JPH0592999A - 膀胱癌細胞の処置法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 膀胱癌細胞上のＥＧＦレセプターを認識して
結合するＴＧＦ−αと、殺哺乳類細胞作用を有するＰＥ
40のハイブリッド蛋白を改変してさらに結合能の高くな
った蛋白を提供する。 【構成】 遺伝子操作により、ＰＥ40部分の４つのシス
テイン残基のうち少くとも２つを除去または置換したも
のを大腸菌に生産させる。
結合するＴＧＦ−αと、殺哺乳類細胞作用を有するＰＥ
40のハイブリッド蛋白を改変してさらに結合能の高くな
った蛋白を提供する。 【構成】 遺伝子操作により、ＰＥ40部分の４つのシス
テイン残基のうち少くとも２つを除去または置換したも
のを大腸菌に生産させる。
Description
【０００１】従来の癌化学療法は、薬剤が癌患者の体内
で腫瘍細胞を殺す能力にたよっているが、残念ながらこ
れらの薬剤はしばしば腫瘍細胞とともに正常細胞をも殺
してしまう。癌の薬剤が正常細胞にくらべ癌細胞を殺す
程度が、その薬剤の腫瘍細胞に対する選択性を示す。腫
瘍細胞選択性を高める一つの方法は、薬剤を正常細胞群
は避けて選択的に腫瘍細胞まで送達することである。化
学療法剤の特定の細胞群に向けた選択的送達はまた局在
化（targetting) ともいう。薬剤の癌細胞局在化はいく
つかの方法で行なうことができる。１つの方法は腫瘍細
胞の表面に見出される特定のレセプター分子の存在に依
存する。局在化薬剤と呼ばれる分子がこれらの細胞表面
のレセプターを認識して結合することができる。これら
局在化薬剤には抗体、成長因子、ホルモンなどが含まれ
る。特定の細胞表層レセプターを認識して結合するこれ
ら局在化薬剤はこれらのレセプターを有する細胞を標的
とするといえる。例をあげると、膀胱癌細胞はその表層
に上皮細胞成長因子レセプターという蛋白質を有する。
トランスフォーム成長因子α（ＴＧＦ−α）は膀胱癌細
胞上のこのＥＧＦレセプターを認識して結合する。した
がって、ＴＧＦ−αはこれらの腫瘍細胞にとっては局在
化薬剤である。
で腫瘍細胞を殺す能力にたよっているが、残念ながらこ
れらの薬剤はしばしば腫瘍細胞とともに正常細胞をも殺
してしまう。癌の薬剤が正常細胞にくらべ癌細胞を殺す
程度が、その薬剤の腫瘍細胞に対する選択性を示す。腫
瘍細胞選択性を高める一つの方法は、薬剤を正常細胞群
は避けて選択的に腫瘍細胞まで送達することである。化
学療法剤の特定の細胞群に向けた選択的送達はまた局在
化（targetting) ともいう。薬剤の癌細胞局在化はいく
つかの方法で行なうことができる。１つの方法は腫瘍細
胞の表面に見出される特定のレセプター分子の存在に依
存する。局在化薬剤と呼ばれる分子がこれらの細胞表面
のレセプターを認識して結合することができる。これら
局在化薬剤には抗体、成長因子、ホルモンなどが含まれ
る。特定の細胞表層レセプターを認識して結合するこれ
ら局在化薬剤はこれらのレセプターを有する細胞を標的
とするといえる。例をあげると、膀胱癌細胞はその表層
に上皮細胞成長因子レセプターという蛋白質を有する。
トランスフォーム成長因子α（ＴＧＦ−α）は膀胱癌細
胞上のこのＥＧＦレセプターを認識して結合する。した
がって、ＴＧＦ−αはこれらの腫瘍細胞にとっては局在
化薬剤である。
【０００２】局在化薬剤それ自体は殺腫瘍細胞作用を示
さない。細胞毒すなわち毒素を含めた他の分子と局在化
薬剤とを結合して腫瘍細胞局在化能力と細胞毒の両方の
ドメインを有するハイブリッド分子を作り出すことがで
きる。これらハイブリッド分子は、腫瘍細胞を標的と
し、ついでこの細胞をトキシン部分によって殺す能力に
より腫瘍細胞にたいする選択的毒物として働く。これら
のハイブリッド分子を構築するのに用いられる毒物の中
でもっとも強力であったのはほ乳類細胞における蛋白合
成を阻害する細菌毒素である。シュードモナスエキソト
キシン（菌体外毒素）Ａはこれらの細菌毒素の１つであ
り、「局在化剤−毒素」分子を構築するのに用いられて
いる（米国特許第４，５４５，９８５号）。
さない。細胞毒すなわち毒素を含めた他の分子と局在化
薬剤とを結合して腫瘍細胞局在化能力と細胞毒の両方の
ドメインを有するハイブリッド分子を作り出すことがで
きる。これらハイブリッド分子は、腫瘍細胞を標的と
し、ついでこの細胞をトキシン部分によって殺す能力に
より腫瘍細胞にたいする選択的毒物として働く。これら
のハイブリッド分子を構築するのに用いられる毒物の中
でもっとも強力であったのはほ乳類細胞における蛋白合
成を阻害する細菌毒素である。シュードモナスエキソト
キシン（菌体外毒素）Ａはこれらの細菌毒素の１つであ
り、「局在化剤−毒素」分子を構築するのに用いられて
いる（米国特許第４，５４５，９８５号）。
【０００３】シュードモナスエキソトキシンＡがほ乳類
細胞を傷害するには、まず細胞表層に結合しついで細胞
質中に入り、蛋白合成に必要な延長因子２を不活化す
る。シュードモナスエキソトキシンＡはこれまで、モノ
クローナル抗体や蛋白ホルモンを用いた抗癌性ハイブリ
ッド分子を構築するのに利用されてきた。しかしこれら
ハイブリッド分子の難点は、正常細胞にも毒性を示すこ
とであった。シュードモナスエキソトキシンＡを含むハ
イブリッド分子の毒性は１つにはエキソトキシンＡその
ものが種々のほ乳類細胞に結合し侵入できることによ
る。したがってシュードモナスエキソトキシンＡと特定
の局在化薬剤とで形成されたハイブリッド分子は局在化
薬剤が認識する細胞のほかに多くの正常細胞に結合でき
る。この問題を解決する１つの方法は、エキソトキシン
Ａが正常細胞に結合できないように修飾を加えることで
ある。これはエキソトキシンＡの細胞結合に関与する部
分をとりのぞくことで解決できる。延長因子２を不活化
できるがもはやほ乳類細胞に結合できなくなったエキソ
トキシンＡの短縮形が調製されている。この改変エキソ
トキシンＡ分子はシュードモナスエキソトキシン−４０
（ＰＥ40）と呼ばれている（Hwang ら、 Cell ４８巻１
２９−１３６頁 １９８７）。
細胞を傷害するには、まず細胞表層に結合しついで細胞
質中に入り、蛋白合成に必要な延長因子２を不活化す
る。シュードモナスエキソトキシンＡはこれまで、モノ
クローナル抗体や蛋白ホルモンを用いた抗癌性ハイブリ
ッド分子を構築するのに利用されてきた。しかしこれら
ハイブリッド分子の難点は、正常細胞にも毒性を示すこ
とであった。シュードモナスエキソトキシンＡを含むハ
イブリッド分子の毒性は１つにはエキソトキシンＡその
ものが種々のほ乳類細胞に結合し侵入できることによ
る。したがってシュードモナスエキソトキシンＡと特定
の局在化薬剤とで形成されたハイブリッド分子は局在化
薬剤が認識する細胞のほかに多くの正常細胞に結合でき
る。この問題を解決する１つの方法は、エキソトキシン
Ａが正常細胞に結合できないように修飾を加えることで
ある。これはエキソトキシンＡの細胞結合に関与する部
分をとりのぞくことで解決できる。延長因子２を不活化
できるがもはやほ乳類細胞に結合できなくなったエキソ
トキシンＡの短縮形が調製されている。この改変エキソ
トキシンＡ分子はシュードモナスエキソトキシン−４０
（ＰＥ40）と呼ばれている（Hwang ら、 Cell ４８巻１
２９−１３６頁 １９８７）。
【０００４】ＰＥ40はこれまでＴＧＦ−αをふくむいく
つかの局在化分子と連結されている（Chaudhary ら、Ｐ
ＮＡＳ ＵＳＡ ８４巻４５８３−４５４２頁 １９８
７年）。ＴＧＦ−αの場合は、ＰＥ40とＴＧＦ−αのド
メインを含むハイブリッド分子はＥＧＦレセプターを有
する細胞に特異的に結合して、これらの細胞の蛋白合成
を阻害することによって傷害することができる。このハ
イブリッド分子が効果的にＥＧＦレセプターに結合する
ためには適切な立体構造をとらなければならない。効率
のよいレセプター結合には、結合するために近付けるよ
う局在化ドメインが適切に露出していることが必要であ
る。ＴＧＦ−αとＰＥ40のハイブリッド分子は、組換え
ＤＮＡ技術を用いて細菌中で融合蛋白質として作られた
場合、ハイブリッド分子の大部分はＥＧＦレセプター結
合活性が弱い。
つかの局在化分子と連結されている（Chaudhary ら、Ｐ
ＮＡＳ ＵＳＡ ８４巻４５８３−４５４２頁 １９８
７年）。ＴＧＦ−αの場合は、ＰＥ40とＴＧＦ−αのド
メインを含むハイブリッド分子はＥＧＦレセプターを有
する細胞に特異的に結合して、これらの細胞の蛋白合成
を阻害することによって傷害することができる。このハ
イブリッド分子が効果的にＥＧＦレセプターに結合する
ためには適切な立体構造をとらなければならない。効率
のよいレセプター結合には、結合するために近付けるよ
う局在化ドメインが適切に露出していることが必要であ
る。ＴＧＦ−αとＰＥ40のハイブリッド分子は、組換え
ＤＮＡ技術を用いて細菌中で融合蛋白質として作られた
場合、ハイブリッド分子の大部分はＥＧＦレセプター結
合活性が弱い。
【０００５】1. 米国特許第４，５４５，９８５号は、
シュードモナスエキソトキシンＡが化学的に抗体あるい
は上皮細胞成長因子と連結されることを開示している。
この特許はさらに、これらの結合体がヒト腫瘍細胞を殺
すために使用できることを開示しているが、これらの化
学的に連結された毒素は望ましくない非特異的レベルの
活性を有していることが示されている。
シュードモナスエキソトキシンＡが化学的に抗体あるい
は上皮細胞成長因子と連結されることを開示している。
この特許はさらに、これらの結合体がヒト腫瘍細胞を殺
すために使用できることを開示しているが、これらの化
学的に連結された毒素は望ましくない非特異的レベルの
活性を有していることが示されている。
【０００６】2. 米国特許第４，６６４，９１１号は植
物毒素でありリシンのＡ鎖あるいはＢ鎖と抗体を連結す
ることを開示している。特許第４，６６４，９１１号は
さらにこれらの連結体をヒト腫瘍細胞を殺すのに用いる
ことができることを開示している。
物毒素でありリシンのＡ鎖あるいはＢ鎖と抗体を連結す
ることを開示している。特許第４，６６４，９１１号は
さらにこれらの連結体をヒト腫瘍細胞を殺すのに用いる
ことができることを開示している。
【０００７】3. 米国特許第４，６７５，３８２号は、
メラノサイト増殖因子（ＭＳＨ）のようなホルモンを、
ジフテリア毒素の一部とペプチド結合で連絡することが
できることを開示している。特許第４，６７５，３８２
号は、さらにハイブリッド融合蛋白を合成を行なわせる
ために、組換えＤＮＡ技術を用いてこれらの蛋白質をコ
ードする遺伝子をつなげることができることを開示して
いる。この融合蛋白質はＭＳＨレセプターを有する細胞
に結合することができる。
メラノサイト増殖因子（ＭＳＨ）のようなホルモンを、
ジフテリア毒素の一部とペプチド結合で連絡することが
できることを開示している。特許第４，６７５，３８２
号は、さらにハイブリッド融合蛋白を合成を行なわせる
ために、組換えＤＮＡ技術を用いてこれらの蛋白質をコ
ードする遺伝子をつなげることができることを開示して
いる。この融合蛋白質はＭＳＨレセプターを有する細胞
に結合することができる。
【０００８】4. Murphyら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３巻
８２５８−８２６２頁 １９８６年）「ジフテリア毒素
−α−メラノサイト増殖ホルモン融合蛋白質の遺伝子構
築、発現およびメラノーマ特異的細胞毒性」。この報文
は、組換えＤＮＡ技術を用いて細菌に生産させた、α−
メラノサイト増殖因子にジフテリア毒素の一部を接続し
た融合蛋白質がヒトメラノーマ細胞に結合し、殺すこと
を開示している。
８２５８−８２６２頁 １９８６年）「ジフテリア毒素
−α−メラノサイト増殖ホルモン融合蛋白質の遺伝子構
築、発現およびメラノーマ特異的細胞毒性」。この報文
は、組換えＤＮＡ技術を用いて細菌に生産させた、α−
メラノサイト増殖因子にジフテリア毒素の一部を接続し
た融合蛋白質がヒトメラノーマ細胞に結合し、殺すこと
を開示している。
【０００９】5. Allured ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３
巻 １３２０−１３２４頁 １９８６年「３．０オング
ストロームにおける、緑膿菌エキソトキシンＡの構造」
この報文はシュードモナスエキソトキシンＡの３次元構
造を開示している。
巻 １３２０−１３２４頁 １９８６年「３．０オング
ストロームにおける、緑膿菌エキソトキシンＡの構造」
この報文はシュードモナスエキソトキシンＡの３次元構
造を開示している。
【００１０】6. Huang ら、ＣＥＬＬ ４８巻 １２９
−１３６頁 １９８７年「E. coli 中で発現された遺伝
子の欠失分析により同定されたシュードモナスエキソト
キシンＡの機能ドメイン」この報文はシュードモナスエ
キソトキシンＡ蛋白質が３つの機能的にはっきり分かれ
たドメイン、すなわちほ乳類細胞に結合する機能、毒素
蛋白質をリソゾーム膜を通過させる機能、およびほ乳類
内部で延長因子２をＡＤＰリボシル化する機能、に分か
れることを開示している。さらにこの機能ドメインがシ
ュードモナスエキソトキシンＡ蛋白の異なる領域に相当
することを開示している。
−１３６頁 １９８７年「E. coli 中で発現された遺伝
子の欠失分析により同定されたシュードモナスエキソト
キシンＡの機能ドメイン」この報文はシュードモナスエ
キソトキシンＡ蛋白質が３つの機能的にはっきり分かれ
たドメイン、すなわちほ乳類細胞に結合する機能、毒素
蛋白質をリソゾーム膜を通過させる機能、およびほ乳類
内部で延長因子２をＡＤＰリボシル化する機能、に分か
れることを開示している。さらにこの機能ドメインがシ
ュードモナスエキソトキシンＡ蛋白の異なる領域に相当
することを開示している。
【００１１】7. Chaudhary ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８
４巻４５３８−４５４２頁 １９８７年「トランスフォ
ーミング成長因子α型とシュードモナス毒素との組替え
融合蛋白質の活性」この報文はＰＥ−４０とトランスフ
ォーミング成長因子αとの間で形成され、組換えＤＮＡ
技術を用いて細菌内で生産された融合ハイブリッド蛋白
質が上皮細胞成長因子レセプターを有するヒト腫瘍細胞
に結合してこれを殺すであろうことを開示している。
４巻４５３８−４５４２頁 １９８７年「トランスフォ
ーミング成長因子α型とシュードモナス毒素との組替え
融合蛋白質の活性」この報文はＰＥ−４０とトランスフ
ォーミング成長因子αとの間で形成され、組換えＤＮＡ
技術を用いて細菌内で生産された融合ハイブリッド蛋白
質が上皮細胞成長因子レセプターを有するヒト腫瘍細胞
に結合してこれを殺すであろうことを開示している。
【００１２】8. 欧州特許出願０ ２６１ ６７１号
（１９８８年３月３０日公開）では、シュードモナスエ
キソトキシンＡの機能のうち、ＡＤＰリボシル化機能と
トランスロケーション機能は有するが細胞結合機能を欠
損しているシュードモナスエキソトキシンＡの一部を生
産できることを開示している。シュードモナスエキソト
キシンＡの機能のうち、ＡＤＰリボシル化機能とトラン
スロケーション機能を保持しているシュードモナスエキ
ソトキシンＡの一部はシュードモナスエキソトキシン−
４０すなわちＰＥ−４０と呼ばれている。ＰＥ−４０は
完全なシュードモナスエキソトキシンＡのNo２５２−６
１３のアミノ酸残基｛Grayら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８１
巻 ２４６５−２６４９頁 １９８４年）による番号｝
からなる。この特許出願はさらにＤＮＡ組換え技術によ
って細菌のなかで生産されるハイブリッド融合蛋白質を
形成するためにこのＰＥ−４０がトランスフォーミング
成長因子に連結できることを開示している。
（１９８８年３月３０日公開）では、シュードモナスエ
キソトキシンＡの機能のうち、ＡＤＰリボシル化機能と
トランスロケーション機能は有するが細胞結合機能を欠
損しているシュードモナスエキソトキシンＡの一部を生
産できることを開示している。シュードモナスエキソト
キシンＡの機能のうち、ＡＤＰリボシル化機能とトラン
スロケーション機能を保持しているシュードモナスエキ
ソトキシンＡの一部はシュードモナスエキソトキシン−
４０すなわちＰＥ−４０と呼ばれている。ＰＥ−４０は
完全なシュードモナスエキソトキシンＡのNo２５２−６
１３のアミノ酸残基｛Grayら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８１
巻 ２４６５−２６４９頁 １９８４年）による番号｝
からなる。この特許出願はさらにＤＮＡ組換え技術によ
って細菌のなかで生産されるハイブリッド融合蛋白質を
形成するためにこのＰＥ−４０がトランスフォーミング
成長因子に連結できることを開示している。
【００１３】9. Kelly ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５巻
３９８０−３９８４頁 １９８８年「インターロイキン
２−ジフテリア毒素融合蛋白はインビボにおける細胞性
免疫を破壊できる」この報文は組換えＤＮＡ技術を用い
て細菌に生産させた、インターロイキン２にジフテリア
毒素の一部を接続した融合蛋白質がマウスのなかで機能
して細胞性免疫を抑制することを開示している。
３９８０−３９８４頁 １９８８年「インターロイキン
２−ジフテリア毒素融合蛋白はインビボにおける細胞性
免疫を破壊できる」この報文は組換えＤＮＡ技術を用い
て細菌に生産させた、インターロイキン２にジフテリア
毒素の一部を接続した融合蛋白質がマウスのなかで機能
して細胞性免疫を抑制することを開示している。
【００１４】10. Bailon、Biotechnology １３２６−１
３２９頁 １９８８年１１月「インターロイキン２−シ
ュードモナスエキソトキシン融合蛋白質の精製とその部
分的性質」この報文は組換えＤＮＡ技術を用いて細菌に
生産される、インターロイキン２にＰＥ−４０を接続し
た融合蛋白質がインターロイキン２レセプターを有する
ヒト細胞系統に結合して殺すであろうことを開示してい
る。
３２９頁 １９８８年１１月「インターロイキン２−シ
ュードモナスエキソトキシン融合蛋白質の精製とその部
分的性質」この報文は組換えＤＮＡ技術を用いて細菌に
生産される、インターロイキン２にＰＥ−４０を接続し
た融合蛋白質がインターロイキン２レセプターを有する
ヒト細胞系統に結合して殺すであろうことを開示してい
る。
【００１５】11. Edwards ら、 Mol. Cell. Biol. ９巻
２８６０−２８６７頁 １９８９年は、膀胱癌治療に
利用できることが見出された改良ＴＧＦ−α−ＰＥ40ハ
イブリッド分子の作成について述べている。
２８６０−２８６７頁 １９８９年は、膀胱癌治療に
利用できることが見出された改良ＴＧＦ−α−ＰＥ40ハ
イブリッド分子の作成について述べている。
【００１６】12. Heimbrook ら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８
７巻４６９７−４７０１頁 １９９０年）は、改良型Ｔ
ＧＦ−α−ＰＥ40がヒト腫瘍細胞の異種移植片を有する
マウスの生存をインビボで顕著に長くする効果について
述べている。
７巻４６９７−４７０１頁 １９９０年）は、改良型Ｔ
ＧＦ−α−ＰＥ40がヒト腫瘍細胞の異種移植片を有する
マウスの生存をインビボで顕著に長くする効果について
述べている。
【００１７】本発明の目的は、局在化剤であるＴＧＦ−
αを認識する膀胱癌細胞上のレセプターにＴＧＦ−α−
ＰＥ40ハイブリッド分子が効率よく結合できるような改
変型ＰＥ40を提供することである。本発明の目的はま
た、膀胱癌細胞を選択的に殺す方法を提供するものであ
る。さらに本発明はＴＧＦ−αと改変型ＰＥ40の間に形
成され活性の増強された融合蛋白を提供するものであ
る。また本発明は活性成分として融合蛋白を含む医薬組
成物を提供するものであるが、この融合蛋白は膀胱癌細
胞上の上皮細胞成長因子レセプターにたいする融合蛋白
の結合を改善するような改変型ＰＥ40を含むものであ
る。これらの目的およびそれ以外の目的を以下の記述に
より明らかにする。
αを認識する膀胱癌細胞上のレセプターにＴＧＦ−α−
ＰＥ40ハイブリッド分子が効率よく結合できるような改
変型ＰＥ40を提供することである。本発明の目的はま
た、膀胱癌細胞を選択的に殺す方法を提供するものであ
る。さらに本発明はＴＧＦ−αと改変型ＰＥ40の間に形
成され活性の増強された融合蛋白を提供するものであ
る。また本発明は活性成分として融合蛋白を含む医薬組
成物を提供するものであるが、この融合蛋白は膀胱癌細
胞上の上皮細胞成長因子レセプターにたいする融合蛋白
の結合を改善するような改変型ＰＥ40を含むものであ
る。これらの目的およびそれ以外の目的を以下の記述に
より明らかにする。
【００１８】本発明を要約すると、本発明はＴＧＦ−α
局在化ドメインに結合させた改変型ＰＥ40からなるハイ
ブリッド分子を提供する。改変型ＰＥ40は本ハイブリッ
ド分子のレセプター結合活性を促進する。ＰＥ40中のシ
ステイン残基を他の中性アミノ酸たとえばアラニンなと
で置換する、あるいはシステイン残基を欠失させると、
局在化ドメインが認識するレセプターへのハイブリッド
分子の結合が改善される。本発明のハイブリッド分子
は、従来の改変されないＰＥ40を有するハイブリッド分
子にくらべて、ヒト腫瘍細胞上の狙ったレセプターによ
り効率よく結合し、さらに膀胱癌細胞を殺すのに利用で
きる。
局在化ドメインに結合させた改変型ＰＥ40からなるハイ
ブリッド分子を提供する。改変型ＰＥ40は本ハイブリッ
ド分子のレセプター結合活性を促進する。ＰＥ40中のシ
ステイン残基を他の中性アミノ酸たとえばアラニンなと
で置換する、あるいはシステイン残基を欠失させると、
局在化ドメインが認識するレセプターへのハイブリッド
分子の結合が改善される。本発明のハイブリッド分子
は、従来の改変されないＰＥ40を有するハイブリッド分
子にくらべて、ヒト腫瘍細胞上の狙ったレセプターによ
り効率よく結合し、さらに膀胱癌細胞を殺すのに利用で
きる。
【００１９】本発明を詳細に説明する。ＴＧＦ−αとＰ
Ｅ40のあいだに形成されたハイブリッド分子は３つの主
要なアッセイシステムにより性質が決定される。そのア
ッセイシステムとは 1. ほ乳類細胞における蛋白合成を阻害するＴＧＦ−α
−ＰＥ40の活性を測定するための、延長因子２のＡＤＰ
リボシル化。 2. ＴＧＦ−α−ＰＥ40のＥＧＦレセプターに対する結
合能を測定するためにおこなう、Ａ４３１細胞から調製
した膜標品上のＥＧＦレセプターへの放射能標識したＥ
ＧＦ結合の阻害。 3. ＴＧＦ−α−ＰＥ40に暴露した後の腫瘍細胞の生存
を測定するために行なう、３−〔４，５−ジメチルチア
ゾール−２−イル〕−２，５−ジフェニルテトラゾリウ
ムブロミド（ＭＴＴ）のホルマザンへの変換で評価する
細胞増殖。これらのアッセイは Dominicら、 Infection
and Immunity １６巻、８３２−８４１頁１９７７年、
Cohenら、 J. Biol. Chem．２５７巻 １５２３−１５
３１頁１９８２年、 Reimen ら、 Peptides ８巻８７７
−８８５頁 １９８７年、 Mosmann、 J. Immunol. Met
hods ６５巻５５−６３頁 １９８３年記載の方法にし
たがって行なった。
Ｅ40のあいだに形成されたハイブリッド分子は３つの主
要なアッセイシステムにより性質が決定される。そのア
ッセイシステムとは 1. ほ乳類細胞における蛋白合成を阻害するＴＧＦ−α
−ＰＥ40の活性を測定するための、延長因子２のＡＤＰ
リボシル化。 2. ＴＧＦ−α−ＰＥ40のＥＧＦレセプターに対する結
合能を測定するためにおこなう、Ａ４３１細胞から調製
した膜標品上のＥＧＦレセプターへの放射能標識したＥ
ＧＦ結合の阻害。 3. ＴＧＦ−α−ＰＥ40に暴露した後の腫瘍細胞の生存
を測定するために行なう、３−〔４，５−ジメチルチア
ゾール−２−イル〕−２，５−ジフェニルテトラゾリウ
ムブロミド（ＭＴＴ）のホルマザンへの変換で評価する
細胞増殖。これらのアッセイは Dominicら、 Infection
and Immunity １６巻、８３２−８４１頁１９７７年、
Cohenら、 J. Biol. Chem．２５７巻 １５２３−１５
３１頁１９８２年、 Reimen ら、 Peptides ８巻８７７
−８８５頁 １９８７年、 Mosmann、 J. Immunol. Met
hods ６５巻５５−６３頁 １９８３年記載の方法にし
たがって行なった。
【００２０】優れたレセプター結合特性を有する新規な
ＴＧＦ−α−ＰＥ40を創出するために、先ずＴＧＦ−α
−ＰＥ40または特別に改変したＴＧＦ−α−ＰＥ40をコ
ードする一連の組換えＤＮＡ分子を作成した。オリジナ
ル、すなわち親のＴＧＦ−α−ＰＥ40は、実施例１に記
載するようにクローン化されたＤＮＡの１部を用い細菌
のＴＡＣ発現プラスミドベクター中にクローン化した
（ｐＴＡＣ ＴＧＦ−ＰＥ４０）。ｐＴＡＣ ＴＧＦ−
ＰＥ４０を特別に改変されたＴＧＦ−α−ＰＥ40ＤＮＡ
を構築するための出発物質とした。ＴＧＦ−α−ＰＥ40
ＤＮＡを特別に改変することは、ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７
−ＰＥ４０ＤＮＡ中のＰＥ40内のシステインコドンの２
〜４個を他のアミノ酸のコドンで置換するのに必要な、
ＤＮＡコード配列中の部位特異的突然変異を含む。ある
いは、ＰＥ40中の２〜４個のシステインコドンを欠失さ
せるよう部位特異的突然変異をおこさせる。ｐＴＡＣ
ＴＧＦ５７−ＰＥ４０ＤＮＡにおける部位特異的突然変
異は、Winter ら、 Nature２９９巻 ７５６−７５８頁
１９８２年の方法を用いて構築した。変異させたｐＴ
ＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０ＤＮＡの特別な例は実施例
３に記載してある。ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０Ｄ
ＮＡでコードされるハイブリッド蛋白質のアミノ酸配列
は表３に示してある。親のＴＧＦ−α−ＰＥ40のＰＥ40
ドメイン中の４個のシステイン残基はＣｙｓ265 、Ｃｙ
ｓ287 、Ｃｙｓ372 、Ｃｙｓ379 （表３）として表わさ
れる残基である。ＰＥ40中のアミノ酸残基は Gray ら、
ＰＮＡＳ ＵＳＡ８１巻 ２６４５−２６４９頁 １９
８４年にしたがって番号付けしてある。ｐＴＡＣ ＴＧ
Ｆ５７−ＰＥ４０を特異的に変異させて得られた改変型
ＴＧＦ−α−ＰＥ40ハイブリッド蛋白は、ＰＥ40のＮ末
端側の２つの残基（Ｃｙｓ265 、Ｃｙｓ287 ）、または
Ｃ末端側の残基（Ｃｙｓ372 、Ｃｙｓ379 ）、さらにあ
るいは双方（Ｃｙｓ265 、Ｃｙｓ287 、Ｃｙｓ372 、Ｃ
ｙｓ379 ）の、置換あるいは欠失を含む。これらの変異
ｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０ ＤＮＡから生産される
改変型ハイブリッド蛋白を記載するための命名法を簡便
にするために、Ｎ末端側のアミノ酸残基をＡ座、Ｃ末端
側のアミノ酸残基をＢ座とする。システイン残基が親Ｔ
ＧＦ−α−ＰＥ40ハイブリッド分子と同様にＰＥ４０の
Ｎ末端側に存在する場合は座は大文字で示される
（“Ａ”）。これらのＮ末端側のシステイン残基が他の
中性アミノ酸たとえばグリシン、アラニン、フェニルア
ラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、
ヒシチジン、トリプトファン、セリン、スレオニン、メ
チオニンで置換されている、または欠失している場合は
座は小文字で示される（“ａ”）。システイン残基が親
ＴＧＦ−α−ＰＥ40ハイブリッド分子と同様にＰＥ４０
のＣ末端側に存在する場合は座は大文字で示される
（“Ｂ”）。“ｂ”はこの座におけるアミノ酸が欠失あ
るいは他のアミノ酸で置換されていることを示す。した
がってＴＧＦ−α−ＰＥ40のＰＥ40ドメインにおける４
つのシステイン残基がすべてアラニンで置換されている
場合、改変型ハイブリッド蛋白はＴＧＦ−α−ＰＥ40ａ
ｂと表わされる。同様に、アミノ酸の位置２６５、２８
７、３７２、３７８にシステインを有する親のＴＧＦ−
α−ＰＥ40ハイブリッド蛋白をＴＧＦ−α−ＰＥ40ＡＢ
と表わされる。
ＴＧＦ−α−ＰＥ40を創出するために、先ずＴＧＦ−α
−ＰＥ40または特別に改変したＴＧＦ−α−ＰＥ40をコ
ードする一連の組換えＤＮＡ分子を作成した。オリジナ
ル、すなわち親のＴＧＦ−α−ＰＥ40は、実施例１に記
載するようにクローン化されたＤＮＡの１部を用い細菌
のＴＡＣ発現プラスミドベクター中にクローン化した
（ｐＴＡＣ ＴＧＦ−ＰＥ４０）。ｐＴＡＣ ＴＧＦ−
ＰＥ４０を特別に改変されたＴＧＦ−α−ＰＥ40ＤＮＡ
を構築するための出発物質とした。ＴＧＦ−α−ＰＥ40
ＤＮＡを特別に改変することは、ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７
−ＰＥ４０ＤＮＡ中のＰＥ40内のシステインコドンの２
〜４個を他のアミノ酸のコドンで置換するのに必要な、
ＤＮＡコード配列中の部位特異的突然変異を含む。ある
いは、ＰＥ40中の２〜４個のシステインコドンを欠失さ
せるよう部位特異的突然変異をおこさせる。ｐＴＡＣ
ＴＧＦ５７−ＰＥ４０ＤＮＡにおける部位特異的突然変
異は、Winter ら、 Nature２９９巻 ７５６−７５８頁
１９８２年の方法を用いて構築した。変異させたｐＴ
ＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０ＤＮＡの特別な例は実施例
３に記載してある。ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０Ｄ
ＮＡでコードされるハイブリッド蛋白質のアミノ酸配列
は表３に示してある。親のＴＧＦ−α−ＰＥ40のＰＥ40
ドメイン中の４個のシステイン残基はＣｙｓ265 、Ｃｙ
ｓ287 、Ｃｙｓ372 、Ｃｙｓ379 （表３）として表わさ
れる残基である。ＰＥ40中のアミノ酸残基は Gray ら、
ＰＮＡＳ ＵＳＡ８１巻 ２６４５−２６４９頁 １９
８４年にしたがって番号付けしてある。ｐＴＡＣ ＴＧ
Ｆ５７−ＰＥ４０を特異的に変異させて得られた改変型
ＴＧＦ−α−ＰＥ40ハイブリッド蛋白は、ＰＥ40のＮ末
端側の２つの残基（Ｃｙｓ265 、Ｃｙｓ287 ）、または
Ｃ末端側の残基（Ｃｙｓ372 、Ｃｙｓ379 ）、さらにあ
るいは双方（Ｃｙｓ265 、Ｃｙｓ287 、Ｃｙｓ372 、Ｃ
ｙｓ379 ）の、置換あるいは欠失を含む。これらの変異
ｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０ ＤＮＡから生産される
改変型ハイブリッド蛋白を記載するための命名法を簡便
にするために、Ｎ末端側のアミノ酸残基をＡ座、Ｃ末端
側のアミノ酸残基をＢ座とする。システイン残基が親Ｔ
ＧＦ−α−ＰＥ40ハイブリッド分子と同様にＰＥ４０の
Ｎ末端側に存在する場合は座は大文字で示される
（“Ａ”）。これらのＮ末端側のシステイン残基が他の
中性アミノ酸たとえばグリシン、アラニン、フェニルア
ラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、
ヒシチジン、トリプトファン、セリン、スレオニン、メ
チオニンで置換されている、または欠失している場合は
座は小文字で示される（“ａ”）。システイン残基が親
ＴＧＦ−α−ＰＥ40ハイブリッド分子と同様にＰＥ４０
のＣ末端側に存在する場合は座は大文字で示される
（“Ｂ”）。“ｂ”はこの座におけるアミノ酸が欠失あ
るいは他のアミノ酸で置換されていることを示す。した
がってＴＧＦ−α−ＰＥ40のＰＥ40ドメインにおける４
つのシステイン残基がすべてアラニンで置換されている
場合、改変型ハイブリッド蛋白はＴＧＦ−α−ＰＥ40ａ
ｂと表わされる。同様に、アミノ酸の位置２６５、２８
７、３７２、３７８にシステインを有する親のＴＧＦ−
α−ＰＥ40ハイブリッド蛋白をＴＧＦ−α−ＰＥ40ＡＢ
と表わされる。
【００２１】ＴＧＦ−α−ＰＥ40ＡＢハイブリッド蛋白
質と改変型ＴＧＦ−α−ＰＥ40蛋白質はともに E. coli
内で、 Linemayerら (Bio-Technology５巻９６０−９６
５頁１９８７年）の方法により、ＴＡＣ発現ベクターシ
ステムを用いて生産される。これらの細菌内で生産され
た組換えハイブリッド蛋白は集菌後、塩酸グアニジンで
溶菌させ、ついで亜硫酸ナトリウムとテトラチオン酸ナ
トリウムを加えた。混合物を透析し、溶液から析出した
蛋白質に尿素を加えて可溶化した。次ぎに混合物は遠心
して不溶性の蛋白質を除き、組換えＴＧＦ−α−ＰＥ40
ハイブリッド蛋白質はイオン交換クロマトグラフィと容
積排除（分子篩い）クロマトグラフィ、再度イオン交換
クロマトグラフィの順に精製を行なった。精製されたＴ
ＧＦ−α−ＰＥ40ハイブリッド蛋白質は次ぎにβメルカ
プトエタノールのような還元剤と接触させてハイブリッ
ド蛋白内のシステイン間にジスルフィド結合を形成させ
た。最後に、構造を回復したハイブリッド蛋白を容積排
除クロマトグラフィとイオン交換クロマトグラフィにか
けてきわめて純度の高いＴＧＦ−α−ＰＥ40蛋白を得
た。この精製手順の詳細に関しては実施例４に述べる。
こうして精製され構造の回復したハイブリッド蛋白が得
られると、ＡＤＰリボシル化、ＥＧＦレセプター結合
性、細胞増殖アッセイを前述のように行なって生物活性
特性をあきらかにすることができる。
質と改変型ＴＧＦ−α−ＰＥ40蛋白質はともに E. coli
内で、 Linemayerら (Bio-Technology５巻９６０−９６
５頁１９８７年）の方法により、ＴＡＣ発現ベクターシ
ステムを用いて生産される。これらの細菌内で生産され
た組換えハイブリッド蛋白は集菌後、塩酸グアニジンで
溶菌させ、ついで亜硫酸ナトリウムとテトラチオン酸ナ
トリウムを加えた。混合物を透析し、溶液から析出した
蛋白質に尿素を加えて可溶化した。次ぎに混合物は遠心
して不溶性の蛋白質を除き、組換えＴＧＦ−α−ＰＥ40
ハイブリッド蛋白質はイオン交換クロマトグラフィと容
積排除（分子篩い）クロマトグラフィ、再度イオン交換
クロマトグラフィの順に精製を行なった。精製されたＴ
ＧＦ−α−ＰＥ40ハイブリッド蛋白質は次ぎにβメルカ
プトエタノールのような還元剤と接触させてハイブリッ
ド蛋白内のシステイン間にジスルフィド結合を形成させ
た。最後に、構造を回復したハイブリッド蛋白を容積排
除クロマトグラフィとイオン交換クロマトグラフィにか
けてきわめて純度の高いＴＧＦ−α−ＰＥ40蛋白を得
た。この精製手順の詳細に関しては実施例４に述べる。
こうして精製され構造の回復したハイブリッド蛋白が得
られると、ＡＤＰリボシル化、ＥＧＦレセプター結合
性、細胞増殖アッセイを前述のように行なって生物活性
特性をあきらかにすることができる。
【００２２】もう１つの、そして好ましい方法としてあ
げられるのは、ハイブリッド蛋白であるＴＧＦ−α−Ｐ
Ｅ40ＡＢ、ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ、ＴＧＦ−α−ＰＥ
40ａＢ、ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂを形質転換細菌中で作
らせることである。細菌を集菌し、細胞ペーストを溶菌
させ、好ましくは遠心処理してデブリスと望ましくない
蛋白質を除く。ついで、所望のハイブリッド蛋白は硫酸
塩、好ましくは（NH4)2SO4を上清にくわえて沈殿させ
る。沈殿は亜硫酸塩で溶解し、過剰のβメルカプトエタ
ノールを加えて構造を回復させ、濃縮後イオン交換クロ
マトグラフィと金属キレートクロマトグラフィで分離し
た。詳細は実施例５に開示した。
げられるのは、ハイブリッド蛋白であるＴＧＦ−α−Ｐ
Ｅ40ＡＢ、ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ、ＴＧＦ−α−ＰＥ
40ａＢ、ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂを形質転換細菌中で作
らせることである。細菌を集菌し、細胞ペーストを溶菌
させ、好ましくは遠心処理してデブリスと望ましくない
蛋白質を除く。ついで、所望のハイブリッド蛋白は硫酸
塩、好ましくは（NH4)2SO4を上清にくわえて沈殿させ
る。沈殿は亜硫酸塩で溶解し、過剰のβメルカプトエタ
ノールを加えて構造を回復させ、濃縮後イオン交換クロ
マトグラフィと金属キレートクロマトグラフィで分離し
た。詳細は実施例５に開示した。
【００２３】ＴＧＦ−α−改変型ＰＥ40の重要な有用性
は、ヒト膀胱癌細胞に結合してこれを殺す能力にある。
ここに述べる抗癌性蛋白質は膀胱癌細胞を殺すという有
用性を有し、この目的のために、生理的に認容される液
体、たとえば滅菌水、注射用水、生理食塩水、このまし
くは緩衝生理食塩水（たとえばリン酸緩衝生理食塩
水）、キャリヤー蛋白質を含む緩衝生理食塩水（たとえ
ばヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ）中での溶液あるい
は懸濁液として用いられる。溶液あるいは懸濁液は生理
的に認容される液体６０mlあたり、抗癌性ハイブリッド
蛋白質を約０．１mg〜約１０mg含む。より好ましくは６
０mlあたり約０．５mg〜約５mgであり、もっとも好まし
いのは、生理的に認容される液体６０mlあたり、約２mg
〜約４mgを含むものである。
は、ヒト膀胱癌細胞に結合してこれを殺す能力にある。
ここに述べる抗癌性蛋白質は膀胱癌細胞を殺すという有
用性を有し、この目的のために、生理的に認容される液
体、たとえば滅菌水、注射用水、生理食塩水、このまし
くは緩衝生理食塩水（たとえばリン酸緩衝生理食塩
水）、キャリヤー蛋白質を含む緩衝生理食塩水（たとえ
ばヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ）中での溶液あるい
は懸濁液として用いられる。溶液あるいは懸濁液は生理
的に認容される液体６０mlあたり、抗癌性ハイブリッド
蛋白質を約０．１mg〜約１０mg含む。より好ましくは６
０mlあたり約０．５mg〜約５mgであり、もっとも好まし
いのは、生理的に認容される液体６０mlあたり、約２mg
〜約４mgを含むものである。
【００２４】本発明の方法は、膀胱癌細胞をここに記載
した抗癌性蛋白質を含む溶液あるいは懸濁液と、１時間
未満（たとえば約３０分）から数時間（たとえば４時間
まで）のあいだ周囲温で接触させることからなる。実験
動物の場合は、溶液あるいは懸濁液は尿道カテーテルを
通して投与する。
した抗癌性蛋白質を含む溶液あるいは懸濁液と、１時間
未満（たとえば約３０分）から数時間（たとえば４時間
まで）のあいだ周囲温で接触させることからなる。実験
動物の場合は、溶液あるいは懸濁液は尿道カテーテルを
通して投与する。
【００２５】ＴＧＦ−α−改変型ＰＥ40ハイブリッド分
子の使用がここおよび以下の実施例において記載される
が、本発明の範囲は：局在化剤としてはＴＧＦ−α、Ｅ
ＧＦ、膀胱癌細胞上のＥＧＦレセプターに結合するＥＧ
Ｆファミリーのペプチドホルモン、 Shopeフィブローマ
ウイルス成長因子、ワクシニアウイルス成長因子；局在
化剤が連結する毒素としてはＰＥ40、ジフテリア毒素、
リシン毒素、その他のＡＤＰリボシル化ほ乳類細胞毒；
を包含することが理解されねばならない。
子の使用がここおよび以下の実施例において記載される
が、本発明の範囲は：局在化剤としてはＴＧＦ−α、Ｅ
ＧＦ、膀胱癌細胞上のＥＧＦレセプターに結合するＥＧ
Ｆファミリーのペプチドホルモン、 Shopeフィブローマ
ウイルス成長因子、ワクシニアウイルス成長因子；局在
化剤が連結する毒素としてはＰＥ40、ジフテリア毒素、
リシン毒素、その他のＡＤＰリボシル化ほ乳類細胞毒；
を包含することが理解されねばならない。
【００２６】以下の実施例は本発明を説明するものであ
るが、制限するものではない。特に断りがない限り、分
子生物学的操作に必要な酵素反応は、 Maniatis ら、
「分子クローニング 実験室マニュアル」（Cold Sprin
g Harbor Press, １９８２年）にしたがって行なった。
るが、制限するものではない。特に断りがない限り、分
子生物学的操作に必要な酵素反応は、 Maniatis ら、
「分子クローニング 実験室マニュアル」（Cold Sprin
g Harbor Press, １９８２年）にしたがって行なった。
【００２７】
【実施例１】 ＴＧＦ−α−ＰＥ40ＤＮＡを含むリコンビナントＤＮＡ
クローンの構築。 ＴＧＦ−αのＤＮＡ断片をデフェオージョーンズらの、
モリキュラー アンドセルラー バイオロジー第８巻、
第２９９９〜３００７頁（１９８８年）（Defeo-Jones,
et al., Molecular and Cellular Biology ８，２９９
９−３００７，１９８８）に記載されているように３組
の合成オリゴヌクレオチドを用いて構築した。この合成
ＴＧＦ−α遺伝子をｐＵＣ−１９へクローン化させた。
リコンビナント ヒト ＴＧＦ−αを含むｐＵＣ−１９
クローンからのＤＮＡを Sph I及び Eco RI を用いて切
断した。この切断はｐＵＣ−１９全部とＴＧＦ−αの
５′部分を含む２．８kbＤＮＡ断片を生じた。この２．
８kb断片を精製しゲル電気泳動によって単離した。 Eco
RI から Sph Iのオリゴヌクレオチドのカセットを合成
した。この合成カセットは以下に示す配列を有してい
た： 5'-CGGACCTCCTGGCTGCGCATCTAGG-3' 3'-GTACGCCTGGAGGACCGACGCGTAGATCCTTAA-5'
クローンの構築。 ＴＧＦ−αのＤＮＡ断片をデフェオージョーンズらの、
モリキュラー アンドセルラー バイオロジー第８巻、
第２９９９〜３００７頁（１９８８年）（Defeo-Jones,
et al., Molecular and Cellular Biology ８，２９９
９−３００７，１９８８）に記載されているように３組
の合成オリゴヌクレオチドを用いて構築した。この合成
ＴＧＦ−α遺伝子をｐＵＣ−１９へクローン化させた。
リコンビナント ヒト ＴＧＦ−αを含むｐＵＣ−１９
クローンからのＤＮＡを Sph I及び Eco RI を用いて切
断した。この切断はｐＵＣ−１９全部とＴＧＦ−αの
５′部分を含む２．８kbＤＮＡ断片を生じた。この２．
８kb断片を精製しゲル電気泳動によって単離した。 Eco
RI から Sph Iのオリゴヌクレオチドのカセットを合成
した。この合成カセットは以下に示す配列を有してい
た： 5'-CGGACCTCCTGGCTGCGCATCTAGG-3' 3'-GTACGCCTGGAGGACCGACGCGTAGATCCTTAA-5'
【００２８】便宜上、このオリゴヌクレオチドカセット
を５７と命名した。カセット５７をアニールし、ＴＧＦ
−αを含む２．８kbの断片へ結合させ、環状プラスミド
を形成した。そのカセットを含むクローンを放射標識し
たカセット５７ＤＮＡへハイブリダイゼーションするこ
とにより同定した。ヒトＴＧＦ−αの存在をＤＮＡシー
クエンシングにより確認した。シークエンシングはＴＧ
Ｆ−α配列の３’末端で新たに導入されたFsp I 部位の
存在をも確認した。ＴＧＦ−α−５７／ｐＵＣ−１９と
命名したこのプラスミドを HinD III 及び Fsp Iを用い
て切断しＴＧＦ−α遺伝子( ＴＧＦ−α−５７）を含む
１６８bp断片を生じさせた。別のｐＵＣ−１９の標品を
HinD III 及び２．６８kb ｐＵＣ−１９ベクターＤＮ
Ａを生じさせる Eco RI を用いて切断した。ＰＦ40ＤＮ
ＡはプラスミドｐＶＣ ８から単離した（チャウドハリ
ー（Chaudhary)ら．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ 第８４巻、第
４５３８〜４５４２頁、１９８７年）。ｐＶＣ ８は N
se Iを用いて切断した。次いで、クレノー（Klenow) 反
応の標準条件（マニアチス（Maniatis) ら、前掲第１１
３頁）を用いることによりこのＤＮＡ上に平滑末端を発
生させた。この平滑末端化したＤＮＡを次いでＰＥ40を
含む１．３kbの Eco RI から平滑末端化 Nde Iの断片を
発生させるために Eco RI を用いて２番目の切断を行っ
た。ＴＧＦ−α−５７ HinD III から Fsp Iの断片（１
６８bp）を２．６８kb ｐＵＣ−１９ベクターへ結合さ
せた。一晩インキュベーションした後、１．３kbの Eco
RIから平滑末端化 Nde IのＰＥ40ＤＮＡ断片を結合混
合物へ加えた。この二番目の結合は一晩進行させた。こ
の結合反応生成物は次いでＪＭ １０９細胞を形質転換
するために用いた。ｐＵＣ−１９中にＴＧＦ−α−５７
ＰＥ40を含むクローンは放射標識したＴＧＦ−α−５７
ＰＥ40ＤＮＡとハイブリダイゼーションすることによ
り同定し、このクローンからのＤＮＡを単離した。その
ＴＧＦ−α−５７ＰＥ40をｐＵＣ−１９ベクターから取
り出しラインメイヤーら．，バイオ−テクノロジー第５
巻、第９６０〜９６５頁（１９８７年）（Linemeyer, e
t al., Bio-Technology ５：９６０−９６５ １９８
７）に記載されているＴＡＣベクターシステムへ移し
た。そのｐＵＣ−１９中のＴＧＦ−α−５７ ＰＥ40を
HinDIII 及び Eco RI で切断してＴＧＦ−α−５７Ｐ
Ｅ40を含む１．５kbの断片を発生させた。標準クレノー
反応条件（マニアチスら．，loc.cit.) を用いてこのＤ
ＮＡ断片上に平滑末端を発生させた。そのＴＡＣベクタ
ーを HinD III 及び EcoRI を用いて切断した。標準ク
レノー反応条件（マニアチスら．，loc.cit.) を用いて
切断したＴＡＣベクターＤＮＡ上に平滑末端を発生させ
た。２．７kbの平滑末端化したベクターをゲル電気泳動
により単離した。その平滑末端化したＴＧＦ−α−５７
ＰＥ40断片を次いで平滑末端化したＴＡＣベクターへ結
合させた。この結合によって生じたプラスミドをＪＭ１
０９細胞を形質転換するために用いた。ＴＧＦ−α−５
７ＰＥ40を含む候補となるクローンは上記したハイブリ
ダイゼーションにより同定しそして配列決定した。所望
の構築を含むそのクローンはｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−Ｐ
Ｅ４０と命名した。これらの操作により生じたプラスミ
ドを表１に示す。そのｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０
ＤＮＡ中にコードされるＴＧＦ−α−ＰＥ40融合蛋白質
のアミノ酸コドンのヌクレオチド配列を表２に示す。そ
のＴＧＦ５７−ＰＥ４０遺伝子によりコードされたアミ
ノ酸配列を表３に示す。
を５７と命名した。カセット５７をアニールし、ＴＧＦ
−αを含む２．８kbの断片へ結合させ、環状プラスミド
を形成した。そのカセットを含むクローンを放射標識し
たカセット５７ＤＮＡへハイブリダイゼーションするこ
とにより同定した。ヒトＴＧＦ−αの存在をＤＮＡシー
クエンシングにより確認した。シークエンシングはＴＧ
Ｆ−α配列の３’末端で新たに導入されたFsp I 部位の
存在をも確認した。ＴＧＦ−α−５７／ｐＵＣ−１９と
命名したこのプラスミドを HinD III 及び Fsp Iを用い
て切断しＴＧＦ−α遺伝子( ＴＧＦ−α−５７）を含む
１６８bp断片を生じさせた。別のｐＵＣ−１９の標品を
HinD III 及び２．６８kb ｐＵＣ−１９ベクターＤＮ
Ａを生じさせる Eco RI を用いて切断した。ＰＦ40ＤＮ
ＡはプラスミドｐＶＣ ８から単離した（チャウドハリ
ー（Chaudhary)ら．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ 第８４巻、第
４５３８〜４５４２頁、１９８７年）。ｐＶＣ ８は N
se Iを用いて切断した。次いで、クレノー（Klenow) 反
応の標準条件（マニアチス（Maniatis) ら、前掲第１１
３頁）を用いることによりこのＤＮＡ上に平滑末端を発
生させた。この平滑末端化したＤＮＡを次いでＰＥ40を
含む１．３kbの Eco RI から平滑末端化 Nde Iの断片を
発生させるために Eco RI を用いて２番目の切断を行っ
た。ＴＧＦ−α−５７ HinD III から Fsp Iの断片（１
６８bp）を２．６８kb ｐＵＣ−１９ベクターへ結合さ
せた。一晩インキュベーションした後、１．３kbの Eco
RIから平滑末端化 Nde IのＰＥ40ＤＮＡ断片を結合混
合物へ加えた。この二番目の結合は一晩進行させた。こ
の結合反応生成物は次いでＪＭ １０９細胞を形質転換
するために用いた。ｐＵＣ−１９中にＴＧＦ−α−５７
ＰＥ40を含むクローンは放射標識したＴＧＦ−α−５７
ＰＥ40ＤＮＡとハイブリダイゼーションすることによ
り同定し、このクローンからのＤＮＡを単離した。その
ＴＧＦ−α−５７ＰＥ40をｐＵＣ−１９ベクターから取
り出しラインメイヤーら．，バイオ−テクノロジー第５
巻、第９６０〜９６５頁（１９８７年）（Linemeyer, e
t al., Bio-Technology ５：９６０−９６５ １９８
７）に記載されているＴＡＣベクターシステムへ移し
た。そのｐＵＣ−１９中のＴＧＦ−α−５７ ＰＥ40を
HinDIII 及び Eco RI で切断してＴＧＦ−α−５７Ｐ
Ｅ40を含む１．５kbの断片を発生させた。標準クレノー
反応条件（マニアチスら．，loc.cit.) を用いてこのＤ
ＮＡ断片上に平滑末端を発生させた。そのＴＡＣベクタ
ーを HinD III 及び EcoRI を用いて切断した。標準ク
レノー反応条件（マニアチスら．，loc.cit.) を用いて
切断したＴＡＣベクターＤＮＡ上に平滑末端を発生させ
た。２．７kbの平滑末端化したベクターをゲル電気泳動
により単離した。その平滑末端化したＴＧＦ−α−５７
ＰＥ40断片を次いで平滑末端化したＴＡＣベクターへ結
合させた。この結合によって生じたプラスミドをＪＭ１
０９細胞を形質転換するために用いた。ＴＧＦ−α−５
７ＰＥ40を含む候補となるクローンは上記したハイブリ
ダイゼーションにより同定しそして配列決定した。所望
の構築を含むそのクローンはｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−Ｐ
Ｅ４０と命名した。これらの操作により生じたプラスミ
ドを表１に示す。そのｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０
ＤＮＡ中にコードされるＴＧＦ−α−ＰＥ40融合蛋白質
のアミノ酸コドンのヌクレオチド配列を表２に示す。そ
のＴＧＦ５７−ＰＥ４０遺伝子によりコードされたアミ
ノ酸配列を表３に示す。
【００２９】
【実施例２】 ＤＮＡクローンを含むリコンビナントＴＧＦ−α−ＰＥ
40の修飾変異の構築： システインに対するアラニンの置換。 ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ：クローンｐＴＡＣ ＴＧＦ５
７−ＰＥ４０を Sph I及びBamHI で切断しその７４８
bp SphI-BamHI 断片（ＴＧＦ−αのＣ末端の４個のアミ
ノ酸、４個のリンカーアミノ酸及びＰＥ40のＮ末端の２
４０個のアミノ酸を指定する）を単離した。Ｍ１３ ｍ
ｐ１９ベクターＤＮＡを Sph I及びBamHI で切断し、そ
のベクターＤＮＡを単離した。７４８bp SphI-BamHI Ｔ
ＧＦ−α−ＰＥ40断片をＭ１３ベクターＤＮＡと１５℃
で一晩にわたり結合させた。細菌性の宿主細胞をこの結
合混合物を用いて形質転換し、候補となるクローンを単
離し適当なリコンビナントＤＮＡを含むこれらのクロー
ンを確認するためにそれらのプラスミドＤＮＡをシーク
エンシングした。一本鎖ＤＮＡを突然変異発生に対して
調製した。オリゴヌクレオチド（オリゴ＃１３２）を合
成し、ＰＥ40のアミノ酸の位置２７２で HpaI 部位をＴ
ＧＦ−α−ＰＥ40ＤＮＡへ導入するために部位特異的な
突然変異にこれを使用した： 5' CTGGAGACGTTAACCCGTC 3' （オリゴ # 132） この部位特異的な突然変異の結果のひとつはＰＥ40中の
残基番号２７２のフェニルアラニンからロイシンへの変
換である。その突然変異はウインターらの、ネイチャ
ー、第２９９巻、第７５６〜７５８頁（１９８２年）
（Winter, et al.,Nature, ２９９：７５６−７５８，
１９８２）に記載されているように行った。
40の修飾変異の構築： システインに対するアラニンの置換。 ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ：クローンｐＴＡＣ ＴＧＦ５
７−ＰＥ４０を Sph I及びBamHI で切断しその７４８
bp SphI-BamHI 断片（ＴＧＦ−αのＣ末端の４個のアミ
ノ酸、４個のリンカーアミノ酸及びＰＥ40のＮ末端の２
４０個のアミノ酸を指定する）を単離した。Ｍ１３ ｍ
ｐ１９ベクターＤＮＡを Sph I及びBamHI で切断し、そ
のベクターＤＮＡを単離した。７４８bp SphI-BamHI Ｔ
ＧＦ−α−ＰＥ40断片をＭ１３ベクターＤＮＡと１５℃
で一晩にわたり結合させた。細菌性の宿主細胞をこの結
合混合物を用いて形質転換し、候補となるクローンを単
離し適当なリコンビナントＤＮＡを含むこれらのクロー
ンを確認するためにそれらのプラスミドＤＮＡをシーク
エンシングした。一本鎖ＤＮＡを突然変異発生に対して
調製した。オリゴヌクレオチド（オリゴ＃１３２）を合
成し、ＰＥ40のアミノ酸の位置２７２で HpaI 部位をＴ
ＧＦ−α−ＰＥ40ＤＮＡへ導入するために部位特異的な
突然変異にこれを使用した： 5' CTGGAGACGTTAACCCGTC 3' （オリゴ # 132） この部位特異的な突然変異の結果のひとつはＰＥ40中の
残基番号２７２のフェニルアラニンからロイシンへの変
換である。その突然変異はウインターらの、ネイチャ
ー、第２９９巻、第７５６〜７５８頁（１９８２年）
（Winter, et al.,Nature, ２９９：７５６−７５８，
１９８２）に記載されているように行った。
【００３０】新たに作成した HpaI 部位を含む候補とな
るクローンを単離し、突然変異した遺伝子配列の存在を
確認するためにシークエンシングした。次いでこのクロ
ーンを SphI 及び SalI で切断した。ＴＧＦ−αのＣ末
端の５アミノ酸及びＰＥ40のＮ末端の６１アミノ酸を特
定しまた新たに導入した HpaI 部位を含む１９８bp断片
を単離し、 SphI-SalI部位で親のｐＴＡＣ ＴＧＦ５７
−ＰＥ４０プラスミドへ再びサブクローン化した。細菌
宿主細胞を形質転換し、候補となるクローンを単離し適
当なリコンビナントＤＮＡを含むこのクローンを確認す
るためにそのプラスミドＤＮＡをシークエンシングさせ
た。便宜上、このクローンをｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ
４０−１３２と命名した。ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ
４０−１３２を SphI 及び HpaI で切断し３．９６kbの
ＤＮＡ断片を単離した。ＴＧＦ−αのＣ末端の５個のア
ミノ酸及びＰＥ40のＮ末端の３２個のアミノ酸をカバー
しかつ SphI 及び HpaI 親和性末端を含む合成オリゴヌ
クレオチドカセットを合成し（オリゴ＃１５３）、切断
したｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２と結合さ
せた： 5' CGGACCTCCTGGCCATGGCCGAAGAGGGCGGCAGCCTGGCCGCGCTGACCGCGCA 3' GTACGCCTGGAGGACCGGTACCGGCTTCTCCCGCCGTCGGACCGGCGCGACTGGCGCGT CCAGGCTGCACACCTGCCGCTGGAGACGTT 3' GGTCCGACGTGTGGACGGCGACCTCTGCAA 5' （オリゴ # 153) このオリゴヌクレオチドカセットはＴＧＦ−α−ＰＥ40
ＤＮＡ中に変異を組み込み、ＴＧＦの残基５１でアラニ
ンを指定するコドンを除去し、ＰＥ40の残基２６４でシ
ステインを指定するコドンがアラニンを指定するように
させた。便宜上、このプラスミドＤＮＡをｐＴＡＣ Ｔ
ＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２、１５３と命名した。細菌
宿主細胞をｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２、
１５３ＤＮＡで形質転換させた。候補となるクローンを
ハイブリダイゼーションにより同定し、単離しそして適
当なリコンビナントＤＮＡを含むことを確認するために
それらのプラスミドＤＮＡをシークエンシングした。
るクローンを単離し、突然変異した遺伝子配列の存在を
確認するためにシークエンシングした。次いでこのクロ
ーンを SphI 及び SalI で切断した。ＴＧＦ−αのＣ末
端の５アミノ酸及びＰＥ40のＮ末端の６１アミノ酸を特
定しまた新たに導入した HpaI 部位を含む１９８bp断片
を単離し、 SphI-SalI部位で親のｐＴＡＣ ＴＧＦ５７
−ＰＥ４０プラスミドへ再びサブクローン化した。細菌
宿主細胞を形質転換し、候補となるクローンを単離し適
当なリコンビナントＤＮＡを含むこのクローンを確認す
るためにそのプラスミドＤＮＡをシークエンシングさせ
た。便宜上、このクローンをｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ
４０−１３２と命名した。ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ
４０−１３２を SphI 及び HpaI で切断し３．９６kbの
ＤＮＡ断片を単離した。ＴＧＦ−αのＣ末端の５個のア
ミノ酸及びＰＥ40のＮ末端の３２個のアミノ酸をカバー
しかつ SphI 及び HpaI 親和性末端を含む合成オリゴヌ
クレオチドカセットを合成し（オリゴ＃１５３）、切断
したｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２と結合さ
せた： 5' CGGACCTCCTGGCCATGGCCGAAGAGGGCGGCAGCCTGGCCGCGCTGACCGCGCA 3' GTACGCCTGGAGGACCGGTACCGGCTTCTCCCGCCGTCGGACCGGCGCGACTGGCGCGT CCAGGCTGCACACCTGCCGCTGGAGACGTT 3' GGTCCGACGTGTGGACGGCGACCTCTGCAA 5' （オリゴ # 153) このオリゴヌクレオチドカセットはＴＧＦ−α−ＰＥ40
ＤＮＡ中に変異を組み込み、ＴＧＦの残基５１でアラニ
ンを指定するコドンを除去し、ＰＥ40の残基２６４でシ
ステインを指定するコドンがアラニンを指定するように
させた。便宜上、このプラスミドＤＮＡをｐＴＡＣ Ｔ
ＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２、１５３と命名した。細菌
宿主細胞をｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２、
１５３ＤＮＡで形質転換させた。候補となるクローンを
ハイブリダイゼーションにより同定し、単離しそして適
当なリコンビナントＤＮＡを含むことを確認するために
それらのプラスミドＤＮＡをシークエンシングした。
【００３１】ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３
２、１５３ＤＮＡを HpaI 及び ＳａｌＩで切断し３．
９５ｋｂのベクターＤＮＡ断片を単離した。ＰＥ40の２
７２〜３０９のアミノ酸残基をカバーしかつ HpaI 及び
SalI 親和性末端を含む合成オリゴヌクレオチドカセッ
ト（オリゴ ＃１４２）を合成し、３．９５kbのｐＴＡ
Ｃ ＴＧＦ／ＰＥ４０−１３２、１５３ＤＮＡへ結合さ
せた。 5' AACCCGTCATCGCCAGCCGCGCGGCTGGGAACAACTGGAGCAGGCTGGCTATCCGGTGC 3' TTGGGCAGTAGCGGTCGGCGCGCCGACCCTTGTTGACCTCGTCCGACCGATAGGCCACG AGCGGCTGGTCGCCCTCTACCTGGCGGCGCGGCTGTCGTGGAACCAGG 3' TCGCCGACCAGCGGGAGATGGACCGCCGCGCCGACAGCACCTTGGTCCAGCT 5' （オリゴ # 142) このオリゴヌクレオチドカセットは残基２８７でシステ
インを指定するコドンがアラニンを指定するように変化
させた。便宜上、この突然変異したプラスミドＤＮＡを
ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２、１５３、１
４２と命名した。細菌宿主細胞をこのプラスミドで形質
変換させ候補となるクローンをハイブリダイゼーション
により同定した。これらのクローンを単離しそして適当
なリコンビナントＤＮＡを含むことを確認するためにそ
れらのプラスミドＤＮＡをシークエンシングした。その
ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２、１５３、１
４３プラスミドは座“Ａ”でＮ末端システインの２つと
もがアラニンに置き換わったＴＧＦ−α−ＰＥ40変異体
をコードする。したがって、前述した命名法に従いＴＧ
Ｆ−α−ＰＥ40のこの修飾変異をＴＧＦ−α−ＰＥ40ａ
Ｂと呼ぶ。ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢによりコードされた
アミノ酸配列を表４に示す。
２、１５３ＤＮＡを HpaI 及び ＳａｌＩで切断し３．
９５ｋｂのベクターＤＮＡ断片を単離した。ＰＥ40の２
７２〜３０９のアミノ酸残基をカバーしかつ HpaI 及び
SalI 親和性末端を含む合成オリゴヌクレオチドカセッ
ト（オリゴ ＃１４２）を合成し、３．９５kbのｐＴＡ
Ｃ ＴＧＦ／ＰＥ４０−１３２、１５３ＤＮＡへ結合さ
せた。 5' AACCCGTCATCGCCAGCCGCGCGGCTGGGAACAACTGGAGCAGGCTGGCTATCCGGTGC 3' TTGGGCAGTAGCGGTCGGCGCGCCGACCCTTGTTGACCTCGTCCGACCGATAGGCCACG AGCGGCTGGTCGCCCTCTACCTGGCGGCGCGGCTGTCGTGGAACCAGG 3' TCGCCGACCAGCGGGAGATGGACCGCCGCGCCGACAGCACCTTGGTCCAGCT 5' （オリゴ # 142) このオリゴヌクレオチドカセットは残基２８７でシステ
インを指定するコドンがアラニンを指定するように変化
させた。便宜上、この突然変異したプラスミドＤＮＡを
ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２、１５３、１
４２と命名した。細菌宿主細胞をこのプラスミドで形質
変換させ候補となるクローンをハイブリダイゼーション
により同定した。これらのクローンを単離しそして適当
なリコンビナントＤＮＡを含むことを確認するためにそ
れらのプラスミドＤＮＡをシークエンシングした。その
ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２、１５３、１
４３プラスミドは座“Ａ”でＮ末端システインの２つと
もがアラニンに置き換わったＴＧＦ−α−ＰＥ40変異体
をコードする。したがって、前述した命名法に従いＴＧ
Ｆ−α−ＰＥ40のこの修飾変異をＴＧＦ−α−ＰＥ40ａ
Ｂと呼ぶ。ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢによりコードされた
アミノ酸配列を表４に示す。
【００３２】ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ：クローンｐＴＡ
Ｃ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０を SphI 及びBamHI で切断
し、その７４８bp SphI-BamHI 断片（ＴＧＦ−αのＣ末
端の４個のアミノ酸、４個のリンカーアミノ酸及びＰＥ
40のＮ末端の２４０個のアミノ酸を特定する）を単離し
た。Ｍ１３ mp １９ベクターＤＮＡを SphI及びBamHI
で切断しそのベクターＤＮＡを単離した。その７４８bp
SphI-BamHI ＴＧＦ−α−ＰＥ40断片をＭ１３ベクター
ＤＮＡへ１５℃で一晩にわたり結合させた。細菌性の宿
主細胞をこの結合混合物を用いて形質転換し、候補とな
るクローンを単離し適当なリコンビナントＤＮＡを含む
これらのクローンを確認するためにそれらのプラスミド
ＤＮＡをシークエンシングした。一本鎖ＤＮＡを突然変
異発生用に調製した。オリゴヌクレオチド（オリゴ ＃
１３３）を合成し、ＰＥ40のアミノ酸の位置３６９で B
steII 部位をＴＧＦ−α−ＰＥ40ＤＮＡへ導入するため
に部位特異的な突然変異にこれを使用した： 5' GACGTGGTGACCCTGAC 3' （オリゴ # 133) この突然変異のひとつの結果はＰＥ40の位置３６９での
セリン残基のトレオニンへの変換である。
Ｃ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０を SphI 及びBamHI で切断
し、その７４８bp SphI-BamHI 断片（ＴＧＦ−αのＣ末
端の４個のアミノ酸、４個のリンカーアミノ酸及びＰＥ
40のＮ末端の２４０個のアミノ酸を特定する）を単離し
た。Ｍ１３ mp １９ベクターＤＮＡを SphI及びBamHI
で切断しそのベクターＤＮＡを単離した。その７４８bp
SphI-BamHI ＴＧＦ−α−ＰＥ40断片をＭ１３ベクター
ＤＮＡへ１５℃で一晩にわたり結合させた。細菌性の宿
主細胞をこの結合混合物を用いて形質転換し、候補とな
るクローンを単離し適当なリコンビナントＤＮＡを含む
これらのクローンを確認するためにそれらのプラスミド
ＤＮＡをシークエンシングした。一本鎖ＤＮＡを突然変
異発生用に調製した。オリゴヌクレオチド（オリゴ ＃
１３３）を合成し、ＰＥ40のアミノ酸の位置３６９で B
steII 部位をＴＧＦ−α−ＰＥ40ＤＮＡへ導入するため
に部位特異的な突然変異にこれを使用した： 5' GACGTGGTGACCCTGAC 3' （オリゴ # 133) この突然変異のひとつの結果はＰＥ40の位置３６９での
セリン残基のトレオニンへの変換である。
【００３３】新たに作成した BsteII 部位を含むＤＮＡ
クローンを同定し、単離し適当なリコンビナントＤＮＡ
の存在を確認するためにシークエンシングした。このク
ローンを次に ApaI 及び SalI 制限酵素により切断し
た。新たに作成した BsteII 部位を含む１２０bp挿入Ｄ
ＮＡ断片を単離しあらかじめ ApaI 及び SalI で切断し
たｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０へ結合させた。細菌
性の宿主細胞を形質転換させ、候補となるクローンを単
離し適当なリコンビナントＤＮＡの存在を確認するため
にシークエンスした。この新たに作成したプラスミドＤ
ＮＡをｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３３と呼ぶ。
これを BsteII 及び ApaI で切断しそして２．６５kbベ
クターＤＮＡ断片を単離した。BsteII から ApaI のオ
リゴヌクレオチドカセット（オリゴ＃１５５）は BsteI
I 及び ApaI 制限酵素により切断されたｐＴＡＣ ＴＧ
Ｆ５７−ＰＥ４０−１３３クローンから取り除かれたＴ
ＧＦ−α−ＰＥ40の領域をカバーするよう合成した。こ
のカセットは BsteII 及び ApaI 親和末端に対するヌク
レオチド配列をも指定した。 5' GTGACCCTGACCGCGCCGGTCGCCGCCGGTGAAGCTGCGGGCC 3' 3' GGACTGGCGCGGCCAGCGGCGGCCACTTCGACGC 5' （オリゴ # 155) このオリゴヌクレオチド カセットはＰＥ40の残基３７
２及び３７９でのシステインに対するコドンをアラニン
を指定するコドンに変化させた。オリゴヌクレオチド
カセット＃１５５を２．６５kbベクターＤＮＡ断片へ結
合させた。細菌性の宿主細胞を形質転換させ、候補とな
るクローンを単離し適当なリコンビナントＤＮＡの存在
を確認するためにシークエンシングした。この新たに作
成したＤＮＡクローンをｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４
０−１３３、１５５と呼ぶ。これは座“Ｂ”でシステイ
ンの２つともがアラニンに置き変わったＴＧＦ−α−Ｐ
Ｅ 40変異体をコードする。したがって、前述した命名法
に従いＴＧＦ−α−ＰＥ40のこの修飾変異をＴＧＦ−α
−ＰＥ40Ａｂと呼ぶ。そのＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ遺伝
子によりエンコードされたアミノ酸配列を表５に示す。
クローンを同定し、単離し適当なリコンビナントＤＮＡ
の存在を確認するためにシークエンシングした。このク
ローンを次に ApaI 及び SalI 制限酵素により切断し
た。新たに作成した BsteII 部位を含む１２０bp挿入Ｄ
ＮＡ断片を単離しあらかじめ ApaI 及び SalI で切断し
たｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０へ結合させた。細菌
性の宿主細胞を形質転換させ、候補となるクローンを単
離し適当なリコンビナントＤＮＡの存在を確認するため
にシークエンスした。この新たに作成したプラスミドＤ
ＮＡをｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３３と呼ぶ。
これを BsteII 及び ApaI で切断しそして２．６５kbベ
クターＤＮＡ断片を単離した。BsteII から ApaI のオ
リゴヌクレオチドカセット（オリゴ＃１５５）は BsteI
I 及び ApaI 制限酵素により切断されたｐＴＡＣ ＴＧ
Ｆ５７−ＰＥ４０−１３３クローンから取り除かれたＴ
ＧＦ−α−ＰＥ40の領域をカバーするよう合成した。こ
のカセットは BsteII 及び ApaI 親和末端に対するヌク
レオチド配列をも指定した。 5' GTGACCCTGACCGCGCCGGTCGCCGCCGGTGAAGCTGCGGGCC 3' 3' GGACTGGCGCGGCCAGCGGCGGCCACTTCGACGC 5' （オリゴ # 155) このオリゴヌクレオチド カセットはＰＥ40の残基３７
２及び３７９でのシステインに対するコドンをアラニン
を指定するコドンに変化させた。オリゴヌクレオチド
カセット＃１５５を２．６５kbベクターＤＮＡ断片へ結
合させた。細菌性の宿主細胞を形質転換させ、候補とな
るクローンを単離し適当なリコンビナントＤＮＡの存在
を確認するためにシークエンシングした。この新たに作
成したＤＮＡクローンをｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４
０−１３３、１５５と呼ぶ。これは座“Ｂ”でシステイ
ンの２つともがアラニンに置き変わったＴＧＦ−α−Ｐ
Ｅ 40変異体をコードする。したがって、前述した命名法
に従いＴＧＦ−α−ＰＥ40のこの修飾変異をＴＧＦ−α
−ＰＥ40Ａｂと呼ぶ。そのＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ遺伝
子によりエンコードされたアミノ酸配列を表５に示す。
【００３４】ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂ：ＴＧＦ−α−Ｐ
Ｅ40ａＢをコードするｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０
−１３２、１５３、１４２プラスミドを SalI 及び Apa
I で切断し、得られた３．８kbベクターＤＮＡ断片を単
離した。ＴＧＦ−α−ＰＥ40ＡｂをコードするｐＴＡＣ
ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３３、１５５プラスミドも
SalI 及び ApaI で切断し、ＰＥ40のアミノ酸残基３７
２及び３７９でシステインがアラニンに置換された１４
０kbＤＮＡ断片を単離した。これらの２つのＤＮＡを一
緒に結合させそして細菌性の宿主細胞を形質変換させる
ことに用いた。候補となるクローンはｐＴＡＣ ＴＧＦ
５７−ＰＥ４０−１３３、１５５からの放射標識した１
４０kbＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションすること
により同定した。この候補となるクローンからのプラス
ミドＤＮＡを単離し、適当なリコンビナントＤＮＡの存
在を確認するためにシークエンシングした。この新たに
作成したＤＮＡクローンはｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ
４０−１３２、１５３、１４２、１３３、１５５と呼
ぶ。このプラスミドは座“Ａ”及び“Ｂ”でのすべての
４つのシステインがアラニンにより置換されたＴＧＦ−
α−ＰＥ40変異体をコードする。したがって、前述した
命名法によりＴＧＦ−α−ＰＥ40のこの修飾変異をＴＧ
Ｆ−α−ＰＥ40ａｂと呼ぶ。そのＴＧＦ−α−ＰＥ40ａ
ｂ遺伝子によりコードされたアミノ酸配列を表６に示
す。
Ｅ40ａＢをコードするｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０
−１３２、１５３、１４２プラスミドを SalI 及び Apa
I で切断し、得られた３．８kbベクターＤＮＡ断片を単
離した。ＴＧＦ−α−ＰＥ40ＡｂをコードするｐＴＡＣ
ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３３、１５５プラスミドも
SalI 及び ApaI で切断し、ＰＥ40のアミノ酸残基３７
２及び３７９でシステインがアラニンに置換された１４
０kbＤＮＡ断片を単離した。これらの２つのＤＮＡを一
緒に結合させそして細菌性の宿主細胞を形質変換させる
ことに用いた。候補となるクローンはｐＴＡＣ ＴＧＦ
５７−ＰＥ４０−１３３、１５５からの放射標識した１
４０kbＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションすること
により同定した。この候補となるクローンからのプラス
ミドＤＮＡを単離し、適当なリコンビナントＤＮＡの存
在を確認するためにシークエンシングした。この新たに
作成したＤＮＡクローンはｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ
４０−１３２、１５３、１４２、１３３、１５５と呼
ぶ。このプラスミドは座“Ａ”及び“Ｂ”でのすべての
４つのシステインがアラニンにより置換されたＴＧＦ−
α−ＰＥ40変異体をコードする。したがって、前述した
命名法によりＴＧＦ−α−ＰＥ40のこの修飾変異をＴＧ
Ｆ−α−ＰＥ40ａｂと呼ぶ。そのＴＧＦ−α−ＰＥ40ａ
ｂ遺伝子によりコードされたアミノ酸配列を表６に示
す。
【００３５】
【実施例３】 組換え体ＴＧＦ−α−ＰＥ40の改変型を含有するＤＮＡ
クローンの構築：システイン残基の欠失 ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ、ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ及び
ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂはまた座“Ａ”及び／又は座
“Ｂ”のシステイン残基を除去することによって構築す
ることができる。これらの型のＴＧＦ−α−ＰＥ40型の
構築はＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢの場合オリゴヌクレオチ
ドカセット１５３を２６５位に予定されるアラニンコド
ンを欠失させるように変化させ、オリゴヌクレオチドカ
セット１４２を２８７位に予定されるアラニンコドンを
欠失させるように変化させることを除いて実施例３と同
様にして達成される。ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂの場合オ
リゴヌクレオチドカセット１５５を残基３７２及び３７
９に予定されるアラニンコドンを欠失させるように変化
させる。ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂの場合この組換え体遺
伝子を構築するために用いられるＤＮＡ断片はこの実施
例に記載されるＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢとＴＧＦ−α−
ＰＥ40Ａｂから用いられる。
クローンの構築：システイン残基の欠失 ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ、ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ及び
ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂはまた座“Ａ”及び／又は座
“Ｂ”のシステイン残基を除去することによって構築す
ることができる。これらの型のＴＧＦ−α−ＰＥ40型の
構築はＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢの場合オリゴヌクレオチ
ドカセット１５３を２６５位に予定されるアラニンコド
ンを欠失させるように変化させ、オリゴヌクレオチドカ
セット１４２を２８７位に予定されるアラニンコドンを
欠失させるように変化させることを除いて実施例３と同
様にして達成される。ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂの場合オ
リゴヌクレオチドカセット１５５を残基３７２及び３７
９に予定されるアラニンコドンを欠失させるように変化
させる。ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂの場合この組換え体遺
伝子を構築するために用いられるＤＮＡ断片はこの実施
例に記載されるＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢとＴＧＦ−α−
ＰＥ40Ａｂから用いられる。
【００３６】
【実施例４】組換え体ＴＧＦ−α−ＰＥ40融合タンパク質の生産及び
分離 融合タンパク質の生産 形質転換された大腸菌（E. coli)ＪＭ−１０９細胞を１
リットル振盪フラスコ中ＬＢ−ブロス５００mlでアンピ
シリン１００mg／mlの存在下３７℃に於て培養した。Ａ
６００分光光度吸光度値が０．６に達した後、イソプロ
ピルＢ−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシドを最終濃度１mM
まで加えた。２時間後細胞を遠心分離によって収集し
た。融合タンパク質のＳ−スルホン化 細胞を８Ｍグアニジン塩酸塩、５０mMトリスpH８．０、
１mMＥＤＴＡに室温で２時間攪拌して溶解した。この溶
解混合液に０．４Ｍ亜硫酸ナトリウムと０．１Ｍ四チオ
ン酸ナトリウムとなるよう固形試薬を加え、１Ｍ NaOH
でpH９．０に調整した。この反応液を室温で１６時間進
行させた。クロマトグラフィーのための調製 タンパク質溶液を１０，０００倍過剰量の１mM ＥＤＴ
Ａで４℃に於て透析した。次にこの混合液を６Ｍ尿素、
５０mMトリスpH８．０、５０mM NaCl となるようにし室
温で２時間攪拌した。溶解されない物質を３２．０００
xgで３０分間遠心分離によって除去した。ＤＥＡＥ Ｆ．Ｆ．セファロースクロマトグラフィー 前工程で得た澄明な上清を６Ｍ尿素、５０mMトリスpH
８．０、５０mM NaCl で平衡にした２６×４０cmＤＥＡ
Ｅ高速流カラム（ファーマシアＬＫＢバイオテクノロジ
ー社）に流速１ml／分で加えた。カラムを出る平衡緩衝
液中のＵＶ２８０分光光度吸光度が０．１以下になるよ
う吸収されない物質全てが除去されるまでカラムを平衡
緩衝液で洗浄した。吸着した融合タンパク質を５０〜３
５０mM NaCl 勾配１０００mlでカラムから溶離し、次に
ＹＭ−３０膜を取り付けた攪拌細胞アミコンコンセント
レイターで濃縮した。セファクリルＳ−３００ 濃縮融合タンパク質（８ml）を６Ｍ尿素、５０mMトリス
pH８．０、５０mM NaCl で平衡にした２．６×１００cm
セファクリルＳ−３００カラム（ファーマシアＬＫＢバ
イオテクノロジー社）に流速０．２５ml／分で加えた。
カラムをさらに平衡緩衝液で溶離し、３ml毎の画分を集
めた。ＴＧＦ−α−ＰＥ40活性を含む画分をプールし
た。Ｑ−セファロースクロマトグラフィー Ｓ−３００カラムからのプールした画分を、６Ｍ尿素、
５０mMトリスpH８．０、５０mM NaCl で平衡にした１．
６×４０cmＱ−セフアロースカラム（ファーマシアＬＫ
Ｂバイオテクノロジー社）に流速０．７ml／分で加え
た。カラムを平衡緩衝液で洗浄し、次に５０〜４５０mM
NaCl 勾配６００mlで溶離した。ＴＧＦ−α−ＰＥ40活
性を含む画分をプールし次に５０mMグリシンpH９．０で
透析し、−２０℃で貯蔵した。再折りたたみ（refolding) タンパク質試料を溶解し、５０mMグリシンpH１０．５で
分光光度吸光度ＵＶＡ２８０＝０．１まで希釈した。β
−メルカプトエタノールを加えてタンパク質試料に存在
するＳ−スルホネート基の理論数以上の４：１モル比と
なるようにした。この反応を４℃で１６時間進行させた
後この溶液を１０，０００倍過剰量の生理的緩衝食塩水
で透析し、−２０℃で貯蔵した。
分離 融合タンパク質の生産 形質転換された大腸菌（E. coli)ＪＭ−１０９細胞を１
リットル振盪フラスコ中ＬＢ−ブロス５００mlでアンピ
シリン１００mg／mlの存在下３７℃に於て培養した。Ａ
６００分光光度吸光度値が０．６に達した後、イソプロ
ピルＢ−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシドを最終濃度１mM
まで加えた。２時間後細胞を遠心分離によって収集し
た。融合タンパク質のＳ−スルホン化 細胞を８Ｍグアニジン塩酸塩、５０mMトリスpH８．０、
１mMＥＤＴＡに室温で２時間攪拌して溶解した。この溶
解混合液に０．４Ｍ亜硫酸ナトリウムと０．１Ｍ四チオ
ン酸ナトリウムとなるよう固形試薬を加え、１Ｍ NaOH
でpH９．０に調整した。この反応液を室温で１６時間進
行させた。クロマトグラフィーのための調製 タンパク質溶液を１０，０００倍過剰量の１mM ＥＤＴ
Ａで４℃に於て透析した。次にこの混合液を６Ｍ尿素、
５０mMトリスpH８．０、５０mM NaCl となるようにし室
温で２時間攪拌した。溶解されない物質を３２．０００
xgで３０分間遠心分離によって除去した。ＤＥＡＥ Ｆ．Ｆ．セファロースクロマトグラフィー 前工程で得た澄明な上清を６Ｍ尿素、５０mMトリスpH
８．０、５０mM NaCl で平衡にした２６×４０cmＤＥＡ
Ｅ高速流カラム（ファーマシアＬＫＢバイオテクノロジ
ー社）に流速１ml／分で加えた。カラムを出る平衡緩衝
液中のＵＶ２８０分光光度吸光度が０．１以下になるよ
う吸収されない物質全てが除去されるまでカラムを平衡
緩衝液で洗浄した。吸着した融合タンパク質を５０〜３
５０mM NaCl 勾配１０００mlでカラムから溶離し、次に
ＹＭ−３０膜を取り付けた攪拌細胞アミコンコンセント
レイターで濃縮した。セファクリルＳ−３００ 濃縮融合タンパク質（８ml）を６Ｍ尿素、５０mMトリス
pH８．０、５０mM NaCl で平衡にした２．６×１００cm
セファクリルＳ−３００カラム（ファーマシアＬＫＢバ
イオテクノロジー社）に流速０．２５ml／分で加えた。
カラムをさらに平衡緩衝液で溶離し、３ml毎の画分を集
めた。ＴＧＦ−α−ＰＥ40活性を含む画分をプールし
た。Ｑ−セファロースクロマトグラフィー Ｓ−３００カラムからのプールした画分を、６Ｍ尿素、
５０mMトリスpH８．０、５０mM NaCl で平衡にした１．
６×４０cmＱ−セフアロースカラム（ファーマシアＬＫ
Ｂバイオテクノロジー社）に流速０．７ml／分で加え
た。カラムを平衡緩衝液で洗浄し、次に５０〜４５０mM
NaCl 勾配６００mlで溶離した。ＴＧＦ−α−ＰＥ40活
性を含む画分をプールし次に５０mMグリシンpH９．０で
透析し、−２０℃で貯蔵した。再折りたたみ（refolding) タンパク質試料を溶解し、５０mMグリシンpH１０．５で
分光光度吸光度ＵＶＡ２８０＝０．１まで希釈した。β
−メルカプトエタノールを加えてタンパク質試料に存在
するＳ−スルホネート基の理論数以上の４：１モル比と
なるようにした。この反応を４℃で１６時間進行させた
後この溶液を１０，０００倍過剰量の生理的緩衝食塩水
で透析し、−２０℃で貯蔵した。
【００３７】
【実施例５】組換え体ＴＧＦ−α−ＰＥ40融合タンパク質の生産及び
分離 適当なＴＧＦ−α−ＰＥ40プラスミドを含む大腸菌株Ｊ
Ｍ−１０９を抗生物質１００mg／mlを含む複合培地（バ
ウエル（Bauer)等バイオテクノロジーアンドバイオエン
ジニアリング第１６巻９３３〜４１頁（１９７４年））
で３７℃に於て培養した。培養液が６００nmに於ける吸
光度２．５を示した後１mMイソプロピルチオガラクトシ
ドを加えてＴＧＦ−ＰＥ40発現を誘発した。９時間の誘
導期間の後クロス／フロー濾過によって培養液を収集
し、−７０℃で凍結した。
分離 適当なＴＧＦ−α−ＰＥ40プラスミドを含む大腸菌株Ｊ
Ｍ−１０９を抗生物質１００mg／mlを含む複合培地（バ
ウエル（Bauer)等バイオテクノロジーアンドバイオエン
ジニアリング第１６巻９３３〜４１頁（１９７４年））
で３７℃に於て培養した。培養液が６００nmに於ける吸
光度２．５を示した後１mMイソプロピルチオガラクトシ
ドを加えてＴＧＦ−ＰＥ40発現を誘発した。９時間の誘
導期間の後クロス／フロー濾過によって培養液を収集
し、−７０℃で凍結した。
【００３８】細胞ペーストを氷上で４容量の５０mMリン
酸ナトリウム、pH７．８に解凍して浮遊液を生成しこれ
を４層のチーズクロス次に９，０００psi のマチン−ゴ
ーリンプレスに２回通過させた。濾過浮遊液をゾーバル
ＧＳ−３ローターで９０００rpm （１３，０００xg）に
於て３０分間遠心分離して破片を除去した。上清に硫酸
アンモニウム飽和溶液を攪拌しながら２０％飽和（２５
０ml／リットル）となるまで室温で加えた。浮遊液を４
℃で０．５〜１時間攪拌し、次にＧＳ−３ローターで９
０００rpm（１３．０００xg）に於て２０分間遠心分離
した。
酸ナトリウム、pH７．８に解凍して浮遊液を生成しこれ
を４層のチーズクロス次に９，０００psi のマチン−ゴ
ーリンプレスに２回通過させた。濾過浮遊液をゾーバル
ＧＳ−３ローターで９０００rpm （１３，０００xg）に
於て３０分間遠心分離して破片を除去した。上清に硫酸
アンモニウム飽和溶液を攪拌しながら２０％飽和（２５
０ml／リットル）となるまで室温で加えた。浮遊液を４
℃で０．５〜１時間攪拌し、次にＧＳ−３ローターで９
０００rpm（１３．０００xg）に於て２０分間遠心分離
した。
【００３９】上清に飽和硫酸アンモニウムを攪拌しなが
ら３５％濃度（２３０ml／リットル上清）となるまで加
えた。硫酸アンモニウム含有溶液を４℃で０．５〜１時
間攪拌し、次に上の通り遠心分離した。沈降物を出発容
量の 1/4の５０mMリン酸ナトリウム、５０％ NH4SO4 pH
７．５に再浮遊させ、上の通り攪拌し、ポリプロピレン
管中でヅーバルＳＡ−６００の５，０００rpm （３．６
００xg）に於て１５分間遠心分離した。上清を捨て沈降
物を５０mMトリス、６Ｍグアニジン− HCl、pH９．０に
タンパク質１０mg／mlとなるよう室温に於て再浮遊させ
た。Na2SO3 を０．４Ｍの濃度まで加え、 Na2S4O6を
０．１Ｍの濃度まで加えた。pHをチェックし、９．０で
ない場合には HCl又はNaOHで適当に調整した。室温で一
晩攪拌した後、亜硫酸塩溶解タンパク質を５０mM Gly-C
l 、pH９．０で４℃に於て徹底的に透析した。
ら３５％濃度（２３０ml／リットル上清）となるまで加
えた。硫酸アンモニウム含有溶液を４℃で０．５〜１時
間攪拌し、次に上の通り遠心分離した。沈降物を出発容
量の 1/4の５０mMリン酸ナトリウム、５０％ NH4SO4 pH
７．５に再浮遊させ、上の通り攪拌し、ポリプロピレン
管中でヅーバルＳＡ−６００の５，０００rpm （３．６
００xg）に於て１５分間遠心分離した。上清を捨て沈降
物を５０mMトリス、６Ｍグアニジン− HCl、pH９．０に
タンパク質１０mg／mlとなるよう室温に於て再浮遊させ
た。Na2SO3 を０．４Ｍの濃度まで加え、 Na2S4O6を
０．１Ｍの濃度まで加えた。pHをチェックし、９．０で
ない場合には HCl又はNaOHで適当に調整した。室温で一
晩攪拌した後、亜硫酸塩溶解タンパク質を５０mM Gly-C
l 、pH９．０で４℃に於て徹底的に透析した。
【００４０】次にタンパク質を５０mM Gly-Cl 、pH１
０．５で０．１mg／mlまで希釈し、４０倍モル過剰量の
β−メルカプトエタノール（８７mMβ−Me、０．１mg／
ml）を加えた。この混合液を４℃で約１５時間攪拌し、
高次構造を回復したタンパク質を２０mMトリス−Cl、５
０mM NaCl 、pH８．０で４℃に於て約１５時間透析し
た。次にタンパク質を約０．３ml樹脂／mgタンパク質を
用いて２０mMトリス−Cl、５０mM NaCl 、pH８．０で４
℃に於て予め平衡にしたＱ−セファロースカラムにの
せ、２０mMトリス−Cl、pH８．０中５０〜５００mM NaC
l の直線塩勾配で溶離した（勾配サイズ＝６〜１０カラ
ム容量）。
０．５で０．１mg／mlまで希釈し、４０倍モル過剰量の
β−メルカプトエタノール（８７mMβ−Me、０．１mg／
ml）を加えた。この混合液を４℃で約１５時間攪拌し、
高次構造を回復したタンパク質を２０mMトリス−Cl、５
０mM NaCl 、pH８．０で４℃に於て約１５時間透析し
た。次にタンパク質を約０．３ml樹脂／mgタンパク質を
用いて２０mMトリス−Cl、５０mM NaCl 、pH８．０で４
℃に於て予め平衡にしたＱ−セファロースカラムにの
せ、２０mMトリス−Cl、pH８．０中５０〜５００mM NaC
l の直線塩勾配で溶離した（勾配サイズ＝６〜１０カラ
ム容量）。
【００４１】カラム画分をＡ280ＵＶ吸収、ゲル電気泳
動及びウェスタンブロットにより分析し、プールした。
キレートセファロース４Ｂを CuSO4で０．３〜１ml樹脂
／mgタンパク質を用いて処理することにより金属キレー
トカラムを調製した。このカラムを５０mMトリス−酢酸
塩、１Ｍ NaCl 、pH７．０で平衡にした。Cu+2が溶離し
ていないことを確かめるためにキレートセファロース４
Ｂの金属を含まない第２カラムをCu2+充填カラムの下流
に取り付けた。Ｑ−セファロース試料プールを５０mMト
リス−酢酸塩、１Ｍ NaCl 、pH７．０で１：２に稀釈し
金属キレートカラムに室温で負荷した。このカラムを１
カラム容量の平衡緩衝液で洗浄し、タンパク質を平衡緩
衝液でpH７．０に維持した０〜７０mMイミダゾールの直
線勾配で溶離した（勾配サイズ１０〜４０カラム容
量）。カラム画分をＡ280 ＵＶ吸収、ゲル電気泳動及び
ウェスタンブロットで分析し、プールした。
動及びウェスタンブロットにより分析し、プールした。
キレートセファロース４Ｂを CuSO4で０．３〜１ml樹脂
／mgタンパク質を用いて処理することにより金属キレー
トカラムを調製した。このカラムを５０mMトリス−酢酸
塩、１Ｍ NaCl 、pH７．０で平衡にした。Cu+2が溶離し
ていないことを確かめるためにキレートセファロース４
Ｂの金属を含まない第２カラムをCu2+充填カラムの下流
に取り付けた。Ｑ−セファロース試料プールを５０mMト
リス−酢酸塩、１Ｍ NaCl 、pH７．０で１：２に稀釈し
金属キレートカラムに室温で負荷した。このカラムを１
カラム容量の平衡緩衝液で洗浄し、タンパク質を平衡緩
衝液でpH７．０に維持した０〜７０mMイミダゾールの直
線勾配で溶離した（勾配サイズ１０〜４０カラム容
量）。カラム画分をＡ280 ＵＶ吸収、ゲル電気泳動及び
ウェスタンブロットで分析し、プールした。
【００４２】
【実施例６】８種のヒト膀胱がん腫細胞系をアメリカン
タイプカルチュアコレクション（ＡＴＣＣ）から凍結ア
ンプルとして入手した。これを直ちに培養し、ＡＴＣＣ
が提供する指示に従って単層として継代した。各細胞系
の増殖速度を確認した後、細胞を検定の終わりに対照ウ
ェルに準集密的層を形成するような適当な希釈度で９６
ウェルプレートにまいた。翌日血清を含まないＭＥＭ−
ａ、ＲＰＭＩ１６４０又はマッコイ５Ａ培地に維持した
これらの準集密的培養物を殺細胞（cell kill)標準検定
（モスマン（Mosmann) J. Immunol. Methods 第６５
巻、５５〜６３頁、１９８３年、エドワーズ（Edwards)
等、 Mol. Cell. Biol.第９巻、２８６０〜２８６７
頁、１９８９年）に使用した。各細胞系を１ウェル当た
り１０，０００個の生細胞で９６ウェルプレートに接種
した。２４時間後、細胞を１回洗浄し、研究中の試験化
合物を含む無血清培地に入れた。４８時間後生存してい
る細胞数を上記モスマンによって記載されたＭＴＴ〔３
−（３，４−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５
−ジフェニルテトラゾリウムブロミド〕検定を用いて定
量した。各細胞系に対する毒素活性を評価し、データを
次の表にまとめＡ４３１（外陰がん腫）細胞に対する活
性を比較として示した。
タイプカルチュアコレクション（ＡＴＣＣ）から凍結ア
ンプルとして入手した。これを直ちに培養し、ＡＴＣＣ
が提供する指示に従って単層として継代した。各細胞系
の増殖速度を確認した後、細胞を検定の終わりに対照ウ
ェルに準集密的層を形成するような適当な希釈度で９６
ウェルプレートにまいた。翌日血清を含まないＭＥＭ−
ａ、ＲＰＭＩ１６４０又はマッコイ５Ａ培地に維持した
これらの準集密的培養物を殺細胞（cell kill)標準検定
（モスマン（Mosmann) J. Immunol. Methods 第６５
巻、５５〜６３頁、１９８３年、エドワーズ（Edwards)
等、 Mol. Cell. Biol.第９巻、２８６０〜２８６７
頁、１９８９年）に使用した。各細胞系を１ウェル当た
り１０，０００個の生細胞で９６ウェルプレートに接種
した。２４時間後、細胞を１回洗浄し、研究中の試験化
合物を含む無血清培地に入れた。４８時間後生存してい
る細胞数を上記モスマンによって記載されたＭＴＴ〔３
−（３，４−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５
−ジフェニルテトラゾリウムブロミド〕検定を用いて定
量した。各細胞系に対する毒素活性を評価し、データを
次の表にまとめＡ４３１（外陰がん腫）細胞に対する活
性を比較として示した。
【００４３】
【００４４】
【実施例７】 数種のがん細胞系のＴＧＦ−α−ＰＥ40ＡＢ、実施例４のＴＧＦ−α−ＰＥ
４０ ａｂ及び実施例５のＴＧＦ−α−ＰＥ４０ａｂに対する比較
EC50's[pM] AB （実施例４） （実施例５） SOUAMOUS 細胞 A-431 39 378 163 A-431 146 355 161 A-431 94 314 183 A-431 77 297 207 ヒーラー 8356 310088 3988 SCC-4 227 861 445 SCC-9 443 647 218 SCC-15 106 392 193 SCC-25 39 147 67 神経膠芽細胞腫 U138MG 20889 >316nM 216609 U373MG >316nM >316nM 204064 乳腺がん MDA-MB-468 78 527 253 BT-20 58 207 94 MCF-7 >316nM >316nM >316nM 結腸腺がん HT-29 7605 786 669 正常細胞系 CHO >316nM >316nM >316nM NR-6 >316nM >316nM >316nM ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
４０ ａｂ及び実施例５のＴＧＦ−α−ＰＥ４０ａｂに対する比較
EC50's[pM] AB （実施例４） （実施例５） SOUAMOUS 細胞 A-431 39 378 163 A-431 146 355 161 A-431 94 314 183 A-431 77 297 207 ヒーラー 8356 310088 3988 SCC-4 227 861 445 SCC-9 443 647 218 SCC-15 106 392 193 SCC-25 39 147 67 神経膠芽細胞腫 U138MG 20889 >316nM 216609 U373MG >316nM >316nM 204064 乳腺がん MDA-MB-468 78 527 253 BT-20 58 207 94 MCF-7 >316nM >316nM >316nM 結腸腺がん HT-29 7605 786 669 正常細胞系 CHO >316nM >316nM >316nM NR-6 >316nM >316nM >316nM ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００４５】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【図１】組換え体プラスミドｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−Ｐ
Ｅ４０の遺伝子地図を示す図である。
Ｅ４０の遺伝子地図を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１０月７日
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/16 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 デイヴイツド シー．ヘイムブルツク アメリカ合衆国，08551 ニユージヤーシ イ，リンゴーズ，サンドラ ロード 44 (72)発明者 アレン アイ．オリフ アメリカ合衆国，19437 ペンシルヴアニ ア，ギユイネツド ヴアレー，フローレン ス ドライヴ 1412 (72)発明者 ステイーヴン エム．ステイアデイヴアン ド アメリカ合衆国，18976 ペンシルヴアニ ア，ウオリントン，オールド ニユー ロ ード 57
Claims (21)
- 【請求項１】 膀胱癌細胞のＥＧＦレセプターに結合す
るＥＧＦファミリーのペプチドホルモンの群から選択さ
れる細胞を標的とする作用物質と、ＡＤＰ−リボシル化
ほ乳類細胞毒の群から選択される細胞毒からなるハイブ
リッド蛋白質を、膀胱癌細胞と接触させることを特徴と
し、ハイブリッド蛋白質の量が殺膀胱癌細胞作用を示す
のに十分な量であるところの、膀胱癌細胞を処置する方
法。 - 【請求項２】 細胞を標的とする作用物質がＥＧＦある
いはＴＧＦ−αであって、細胞毒がＰＥ40ＡＢ、ＰＥ40
Ａｂ、ＰＥ40ａＢ、ＰＥ40ａｂ、ジフテリア毒素あるい
はリシンである、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 ハイブリッド蛋白質が生理的に受容され
る液体中に溶液あるいは懸濁液として存在することを特
徴とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 液体が滅菌水、注射用水、生理食塩水あ
るいは緩衝生理食塩水であって、場合によってはキャリ
ヤー蛋白質を含んでいる請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 液体がリン酸緩衝生理食塩水であって、
場合によってはヒト血清アルブミンを含んでいる、請求
項４記載の方法。 - 【請求項６】 生理的に受容される液体が６０mlあたり
約０．１mgから約１０mgのハイブリッド蛋白を含んでい
る請求項３記載の方法。 - 【請求項７】 生理的に受容される液体が６０mlあたり
約０．５mgから約５mgのハイブリッド蛋白を含んでいる
請求項３記載の方法。 - 【請求項８】 生理的に受容される液体が６０mlあたり
約２mgから約４mgのハイブリッド蛋白を含んでいる請求
項３記載の方法。 - 【請求項９】 接触が約３０分から約４時間継続され
る、請求項３記載の方法。 - 【請求項１０】 緩衝生理食塩水が６０mlあたり約０．
１mgから約１０mgのハイブリッド蛋白を含んでいる請求
項４記載の方法。 - 【請求項１１】 緩衝生理食塩水が６０mlあたり約０．
５mgから約５mgのハイブリッド蛋白を含んでいる請求項
４記載の方法。 - 【請求項１２】 緩衝生理食塩水が６０mlあたり約２mg
から約４mgのハイブリッド蛋白を含んでいる請求項４記
載の方法。 - 【請求項１３】 接触が室温で行なわれる、請求項３記
載の方法。 - 【請求項１４】 ハイブリッド蛋白質であるＴＧＦ−α
−ＰＥ40ａＢ、ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ、ＴＧＦ−α−
ＰＥ40ａｂのいずれかを殺膀胱癌細胞作用を示す濃度で
含んでいる、生理的に受容される液体からなる組成物。 - 【請求項１５】 ６０mlあたり約０．１mgから約１０mg
のハイブリッド蛋白を含んでいる請求項１４記載の組成
物。 - 【請求項１６】 ６０mlあたり約０．５mgから約５mgの
ハイブリッド蛋白を含んでいる請求項１４記載の組成
物。 - 【請求項１７】 ６０mlあたり約２mgから約４mgのハイ
ブリッド蛋白を含んでいる請求項１４記載の組成物。 - 【請求項１８】 生理的に受容される液体が、場合によ
ってはキャリヤー蛋白質を含んでいるリン酸緩衝生理食
塩水である、請求項１４記載の組成物。 - 【請求項１９】 キャリヤー蛋白質がヒト血清アルブミ
ンである請求項１８記載の組成物。 - 【請求項２０】 形質転換細胞中で発現されているハイ
ブリッド蛋白質、ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ、ＴＧＦ−α
−ＰＥ40Ａｂ、ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂを、 硫酸塩で沈殿させ、 金属キレートカラムを用いたアフィニティクロマトグラ
フィで精製し、 尿素処理を行なわないことを特徴とする工程により処理
して得られる、効力の増強されたハイブリッド蛋白質、
ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ、ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ、Ｔ
ＧＦ−α−ＰＥ40ａｂ。 - 【請求項２１】 硫酸塩が（NH4)2SO4である請求項２０
記載のハイブリッド蛋白質。
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