JPH08283293A

JPH08283293A - 低−動物毒性と高殺細胞活性の改良シュードモナス外毒素

Info

Publication number: JPH08283293A
Application number: JP8080540A
Authority: JP
Inventors: Ira Pastan; パスタン，イラ; David Fitzgerald; フィッツゲラルド，ディヴィッド; Vijay Chaudhary; チャウドハリー，ヴィジェイ
Original assignee: US Department of Health and Human Services; US Government
Current assignee: US Department of Health and Human Services; US Government
Priority date: 1990-05-11
Filing date: 1996-03-08
Publication date: 1996-10-29
Anticipated expiration: 2014-09-06
Also published as: DE69131449T2; US5512658A; US5705156A; DE69131449D1; EP0531434A4; AU646673B2; EP0531434A1; EP0531434B1; ATE182175T1; JPH05502380A; CA2082394C; JP2665827B2; CA2082394A1; JP2946457B2; AU7991891A; DK0531434T3; WO1991018100A1

Abstract

(57)【要約】【課題】低−動物毒性であるが、適当な標的剤と接合さ
せた時に、他の細胞に実質的に影響を与えずに、より大
きい細胞毒性がある、新規な組換えＰＥ分子（ｒＰＥ）
を提供する。【解決手段】ＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０よりなる
組換え変異シュードモナス外毒素（ＰＥ）分子。ＩＬ６
受容体をもつ細胞を死滅させるのに有効な量の該ＰＥ分
子と薬学的に許容される担体よりなる組成物は、接触に
より、ＩＬ６受容体を発現する細胞を死滅させる方法に
使用しうる。並びに、ＩＬ６−ＰＥ４０Δ３６５−３８
０よりなる組換え変異シュードモナス外毒素（ＰＥ）分
子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、概して組換えキメ
ラ外毒素を作成することに関する。更に具体的には、本
発明は、低−動物毒性の（動物に試験した場合低毒性
の）そして適当な標的剤に接合させると高殺細胞特性を
示す組換えシュードモナス外毒素（ｒＰＥ）の改良型を
工夫して作成することに関する。

【０００２】

【従来の技術】本明細書に記載されている性質と特性を
持つ活性キメラ外毒素は以前に知られておらず報告もさ
れていなかった。天然毒素のドメインＩａにおける欠失
を含む組換えシュードモナス外毒素と、それが低い副作
用を示すことは、米国特許第４，８９２，８２７号に記
載されている。しかしながら、ＰＥ分子のいろいろのド
メインにおける各々のアミノ酸、その単独のまたは他の
アミノ酸配列との組み合わせの役目は、知られていなか
った。とはいうものの、ドメインＩａが標的細胞へのＰ
Ｅ分子の結合に要求されるということは、示されてい
た。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ＰＥ分子の動物毒性に関与するアミノ酸配列残基ま
たは配列を同定することである。ＰＥ分子の動物毒性に
影響する特定のアミノ酸の役目を決定した後に、低−動
物毒性であるが、適当な標的剤と接合させた時に、他の
細胞に実質的に影響を与えずに、より大きい細胞毒性が
ある、新規形の組換えＰＥ分子（ｒＰＥ）を構成するこ
とである。本発明の別の目的は、改良された、活性ある
キメラ毒素をいろいろ用意することにより標的細胞を殺
滅するための効果的方法を提供することである。他の目
的と利点は、下記の本発明の詳細な記述により明瞭にな
るであろう。特に述べると、本発明の一つの課題は、特
定の組換え変異シュードモナス外毒素（ＰＥ）分子を提
供することにある。そして、本発明の別の課題は、ＩＬ
６受容体をもつ細胞を死滅させるのに有効な量の該ＰＥ
分子と、薬学的に許容される担体よりなる、組成物、並
びに、該組成物の使用方法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】まず、本発明には、いく
つかの関連する発明がある。その一つの発明は、ドメイ
ンＩａのアミノ酸配列中の４個の陽性に荷電したアミノ
酸が各々グルタミン酸に置換されている約６６，０００
Ｍｒの変異シュードモナス外毒素の合成を統制する遺伝
子を含む、ｐＶＣ４５／４ＥおよびｐＣＳ６４Ｇからな
る群から選択されたプラスミドに関する。ｐＶＣ４５／
４ＥはＡＴＣＣに第６８３１０号の寄託番号で寄託さ
れ、ｐＣＳ６４Ｇは、ＡＴＣＣに第６８３１３号の寄託
番号で寄託されている。関連する別の発明は、一個の標
的剤と一個の細胞毒の変異ＰＥ分子よりなるキメラタン
パク質を製造する方法であって、プラスミドｐＶＣ４５
／４Ｅに標的剤をコードしている遺伝子を付加すること
により新規のプラスミドを構成し、次いで適当な発現ベ
クター中の新規プラスミドを発現することにより該標的
剤を含むキメラタンパク質を取得する段階からなる方法
に関する。また、関連する他の発明は、アミノ酸残基２
４５ないし２４９の内の少なくとも一個のアミノ酸置換
またはアミノ酸残基２４１ないし２５０の欠失を含むも
のであって、前記アミノ酸置換または前記アミノ酸欠失
がアミノ酸残基２４５ないし２４９内の総荷電を陽性か
ら中性または陰性に変えそしてこれによって分子の毒性
活性を未変異のシュードモナス外毒素分子と比較して大
きく減少せしめている組換え変異シュードモナス外毒素
（ＰＥ）分子に関する。陽電荷のないアミノ酸残基は、
グルタミン酸およびグリジンよりなる群から選択され
る。また、ＰＥアミノ酸残基Ｈｉｓ−２４６、Ａｒｇ
−２４７、Ｈｉｓ−２４９は、各々陽荷電のないアミノ
酸残基により置換されている。より明確には、前記のＰ
Ｅは、例えば、ＰＥ−Ｇｌｕ−２４６，２４７，２４
９、ＰＥ−Ｇｌｕ−５７，２４６，２４７，２４９、Ｐ
Ｅ−Ｇｌｕ−５７Δ２４１−２５０、およびＰＥ−Ｇｌ
ｕ−５７−Ｇｌｙ−２４６，２４７，２４９よりなる群
から選択される。また、上記のＰＥは、細胞上の特異部
位を死滅すべき標的とされたと認識する標的剤に結合さ
れた上記ＰＥであって、生じた、標的剤に結合されたＰ
Ｅは、同じ標的剤に結合された未変異のＰＥ分子と比較
して改良された特性を有する。標的剤は抗体またはその
断片、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、抗
原および受容体よりなる群から選択される。より明確に
は、上記のＰＥは、ＩＬ６−ＰＥ６６−４Ｇｌｕ、ＩＬ
６−ＰＥＧｌｕ５７Ｇｌｙ−２４６，２４７，２４９、
ＴＧＦα−ＰＥ６６−４ＧｌｕおよびＣＤ４−ＰＥ６６
−４Ｇｌｕよりなる群から選択される。

【０００５】そして、本発明の一つの発明は、ＩＬ６−
ドメインＩＩ−ＰＥ４０よりなる組換え変異シュードモ
ナス外毒素（ＰＥ）分子に関する。また、本発明は、Ｉ
Ｌ６受容体をもつ細胞を死滅させるのに有効な量の上記
ＰＥ分子と、薬学的に許容される担体よりなる、組成物
に関する。さらに、本発明は、ＩＬ６受容体を発現する
細胞を殺細胞量の上記の組成物と接触させることよりな
る、ＩＬ６受容体を発現する細胞を死滅させる方法に関
する。また、本発明は、ＩＬ６受容体をもつ細胞を死滅
させるのに有効な量のＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０
と、薬学的に許容される担体よりなる、ＩＬ６受容体を
発現する細胞を死滅させる用途のための組成物に関す
る。さらに、本発明は、ＩＬ６受容体をもつ細胞を死滅
させる殺細胞有効量のＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０
と、薬学的に許容される担体よりなる、組成物を、ＩＬ
６受容体を発現する細胞を死滅させるための医薬の製造
に使用する方法に関する。そして、本発明の他の発明
は、ＩＬ６−ＰＥ４０Δ３６５−３８０よりなる組換え
変異シュードモナス外毒素（ＰＥ）分子に関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】略号本明細書で使用するいろいろの略号、記号、述語等を次
に記載する。ＰＥ−４０は約４０，０００ＭｒのＰＥ分
子を意味しそしてドメインＩＩは、毒素を細胞質ゾル中
へ移送するのに必要な領域である（フワング他，１９８
７年，Ｃｅｌｌ４８：１２９−１３６）。ＩＬ６−Ｐ
Ｅ６６−４Ｇｌｕは、約６６，０００ＭｒのＩＬ２とＰ
Ｅ分子からなるキメラタンパク質であり、その中では４
個の＋に荷電したアミノ酸がグルタミン酸（Ｇｌｕ）に
置換されており、ＩＬ２は標的剤である。従って、標的
剤がＴＧＲαまたはＣＤ４および同様のもののような異
なる実態である場合は、従って、キメラタンパク質は、
ＴＧＦα−またはＣＤ４−ＰＥ６６−４Ｇｌｕおよび同
様のものである。従って、もしも置換するアミノ酸がグ
ルタミン酸でない場合は、グリシンが「Ｇｌｙ」と命名
されるように、置換するアミノ酸が命名される。例えば
ＰＥ−Ｇｌｕ５７Ｇｌｙ２４６，２４７，２４９のよう
な番号付けが行われるとき、それは、天然ＰＥの配列中
の位置５７におけるアミノ酸がグルタミン酸により置換
されそして位置２４６，２４７と２４９におけるアミノ
酸がグリシン（Ｇｌｙ）により置換されていることを意
味する。２４１−２５０、またはＤ３６４−３８０のよ
うに、記号「△」または「Ｄ」が使用される場合、文字
「Ｄ」または「△」に続くアミノ酸配列、即ち、これら
の例に含まれるアミノ酸２４１ないし２５０までまたは
アミノ酸３６４−３８０が欠失していることを意味す
る。

【０００７】図面の簡単な説明本発明のこれらと他の目的、特徴およびそれに付随する
特徴は、下記の図面を参照することによりさらによく理
解されるであろう。図１は、ＰＥ変異体の発現ベクター
の構造を線図で示している。そのベクターは、開始コド
ンの前に適当に配置されているリボゾーム結合位置を持
つＴ７プロモーターの下流でＰＥをコードしている配列
を含む（チャウドハリー他，１９８８年，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２９
３９−２９４３；スツジールとモハット，１９８６年，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０；ロー
ゼンベルグ他，１９８７，Ｇｅｎｅ５６：１２５−２
３５）。タンパク質の発現は、このプラスミドを持つ
Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（λＤＥ３）の培養物のＩＰＴ
Ｇ誘導により実施される。ＯｍｐＡシグナル配列がある
ので、そのタンパク質はペリプラズム中に分泌される。
シグナル配列が存在しないと、それらは細胞内に蓄積す
る。シグナル配列のプロセシングの後で三個のアミノ酸
延長（ａｌａａｓｎｌｅｕ）が残っている。水平方
向の太線の矢印は翻訳の方向を示している。ＰＥの残部
は一周しており、１は成熟ＰＥの第１番目のアミノ酸で
ある（グレイ他，１９８４年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：２６４５−２６
４９）。始めのｐＶＣ４５は、Ｔ７翻訳ターミネーター
（Ｔ）、並びに、ファージ起源（ｆ＋）が欠如してい
る。垂直方向の矢印はシグナル配列の切断部位である。
図２は、ＩＬ６−ＰＥ４０誘導体を線図で示したもので
ある。図３は、ＰＥ変異タンパク質のドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動を示してい
る。試料をラメリ緩衝液中で煮沸し、１０％ドデシル−
ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上に適用
する。タンパク質をクーマッシェ青Ｒ−２５０で染色す
る。レーン１と２，ＰＥ；レーン３と４，ＰＥ^Glu57 ；
レーン５と６，ＰＥ^{Glu246,247,249}（ＰＥ６６−４Ｇｌ
ｕ）；レーン７と８，ＰＥ^{Glu57,246,247,249} 。レーン
１，３，５と７は、ペリプラズムの試料であり、レーン
２，４，６と８は、ＭｏｎｏＱフラクションであ
る。標準分子量マーカーをｋＤａで示す。図４ないし図
７は、ＰＥ変異タンパク質のＭｏｎｏＱのプロフィー
ルを示す。タンパク質は、ファージＴ７ターミネーター
を持つプラスミドを使用して発現した。培養液１５０ml
に等量の各々のペリプラズムの試料をＭｏｎｏＱカラ
ム（ＨＲ５／５）上に適用しそしてそのカラムをＮａＣ
ｌ（２０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．６中で０−４００ｍ
Ｍ）直線グラジエントで溶離する。１ｍｌのフラクショ
ンを採取した：Ａ（図４），ＰＥ；Ｂ（図５），ＰＥ
^Glu57 ；Ｃ（図６），ＰＥ^{Glu246,247,249}；およびＤ
（図７），ＰＥ^{Glu57,246,247,249} 。垂直の矢印は興味
のあるピークの位置を示している。図８は、Ｓｗｉｓｓ
３Ｔ３細胞に対するＰＥ変異体の細胞毒素を示す。
タンパク質いろいろの希釈液をＳｗｉｓｓ３Ｔ３細
胞に添加し、タンパク質合成を測定した。結果を、トキ
シンが添加しない対照の％として表現する：○−○，Ｐ
Ｅ；□−−−□，ＰＥ^Glu57 ；■−−−■，ＰＥ
^{Glu246,247,249}；および△−−−△，ＰＥ
^{Glu57,246,247,249} 。図９は、発現したＩＬ６−ＰＥ４
０−ＰＥ４０（レーン１），ＩＬ６−ＰＥ４０−ＩＬ６
（レーン２），（ＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０（レ
ーン３），ＩＬ６−ＰＥ４０（レーン４），ＩＬ６−Ｐ
Ｅ４０Ｄ３６４−３８０（レーン５）およびＩＬ６−Ｐ
Ｅ６６^4Glu（レーン６）のＮａＤｏｄＳｏ₄ ／ＰＡＧＥ
をそれぞれ示す。１０．０％タンパク質ゲルをクーマッ
シー青（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ）で染色する。
標準分子量をｋＤａで示す。図１０は、Ｕ２６６細胞へ
のＩＬ６−ＰＥ４０誘導体の殺細胞活性を示す。キメラ
毒素をいろいろの濃度で細胞（５×１０⁵ 細胞／ｍｌ）
に添加し、細胞タンパク質への［ ³Ｈ］ロイシンの取込
みを測定する。ＩＬ６−ＰＥ４０（○），ＩＬ６−ＰＥ
４０−ＰＥ４０（●），ＩＬ６−ドメインＩＩＰＥ
（Ｘ），ＩＬ６−ＰＥ４０（Ｘ），ＩＬ６、−ＰＥ４０
−ＩＬ６（□），ＩＬ６−ＰＥ６６^4Glu（■）。図１１
は、Ｕ２６６細胞［５×１０⁵ 細胞／ｍｌ］を使用する
ＩＬ６競合検定の結果を示す。ＩＬ６−ＰＥ６６^4Gluと
ＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０を、１０００ｎｇのｒ
ＩＬ６の存在下または非存在下細胞に添加する。細胞を
２４時間インキュベートし、タンパク質合成を細胞毒性
検定と同様にして測定した。図１２は、結合置換検定の
結果を示す。１０ｎｇの ¹²⁵Ｉ−ＩＬ６の存在下、ＩＬ
６キメラタンパク質を細胞へ、いろいろの濃度（同じモ
ル比）で添加する：ｒＩＬ６（○），ＩＬ６−ＰＥ４０
（●），ＩＬ６−ＰＥ４０−ＩＬ６（□），ＩＬ６−Ｐ
Ｅ６６^4Glu（■）。

【０００８】発明の詳細な説明本発明の上述のそしていろいろな他の目的と利点は、ド
メインＩａのアミノ酸配列中の特定の点変異といろいろ
の欠失を含む変形組換えＰＥ分子の多数を作成すること
によりそしてそれらからのキメラタンパク質の多数を合
成することにより実施できる。そのような分子の実体に
含まれるものは、ＰＥ^{Glu246,247,249}，ＰＥ
^{Glu57,246,247,249} ，ＰＥ^{Glu57,Gly246,247,249}，ＰＥ
^Glu57 Δ２４１−２５０，ＩＬ６−ＰＥ
^{Glu57,246,247,249} ，ＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４
０，ＴＧＦａ−ＰＥ６６^4Glu，ＣＤ４−ＰＥ６６^4Gluお
よび同様のものである。本発明を上述の新規の分子実体
の多数の合成と試験により例示したので、いろいろの他
の分子実体はここに記述した方法により同様に合成でき
そしてこの発明の範囲に包含されることに注目する。他
に定義しない限りは、全ての技術術語と科学術語は、こ
の発明の分野に属する当業者に理解されるのと同様の意
味を持つ。しかし、ここに記述したそれらと同様または
同等の方法と物質は、本発明の実施と試験に使用でき、
好ましい方法と物質はここで記述する。以下述べる公刊
物は引用によりここに包含される。他に記述のない限
り、ここで使用または考慮される技術は当業者に周知の
標準的方法である。物質、方法および例は説明だけのも
のであって、限定を意図していない。術語の「組換え」
変異体、分子、またはＰＥおよび同様のものは、ここで
は変異体、分子またはＰＥ等を意味し、天然の産物では
なく、分子生物学および同等のものの技術により計画的
に作成されたものである。術語の「実質的影響のない」
は、細胞の正常機能が検出できる程度に影響を受けてい
ないことを示す。

【０００９】物質と方法動物毒性に関与する配列の決定：配列の検討変異体は、標準のオリゴヌクレチオチドを用いた変異誘
発により発生させた（ジンノ他，１９８８年，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１３２０３−１３２０７）。
変異を含むＤＮＡ断片を、ＰＥ発現ベクターｐＶＣ４５
（チャウドハリー他，上述）またはｐＶＣ４５ｆ＋Ｔ
（ジンノ他，１９８９年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６４：１５９５３−１５９５９）中へサブクローンし
た。ある種の変異は新しい制限酵素部位も導入した。変
異は、シークェナーゼ（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用するＤＮＡ配列決定
法により最終的に決定した。

【００１０】タンパク質の発現と精製プラスミド（スツジールとモハット，上述）を担持して
いるＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（λＤＥ３）の培養液をア
ンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地中
で生育した。０．６−０．８のＯＤ₆₅₀ で培地にｌｍＭ
のＩＰＴＧを誘導し、３７℃で約９０分間にわたり震盪
した。ＯｍｐＡシグナル配列の存在は、ＰＥ変異体タン
パク質をペリプラズム中へ分泌する原因になる。ＰＥを
下記のようにしてペリプラズムから抽出した：誘導期間
の最終点で、１５０ｍｌの培地を１０分間にわたり２０
００×ｇで遠心分離し、ペレットを７．５ｍｌの蔗糖溶
液（３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４，１ｍＭ
ＥＤＴＡ中２０％蔗糖）中にけん濁し氷上１０分間放
置した。その蔗糖けん濁液を、１０分間５０００×ｇで
遠心分離し、ペレットを回収した。ペレットを６ｍｌの
冷水中に静かにけん濁し、１０分間氷上に置き、１０分
間１０，０００×ｇで遠心分離した。この上澄み液（ペ
リプラズム）を回収し、ファルマシアＰＰＬＣ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａＰＰＬＣ）に付いているＭｏｎｏＱカ
ラム（ＨＲ５／５）上に適用した。５ｍｌの緩衝液Ａ
（２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ７．６）で洗浄
し、４０ｍｌのＮａＣｌ（緩衝液Ａ中０−４００ｍＭ）
で、次いでＮａＣｌの急勾配グラジエントで展開した。
ＰＥ変異タンパク質を、０．２２−０．２６ＭＮａＣ
ｌで抽出した。

【００１１】分析検定と動物毒性ＡＤＰ−リボシル化活性は、コリールとカンデル（１９
７１年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１４６：１４９６−
１５０３）により記述されているようにして推定され
た。細胞毒性活性を測定するためには、Ｓｗｉｓｓ３
Ｔ３細胞１０⁵／ｍｌを、毒素を添加する前に、２４
孔皿中で２４時間接種した。精製したタンパク質を、
０．２％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するズ
ルベコ燐酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中で希釈し、細胞
に１６−１８時間添加した。細胞を［³Ｈ］−ロイシン
で９０分間にわたりパルス−標識化し、トリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）沈澱性細胞随伴放射活性は、タンパク質合成
の尺度として測定された。結果を、毒素が添加されてい
ない対照のパーセントとして表した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥ
をラエムリ（１９７０年，Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８
０−６８５）により記述されたようにして実施した。タ
ンパク質のバンドをクーマッシー青Ｒ−２５０（Ｃｏｏ
ｍａｓｓｉｅＢｌｕｅＲ−２５０）で染色すること
により可視化した。タンパク質の濃度を、ウシ血清アル
プミンを標準として使用して、クーマッシー青Ｇ−２５
０結合検定（バイオラドプロテイン検定（Ｂｉｏ
ＲａｄＡｓｓａｙ））により測定した。動物毒性を試
験するために、精製した毒素を、０．２％ＨＳＡを含有
するＤＰＢＳで希釈し、０．５ｍｌを８週令のマウスに
Ｉ．Ｐ．注射し、４８時間後に死亡したマウスの数を測
定した。

【００１２】ＰＥの発現とＰＥの変異型新規の変異体のヌクレオチド配列を、表Ｉに示してあ
る。複数の変異をしたタンパク質は、連続するサブクロ
ーニングにより作成した。マウス中と細胞培養物中にお
けるＰＥの変異体の細胞毒活性を分析するためには、こ
れらのタンパク質の大量を殆ど同質になるまで精製する
必要がある。これは、Ｔ７プロモーターに基づく発現ベ
クター（その中でＰＥをコードしている配列の前にＯｍ
ｐＡシグナル配列がある。（図１））を構成することに
より達成された。このベクターを使用して、大量の可溶
性のＰＥをペリプラズム中に分泌する。典型的な試験で
は、ＰＥはペリプラズム中に約２０−５０％のタンパク
質を包含し（図３），レーン１，３，５と７）、７０％
純度またはそれより高い純度の分子はＭｏｎｏＱ上の
一回のイオン交換精製段階により得られる（図４ないし
図７と図３，レーン２，４，６と８）。変異に依存し
て、タンパク質は０．２２ないし０．２６ＭのＮａＣｌ
濃度で溶離される。例えば、４個の塩基性残基が酸性残
基に変換したＰＥ^{Glu57,246,247,249} は、ＰＥより後に
溶離された（図４ないし図７）。ＯＤ₆₅₀ ０．８で誘導
した培地１ｌからの典型的な収率は、実質的に純粋な
（＞９０％）タンパク質で１５−４５ｍｇの範囲にある
（表II）。

【００１３】ＰＥと変異型ＰＥの細胞毒性と動物毒性表III に示したように、ＰＥ^Glu57 とＰＥΔ６−２２５
は、３Ｔ３細胞に同等の細胞毒活性を持ちそしてマウス
についても同等の毒性（ＬＤ₅₀＝１μｇ）を持つが、一
方アミノ酸４−２５２の欠失を持つＰＥ４０は、３Ｔ３
細胞に対する毒性は検出できず、マウスに対してかなり
より低い毒性（ＬＤ₅₀＝５０μｇ）を持つ。ＰＥ^Glu57
とＰＥΔ６−２２５の高細胞毒活性に関与するドメイン
Ｉのカルボキシル末端における配列を精密に決定するた
めに、ドメインＩの増加する量を除去する一連の欠失の
創作を行った。これらの変異体の３Ｔ３への細胞毒活性
を表IVに示す。ドメインＩａの殆ど全ては、３Ｔ３細胞
へのこれら変異体の活性を減らさずに除けた。例えば、
アミノ酸６−２４５の欠失を持つ変異分子はＰＥ^Glu57
と同等の活性を持つ。これらデータは、アミノ酸２４６
−２５２が高細胞毒性に寄与していることを示している
だろうことを示している。Ｌｙｓ⁵⁷はＧｌｕに変換する
と細胞結合を減らしそしてアミノ酸２４１−２５０が欠
失されること（ＰＥ^Glu5,241-250）が一つの実験で確定
された。この分子も、３Ｔ３細胞に対しては検出できる
毒活性を持っていなかった（表IV）。シュードモナス外
毒素の位置２４６，２４７と２４９に三個の塩基性のア
ミノ酸を有するドメインＩａのカルボキシル末端は、ド
メインＩｂにおける３６９，３６８と３６７のアミノ酸
に水素結合していることは注目された（アルレッド他，
１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：１３２０−１３２４）。従って、こ
れらのＰＥ伝達毒性における塩基性アミノ酸の役目を検
討することに決めた。従って、これらのアミノ酸は単独
にまたは組み合わして変異する（表Ｖと図８）。これを
するために、全長のＰＥ分子を利用し、その中でＰＥ受
容体を介する細胞結合を減少させるかまたは無くすため
にｌｙｓｉｎ（リジン）５７をグルタミン酸に変換し
た。２４６，２４７と２４９における三個のアミノ酸を
グルタミン酸またはグリシンの何れかに変換すると、３
Ｔ３細胞への細胞毒活性は大きく減少し、ＰＥ４０に見
られるレベルまで到達した。しかし、それらを個々に変
換すると、細胞毒活性の減少は観察されなかった（表
Ｖ）。２４６（ヒスチジン）、２４７（アルギニン）、
および２４９（ヒスチジン）における陽電気で荷電した
アミノ酸は他の荷電したアミノ酸で置換できるかを決め
るために、若干数の他の置換した変異体を構成した。全
ての３種のアミノ酸をリジンに変換した場合は、細胞毒
活性は影響を受けなかった（表Ｖ）。更に２４６と２４
９における２個のヒスチジンをアルギニンに変換した場
合も、細胞毒の活性は影響を受けなかった。しかし、２
４５，２４７と２４８の位置にグルタミン酸を導入する
と、３Ｔ３細胞への細胞毒活性は大きく減少しそしてＩ
Ｄ₅₀は約６００ｎｇ／ｍｌへ増加した。いろいろなＰＥ
変異体の細胞毒活性は、ドメインＩａ上のカルボキシル
末端に存在するアミノ酸の電荷に関連するように見える
（表Ｖ）。もしも２４５と２４９の位置における電荷だ
けを考慮するならば、正味の正電荷の保持は細胞毒活性
を維持するが、一方中性または負電荷の存在は大きく細
胞毒活性を減少させる。いろいろのＰＥ変異体の毒性
は、若干数の精製した変異体毒素をマウスに注射するこ
とによっても検討した。表VIに示したように、２個だけ
がマウスにおいて低毒性を持っていた。これらの一つ
は、ＰＥ４０（ＰＥΔ４−２５２）であり、他の一つは
ＰＥ^{Glu57,246,247,249} である。Ｌｙｓ⁵⁷をＧｌｕに変
換する変異とＰＥ６−２２９，ＰＥ６−２３９とＰＥ６
−２４５におけるような周辺の配列の多数の欠失は、マ
ウスにおける約１μｇのＬＤ₅₀を持つ分子を生産した。
同様にして、２４６，２４７と２４９における塩基性ア
ミノ酸をグルタミン酸に変換し、そして位置５７におけ
るリジンを保存した変異体においても、マウスにおける
ＬＤ₅₀は約１μｇであった。ＰＥ^Glu57,24 ^6,247,249 に
おけるように二型の変異を組み合わせた時にのみ、細胞
毒活性の大きな減少がありそして動物毒性はＰＥ４０に
おけるようにアミノ酸４−２５２の欠失に等しい。

【００１４】新規のキメラタンパク質の細胞毒活性：Ｉ
１６−ＰＥ４０とその誘導体の研究酵素と化学品は標準の購買源から購入した。インターロ
イキン６は、シーガル他，１９９０年，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌＢｉｏ．に記述されているようにして合成し、精製
した。ＡＤＰ−リボシル化検定は、コリール他，１９７
１年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：１４９６−１
５０３に記述されているようにして行った。放射性物質
はアメルシャム・コーポレーション（ｔｈｅＡｍｅｒ
ｓｈａｍＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（イリノイ州，アー
リントン・ハイ所在）から購入した。

【００１５】動物、細胞系および菌株ＩＬ６−ＰＥ４０と誘導体についての毒性と血清レベル
検定では、８週令の体１８−２０ｇのヌードマウスを使
用した（株Ｂａｌｂ／Ｃ；フレデリックカンサーリ
サーチファシリティ（ＦｒｅｄｅｒｉｃＣａｎｃｅ
ｒＲｅｓｅａｒｃｈＦａｃｉｌｉｔｙ））。Ｈ９２
９とＨ１１１２細胞はＡ．ガズダール（Ｇａｚｄａｒ）
（ＮＣＩ）の贈り物であった。他の全ての細胞株はＡＴ
ＣＣ（メリーランド州，ロックヴィレ）から購入した。
プラスミドは、Ｅ．Ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１中で増殖し、
導入可能なＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つＥ．ｃ
ｏｌｉ株ＢＬ２１（λＤＥ３）中で発現した。

【００１６】プラスミドＩＬ６−ＰＥ４０をコードしているプラスミドｐＣＳ６
８は、（シーガル他，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：９７３８）に記述さ
れているようにして作成した。ＩＬ６−ＰＥ４０−ＰＥ
４０とＰＥ４０−ＩＬ６ＰＥ４０を構成するには、ＰＥ
４０をコードしているＤＮＡをプラスミドｐＶＣ３８７
５（シーガル他，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６４：１４２５６；シーガル他，１９８９，ＦＡＳＥ
ＢＪ３，２６４７）から取り出し、部位変異に処し
（クンケル他，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：４８８）：そしてそ
の変異は、ＮｄｅＩ制限部位を、ＰＥ４０中の最後のコ
ドンの後とＰＥ４０中の最初のコドンの前に導入した。
生成したプラスミド、ｐＣＳＡ２０／Ａ２１をＮｄｅＩ
で切断し、１０８０ｂｐＰＥ４０遺伝子を、ＮｄｅＩで
部分的に切断したプラスミドｐＣＳ６８にリゲートし
た。ＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０とドメインＩＩ−
ＩＬ６−ＰＥ４０を構成するためには、ｐＶＣ３８７５
を部位変異に処し、そしてその変異はＮｄｅＩ制限部位
を、ＰＥ４０の最初のコドンの前とアミノ酸３６４をコ
ードしているドメインＩＩの最後のコドンの後に導入し
た。得られたプラスミド：ｐＣＳＡ２０／Ａ２２は、Ｎ
ｄｅＩで制限し、３３３ｂｐ断片を、ＮｄｅＩで部分的
に切断したｐＣＳ６８にリゲートした。ＩＬ６−ＰＥ４
０Δ３６４−３８０を構成するには、ＩＬ６−ＰＥ４０
をＳａｌＩで部分的に切断し、ＢａｍＨＩで完全に切断
し、そしてｐＣＳ９（シーゲル他，１９８９年，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２５６）からのＳａｌ
Ｉ，ＢａｍＨＩ断片にリゲートした。ＩＬ６−ＰＥ４０
−ＩＬ６を構成するには、ＩＬ６をＢｓｔＸＩとＢａｍ
ＨＩで切断し；ＢｓｔＸＩ部位に近い方に位置している
ＩＬ６配列、アミノ酸Ａｌａ，Ｐｈｅ，Ｌｅｕ，Ａｓ
ｐ，Ｌｅｕ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｖａｌをコードしている
セグメント、および末端であってＰＥ中のアミノ酸５５
６におけるＰｐｕＭＩ部位に到るまで位置しているＰＥ
配列を含む二重のオリゴヌクレオチドにリゲートした。
生成した中間体のベクター、ｐＩＬ６ｉｎｔをＰｐｕＭ
ＩとＥｃｏＲＩで切断し、５８０ｂｐ断片を、同様にし
て切断してｐＣＳ６８から得られた４ｋｂＤＮＡ分子に
リゲートした。ＩＬ６−ＰＥ６６^4Gluを構成するために
は、ｐＣＳ６８をＮｄｅＩで部分的に分解し、ＥｃｏＲ
Ｉで完全に切断して、Ｔ７プロモーターとＩＬ６を含有
する３０００ｂｐベクター断片を得た。全長の変異した
ＰＥをコードしているｃＤＮＡをＮｄｅＩとＥｃｏＲＩ
で切断し、同様に切断したｐＣＳ６８断片中にリゲート
した。変異体のＰＥは、プラスミドｐＪＹ３Ａ１１３６
−１．３（ｐＶＣ４５／４Ｅ）中に搬入した。ＩＬ６−
リンカー−ＰＥ４０を構成するためには、ｐＣＳ６８を
ＮｄｅＩで部分的に切断し、そしてＢｓｕ３６Ｉで完全
に切断した。（Ｇ１ｙ₄ Ｓｅｒ）３（リンカー）をコー
ドし、そして配列に沿って５′未端上のＢｓｕ３６Ｉ部
位に続いていてその３′未端にＮｄｅＩ部位を形成して
いる残りのＩＬ６配列を含む、二重のオリゴヌクレオチ
ドは、調製したｐＣＳ６８ベクター中にリゲートされ
た。ＩＬ６−ＩＬ６−ＰＥ４０を構成するためには、ｐ
ＣＳ６８を部分的にＮｄｅＩで切断しそして両方の（一
カ所で切断した）直線ベクターと（二カ所で切断した）
挿入部のバンドを精製し、互いにリゲートした。図２は
いろいろの構造を線画で図示しそして表VII はプラスミ
ドの番号とここに記述した方法に従ってそれらから誘導
した該当するキメラタンパク質を掲示した。

【００１７】ＩＬ６−ＰＥ４０と誘導体の発現と精製全ての融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ
３）中で発現し、Ｅ．ｃｏｌｉの不溶画分（顆粒画分）
から、（シーゲル他，１９８９年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：９７３８）に記
述されているようにして単離、精製した。簡単に説明す
ると、７Ｍグアニジン−ＨＣｌ中での顆粒画分の変性
と燐酸塩緩衝液中の再生後、融合タンパク質は陰イオン
交換とゲルろ過クロマトグラフィーを使用して均一にな
るまで精製しそして各々の精製した毒素調製物のＡＤＰ
−リボシル化活性を標準法により測定した。

【００１８】ＩＬ６−ＰＥ４０と関連融合タンパク質全てのＩＬ６−毒素融合タンパク質の毒性は、各々の試
験で使用された未処理の腫瘍細胞に対する処理腫瘍細胞
におけるタンパク質合成のレベルを検定することにより
測定した（シーゲル他，１９８９年，Ｐｒｏｃ．Ｎｔ
１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：９７３
８）。キメラタンパク質をいろいろな濃度で細胞に添加
し、２４時間にわたり３７℃でインキュベートした。次
に、細胞タンパク質中への［ ³Ｈ］ロイシンの取込みを
測定した（シーゲル他，１９８９年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：９７３
８）。競合解析を、腫瘍細胞へのＩＬ６−毒素の添加直
前のｒＩＬ６の添加により行なった。

【００１９】受容体結合解析 ¹²⁵ Ｉ−ＩＬ６の特異的結合と標識化工程は、上述した
ようにして行った。これらの実験においては、 ¹²⁵Ｉ−
ＩＬ６の一定量（０．５ｎｇ）を細胞に添加しｒＩＬ６
とＩＬ６−毒素のいろいろな量で競合せしめた。ｒＩＬ
６とＩＬ６−毒素はそれらの各々のモル重量を使用して
等モル量になるように調節した。 ¹²⁵Ｉ−ＩＬ６と競合
体を細胞に添加した後、５分間に一度穏やかに攪拌しな
がら０℃で１５０分間にわたりインキュベートした。次
いで、細胞を、大過剰の結合緩衝液と共に少なくとも３
回遠心分離し、未結合の ¹²⁵Ｉ−ＩＬ６を除いた。次い
で、細胞に付随した放射活性をベックマンガンマカウン
ター中で測定した。

【００２０】ＩＬ６誘導体の動物毒性と血清レベル２−４匹のマウス群を使用して、ＩＬ６−ＰＥ４０，Ｉ
Ｌ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０とＩＬ６−ＰＥ６６^4Glu
の毒性を測定した。キメラ毒素を一回用量で腹腔内
（Ｉ．Ｐ．）投与し、その動物を３日間にわたり観察し
た。血清のレベルを、キメラトキシンの一回Ｉ．Ｐ．投
与の後、血清レベルをいろいろの時間に測定した。生物
活性は、上述したようにしてＵ２６６細胞への血清試料
の細胞毒性を測定することにより測定した。キメラ毒素
の濃度は、Ｕ２６６細胞への精製キメラ毒素の添加によ
り作成した標準曲線と、各々の血清試料のＩＤ₅₀を比較
することにより推定した。図９は、若干数の異なるキメ
ラタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。この研
究で使用した全てのキメラタンパク質は９５％以上の純
度であって、期待したＡＤＰ−リボシル化活性（データ
を示していない。）を持っていた。

【００２１】ＩＬ６−ＰＥ４０誘導体の細胞毒性図１０に示しそして表VII に纏めたデータは、ＩＬ６−
ＰＥ４０誘導体が骨髄腫細胞Ｕ２６６への細胞毒性に基
づいて４種の群に分類されることを示している。群１
誘導体は、Ｕ２６６細胞に対してＩＬ６−ＰＥ４０より
毒性が高く、群２はＩＬ６−ＰＥ４０に等価の毒性であ
り、群３誘導体はＩＬ６−ＰＥ４０より約３倍毒性が少
ないが、一方群４誘導体はＵ２６６細胞に毒性がなかっ
た。群１は２種の毒素からなり、その一番目は、位置５
７，２４６，２４７と２４９に変異を持つ天然のＰＥ
（６６ｋＤａ）に融合したＩＬ６を含有しているＩＬ６
−ＰＥ６６^4Gluである。元々はリジン、ヒスチジン、ア
ルギニンとヒスチジンをコードしているこれらのアミノ
酸はその各々がグルタミン酸に変換していた。ＩＬ６−
ＰＥ６６^4Gluは、骨髄種細胞Ｕ２６６への活性がＩＬ６
−ＰＥ４０より８倍高くて、ＩＤ₅₀＝１．０ｎｇ／ｍｌ
（表VII ）である。群１の第２の部員は、ＰＥ４０が続
いて付いているＰＥドメインＩＩ（アミノ酸２５３−３
６４）に、融合したＩＬ６からなるＩＬ６−ドメインＩ
Ｉ−ＰＥ４０である。ドメインＩＩは、細胞膜を通過す
る毒素のプロセシングと転移に関与する。ＩＬ６−ドメ
インＩＩ−ＰＥ４０は、骨髄腫細胞Ｕ２６６に対してＩ
Ｌ６−ＰＥ４０より１．６倍活性が高く、ＩＤ₅₀＝５ｎ
ｇ／ｍｌ（表VII ）である。群２も２種の部員、ＩＬ６
−ＰＥ４０Δ３６５−３８０とＩＬ６−リンカー−ＰＥ
４０を含む。ＩＬ６−ＰＥ４０Δ３６５−３８０はアミ
ノ酸３６５−３８０（ドメインＩＢの半分のアミノ基）
を欠失したＰＥ４０分子に融合したＩＬ６からなる。ジ
スルフィド橋を含有するアミノ酸３６５−３８０の除去
はＴＧＦα−ＰＥ４０の活性を増すことが見出された。
ＰＥ４０Δ３６５−３８０のＩＬ６変換においては、Ｕ
２６６細胞に対する細胞毒性はＩＬ６−ＰＥ４０のそれ
（ＩＤ₅₀＝８ｎｇ／ｍｌ）と同等であったが、この構成
はＩＬ６−ＰＥ４０よりキメラ毒素のより高い収率をも
たらした（データを示さず。）。群３には２種の誘導体
がある。ＩＬ６−ＰＥ４０−ＰＥ４０は２個の連続する
ＰＥ４０分子に融合したＩＬ６からなる。融合タンパク
質のＰＥ４０部分を二重にすることにより、２個の酵素
的に活性であるドメインを含有することにより分子の細
胞毒活性を増加しようと試みた。新規の融合タンパク質
ＩＬ６−ＰＥ４０−ＰＥ４０はＵ２６６細胞に毒性があ
るが、それはＩＬ６−ＰＥ４０より３倍毒性が少なかっ
た。ＰＥ４０に融合した２個の隣接するＩＬ６分子から
なるＩＬ６−ＩＬ６−ＰＥ４０は、ＩＬ６受容体への結
合を増す目的で開発した。Ｕ２６６細胞への細胞毒活性
では、ＩＬ６−ＩＬ６−ＰＥ４０はＩＬ６−ＰＥ４０よ
り３倍毒性が低く、ＩＤ₅₀は２５ｎｇ／ｍｌであること
を示した。群４は３部員、ＰＥ４０−ＩＬ６−ＰＥ４
０、ドメインＩＩ−ＩＬ６−ＰＥ４０およびＩＬ６−Ｐ
Ｅ４０−ＩＬ６からなる。２種の誘導体ＰＥ４０−ＩＬ
６−ＰＥ４０とドメインＩＩ−ＩＬ６−ＰＥ４０は、Ｐ
Ｅ４０分子またはドメインＩＩ（アミノ酸２５３−３６
４）のいずれもＩＬ６−ＰＥ４０のアミノ末端に結合し
ているという点で類似している。これら分子のいずれも
Ｕ２６６細胞に対して毒性がなく（ＩＤ₅₀＞２５０ｎｇ
／ｍｌ）、低収量のタンパク質を生産した（データを示
さず。）。ＩＬ６のＮ−末端はこれらの付加によりブロ
ックされるので、受容体へのＩＬ６の結合はブロックさ
れているかも知れない。ＩＬ６−ＰＥ４０−ＩＬ６はＰ
Ｅ４０のアミノ末端とカルボキシル末端に融合している
ＩＬ６からなる。この融合タンパク質も実質的には不活
性であった。この結果は、ＰＥ４０のカルボキシル末端
上のＩＬ６はキメラタンパク質の毒活性を阻害している
ことを示している。

【００２２】Ｕ２６６細胞へのｒＩＬ６とのＩＬ６−ト
キシン誘導体の競合Ｕ２６６細胞への増加した細胞毒性を持つ２種のＩＬ６
−ＰＥ４０誘導体のＩＬ６受容体への結合を評価するた
めに、ＩＬ６競合検定を実施した。この試験では、Ｕ２
６６細胞上へのＩＬ６−毒素の細胞毒の影響に競合させ
るために、ｒＩＬ６を過剰に添加した。図１１に示した
ように、ｒＩＬ６の１０００ｎｇの添加は、２５ｎｇ／
ｍｌのＩＬ６−ＰＥ６６^4Gluの細胞毒活性を減らして、
Ｕ２６６細胞上のタンパク質合成を１５％から９８％に
した。同様な結果は、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ６−ドメイ
ンＩＩ−ＰＥ４０を使用した時にも得られた（図１
１）。これらのデータは、ＩＬ６−ＰＥ６６^4GluとＩＬ
８−ドメインＩＩ−ＰＥ４０の両方は、ＩＬ６受容体を
介して特異的に作用することを示している。

【００２３】ＩＬ６受容体の異なる量を発現する細胞上
のＩＬ６−ＰＥ４０、ＩＬ６−ドメインＩＩおよびＩＬ
６−ＰＥ６６^4Gluの影響ＩＬ６−ＰＥ４０は、ＩＬ６受容体の異なる数量を発現
する骨髄腫と肝臓癌細胞系細胞の両方に細胞毒があるこ
とが以前に示された（シーゲル他，１９９０年，上
述）。ＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０とＩＬ６−ＰＥ
６６^4GluがＩＬ６受容体を発現する他の細胞により毒性
があるかどうかを正確に決めるために、いろいろの腫瘍
細胞を測定して見た。更に、これらの同じ腫瘍細胞系へ
のＰＥ６６^4G ^luとＰＥ（天然）の細胞毒性を決定した。
それらの結果は、表VIIIに纏めてある。ＩＬ６−ドメイ
ンＩＩ−ＰＥ４０は、肝臓癌細胞系ＰＬＣ／ＰＲＦ／
５，ＭＥＰ３ＢおよびＨＥＰＧ２に対して、ＩＬ６
−ＰＥ４０より細胞毒性があり（表VIII）、ＩＬ６−Ｐ
Ｅ６６^4Gluは、ＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０または
ＩＬ６−ＰＥ４０よりも、肝臓癌細胞系ＰＬＣ／ＰＲＦ
／５およびＨＥＰＧ２に対して、毒性が高かった。驚
くべきことに、ＩＬ６−ＰＥ６６^4Gluは、ＩＬ６−ドメ
インＩＩ−ＰＥ４０またはＩＬ６−ＰＥ４０のいずれよ
りも、ＨＥＰ３Ｂ細胞に対して僅かに毒性が低かっ
た。肝臓癌細胞系ＳＫ−ＨＥＰは全てのＩＬ６−毒素分
子に対して感受性がなかった（表VIII）。類表皮系の癌
細胞系Ａ４３１とＫＢについても、ＩＬ６−毒素キメラ
類に対するその感受性を評価した。ＩＬ６−ＰＥ４０に
対して感受性のないＡ４３１細胞は、ＩＬ６−ドメイン
ＩＩ−ＰＥ４０とＩＬ６−ＰＥ６６^4Gluに対して中程度
に活性がある。細胞系、ＫＢは全てのＩＬ６−毒素分子
に対して感受性がない。更に、骨髄腫細胞系Ｈ９２９
も、全て３種のＩＬ６毒素に対して感受性であることが
見出されている。これらの同じ細胞系に対する天然ＰＥ
と転換変異したＰＥ，ＰＥ６６^4Gluの細胞毒性も測定し
た。ＰＥは試験した全ての細胞系に対して細胞毒性があ
った（ＩＤ₅₀＝５ｎｇ／ｍｌないし６８ｎｇ／ｍｌ）。
ＰＥ６６^4Gluは試験した細胞系のいずれに対しても細胞
毒性がなかったということは（ＩＤ₅₀＞６２５ｎｇ／ｍ
ｌ）、キメラ分子における可能性のある有用性を示して
いる（表VIII）。競合解析も、類表皮癌細胞であるＡ４
３１と肝臓癌細胞であるＰＬＣ／ＰＲＦ／５とＨＥＰ
Ｇ２への競合剤としてｒＩＬ６を使用して実施した。そ
の結果は、ＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０とＩＬ６−
ＰＥ６６^4GluはＩＬ６受容体に特異的であることを確定
した（データを示さず。）

【００２４】ｒＩＬ６，ＩＬ６−ＰＥ４０および誘導体
による ¹²⁵Ｉ−ＩＬ６の置換キメラ毒素ＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０とＩＬ６−
ＰＥ６６^4GluはＩＬ６−ＰＥ４０より毒性が高いので、
増加した活性は増加した結合によるのかどうかを決める
ことは興味のあることである。この実験のために、 ¹²⁵
Ｉ−ＩＬ６を結合解析のためのリガンドとして使用し
た。骨髄腫細胞Ｕ２６６を、結合緩衝液７０μｌ中５×
１０⁶ 個の細胞当り０．５ｎｇ／ｍｌの ¹²⁵Ｉ−ＩＬ６
と共に、そして次第に増やして添加する量のｒＩＬ６，
ＩＬ６−ＰＥ４０，ＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０お
よびＩＬ６−ＰＥ６６^4Gluと共にまたはなしで、インキ
ュベートした。結果はｒＩＬ６はＩＬ６−ＰＥ６６^4Glu
よりも僅かに多く ¹²⁵Ｉ−ＩＬ６をＩＬ６受容体から立
ち退かすことを示している（図１２）。しかし、ＩＬ６
−ドメインＩＩ−ＰＥ４０とＩＬ６−ＰＥ６６^4Gluが、
¹²⁵Ｉ−ＩＬ６をＩＬ６−ＰＥ４０と同程度に立ち退か
すことは、キメラ毒素類がＩＬ６受容体に同程度の親和
性でもって結合していることを示している。従って、Ｉ
Ｌ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０とＩＬ６−ＰＥ６６^4Glu
の増加する活性は、細胞への増加する結合によるのでは
なくて、キメラタンパク質の他の性質によると結論し
た。

【００２５】ヌードマウスにおけるＩＬ６−ＰＥ４０と
誘導体の毒性抗癌剤としてのＩＬ６−ＰＥ４０，ＩＬ６−ドメインＩ
Ｉ−ＰＥ４０，およびＩＬ６−ＰＥ６６^4Gluの可能性の
ある有用性を決めるために、それらの動物における毒性
を測定した。抗腫瘍感応性を検討するためにヌードマウ
スを使用するので、それらをキメラ毒素の毒性を検討す
るのにも使用した。マウス（２−４匹／群）に、ＩＬ６
−ＰＥ４０については５μｇないし５０μｇ、ＩＬ６−
ドメインＩＩ−ＰＥ４０については５μｇないし３０μ
ｇそしてＩＬ６−ＰＥ６６^4Gluについては５μｇないし
２０μｇの範囲のＩＬ６−毒素類を単一薬量でＩ．Ｐ．
投与した（表IX）。動物を死亡率について７２時間にわ
たり観察した。ＬＤ₅₀は、ＩＬ６−ＰＥ４０とＩＬ６−
ドメインＩＩ−ＰＥ４０については２０μｇそしてＩＬ
６−ＰＥ６６^4Gluについては１０μｇであった。

【００２６】ヌードマウスにおけるＩＬ６−毒素類の血
清レベルヌードマウスに、ＩＬ６−ＰＥ４０、ＩＬ６−ドメイン
ＩＩ−ＰＥ４０とＩＬ６−ＰＥ６６^4GluをＩ．Ｐ．注射
しそして血清試料を５分間、３０分間、１時間、２時
間、４時間、８時間および２４時間で採取した。キメラ
毒素の血清レベルを、投与後のいろいろな時間における
マウス血清中に見出される生物的に活性のある物質の細
胞毒性を測定することにより測定した。表Ｘに示したよ
うに、ＩＬ６−ＰＥ４０，ＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ
４０とＩＬ６−ＰＥ６６^4Gluの全ては、１時間以内に最
高の血清濃度に達しそして８時間後まで検出できた。最
高のレベルは、ＩＬ６−ＰＥ４０，ＩＬ６−ドメインＩ
Ｉ−ＰＥ４０とＩＬ６−ＰＥ６６^4Gluについて、それぞ
れ３μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌおよび１２μｇ／ｍｌで
あった。表XIとXII は、同様に作成したＴＧＦａ−ＰＥ
６６^4GluとＣＤ４−ＰＥ６６^4G ^luの性質を示している。
概括すると、ここに示したデータは、明瞭に新規の、改
良した、高い細胞毒特異性を持つシュードモナス変異体
とキメラ毒素が得られたことを示している。動物で試験
すると、これらの組換え的に作成したキメラタンパク質
は該当する未変異分子よりより低い動物毒性を持ってい
る。本発明に従った標的特異性の細胞毒的組成物は、本
発明のキメラ毒素の細胞毒的量を滅菌した、無毒性の担
体中に包含する。標的細胞を殺滅する方法は、殺滅する
のを所望する細胞を、他の細胞への実質的副作用なし
に、単一用量または繰り返し用量で本発明のキメラ毒素
の細胞毒量に接触させることからなる。勿論標的剤は、
他の細胞への実質的影響なしに殺滅されると標的された
細胞を認識する部分であればどれであってもよい。その
ような標的剤の例は、抗体、ホルモン、サイトカイン、
受容体、成長因子、抗原および同様のものである。ここ
に記述した方法は好ましくそして本発明を実施するため
の最良の方法であるが、ここに教示したように、当業者
に周知の方法も同様の結果と生物学的に活性なキメラ毒
素等を得るのに使用されてもよいということを特に言及
する。

【００２７】寄託プラスミドｐＶＣ４５／４ＥとｐＣＳ６４Ｇ（これから
は、本発明に従っていろいろなキメラ毒素が作成され
る。）の寄託は、本発明に従って、ＡＴＣＣ（所在：メ
リーランド州，ロックヴィレ、パークローン・ドライブ
１２３０１）に各々寄託番号第６８３１０号と第６８３
１３号で、１９９０年４月１９日と２３日に行われた。
寄託物は、生存して保存されていなければならず、特許
の有効期間、寄託から３０年間の期間、または寄託試料
への要求の最後の日から５年間の何れか長い期間にそれ
らがもしも存在しなくなったら交換しなければならず、
そして特許が発行されれば、法律の定める所に従って制
約なしに公衆に入手されるようになっていなければなら
ず、特許商標局長は要求があれば寄託物を入手しなけれ
ばならない。上述の実施例と実施態様は、ここでは説明
だけのために記述したものであり、それらに照らしたい
ろいろな変化、経路と変形は、当業者に示唆されたもの
であるだろうこととそしてそれらは本出願の精神と範囲
と付属した請求項の範囲内に包含されるべきであること
は理解される。

【００２８】

【表１】表Ｉ変異体の配列新規制限部位 A. 54 55 56 57 58 59 60 61 D A L K L A I D PE 5' GACGCGCTCAAGCTGGCCATCGAC 3' ── D A L E^* L A I D PE^Glu57 GACGCGCTCGAGCTGGCCATCGAC XhoI B. 243 244 245 246 247 248 249 250 V I S H R L H F PE 5' GTCATCAGTCATCGCCTGCACTTT 3' ── E^* PE^Glu246 GTCATCAGTGAACGCCTGCACTTT 無し E^* PE^Glu247 GTCATCAGTCATGAGCTGCACTTT 無し E^* PE^Glu249 GTCATCAGTCATGAGCTGGAGTTT 無し E^* E^* E^* PE^{Glu246,247,249} GTCATCAGTGAAGAGCTGGAGTTT 無し G^* G^* G^* PE^{Glu246,247,249} GTCATCAGTGGCGGCCTGGGCTTT 無し K^* K^* K^* PE^{Lys246,247,249} GTCATCAGTAAAAAGCTTAAGTTT HindIII

【００２９】アミノ酸をヌクレオチド配列の上に１文字
コードとして示し、変異アミノ酸を星印＊により標識し
た。数字はＰＥ中の配置を示す。新規の制限エンドヌク
レアーゼ切断部位は下線を付したヌクレオチドにより示
した。

【００３０】

【表２】表II ＭｏｎｏＱの後の変異ＰＥ分子の回収 ──────────────────────────────────── タンパク質量（ｍｇ）純度（％） ──────────────────────────────────── ＰＥ４６＞９５ＰＥ^Glu57 ３９９５ＰＥ^{Glu246,247,249} １９７０ＰＥ^{Glu57,246,247,249} １６８０ ──────────────────────────────────── ＊ＯＤ_650nm ０．８で誘導した培地の１Ｌからの毒素の量。タンパク質の濃度は、ウシ血清アルブミンを標準として使用するクーマッシー青Ｇ−２５０タンパク質検定試薬（ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌｕｅＧ−２５０ｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙｒｅａｇｅｎｔ）により推定した。

【００３１】

【表３】表III Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞上とマウスにおけるＰＥとＰＥの変異型の毒活性毒活性毒素^a ３Ｔ３細胞^b マウス^c ＩＤ₅₀(ng/ml) ＬＤ₅₀（μｇ） ──────────────────────────────────── ＰＥ１０．２ＰＥ^Glu57 １００１ＰＥΔ６−２２５１００１ＰＥΔ４−２５２＞２０００５０ ──────────────────────────────────── ^a その位置におけるアミノ酸の置換は肩書で示した。 Δはアミノ酸の欠失を示す。 ^b ＩＤ₅₀は、毒素を添加しなかった対照と比較して、Ｓｗｉｓｓマウス３Ｔ３細胞についてタンパク質合成を５０％阻害するのに必要な毒素の量である。タンパク質合成は細胞内の［ ³Ｈ］−ロイシンの取込みにより測定した。^c ｌＤ₅₀は一回のＩ．Ｐ．（腹腔内）注射後、４８時間内にマウスを５０％殺す毒素の量である。

【００３２】

【表４】表IV ドメインＩ欠失変異体の３Ｔ３細胞上への細胞毒活性 ──────────────────────────────────── 欠失変異体ＩＤ₅₀（ｎｇ） ──────────────────────────────────── ＰＥ１ＰＥ^Glu57 １００ＰＥΔ６−２２４１００ＰＥΔ６−２３４１２０ＰＥΔ６−２３９８０ＰＥΔ６−２４５１００ＰＥΔ４−２５２＞２０００ＰＥ^Glu57 Δ２４１−２５０＞２０００ ──────────────────────────────────── 凡例については、表III を参照。

【００３３】

【表５】表ＶドメインＩの点変異体の３Ｔ３細胞変異体への細胞毒活性 ──────────────────────────────────── 変異体ＩＤ₅₀（ng）電荷^a ──────────────────────────────────── ＰＥ１（＋３）ＰＥ^{Glu246,247,249} （−３）ＰＥ^Glu57 １００（＋３）ＰＥ^Glu57,246 １３５（＋１）ＰＥ^Glu57,247 ６０（＋１）ＰＥ^Glu57,249 ６０（＋１）ＰＥ^{Glu57,246,247,249} ＞２０００（−３）ＰＥ^{Glu57,Gly246,247,249} ＞２０００（０）ＰＥ^{Glu57,Lys246,247,249} １００（＋３）ＰＥ^{Glu57,Arg246,249} ６０（＋３）ＰＥ^{Glu57,245,247,248} ６００（−１）ＰＥ４０＞２０００ ──────────────────────────────────── ^a 電荷は、ＰＥの２４５ないし２５０の領域における酸性または塩基性残基の数に基づく。

【００３４】

【表６】表VI マウスにおけるＰＥ変異体の毒活性 ──────────────────────────────────── 変異体ＬＤ₅₀（ｎｇ） ──────────────────────────────────── ＰＥ０．２ＰＥΔ６−２５２５０ＰＥΔ６−２２４１ＰＥΔ６−２３９１ＰＥΔ６−２４５１ＰＥ^Glu57 １ＰＥ^{Glu246,247,249} １ＰＥ^{Glu57,246,247,248} ３０ ──────────────────────────────────── 凡例については、表III を参照。

【００３５】

【表７】

【００３６】

【表８】

【００３７】

【表９】表IX ＬＤ₅₀解析 ───────── 分子注射量＃死亡数／＃マウス数 ──────────────────────────────────── ＩＬ６−ＰＥ４０５μｇ０／４１０μｇ０／４１５μｇ０／２２０μｇ２／４２５μｇ３／４５０μｇ２／２ＩＬ６−ＩＩ−ＰＥ４０５μｇ０／２１０μｇ０／２２０μｇ１／２３０μｇ２／２ＩＬ６−ＰＥ６６^4Glu ５μｇ０／２１０μｇ１／２２０μｇ２／２ ──────────────────────────────────── マウスに表に示した量のＩＬ６−毒素を１回Ｉ．Ｐ．投与し、７２時間後の死亡マウス数を測定した。

【００３８】

【表１０】

【００３９】

【表１１】表XI 標的細胞へのＴＧＦａ−ＰＥ６６^4GluとＣＤ４（１７８）ＰＥ６６^4Gluの活性ＩＤ₅₀(ng/ml) ─────────── ＴＧＦａ−ＰＥ６６^4Glu ０．００７^a ＣＤ４（１７８）ＰＥ６６^4Glu １．５^b ──────────────────────────────────── a. Ａ４３１細胞への２０時間以内の検定。 b. ｇｐ１２０を発現するＣＶ−１細胞への４時間以内の検定。

【００４０】

【発明の効果】本発明により、ＩＬ６−ドメインＩＩ−
ＰＥ４０よりなる組換え変異シュードモナス外毒素（Ｐ
Ｅ）分子、つまり低−動物毒性であるが、適当な標的剤
と接合させた時に、他の細胞に実質的に影響を与えず
に、より大きい細胞毒性がある、新規な組換えＰＥ分子
（ｒＰＥ）が提供される。また本発明により、ＩＬ６受
容体をもつ細胞を死滅させるのに有効な量の上記ＰＥ分
子と、薬学的に許容される担体よりなる、組成物が提供
される。これは、該組成物との接触により、ＩＬ６受容
体を発現する細胞を死滅させる方法に利用される。同様
に、本発明により、ＩＬ６受容体をもつ細胞を死滅させ
るのに有効な量のＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０と、
薬学的に許容される担体よりなる、組成物が提供され
る。これはＩＬ６受容体を発現する細胞を死滅させる用
途を有する。さらに、本発明により、上記ＰＥ分子と同
様の効能を奏しうる、ＩＬ６−ＰＥ４０Δ３６５−３８
０よりなる組換え変異シュードモナス外毒素（ＰＥ）分
子も提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】この図は、ＰＥ変異体の発現ベクターの構造を
線図で示す図である。

【図２】この図は、ＩＬ６−ＰＥ４０誘導体を線図で示
す図である。

【図３】この図は、ＰＥ変異タンパク質のドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動を示す
図である。

【図４】この図は、ＰＥについてＰＥ変異タンパク質の
ＭｏｎｏＱのプロフィールを示す図である。

【図５】この図は、ＰＥ^Glu57 についてＰＥ変異タンパ
ク質のＭｏｎｏＱのプロフィールを示す図である。

【図６】この図は、ＰＥ^{Glu246,247,249}についてＰＥ変
異タンパク質のＭｏｎｏＱのプロフィールを示す図で
ある。

【図７】この図は、ＰＥ^{Glu57,246,247,249} についてＰ
Ｅ変異タンパク質のＭｏｎｏＱのプロフィールを示す図
である。

【図８】この図は、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に対する
ＰＥ変異体の細胞毒素を示す図である。

【図９】この図は、発現したＩＬ６−ＰＥ４０−ＰＥ４
０（レーン１），ＩＬ６−ＰＥ４０−ＩＬ６（レーン
２），（ＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０（レーン
３），ＩＬ６−ＰＥ４０（レーン４），ＩＬ６−ＰＥ４
０Ｄ３６４−３８０（レーン５）およびＩＬ６−ＰＥ６
６^4Glu（レーン６）のＮａＤｏｄＳｏ₄ ／ＰＡＧＥを示
す図である。

【図１０】この図は、Ｕ２６６細胞へのＩＬ６−ＰＥ４
０誘導体の殺細胞活性を示す図である。

【図１１】この図は、Ｕ２６６細胞［５×１０⁵ 細胞／
ｍｌ］を使用するＩＬ６競合検定の結果を示す図であ
る。

【図１２】この図は、結合置換検定の結果を示す図であ
る。

【符号の説明】

図３において、レーン１、２ＰＥレーン３、４ＰＥ^Glu57 レーン５、６ＰＥ^{Glu246,247,249}（ＰＥ６６−４Ｇ
ｌｕ）レーン７、８ＰＥ^{Glu57,246,247,249} 図８において、 ○−○ ＰＥ □−−−□ ＰＥ^Glu57 ■−−−■ ＰＥ^{Glu246,247,249} △−−−△ ＰＥ^{Glu57,246,247,249} 図１０において、ＩＬ６−ＰＥ４０（○）ＩＬ６−ＰＥ４０−ＰＥ４０（●）ＩＬ６−ドメインＩＩＰＥ（Ｘ）ＩＬ６−ＰＥ４０（Ｘ）ＩＬ６、−ＰＥ４０−ＩＬ６（□）ＩＬ６−ＰＥ６６^4Glu（■）図１２において、ｒＩＬ６（○）ＩＬ６−ＰＥ４０（●）ＩＬ６−ＰＥ４０−ＩＬ６（□）ＩＬ６−ＰＥ６６^4Glu（■）

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者フィッツゲラルド，ディヴィッドアメリカ合衆国，メリーランド 20902 , シルバースプリング，ラドストリート 1731 (72)発明者チャウドハリー，ヴィジェイアメリカ合衆国，メリーランド 20852 , ロックヴィレ，ロックヴィレパイク 1001，＃1207

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０よりなる
組換え変異シュードモナス外毒素（ＰＥ）分子。
【請求項２】ＩＬ６受容体をもつ細胞を死滅させるのに
有効な量の請求項１記載のＰＥ分子と、薬学的に許容さ
れる担体よりなる、組成物。
【請求項３】ＩＬ６受容体を発現する細胞を殺細胞量の
請求項２記載の組成物と接触させることよりなる、ＩＬ
６受容体を発現する細胞を死滅させる方法。
【請求項４】ＩＬ６受容体をもつ細胞を死滅させるのに
有効な量のＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０と、薬学的
に許容される担体よりなる、ＩＬ６受容体を発現する細
胞を死滅させる用途のための組成物。
【請求項５】ＩＬ６受容体をもつ細胞を死滅させる殺細
胞有効量のＩＬ６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０と、薬学的
に許容される担体よりなる、組成物を、ＩＬ６受容体を
発現する細胞を死滅させるための医薬の製造に使用する
方法。
【請求項６】ＩＬ６−ＰＥ４０Δ３６５−３８０よりな
る組換え変異シュードモナス外毒素（ＰＥ）分子。