CN100436481C - 含腺病毒E4orf4蛋白的靶向性抗肿瘤融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明包括重组人表皮生长因子-腺病毒E4orf4融合蛋白、编码这种融合蛋白的融合基因、含有该融合基因的表达载体、利用甲基营养型酵母进行分泌性表达这种重组融合蛋白的方法及含有该蛋白的药物组合物及其治疗用途。

Description

含腺病毒E4orf4蛋白的靶向性抗肿瘤融合蛋白

技术领域

本发明涉及重组人表皮生长因子-腺病毒早期转录区4第四开放读码框蛋白产物(E4orf4)融合蛋白、编码这种融合蛋白的融合基因、含有该融合基因的表达载体、利用甲基营养型酵母进行分泌性表达这种重组融合蛋白的方法及含有该蛋白的医药组合物及其治疗用途。

背景技术

人腺病毒基因早期转录区4(E4)转录单元中至少包含7个开放读码框，其各自的产物无明显的相似性。其中第四开放读码框(E4open reading frame 4，E4orf4)编码的产物是一个由114个氨基酸组成的14kDa小分子蛋白，其氨基酸序列与任何已知蛋白没有同源性。E4orf4蛋白具有一个高度保守的序列，为RXKRRXRRRR，它在氨基端还有一个富含脯氨酸的序列，有可能提供潜在的Src同源区3(SH3)结合位点。包括氨基端和羧基端区域在内，多肽链的任何小部分氨基酸缺失都会产生无功能和通常是不稳定的突变体。在腺病毒感染早期，E4orf4基因就由E4启动子转录产生mRNA。尽管在晚期E4启动子停止转录，但细胞中的E4orf4蛋白始终保持一个稳定的水平。这说明E4orf4蛋白在细胞内是高度稳定的(Branton PEand Roopchand DE.Oncogene，2001；(20)：7855-7865；Marcellus RC，Chan H，Paquette D et al.J Virol，2000；74(17)：7869-7877)。

许多种病毒在它们的生活周期中都可诱导凋亡而杀死被感染的细胞。人腺病毒感染可形成一个诱导和抑制凋亡的复杂过程。腺病毒早期区1A(E1A)产物通过增强p53基因的活性及稳定性，导致p53依赖的细胞凋亡。早期区1B(E1B)编码55kDa、19kDa两个蛋白，与E4orf6蛋白一起通过阻断E1A的毒性作用抑制凋亡而产生大量病毒。进一步实验发现，用p53缺失细胞感染腺病毒，表达完整E1A，仍可诱导细胞凋亡，提示这一过程是由在E1A反式激活区控制下表达的其它病毒产物所致。经过一系列实验最终将细胞毒功能定位于E4orf4蛋白，在其它腺病毒蛋白不存在的情况下，E4orf4蛋白有高细胞毒性，诱导不依赖p53的细胞凋亡，表达E4orf4的pcDNA质粒可诱导肿瘤细胞的死亡率达80-90％，是仅有的可独自杀死细胞的E4产物。腺病毒E4orf4蛋白是一种多功能的病毒调节蛋白，在体外实验中，它能够特异地引起转化细胞的凋亡，而对正常细胞没有影响；E4orf4蛋白所诱导的细胞凋亡是p53非依赖性的，其诱导凋亡作用的发挥，需要与蛋白磷酸酶2A的相互作用；E4orf4蛋白通过调节Src激酶的活性，引发细胞凋亡的细胞质表现(Maecellus RC，Tendom JG，Wu T et al.J.Virol.1996，70：6207-6215；Marcellus RC，Lavoie JN，Boivin D et al.J.Virol.1998，72：7144-7153；Shtricheman R，Sharf R，Barr H et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1999，96：10080-10085)。

大量研究报道证实，在大多数肿瘤细胞如乳腺、肺、脑、膀胱、肾、前列腺等都有EGF受体的过量表达，而且它们的细胞株在体外的生长或移植后常受EGF抑制。有结果显示，采用化学连接RNase 1与重组EGF，形成复合物EGF-RNase 1，对高表达EGF受体的乳腺癌和鳞状细胞癌有剂量依赖型的细胞毒作用，即表达EGF受体越高的细胞系则细胞毒作用越明显。最近Dmitriev等利用杆状病毒表达体系表达了CAR-EGF融合蛋白(CAR，柯萨基病毒和腺病毒受体)，有效地通过EGF与EGF受体结合的靶向性作用，将腺病毒载体转运至肿瘤细胞内，增加了报告基因的释放(杨予安，黄秉仁，蔡良婉，等.中华医学科学院学报.1996，18(3)：171；Ueda M，PsarrasK，Jinno H et al.Breast Cancer 1997，4(4)：253-255；Dmitriev I，Kashentseva E，Rogers BE et al.J.Virol.2000，74(15)：6875-6884)。

由于人类肿瘤中高比例的p53基因突变以及这些肿瘤的常规治疗预后往往不佳，因此发现一种治疗p53突变肿瘤的新方法是非常有意义的尝试。腺病毒是一种很有应用前途的基因治疗载体，但鉴于腺病毒的基因治疗在提供了诸多益处的同时，有关技术尚未完全成熟，在治疗的安全性方面具有一定的风险性。因此，进一步探求利用腺病毒而进行治疗的方法和药物仍是肿瘤治疗领域的研究热点。

发明内容

本发明涉及一种重组人表皮生长因子-腺病毒E4orf4融合蛋白，含有该融合蛋白的药物组合物及其用于靶向性肿瘤治疗的用途。在一个实施方案中，编码本发明的融合蛋白的融合基因具有SEQ ID NO：1的序列，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的另一方面涉及编码所述融合蛋白的融合基因，含有该融合基因的表达载体及工程菌株。根据本发明的一种遗传工程菌株，命名为巴氏毕赤酵母GS115-3EGF-E4orf4，已于2002年7月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心〔CGMCC〕，其保藏号为0771。

附图说明

图1：重叠PCR构建α-因子前导肽-EGF-E4orf4基因片段；

图2：重组质粒pUC-EGF-E4orf4的酶切鉴定电泳图谱；

图3：重组质粒pUC-EGF-E4orf4定点突变示意图；

图4：质粒pAO815物理图谱，pAO815由7709个核苷酸组成，其中碱基1-940为5’AOX1启动子片段，碱基943-948为EcoRI位点，碱基950-1277为3’AOX1转录终止子(TT)，碱基4199-1665为HISORF，碱基4554-5310为3’AOX1片段，碱基6394-5740为ColE1起始，碱基7399-6539为氨苄青霉素抗性基因；

图5：重组质粒pAO-EGF-E4orf4的构建图；

图6：重组质粒pAO-EGF-E4orf4的酶切鉴定电泳图；

图7：重组质粒pAO-3EGF-E4orf4的构建图；

图8：重组质粒pAO-3EGF-E4orf4的酶切鉴定电泳图；

图9：Mut⁺和Mut^s转化子对比；

图10：GS115-3EGF-E4orf4分泌EGF-E4orf4的SDS-PAGE电泳图；

图11：GS115-3EGF-E4orf4分泌EGF-E4orf4的Western Blot分析。

图12：重组EGF-E4orf4融合蛋白经阳离子交换层析纯化后的结果；

图13：MTT比色法检测BT325细胞活力；

图14：MTT比色法检测MDA-MB-231细胞活力；

图15：MDA-MB-231细胞培养72小时，流式细胞仪分析细胞凋亡的情况；

图16：MDA-MB-231细胞与融合蛋白EGF-E4orf4(10μg/3×10⁵细胞)共同培养72小时，流式细胞仪分析细胞凋亡的情况；

图17：MDA-MB-231细胞与融合蛋白EGF-E4orf4(15μg/3×10⁵细胞)共同培养72小时，流式细胞仪分析细胞凋亡的情况；

图18：MDA-MB-231细胞与融合蛋白EGF-E4orf4(20μg/3×10⁵细胞)共同培养72小时，流式细胞仪分析细胞凋亡的情况；

图19：MDA-MB-231细胞与融合蛋白EGF-E4orf4(25μg/3×10⁵细胞)共同培养72小时，流式细胞仪分析细胞凋亡的情况。

具体实施方案

根据本发明的一个方面，提供了一种重组人表皮生长因子(EGF)-腺病毒E4orf4融合蛋白，其从N端至C端依次为人表皮生长因子，接头，和腺病毒E4orf4蛋白。在一个优选的实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

根据本发明的另一方面，本发明提供了编码本发明的融合蛋白的融合基因。

本发明融合基因中优选采用的是经人工合成的编码51个氨基酸的EGF基因片段，该基因片段详见中国专利申请号97115284.5所述。本发明融合基因中的腺病毒的E4orf4蛋白基因序列优选是经过修饰的编码腺病毒A5的E4orf4蛋白基因序列，所述修饰的序列是经定点突变将第228位碱基由T突变为G，从而消除了限制性内切酶BglII的酶切位点，但不改变氨基酸序列，以便于酵母多拷贝串联表达载体的构建。在EGF与E4orf4两个基因片段之间的接头优选是编码由甘氨酸和丝氨酸组成的11个氨基酸的基因序列，使其能形成一个臂，以保证EGF和E4orf4蛋白能互不干扰，各自形成独立的高级结构，行使正常的生物活性。在一个优选的实施方案中，本发明的编码EGF-E4orf4融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

根据本发明的再一方面，提供了包含本发明的融合基因的表达载体和含有该表达载体的工程菌。优选地，本发明的表达载体是可分泌性表达的整合型单拷贝或三拷贝EGF-E4orf4融合蛋白的表达载体，其是通过采用重叠PCR将编码酵母α-因子前导肽的DNA片段与EGF-E4orf4融合蛋白的基因序列融合，并在α-因子前导肽前加入Kozak序列，再克隆到醇氧化酶启动子(AOX1)下游构建而成。本发明的单拷贝和三拷贝表达载体例如为pAO-EGF-E4orf4和pAO-3EGF-E4orf4，如图5和图7所示。优选地，本发明的工程菌是包含本发明的表达载体的甲基营养型酵母(又称巴氏毕赤酵母)，特别是巴氏毕赤酵母GS115-3EGF-E4orf4，其已于2002年7月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心〔CGMCC〕，其保藏号为0771。该菌株是以3拷贝载体转化巴氏毕赤酵母株GS115后筛选出的整合型Mut⁺基因型菌株(GS115-3EGF-E4orf4)，经高密度培养及诱导表达后，该株可分泌EGF-E4orf4融合蛋白。分泌表达的EGF-E4orf4融合蛋白分子量与预测的相符。分别使用兔抗人EGF多克隆抗体及兔抗腺病毒E4orf4蛋白的抗血清进行Western Blot分析，证实特异表达蛋白条带与两个抗体均呈阳性反应，为由EGF和E4orf4两部分组成的融合蛋白。利用柱层析分离纯化表达蛋白，使提纯纯度达90％或更高。

另外，本发明在EGF-E4orf4融合蛋白第176个氨基酸的编码序列末端连接有两个终止子TAA和TGA，这种设计有利于基因表达产物的分离纯化和基因转录的终止。而Kozak序列的加入为高效表达EGF-E4orf4融合蛋白提供了条件。

本发明的融合蛋白具有肿瘤靶向性，能特异性杀死肿瘤细胞尤其是p53基因缺陷的肿瘤，靶向性是利用大多数肿瘤细胞表面都有EGF受体的高表达，融合蛋白中含有EGF，通过EGF与EGF受体的结合，可将E4orf4蛋白带入肿瘤细胞内，E4orf4是腺病毒中可独自产生高细胞毒性的蛋白，其可诱导肿瘤细胞发生不依赖p53的凋亡，从而实现肿瘤的定向治疗。本发明融合蛋白的活性如实施例部分所验证。

本发明的另一方面涉及含有药物有效量的EGF-E4orf4融合蛋白作为有效成分的药物组合物。这种组合物含有制药上可接受的载体、辅助剂、稀释或填充剂。所述的药物组合物可以注射给药，或是经介入治疗肿瘤局部给药，总之以适合临床需要用于肿瘤的治疗。

以下将参照如下实施例进一步描述本发明。

实施例1：重叠PCR构建α-因子前导肽-EGF-E4orf4基因片段

本例中采用如下PCR引物：

引物1(31-mer)：

5’-GGAATTC ACC ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT-3’

EcoRI    Kozak

引物2(45-mer)：

5’-ACC ACC ACC GGA ACC ACC ACC ACC TTC CCA CCACTT CAA GTC TCT-3’

引物3(45-mer)：

5’-GGT TCC GGT GGT GGT GGT TCC TCC ATG GTT CTTCCA GCT CTT CCC-3’

引物4(31-mer)：

5’-GGAATTC TCA TTA CTG TAC GGA GTG CGC CGA-3’

EcoRI     终止密码

其中引物1含有EcoRI酶切位点和Kozak序列，并与α-因子前导肽的5’端互补；引物2与EGF的3’端互补，并加入了部分编码由甘氨酸和丝氨酸组成的氨基酸臂的序列；引物3与E4orf4的5’端互补，并加入了部分编码由甘氨酸和丝氨酸组成的氨基酸臂的序列，这段序列与引物3互补；引物4与E4orf4的3’端互补，并加入了两个终止子及EcoRI酶切位点。

以质粒pYA41EGF为模板(黄秉仁，张岱，迟来顺，等.中国医学科学院学报1989，11(5)：331-337)，用引物1和引物2进行扩增，得到DNA片段含有EcoRI识别位点、Kozak序列、α-因子前导肽、EGF和8个由甘氨酸和丝氨酸组成的氨基酸臂。以质粒pUC-E4orf4为模板，用引物3和引物4扩增得到的DNA片段含有8个由甘氨酸和丝氨酸组成的氨基酸臂、E4orf4和E coRI识别位点。进一步以两个DNA片段为模板，先进行退火，使两端氨基酸臂的5个氨基酸的碱基互补，再用引物1和引物4进行扩增，即得到两端为EcoRI识别位点、含有完整的α-因子前导肽-EGF-E4orf4基因片段。该基因片段经EcoRI酶切后连入pUC18质粒载体，所得重组克隆为pUC-EGF-E4orf4，见图1。测序结果证实其与设计完全相符。

实施例2：重组质粒pUC-EGF-E4orf4的酶切鉴定

鉴定方法：2μg重组质粒pUC-EGF-E4orf4加入EcoRI酶于37℃消化2h后，1.0％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色可见pUC18载体片段及编码α-因子前导肽-EGF-E4orf4共261个氨基酸、2个终止子、Kozak序列及EcoRI位点的约800bp的DNA克隆片段。

该质粒的酶切鉴定见图2，图中：泳道1：λDNA/HindIII，片段从大到小依次为：23130bp、9414bp、6557bp、4361bp、2322bp、2021bp、564bp。泳道2：重组质粒pUC-EGF-E4orf4。泳道3：pUC-EGF-E4orf4/EcoRI 2.69kb(载体)，800bp(插入片段)。泳道4：DNA Marker DL2000，片段从大到小依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

实施例3：重组质粒pUC-EGF-E4orf4的定点突变

因构建多拷贝表达载体时需要利用同尾酶Bg1II和BamHI进行表达单元的串联连接，故外源基因片段中不能含有BglII和BamHI的切点。E4orf4基因片段中含有1个BglII识别位点，需通过定点突变将其去除，但不改变氨基酸序列。

定点突变采用Stratagene公司的试剂盒(QuickChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit)，策略见图3。定点突变的引物序列如下：

引物1：

5’-CGG AGA CGC AGA TCG GTT TGT CAC GCC CGC-3’

引物2：

5’-GCG GGC GTG ACA AAC CGA TCT GCG TCT CCG-3’

以实施例1得到的质粒pUC-EGF-E4orf4为模板，进行定点突变的PCR扩增后，转化大肠杆菌DH5α，转化子经DNA序列分析证实E4orf4基因第228位碱基由T变为G。用EcoRI酶切突变后的pUC-EGF-E4orf4质粒，得到编码α-因子前导肽-EGF-E4orf4的基因片段，与经EcoRI线性化的酵母表达载体pAO815(购自Invitrogen公司)连接得到重组质粒pAO-EGF-E4orf4(图5)。

实施例4：重组质粒pAO-EGF-E4orf4的酶切鉴定

pAO815载体AOX1启动子下游既第944bp处为EcoRI克隆位点，重组质粒pAO-EGF-E4orf4经EcoRI酶切后，可见-约800bp的插入片段。重组质粒pAO-EGF-E4orf4需经酶切鉴定筛选出正向克隆，在α-因子前导肽的第24位碱基处有PstI切点，pAO815载体的第6858位碱基处亦有一个PstI切点，重组质粒pAO-EGF-E4orf4经PstI酶切后，正向克隆可获得1.8kb及6.7kb的两个片段，反向克隆则为2.6kb及5.9kb的两个片段。

该质粒的酶切鉴定电泳结果见图6，图中：泳道1：DNA分子量标记DL2000，片段从大到小依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。泳道2：pAO-EGF-E4orf4/EcoRI，7.7kb(载体)，800bp(插入片段)。泳道3：pAO-EGF-E4orf4/PstI，6.7kb，1.8kb。泳道4：pAO-EGF-E4orf4。泳道5：λDNA/HindIII，片段从大到小依次为：23130bp、9414bp、6557bp、4361bp、2322bp、2021bp、564bp。

实施例5：三拷贝表达载体pAO-3EGF-E4orf4的构建

将实施例3得到的pAO-EGF-E4orf4用BglII和BamHI切出含AOX1启动子、α-因子前导肽-EGF-E4orf4编码顺序及AOX1终止子的片段，使之体外自连后再用BglII和BamHI酶切，此时反应体系中只有BglII与BamHI连接成的二聚体，即片段两端分别为BglII及BamHI的片段不能被再次切开。将此反应物连入碱性磷酸酶处理过的pAO-EGF-E4orf4的BamHI位点，转化DH5α受体菌，重组子DNA酶切筛选鉴定后可获得含同方向的三拷贝EGF-E4orf4表达单元的重组pAO-3EGF-E4orf4。质粒构建图见图7，质粒酶切鉴定图谱见图8。

pAO815以BglII及BamHI酶切后将产生由大至小4028bp，2405bp，1279bp三个片段；pAO-EGF-E4orf4以BglII及BamHI酶切后将产生由大至小4028bp，2405bp，2079bp三个片段，最后一个片段系因800bp片段插入1279片段而来。pAO-3EGF-E4orf4以BglII及BamHI酶切后将产生由大至小6237bp，4028bp，2405bp三个片段，6237bp片段系2079bp片段的三倍体。

图8中：泳道1：λDNA/HindIII，片段从大到小依次为：23130bp、9414bp、6557bp、4361bp、2322bp、2021bp、564bp。泳道2：pAO815/BglII+BamHI，片段从大到小依次为：4028bp，2405bp，1279bp。泳道3：pAO-EGF-E4orf4/BglII+BamHI，片段从大到小依次为：4028bp，2405bp，2079bp。泳道4：pAO-3EGF-E4orf4/BglII+BamHI，片段从大到小依次为：6237bp，4028bp，2405bp。

实施例6：宿主菌的制备、转化及工程菌的筛选

采用甲基营养型酵母(即Pichia pastoris，巴氏毕赤酵母)作为表达宿主。甲基营养型酵母有许多优点：(1)含特有的AOX1(醇氧化酶)启动子，用甲醇可以严格地调控表达。(2)有完备的发酵方法，可以高密度连续培养，蛋白表达产量高。(3)生存能力强，易于处理，可以在廉价的非选择性培养基中生长。为此，本发明采用的经实施例5得到的多拷贝EGF-E4orf4表达载体pAO-3EGF-E4orf4，它的转化、筛选和表达过程如下。

实施例6至9中使用的材料为：

10X YNB：134g含硫酸铵但不含氨基酸的酵母碱基溶于1000ml水，无菌过滤后备用。

500X生物素(0.02％生物素)：20mg VitH溶于100ml水，无菌过滤后，4℃储存备用。

10X D(20％葡萄糖)：200g葡萄糖溶于1000ml水，无菌过滤后，4℃储存备用。

10X M(5％甲醇)：5ml甲醇溶于95ml水，无菌过滤后，4℃储存备用。

10X GY(10％甘油)：100ml甘油溶于900ml水，高压灭菌，室温保存备用。

1M磷酸盐缓冲液，pH6.0：混合132ml 1M K₂HPO4，868ml 1MKH2PO4。

BMG及BMMY：100mM磷酸缓冲液pH6.0，1.34％YNB，1％甘油或0.5％甲醇，0.00004％生物素，BMMY中还含有1％酵母提取物，2％蛋白胨。

YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。

MD及MM：1.34％YNB，0.00004％生物素，2％葡萄糖或0.5％甲醇。

表达载体3EGF-E4orf4的制备及线性化具体步骤：

中等量质粒DNA的制备：50ml含100μg氨苄青霉素/ml的LB培养基中接种含该表达载体的菌株后，37℃摇床培养过夜，离心收集菌体后，用QIAGEN公司的质粒纯化试剂盒提取纯化质粒DNA。

取10μg pAO-3EGF-E4orf4用BglII完全酶切后，酚-氯仿-异戊醇抽提、乙醇沉淀、冷冻干燥备用。

实施例7：pAO-3EGF-E4orf4转化宿主菌

巴氏毕赤酵母GS115(his4-)购自Invitrogen公司，将之接种于YPD板上，30℃培养2天，分离出单克隆。单克隆再接种于5mlYPD液体培养基，30℃培养至OD₆₀₀约为1.3-1.5，离心收集菌体，消毒冷却水漂洗、离心后混悬于1ml冰冷的1M山梨醇溶液。取80μl宿主菌与经实施例6制备好的5μl 10μg线性化的pAO-3EGF-E4orf4混合于电打孔杯中，0℃预冷5分钟。设置Bio-Rad基因打孔仪(Gene-pluserII)程序，使产生7500V/cm，10ms的电脉冲以完成转化。立即加入1ml冰冷的1M山梨醇于电打孔杯中，取200μl铺MD培养板，30℃培养至重组子出现。

实施例8：筛选Mut⁺和Mut^s转化子

甲基营养型酵母含有两个AOX基因，分别为AOX1，AOX2基因。将表达载体用不同的酶切(如BglII，NotI或SalI，StuI等)后线性化，使之整合于酵母基因组的AOX1或HIS4基因的位置。当酵母的AOX1基因被替换而丢失后，就产生了Mut^s表型(methanolutilization slow)，它们将利用弱的AOX2基因启动合成AOX，在含甲醇的培养基中生长缓慢。而野生型的酵母在含甲醇的培养基中生长正常，被称为Mut⁺表型。

准备好MD-琼脂糖板和MM-琼脂糖板。在将GS115-Albumin(His⁺Mut^s)及GS115-Gal(His⁺Mut⁺)两个菌株作为对照的情况下，用无菌牙签将实施例7所获转化子从MM板到MD板依次对称接种到两种平板上，30℃培养，观察转化子的生长情况。Mut^s表型在含甲醇的培养基中生长缓慢，Mut⁺表型在含甲醇的培养基中生长正常，见图9。挑取His⁺Mut⁺的转化子作为遗传工程菌株，命名为GS 115-3EGF-E4orf4，观察EGF-E4orf4表达情况。

实施例9：EGF-E4orf4的表达

应用摇瓶培养实施例8获得的遗传工程菌株GS115-3EGF-E4orf4。以单克隆或-80℃保存的菌种接种于25mlBMG培养基中，30℃培养18-24h，至OD₆₀₀＝10～12，离心收集菌体，转接至250mlBMMY培养基中，30℃培养，每24h以1％浓度追加甲醇进行诱导表达，最佳诱导表达时间确定为96～120h。离心收集培养上清，进行EGF-E4orf4融合蛋白的检测。

实施例10：重组EGF-E4orf4融合蛋白的检测

经上述实施例9得到的重组EGF-E4orf4融合蛋白，用SDS-PAGE蛋白电泳分析。使用Bio-Rad蛋白电泳装置，灌制15％分离胶，收集的培养上清，加入蛋白电泳样品缓冲液，100℃变性5min后上样电泳，100V恒压，电泳至溴酚兰出胶，停止电泳，用硝酸银染色。

结果见图10，参照蛋白分子量标准，EGF-E40rf4融合蛋白的分子量约为20kD，符合氨基酸组成的EGF-E4orf4融合蛋白的分子量。图10中：泳道1：GS115-3EGF-E4orf4表达上清，箭头所示为EGF-E4orf4融合蛋白条带。泳道2：蛋白低分子量标准，片段从大到小依次为：43kD、29kD、18.4kD、14.3kD、6.2kD。

还进行了Western Blot分析。将重组EGF-E4orf4融合蛋白先经SDS-PAGE电泳分离后，电转移至硝酸纤维素膜上，先分别加入兔抗人EGF多克隆抗体(购自Santa Cruz公司)或兔抗E4orf4蛋白抗血清(本发明人依常规方法制备)与硝酸纤维素膜孵育，室温1h，漂洗后再加入HRP标记的羊抗兔IgG抗体，室温1h，漂洗后采用ECL化学发光显色法检测。

结果见图11，可见EGF-E4orf4融合蛋白与人EGF抗体呈阳性反应。图11中：泳道1：蛋白低分子量标准，片段从大到小依次为：43kD、29kD、18.4kD、14.3kD、6.2kD。泳道2-3：GS115-3EGF-E4orf4表达上清，一抗为兔抗人EGF多克隆抗体。泳道4：GS115-3EGF-E4orf4表达上清，一抗为兔抗E4orf4抗血清，箭头所示为EGF-E4orf4融合蛋白条带。

实施例11.重组EGF-E4orf4融合蛋白的分离纯化

将实施例9得到的含有重组EGF-E4orf4融合蛋白的酵母表达上清，采用Pharmacia公司的FPLC系统，进行阳离子交换层析纯化。层析柱：XK26，层析介质：SP Sepharose Fast Flow(strong cation)，柱体积50ml。酵母表达上清用6-7倍体积缓冲液A(50mMNaAC/HAC，pH 4.0)稀释，用0.45μm的微孔滤膜过滤；用5个柱体积的缓冲液A平衡介质后，上样，流速5ml/min，用缓冲液A将上样峰洗至基线后，调整流速至3ml/min，用不同盐浓度的缓冲液B(B1：0.5M NaCL，50mM NaAC/HAC，pH 4.0；B2：1.0M NaCL，50mM NaAC/HAC，pH 4.0；B3：1.5M NaCL，50mM NaAC/HAC，pH4.0)进行分步洗脱，分管收集洗脱峰，SDS-PAGE蛋白电泳鉴定。用0.5M和1.0M NaCl，50mM醋酸缓冲液，pH4.0，可将大部分杂蛋白洗脱，随后用1.5M NaCl，50mM醋酸缓冲液，pH4.0洗脱，可得到较好的纯化效果。收集经电泳鉴定后含有融合蛋白的洗脱液，透析脱盐，PEG-10000浓缩，用0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃保存，并作蛋白定量。见图12。

图12中：泳道1：融合蛋白EGF-E4orf4酵母表达上清。泳道2：蛋白低分子量标准，片段从大到小依次为：43kD、29kD、18.4kD、14.3kD。泳道3：阳离子交换层析收集的洗脱液，箭头所示为重组EGF-E4orf4融合蛋白。

实施例12.MTT比色实验测定重组EGF-E4orf4融合蛋白对细胞活力的影响

活细胞的线粒体脱氢酶能将染料MTT(二甲基噻唑蓝二苯基四唑溴盐)转变为不可溶性的紫色物质(formazan)颗粒，后者被有机溶剂DMSO溶解后所呈现的色度(用OD值表示)，能够反映出活细胞的代谢水平。死细胞则无此酶活性。因此在一定细胞数目范围内，MTT结晶物的形成量与活细胞数成正比。在本例中，即利用此实验测试融合蛋白对细胞活力的影响。

具体地，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的培养基吹打成单细胞悬液，以每孔5000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200μl，37℃，5％CO₂培养，20-24小时待细胞完全贴壁后，弃去上清，更换为含5％胎牛血清的培养基，每孔200μl，37℃，5％CO₂培养。用PBS将实施例11得到的融合蛋白EGF-E4orf4从1ng-15μg/ml的浓度作系列稀释，EGF标准品作为对照，按照与融合蛋白EGF-E4orf4等分子比作对应的浓度稀释，每孔依次加入稀释好的连续梯度融合蛋白EGF-E4orf4溶液和等分子比对应的EGF溶液，每个浓度设3个平行孔，重复2板，与细胞共同孵育，37℃，5％CO₂培养2-3天。每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃，5％CO₂继续孵育4--5小时，小心吸去孔内培养上清液，每孔加入100μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上测定各孔在波长570nm的光吸收值。将OD值求均值，输入SPSS分析软件，结果以自动生成的曲线图表示，横坐标显示刺激物浓度，为融合蛋白E4orf4的终浓度(ng/ml)，纵坐标为OD值。

图13中可见：BT325细胞(人脑神经胶质瘤细胞，由北京天坛医院建株)与融合蛋白EGF-E4orf4共同培养44小时，从2.5μg/ml到12.5μg/ml的较高浓度下，细胞活力持续下降，在融合蛋白达到12.5μg/ml即本实验所用融合蛋白的最高浓度处，细胞活力降至最低，OD₅₇₀为0.183，远远低于未加刺激物的阴性对照组细胞活力，其OD₅₇₀为0.276，表现完全不同于加入EGF的阳性对照组细胞，此时加入对应分子数浓度的EGF组细胞的活力仍旧维持在一个较高的水平上，出现两条活力曲线分离的现象。这一结果证明：融合蛋白EGF-E4orf4可以在EGF的介导下进入BT325细胞，并且当其浓度积累到较高水平时，能够对BT325细胞产生明显的细胞毒作用。

图14中可见：MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞，ATCCNumber：HTB-26)与融合蛋白EGF-E4orf4共同培养68小时，从浓度加至500ng/ml起，细胞活力降至最低，低于未加刺激物的对照细胞组，在以后的刺激物浓度下(2.5μg/ml-15μg/ml)，细胞活力始终低于或接近于未加刺激物的对照细胞组，而EGF对照组的细胞活力则始终高于未加刺激物组，表明融合蛋白EGF-E4orf4可以抑制MDA-MB-231细胞的活力。

实施例13.流式细胞仪检测细胞凋亡

在细胞凋亡过程中，由于胞浆和染色质浓缩，细胞核裂解，产生凋亡小体，导致细胞光散射性质发生变化。与活细胞或坏死细胞相比，凋亡细胞具有特殊的光散射类型-低前向散射和高侧向散射。流式细胞仪能够测定细胞光散射的变化，因此广泛应用于细胞凋亡的观察、检测和分析。根据MTT比色实验的结果，以MDA-MB-231细胞的活力降至最低点时融合蛋白所需的浓度为起点，以能够基本饱和细胞表面EGFR的融合蛋白的浓度为终点，在这个范围内设置一系列连续的融合蛋白浓度(10μg/3×10⁵个细胞-25μg/3×10⁵个细胞)，与MDA-MB-231细胞共同培养，L15培养基含5％FBS，培养72小时后用流式细胞仪检测细胞的变化。结果见图15-19，可以看出融合蛋白EGF-E4orf4能够使MDA-MB-231细胞发生凋亡。在一定浓度范围内，细胞凋亡的程度与融合蛋白的浓度成正相关的关系。随着融合蛋白从无到有，细胞凋亡也从无到有；融合蛋白从10μg升至25μg，细胞从少量出现凋亡到细胞明显凋亡，直至细胞进入凋亡晚期。由此可得出结论：融合蛋白EGF-E4orf4能够诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡，而且MDA-MB-231细胞对融合蛋白的细胞毒作用相对敏感，在融合蛋白较低浓度的时候细胞凋亡就表现得很明显。

如图15所示：MDA-MB-231细胞未加融合蛋白培养72小时，92.1％的细胞生长状态良好。

如图16所示：MDA-MB-231细胞与融合蛋白EGF-E4orf4(10μg/3×10⁵细胞)共同培养，已经有少量的细胞发生凋亡，约占15.4％。

如图17所示：MDA-MB-231细胞与融合蛋白(15μg/3×10⁵细胞)共同培养，有28.2％的细胞脱离细胞周期，细胞发生明显的凋亡。而且，从图上还可以看出细胞早期凋亡的特征，即G₀/G₁峰之前出现一个由凋亡细胞产生的坡度或者称为亚峰。这是因为在凋亡早中期，细胞核DNA发生断裂，被降解成为核小体整数倍大小的DNA片段而产生的。箭头所示为亚二倍体峰。

如图18所示：MDA-MB-231细胞与融合蛋白(20μg/3×10⁵细胞)共同培养，可见有19.1％的细胞发生凋亡。

如图19所示：当融合蛋白的浓度达到25μg/3×10⁵细胞，有27.0％的MDA-MB-231细胞发生凋亡。此时细胞凋亡已进入晚期，细胞核DNA被降解成为核小体大小的DNA碎片，导致在很低的PI光吸收值处有一个高峰，箭头所示。

序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>含腺病毒E4orf4蛋白的靶向性抗肿瘤融合蛋白

<130>I20021081CB

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>540

<212>DNA

<213>融合基因

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(528)

<223>

<400>1

aac tcc gac tcc gaa tgt cca ttg tcc cac gac ggt tac tgt ttg cac    48

Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His

1               5                   10                  15

gac ggt gtt tgt atg tac atc gaa gct ttg gac aag tac gcc tgt aac    96

Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn

            20                  25                  30

tgt gtt gtt ggt tac atc ggt gaa aga tgt caa tac aga gac ttg aag    144

Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys

        35                  40                  45

tgg tgg gaa ggt ggt ggt ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc tcc atg gtt    192

Trp Trp Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Met Val

    50                  55                  60

ctt cca gct ctt ccc gct cct ccc gtg tgt gac tcg cag aac gaa tgt    240

Leu Pro Ala Leu Pro Ala Pro Pro Val Cys Asp Ser Gln Asn Glu Cys

65                  70                  75                  80

gta ggt tgg ctg ggt gtg gct tat tct gcg gtg gtg gat gtt atc agg    288

Val Gly Trp Leu Gly Val Ala Tyr Ser Ala Val Val Asp Val Ile Arg

                85                  90                  95

gca gcg gcg cat gaa gga gtt tac ata gaa ccc gaa gcc agg ggg cgc    336

Ala Ala Ala His Glu Gly Val Tyr Ile Glu Pro Glu Ala Arg Gly Arg

            100                 105                 110

ctg gat gct ttg aga gag tgg ata tac tac aac tac tac aca gag cga    384

Leu Asp Ala Leu Arg Glu Trp Ile Tyr Tyr Asn Tyr Tyr Thr Glu Arg

        115                 120                 125

gct aag cga cga gac cgg aga cgc aga tcg gtt tgt cac gcc cgc acc    432

Ala Lys Arg Arg Asp Arg Arg Arg Arg Ser Val Cys His Ala Arg Thr

    130                 135                 140

tgg ttt tgc ttc agg aaa tat gac tac gtc cgg cgt tcc att tgg cat    480

Trp Phe Cys Phe Arg Lys Tyr Asp Tyr Val Arg Arg Ser Ile Trp His

145                 150                 155                 160

gac act acg acc aac acg atc tcg gtt gtc tcg gcg cac tcc gta cag    528

Asp Thr Thr Thr Asn Thr Ile Ser Val Val Ser Ala His Ser Val Gln

                165                 170                 175

taatgagaat tc                                                      540

<210>2

<211>176

<212>PRT

<213>融合基因

<400>2

Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His

1               5                   10                  15

Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn

            20                  25                  30

Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys

        35                  40                  45

Trp Trp Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Met Val

    50                  55                  60

Leu Pro Ala Leu Pro Ala Pro Pro Val Cys Asp Ser Gln Asn Glu Cys

65                  70                  75                  80

Val Gly Trp Leu Gly Val Ala Tyr Ser Ala Val Val Asp Val Ile Arg

                85                  90                  95

Ala Ala Ala His Glu Gly Val Tyr Ile Glu Pro Glu Ala Arg Gly Arg

            100                 105                 110

Leu Asp Ala Leu Arg Glu Trp Ile Tyr Tyr Asn Tyr Tyr Thr Glu Arg

        115                 120                 125

Ala Lys Arg Arg Asp Arg Arg Arg Arg Ser Val Cys His Ala Arg Thr

    130                 135                 140

Trp Phe Cys Phe Arg Lys Tyr Asp Tyr Val Arg Arg Ser Ile Trp His

145                 150                 155                 160

Asp Thr Thr Thr Asn Thr Ile Ser Val Val Ser Ala His Ser Val Gln

                165                 170                 175

Claims (14)

1、一种重组人表皮生长因子(EGF)-腺病毒E4orf4融合蛋白，其从N端至C端依次为人表皮生长因子，由甘氨酸和丝氨酸组成的11个氨基酸的接头，和腺病毒E4orf4蛋白。

2、如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其由51个氨基酸残基的人表皮生长因子、11个氨基酸残基的接头和腺病毒A5的E4orf4蛋白组成。

3、一种融合基因，其具有编码权利要求1或2的融合蛋白的核苷酸序列。

4、如权利要求3所述的融合基因，其具有SEQ ID NO：1的序列。

5、含有至少一个拷贝的权利要求3或4的融合基因的表达载体。

6、如权利要求5的表达载体，其为图5所示的质粒pAO-EGF-E4orf4。

7、如权利要求5的表达载体，其为图7所示的质粒pAO-3EGF-E4orf4。

8、包含权利要求3或4的融合基因或者权利要求5-7任一项的表达载体的宿主细胞。

9、如权利要求8的宿主细胞，其为甲基营养型酵母细胞。

10、如权利要求9的宿主细胞，其为巴氏毕赤酵母GS115-3EGF-E4orf4，保藏号为CGMCC 0771。

11、一种生产权利要求1或2的融合蛋白的方法，包括在适于表达的条件下培养权利要求8-10任一项的宿主细胞，以及分离和纯化所表达的融合蛋白。

12、一种药物组合物，其包含权利要求1或2的融合蛋白和药学可接受的载体。

13、权利要求1或2的融合蛋白在制备用于治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

14、如权利要求13的应用，其中所述的恶性肿瘤是p53基因缺失的肿瘤。

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