KR970000530B1 - 재조합 아비폭스비루스 - Google Patents

재조합 아비폭스비루스 Download PDF

Info

Publication number
KR970000530B1
KR970000530B1 KR1019880012033A KR880012033A KR970000530B1 KR 970000530 B1 KR970000530 B1 KR 970000530B1 KR 1019880012033 A KR1019880012033 A KR 1019880012033A KR 880012033 A KR880012033 A KR 880012033A KR 970000530 B1 KR970000530 B1 KR 970000530B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
dna
recombinant
fragment
pnz
Prior art date
Application number
KR1019880012033A
Other languages
English (en)
Other versions
KR890005269A (ko
Inventor
노보루 야나기다
사끼꼬 사에끼
료헤이 오가와
고우이찌 가모가와
요시유끼 하야시
가즈나리 사와구찌
Original Assignee
다끼사와 다께시
닛뽕제온 가부시끼가이샤
요시또시 가즈오
시오노기 세이야꾸 가부시끼가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다끼사와 다께시, 닛뽕제온 가부시끼가이샤, 요시또시 가즈오, 시오노기 세이야꾸 가부시끼가이샤 filed Critical 다끼사와 다께시
Publication of KR890005269A publication Critical patent/KR890005269A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR970000530B1 publication Critical patent/KR970000530B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

내용 없음.

Description

재조합 아비폭스비루스
제1도, 제2도 및 제3도는 재조합 아비폭스비루스의 제작과정을 나타낸다.
제4도는 NDV의 HN 유전자의 아미노산 서열 및 염기 서열을 나타낸다.
제5도는 아비폭스비루스의 증식에 비-필수적인 DNA 영역의 예를 나타낸다.
제6도는 증식에 비-필수적인 DNA 영역의 적어도 한 부분을 함유하는 플라스미드 벡터의 제작과정을 나타낸다. 제6도는 본 발명에 언급된 하이브리드 플라스미드(A)의 제작과정을 설명한다.
제7도는 하이브리드 플라스미드(B)의 제작과정을 설명한다.
제8도는 하이브리드 플라스미드(C)의 제작과정을 설명한다.
본 발명은 재조합 아비폭스비루스(Avipoxvirus)에 관한 것이고, 보다 상세히 설명하면 아비폭스비루스 증식에 비-필수적인 DNA 영역에 뉴우캣슬 병(Newcastle disease)-유래 cDNA를 삽입시킨 재조합 아비폭스비루스에 관한 것이다.
최근, 종두비루스에 뉴우캣슬병-유래 cDNA를 삽입한 재조합 종두비루스의 제작방법이 개발되었으며, 외래성 DNA, 예를 들면 생백신과 같은 감염성 질병을 코오딩하는 DNA를 사용하여 수득된 재조합 종두비루스의 이용방법이 제안되었다(예를 들면, 일본국 특허 공개 제129971/83호, 일본국 특허 공고 제500518/85호, 501957/86호 등), 이 방법에 따라 목적에 따라 각종 외래성 DNA를 삽입할 수 있으며, 이 방법은 생백신의 새로운 제조 방법으로 기대되고 있다.
그러나 종두비루스에서는 그의 숙주 범위가 제한되어 있다. 이런 이유때문에, 예를 들면 뉴우캣슬병 같은 병아리 질병에 대한 생백신의 제조를 위해 제조합 종두비루스 기술을 적용하는 것은 불가능하며, 조류의 생백신을 제조할 목적으로 제안된 방법은 종두비루스 대신에 포을폭스비루스(Fowlpoxvirus)에 외래성 DNA를 삽입하는 것이다(Avian Diseases, Vol. 30. No. 1, 24~27). 그러나, 종두비루스 및 포을폭스비루스를 비교하면, 이들은 서로 다른 속에 속한다. 즉 전자는 폭스비루스 속에 속하고, 후자는 아비폭스비루스에 속한다. 더욱이, 전자는 약 180kb의 게놈 길이를 갖고, 후자는 260~270kb의 게놈 길이를 갖기 때문에 게놈의 길이가 약 1.5배 차이난다. 더욱이, 종두비루스에 있어서는 그의 게놈 DNA 구조가 현저할 정도로 설명되어 있으나, 포을폭스비루스는 단지 게놈 DNA의 제한효소 절단 패턴만이 알려져 있으며(J. Gen. Virol., 38, 135~147(1977)), 게놈 DNA의 기능에 대해서는 티미딘 키나 제유전자의 존재만이 판명되어 있다[J. Gen. Virol., 67, 1591~1600(1986)].
따라서, 재조합 종두비루스를 형성하는 상술한 방법을 아비폭스비루스에 적용하는 것은 많은 난점이 있다. 이러한 이유때문에, 최근에 뉴우캣슬병 비루스의 혈구응집소 뉴우라미니다제(hemagglutinin neuraminidase, HN) 및/또는 F 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA가 발견되었다[예를 들면, J. Gen. Virol., 67, 1917~1927(1986). 일본국 특허 공개 제163693/87호). 그러나, 이러한 cDNA가 삽입되어 있는 재조합 아비폭스비루스는 아직 얻어지지 않았다.
그래서 본 발명자들은 종래 기술하에서 뉴우캣슬병 비루스(이후에는 때때로 NDV로 표기한다)에서 유래된 항원을 코딩하는 cDNA가 게놈 DNA 중에 삽입되어 있는 증식 가능한 재조합 아비폭스비루스의 제작을 목적으로 하여 광범위하게 연구하였다. 그 결과로서, 본 발명자들은 NDV cDNA로부터 혈구응집소 뉴우라미니다제(이후에는 때때로 HN으로 표기한다)-코딩 영역을 선택하고 그 영역을 아비폭스비루스의 증식에 비-필수적인 게놈 영역에 삽입함으로써 증식 가능한 재조합 아비폭스비루스를 얻을 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
그러므로, 본 발명에 따르면, NDV-유래항원을 코딩하는 cDNA가 아비폭스비루스의 증식에 비-필수적인 게놈 영역에, 바람직하게는 프로모터 기능을 갖는 NDA와 함께 발현가능한 형태로 삽입되어 있는 재조합 아비폭스비루스가 제공된다.
본 발명에서 NDV-유래 cDNA를 삽입하기 위해 사용되는 비루스로는 바이폭스비루스속으로 분류되는 한 어떤 비루스도 사용될 수 있으며, 닭, 칠면조, 오리 등과 같은 가금의 세포에서 성장할 수 있는 것이 바람직하다. 특정예로는 ATCC VR-251, ATCC VR-250, ATCC VR-229, ATCC VR-249, ATCC VR-228, 니시가와라 주, 시스이 주 등과 같은 포을폭스비루스; 및 NP 주(병아리 태아에 상주하는 도브폭수비루스 나까노주)와 같은 종류의 생백신주에 사용되며 포을폭스비루스와 유사한 것 등이 있다. 이들 균주는 모두 시판되고 있으며 용이하게 입수할 수 있다.
덧붙여, NDV-유래 HN을 코딩하는 cDNA는 예를 들면 NDV의 D-26 주 또는 뷰데트(Beaudette)C 주를 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 D-26 주로부터 제조한 cDNA는 112번째부터 1857번째까지의 1746염기쌍으로 이루어진 것과 112번째에서 1959번째까지의 1848 염기쌍으로 이루어진 것의 두가지 종류를 포함한다(염기 서열은 제4도에 나타나 있음). 두 cDNA 사이의 차이는 제4도의 1747번째 염기(제4도에서 *로 표시한 염기)에 있는데, 긴 cDNA의 경우에는 도면에 나타나 있는 대로 그 염기가 C인 반면에 짧은 cDNA의 경우에는 T로 치환되어 있어 번역 종결 코돈(TAA)을 이룬다. 참고로, 실시예에서 이용된 cDNA는 짧은 것이다.
또한 뷰데트 C 주에서부터 제조한 cDNA는 1731 염기쌍으로 이루어져 있으며[N. Miller, J. Gen. Virol., 67, 1917~1927(1986). D-26 주에서 제조된 짧은 cDNA와는 170개소에서 염기 서열이 다른 구조를 갖는다.
이와 같이 NDV-종래 HN 유전자를 코딩하는 cDNA의 염기 서열은 반드시 동일한 것일 필요는 없으며 본 발명에서는 cDNA는 상술한 3종류의 cDNA와 실질적으로 동일한 기능을 갖는 범위내에서 변형된 것(즉, 염기 서열이 치환, 삽입 또는 결손된 cDNA)일 수 있다. 물론 이들이 실질적으로 동일한 기능을 갖는 한, 아미노산 서열이 다른 정도까지 변형될 수도 있다.
본 발명을 실시하는데 있어서는, 아비폭스비루스의 성장에 비-필수적인 DNA 영역이 삽입되어 있는 제1재조합 벡터를 먼저 제작한다. 바람직한 것은 동일한 영역내에 아비폭스비루스에서 작용하는 프로모터를 함유하는 재조합 벡터이다.
성장에 비-필수적인 DNA 영역의 특별한 예에는 EcoRI-HindIII 단편(약 5.0kbp), BamHI 단편(약 4.0kbp), EcoRV-HindIII 단편(약 1.8kbp), BamHI 단편(약 3.3kbp), HindIII 단편(약 5.2kbp) 등에 의해 상동 재조합을 유발할 수 있는 영역이 포함된다.
이러한 성장에 비-필수적인 DNA 영역은 예를 들면 다음 방법에 의해 고정시킬 수 있다. 우선, 아비폭스비루스 게놈의 임의의 DNA 단편이 삽입되어 있는 하이브리드 플라스미드(A) 및 프로모터의 통제하에 쉽게 검출될 수 있는 효소를 코딩하는 연결 DNA를 갖는 하이브리드 플라스미드(B)를 제조한다. 다음에, 프로모터 및 효소를 코딩하는 DNA를 전부 함유하는 DNA 단편을 하이브리드 플라스미드(B)로부터 제조한다. DNA 단편을 하이브리드 플라스미드(B)로부터 제조한다. DNA 단편을 하이브리드 플라스미드(A)의 비루스 DNA 부분에 삽입함으로써 하이브리드 플라스미드(C)를 제조한다. 그후에, 아비폭스비루스로 미리 감염시킨 숙주 세포에 하이브리드 플라스미드(C)를 트랜스팩션시켜 재조합 아비폭스비루스의 형성의 유무를 확인한다.
상술한 일련의 방법에 의해 재조합 아비폭스비루스가 제작되었는가를 검사하기 위한 선택은 공지 방법으로 행할 수 있다. 예를 들면, β-갈락토시다제 유전자를 효소-코딩 DNA로 사용한 경우에는, 재조합 아비폭스비루스의 플라크 형성용 배지에 플라크가 확인된 후에 클로로페놀 레드-β-D-갈락토피라노시드(CPRG)를 함유하는 아가로스 배지를 적층하고; 37℃에서의 배양에 의해 빨간색으로 염색된 플라크를 선택한다.
이렇게 선택방법으로서 효소 활성 검출을 이용하여 재조합 아비폭스비루스가 얻어지는 경우에는, 하이브리드 플라스미드(A)의 제작에 이용된 아비폭스비루스-유래 DNA단편이 성장에 비-필수적인 DNA 영역임을 시사한다.
본 발명에서 사용된 프로모터 기능을 갖는 DNA는 합성 또는 천연 DNA를 불문하고 아비폭스비루스가 보유하는 전사계에서 프로모터로서 효과적으로 작용하는 것이면 어떠한 염기 서열을 갖는 DNA이어도 무방하다. 말할 필요도 없이 티미딘 키나제를 코딩하는 아비폭스비루스 유전자의 프로모터 같은 아비폭스비루스에 고유한 프로모터를 사용할 수 있으며, 아비폭스비루스 이외의 비루스에서 유래된 DNA 또는 진핵 또는 원핵 생물계에서 유래된 DNA도 상술한 조건을 만족시키는 것이면 당연히 본 발명에서 이용할 수 있다.
이들 프로모터의 구체예에는 문헌[Journal of Virology, September 1984, 662~669]에 기재된 종두비루스의 프로모터, 특히 7.5K 폴리펩티드를 코딩하는 종두비루스의 프로모터, 19K 폴리펩티드를 코딩하는 종두비루스의 프로모터, 42K 폴리펩티드를 코딩하는 종두비루스의 프로모터, 티미딘 키나제 폴리펩티드를 코딩하는 종두비루스의 프로모터, 28K 폴리펩티드를 코딩하는 종두비루스의 프로모터 등이 포함된다. 프로모터는 그 기능을 보유하는 한 완전히 또는 부분적으로 변형될 수 있다.
제1재조합 벡터는 공지 방법으로 제작할 수 있다. 예를 들면, 아비폭스비루스의 성장에 비-필수적인 DNA 단편을 적절한 백터에 삽입한 후에, 필요에 따라 단편내에 존재하는 제한효소 절단 부위를 이용하여 상기 DNA의 하류에 제한효소 절단 서열을 부가한 프로모터를 삽입할 수 있다.
여기에서 사용되는 벡터의 구체예에는 pBR 322, pBR 325, pBR 327, pBR 328, pUC7, pUC 8, pUC 9, pUC 19 등 같은 플라스미드; λ 파지, M 13 파지같은 파지; pHC 79(Gene. 11, 291, 1980)같은 코스미드등이 포함된다.
본 발명에 있어서, 제2재조합 백터는 제1재조합 벡터의 프로모터의 하류에 NDV HN-코딩 영역을 삽입하여 제작한다. 삽입은 통상의 방법으로 행할 수 있다. 예를 들면, 미리 제1벡터의 프로모터의 하류에 제공된 제한효소 절단 부위를 이용하여 NDV-유래 cDNA 단편을 삽입할 수 있다.
이들 제1 및 제2재조합 벡터를 제작하는데 있어서, 유전자 조작이 용이한 에스케리키아 콜리게를 이용할 수 있다. 사용되는 프라스미드 벡터는 목적에 적절하기만 하다면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서는, 미리 아비폭스비루스로 감염시킨 동물 배양 세포에 제2재조합 벡터를 트랜스팩션시켜 벡터 DAN와 비루스 게놈 DNA 사이에 상동 재조합을 유발시켜 재조합 아비폭스비루스를 제작한다. 여기에서 사용되는 동물 배양 세포는 아비폭스비루스가 자랄 수 있는 것이면 어느 세포이어도 무방하다. 구체예는 병아리 태아 섬유 아세포 같은 병아리-유래 배양 세포이다. 덧붙여, 병아리 융모요막도 또한 숙주세포의 범주에 속한다.
재조합 아비폭스비루스의 제작은 상법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면 문헌 [D.M. Glover, DNA Cloning, volume Ⅱ, a practical approach, pp 191~211, IRL Press, Oxford, Washington]에 기술된 방법에 따라, 인산칼슘 침전법에 의해 처리한 제2재조합 벡터를 아비폭스비루스로 감염시킨 숙주세포내에 트랜스팩션시킨다. 이렇게 얻어진 재조합 비루스를 함유하는 비루스 집단을 이글 MEM 배지상에서 배양한 숙주세포에 감염시킨다. 배지에서 자란 플라크는 재조합 비루스 후보 균주가 될 수 있다. 이들 후보 균주로부터 NDH HN을 코딩하는 DNA 단편이 삽입되어 있는 비루스를 선택하기 위해, DNA를 탐침으로 사용하는 하이브리드화법에 의해 후보 균주를 정제한 후, NDV 항체를 이용하는 면역분석을 이용할 수 있다.
그러므로 본 발명에 따르면 가금용 생백신으로 사용할 수 있고, 프로모터 기능을 갖는 DNA와 함께 아비폭스비루스의 증식에 비-필수적인 게놈 영역내에 NDV-유래 항원-코딩 cDNA가 발현 가능한 형태로 삽입되어 있는 재조합 아비폭스비루스가 제공된다.
본 발명은 하기 실시예 및 참고예에서 보다 상세히 설명될 것이다.
참고예 1
비-필수 DNA 영역의 등정
(1) 아비폭스비루스 게놈 DNA의 제작:
75㎠ 배양 플라스크에서 배양된 병아리 태아 섬유 아세포에 아비폭스비루스 NP 주(Japan Pharmacy Co. 제품, 병아리 태아 상주 도브폭스비루스 나까노 주)를 1p.f.u./세포로 접종시킨다. 37℃, 5% CO2의 배양기에서 2시간동안 배양한 후, 10% 트립토스포스페이트 브로쓰(Difco DO., Ltd. 제품) 및 0.03% L-글루타민이 보충된 15㎖의 이글 MEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2의 배양기에서 4일동안 배양한다. 배양 상층액을 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 회수한다. 배양 상층액을 25000rpm(약 98000×g)에서 1시간동안 원심분리하고 침전물을 회수한다. 침전물을 배양 상층액의 1/10부피의 DNase 반응 완층액(50mM 트리스, pH7.5, 1mM MgCl2)에 현탁시키고, 이 현택액에 9㎍/㎖의 DNase I(Boehringer Mannheim Co., Ltd. 제품)를 가한 후, 37℃에서 30분간 반응시킨다. 반응 후, 25mM DETA ㆍ2Na를 가하고, 혼합물을 실온에서 30분간 방치한다. 그후 500㎍/㎖의 프로테이나제 K(Boehringer Mannheim Co., Ltd. 제품) 및 소듐도데실설페이트(SDS)를 1% 농도로 혼합물에 가하고, 37℃에서 밤새 반응시킨다. 페놀-클로로포름으로 처리한 후, 반응 혼합물을 에탄올로 침전시켜 0.5㎍의 비루스 DNA를 수득한다.
(2) 아비폭스비루스 게놈 단편을 함유하는 하이브리드 플라스미드(A)의 제작(제6도 참고)
(a) 아비폭스비루스 NP 주 DNA의 약 5.0Kb EcoRI-HindIII 단편을 함유하는 플라스미드(pNZ 180)의 제작 :
2㎍의 pUC 18(Pharmacia Inc. 제품)를 EcoRI 및 HindIII으로 분해한 후, 페놀-클로로포름(1 : 1)로 추출하여 에탄올 침전에 의해 절단된 pUC 18을 회수한다. 알칼리 포스파타제로 처리함으로써 5'-말단 포스페이트를 제거한다. 페놀-클로로포름으로 다시 추출한 후, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수한다. 절단된 pUC 18 0.2g 및 정제된 아비폭스비루스(NP 주) DNA의 EcoRI 및 HindIII 분해 생성물 1㎍을 서로 연결시킨다. 적합 이. 콜리(competent E. coli) JM 103을 형질전환시키고, 0.003%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드, 0.03mM의 이소프로필-β-D-갈락토피라노시드 및 40㎍/㎖의 암피실린이 보충된 LB 한천 배지에서 37℃로 15시간동안 배양한다. 한천 배지에서 성장된 형질전환 이. 콜리의 백색 콜로니를 40㎍/㎖의 암피실린이 가해진 LB 액체 배지에서 37℃로 15시간동안 배양하고, 비른보임 및 돌리의 방법[Nucleic Acid Research, 7, 1513 (1979)]에 의해 플라스미드를 추출한다. EcoRI 및 HindIII으로 분해한 후, 고유의 아비폭스비루스 DNA EcoRI - HindIII 단편과 같은 길이의 단편을 갖는 하이브리드 플라스미드를 0.6% 아가로스 전기영동에 의해 검출하고, pNZ 180이라고 명명한다. 약 5.0Kb EcoRI-HindIII 단편의 제한효소 지도는 제5(a)도에 나타낸다. pNZ 180은 하이브리드 플라스미드(A)에 해당된다.
(b) 아비폭스비루스 NP 주의 약 4.0Kb EcoRI-HindII 단편을 함유하는 플라스미드(pNZ 160)의 제작 :
(a)에서 사용된 벡터 pUC 18을 pUC 9로 변화시키고, EcoRI-HindIII 단편 대신에 NP 주 DNA의 약 4.0Kb BamHI 단편을 사용하는 것을 제외하고는 (a)와 유사한 방법으로 하이브리드 플라스미드를 수득한다. 이 하이브리드 플라스미드는 pNZ 160으로 명명한다. EcoRI-HindIII 단편 EcoRI-HindIII 단편약 5.0Kb EcoRI-HindIII약 4.0Kb BamHI 단편의 제한효소 지도는 제5(b)도에 나타내며, pNZ 160은 하이브리드 플라스미드 (A)에 해당된다.
(c) 아비폭스비루스 NP 주의 약 1.8Kb EcoRI-HindII 단편을 함유하는 플라스미드(pNZ 160S)의 제작 :
(a)에서 사용된 약 5.0Kb EcoRI-HindIII 단편 대신에 NP 주 DNA의 약 7.3Kb EcoRI 단편을 사용하는 것을 제외하고는 (a)와 유사한 방법으로 하이브리드 플라스미드를 수득한다. 이 하이브리드 플라스미드는 pNZ 136으로 명명한다. pNZ 136을 HindⅢ로 소화한 후에, 소화 생성물을 EcoRV로 부분 소화시킨다. 부분 소화 생성물을 0.8% 아가로스 전기영동하여 서로 인접한 약 0.6Kb EcoRV-EcoRV단편 및 약 1.2Kb EcoRV-HindⅢ단편으로 이루어진 약 1.8Kb EcoRV-HindⅢ단편을 회수한다.
한편, pUC 18을 HindIII 및 EcoRI으로 소화한 후에, 페놀 : 클로로포름(1:1)으로 추출하고, 추출액을 에탄올로 침전시켜 절단 pUC 18을 회수한다. 절단된 pUC 18 및 아가로스 겔에서 회수한 약 1.8Kb EcoRV-HindIII 단편을 DNA 폴리머라제를 이용하여 블런트 말단으로 만든 후 리가제를 이용하여 연결시킨다. 적합 이. 콜리 JM 103을 형질전환시키고 형질전환제를 암피실린-보충 LB 한천 배지상에서 선택하여 약 1.8Kb EcoRV-HindⅢ단편을 함유하는 플라스미드를 얻는다. 이 플라스미드를 pNZ 136S로 명명한다.
약 1.8Kb EcoRV-HindⅢ 단편의 제한효소 지도를 제5(e)도에 나타냈는데, pNZ 136S는 하이브리드 플라스미드(A)에 해당된다.
(3) 프로모터 및 그의 통제하에 쉽게 검출 가능한 효소를 코딩하는 DNA와 연결된 제2플라스미드(B)(pNZ 76)의 제작(제7도 참고)
종두비루스 WR 주의 7.5K 달톤 펩티드를 코딩하는 DNA의 프로모터를 함유하는 0.26kbp의 SalI-RsaI 단편[cell, 125, 805~813 (1981)]을 pUC 9의 SalI-SmaI 부분에 삽입시킨 플라스미드를 pUWP-1로 명명한다.
10㎍의 pMA 011[Shirakawa et al., Gene, 28, 127 (1984)]을 BamHI으로 소화시킨 후, (2)와 비슷한 방법으로 β-갈락토시다제 유전자(약 3.3kbp)를 회수한다. 한편, pUC 19 0.3㎍을 BamHI으로 소화시킨 후, 페놀-클로로포름으로 추출하고 에찬올로 침전시켜 회수한다. 상술한대로 제조한 β-갈락토시다제 유전자와 연결시켜 하이브리드 플라스미드 pNZ 66을 제작한다.
한편, 40㎍의 pUWP-1을 HpaII 및 EcoRI으로 소화시키고, 7.5K 프로모터를 함유하는 약 0.26kbp의 단편을 1.5% 저융점 아가로스 전기영동(70볼트, 6시간)에 의해 분리하고, (2)와 동일한 조작에 의해 DNA를 회수한다. 이 DNA 단편의 점착 말단을 DNA 폴리머라제에 의해 블런트 말단으로 만든다. 0.3㎍의 pNZ 66을 HincII로 소화시킨 후, 페놀-클로로포름으로 추출하고 에탄올 침전에 의해 회수한다. 상술한 약 0.26kbp의 7.5K 프로모터와 연결시킴으로써 하이브리드 플라스미드를 얻고 pNZ 76으로 명명한다. pNZ 76은 하이브리드 플라스미드(B)에 해당된다.
(4) 하이브리드 플라스미드 (A) 및 하이브리드 플라스미드(B)로부터 하이브리드 플라스미드(C)의 제작(제8도 참고)
(a) pNZ 180의 EcoRV 부위에 종두비루스 7.5K 프로모터 및β-갈락토시다제 DNA의 연결 단편이 삽입된 하이브리드 플라스미드(pNZ 1003)의 제작 :
10㎍의 pNZ 76을 HindⅢ 및 SmaI으로 분해한 후, 약 3.6kbp의 단편을 0.7% 저융점 아가로스 전기영동(40볼트, 20시간)에 의해 분리한다. 에티듐 브로마이드로 염색함으로써 DNA 단편을 확인하고, 겔을 절단하여 페놀로 처리한 후, 에탄올 침전시켜 DNA 단편을 회수한다.
한편, 1㎍의 pNZ 180을 EcoRV로 분해하고, 페놀-클로로포름으로 추출한 후, 에탄올 침전시켜 이를 회수한다. 절단된 pNZ 180 DNA 0.3㎍을 약 0.4㎍의 상술한 약 3.6kbp 단편(7.5K 프로모터 DNA와 β-갈락토시다제 유전자의 연결단편)과 혼합하고, 점착 말단을 DNA 폴리머라제에 의해 블런트 말단으로 만든다. 페놀-클로로포름으로 추출한 후, DNA를 회수한다. 회수된 DNA를 리가제로 연결시킨다. 적합 이. 콜리 JM 103균주를 형질전환시키고, 40㎍/㎖의 암피실린을 보충한 LB 한천 배지에서 37℃로 15시간 동안 성장시킨다. 실시예 (2)와 유사한 방법으로 성장된 이. 콜리로부터 플라스미드를 회수하고, BamHI으로 분해한다. β-갈락토시다제 유전자 단편 (약 3.3kbp)을 함유하는 하이브리드 플라스미드를 0.5% 아가로스 전기영동에 의해 선택하고, pNZ 1003으로 명명한다.
(b) pNZ 160의 XbaI 부위에 종두비루스 7.5K 프로모터 및 β-갈락토시다제 DNA의 연결 단편이 삽입된 하이브리드 플라스미드(pNZ 1004)의 제작 :
(a)에 사용된 pNZ 180 및 제한 효소 EcoRV를 pNZ 160 및 XbaI으로 각각 대치하는 것을 제외하고는 (a)와 유사한 방법으로 β-갈락토시다제 유전자 단편 (약 3.3kbp)을 함유한 하이브리드 플라스미드를 선택한다. 이 하이브리드 플라스미드는 pNZ 1004으로 명명한다.
(c) pNZ 136S의 EcoRV 부위에 종두비루스 7.5K 프로모터 및 β-갈락토시다제 DNA의 연결 단편이 삽입된 하이브리드 플라스미드(pNZ 1137)의 제작 :
pNZ 136S를 EcoRV로 소화시킨 후, 리가제를 이용하여 EcoRI 링커(Takara Shuzo Co., Ltd. 제품)를 소화 생성물에 연결시킨다. 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수한다. 회수한 DNA를 비슷하게 EcoRI 및 XbaI으로 소화시킨 후, 1.5% 아가로스 겔에서 약 0.2kbp EcoRI-XbaI 단편을 회수한다. pNZ 136S를 EcoRV로 소화시킨 후, HindⅢ링커(Takara Shuzo Co., Ltd. 제품)를 리가제를 이용하여 소화 생성물에 연결시킨다. 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수한다. 회수한 DNA를 소화 생성 및 XbaI으로 소화시킨 후, 0.8% 아가로스 겔로부터 약 4.3kbp HindⅢ-XbaI 단편을 회수한다. pUC 18을 HindⅢ 및 EcoRI으로 더 소화시킨 후, 2.0% 아가로스겔에서 51bp 단편의 폴리링커 일부를 회수한다. 이렇게 얻어진 약 0.2kb EcoRI-XbaI 단편, 약 4.3kbp HindⅢ-XbaI 단편 및 51bp HindⅢ-EcoRI 단편을 리가제에 의해 서로 연결시킨다. 플라스미드를 실시예 1(4)와 비슷한 방법으로 추출한다. 3 단편이 연결되어 있는 폴라스미드를 검출하고 pNZ 136SL로 명명한다.
한편, pNZ 76을 HindⅢ 및 Smal으로 소화시킨 후, 약 3.6Kb 단편을 (2) 와 유사한 방법으로 회수한다. 상승한 pNZ 136SL을 HindⅢ 및 Smal으로 소화시킨다. 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 회수한다. 두개를 리가제에 의해 서로 연결시키고 적합 이. 콜리 JM 103 주를 형질전환시킨다. 이어서, (2)와 비슷한 방법으로 하이브리드 플라스미드를 선택하고 이것을 pNZ 1137로 명명한다.
(5) 제조합 아비폭스비루스의 제작
25㎠ 배양 플라스크에서 배양된 병아리 태아 섬유 아세포에 아비폭스비루스 NP 주를 0.05p.f.u./세포로 접종시킨다. (4)에서 수득된 하이브리드 플라미스드 50㎍을 2.2㎖의 멸균수에 용해시키고, 1% HEPES(GIBCO CO. ltd.제품) 및 0.6% 염화나트륨의 혼합물 2.5㎖ 및 70mM 인산수소 2 나트륨 12수화물, 70mM 인산수소 2 나트륨 2 수화물을 동량 혼합함으로써 수득된 완충용액 50㎕를 가하여 수용액을 제조한다. 이 수용액을 15㎖ 튜브(Falcon Co. ltd. 제품)에 옮기고, 교반기로 교반하면서, 300㎕의 2M 염화칼슘 수용액을 적가하여 DNA-인산칼슘 공동 침전물을 형성한다. 비루스 접종 후 45분 되었을 때, 감연된 병아리 태아 섬유 아세포에 0.5㎖의 공동 침전물을 적가한다. 37C, 5% CO2의 배양기에서 30분간 정치한 후, 5% 송아지 태아혈청, 0.03% L-글루타민 및 10% 트립토스 포스페이트 브로쏘가 보충된 이글 MEM 배지 4.5㎖를 가한다. 3시간 후, 배양 상층액을 교환하고 37C, 5% CO2의 배양기에서 3일간 배양한다. 배양 세포를 포함한 계를 3번 동결 및 해동시켜 재조합체를 함유하는 비루스의 용액을 수득한다.
(6) 클로로페놀레드-β-D-갈락토피라노시드에 의한 제조합체의 선택
(5)에서 수득된 비루스 용액을 10㎝ 페크리디시에서 배양된 병아리 태아 섬유 아세포에 접종시킨다. 2시간 후, 0.8% 박토 한천(Difco Co., ltd. 제품), 5% 송아지 태아 혈청, 0.03% L-글루타민 및 10% 트립토스 포스페이트 브로쓰가 보충된 페놀레드가 없는 이글 MEM 배지 10㎖를 적층하고, 37C, 5% CO2의 배양기에서 3일동안 배양한다. 배지위에 0.8% 박토 한천, 0.03% L-글루타민, 10% 트립토스 포스페이트 브로쏘 및 0.03% 클로로페놀레드-β-D-갈락토피라노시드(Boehringer Mannheim)으로 보충된 페놀레드가 없는 이글 MEM 배지10㎖를 적충하고, 37oC, 5% CO2의 배양기에서 6시간 동안 배양한다. 재조합 비루스는 β-갈락토시다제를 형질 발현하며, 클로로페놀레드-β-갈락토피라노시드가 적색으로 변하여 제조합체 플라크 주변의 한천 및 세포가 적색으로 변하므로, 비-재조합체와 쉽게 구별될 수 있다. 이 적색 플라크로부터 생성된 재조합체를 멸균 파스퇴리 피펫으로 구분한다. 각 재조합체는 표 1에 나타낸 바와 같이 명명한다.
Figure kpo00001
(7) 재조합 아비폭스비루스의 게놈 DNA의 분석
(6)에서 얻은 각 아비폭스비루스를 플라크 정제한 후에, 아비폭스비루스를 10㎝ 페트리디시에서 배양된 병아리 태아 섬유 아세포에 1p.f.u/세포로 접종한다. (1)과 유사한 방법으로 비루스 DNA를 분리한다. 2㎍의 각 재조합 비류스 DNA를 BamHI 또는 HindⅢ으로 분해하고, 단편을 0.5% 아가로스 전기영동(25볼트, 20시간)에 의해 분리한다. DNA를 서던 방법[Southern's method, Journal of Molecular Biology, 98, 503 (1975)]에 의해 나일론 막에 옮기고, DNA를 80℃에서 강압하 나일론 막에 고정시킨다. 4배 SET-[0.6M NaCl, 0.08M 트리스 HCl(pH 7.8), 4mM EDTA]-10배 덴하르트-0.1% SDS로 68℃에서 2시간동안 처리한 후, 니크번역에 의해 p로 표지된 β-갈락토시다제를 4배 SET-10배 덴하르트-0.1% SDS-변형 연어정자 DNA와 68℃에서 14시간동안 하이브리드화시칸다. 세척 및 건조 후 나일론 막을 X선 필름에 포개어 오토라이도그래피 함으로써 밴드의 존재를 확인한다. 이를 재조합 비루스가 일정한 장소에서 β-갈락토시다제 유전자를 함유한다는 것이 확인된다.
(8) 비-필수 DNA 영역의 동정
상기 결과로부터, pNZ 180의 제작에 사용된 EcoRI-HindⅢ 단편(약 5.0 kbp), pNZ 160의 제작에 사용된 BamHI 단편(약 4.0kbp) 및 EcoRV-HindⅢ 단편(약 1.8kbp)이 비루스의 중식에 비-필수적인 영역이라는 것이 이해될 것이다.
상기와 동일한 방법으로 NP 주의 DNA의 BamHI 단편(약 3.3kbp) 및 HindⅢ 단편(약 5.2kbp)도 비루스의 중식에 비-필수적인 영역이라는 것을 확인하였다. 이들 단편의 제한효소 지도는 제5도에 나타낸다.
덧붙여 (4)에서 제작한 하이브리드 플라스미드 pNZ 1003, pNZ 1004 및 pNZ 1137은 모두 아비폭스비루스의 성장에 비-필수적인 DNA영역을 함유하며, 따라서 본 발명에서 벡터로 이용될 수 있다.
실시예 1
NDV의 HN 유전자 DNA를 함유하는 제2재조합 벡터(pNZ 2003)의 제작(제1도 참고).
(1) 아답터를 함유하는 하이브리드 피지(mp10-mpa)의 제작
0.1㎍의 M13-mp10 RF DNA(Amersham Co., Ltd. 제품)를 BamHI 및 xbaI으로 소화시킨 후 소화 생성물을 페놀-클로로포름(1:1)으로 추출한다. 에탄올 침전에 의해, 절단된 M13-mp10 RF DNA를 회수한다.
한편, 후술한 염기서열을 갖는 40bp 올리고데옥시리보누클레오티드로 이루어진 아답터를 Genet AⅢ(Nippon Zeon Co., Ltd. 제품)을 이용하여 화학적으로 합성한다. 이 아답터를 절단된 M13-mp10 RF DNA와 혼합하고, 리가제에 의해 연결시키고 공지방법(Methods in Enzymology, vol. 10)에 따라 적합 이. 콜리 TG-1 주에 형질 도입시킨다. 0.003% 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드 및 0.03mM 이소프로필-β-D-갈락토피라노시드를 보충한 2×XY 한천 배지에서 37℃에서 12시간 동안 배양한다. 형성된 플라크 중에서, 백색 플라크로부터 파지 RF DNA를 회수한다. 이 DNA를 BalII로 절단한다. 0.8% 아가로스겔 전기영동에 의해, 아답터 DNA가 삽입되어 있는 하이브리드 파지를 선택하고 mp10-mpa로 명명한다.
Figure kpo00002
(2) NDV의 HN 유전자 DNA의 AvaII(약 1.15kbp) 단편을 함유하는 하이브리드 파지(mp10-HN 115)의 제작
NDV HN 유전자를 함유하는 플라스미드 XLIII-10H[참고, Virus Research, 7, 241~255(1987)]를 동경대학교 양학부, 가와끼따 마사오 조교수로부터 입수한다. 이 플라스미드의 염기 서열을 M13 파지를 이용하는 디데옥시법에 의해 분석하고 공지의 HN 유전자의 염기 서열[J. Gen. Virol., 67, 1917~1927 (1986)]과 대비함으로써 HN유전자의 cDNA가 제4도에 나타낸 112번째에서 1857번째까지의 1746 염기쌍임을 해명한다. 이러한 해명은 가와끼따 조교수에 의해 행해졌다.
이렇게 해서 얻은 cDNA가 코딩하는 아마노산은 뷰데트주[N. Miller, J. Gen. Virol., 67, 1917~1927 (1986)] 및 B, 주[E. Jorgensen, Virology, 156, 12~24(1987)]의 HN의 아미노산과 90% 이상의 상등성을 갖는다.
플라스미드 XLIII-10H 4㎍을 AvaII로 소화시킨 후에, 소화 생성물을 1.5% 아가로스겔 전기영동시킨다. 약 1.15kbp DNA 단편을 아가로스겔로부터 추출하고 에탄올을 이용하여 침전시켜 HN 유전자 DNA의 AvaII 단편을 회수한다.
(1)에서 제작한 하이브리드 파지 mp10-mpa RF DNA를 Kpnl으로 소화한 후에, 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 행하여 절단된 mp10-mpa를 회수한다.
절단된 mp10-mpa RF DNA 0.1㎍을 상술한 HN 유전자 DNA의 AvaII 단편(약 1.15kbp)약 0.2㎍과 혼합하고, DNA 플리머라제에 의해 점착 말단을 블런트 말단으로 만든다. 페놀-클로로포름으로 추출한 후에, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수한다. 회수된 DNA를 리가제에 의해 연결시키고 적합 이. 콜리 TG-1 주내에 형질도입시키고, 이것을 2×YT 한천 배지에서 37℃에서 12시간동안 성장시킨다. 형성된 플라크로부터 파지 RF DNA를 회수한다. Xbal 및 XhoI으로 절단한 후에, HN 유전자 DNA의 AvaII 단편(약 1.15kbp)을 함유하는 하이브리드 파지를 0.8% 아가로스 전기영동에 의해 선택한다. 하이브리드 파지를 mp10-HN 115 RF로 명명한다.
(3) NDV의 HN 유전자 DNA를 함유하는 하이브리드 파지(mp10-HN 180)의 제작
플라스미드 XLIII-10H 4㎍을 AatII 및 XhoI으로 소화한 후에, (2)와 비슷한 방법으로 HN 유전자 DNA의 약 1.4kbp AatII-XhoI 단편을 회수한다.
한편, 하이브리드 파지 mp10-HN 115 RF DNA를 AatII 및 XhoI으로 소화시킨 후, 소화 생성물을 0.6% 아가로스 전기영동하여 mp10-HN 115의 AatII-XhoI 단편(약 7.7kbp)을 회수한다.
HN 유전자의 AatII-XhoI 단편(약 7.7kbp)을 리가제에 의해 mp10-HN 115의 AatII-XhoI 단편(약 1.4kbp)과 연결시키고 (2)와 비슷한 조작에 의해 파지 RF DNA를 회수한다. 파지 RF DNA를 Xhol 및 BaIII로 절단하고, 약 1.8kbp HN 유전자 DNA 단편을 함유하는 하이브리드 파지 RF DNA를 0.8% 아가로스 전기영동에 의해 선택하고, 이를 mp10-HN 180 RF로 명명한다.
(4) 제1재조합 벡터 pNZ 1003 및 하이브리드 파지 mp10-HN 180 RF DNA로부터의 제2재조합 벡토(pNZ 2003)의 제작
참고예 1(4)에서 제작한 제1재조합 벡터 pNZ 1003을 BamHI으로 부분 소화시키고, 생성물을 0.6% 아가로스 전기영동시킨다. (2)와 비슷한 방법에 따라 약 7.6kbp BamHI 단편을 회수한다. 한편, (3)에서 제작한 하이브리드 파지 mp10-HN 180 RF DNA를 BamHI 및 BglII로 소화시키고 생성물을 0.8% 아가로스 전기영동한다. 그후에, HN 유전자 DNA을 함유하는 BamHI-BglI 단편(약 1.8kbp)을 회수한다.
pNZ 1003을 BamHI으로 부분 소화시켜 얻은 약 7.6kbp위 BamHI 단편을 HN 유전자 DNA를 함유하는 약 1.8kbp BamHI-BglII 단편과 혼합한다. 혼합물을 리가제를 이용하여 연결시키고, 적합 이.콜리 TG-1 주를 형질 전환시키고, 이것을 40㎍/㎖의 암피실린을 보충한 LB 한천 배지상에서 37℃에서 15시간 동안 성장시킨다. 실시예 1(2)와 비슷한 방법으로 성장한 이.콜리로부터 플라스미드를 회수한다. 플라스미드를 BamHI으로 소화시키고 7.5K 프로모터 및 HN 유전자가 연결되어 있는 단편(약 3.1kbp)을 함유하는 재조합 벡터를 0.8% 아가로스 전기영동에 의해 선택한다. 이 벡터를 pNZ 2003으로 명명한다.
pNZ 2003은 본 발명의 제2재조합 벡터에 해당된다.
실시예 2
NDV HN 유전자 DNA를 함유하는 제2재조합 벡터(pNZ 2104)의 제작
(1) 하이브리드 파지 mp10 - HN RF DNA로부터의 하이브리드 플라스미드 PHN 18의 제작
pUC 18을 BamHI으로 소화시킨다. 페놀-플로로포름으로 추출한 후에, 에탄올 침전에 의해 절단된 pUC 18을 회수한다. 이 단편 및 실시예 1(4)에서 얻은 HN 유전자 DNA를 함유하는 약 1.8kbp BamHI-BglII 단편을 리가제에 의해 연결시키고 적합 이.콜리 TG-1 주를 형질전환시킨다. 참고예 1(2)와 비슷한 방법으로 플라스미드를 추출한다. BamHI 및 Xbal으로 소화시킨 후에, HN 유전자를 함유하는 하이브리드 플라스미드를 0.8% 아가로스 전기영동에 의해 검출하고 pHN 18로 명명한다.
(2) 제1재조합 벡터 pNZ 1004 및 하이브리드 플라스미드 pHN 18로부터 제2재조합 벡터(pNZ 2104)의 제작
참고예 1(4)에서 제작한 제1재조합 벡터 pNZ 1004를 EcoRL으로 소화시키고 생성물을 0.6% 아가로스 전기영동하여 약 6.2kbp DNA 단편 및 약 3.5kbp DNA 단편을 동시에 회수한다. 약 6.2kbp EcoRL 단편을 EcoRV로 소화한 후 xbal으로 더 부분 소화하고, 소화 생성물을 0.8% 아가로스 전기영동하여 7.5k 프로모터를 함유하는 약 3.3kbp Xbal-EcoRL 단편을 회수한다. 3.5kbp EcoRI 단편을 BamHI으로 더 소화시킨 후 0.8% 아가로스 전기영동시켜 약 3.3 kbp의 BamHI-EcoRI 단편을 회수한다.
한편, (1)에서 제작한 하이브리드 플라스미드 pHN 18을 BamHI으로 소화한 후 Xbal으로 부분 소화한다. 소화 생성물을 0.8% 아가로스 전기영동하여 HN 유전자 DNA를 함유하는 BamHI-Xbal 단편(약 1.8kbp)을 회수한다. 상술한 pNZ 1004에서 얻은 약 3.3kbp Xbal-EcoRL 단편 및 HN 유전자 DNA를 함유하는 약 1.8kbp의 BamHI-Xbal 단편을 혼합하고 리가제에 의해 연결시킨다. 실시예 1(4)와 비슷한 방법으로 7.5k 프로모터 및 HN 유전자가 연결되어 있는 단편(약 2.1kbp)을 함유하는 재조합 벡터를 선택하고 pNZ 2104로 명명한다. pNZ 2104는 본 발명의 제2재조합 벡터에 해당된다.
실시예 3
NDV HN 유전자 DNA를 함유하는 제2재조합 벡터(pNZ 2137, pNZ 2237 및 pNZ 2337)의 제작
(1) 하이브리드 파지 mp10-HN 180으로부터 프로모터 및 그의 통제하에 NDV HN 유전자 DNA가 연결되어 있는 하이브리드 플라스미드 pNZ 87의 제작
pNZ 76을 BamHI으로 소화하고, 0.8% 아가로스겔로부터 β-갈락토시다제 유전자를 포함하지 않는 약 2.9kb단편을 회수한다. 한편, 하이브리드 파지 mp10-HN 180을 BglII 및 BamHI으로 소화시킨 후 0.8% 아가로스 겔로부터 NDV HN 유전자 DNA 단편을 회수한다. 둘을 리가제에 의해 연결시키고 적합 이.콜리 TG-1을 형질 전환시킨다. 플라스미드를 추출하고 HN 유전자를 함유하는 하이브리드 플라스미드를 참고예 1(2)와 비슷한 방법으로 검출한다. 이것을 pNZ 87로 명명한다.
(2) 번역 개시 서열까지의 HN 유전자의 염기 서열이 변경된 종두비루스 7.5k 프로모터-함유 플라스미드(pNZ 87-22 및 pNZ 87~37)의 제작
pNZ 87을 Xbal 및 HindIII로 소화하여 약 4.3kb의 Xbal-HindIII 단편(단편 (1))을 회수한다. 비슷하게, pNZ 87을 Xbal 및 AvaII로 소화시켜 약 0.2kb의 Xbal-AvaII 단편(단편(2))을 회수한다. 덧붙여, pNZ 87을 HindIII 및 Hinfl으로 소화시켜 약 0.2kb의 HindIII-Hinfl 단편(단편(3))을 회수한다. 이렇게 얻은 단편 (1),(2) 및 (3)에 후술한 합성 DNA(4) (22 bp) :
Figure kpo00003
또는 후술한 합성 DNA(5)(37bp) :
Figure kpo00004
을 부가한 후 리가제를 이용하여 연결시킨다. 실시예 1(4)와 비슷한 방법으로 플라스미드를 추출하고, 각각 합성 DNA(4) 및 (5)를 함유하는 하이브리드 플라스미드를 검출한다. 이들 플라스미드를 pNZ 87-22 및 pNZ 87-37로 명명한다.
(3) 하이브리드 플라스미드(A)에 해당되는 pNZ 136SL, 프로모터 및 그의 통제하에 HN 유전자 DNA를 연결시킨 하이브리드 플라스미드 pNZ 87, pNZ 87-22 및 pNZ 87-37로부터의 제2재조합 벡터(pNZ 2137, pNZ 2237 및 pNZ 2237)의 제작
참고예 1(2)-(c)에서 제작한 하이브리드 플라스미드 pNZ 136SL을 HindIII 및 BamHI으로 소화시킨다. 페놀-크로로포름으로 추출한 후, 에탄올 침전에 의해 회수한다. 한편, pNZ 187, pNZ 87-22 및 pNZ 87-37을 각각 HindIII 및 BamHI으로 소화한 후에, 소화 생성물을 0.8% 아가로스 전기영동하여 종두비루스 7.5k 프로모터 및 HN 유전자 DNA를 함유하는 약 2.1kb의 HindIII-BamHI 단편을 회수한다. 리가제를 이용하여 전자를 각각의 후자와 연결시킨다. 7.5k 프로모터 및 HN 유전자가 연결되어 있는 단편(약 2.1kb)을 보유하는 재조합 벡터를 선택하고 각각 pNZ 2137, pNZ 2237로 명명한다. 이들은 본 발명의 제2재조합 벡터에 해당한다.
실시예 4
NDV HN 유전자를 함유하는 재조합 아비폭스비루스의 제작
참고예 1(5)에서 사용된 하이브리드 플라스미드 대신에 실시예 1,2 및 3에서 얻은 제2재조합 벡터를 사용하는 것을 제외하고 참고예 1(5)와 비슷한 방법으로 NDC HN 유전자를 재조합 아비폭스비루스의 용액을 얻는다.
실시예 5
플라크 하이브리드화에 의한 재조합체의 선택
실시예 4에서 얻은 비루스 용액을 10㎝ 페크리디시에서 배양한 병아리 태아 섬유 아세포상에 접종한다. 2시간 후에, 0.8% 박토 한천, 5% 소 태아 혈청, 0.03%L-글루타민 및 10% 트립토스 포스페이트 브로쓰를 보충한 이글 MEM 배지 10㎖를 적충하고 37℃, 5% CO2하에 배양기내에서 3일간 배양한다. 배지에 상술한 것과 동일한 조성을 갖는 이글 MEM 배지 10㎖를 더 적층한 후, 37℃, 5% CO2하에 배양기내에서 3일간 배양한다. 0.8% 박토 한천, 0.03% L-글루타민, 10% 트립토스 포스페이트 브로쓰 및 % 뉴트럴 레드를 보충한 이글 MEM 배지 10㎖를 적층한 후 37℃, 5% CO2하에 배양기내에서 12시간 동안 배양하여 감염 세포를 염색한다.
페트리디시에서 한천 배지를 제거한다. 멸균 나일론 막을 4℃에서 보존한 페트리디시의 바닥에 남아 있는 세포의 표면에 붙여 비루스가 그리로 이동되도록 한다. 0.5N NaOH로 10분간, 그리고 1M 트리스-염산염 완충액으로 5분간의 처리를 3회 반복한 후, 계를 1.5M NaCl 및 0.5M 트리스-염산염 완충액으로 5분간 처리한다. 계를 2배 SSC[1배 SSC, 0.15M NaCl, 0.015M C3H4(OH)(COONa)3]로 포화시킨 후 80℃에서 2시간동안 탕화한다. 계를 4배 SET(0.6M NaCl, 0.08M 트리스 HCl, 4mM EDTAph 7.8)-10배 덴하르트-0.1% SDS를 이용하여 68℃에서 2시간동안 처리한다. 4배 SET-10배 덴하르트-0.1% SDS-0.1% Na4P2O7-50㎍/㎖-변형 연어 정자 DNA 및32p로 표지화 한 NDV의 HN을 코딩하는 cDNA를 68℃에서 14시간 동안 니크 번역에 의해 하이브리드화한다. 세척 후에, 나일론 막을 X선 필름 위에 포개어 놓고 오토라디오그래피하여 스폿의 존재를 확인한다. X선 필름을 4℃에서 보존한 한천위에 적층하고, 스폿과 일치하는 플라크를 HN 유전자를 함유하는 재조합체로 등정한다. 재조합체를 멸균 파스퇴르 피펫을 이용하여 분리한다. 이 재조합체의 플라크는 약 500플라크가 나타나는 10㎝ 패트리디시 10개당 2개가 나타난다.(약 0.04%)
이렇게 얻어진 재조합 비루스에 있어서, pNZ 2003을 이용하여 얻은 재조합 비루스를 fNZ 2003으로 명명한다. 비슷하게 pNZ 2104, pNZ 2137, pNZ 2237 및 pNZ 2337을 이용하여 얻은 것들을 각각 fNZ 2104, fNZ 2137, fNZ 2237 및 fNZ 2337로 명명한다.
실시예 6
NDV HN 유전자를 함유하는 재조합 아비폭스비루스의 정체
실시예 5에서 분리한 플라크를 이글 MEM 배지 1㎖에 현탁하고, 현탁액 200㎕를 10㎝ 패트리디시에서 배양한 병아리 태아 섬유 아세포상에 접종한다. 2시간 후에, 0.8% 박토 한천, 5% 송아지 태아 혈청, 0.03% L-글루타민 및 10% 트립토스 포스페이트 브로쓰를 보충한 페놀 레드를 함유하지 않은 이글 MEM 배지 10㎖를 적층한 후 37℃, 5% CO2하에 배양기에서 3일간 배양한다. 배지에 상술한 것과 동일한 조성을 갖는 페놀레드를 함유하지 않는 이글 MEM 배지 10㎖를 적충한 후, 37℃, 5% CO2하에 배양기에서 3일간 배양한다. 0.8% 박토 한천, 0.03% L-글루타민 및 10% 트립토스 포스페이트 브로쓰를 보충한 페놀 레드를 함유하지 않는 이글 MEM 배지 10㎖를 배지에 적층한 후. 37℃, 5% CO2하에 배양기내에서 배양한다. 실시예 5에서처럼 재조합 플라크는 X선 필름상에서 스폿을 형성한다.
상기 상기 조작을 비슷한 방법으로 반복하여 재조합체를 다시 정제한다.
결과로서, fNZ 1004에 있어서는, 실시예 5에서 약 500플라크가 나타난 패트리디시 10개당 20개의 재조합 플라크(적색 플라크)(0.2%)가 나타난다; 첫 번째의 플라크 정제에서는 약 200플라크가 나타난 패트리디시 3개에 재조합 플라크 90개(15%)가 나타난다. 두번째의 플라크 정제에서는 거의 모든 플라크가 재조합체이다. fNZ 2104, fNZ 2137, fNZ 2237 및 fNZ 2337에 있어서도, 거의 동일한 결과가 얻어진다.
실시예 7
세포에서의 재조합체의 발현(형광 항체법)
1.0 또는 0.1의 m.o.i를 나타내는 본 발명의 비루스 주(fNZ 2003, fNZ 2104, fNZ 2137, fNZ 2237 및 fNZ 2337)을 조직 배양용 챔버 슬라이드에서 배양한 병아리 태아 섬유 아세포에 접종한다. 37℃에서 5% CO2배양기내에서 2시간 동안 배양한 후에, 10% 트립토스 포스페이트 브로쓰(Difco Co., Ltd. 제품) 및 0.03% L-글루타민을 보충한 이글 MEM 배지를 가한다. 5% CO2배양기내에서 37℃에서 2일간 배양하고 배지를 제거한다. PBS(인산염 완충 생리식염수)로 세척하고 풍건한 후, 계를 -20℃에서 아세톤으로 20분간 처리하여 세포를 고정시킨다. 일차 항체로서 항-NDV 병아리 항체를, 그리고 이차 항체로서 플루오레세인 이소시아네이트-결합 항-병아리 IgG항체를 이용하는 형광항체법에 따라 시험함으로써 재조합 아비폭스비루스가 NDV HN 단백질 생산성을 갖는 것을 확인한다.
실시예 8
세포에서의 재조합체의 발현(효소 항체법)
실시예 6에서 얻은 비루스 용액을 10㎝ 패트리디시에서 배양한 병아리 태아 섬유 아세포에 접종한다. 2시간 후, 0.8% 박토 한천, 5% 송아지 태아 혈청, 0.03% L-글루타민 및 10% 트립토스 포스페이트 브로쓰를 보충한 이글 MEM 배지 10㎖를 적충한 후 37℃, 5% CO2하에 배양기에서 3일간 배양한다. 덧붙여 상술한 것과 동일한 조성을 갖는 이글 MEM 10㎖를 적층한 후 37℃, 5% CO2하에 배양기내에서 3일간 배양한다.
한천 배지를 페트리디시에서 제거한다. 페트리디시의 바닥에 남아있는 세포의 표면에 멸균 나일론 막을 붙여 비루스 플라크 및 세포를 옮긴다. 2% 스킴 밀크를 함유하는 PBS(인산염 완충 생리식염수)로 30분간 처리한 후, 일차 항체로서 항-NDV 병아리 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응 후, 혼합물을 PBS로 세척하고, 이차 항체로서 비오틴화 항-병아리 IgG 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응 후, 혼합물을 PBS로 세척하고, 양고추냉이 퍼옥시다제-결합 아비딘-비오딘 착체를 실온에서 30분간 반응시킨다. 반응 후, 0.05% 4-클로로-1-나프톨 및 0.3%H2O2를 함유하는 8mM 트리스-염산염 완충액(pH 8.0)을 이용하여 발색시킨다. 상기 효소 항체법에 의해 체크함으로써 재조합 아비폭스비루스가 NDV HN 단백질 생산성을 갖는 것을 확인한다.
실시예 9
재조합 비루스를 다섯 개의 플라스크(150㎠/플라스크)내에서 병아리 태아 섬유 아세포(CEF)중에서 37℃에서 48시간 동안 배양한다. 재조합 비루스 번식-CEF를 2회 동결-해동시킨 후, 세포 현탁액을 수집하고 2,000rpm에서 15분간 원심 분리한다. 상층액 130㎖에 20%(v/v)소듐 글루타메이트 용액 40㎖ 및 10%(v/v)사카로스 용액 30㎖를 가한다. 혼합물을 각 2㎖씩 100바이알에 넣는다. 1.5시간 동안 예비 동결한 후에, 감압하에 30시간 동안 동결 건조시킨다. 백신 1바이알을 30%(v/v) 글리세롤을 보충한 생리식염수 10㎖에 용해시키고, 스틱을 이용하여 7일된 특이 병원균을 함유하지 않는(specific pathogen free:SPF) 병아리의 오른쪽 날개 깃털에 0.01㎖/병아리의 용액을 접종한다. 접종 후 병아리의 종두진을 관찰한다. 2주만에 뉴우캣슬병 비루스(NDV)의 백신 주사 후의 혈구 응집-억제(HI) 항체를 측정한다. 백신 주사 후 2 및 3주만에 병원성 NDV Sato 주 및 병원성 포을폭스비루스 니시가하라주로 공격하여 백신의 면역 효과를 결정한다.
후술한 대로 NDV HI 시험을 행한다. 4HA 단위를 함유하는 NDV 혈구응집(HA) 항원 25㎍를 마이크로타이터플레이트중의 2배 연속 회석 혈청의 동피부에 가한다. 플레이트를 실온에서 10분간 방치한 후 혼합한다. 0.5%(v/v) 병아리 적혈구 현탄액 50㎕를 각 웰에 가하고, 혼합물을 실온에서 45분간 방치한다. 완전억제를 나타내는 가장 높은 희석의 역수로서 HI 역가를 결정한다.
백신의 효과를 표2에 나타낸다. 본 발명의 재조합 백신으로 접종한 병아리에서는 병아리와 포을폭스비루스 백신의 반응을 나타내는 피부 팽윤이 통상의 포을폭스비루스 백신에서처럼 관찰되며 3주 백신 주사 후에 포을폭스비루스 병원성 주로 공격하여도 발진이 관찰되지 않는다. 덧붙여, NDV에 대한 병아리의 항체가 검출되며, 병아리는 2주 백신 주사 후에 병원성 NDV 주의 공격에 대해 내성을 갖는다.
이들 결과로부터 본 발명의 재조합 백신이 병아리를 포올폭스 및 NDV 감염에 대해 동시에 면역화시킬 수 있음이 나타난다.
Figure kpo00005
* FPV +: 발진이 관찰됨.
(3주) -: 발진이 관찰되지 않음.
NDV +: 증세와 사망이 관찰됨.
(2주) -: 공격에 대한 저항성이 관찰됨.

Claims (6)

  1. 뉴우캣슬병 비루스 혈구응집소 뉴우라미니다제를 코딩하는 전체-길이 cDNA로 이루어진 누클레오티드 서열에 결합된 프로모터를 나까노 도브폭스비루스의 중식에 비-필수적인 게놈 영역에 삽입시킨 재조합 나까노 도브폭스비루스.
  2. 가금류에서 뉴우캣슬병에 대해 보호 면역 반응을 유발하는 재조합 아비폭스비루스로서, 상기 아비폭스비루스는 제4도에 도시된 바의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴우캣슬병 비루스 혈구응집소 뉴우라미니다제 cDNA에 결합된 프로모터로 이루어진 누클레오시드 서열이 아비폭스비루스의 증식에 비-필수적인 게놈 영역에 삽입되어 있는 재조합 아비폭스비루스.
  3. 제2항에 있어서, 상기 cDNA가 제4도에 표시된 염기 서열을 가지며 아비폭스비루스의 중식에 비-필수적인 상기 게놈 영역이 병아리 태아에 상주하는 도브폭스비루스 나까노 균주의 DNA의 5.0kbp EcoRL-HindIII 단편과의, 4.0kbp BamHI 단편과의, 1.8kbp EcoRV-Hind III 단편과의, 3.3kbp BamHI 단편과의, 또는 5.2kbp HindIII단편과의 상동 재조합을 유발할 수 있는 재조합 아비폭스비루스.
  4. 제2항에 있어서, 상기 cDNA가 종두비루스 7.5k 프로모터에 결합되는 재조합 비루스.
  5. 제4항에 있어서, 아비폭스비루스의 증식에 비-필수적인 게놈 영역이 병아리 태아에 상주하는 도브폭스비루스 나까노 균주의 DNA의 5.0kbp EcoRL-HindIII 단편과의, 4.0kbp BamHI 단편과의, 1.8kbp EcoRV-HindIII 단편과의, 3.3kbp BamHI 단편과의, 또는 5.2kbp Hind III단편과의 상동 재조합을 유발할 수 있는 재조합 아비폭스비루스.
  6. 제4, 5 또는 2항중 어느 한 항에 따른 재조합 아비폭스비루스로 이루어진, 포을폭스비루스 및 뉴우캣슬병 비루스에 대한 항-비루스 면역성을 유발하는 가금용 백신.
KR1019880012033A 1987-09-16 1988-09-16 재조합 아비폭스비루스 KR970000530B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP231653/87 1987-09-16
JP23165387 1987-09-16
JP62-231653 1987-09-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR890005269A KR890005269A (ko) 1989-05-13
KR970000530B1 true KR970000530B1 (ko) 1997-01-13

Family

ID=16926866

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019880012033A KR970000530B1 (ko) 1987-09-16 1988-09-16 재조합 아비폭스비루스

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP0308220B1 (ko)
KR (1) KR970000530B1 (ko)
AU (1) AU611711B2 (ko)
CA (1) CA1340203C (ko)
DE (1) DE3850019T2 (ko)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ227934A (en) * 1988-02-12 1991-06-25 Commw Scient Ind Res Org Fowlpox virus vectors
DE3813093A1 (de) * 1988-04-19 1989-11-09 Immuno Ag Rekombinantes plasmid, verfahren zum herstellen eines rekombinanten avipoxvirus, rekombinantes avipoxvirus und dessen verwendung
US5631154A (en) * 1988-06-10 1997-05-20 Therion Biologics, Incorporated Self assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles
ES2061996T3 (es) * 1988-06-24 1994-12-16 British Tech Group Regiones no esenciales de avipoxvirus.
US5093258A (en) * 1988-08-26 1992-03-03 Therion Biologics Corporation Recombinant fowlpox virus and recombination vector
AU623476B2 (en) * 1988-12-29 1992-05-14 Nippon Zeon Co., Ltd. Promoter, plasmid containing the same, and recombinant avipoxvirus
JP2781605B2 (ja) * 1989-06-22 1998-07-30 日本ゼオン株式会社 組み換えアビポックスウイルス
EP0537232A4 (en) * 1990-07-02 1993-06-30 Smithkline Beecham Corporation Recombinant pigeon pox virus vaccine
EP1380651A2 (en) * 1991-08-26 2004-01-14 Baxter Healthcare S.A. Recombinant fowlpox virus with intact FPV-tk-gene
US6136318A (en) * 1993-02-26 2000-10-24 Cochran; Mark D. Recombinant fowlpox viruses and uses thereof
US5925358A (en) * 1993-02-26 1999-07-20 Syntro Corporation Recombinant fowlpox viruses and uses thereof
AU6299594A (en) * 1993-02-26 1994-09-14 Nippon Zeon Co., Ltd. Recombinant fowlpox virus s-fpv-043 and uses thereof
US5871742A (en) * 1993-03-31 1999-02-16 Nippon Zeon Co., Ltd Recombinant Avipox virus encoding polypeptide of mycoplasma gallisepticum, and utilized a live vaccine
EP0954593A1 (en) 1996-07-25 1999-11-10 Therion Biologics Corporation Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
EP2042598A1 (en) 1998-11-18 2009-04-01 Oxford Biomedica (UK) Limited 5T4 tumour-associated antigen for use in tumour immunotherapy
US7638134B2 (en) 2003-02-20 2009-12-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Insertion sites in fowlpox vectors
EP2045268B1 (en) 2005-05-13 2011-09-21 Oxford BioMedica (UK) Limited Mhc class I and II peptide antigens derived from tumour antigen 5t4
EP2397855A3 (en) 2006-03-14 2012-03-14 Oregon Health and Science University Methods for detecting a mycobacterium tuberculosis infection
EP2918598B1 (en) 2007-02-28 2019-01-30 The Govt. Of U.S.A. As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Brachyury polypeptides and methods for use
US8691502B2 (en) 2008-10-31 2014-04-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
US8664183B2 (en) 2009-02-27 2014-03-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services SPANX-B polypeptides and their use
EP2501397B1 (en) 2009-11-20 2017-10-04 Oregon Health and Science University Methods for producing an immune response to tuberculosis
WO2012151272A2 (en) 2011-05-02 2012-11-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
EP2788021B1 (en) 2011-12-09 2017-01-18 Bavarian Nordic A/S Poxvirus vector for the expression of bacterial antigens linked to tetanus toxin fragment c
WO2014043535A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions for the treatment of cancer
JP6887955B2 (ja) 2015-03-18 2021-06-16 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 組換え体発現系のアッセイ
WO2023077147A2 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Pellis Therapeutics, Inc. T-cell vaccines for patients with reduced humoral immunity

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1986000528A1 (en) * 1984-07-05 1986-01-30 Genex Corporation Cloned gene and method for making and using the same
DE3650289T2 (de) * 1985-03-29 1995-08-10 British Tech Group Spike-protein des virus der infektiösen bronchitis.
AU602875B2 (en) * 1985-12-18 1990-11-01 British Technology Group Limited Newcastle disease virus gene clones
JPS6324888A (ja) * 1986-06-30 1988-02-02 スミスクライン・ベックマン　―　アニマル・ヘルス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム 組換え型ｄｎａ分子
WO1988002022A1 (en) * 1986-09-22 1988-03-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Or Recombinant poxviruses
AU605567B2 (en) * 1987-03-11 1991-01-17 Nippon Zeon Co., Ltd. Recombinant avipoxvirus
CA1341245C (en) * 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva

Also Published As

Publication number Publication date
DE3850019T2 (de) 1994-12-01
CA1340203C (en) 1998-12-15
KR890005269A (ko) 1989-05-13
AU2222888A (en) 1989-03-16
EP0308220A1 (en) 1989-03-22
AU611711B2 (en) 1991-06-20
EP0308220B1 (en) 1994-06-08
DE3850019D1 (de) 1994-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR970000530B1 (ko) 재조합 아비폭스비루스
CA2031164C (en) Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof
EP0389509B1 (en) Fowlpox virus promoters
EP0353851B1 (en) Fowlpox virus non-essential regions
US5180675A (en) Recombinant fowlpox virus
US5453364A (en) Recombinant poxvirus host range selection system
US5225336A (en) Recombinant poxvirus host range selection system
AU605567B2 (en) Recombinant avipoxvirus
US5017487A (en) Vaccinia DNA
US5093258A (en) Recombinant fowlpox virus and recombination vector
JP2002348255A (ja) 組換えアビポックスウイルスによる免疫方法
AU645333B2 (en) Recombinant marek's disease virus
US5369025A (en) Recombinant fowlpox vaccine for protection against Marek's disease
US5387519A (en) Recombinant avipoxvirus
EP0133063A1 (en) Immunologically reactive non-glycosylated amino acid chains of glycoprotein B of herpes virus types 1 and 2
JP2781605B2 (ja) 組み換えアビポックスウイルス
US5286639A (en) Recombinant avipoxvirus
JPH09206084A (ja) Ｃｈｏ細胞において増殖可能な組換えワクシニアウイルスを用いる方法
US5676952A (en) Herpesviruses transformed to express GD in vitro
JP2638622B2 (ja) 組み換えアビポックスウイルス
KR940001265B1 (ko) 프로모터, 그를 함유하는 플라스미드 및 재조합 아비폭스비루스
US5426051A (en) Gene for A-type inclusion body of poxvirus
JP3458880B2 (ja) 組み換え体、多価組み換え体、及びその作製方法
JP3924328B2 (ja) 新規ｄｎａベクター、及び組み換え新規ｄｎａベクターを有効成分とするワクチン
JP2638677B2 (ja) プロモーター、それを含むプラスミド及び組み換えアビポツクスウイルス

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
G160 Decision to publish patent application
N231 Notification of change of applicant
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20000104

Year of fee payment: 4

LAPS Lapse due to unpaid annual fee