JPH07508641A - 高められた活性を有する組換シュードモナス外毒素 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 高められた活性を有する組換シュードモナス外毒素本発明は毒性及び治療能を高 めるように改良された組換シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍａｎａｓ）由来の毒 素の製造及び利用に関する。より詳しくは、本発明はシュードモナス外毒素のド メインＩａ及び一定のドメイン■配列の除去で表わされるアミノ酸配列の中の欠 損を含んで成る外毒素に関する。 発明の背景 成長因子、抗体及びその他の細胞標的分子に付加された毒素は特異的なレセプタ ー又は抗原を抱える存置な細胞を殺傷するのに利用されうる（Ｐａｓｔａｎら、 Ｃ［！Ｉ＋　４７　：　６４１　（１９８６）及びＶｉｔｅｔｔａ　ら、５ｃｉ ｅｎｃｅ　２３８　：　１０９８　（１９８７））。有効な治療的毒素にとって の−の見込みのある起源はシュードモナス外毒素Ａである。シュードモナス外毒 素Ａ　（ＰＥ）はシュードモナスアエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅ ｒｕｇｉｎｏｓａ）により分泌される非常に活性な七ツマータンパク質（分子量 ６６ＫＯ）であり、これはＡＤＰリボシル化を触媒すること（酸化ＮＡＤのＡＤ Ｐリボシル成分の伸長因子２　（ＥＦ−２）への転移を触媒）によるＥＦ−２の 不活性化を通じて真核細胞におけるタンパク質合成を阻害する。 この毒素は、協同で細胞障害を引き起こすように作用する３つの構造ドメインを 含む。ドメインＩａ（アミノ酸１−２５２）は細胞結合を媒介する。ドメイン■ （アミノ酸２５３−３６４）は細胞質ゾルへのトランスロケーションにとって重 要であり、そしてドメイン■（アミノ酸４００−６１３）は伸長因子２のＡＰＰ 　リボシル化を媒介し、これはタンパり質を不活性化し、そして死をもたらしめ る。ドメインＩｂ（アミノ酸３６５−３９９）の機能は不明であり続けているが 、しかしその主要部、即ちアミノ酸３６５−３８０は細胞障害性の損失を伴わな いで削除できる。 Ｓｉｅｇａｌｌ　ら、Ｂｉｏｃｈｅｓ＋、　３０　：　７１５４−７１５９　（ １９９１）を参照のこと、ＰＥは、Ｐａ５ｔａｎ　ａｎｄ　ＦｉｔｚＧｅｒａｌ ｄ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５４　：　１１７３−１１７７　（１９９１）に記載 の通り、様々な細胞膜タンパク質を有する細胞を選択的に標的にできうる毒素を 作り上げるために、成長因子、抗体又はＣＤ４と組合されている。 天然のＰＥは特徴的には肝臓不全に基づく死をもたらす。ＰＥを有する免疫毒素 も肝臓を攻撃し、そしてもっと大量（２０〜２５０倍多く）の用量で付与すると 肝Ｒ毒性に基づく死を招いてしまいうる。宿主における非特異的毒性が下がり、 且つ治療効能が高まったＰＥの改良形態が非常に所望されている。細胞結合性ド メインＩａを欠＜ＰＥの変異性は、非特異的な毒性の程度を下げながら有効であ ることが見い出されている。例えば米国特許第４．８９２，８２７号を参照のこ と。 発明の概要 本発明は従来述べられている分子よりも高い活性を示す改良組換えシュードモナ ス外毒素分子を開示する。更に、ここに記載の発見は、サイズにおいてより小さ く、免疫原性が低い傾向にあり、標的細胞の細胞質ゲルに侵入でき、そして腫瘍 の内部に浸透し易いＰＥ分子を作り出すことを可能にする。 細胞障害性とするには、天然ＰＥは細胞内でタンパク質分解的に切断されねばな らない（Ｏｇａｔａ　ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６５　：　２０６ ７Ｂ−２０６８５（１９９０））、この切断はアミノ酸２７９と２８０との間で 起こる。この切断の重要性は、この部位で切断することのできないＰＥの突然変 異形態が無毒であることを示唆する結果で説明されている。Ｏｇａ　ｔａ　ら、 前掲、しかしながら、細胞による切断はあまり効率的でない０本発明は細胞によ る切断を必要としないＰＥ誘導体を構築することにより非効率的な切断の問題を 解消することを狙いとする。かかる［事前切断型ＪＰＥ分子の高められた能力を 有し、その理由は細胞質ゾルに至る活性毒素フラグメントの輸送の効率が高まっ ているからである。 本発明は組換シュードモナス外毒素分子を含み、そのドメインＩａは欠損してお り、そしてそのドメイン■のアミノ末端から最初の２７個のアミノ酸より多くは 欠損していない、好適なＰＥ分子はドメインＨのアミノ酸位置２８０におけるメ チオニンで始まり、ドメインＩｂのおよそのアミノ酸３６５から３８０までの欠 損を含んで成り、そしてアミノ酸位置２８７においてシスティンの代わりとなる セリンの置換を含んでいる。好適な分子には、その分子のカルボキシル末端にお いて、ＲＥＤＩＪ　（Ｓｅｑ、　１０　Ｎｏ、　１４）、　ＲＥＤＬ　（Ｓｅｑ 、　ＩＤ　Ｎｏ、　１５）及びＫＤＥＬ（Ｓｅｑ、　１０　Ｎｏ、　１６）より 成る群から選ばれるアミノ酸配列を有するものも含まれる。典型的なＰＥ分子は ほぼアミノ酸２８０から６１３より本質的に成るか、又はほぼアミノ酸２８０か ら３６４及び３８１から６１３より本質的に成る。 このＰＥ分子はリガンド結合因子、例えば抗体又はその結合性フラグメント、成 長因子、ホルモン、サイトカイン等に融合されていてもよい、このリガンド結合 因子は好ましくはほぼアミノ部位６０７の後に挿入し、そしてアミノ酸６０４− ６１３をリガンドのＣ末端に置く。 我々は、ドメイン■の中の一定の配列のみが結合性タンパク質を細胞質ゾルの中 にトランスロケートさせるのに必要であることを示したため、本発明のＰＥ分子 は様々なペプチドを細胞へと輸送するのに利用されうる。ドメイン■はＰＥ分子 から削除してよく、そしてワクチンとして又は遺伝子治療用途に利用するための その他のペプチドで置き換えられてよい。 このＰＥ分子は、ドメインｌａの欠損及びドメインＨのアミノ末端の中に欠損を 有することによっても特徴付けられ、この分子量よ細胞障害アッセイにおいてＰ Ｅ４０　（以下に説明）よりも標的細胞に対して少なくとも２０倍細胞障害性で ある。ここで、本明細書記載のＰＥ４０及び組換ＰＥ分子の標的細胞に対する細 胞障害性は、その標的細胞に対して、その標的細胞に特異的なりガント結合因子 に融合したＰＥ４０及びこの標的細胞に特異的なりガント結合因子に融合した組 換ＰＥ分子をアッセイすることにより測定する。 このＰＥ分子のアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を含んで成るヘクター及 びこの分子を発現する宿主細胞も考慮する。更Ｇこ、ここに記載の新規分子を有 する、癌及びその他の症状を処置するための薬理製剤及び方法を含む。 図面の説明 図１はＰＥのドメインＨにおいて一定の欠損を示す発現タン／＜り質の模式図で ある。更に、ドメインｌａの全のアミノ酸が欠損してし）る、　ＰＥ配列に広が るアミノ酸の位置に番号を付してし）る。 図２は図１に示す発現タンパク質の５Ｏ５−ＰＡＧＥである。１０％のタンパク 質ゲルをクマジーブルーで染めた。標準品の分子量しよ左縁に示している。 図３は図１に示す発現タンパク質、シュードモナス外毒素のイムノプロント分析 である。標準品の分子量は左縁に示してし）る。 図４は、左側（図４Ａ）においてはＰＥ３７／Ｔ　（白四角）　、ＰＥ　（４Ｅ ）／Ｔ（白三角）及びＰＥ３７Δ３１４−３８０／Ｔ　（黒丸）、並びに右側（ 閲４Ｂ）においてはＰＥ３７／Ｔ　（白四角）　、ＰＥ２８２−６１３／Ｔ（黒 三角）　、ＰＥ２８４−６１３／Ｔ（黒四角）及びＰＥ２８７−６１３／Ｔ　（ 白丸）による、Ａ４３１細胞のタンノぐり質合成阻害を示す。〔３Ｈ〕ロイシン 取り込みを、毒素抜きでインキュヘ−トした細胞のｃｐｓの％として表わしてい る。 図５は、ＰＥ３７／Ｔ　（白四角）　、ＰＥ２８２−６１３／Ｔ（黒三角）　、 ＰＥ２８４−６１３／Ｔ（黒四角）及びＰＨ２８７−６１３／Ｔ　（白丸）によ る阿ＣＦ−７細胞のタンパク質合成阻害を示す。〔３Ｈ〕ロイシンの取り込みを 、毒素抜きでインキュベートした細胞のｃｐ＋ｍの％として表わしている。 図６は、左側（図６Ａ）においてはＰＨ３７／Ｔ　（白四角）　、ＰＥ　（４Ｅ ）／Ｔ（白三角）及びＰＥ３７Δ３１４−３８０／Ｔ（黒丸）、並びに右側（図 ６Ｂ）においてはＰＥ３７／Ｔ　（白四角）　、ＰＥ２８２−６１３／Ｔ（黒三 角）　、ＰＨ２８４−６１３／Ｔ（黒四角）及びＰＥ２８７−６１３／Ｔ（白丸 ）によるＡ４３１細胞からの（”Ｉ）　−ＥＧＦの放出（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅ ｎｔ）を示す、　Ａ４３１細胞に結合している（１！５ｔ）−ＥＧＦをｄｐｍと して測定し、そして毒性抜きでインキュベートした細胞のｄｐｓの％とじて表わ している。 図７゜Ａ　：　Ｉｙｓ　ＰＥ３Ｂに千オニーチル結合により抱合されているＭＡ ｂを含む免疫毒素の模式図である。また、ドメイン■の残基２６５と２８７とに わたるジスルフィド結合も示している。その矢印は、細胞質ゾルへとトランスロ ケートする３７ＫＤフラグメントを作り上げるのに必要とされるタンパク質分解 部位を示している。Ｂ：位置２８７におけるシスティン残基を介するＰＥ３５に 対するジスルフィド結合により抱合されているＭＡｂを含む免疫毒素の模式図で ある。細胞内でのジスルフィド結合の還元は細胞質ゾルにトランスロケートでき る毒素フラグメントを作り上げる。 図８：Ａ４３１細胞に及ぼすｌＢ２１コンジユゲートのタンパク質合成阻害：　 ｌＢ２１−５−Ｃ−ＰＥ３５（黒丸）　、ｌＢ２１−５−Ｃ−ＰＥ３８（黒三角 ）　、）ｌＢ２１−５−５−ＰＥ３８（白四角）及びｌＢ２１−５−５−ＰＥ３ ５（黒四角）。 図９　二ＭＣＦ７細胞に及ぼすＢ３コンジュゲートのタンパク質阻害活性：　Ｂ ５−３−Ｃ−ＰＥ３８（白四角）及びＢ５−５−３−ＰＥ３５（黒三角）０両免 疫毒素は？ＩＡｂをイミノチオランで誘導化することにより構築した。 図１０　：　８３−５−５−ＰＥ３５の血清レベルを、５■ｇの免疫毒素の静脈 内注射の後に決定した。　Ｂ５−５−５−ＰＨ３５のレベルを、血清を４４３１ 細胞とインキュベートし、次いでタンパク質合成に及ぼすその効果を測定するこ とによりアッセイした。標準曲線をコントロールマウス血清で希釈したＢ５−３ −３−ＰＨ３５で作った。 図１１：ヌードマウスにおける皮下Ａ４３１腫瘍の増殖に及ぼす８３−５−Ｓ− ＰＥ３５の作用、動物にはＯ日日において、２，０００，０００個の細胞と、２ ５μｇの８３−３−５−ＰＥ３５（白丸）又は等量の８３　（黒三角）もしくは ＰＥ３５（白四角）もしくはＨ５Ａ含有ＰＢＳ　（黒四角）とを受容させた。棒 線は平均の標準誤差を示している。 詳細な説明 本発明は高められた細胞障害活性を有する組換シュードモナス外毒素に関連し、 それにおいてはドメインＨのアミノ末端の一部が欠損している。この分子は別の 標的分子に結合又は融合されており、従ってその改良型細胞毒素は所望の細胞を 標的とするようになっている。 天然ＰＨは配列１０表Ｎｏ、１に示している０本明細書に記載されている全ての アミノ酸配列の位置は、対照のフレームとしてこの配列表を利用している０例え ば、「本質的にほぼアミノ＃！２８０〜６１３より成るＪＰＥ分子は、配列Ｉｎ 表Ｎｏ、１上のそれに実質的に対応する位置のアミノ酸を有する分子を意味して いる。配列ＩＤ表Ｎｏ、１を対照のフレームとして利用している配列についての 欠損又は置換を示すためにその他の一般的な対照を本明細書では用いている。記 号「Δ」の利用は、その記号の後方のアミノ酸の欠失を意味する０例えば、「Δ ３６５−３８０」とは、ＰＥ分子からのアミノ酸３６５〜３８０の欠損を意味し ている。アミノ酸置換はかっこにより示すことができ、例えば’　（ｓｅｔ２８ ７）　Ｊとは、アミノ酸位置２８７にセリンを有する分子を意味している。アミ ノ酸はここでは時折り、ＩＵＰＡＣ−ＴＵＢ生化学命名協会により推奨されてい る単文字コードによって表わしている。 本発明の数多くのＰＥ分子は、標的細胞に特異的なりガント結合因子と複合され ているとき、標的細胞に対するその高められた細胞障害性により固存に特徴付け られる。この高められた細胞障害性は、天然分子又はドメインＨに有意義な欠損 がないもの、例えば下記の実施例の章並びに引用することで本明細書に組込む一 般譲渡されたＵ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ、　０７／４５９．６３５及びＵ、　Ｓ、　 Ｓ、　Ｎ、　０７１５２２，１８２に記載のＰＥ（４Ｅ）又はＰＥ４０の使用に 比して認められる。細胞障害性の上昇を決定するためのアッセイは、課題のＰＥ 分子とリガンド結合因子とを含んで成る融合タンパク質を、対照のＰＥ分子、例 えばＰＥ４０と前記のりガント結合因子とを含んで成る融合タンパク質と比較す るアッセイである。次に対応の融合タンパク質を、リガンド結合因子に対して特 異的な細胞に対する細胞障害アッセイで試験する。得られるＩＤｓ＊（以下に定 義）は、リガンドレセプターから５０％のラベル化リガンドを放出させる毒素の 濃度を、リガンドレセプターを抱える細胞上の組換毒素のＩＤ３゜で除すること によってその値を調整することにより、細胞障害指数を得るように調整されうる 。次に各ＰＥ分子についての細胞障害指数を比較する。リガンド結合因子として のＴＧＦα及びＥＧＦ　レセプターを抱えるＡ４３１細胞を利用する典型的なア ッセイを下記に捷供する実施例に記載している。ＰＥ４０又はドメインＨの欠損 を有さないことが認められたその他のＰＥ分子よりも約２０倍以上、好ましくは 約６０倍以上、そして最も好ましくは約３００倍以上の適正な細胞障害指数を有 するＰＥ分子が所望される。ドメインＩａを欠＜ＰＥ分子は、ドメインｎ、Ｉｂ 及び■を発現するプラスミドｐＪＤにより発現されうる。プラスミドｐＪＨ８は 引用することで本明細書に組入れる米国特許第４，８９２，８２７号に記載され ており、そしてＲｏｃｋｖｉｌｌｅ。 ＭａｒｙｌａｎｄのＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ ｃｔｉｏｎよりＡＴＣＣ６７２０８として入手できる。 ｒＴＤ％。」は標的細胞の中でのタンパク質合成を５０％阻害する毒素の濃度を 意味し、これは典型的には標準の３■−ロイシン取り込みアッセイにより測定さ れる。放出アッセイ又は競合結合アッセイは公知であり、そして当業界において 述べられている。それらは、標的抗原の結合について、−のペプチドが他のペプ チドと競合する能力を測定する。 好適なＰＥ分子はドメインＩａが欠損しており、そしてドメインＨのアミノ末端 から最初の２７個より多くのアミノ酸が欠損していないものである。これは実質 的にはアミノＭｌから２７ａの欠損を示す。 この欠損によりもたらされる細胞障害性の利点は、下記の欠損があると大いに低 下する：　１−２８１　；　１−２８３　；　ｌ−２８６；及び３１４−３８０ 　、ドメイン■のアミノ末端からの、２９．３１．３３又は３６のアミノ酸では なく、２７のアミノ酸の欠損が、高められた毒素活性をもたらすことは驚くべき ことであり、なぜならこのドメインは毒素の細胞質ゾルへのトランスロケーンヨ ンにとって重要であるからである。 更に、これらのＰＥ分子は、特定の所望の用途のためにこの分子を改変するため に、部位特異的突然変異誘発又はその他の当業界に公知の技術に用いて更に改良 されうる０本明細書に記載のＰＥ分子により供される機能的な長所に実質的に影 響を及ぼさない状況でＰＥ分子を改変せしめる手段も利用してよく、そしてこの ようにして得られる分子は本発明に包括されることを意味する６好適なＰＥ分子 の最大細胞障害特性のため、分子にいくつかの改良を施すことが推奨されている 。この組換分子への適当なカルボキシル末端配列は、この分子の標的細胞の細胞 質ゾルに至るトランスロケーシゴンにとって好適である。作動であると認められ ているアミノ酸配列には、ｌ？Ｅ［１ＬＫ（天然ＰＥにおける）　、Ｉｌｌ！Ｄ ＬもしくはＫＤＥＬ、それらの反復体、又はその他の配列であって小胞体の中で タンパク質を維持もしくは再循環させるのに機能する本明細書でば「細胞質内保 持配列」と称する配列が含まれる０例えば、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ八へ７　：　３０Ｂ−３１２及びＳｅ ｅｔｈａｒａｍら、Ｊ、　Ｒｉａｌ。 Ｃｈｅｗ、　２６６　：　１７３７６−１７３８１　（１９９１）、並びに一般 譲受された１９９０年１月２日提出のｌｌ５ＳＮ　０７／４５９，６３５を参照 のこと、全て引用することで本明細書に組入れる。 ドメインＩｂのアミノ酸３６５−３８０の欠損は活性の損失を伴わずになせうる 。更に、タンパク質の合成が開始されるようにアミノ酸位置２８０でのグリシン に代わるメチオニンの置換及び不適切なジスルフィド結合の形成を防ぐためのア ミノ酸位置２８７でのシスティンに代わるセリンの置換が有利である。 「リガンド結合因子」は一般に、標的細胞上のレセプターと反応する、又はそれ を認識又はそれと結合することのできる全ての分子を意味する。かかる結合因子 の例には、限定することなく、抗体、成長因子、例えばＴＧＦα、　ＩＬ２．　 ＩＬ４．　ＩＬ６．　ＩＧＦＩ又はＣ０４、リンホカイン、サイトカイン、ホル モン等であって所望の標的細胞に特異的に結合するものが含まれる。 「抗体」なる語には、様々な改良又は改変抗体、例えば完全イムノグロブリン、 軽鎖及び重鎮の可変領域のみを含むＰｖフラグメント、可変領域及び一部の定常 領域を含むＰａｂもしくは（Ｆａｂ）　’　ｘ、−重鎮抗体（Ｂｉｒｄら、５ｃ ｉｅｎｃｅ　２４２．４２４−４２６　（１９８Ｂ）　；　Ｈｏ５ｔｏｎら、Ｐ ｒｏｃ。 Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５．５８７９−５８８３　（１９ ８８））等が含まれる。抗体は動物（特にマウス又はラント）もしくはヒト起源 のもの、又はキメラ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　［ＩＳＡ　８１．６８５１−６８５５（＋９８４））、又はヒト化 （Ｊｏｎｅｓ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３２１．５２２−５２５　（１９８６）及び 公開１１に特許出願＃８７０７２５２）のものであってよい。本発明における利 用にとって適当である抗体の生産方法は当業者によく知られ、そしてＨａｒｌｏ ｗ　＆　ＬａｎｅのＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ ａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 （１９８８）の如きの公開物に記載されている。 本発明の組換ＰＥ分子はリガンド結合因子に、当業者に知られ、且つ利用されて いる任意の方法により融合又はそうでなければ結合させることができうる。これ らの２つの成分は任意の公知の様々な化学手順によって互いに化学結合させるこ とができうる。例えば、その結合はへテロニ価架橋剤、例えばＳＰ叶、カルボジ イミド、グルタルアルデヒド等を介してよい。様々な免疫毒素の製法が当業界に 知られており、そして例えば、共に引用することで本明細書に組入れる、’Ｍｏ ｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　： 　Ａｉ＋ａｉｎｇ　ｔｈｅ　ＭａｇｉｃＢｕｌｌｅｔ　Ｊ　Ｔｈｏｒｐｅら、　 Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｅ ｄｉｃｉｎｅ。 Ａｃａｄｅ＋＊ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、頁１６８−１９０　（１９８２）及びＷａｌ ｄ＋ｇａｎｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ＋　２５２　：１６５７　（１９９１）に見い 出せうる。組換ＰＥ分子を抗体と一緒に用いるためには、アミノ酸位置２８７に おいてシスティンを有するＰＥ分子が、その毒素を抗体又はその他のりガントに システィンのチオール成分を介して複合させるのに好ましい。 このＰＥ分子は、Ｅ、コリ（大腸菌）の中での一本鎖抗体の生産を通しての如き の組換手段によってリガンド結合因子に融合させてもよい。タンパク質をエンコ ードする遺伝子は、当業者に知られる任意のクローニング手順によってｃＤＮＡ 又はゲノム形態においてクローンさせることができうる。例えばＳａｍｂｒｏｏ ｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ ａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　（１９８９）を参照のこと。 リガンド結合因子、特にＴＧＦα（形質転換成長因子α）の如きの小さめの因子 は、ＰＥ分子のドメイン■内の位置に挿入するのが所望される。最も好ましくは 、このリガンド結合因子はＰＥ分子のほぼアミノ酸位置６０７と６０４　との間 に融合させる。このことは、そのリガンド結合因子がこの分子のほぼアミノ酸６ ０７の後ろに挿入されており、そしてＰＥの適当なカルボキシル末端が、ＰＥの アミノ酸はぼ６ｏ４−６１３をこの結合因子の後ろに置くことにより再生された ことを意味している。従って、このリガンド結合因子は組換ＰＥ分子の中でほぼ アミノ酸６０７の後ろに挿入され、そしてドメイン■のアミノ酸６ｏ４−６１３ がそれに続く。所望の抗体由来の■、及びＶＨｒｔｌ域もドメイン■内に一本鎖 形態で挿入してよい。 結合因子は、全て引用することで本明細書に組入れるＨｅｉ＋ｗｂｒｏｏｋら、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　’ＵＳＡ、　８７　：　４ ６９７−４７０１　（１９９０）及び一般譲渡された１９９２年４月８日提出の υ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ、　０７／８６５，７２２及び１９９０年５月１４日提出 （７）Ｕ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ、　０７１５２２，５６３ニ記載（ＤＴＧＦｔｘ／ ＰＥ４０分子（ＴＰ４０とも称する）として知られるものにおいて成し遂げられ ている通りにドメインＩａの代わりに挿入してもよい。 当業者は、リガンド結合因子及びＰＥ遺伝子に追加の改良、欠損、挿入等を施し てよいことを認識するであろう、特に、標的細胞に対する融合タンパク質の細胞 障害性を高めるために、又は抗体についての抗原を有さない細胞に対する非特異 的な細胞障害性を低めるために、ＰＥの中に、又は抗体遺伝子をＰＥに連結する リンカ−の中に、欠損又は変更を施すことができうる。かがる構築体は全て、当 業者によく知られている遺伝子工学の方法により作られることができ、そしてそ れらを様々な臨床又は生物系的用途にとって極めて適当なものに仕上げる親和性 、特異性、安定性及び毒性の様々な性質を有するタンパク質を産生せしめうる。 ＰＥ分子を含む本発明の融合タンパク質は様々な宿主細胞、例えばＥ、コリ、そ の他の細菌宿主、酵母、並びにその他の高等真核細胞、例えばＣＯ５，（：ＨＯ 及びＨｅＬａ細胞系及びミエローマ細胞系において発現されうる。その組換タン パク質遺伝子は各宿主にとって適切な発現コントロール配列に作動連結されてい るであろう。Ｅ、コリにとっては、これにはプロモーター、例えばＴ７．　Ｔｒ ｐ又はラムダプロモーター、リポソーム結合部位及び好ましくは転写終結シグナ ルが含まれる。真核細胞にとっては、そのコントロール配列にはプロモーター、 及び好ましくはイムノグロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウィルス等に 由来するエンハンサ−１並びにポリアデニル化配列が含まれ、そしてスプライス ドナー及びアクセプター配列が含まれうる０本発明のプラスミドはよく知られて いる方法、例えばＥ、コリにとっての塩化カルシウム形質転換並びに哺乳類細胞 にとってのリン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションによって特定の宿 主細胞の中に移入することができうる。プラスミドにより形質転換された細胞は 、プラスミド上に含まれるａｍｐ、　ｇｐｔ、　ｎｅｏ及びｈｙｇ遺伝子の如き の遺伝子により授けられる抗生物質に対する耐性により選別されうる。 発現したら、この組換融合タンパク質は当業界の標準の手順、例えば硫酸アンモ ニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動 等に従って精製されうる（一般的には、Ｒ，５ｃｏｐｅｓ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　 Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎ、　Ｙ、 （１９８２）を参照のこと）、少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純 粋な組成物が好ましく、そして９８〜９９％又はそれより高い均一性が薬理用途 にとって最も好ましい０部分的に、又は所望の均一性にまで精製したら、そのポ リペプチドは治療的に使用されうる。 本発明の組換融合タンパク質及び薬理製剤は非経口投与、例えば静脈内投与、又 は身体の腔もしくは器官の内腔への投与にとって特に有用である。投与のための 製剤は一般に薬理学的に許容される担体、好ましくは水性担体の中に溶解されて いるＰＥ分子融合タンパク質の溶液を含んで成るであろう。様々な水性担体、例 えば緩衝食塩水等が使用されうる。これらの溶液は無菌であり、そして一般に不 要の物質を含まない、これらの製剤は慣用のよく知られた除菌技術によって除菌 されうる。これらの製剤は、生理学的条件に近づけるための必要な薬理学的に許 容される補助物質、例えばｐＨ１８！整及び緩衝剤、毒性調整剤等、例えば酢酸 ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム 等を含みうる。これらの製剤の中での融合タンパク質の濃度は幅広く変えること ができ、そして主に流体容量、粘度、体重等に基づき、選ばれた投与の特定の態 様及び患者の要望に応じて選ばれるであろう。 従って、静脈内投与にとっての典型的な薬理製剤は１日当り、患者当りで約０． １〜１０ｍｇであろう、１日当り、患者当りで０．１〜約１００ｍｇの用量は、 特にその薬剤を血管ではなく隔離部位、例えば身体の腔又は器官の内腔に投与す るときに利用されうる。非経口投与用製剤を調製するための実際の方法は当業者 に公知又は自明であり、そしてＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ ｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ第１５版、Ｍａｃｋ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐ ａｎｙ、　Ｅａｓｔｏｎ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ　（１９８０）の如きの 公開物に詳しく記載されている。 本発明の融合タンパク質又はそのカクテル（即ち、その他のタンパク質との）を 含む製剤は治療的処置のために投与されうる。治療的用途においては、製剤は疾 患に苦しむ患者に、その疾患を及びその合併症を治癒させる又は少なくとも部分 的に緩和させるのに十分な量で投与される。これを達成させるのに適当な量を「 治療的に有効な量」と定義する。この用途にとって有効な量は疾患の症度及びそ の患者の健康の一般的な状態に依存するであろう。 該製剤の一回又は複数回の投与を、患者に必要とされ、且つ許容される用量及び 頻度に応じて投与せしめてよい、あらゆる事態においても、この製剤はその患者 を効果的に処置するのに十分な量の本発明のタンパク質を供すべきである。 本発明の組換融合タンパク質の用途の中にはとりわけこのタンパク質の毒性作用 によって排除されうる特定のヒト細胞により引き起こされる様々な疾患症状が含 まれる。−の好適な用途は例えばりガント結合因子としてのＴＧＦαの利用によ る癌の処置、又はＴ及びＢ細胞により生ずる自己免疫症状、例えば移植片一対一 宿主疾患、器官移植拒絶、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、全身 性エリテマトーデス、重症筋無力症等の処置である。この融合タンパク質はイン ビトロで、例えば移植する前での骨髄からの存寄な細胞の排除にも利用されうる 。融合タンパク質のりガント結合因子部分は意図する用途に従って選ぶ、結合因 子にとっての標的として働きうるＴ細胞の膜上のタンパク質にはＣＤ２　（Ｔｌ ｌ）、　ＣＤ３．　ＣＤ４及びＣＤ８が含まれる。標的として働きうるＢ細胞上 に主に見い出せるタンパク質にはＣ［１１０（ＣＡＬＬＡ抗原）　、ＣＤ１９及 びＣＤ２０が含まれる。　ＣＤ４５はリンパ球様細胞上に幅広く認められる、可 能性のある標的である。結合因子にとってのこれら及びその他の可能性のある標 的リンパ球抗原は、Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　Ｔｙｐｉｎｇ　ｆｉｒ、　Ａ、　Ｊ、 　ＭｃＭｉｃｈａｅｌ　Ｗ、　０ｘｆｏｒｄｔｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓ ｓ、　１９８７に記載されている。この結合因子にとっての標的として働きうる 癌細胞上に見い出せる抗原には、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、トランスフェリンレ セプター、Ｐ−塘タンパク譬、Ｃ−ｅｒｂＢ２　、及び癌についてのモノクロー ナル抗体免疫抱合体の第３回国際会議（Ｔｈｉｒｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ＡｎｔｉｂｏｄｙＩ ｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ）　（サンディエゴ、 カリフォルニア。 １９８８年）の誓約書に記載の抗原が含まれる。当業者は、上記の細胞以外のそ の他のタイプ上で発現されるレセプター、例えば脱糖タンパク質又は成長因子又 はホルモンレセプター、例えば表皮成長因子レセプター等に結合するりガント結 合因子を選択できうることを理解しているであろう。 ここに記載のＰＥ分子、そして最良には以下に記載のＰＥ３７及びＰＥ３５によ り代表されるものは、遺伝子治療用途におけるシグナル配列として、又は例えば ワクチンの使用に伴うときのようにシグナル配列が有用となるその他の用途にお けるシグナル配列としても働くであろう。かかる用途においては、ＰＥ分子のド メイン■のかなりの欠損が所望の抗原に置き換えられていてよい、「ドメイン■ のかなりの欠損」とは、ドメインの大部分が欠損している、即ちそのドメインの 機能が不活性化されている、又は破壊されていることを意味する。 この分子におけるドメイン■のほぼアミノ酸６０４−６１３の保持は非常に所望 される。 例えば、ＡＩＤＳ又は癌を処置するワクチンを作るためには、所望のタンパク質 の一部をドメイン■の・場所に挿入してよく、そしてリガンドは組換タンパク質 を抗原表示細胞に結合させるように所望のタンパク質とＰＥのカルボキシル末端 との間に挿入する。遺伝子治療にとっては、ＤＮＡ配列はドメイン■の場所に挿 入してよい。 這■Ω二敢定ｌ 「組換」とは、課題の産物が遺伝子の新たな又は非天然的な組合せに至る操作の 結果物であることを意味する。 「ベクター」とは、ＤＮＡ配列、典型的にはプラスミド又はウィルス形態におけ るＤＮＡ配列であり、これは宿主の中で複製することが可能である。ベクターは ＤＮＡ配列を輸送又は操作するのに利用できうる。「発現ベクター」には、その 中に含まれているＤＮＡ配列を発現させてタンパク質産物を産生ずることのでき るベクターが含まれる。コード配列はその発現を及ばしめることのできる別の配 列、例えばプロモーター及びエンハンサ−に連結している。 「有意義な毒性抜きで」なる表現は、本発明の融合タンパク質が、標的でない細 胞の機能を任意の感知できる程度に、又は任意の異常なレベルにまで影響を及ぼ さないことを意味する。 以下の実施例は例示のために提供し、本発明を限定する意図はない。 実」１舛 １．３７にＤのカルボキシル−「ＰＥフーグメントのＡ、材料−制限エンドヌク レアーゼ及びＤＮＡ　リガーゼを、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　（ Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍ＾）、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＯ）、又はＢｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ＋ｗ　（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ。 ＩＮ）より人手した。ＰＥ　（４Ｅ）　／、ＴＧＦＡ　（時折りＰＥ”−ＴＧＦ αとも呼ぶ）はＲ，Ｋｒｅｉｔｍａｎからの贈呈品である。　Ｋｒｅｉｔｍａｎ ら、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｌｌ、　３　：　５８−６２　（１９９２ ）及びＫｒｅｉ　ｔＩＩｌａｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｗ、　３ 　：６３−６８　（１９９２）を参照のこと。これらは共に引用することで本明 細書に組入れ、そして共にｒＫｒｅｉｔｍａｎらＪと本明細書において称する。 これはＫｒｅｉｔｍａｎらに記載の通り、アミノ酸５７．２４６．２４７及び２ ４９が全てグルタミン酸に置き換えられ、ＴＧＦαがアミノ酸６０７の後ろに置 かれ、そしてＰＥの適当なカルボキシル末端がＰＥのアミノ酸６０４−６１３を ＴＧＦαの後に置くことにより再生されている突然変異した不活性の天然結合ド メインを有する全長ＰＥである。 Ｈｕｔ　１０２細胞はＴ、　Ｗａｌｄｗ＋ａｎ、　Ｌｅｏｎａｒｄらからの贈呈 品である（Ｎａｔｕｒｅ　３００　：　２６７−２６９　（１９８２））。その 他の細胞系は全てＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）に由来する。 Ｂ、増幅−オリゴヌクレオチドＣ１，Ｃ２，Ｃ７及びＣ８は表１に詳細しており 、そしてこれらはＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓＬｅ＋ｓｓ、 　Ｉｎｃ、。 Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）を用いて構築した。ポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）の反応は鋳型としての１０ｎｇのｐＣＴ４　（下記の参照）及び製造者 の仕様書　（Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ　：　Ｐｅｒｋｉｎ−ＥＩ＋ｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ 　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ＋　ＣＴ）に従う試薬を用い、５％ のホルムアミド（Ｐｌｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｋａ、　Ｒａｎｋｏｋｏｍａ。 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）及び１００　ｐｍｏｌのプライマーＣ１とＣ２、又はＣ７と Ｃ２、又はＣ８と０２の存在下で実施した。各ＰＣＲ反応は９４°Ｃで１分の変 性、４２°Ｃで　・９０秒のアニーリング及び７２°Ｃで２分の重合、それに伴 う各サイクルにおける１０秒の伸長より構成される全部で３０のサイクルとした 。増幅フラグメントを１．５％の低融点アガロース（Ｓｅａ　Ｐｌａｑｕｅ　； 　ＦＭＣＣｏｒｐ、、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　ＭＥ）で精製した。 表１：ＰｃＲに用いた、又はオリゴヌクレオチド二本鎖を作るのに用いたリンカ −配列及びオリゴヌクレオチドＣ１：　５’−ＡＴＧ　ＴＧＧ　ＧＡＡ　ＣＡＡ 　ＣＴＣＧＡＧ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＧＧＣＴＡＴ　ＣＣＧ　ＧＴＧ　ＣＡＧＣ− ３’　（Ｓｅｑ、　１０　Ｎｏ、　２）Ｃ２：　５’−ＧＧＧ　ＣＡＣＣＧＴ　 ＴＧＣＧＧＡ　ＴＣＣＧＧＣＣＧＣＧＴＧ　ＣＧＴ−３゜（Ｓｅｑ、　１０　Ｎ ｏ、　３） Ｃ７：　５°−ＧＡＴ　ＡＴＡ　ＣＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　Ｃへへ　Ｃ ＴＣＧＡＧ　ＣＡＧ　ＡＧＣＧＧＣＴＡＴＣＣＧ　ＧＴＧ−３°　（Ｓｅｑ、　 ＩＤ　Ｎｏ、　４）Ｃ８：　５’−ＣＡＡ　ＡＴＧ　ＴＧＧ　ＧＡＡ　ＣＡＴ　 ＡＴＧ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＡＧＣＧＧＣＴＡＴ　ＣＣＧ　ＧＴＧ−３’（Ｓｅｑ 、　１０　Ｎｏ、　５） Ｃ９：　５°−ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＡＴＡ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＴＧＧ　Ｇ ＡＡ　ＣＡＡ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＴＧＣＧＧ−３’（Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、　 ６） ５１　：　５’−ＴＡＴ　ＧＴＧ　ＧＧＡ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　ＣＧＡ　ＧＣＡ　 ＧＡＧ　ＣＧＧ　ＣＴＡ　ＴＣＣＧＧＴ　ＧＣＡＧＣＧ　ＡＣＴ　ＡＧＴ　ＡＧ ＣＧＣＴ　ＣＴＡ　ＣＣＴ　ＧＧＣＧＧＣＧＣＧ　ＧＣＴ　ＧＴＣＧＴＧＧＡＡ 　ＣＣＡ　ＧＧ−３’　（Ｓｅｑ、　１０　Ｎｏ、　７）Ｓ２　：　５’−ＴＣ Ｇ　ＡＣＣＴＧＧ　ＴＴＣＣＡＣＧＡＣＡＧＣＣＧＣＧＣＣＡＧＧ　ＴＡＧ　Ａ ＧＣＧＣＴＣＣＴ　ＡＧＴ　ＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＧＡ　ＴＡＧ　ＣＣＧ　ＣＴ ＣＴＣＧ　ＡＧＴ　ＴＧＴ　ＴＣＣＣＡＣＣ−３’　（Ｓｅｑ、　ｒＤ　Ｎｏ、 　８）Ｓ３　：　５’−ＴＣＧ　ＡＣＣＡＧＧ　ＴＧＡ　ＴＣＣＧＣＧ　ＧＣＣ −３“（Ｓｅｑ、　１０　Ｎｏ、　９） Ｓ４　：　５’−ＧＧＴ　ＣＣＡ　ＣＴＡ　ＧＧＣＧ−３’（Ｓｅｑ、　１０　 Ｎｏ、　１０） Ｓ５　：　５’　ＴＡＴ　ＧＣＴ　ＧＣＡ　ＧＧＧ　ＴＡＣＣＡＡ　ＧＣＴ　３ ’３’　Ａ　ＣＧＡ　ＣＧＴ　ＣＣＣＡＴＧ　ＧＴＴ　ＣＧＡＴＴ　５″（Ｓｅ ｑ、　１０　Ｎｏ、　１１） Ｃ１細菌株及びプラスミド−Ｅ、コリ株ＨＢＩＯＩをプラスミドの増殖のために 用いた。プロファージ上に誘発性Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有する。 Ｅ、コリ株ＢＬ２１　（スＤＥ３）　（Ｓｔｕｄｉｅｒ　＆　Ｍｏｆｆａｔｔ。 Ｓ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１８９　：　１１３−１３０　（１９８６））を 融合タンパク質発現のための宿主として用いた。プラスミド４７３５／４Ｅは既 に述べられている（Ｋｒｅｉ　ｔＩｌ＋ａｎら、前掲）。これはアミノ酸６０７ の後ろに挿入されているＴＧＦαをエンコードする遺伝子を含む、アニールさせ たオリゴヌクレオチドＳＬ及びＳ２　（表１）の、アミノ末端において追加のリ ジンを含むＰＥ４０の誘導体ＮＬｙｓＰＥ４０をエンコードするプラスミドＭＳ ８の４．２　ｋｂ　（キロベース）のＮｄｅ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉフラグメントへ の挿入により作り上げたプラスミドＤＰＩを、１１８１０１株の中で増殖させた 。プラスミドＭＳ８は、Ｎｄｅ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼで線状化したプラス ミドｐＶＣ８ｆ（＋）　Ｔ　（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、＋　ＵＳＡ８５　：　２９３９−２９４３　（１９８ ８）　；引用することで組入れる）にオリゴヌクレオチド二本鎖をリゲートする ことにより調製した。そのリンカ−の配列は表１の３５に見い出せる。その配列 は、引用することで本明細書に組入れるＳａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５　：　２６５９−２６６３　（１９７ ７）に記載の方法でのＤＮＡ配列決定（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、　Ｕ、　Ｓ。 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｃ１ｅｒｅｌａｎｄ＋　０ｈｉｏ）により確認した 。このプラスミドＤＰＩは、開始メチオニン、それに続く天然ＰＥのアミノ酸２ ８１−６１３を含むＰＥ３７と呼ぶ３７ＫＤのタンパク質をエンコードする０位 置２８７におけるシスティンはセリンで置き代わっている。プラスミドＤＰＩは Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄの＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに１９９２年６月１２日寄託され、そしてＡ ＴＣＣＮｏ、　が付与されている。プラスミドＣＴ４　（ｐＣＴ４）は、プラス ミド４７３５／４Ｅの５５１　ｂｐ　（塩基対）のＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩフ ラグメントと同一の［ｌＮＡフラグメントと、プラスミドＤＰＩの３．６　ｋｂ のＢａｗＨＩ　−ＥｃｏＲＩ脱リン酸化フラグメントとのりゲートによって作っ た。プラスミドＣＴ４はＰＨ３７／ＴＧＦα（ＰＥ２８０−６１３／ＴＧＰα） と呼ぶタンパク質をエンコードする。 ＰＥ３７欠損突然変異体は、プラスミド叶１の中に見い出せるＮｄｅ　１−５ａ ｃＵ制限部位へのＮｄｅ　Ｉ　−Ｓａｃ　Ｕ消化ＰＣＲフラグメントの挿入によ り作り上げた。プラスミドＣＴ２は位置２８２のメチオニン、及び位置２８７を 除く天然ＰＥのアミノ酸２８３−６１３をエンコードする。プラスミドＣＴ３は 位置２８４のメチオニン、及び位Ｗ２８７を除く天然ＰＥのアミノ酸２８５−６ １３をエンコードする。プラスミドＣＴ１４は位置２８７のメチオニン、及び天 然ＰＥのアミノ酸２８８−６１３をエンコードする。 ＰＥ３７に由来するアミノ酸３１４−３８０の内部欠損を含むプラスミドＣＴ８ を、アニールさせたオリゴヌクレオチドＳ３及びＳ４　（表１）の、プラスミド ＤＰＩの３．９　ｋｂの５ａｉｌ−＾ｐａｌルミｌフラグメント入により作った 。４つのプラスミド全ての配列をＤＮＡ配列決定により確認した。全ての突然変 異プラスミドをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで制限消化し、そしてプラスミドＶＣ ４７３５／４Ｅの５５１　ｂｐのＢａｎ＋）Ｉ　Ｔ　−ＥｃｏＲＩフラグメント と同一のＤＮＡフラグメントにリゲートさせて突然変異プラスミドＣＴ２／Ｔ、 　ｐＣＴ３／Ｔ、　ｐｃＴ１４／Ｔ及びｐＣＴ８／Ｔを作り上げた。これらのプ ラスミドを制限分析により確認したところ、ＰＥ２８２−６１３／　ＴＧＰα、 ＰＥ２８４−６１３／　ＴＧＦα、ＰＥ２８７−６１３／　ＴＧＦα及びＰＥ３ ７Δ３１４−６８０／　ＴＧＦαそれぞれをエンコードする（図１）。 Ｄ、　＆Ｉｌｌ換融合タンパク質の発現及び精製−シュードモナス外毒素を含む 融合タンパク質の発現は、先に記載されている通りに（Ｓｉｅｇａｌｌ　ら、　 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５　：　９７３８−９７４ ２（１９８８）　；　Ｃｈａｕｄｈａｒｙ　ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｊ、ＵＳＡ　８４　：　４５３８−４５４２　（１９８７）　；及びＣ ｈａｕｄｈａｒｙ　らＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 　８５：　２９３９−２９４３　（１９８８）　：全て引用することで本明細書 に組入れる）宿主Ｅ、コリ株ＢＬ２１　（λＤＥ３）を用いて行った。細胞を、 ＩＰＴＧ　（イソプロピルチオガラクトシド）による誘発の後に９０分インキュ ベートした。そのベリプラズマ画分をプラスミドＤＰＩ由来の突然変異タンパク 質のために用意した。　ＴＧＦαドメインを含むタンパク質に関しては、融合タ ンパク質はＫｒｅｉ　ｔｗａａｎら、前掲に記載の通り封入体から精製した。 グアニジンで抽出し、そしてＰＢＳへの急速希釈により再生させたペリプラズマ 又は封入体を、Ｐｈａｒ＋ｎｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ、　Ｉ ｎｃ。 （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）　ＦＰＬＣを用い、Ｑセファロース、モノＱ 　ＨＲ５１５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ、　Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｃａｔａｗ ａｙ、　ＮＪ）又はＰｏｒｏｕｓ　Ａ／Ｆ　（ＰｅｒｃｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｔ、　ＮＡ）及びＴＳＫ−２５０カラムの連続 使用により精製した。引用することで組入れるＬａｅ＋＋ｎｌｉ、　Ｎａｔｕｒ ｅ　２２７　：　６８０−６８５（１９７０）に記載の５Ｏ５−ＰＡＧＥをカラ ム画分を分析するために用いた。 ＰＥ含有タンパク質の同定は、ポリクローナルウサギ抗−ＰＥ抗血清及びＶｅｃ ｔａｓｔａｉｎキット（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ＋　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ＋　 Ｃａ）を用いるイムノブロッティングにより確認した。 Ｅ、タンパク質合成■害アッセイータンパク質合成の阻害は引用することで本明 細書に組入れるＰｒ１ｏｒら、Ｃｅ１ｌ　６４　：　１０１７−１０２３（１９ ９１）に記載の通りに実施した。細胞を毒素添加の前に、９６穴プレートの中で 各ウェル当り１５．０００細胞において２４時間平板培養した。 ０．２％のＢＳＡ−ＰＢＳ（生血清アルブミンーリン酸緩衝食塩水）の中に希釈 した毒素又はコントロールを２００μｌ／ウエルの最終容量にまで加えた。３７ °Ｃで１６〜２０時間のインキュベーションの後、各ウェルに〔コＨ］−ロイソ ン（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、 　ＩＬ　：１μＣｉを０．２％のＢＳＡ−ＰＢＳの中に１０μｌまで希釈）で２ 時間パルスに付した。凍結後、その細胞をガラスファイバーフィルターで集め、 そしてタンパク質の中への放射活性の取り込みをＢｅｔａｐｌａｔｅシンチレー ノヨンカウンター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　ＬＫＢ）で定量した。結果は、毒素 抜きでインキュベートした細胞の取り込みｃｐｓ’（分当りのカウント数）の％ とじて算定した。競合アンセイを２μｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下で細胞に付加し た毒素を利用して行った。 Ｆ、　ＡＤＰ−リボシル化アッセイ−タンパク質サンプルのＡＤＰ−リボシル化 活性を、伸長因子２に冨む小麦胚芽を用いてＣｏ１１ｉｅｒとＫａｎｄｅｌの手 順により測定した。引用することで本明細書に組入れるＪ、　Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｗ、　２４６　：　１４９６−１５０３　（１９７１）。 Ｇ、（”’Ｉ）−ＥＧＦ放出研究−＾４３１細胞（ヒト表皮癌細胞）を２４穴プ レートの中で１ｍｌの培地中で、ウェル当り８，０００個の細胞において平板培 養した。２４時間後、これらの細胞を結合バッファー（５０ｍＭのＭＥＳ、　ｐ Ｈ６，８、及びＢＳＡ　１ｍｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ　）で２回洗い、そして０ 、０．８．４．２０又は１００　ｐｍｏｌの毒素のいづれかと組合せた（＋ｚｓ ｌ）−ＥＧＦ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ＋　Ｉｎｃ、、Ｂｏ ｓｔｏｎ、ＭＡ）　０．５Ｈｇ　（０，０５μＣｉ）を含む結合バッファ−２０ ０μｍで処理した。４°Ｃで口・フカ−上で９０分平衡にした後、それらの細胞 を結合バッファーで洗い、０．５％のｓｏｓ及び１ｍＨのＥＤＴＡを含む１０ｍ Ｍのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，４で溶解し、そして結合リガンドをガンマ−検 出器で計測した。 Ｈ１３１ＫＯのカルボキシル−末端フラグメントのデザイン−ＰＨの３７ＫＯの カルボキシル−末端フラグメント（ＰＥ３７）が細胞質ゾルへとトランスロケー トされ、そしてタンパク質合成を抑制しているかどうかを調べるため、我々は位 置２８０においてグリシンの代わりにメチオンで始まり、それに天然ＰＥのアミ ノ酸２８１−６１３が続くタンパク質をエンコードするプラスミドＤＰＩを構築 した。天然ＰＥにおいて、メチオニンによるｇｌｙ　２８０の交換は細胞障害性 を低めない、更に、システィン２８７をセリンに変え、不適切なジスルフィド結 合の数を減らした。その結果、ＰＨ３７はドメインｒｂにおいて位Ｗ３７２及び ３７９に位置する２個のシスティン残基のみを有する。プラスミド叶ｌのＤＮＡ 配列決定はそれが所望の配列を有することを確証せしめた。プラスミドＤＦＩの 中に存在しているＴ７プロモーターを用いることにより、ＰＥ３７はＢＬ２１　 （λＤＥ３）の中で発現され、そして細胞画分を５Ｏ５−ＰＡＧＥにより分析し たとき、ベリプラズマとスフェロプラストとに均等に分布していることが認めら れた。毒素をペリプラズマから、アニオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過 を利用して〉９０％の均一性にまで精製した。その精製タンパク質は５ＯＳ−Ｐ ＡＧＥ上で予測の分子量（３７ＫＤ’）を有し、そして抗−ＰＥ抗体と免疫反応 性であった（図２及び３）。タンパク質の配列決定は１４個のアミノ末端アミノ 酸を確証した（ＭＷＥＱＬＥＱＳＧＹＰＶＱＲ）　、　ＡＤＰ　リボシル化活性 は、天然ＰＥと同一のＡＤＰ　リボシル化活性を有する分子ＰＥ４０のそれと同 一であった。　Ｋｏｎｄ。 ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６３　：　９４７０−９４７５　（１９ ８Ｂ）を参照のこと、いくつかの細胞系で試験したとき、ＰＥ３７はその標的細 胞に結合できないために非常にわずかな細胞障害活性しか有していなかった。 １、　ＰＥ３７／　ＴＧＦαのデザイン及び活性−ＰＥ３７をそのアミノ末端を 改変することなく細胞を標的化できるようにするため、ＴＧＦαをエンコードす るｃＤＮＡを挿入せしめてＴＧＦαがＰＥ３７のアミノ酸６０７の後ろに置かれ 、且つＰＨのカルボキシル末端が、ＴＧＦαの後にＰＥのアミノ酸（６０４−６ １３）を置くことにより再生されているプラスミドを構築した。この位置に挿入 され、且つ不活性細胞結合ドメインをも含む毒素分子ＰＥ　（４Ｅ）　／ＴＧＦ α（ＰＥ６６４Ｇ”−ＴＧＦαとしても知られる）はＥＧＰ　レセプターを抱え る細胞に対しては非常に細胞障害性である。 Ｋｒｅｉ　ｔｍａｎら、前掲を参照のこと。 構造を図１に示す融合タンパク質ＰＥ３７／ＴＧＦαをＢＬ２１　（λＤＥ３） の中で発現させ、そしてほとんど独占的に封入体の中で見い出された。 このタンパク質を７Ｍのグアニジンの中に溶かし、リン酸緩衝食塩水で再生し、 そしてその他のＴＧＦα含有組換タンパク質について先に記載した通りにアニオ ン交換及びゲル濾過で〉９０％の均一性にまで精製した（Ｋｒｅｉｔｍａｎら、 前掲）　、　５ｏｓ−ＰＡＧＥ上での予測の分子量（４３ＫＤ　）で泳動した精 製タンパク質はＰＥに対する抗体と免疫反応性であり（図２及び３）、そしてそ の他のＰＥ分子と比べたときに完全たるＡＤＰ　リボシル化活性を有していた（ 表２）、その組換タンパク質を様々な数のＥＧＰレセプクーを発現する細胞系に 対して細胞障害性であり、そしてその細胞障害作用は存在するレセプターの数に 相関していた（表３）。更に、ＥＧＦレセプターを有さないＨＵＴ　１０２細胞 はＰＥ３７／ＴＧＦαの毒性作用に耐性であった。Ａ４３１ヒト表皮癌細胞に及 ぼす細胞障害性は過剰のＥＧＦを用いることで完全に阻害され、ＰＥ３７／ＴＧ ＦαはＥＧＦ　レセプターを介して特異的に結合することを示唆する。　Ａ４３ １細胞に対するＰＥ３７／ＴＧＦαのＩ［ｌＳ。は、ドメイン■全体を含む分子 ＰＥ　（４Ｆ）　／ＴＧＦαより低く、従って細胞質ゾルにトランスロケートさ れる前にプロセスされねばならない（図４）。このデーターはＰＥ３７／ＴＧＦ αが非常に活性であり、且つ特異的な組換毒素であることを示唆する。 表２：様々なＰＥ突然変異体の活性の比較ＰＥ３７　ｐＤＦｌ　１００　２５０ 　ＮＤ　ＮＤＰＥ３７／ＴＧＦｃｒ　ｐＣＴ４／Ｔ　１００　０．０２　２０　 １０００ＰＥ２８２−６１３／　ＴＧＦα　ｐＣＴ２／Ｔ　１００　０．５　４ １　８２ＰＥ２８４−６１３／　ＴＧＦα　ｐＣＴ３／Ｔ　１００　０．２５　 １４　５６ＰＥ２８７−６１３／　ＴＧＦα　ｐｃＴ１４／Ｔ　１００　２　１ ２　６ＰＥ（４Ｅ）／ＴＧＦαｐＶＣ４７３５／４Ｅ　１００　０．３　１２　 ４０ＰＥ３５／ＴＧＦα　０．０６　２０　３３３ＰＥ３５／ＴＧＦα＆　ＫＤ ＥＬ　Ｏ，００６９１５００ＰＥ３７／ＴＧＦ　α（ｓｅｔ　２８７）　０．０ ６　２０　３３３ＰＥ３７／ＴＧＦ　ａ　（ｃｙｓ　２８７）　０．０９　１０ 　１１１１、最初の７つの構築体は、１回目の試験からの結果を示し、そして最 後の５つの構築体は第２回目及び別の試験からの結果を示す。 ２、ｒＤｓ。は３Ｈ−ロイシンの取り込みによる測定に従い、Ａ４３１細胞中で のタンパク質合成を５０％阻害する毒素の濃度により決定される。 ３、細胞障害指数は、結合”’Ｉ−ＥＧＦの５０％を放出させるのに必要な毒素 の４度を毒素の１０．。で除することにより決定した。この指数が高いほど、よ り所望される化合物であることを意味する。 表３＝様々な数のＥＧＦ　レセプターを有する悪性細胞系に及ぼすＰＩｌ、３７ ／ＴＧＦαの活性 Ａ４３１　１！表皮　２　ＸＩＯ’　０．０２ＨＴ２９　結腸　ｌＸｌ０’　１ 門ＣＦ７　胸部　ｌＸｌ０’　３ ）ＩＵＴ　１０２　白血病　０　＞１００００Ｊ、　ＰＥ３７／ＴＧＦαの突然 変異体−ＰＥ３７／ＴＧＦαのアミノ末端部分の調査は、ＰＥの３７ＫＤのフラ グメントがＢアルファーヘリンクス（ａａ　２８７−３０８）へと導かれる負帯 電リーダー配列を形成する７つのアミノ末端アミノ酸（ＭＷＥＱＬＥＱ）を含む ことを示した。　ＰＥ３７のアミノ末端が活性にとって必須であるかを決定する ため、一連の欠損突然変異体を構築した。それにおいては２．４又は７個のアミ ノ酸がアミン末端から欠損している（図１及び表１）、第四の突然変異体を構築 し、これは通常のアミノ末端を、しかしながら大きめの内部欠損（アミノ酸３１ ４−３８０）を含む、　ＥＧＦ　レセプターを含む細胞系に及ぼす細胞障害性に ついて試験することができるようにするため、ＴＧＦαをこれらの組換タンパク 質金てのカルボキシル末端の近くに置いた（図１）。 ＴＧＦαを含む全ての突然変異タンパク質をＢＬ２１　（ス［ＩＥ３）の中の封 入体として発現させ、そして前述の通りに精製した。〉９０％の均一性にまで精 製され、５Ｏ５−ＰＡＧＥ上で適切な分子量で泳動した突然変異タンパク質はウ サギ抗ＰＥ抗体に対して免疫反応性であり（回２及び３）、そして全ＡＤＰ　リ ボシル化活性を有していた（表２）。Ａ４３１及びＭＣＦ７細胞に対する■Ｄ、 。を表２並びに図４及び５に詳細する。ＰＥ３７／ＴＧＦα（ＰＥ２８０−６１ ３／　ＴＧＦα）は活性が１２〜２５分の１に低下している２又は４個のアミノ 末端アミノ酸の欠損した最も活性な分子であった。７個の末端アミノ酸の欠損は 更に活性を低下させ、そして内部欠損は大幅な細胞障害の損失をもたらした。 細胞障害性の低下は組換毒素のＥＧＦレセプターへの低められた結合能に原因し うる。　ＴＧＦαは３本のジスルフィド結合を有するため、様々な不適切な折り たたみ形態が再折りたたみプロセスの際に生じうる。　Ｋｒｅｉｔ霧ａｎ、前掲 、ＥＧＦレセプター結合における相違がＰＥ３７／ＴＧＦα及びその他の組換毒 素間での１０．。の相違に原因するかどうかを決定するため、（”５ｒ）−ＥＧ Ｆ放出アッセイを行った（図６）、各毒素の細胞障害活性をＥＧＦレセプター結 合における相違について補正した。補正した細胞障害指数値は、ＥＧＦ　レセプ ターから５０％の（”’［）−ＥＧＰを放出させる毒素の濃度（ｎＭ）をへ４３ １細胞に対する組換毒素の１０．。で除することによって算定した。この指数は 、ＰＥ３７／ＴＧＦαの、ここに記載のその他の突然変異体及びＰＥ（４Ｅ）　 ／ＴＧＦαに比しての優れた細胞障害活性を強調せしめる。 上記の３７ＫＤタンパク質（ＰＥ３７と呼ぶ）は好適な態様である。アミノ末端 メチオニンはアミノ酸位２８０にあるため、この分子はそれが細胞質ゾルにトラ ンスロケートされるのにタンパク質分解又はジスルフィド結合還元のいづれに付 される必要もないであろう０位置２８０でのグリシノのメチオニンへの置換は細 胞障害性を下げない、　ＰＥ３７を標的とするために−キメラ分子を、τＧＦα をエンコードするｃＤＨＡを用いて作り上げた。　ＰＥ３７／ＴＧＦαは標的細 胞を特異的に殺傷するように働き、なぜなら細胞障害性は過剰のＥＧＦにより阻 害され、一方、ＥＧＦ　レセプターを欠＜　１ＩＵＴ１０２細胞はＰＥ３１／Ｔ ＧＦαに非感受性であったからである。アミノ酸２５３−２８０はタンパク質分 解プロセスを助長するためのみの毒素機能にとって明らかに必要である。 標的細胞によるＰＥの代謝の分析は細胞結合ＰＥ分子の約１０％がプロセスを受 けたことを示す、Ｏｇａｔａ　ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５　： 　２０６７８−２０６８５　（１９９０）を参照のこと、このことは、タンノぐ り質分解プロセスがＰＥの作用において律速段階でありうることを示唆する０表 ２番よ結合ＰＥ３７／ＴＧＦαの方が、ＰＥ　（４Ｅ）　／ＴＧＦαよりも２０ 倍効率的に細胞質ゾルに到達することを示唆する。トランスロケートするＰＨ（ ４Ｅ）／ＴＧＦαのフラグメントはＰＥ３７／ＴＧＦαとほとんど同一であるた め、実際の脱トランスロケーション段階は両分子に関して類（以してし）る。 従って、タンパク質分解プロセスはＰＲ（４Ｂ）　／ＴＧＦαの細胞障害性を制 約する傾向が強いようである。 事前の研究（Ｓｉｅｇａｌｌ　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　３０　：　７１５４−７１ ５９　（１９９１））４よ、アミノ酸３４６−３８０は活性の損失を伴うことな りＰＥから欠損されうるが、しかし位置３４５での追加の突然変異は有害である ことを示している。残５３１４−３８０を欠＜　ＰＥ３７／ＴＧＦα突然変異体 の劣る活性番よ３１４−３４６の間にある残基がトランスロケーションにかかわ ってし）ることを示唆する。この要件は３７ＫＯの活性フラグメントを作り上番 ヂるのに必要不可決である。従って、トランスロケーションにとって重要である ドメイン■の部分は位１１２８０−３４５にある６６個のアミノ酸のようである 。ドメインＩｂ及び■（アミノ酸３６４−６１３）もトランスロケーションにと って必要であり、なぜならそれらはＰｒ１ｏｒら、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗｉｓｔｒｙ 　３１　：　３５５５−３５５９　（１９９２）に記載の通りリボヌクレアーゼ ノ＼ルナーゼで置き換えられて細胞障害性分子を作り上げること力（できる力・ 要である。　ＰＥ３７／ＴＧＦαのアミノ末端からの２，４又番よ７個のアミノ 酸の欠損を有する突然変異タンパク質はＰＥ３７／ＴＧＦαよりも活性力（弱い 。ＥＧＦ　レセプターに対する結合について補正したとき、１２〜２５イ合の細 胞障害活性の損失が、２又は４個のアミノ末端アミノ酸を欠く突然変異体におい て認められた。これらのアミノ末端欠損突然変異体はそれぞれ１個のグルタミン 及び正味の負帯電を保持している。 補正した細胞障害性において更に１０倍の低下が７個のアミノ酸の欠）員により 認められた。 １１．３５ＫＤのカルボキシル−末端ＰＲフラグメント及び抗体−ＰＥ融合タン パク質の構築。 Ａ、材料及び細胞系−何らかのことわりのない限り、材料及び細胞系は先の実施 例のもとで記載したものと同一の起源より入手した。 Ｂ、増幅−オリゴヌクレオチドＣ９及びＣ２（表１参照のこと）をＯＮ八へ成装 置（＾ｐｐｌｉｅｄ　ＢｊｏｓｙｓＬｅｓ＋ｓ）を用いて構築した。ポリメラー ゼ連鎖反応（ＰＣＩ＋）は鋳型としてのＬｏｎｇのプラスミド叶１（上記）及び 製造者の仕様書（Ｇｅｎｅ　Ａｓｐ　：　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕ ｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ。 Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ）に従う試薬を用い、５％のホルムアミド（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｋａ）及び１００　ｐＩＩＩｏｌのプライマー０９と０２の存在下で 実施した。各ＰＣＲ反応は９４°Ｃで１分の変性、４２°Ｃで９０秒のアニーリ ング及び７２℃で２分の重合、それに伴う各サイクルにおける１０秒の伸長より 構成される全部で３０のサイクルとした。増幅フラグメントを１．５％の低融点 アガロース（Ｓｅａ　Ｐｌａｑｕｅ　；　ＦＭＣＣａｒｐ、、　Ｒｏｃｋｌａｎ ｄ＋　ＭＥ）で精製した。 Ｃ９細菌株及びプラスミド−上記の）１８１０１をプラスミドの増殖のために用 いた。誘発性Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼをプロファージ上に保有するＢＬ２１　 （λＤε３）（これも上記）を融合タンパク質発現のための宿主として用いた。 プラスミドＣＴｌ３２は、Ｎｄｅ　Ｉ　−５ａｃＩ［消化ＰＣＲフラグメン）　 （Ｃ９及びＣ２を用いて増殖）の、上記のプラスミドＤＰＩの脱リン酸化３．６ 　ｋｂのＮｄｅ　Ｉ　−Ｓａｃ　ＩＩフラグメントへの挿入により作った。プラ スミドＣＴ１１は、ドメイン１ｂからのアミノ酸３６５−３８０の欠損を含むＰ Ｅ突然変異体をエンコードするプラスミドＣ３ｌＯ（Ｓｉｅｇａｌｌら、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、　３０　：　７１５４−５９　（１９９１））　と同一のＤＮＡ配列 を含むプラスミドの５１５　ｂｐのＳａｌ　Ｉ　−ＢａｓＨＩフラグメントの、 プラスミドＣＴ１３２ノ３．７　ｋｂのＳａｌ　Ｉ−Ｂａｗｌ脱リン酸化フラグ メントとのリゲーションによって作り上げた。プラスミドＣＴＩＩをＤＮＡ配列 決定により確認し、そしてメチオニン及び天然ＰＥのアミノ酸２８１−３６４． ３８１−６１３より成るＰＥ３５と称するタンパク質をエンコードする。 Ｄ９組換融合タンパク質の発現及び精製−シュードモナス外毒素タンパク質の発 現を、先の実施例に記載の通り、宿主ＢＬ２１　（λＤＥ３）を用いて行った。 細胞を、ＩＰＴＧでの誘発に続いて９０分インキュベートした。そのペリプラズ マ画分をＰＥ３５及びＮ１ｙｓ　ＰＥ３８の精製のために用意した。　Ｎ１ｙｓ 　ＰＥ３８は、容易に誘導化されるリジンを含む１１個のアミノ酸のペプチドが 先行するＰＥのａａ　２５３−３６４．３８１−６１３を含む突然変異ＰＥタン パク質である。Ｎ１ｙｓ　ＰＥ３８は、先の実施例に記載のＰｈａｒ＋５ａｃｉ ａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、　ＦＰＬＣを用いるＱセフ ァロース、モノＱ　（ＨＲ５１５；　Ｐｈａｒｖａｃｉａ）及びＴＳＫ−２５０ （Ｔｏｓｏｈａａｓ。 Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、　ＰＡ）カラムの連続使用により精製した。 　ＰＥ３５を含むペリプラズマをＱセファロースから、２０ｍＭのトリスｐＨ７ ，４中の０．２６〜０．３０μのＮａＣ１でのＴ８離より精製した。その溶離液 を、１ＭのＮａＣ１を含む５０ｍＭのトリス−アセテートｐＨ７，０中のＩｍｇ ／ｍｌのＣｕ５Ｏａで５０％飽和となったキレート化性セファロースカラム（Ｐ ｈａｒｌｌａｃｉａ）上に注入した。そのフロースルーはほぼ純粋なＰＥ３５を 含み、それは１０ｍＭ＋７１ＥＤＴＡ及び１０ｍＭ（７）ＤＴＴを含むＰＢＳ中 でのＴＳＫ−２５０カラムにおいて七ツマ−として精製された。 Ｌａｅ腸ｍｌｉ　、前掲の方法を用いる５Ｏ３−ＰＡＧＥをカラム画分を分析す るために用いた。　ＰＥ含をタンパク質の同定はＰＥと反応性のウサギ血清を用 いるイムノプロンティングにより確認した。対応の抗体及び基質をＶｅｃｔａキ ット（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ）を用いて供した。突然変異ＰＥタンパク質濃度 を２８０　ｎｍでの吸収により、１．２　ｍｌ／＋＋ｇ−ｃｍの励起係数と仮定 して決定した。 Ｅ、免疫毒素の構築−１ｓ＋ＨのＥＤＴＡを含む０．２　Ｍのリン酸ナトリウム （ｐＨ８，０）中のＮ１ｙｓ　ＰＥ３８（６〜１３ｍｇ／＋ｗｌ）を５倍過剰量 のイミノチオランで誘導し、そして３７°Ｃで１０分インキュベートした。タン パク質を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（ＰＯＬＯ；　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で未 反応の架橋剤から分けた。誘導化は典型的には、ＥＩｌ＋ａａｎ試薬（Ｅｌｌｍ ａｎ、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　８２　：　７０−７７　（１９５９）を用いて測定し、Ｎ１ ｙｓ　ＰＥ３８のモル当り０．５モルのチオールを導入した。同様に、１１１Ｍ のＥＤＴＡを含む０．２Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝　７　）中の旧ｙｓＰＥ ３８（６〜１３＋＋ｇ／＋ｓｌ　）を３倍過剰量のＳＭＣＣ（スクシニミジル− ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）で誘導 し、そして２２°Ｃで１時間インキュベートした（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ　ら、Ｊ 、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９２　：　１４１３−１４２４　（１９８２））　、タ ンパク質を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５上で反応体から分離させた。誘導化は典 型的にはＮ１ｙｓ　ＰＥ３８のモル当り０．５個の反応性基を導入した。　ＰＥ ３５を１ｍＭのＥＩＩＴＡ及び５ｆ）＋ＭのＤＴＴを含む０．２　Ｍのリン酸ナ トリウム（ｐＨ７、ｏ）で保存し、そして抗体にカップリングする前に５ｅｐｈ ａｄｅｘ　Ｇ−２５でＤＴＴから分離させた。モノクローナル抗体（阿＾ｂ）　 Ｂ３は、数多くのヒト腫瘍上で見い出せる多糖抗原に対して反応性であり、そし て前記の無血清培養培地から精製した。引用することで本明細書に組入れるＰａ ｓ　ｔａｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　５１　：　３７８１−７（１９９１） 。門＾ｂ　ＨＢ２１はヒトトランスフェリンレセプターに対して特異的であり、 そして前述の１（Ｂ２１を抱えるヌードマウスの腹水から精製した。　ＭＡｂ濃 度を２８０　ｎｍでの吸収により、１．４　ｍｌ／Ｂ−ｃ■の励起係数と仮定し て決定した。ｌｆｆ１ＭのＥＤＴＡを含む０．２Ｍのリン酸ナトリウム（ｐ１１ ７．０）中のＢ及びＨＢ２１（４〜８ｍｇ／＋＊Ｉ）を２倍及び４倍過剰量のＳ ＭＣＧそれぞれと反応させ、そして２２゛ｃで１時間インキュベートした。誘導 化ＭＡｂを５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５を用いて反応体がら分離させた。 Ｂ３及びＨＢ２１はそれぞれ分子当り０．８３及び１．０個の測定反応性基をこ れらの条件下で有していた。　Ｙｏｓｈｉｔａｋｅら、前掲を参照のこと、１ｍ Ｍ（７）ＥＤＴＡを含む０．２Ｍのリン酸ｆ　ト’Ｊ　ラム（１））１８．０） 中（７）Ｂ３及び１（Ｂ２１（４〜５ｍｇ／ｍｌ）もそれぞれ２倍又は３倍過剰 量の５ＰＤＰと反応させ、そして２２゛Ｃで３０分インキュベートした。誘導化 ＭＡｂを５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５を用いて反応体から分離させた。Ｂ３及び ＨＢ２１はそれぞれ分子当り０．７９及び０，５６個の測定反応性基をこれらの 条件下で有していた（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、ＢｉｏｃｈｅＩＩｌ、　Ｊ、　１７ ３　：　７２３−７３７　（１９７Ｂ））　、　５ＰＤＰ又はＳＭＣＣのいづれ かで誘導化せしめたＢ３又はＩＩ　８２１をそれぞれ２つのプールに分け、そし てイミノチオラン又は還元ＰＥ３５で誘導せしめた２〜３倍過剰量のＮ１ｙｓ　 ＰＥ３８と２２°Ｃで１６時間反応させた。反応はヨードアセトアミド（Ｓｉｇ ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ＋　Ｍｏ、）の１ｍＭ の最終濃度に至る添加により停止させた。更に、Ｂ３をイミノチオランで誘導さ せた。　０．２　Ｍノリン酸ナトリ’ｙＬ　（ｐＨ８，０）中（７）８３　（５ 〜１０ｍｇ／ｖｓ　ｌ　）を２倍過剰量のイミノチオランと３７°Ｃで１時間イ ンキュベートした。誘導化抗体を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５を用いて反応体か ら分離させた。Ｂ３にはこれらの条件のもとて１．０個の反応性基が導入された （Ｅｌｌｍａｎ、前掲）。このｌ’ｌＡｂを、ＤＴＮＢ（５，５’−ジチオ−ビ ス−（２−二トロ安息香酸）で記載の通り（Ｆｉｔｚ　Ｇｅｒａｌｄ、　Ｍｅｔ ｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ。 １５１　：　１３９−１４５　（１９８７））に誘導化しておいたＰＨ３５と混 合した。２２°Ｃで２時間のインキュベーション後、反応をシスティン（Ｐｉｅ ｒｃｅ）の０．２　ｍＭの最終濃度に至る添加により停止させた。同様に、イミ ノチオランで誘導させたＢ３を２２°Ｃで２時間、ＳＭＣＣで誘導化しておいた Ｎ１ｙｓ　ＰＢＳ８と反応させた。その反応を１ｍＭのヨードアセトアミドで停 止させた。免疫毒素を４１Ｑ　（ＨＲ５１５）及びＴＳＫ−２５０カラムの連続 使用により、ＦＰＬＣを用いて単一ピークとして精製した。 Ｆ、　ＡＤＰ−リボシル化アッセイ−タンパク質サンプルのＡＤＰ−リボシル化 活性を、先の実施例に記載の通りに、伸長因子２に冨む小麦胚芽抽出物を用いて Ｃｏ１１ｉｅｒとＫａｎｄｅｌの手順により測定した。 Ｇ、タンパク質合成阻害アッセイータンパク質合成の阻害は先の実施例に記載の 通りに実施した。細胞を毒素添加の前に、９６穴プレートの中で各ウェル当り１ ５．０００細胞において２４時間平板培養した。 ０．２％のＢＳＡ−ＰＢＳの中に希釈した毒素又はコントロールを２００μｌ／ ウエルの最終容量にまで加えた。３７°Ｃで１６〜２０時間のインキュベーショ ンの後、各ウェルに〔３Ｈ〕−ロイシン（Ａｍｅｒｓｈａｍ　；　１　ｕｃｉを ０．２％のＢＳＡ−ＰＢＳの中に１０μＩまで希釈）で２時間パルスに付した。 凍結後、その細胞をガラスファイバーフィルターで集め、そしてタンパク質の中 への放射活性の取り込みをＢｅｔａｐｌａｔｅシンチレーシランカウンター（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）で定量した。結果は、毒素抜きでインキュベートした細胞の 取り込みＣｐＩｌｌ（分当りのカウント数）の％として算定した。競合アッセイ を２Ｍｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下で細胞に付加した毒素を利用して行った。 Ｈ，３５ＫＤのカルボキシル−末端フラグメントのデザイン−我々は有用な免疫 毒素を作り上げるため、ＰＥの３５ＫＤのカルボキシル末端フラグメント（ＰＥ ３５と称す）をモノクローナル抗体に抱合せしめることができるかどうかを調べ た。Ｐ　Ｅ　３’５をエンコードするプラスミドをプラスミドＣＴ１３２を用い て構築した。 プラスミドＣＴ１３２を、ＰＥ３７の位置２８７においてシスティンを再導入せ しめるＰｃｔ？フラグメントを用いて構築した。　ＤＮＡ配列決定はこの突然変 異が存在していることを確証せしめた。プラスミドＣＴＩＩは、プラスミドＣＴ １３２のＰＥをエンコードするＤＮＡ配列を、ドメインＩｂのアミノ酸３６５− ３８０の欠損を含むＰＥをエンコードするＤＮＡ配列に置き換えることにより構 築した。この欠損はＰＥタンパク質の細胞障害性には影響しない、従って、プラ スミドＣＴＩＩ（ｆ＋Ｔ）はＴ７プロモーターと、位置２８０の曽ｅｔ、それに 続く天然ＰＥのアミノ酸２８１−３６４゜３８１−６１３をエンコードするＤＮ ＾とを含む、このプラスミドによりエンコードされるタンパク質（ＰＥ３５）は 位置２８７において単独のシスティン残基を含む（図７　）　、　ＰＥ３５をＢ Ｌ２１　（λ［ＩＦ５）において発現させ、そして５Ｏ５−ＰＡＧＥでペリプラ ズマとスフ二口プラストとに均等に分布していることが見い出せた。〉９５％の 均一性に至るベリプラズマからの精製をアニオン交換及びキレート化クロマトグ ラフィー及びゲル濾過を用いて行った。ＰＥ３５は５０Ｓ−ＰＡＧＥ上で予測の 分子量（３５ＫＯ）であることが認められ、そしてＰＥに反応性であるウサギ血 清と免疫反応性であった。　ＡＤＰ　リボシル化活性は、天然ＰＥと同一のへ〇 Ｐ−リボシル化活性を有する分子であるｌｙｓ　ＰＥ４０　（Ｃｏｌｌｉｅｒと Ｋａｎｄｅｌ、前掲）のそれと同一である。チオール基の数はＥｌ１ｍａｎ試薬 を用いて測定したときにモル当り１個見つけられた。細胞系の数に基づいて試験 したとき、ＰＨ３５は標的細胞に特異的に結合できないために非常にわずかな細 胞障害活性を存していた。 １、ＩＦ２１を用いる免疫毒素のデザイン及び活性−ＰＥ３５が細胞を特異的に 標的とすることができるかどうがを調べるため、それを、ヒトトランスフェリン レセプターを認識する抗体ＭＡｂ　ＩＦ２１　（ＡＴＣＣ）に抱合させた。　Ｐ Ｅ３５をチオエーテル及びジスルフィド結合の両者を用いて複合させた。　ＰＥ ３５を基礎とする免疫毒素と、事前に作られた分子、旧ｙｓ　ＰＥ３８とを比較 するため、接近可能なりジン残基（図７）を含む１１個のアミノ酸ペプチドが先 行しているＰＥのアミノ酸２５３−３６４゜３８１−６１３を含む分子をイミノ チオランで誘導化させて遊離スルフヒドリル基を作り上げ、そしてＳＭＣＣ（チ オエーテル結合を供するため）又は５ＰＤＰ　（ジスルフィド結合を供するため ）のいづれがで誘導化させたＭＡｂに複合させた。４つの免疫毒素それぞれをア ニオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過を用いて〉９５％の均一性にまで精 製した。それらは１９０．０００　ＫＤの分子量で泳動し、抗体と毒素との１対 １の比を示唆する。還元５０５−ＰＡＧＥは抗体及び毒素フラグメントの予測の パターンをもたらした。チオエーテル結合を介してＰＥ３５に抱合させた１（Ｂ ２１　（ＩＦ２１−５−Ｃ−ＰＨ３５）を還元してＰＡＧＥにかけたとき、それ は阿＾ｂ重鎖（５０ＫＤ）及びＭＡｂ軽鎖（２０ＫＤ）並びにＰＥ３５に結合し ている重鎮及び軽鎖（ゲル上の高めの分子量バンドに該当）をもたらした。 Ｎ１ｙｓ　ＰＥ３８にチオエーテル結合を介して抱合させたＩＦ２１を同様に分 析すると、それは重及び軽鎖、並びにＮ１ｙｓ　ＰＥ３８に結合している重及び 軽鎖をもたらした。ジスルフィド結合を介して旧ｙｓ　ＰＥ３８に抱合させた） １８２１　（ＩＦ２１−５−５−ＰＥ３Ｂ）は還元されたＭＡｂ重鎖及び軽鎖、 並びに遊離毒素（３８ＫＤ）をもたらした、同様に、ジスルフィド結合を介し− ＣＰＥ３５　ニ抱合された８８２１　（ＩＦ２１−３−５−ＰＨ３５）　ハＭＡ ｂ重鎖及び軽鎖、並びに遊離毒素（３５ＫＯ）をもたらした、　ＰＥと反応性で あるポリクローナルウサギ血清を用いての還元免疫毒素のウェスタンブロッティ ングは、遊離毒素（ジスルフィドコンジュゲートの場合）又は抗体の重鎮及び軽 鎖に結合している毒素（チオエーテルコンジュゲートの場合）の存在を確証せし めた。 次にコンジュゲートをその活性を決定するためにＡ４３１及びＭＣＦ？細胞に基 づいて試験した。　ＰＥ３５に対するジスルフィド結合を採用するコンジュゲー トはＡ４３１及びＭＣＦ？細胞に対して最も活性であった（表４及び図８　）　 、　Ｎｔｙｓ　ＰＥ３８コンジユゲートはコンジュゲーシヨンの方法に関係なく ほぼ同一の細胞障害性を示したが、しかしＡ４３１細胞に対してはＰＥ３５に対 するジスルフィド結合を含むものよりも活性が５分の１であった。ＰＥ３５を用 いて作ったチオエーテルコンジュゲートはＰＥ３５を含むジスルフィドコンジュ ゲートよりも１００分の１以下の活性であった。ヒトトランスフェリンレセプタ ーを含まないマウスＬ９２９細胞はＩＦ２１を含む免疫毒素の毒性作用に耐性で あった。更に、Ａ４３１ヒト１１表皮癌細胞系に及ぼす細胞障害性は１０μｇ／ ｎ＋ｌのＩＦ２１を用いて阻害され、この免疫毒素はヒトトランスフェリンレセ プターを介して特異的に結合することを示唆する。 Ｊ、Ｂ３を用いる免疫毒素のデザイン及び活性：ＰＥ３５がヒト癌細胞を特異的 に標的とすることができるかどうかを調べるため、数多くのヒト癌上に見い出せ る多Ｉｉ類抗原を認識するＭＡｂであるＭＡｂ　８３にそれを抱合させた（Ｐａ ｓｔａｎ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　、前掲）　、　ＰＥ３５をＤＴＮＢで活 性化させ、そしてジスルフィド結合を介して、イミノチオランで誘導化させてお いたＢ３に複合させた。比較のため、Ｎ１ｙｓ　ＰＥ３８　（ＳＭＣＣで誘導化 させておいたもの）を８３　（イミノチオランで誘導化させておいたもの）に複 合させることにより作った免疫毒素を使用した。各免疫毒素をアニオン交換クロ マトグラフィー及びゲル濾過を用いて〉９５％の均一性にまで精製した。それら は各々約２１０，０００　ＫＯの分子量で泳動し、抗体と毒素との１対１の比を 示唆する。還元５Ｏ５−ＰＡＧＥは抗体及び毒素フラグメントの予測のパターン をもたらした。チオエーテル結合を介してＮ１ｙｓ　ＰＥ３８に抱合させたＢ３ 　（Ｂ３−５−Ｃ−ＰＥ３Ｂ）は還元されてＭＡｂ重鎮（５０ＫＯ）及び軽ｔｊ ｆ　（２０Ｋ［ｌ）、並びにＰＥ３５に結合しているＭＡｂ重鎖及び軽鎖をもた らした。ジスルフィド結合を介してＰＥ３５に抱合させたＢ３　（Ｂ３−５−Ｓ −ＰＥ３５）は還元されてＭＡｂ重鎮及び軽鎖、並びにｉ離毒素（３５Ｋ［ｌ） をもたらした。還元された免疫毒素のＰＥに対するポリクローナルウサギ血清を 用いるウェスタンブロンティングは遊離毒素（ジスルフィドコンジュゲートの場 合）又はＭＡｂの重鎮及び軽鎖（チオエーテルコンジュゲートの場合）の存在を 確証せしめた。ジスルフィド結合を含む免疫毒素はＡ４３１細胞に対して２倍の 活性であり、そしてＭＣＦ７細胞に対しては若干活性が強かった（表４及び図９ ）。ＫＢ細胞は両毒素の毒性作用に対して耐性であった（表４）、ＫＢ細胞はヒ ト類表皮癌腫に由来し、そしてＡＴＣＣから獲得した。同様に、ＭＣＰ７細胞に 対する免疫毒素の活性は９００μｇ／＋ｗｌの８３により完全に阻害され、免疫 毒素が８３抗原に特異的に結合することを示唆する。 １１Ａｂがイミノチオランで誘導化され、そしてＮ１ｙｓ　ＰＥ３ＢがＳＭＣＣ で誘導化されている８３とＮ１ｙｓ　ＰＥ３８とのチオエーテルコンジュゲート を、同一のタンパク質であるが誘導剤を逆にしたものを用いて作った同様のコン ジュゲートと比較した。興味深いことに、ＳＭＣＣで誘導化されたＢ３は、Ｂ３ がイミノチオランで誘導化されている同一の免ｉ毒素よりも６〜８分の１の活性 であった。同様に、ジスルフィド結合を介してＢ３に抱合されているＰＥ３５を 含む免疫毒素は、Ｂ３が５ｐｏｐで誘導化されているときの方が、Ｂ３がイミノ チオランで誘導化されているときよりも９分の１の活性であった。　ＩＦ２１を 含む免疫毒素の活性に対する誘導化剤の有意義な作”用は認められなかった。 ＰＥ３５はＰＥ３７の固有の特徴を有し、そして抗体に容易に抱合させることが できる。これは任意２８７に１個のシスティン残基を含み、従ってチオエーテル 又はジスルフィド結合のいづれかを介して抗体に確実に複合させることができる 。我々はＰＥ３５を用いて作った免疫毒素を、遊離スルフヒドリル基を作り上げ るためにイミノチオランで誘導化させたＮ１ｙｓ　ＰＥ３８を用いて構築したも のと比較した。　ＳＭＣＣ又は５ＰＤＰのいづれかで誘導化されているＭＡｂ　 ＩＦ２１を２つのプールに分け、そしてチオエーテル又はジスルフィド結合それ ぞれのいづれがを採用してコンジュゲートを作り上げるために平行で各毒素と反 応させた。誘導化は１対１の比で抗体と毒素とを含む免疫毒素の優勢を確実なも のとするために行った。精製した１対１の免疫毒素のみをここで行った分析のた めに利用した。 予測通り、ＨＢ２１に対するジスルフィド又はチオエーテル結合のいづれかを用 いて作ったＮ１ｙｓ　ＰＥ３８コンジユゲートは同程度の毒性を有していた。　 ＰＥ３８を含む免疫毒素は細胞死をもたらしめるために細胞質ゾルに到達できる ようカルボキシル末端フラグメントを遊離させる２つの重要なプロセシング段階 を、コンジュゲーシゴンの方法に関係なく必要とする。・・・（１）アミノ酸２ ７９と２８０との間でのタンパク質分解プロセシング、及び（２）アミノ酸２６ ５と２８７とにわたるジスルフィド結合の還元、対照的に、ジスルフィド結合を 介してＰＨ３５に抱合されたＨＢ２１はＰＥ３８コンジユゲートよりもＡ４３１ 細胞に対して５倍活性であった。細胞質ゾルに到達する各免疫毒素の部分は類似 するため（ＰＥのアミノ酸２８０−２６４．３８Ｌ　６１３）、タンパク質分解 プロセスはこれらの細胞に対するＰＥ３８含有免疫毒素の作用の律速段階があり うる。しかしながら、ＨＢ２１−５−５−ＰＥ３５は、Ｎ１ｙｓ　ＰＥ３８を含 むコンジュゲートに比してヒト乳癌ＭＣＦ７細胞系に対する高められた細胞障害 性を示さなかった。ＭＣＦ７細胞はＰＥ３８をタンパク質分解することにおいて Ａ４３１細胞よりも効率的である可能性がある。それ故、ＰＥ突然変異性のタン パク質分解はこれらの細胞における律速段階ではないであろう。ＰＥ３５及びＰ Ｅ３８がこの細胞系に対して類似の非特異的毒性を存する事実は（それぞれ２０ ０　ｎｇ／＋ｗｌ、対、３００　ｎｇ／ｍｌ）、ＭＣＦ７細胞がＮ１ｙｓ　ＰＥ ３８をＰＥ３５とほぼ同様にプロセスする考えを裏付けする。 ＰＥ３５はＰＥをプロセスする哺乳動物細胞により認識されるタンパク質分解部 位を含まないため、チオエーテル結合を介してＨＢ２１に結合しているＰＥ３５ を含む免疫毒素はかなり不活性である。観察される低い度合いの活性はＭＡｂ又 はＰＥ３５内のその他の部位で起こるタンパク質分解プロセシング及び得られる フラグメントの非効率的なトランスロケーションに寄与しうる。 ジスルフィド結合を介してＰＨ３５に抱合されたＢ３を含む免疫毒素も、Ｎ１ｙ ｓ　ＰＥ３８に対するＢ３チオエーテルコンジュゲートよりも活性であった。し かしながら、バイパス式タンパク質分解プロセシングの効果の程度は８８２１コ ンジユゲートで観察されるものより低かった。興味深いことに、ＭＡｂを誘導化 するのにＳＭＣＣを用いて作ったＢ３コンジュゲートは、ＭＡｂがイミノチオラ ンで誘導化され、そしてＮ１ｙｓ　ＰＥ３８がＳＭＣＣで誘導化されている同じ 免疫毒素よりも活性が低かった。これらの試薬は共にアミノ基と反応するが、そ れらは極性において相違する（イミノチオラン＞　５ＰＤＰ　＞　ＳＭＣＣ）。 非極性反応体ＳＭＣＣは固有のりジン残基を誘導化し、そして誘導過程の際に８ ３の重要な結合特性を妨げる。同様に、Ｂ３を誘導化するためにイミノチオラン を用いて作ったＰＥ３５ジスルフイドコンジユゲートはＢ３を誘導化するのに５ ＰＤＰを用いたものよりも１０倍有能であった。 Ｋ、　Ｂ５−５−５−ＰＥ３５によるインビボ結果Ｂ５−５−Ｓ−ＰＨ３５を５ μｇのレベルでマウスに静脈内注射した。免疫毒素の血清レベルを２０時間にわ たり、その血清をＡ４３１細胞とインキュベートし、そして前記の通りにタンパ ク質合成に対する作用を測定することより決定した。標準曲線をコントロールマ ウス血清に希釈したＢ５−５−５−ＰＥ３５で作った。図１０参照のこと。 ヌードマウスにおける皮下Ａ４３１腫瘍の増殖に及ぼすＢ５−３−５−ＰＥ３５ の効果を決定した。マウスには０日目にて２，０００，０００個のＡ４３１細胞 を、そして５日目にて２５μｇの８３−５−５−ＰＥ３５の単独静脈内投与を与 えた。立方暢−で測定した腫瘍増殖に基づく経時的な結果を図１１に示す、免疫 毒素は腫瘍の完全な退化をもたらした。 ■、■塁隻２町剥 膀胱癌と診断された患者は、カルボキシル末端配列ＫＤＥＬを有するＰＥ３５／ ＴＧＦαで、６０−１の希釈液中のそのタンパク質を６週間にねたって週に一度 カテーテルにより注入することによって処置されうる。 この分子はＴＰ４０よりも活性が高く、且つ小さいものであり、そしてＢ３抗原 （乳、類表皮、胃及び前立腺の癌腫を含む）を抱える腫瘍と診断された患者は、 それらの者をカルボキシル末端配列ＫＤＥＬを有するＢ３ＦｖとのＰＥ３５融合 タンパク質を構成するＰＩＥで、１日当りにて患者当り１〜１００　ｍｇの用量 で静脈内投与することにより処置されうる。 ｒ　Ｂ３Ｆν」は、重鎖Ｆｖドメインのカルボキシル末端及び軽１ｉＦｖドメイ ンのアミノ末端において開始する、柔軟リンカ−（Ｇｌｙ、　５ｅｒ）により連 結されたＭａｂ　Ｂ３の重及び軽鎖領域を含む配列を称する。これは全て引用す ることで本明細書に組入れる一般譲渡されたＵ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ。 ０７／７６７．３３１号に記載されている。このタンパク質をエンコードする遺 伝子はＰＨ３５遺伝子と融合されている。 表４ タンパク質及び免疫毒素の細胞障害活性（１０５゜）：ｉ４号＋　Ａ４３１　Ｍ ＣＦ７　Ｌ９２９　ＫＢＰＥ３５　８００　２００　ＮＤ　ＮＤＮＬｙｓＰＥ３ ８　＞１０００　３００　ＮＤ　ＮＤＨＢ２１−５−Ｃ−ＰＥ３５　２００　３ ０　＞１０００　ＮＤＨＢ２１−５−Ｃ−ＰＥ３８　５　１．２　＞１００（ｌ 　ＮＯ！（８２１−５−５−ＰＥ３８　５　２　＞１０００　ＮＤＨＢ２１−５ −５−ＰＥ３５　１　１．２　＞１０００　ＮＤＢ３−５−Ｃ−ＰＥ３８　６　 ３．２　ＮＤ　＞１０００Ｂ３−５−５−ＰＥ３５　４．７　１．ＯＮＤ　＞１ ０００タンパク質名　タンパク質構造 ＰＥ３７　２８０口ｍ琢圀＝＝＝コロ１３ＦＩＧ、／。 ロ　ロ ！　！ ＦＩＧ、　２゜ ＦＩＧ、４Ａ。 ＦＩＧ、４Ｂ。 ＦＩＧ、６Ａ。 ．０１　．１　１　１０　１００　１００ＯＮＧ／ＭＬ ＦＩＧ　９゜ 時間 １６Ｉ０ 日 Ｆｌに、ＩＩ。 ［ 「 、ｍＡ、１１．、Ｎ、　ＰＣＴ／ＵＳ　９３１０５８５Ｂ、　、陶ＰＣＴ／ＬＩ Ｓ　９３１０５Ｂ５ｇフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，ら　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９ ５　Ｃ９２８４−４ＣＣ１２Ｎ　１／２１　８８２８−４８ ＣＩ２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｎ　１５１０９ Ｃ１２Ｒ１：３８） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃｌ３Ｆ　２１１０２ ＣＩ２Ｒ１：１９） ９４５５−４Ｃ Ｉ Ａ６１Ｋ　３７／２４ （Ｃ１２Ｎ　１５１００　Ａ Ｃ１２Ｒ１：３８）

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．組換シュードモナス外毒素分子であって、ドメインＩａが欠損しており、そ してドメインＩＩのアミノ末端から最初の２７個より多くのアミノ酸が欠損して いない分子。
2. ２．前記分子がドメインＩＩのアミノ酸位２８０にあるメチオニンで開始する、 請求項１記載の組換ＰＥ。
3. ３．前記分子がドメインＩｂのほぼアミノ酸３６５〜３８０の欠損を含んで成る 、請求項１記載の組換ＰＥ。
4. ４．前記分子がほぼアミノ酸２８０〜６１３より本質的に成る、請求項１記載の 組換ＰＥ。
5. ５．前記分子がほぼアミノ酸２８０〜３６４及び３８１〜６１３より本質的に成 る、請求項１記載の組換ＰＥ。
6. ６．前記分子がアミノ酸２８７においてシステインの代わりにセリンの置換を含 む、請求項１記載の組換ＰＥ。
7. ７．前記分子がその分子のカルボキシル末端において、ＲＥＤＬＸ，ＲＥＤＬ及 びＫＤＥＬより成る群から選ばれるアミノ酸配列を更に含む、請求項１記載の組 換ＰＥ。
8. ８．前記分子がドメインＩＩＩの実質的な欠損を更に含んで成る、請求項１記載 の組換ＰＥ。
9. ９．ドメインＩＩＩのほぼアミノ酸６０４−６１３が保持されている、請求項８ 記載の組換ＰＥ。
10. １０．前記分子が、欠損したドメインＩＩＩの代わりにＰＥに融合したリガンド 結合因子を更に含んで成る、請求項９記載の組換ＰＥ。
11. １１．前記分子がリガンド結合因子に融合した、請求項１記載の組換ＰＥ。
12. １２．前記リガンド結合因子がほぼアミノ酸位６０７の後に融合されており、そ してドメインＩＩＩのアミノ酸６０４−６１３がそれに続いている、請求項１１ 記載の組換ＰＥ。
13. １３．前記リガンド結合因子がＴＧＦαである、請求項１１記載の組換ＰＥ。
14. １４．前記リガンド結合因子が抗体又はその結合性フラグメントである、請求項 １１記載の組換ＰＥ。
15. １５．前記リガンド結合因子がホルモンである、請求項１１記載の組換ＰＥ。
16. １６．前記リガンド結合因子が成長因子である、請求項１１記載の組換ＰＥ。
17. １７．前記リガンド結合因子が癌細胞レセプターに特異的に結合する、請求項１ １記載の組換ＰＥ。
18. １８．アミノ酸２８０〜３６４及び３８１〜６１３より本質的に成り、この組換 ＰＥ分子内においてアミノ酸６０７の後にＴＧＦαが挿入されており、そしてそ れにドメインＩＩＩのアミノ酸６０４−６１３が続いている、請求項１記載の組 換ＰＥ。
19. １９．前記ＰＥ分がその分子のカルボキシル末端において細胞質内保持配列を含 む、請求項１１記載の組換ＰＥ分子。
20. ２０．組換シュードモナス外毒素（ＰＥ）分子であってドメインＩＩのアミノ末 端において欠損を有し、これによりその分子は細胞障害アッセイにおいて標的細 胞に対する細胞障害性がＰＥ４０よりも少なくとも２０倍高くなっており、ここ でＰＥ４０及びこの組換ＰＥ分子の標的細胞に対する細胞障害性は、この標的細 胞に対して特異的なリガンド結合因子に融合させたＰＥ４０及びこの標的に対し て特異的なリガンド結合因子に融合させたこの組換ＰＥ分子を、その標的細胞に 対してアッセイすることにより測定する、組換ＰＥ分子。
21. ２１．請求項１記載のアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を含んで成るベク ター。
22. ２２．請求項６記載のアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を含んで成るベク ター。
23. ２３．請求項１記載の配列を発現する宿主細胞。
24. ２４．請求項６記載の配列を発現する宿主細胞。
25. ２５．請求項１記載の分子及び薬理学的に許容される担体を含んで成る薬理製剤 。
26. ２６．患者における腫瘍増殖を阻害するための方法であって、その患者に、その 身体腔の中へと又は器官の内腔の中へと、組換シュードモナス外毒素分子であっ てドメインＩａが欠損されており、且つドメインＩＩのアミノ酸末端から最初２ ７個のアミノ酸より多くが欠損されていない分子に融合させた腫瘍細胞に対して 特異的なリガンド結合因子を投与することを含んで成る方法。