)- bencenosulfonilamino]-tetrahidropiran-4-carboxflico; hidroxiamida de acido (R) 3-[4-(4-cloro-fenoxi)- bencenosulfonilamino]-tetrahidropiran-3-carboxflico; hidroxiamida de acido (2R, 3R) 1-[4-(4-fluoro-2-metil- benciloxi)-bencenosulfonilo]-3-hidroxi-3-metil-piperidin-2-carboxilico; acido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)- bencenosulfonil] - (1-hidroxicarbamoil-1-metill-etil)-amino]-propionico; acido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)- bencenosulfonil]-(4-hidroxicarbamoil-tetrahidropiran-4-il)-amino]-propionico; hidroxiamida de acido 3-exo- 3-[4-(4-cloro-fenoxi)-benxenesulfonilamino]-8-oxaiciclo[3.2.1]octano-3-carboxflico; hidroxiamida de acido 3-endo-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-8-oxa-iciclo[3.2.1]octano-3-carboxflico; e hidroxiamida de acido (R) 3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-furan-3-carboxflico; y sales y solvatos farmaceuticamente aceptables de dichos compuestos.
Los anticuerpos que se unen especfficamente a la endoplasmina tambien pueden utilizarse con inhibidores de la transduccion de senales, como agentes capaces de inhibir las respuestas EGF-R (receptor del factor de crecimiento epidermico 5), tales como anticuerpos EGF-R, anticuerpos EGF y moleculas inhibidoras de EGF-R; inhibidores de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), tales como receptores de VEGF y moleculas capaces de inhibir VEGF; e inhibidores del receptor de erbB2, tales como moleculas organicas o anticuerpos que se unen al receptor de erbB2, como por ejemplo HERCEPTIN™ (Genentech, Inc.). Se describen inhibidores de EGF-R en, por ejemplo, las Publicaciones PCT n° WO 95/19970 (publicada el 27 jul. 1995), WO 98/14451 (publicada el 9 abr. 1998), WO 98/02434 (publicada el 22 en. 1998) y la Patente USA n° 5.747.498 (emitida el 5 de mayo de 1998). Los agentes inhibidores de EGFR tambien incluyen, sin caracter limitativo, los anticuerpos monoclonales C225 y anti- EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. and Merck KgaA), y los compuestos ZD- 1834, ZD-1838 y ZD- 1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomida (Pharmacia/Sugen), Cl-1033 (Warner Lambert Parke Davis), C1-1033/PD 183,805 (Warner Lambert Parke Davis), CL- 387,785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidine A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VrCtC-310 (Ventech Research), toxina de fusion EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM- 252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW- 282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) y vacuna EGF-R (York Medical/Centro de Inmunologfa
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Molecular (CIM)).
Los inhibidores de VEGF, por ejemplo SU-5416 y SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Schering) y NX-1838 (NeXstar) se pueden utilizar tambien en combinacion con un anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina. Se describen inhibidores de VEGF en, por ejemplo, la Publicacion PCT n° WO 99/24440 (publicada el 20 de mayo, 1999), la Solicitud Internacional pCt PCT/IB99/00797 (presentada el 3 de mayo, 1999), la Publicacion PCT n° WO 95/21613 (publicada el 17 ag. 1995), la Publicacion PCT n° WO 99/61422 (publicada el 2 dic., 1999), la Patente USA n° 5.834.504 (emitida el 10 nov., 1998), la Publicacion PCT n° WO 98/50356 (publicada el 12 nov., 1998), la Patente USA n° 5.883.113 (emitida el 16 mar., 1999), la Patente USA n° 5.886.020 (emitida el 23 mar., 1999), Patente USA n° 5.792.783 (emitida el 11 ag., 1998), la Publicacion PCT n° WO 99/10349 (publicada el 4 mar., 1999), la Publicacion PCT n° WO 97/32856 (publicada el 12 sep., 1997), la Publicacion PCT n° WO 97/22596 (publicada el 26 jun., 1997), la Publicacion PCT n° WO 98/54093 (publicada el 3 dic., 1998), la Publicacion PCT n° WO 98/02438 (publicada el 22 en., 1998), la Publicacion PCT n° WO 99/16755 (publicada el 8 abr., 1999), y la Publicacion PCT n° WO 98/02437 (publicada el 22 en., 1998). Otros ejemplos de algunos inhibidores de VEGF especfficos son IM862 (Cytran Inc.); anticuerpo monoclonal anti-VEGF de Genentech, Inc.; y angiozima, una ribozima sintetica de Ribozyme y Chiron. Estos y otros inhibidores de VEGF pueden utilizarse en combinacion con un anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina.
Ademas, pueden combinarse con el compuesto de la invencion inhibidores del receptor de ErbB2, tales como GW-282974 (Glaxo Wellcome pic), y los anticuerpos monoclonales AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) y 2B-1 (Chiron), por ejemplo aquellos indicados en la Publicacion PCT n° WO 98/02434 (publicada el 22 en., 1998, la Publicacion PCT n° WO 99/35146 (publicada el 15 jul., 1999), la Publicacion PCT n° WO 99/35132 (publicada el 15 jul., 1999), la Publicacion PCT n° WO 98/02437 (publicada el 22 en., 1998), la Publicacion PCT n° WO 97/13760 (publicada el 17 abr., 1997), la Publicacion PCT n° WO 95/19970 (publicada el 27 jul., 1995), la Patente USA n° 5.587.458 (emitida el 24 dic., 1996) y la Patente USA n° 5.87.305 (emitida el 2 mar., 1999). Los inhibidores del receptor de ErbB2 de uso se describen tambien en la Solicitud provisional USA n° 60/117.341, presentada el 27 en.,1999, y en la Solicitud provisional USA n° 60/117.346, presentada el 27 en., 1999.
Los anticuerpos que se unen especfficamente a la endoplasmina (o un fragmento de union al antfgeno de dichos anticuerpos) se pueden utilizar con, y/o conjugar con, una citoquina o una quimiocina, o se pueden conjugar con una citoquina o una quimiocina. Las citoquinas ejemplares incluyen, sin caracter limitativo, interferones (IFN), tales como IFN-a, IFN-p e IFN-y); miembros de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFSF); hormona de crecimiento humana; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormona foliculoestimulante (FSH); hormona estimulante de la tiroides (TSH); hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepatico; prostaglandina, factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactogeno placentario, protefna OB; factor de necrosis tumoral (TNF)-a; TNF-p; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso (NGF) tales como NGF-p; factor de crecimiento de plaquetas; factor de crecimiento transformante (TGF)-a; TGF-p; factores de crecimiento similares a la insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores estimulantes de colonias (CSF) tales como CSF de macrofagos (M-CSF); CSF de granulocitos-macrofagos (GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); interleucinas (IL-1 a IL-21), ligando de kit o FLT-3, angiostatina, trombospondina y endostatina. Las quimiocinas adecuadas incluyen, pero sin limitarse a estas, RANTES, MCAF, MCP-1 y fractalquina.
Para el tratamiento del cancer, por ejemplo melanoma, los anticuerpos aquf divulgados se pueden utilizar con tratamiento quirurgico, o con otros agentes terapeuticos, incluyendo dacarbacina (tambien conocida como DTIC), temozolomida, inhibidores de PARP o interleucina-2 (IL-2) o interferon, por ejemplo interferon (IFN), o combinaciones de dichos agentes. Para el tratamiento de un melanoma superficial, los anticuerpos se pueden utilizar en combinacion con imiquimod. Para el tratamiento del carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, los anticuerpos aquf divulgados se pueden utilizar en combinacion con cirugfa, radioterapia, quimioterapia, otros anticuerpos (tales como cetuximab y bevacizumab) o agentes terapeuticos de moleculas pequenas (tales como erlotinib).
Se administran administraciones unicas o multiples de las composiciones, dependiendo de la dosis y la frecuencia, en la medida requerida y tolerada por el paciente. En cualquier caso, para tratar al paciente de forma efectiva, la composicion deberfa aportar una cantidad suficiente de al menos uno de los anticuerpos (o fragmentos de union al antfgeno de dichos anticuerpos) aquf divulgados. La dosis se puede administrar una sola vez, pero puede aplicarse periodicamente hasta que se haya logrado un resultado terapeutico o hasta que los efectos secundarios aconsejen la interrupcion del tratamiento. En un ejemplo, se administra mediante infusion una dosis del anticuerpo durante treinta minutos en dfas alternos. En este ejemplo se pueden administrar aproximadamente de una a diez dosis, por ejemplo, se pueden administrar tres o seis dosis en dfas alternos. En otro ejemplo, se administra una infusion continua durante aproximadamente cinco a aproximadamente diez dfas. El sujeto puede ser tratado a intervalos regulares, por ejemplo mensualmente, hasta que se haya logrado un resultado terapeutico deseado. Generalmente, la dosis es suficiente para tratar o mitigar sfntomas o signos de enfermedad sin producir una toxicidad inaceptable en el paciente.
Formulaciones parenterales de liberacion controlada pueden realizarse como implantes, inyecciones oleosas o sistemas de partfculas. Para una amplia vista de conjunto de sistemas de liberacion de
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protefnas, vease Banga, A.J., Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, (1995) incorporados aquf como referencia. Los sistemas de partfculas incluyen microesferas, micropartfculas, microcapsulas, nanocapsulas, nanoesferas y nanopartfculas. Las microcapsulas contienen la protefna terapeutica, como una citotoxina o un farmaco, como nucleo central. En microesferas, el agente terapeutico esta dispersado por toda la partfcula. Las partfculas, las microesferas y las microcapsulas de tamano inferior a aproximadamente 1 pm se denominan generalmente nanopartfculas, nanoesferas y nanocapsulas, respectivamente. Los capilares tienen un diametro de aproximadamente 5 pm, de modo que tan solo las nanopartfculas se administran intravenosamente. Las micropartfculas tienen tfpicamente un diametro aproximado de 100 pm y se administran por via subcutanea o intramuscular. Vease, por ejemplo, Kreuter, J., Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, pp. 219-342 (1994); y Tice & Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 315-339, (1992).
Se pueden utilizar polfmeros para la liberacion controlada de iones de las composiciones de anticuerpos aquf divulgadas. En la tecnica se conocen varias matrices polimericas degradables y no degradables para su uso en la liberacion de farmacos controlada (Langer, Accounts Chem. Res. 26:537-542, 1993). Por ejemplo, el copolfmero de bloque, polaxamer 407, existe como un lfquido viscoso pero movil a bajas temperaturas, pero forma un gel semisolido a temperatura corporal. Ha demostrado ser un vehfculo efectivo para la formulacion y la liberacion sostenida de intercelucina-2 recombinante y ureasa (Johnston et al., Pharm. Res. 9:425-434, 1992; y Pec et al., J. Parent. Sci. Tech. 44(2):58-65, 1990). Alternativamente, se ha utilizado hidroxiapatita como microvehfculo para la liberacion controlada de protefnas (Ijntema et al., Int. J. Pharm. 112:215-224, 1994). En otro aspecto, se utilizan liposomas para la liberacion controlada, asf como para el direccionamiento del farmaco encapsulado en lfpido (Betageri et al., Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)). Se conocen numerosos sistemas adicionales para la liberacion controlada de protefnas terapeuticas (veanse Patente USA n° 5.055.303; Patente USA n° 5.188.837; Patente USA n° 4.235.871; Patente USA n° 4.501.728; Patente USA n° 4.837.028; Patente USA n° 4.957.735; Patente USA n° 5.019.369; Patente USA n° 5.055.303; Patente USA n° 5.514.670; Patente USA n° 5.413.797; Patente USA n° 5.268.164; Patente USA n° 5.004.697; Patente USA n° 4.902.505; Patente USA n° 5.506.206; Patente USA n° 5.271.961; Patente USA n° 5.254.342 y Patente USA n° 5.534.496).
Se pueden utilizar anticuerpos monoclonales totalmente humanos que se unen especfficamente a la endoplasmina, o fragmentos de union al antfgeno de dichos anticuerpos, enlazados de forma covalente a una molecula efectora, para diversos fines, incluyendo la radioinmunoterapia o la cirugfa radioinmunoguiada. Por ejemplo, puede ligarse un anticuerpo contra endoplasmina a un isotopo radioactivo y utilizarse en la inmunoterapia para tratar un tumor que expresa endoplasmina. Un anticuerpo humano contra endoplasmina ligado de forma covalente a un isotopo radioactivo puede utilizarse para localizar un tumor en la cirugfa radioinmunoguiada, a fin de posibilitar la extirpacion quirurgica del tumor. En una realizacion, se administran a un sujeto aproximadamente 10 mCi de un anticuerpo monoclonal humano contra endoplasmina radioetiquetado. En otras realizaciones, se administran a un sujeto aproximadamente 15 mCi, aproximadamente 20 mCi, aproximadamente 50 mCi, aproximadamente 75 mCi o aproximadamente 100 mCi de un anticuerpo monoclonal humano contra endoplasmina radioetiquetado. En otras realizaciones, se administran a un sujeto de aproximadamente 100 mCi a aproximadamente 100 mCi de un anticuerpo monoclonal humano contra endoplasmina radioetiquetado.
Un metodo para detectar tumores en un sujeto in vivo incluye la administracion de un anticuerpo humano que se une especfficamente a la endoplasmina, o un fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo, formando un complejo con una molecula efectora, como un isotopo radioactivo.
Una vez transcurrido un lapso de tiempo suficiente para permitir que el anticuerpo radioetiquetado administrado localice el tumor, el tumor es detectado. En un ejemplo especffico no limitativo, un complejo inmunitario radioetiquetado se detecta utilizando una sonda manual de deteccion gamma. En algunas realizaciones, el tumor se detecta mediante MRI, escaneo CT o escaneo PET. Se pueden detectar tumores primarios, tumores metastatizados o celulas que expresan endoplasmina. Por ejemplo, antes de la cirugfa o el tratamiento se administra a un sujeto un anticuerpo monoclonal humano contra endoplasmina, formando un complejo con una molecula efectora, por ejemplo un isotopo radioactivo. En una realizacion especffica, el paso de deteccion se lleva a cabo antes de la cirugfa para localizar el tumor. En otra realizacion, el paso de deteccion se lleva a cabo durante la cirugfa, por ejemplo para detectar la ubicacion del tumor antes de extirparlo, como en el caso de la cirugfa radioinmunoguiada. Un anticuerpo monoclonal humano contra endoplasmina, formando un complejo con una molecula efectora, por ejemplo un isotopo radioactivo, tambien puede ser administrado a un sujeto tras la cirugfa o el tratamiento, para determinar la efectividad del tratamiento, por ejemplo confirmando la extirpacion completa del tumor, o para detectar una recurrencia del tumor. Asf pues, los anticuerpos tienen utilidad como agentes terapeuticos (por ejemplo, para la inmunoterapia contra tumores) o para practicar cirugfa radioinmunoguiada.
VI. Metodos y kits diagnosticos
En la presente se da a conocer un metodo para la deteccion de la expresion de endoplasmina in vitro. En
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un ejemplo, la expresion de endoplasmina se detecta en una muestra biologica. La muestra puede ser cualquier muestra, incluyendo aunque sin limitacion, tejido de biopsias, autopsias y muestras de patologfa. Las muestras biologicas tambien incluyen secciones de tejidos, por ejemplo criosecciones tomadas con fines histologicos. Las muestras biologicas tambien incluyen fluidos corporales, tales como sangre, suero, plasma, esputo, lfquido cefalorraqufdeo u orina.
En varias realizaciones, se divulga un metodo para detectar una neoplasia maligna, como carcinoma de celulas escamosas (por ejemplo, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello), melanoma, cancer renal, cancer de pulmon, glioma, cancer de vejiga, cancer de ovario o cancer de pancreas. Los anticuerpos que se unen especfficamente a la endoplasmina, o fragmentos de union al antfgeno de dichos anticuerpos, se pueden utilizar para detectar endoplasmina en una muestra de suero de un sujeto para detectar cancer en el sujeto, o para confirmar un diagnostico de cancer en el sujeto.
Tambien se pueden utilizar los anticuerpos para identificar el original de una lesion metastasica.
La divulgacion revela un metodo para detectar endoplasmina en una muestra biologica, donde el metodo incluye poner en contacto una muestra biologica con un anticuerpo humano que se une a la endoplasmina, o un fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo, en condiciones propicias para la formacion de un complejo inmunitario, y detectar el complejo inmunitario para detectar la endoplasmina en la muestra biologica. En un ejemplo, la deteccion de endoplasmina en la muestra indica que el sujeto padece una patologfa maligna. En otro ejemplo, la deteccion de endoplasmina en la muestra confirma el diagnostico de cancer en un sujeto. En otro ejemplo, la deteccion de endoplasmina confirma o detecta la presencia de metastasis.
En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal totalmente humano que se une especfficamente a la endoplasmina, o el fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo, se utiliza para la deteccion o el diagnostico de un tumor en un sujeto, por ejemplo para confirmar el diagnostico de un tumor en un sujeto. En otras realizaciones, el anticuerpo monoclonal totalmente humano que se une especfficamente a la endoplasmina, o el fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo, se utiliza para detectar la eficacia de una terapia. Por ejemplo, se administra un agente terapeutico a un sujeto con una neoplasia conocida que expresa endoplasmina. El metodo puede incluir poner en contacto una muestra biologica con un anticuerpo humano que se une a la endoplasmina, o un fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo, en condiciones propicias para la formacion de un complejo inmunitario, y detectar el complejo inmunitario para detectar la endoplasmina en la muestra biologica. Una disminucion de la cantidad de endoplasmina en comparacion con un control, como una muestra del sujeto antes del tratamiento o un estandar de referencia, indica que el agente terapeutico es efectivo para tratar la patologfa maligna. En algunos ejemplos, un incremento de la cantidad de endoplasmina en comparacion con el control indica que el agente terapeutico no es efectivo para tratar la patologfa maligna.
En algunas realizaciones, la deteccion puede ser in vivo. El anticuerpo monoclonal humano que se une especfficamente a la endoplasmina, o un fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo, puede ser ligado a un isotopo radioactivo para formar un complejo. Una vez transcurrido un lapso de tiempo suficiente para permitir que el anticuerpo radioetiquetado administrado localice el tumor, el tumor es detectado, por ejemplo mediante MRI, escaneo CT o escaneo PET (vease arriba).
En una realizacion, el anticuerpo humano que se une especfficamente a la endoplasmina o un fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo se etiqueta directamente con una etiqueta detectable. En otra realizacion, el anticuerpo humano que se une especfficamente a la endoplasmina o el fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo (el primer anticuerpo) no esta etiquetado y un segundo anticuerpo u otra molecula que puede unirse al anticuerpo humano que se une especfficamente a la endoplasmina esta etiquetado. Como bien conocen los expertos en la tecnica, se elige un segundo anticuerpo capaz de unirse especfficamente a la especie y la clase especfficas del primer anticuerpo. Por ejemplo, si el primer anticuerpo es una IgG humana, el anticuerpo secundario puede ser una IgG antihumana. Otras moleculas que pueden unirse a anticuerpos incluyen, sin caracter limitativo, la protefna A y la protefna G, las cuales estan disponibles comercialmente.
Mas arriba se describen etiquetas adecuadas para el anticuerpo o anticuerpo secundario, e incluyen varias enzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, agentes magneticos y materiales radioactivos. Ejemplos no limitativos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rabano silvestre, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa. Ejemplos no limitativos de complejos de grupos prosteticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina. Ejemplos no limitativos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelliferona, fluorescefna, isotiocianato de fluorescefna, rodamina, diclorotriacinilamina fluorescefna, cloruro de dansilo o ficoeritrina. Un ejemplo no limitativo de material luminiscente es el luminol; un ejemplo no limitativo de agente magnetico es el gadolinio, y ejemplos no limitativos de etiquetas radioactivas incluyen 35S, 11C, 13N, 15O, 18F, 19F, 99MTc, 131I,3H, 14C, 15N, 90Y, 99Tc, 111In e 125I.
En una realizacion alternativa, la endoplasmina puede ensayarse en una muestra biologica con un inmunoensayo competitivo utilizando estandares de endoplasmina etiquetados con una sustancia detectable y un anticuerpo humano no etiquetado que se une especfficamente a la endoplasmina. En este ensayo se combinan la muestra biologica, los estandares de endoplasmina etiquetados y el anticuerpo
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humano no etiquetado que se une especfficamente a la endoplasmina o un fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo, y se determina la cantidad de estandar de endoplasmina etiquetado unido al anticuerpo no etiquetado. La cantidad de endoplasmina en la muestra biologica es inversamente proporcional a la cantidad de estandar de endoplasmina etiquetado unido al anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina o al fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo.
Los inmunoensayos y metodos aquf divulgados pueden utilizarse para diversos fines. En una realizacion, el anticuerpo humano que se une especfficamente a la endoplasmina, o el fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo, se puede utilizar para detectar la produccion de endoplasmina en celulas en un cultivo celular. En otra realizacion, se puede utilizar el anticuerpo para detectar la cantidad de endoplasmina en una muestra biologica.
El aumento de la expresion de endoplasmina esta asociado a diversos tipos de cancer, incluyendo sin limitacion, melanoma, cancer de mama, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer renal, cancer de pulmon, glioma, cancer de vejiga, cancer de ovario o cancer de pancreas. En una realizacion, se suministra un kit para detectar endoplasmina en una muestra biologica, por ejemplo una muestra de suero o de tejido. Por ejemplo, para confirmar un diagnostico de cancer en un sujeto, se puede realizar una biopsia para obtener una muestra de tejido para su examen histologico. Alternativamente, se puede obtener una muestra de suero para detectar la presencia de protefna endoplasmina. Los kits para detectar un polipeptido comprenderan tfpicamente un anticuerpo humano que se une especfficamente a la endoplasmina, como por ejemplo cualquiera de los anticuerpos aquf divulgados. En algunas realizaciones se incluye en el kit un fragmento de anticuerpo, por ejemplo un fragmento Fv o Fv monocatenario, o un Fab. En otra realizacion, el anticuerpo esta etiquetado (por ejemplo, con una etiqueta fluorescente, enzimatica o radioactiva).
En una realizacion, un kit incluye materiales instructivos que divulgan medios de uso de un anticuerpo que se une especfficamente a la endoplasmina. Los materiales instructivos pueden ser escritos, en forma electronica (como un disquete de ordenador o disco compacto) o pueden ser visuales (como archivos de video). Los kits tambien pueden incluir componentes adicionales para facilitar la aplicacion concreta para la que esta disenado el kit. Asf, por ejemplo, el kit puede contener adicionalmente medios para detectar una etiqueta (como sustratos de enzima para etiquetas enzimaticas, juegos de filtros para detectar etiquetas fluorescentes, etiquetas secundarias adecuadas como un anticuerpo secundario, o similares). Los kits pueden incluir adicionalmente tampones y otros reactivos utilizados rutinariamente para la implementacion de un metodo especffico. Tales kits y los contenidos adecuados son conocidos por los expertos en la tecnica.
En una realizacion, el kit diagnostico comprende un inmunoensayo. Aunque los detalles de los inmunoensayos pueden variar en funcion del formato concreto empleado, el metodo para detectar endoplasmina en una muestra biologica incluye generalmente los pasos de poner la muestra biologica en contacto con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que reacciona especfficamente, en condiciones inmunologicamente reactivas, para crear un polipeptido de endoplasmina. Se deja al anticuerpo que se una especfficamente en condiciones inmunologicamente reactivas, para formar un complejo inmunitario, y la presencia del complejo inmunitario (anticuerpo ligado) se detecta directa o indirectamente.
Cuando se utiliza el anticuerpo para detectar cancer o confirmar el diagnostico de cancer en un sujeto, la informacion sobre el diagnostico puede visualizarse en un medio de expresion, por ejemplo un medio electronico o de papel. Un medio electronico puede incluir, por ejemplo, una base de datos informatica, un monitor de visualizacion o un historial medico electronico. Un medio de papel incluye, por ejemplo, un resultado de ensayo o un registro en papel registrado por un laboratorio o facultativo.
En algunas realizaciones, una vez confirmado el diagnostico del tumor (por ejemplo, el melanoma), se trata al sujeto para combatir el tumor (por ejemplo, el melanoma). Por ejemplo, el tratamiento puede incluir la extirpacion quirurgica de una lesion primaria o metastasica y/o la administracion de un regimen quimioterapeutico para el tratamiento de la enfermedad.
En la tecnica se conocen metodos para determinar la presencia o ausencia de un marcador de la superficie celular. Por ejemplo, los anticuerpos pueden conjugarse con otros compuestos, incluyendo sin limitacion, enzimas, nanoperlas magneticas, nanoperlas magneticas coloidales, haptenos, fluorocromos, compuestos metalicos, compuestos radioactivos o farmacos. Los anticuerpos tambien pueden utilizarse en inmunoensayos como, sin limitacion, ensayos radioinmunologicos (RIA), ensayos por inmunoadsorcion ligados a enzimas (ELISA) o ensayos inmunohistoqufmicos). Los anticuerpos tambien pueden utilizarse para la microscopfa de fluorescencia o la clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS). Una FACS emplea una pluralidad de canales de color, canales de deteccion de dispersion de luz de angulo bajo y obtusa y canales de impedancia, entre otros niveles de deteccion mas sofisticados, para separar o clasificar celulas (vease la Patente USA n° 5.061.620). En estos ensayos puede utilizarse cualquiera de los anticuerpos humanos que se unen especfficamente a la endoplasmina divulgados en el presente documento. Asf pues, los anticuerpos pueden utilizarse en un inmunoensayos convencional, incluyendo sin limitacion, un ELISA, un RIA, FACS, inmunohistoqufmica tisular, Western blot o inmunoprecipitacion.
Salvo que se defina de otra forma, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados aquf tienen el mismo significado que el comunmente entendido por un experto en la tecnica a la que pertenece esta
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divulgacion. Las formas singulares «un/a» y «el/la» incluyen referentes plurales, a no ser que el contexto dicte claramente lo contrario. Similarmente, se entiende que la palabra «o» incluye «y», a no ser que el contexto dicte claramente lo contrario. Asimismo, debe entenderse que todos los tamanos de bases o tamanos de aminoacidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular dados para los acidos nucleicos o polipeptidos son aproximados, y se proporcionan con fines descriptivos. Si bien para la practica o la prueba de la presente divulgacion pueden utilizarse metodos y materiales similares o equivalentes a los aquf descritos, a continuacion se describen metodos y materiales adecuados. El termino «comprende» significa «incluye». En caso de conflicto, prevalecera la presente especificacion, incluyendo las explicaciones de terminos. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos tienen caracter unicamente ilustrativo y no pretenden ser limitativos.
La divulgacion se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
EJEMPLOS
Pruebas clfnicas convincentes han demostrado que la inmunoterapia basada en anticuerpos puede ser efectiva en el tratamiento de neoplasias hematologicas y tumores solidos. Para eliminar la influencia de la inmunogenicidad de los antfgenos tumorales sobre la especificidad de los anticuerpos desarrollados, se utilizo una biblioteca de region variable monocatenaria (scFv) en fagos sinteticos para aislar anticuerpos humanos que reconocen moleculas de la superficie celular que presentan niveles aumentados en celulas malignas. Se aislaron anticuerpos que se unen especfficamente a la endoplasmina.
La inmunopurificacion de la biblioteca de fagos sinteticos scFv con la lfnea celular humana de melanoma WM1158 ha dado como resultado el aislamiento de un fragmento de Fv monocatenario, denominado W9, que muestra una elevada reactividad con un amplio panel de lfneas celulares humanas. El analisis SDS- PAGE del antfgeno inmunoprecipitado por el Fv monocatenario W9 a partir de lfneas celulares identifico un componente de 94-KDa. El determinante reconocido por el Fv monocatenario W9 incluye carbohidratos, puesto que su expresion se redujo significativamente en celulas incubadas con tunicamicina. El analisis basado en espectrometrfa de masas de la banda inmunoprecipitada por el Fv monocatenario W9 a partir de varias lfneas celulares identifico el componente de 94-KDa como endoplasmina, un miembro de la familia de chaperonas moleculares 90-KDa. Esta conclusion se corroboro por la reactividad del Fv monocatenario W9 con la endoplasmina (Grp94) protefna canina recombinante, que presenta una homologfa del 98,5 % en la secuencia de aminoacidos con la endoplasmina humana (Grp94). El determinante reconocido por el Fv monocatenario W9 no se expresa en celulas normales. El anticuerpo fue efectivo al inducir apoptosis e inhibio el crecimiento de las celulas cancerosas. Asf pues, los resultados aquf divulgados documentan que los anticuerpos que se unen especfficamente a la endoplasmina, tales como el Fv monocatenario W9, son utiles para la inmunoterapia de enfermedades malignas. Estos anticuerpos tambien pueden utilizarse para detectar la enfermedad maligna.
Ejemplo 1
Materiales y metodos
En los ejemplos presentados a continuacion se utilizaron los siguientes materiales y metodos:
Lfneas celulares: las lfneas celulares humanas del melanoma WM1158, MV3, COLO38, SK-MEL-28, M14 y FO-1, las lfneas celulares humanas del carcinoma de mama SUM149, MDA- MB-435s, MCF-7, T47D, la lfnea celular humana del cancer de cabeza y cuello PCI-13, las lfneas celulares humanas del cancer pancreatico Pane 2.03, Pane 3.27, Pane 10.05, la lfnea celular humana del cancer de colon 40-16, la lfnea humana celular del cancer renal SLR21, la lfnea celular humana del cancer de prostata Dul45, la lfnea celular humana del cancer de ovario OVCAR3, la lfnea celular humana del glioma U-138 , la lfnea celular humana del cancer cervical HeLa y la lfnea celular humana de celulas B linfoides LG2 fueron mantenidas en medio RPMI1640 (Cellgro, Mediatech, Washington, DC, EE.UU.) suplementado con un 10 % de suero fetal bovino (FBS: BioWhittaker, Walkersville, MD, EE.UU) y 2 mM de L-glutamina (BioWhittaker). La lfnea celular humana del cancer de vejiga T24, la lfnea celular humana del cancer de pulmon A549, la lfnea celular humana del cancer epidermoide A431, la lfnea celular humana del glioma A-172 y la lfnea celular humana 293 fueron cultivadas en medio DMEM (Lonza, Verviers, Belgica) suplementado con un 10 % de FBS. Se cultivaron las celulas a 37 °C en una atmosfera con un 5 % de CO2.
Anticuerpos monoclonales, anticuerpos Fv monocatenarios y reactivos: Ya se han descrito previamente el mAb 9E10 de raton especffico de la oncoprotefna C-myc (Evan, et al., Mol Cell Biol, 1985 Dec; 5(12):3610-6) y el mAb TP25.99 de raton especffico del antfgeno HLA-clase I (D'Urso et al., J Clin Invest. 1991 enero; 87(1): 284-292). The Fv monocatenario anti-anti-id n° 119 (Wang et al., 1997. The antiidiotypic approach to active specific immunotherapy of malignant melanoma. In idiotypes in Medicine: Autoimmunity, Infection and Cancer. Y. Shoenfeld, R. Kennedy, and S. Ferrone, eds. Elsevier, Amsterdam, p. 523) fue aislado a partir de la biblioteca de Fv monocatenarios sinteticos (n° 1) ( Nissim et al., 1994. Embo J 13:692-698) mediante inmunopurificacion con el mAb MK2-23 anti-id. Se purificaron mAb de raton a partir de lfquido ascftico mediante precipitacion secuencial con sulfato de amonio y acido caprflico (Temponi et al,. 1989, Hybridoma 8:85-95). La pureza y la actividad de las preparaciones de mAb se evaluaron mediante SDS-PAGE y mediante ensayo con el antfgeno correspondiente en un ensayo de
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union, respectivamente. Se adquirieron anticuerpos Fc IgG HRP-antirraton de Jackson ImmunoResearch (Laboratories, Inc., West Grove, PA, EE.UU.). Se adquirieron fragmented F(ab')2 etiquetados con R- ficoeritrina (RPE) de anticuerpos Ig de cabra antirraton de BD Pharmingen (San Diego, CA, EE.UU.). La endoplasmina (Grp94) protefna canina recombinante se adquirio a Stressgen Biothecnology Corporation (Victoria, British Columbia, Canada).
Bibliotecas de expresion en fago: La biblioteca semisintetica de fagos de anticuerpos humanos Fv monocatenarios (scFv) se construyo de la manera descrita por Nissim et al. 1994, Embo J 13:692-698).
Seleccion de anticuerpos Fv monocatenarios de expresion en fago: los anticuerpos Fv monocatenarios de expresion en fago que se unen a las celulas de melanoma se aislaron a partir de la biblioteca de anticuerpos Fv monocatenarios de expresion en fago, de la manera previamente descrita (Noronha et al. 1998, J Immunol 161:2968-2976). Se anadieron brevemente partfculas de fago (1x103) al tubo de cultivo de polipropileno que contenfa 1x107 celulas de melanoma WM1158. Tras 90 min de incubacion a temperatura ambiente, se eliminaron los fagos no unidos lavando las celulas seis veces con PBS.
Los fagos unidos se eluyeron anadiendo 200 pl de 0,1 M glicina-HCl (pH= 2,2). Tras cuatro ciclos de inmunopurificacion, los clones aislados se adsorbieron con celulas linfoides humanas cultivadas LG2 B para eliminar los fagos unidos a los antfgenos compartidos por las celulas del melanoma y linfoides humanas.
Ensayo de union: el ELISA para ensayar la reactividad del anticuerpo Fv monocatenario W9 soluble a las lfneas celulares tumorales y la endoplasmina (Grp94) protefna canina recombinante se llevo a cabo de la manera descrita (Noronha et al., 1998, J Immunol 161:2968-2976).
Los resultados se expresan como absorbancia de densidad optica (O.D.) a 450 nm.
Experimentos de inmunoprecipitacion: se lavaron celulas WM1158 (3 x 107), se peletizaron y se lisaron en 1,5 ml de tampon de lisis (50 mmol/L Tris, 4 mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl, 0,5 % NP40 con 1 mmol/L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo) que contenfa inhibidores de la proteasa. Tras 30 min de incubacion en hielo, se centrifugo el lisado celular a 13 000xg durante 30 min a 4 °C. Se recogio el sobrenadante, se preaclaro mediante incubacion con PG-sefarosa (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia), y se transfirio a un tubo que contenfa 15 pl de protefna empaquetada G sefarosa, previamente armada con 15 pg de mAb 9E10 y la preparacion periplasmica de Fv monocatenario W9, y 119 (control negativo). Tras 2 h de incubacion a 4 °C, se lavaron 4 veces las nanoperlas con PBS, dos veces con tampon altamente salino (350 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 10 mmol/L Tris, 0,1% de albumina de suero bovino, 1 % de NP40) y dos veces con tampon de lisis. Las protefnas precipitadas se eluyeron en tampon de muestra SDS, se resolvieron en un gel de SDS-poliacrilamida Tris-HCl al 12 % reductor y se tineron con azul de Coomassie.
Tratamiento con tunicamicina: se cultivaron celulas COLO38 en presencia de 0,5 pg/ml de tunicamicina (MP Biomedicals, Solon, OH, EE.UU.) durante 72 horas a 37 °C en una atmosfera con un 5 % de CO2. Se utilizaron como control celulas incubadas en medio con tan solo DMSO.
Transfeccion: se transfectaron celulas 293 con 3 pg de clon de ADNc Grp 94 HSP90B1 (Origene) utilizando la tecnologfa de nucleofeccion Amaxa y siguiendo las instrucciones del fabricante (Amaxa, Cologne, Alemania). Se utilizo el programa nucleofector Q-001. Tras la transfeccion, se suspendieron inmediatamente celulas en 500 pl de medio de cultivo DMEM precalentado suplementado con un 10 % de FBS y se sembraron durante 24 horas en placas de 6 pocillos en un incubador humidificado a 37 °C, 5 % CO2. La eficiencia de la transfeccion se determino mediante analisis citometrico de flujo de GFP. Se utilizo como control el vector pCMV6-XL4. La transfeccion con lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) se llevo a cabo conforme a las instrucciones del fabricante. La transfeccion de celulas con endoplasmina (Grp94) siRNA y el control siRNA (conjugado de fluorescefna)-A (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, eE.UU.) se llevo a cabo conforme a las instrucciones del fabricante.
Tambien se utilizaron los siguientes materiales y metodos (veanse los ejemplos 5 y 9): Lfneas celulares, lisados celulares y tejidos. Las lfneas celulares humanas del melanoma M21, MV3 y SK-MEL-5, las lfneas celulares humanas del adenocarcinoma pancreatico MiaPaCa-2 y PANC1, la lfnea celular humana del glioma U1338MG, las lfneas celulares humanas del carcinoma de mama SUM149 y MDA-MB-231, la lfnea celular humana del mesotelioma Phi, la lfnea celular humana del cancer de colon RKO, la lfnea celular humana del cancer de ovario OVCAR3, la lfnea celular humana del sarcoma HT1080, la lfnea celular humana de celulas B linfoides RAJI y la lfnea celular de raton de mieloma NSO fueron mantenidas en medio RPMI1640 suplementado con 2 mM de L-glutamina (Cellgro).un 10 % de suero fetal bovino (FBS) (PAA Laboratories Inc). Se cultivaron las celulas a 37 °C en una atmosfera con un 5 % de C02. Se prepararon los lisados celulares de la forma descrita (Desai et al.. Cancer Res 1998;58(11):2417-25).
Animales. Se obtuvieron ratones C.B-17 SCID (8-10 semanas de edad) de Taconic Farms, Inc.
Anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos Fv monocatenarios y reactivos. El mAb TP25.99 de raton especffico del antfgeno HLA-clase I TP25.99 (Desai et al., J Immunol 2000; 165(6):3275-83) y el mAb TO-5 especffico de calnexina (usado como control de carga) se desarrollaron y caracterizaron de la manera descrita (Ogino et al., Tissue Antigens 62:385-393, 2003).
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Las inmunoglobulinas humanas purificadas se adquirieron a Sigma-Aldrich. Anticuerpos especfficos de FAK y FAK fosforilada (Tyr397) y de ERK1/2 y 44/42 ERK1/2 fosforilada, AKT y 473 AKT fosforilada, MET, MET fosforilada, PKC, p-catenina, Ras, B-Raf, C-Raf, caspasa-3 escindida, caspasa 7 escindida SHh,GLI1 y p-actina fueron adquiridos a BD Bioscience y a Cell signaling technology. El anticuerpo de rata contra endoplasmina (Grp94) fue adquirido a StressGen. Se purificaron mAb de raton a partir de lfquido ascftico mediante precipitacion secuencial con sulfato de amonio y acido caprflico (Temponi et al, Hybridoma 1989;8(l):85-95). La pureza y la actividad de las preparaciones de mAb se evaluaron mediante SDS-PAGE y mediante ensayo con el antfgeno correspondiente en un ensayo de union, respectivamente.
Los anticuerpos HRP antirraton, anticonejo y de rata y fragmentos F(ab')2 etiquetados con RPE de anticuerpo Fcy contra IgG humana fueron adquiridos a Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Los F(ab')2 etiquetados con RPE de anticuerpos contra Ig de raton fueron adquiridos a BD Pharmingen.
Construccion de mAb W9 totalmente humano. El gen que codifica las regiones variables ligera (VL) y pesada (VH) del Fv monocatenario Fv W9 se amplificaron mediante PCR y se clonaron en pFUSE2-CLIg- hk y pFUSE-CHIg-hGl, respectivamente (InvivoGen), utilizando el DnA Ligation Kit, MlGHTY MIX® (TAKARA Bio USA) conforme a las instrucciones del fabricante.
Expresion y purificacion de mAb W9 totalmente humano. Los plasmidos de expresion pFUSE2-CLIg-hk y pFUSE-CHIg-hG1 se cotransfectaron en la lfnea celular de mieloma de raton NSO utilizando electroporacion (GENE PULSER® II Electroporation System Bio-Rad) conforme a las instrucciones del fabricante. Las celulas transfectadas se seleccionaron en medio RPMI 1640 suplementado con un 10 % de FCS , zeocina (50 pg/mL) y blasticidina S (10 pg/mL). A continuacion, las celulas resistentes a la zeocina y la blasticidina S se subclonaron monocelularmente mediante dilucion limitadora. Los sobrenadantes agotados de celulas subclonadas se cribaron mediante ELISA para determinar la expresion Fc y (Fab')2 humanos y la reactividad con los antfgenos correspondientes. El mAb W9 totalmente humano fue purificado a partir de sobrenadante de cultivo agotado o ascites de raton, utilizando columnas HITRAP® protein G HP (GE healthcare) conforme a las instrucciones del fabricante. La pureza y la actividad del mAb W9 purificado se determinaron mediante SDS-PAGE y ensayos de union de antfgenos, respectivamente.
Desglicosilacion de endoplasmina (Grp94). Se incubaron Grp94+ celulas MIAPaCa-2 (5x105) con o sin 2 pl de PNGase F, 2 pl de O-glicosidasa y 2 pl de a-2(3,6,8.9)-neuraminidasa (Enzymatic Protein Degylcosylation Kit, Sigma) en 50 pl de medio RPMI1640 durante 24 horas a 37 °C. A continuacion, las celulas tratadas se tineron con mAb W9 y se analizaron mediante citometrfa de flujo (Cyan, Beckman Coulter).
Analisis por citometrfa de flujo. Se incubaron celulas (2 x 105) durante 30 min a 4 °C con 2 pg/ml de mAb W9 (diluido en un volumen total de 100 pl de BSA-PBS al 2 %). A continuacion se lavaron dos veces las celulas con BSA-PBS al 5 % y se incubaron durante 30 min a 4 °C con una cantidad optima de fragmentos F(ab')2 de anticuerpo Fcy de cabra contra IgG humana etiquetado con RPE (Jackson ImmunoResearch, Inc). Tras tres lavados, se fijaron las celulas en formaldehfdo al 2 % y se analizaron con un citometro de flujo CYAN™ ADP LX 9 Color (Dako). Se utilizaron como control mAb TP25.99 e inmunoglobulinas humanas. Para el ensayo de union de celulas iniciadoras de cancer, previamente se tineron las celulas con ALDEFLUOR® (Stem Cell Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Inmunohistoqufmica. Se fijaron con formaldehfdo al 4 %/PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente criosecciones de una lesion de adenocarcinoma pancreatico humano extirpada quirurgicamente y tejido pancreatico normal. La tincion IHC de portaobjetos TMA con scFv-FcC21 se llevo a cabo de la manera descrita (Wang et al., Curr. Mol. Med 2010). Se capturaron imagenes de los portaobjetos de micromatriz utilizando el microscopio OLYMPUS® BX51 (OLYMPUS UK Ltd) con 200 aumentos para el examen.
Proliferacion celular y ensayos MTT. Se sembraron celulas con una densidad de 1 x 104 por pocillo en placas de 96 pocillos, y se incubaron durante 3 dfas con mAb W9 (5 pg/ml) en medio suplementado con un 1 % de FBS. Se midieron los numeros de celulas viables en diferentes momentos anadiendo 10 pl por pocillo de componente de tetrazolio bromuro de metiltiazolildifenil-tetrazolio (Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO) y se incubo la mezcla durante aproximadamente 3-4 horas a 37 °C. Las celulas viables metabolicamente activas convirtieron el MTT en un producto de formazan coloreado que se midio en un lector de microplaca espectrofotometrico (MTX Lab System, Inc, Vienna, VA) a 540 nm. Los resultados se expresaron como porcentaje de inhibicion de celulas vivas, utilizando como referencia del 100 % el numero de celulas vivas incubadas solo con PBS.
Apoptosis. Tras una incubacion de 6 horas con mAb W9 (50 pg/mL) se llevo a cabo un analisis por citometrfa de flujo de celulas MV3 y MIAPaca-2 apoptoticas y necroticas con el kit de tincion de anexina V- FTIC y yoduro de propidio (PI) (BD PharMingen), siguiendo las especificaciones del fabricante.
Western Blot. Las protefnas en lisados celulares se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sodico al 8 % (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas PVDF de 0,45 pm (tamano de poro) (Millipore). Tras bloquear con leche deshidratada sin grasa al 5 % mas BSA al 2 % durante la noche a 4 °C, se incubaron secuencialmente durante la noche las membranas con la concentracion adecuada de anticuerpos primarios a 4 °C, y los respectivos anticuerpos secundarios
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etiquetados con HRP se incubaron durante 45 min a temperature ambiente. Se visualizaron las bandas mediante el sistema de quimioluminiscencia ampliado (GE Life Science), y se leyo la densidad de las bandas mediante el sistema FOTO/Analyst® Investigator Eclipse (Fotodyne Incorporate). Como control de carga se utilizaron mAb TO-5 especfficos de la calnexina y mAb especfficos de la p-actina.
Inmunoprecipitacion. Las celulas MV3 (3x107) se lavaron, peletizaron y lisaron en 1,5 ml de tampon de lisis (50 mmol/L Tris, 4 mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl, 0,5 % Np40 con 1 mmol/L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo) que contenfa inhibidores de la proteasa. Tras 30 minutos de incubacion en hielo, se centrifugo el lisado celular a 13 000xg durante 30 min a 4 °C. Se recogio el sobrenadante, se preaclaro mediante incubacion con PG-sefarosa (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia), y se transfirio a un tubo que contenfa 10 pl de protefna empaquetada G sefarosa, previamente armada con 10 pg de mAb W9. Tras 2 horas de incubacion a 4 °C, se lavaron 4 veces las nanoperlas con PBS, dos veces con tampon altamente salino (350 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 10 mmol/L Tris, 0,1% de albumina de suero bovino, 1 % de NP40) y dos veces con tampon de lisis. Las protefnas precipitadas se eluyeron en tampon de muestra SDS, se resolvieron en un gel de SDS-poliacrilamida Tris-HCl al 12 % reductor y se transfirieron a membranas PVDF de 45 pm (tamano de poro) (Millipore). Se llevo a cabo la transferencia de la manera previamente descrita.
ADCC: Se etiquetaron celulas MV3 con 50 pCi de 51Cr (Perkin Elmer) y se resuspendieron con una densidad de 0,4 x 106 celulas/ml. Las celulas etiquetadas con 51Cr se mezclaron con mAb W9 (50, 10 y 2 pg/ml) en una placa de ensayo de cultivo celular con base en U de 96 pocillos (BD. Falcon). Se utilizaron como control inmunoglobulinas humanas. Tras 30 minutos de incubacion a 4 °C, se anadieron PBMC (40:1 efector a diana (E:T)) y se incubaron durante 4 horas a 37 °C en un incubador de CO2. Se determino la liberacion de 51Cr contando el sobrenadante libre de celulas utilizando un contador de centelleo en microplaca Packard TOPCOUNT™ (Conroe). El experimento se llevo a cabo dos veces por triplicado.
CDC. Se etiquetaron celulas diana MV3 con 50 pCi de 51Cr y se resuspendieron con una densidad de 1 x 106 celulas/ml. Se incubaron las celulas MV3 con mAb W9 (50, 10 y 2 pg/ml) en presencia de complemento de suero humano (Quidel) diluido cuatro veces en RpMI 1640, 10 mM HePeS, 0,1 % BSA. Se utilizaron como control inmunoglobulinas humanas. Tras 2 horas de incubacion a 37 °C en un incubador de CO2, se determino la liberacion de 51Cr contando el sobrenadante libre de celulas utilizando un contador de centelleo en microplaca Packard TOPCOUNT™. El experimento se llevo a cabo dos veces por triplicado.
Tratamiento de ratones portadores de metastasis en pulmon derivada de celulas de melanoma humanas. Se inyectaron intravenosamente (i.v.) ratones SCID hembra de ocho semanas de edad con las celulas de melanoma humanas MV3 (1,4 x 108 celulas/raton). Quince dfas despues de la inyeccion i.v. de celulas, se dividieron aleatoriamente los ratones en dos grupos de 13 ratones cada uno. Un grupo de ratones fue inyectado i.v. con mAb W9 (100 pg/por raton) cada 48 horas para un total de 3 inyecciones. El otro grupo de ratones fue inyectado i.v. con inmunoglobulinas humanas aplicando el mismo esquema. El dfa 25 se sacrificaron los ratones, se cosecharon los pulmones y se sometieron a FFPE. Se examinaron microscopicamente secciones de tejido pulmonar tenidas con H&E en busca de metastasis.
Analisis estadfstico. La significacion estadfstica de la diferencia entre los resultados obtenidos en los grupos sometidos a ensayo se analizo empleando la prueba t de Suden.
Las estadfsticas de supervivencia se analizaron con el software MEDCALC® (Mariakerke, Belgica). Ejemplo 2
Aislamiento de fragmentos de scFv de union a celulas de melanoma
La biblioteca de fagos sinteticos scFv (n° #1) se sometio a cuatro ciclos de inmunopurificacion con celulas WM1158. Los fagos aislados se absorbieron con celulas linfoides B humanas cultivadas LG-2 para eliminar los fagos unidos a los antfgenos compartidos por las celulas humanas. Se produjeron scFv a partir de 80 clones y se ensayaron en cuanto a su reactividad con celulas de melanoma en un ELISA celular. Entre los clones ensayados, el scFv denominado W9 reacciono intensamente con la lfnea celular WM1158. La reactividad fue especffica, puesto que no se detecto reactividad con celulas LG-2. Como control negativo se utilizo el scFv n° 119, que reconoce un antfgeno irrelevante (Figura 1).
Ejemplo 3
Reactividad de scFv W9
Al ensayarlo con ELISA con un panel de lfneas celulares humanas, el scFv W9 soluble reacciono con lfneas celulares de melanoma (MV3, COLO38, SK-MEL-28, M14, FO-1), de cancer de mama basal (SUM149, MDA-MB-435s), cancer de cabeza y cuello (PCI-13), cancer pancreatico (PANC 2.03, PANC 3.27, PANC 10.05), de vejiga (T24), de pulmon (A549), epidermoide (A431), cervical (HeLa), renal (SLR21), ovarico (OVCAR3) y glioma (U-138, A-172). El fragmento de scFv no reacciono con las lfneas celulares de cancer de mama luminal (MCF-7, T47D), la lfnea celular de cancer de colon 40-16, la lfnea celular de cancer de prostata Du 145 y la lfnea celular B linfoide LG-2 (Figura 2).
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A continuacion se presentan los resultados de un analisis inmunohistoqufmico de la inmunorreactividad de scFv W9 a tejidos normales. Los resultados estan relacionados con biopsias de al menos dos pacientes sometidos a ensayo (+Positivo).
TEJIDOS*
W9
Piel
solo glandula sudorfpara: +
Rinon
negativo
Pulmon
negativo
Hfgado
negativo
Colon-recto
negativo
Pancreas
negativo
Estomago
negativo
Tiroides
negativo
Corteza cerebral
negativo
Testfculo
negativo
Parotida
solo epitelio acinar: +
Mama
negativo
Prostata
negativo
Bazo
negativo
La tincion inmunohistoqufmica con scFv W9 revelo que la endoplasmina (Grp94) tan solo es expresada por la glandula sudorfpara y el epitelio acinar, mientras que no es expresada por diversos tejidos normales.
La tincion inmunohistoqufmica con mAb W9 revelo que el epftopo de la endoplasmina (Grp94) presenta una distribucion restringida en el tejido normal y es expresada en la lesion de adenocarcinoma pancreatico (Figura 11). El analisis inmunohistoqufmico ha revelado que el epftopo reconocido por mAb W9 presenta una distribucion restringida en tejidos normales. Ademas, el mAb W9 tino unicamente la lesion de adenocarcinoma pancreatico humano extirpada quirurgicamente, mientras que no tino el tejido pancreatico normal del mismo paciente. Ademas, los xenoinjertos derivados de las lfneas celulares MDA- MB-231 y MV3, respectivamente, presentaron una intensa tincion por mAb W9, mientras que no se detecto tincion en el MCF-7 (Figura 12).
Ejemplo 4
Analisis inmunoqufmico de la especificidad de scFv W9 e identificacion de Grp94 mediante espectrometrfa de masas en tandem
La inmunoprecipitacion de un lisado celular total obtenido de WM1158a con scFv W9 permitio identificar una unica banda a aproximadamente 100 KDa (Figura 3). Como control negativo se utilizo scFv #119. Se obtuvieron los mismos resultados utilizando lisados de lfneas celulares MV3 (melanoma), SUM149 (cancer de mama basal), T24 (cancer de vejiga) y SLR21 (cancer renal). Se escindieron las bandas especfficas de 100 KDa inmunoprecipitadas por scFv W9 a partir de los diferentes lisados celulares y se digirieron en gel con tripsina. El analisis de los peptidos trfpticos resultantes mediante cromatograffa de lfquidos-espectrometrfa de masas en tandem identifico dos peptidos trfpticos (ELISNASDALDK (SEC ID N°: 7) y GVVDSDDLPLNVSR (SEC ID N°: 8)) que se derivan exclusivamente de la endoplasmina (Grp94) (Figura 4).
El epftopo reconocido por mAb W9 depende esencialmente del residuo(s) de acido sialico, puesto que su reactividad a celulas tumorales fue suprimida tras la incubacion con neuraminidasa, pero no se vio afectada por otras glicosidasas (Figura 9). Para estos experimentos se incubaron celulas MIAPaCa-2 (5x105) de adenocarcinoma pancreatico humanas con o sin 2 pl de a-2(3,6,8.9)-neuraminidasa en 50 pl de medio RPM I1640 durante 24 horas a 37 °C en un incubador de CO2 al 5 %. A continuacion se tineron con mAb W9 las celulas tratadas y se analizaron mediante citometrfa de flujo. Se utilizaron como control
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celulas tratadas con mAb TP25.99.
Se incubaron con ALDEFLUOR® celulas de adenocarcinoma pancreatico humanas MIAPaCa-2 para detectar actividad ALDH (TEST) y se tineron con mAb W9. Se utilizaron como referencia (CONTROL) celulas incubadas con ALDEFLUOR® + inhibidor DAEB y tenidas con mAb W9. Se utilizaron como control Ig humanas (IgH). Se indica el porcentaje de celulas cancerosas, identificadas como celulas ALDHbnght.
El analisis de flujo revelo que el epftopo reconocido por mAb W9 es expresado por celulas iniciadoras de cancer, puesto que el mismo anticuerpo se unio a la poblacion de celulas ALDHbnght identificada (Figura 10).
Ejemplo 5
Efecto de la tunicamicina sobre la expresion del determinante reconocido por scFv W9 y caracterizacion adicional del epftopo
La glicosilacion desempena un papel en la expresion del epftopo reconocido por scFv W9 en endoplasmina (Grp94), puesto que este fragmento de scFv no reacciono con celulas COLO38 tratadas con tunicamicina, un inhibidor de la /V-glicosilacion de las glicoprotefnas (Figura 4). No se observo inhibicion con DMSO solo.
Ademas, no se observo inhibicion para mAb TP25.99 (control) bajo las mismas condiciones. Estos datos sugieren que los carbohidratos son esenciales para el reconocimiento de la endoplasmina (Grp94) por el scFv W9.
El epftopo reconocido por mAb W9 depende esencialmente del/los residuo/s de acido sialico, puesto que su reactividad a celulas tumorales fue suprimida tras la incubacion con neuraminidasa, pero no se vio afectada por otras glicosidasas (Figura 9).
Ejemplo 6
Reactividad de scFv W9 con endoplasmina (Grp94) protefna recombinante canina
scFv W9 reacciono especfficamente con la endoplasmina (Grp94) protefna recombinante canina (RC- Grp94) de una forma dependiente de la dosis (Figura 5A), puesto que no se detecto union con BSA (control negativo, Figura 5b). Ademas, la RC-Grp94 afecto especfficamente a la union de scFv W9 a las celulas COLO38 de una forma dependiente de la dosis. La inhibicion fue dependiente de la dosis y especffica, puesto que la p2-microglobulina (control negativo) no mostro ningun efecto inhibidor (Figura 6).
Ejemplo 7
Efecto de la electroporacion sobre la union de scFv W9
Celulas 293 electroporadas fueron transfectadas transitoriamente con ADNc completo de endoplasmina (Grp94) o unicamente con el vector (pCMV-XL4, control negativo). La eficiencia de la transfeccion (94 %) se determino mediante expresion de GFP. Las celulas recogidas 24 horas despues de la transfeccion se incubaron con Fv monocatenario W9 y mAb 9E10, seguido de incubacion con anticuerpos FITC de cabra anti IgG de raton. Se analizaron las celulas mediante citometrfa de flujo. Se utilizaron como control celulas no transfectadas. Se observo un fuerte aumento de la union del scFv W9 en celulas tratadas con endoplasmina (Grp94) (Figura 7A) y unicamente con el plasmido (Figura 7B). Estos datos sugieren que la union de scFv se incremento por electroporacion y que el choque termico regula la expresion del antfgeno reconocido por scFv W9.
Ejemplo 8
Efecto de ARNhc dirigido contra endoplasmina (Grp94) sobre la union de scFv W9
Celulas FO-1 fueron transducidas con ARNhc para reducir la expresion de endoplasmina (Grp94), o con ABCB5 ARNhc como control. Las celulas recogidas 72 horas despues de la transduccion se incubaron con Fv monocatenario W9 y mAb 9E10, seguido de incubacion con anticuerpos FITC de cabra anti IgG de raton. Se analizaron las celulas mediante citometrfa de flujo. El ARNhc Grp94 (Figura 8A) inhibio significativamente la union del Fv monocatenario W9 en comparacion con el ARNhc de control (Figura 8B).
Ejemplo 9
Efecto de mAb W9 sobre celulas cancerosas
Se evaluo el efecto de mAb W9 sobre celulas cancerosas. Especfficamente, el analisis MTT ha revelado que el mAb W9 inhibio significativamente el crecimiento de todas las lfneas celulares tumorales positivas de endoplasmina (Grp94+). Sin embargo, no se observo efecto alguno en una lfnea celular Grp94 Raji. El efecto antiproliferativo fue especffico, puesto que no se observo inhibicion del crecimiento con las inmunoglobulinas humanas utilizadas como control (Figura 13). Asf pues, mAb W9 inhibio la proliferacion de celulas cancerosas.
El analisis de flujo ha revelado que mAb W9 indujo apoptosis en celulas humanas de melanoma MV3 y de
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cancer pancreatico MIAPaCa-2 (48,90 % y 53,56 % de apoptosis, respectivamente). Ademas, los analisis Western blot revelaron un incremento significativo de la expresion de caspasa-3 escindida y de PARP escindida en celulas tratadas con mAb W9 (Figuras 14, 15 y 16). Asf pues, mAb W9 indujo apoptosis en celulas cancerosas. Sin embargo, mAb W9 no medio la lisis de celulas diana dependiente de la celula ni del complemento (Figuras 17 y 18).
Ademas, mAb W9 inhibio la proliferacion de celulas iniciadoras de adenocarcinoma pancreatico humanas MIAPaCa-2. El analisis de flujo ha revelado que en celulas tratadas con mAb W9, el porcentaje de celulas iniciadoras de cancer, definidas como celulas ALDHbnght, se redujo en un 50 % en comparacion con inmunoglobulinas humanas (control negativo) (Figura 19). Las celulas tratadas con mAb W9 presentaban un nivel reducido de Ras, C-Raf, PCKa, p-catenina y Bcl-2. Ademas, el tratamiento con mAb W9 inhibio la activacion de Akt, Erk, Mek, Fak y Met (Figuras 20-22).
En un ensayo pull-down utilizando mAb W9, se co-inmunoprecipito la endoplasmina (Grp94) con Met, Ras y C-Raf (Figura 23).
Utilizando un microscopio OLYMPUS® BX51 (OLYMPUS® UK Ltd.), se analizaron secciones tisulares tenidas con H&E para determinar el area acumulativa de los nodulos metastasicos presentes en 5 campos 200x/seccion seleccionados aleatoriamente. Se utilizo SPOT IMAGING SOFTWARE® Advanced (Diagnostic Instruments, Inc.) para medir y calcular el area promedio de tumor para cada grupo, y estos valores para el tumor MV3 se presentan en los graficos de barras ± SD. Los ratones tratados con mAbW9 presentaron una reduccion estadfsticamente significativa (aproximadamente del 50 %) en el area de las metastasis en comparacion con los ratones tratados con el anticuerpo de control de isotipo (Figura 24).
La expresion de endoplasmina (Grp94) se incremento mediante agentes quimioterapeuticos. El analisis de flujo revelo que el tratamiento con 5-fluorouracilo (FU), cisplatina y paclitaxel incremento la expresion superficial de endoplasmina (Grp94). El efecto fue especffico (Figura 25). Los resultados del MTT revelaron que el mAb W9 en combinacion con 5-FU y ciclopamina, respectivamente, es mas efectivo que cada agente por si solo para inhibir el crecimiento de celulas de adenocarcinoma pancreatico (Figura 26). El analisis de flujo tambien revelo que la inhibicion del crecimiento de celulas iniciadoras de cancer por mAb W9 fue potenciada por la ciclopamina y el 5-FU. Se detecto una inhibicion del crecimiento de celulas ALDHbnght de aproximadamente el 90 % tras la incubacion con mAb W9, ciclopamina y 5-FU. En contraste, la inhibicion fue de tan solo el 50 % en los cultivos incubados individualmente con mAb W9 o ciclopamina, del 20 % en el cultivo incubado con 5-FU y del 70 % en los cultivos incubados con mAb W9 en combinacion con ciclopamina o 5-FU (Figura 27). El analisis de flujo tambien revelo que la induccion de apoptosis por mAb fue potenciada por la ciclopamina y el 5-FU. Mediante mAb W9 en combinacion con ciclopamina y 5-FU se indujo apoptosis en el 70 % de las celulas. Sin embargo, se indujo apoptosis en menos del 35 % de las celulas tratadas con 5-FU, ciclopamina o una combinacion de 5-FU y ciclopamina (Figura 28).
El analisis de flujo tambien revelo que la inhibicion del crecimiento de celulas iniciadoras de cancer por mAb W9 fue potenciada por radiacion y ciclopamina. Se detecto una inhibicion del crecimiento de celulas ALDHbnght de aproximadamente el 90 % tras el tratamiento con mAb W9 en combinacion con radiacion y ciclopamina. En contraste, la inhibicion fue de tan solo aproximadamente el 50 % en los cultivos tratados individualmente con mAb W9 o ciclopamina, y de menos del 30 % en los cultivos tratados exclusivamente con radiacion (Figura 29). El analisis de flujo revelo que la induccion de apoptosis por mAb fue potenciada por la radiacion y la ciclopamina. Mediante mAb W9 en combinacion con radiacion y ciclopamina se indujo apoptosis en el 73,87 % de las celulas, pero en menos del 25 % utilizando unicamente mAb W9 (Figura 30).
Tambien se examino el efecto del tratamiento con mAb W9 sobre los niveles de protefnas Ras y C-Raf. Los niveles de protefnas Ras y C-Raf se incrementaron mediante ciclopamina y 5-FU. Se observo un efecto sinergico en la inhibicion de la activacion de Mek, Erk y Akt (Figura 31). El efecto del tratamiento con mAb W9 sobre la inhibicion de los niveles de protefnas Ras y GLI1, asf como sobre la activacion de Erk y Akt fue potenciado mediante radiacion y ciclopamina (Figura 32).
Ejemplo 10
Anticuerpos monoclonales especfficos de endoplasmina para el tratamiento del cancer
Este ejemplo describe el uso de anticuerpos monoclonales humanos especfficos de la endoplasmina para el tratamiento de canceres que presentan un incremento de la expresion de endoplasmina (en lo sucesivo denominados cancer «positivo para endoplasmina»), incluyendo sin limitacion, melanoma, cancer de mama, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer renal, cancer de pulmon, glioma, cancer de vejiga, cancer de ovario o cancer de pancreas. Los pacientes diagnosticados con cancer positivo para endoplasmina pueden ser tratados conforme a procedimientos estandar en la tecnica. Generalmente, las opciones de tratamiento incluyen cirugfa, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia o terapia con interferon.
En este ejemplo, a los pacientes diagnosticados con un melanoma positivo de endoplasmina se les administra un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo monoclonal humano especffico de la
endoplasmina ligado a exotoxina de Pseudomonas (PE). La preparacion de inmunoconjugados de PE ha sido descrita (veanse, por ejemplo, la Patente USA n° 7.081.518 y la Publicacion preconcesion USA n° 2005/0214304.
En algunos pacientes, el inmunoconjugado se administra mediante inyeccion de bolo intravenoso en dfas 5 alternos para un total de tres a seis dosis. En otros pacientes, el inmunoconjugado se administra por infusion intravenosa continua a lo largo de diez dfas. La dosis de inmunoconjugado administrada a un paciente varfa dependiendo del peso y el sexo del paciente, y del modo y la cronologfa de la administracion.
Despues del tratamiento, se evaluan los pacientes para determinar la progresion del cancer (incluyendo el 10 crecimiento tumoral y la metastasis) y otros signos clfnicos de enfermedad. Los pacientes pueden ser tratados con el inmunoconjugado solo o en combinacion con uno o varios tratamientos estandar contra el cancer. Por ejemplo, un paciente que se ha sometido a cirugfa para extirpar el melanoma puede ser tratado posteriormente con el inmunoconjugado.
Se pondra de manifiesto que los detalles exactos de los metodos o las composiciones descritas pueden 15 variarse o modificarse sin desviarse de la invencion reivindicada. Reivindicamos todas aquellas modificaciones y variaciones dentro del alcance de las reivindicaciones expuestas a continuacion.

Claims (31)

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    1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado o un fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo, donde la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoacidos establecida como aminoacidos 26-33 de SEC ID N°: 1 (CDR1), aminoacidos 51-58 de SEC ID N°: 1 (CDR2), aminoacidos 97-103 de SEC ID N°: 1 (CDR3) y un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo comprende los aminoacidos 27-32 de SeC ID N°: 2 (CDR1), aminoacidos 50-52 de SEC ID N°: 2 (CdR2), y aminoacidos 89-97 de SEC ID N°: 2 (CDR3), y donde el anticuerpo se une especfficamente a la endoplasmina humana glicosilada.
  2. 2. El anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de union al antfgeno de la reivindicacion 1, donde la cadena pesada del anticuerpo comprende SEC ID N°: 1.
  3. 3. El anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de union al antfgeno de las reivindicaciones 1 o 2, donde la cadena ligera del anticuerpo comprende SEC ID N°: 2.
  4. 4. El anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de union al antfgeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el fragmento de union al antfgeno es un fragmento Fav, un fragmento Fab', un fragmento F(ab)'2, una protefna Fv monocatenaria (scFv) o una protefna Fv estabilizada por disulfuro (dsFv).
  5. 5. El anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de union al antfgeno de la reivindicacion 4, donde el anticuerpo es un scFv.
  6. 6. El anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de union al antfgeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el anticuerpo es una IgG.
  7. 7. El anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de union al antfgeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el anticuerpo esta etiquetado.
  8. 8. El anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de union al antfgeno de la reivindicacion 7, donde la etiqueta es una etiqueta fluorescente, enzimatica o radioactiva.
  9. 9. Un inmunoconjugado aislado que comprende el anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de union al antfgeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 ligado a una molecula efectora.
  10. 10. El inmunoconjugado aislado de la reivindicacion 9, donde la molecula efectora es la exotoxina de Pseudomonas (PE) o una variante o fragmento de esta.
  11. 11. El inmunoconjugado aislado de la reivindicacion 9, donde la molecula efectora es una citoquina, quimiocina, agente terapeutico o radionucleotido.
  12. 12. El inmunoconjugado aislado de la reivindicacion 11, donde la molecula efectora es una citoquina o una quimiocina.
  13. 13. Una composicion que comprende el anticuerpo aislado o fragmento de union al antfgeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el inmunoconjugado aislado de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
  14. 14. Una composicion conforme a la reivindicacion 13 para su uso en un metodo de tratamiento de un sujeto diagnosticado con un cancer que expresa endoplasmina, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de la composicion, tratando asf el que expresa endoplasmina en el sujeto.
  15. 15. La composicion para el uso de la reivindicacion 14, donde el cancer es un melanoma, cancer de mama, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer renal, cancer de pulmon, glioma, cancer de ovario, cancer de vejiga o adenocarcinoma pancreatico.
  16. 16. La composicion para el uso de la reivindicacion 15, donde el tratamiento del sujeto comprende reducir el numero o el tamano de las metastasis.
  17. 17. La composicion para el uso de la reivindicacion 14 o 15, donde el metodo comprende opcionalmente ademas la administracion al sujeto de una dosis terapeuticamente efectiva de un agente quimioterapeutico.
  18. 18. La composicion para el uso de la reivindicacion 17, donde el agente quimioterapeutico es 5- fluorouracilo, ciclopamina, radiacion o una combinacion de estos.
  19. 19. Un metodo para detectar cancer o para confirmar el diagnostico de cancer en un sujeto, que comprende:
    poner en contacto una muestra del sujeto con el anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de union al antfgeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y
    detectar la union del anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de union al antfgeno a la muestra,
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    donde un incremento en la union a la muestra del anticuerpo monoclonal humano aislado o del fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo en comparacion con la union del anticuerpo monoclonal humano aislado o del fragmento de union al antfgeno de dicho anticuerpo a una muestra de control detecta cancer en el sujeto o confirma el diagnostico de cancer en el sujeto.
  20. 20. El metodo de la reivindicacion 19, donde el anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de union al antfgeno esta etiquetado directamente.
  21. 21. El metodo conforme a la reivindicacion 19 o 20, que ademas comprende:
    poner en contacto un segundo anticuerpo que une espedficamente al anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de union al antfgeno con la muestra, y
    detectar la union del segundo anticuerpo,
    donde un incremento en la union a la muestra del segundo anticuerpo en comparacion con la union del segundo anticuerpo a una muestra de control detecta cancer en el sujeto o confirma el diagnostico de cancer en el sujeto.
  22. 22. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, donde el cancer es un melanoma, cancer de mama, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer renal, cancer de pulmon, glioma, cancer de vejiga, cancer de ovario o cancer pancreatico.
  23. 23. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, donde la muestra de control es una muestra de un sujeto sin cancer.
  24. 24. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, donde la muestra es una muestra de sangre, orina, biopsia, suero, esputo, plasma o lfquido cefalorraqrndeo.
  25. 25. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, donde el cancer es metastasico.
  26. 26. Una molecula de acido nucleico aislada o recombinante que codifica el anticuerpo monoclonal humano o fragmento de union al antfgeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  27. 27. Una molecula de acido nucleico aislada o recombinante conforme a la reivindicacion 26, donde el dominio Vh del anticuerpo monoclonal humano comprende la secuencia nucleotidica de SEC ID N°: 3 o una variante degenerada de esta.
  28. 28. Una molecula de acido nucleico aislada o recombinante conforme a la reivindicacion 26 o 27, donde el dominio Vl del anticuerpo monoclonal humano comprende la secuencia nucleotidica de SEC ID N°: 4 o una variante degenerada de esta.
  29. 29. Una molecula de acido nucleico aislada o recombinante conforme a cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28 ligada funcionalmente a un promotor heterologo.
  30. 30. Un vector de expresion que comprende la molecula de acido nucleico aislada o recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29.
  31. 31. Una celula hospedadora aislada transformada con la molecula de acido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29 o un vector de expresion conforme a la reivindicacion 30.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2695899T3 (es) 2010-06-16 2019-01-11 Univ Pittsburgh Commonwealth Sys Higher Education Anticuerpos contra endoplasmina y su uso
PL2822575T3 (pl) * 2012-03-03 2020-08-10 Immungene, Inc. Zmodyfikowane sposobami inżynierii cząsteczki fuzyjne przeciwciało-mutant interferonu
CN103048446B (zh) * 2012-12-25 2015-02-04 苏州浩欧博生物医药有限公司 一种促黄体生成激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法
WO2014165644A2 (en) * 2013-04-04 2014-10-09 The General Hospital Corporation Combination treatments with sonic hedgehog inhibitors
GB201314485D0 (en) * 2013-08-13 2013-09-25 Electrophoretics Ltd Materials and methods relating to pancreatic cancer
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US20180312561A1 (en) * 2015-06-12 2018-11-01 Immungene, Inc. Focused interferon immunotherapy for treatment of cancer
WO2016201337A1 (en) * 2015-06-12 2016-12-15 Immungene, Inc. Engineered antibody-interferon fusion molecules for the treatment of glucose-regulated protein 94 (grp94) expressing cancers
WO2017015374A1 (en) * 2015-07-20 2017-01-26 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for chimeric antigen receptor targeting the glucose-regulated protein of 94 kda (grp94)
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
EP4163298A4 (en) * 2020-06-09 2024-06-12 Univ Kookmin Ind Acad Coop Found ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING GRP94 OR AN ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF, AND USES THEREOF
WO2021263194A1 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Inhibition of n-glycosylated grp94
CN111944043B (zh) * 2020-09-01 2023-05-09 华兰生物工程重庆有限公司 一种从血浆废弃物中提取IgM的方法

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4036945A (en) 1976-05-03 1977-07-19 The Massachusetts General Hospital Composition and method for determining the size and location of myocardial infarcts
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4957735A (en) 1984-06-12 1990-09-18 The University Of Tennessee Research Corporation Target-sensitive immunoliposomes- preparation and characterization
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US5079163A (en) 1985-03-29 1992-01-07 Cetus Corporation Recombinant ricin toxin fragments
US4689401A (en) 1986-03-06 1987-08-25 Cetus Corporation Method of recovering microbially produced recombinant ricin toxin a chain
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4892827A (en) 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
AU622426B2 (en) 1987-12-11 1992-04-09 Abbott Laboratories Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
ATE138106T1 (de) 1988-07-20 1996-06-15 David Segev Verfahren zur amplifizierung und zum nachweis von nukleinsäuresequenzen
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5055303A (en) 1989-01-31 1991-10-08 Kv Pharmaceutical Company Solid controlled release bioadherent emulsions
US5271961A (en) 1989-11-06 1993-12-21 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Method for producing protein microspheres
US5188837A (en) 1989-11-13 1993-02-23 Nova Pharmaceutical Corporation Lipsopheres for controlled delivery of substances
US5427930A (en) 1990-01-26 1995-06-27 Abbott Laboratories Amplification of target nucleic acids using gap filling ligase chain reaction
US5061620A (en) 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
US5268164A (en) 1990-04-23 1993-12-07 Alkermes, Inc. Increasing blood-brain barrier permeability with permeabilizer peptides
ATE182175T1 (de) 1990-05-11 1999-07-15 Us Health Verbesserte exotoxine aus pseudomonas mit geringer toxität bei tieren und hoher zelltötender aktivität
US5608039A (en) 1990-10-12 1997-03-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Single chain B3 antibody fusion proteins and their uses
US5254342A (en) 1991-09-30 1993-10-19 University Of Southern California Compositions and methods for enhanced transepithelial and transendothelial transport or active agents
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
CA2129514A1 (en) 1992-03-12 1993-09-16 M. Amin Khan Controlled released acth containing microspheres
JP3553933B2 (ja) 1992-06-18 2004-08-11 アメリカ合衆国 高められた活性を有する組換シュードモナス外毒素
US5534496A (en) 1992-07-07 1996-07-09 University Of Southern California Methods and compositions to enhance epithelial drug transport
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
US5648211A (en) 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
AU711115B2 (en) 1994-07-15 1999-10-07 Akzo Nobel N.V. Use of RNA polymerase to improve nucleic acid amplification process
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
WO1996033172A1 (en) 1995-04-20 1996-10-24 Pfizer Inc. Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives as mmp and tnf inhibitors
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
AT402203B (de) 1995-06-13 1997-03-25 Himmler Gottfried Dipl Ing Dr Verfahren zur transkriptionsfreien amplifizierung von nucleinsäuren
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
EP0780386B1 (en) 1995-12-20 2002-10-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Matrix metalloprotease inhibitors
DK0885198T3 (da) 1996-03-05 2002-03-25 Astrazeneca Ab 4-Anilinoquinazolinderivater
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
ID19609A (id) 1996-07-13 1998-07-23 Glaxo Group Ltd Senyawa-senyawa heterosiklik
PE91098A1 (es) 1996-07-13 1999-01-15 Glaxo Group Ltd DERIVADOS DE PIRIDO[3,4-d]PIRIMIDINA
EA199900036A1 (ru) 1996-07-18 1999-06-24 Пфайзер Инк Ингибиторы металлопротеаз матрикса на основе фосфинатов, фармацевтическая композиция, способ лечения
JP2000501423A (ja) 1996-08-23 2000-02-08 ファイザー インク． アリールスルホニルアミノヒドロキサム酸誘導体
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
EP0950059B1 (en) 1997-01-06 2004-08-04 Pfizer Inc. Cyclic sulfone derivatives
PL335027A1 (en) 1997-02-03 2000-03-27 Pfizer Prod Inc Derivatives of arylsulphonylamino hydroxamic acid
EP0966438A1 (en) 1997-02-07 1999-12-29 Pfizer Inc. N-hydroxy-beta-sulfonyl-propionamide derivatives and their use as inhibitors of matrix metalloproteinases
JP3710489B2 (ja) 1997-02-11 2005-10-26 ファイザー・インク アリールスルホニルヒドロキサム酸誘導体
ATE292623T1 (de) 1997-05-07 2005-04-15 Sugen Inc 2-indolinonderivate als modulatoren der proteinkinase-ativität
EP0984692A4 (en) 1997-05-30 2001-02-21 Merck & Co Inc ANGIOGENESIS INHIBITORS
WO1999007675A1 (en) 1997-08-08 1999-02-18 Pfizer Products Inc. Aryloxyarylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
DE69838172T2 (de) 1997-08-22 2008-04-10 Astrazeneca Ab Oxindolylchinazolinderivate als angiogenesehemmer
CA2303830A1 (en) 1997-09-26 1999-04-08 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
CN101328186A (zh) 1997-11-11 2008-12-24 辉瑞产品公司 用作抗癌药的噻吩并嘧啶和噻吩并吡啶衍生物
US6809184B1 (en) 1997-12-01 2004-10-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Antibodies, including FV molecules, and immunoconjugates having high binding affinity for mesothelin and methods for their use
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
GB9800569D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
JP4462654B2 (ja) 1998-03-26 2010-05-12 ソニー株式会社 映像素材選択装置及び映像素材選択方法
US6296843B1 (en) 1998-04-03 2001-10-02 The Penn State Research Foundation Mutagenized IL 13-based chimeric molecules
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
CA2314156C (en) 1998-05-29 2010-05-25 Sugen, Inc. Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
UA60365C2 (uk) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця
ATE260255T1 (de) 1998-11-05 2004-03-15 Pfizer Prod Inc 5-oxo-pyrrolidine-2-carbonsäure- hydroxamidderivate
US7081518B1 (en) 1999-05-27 2006-07-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Anti-mesothelin antibodies having high binding affinity
US7252821B2 (en) 1999-10-08 2007-08-07 Arius Research Inc. Cancerous disease modifying antibodies
US20040001789A1 (en) * 1999-10-08 2004-01-01 Young David S. F. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of gp96 or precursors thereof
EP1578394A4 (en) * 2002-12-31 2011-02-23 Nektar Therapeutics ANTIBODY PARTICLES AND COMPOSITIONS
WO2005021710A2 (en) * 2003-06-02 2005-03-10 University Of Miami Chimeric molecules and methods of use
PT1749029E (pt) * 2004-05-27 2011-06-27 Crucell Holland Bv Moléculas de ligação capazes de neutralizar o vírus da raiva, e suas utilizações
ATE500276T1 (de) 2004-12-30 2011-03-15 Us Gov Health & Human Serv Humanisierte col-1-antikörper mit substituierten resten am gerüst, und deren anwendung
WO2006120230A2 (en) * 2005-05-12 2006-11-16 Crucell Holland B.V. Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof
ES2536772T3 (es) * 2007-09-21 2015-05-28 The Regents Of The University Of California El interferón dirigido demuestra potentes actividades apoptóticas y antitumorales
AU2009222974A1 (en) 2008-03-13 2009-09-17 Compugen Ltd. Novel gp96 derived peptides
ES2695899T3 (es) * 2010-06-16 2019-01-11 Univ Pittsburgh Commonwealth Sys Higher Education Anticuerpos contra endoplasmina y su uso
US8771687B2 (en) * 2010-12-02 2014-07-08 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Methods for treating a tumor using an antibody that specifically binds GRP94
US9672526B2 (en) 2012-03-13 2017-06-06 American Express Travel Related Services Company, Inc. Systems and methods for tailoring marketing
US10884952B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Intel Corporation Enforcing memory operand types using protection keys

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AU2013270597B2 (en) Antibodies to endoplasmin and their use