JPH04506976A - 免疫毒素の構築のための改良された毒素 - Google Patents
免疫毒素の構築のための改良された毒素Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
免疫毒素の構築のための改良された毒素原出願(08/911227)は、その
ための特定の受容体が細胞上に存在する認識タンパク質をコード化するDNA配
列と融合した変形シュードモナス(Pseudoyt。
nas )外毒素(PE)遺伝子からの組換えタンパク質の製造を教示している
。この原出願ではIL−2−PE融合遺伝子の構築および発現が説明されていた
。本出願はより有効な免疫毒素の構築に有用である改良された毒素の製造に関す
る。特に、本発明は、標的細胞に対して有効な細胞毒性を有する抗体に容易に結
合し得る改変されたPE分子(本明細書ではLys−PE40と表記される)を
提供する。
図面の簡単な説明
本発明の種々の目的、態様および付随する多くの利点は添付の図面を参照して以
下の詳細な記載を読めばよりよく理解されるであろう。
図1はT7プロモーターと、OmpAシグナル配列と、シュードモナス外毒素の
ドメインII(転位ドメイン)およびDI (ADPリボシル化ドメイン)の存
在を示すプラスミドpVC85Lの構造を示す。
図2Aは精製の種々の段階でのLysPE40ブールの5DS−PAGE分析の
結果を示す。12.5%ゲルはクーマシーブルーで染色された。列1.QMA濃
縮培養培地タンパク質:列2.Qセファロースプール;列3゜MonoSからの
流出物質;列4.MonoSブール;列5.TSK250ブール。分子量標準の
位置が示されている。図2Bはan t f =TFR=LysPE40の5D
S−PAGE分析の結果を示す。試料は10%還元性ポリアクリルアミドゲルに
注入された。列1.αTFR−LysPE40 :列2.LysPE40 ;列
3. an t 1−TFR,ゲルはクーマシーブルーで染色された。
図3Aはanti−TFR−LysPE40によるA431細胞中でのタンパク
質合成の阻害を示す。免疫毒素は過剰のant 1−TFR(tp μg/mf
)の不在中(ネ)および存在中(○)37℃で18−24時間細胞に添加された
。図3BはHUT 102細胞へのant t−Tac−LysPE40の細胞
毒性活性を示す。
ant 1−Tac−LysPE40は示された細胞株に種々の濃度で添加され
た。競合試験のために、70μg/mI!anti−Tacが免疫毒素の添加前
に添加された。′Hレシチン取込みが文献の記載どおりに測定された。
図4はanti−TFR−LysPE40の血液レベルを示す。A4311Ii
瘍を有するBALB/cマウスまたはヌードマウスにanti−TFR−Lys
PE40100μgまたはs OALgを1.P、注射した。血清中の免疫毒素
レベルを異なる時間に測定した。結果は2回の別の実験の平均である。
図5AはヌードマウスにおけるA431の増殖へのanti−TFR−LysP
E40の影響を示す。マウスには3X10@A431細胞を注射し、そして上記
のように免疫毒素で処理した。マウスには以下に示された日に各50μgを4回
投与した: (・)2.4,6.8日; (ム)9,11.13および15日;
(■)処置せず。
図5Bは5,7.9および11日目に4回投与したマウスに対する結果を示し;
(■)処置せず; (ロ)5μg: (・)20μg: (ム)50μg;(
△)5B目に150μg1回のみの投与。
図6はHE11−PE40での処理を行った、および行わなかったヌードマウス
における皮下A431!!瘍の全体の外観を示す。
ヌードマウスにはOB目に3X10’A431細胞を皮下注射した。さらに処理
しない場合、5B目に腫瘍が皮膚の下に小さなこぶとして現れた(A;矢印)。
15日目までに腫瘍は太き(なり、しばしば皮膚表面から飛び出していた(B)
。HE11−PE40で2.4.6および8Ef目に処理したマウスは通常腫瘍
を示さず、26日目に全体に腫瘍が存在しないとしてここでは示されていた(C
)。大きな腫瘍を存するマウスをHE11−PE40 (9,11,13および
15日目)で処理した場合、腫瘍はしばしば縮小を始め、それらの壊死中心内ま
で消失した(D;矢印)。
図7は典型的な処理および対照A431皮下腫瘍の組織学的外観を示す。
A431腫瘍を壊死部から採取し、ホルムアルデヒドで固定し、そして通常のパ
ラフィン包埋および切片化処理を施し、さらにヘマトキシリンおよびエオシンで
染色した。15日目にマウスから除去された腫瘍細胞からの切片がA−4に示さ
れている。9,11.13および15日目にanti−TFR−LysPE40
で処理した19日目のマウスから採取した腫瘍の小切片はB −B l:示され
ている。Aに示される切片は、未処理腫瘍の大部分が小さな一領域のみの壊死(
矢印)を有する生存腫瘍細胞(VT)を含むことを明らかにする。これに対し、
処理マウスからの腫瘍(B)は、腫瘍の大部分が壊死部(NT)であり、わずか
に周縁に生存腫瘍(VT)が残っているだけであることを示すCs=皮膚)。(
A′。
A“′)および(B’、B“1)は、未処理腫瘍が均一な生存膿瘍(VT)から
ほとんど構成され、一方処理腫瘍が結合組織嚢(c t)に隣接した目に見える
厚さの生存細胞の周縁を示すことを明らかにする腫瘍の周縁部からのより高倍率
の領域である。処理腫瘍の大部分は中央壊死の大きな領域を示し、そして腫瘍周
縁のいくつかの領域において、全ての腫瘍細胞は壊死であり、一方、その他の領
域である生存腫瘍周縁部においてわずかな細胞の厚さが残っているのみである(
E’″、二重矢印)(倍率:A、B=X5.バー=1mm;A’、B’=x26
.バー=200μm;A”、B”=x280.バー=20μm)。
発明の詳細な説明
本発明の上記および種々のその他の目的は、シュードモナス固有の外毒素の受容
体結合性ドメインIa内に欠失を含むタイプの改良されたシュードモナス外毒素
(PE)であって、該改良は、PE分子のドメインIaに少なくとも1個のりジ
ン残基を有し、さもなければ受容体結合性ドメインIaに欠失を育する場合にリ
ジン残基を欠くであろう組換えPE分子からなり、前記リジン残基は組換えPE
のその他の分子(例えば抗体等)への有効なカップリングのための実質的な結合
を供給する、前記改良されたシュードモナス外毒素により達成される。
PEが抗体またはその他の標的性分子に化学的に結合する場合に、PEをその他
の分子にカップリングするためにリジン残基が必要とされる。ドメインエがPE
から欠失されてドメイン■のリジン残基12個全てが失われている場合、分子の
その他の部分(例えばドメイン■)にある3個の残基の1つがPE40を抗体ま
たは別の標的性分子に結合するために使用されなければならない。
しかしながら、これら3個のりジン残基の1つが使用される場合、低活性の複合
体が得られる( Kondo等、 J、 BioL、 Chertr、 263
:9470.1988 ) 。この問題を克服し、そして高活性の複合体を得る
ために、ドメインエのほとんど(残基6−252)を欠失するが、ドメインIに
本来存在する12個のりジン残基の1つを残すことにより新規PE分子が創成さ
れた。本発明に係るこの新規分子は本明細書においてLysPE40と表記され
る。
新規分子の免疫毒素構築物への作用を示すために、2種類の新規免疫毒素、第一
にantiTac抗体に複合させたLysPE40、および第二にヒトトランス
フェリン受容体に特異的な抗体(an t 1−TFR)に複合させたLysP
E40が作成された。
特記しない場合、本明細書で使用されている全ての技術および科学用語は本発明
の属する技術の通常の熟練者により通常理解されているものと同様の意味を有す
る。
本明細書に記載されている同様または等価のあらゆる方法および材料が本発明の
実施または試験において使用され得るけれども、好ましい方法および材料はここ
で記載される。以下に記載される全ての刊行物は参照により本明細書に編入され
る。特記しない限り、本明細書で使用されている技術は当業者に十分に公知の標
準的な方法論である。材料、方法および実施例は説明のためだけのものであり、
限定するものではない。
本明細書中で使用される[抗体jという用語は、抗原に結合し得る免疫グロブリ
ン分子(W、 E、 Paulii、r基礎免疫学J (’Fundament
al [mmunolagy”)、 Raven Press。
N、 Y、、 1984. I)[1,131−165:lの一部を意味する。
この定義に従って、「抗体」という用語は種々の形態の修飾または改変された抗
体、例えば免疫グロブリン自体、軽鎖および重鎮可変領域のみを含むFv断片、
可変領域および一部の不変領域を含むFabまたは(Fa、b)’□断片、−重
鎖抗体(Bird等、 1988.5cience 242.424−426;
HuStOll等、1988. Proc、 NatL、 Acad、 Sc
i、 IJsA 85゜5879−5883)等を包含する。抗体は動物(特に
マウスまたはラット)もしくはヒト起源であっても、またはキメラ(Morri
son等、1984. Proc、 NatL、 Acad、 Sci、 IJ
sA 81、6851−6855)もしくはヒト化されたもの(Jones等。
1986、 Nature、 321.522−525および公開英国特許出願
第8707252号)であってもよい。本発明における使用に適当である抗体を
製造する方法は当業者に十分公知であり、そしてHarlow & Lane、
Antibodies: A Laboratory Manual、 Co
1d Spring Harbor Laboratory、 1988のよう
な刊行物の記載をみることができる。抗体鎖をコード化する遺伝子は当業者に公
知のあらゆるクローニング方法により、cDNA中で、またはゲノム形態でクロ
ーン化されてもよい。例えば、Maniatfs等、 Mo1ecular C
lonfng: A t、aboratory Manual、 Co1d S
pring Harbor Laboratory、 1982参照。
本明細書で使用される「顕著な細胞毒性なしに」という用語は、本発明の融合タ
ンパク質が容易に感知できる程度または異常なレベルまで非標的化細胞の通常の
機能に影響を及ぼさないことを意味する。
組換え抗体−LysPE40融合タンパク質は1本のポリペプチド鎖または2本
の鎖を含み得る。本明細書に開示された例は1本鎖の場合に関する。2本鎖を製
造するために、アミノ酸リンカ−はV、配列とVLl配列の間に挿入されないで
あろう。その代わり、終止コドンがv、l配列の後ろに挿入され、そして開始コ
ドンとリポソーム結合性配列がVLl配列前に挿入されるであろう。
本発明の別の実施態様において、VLおよびV、配列にはそれぞれ軽鎖および重
鎮不変領域の一部または全部、例えば全体のカッパ軽鎖不変領域および重鎮不変
領域のC,1ドメインが重鎖ヒンジドメインと共にまたはなしで続(であろう。
V L 、 V HおよびPE40遺伝子はあらゆる順序でプラスミドに現れて
もよく、従って、PE40遺伝子は軽鎖または重鎮遺伝子いずれかの5′または
3′末端のいずれかに結合され得る。当業者は、さらに修飾、欠失、挿入等が抗
体およびPE40遺伝子になされ得ることを知っているであろう。特に欠失また
は変更は、標的細胞に対する融合タンパク質の細胞毒性を高めるか、または抗体
に対する抗原のない細胞に対して細胞毒性を減らすために、LysPE40また
は抗体遺伝子をLysPE40に連結するリンカ−においてなされてもよい。全
てのそのような構築物は当業者に十分公知な遺伝子操作の方法により行われ得(
一般にはManiatis等、同上、参照)、そして様々な臨床用途または生物
学的用途に特に適したものとする親和性、特異性、安定性および毒性の異なる特
性を存するタンパク質を製造し得る。
材料および方法
以下の実施例が説明のために提示されるが、これに限定されるものではない。
LysPE40をコード化し、そして培地中にそれを分泌するベクターの構築
プラスミドpVC4(pJH4を5phlおよびTthlllIで処理し、そし
てPE遺伝子を含む大断片を再び連結することによりpJH4から誘導される)
をCha’udhary等、 Proc、 NatL、 Acad、 Sci、
8A 85.2929−2943、1988に記載されるようにOmpAシグ
ナル配列に結合し、pVC45を製造した。部位関連突然変異誘発は欠失体を作
成する便利な方法であり、図1に示されるLysPE40を産生するプラスミド
pJY85L、を創成するために用いられた。pVC45内のPE遺伝子のHi
ndI[[/5afl断片をクンケルの方法(Kunkel。
T、 A、 Proc、 Mate、 Acad、 Sci、 IJsA 82
.488−492.1985)により調製された一本鎖DNAを含む、M13、
mp19およびウラシル中にクローン化した。以下の構造=5’ CCAGGC
TGCCGCCCTTGAAAGCTTGGCGTAATCATG 3’の長さ
36ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが合成され、これはPE中にアミノ酸6
ないし252の間の大きな欠失を生じ、そしてアミノ酸5と253の間にリジン
残基が保持されており、次式:
%式%
の配列を有する分子を得た。
176bpのHindI[[/Sai’I断片をM2S内の突然変異DNAの複
製体から切除し、モしてpVC45の3.3kbのHindIf[/5afI断
片と連結して、以下の構造:
Met−Lys−Lys−Thr−Ala−IIe−Ala−11e−Ala−
VaI−Ala−Leu−Ala−Gly−Phe
↓
Al a−Th r−Va l−A Ia−Gl n−Al a−A 1a−A
s n−Leu−Gl u−Glu−Ala−Phe−Lys
cty−cxy−ser 、、、。
を有するタンパク質をコード化するpJY85Lが得られた。このタンパク質は
(↓)でプロセシングされ、そしてプロセシング後の生成物は培地中に分泌され
た。プラスミドが大腸菌BL21(λDE3)細胞中に発現されたとき、Lys
PE40が培地中に見出され、そしてリットルあたりImgより多い収量で培地
から精製された。そのアミノ末端のアミノ酸配列はDNA配列から予測されたも
のであることが判明した:
H!N Al、a−Asn−Leu−Ala−Glu−Glu−Ala−Phe
−Lys−Gly−Gly−Ser(数字は本来のPE構造におけるアミノ酸の
位置を示す)プラスミドpJY85Lの寄託は、アメリカ合衆国。
20852メリーランド、ロツクヴイレ、パークロウン・ドライブ12301の
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(A、 T CC’)に198
9年12月18日に行い、寄託番号は68189である。寄託物は寄託日から3
0年間または寄託試料の最後の請求日から5年のより長い方の間生存したまま保
管され、もし生存していない場合は再寄託するであろう。そして法律に特に制限
のない場合一般に分譲される。特許および商標症の長官は請求に応じて寄託物を
利用するであろう。
LysPE40の発現
BL21 (λDE3)細胞をプラスミドpVC85Lで形質転換し、そして1
00μg / m lアンピシリンを含むLB培培地中子7℃増殖させた。吸光
度0. 6 (650nm)でイソプロピル−1−チオ−β−ガラクトピラノシ
ドを最終濃度1mMまで添加した。細胞を90分後に集めた。タンパク質のほと
んどが培地中に分泌されたので、培養培地をLysPE40の供給源として使用
した。 LysPE40の精製
LysPE40を含存する清澄化培養培地25リツトルを冷却脱イオン水で4倍
に希釈し、そして10×5.5cmシリカをベースとした陰イオン交換カラム(
QMA、ウォーターズ)に100ml/分の流速で注入した。カラムを0.05
Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7,0)で洗浄し、そしてタンパク質を平衡緩
衝液中の0,25M NaCf2リツトルで溶離した。QMAカラムからのLy
sPE40をアミコンYM30メンプランを用いて150mlまでさらに濃縮し
、0.02M)リス−MCI! (pH7,6)に対して12−16時間透析し
、110000Xで20分間遠心分離し、そして0.02Mトリス−HCf (
pH7,6)で平衡化した2、5X14cmのQ−セファロースカラムに注入し
た。タンパク質を0−0.5M NaC1のリニアグラジェント500mlで溶
離し、LysPE40含存画分をSDS PAGEにより検出し、プールし、0
. 02M Mes (pH5,5)で10倍に希釈し、そして0.02M M
es (pH5,5)で平衡化したFPLCMono S 18/10カラムに
載せた。LysPE40はカラムに結合し、モして0−0.5MNaCl!のり
ニアグラジェント100mAで溶離された。それをさらに1mM EDTA含有
の0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7,0)を用いてTSK250(22
,5X 660mM)カラム(バイオラド)で精製した。
免疫複合体の構築
1mM EDTA含有の0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7,0)中のL
ysPE40 (2,5mg/mIりを3倍モル過剰のSMCCと混合し、そし
て室温(約22−24℃)で30分間保温した。タンパク質をPDIOカラム上
の未反応クロスリンカ−から分離した。
MoAb (HB21またはαTac)(5−10mg/mf)を、1mM E
DTA含有の0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH8,0)中の3倍モル過剰
の2−イミノチオラン−HClと混合し、そして37℃で1時間保温した。誘導
された抗体がPDIOカラム上の反応体から分離された。免疫毒素を製造するた
めに、誘導化L75PE40および誘導化抗体が4=1のモル比で混合され、そ
して室温で16−20時間保温された。免疫毒素を次にmonoQおよびTSK
250カラムでの連続クロマトグラフィーにより精製した。
有効性を決定するために、2種の異なる免疫毒素が準備され、そして使用された
。1つはヒトトランスフェリン受容体(TFR)に結合するan t f −T
FR−LysPE40であり、そして他方はヒトIL2受容体の55kDサブユ
ニツトに結合するanti−Tac−LysPE40である。
5DS−PAGEおよびイムノブロッティング5DS−PAGEは文献に記載さ
れている。
タンパク質合成阻害アッセイ
複合体の活性がA431.KB、HUT 102.HT29.0VCAR2,0
VCAR3,0VCAR4,CEMおよびMOLT4細胞に対してsH−ロイシ
ン取込みを測定することにより試験された(Kondo等、 J、 3i。
L、 CherIl、 263:9470.1988 ) 、 HUT 102
細胞をRPM1640で2回洗浄し、そしてすぐに使用した。免疫毒素を細胞へ
の添加前にPBS中の0.2%ヒト血清アルブミンで希釈した。
マウスにおけるan t 1−TFR−Ly s PE 40の血液レベルのア
ッセイ
A431を生じるBALB/Cマウスまたはヌードマウスに免疫毒素100μg
または50Mgを1.P、注射した。異なる時点で採血し、そして血清をA43
1細胞と保温し、タンパク質合成への影響を測定することによりITのレベルを
調べた。標準曲線はantt −TFR−LysPE40を用いて作製された。
ヒト類表皮腫瘍を生じるヌードマウスにおけるanti−TFR−Ly s P
E 40の抗腫瘍活性A431細胞(cX10@)を0日目にヌードマウスの皮
下に注射した。この注射は5日目までには全てのマウスに検出可能な腫瘍を生じ
た。マウスの処置は腫瘍移植の2.5または9B後のいずれかに始められた。各
処置群は4−6匹の動物から構成される。腫瘍は4日毎にカリバスを用いて測定
され、そして腫瘍の容積は次式:腫瘍の容積(nnm” )=長さ×(輻)”X
o、4を用いて計算された。anti−Tac−LysPE40での試験も同様
に行われた。
上記したように、PE40のアミノ末端は、1個のりジン残基およびOmpAシ
グナル配列を含むように改変された(OmpAシグナル配列はLysPE40の
成長培地への輸送を主として指示するために添加された)。
LysPE40およびT7プロモーターの制御下にあるLysPE40をコード
化するプラスミドの構造は図1に示されている。PE40と同様にLysPE4
0もまた培養培地中に大量に分泌された。各精製段階でのタンパク質の純度は図
2に示されている。第1段階として使用されたTSK250カラムからの物質は
SDS PAGEにより(図21列5)ならびにPEに対する抗体とのイムノブ
ロッティング(データは示していない)により分析された場合に均一であること
が判明した。典型的には、2mgの純粋なLysPE40が培養1リツトルから
得られた。
精製タンパク質(LysPE40)のN−末端配列はA 1a−Asn−Leu
−Ala−G 1 u−A 1a−Phe−Lys−Gl y−Gl y−Se
r−Le uであることが見出された。精製タンパク質はDNA配列から期待
される正確な配列を有し、そしてプロセシングはOmpA配列内に生じていた(
図1)。これに対し、PE40のN末端配列はAla−Asr+−Leu−Al
a−Glu−Glu−Gly−ctyである。
LysPE40を存する免疫毒素の構築LysPE40を2種類のモノクローナ
ル抗体、ヒトトランスフェリン受容体に結合するHB21 (anti−T F
R) (Haynes等、 J、IrnrttunoL、127+347.
1981 )およびヒトインターロイキン2受容体の55kDaサブユニツトに
結合するa n t i −T a c (Uchiyama等、J。
ImruunoL、 126:1393.1981)に化学的にカップリングさ
せた。複合の後に、免疫毒素(IT)をM o n o QおよびTSK250
カラムで精製した。精製複合体は軽鎖および重鎮の両方にカップリングしたLy
sPE40を含み、そしていかなる遊離LysPE40も含まない(図3)。比
較のために、天然のPBを用いた免疫毒素も製造した。
LysPE40を用いて製造された免疫毒素の活性anti−TFR−LysP
E40の活性が種々のヒト細胞株に対してアッセイされ、そして調べたヒト細胞
株の全てにおいてタンパク質合成を阻害した(表1)。
anti−TFR−LysPE40はA4311胞に対してID、。4.0ag
/m7で最も活性だった。特異性は過剰な非複合抗体がanti−TFR−Ly
sPE4゛0の細胞毒性効果を抑制することを示すことにより証明された(図3
A)、anti−TFR−LysPE40はマウス5w1ss3T3細胞に対し
て2 it g/m lでさえも細胞毒性ではなかった(データは示されていな
い)。
ant 1−Tac−LysPE40の細胞毒性活性がHUT 102細胞、I
L2受容体を含むヒトT細胞白血病株に対して決定された。図5に示されるよう
に、anti−Tac−LysPE40はHUT 102細胞においてI Ds
o2.5 n g/mfでタンパク質合成を阻害し、そして過剰のanti−T
acは免疫毒性の特異性を示すこの効果を阻害した(図3B)o anti−T
ac−LysPE40はIL2受容体陰性細胞では2000ag/’mi!でさ
えもタンパク質合成を阻害せず、さらにITの特異性を示した。
マウスにおけるant 1−TFR−LysPE40の血液レベル
B A L B / c マウスに100μg(7)anti−TFR−Lys
PE40を1.P、注射し、そして免疫毒素活性をアッセイするために注射後の
異なる時点で採血した。
図4に示されるように、78μg / m 1の最高血液レベルは注射4時間後
に得られ、そして10μg / m 1のレベルが注射24時間後でも依然と存
在した。同様の実験がA431を生じるアサイミックマウスにおいて行われた。
50μgのantf−TFR−LysPE40を注射した後、27μg / m
1の血液レベルが注射4時間後に、そして24時間後に8μg / m fの
血液レベルが検出された(図4)。
マウスにおけるA431臘瘍へのan t i −TFR−LysPE40の効
果
anti−TFR−LysPE40がヌードマウスにおいて皮下異種移植片とし
てのA431細胞の増殖を阻害する能力に対してアッセイされた。膿瘍を発生さ
せるために、3X10”A431細胞がOB目に皮下注射された。希釈剤のみで
処理した対照群において、膿瘍は非常に迅速に増殖し、そしてその動物は皮膚を
貫通する非常に大きな腫瘍を存していた19日目に殺された(図5゜6)、2,
4.6.8日目にant 1−TFR−L7SPE40を受容した群において、
実験を終えた24日目に腫瘍は認められなかった(図5A、および6)。別の群
の動物において、腫瘍の容積が約125mm”になるまで処置は遅延され、そし
て9,11.13および15日目に行われた。処置が開始されるとすぐに、腫瘍
の大きさの増大が停止しく図5A、および6)、そして柔らかい中心部を発達さ
せた。組織学的試験は、腫瘍中心部のほとんど全ての細胞が生存していなかった
(図7)。
しかしながら、膿瘍の周辺部に多くの生存細胞が観察された。
抗腫瘍効果が投与量に関係するか否かを決定するために、種々の量のanti−
TFR−LysPE40での処置が、小さい腫瘍が出現した5日目に始められた
(図5B)。5μgの投与量でさえも腫瘍増殖の遅延が生じたが、処置が111
日目停止された後、腫瘍は急速に増殖し始めた。投与量が増加されるにつれ(2
0または50gg)、腫瘍のいくつか、または全ては111日目でに検出できな
い程度になったが、時の経過につれ再び現れ、そして増殖した。動物の1群は5
日目にIDs*に近接している150ggの1回投与を受けた。2匹の動物が死
亡したが、その他の3匹の動物において腫瘍が後退し、そして再び現れなかった
。腫瘍と反応しなかった抗体単独または該抗体からなる免疫毒素(MOPC−1
゜ysPE40)が50ggの投与量で投与された場合、抗腫瘍応答は観察され
なかった。
要するに、この結果は、LysPE40が抗体に効率よ(カブブリングされ得、
適当な抗原を産生ずる培養細胞株に対して高活性の細胞毒性を有する免疫毒素を
生じ、そして該抗体が結合しない培養細胞に対する細胞毒性を検出し得ないこと
を示す。さらに、LysPE40にカップリングされたヒトトランスフェリンに
対する抗体からなる免疫毒素(a n t i −TFR−Ly s PE 4
0)はマウスに大量に安全に投与され得、そして皮下に移植された急速に増殖す
るヒト上皮腫瘍の後退を引き起こし得る。
マウスに腹腔内投与した場合、anti −TFRLysPE40は血液中に迅
速に現れた。50ggの投与量は約30μg / m lの注射4時間後の最高
血液レベルを与え、そして血液レベルは24時間で依然として8μg/mfであ
り、この免疫毒素が比較的長い半減期を有することを示した。100μgの1回
投与は80gg/mlの最高血液レベルを与えた。10gのマウスは約1mlの
血液容量を有するから、腹腔内投与4時間後の血液中にほとんど全ての免疫毒素
が見出される。
本明細書に記載された処置プロトコルにおいて、腫瘍細胞は増殖して、処置が開
始される前に検出可能な硬い腫瘍を形成し得た。これらの条件下、8日間にわた
る4回の注射からなる処置は明確な腫瘍後退を引き起こした(図5B)。小さい
腫瘍に対するより低い投与量で、または大きい膿瘍に対して高い投与量レベルで
さえも、生存腫瘍細胞が残った。より長期間の処置を継続することにより、より
大きい抗腫瘍効果が達成され得るであろう。
しかしながら、プロトコルは標準的化学療法に耐性の硬い腫瘍の著しい後退を生
じた。それ故に、LysPE40は標的特異性抗体に結合したとき強力な免疫毒
素として作用することを示す。
本発明に係る治療性組成物は、標的特異性リガンドにカップリングしたLysP
E40の標的細胞を殺すための有効量および薬学的に許容性の担体からなる。該
標的細胞は選択的に殺されることが所望され、そして前記リガンドが特異的に結
合する結合性部位を育するものである。
もちろん、抗体以外のリガンド、例えば受容体、成長因子および標的細胞を選択
的に認識する分子が、本明細書に記載された方法論と同様にLysPE40にカ
ブブリングされて、標的特異性細胞毒性体が得られる。
本明細書に記載された実施態様は説明のためだけのものであり、そして本明細書
の記載から種々の変形または変更は当業者には考えられ得るものであり、それら
は本願の精神および範囲ならびに添付された請求の範囲内に包含されるべきもの
であることが理解される。
表 I
種々のヒト細胞株へのant 1−TFR−LysPE40の活性
A431 4.0 >2000
KB 14.0 >2000
HT29 6.6 >2000
HUT102 21.0 >2000
CEM 22.5 >2000
0VCAR2135,OND
OVCAR3280,OND
OVCAR430,OND
MOLT4 32.OND
′″ID1 はタンパク質合成の50%阻害に必要な免疫毒素の濃度として記載
される。
ND−行われなかった。
表 II
anti−TFR−LysPE40と処理したヌードマウスにおける腫瘍の発生
アサイミックマウスに3X10’A431細胞を皮下注射した。5,7.9およ
び11日目に、動物にanti−TFR−Ly s PE 40を示された投与
量で1.P。
注射した。腫瘍移植後の種々の日の腫瘍を存する動物数/全動物数が示されてい
る。
処置 腫瘍移植後の日数
なし 515 515 515−
5μg 5/6 6/6 6/6 6/6 6/6 −20μg 115 11
5 315 315 315 41550μg O1501511511511
5215150μg” O/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/315
日目に1回投与
’9−ri7v合に、% ”j 叩 FIGa 3A、01 .1 1 10
100 11000n/m1
9−1? 7 ”il ”; Fi’r’ H’ ” ” F IG m 3
B、1 1 10 100 1000 110000n/ml
吋 P:g
FIG、 4
.0 10 20 30 40
要約書
本発明は、適当な抗原または受容体を産生ずる細胞を選択的に殺すLysPE4
0−抗体免疫毒素に関する。
補正書の翻訳文提出書(特許法第184条の8)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.シュードモナス固有の外毒素の受容体結合性ドメインIa内に欠失を食むタ イプの改良されたシュードモナス外毒素(PE)であって、該改良は、PE分子 のドメインIaに少なくとも1個のリジン残基を有し、さもなければ受容体結合 性ドメインIaに欠失を有する場合にリジン残基を欠くであろう組換えPE分子 からなり、前記リジン残基は組換えPEのその他の分子への有効なカップリング のための実質的な結合を供給する、前記改良されたシュードモナス外毒素。 2。標的特異性リガンドにカップリングした請求項1記載の組換えPEからなる 細胞毒性分子。 3.前記リガンドが抗体または成長因子である請求項2記載の細胞毒性分子。 4.標的細胞を殺すための請求項2記載の細胞毒性分子の有効量および薬学的に 許容性の担体からなる組成物。 5.殺されるべく標的化された細胞を細胞毒性量の請求項3記載の組成物と接触 させることからなる標的化細胞毒性の獲得方法であって、 前記原的細胞は標的特異性リガンドが結合する結合性部位を有するものであるが 、しかし前記組成物は前記結合性部位を欠く細胞に対して検出し得る細胞毒性を もたない、前記方法。
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