JP3553933B2 - 高められた活性を有する組換シュードモナス外毒素 - Google Patents

Description

本発明は毒性及び治療能を高めるように改良された組織シュードモナス（Pseudomanas）由来の毒素の製造及び利用に関する。より詳しくは、本発明はシュードモナス外毒素のドメインI a及び一定のドメインII配列の除去で表わされるアミノ酸配列の中の欠損を含んで成る外毒素に関する。
発明の背景
成長因子、抗体及びその他の細胞標的分子に付加された毒素は特異的なレセプター又は抗原を抱える有害な細胞を殺傷するのに利用されうる（Pastanら、Cell 47:641（1986）及びVitettaら、Science 238:1098（1987））。有効な治療的毒素にとっての一の見込みのある起源はシュードモナス外毒素Ａである。シュードモナス外毒素Ａ（PE）はシュードモナスアエルギノーザ（Pseudomonas Aeruginosa）により分泌される非常に活発なモノマータンパク質（分子量66KD）であり、これはADPリボシル化を触媒すること（酸化NADのADPリボシル成分の伸長因子２（EF−２）への転移を触媒）によるEF−２の不活性化を通じて真核細胞におけるタンパク質合成を阻害する。
この毒素は、協同で細胞障害を引き起こすように作用する３つの構造ドメインを含む。ドメインI a（アミノ酸１−252）は細胞結合を触媒する。ドメインII（アミノ酸253−364）は細胞質ゾルへのトランスロケーションにとって重要であり、そしてドメインIII（アミノ酸400−613）は伸長因子２のAPPリボシル化を媒介し、これはタンパク質を不活性化し、そして死をもたらしめる。ドメインI b（アミノ酸365−399）の機能は不能であり続けているが、しかしその主要部、即ちアミノ酸365−380は細胞障害性の損失を伴わないで削除できる。Siegallら、Biochem.30:7154−7159（1991）を参照のこと。PEは、Pastan and FitzGerald,Science 254:1173−1177（1991）に記載の通り、様々な細胞膜タンパク質を有する細胞を選択的に標的にできうる毒素を作り上げるために、成長因子、抗体又はCD4と組合されている。
天然のPEは特徴的には肝臓不全に基づく死をもたらす。PEを有する免疫毒素も肝臓を攻撃し、そしてもっと大量（20〜250倍多く）の用量で付与すると肝臓毒性に基づく死を招いてしまいうる。宿主における非特異的毒性が下がり、且つ治療効能が高まったPEの改良形態が非常に所望されている。細胞結合性ドメインI aを欠くPEの変異性は、非特異的な毒性の程度を下げながら有効であることが見い出されている。例えば米国特許第4,892,827号を参照のこと。
発明の概要
本発明は従来述べられている分子よりも高い活性を示す改良組換えシュードモナス外毒素分子を開示する。更に、ここに記載の発見は、サイズにおいてより小さく、免疫原性が低い傾向にあり、標的細胞の細胞質ゲルに侵入でき、そして腫瘍の内部に浸透し易いPE分子を作り出すことを可能にする。
細胞障害性とするには、天然PEは細胞内でタンパク質分解的に切断されねばらない（Ogataら、J.Biol.Chem.265:20678−20685（1990））。この切断はアミノ酸279と280との間で起こる。この切断の重要性は、この部位で切断することのできないPEの突然変異形態が無毒であることを示唆する結果で説明されている。Ogataら、前掲。しかしながら、細胞による切断はあまり効率的でない。本発明は細胞による切断を必要としないPE誘導体を構築することにより非効率的な切断の問題を解消することを狙いとする。かかる「事前切断型」PE分子の高められた能力を有し、その理由は細胞質ゾルに至る活性毒素フラグメントの輸送の効率が高まっているからである。
本発明は組換シュードモナス外毒素分子を含み、そのドメインI aは欠損しており、そしてそのドメインIIのアミノ末端から最初の27個のアミノ酸より多くは欠損していない。好適なPE分子はドメインIIのアミノ酸位置280におけるメチオニンで始まり、ドメインI bのおよそのアミノ酸365から380までの欠損を含んで成り、そしてアミノ酸位置287においてシステインの代わりとなるセリンの置換を含んでいる。好適な分子には、その分子のカルボキシル末端において、REDLK（Seq.ID No.14）,REDL（Seq.ID No.15）及びKDEL（Seq.ID No.16）より成る群から選ばれるアミノ酸配列を有するものも含まれる。典型的なPE分子はほぼアミノ酸280から613より本質的に成るか、又はほぼアミノ酸280から364及び381から613より本質的に成る。
このPE分子はリガンド結合因子、例えば抗体又はその結合性フラグメント、成長因子、ホルモン、サイトカイン等に融合されていてもよい。このリガンド結合因子は好ましくはほぼアミノ酸位607の後に挿入し、そしてアミノ酸604−613をリガンドのＣ末端に置く。我々は、ドメインIIの中の一定の配列のみが結合性タンパク質を細胞質ゾルの中にトランスロケートさせるのに必要であることを示したため、本発明のPE分子は様々なペプチドを細胞へと輸送するのに利用されうる。ドメインIIIはPE分子から削除してよく、そしてワクチンとして又は遺伝子治療用途に利用するためのその他のペプチドで置き換えられてよい。
このPE分子は、ドメインI aの欠損及びドメインIIのアミノ末端の中に欠損を有することによっても特徴付けられ、この分子は細胞障害アッセイにおいてPE40（以下に説明）よりも標的細胞に対して少なくとも20倍細胞障害性である。ここで、本明細書記載のPE40及び組換PE分子の標的細胞に対する細胞障害性は、その標的細胞に対して、その標的細胞に特異的なリガンド結合因子に融合したPE40及びこの標的細胞に特異的なリガンド結合因子に融合した組換PE分子をアッセイすることにより測定する。
このPE分子のアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を含んで成るベクター及びこの分子を発現する宿主細胞も考慮する。更に、ここに記載の新規分子を有する、癌及びその他の症状を処置するための薬理製剤及び方法を含む。
図面の説明
図１はPEのドメインIIにおいて一定の欠損を示す発現タンパク質の模式図である。更に、ドメインI aの全のアミノ酸が欠損している。PE配列に広がるアミノ酸の位置に番号を付している。
図２は図１に示す発現タンパク質のSDS−PAGEである。10％のタンパク質ゲルをクマジーブルーで染めた。標準品の分子量は左縁に示している。
図３は図１に示す発現タンパク質、シュードモナス外毒素のイムノブロット分析である。標準品の分子量は左縁に示している。
図４は、左側（図4A）においてはPE37/T（白四角）、PE（4E）/T（白三角）及びPE37Δ314−380/T（黒丸）、並びに右側（図4B）においてはPE37/T（白四角）、PE282−613/T（黒三角）、PE284−613/T（黒四角）及びPE287−613/T（白丸）による、A431細胞のタンパク質合成阻害を示す。〔³H〕ロイシン取り込みを、毒素抜きでインキュベートした細胞のcpmの％として表わしている。
図５は、PE37/T（白四角）、PE282−613/T（黒三角）、PE284−613/T（黒四角）及びPE287−613/T（白丸）によるMCF−７細胞のタンパク質合成阻害を示す。〔³H〕ロイシンの取り込みを、毒素抜きでインキュベートした細胞のcpmの％として表わしている。
図６は、左側（図6A）においてはPE37/T（白四角）、PE（4E）/T（白三角）及びPE37Δ314−380/T（黒丸）、並びに右側（図6B）においてはPE37/T（白四角）、PE282−613/T（黒三角）、PE284−613/T（黒四角）及びPE287−613/T（白丸）によるA431細胞からの〔¹²⁵I〕−EGFの放出（displacement）を示す。A431細胞に結合している〔¹²⁵I〕−EGFをdpmとして測定し、そして毒性抜きでインキュベートした細胞のdpmの％として表わしている。
図７。A:lys PE38にチオエーテル結合により抱合されているMAbを含む免疫毒素の模式図である。また、ドメインIIの残基265と287とにわたるジスルフィド結合も示している。その矢印は、細胞質ゾルへとトランスロケートする37KDフラグメントを作り上げるのに必要とされるタンパク質分解部位を示している。B:位置287におけるシステイン残基を介するPE35に対するジスルフィド結合により抱合されているMAbを含む免疫毒素の模式図である。細胞内でのジスルフィド結合の還元は細胞質ゾルにトランスロケートできる毒素フラグメントを作り上げる。
図8:A431細胞に及ぼすHB21コンジュゲートのタンパク質合成阻害:HB21−Ｓ−Ｃ−PE35（黒丸）、HB21−Ｓ−Ｃ−PE38（黒三角）、HB21−Ｓ−Ｓ−PE38（白四角）及びHB21−Ｓ−Ｓ−PE35（黒四角）。
図9:MCF7細胞に及ぼすB3コンジュゲートのタンパク質阻害活性:B3−Ｓ−Ｃ−PE38（白四角）及びB3−Ｓ−Ｓ−PE35（黒三角）。両免疫毒素はMAbをイミノチオランで誘導化することにより構築した。
図10:B3−Ｓ−Ｓ−PE35の血清レベルを、５μｇの免疫毒素の静脈内注射の後に決定した。B3−Ｓ−Ｓ−PE35のレベルを、血清をA431細胞とインキュベートし、次いでタンパク質合成に及ぼすその効果を測定することによりアッセイした。標準曲線をコントロールマウス血清で希釈したB3−Ｓ−Ｓ−PE35で作った。
図11:ヌードマウスにおける皮下A431腫瘍の増殖に及ぼすB3−Ｓ−Ｓ−PE35の作用。動物には０日目において、2,000,000個の細胞と、25μｇのB3−Ｓ−Ｓ−PE35（白丸）又は等量のB3（黒三角）もしくはPE35（白四角）もしくはHSA含有PBS（黒四角）とを受容させた。棒線は平均の標準誤差を示している。
詳細な説明
本発明は高められた細胞障害活性を有する組織シュードモナス外毒素に関連し、それにおいてはドメインIIのアミノ末端の一部が欠損している。この分子は別の標的分子に結合又は融合されており、従ってその改良型細胞毒素は所望の細胞を標的とするようになっている。
天然PEは配列ID表No.1に示している。本明細書に記載されている全てのアミノ酸配列の位置は、対照のフレームとしてこの配列表を利用している。例えば、「本質的にほぼアミノ酸280〜613より成る」PE分子は、配列ID表No.1上のそれに実質的に対応する位置のアミノ酸を有する分子を意味している。配列ID表No.1を対照のフレームとして利用している配列についての欠損又は置換を示すためにその他の一般的な対照を本明細書では用いている。記号「Δ」の利用は、その記号の後方のアミノ酸の欠失を意味する。例えば、「Δ365−380」とは、PE分子からのアミノ酸365〜380の欠損を意味している。アミノ酸置換はかっこにより示すことができ、例えば「（ser 287）」とは、アミノ酸位置287にセリンを有する分子を意味している。アミノ酸はここでは時折り、IUPAC−IUB生化学命名協会により推奨されている単文字コードによって表わしている。
本発明の数多くのPE分子は、標的細胞に特異的なリガンド結合因子と複合されているとき、標的細胞に対するその高められた細胞障害性により固有に特徴付けられる。この高められた細胞障害性は、天然分子又はドメインIIに有意義な欠損がないもの、例えば下記の実施例の章並びに引用することで本明細書に組込む一般譲渡されたU.S.S.N.07/459,635及びU.S.S.N.07/522,182に記載のPE（4E）又はPE40の使用に比して認められる。細胞障害性の上昇を決定するためのアッセイは、課題のPE分子とリガンド結合因子とを含んで成る融合タンパク質を、対照のPE分子、例えばPE40と前記のリガンド結合因子とを含んで成る融合タンパク質と比較するアッセイである。次に対応の融合タンパク質を、リガンド結合因子に対して特異的な細胞に対する細胞障害アッセイで試験する。得られるID₅₀（以下に定義）は、リガンドレセプターから50％のラベル化リガンドを放出させる毒素の濃度を、リガンドレセプターを抱える細胞上の組換毒素のID₅₀で除することによってその値を調整することにより、細胞障害指数を得るように調整されうる。次に各PE分子についての細胞障害指数を比較する。リガンド結合因子としてのTGFα及びEGFレセプターを抱えるA431細胞を利用する典型的なアッセイを下記に提供する実施例に記載している。PE40又はドメインIIの欠損を有さないことが認められたその他のPE分子よりも約20倍以上、好ましくは約60倍以上、そして最も好ましくは約300倍以上の適正な細胞障害指数を有するPE分子が所望される。ドメインI aを欠くPE分子は、ドメインII,I b及びIIIを発現するプラスミドpJH8により発現されうる。プラスミドpJH8は引用することで本明細書に組入れる米国特許第4,892,827号に記載されており、そしてRockville,MarylandのAmerican Type Culture CollectionよりATCC 67208として入手できる。
「ID₅₀」は標的細胞の中でのタンパク質合成を50％阻害する毒素の濃度を意味し、これは典型的には標準の³H−ロイシン取り込みアッセイにより測定される。放出アッセイ又は競合結合アッセイは公知であり、そして当業界において述べられている。それらは、標的抗原の結合について、一のペプチドが他のペプチドと競合する能力を測定する。
好適なPE分子はドメインI aが欠損しており、そしてドメインIIのアミノ末端から最初の27個より多くのアミノ酸が欠損していないものである。これは実質的にはアミノ酸１から27aの欠損を示す。この欠損によりもたらされる細胞障害性の利点は、下記の欠損があると大いに低下する:1−281;1−283;1−286;及び314−380。ドメインIIのアミノ末端からの、29,31,33又は36のアミノ酸ではなく、27のアミノ酸の欠損が、高められた毒素活性をもたらすことは驚くべきことであり、なぜならこのドメインは毒素の細胞質ゾルへのトランスロケーションにとって重要であるからである。
更に、これらのPE分子は、特定の所望の用途のためにこの分子を改変するために、部位特異的突然変異誘発又はその他の当業界に公知の技術に用いて更に改良されうる。本明細書に記載のPE分子により供される機能的な長所に実質的に影響を及ぼさない状況でPE分子を改変せしめる手段も利用してよく、そしてこのようにして得られる分子は本発明に包括されることを意味する。
好適なPE分子の最大細胞障害特性のため、分子にいくつかの改良を施すことが推奨されている。この組換分子への適当なカルボキシル末端配列は、この分子の標的細胞の細胞質ゾルに至るトランスロケーションにとって好適である。有効であると認められているアミノ酸配列には、REDLK（天然PEにおける）、REDLもしくはKDEL、それらの反復体、又はその他の配列であって小胞体の中でタンパク質を維持もしくは再循環させるのに機能する本明細書では「細胞質内保持配列」と称する配列が含まれる。例えば、Chaudharyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:308−312及びSeetharamら、J.Biol.Chem.266:17376−17381（1991）、並びに一般譲渡された1990年１月２日提出のUSSN 07/459,635を参照のこと。全て引用することで本明細書に組入れる。
ドメインI bのアミノ酸365−380の欠損は活性の損失を伴わずになせうる。更に、タンパク質の合成が開始されるようにアミノ酸位置280でのグリシンに代わるメチオニンの置換及び不適切なジスルフィド結合の形成を防ぐためのアミノ酸位置287でのシステインに代わるセリンの置換が有利である。
「リガンド結合因子」は一般に、標的細胞上のレセプターと反応する、又はそれを認識又はそれと結合することのできる全ての分子を意味する。かかる結合因子の例には、限定することなく、抗体、成長因子、例えばTGFα,IL2,IL4,IL6,IGF1又はCD4、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン等であって所望の標的細胞に特異的に結合するものが含まれる。
「抗体」なる語には、様々な改良又は改変抗体、例えば完全イムノグロブリン、軽鎖及び重鎖の可変領域のみを含むFvフラグメント、可変領域及び一部の定常領域を含むFabもしくは（Fab）'₂、一本鎖抗体（Birdら、Science 242,424−426（1988）;Hustonら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85,5879−5883（1988））等が含まれる。抗体は動物（特にマウス又はラット）もしくはヒト起源のもの、又はキメラ（Morrisonら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 81,6851−6855（1984））、又はヒト化（Jonesら、Nature 321,522−525（1986）及び公開UK特許出願＃8707252）のものであってよい。本発明における利用にとって適当である抗体の生産方法は当業者によく知られ、そしてHarlow ＆ LaneのAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory（1988）の如きの公開物に記載されている。
本発明の組換PE分子はリガンド結合因子に、当業者に知られ、且つ利用されている任意の方法により融合又はそうでなければ結合させることができうる。これらの２つの成分は任意の公知の様々な化学手順によって互いに化学結合させることができうる。例えば、その結合はヘテロ二価架橋剤、例えばSPDP、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等を介してよい。様々な免疫毒素の製法が当業界に知られており、そして例えば、共に引用することで本明細書に組入れる、「Monoclonal Antibody−Toxin Conjugates:Aiming the Magic Bullet」Thorpeら、Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine,Academic Press、頁168−190（1982）及びWaldmann,Science,252:1657（1991）に見い出せうる。組換PE分子を抗体と一緒に用いるためには、アミノ酸位置287においてシステインを有するPE分子が、その毒素を抗体又はその他のリガンドにシステインのチオール成分を介して複合させるのに好ましい。
このPE分子は、E.コリ（大腸菌）の中での一本鎖抗体の生産を通じての如きの組換手段によってリガンド結合因子に融合させてもよい。タンパク質をエンコードする遺伝子は、当業者に知られる任意のクローニング手順によってcDNA又はゲノム形態においてクローンさせることができうる。例えばSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）を参照のこと。
リガンド結合因子、特にTGFα（形質転換成長因子α）の如きの小さめの因子は、PE分子のドメインIII内の位置に挿入するのが所望される。最も好ましくは、このリガンド結合因子はPE分子のほぼアミノ酸位置607と604との間に融合させる。このことは、そのリガンド結合因子がこの分子のほぼアミノ酸607の後ろに挿入されており、そしてPEの適当なカルボキシル末端が、PEのアミノ酸ほぼ604−613をこの結合因子の後ろに置くことにより再生されたことを意味している。従って、このリガンド結合因子は組換PE分子の中でほぼアミノ酸607の後ろに挿入され、そしてドメインIIのアミノ酸604−613がそれに続く。所望の抗体由来のV_L及びV_H領域もドメインIII内に一本鎖形態で挿入してよい。
結合因子は、全て引用することで本明細書に組入れるHeimbrookら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,87:4697−4701（1990）及び一般譲渡された1992年４月８日提出のU.S.S.N.07/865,722及び1990年５月14日提出のU.S.S.N.07/522,563に記載のTGFα/PE40分子（TP40とも称する）として知られるものにおいて成し遂げられている通りにドメインI aの代わりに挿入してもよい。
当業者は、リガンド結合因子及びPE遺伝子に追加の改良、欠損、挿入等を施してよいことを認識するであろう。特に、標的細胞に対する融合タンパク質の細胞障害性を高めるために、又は抗体についての抗原を有さない細胞に対する非特異的な細胞障害性を低めるために、PEの中に、又は抗体遺伝子をPEに連結するリンカーの中に、欠損又は変更を施すことができうる。かかる構築体は全て、当業者によく知られている遺伝子工学の方法により作られることができ、そしてそれらを様々な臨床又は生物系的用途にとって極めて適当なものに仕上げる親和性、特異性、安定性及び毒性の様々な性質を有するタンパク質を産生せしめうる。
PE分子を含む本発明の融合タンパク質は様々な宿主細胞、例えばE.コリ、その他の細菌宿主、酵母、並びにその他の高等真核細胞、例えばCOS,CHO及びHeLa細胞系及びミエローマ細胞系において発現されうる。その組換タンパク質遺伝子は各宿主にとって適切な発現コントロール配列に作動連結されているであろう。E.コリにとっては、これにはプロモーター、例えばT7,Trp又はラムダプロモーター、リボソーム結合部位及び好ましくは転写終結シグナルが含まれる。真核細胞にとっては、そのコントロール配列にはプロモーター、及び好ましくはイムノグロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウィルス等に由来するエンハンサー、並びにポリアデニル化配列が含まれ、そしてスプライスドナー及びアクセプター配列が含まれうる。本発明のプラスミドはよく知られている方法、例えばE.コリにとっての塩化カルシウム形質転換並びに哺乳類細胞にとってのリン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションによって特定の宿主細胞の中に移入することができうる。プラスミドにより形質転換された細胞は、プラスミド上に含まれるamp,gpt,neo及びhyg遺伝子の如きに遺伝子により授けられる抗生物質に対する耐性により選別されうる。
発現したら、この組換融合タンパク質は当業界の標準の手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等に従って精製されうる（一般的には、R.Scopes,Protein Purification,Springer−Verlag,N.Y.（1982）を参照のこと）。少なくとも約90〜95％の均一性の実質的に純粋な組成物が好ましく、そして98〜99％又はそれより高い均一性が薬理用途にとって最も好ましい。部分的にＨ、又は所望の均一性にまで精製したら、そのポリペプチドは治療的に使用されうる。
本発明の組換融合タンパク質及び薬理製剤は非経口投与、例えば静脈内投与、又は身体の腔もしくは器官の内腔への投与にとって特に有用である。投与のための製剤は一般に薬理学的に許容される担体、好ましくは水性担体の中に溶解されているPE分子融合タンパク質の溶液を含んで成るであろう。様々な水性担体、例えば緩衝食塩水等が使用されうる。これらの溶液は無菌であり、そして一般に不要の物質を含まない。これらの製剤は慣用のよく知られた除菌技術によって除菌されうる。これらの製剤は、生理学的条件に近づけるための必要な薬理学的に許容される補助物質、例えばpH調整及び緩衝剤、毒性調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含みうる。これらの製剤の中での融合タンパク質の濃度は幅広く変えることができ、そして主に流体容量、粘度、体重等に基づき、選ばれた投与の特定の態様及び患者の要望に応じて選ばれるであろう。
従って、静脈内投与にとっての典型的な薬理製剤は１日当り、患者当りで約0.1〜10mgであろう。１日当り、患者当りで0.1〜約100mgの用量は、特にその薬剤を血管ではなく隔離部位、例えば身体の腔又は器官の内腔に投与するときに利用されうる。非経口投与用製剤を調製するための実際の方法は当業者に公知又は自明であり、そしてRemington's Pharmaceutical Science第15版、Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania（1980）の如きの公開物に詳しく記載されている。
本発明の融合タンパク質又はそのカクテル（即ち、その他のタンパク質との）を含む製剤は治療的処置のために投与されうる。治療的用途においては、製剤は疾患に苦しむ患者に、その疾患を及びその合併症を治療させる又は少なくとも部分的に緩和させるのに十分な量で投与される。これらを達成させるのに適当な量を「治療的に有効な量」と定義する。この用途にとって有効な量は疾患の症度及びその患者の健康の一般的な状態に依存するであろう。
該製剤の一回又は複数回の投与を、患者に必要とされ、且つ許容される用量及び頻度に応じて投与せしめてよい。あらゆる事態においても、この製剤はその患者を効果的に処置するのに十分な量の本発明のタンパク質を供すべきである。
本発明の組換融合タンパク質の用途の中にはとりわけこのタンパク質の毒性作用によって排除されうる特定のヒト細胞により引き起こされる様々な疾患症状が含まれる。一の好適な用途は例えばリガンド結合因子としてのTGFαの利用による癌の処置、又はＴ及びＢ細胞により生ずる自己免疫症状、例えば移植片一対一宿主疾患、器官移植拒絶、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症等の処置である。この融合タンパク質はインビトロで、例えば移植する前での骨髄からの有害な細胞の排除にも利用されうる。融合タンパク質のリガンド結合因子部分は意図する用途に従って選ぶ。結合因子にとっての標的として働きうるＴ細胞の膜上のタンパク質にはCD2（T11）,CD3,CD4及びCD8が含まれる。標的として働きうるＢ細胞上に主に見い出せるタンパク質にはCD10（CALLA抗原）、CD19及びCD20が含まれる。CD45はリンパ球様細胞上に幅広く認められる、可能性のある標的である。結合因子にとってのこれら及びその他の可能性のある標的リンパ球抗原は、Leucocyte Typing III,A.J.McMichael編,Oxford University Press,1987に記載されている。この結合因子にとっての標的として働きうる癌細胞上に見い出せる抗原には、癌胎児性抗原（CEA）、トランスフェリンレセプター、Ｐ−糖タンパク質、Ｃ−erbB2、及び癌についてのモノクローナル抗体免疫抱合体の第３回国際会議（Third International Conference on Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer）（サンディエゴ，カリフォルニア,1988年）の要約書に記載の抗原が含まれる。当業者は、上記の細胞以外のその他のタイプ上で発現されるレセプター、例えば膜糖タンパク質又は成長因子又はホルモンレセプター、例えば表皮成長因子レセプター等に結合するリガンド結合因子を選択できうることを理解しているであろう。
ここに記載のPE分子、そして最良には以下に記載のPE37及びPE35により代表されるものは、遺伝子治療用途におけるシグナル配列として、又は例えばワクチンの使用に伴うときのようにシグナル配列が有用となるその他の用途におけるシグナル配列としても働くであろう。かかる用途においては、PE分子のドメインIIIのかなりの欠損が所望の抗原に置き換えられていてよい。「ドメインIIIのかなりの欠損」とは、ドメインの大部分が欠損している、即ちそのドメインの機能が不活性化されている、又は破壊されていることを意味する。この分子におけるドメインIIIのほぼアミノ酸604−613の保持は非常に所望される。
例えば、AIDS又は癌を処置するワクチンを作るためには、所望のタンパク質の一部をドメインIIIの場所に挿入してよく、そしてリガンドは組換タンパク質を抗原表示細胞に結合させるように所望のタンパク質とPEのカルボキシル末端との間に挿入する。遺伝子治療にとっては、DNA配列はドメインIIIの場所に挿入してよい。
追加の一般定義
「組換」とは、課題の産物が遺伝子の新たな又は非天然的な組合せに至る操作の結果物であることを意味する。
「ベクター」とは、DNA配列、典型的にはプラスミド又はウィルス形態におけるDNA配列であり、これは宿主の中で複製することが可能である。ベクターはDNA配列を輸送又は操作するのに利用できうる。「発現ベクター」には、その中に含まれているDNA配列を発現させてタンパク質産物を産生することのできるベクターが含まれる。コード配列はその発現を及ぼしめることのできる別の配列、例えばプロモーター及びエンハンサーに連結している。
「有意義な毒性抜きで」でなる表現は、本発明の融合タンパク質が、標的でない細胞の機能を任意の感知できる程度に、又は任意の異常なレベルにまで影響を及ぼさないことを意味する。
以下の実施例は例示のために提供し、本発明を限定する意図はない。
実施例
I. 37KDのカルボキシル−末端PEフラグメントの構築
A. 材料−制限エンドヌクレアーゼ及びDNAリガーゼを、New England Biolabs（Beverly,MA）,Bethesda Research Laboratories（Gaithersburg,MD）、又はBoehringer Mannheim（Indianapolis,IN）より入手した。PE（4E）/TGFA（時折りPE^4E−TGFαとも呼ぶ）はR.kreitmanからの贈呈品である。Kreitmanら、Bioconjugate Chem.3:58−62（1992）及びKreitmanら、Bioconjugate Chem.3:63−68（1992）を参照のこと。これらは共に引用することで本明細書に組入れ、そして共に「Kreitmanら」と本明細書において称する。これはKreitmanらに記載の通り、アミノ酸57,246,247及び249が全てグルタミン酸に置き換えられ、TGFαがアミノ酸607の後ろに置かれ、そしてPEの適当なカルボキシル末端がPEのアミノ酸604−613をTFGαの後に置くことにより再生されている突然変異した不活性の天然結合ドメインを有する全長PEである。
Hut 102細胞はT.Waldman,Leonardらからの贈呈品である（Nature 300:267−269（1982））。その他の細胞系は全てAmerican Type Culture Collection（Rockville,MD）に由来する。
B. 増幅−オリゴヌクレオチドC1,C2,C7及びC8は表１に詳細しており、そしてこれらはDNA合成装置（Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA）を用いて構築した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の反応は鋳型としての10ngのpCT4（下記の参照）及び製造者の仕様書（Gene Amp:Perkin−Elmer Cetus Instruments,Norwalk,CT）に従う試薬を用い、５％のホルムアミド（Fluka Chemika,Rankokoma,New York）及び100pmolのプライマーC1とC2、又はC7とC2、又はC8とC2の存在下で実施した。各PCR反応は94℃で１分の変性、42℃で90秒のアニーリング及び72℃で２分の重合、それに伴う各サイクルにおける10秒の伸長より構成される前部で30のサイクルとした。増幅フラグメントを15％の低融点アガロース（Sea Plaque;FMC Corp.,Rockland,ME）で精製した。

C. 細菌株及びプラスミド−E.コリ株HB101をプラスミドの増殖のために用いた。プロファージ上に誘発性T7 RNAポリメラーゼ遺伝子を保有する。E.コリ株BL21（λDE3）（Studier ＆ Moffatt,S.Mol.Biol.189:113−130（1986））を融合タンパク質発現のための宿主として用いた。プラスミド4735/4Eは既に述べられている（Kreitmanら、前掲）。これはアミノ酸607の後ろに挿入されているTGFαをエンコードする遺伝子を含む。アニールさせたオリゴヌクレオチドS1及びS2（表１）の、アミノ末端において追加のリジンを含むPE40の誘導体NLysPE40をエンコードするプラスミドMS8の4.2kb（キロベース）のNde I−Sal Iフラグメントへの挿入により作り上げたプラスミドDF1を、HB101株の中で増殖させた。プラスミドMS8は、Nde I制限エンドヌクレアーゼで線状化したプラスミドpVC8f（＋）Ｔ（Chaudharyら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 85:2939−2943（1988）；引用することで組入れる）にオリゴヌクレオチド二本鎖をリゲートすることにより調製した。そのリンカーの配列は表１のS5に見い出せる。その配列は、引用することで本明細書に組入れるSangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:2659−2663（1977）に記載の方法でのDNA配列決定（Sequenase,U.S.Biochemical,Clereland,Ohio）により確認した。このプラスミドDF1は、開始メチオニン、それに続く天然PEのアミノ酸281−613を含むPE37と呼ぶ37KDのタンパク質をエンコードする。位置287におけるシステインはセリンで置き代わっている。プラスミドDF1はRockville,MarylandのAmerican Type Culture Collectionに1992年６月12日寄託され、そしてATCC No.69019が付与されている。プラスミドCT4（pCT4）は、。プラスミド4735/4Eの551bp（塩基対）のBamH I−EcoR Iフラグメントと同一のDNAフラグメントと、プラスミドDF1の3.6kbのBamH I−EcoR I脱リン酸化フラグメントとのリゲートによって作った。プラスミドCT4はPE37/TGFα（PE280−613/TGFα）と呼ぶタンパク質をエンコードする。
PE37欠損突然変異体は、プラスミドDF1の中に見い出せるNde I−Sac II制限部位へのNde I−Sac II消化PCRフラグメントの挿入により作り上げた。プラスミドCT2は位置282のメチオニン、及び位置287を除く天然PEのアミノ酸283−613をエンコードする。プラスミドCT3は位置284のメチオニン、及び位置287を除く天然PEのアミノ酸285−613をエンコードする。プラスミドCT14は位置287のメチオニン、及び天然PEのアミノ酸288−613をエンコードする。PE37に由来するアミノ酸314−380の内部欠損を含むプラスミドCT8を、アニールさせたオリゴヌクレオチドS3及びS4（表１）の、プラスミドDF1の3.9kbのSal I−Apa Iフラグメントへの挿入により作った。４つのプラスミド全ての配列をDNA配列決定により確認した。全ての突然変異プラスミドをBamH I及びEcoR Iで制限消化し、そしてプラスミドVC4735/4Eの551bpのBamH I−EcoR Iフラグメントと同一のDNAフラグメントにリゲートさせて突然変異プラスミドCT2/T,pCT3/T,pCT14/T及びpCT8/Tを作り上げた。これらのプラスミドを制限分析により確認したところ、PE282−613/TGFα、PE284−613/TGFα、PE287−613/TGFα及びPE37Δ314−680/TGFαそれぞれをエンコードする（図１）。
D. 組換融合タンパク質の発現及び精製−シュードモナス外毒素を含む融合タンパク質の発現は、先に記載されている通りに（Siegallら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:9738−9742（1988）;Chaudharyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4538−4542（1987）；及びChaudharyらProc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2939−2943（1988）；全て引用することで本明細書に組入れる）宿主E.コリ株BL21（λDE3）を用いて行った。細胞を、IPTG（イソプロピルチオガラクトシド）による誘発の後に90分インキュベートした。そのペリプラズマ画分をプラスミドDF1由来の突然変異タンパク質のために用意した。TGFαドメインを含むタンパク質に関しては、融合タンパク質はKreitmanら、前掲に記載の通り封入体から精製した。
グアニジンで抽出し、そしてPBSへの急速希釈により再生させたペリプラズマ又は封入体を、Pharmacia LKB Biotechnolgy,Inc.（Piscataway,NJ）FPLCを用い、Ｑセファロース、モノQ HR 5/5（Pharmacia−LKB,Inc.,Piscataway.NJ）又はPorous A/F（Perceptive Biosystems,Cambridgt,NA）及びTSK−250カラムの連続使用により精製した。引用することで組入れるLaemmli,Nature 227:680−685（1970）に記載のSDS−PAGEをカラム画分を分析するために用いた。PE含有タンパク質の同定は、ポリクローナルウサギ抗−PE抗血清及びVectastainキット（Vector Labs,Burlingame,CA）を用いるイムノブロッティングにより確認した。
E. タンパク質合成阻害アッセイ−タンパク質合成の阻害は引用することで本明細書に組入れるPriorら、Cell 64:1017−1023（1991）に記載の通りに実施した。細胞を毒素添加の前に、96穴プレートの中で各ウェル当り15,000細胞において24時間平板培養した。0.2％のBSA−PBS（牛血清アルブミン−リン酸緩衝食塩水）の中に希釈した毒素又はコントロールを200μl/ウェルの最終容量にまで加えた。37℃で16〜20時間のインキュベーションの後、各ウェルに〔³H〕−ロイシン（Amersham Corp,,Arlington Heights,IL;1μCiを0.2％のBSA−PBSの中に10μｌまで希釈）で２時間パルスに付した。凍結後、その細胞をガラスファイバーフィルターで集め、そしてタンパク質の中への放射活性の取り込みをBetaplateシンチレーションカウンター（Pharmacia,LKB）で定量した。結果は、毒素抜きでインキュベートした細胞の取り込みcpm（分当りのカウント数）の％として算定した。競合アッセイを２μg/mlのEGFの存在下で細胞に付加した毒素を利用して行った。
F. ADP−リボシル化アッセイ−タンパク質サンプルのADP−リボシル化活性を、伸長因子２に富む小麦胚芽を用いてCollierとKandelの手順により測定した。引用することで本明細書に組入れるJ.Biol.Chem.246:1496−1503（1971）。
G. 〔¹²⁵I〕−EGF放出研究−A431細胞（ヒト表皮癌細胞）を24穴プレートの中で1mlの培地中で、ウェル当り8,000個の細胞において平板培養した。24時間後、これらの細胞を結合バッファー（50mMのMES,pH6.8、及びBSA 1mg/mlを含むDMEM）で２回洗い、そして0,0.8,4,20又は100pmolの毒素のいづれかと組合せた〔¹²⁵I〕−EGF（New England Nuclear,Inc.,Boston.MA）0.5ng（0.05μCi）を含む結合バッファー200μｌで処理した。４℃でロッカー上で90分平衡にした後、それらの細胞を結合バッファーで洗い、0.5％のSDS及び1mMのEDTAを含む10mMのトリス−HCl,pH7.4で溶解し、そして結合リガンドをガンマー検出器で計測した。
H. 37KDのカルボキシル−末端フラグメントのデザイン−PEの37KDのカルボキシル−末端フラグメント（PE37）が細胞質ゾルへとトランスロケートされ、そしてタンパク質合成を抑制しているかどうかを調べるため、我々は位置280においてグリシンの代わりにメチオンで始まり、それに天然PEのアミノ酸281−613が続くタンパク質をエンコードするプラスミドDF1を構築した。天然PEにおいて、メチオニンによるgly 280の交換は細胞障害性を低めない。更に、システイン287をセリンに変え、不適切なジスルフィド結合の数を減らした。その結果、PE37はドメインI bにおいて位置372及び379に位置する２個のシステイン残基のみを有する。プラスミドDF1のDNA配列決定はそれが所望の配列を有することを確証せしめた。プラスミドDF1の中に存在しているT7プロモーターを用いることにより、PE37はBL21（λDE3）の中で発現され、そして細胞画分をSDS−PAGEにより分析したとき、ペリプラズマとスフェロプラストとに均等に分布していることが認められた。毒素をペリプラズマから、アニオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過を利用して＞90％の均一性にまで精製した。その精製タンパク質はSDS−PAGE上で予測の分子量（37KD）を有し、そして抗−PE抗体と免疫反応性であった（図２及び３）。タンパク質の配列決定は14個のアミノ末端アミノ酸を確証した（MWEQLEQSGYPVQR）。ADPリボシル化活性は、天然PEと同一のADPリボシル化活性を有する分子PE40のそれと同一であった。Kondoら、J.Biol.Chem.263:9470−9475（1988）を参照のこと。いくつかの細胞系で試験したとき、PE37はその標的細胞に結合できないために非常にわずかな細胞障害活性しか有していなかった。
I. PE37/TGFαのデザイン及び活性−PE37をそのアミノ末端を改変することなく細胞を標的化できるようにするため、TGFαをエンコードするcDNAを挿入せしめてTGFαがPE37のアミノ酸607の後ろに置かれ、且つPEのカルボキシル末端が、TGFαの後にPEのアミノ酸（604−613）を置くことにより再生されているプラスミドを構築した。この位置に挿入され、且つ不活性細胞結合ドメインをも含む毒素分子PE（4E）/TGFα（PE66^4GLu−TGFαとしても知られる）はEGPレセプターを抱える細胞に対しては非常に細胞障害性である。Kreitmanら、前掲を参照のこと。
構造を図１に示す融合タンパク質PE37/TGFαをBL21（λDE3）の中で発現させ、そしてほとんど独占的に封入体の中で見い出された。このタンパク質を7Mのグアニジンの中に溶かし、リン酸緩衝食塩水で再生し、そしてその他のTGFα含有組換タンパク質について先に記載した通りにアニオン交換及びゲル濾過で＞90％の均一性にまで精製した（Kreitmanら、前掲）。SDS−PAGE上での予測の分子量（43KD）で泳動した精製タンパク質はPEに対する抗体と免疫反応性であり（図２及び３）、そしてその他のPE分子と比べたときに完全たるADPリボシル化活性を有していた（表２）。その組換タンパク質を様々な数のEGPレセプターを発現する細胞系に対して細胞障害性であり、そしてその細胞障害作用は存在するレセプターの数に相関していた（表３）。更に、EGFレセプターを有さないHUT 102細胞はPE37/TGFαの毒性作用に耐性であった。A431ヒト表皮癌細胞に及ぼす細胞障害性は過剰のEGFを用いることで完全に阻害され、PE37/TGFαはEGFレセプターを介して特異的に結合することを示唆する。A431細胞に対するPE37/TGFαのID₅₀は、ドメインII全体を含む分子PE（4F）/TGFαより低く、従って細胞質ゾルにトランスロケートされる前にプロセスされねばならない（図４）。このデーターはPE37/TGFαが非常に活性であり、且つ特異的な組換毒素であることを示唆する。

J. PE37/TGFαの突然変異体−PE37/TGFαのアミノ末端部分の調査は、PEの37KDのフラグメントがＢアルファーヘリックス（aa 287−308）へと導かれる負帯電リーダー配列を形成する７つのアミノ末端アミノ酸（MWEQLEQ）を含むことを示した。PE37のアミノ末端が活性にとって必須であるかを決定するため、一連の欠損突然変異体を構築した。それにおいては2,4又は７個のアミノ酸がアミノ末端から欠損している（図１及び表１）。第四の突然変異体を構築し、これは通常のアミノ末端を、しかしながら大きめの内部欠損（アミノ酸314−380）を含む。EGFレセプターを含む細胞系に及ぼす細胞障害性について試験することができるようにするため、TGFαをこれらの組換タンパク質全てのカルボキシル末端の近くに置いた（図１）。
TGFαを含む全ての突然変異タンパク質をBL21（λDE3）の中の封入体として発現させ、そして前述の通りに精製した。＞90％の均一性にまで精製され、SDS−PAGE上で適切な分子量で泳動した突然変異タンパク質はウサギ抗PE抗体に対して免疫反応性であり（図２及び３）、そして全ADPリボシル化活性を有していた（表２）。A431及びMCF7細胞に対するID₅₀を表２並びに図４及び５に詳細する。PE37/TGFα（PE280−613/TGFα）は活性が12〜25分の１に低下している２又は４個のアミノ末端アミノ酸の欠損した最も活性な分子であった。７個の末端アミノ酸の欠損は更に活性を低下させ、そして内部欠損は大幅な細胞障害の損失をもたらした。
細胞障害性の低下は組換毒素のEGFレセプターへの低められた結合能に原因しうる。TGFαは３本のジスルフィド結合を有するため、様々な不適切な折りたたみ形態が再折りたたみプロセスの際に生じうる。Kreitman、前掲。EGFレセプター結合における相違がPE37/TGFα及びその他の組換毒素間でのID₅₀の相違に原因するかどうかを決定するため、〔¹²⁵I〕−EGF放出アッセイを行った（図６）。各毒素の細胞障害活性をEGFレセプター結合における相違について補正した。補正した細胞障害指数値は、EGFレセプターから50％の〔¹²⁵I〕−EGFを放出させる毒素の濃度（nM）をA431細胞に対する組換毒素のID₅₀で除することによって算定した。この指数は、PE37/TGFαの、ここに記載のその他の突然変異体及びPE（4E）/TGFαに比しての優れた細胞障害活性を強調せしめる。
上記の37KDタンパク質（PE37と呼ぶ）は好適な態様である。アミノ末端メチオニンはアミノ酸位280にあるため、この分子はそれが細胞質ゾルにトランスロケートされるのにタンパク質分解又はジスルフィド結合還元のいづれに付される必要もないであろう。位置280でのグリシンのメチオニンへの置換は細胞障害性を下げない。PE37を標的とするために、キメラ分子を、TGFαをエンコードするcDNAを用いて作り上げた。PE37/TGFαは標的細胞を特異的に殺傷するように働き、なぜなら細胞障害性は過剰のEGFにより阻害され、一方、EGFレセプターを欠くHUT102細胞はPE37/TGFαに非感受性であったからである。アミノ酸253−280はタンパク質分解プロセスを助長するためのみの毒素機能にとって明らかに必要である。
標的細胞によるPEの代謝の分析は細胞結合PE分子の約10％がプロセスを受けたことを示す。Ogataら、J.Biol.Chem.265:20678−20685（1990）を参照のこと。このことは、タンパク質分解プロセスがPEの作用において律速段階でありうることを示唆する。表２は結合PE37/TGFαの方が、PE（4E）/TGFαよりも20倍効率的に細胞質ゾルに到達することを示唆する。トランスロケートするPE（4E）/TGFαのフラグメントはPE37/TGFαとほとんど同一であるため、実際の脱トランスロケーション段階は両分子に関して類似している。従って、タンパク質分解プロセスはPE（4E）/TGFαの細胞障害性を制約する傾向が強いようである。
事前の研究（Siegallら、Biochem 30:7154−7159（1991））は、アミノ酸364−380は活性の損失を伴うことなくPEから欠損されうるが、しかし位置345での追加の突然変異は有害であることを示している。残基314−380を欠くPE37/TGFα突然変異体の劣る活性は314−346の間にある残基がトランスロケーションにかかわっていることを示唆する。この要件は37KDの活性フラグメントを作り上げるのに必要不可欠である。従って、トランスロケーションにとって重要であるドメインIIの部分は位置280−345にある66個のアミノ酸のようである。ドメインI b及びIII（アミノ酸364−613）もトランスロケーションにとって必要であり、なぜならそれらはPriorら、Biochemistry 31:3555−3559（1992）に記載の通りリボヌクレアーゼバルナーゼで置き換えられて細胞障害性分子を作り上げることができるからである。
PE37/TGFαのＢヘリックス（アミノ酸287−308）へと導かれるアミノ末端リーダー配列（MWEQLEQ）（SEQ ID No.13）の存在は完全細胞障活性にとって重要である。PE37/TGFαのアミノ末端からの2,4又は７個のアミノ酸の欠損を有する突然変異タンパク質はPE37/TGFαよりも活性が弱い。EGFレセプターに対する結合について補正したとき、12〜25倍の細胞障害活性の損失が、２又は４個のアミノ末端アミノ酸を欠く突然変異体において認められた。これらのアミノ末端欠損突然変異体はそれぞれ１個のグルタミン及び正味の負帯電を保持している。補正した細胞障害性において更に10倍の低下が７個のアミノ酸の欠損により認められた。
II. 35KDのカルボキシル−末端PEフラグメント及び抗体−PE融合タンパク質の構築。
A. 材料及び細胞系−何らかのことわりのない限り、材料及び細胞系は先の実施例のもとで記載したものと同一の起源より入手した。
B. 増幅−オリゴヌクレオチドC9及びC2（表１参照のこと）をDNA合成装置（Applied Biosystems）を用いて構築した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は鋳型としての10ngのプラスミドDF1（上記）及び製造者の仕様書（Gene Amp:Perkin−Elmer Cetus Instruments,Norwalk,CT）に従う試薬を用い、５％のホルムアミド（Fluka Chemika）及び100pmolのプライマーC9とC2の存在下で実施した。各PCR反応は94℃で１分の変性、42℃で90秒のアニーリング及び72℃で２分の重合、それに伴う各サイクルにおける10秒の伸長より構成される全部で30のサイクルとした。増幅フラグメントを1.5％の低融点アガロース（Sea Plaque;EMC Corp.,Rockland,ME）で精製した。
C. 細菌株及びプラスミド−上記のHB101をプラスミドの増殖のために用いた。誘発性T7 RNAポリメラーゼをプロファージ上に保有するBL21（λDE3）（これも上記）を融合タンパク質発現のための宿主として用いた。プラスミドCT132は、Nde I−Sac II消化PCRフラグメント（C9及びC2を用いた増殖）の、上記のプラスミドDF1の脱リン酸化3.6kbのNde I−Sac IIフラグメントへの挿入により作った。プラスミドCT11は、ドメインI bからのアミノ酸365−380の欠損を含むPE突然変異体をエンコードするプラスミドCS10（Siegallら、Biochem.30:7154−59（1991））と同一のDNA配列を含むプラスミドの515bpのSal I−BamH Iフラグメントの、プラスミドCT132の3.7kbのSal I−BamH脱リン酸化フラグメントとのリゲーションによって作り上げた。プラスミドCT11をDNA配列決定により確認し、そしてメチオニン及び天然PEのアミノ酸281−364,381−613より成るPE35と称するタンパク質をエンコードする。
D. 組換融合タンパク質の発現及び精製−シュードモナス外毒素タンパク質の発現を、先の実施例に記載の通り、宿主BL21（λDE3）を用いて行った。細胞を、IPTGでの誘発に続いて90分インキュベートした。そのペリプラズマ画分をPE35及びNlys PE38の精製のために用意した。Nlys PE38は、容易に誘導化されるリジンを含む11個のアミノ酸のペプチドが先行するPEのaa 253−364,381−613を含む突然変異PEタンパク質である。Nlys PE38は、先の実施例に記載のPharmacia LKB Biotechnology Inc.FPLCを用いるＱセファロース、モノＱ（HR 5/5;Pharmacia）及びTSK−250（Tosohaas,Montgomeryville,PA）カラムの連続使用により精製した。PE35を含むペリプラズマをＱセファロースから、20mMのトリスpH7.4中の0.26〜0.30μのNaClでの溶離より精製した。その溶離液を、1MのNaClを含む50mMのトリス−アセテートpH7.0中の1mg/mlのCuSO₄で50％飽和となったキレート化性セファロースカラム（Pharmacia）上に注入した。そのフロースルーはほぼ純粋なPE35を含み、それは10mMのEDTA及び10mMのDTTを含むPBS中でのTSK−250カラムにおいてモノマーとして精製された。
Laemmli、前掲の方法を用いるSDS−PAGEをカラム画分を分析するために用いた。PE含有タンパク質の同定はPEと反応性のウサギ血清を用いるイムノブロティングにより確認した。対応の抗体及び基質をVectaキット（Vector Labs）を用いて供した。突然変異PEタンパク質濃度を280nmでの吸収により、1.2ml/mg−cmの励起係数と仮定して決定した。
E. 免疫毒素の構築−1mMのEDTAを含む0.2Mのリン酸ナトリウム（pH8.0）中のNlys PE38（６〜13mg/ml）を５倍過剰量のイミノチオランで誘導し、そして37℃で10分インキュベートした。タンパク質をSephadex G−25（PD10;Pharmacia）で未反応の架橋剤から分けた。誘導化は典型的には、Ellman試薬（Ellman,Arch.Biochem.Biophys.82:70−77（1959）を用いて測定し、Nlys PE38のモル当り0.5モルのチオールを導入した。同様に、1mMのEDTAを含む0.2Mのリン酸ナトリウム（pH＝７）中のNlys PE38（６〜13mg/ml）を３倍過剰量のSMCC（スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）で誘導し、そして22℃で１時間インキュベートした（Yositakeら、J.Biochem.92:1413−1424（1982））。タンパク質をSephadex G−25上で反応体から分離させた。誘導化は典型的にはNlys PE38のモル当り0.5個の反応性基を導入した。PE35を1mMのEDTA及び50mMのDTTを含む0.2Mのリン酸ナトリウム（pH7.0）で保存し、そして抗体にカップリングする前にSephadex G−25でDTTから分離させた。モノクローナル抗体（MAb）B3は、数多くのヒト腫瘍上で見い出せる多糖抗原に対して反応性であり、そして前記の無血清培養培地から精製した。引用することで本明細書に組入れるPastanら、Cancer Res.51:3781−７（1991）。MAb HB21はヒトトランスフェリンレセプターに対して特異的であり、そして前述のHB21を抱えるヌードマウスの腹水から精製した。MAb濃度を280nmでの吸収により、1.4ml/mg−cmの励起係数と仮定して決定した。1mMのEDTAを含む0.2Mのリン酸ナトリウム（pH7.0）中のＢ及びHB21（４〜8mg/ml）を２倍及び４倍過剰量のSMCCそれぞれと反応させ、そして22℃で１時間インキュベートした。誘導化MAbをSephadex G−25を用いて反応体から分離させた。B3及びHB21はそれぞれ分子当り0.83及び1.0個の測定反応性基をこれらの条件下で有していた。Yositakeら、前掲を参照のこと。1mMのEDTAを含む0.2Mのリン酸ナトリウム（pH8.0）中のB3及びHB21（４〜5mg/ml）もそれぞれ２倍又は３倍過剰量のSPDPと反応させ、そして22℃で30分インキュベートした。誘導化MAbをSephadex G−25を用いて反応体から分離させた。B3及びHB21はそれぞれ分子当り0.79及び0.56個の測定反応性基をこれらの条件下で有していた（Carlssonら、Biochem.J.173:723−737（1978））。SPDP又はSMCCのいづれかで誘導化せしめたB3又はHB21をそれぞれ２つのプールに分け、そしてイミノチオラン又は還元PE35で誘導せしめた２〜３倍過剰量のNlys PE38と22℃で16時間反応させた。反応はヨードアセトアミド（Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.）の1mMの最終濃度に至る添加により停止させた。更に、B3をイミノチオランで誘導させた。0.2Mのリン酸ナトリウム（pH8.0）中のB3（５〜10mg/ml）を２倍過剰量のイミノチオランと37℃で１時間インキュベートした。誘導化抗体をSephadex G−25を用いて反応体から分離させた。B3にはこれらの条件のもとで1.0個の反応性基が導入された（Ellman、前掲）。このMAbを、DTNB（5,5′−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）で記載の通り（Fitz Gerald,Meth.Enzymol.151:139−145（1987））に誘導化していおいたPE35と混合した。22℃で２時間のインキュベーション後、反応をシステイン（Pierce）の0.2mMの最終濃度に至る添加により停止させた。同様に、イミノチオランで誘導させたB3を22℃で２時間、SMCCで誘導化しておいたNlys PE38と反応させた。その反応を1mMのヨードアセトアミドで停止させた。免疫毒素を41Q（HR 5/5）及びTSK−250カラムの連続使用により、FPLCを用いて単一ピークとして精製した。
F. ADP−リボシル化アッセイ−タンパク質サンプルのADP−リボシル化活性を、先の実施例に記載の通りに、伸長因子２に富む小麦胚芽抽出物を用いてCollierとKandelの手順により測定した。
G. タンパク質合成阻害アッセイ−タンパク質合成の阻害は先の実施例に記載の通りに実施した。細胞を毒素添加の前に、96穴プレートの中で各ウェル当り15,000細胞において24時間平板培養した。0.2％のBSA−PBSの中に希釈した毒素又はコントロールを200μl/ウェルの最終容量にまで加えた。37℃で16〜20時間のインキュベーションの後、各ウェルに〔³H〕−ロイシン（Amersham;1μCiを0.2％のBSA−PBSの中に10μｌまで希釈）で２時間パルスに付した。凍結後、その細胞をガラスファイバーフィルターで集め、そしてタンパク質の中への放射活性の取り込みをBetaplateシンチレーションカウンター（Pharmacia）で定量した。結果、毒素抜きでインキュベートした細胞の取り込みcpm（分当りのカウント数）の％として算定した。競合アッセイを２μg/mlのEGFの存在下で細胞に付加した毒素を利用して行った。
H. 35KDのカルボキシル−末端フラグメントのデザイン−我々は有用な免疫毒素を作り上げるため、PEの35KDのカルボキシル末端フラグメント（PE35と称す）をモノクローナル抗体に抱合せしめることができるかどうかを調べた。PE35をエンコードするプラスミドをプラスミドCT132を用いて構築した。
プラスミドCT132を、PE37の位置287においてシステインを再導入せしめるPCRフラグメントを用いて構築した。DNA配列決定はこの突然変異が存在していることを確証せしめた。プラスミドCT11は、プラスミドCT132のPEをエンコードするDNA配列を、ドメインI bのアミノ酸365−380の欠損を含むPEをエンコードするDNA配列に置き換えることにより構築した。この欠損はPEタンパク質の細胞障害性には影響しない。従って、プラスミドCT11（ｆ＋Ｔ）はT7プロモーターと、位置280のmet、それに続く天然PEのアミノ酸281−364,381−613をエンコードするDNAとを含む。このプラスミドによりエンコードされるタンパク質（PE35）は位置287において単独のシステイン残基を含む（図７）。PE35をBL21（λDE3）において発現させ、そしてSDS−PAGEでペリプラズマとスフェロプラストとに均等に分布していることが見い出せた。＞95％の均一性に至るペリプラズマからの精製をアニオン交換及びキレート化クロマトグラフィー及びゲル濾過を用いて行った。PE35はSDS−PAGE上で予測の分子量（35KD）であることが認められ、そしてPEに反応性であるウサギ血清と免疫反応性であった。ADPリボシル化活性は、天然PEと同一のADP−リボシル化活性を有する分子であるlys PE40（CollierとKanadel、前掲）のそれと同一である。チオール基の数はEllman試薬を用いて測定したときにモル当り１個見つけられた。細胞系の数に基づいて試験したとき、PE35は標的細胞に特異的に結合できないために非常にわずかな細胞障害活性を有していた。
I. HB21を用いる免疫毒素のデザイン及び活性−PE35が細胞を特異的に標的とすることができるかどうかを調べるため、それを、ヒトトランスフェリンレセプターを認識する抗体MAb HB21（ATCC）に抱合させた。PE35をチオエーテル及びジスルフィド結合の両者を用いて複合させた。PE35を基礎とする免疫毒素と、事前に作られた分子、Nlys PE38とを比較するため、接近可能なリジン残基（図７）を含む11個のアミノ酸ペプチドが先行しているPEのアミノ酸253−364,381−613を含む分子をイミノチオランで誘導化させて遊離スルフヒドリル基を作り上げ、そしてSMCC（チオエーテル結合を供するため）又はSPDP（ジスルフィド結合を供するため）のいづれかで誘導化させたMAbに複合させた。４つの免疫毒素をそれぞれをアニオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過を用いて＞95％の均一性にまで精製した。それらは190,000KDの分子量で泳動し、抗体と毒素との１対１の比を示唆する。還元SDS−PAGEは抗体及び毒素フラグメントの予測のパターンをもたらした。チオエーテル結合を介してPE35に抱合させたHB21（HB21−Ｓ−Ｃ−PE35）を還元してPAGEにかけたとき、それはMAb重鎖（50KD）及びMAb軽鎖（20KD）並びにPE35に結合している重鎖及び軽鎖（ゲル上の高めの分子量バンドに該当）をもたらした。Nlys PE38にチオエーテル結合を介して抱合させたHB21を同様に分析すると、それは重及び軽鎖、並びにNlys PE38に結合している重及び軽鎖をもたらした。ジスルフィド結合を介してNlys PE38に抱合させたHB21（HB21−Ｓ−Ｓ−PE38）は還元されたMAb重鎖及び軽鎖、並びに遊離毒素（38KD）をもたらした。同様に、ジスルフィド結合を介してPE35に抱合されたHB21（HB21−Ｓ−Ｓ−PE35）はMAb重鎖及び軽鎖、並びに遊離毒素（35KD）をもたらした。PEと反応性であるポリクローナルウサギ血清を用いての還元免疫毒素のウェスタンブロッティングは、遊離毒素（ジスルフィドコンジュゲートの場合）又は抗体の重鎖及び軽鎖に結合している毒素（チオエーテルコンジュゲートの場合）の存在を確証せしめた。
次にコンジュゲートをその活性を決定するためにA431及びMCF7細胞に基づいて試験した。PE35に対するジスルフィド結合を採用するコンジュゲートはA431及びMCF7細胞に対して最も活性であった（表４及び図８）。Nlys PE38コンジュゲートはコンジュゲーションの方法に関係なくほぼ同一の細胞障害性を示したが、しかしA431細胞に対してはPE35に対するジスルフィド結合を含むものよりも活性が５分の１であった。PE35を用いて作ったチオエーテルコンジュゲートはPE35を含むジスルフィドコンジュゲートよりも100分の１以下の活性であった。ヒトトランスフェリンレセプターを含まないマウスL929細胞はHB21を含む免疫毒素の毒性作用に耐性であった。更に、A431ヒト類表皮癌細胞系に及ぼす細胞障害性は10μg/mlのHB21を用いて阻害され、この免疫毒素はヒトトランスフェリンレセプターを介して特異的に結合することを示唆する。
J. B3を用いる免疫毒素のデザイン及び活性：
PE35がヒト癌細胞を特異的に標的とすることができるかどうかを調べるため、数多くのヒト癌上に見い出せる多糖類抗原を認識するMAbであるMAb B3にそれを抱合させた（Pastan,Cancer Res.、前掲）。PE35をDTNBで活性化させ、そしてジスルフィド結合を介して、イミノチオランで誘導化させておいたB3に複合させた。比較のため、Nlys PE38（SMCCで誘導化させておいたもの）をB3（イミノチオランで誘導化させておいたもの）に複合させることにより作った免疫毒素を使用した。各免疫毒素をアニオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過を用いて＞95％の均一性にまで精製した。それらは各々約210,000KDの分子量で泳動し、抗体と毒素との１対１の比を示唆する。還元SDS−PAGEは抗体及び毒素フラグメントの予測のパターンをもたらした。チオエーテル結合を介してNlys PE38に抱合させたB3（B3−Ｓ−Ｃ−PE38）は還元されたMAb重鎖（50KD）及び軽鎖（20KD）、並びにPE35に結合しているMAb重鎖及び軽鎖をもたらした。ジスルフィド結合を介してPE35に抱合させたB3（B3−Ｓ−Ｓ−PE35）は還元されたMAb重鎖及び軽鎖、並びに遊離毒素（35KD）をもたらした。還元された免疫毒素のPEに対するポリクローナルウサギ血清を用いるウェスタンブロッティングは遊離毒素（ジスルフィドコンジュゲートの場合）又はMAbの重鎖及び軽鎖（チオエーテルコンジュゲートの場合）の存在を確証せしめた。ジスルフィド結合を含む免疫毒素はA431細胞に対して２倍の活性であり、そしてMCF7細胞に対しては若干活性が強かった（表４及び図９）。KB細胞は両毒素の毒性作用に対して耐性であった（表４）。KB細胞はヒト類表皮癌腫に由来し、そしてATCCから獲得した。同様に、MCF7細胞に対する免疫毒素の活性は900μg/mlのB3により完全に阻害され、免疫毒素がB3抗原に特異的に結合することを示唆する。
MAbがイミノチオランで誘導化され、そしてNlys PE38がSMCCで誘導化されているB3とNlys PE38とのチオエーテルコンジュゲートを、同一のタンパク質であるが誘導剤を逆にしたものを用いて作った同様のコンジュゲートと比較した。興味深いことに、SMCCで誘導化されたB3は、B3がイミノチオランで誘導化されている同一の免疫毒素よりも６〜８分の１の活性であった。同様に、ジスルフィド結合を介してB3に抱合されているPE35を含む免疫毒素は、B3がSPDPで誘導化されているときの方が、B3がイミノチオランで誘導化されているときよりも９分の１の活性であった。HB21を含む免疫毒素の活性に対する誘導化剤の有意義な作用は認められなかった。
PE35はPE37の固有の特徴を有し、そして抗体に容易に抱合させることができる。これは任意287に１個のシステイン残基を含み、従ってチオエーテル又はジスルフィド結合のいづれかを介して抗体に確実に複合させることができる。我々はPE35を用いて作った免疫毒素を、遊離スルフヒドリル基を作り上げるためにイミノチオランで誘導化させたNlys PE38を用いて構築したものと比較した。SMCC又はSPDPのいづれかで誘導化されているMAb HB21を２つのプールに分け、そしてチオエーテル又はジスルフィド結合それぞれのいづれかを採用してコンジュゲートを作り上げるために平行で各毒素と反応させた。誘導化は１対１の比で抗体と毒素とを含む免疫毒素の優勢を確実なものとするために行った。精製した１対１の免疫毒素のみをここで行った分析のために利用した。
予定通り、HB21に対するジスルフィド又はチオエーテル結合のいづれかを用いて作ったNlys PE38コンジュゲートは同程度の毒性を有していた。PE38を含む免疫毒素は細胞死をもたらしめるために細胞質ゾルに到達できるようカルボキシル末端フラグメントを遊離させる２つの重要なプロセシング段階を、コンジュゲーションの方法に関係なく必要とする。…（１）アミノ酸279と280との間でのタンパク質分解プロセシング、及び（２）アミノ酸265と287とにわたるジスルフィド結合の還元。対照的に、ジスルフィド結合を介してPE35に抱合されたHB21はPE38コンジュゲートよりもA431細胞に対して５倍活性であった。細胞質ゾルに到達する各免疫毒素の部分は類似するため（PEのアミノ酸280−264,381,613）、タンパク質分解プロセスはこれらの細胞に対するPE38含有免疫毒素の作用の律速段階がありうる。しかしながら、HB21−Ｓ−Ｓ−PE35は、Nlys PE38を含むコンジュゲートに比してヒト乳癌MCF7細胞系に対する高められた細胞障害性を示さなかった。MCF7細胞はPE38をタンパク質分解することにおいてA431細胞よりも効率的である可能性がある。それ故、PE突然変異性のタンパク質分解はこれらの細胞における律速段階ではないであろう。PE35及びPE38がこの細胞系に対して類似の非特異的毒素を有する事実は（それぞれ200ng/ml、対、300ng/ml）、MCF7細胞がNlys PE38をPE35とほぼ同様にプロセスする考えを裏付けする。
PE35はPEをプロセスする哺乳動物細胞により認識されるタンパク質分解部位を含まないため、チオエーテル結合を介してHB21に結合しているPE35を含む免疫毒素はかなり不活性である。観察される低い度合いの活性はMAb又はPE35内のその他の部位で起こるタンパク質分解プロセシング及び得られるフラグメントの非効率的なトランスロケーションに寄与しうる。
ジスルフィド結合を介してPE35に抱合されたB3を含む免疫毒素も、Nlys PE38に対するB3チオエーテルコンジュゲートよりも活性であった。しかしながら、バイパス式タンパク質分解プロセシングの効果の程度はHB21コンジュゲートで観察されるものより低かった。興味深いことに、MAbを誘導化するのにSMCCを用いて作ったB3コンジュゲートは、MAbがイミノチオランで誘導化され、そしてNlys PE38がSMCCで誘導化されている同じ免疫毒素よりも活性が低かった。これらの試薬は共にアミノ基と反応するが、それらは極性において相違する（イミノチオラン＞SPDP＞SMCC）。非極性反応体SMCCは固有のリジン残基を誘導化し、そして誘導過程の際にB3の重要な結合特性を妨げる。同様に、B3を誘導化するためにイミノチオランを用いて作ったPE35ジスルフィドコンジュゲートはB3を誘導化するのにSPDPを用いたものよりも10倍有能であった。
K. B3−Ｓ−Ｓ−PE35によるインビボ結果
B3−Ｓ−Ｓ−PE35を５μｇのレベルでマウスに静脈内注射した。免疫毒素の血清レベルを20時間にわたり、その血清をA431細胞とインキュベートし、そして前記の通りにタンパク質合成に対する作用を測定することより決定した。標準曲線をコントロールマウス血清に希釈したB3−Ｓ−Ｓ−PE35で作った。図10参照のこと。
ヌードマウスにおける皮下A431腫瘍の増殖に及ぼすB3−Ｓ−Ｓ−PE35の効果を決定した。マウスには０日目にて2,000,000個のA431細胞を、そして５日目にて25μｇのB3−Ｓ−Ｓ−PE35の単独静脈内投与を与えた。立方mmで測定した腫瘍増殖に基づく経時的な結果を図11に示す。免疫毒素は腫瘍の完全な退化をもたらした。
III. 膀胱癌とPE35
膀胱癌と診断された患者は、カルボキシル末端配列KDELを有するPE35/TGFαで、60mlの希釈液中のそのタンパク質を６週間にわたって週に一度カテーテルにより注入することによって処置されうる。この分子はTP40よりも活性が高く、且つ小さいものであり、そして大きい分子よりも膀胱腫瘍の中に浸透し、且つ有効である。
IV. PE35/B3（Fv）/KDELを用いる抗−腫瘍活性
B3抗原（乳、類表皮、胃及び前立腺の癌腫を含む）を抱える腫瘍と診断された患者は、それらの者をカルボキシル末端配列KDELを有するB3FvとのPE35融合タンパク質を構成するPEで、１日当りにて患者当り１〜100mgの用量で静脈内投与することにより処置されうる。「B3Fv」は、重鎖Fvドメインのカルボキシル末端及び軽鎖Fvドメインのアミノ末端において開始する、柔軟リンカー（Gly,Ser）により連結されたMab B3の重及び軽鎖領域を含む配列を称する。これは全て引用することで本明細書に組入れる一般譲渡されたU.S.S.N.07/767,331号に記載されている。このタンパク質をエンコードする遺伝子はPE35遺伝子と融合されている。

Claims (24)

1. 組換シュードモナス外毒素（以下「組換PE」）分子であって、ドメインI aと、ドメインIIの最初の27個のアミノ酸とが欠損しており、そしてメチオニンが当該分子のアミノ末端において存在し、ここで当該メチオニンはドメインIIのアミノ酸位280にあるグリシンを置換している、組換PE分子。
2. 前記分子がドメインI bのほぼアミノ酸365〜380の欠損を更に含んで成る、請求項１記載の組換PE分子。
3. 前記分子がアミノ酸280〜613から本質的に成る、請求項１記載の組換PE分子。
4. 前記分子がアミノ酸280〜364及び381〜613から本質的に成る、請求項１記載の組換PE分子。
5. 前記分子がアミノ酸287においてシステインの代わりにセリンで置換されている、請求項１記載の組換PE分子。
6. 前記分子がその分子のカルボキシル末端において、REDLK,REDL及びKDELから成る群から選ばれるアミノ酸配列を更に含む、請求項１記載の組換PE分子。
7. リガンドに融合した組換PEであって、ドメインI aと、ドメインIIの最初の27個のアミノ酸とが欠損している、組換PE分子。
8. 前記リガンドがほぼアミノ酸位607の後に融合されており、そしてドメインIIIのアミノ酸604−613がそれに続いている、請求項７記載の組換PE分子。
9. 前記リガンドがTGFαである、請求項７記載の組換PE分子。
10. 前記リガンドが抗体又はその結合性フラグメントである、請求項７記載の組換PE分子。
11. 前記リガンドがホルモンである、請求項７記載の組換PE分子。
12. 前記リガンドが成長因子である、請求項７記載の組換PE分子。
13. 前記リガンドが癌細胞レセプターに特異的に結合する、請求項７記載の組換PE分子。
14. アミノ酸280〜364及び381〜613から本質的に成り、この組換PE分子内においてアミノ酸607の後にTGFαが挿入されており、そしてそれにドメインIIIのアミノ酸604−613が続いている、請求項１記載の組換PE分子。
15. 前記組換PE分子がその分子のカルボキシル末端において細胞質内保持配列を含む、請求項７記載の組換PE分子。
16. 組換PE分子であって、ドメインI aと、ドメインIIの最初の27個のアミノ酸とが欠損している分子をコードする核酸配列を含んで成るベクター。
17. 請求項５記載の組換PE分子のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んで成るベクター。
18. 請求項１記載の組換PE分子の配列を発現する宿主細胞。
19. 請求項５記載の組換PE分子の配列を発現する宿主細胞。
20. 組換PE分子であって、ドメインI aと、ドメインIIの最初の27個のアミノ酸とが欠損している組換PE分子及び薬理学的に許容される担体を含んで成る薬理製剤。
21. ヒトを除く患者における腫瘍増殖を阻害するための方法であって、その患者に、その身体腔の中に又は器官の内腔の中に、組換PE分子であって、ドメインI aと、ドメインIIの最初の27個のアミノ酸とが欠損している組換PE分子に融合させた腫瘍細胞に対して特異的なリガンドを投与することを含んで成る方法。
22. 腫瘍を有する患者を治療するための医薬品の製造のための、組換PE分子であって、ドメインI aと、ドメインIIの最初の27個のアミノ酸とが欠損している組換PE分子を含んで成る組成物を利用する方法。
23. 前記組換PE分子が前記腫瘍の細胞上の抗原に対し特異的に結合するリガンドに融合されている、請求項22記載の方法。
24. 前記組換PE分子のアミノ末端においてメチオニンを更にコードし、ここで当該メチオニンはドメインIIのアミノ酸位280にあるグリシンを置換している残基である、請求項16記載のベクター。

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