JPS63500003A - 哺乳動物細胞中でγ−インタ−フエロンを発現させるためのベクタ−、それを実施する方法、得られた製品及び該γ−インタ−フエロンを含有する医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物細胞中でγ−インターフェロンを発現させるためのベクター、それを実 施する方法、得られた製品及び該γ−インターフェロンを含有する医薬組成物 ヒトインターフェロン類は、アイザークス（１５ａａｃｓ　）とリンデンマン（ Ｌ　ｉｎｄｅｎｍａｎ）　（１９５７年）により、標的細胞においてウィルス低 抗性の状態を誘発できる一群の蛋白質として記載された。

それ以来、多くの重要な生物学的活性が記載されてきた（　Ｓ　ｔｅｗａｒｔ、 １９７９年参照）。とりわけ、免疫調節及び細胞増殖阻害並びに動物での腫瘍増 殖に対する直接的作用が記載されてきた。

その結果、近い将来に、インターフェロンがウィルス感染症及び腫瘍の臨床処置 において重要な役割を果たすであろうと期待される。

白血球（ＩＦＮ−α）、繊維芽細胞（ＩＦＮ−β）及び免疫（Ｉ　ＦＮ−γ）と いう３クラスのインターフェロンのうち、ＩＦＮ−７は免疫制御作用（Ｓ　ｏｎ ｎｅｎｆｅｌｄら、１９７７年）、細胞制御作用（Ｂ　Ｉａｌｏｃｋら、１９８ ０年）及び腫瘍阻害作用（Ｓ　ａｌｖｉｎら、１９７５年；　Ｇ　ｔａｓｇｏｗ ら、１９７８年）において、最も活発であることが示されている。

天然ＩＦＮ−γは、ミトゲン刺激により末梢血白血球培養物中に誘発される。ご く最近、リンデルクネヒト（Ｒ１ｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ　）ら（１９８４年）が 成熟蛋白質の正しい配列を記載し、そのタイプとグリコジル化度を証明した。

ｃＤＮＡクローニング実験から推論された蛋白質配列は、生物活性をもつ成熟分 子のＮ末端及びＣ末端に関して様々の不明確な点のあることを曝露した。例えば 大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）や酵母での発現を選択した場合の蛋白質の配列は、グ レイ（Ｇｒａｙ）ら（１９８２年）が発表したｃＮＤＡに関するデータを基礎と するとき、天然の配列に正確には対応しない。もつとも、これらの修飾は分子の 生物活性に影響しない。

本発明は、ＩＦＮ−γ蛋白質をコードする遺伝子が組込まれ、蛋白質の効率的な 合成と培地への放出を可能ならしめる組換えワクシニアウィルス（ＶＶ）を基礎 としたーシステムに関するものである。この合成は種々のタイプの真核細胞中で 達成できる。また、このウィルスは生きた動物中で増殖させることができ、それ により、高濃度の内因性ＩＦＮ−γの免疫制御作用の生体内研究を可能とする。

最近、幾つかの研究グループが、インフルエンザ抗原、Ｂ型肝炎抗原及び狂犬病 糖蛋白質の抗原の発現のために、生きた組換えワクシニアウィルスを使用して、 これらの疾患に対する免疫を得ることができることを示している［スミス（Ｓ　 ｍ１ｔｈ）ら１９８３年；パニカリ（Ｐ　ａｎｉｃａｌｉ　）ら、１９８３年； キーニー（Ｋ　１ｅｎｙ）ら、１９８４年］。

ワクシニアウィルス（ＶＶ）中での外因性蛋白質をコードする配列の発現には、 必然的に次の二つの段階が含まれる： １）コード配列をＶＶプロモーターと一列に並べ、適当な細菌プラスミド中にク ローニングされたＶＶ　ＤＮＡの非必須セグメントに挿入しなければならない。

２）両側に位置するＶＶ　ＤＮＡは動物中で該プラスミドとウィルスゲノムとの 間の同種（ホモロガス）組換えを可能にするものでなければならない、二重相互 組換えにより、プラスミドに挿入されたＤＮＡがウィルスゲノムに移され、それ によってそれが増殖、発現される［パニカリ（Ｐ　ａｎｉｃａｌｉ　）とパオレ ッテイ（Ｐａｏｌｅｔｔｉ　）　、１９８３年；パニカリ（Ｐ　ａｎｉｃａｌｉ 　）ら、１９８３年］。

本発明は、ヒトＩＦＮ−γ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とす るポックスウィルス、とりわけワクシニアウィルスに関する。このウィルスは、 好ましくは、細胞から培地中へ分泌される完全な成熟型ＩＦＮ−γの発現を行な う要素一式を含んでいる。

とりわけ、それは、ヒトＩＦＮ−γ蛋白質をコードする配列から上流に位置する ポックスウィルス、特にワクニシアの遺伝子プロモーター、例えばＩＦＮ−γを コードするＤＮＡ配列［以下ＤＮＡ（ＩＦＮ−γ）という］の発現を行なうＰ７ ．５にと呼ばれる７、５に遺伝子プロモーターを含むであろう。

このプロモーター／ＤＮＡ　（Ｉ　ＦＮ−γ）配列一式を、ワクシニアウィルス の遺伝子、例えばＴＫ遺伝子の如きワクニシアＤＮＡの非必須配列へ挿入すると 、後述のように選択の可能性が生じる。

当然のことながら、本発明の文脈内で、「ワクシニアウィルス」というとき、ウ ィルス全体又は非必須部分を欠失させたウィルスを意味しうる。

本発明は上に定義したウィルスに感染しだ哺乳動物細胞にも関する。

特に使用可能な細胞のうち、特に挙げるべきはヴエロ（Ｖｅｒｏ）細胞である。

しかしながら、実施例に記載するように、他の細胞も使用できる。

本発明はまた、上記細胞を適当な培地中で培養して得られるヒトＩＦＮ−γの調 製法に関する。

本発明は最後に、上記方法を実施して得られたヒトＩＦＮ−γに関する。

本発明は特に、本発明の方法を実施して得られたＩＦＮ−γを有効成分として含 有する治療用組成物並びに上記の通りに修飾されたポックスウィルス、とりわけ ワクシニアウィルスを有効成分として含有する治療用組成物に関する。後者の場 合、人体又は動物体を処置するための治療剤として使用されるワクシニアウィル スは生体内でＩＦＮ−γを生成させることができなければならない。

本発明の組換えウィルスの調製は、とりわけ次の段階を包含する： １）ｃＤＮＡ　（ＩＦＮ−７）の一端を再構築してＭ１３ｐＴＧＯ５を得る； ２）ｐＢＲ３２２からのミニプラスミドｐＴＧＩＨの合成； ３）ＶＶＴＫ遺伝子を担持するＨｉｎ−Ｊ断片の上記ミニプラスミドへの挿入； ４）７．５に蛋白質プロモーターのＴＫ遺伝子への挿入；５）Ｐ７．５にプロモ ーターの下流へのポリリンカーの挿入； ６）ポリリンカーの２か所の制限部位間への、ＩＦＮ−γ蛋白質をコードする完 全なｃＤＮＡ配列の挿入；７）この最後のプラスミドの必須要素のワクシニアウ ィルスにおけるクローニング。

以下の実施例は、得られる種々の成分の性質を説明するものである。

使用する種々の材料は実施例中で特定されている。

特記した場合を除いて、酵素類は製造者の推奨する条件下で使用し、用いる諸技 法は当業者にとって既知のものである。

図に示した配列及びヌクレオチド配列は、明細書を煩雑にしないよう、本文中で は繰り返さないが、その不可欠な部分をなすものである。

添付の図面において、 第１図は、ＩＦＮ−γ蛋白質をコードするｐＴＧｌｌｃＤＮＡの配列を示し、 第２図は、ＢｇｌＩ［部位導入のための上記ｃＤＮＡの変異の概要を示し、 第３図は、ｐ　Ｍ　Ｌ　２の構成の概要を示し、第４図は、ｐＴＧ１８６−ＰＯ ＬＹの調製の概要を示し、 第５図は、ｐＶＶＴＧ４１の調製の概要を示し、第６図は、ワクシニアウィルス におけるクローニングの概要を示し、 第７図は、標識ｃＤＮＡ（ＩＦＮ−γ）プローブとのハイブリダイゼーション後 のＴＫ−組換えウィルスのＤＮＡ断片の螢光写真を示し、 第８図は、３Ｘ１０−２ＭＯＩでの組換えＩＦＮ−γワクシニアウィルス感染細 胞による培地への１ＦＮ−γの合成、放出の速度を表わす曲線を示す。

１−ベクターの構築 マイトジェンで刺激されたリンパ球のＲＮＡから誘導されたライブラリーから元 来単離されたクローンｐＴＧ１１のｃＤＮＡ配列を第１図に示す。

この配列は、グレイ（Ｇｒａｙ）ら（１９８２年）が発表している第一配列と第 ５２１位で相違する。ＧｉｎをコードするトリプレットＣＡＡが、ｐＴＧｌｌで は、ＡｒｇをコードするトリプレットＣＧＡにより置換されている。

実際多くのグループがこの変異を確認しており、更に、ゲノム配列は、記載され ていたアデニンの代わりにグアニジンを示している。

ｐＴＧｌｌにおいてＩＦＮ−γをコードする配列には、５′末端の非コード領域 の３０塩基が先行している。

のちの構築においてＰ７．５にプロモーターと蛋白質配列の始まりとの間にポリ ｄ　Ｇ／ｄ　Ｃ伸長部が存在するのを排除するため、開始コドンの上流にＢｇｌ ＩＩ制限部位を導入した。これにより、ｃＤＮＡのＶＶベクターへの移入も容易 になる。

該部位の特異変異は第２図に示した方法に従って行う。

ｐＴＧｌｌ中に存在するＩＦＮ−７ｃＤＮＡに由来する１、１００ｂｐのＰｓｔ Ｉ　−Ｈｌｎｄ　ＩＩ制限断片をファージＭ１３ｍｐ８の二本鎖ＤＮＡに挿入す る。Ｍ　１３　ｍ　ｌ）８から得られた一本鎖ＤＮＡを、第２図に示した構造を もつ合成１８ヌクレオチドオリゴマーとハイブリダイズさせる。これによりＡＴ 配列がＧＡ配列により置換される。

かくして、Ｍ　１３　ｐ　Ｔ　Ｇ　０５と呼ぶファージＭ　１３の誘導体が得ら れ、これをＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化すると、もはやｄｇ／ｄＣ末端を含 まず、完全なＩＦＮ−γ蛋白質をコードする９５０ｂｐの断片が得られる。

２）ハイブリッドプラスミドの構築 ヒトＩＦＮ−γをコードする配列のＶＶゲノムへの移入及びその後のそれの発現 に必要な各種要素を合わせたサイズは数ｋｂのオーダーである。それゆえ、必要 な操作を容易にするべく、構築作業に用いるＥ、　ｃｏｌｉ中での複製のために プラスミドの寸法を最小必要限まで縮小することが必要であると考えられた。

ＶＶゲノムのＨｌｎｄ　Ｔｒｉ　（Ｈｉｎ　−Ｊ　）断片はチミジンキナーゼ（ ＴＫ）の完全な遺伝子を含んでおり、このものは既に先にＶＶゲノム中での異種 ＤＮＡの交換及び組換えを可能にするのに用いられている［マケット（Ｍａｃｋ ｅｔｔ）ら、１９８２年］。ＶｖのＴＫ遺伝子への挿入部の移入が認識可能なＴ Ｋ欠損ウィルスをうみ出すことを指摘しておくことは重要である。まず第一に、 ＶＶ　ＤＮＡのＨｌｎ−Ｊ断片の完成に使用できるようなＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位 １か所を有する小型プラスミドを製出することが必要であった。更に、実施すべ き後の操作を可能ならしめるべく、プラスミドの不必要な制限配列を除去するこ とが必要であった。

ヌクレオチド１０８９と２４９１との間のセグメントの自然欠失によりプラスミ ドｐＢＲ３２２から導かれたベクターであるプラスミドｐＭＬ２　［ラスキー（ Ｌ　ｕｓｋｙ）とボチャン（Ｂｏｔｃｈａｎ）　、１９８１年］を用いて構築を 開始した（第３図）。まず、ｐ　Ｍ　Ｌ　２の２か所のＡ　ｈａＩＩ［部位間に ｐＵＣ８［ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ　）とメリック（Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、１９ ８２年］のＡ　ｈａｍ　−Ａ　ｈａｍ断片を挿入することにより、１９塩基対を 除去して、ＰｓｔＩ配列を消去した。「リンカ−テーリング」法［ラス（Ｌ　ａ ｔｈｅ）ら、１９８４年］を用いて、このプラスミドの、前もってＳｌで処理し たＮｒｕＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間にＨｉｎｄ　ｍリンカ−を挿入した。こ れにより、ＢａｍＨＩ部位をもはや含まず、機能性のβ−ラクタマーゼ遺伝子（ アンピシリン耐性を付与する）を担持し、更にＥ、　ｃｏｌｉ中で活性な複製開 始点及び１か所のＨｉｎｄ■制限部位を含む２０４９塩基対のプラスミドが得ら れる。

この構築物をｐＴＧＩＨと名付けた。

ＴＫ遺伝子を担持するＶＶ　ＤＮＡのＨｉｎ−Ｊ断片は先に、ｐＢＲ３２７由来 のベクター中でクローニングされている［ドリリエン（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ　）と スペーナ−（Ｓｐｅｈｎｅｒ）　、１９８３年］。この４．６Ｋｂの断片をｐＴ ＧＩＨのＨｉｎｄＩＩＩ部位で再クローニングした。アンピシリン耐性をコード する遺伝子に関して遠位にＴＫ遺伝子が位置するクローニンを選択した。　この ｐＴＧＩＨ構築物を次の実験のキャリヤーとして使用した。

次の段階は、ヒトＩＦＮ−γをコードする配列の発現制御に用いうるｖＶプロモ ーターを単離することがらなっていた。７，５００ダルトン（７，５Ｋ）の蛋白 質をコードする初期遺伝子のプロモーターが同じ目的で既に成功裏に使用されて おり　［スミス（Ｓ　ｍ１ｔｈ）ら、１９８３年］、それゆえこのセグメントの 単離に着手した。

この７．５に遺伝子はＷＲ型ｖｖのゲノムのより小さい５ａｌＩ断片（Ｓａｌ− ３断片）の一つの上に位置している［ペン力タサン（Ｖ　ｅｎｋａｔａｓａｎ　 ）ら、１９８１年］。

それら小型断片が優先的にクローニングされるので、５ａｌＩ切断ＷＲ型ＶＶ　 ＤＮＡをプラスミドｐＢＲ３２２中で直接クローニングして得られるクローンの 多くが５ａｔ−３断片を担持する。この断片を、５ａｌＩ消化及び再結合により ベクターバクテリオファージＭ１３ｍｐ７０１［キー−Ｚ　−（Ｋｉｅｎｙ）ら 、１９８３年］に挿入して、ファージＭ１３ＴＧＳａｌ−３を得る。

このクローンでは、７．５に遺伝子の開始ＡＴＧのすぐ近くにＳ　ｃａ　Ｉ部位 が存在する。ベクター由来の各１か所のＢａｍＨＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位が７ ．５遺伝子の下流に位置している。ＢａｍＨＩ部位及びＳ　ｃａ　Ｉ部位を、Ｂ ａｍＨＩ消化により生じた末端をポリメラーゼのフレノウ断片を用いてうめたの ち、Ｂａ１ｎリンカ−５５’　−ＣＡＧＡＴＣＴＧ−３’を介して融合する。こ のプロセスにより、５ｃａＩ部位は除去されるが、ＢａｍＨＩ部位が再構成され 、単一のＥｃｏＲＩ部位は下流ヘシフトする。同時に、下流の５ａｌＩ　（Ａｃ ｃＩ）部位が除がれ、従って上流の該部位が単独のものとなる。

この構築物をＭ１３ＴＧ７．５にと称する。

ＶＶ　ＤＮＡ（７）Ｈｉｎ−Ｊ断片内には、約３０塩基対により隔てられたＣＩ ａＩ部位とＥｃｏＲＩ部位とが位置されている［ウェアー（Ｗｅｉｒ）と（Ｍｏ ｓｓ）、１９８３年］。

Ｍ１３ＴＧ７．５に中に存在する７、５にプロモーター断片をＡｃｃＩ及びＥｃ ｏＲＩで切り出し、ｐＴＧＩＨ−ＴＫのＣ１ａ−Ｉ部位とＥｃｏＲＩ部位との間 でクローニングし、ｐＴＧＩＨ−ＴＫ−ｐ７．５Ｋを生ぜしめる。これの合成の 概略を第４図に示す。

この構築により、ベクターＭ１３のそれぞれ単一のＢａｍＨＩ部位及びＥｃｏＲ Ｉ部位が７．５にプロモーター配列の直ぐ下流へ移動する。これら各単−のＢａ ｍＨＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位は、次の構築で利用する。

バクテリオファージＭ１３ＴＧ１３１［キーニー（Ｋ　１ｅｎｙ）ら、１９８４ 年］のポリリンカーセグメントをＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩを用いて切り出し、 プラスミドｐＴＧＩＨ−ＴＫ−ｐ７．５にのＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩとの間 に挿入して、ｐＴＧ１８６−ＰＯＬｙを生ぜしめる。この構築物では、ｐ７．５ にの制御下に異種遺伝子をクローニングするのに１０か所の制限部位を利用でき る。

ｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとで消化し、Ｍ　１３　ｐ　 Ｔ　Ｇ　０５から導いた、ＩＦＮ−７ｃＤＮＡ配列を含有するＢｇｌＩＩ　−Ｅ ｃｏＲＩ断片に結合する（第５図）。Ｅ、　ｃｏｌｉを形質転換後、プラスミド ＤＮＡのミニ調製物を酵素消化して組換えプラスミドを確認する。

正しい酵素１検体を採用し、ｐＶＶＴＧ４１と名付けた。

７）ワクシニアウィルスでのクローニング（第６図）スミス（Ｓ　ｍ１ｔｈ）ら （１９８３年）が記載している方法は、ＶＶ　ＴＫ遺伝子中に挿入断片を担持し ているプラスミドと野生型ウィルスゲノムとの間で生体内交換を行わせ、ウィル スが担持しているＴＫ遺伝子を不活性化することを基礎としている。ＴＫ−ウィ ルスは、５−ブロモデオキシウリジン（５ＢＵＤＲ）の存在下に細胞系（ＴＫネ ガイブ）でのブレーティングにより選択できる［マケット（Ｍａｃｋｅｔｔ）ら 、１９８２年］。チミジンキナーゼは５ＢＵＤＲをリン酸化して５′−モノリン 酸とし、これは次にトリリン酸に転化される。この化合物はｄＴＴＰアナログで あって、それがＤＮＡに組込まれると、ウィルスの正常な発育が阻害される。そ れにもかかわらず、ＴＫ−ウィルスは、そのＤＮＡを正常に複製し、ＴＫ−の細 胞形において目に見えるウィルスのプラークを生じる。

ワクシニアウィルスは、感染細胞の核内でよりも細胞質内で増殖する。その結果 、宿主ＤＮＡの複製、転写機構を利用することができず、ウィルス粒子がそのゲ ノム発現のための諸成分を有することが必要である。精製ＶＶ　ＤＮＡは非感染 性である。

組換え体を生成させるには、細胞をＶｖウィルス粒子に感染させることと関心の あるクローニン化ＤＮＡセグメントによるトランスフェクションとを同時に行う ことが必要である。それにもかかわらず、組換え体の形成は、ＤＮＡによる形質 転換を受けうる細胞のごく僅かに限られる。そのため、組換え体でない親つイス ルがもたらすバックグラウンドを減じるため、間接的「コングルエンス（適合） 」という手段をとることが必要であった。これは、生きた感染性ライスルとして 、非許容温度３９．５℃で増殖できない温度感受性（ｔ　ｓ）のワクニシア変異 株［ドリリエン（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ　）とスペーナー（Ｓｐｅｈｎｅｒ）　、１ ９８３年］を用いることによって、達成された。細胞を非許容条件下でｔｓ変異 株に感染させ、野生型ウィルスのＤＮＡでトランスフェクトすると、トランスフ ェクションを受けることができて、その中で野生型ウィルスＤＮＡ（！：ｔｓウ ィルスのゲノムとの形で組換えが起る細胞の中でのみ、ウィルスの増殖が起る； その他の細胞では、感染していても、ウィルスは増えない。

ｐＶＶＴＧ４１のようなワクシニアＤＮＡの断片を含有する組換えプラスミドが 、野生型ＤＮＡと共に、適当な濃度でトランスフェクション用混合物に含まれて いると、適格細胞中でのワクニシアＤＮＡとの同種組換えにそれを関与させるこ ともできる。

ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥ　Ｆ）の初代細胞層を３３°ＣでＶｖ−コペンハー ゲンｔ　ｓ　７　（０，１ｐ　ｆ　ｕ／細胞）に感染させ、野生型■Ｖ−コペン ハーゲンウイルスのＤＮＡ　（５０ｎｇ／１０６細胞）と組換えプラスミド（２ ５〜３０ｎｇ／１０６細胞）とのリン酸カルシウム共沈物でトランスフェクトす る。

ｔｓウィルスの生育を許容しない温度（３９，５°Ｃ）で２時間インキュベーシ ョン後、細胞を再び３９．５℃で４８時間インキュベートする。ｔｓ＋ウィルス を希釈したものを用いて３７°ＣでＬ−ＴＫ−マウス細胞の単層の再感染を行い 、それら細胞を次に５ＢＵＤＲ（１００μｇ　／　ｒｒＱ　）の存在下にイキン ユベートする。組換えプラスミドを受け入れたこれらの細胞からＴＫ−ウィルス のプラークが得られ、一方、プラスミドなしの対照培養物は目に見えるプラーク を示さない。ＴＫ−ウィルスを次に、５ＢＵＤＲの存在下での第二次選択でサブ クローニングする。

ＩＦＮ−γ／ワクシニアハイブリッドプラスミドと■Ｖゲノムとの間で正しい二 重相互組換えが起ると、挿入断片を担持するＴＫ遺伝子とウィルスのＴＫ遺伝子 とが交換され、組換え体はＴＫ−となる。

種々のＴＫ−組換えウィルスミから精製したＤＮＡをＰｓｔＩとＥｃｏＲＩとで 同時に消化し、アガロースゲル電気泳動に付す。ＤＮＡ断片をサザン（Ｓ　ｏｕ ｔｈｅｒｎ　）　（１９７５年）が記載している技法に従って、ニトロセルロー スフィルターに移す。次にフィルターを３２　ｐでニック翻訳したｃＤＮＡ（Ｉ ＦＮ−γ）プローブとハイブリダイズする。フィルターを洗浄後、螢光写真をと る。ワクシニアウィルスがＩＦＮ−γ遺伝子を取り込んでいれば（第７図）、オ ートラジオグラフ上に１．０ｋｂのバンドが見られる。

組換えワクシニアウィルスで哺乳動物細胞を感染させた後のヒトＩＦＮ−γの発 現 ＩＦＮ−γの遺伝子を組込んだＴＫ″′組換えウィルス、すなわちｐＶＶＴＧ４ １は各種培養細胞の感染に用いられる。

ヒト［チャン、ヘーラ（Ｃｈａｎｇ、　Ｈｅ１ａ　）　］　、マウス（ＬＭ）　 、ハムスター（ＢＨＫ）　、イヌ（ＭＤｃＫ）及ヒ＋ル（Ｖｅｒｏ　）株あるい はニワトリ−次細胞について試験を行う。

これ等の株は互いに極めて類似した量のヒトＩＦＮ−γを産生ずる。

標準プロトコール及び得られる結果を以下ヴエロ（Ｖｅｒｏ）株について説明す る。

ワクニシアによるヴエロ株の感染 ヴエロ細胞の単層（集密度８０％〜１００％）に、各種感染濃度（ＭＯＩ　、　 １０〜１０５ｐｆｕ　／ｃｅｌｌ）のライスルを含む非血清加培地を用いて感染 させる。室温で１時間吸着させた後、ウィルスを培地で希釈し、インキュベータ 中３７℃で感染を継続させる。各種の感染時間（３乃至７２時間）の後、上清を 取って凍結し、２回反復して洗浄後、細胞を剥離してＢＳＡ　（０，１ｍｇ／脱 ）加培地中で凍結させる。これと平行して、ウィルス（野生株乃至組換え）株を ニュートラル・レッド染色によって定量し、溶解面積を各種感染濃度ごとに観察 する。

産生インターフェロンの定量 抽出液中に存在するワタシニアウイルスによる定量への干渉を避けるため、抽出 物を、紫外線を用いてウィルスの９９％以上を不活性化するに充分な時間処理す るか、あるいは３０，０００ｒｐｍ、４℃で２時間遠心する（この条件でウィル スの９９，９％以上が固形ペレットとして得られ、存在するインターフェロンの ９５％以上が回収される）。

上清についてはその他の操作を施さない。細胞抽出液を得るには、凍結、融解を ３度繰り返すことによって細胞を破壊し、ついで短時間の超音波処理を施し、更 に遠心する（１０．０００ｒｐｍ、４℃で１０分）。

上清中のインターフェロン活性もしくはこのように処理された細胞中のインター フェロン活性は、ＶＳＶ　（水痘性口内炎ウィルス）のＷＩ　ＳＨ細胞（ヒト表 皮細胞）における複製に及ぼす抑制作用を測定することによって定量される。

集密なＷＩ　ＳＲ単層を供試抽出物の段階希釈液及び標準インターフェロン（Ｐ ＨＡ刺激リンパ球から得られる天然インターフェロン）の存在下で２４時間、３ ８７°Ｃでインキュベートする。ついで培地を除き、血清枯渇培地中０．１Ｍｌ ０のｖＳＶで細胞を感染させる。３７℃で２４時間乃至３０時間一対照培養物に おいて完全な溶解を起こさせるに必要かつ充分な時間−インキュベートし抽出物 中での溶解に対して１／２の保護を与える希釈を、標準試験室インターフェロン によるそれと比較する。

この内部標準は国際標準（ＮＩＨＧ９　２３−９０１−５３０）　、即ちＮａｔ ｉｏｎａｌ　Ｉ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙａｎｄ　Ｉｎｆｅｃ ｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＵＳＡ）から得た、Ｉ Ｕ／ｍＱで１／２保護が観察された天然ヒトＩＦＮ−γと比較定量される。結果 は国際単位で表わされている。

免疫テストにおいては、抗ＩＦＮ−γ抗体（バクテリア中でクローンされたヒト ＩＦＮ−γに対して作られたマウス・モノクローナル抗体）の段階希釈液を、ｌ ０ＵＺ鵬のインターフェロンに対応する一定量の抽出物の存在下、３７℃で２時 間ブレインキュベートし、その後に細胞に加える。

ウシ（ＭＤ　Ｂ　Ｋ）もしくはマウス（ＬＭ）株を用いた種得意性のテストをＶ ＳＶ感染によっても行う。この場合、バクテリア中でクローンされたヒトＩＦＮ −α又は部分精製天然マウスＩＦＮ−γを対照として用いる。

インターフェロンの酸性ｐＨに対する感受性を調べるためには、抽出物をＩ　Ｍ 　ＨＣＱでｐＨ２に調製し、４°Ｃで２時間インキュベートした後、ＩＭＮａＯ Ｈを加えて中性とし、その後に定量を行う。

結　果 ヴエロ株について得られた結果を第１、■、■表と第８図に要約した。

これらによると、ＩＦＮ−γの細胞外蓄積の速度は組換えウィルスの感染度に依 存することが知られる（第工表）。

低いＭＯＩ　（＜１Ｏ−２）では、感染後４８時間においても、極めて僅かなイ ンターフェロンしか検出されていない。

ＭＯＩ≧１０−２では、細胞外インターフェロンの量はインキュベーション時間 に依存する。ヴエロ株（３，５Ｘ１０’Ｕ／１０６細胞）で得られる最大量はＭ ＯＩ　＝１０では２５時間以降に達成され、ＭＯＩ　＝　１では４８時間まで得 られない。

ＭＯＩをやや大きい値（３Ｘ１０−２）にとると、インターフェロンの細胞内合 成をそれに続く細胞外培地中への放出の段階的プロセスを見ることもできる（第 ８図参照）。インキュベーション８時間後では、Ｍｏｌの値に関わりなく、産生 されるインターフェロンの１０ないし３０％が細胞内にとどまっている。

組換えワクシニアウィルスで感染したヴエロ株が合成するインターフェロンはヒ トＩＦＮ−γに特異な諸性質をもっていることが確認されたニ ーヒト細胞株に対する種特異性、即ちウシないしマウス株に対する抗ウィルス活 性の欠如（第■表）。

−湿度、酸性度及び界面活性剤に対する感受性（第１表）。

−ヒトＩＦＮ−γに特異な抗体による中和（第■表）。

第１表 組換えＩＦＮ−γワクニシアワクチン感染ヴ工ロ細胞中に産生されるインターフ ェロンの安定性ＮＤ−測定せず これらの結果は対照に対する相対９６活性値として示さ全ての供試株は組換えワ クシニアウィルス感染後にヒトＩＦＮ−γを合成する能力をもつことが明かとな った。

ヒト由来株を含めたこれらの株については、産生ヒトＩＦＮ−γは使用した感染 条件下においてワクニシアの複製に対して無視し得る程度の作用しか及ぼさなか った。

これらの各種の株について得られた最大力価は、感染細胞１０６当たり２Ｘ１０ ’乃至７Ｘ１０’ヒトＩＦＮ−γ単位の間にあった。この３倍のファクターは、 ワクシニウィルスに対する各種株の感受性における僅かな差異を反映したものと 考えられる。

天然インターフェロンについて述べた特異活性値が１０”　Ｕ／１０６ｍｇであ ることを考慮すると、これらの結果は、１０６感染細胞当たり最高０．　２乃至 ０．７ｍｇの産生、つまり培養物１リットル当り純粋インターフェロン約０．２ 乃至０．７ｍｇを得ることが可能であることを示している。

プラスミドｐＶＶＴＧ４１は１９８５年６月１２日に７３０１５パリ市ドクテユ ール・ルー街２８番地のパスツール研究所国立微生物寄託機関（Ｃｏｆ　Ｉｅｃ ｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａ！ｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒ ｇｇａｎｉｓｍｅｓ　）に寄託されている。寄託番号は次の通りである。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＳＫ株ｐＶＶＴＧ４１　：Ｎｏ、ｌ−４５６本プラスミドを要約 すると次の通りである。

ワクシニアウィルスプロモーターの制御下に置かれ、哺乳動物細胞中でのワクシ ニアウィルスによる生体内組換えにより哺乳動物細胞中でヒトインターフェロン γ（ＩＦＮ−γ）を発現しうるＴＫ−Ｉ　ＦＮ−γ組換えワクシニアウィルスを 生成させることを意図したヒトＩＦＮ−γをコードする５ＤＮＡを担持するとこ ろのＥ、ｃｏｌｉ複製プラスミド。

一該ＩＦＮ−γｃＤＮＡは、マイトジェン刺激リンパ球のメツセンジャーＲＮＡ に由来するライブラリーから単離した。

−このｃＤＮＡはワクシニアウィルスプロモーターである７、５に蛋白質プロモ ータの支配下に置かれた。

−哺乳動物細胞の感染に使用する予定の野生型ワクシニアウィルスのＴＫ遺伝子 との同種組換えを促進すべく、ｐ７．５に−Ｉ　ＦＮ−γＤＮＡ配列を、ワクニ シアのＴＫ遺伝子内に組込んだ。

−ＴＫ遺伝子に組込まれたｐ７．５に−ＩＦＮ−γを含有するＤＮＡ配列を、Ｅ 、　ｃｏｌｉ中での複製の開始点とβ−ラクタマーゼ遺伝子とを含むｐＭＬ２由 来のＥ。

ｃｏｌｉプラスミドに挿入した。

この構築物をｐＶＶＴＧ４１と名付ける。

プラスミドｐＶＶＴＧ４１のＤＮＡをリン酸カルシウム沈澱の形で、ワクシニア ウィルス感染哺乳動物のトランスフェクトに用いることにより、細胞内でのウィ ルス増殖の間に、ウィルスのＴ’に遺伝子と該プラスミドに担持されたＩＦＮ− γ遺伝子含有ＴＫ遺伝子との間に組換えが起る。この交換で生じる組換えウィル スはＴＫ−であり、ＩＦＮ−γ遺伝子を担持する。

参考資料 １、アール、ドリリエン（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ　Ｒ，）及びディー。

スペーナー（Ｓｐｅｈｎｅｒ　Ｄ、　）　（１９８３）　、ヴイロロジ−（Ｖｉ ｒｏｌｏｇｙ　）　１３１．　３８５〜３９３２、ジエイ、イー、ブラロツタ（ Ｂｌａｌｏｃｋ　Ｊ、Ｅ、　）、ジエイ、エイ、ゲオルギアデス（Ｇｅｏｒｇｉ ａｄｅｓ　Ｊ、Ａ。

）、エム、ピー、ロングフォード（Ｌｏｎｇｆｏｒｄ　、　Ｍ。

ｐ、）及びエイチ、エム、ジョンソン（Ｊ　ｏｈｎｏｎ　Ｈ。

Ｍ、）（１９８０）　、セル　イミュノロジー（ＣｅｌｌＩｒ５ｍｕｎｏ１．　 ）　、４９．　３９０〜３９４３、エル、エイ、グラスボウ（Ｇｌａｓｇｏｗ　 Ｌ、Ａ、　）、ジエイ、エル、フレイン（Ｃｒａｎｅ　Ｊ、Ｌ、　）　、イー。

アール、ヤーン（Ｊｅｒｎ　Ｅ、　Ｒ，）及びジエイ、ニス。

ヤンガー（Ｙｏｕｎｇｅｒ　Ｊ、Ｓ、　）　（１９７８）　、キャンサー　トリ ート、レボ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔ、Ｒｅｐ、　）６２．１８８１〜１８８ ８ ４、ピー、ダブリュー、グレイ　（Ｇｒａｙ　Ｐ、　Ｗ、　）、ディー、タフリ ュー。ヤング（Ｙｅｕｎｇ　Ｄ、　Ｗ、　）、ディー、ペン二カ（Ｐｅｎｎｉｃ ａ　Ｄ、　）　、イー、イエルバートン（Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ　Ｅ、　）　、７ −ル、ナヤチアン（Ｎａｊａｔｉａｎ　Ｒ，）　、シー、シー、シＥンセン（Ｓ ｌｍｏｎｓｅｎ　Ｃ，Ｃ，）　、７−）Ｉｙ、　−７”）　ン’７（Ｄｅｒｙｎ ｃｋ　Ｒ，）　、ピー、ジエイ、シャーウッド（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ　Ｐ、Ｊ、　 ）　、ディー、エム、ウォーレス（Ｗａｌｌａｃｅ　Ｄ、　Ｍ、　）　、ニス、 　エル、　ヘルカ−（Ｂｅｒｇｅｒ　Ｓ、Ｌ、　）　、エイ、ディー、レヒン７ ／＞（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ　Ａ、　Ｄ、　）及びディー、’ｊビイ−ゲーデル（Ｇ ｏｅｄｄｅｌ　Ｄ、Ｖ、　）　（１９８２）　、ネイチャー５、エイ、アイザー クク（Ｉ　５ａａｃｓ　Ａ、　）及びジェイ。

リンデンマン（Ｌ　ｉｎｄｅｎｍａｎｎ　）、（１９７５）ブロク。

６、エム、ピー、キーニー（Ｋｉｅｎｙ　Ｍ、Ｐ、　）　、７−ル、ラテ（Ｌａ ｔｈｅ　Ｒ，）及びジェイ、ｔ：’−，ルコ”）り（Ｌｅｃｏｃｑ　Ｊ、　Ｐ、 　）　（１９８Ｂ）ジーン（Ｇｅ、ｎｅ）１６．９１〜９９ ７、工、ピー、キーニー（Ｋｉｅｎｙ　Ｍ、Ｐ、　）　、７−／Ｉ／。

ラテ（Ｌａｔｈｅ　Ｒ，）　、７−ル、ＦＩＪ　＋）工＞（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ　 Ｒ，）　、エイ、スペーナ−（Ｓ　ｐｅｈｎｅｒＡ、）１．＝ｒ−ス、スコーリ ー（Ｓｋｏｒｙ　Ｓ、　）　、ディー。

シュミット（Ｓｅｈｍｉｔｔ　Ｄ、　）　、ティー、ライクトール（Ｗｉｋｔｏ ｒ　Ｔ、　）　、エイチ、コ１ｏ’ｙスキ−（Ｋ　ｏｐｒｏｗｓｋｉ　Ｈ、）及 びジエイ、ビー６　ルコツク（Ｌｅｃｏｃｑ　Ｊ、Ｐ、）、（１９８４）ネイチ ャー（Ｎｅｔｕｒｅ）３１２，１６３〜１６６８、アール、ラテ（Ｌａｔｈｅ　 Ｒ，）　、エム、ビー、キーニー（Ｋｉｅｎｅｙ　Ｍ、Ｐ、　）　、１ス、　ス コーリ−（Ｓｋｏｒｙ　Ｓ、　）及びジエイ、ピー、ルコツク９、エム、ルスキ ー（Ｌｕｓｋｙ　Ｍ、　）及びエム、ボチャン（Ｂｏｔｃｈａｎ　Ｍ、　）　（ １９８１）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　２９３．　７９〜８１１０、エム、 マケット（Ｍａｅｋｅｔｔ　Ｍ、　）　、ジエイ、エル。

スミス（Ｓ＋ｎ１ｔｈ　Ｊ　Ｌ、　）及びビー、モス（ＭｏｓｓＢ、）（１９８ ２）　、プロシーディンゲス　オン　ナショナル　アカデミ−オン　サイエンス 　オン　ザユナイテツド　ステーブ　オン　アメリカ（Ｐｒｏｃ。

１１、ディー、パニカリ（Ｐａｎｉｃａｌｌｉ　Ｄ、　）及びイー。

パオレツテイ（Ｐａｏｌｅｔｔｉ　Ｅ、　）　（１９８２）　、プロシーディン ゲス　オン　ナショナル　アカデミ−オン　サイエンス　オン　ザ　ユナイテツ ド　ステーツオン　アメリカ（Ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ　、　Ｓ ｃｉ。

ＵＳＡ）７９．４９２７〜４９３１ １２、ディー、パニカリ（Ｐａｎｉｃａｌｌｉ　Ｄ、　）　、ニス、ダブリュー 、デイヴイス（Ｄａｖｉｓ　Ｓ、　Ｗ、　）　、アール。

エル、ワインバーブ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ　Ｒ，Ｌ、　）及びイー。

パオレツテイ（Ｐａｏｌｅｔｔｉ　Ｅ、　）　（１９８３）　、プロシーディン ゲス　オン　ナショナル　アカデミ−オン　サイエンス　オン　ザ　ユナイテッ ド　ステーツオン　アメリカ（Ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ　、　Ｓ ｃｉ。

ＵＳＡ）、８０．５３６４〜５３６８ １３、イー、リンダークネヒト（Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ　Ｅ、　）、ビー、 エイチ、オコナー（０′Ｃｏｎｎｏｒ　Ｂ、Ｈ，）及びエイチ、ロドリゲス（Ｒ ｏｄｒｉｇｕｅｚ　Ｈ，）　（１９８４）ジャーナル　オン　バイオロジカル　 ケミストリー１４、ビー、ニス、サルビン（Ｓａｌｖ４ｎ　Ｂ、Ｓ、　）　、エ イチ、ニシオ（Ｎｉｓｈｉｏ　Ｈ，）及びアール、メータ（Ｍｅｔａ　Ｒ，）（ １９７５）　、ジャーナル　オン　ナショナル　キャンサー　インステイテユー ト（Ｊ。

Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ　、　）　５５．　１２３３〜１２３１５、 ジー、エル、スミス（Ｓｍｉｔｈ　Ｇ、Ｌ、　）　、エム。

マケット（Ｍａｃｋｅｔｔ　Ｍ、　）及びブイ−。モス（Ｍｏｓｓ　Ｖ、）（１ ９８３）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）３０２．４９０〜４９５ １６、ジー、ゾンネンフエルト（Ｓｏｎｎｅｎｆｅｌｄ　Ｇ、　）　、エイ、デ ィー、マンデル（Ｍａｎｄｅｌ　Ａ、　Ｄ、　）及びティー、シー、メリガン（ Ｍｅｒｉｇａｎ　Ｔ、Ｃ，）　（１９７１７、イー、エム、サザーン（Ｓｏｕｔ ｈｅｒｎ　Ｅ、　Ｍ、　）　（１９７５）、ジャーナル　オン　モレキュラー　 バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｌｏｌ　、　）　９８．　５０３１８、ダ ブリュー、イー、ステユワー’ｐ　（Ｓｔｅｗａｒｔ　Ｗ。

Ｅ、）（１９７９）　、ザ　インターフェロン　システム（Ｔｈｅ　Ｉ　ｎｔｅ ｒｆｅｒｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　）　、シュプリンガーフエアラーク（Ｓ　ｐｒｉ ｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ　）　１．＝−ニーＥ　−り（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　） １９、ニス、ベンカテサン（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ　Ｓ、　）　、ビー。

エム、バルーディ（Ｂａｒｏｕｄｙ　Ｂ、　Ｍ、　）及びビー。

２０、ジエイ、ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ　Ｊ、　）及びジエイ、メリック（Ｍｅ ｓｓｉｎｇ　Ｊ、　）　（１９８２）ジーン（Ｇｅｎｅ）１９，２５９〜２６８ ２１、ジエイ、ピー、ウェア（Ｗｅｉｒ　Ｊ、Ｐ−）及びビー、モス（Ｍｅｓｓ 　、　Ｂ、　）　（１９８３）ジャーナル　オン　ビｏｏジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ 、）４６，５３０〜５３ＦＩＧ、７ （１）γＨ４ｎｄ　／　ＥｃｏマーカーＦＩＧ、８ ｍ−＾−”””ｌ’　ＰＣＴ／ＦＲ，８６１００２０７ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　’ｌ ’ＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣ！（Ｒ三ＦＯＲＴ　ＯＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ＩＦＮ−γをコードするＤＮＡ配列の全部又は一部を含有することを特徴と するポツクスウイルス。 ２　ワクシニアウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のポツ クスウイルス。 ３　ＩＦＮ−γをコードするＤＮＡ配列が完全な当該蛋白質をコードするＤＮＡ 配列であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載のウイルス。 ４　ＩＦＮ−γをコードするＤＮＡ配列がポツクスウイルス遺伝子プロモーター に依存していることを特徴とする請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のウイ ルス。 ５　プロモーターがワクニシア遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請 求の範囲第４項に記載のウイルス。 ６　ＩＦＮ−γをコードするＤＮＡ配列がワクニシアの７５Ｋ蛋白質をコードす る遺伝子のプロモーターの支配下にあることを特徴とする請求の範囲第５項に記 載のウイルス。 ７　ＩＦＮ−γをコードする配列がワクニシアのＴＫ遺伝子中にクローンされて いることを特徴とする請求の範囲第１〜６項に記載のウイルス。 ８　組換えウイルスｐＶＶＴＧ４１。 ９　請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載のウイルスに感染した哺乳動物細胞 。 １０　請求の範囲第９項に記載の細胞を培養し、生成蛋白質を回収することを特 徴とするＩＦＮ−γの調製法。 １１　請求の範囲第１０項の方法を実施して得られたＩＦＮ−γ。 １２　グリコシル化された成熟型のものであることを特徴とする、細胞培養物か ら得られたＩＦＮ−γ。 １３　請求の範囲第１１又は第１２項に記載のＩＦＮ−γを含有することを特徴 とする治療用組成物。 １４　請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載のウイルスを含有することを特徴 とする治療用組成物。 １５　接種できる形を取っていることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載の 組成物。