NO303579B1 - FremgangsmÕte for fremstilling av et TGF-<alfa>-PE40-hybridprotein - Google Patents
FremgangsmÕte for fremstilling av et TGF-<alfa>-PE40-hybridprotein Download PDFInfo
- Publication number
- NO303579B1 NO303579B1 NO912418A NO912418A NO303579B1 NO 303579 B1 NO303579 B1 NO 303579B1 NO 912418 A NO912418 A NO 912418A NO 912418 A NO912418 A NO 912418A NO 303579 B1 NO303579 B1 NO 303579B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- tgf
- alpha
- protein
- dna
- hybrid
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 60
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 52
- 108010065303 transforming growth factor type alpha-Pseudomonas exotoxin A Proteins 0.000 title claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 49
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 14
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 13
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 10
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 8
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 claims description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 abstract description 64
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 abstract description 62
- 108700033844 Pseudomonas aeruginosa toxA Proteins 0.000 abstract description 19
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 abstract description 13
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 abstract description 8
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 abstract description 6
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 abstract description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 abstract 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 abstract 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 abstract 1
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 65
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 57
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 9
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 8
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 8
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 6
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 5
- -1 alanine or glycine Chemical class 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 4
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 4
- 102100031334 Elongation factor 2 Human genes 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 108010077519 Peptide Elongation Factor 2 Proteins 0.000 description 4
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 4
- 150000001295 alanines Chemical group 0.000 description 4
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 4
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 3
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 101500027527 Homo sapiens Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 239000000637 Melanocyte-Stimulating Hormone Substances 0.000 description 2
- 108010007013 Melanocyte-Stimulating Hormones Proteins 0.000 description 2
- 101800001751 Melanocyte-stimulating hormone alpha Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 102100027467 Pro-opiomelanocortin Human genes 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 2
- 201000001531 bladder carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 2
- HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L sodium tetrathionate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FRGKKTITADJNOE-UHFFFAOYSA-N sulfanyloxyethane Chemical compound CCOS FRGKKTITADJNOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 208000010570 urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- WHNFPRLDDSXQCL-UAZQEYIDSA-N α-msh Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(C)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WHNFPRLDDSXQCL-UAZQEYIDSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000763236 Colpodella Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101710082714 Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000410 MSH receptor Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 108010078376 interleukin 2-diphtheria toxin Proteins 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 201000004916 vulva carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000013013 vulvar carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Networks Using Active Elements (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Foreliggende patentsøknad angår en fremgangsmåte for fremstilling av et TGF-a-PE40-hybridprotein med økt celledrepende aktivitet.
Tradisjonell kjemoterapi av cancer bygger på medika-menters evne til å drepe tumorceller i cancerpasienter. Uheldigvis dreper disse medikamentene ofte normale celler såvel som tumorceller. I hvilken grad et cancermedikament dreper tumorceller snarere enn normale celler, er et mål på medika-mentets selektivitetsgrad for tumorceller. Én måte å øke cancermedikamenters selektivitet for tumorceller på, er å levere medikamentene fortrinnsvis til tumorcellene mens normale cellepopulasjoner unngås. En annen betegnelse for selektiv avlevering av kjemoterapeutiske stoffer til spesifikke celle-populas joner er "målsøking". Målretting av medikamenter til tumorceller kan oppnås på flere måter. En fremgangsmåte bygger på nærvær av spesifikke reseptormolekyler på overflaten av tumorceller. Andre molekyler, kalt "målsøkende stoffer", kan gjenkjenne og binde seg til disse celleoverflateresep-torene. Slike "målsøkende stoffer" omfatter bl.a. antistoffer, vekstfaktorer og hormoner. "Målsøkende stoffer" som gjenkjenner og binder seg til spesifikke celleoverflatereseptorer, sies å målsøke cellene som har slike reseptorer. Således har blæretumorceller et protein på sin overflate kalt epidermal vekstfaktorreseptor. Transformerende vekstfaktor-alfa (TGF-alfa) gjenkjenner og bindes til EGF-reseptoren på blære-tumorcellene. TGF-alfa er derfor et "målsøkende stoff" for disse tumorcellene.
"Målsøkende stoffer" i seg selv dreper ikke tumorceller. Andre molekyler som cellegifter og toksiner, kan bindes til "målsøkende stoffer" slik at hybride molekyler som besitter både tumorcelle-målsøkende egenskaper og celletoksin-domener, dannes. Slike hybridmolekyler virker som selektive gifter for tumorceller i kraft av sin evne til å målsøke tumorceller og deretter drepe disse cellene via sin toksinkomponent. Bakterielle toksiner som inhiberer proteinsyntesen i pattedyrceller, utgjør noen av de mest aktive cellegiftene som benyttes til konstruksjon av slike hybridmolekyler. Pseudomonas exotoksin A er ett av disse bakterietoksiner og er blitt
benyttet i konstruksjon av hybride "målsøker-toksin"-molekyler (US patentskrift 4 545 985).
Pseudomonas exotoksin A forgifter pattedyrceller ved først å bindes til cellens overflate for så å gå inn i cellens cytoplasma og inaktivere elongasjonsfaktor 2 som er et cellulært protein som er nødvendig for proteinsyntese. Pseudomonas exotoksin A er benyttet i anticancer-hybridmolekyler sammen med monoklonale antistoffer og protein-hormoner. Ett problem med disse hybridmolekylene er imidlertid at de er giftige for normale celler. Giftigheten for-bundet med hybridmolekyler som inneholder Pseudomonas exotoksin A, skyldes iallfall delvis at Pseudomonas exotoksin A i seg selv kan bindes til og opptas i mange slags pattedyrceller. Hybridmolekyler dannet mellom Pseudomonas exotoksin A og spesifikke "målsøkende stoffer", kan således bindes til mange normale celler i tillegg til de celler som gjenkjennes av det "målsøkende stoff". En måte å håndtere dette problem på er å modifisere Pseudomonas exotoksin A slik at det ikke lenger er i stand til å bindes til normale celler. Dette kan oppnås ved å fjerne den delen av Pseudomonas exotoksin A-molekylet som er ansvarlig for den cellebindende aktivitet. En trunkert form av Pseudomonas exotoksin A som bibeholder evnen til å inaktivere elongasjonsfaktor 2, men som ikke lenger er i stand til å bindes til pattedyrceller, er fremstilt. Dette trunkerte Pseudomonas exotoksin A-molekyl kalles Pseudomonas exotoksin-40 eller PE^q (Hwang et al., Cell 48:129-136, 1987).
PE^0er blitt koblet til flere målsøkende molekyler, deriblant TGF-alfa (Chaudhary et al., PNAS USA 84:4583-4542, 1987). Hybridmolekyler som inneholder PE4Qog TGF-alfa-domener, er i stand til spesifikt å bindes til tumorceller som innehar EGF-reseptorer, og å forgifte disse cellene ved å inhibere proteinsyntesen. Dette hybridmolekyl må innta den rette konformasjon for å kunne bindes effektivt til EGF-reseptoren. Effektiv reseptorbinding.er også avhengig av at det "målsøkende domene" er riktig eksponert slik at det er tilgjengelig for binding. Når hybridmolekyler mellom TGF- alfa og PE^q produseres som fusjonsproteiner i bakterier ved bruk av rekombinant DNA-teknikker, vil hovedmengden av hybridmolekyler vise dårlig bindingsaktivitet overfor EGF-reseptoren. 1. Pseudomonas exotoksin A kan ifølge US patentskrift 4 545 985 konjugeres kjemisk til et antistoff eller til epidermal vekstfaktor. Slike konjugater kan ifølge dette patent benyttes til å drepe humane tumorceller, imidlertid har disse kjemisk koblede toksiner vist seg å ha uønskede, ikke spesifikke aktivitetsnivåer. 2. Antistoffer kan ifølge US patentskrift 4 664 911 konjugeres til A-kjeden eller B-kjeden av ricin som er et toksin fra planter. Slike konjugater kan ifølge patentskrift 4 664 911 benyttes til å drepe humane tumorceller. 3. Hormoner som melanocyttstimulerende hormon (MSH), kan ifølge US patentskrift 4 675 382 kobles til en del av
difteritoksinproteinet med peptidbindinger. Genene som koder for disse proteiner, kan, ifølge patentskrift 4 675 382, ved hjelp av rekombinant DNA-teknikker kobles sammen for å styre syntesen av et hybrid fusjonsprotein. Dette fusjonsprotein kan bindes til celler som har MSH-reseptorer.
4. Murphy et al., PNAS USA 82:8258-8262, 1986, Genetic construction, expression, and melanoma-selective
cytotoxicity of a diphtheria toxin-related alpha-melanocyte-stimulating hormone fusion protein. Et hybrid fusjonsprotein produsert i bakterier ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi, og som består av en del av difteritoksinproteinet koblet til alfa-melanocyttstimulerende hormon, vil ifølge denne publikasjon bindes til og drepe humane melanomceller.
5. Allured et al., PNAS USA 83:1320-1324, 1986, Structure of exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa at
3.0 Angstrom. Denne publikasjon beskriver den tredimen-
sjonale struktur av Pseudomonas exotoksin A-proteinet.
6. Hwang et al., Cell 4^:129-136, 1987, Functional Domains of Pseudomonas Exotoxin Identified by Deletion Analysis of the Gene Expressed in E. Coli. Pseudomonas exotoksin A-proteinet kan ifølge denne publikasjon deles inn i tre adskilte, funksjonelle domener ansvarlige for: binding til pattedyrceller, translokasjon av toksinproteinet over lysosomale membraner, og ADP-ribosylering av elongasjonsfaktor 2 inne i pattedyrceller. Videre viser publikasjonen at disse funksjonelle domener svarer til adskilte deler av Pseudomonas exotoksin A-proteinet. 7. Chaudhary et al., PNAS USA 8±: 4538-4542, 1987, Activity of a recombinant fusion protein between transforming growth factor type alpha and Pseudomonas toxin. Hybride fusjonsproteiner dannet mellom PE-40 og transformerende vekstfaktor-alfa og produsert i bakterier ved hjelp av rekombinant DNA-teknikker, vil, ifølge denne publikasjon, bindes til og drepe humane tumorceller med epidermal vekstfaktor-reseptorer. 8. I henhold til europeisk patentsøknad 0 261 671 publisert 30. mars 1988, kan en del av Pseudomonas exotoksin A-proteinet fremstilles som mangler cellebindingsevnen, men som fortsatt besitter translokasjonsaktiviteten og ADP-ribosylering sakt i vi te tene til det intakte Pseudomonas exotoksin A-protein. Den del av Pseudomonas exotoksin A-proteinet som besitter toksinets translokasjonsaktivitet og ADP-ribosyl-eringsaktivitet, kalles Pseudomonas exotoksin-40 eller PE-40. PE-40 består av aminosyrerester 252-613 fra det intakte Pseudomonas exotoksin A-protein som definert i Gray et al., PNAS USA 8_1:2645-2649, 1984. PE-40 kan ifølge foreliggende patentsøknad kobles til transformerende vekstfaktor-alfa slik at et hybrid fusjonsprotein som kan produseres i bakterier ved hjelp av rekombinant DNA-teknikker, blir dannet. 9. Kelley et al., PNAS USA 85:3980-3984, 1988, Interleukin 2-diphtheria toxin fusion protein can abolish cell-mediated immunity in vivo. Et hybrid fusjonsprotein produsert i bakterier ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi og som består av en del av difteritoksinproteinet koblet til interleukin 2, vil ifølge denne publikasjon undertrykke cellemediert immunitet i mus. 10. Bailon, Biotechnology, s. 1326-1329, nov. 1988. Purification and Partial Characterization of an Interleukin 2-Pseudomonas Exotoxin Fusion Protein. Hybride fusjonsproteiner dannet mellom PE-40 og interleukin 2 og fremstilt i bakterier ved hjelp av rekombinant DNA-teknikker, vil ifølge denne publikasjon bindes til og drepe humane cellelinjer med interleukin 2-reseptorer. 11. Edwards et al., Mol. Cell. Biol. 9^:2860-2867, 1989, beskriver fremstillingen av modifiserte TGF-alfa -
PE^0hybridmolekyler som har vist seg anvendelige i behandling av blærekreftceller. 12. Heimbrook et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 8_7:4697-4701, 1990, beskriver evnen in vivo til modifisert TGF-alfa - PE4Qtil signifikant å øke overlevelsen av mus med inntransplanterte, humane tumorceller. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av et TGF-a-PE40-hybridprotein med økt celledrepende aktivitet, kjennetegnet ved trinnene a) innhøsting av en tilstrekkelig mengde celler som uttrykker et hybridprotein utvalgt fra TGF-a-PE40Ab, TGF-a-PE40aB og TGF-aPE40ab, hvori "a" og "b" representerer substitu-sjon av cysteinrestene ved hhv. locus A og B med alanin- eller glysinrester; b) utfelling av det uttrykte protein med ammoniumsulfat;
c) oppløsning av det utfelte protein; og
d) rensing av det oppløselige protein ved affinitets-kromatografi ved anvendelse av en metallchelaterende kromatografikolonne, idet hybridproteinet ikke utsettes for urea under fremstillingen.
Fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et hybridmolekyl bestående av et modifisert PE40-domene koblet til et TGF-alfa-målsøkende domene. Det modifiserte PE40-domene forbedrer hybridmolekylets reseptorbindings-aktivitet. Erstatning av cysteinrestene i PE40med andre nøytrale aminosyrer, som alanin eller glysin, gir økt binding av hybridmolekylet til reseptorer som gjenkjennes av det mål-søkende domene. Hybridmolekylene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse bindes mer effektivt til målreseptorene på humane tumorceller enn hybridmolekyler med umodi f i sert PE40, og kan nyttes til å drepe blæretumorceller.
Hybridmolekyler dannet mellom TGF-alfa og PE40, er kjennetegnet ved tre primære testsystemer. Prøvene omfatter: 1 - ADP-ribosylering av elongasjonsfaktor 2 som måler den enzymatiske aktivitet av TGF-alfa - PE4Qsom inhiberer proteinsyntesen i pattedyrceller, 2 - inhibering av binding av radioaktivt merket EGF til EGF-reseptoren på membranvesikler fra A431-celler som måler bindingsaktiviteten av TGF-alfa - PE^q til EGF-reseptoren, og 3 - celleproliferasjon som anslått ved omdanning av 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetra-zoliumbromid (MTT) til formazan, som benyttes for å måle overlevelse av tumorceller etter behandling med TGF-alfa - PE^q. Disse prøver ble utført som tidligere beskrevet
(Dominic et al., Infection and Immunity _16: 832-841, 1977,
Cohen et al., J. Biol. Chem. 257:1523-1531, 1982, Riemen et al., Peptides ji:877-885, 1987, Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983).
For å danne nye TGF-alfa - PE4Q-hybridmolekyler med forbedrede reseptorbindingsegenskaper ble det først produsert en serie rekombinant DNA-molekyler som kodet for entenTGF-alfa - PE4Q eller endrede versjoner av TGF-alfa-<p>e4q-Utgangsgenet for TGF-alfa - PE4Q-genet var molekylært klonet i en bakter-iell TAC-ekspresjonsvektor, plasmidet pTAC TGF57-PE40, ved å benytte adskilte segmenter av klonet DNA som beskrevet i eksempel 1. DNA-klonen pTAC TGF57-PE40 ble benyttet som utgangs-stoff for konstruksjon av spesifikt endrede utgaver av TGF-alfa - PE4Q-DNA. De spesifikke endringer av pTAC TGF57- PE40-DNA omfatter sete-spesifikke mutasjoner i den kodende sekvens som erstatter to eller fire av cysteinkodonene innen PE4Q-domenet i pTAC TGF57-PE40-DNA med kodoner for andre aminosyrer. De sete-spesifikke mutasjoner i pTAC TGF57-PE40-DNA ble utført ifølge Winter et al., Nature 299:756-758, 1982. Eksempler på mutere pTAC TGF57-PE40-DNA er vist i eksempel 3. Aminosyresekvensen til det hybride protein som pTAC TGF57-PE40-DNA koder for, er vist i figur 3. De fire cysteinrester i PE40-domenet i det opprinnelige TGF-alfa - PE040hybride protein er betegnet rest Cys265, Cys287, Cys372 og Cys<379>(figur 3). Aminosyrerestene i PE40-domenet er nummerert ifølge Gray et al., PNAS USA 81: 2645-2649 (1984). Modifiserte TGF-alfa - PE40-hybridproteiner som dannes fra spesifikt mutert pTAC TGF57-PE40-DNA, inneholder substitusjoner i de to N-terminale PE40-restene [Cys265og Cys<287>] eller de to C-terminale rester [Cys<372>og Cys<379>], eller begge deler [Cys<265>, Cys287, Cys372 og Cys<379>]. En forenklet nomenklatur for å beskrive de modifiserte hybridproteiner produsert fra disse muterte pTAC TGF57-PE40-DNA-er, oppnås ved å betegne aminosyrerestene i de N-terminale posisjoner "A"-lokuset, og restene i de C-terminale posisjoner "B"-lokuset. Når cysteinrester er til stede i de to N-terminale PE40-posisjoner som i det opprinnelige TGF-alfa PE40-hybridmolekyl, betegnes lokuset med stor bokstav (dvs. "A"). Hvis disse cysteiner er erstattet med andre nøytrale aminosyrer som glysin eller alanin, betegnes lokuset med en liten "a". Tilsvarende betegnes det C-terminale lokus med en stor "B" hvis aminosyrerestene i de to C-terminale posisjoner er cysteiner, mens lokuset betegnes med liten "b" hvis cysteinrestene i disse posisjoner er erstattet med andre aminosyrer. Hvis alle fire cysteinrester i PE40-domenet i TGF-alfa - PE40er erstattet med alaniner, blir det modifiserte hybridprotein således betegnet TGF-alfa - PE40ab. Tilsvarende blir det opprinnelige TGF-alfa - PE40-hybridprotein med cysteiner i amino-syrerestposisjoner 265, 287, 372 og 379, betegnet TGF-alfa - PE40AB.
Både TGF-alfa - PE4QAB-hybridproteinet og de modifiserte TGF-alfa - PE4Q-hybridproteiner er produsert i E. coli ved bruk av TAC-ekspresjonsvektorsystemet beskrevet av Linemeyer et al., Bio-Technology 5:960-965, 1987. De rekom binante hybridproteiner som produseres i disse bakterier, høstes og renses ved å lysere bakteriene i guanidinhydroklorid etterfulgt av tilsetning av natriumsulfitt og natriumtetrathionat. Reaksjonsblandingen blir deretter dialysert og urea tilsatt for å bringe utfelte proteiner i løsning. Blandingen sentrifugeres så for å fjerne uløselige proteiner, og de rekombinante, hybride TGF-alfa - PE^-proteiner skilles ved bruk av ionebytterkromatografi fulgt av størrelseseksklusjons-kromatograf i , igjen fulgt av ionebytterkromatografi. De rensede TGF-alfa - PE4Q-hybridproteiner behandles så med reduserende stoffer som beta-mercaptoethanol for å tillate disulfidbindinger å dannes mellom par av cysteinrester innen hybridproteinet. TGF-alfa - PE^-protein av høy renhet oppnås så ved størrelseseksklusjons- og ionebytterkromatografi av de renaturerte hybridproteiner. Detaljene i dette renseskjema er beskrevet i eksempel 4. Den biologiske aktivitet av disse fibrinproteiner etter rensing og renaturering kan bestemmes ved å benytte prøvene for ADP-ribosylering, EGF-reseptor-binding og celleproliferasjon som er beskrevet ovenfor.
Et foretrukket alternativ er å fremstille hybrid-proteinene TGF-alfa - PE4QAB, TGF-alfa - PE4QAb, TGF-alfa -PE„^aB og TGF-alfa - PE.^ab i transformerte bakterier.
40 ^ 40
Bakteriene høstes, cellemassen lyseres og celledebris og uønskede proteiner fjernes, fortrinnsvis ved sentrifugering. Det ønskede hybridprotein utfelles så ved tilsetning av et sulfatsalt, fortrinnsvis (NI^^SO^, til supernatanten. Bunnfallet behandles med sulfitt, renatureres ved tilsetning av et overskudd av (3-mercaptoethanol, konsentreres og separeres ved ionebytterkromatografi og metallchelaterende kromatografi. Spesifikke detaljer beskrives i eksempel 5.
En viktig egenskap ved TGF-alfa-modifisert<p>e4q er dets evne til å bindes til og drepe humane blæretumorceller. Anti-cancerproteinene som beskrives her, kan anvendes for å drepe blærecancerceller og nyttes i denne hensikt i form av en løs-ning eller suspensjon i en fysiologisk akseptabel væske som f.eks. sterilt vann, vann for injeksjon, saltvann eller fortrinnsvis bufret saltvann eller bufret saltvann med et bærer-protein som f.eks. humant serumalbumin, f.eks. fosfatbufret saltvann eller PBS med humant serumalbumin. Løsningen eller suspensjonen inneholder tilnærmet 0,1 mg til 10 mg av anti-cancerhybridproteinet pr. 60 ml av den fysiologisk akseptable væske. Mer foretrukket er et innhold på tilnærmet 0,5 mg til 5 mg pr. 60 ml, og mest foretrukket et innhold på tilnærmet 2 mg til 4 mg pr. 60 ml av den fysiologisk akseptable væske. Blærecancerceller utsettes for en løsning eller suspensjon av de anti-cancerproteiner som er beskrevet her, i en periode av fra mindre enn 1 time, f.eks. 30 minutter, til en periode på flere timer, f.eks. opptil 4 timer, ved romtemperatur. Når det gjelder laboratoriedyr, tilføres løsningen eller suspensjonen ved hjelp av et trans-urethralt kateter.
De følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse. Alle enzymatiske reaksjoner som kreves for mole-kylærbiologiske manipulasjoner, ble, med mindre annet et spesifisert, utført som beskrevet i Maniatis et al. (1982) i: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press.
Eksempel 1
Oppbygging av rekombinant DNA-kloner som inneholder
TGF-alfa - PE._-DNA
40
DNA-segmentet for TGF-alfa ble oppbygd ved bruk av
tre sett av syntetiske oligonukleotider i henhold til Defeo-Jones et al., Molecular and Cellular Biology 8: 2999-3007, 1988. Dette syntetiske TGF-alfa-gen ble klonet inn i pUC-19. DNA fra pUC-19-klonen som inneholdt rekombinant, humant TGF-alfa, ble oppsluttet med Sph I og Eco RI. Ved oppslut-ningen ble et 2,8 kb DNA-fragment som inneholdt hele pUC-19
og 5'-delen av TGF-alfa, dannet. 2,8 kb-fragmentet ble renset og isolert ved gelelektroforese. En Eco RI til Sph I-oligonukleotid-kassett ble syntetisert. Denne syntetiske kassett hadde følgende sekvens:
Denne oligonukleotid-kassett er i det følgende kalt 57. Kassett 57 ble "annealed" og ligert til 2,8 kb-fragmentet som inneholdt TGF-alfa, slik at et sirkularisert plasmid ble dannet. Kloner som inneholdt kassetten, ble identifisert ved hybridisering mot radiaktivt merket kassett 57-DNA. Nærvær av humant TGF-alfa ble bekreftet ved DNA-sekvensering. Sekvensering bekreftet også nærvær av et nyinnsatt Fsp I-sete i 3'-enden av TGF-alfa-sekvensen. Dette plasmid, kalt TGF-alfa-57/pUC-19, ble oppsluttet med HinD III og Fsp I, hvorved et 168 bp-fragment som inneholdt TGF-alfa-genet (TGF-alfa-57), ble dannet. pUC-19 ble oppsluttet med HinD III og Eco RI, hvorved et 2,68 kb pUC-19 vektor-DNA ble dannet. PE4Q-DNA ble isolert fra plasmid pVC 8 (Chaudhary et al., PNAS USA 84^4538-4542, 1987). pVC 8 ble oppsluttet med Nde I. En butt ende ble så dannet på dette DNA ved å benytte standard-betingelser for Klenow-reaksjonen (Maniatis et al., supra,
s. 113). Det butt-endede DNA ble så oppsluttet med Eco RI slik at et 1,3 kb Eco RI - Nde I (butt-endet) fragment som inneholdt PE4o, ble dannet. HinD III - Fsp I-fragmentet fra TGF-alfa-57 (168 bp) ble ligert til 2,68 kb-fragmentet fra pUC-19. Etter inkubering over natten ble EcoRI - Nde I-fragmentet fra PE4Q(1,3 kb, butt-endet) tilsatt ligerings-blandingen, og ligeringen ble fortsatt over natten. Liger-ingsproduktet ble så benyttet til transformasjon av JM 109-celler. Kloner som inneholdt TGF-alfa-57 PE4Qi pUC-19, ble identifisert ved hybridisering mot radioaktivt merket TGF-alfa-57 PE4Q-DNA, og DNA fra denne klon ble isolert. TGF-alfa-57 PE4Qble tatt ut av pUC-19-vektoren og overført til et TAC-vektor,system beskrevet av Linemeyer et al., Bio-Technology _5:960-965, 1987). TGF-alfa-57 PE4Qi pUC-19 ble oppsluttet med HinD III og Eco RI slik at et 1,5 kb fragment som inneholdt TGF-alfa-57<p>E4Q, ble dannet. En butt ende ble dannet på dette DNA-fragment ved å benytte standardbeting-elser for Klenow-reaksjonene (Maniatis et al., loe. eit.). TAC-vektoren ble oppsluttet med HinD III og Eco RI. En butt ende ble dannet på det oppsluttede TAC-vektor-DNA ved å benytte standard reaksjonsbetingelser for Klenow-reaksjonen (Maniatis et al., loe. eit.). Butt-endet 2,7 kb vektor ble isolert ved gelelektroforese. Det butt-endede TGF-alfa-57 PE4Q-fragment ble så ligert til den butt-endede TAC-vektor. Plasmidet som ble dannet ved denne ligering, ble benyttet til transformasjon av JM 109-celler. Kloner som inneholdt TGF-alfa-57 PE4Q, ble isolert ved hybridisering som beskrevet
ovenfor og sekvensert. Klonen som inneholdt den ønskede konstruksjon, ble kalt pTAC TGF57-PE40. Plasmidet som ble dannet ved disse manipulasjoner, er avbildet i figur 1. Nukleotidsekvensen til aminosyrekodonene for det TGF-alfa - PE4Q-fusjonsprotein som pTAC TGF-57-PE40-DNA koder for, er gjengitt i figur 2. Aminosyresekvensen kodet for av TGF-57-PE40-genet, er vist i figur 3.
Eksempel 2
Oppbygging av modifiserte utgaver av DNA-kloner som inneholder rekombinant TGF-alfa - PE40:
Erstatning av cystein med alanin
TGF-alfa - PE4QaB:
Klonen pTAC TGF57-PE40 ble oppsluttet med SphI og BåmHI og Sphl-BamHI-fragmentet på 748 bp, og som koder for
de C-terminale 4 aminosyrer av TGF-alfa, 4 linker-aminosyrer og de N-terminale 240 aminosyrer av PE4Q, ble isolert. M13 mpl9 vektor-DNA ble oppsluttet med SphI og BamHI, og vektor-DNA ble isolert. Sphl-BamHI TGF-alfa - PE4Q-fragmentet på 748 bp ble ligert inn i M13 vektor-DNA over natten ved 15°C.
Bakterielle vertsceller ble transformert med denne ligeringsblanding, kandidatkloner ble isolert, og deres plasmid-DNA ble sekvensert for å bekrefte at disse kloner inneholdt det rette, rekombinante DNA., Enkelttrådet DNA ble fremstilt for mutagenese.
Et oligonukleotid (oligo nr. 132) ble syntetisert og anvendt i setedirigert mutagenese for å introdusere et Hpal-sete i TGF-alfa - PE4Q-DNA ved aminosyreposisjon 272 i PE4Q:
Ett resultat av denne setedirigerte mutagenese var forandring av rest nr. 272 i PE4Qfra fenylalanin til leucin. Mutagenesen ble utført i henhold til Winter et al., Nature, 299:756-758, 1982.
En kandidatklon som inneholdt det nydannede Hpal-sete, ble isolert og sekvensert for å bekrefte nærvær av den muterte, genetiske sekvens. Denne klon ble så oppsluttet med SphI og Sali. Et 198 bp-fragment som koder for de C-terminale 5 aminosyrer i TGF-alfa og de N-terminale 61 aminosyrer av PE4Qog som inneholder det nylig introduserte Hpal-sete, ble isolert og subklonet tilbake i det opprinnelige pTAC TGF57-PE40-plasmid i Sphl-Sall-setene. Bakterielle vertsceller ble transformert, en kandidatklon ble isolert, og dens plasmid-DNA ble sekvensert for å forsikre at denne klon inneholdt detønskede, rekombinante DNA. Denne klon ble kalt pTAC TGF57-PE40-132. pTAC TGF57-PE40-132 ble oppsluttet med SphI og Hpal, og et 3,96 kb DNA-fragment ble isolert. En syntetisk oligonukleotid-kassett (oligo nr. 153) som spenner over de C-terminale 5 aminosyrer av TGF-alfa og de N-terminale 32 aminosyrer av PE4Qog inneholdende SphI- og Hpal-kompatible ender, ble syntetisert og ligert til det oppsluttede pTAC TGF57-PE40-132:
Denne oligonukleotid-kassett innførte en forandring
i TGF-alfa - PE4Q-DNA slik at det alaninkodende kodon ved rest 51 ble fjernet og det cysteinkodende kodon ved rest 264 i PE4Qnå kodet for alanin. Dette plasmid-DNA ble kalt pTAC TGF57-PE40-132,153. Bakterielle vertsceller ble transformert med pTAC TGF57-PE40-132,153-DNA. Kandidatkloner ble identifisert ved hybridisering, isolert, og deres plasmid-DNA ble sekvensert for å vise at det inneholdt det ønskede, rekombinante DNA.
pTAC TGF57-PE40-132,153-DNA ble oppsluttet med Hpal
og Sali, og et 3,95 kb stort vektor-DNA ble isolert. En syntetisk oligonukleotid-kassett (oligo nr. 142) som spenner over aminosyrerest 272 til 309 av PE4Qog som inneholder Hpal-og Sall-kompatible ender, ble syntetisert og ligert til det 3,95 kb store pTAC TGF/PE40 132,153-DNA.
Denne oligonukleotid-kassett forandret cystein-kodonet ved rest 287 slik at dette nå kodet for alanin.
Dette muterte plasmid-DNA ble kalt pTAC TGF57-PE40-132,153,142. Bakterielle vertsceller ble transformert med dette plasmid, og kandidatkloner ble identifisert ved hybridisering. Disse kloner ble isolert, og deres plasmid-DNA ble sekvensert for å vise at det inneholdt det ønskede, rekombinante DNA. Plasmidet pTAC TGF57-PE40-132,153,142 koder for TGF-alfa - PE4Q-varianter hvor begge de to N-terminale cysteiner i lokus "A" er erstattet med alaniner. Ifølge den nomenklatur som er beskrevet tidligere, kalles således denne endrede utgave av TGF-alfa - PE4QTGF-alfa - PE4QaB. Aminosyresekvensen som TGF-alfa-PE4QaB-genet koder for, er vist i figur 4.
TGF-alfa - PE4QAb:
Klonen pTAC TGF57-PE40 ble oppsluttet med SphI og BamHI, og det 748 bp store Sphl-BamHI-fragment som koder for de C-terminale 4 aminosyrer av TGF-alfa, 4 linker-aminosyrer og de N-terminale ,240 aminosyrer av PE4Q, ble isolert.
M13 mpl9 vektor-DNA ble oppsluttet med SphI og BamHI, og vektor-DNA ble isolert. Sphl-BamHI-fragmentet på 748 bp fra TGF-alfa - PE4Qble ligert inn i M13 vektor-DNA over natten ved 15°C. Bakterielle vertsceller ble transformert med denne ligeringsblanding, kandidatkloner ble isolert, og deres plasmid-DNA ble sekvensert for å vise at disse kloner inneholdt de ønskede, rekombinante DNA. Enkelttrådet DNA ble fremstilt for mutagenese.
Et oligonukleotid (oligo nr. 133) ble syntetisert og benyttet til setedirigert mutagenese for å innføre et Bstell-sete i TGF-alfa - PE4Q-DNA ved aminosyreposisjon 369 i PE4Q:
Ett resultat av denne mutagenese var at serinresten ved posisjon 369 i PE4Qble erstattet med threonin.
En DNA-klon som inneholdt det nyinnsatte Bstell-sete, ble identifisert, isolert og sekvensert for å vise at den inneholdt det ønskede, rekombinante DNA. Denne klon ble så oppsluttet med restriksjonsenzymene Apal og Sali. Et 120 bp DNA-fragment av innsatt DNA som inneholdt det nyinnsatte Bstell-sete, ble isolert og ligert inn i pTAC TGF57-PE40 som også var blitt oppsluttet med Apal og Sali. Bakterielle vertsceller ble transformert, og en kandidatklon ble isolert og sekvensert for å vise at det ønskede, rekombinante DNA var til stede. Dette nye plasmid-DNA ble kalt pTAC TGF57-PE40-133. Det ble oppsluttet med Bstell og Apal, og et 2,65 kb vektor-DNA-fragment ble isolert.
En Bstell til Apal oligonukleotid-kassett (oligo nr. 155) som omfattet den region av TGF-alfa - PE4Qsom var deletert fra pTAC TGF57-PE40-133-klonen oppsluttet med res-triks jonsenzymene Bstell og Apal, ble syntetisert. Kassetten inneholdt også Bstell- og Apal-kompatible ender.
Denne oligonukleotid-kassett endret cysteinkodonene ved rest 372 og 379 i PE4Qtil alaninkodoner. Oligonukleotid-kassett nr. 155 ble ligert til det 2,65 kb store vektor-DNA-fragment. Bakterielle vertceller ble transformert, og kandidatkloner ble isolert og sekvensert for å vise at det ønskede, rekombinante DNA var til stede. Denne nye DNA-klon ble kalt pTAC TGF57-PE40-133,155. Den koder for TGF-alfa - PE4Q-varianten hvor begge cysteiner ved lokus "B" er erstattet med alaniner. Ifølge den tidligere beskrevne nomenklatur kalles denne modifiserte utgave av TGF-alfa - PE4Qderfor TGF-alfa - PE4QAb. Aminosyresekvensen som TGF-alfa-PE4QAb-genet koder for, er vist i figur 5.
TGF-alfa - PE4Qab:
pTAC-TGF57-PE40-132,153,142-plasmidet som koder for
TGF-alfa - PE4QaB, ble oppsluttet med Sali og Apal, og det resulterende 3,8 kb store vektor-DNA-fragment ble isolert. pTAC TGF57-PE40-133,155-plasmidet som koder for TGF-alfa - PE4QAb, ble også oppsluttet med Sali og Apal,
og det resulterende 140 bp DNA-fragment som inneholdt cystein til alanin-forandringene ved aminosyrerest 372 og 379 i PE40'ble isolert. Disse to DNA-er ble ligert sammen og benyttet til å transformere bakterielle vertsceller. Kandidatkloner ble identifisert ved hybridisering med et radioaktivt merket 140 bp DNA fra pTAC TGF57-PE40-133,155. Plasmid-DNA fra kandidatklonene ble isolert og sekvensert for å vise nærvær av det ønskede, rekombinante DNA. Denne nye DNA-klon ble kalt pTAC TGF57-PE40-132,153,142,133,155. Dette plasmid
koder for en TGF-alfa - PE4Q-variant hvor alle fire cysteiner 1 loki "A" og "B" er erstattet med alaniner. Ifølge den tidligere beskrevne nomenklatur kalles derfor denne modifiserte utgave av TGF-alfa - PE4QTGF-alfa - PE4Qab. Aminosyresekvensen som TGF-alfa-PE4Qab-genet koder for, er vist i figur 6.
Eksempel 3
Fremstilling og isolering av rekombinante TGF-alfa-PE4 Q- fusjonsproteiner:
Produksjon av fusjonsprotein
Transformerte E. coli JM-109-celler ble dyrket i 1-liters rysteflasker i 500 ml LB-medium med 100 mg/ml ampicillin ved 37°C. Etter at absorpsjonen ved 600 nanometer hadde nådd 0,6, ble isopropyl B-D-thio-galactopyranosid tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 mM. Etter 2 timer ble cellene høstet ved sentrifugering.
S- sulfonering av fusjonsprotein
Cellene ble lysert i 8M guanidinhydroklorid, 50 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA ved røring ved romtemperatur i 2 timer. Den lyserte blanding ble justert til 0,4 M natriumsulfitt og 0,1 M natriumtetrathionat ved tilsetning av faste reagenser, og pH ble justert til 9,0 med 1 M NaOH. Reaksjonen fikk fortsette ved romtemperatur i 16 timer.
Forberedelse til kromatografi
Proteinløsningen ble dialysert mot et 10.000 ganger større volum av 1 mM EDTA ved 4°C. Blandingen ble så justert til 6 M urea, 50 mM Tris, pH 8,0, 50 mM NaCl ved romtemperatur og rørt i 2 timer. Uløst materiale ble fjernet ved sentrifugering ved 32.000 x g i 30 minutter.
" PEAE F. F. Sepharose- kromatografi
Den klarnede supernatant fra foregående trinn ble applisert på en 26 x 40 cm "DEAE Fast Flow"-søyle (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) ekvilibrert med 6 M urea, 50 mM Tris, pH 8,0, 50 mM NaCl, ved en strømningshastighet på 1 ml/minutt. Søylen ble vasket med ekvilibreringsbuffer inntil alt ikke-absorbert materiale var fjernet, som vist ved en absorbans på mindre enn 0,1 ved 280 nanometer i ekvilibreringsbufferen som forlot søylen. Det adsorberte fusjonsprotein ble eluert fra søylen med en 1000 ml 50-350 mM NaCl-gradient og så kon-sentrert i en Amicon-konsentreringscelle med røring, utstyrt med en YM-30-membran.
" Sephacryl S- 300"
Det konsentrerte fusjonsprotein (8 ml) ble applisert på en 2,6 x 100 cm "Sephacryl S-300"-søyle (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) ekvilibrert med 6 M urea, 50 mM Tris,
pH 8,0, 50 mM NaCl, ved en strømningshastighet på 0,25 ml/min. Søylen ble eluert med ytterligere ekvilibreringsbuffer, og fraksjoner på 3 ml ble samlet opp. Fraksjoner som inneholdt TGF-alfa - PE4Q-aktivitet, ble slått sammen.
" Q- Sepharose"- kromatografi
De sammenslåtte fraksjoner fra S-300-søylen ble applisert på en 1,6 x 40 cm "Q-Sepharose"-søyle (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.) ekvilibrert med 6 M urea, 50 mM Tris, pH 8,0, 50 mM NaCl, ved en strømningshastighet på
0,7 ml/minutt. Søylen ble vasket med ekvilibreringsbuffer og så eluert med en 600 ml 50-450 mM NaCl-gradient. Fraksjonene som inneholdt TGF-alfa - PE4Q-aktivit€t, ble slått sammen og så dialysert mot 50 mM glycin, pH 9,0, og lagret ved -20°C.
Renaturering
Et uttak av proteinet ble tint og fortynnet til en absorbans ved 280 nanometer på 0,1 i 50 mM glycin, pH 10,5. Beta-mercaptoethanol ble tilsatt i et molart ratio på 4:1 over det teoretiske antall S-sulfonatgrupper til stede i protein-prøven. Reaksjonen fikk fortsette i 16 timer ved 4°C, hvor-etter løsningen ble dialysert mot et 10.000 gangers overskudd av fysiologisk bufret saltvann og lagret ved -20°C.
Eksempel 4
Fremstilling og isolering av rekombinante TGF-alfa - PE4Q-fusjonsproteiner
E. coli stamme JM-109 som inneholdt det ønskede TGF-alfa -PE4Q-plasmid, ble dyrket ved 37°C i komplekst medium (Bauer et al., Biotechnology and Bioengineering 16, 933-41 (1974)) med 100 mg/ml antibiotika. TGF-PE4Q-eks-presjon ble indusert ved tilsetning av 1 mM isopropylthio-galactosid etter at kulturen hadde oppnådd en absorbans ved 600 nm på 2,5. Kulturen ble høstet ved "cross-flow"-filtrer-ing etter en 9 timers induksjonsperiode, og frosset ved -70°C.
Cellemassen ble tint på is i 4 volumer 50 mM natriumfosfat, pH 7,8, og suspensjonen ble passert gjennom 4 lag osteklede og deretter to ganger gjennom en Matin-Gaulin-presse ved 632 kg/cm 2. Den filtrerte suspensjon ble sentrifugert i en "Sorvall GS-3"-rotor ved 9000 rpm (13.000 x g) i 30 minutter for å fjerne cellerester. Mettet ammoniumsulfat-løsning ble tilsatt til supernatanten dråpevis med røring til 20% metning (250 ml/l) ved romtemperatur. Suspensjonen ble rørt ved 4°C i 0,5 - 1 time og så sentrifugert i GS-3-rotoren ved 9000 rpm (13.000 x g) i 20 minutter.
Mettet ammoniumsulfat ble tilsatt supernatanten under røring til en konsentrasjon på 35% (230 ml/l supernatant). Den ammoniumsulfatholdige løsning ble rørt ved 4°C i 0,5 - 1 time og så sentrifugert som over. Bunnfallet ble resuspendert i 50 mM natriumfosfat, 50% NH4S04, pH 7,5, i 1/4 av ut-gangsvolumet, rørt som over og sentrifugert i "Sorvall SA-600" ved 5.000 rpm (3.600 x g) i 15 minutter i polypropylenrør. Supernatantene ble fjernet, og bunnfallene ble resuspendert
i en konsentrasjon på 10 mg protein/ml i 50 mM Tris, 6 M
guanidin-HCl, pH 9,0, ved romtemperatur.
Na2S03 ble tilsatt til en konsentrasjon på 0,4 M, og Na2S4°6 ble tilsatt til en konsentrasjon på 0,1 M. pH ble kontrollert og om nødvendig justert til 9,0 med HC1 eller NaOH. Etter røring over natten ved romtemperatur ble det sulfitolyserte protein dialysert grundig mot 50 mM Gly-Cl,
pH 9,0, ved 4°C.
Proteinet ble så fortynnet til 0,1 mg/ml i 50 mM Gly-Cl, pH 10,5, og et 40-gangers molart overskudd av |3-mercaptoethanol (87 mM |3-Me ved 0,1 mg/ml) ble tilsatt. Blandingen ble rørt ved 4°C i omtrent 15 timer, og det renaturerte protein ble dialysert i omtrent 15 timer ved 4°C mot 20 mM Tris-Cl, 50 mM NaCl, pH 8,0. Proteinet ble så applisert på en "Q-Sepharose"-søyle pre-ekvilibrert med 20 mM Tris-Cl, 50 mM NaCl, pH 8,0, ved 4°C, med tilnærmet 0,3 ml harpiks/mg protein, og eluert med en lineær saltgradient fra 50 mM til 500 mM NaCl i 20 mM Tris-Cl, pH 8,0 (gradient-størrelse = 6-10 søylevolumer).
Søylefraksjonene ble analysert ved måling av absorbans ved 280 nanometer, gelelektroforese og Western-blotting, og slått sammen. En metallchelaterende søyle ble fremstilt ved å behandle chelaterende "Sepharose 4B" med koppersulfat, og med 0,3 til 1 ml harpiks/mg protein. Søylen ble ekvilibrert med 50 mM Tris-acetat, 1 M NaCl, pH 7,0. For å hindre eluer-+2
ing av Cu ble en ny, metallfri søyle med chelaterende
2+
"Sepharose 4B" tilkoblet nedstrøms for den Cu -ladede søyle.
"Q-Sepharose"-preparatet ble fortynnet 1:2 i 50 mM Tris-acetat, 1 M NaCl, pH 7,0, og applisert på den metallchelaterende søyle ved romtemperatur. Søylen ble vasket med ett søylevolum ekvilibreringsbuffer, og proteinet ble eluert med en lineær gradient fra 0 til 70 mM imidazol ved pH 7,0 i ekvilibreringsbufferen (gradientstørrelse 10 til 40 søylevolumer).
Søylefraksjonene ble analysert ved måling av absorbans ved 280 nanometer, gelelektroforese og Western-blotting, og slått sammen.
Eksempel5
8 humane blærecarcinoma-cellelinjer ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC) som frosne ampuller.
De ble umiddelbart dyrket og passert som monolag-kulturer
i henhold til instruksjonene gitt av ATCC. Etter karakter-isering av veksthastigheten for hver cellelinje ble celler sådd ut i 96-brønners plater i en mengde som ville gi sub-konfluente lag i kontrollbrønnene ved slutten av forsøket. Neste dag ble disse sub-konfluente kulturer som ble dyrket enten i serumfritt MEM-a, RPMI 1640 eller McCoy's 5A-medium, benyttet i et standardsystem for måling av celledreping (Mosmann, J. Immunol. Methods 6_5: 55-63, 1983; Edwards et al., Mol. Cell. Biol. 9: 2860-2867, 1989). Hver cellelinje ble sådd ut i 96-brønners plater med 10.000 levedyktige celler pr. brønn. 24 timer senere ble cellene vasket én gang og plassert i serumfritt medium med forbindelsen som skulle testes.. 48 timer senere ble antall overlevende celler kvantitert ved bruk av et MTT [3-(3,4-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazaliumbromid]-prøvesystem som beskrevet av Mosmann, supra. Aktiviteten av toksinet mot hver cellelinje ble anslått. Resultatene er vist i følgende tabell og sammen-lignet med aktivitet mot A431 (vulva-carcinoma)-celler.
Aktivitet av TGF-alfa-PE40 ab (eks. 5) mot humane blærecarcinoma- cellelinjer
<*>konsentrasjon (picomol/liter) som reduserer
antall overlevende celler etter 48 timer til 50% av antall kontrollceller.
Eksempel&
Sammenligning av flere cancercellelinjer mot TGF-alfa - PE4QAB, TGF-alfa - PE4Qab fra eksempel 4 og TGF- alfa - PE4 Q ab fra eksempel 5
Claims (1)
- Fremgangsmåte for fremstilling av et TGF-a-PE40-hybridprotein med økt celledrepende aktivitet,karakterisert vedtrinnene a) innhøsting av en tilstrekkelig mengde celler som uttrykker et hybridprotein utvalgt fra TGF-a-PE40Ab, TGF-a-PE40aB og TGF-aPE40ab, hvori "a" og "b" representerer substitu-sjon av cysteinrestene i hhv. locus A og B med alanin- eller glysinrester; b) utfelling av det uttrykte protein med ammonium-sulf at ; c) oppløsning av det utfelte protein; og d) rensing av det oppløselige protein ved affinitets-kromatografi ved anvendelse av en metallchelaterende kromatografikolonne, idet hybridproteinet ikke utsettes for urea under fremstillingen.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US54228190A | 1990-06-21 | 1990-06-21 | |
| US66926991A | 1991-03-14 | 1991-03-14 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO912418D0 NO912418D0 (no) | 1991-06-20 |
| NO912418L NO912418L (no) | 1991-12-23 |
| NO303579B1 true NO303579B1 (no) | 1998-08-03 |
Family
ID=27066985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO912418A NO303579B1 (no) | 1990-06-21 | 1991-06-20 | FremgangsmÕte for fremstilling av et TGF-<alfa>-PE40-hybridprotein |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5690928A (no) |
| EP (2) | EP0467536B1 (no) |
| JP (1) | JPH0721000B2 (no) |
| KR (1) | KR920000332A (no) |
| AT (1) | ATE173274T1 (no) |
| AU (1) | AU645094B2 (no) |
| CA (1) | CA2044858A1 (no) |
| DE (1) | DE69130466T2 (no) |
| DK (1) | DK0467536T3 (no) |
| ES (1) | ES2122968T3 (no) |
| FI (1) | FI913058A (no) |
| IE (1) | IE912130A1 (no) |
| IL (1) | IL98528A0 (no) |
| NO (1) | NO303579B1 (no) |
| PT (1) | PT98048B (no) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6207798B1 (en) * | 1989-08-03 | 2001-03-27 | Merck & Co., Inc. | Modified PE40 toxin fusion proteins |
| AU665360B2 (en) * | 1991-07-05 | 1996-01-04 | Seragen, Inc. | Epidermal growth factor receptor targeted molecules for treatment of inflammatory arthritis |
| EP0665746A4 (en) * | 1992-10-07 | 1996-03-13 | Merck & Co Inc | FORMULATION WITH CONTROLLED pH FOR THE INSTILLATION OF TGF ALPHA PE 40 INTO THE BLADDER. |
| AU4679300A (en) * | 1999-04-26 | 2000-11-10 | Stem Cell Pharmaceuticals, Inc. | Tgf-alpha polypeptides, functional fragments and methods of use therefor |
| CA2380635A1 (en) * | 1999-08-19 | 2001-02-22 | Stem Cell Pharmaceuticals, Inc. | Tgf-.alpha. polypeptides, functional fragments and methods of use therefor |
| US20020193301A1 (en) * | 1999-08-19 | 2002-12-19 | Stem Cell Pharmaceuticals, Inc. | TGF-alpha polypeptides, functional fragments and methods of use therefor |
| CU23077A1 (es) * | 2000-12-06 | 2005-08-17 | Centro Inmunologia Molecular | Composicion vacunal que contiene factor de crecimiento transformante (tgf-alfa). su uso en la terapia de enfermedades malignas |
| PT2382990E (pt) | 2003-04-30 | 2014-12-29 | Univ Zuerich | Método para tratamento do cancro usando uma imunotoxina |
| CN100436481C (zh) * | 2003-08-18 | 2008-11-26 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 含腺病毒E4orf4蛋白的靶向性抗肿瘤融合蛋白 |
| GB0321344D0 (en) | 2003-09-11 | 2003-10-15 | Health Prot Agency | Re-targeted toxin conjugates |
| US8735394B2 (en) | 2005-02-18 | 2014-05-27 | Abraxis Bioscience, Llc | Combinations and modes of administration of therapeutic agents and combination therapy |
| US20070166388A1 (en) | 2005-02-18 | 2007-07-19 | Desai Neil P | Combinations and modes of administration of therapeutic agents and combination therapy |
| KR20140016402A (ko) * | 2005-02-18 | 2014-02-07 | 아브락시스 바이오사이언스, 엘엘씨 | 치료제의 조합 및 투여 방식, 및 조합 요법 |
| DK2117520T3 (en) | 2006-12-14 | 2019-01-07 | Abraxis Bioscience Llc | BREAST CANCER THERAPY BASED ON HORMON RECEPTOR STATUS WITH NANOPARTICLES INCLUDING TAXAN |
| CA2793974A1 (en) | 2010-03-29 | 2011-10-06 | Abraxis Bioscience, Llc | Methods of treating cancer |
| KR20130028727A (ko) | 2010-03-29 | 2013-03-19 | 아브락시스 바이오사이언스, 엘엘씨 | 치료제의 약물 전달 및 유효성 향상 방법 |
| KR20180049180A (ko) | 2010-06-04 | 2018-05-10 | 아브락시스 바이오사이언스, 엘엘씨 | 췌장암의 치료 방법 |
| MX2016004239A (es) | 2013-10-02 | 2016-11-14 | Viventia Bio Inc | Anticuerpos anti-epcam y métodos de uso. |
| ITUD20130127A1 (it) * | 2013-10-04 | 2015-04-05 | Danieli Off Mecc | Impianto siderurgico per la produzione di prodotti metallici lunghi e relativo metodo di produzione |
| EP3268041A4 (en) | 2015-03-12 | 2018-09-05 | Viventia Bio Inc. | Dosing strategies for targeting epcam positive bladder cancer |
| JP6824183B2 (ja) | 2015-03-12 | 2021-02-03 | セセン バイオ，インコーポレイテッド | Ｅｐｃａｍ陽性膀胱癌の処置方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES522315A0 (es) * | 1982-05-12 | 1984-08-16 | Harvard College | Un procedimiento para obtener una proteina hibrida. |
| IE56026B1 (en) * | 1982-10-19 | 1991-03-27 | Cetus Corp | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
| US4518584A (en) * | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
| US4664911A (en) * | 1983-06-21 | 1987-05-12 | Board Of Regents, University Of Texas System | Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties |
| US4545985A (en) * | 1984-01-26 | 1985-10-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins |
| EP0154434B1 (en) * | 1984-02-17 | 1993-01-27 | Genentech, Inc. | Human transforming growth factor and precursor or fragment thereof, cells, dna, vectors and methods for their production, compositions and products containing them, and related antibodies and diagnostic methods |
| US4785079A (en) * | 1984-11-09 | 1988-11-15 | The Salk Institute For Biological Studies | Isolation of fibroblast growth factor |
| IN165717B (no) * | 1986-08-07 | 1989-12-23 | Battelle Memorial Institute | |
| US4892827A (en) * | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
| EP0383599B1 (en) * | 1989-02-17 | 1996-02-07 | Merck & Co. Inc. | Protein anti-cancer agent |
| NZ232900A (en) * | 1989-03-22 | 1993-08-26 | Merck & Co Inc | Pseudomonas exotoxin a, pe 40 domain derivatives |
-
1991
- 1991-06-17 IL IL98528A patent/IL98528A0/xx unknown
- 1991-06-18 CA CA002044858A patent/CA2044858A1/en not_active Abandoned
- 1991-06-20 FI FI913058A patent/FI913058A/fi not_active Application Discontinuation
- 1991-06-20 ES ES91305582T patent/ES2122968T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-20 DK DK91305582T patent/DK0467536T3/da active
- 1991-06-20 EP EP91305582A patent/EP0467536B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-20 EP EP98106872A patent/EP0868920A3/en not_active Withdrawn
- 1991-06-20 NO NO912418A patent/NO303579B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-06-20 PT PT98048A patent/PT98048B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-06-20 AU AU79189/91A patent/AU645094B2/en not_active Ceased
- 1991-06-20 AT AT91305582T patent/ATE173274T1/de active
- 1991-06-20 IE IE213091A patent/IE912130A1/en unknown
- 1991-06-20 DE DE69130466T patent/DE69130466T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-06-21 KR KR1019910010286A patent/KR920000332A/ko not_active Application Discontinuation
- 1991-06-21 JP JP3266746A patent/JPH0721000B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-04-11 US US08/224,422 patent/US5690928A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0467536T3 (da) | 1999-07-26 |
| US5690928A (en) | 1997-11-25 |
| ES2122968T3 (es) | 1999-01-01 |
| PT98048B (pt) | 1998-11-30 |
| KR920000332A (ko) | 1992-01-29 |
| EP0467536A3 (en) | 1992-09-16 |
| IE912130A1 (en) | 1992-01-01 |
| EP0467536A2 (en) | 1992-01-22 |
| NO912418L (no) | 1991-12-23 |
| CA2044858A1 (en) | 1991-12-22 |
| AU7918991A (en) | 1992-01-02 |
| DE69130466T2 (de) | 1999-06-02 |
| ATE173274T1 (de) | 1998-11-15 |
| DE69130466D1 (de) | 1998-12-17 |
| FI913058A0 (fi) | 1991-06-20 |
| PT98048A (pt) | 1992-04-30 |
| EP0467536B1 (en) | 1998-11-11 |
| JPH0721000B2 (ja) | 1995-03-08 |
| EP0868920A2 (en) | 1998-10-07 |
| EP0868920A3 (en) | 1999-02-10 |
| FI913058A (fi) | 1991-12-22 |
| NO912418D0 (no) | 1991-06-20 |
| IL98528A0 (en) | 1992-07-15 |
| JPH0592999A (ja) | 1993-04-16 |
| AU645094B2 (en) | 1994-01-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO303579B1 (no) | FremgangsmÕte for fremstilling av et TGF-<alfa>-PE40-hybridprotein | |
| JP3553933B2 (ja) | 高められた活性を有する組換シュードモナス外毒素 | |
| US5696237A (en) | Recombinant antibody-toxin fusion protein | |
| US5863745A (en) | Recombinant antibody-toxin fusion protein | |
| AU656352B2 (en) | Recombinant immunotoxin composed of a single chain antibody reacting with the human transferrin receptor and diphtheria toxin | |
| NO176575B (no) | Sammensmeltet gen, kloningsvektor, samt anvendelse av kloningsvektoren | |
| CN109517073A (zh) | 一种靶向治疗肿瘤的融合肽及其应用 | |
| Edwards et al. | Epidermal growth factor receptor binding is affected by structural determinants in the toxin domain of transforming growth factor-alpha-Pseudomonas exotoxin fusion proteins | |
| WO1990012592A1 (en) | Recombinant antibody-toxin fusion protein | |
| JP3512795B2 (ja) | 組換免疫毒素 | |
| NO300595B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som omfatter et PE40-domene, samt plasmid for anvendelse ved ekspresjon av hybridproteinet | |
| CA2071946A1 (en) | Toxin for construction of immunotoxins | |
| US5621078A (en) | Modified pseudomonas exotoxin PE40 | |
| FitzGerald et al. | Generation of chimeric toxins | |
| CA2012732C (en) | Production of modified pe40 | |
| NZ238583A (en) | Targetted cytotoxic anticancer conjugates and | |
| US6207798B1 (en) | Modified PE40 toxin fusion proteins | |
| Riemen et al. | Modified pseudomonas exotoxin PE 40 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |
Free format text: LAPSED IN DECEMBER 2003 |