JP3458880B2 - 組み換え体、多価組み換え体、及びその作製方法 - Google Patents
組み換え体、多価組み換え体、及びその作製方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、組み換え体、その作製
方法、及び当該プラスミドを用いて得られる多価組み換
え体（プラスミド、形質転換体、ウイルス等）に関す
る。
方法、及び当該プラスミドを用いて得られる多価組み換
え体（プラスミド、形質転換体、ウイルス等）に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】近年、医薬品、医薬品原料、医薬品合成
材料などとして、形質転換細菌や組み換えウイルスなど
の組み換え体は重要な役割を果たしている。例えば、病
原体由来の遺伝子を導入した形質転換細菌を用いて抗原
タンパク質を製造したり、病原体由来の遺伝子を組み込
んだ組み換えウイルスを生ワクチンとして投与したりす
ることができる。とくに、最近では複数の病原体由来の
遺伝子を導入または組み込んで、多価組み換え体を構築
し、安全性の高い生ワクチンを得ることが検討されてい
る。これは、組み換え体を用いたワクチンでは、組み換
え体が１種類の病原体由来の遺伝子しか発現しない場
合、複数の病原体への免疫を生体に付与する為には複数
の組み換え体を接種または投与する必要があるのに対し
て、複数の病原体由来の遺伝子を発現する多価組み換え
体を用いると、一つの組み換え体で複数の病原体への免
疫を付与することができ、生体に対する負担を軽くする
ことができるなどの利点によるものと考えられる。
材料などとして、形質転換細菌や組み換えウイルスなど
の組み換え体は重要な役割を果たしている。例えば、病
原体由来の遺伝子を導入した形質転換細菌を用いて抗原
タンパク質を製造したり、病原体由来の遺伝子を組み込
んだ組み換えウイルスを生ワクチンとして投与したりす
ることができる。とくに、最近では複数の病原体由来の
遺伝子を導入または組み込んで、多価組み換え体を構築
し、安全性の高い生ワクチンを得ることが検討されてい
る。これは、組み換え体を用いたワクチンでは、組み換
え体が１種類の病原体由来の遺伝子しか発現しない場
合、複数の病原体への免疫を生体に付与する為には複数
の組み換え体を接種または投与する必要があるのに対し
て、複数の病原体由来の遺伝子を発現する多価組み換え
体を用いると、一つの組み換え体で複数の病原体への免
疫を付与することができ、生体に対する負担を軽くする
ことができるなどの利点によるものと考えられる。
【０００３】ところで、従来、組み換え体の作製には、
プラスミドやファージなどいわゆるベクターが用いられ
ている。例えば、細菌に遺伝子を導入する場合は、導入
したい遺伝子を組み込んだプラスミドやファージを構築
し、これを細菌に導入する形質転換や形質導入する。ま
た、ウイルスに遺伝子を導入する場合は、ウイルスの増
殖に非必須な領域の間に導入したい遺伝子が挿入された
遺伝子を有する組み換えプラスミドを構築し、これを用
いてウイルスと相同組み換えを起こさせて、ウイルスに
遺伝子を導入する方法が一般的に知られている。
プラスミドやファージなどいわゆるベクターが用いられ
ている。例えば、細菌に遺伝子を導入する場合は、導入
したい遺伝子を組み込んだプラスミドやファージを構築
し、これを細菌に導入する形質転換や形質導入する。ま
た、ウイルスに遺伝子を導入する場合は、ウイルスの増
殖に非必須な領域の間に導入したい遺伝子が挿入された
遺伝子を有する組み換えプラスミドを構築し、これを用
いてウイルスと相同組み換えを起こさせて、ウイルスに
遺伝子を導入する方法が一般的に知られている。
【０００４】上述の方法においては、構築される組み換
えプラスミドが、細菌やウイルスの組み換え体の作製に
重要な道具として用いられる。病原体由来の遺伝子を有
するプラスミドは、制限酵素によってプラスミドの一部
を切断し、ここに病原体由来の遺伝子を挿入して構築さ
れるのが一般的である。ここで用いられる制限酵素は、
特定の遺伝子の配列を認識し、当該配列内または配列か
ら一定の位置のヌクレオチドを切断するものであり、多
くの制限酵素は６〜８塩基を認識する制限酵素である。
中でも６塩基認識タイプの制限酵素がその種類の多さか
ら、広く組み換え体の構築に利用されている。
えプラスミドが、細菌やウイルスの組み換え体の作製に
重要な道具として用いられる。病原体由来の遺伝子を有
するプラスミドは、制限酵素によってプラスミドの一部
を切断し、ここに病原体由来の遺伝子を挿入して構築さ
れるのが一般的である。ここで用いられる制限酵素は、
特定の遺伝子の配列を認識し、当該配列内または配列か
ら一定の位置のヌクレオチドを切断するものであり、多
くの制限酵素は６〜８塩基を認識する制限酵素である。
中でも６塩基認識タイプの制限酵素がその種類の多さか
ら、広く組み換え体の構築に利用されている。
【０００５】しかしながら、制限酵素により切断される
部位（切断部位）が、遺伝子上に存在する確率は、各塩
基が完全にランダムに連結していると仮定すると、４
（塩基の種類の数）の４〜８乗（認識する塩基の数）で
あることから、４塩基認識の制限酵素による切断部位の
存在確率が最も高く、これは多価組み換え体構築にあま
り適していない。同様に６塩基認識の制限酵素であって
も、プラスミドなどのサイズが大きくなるに従って、同
じ制限酵素により認識される部位が複数ある確率が高く
なる。一つのプラスミド中に、複数箇所の切断部位があ
る制限酵素を用いてプラスミドに病原体由来の遺伝子を
挿入する場合、部分分解などの技法が必要であり、操作
が煩雑となる。また、８塩基認識の制限酵素を用いる
と、プラスミド中の認識箇所は少ないため、上記問題は
解決する。しかし、一つの病原体由来の遺伝子を組み込
んだ後、第二の他の病原体由来の遺伝子を導入するに際
し、同じ制限酵素を用いると、先に組み込んだ病原体由
来の遺伝子の両端にある切断点も切断されてしまう。こ
の場合も、上記の同一制限酵素認識部位が複数あること
になり、６塩基認識制限酵素を用いた場合と同様、部分
分解などの技法が必要となる。さらに、挿入遺伝子の方
向のコントロールができないため、組み換えプラスミド
を得た後、目的の方向性を持ったプラスミドを得るのに
すクリーニングする必要がある。このような現象は、同
じ認識部位の制限酵素を用いる限り、当然、認識塩基数
に限らず起こることである。
部位（切断部位）が、遺伝子上に存在する確率は、各塩
基が完全にランダムに連結していると仮定すると、４
（塩基の種類の数）の４〜８乗（認識する塩基の数）で
あることから、４塩基認識の制限酵素による切断部位の
存在確率が最も高く、これは多価組み換え体構築にあま
り適していない。同様に６塩基認識の制限酵素であって
も、プラスミドなどのサイズが大きくなるに従って、同
じ制限酵素により認識される部位が複数ある確率が高く
なる。一つのプラスミド中に、複数箇所の切断部位があ
る制限酵素を用いてプラスミドに病原体由来の遺伝子を
挿入する場合、部分分解などの技法が必要であり、操作
が煩雑となる。また、８塩基認識の制限酵素を用いる
と、プラスミド中の認識箇所は少ないため、上記問題は
解決する。しかし、一つの病原体由来の遺伝子を組み込
んだ後、第二の他の病原体由来の遺伝子を導入するに際
し、同じ制限酵素を用いると、先に組み込んだ病原体由
来の遺伝子の両端にある切断点も切断されてしまう。こ
の場合も、上記の同一制限酵素認識部位が複数あること
になり、６塩基認識制限酵素を用いた場合と同様、部分
分解などの技法が必要となる。さらに、挿入遺伝子の方
向のコントロールができないため、組み換えプラスミド
を得た後、目的の方向性を持ったプラスミドを得るのに
すクリーニングする必要がある。このような現象は、同
じ認識部位の制限酵素を用いる限り、当然、認識塩基数
に限らず起こることである。
【０００６】また、遺伝子を挿入するとき、ＤＮＡポリ
メラーゼのクレノーフラグメント等を用いて末端修飾し
て、できたプラスミド上に元の制限酵素切断部位をなく
す方法が知られている。しかし、もとの制限酵素切断部
位がなくなるため、再度同じ部位に遺伝子を挿入するこ
とができなくなる。また、末端が平滑になるため、遺伝
子の挿入される方向が２通りとなる点も変わらない。挿
入方向が２通りあるということは、組み込む遺伝子の読
みの方向が正方向に連結されたプラスミドと、逆方向に
連結されたプラスミドとが得られる可能性を示すもので
あり、操作上、望ましくない。もちろん、制限酵素を別
のものにすれば、別の箇所に病原体由来の遺伝子を複数
挿入することは可能であるが、プラスミドが本来有する
制限酵素切断部位を考慮する必要があり、遺伝子の挿入
間隔やプロモーターの利用など、厳密な設計が必要な多
価組み換え体の構築には不向きである。このように、多
価組み換え体を得るための多価プラスミド（ひとつのプ
ラスミドに複数の遺伝子を連続して導入されたプラスミ
ド）は、挿入箇所や挿入された遺伝子の方向などの設計
が必要なため、その構築操作においてきわめて煩雑で、
かつ複雑な問題があった。
メラーゼのクレノーフラグメント等を用いて末端修飾し
て、できたプラスミド上に元の制限酵素切断部位をなく
す方法が知られている。しかし、もとの制限酵素切断部
位がなくなるため、再度同じ部位に遺伝子を挿入するこ
とができなくなる。また、末端が平滑になるため、遺伝
子の挿入される方向が２通りとなる点も変わらない。挿
入方向が２通りあるということは、組み込む遺伝子の読
みの方向が正方向に連結されたプラスミドと、逆方向に
連結されたプラスミドとが得られる可能性を示すもので
あり、操作上、望ましくない。もちろん、制限酵素を別
のものにすれば、別の箇所に病原体由来の遺伝子を複数
挿入することは可能であるが、プラスミドが本来有する
制限酵素切断部位を考慮する必要があり、遺伝子の挿入
間隔やプロモーターの利用など、厳密な設計が必要な多
価組み換え体の構築には不向きである。このように、多
価組み換え体を得るための多価プラスミド（ひとつのプ
ラスミドに複数の遺伝子を連続して導入されたプラスミ
ド）は、挿入箇所や挿入された遺伝子の方向などの設計
が必要なため、その構築操作においてきわめて煩雑で、
かつ複雑な問題があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、かかる
従来技術のなかで一般に困難である上記の操作上の問題
点を解決すべく鋭意検討を加えた結果、特異な制限酵素
切断部位を導入した２つのプラスミド（プラスミド対）
を利用すると、簡便に多数の遺伝子をプラスミド上の一
ヶ所に導入でき、さらに導入する遺伝子の方向も任意に
決定することができることを見いだし本発明を完成する
に至った。
従来技術のなかで一般に困難である上記の操作上の問題
点を解決すべく鋭意検討を加えた結果、特異な制限酵素
切断部位を導入した２つのプラスミド（プラスミド対）
を利用すると、簡便に多数の遺伝子をプラスミド上の一
ヶ所に導入でき、さらに導入する遺伝子の方向も任意に
決定することができることを見いだし本発明を完成する
に至った。
【０００８】かくして本発明によれば、第一に、１つの
制限酵素ＳｆｉＩ認識部位を有するプラスミド（以下、
アクセプタープラスミドということがある）のＳｆｉＩ
認識部位に、一端は制限酵素ＳｆｉＩによる切断面であ
り、もう一端は制限酵素ＳｆｉＩ以外の制限酵素Ｘによ
る切断面であるＤＮＡ断片（以下、挿入ＤＮＡ断片とい
うことがある）が、挿入されることにより得られるただ
１つの制限酵素ＳｆｉＩ認識部位を有する組み換えプラ
スミドが提供され、ＳｆｉＩ以外の制限酵素ＸがＢｇｌ
Ｉ、ＡｌｗＮＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＰｆｌＭＩ、Ｂｓｌ
Ｉ、およびＭｗｏＩのいずれかひとつが好ましい実施態
様である。第二に本発明の組み換えプラスミドに、さら
に制限酵素ＳｆｉＩによる切断面であり、もう一端は制
限酵素ＳｆｉＩ以外の制限酵素Ｘによる切断面であるＤ
ＮＡ断片をひとつ以上挿入して得られる多価組み換えプ
ラスミドが提供される。第三に、１つの制限酵素Ｓｆｉ
Ｉ認識部位を有するプラスミドのＳｆｉＩ認識部位に、
一端は制限酵素ＳｆｉＩ切断面であり、もう一端は制限
酵素ＳｆｉＩ以外の制限酵素Ｘ切断面であるＤＮＡ断片
を挿入することを特徴とする組み換えプラスミドの作製
方法が提供され、ここで得られた組み換えプラスミドは
アクセプタープラスミドとなりうるため、再び挿入ＤＮ
Ａ断片をこのプラスミドに組み込み、多価組み換えプラ
スミドが得られる。もちろん、再び挿入ＤＮＡ断片をア
クセプタープラスミドに組み込む操作は、繰り返しでき
るので、２以上の多数の外来ＤＮＡを挿入ＤＮＡ断片と
して組み込むことができる。よって、本発明において提
供される組み換えプラスミドの作製方法は、多価組み換
えプラスミドの精製方法として有用である。さらに第四
に、本発明の多価組み換えプラスミドによって形質転換
した形質転換体と本発明の多価組み換えプラスミドを用
いて作製された組み換えウイルスが提供される。
制限酵素ＳｆｉＩ認識部位を有するプラスミド（以下、
アクセプタープラスミドということがある）のＳｆｉＩ
認識部位に、一端は制限酵素ＳｆｉＩによる切断面であ
り、もう一端は制限酵素ＳｆｉＩ以外の制限酵素Ｘによ
る切断面であるＤＮＡ断片（以下、挿入ＤＮＡ断片とい
うことがある）が、挿入されることにより得られるただ
１つの制限酵素ＳｆｉＩ認識部位を有する組み換えプラ
スミドが提供され、ＳｆｉＩ以外の制限酵素ＸがＢｇｌ
Ｉ、ＡｌｗＮＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＰｆｌＭＩ、Ｂｓｌ
Ｉ、およびＭｗｏＩのいずれかひとつが好ましい実施態
様である。第二に本発明の組み換えプラスミドに、さら
に制限酵素ＳｆｉＩによる切断面であり、もう一端は制
限酵素ＳｆｉＩ以外の制限酵素Ｘによる切断面であるＤ
ＮＡ断片をひとつ以上挿入して得られる多価組み換えプ
ラスミドが提供される。第三に、１つの制限酵素Ｓｆｉ
Ｉ認識部位を有するプラスミドのＳｆｉＩ認識部位に、
一端は制限酵素ＳｆｉＩ切断面であり、もう一端は制限
酵素ＳｆｉＩ以外の制限酵素Ｘ切断面であるＤＮＡ断片
を挿入することを特徴とする組み換えプラスミドの作製
方法が提供され、ここで得られた組み換えプラスミドは
アクセプタープラスミドとなりうるため、再び挿入ＤＮ
Ａ断片をこのプラスミドに組み込み、多価組み換えプラ
スミドが得られる。もちろん、再び挿入ＤＮＡ断片をア
クセプタープラスミドに組み込む操作は、繰り返しでき
るので、２以上の多数の外来ＤＮＡを挿入ＤＮＡ断片と
して組み込むことができる。よって、本発明において提
供される組み換えプラスミドの作製方法は、多価組み換
えプラスミドの精製方法として有用である。さらに第四
に、本発明の多価組み換えプラスミドによって形質転換
した形質転換体と本発明の多価組み換えプラスミドを用
いて作製された組み換えウイルスが提供される。
【０００９】（アクセプタープラスミド）本発明におい
てアクセプタープラスミドは、制限酵素ＳｆｉＩ認識部
位を一ヶ所有するプラスミドである。ここでいう制限酵
素ＳｆｉＩ認識部位とは、５’−ＧＧＣＣＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4
Ｎ5ＧＧＣＣ−３’（Ｎ1〜Ｎ5は、それぞれ独立にＡ、
Ｃ、Ｇ、Ｔいずれの塩基でも良い）という塩基配列であ
り、制限酵素ＳｆｉＩはこの配列を認識し、その中央の
３塩基（Ｎ2Ｎ3Ｎ4）が３’末端側に突出した形でＤＮ
Ａを切断する。もちろん、制限酵素ＳｆｉＩ以外の制限
酵素、例えばＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｃＩ
Ｉ、ＢａｍＨＩなどの一般的なプラスミドのマルチクロ
ーニングサイト中に多く含まれる制限酵素によって認識
される部位を、本発明で言うアクセプタープラスミドが
有していても良い。このようなプラスミドは、任意に作
製することができる。
てアクセプタープラスミドは、制限酵素ＳｆｉＩ認識部
位を一ヶ所有するプラスミドである。ここでいう制限酵
素ＳｆｉＩ認識部位とは、５’−ＧＧＣＣＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4
Ｎ5ＧＧＣＣ−３’（Ｎ1〜Ｎ5は、それぞれ独立にＡ、
Ｃ、Ｇ、Ｔいずれの塩基でも良い）という塩基配列であ
り、制限酵素ＳｆｉＩはこの配列を認識し、その中央の
３塩基（Ｎ2Ｎ3Ｎ4）が３’末端側に突出した形でＤＮ
Ａを切断する。もちろん、制限酵素ＳｆｉＩ以外の制限
酵素、例えばＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｃＩ
Ｉ、ＢａｍＨＩなどの一般的なプラスミドのマルチクロ
ーニングサイト中に多く含まれる制限酵素によって認識
される部位を、本発明で言うアクセプタープラスミドが
有していても良い。このようなプラスミドは、任意に作
製することができる。
【００１０】（挿入ＤＮＡ断片）本発明において、アク
セプタープラスミドに挿入するＤＮＡ断片は、その両端
がアクセプタープラスミドの制限酵素ＳｆｉＩによって
与えられる切断面（即ち、前記ＳｆｉＩ認識配列のＮ2
Ｎ3Ｎ4が３’側に突出した断面と、Ｎ2cＮ3cＮ4cが３’
側に突出した断面）と連結できるように、一端はＮ2Ｎ3
Ｎ4が３’側に突出した断面であり、もう一端はＮ2cＮ
3cＮ4cが３’側に突出した断面を有するものである。さ
らにこの断面のうち一端のみが制限酵素ＳｆｉＩ切断面
と同じであり、もう一端は制限酵素ＳｆｉＩ切断面であ
ってはならず、制限酵素ＳｆｉＩ以外の制限酵素Ｘの切
断面である。本発明において、制限酵素Ｘは、その断面
がアクセプタープラスミドのＳｆｉＩ切断面と連結する
必要があることから、ＳｆｉＩと同じの方向に３塩基が
突出する切断面を与える制限酵素であればよい。組み換
え体構築の設計の便利さや認識部位の特異性などを考え
ると、制限酵素ＢｇｌＩ、ＡｌｗＮＩ、ＤｒａＩＩＩ、
ＰｆｌＭＩ、ＢｓｌＩ、ＭｗｏＩ、これらのｉｓｏｓｃ
ｈｉｚｏｍｅｒなどが制限酵素Ｘとして好ましく、なか
でも制限酵素ＳｆｉＩ切断部位をも切断可能な制限酵素
ＢｇｌＩが最も好ましい。これらの制限酵素は、中央の
塩基が任意に設定できるものである。
セプタープラスミドに挿入するＤＮＡ断片は、その両端
がアクセプタープラスミドの制限酵素ＳｆｉＩによって
与えられる切断面（即ち、前記ＳｆｉＩ認識配列のＮ2
Ｎ3Ｎ4が３’側に突出した断面と、Ｎ2cＮ3cＮ4cが３’
側に突出した断面）と連結できるように、一端はＮ2Ｎ3
Ｎ4が３’側に突出した断面であり、もう一端はＮ2cＮ
3cＮ4cが３’側に突出した断面を有するものである。さ
らにこの断面のうち一端のみが制限酵素ＳｆｉＩ切断面
と同じであり、もう一端は制限酵素ＳｆｉＩ切断面であ
ってはならず、制限酵素ＳｆｉＩ以外の制限酵素Ｘの切
断面である。本発明において、制限酵素Ｘは、その断面
がアクセプタープラスミドのＳｆｉＩ切断面と連結する
必要があることから、ＳｆｉＩと同じの方向に３塩基が
突出する切断面を与える制限酵素であればよい。組み換
え体構築の設計の便利さや認識部位の特異性などを考え
ると、制限酵素ＢｇｌＩ、ＡｌｗＮＩ、ＤｒａＩＩＩ、
ＰｆｌＭＩ、ＢｓｌＩ、ＭｗｏＩ、これらのｉｓｏｓｃ
ｈｉｚｏｍｅｒなどが制限酵素Ｘとして好ましく、なか
でも制限酵素ＳｆｉＩ切断部位をも切断可能な制限酵素
ＢｇｌＩが最も好ましい。これらの制限酵素は、中央の
塩基が任意に設定できるものである。
【００１１】もちろん、この挿入ＤＮＡ断片の大きさや
読みの方向などは任意に選択することができる。また、
挿入ＤＮＡ断片中には、抗原遺伝子やマーカー遺伝子な
ど発現させる目的の遺伝子（以下、目的遺伝子というこ
とがある）が含まれているが、このほか転写制御因子、
シグナル配列などのレギュレーター遺伝子も連結したハ
イブリッドＤＮＡが一般的な組み換え技術では用いられ
る。このようなハイブリッドＤＮＡを作製するため、プ
ラスミドなどのベクターを用いることがある。本発明に
おいては、このようなベクターをドナーと言うことがあ
る。ドナーとなるベクターは、通常マルチプルクローニ
ングサイトを有するプラスミドを用いる。
読みの方向などは任意に選択することができる。また、
挿入ＤＮＡ断片中には、抗原遺伝子やマーカー遺伝子な
ど発現させる目的の遺伝子（以下、目的遺伝子というこ
とがある）が含まれているが、このほか転写制御因子、
シグナル配列などのレギュレーター遺伝子も連結したハ
イブリッドＤＮＡが一般的な組み換え技術では用いられ
る。このようなハイブリッドＤＮＡを作製するため、プ
ラスミドなどのベクターを用いることがある。本発明に
おいては、このようなベクターをドナーと言うことがあ
る。ドナーとなるベクターは、通常マルチプルクローニ
ングサイトを有するプラスミドを用いる。
【００１２】挿入ＤＮＡ断片の構造は基本的には、［制
限酵素Ｘ切断部位］−［目的遺伝子等］−［制限酵素Ｓ
ｆｉＩ切断部位］の順に連結されたものであり、ドナー
を用いて挿入ＤＮＡ断片を得る場合の構造は、［制限酵
素Ｘ切断部位］−［クローニングサイト（目的遺伝子等
が挿入されている）］−［制限酵素ＳｆｉＩ切断部位］
の順に連結されたものである。目的遺伝子はドナー由来
のクローニングサイト中に挿入されるのが一般的であ
る。ここで挿入されてる各種遺伝子の由来は、ほ乳類、
鳥類、魚類、昆虫などの脊椎または無脊椎動物はもとよ
り、植物、原生生物、ウイルスなどいかなるものであっ
てもよい。
限酵素Ｘ切断部位］−［目的遺伝子等］−［制限酵素Ｓ
ｆｉＩ切断部位］の順に連結されたものであり、ドナー
を用いて挿入ＤＮＡ断片を得る場合の構造は、［制限酵
素Ｘ切断部位］−［クローニングサイト（目的遺伝子等
が挿入されている）］−［制限酵素ＳｆｉＩ切断部位］
の順に連結されたものである。目的遺伝子はドナー由来
のクローニングサイト中に挿入されるのが一般的であ
る。ここで挿入されてる各種遺伝子の由来は、ほ乳類、
鳥類、魚類、昆虫などの脊椎または無脊椎動物はもとよ
り、植物、原生生物、ウイルスなどいかなるものであっ
てもよい。
【００１３】（組み換え体作製方法）本発明において
は、上述してきたアクセプタープラスミドと挿入ＤＮＡ
断片とを用いて組み換え体（組み換えプラスミド）を構
築することができる。先にも触れたとおり本発明の組み
換え体は、また、アクセプタープラスミドとしても機能
するため、同じ操作を繰り返すことにより多価組み換え
体（多価組み換えプラスミド）を得ることができる。
は、上述してきたアクセプタープラスミドと挿入ＤＮＡ
断片とを用いて組み換え体（組み換えプラスミド）を構
築することができる。先にも触れたとおり本発明の組み
換え体は、また、アクセプタープラスミドとしても機能
するため、同じ操作を繰り返すことにより多価組み換え
体（多価組み換えプラスミド）を得ることができる。
【００１４】具体的な組み換え体の作製方法としては、
次の方法が挙げられる。常法によりドナーとなるプラス
ミドを構築した後、制限酵素ＸおよびＳｆｉＩで切断し
て挿入ＤＮＡ断片（遺伝子カートリッジ）を得て、これ
をアクセプタープラスミドのＳｆｉＩ切断部位に挿入す
る。前記ＳｆｉＩ認識配列のＮ2Ｎ3Ｎ4は回文配列では
ないので挿入される遺伝子の方向は一義的に決まる。制
限酵素Ｘ切断部位が導入しようとする任意の遺伝子内部
にも存在する場合には、ドナーをＳｆｉＩで完全分解
後、制限酵素Ｘで部分分解すればよい。制限酵素Ｘの中
ではＢｇｌＩを用いた場合、ＳｆｉＩ部位は自動的にＢ
ｇｌＩでも切断されるため、単にＢｇｌＩで切断するだ
けで遺伝子カートリッジを調製することができる。この
ようにして簡便に任意の遺伝子を単一方向にアクセプタ
ープラスミドのＳｆｉＩサイトに導入することができ
る。ＳｆｉＩは８塩基認識であることから、全く同じ塩
基配列のＳｆｉＩサイトが生じる確率は殆どないと言え
るため、ここでできたプラスミドは挿入した任意の遺伝
子中にＳｆｉＩ切断部位がない限りただひとつのＳｆｉ
Ｉ切断部位を持つことになる。
次の方法が挙げられる。常法によりドナーとなるプラス
ミドを構築した後、制限酵素ＸおよびＳｆｉＩで切断し
て挿入ＤＮＡ断片（遺伝子カートリッジ）を得て、これ
をアクセプタープラスミドのＳｆｉＩ切断部位に挿入す
る。前記ＳｆｉＩ認識配列のＮ2Ｎ3Ｎ4は回文配列では
ないので挿入される遺伝子の方向は一義的に決まる。制
限酵素Ｘ切断部位が導入しようとする任意の遺伝子内部
にも存在する場合には、ドナーをＳｆｉＩで完全分解
後、制限酵素Ｘで部分分解すればよい。制限酵素Ｘの中
ではＢｇｌＩを用いた場合、ＳｆｉＩ部位は自動的にＢ
ｇｌＩでも切断されるため、単にＢｇｌＩで切断するだ
けで遺伝子カートリッジを調製することができる。この
ようにして簡便に任意の遺伝子を単一方向にアクセプタ
ープラスミドのＳｆｉＩサイトに導入することができ
る。ＳｆｉＩは８塩基認識であることから、全く同じ塩
基配列のＳｆｉＩサイトが生じる確率は殆どないと言え
るため、ここでできたプラスミドは挿入した任意の遺伝
子中にＳｆｉＩ切断部位がない限りただひとつのＳｆｉ
Ｉ切断部位を持つことになる。
【００１５】更に、こうして得られたプラスミドは再び
アクセプタープラスミドとして利用できる。即ち、得ら
れた組み換え体を制限酵素ＳｆｉＩで分解し、別に作製
したドナーから新たな挿入ＤＮＡ断片（遺伝子カートリ
ッジ）を同様の方法で切り出し、再び連結させる操作を
繰り返すことにより、複数の遺伝子（同一の遺伝子でも
良い）を連続してかつ簡便に任意の方向に導入すること
ができる。
アクセプタープラスミドとして利用できる。即ち、得ら
れた組み換え体を制限酵素ＳｆｉＩで分解し、別に作製
したドナーから新たな挿入ＤＮＡ断片（遺伝子カートリ
ッジ）を同様の方法で切り出し、再び連結させる操作を
繰り返すことにより、複数の遺伝子（同一の遺伝子でも
良い）を連続してかつ簡便に任意の方向に導入すること
ができる。
【００１６】（形質転換と組み換えウイルス）以上の方
法により得られた本発明の（多価）組み換え体は、常法
により大腸菌、枯草菌、セラチア菌、サルモネラ菌、放
線菌などの原核微生物を始め、糸状菌（カビ）、酵母な
どの真核微生物、鶏胚線繊芽細胞、ヒト骨髄細胞などの
高等真核細胞などの宿主細胞に移入して形質転換体を得
ることができる。
法により得られた本発明の（多価）組み換え体は、常法
により大腸菌、枯草菌、セラチア菌、サルモネラ菌、放
線菌などの原核微生物を始め、糸状菌（カビ）、酵母な
どの真核微生物、鶏胚線繊芽細胞、ヒト骨髄細胞などの
高等真核細胞などの宿主細胞に移入して形質転換体を得
ることができる。
【００１７】また、同様に組み換えウイルスも、本発明
の（多価）組み換え体を用いて常法に従って構築するこ
とができる。もちろん用いるウイルスは、使用目的によ
り任意に選択することができ、例えばワクチニアウイル
スなどに代表されるオルソポックスウイルス；フォウル
ポックスウイルスなどに代表されるアビポックスウイル
スなどのポックスウイルス；単純ヘルペスウイルス、シ
ュードレービスウイルス、七面鳥ヘルペスウイルスなど
のヘルペスウイルス；ヒトアデノウイルス２型、ヒトア
デノウイルス５型などのアデノウイルス；などが例示さ
れる。
の（多価）組み換え体を用いて常法に従って構築するこ
とができる。もちろん用いるウイルスは、使用目的によ
り任意に選択することができ、例えばワクチニアウイル
スなどに代表されるオルソポックスウイルス；フォウル
ポックスウイルスなどに代表されるアビポックスウイル
スなどのポックスウイルス；単純ヘルペスウイルス、シ
ュードレービスウイルス、七面鳥ヘルペスウイルスなど
のヘルペスウイルス；ヒトアデノウイルス２型、ヒトア
デノウイルス５型などのアデノウイルス；などが例示さ
れる。
【００１８】
【発明の効果】本発明の多価組み換え体は、多価ワクチ
ンとして有用であり、本発明の方法によれば、この多価
ワクチンの原料となる組み換え体、組み換えウイルス、
形質転換体を簡便に得ることができる。
ンとして有用であり、本発明の方法によれば、この多価
ワクチンの原料となる組み換え体、組み換えウイルス、
形質転換体を簡便に得ることができる。
【００１９】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、
本発明はこれに限定されるものではない。
本発明はこれに限定されるものではない。
【００２０】（実施例１） ドナープラスミドｐＧＴＰ
ｓおよびｐＧＴＰ７．５の構築（図１参照） ｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位に合成ＤＮ
Ａ（５’−ＡＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴ
ＴＧＣＡ−３’（配列番号１））を挿入し、次いで得ら
れたプラスミドのＳａｌＩ−ＫｐｎＩ部位に合成ＤＮＡ
（５’−ＴＣＧＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣ−３’
（配列番号２））を挿入し、さらに、ここで得られたプ
ラスミドのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位に２本の合成ＤＮ
Ａ（５’−ＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＣＣＡＧ
ＣＴ−３’（配列番号３））および（５’−ＧＧＣＣＣ
ＣＣＣＣＧＧＣＣＧ−３’（配列番号４））をアニール
させたものを挿入し、最後にこのプラスミドのＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＳａｌＩ部位にプラスミドｐＮＺ１７２９Ｒ
（Ｙａｎａｇｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．、６６、１４０２−１４０８、１９９２）をＨｉｎ
ｄＩＩＩとＳａｌＩで消化して得られた約１４０ｂｐの
ＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＧＴＰｓを構築し
た。
ｓおよびｐＧＴＰ７．５の構築（図１参照） ｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位に合成ＤＮ
Ａ（５’−ＡＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴ
ＴＧＣＡ−３’（配列番号１））を挿入し、次いで得ら
れたプラスミドのＳａｌＩ−ＫｐｎＩ部位に合成ＤＮＡ
（５’−ＴＣＧＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣ−３’
（配列番号２））を挿入し、さらに、ここで得られたプ
ラスミドのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位に２本の合成ＤＮ
Ａ（５’−ＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＣＣＡＧ
ＣＴ−３’（配列番号３））および（５’−ＧＧＣＣＣ
ＣＣＣＣＧＧＣＣＧ−３’（配列番号４））をアニール
させたものを挿入し、最後にこのプラスミドのＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＳａｌＩ部位にプラスミドｐＮＺ１７２９Ｒ
（Ｙａｎａｇｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．、６６、１４０２−１４０８、１９９２）をＨｉｎ
ｄＩＩＩとＳａｌＩで消化して得られた約１４０ｂｐの
ＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＧＴＰｓを構築し
た。
【００２１】これとは別に、ｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＰｓｔＩ部位に合成ＤＮＡ（５’−ＡＧＣＴＧＣＣ
ＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡ−３’（配列番号
１））を挿入し、次いでここで得られたプラスミドのＳ
ａｌＩ−ＫｐｎＩ部位に合成ＤＮＡ（５’−ＴＣＧＡＣ
ＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣ−３’（配列番号２））を挿
入し、さらにここで得られたプラスミドのＳａｃＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ部位に２本の合成ＤＮＡ（５’−ＡＡＴＴＣＧ
ＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号
３）および５’−ＧＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＣＧ−３’
（配列番号４））をアニールさせたものを挿入し、最後
にこのプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位にプ
ラスミドｐＮＺ１０３７（Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，
Ｖａｃｃｉｎｅ、８、４８６−４９０、１９９０）をＨ
ｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化して得られた約２７０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＧＴＰ７．５
を構築した。
Ｉ−ＰｓｔＩ部位に合成ＤＮＡ（５’−ＡＧＣＴＧＣＣ
ＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡ−３’（配列番号
１））を挿入し、次いでここで得られたプラスミドのＳ
ａｌＩ−ＫｐｎＩ部位に合成ＤＮＡ（５’−ＴＣＧＡＣ
ＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣ−３’（配列番号２））を挿
入し、さらにここで得られたプラスミドのＳａｃＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ部位に２本の合成ＤＮＡ（５’−ＡＡＴＴＣＧ
ＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号
３）および５’−ＧＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＣＧ−３’
（配列番号４））をアニールさせたものを挿入し、最後
にこのプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位にプ
ラスミドｐＮＺ１０３７（Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，
Ｖａｃｃｉｎｅ、８、４８６−４９０、１９９０）をＨ
ｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化して得られた約２７０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＧＴＰ７．５
を構築した。
【００２２】このプラスミドｐＧＴＰｓは［制限酵素Ｂ
ｇｌＩ認識部位］−［ポックスウイルス合成プロモータ
ーＰｓ］−［異種遺伝子導入のためのマルチプルクロー
ニングサイト］−［ポックスウイルス初期転写終結シグ
ナル］−［制限酵素ＳｆｉＩ認識部位］の順に連結され
た構造を有し、プラスミドｐＧＴＰ７．５は、［制限酵
素ＢｇｌＩ認識部位］−［ワクチニアウイルス７．５プ
ロモーター］−［異種遺伝子導入のためのマルチプルク
ローニングサイト］−［ポックスウイルス初期転写終結
シグナル］−［制限酵素ＳｆｉＩ認識部位］の順に連結
された構造を有している。これらのプラスミドのマルチ
プルクローニングサイトに挿入したい抗原遺伝子を挿入
し、ＢｇｌＩで切断することで簡単に挿入ＤＮＡ断片
（遺伝子カートリッジ）が作製できる。
ｇｌＩ認識部位］−［ポックスウイルス合成プロモータ
ーＰｓ］−［異種遺伝子導入のためのマルチプルクロー
ニングサイト］−［ポックスウイルス初期転写終結シグ
ナル］−［制限酵素ＳｆｉＩ認識部位］の順に連結され
た構造を有し、プラスミドｐＧＴＰ７．５は、［制限酵
素ＢｇｌＩ認識部位］−［ワクチニアウイルス７．５プ
ロモーター］−［異種遺伝子導入のためのマルチプルク
ローニングサイト］−［ポックスウイルス初期転写終結
シグナル］−［制限酵素ＳｆｉＩ認識部位］の順に連結
された構造を有している。これらのプラスミドのマルチ
プルクローニングサイトに挿入したい抗原遺伝子を挿入
し、ＢｇｌＩで切断することで簡単に挿入ＤＮＡ断片
（遺伝子カートリッジ）が作製できる。
【００２３】（実施例２） アクセプタープラスミドｐ
ＮＺ１８２９Ｒの構築（図２参照） プラスミドｐＮＺ１７２９Ｒ（Ｙａｎａｇｉｄａ ｅｔ
ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、１４０２−１４０
８、１９９２）をＥｃｏＲＩとＳａｃＩで消化し、この
部位に配列番号３と配列番号４に記載の２種類の合成Ｄ
ＮＡ（５’−ＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＣＣＡ
ＧＣＴ−３’（配列番号３）および５’−ＧＧＣＣＣＣ
ＣＣＣＧＧＣＣＧ−３’（配列番号４））をアニーリン
グしたＳｆｉＩ部位を含む合成アダプターを挿入し、プ
ラスミドｐＮＺ１８２９Ｒを構築した。
ＮＺ１８２９Ｒの構築（図２参照） プラスミドｐＮＺ１７２９Ｒ（Ｙａｎａｇｉｄａ ｅｔ
ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、１４０２−１４０
８、１９９２）をＥｃｏＲＩとＳａｃＩで消化し、この
部位に配列番号３と配列番号４に記載の２種類の合成Ｄ
ＮＡ（５’−ＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＣＣＡ
ＧＣＴ−３’（配列番号３）および５’−ＧＧＣＣＣＣ
ＣＣＣＧＧＣＣＧ−３’（配列番号４））をアニーリン
グしたＳｆｉＩ部位を含む合成アダプターを挿入し、プ
ラスミドｐＮＺ１８２９Ｒを構築した。
【００２４】（実施例３） アクセプタープラスミドｐ
ＮＺ６９２９Ｓｆｉの構築（図３参照） プラスミドｐＮＺ９８（特開平３−２７２８４号公報記
載のニューカッスル病ウイルス由来のＦ抗原遺伝子を有
するプラスミド）をＳａｃＩで部分消化後、さらにＢａ
ｍＨＩで部分消化し、約１．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を回
収した。一方、プラスミドｐＮＺ１８２９ＲをＢａｍＨ
Ｉで消化後、さらにＳａｃＩで部分消化し、前述の約
１．９ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩＤＮＡ断片を挿入
して目的のプラスミドｐＮＺ５９２９を構築した。プラ
スミドｐＮＺ８７（特開昭６３−２３９２３９号公報記
載のニューカッスル病ウイルス由来のＨＮ抗原遺伝子を
有するプラスミド）をＨｉｎｄＩＩＩで切断後ＡｖａＩ
Ｉで部分消化して得た最も大きな断片と、プラスミドｐ
ＮＺ１８２９ＲをＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで消化し
て得た９５ｂｐの断片に、配列番号５と配列番号６に記
載の２種類の合成ＤＮＡ（５’−ＧＡＴＣＣＡＧＣＡＴ
Ｇ−３’（配列番号５）および５’−ＧＴＣＣＡＴＧＣ
ＴＧ−３’（配列番号６））をアニールしたものを加え
てプラスミドｐＮＺ２９２９Ｒを構築した。このプラス
ミドｐＮＺ２９２９ＲをＨｉｎｄＩＩＩで切断後Ｂａｍ
ＨＩで部分消化し、約１．９ｋｂの断片を得る。この断
片をＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用い
て平滑末端とした後、ＳｍａＩで消化したプラスミドｐ
ＮＺ５９２９に挿入してアクセプタープラスミドｐＮＺ
６９２９Ｓｆｉを得た。
ＮＺ６９２９Ｓｆｉの構築（図３参照） プラスミドｐＮＺ９８（特開平３−２７２８４号公報記
載のニューカッスル病ウイルス由来のＦ抗原遺伝子を有
するプラスミド）をＳａｃＩで部分消化後、さらにＢａ
ｍＨＩで部分消化し、約１．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を回
収した。一方、プラスミドｐＮＺ１８２９ＲをＢａｍＨ
Ｉで消化後、さらにＳａｃＩで部分消化し、前述の約
１．９ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩＤＮＡ断片を挿入
して目的のプラスミドｐＮＺ５９２９を構築した。プラ
スミドｐＮＺ８７（特開昭６３−２３９２３９号公報記
載のニューカッスル病ウイルス由来のＨＮ抗原遺伝子を
有するプラスミド）をＨｉｎｄＩＩＩで切断後ＡｖａＩ
Ｉで部分消化して得た最も大きな断片と、プラスミドｐ
ＮＺ１８２９ＲをＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで消化し
て得た９５ｂｐの断片に、配列番号５と配列番号６に記
載の２種類の合成ＤＮＡ（５’−ＧＡＴＣＣＡＧＣＡＴ
Ｇ−３’（配列番号５）および５’−ＧＴＣＣＡＴＧＣ
ＴＧ−３’（配列番号６））をアニールしたものを加え
てプラスミドｐＮＺ２９２９Ｒを構築した。このプラス
ミドｐＮＺ２９２９ＲをＨｉｎｄＩＩＩで切断後Ｂａｍ
ＨＩで部分消化し、約１．９ｋｂの断片を得る。この断
片をＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用い
て平滑末端とした後、ＳｍａＩで消化したプラスミドｐ
ＮＺ５９２９に挿入してアクセプタープラスミドｐＮＺ
６９２９Ｓｆｉを得た。
【００２５】（実施例４）マレック病ウイルス（ＭＤ
Ｖ）ｇＥ，およびｇＩ遺伝子のクローニング ＭＤＶのＧＡ株が感染した鶏繊維芽細胞（ＣＥＦ；chic
ken embrionic fibroblast）細胞をトリプシン処理でシ
ャーレより回収し、ＰＢＳで２回その細胞を洗った後、
プロテナーゼＫバッファー（１０ｍＭ トリス塩酸（ｐ
Ｈ７．８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ）で
縣濁し、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を５０μｇ／ｍｌの濃度にな
るように加えた。５５℃で２時間放置した後、フェノー
ル／クロロホルムで２回、タンパク質の除去を行い、２
倍量のエタノールを加えて−２０℃で２０分間放置した
後、遠心し、ＭＤＶのＧＡ株のゲノムＤＮＡを得た。
Ｖ）ｇＥ，およびｇＩ遺伝子のクローニング ＭＤＶのＧＡ株が感染した鶏繊維芽細胞（ＣＥＦ；chic
ken embrionic fibroblast）細胞をトリプシン処理でシ
ャーレより回収し、ＰＢＳで２回その細胞を洗った後、
プロテナーゼＫバッファー（１０ｍＭ トリス塩酸（ｐ
Ｈ７．８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ）で
縣濁し、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を５０μｇ／ｍｌの濃度にな
るように加えた。５５℃で２時間放置した後、フェノー
ル／クロロホルムで２回、タンパク質の除去を行い、２
倍量のエタノールを加えて−２０℃で２０分間放置した
後、遠心し、ＭＤＶのＧＡ株のゲノムＤＮＡを得た。
【００２６】ｇＩ、ｇＥ両遺伝子をＭＤＶのＧＡ株のゲ
ノムＤＮＡからクローニングするためにＶｅｌｉｃｅｒ
らが発表したＭＤＶのＧＡ株のユニークショート領域の
塩基配列（米国特許５，２５２，７１６号）をもとに２
種のＤＮＡプライマー（５’−ＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧ
ＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴＡ−３’（配
列番号７）および５’−ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＴＣＧＡ
ＣＡＡＴＡＡＡＴＴ−３’ （配列番号８））を使用し
た。これらのプライマーを用いて先に得たＭＤＶのＧＡ
株ゲノムＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ・チェーン・
リアクション（以下、ＰＣＲという）により、ｇＩ遺伝
子の全長及びｇＥ遺伝子の一部を有するＤＮＡ断片の増
幅を行った。反応組成はＭＤＶゲノムＤＮＡ２０ｐｇを
含む水溶液６４．５μｌに８μｌの１０倍濃縮ＰＣＲ反
応バッファー（２００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．
４）、５００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2）、
４μｌの２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．５μｌの５Ｕ／
μｌ タックポリメラーゼ及び１μｌずつ２０μＭの各
プライマーを加えた。反応条件は、変性９５℃１分間、
アニール５５℃２分間、ポリメラーゼ反応７２℃２分
間、３０サイクルをパーキンエルマーシータス社製のサ
ーマルサイクラー４８０で行った。その結果、ｇＩ遺伝
子の全長とｇＥ遺伝子の５’側の一部の塩基配列を含む
約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
ノムＤＮＡからクローニングするためにＶｅｌｉｃｅｒ
らが発表したＭＤＶのＧＡ株のユニークショート領域の
塩基配列（米国特許５，２５２，７１６号）をもとに２
種のＤＮＡプライマー（５’−ＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧ
ＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴＡ−３’（配
列番号７）および５’−ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＴＣＧＡ
ＣＡＡＴＡＡＡＴＴ−３’ （配列番号８））を使用し
た。これらのプライマーを用いて先に得たＭＤＶのＧＡ
株ゲノムＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ・チェーン・
リアクション（以下、ＰＣＲという）により、ｇＩ遺伝
子の全長及びｇＥ遺伝子の一部を有するＤＮＡ断片の増
幅を行った。反応組成はＭＤＶゲノムＤＮＡ２０ｐｇを
含む水溶液６４．５μｌに８μｌの１０倍濃縮ＰＣＲ反
応バッファー（２００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．
４）、５００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2）、
４μｌの２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．５μｌの５Ｕ／
μｌ タックポリメラーゼ及び１μｌずつ２０μＭの各
プライマーを加えた。反応条件は、変性９５℃１分間、
アニール５５℃２分間、ポリメラーゼ反応７２℃２分
間、３０サイクルをパーキンエルマーシータス社製のサ
ーマルサイクラー４８０で行った。その結果、ｇＩ遺伝
子の全長とｇＥ遺伝子の５’側の一部の塩基配列を含む
約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００２７】前記ＭＤＶのＧＡ株を各種制限酵素で切断
後、０．８％アガロースゲルで電気泳動を行い、ゲル中
のＤＮＡ断片をナイロンメンブレンにトランスファー
し、前述のＰＣＲ産物をプローブとしたサザンハイブリ
ダイゼーションを行った。その結果、ｇＩ遺伝子を含む
約１．１ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩＤＮＡ断片とｇ
Ｅ遺伝子を含む約６．０ｋｂｐのＢｇｌＩＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩＤＮＡ断片がハイブリダイズしていることを確認
した。これらのＤＮＡ断片は、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ
−ＫｐｎＩ部位とＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にク
ローニングし、それぞれｐＵＣ−ｇＩ−１とｐＵＣ−ｇ
Ｅ−１を得た。ｐＵＣ−ｇＥ−１にクローニングした約
６．０ｋｂｐのＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片
を各種制限酵素で切断して、制限酵素地図を作製した。
これを利用して、ｇＥ遺伝子を含む約２．２ｋｂｐのＫ
ｐｎＩ−ＨｐａＩＤＮＡ断片をｐＵＣ１８のＫｐｎＩ−
ＨｉｎｃＩＩ部位にサブクローニングし、ｐＵＣ−ｇＥ
−２を得た。サンガーのダイデオキシチェーンターミネ
ーション法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｏｃ．ＵＳＡ、７４、５４６３
−５４６７、１９７７）によって、ｐＵＣ−ｇＥ−２の
一連の欠失変異体の配列を調べることにより、ｇＥ遺伝
子がこのプラスミドに挿入されていることを確認した。
後、０．８％アガロースゲルで電気泳動を行い、ゲル中
のＤＮＡ断片をナイロンメンブレンにトランスファー
し、前述のＰＣＲ産物をプローブとしたサザンハイブリ
ダイゼーションを行った。その結果、ｇＩ遺伝子を含む
約１．１ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩＤＮＡ断片とｇ
Ｅ遺伝子を含む約６．０ｋｂｐのＢｇｌＩＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩＤＮＡ断片がハイブリダイズしていることを確認
した。これらのＤＮＡ断片は、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ
−ＫｐｎＩ部位とＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にク
ローニングし、それぞれｐＵＣ−ｇＩ−１とｐＵＣ−ｇ
Ｅ−１を得た。ｐＵＣ−ｇＥ−１にクローニングした約
６．０ｋｂｐのＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片
を各種制限酵素で切断して、制限酵素地図を作製した。
これを利用して、ｇＥ遺伝子を含む約２．２ｋｂｐのＫ
ｐｎＩ−ＨｐａＩＤＮＡ断片をｐＵＣ１８のＫｐｎＩ−
ＨｉｎｃＩＩ部位にサブクローニングし、ｐＵＣ−ｇＥ
−２を得た。サンガーのダイデオキシチェーンターミネ
ーション法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｏｃ．ＵＳＡ、７４、５４６３
−５４６７、１９７７）によって、ｐＵＣ−ｇＥ−２の
一連の欠失変異体の配列を調べることにより、ｇＥ遺伝
子がこのプラスミドに挿入されていることを確認した。
【００２８】（実施例５）ドナープラスミドｐＧＴＰｓ
ＭＤｇＢ、ｐＧＴＰｓＭＤｇＥ、およびｐＧＴＰ７．５
ＭＤｇＩの構築（図４、５参照） プラスミドｐＮＺ２９ＲＭＤｇＢ（Ｙａｎａｇｉｄａ
ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、１４０２−１
４０８、１９９２）をＳａｌＩで消化後、ＢａｍＨＩで
部分消化して得た約２．９ｋｂの断片をプラスミドｐＧ
ＴＰｓをＳａｌＩ，ＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＧＴＰ
ｓＭＤｇＢを得た。実施例４で得たｐＵＣ−ｇＥ−１を
鋳型とし、配列番号９と１０に示すプライマーを利用し
てＰＣＲを行った。反応組成及び条件は、実施例４と同
様とした。得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩとＳａｌＩ
で消化後、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し、プラ
スミドｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＰｓｔＩ部位
の間にＢｇｌＩＩ部位を作るための合成ＤＮＡ（５’−
ＡＧＣＴＡＧＡＴＣＴＴＧＣＡ−３’（配列番号１
１））を組み込んで調製したプラスミドｐＵＣ１８−Ｘ
ＧのＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ部位に挿入し、プラスミドｐ
ＵＣ−ｇＥ−ＰＣＲを構築した。挿入したＤＮＡ断片の
塩基配列を確認したが、ＰＣＲ中に如何なる変異も見ら
れなかった。このプラスミドｐＵＣ１８−ｇＥ−ＰＣＲ
をＢｇｌＩＩとＳａｌＩで消化後、約１．５ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片を回収し、ｐＧＴＰｓのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ
部位に挿入し、プラスミドｐＧＴＰｓ−ｇＥを構築し
た。
ＭＤｇＢ、ｐＧＴＰｓＭＤｇＥ、およびｐＧＴＰ７．５
ＭＤｇＩの構築（図４、５参照） プラスミドｐＮＺ２９ＲＭＤｇＢ（Ｙａｎａｇｉｄａ
ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、１４０２−１
４０８、１９９２）をＳａｌＩで消化後、ＢａｍＨＩで
部分消化して得た約２．９ｋｂの断片をプラスミドｐＧ
ＴＰｓをＳａｌＩ，ＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＧＴＰ
ｓＭＤｇＢを得た。実施例４で得たｐＵＣ−ｇＥ−１を
鋳型とし、配列番号９と１０に示すプライマーを利用し
てＰＣＲを行った。反応組成及び条件は、実施例４と同
様とした。得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩとＳａｌＩ
で消化後、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し、プラ
スミドｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＰｓｔＩ部位
の間にＢｇｌＩＩ部位を作るための合成ＤＮＡ（５’−
ＡＧＣＴＡＧＡＴＣＴＴＧＣＡ−３’（配列番号１
１））を組み込んで調製したプラスミドｐＵＣ１８−Ｘ
ＧのＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ部位に挿入し、プラスミドｐ
ＵＣ−ｇＥ−ＰＣＲを構築した。挿入したＤＮＡ断片の
塩基配列を確認したが、ＰＣＲ中に如何なる変異も見ら
れなかった。このプラスミドｐＵＣ１８−ｇＥ−ＰＣＲ
をＢｇｌＩＩとＳａｌＩで消化後、約１．５ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片を回収し、ｐＧＴＰｓのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ
部位に挿入し、プラスミドｐＧＴＰｓ−ｇＥを構築し
た。
【００２９】（実施例６）多価組み換え鶏痘ウイルス作
製用プラスミドｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢ、ｐ
ＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢｇＥ、およびｐＮＺ２
９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢｇＥｇＩの構築（図６参照） ドナープラスミドｐＧＴＰｓＭＤｇＢをＢｇｌＩで消化
して得た約３．０ｋｂの断片を、アクセプタープラスミ
ドｐＮＺ６９２９ＳｆｉのＳｆｉＩ部位に挿入してプラ
スミドｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢを得た。十分
量の挿入断片を使用することで末端フォスファターゼ処
理などをせずに高い組み込み効率を達成した。具体的に
はランダムに２４個の形質転換体のプラスミドを調べ、
１２個が挿入断片なし、６個がひとつの挿入があったも
の、残りの６つはＭＤｇＢが２つタンデムに挿入された
ものであった。
製用プラスミドｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢ、ｐ
ＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢｇＥ、およびｐＮＺ２
９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢｇＥｇＩの構築（図６参照） ドナープラスミドｐＧＴＰｓＭＤｇＢをＢｇｌＩで消化
して得た約３．０ｋｂの断片を、アクセプタープラスミ
ドｐＮＺ６９２９ＳｆｉのＳｆｉＩ部位に挿入してプラ
スミドｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢを得た。十分
量の挿入断片を使用することで末端フォスファターゼ処
理などをせずに高い組み込み効率を達成した。具体的に
はランダムに２４個の形質転換体のプラスミドを調べ、
１２個が挿入断片なし、６個がひとつの挿入があったも
の、残りの６つはＭＤｇＢが２つタンデムに挿入された
ものであった。
【００３０】ここで得られたプラスミドｐＮＺ２９ＲＮ
ＤＦＨＮ−ＭＤｇＢを再びアクセプタープラスミドとし
て使用して次の遺伝子の挿入を試みた。ドナープラスミ
ドｐＧＴＰｓＭＤｇＥをＢｇｌＩで消化し、生じた約
１．７ｋｂの断片をｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢ
のＳｆｉＩ部位に挿入し、ｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−Ｍ
ＤｇＢｇＥを得た。全く同様にしてドナープラスミドｐ
ＧＴＰ７．５ＭＤｇＩをＢｇｌＩで消化後、約１．４ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を先に得
たｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢｇＥのＳｆｉＩ部
位に挿入し、プラスミドｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤ
ｇＢｇＥｇＩを構築した。
ＤＦＨＮ−ＭＤｇＢを再びアクセプタープラスミドとし
て使用して次の遺伝子の挿入を試みた。ドナープラスミ
ドｐＧＴＰｓＭＤｇＥをＢｇｌＩで消化し、生じた約
１．７ｋｂの断片をｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢ
のＳｆｉＩ部位に挿入し、ｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−Ｍ
ＤｇＢｇＥを得た。全く同様にしてドナープラスミドｐ
ＧＴＰ７．５ＭＤｇＩをＢｇｌＩで消化後、約１．４ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を先に得
たｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢｇＥのＳｆｉＩ部
位に挿入し、プラスミドｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤ
ｇＢｇＥｇＩを構築した。
【００３１】（実施例７） 組み換え鶏痘ウイルスの作
製と純化 モノレイヤーになったＣＥＦに鶏痘ウイルスのワクチン
から単離した大型プラーク形成を表現型としてもつウイ
ルス（Ｎａｚｅｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｖｉａｎ
Ｄｉｓ．、３３、４５８−４６５、１９８９）を０．１
の感染多重度で感染した。３時間後、これらの細胞をト
リプシン処理で剥がし、細胞縣濁液とした。この縣濁液
からの２×１０7個の細胞と１０μｇの組み換え鶏痘ウ
イルス作製用プラスミドｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤ
ｇＢ（実施例６）を混合した。この細胞と組み換え用プ
ラスミドの混合物をＳａｌｉｎｅ Ｇ（０．１４Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．５ｍＭ ＫＣｌ、１．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０１１％
グルコース）に懸濁し、室温において、ジーンパルサ
ー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）３．０ＫＶ／ｃｍ、０．４ｍｓ
ｅｃ条件下でエレクトロポレーションした。プラスミド
を導入した細胞を、その後３７℃で７２時間培養し、３
回の凍結融解によって細胞を溶解した。放出した組み換
えウイルスは次のように選別された。
製と純化 モノレイヤーになったＣＥＦに鶏痘ウイルスのワクチン
から単離した大型プラーク形成を表現型としてもつウイ
ルス（Ｎａｚｅｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｖｉａｎ
Ｄｉｓ．、３３、４５８−４６５、１９８９）を０．１
の感染多重度で感染した。３時間後、これらの細胞をト
リプシン処理で剥がし、細胞縣濁液とした。この縣濁液
からの２×１０7個の細胞と１０μｇの組み換え鶏痘ウ
イルス作製用プラスミドｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤ
ｇＢ（実施例６）を混合した。この細胞と組み換え用プ
ラスミドの混合物をＳａｌｉｎｅ Ｇ（０．１４Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．５ｍＭ ＫＣｌ、１．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０１１％
グルコース）に懸濁し、室温において、ジーンパルサ
ー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）３．０ＫＶ／ｃｍ、０．４ｍｓ
ｅｃ条件下でエレクトロポレーションした。プラスミド
を導入した細胞を、その後３７℃で７２時間培養し、３
回の凍結融解によって細胞を溶解した。放出した組み換
えウイルスは次のように選別された。
【００３２】溶解した細胞からは子孫ウイルスが放出さ
れるが、その溶解液の１０倍段階希釈液をＣＥＦに感染
させ、生育培地を含んだ１０ｍｌの寒天溶液を重層し
た。室温中で寒天を固めた後、典型的な鶏痘ウイルスの
プラークが出現するまで３７℃で培養した。さらにＢｌ
ｕｏ−ｇａｌを６００μｇ／ｍｌ含んだ別の寒天１０ｍ
ｌをそれぞれの培養プレートに重層し、さらに２４時間
３７℃で培養した。すべての子孫ウイルスに対し、およ
そ１％の比率で青色プラークが出現した。これらの青色
プラークを単離し含まれているウイルスを回収し、形成
する全てのプラークがＢｌｕｏ−ｇａｌで青く染まるま
で、同じ方法でさらに組み換えウイルスの純化を行っ
た。通常この過程は３〜４回で終了する。この純化され
たウイルスを、ｆＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢと名
付けた。このｆＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢを、サ
ザンハイブリダイゼーション法により解析し、それぞれ
の遺伝子が予想通りの位置にあることを確認した。実施
例６で示した組み換え鶏痘ウイルス作製用プラスミドｐ
ＮＺ６９２９Ｓｆｉ、ｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇ
ＢｇＥ、ｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢｇＥｇＩに
ついても、上記と同様の方法で鶏痘ウイルス感染細胞に
導入し、得られた組み換えウイルスを、それぞれｆＮＺ
６９２９Ｓｆｉ、ｆＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢｇ
Ｅ、ＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢｇＥｇＩと名付け
た。
れるが、その溶解液の１０倍段階希釈液をＣＥＦに感染
させ、生育培地を含んだ１０ｍｌの寒天溶液を重層し
た。室温中で寒天を固めた後、典型的な鶏痘ウイルスの
プラークが出現するまで３７℃で培養した。さらにＢｌ
ｕｏ−ｇａｌを６００μｇ／ｍｌ含んだ別の寒天１０ｍ
ｌをそれぞれの培養プレートに重層し、さらに２４時間
３７℃で培養した。すべての子孫ウイルスに対し、およ
そ１％の比率で青色プラークが出現した。これらの青色
プラークを単離し含まれているウイルスを回収し、形成
する全てのプラークがＢｌｕｏ−ｇａｌで青く染まるま
で、同じ方法でさらに組み換えウイルスの純化を行っ
た。通常この過程は３〜４回で終了する。この純化され
たウイルスを、ｆＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢと名
付けた。このｆＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢを、サ
ザンハイブリダイゼーション法により解析し、それぞれ
の遺伝子が予想通りの位置にあることを確認した。実施
例６で示した組み換え鶏痘ウイルス作製用プラスミドｐ
ＮＺ６９２９Ｓｆｉ、ｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇ
ＢｇＥ、ｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢｇＥｇＩに
ついても、上記と同様の方法で鶏痘ウイルス感染細胞に
導入し、得られた組み換えウイルスを、それぞれｆＮＺ
６９２９Ｓｆｉ、ｆＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢｇ
Ｅ、ＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢｇＥｇＩと名付け
た。
【００３３】（実施例８） 組み換えウイルスを接種し
た鶏の抗ＮＤＶ抗体価および抗ＭＤＶ抗体価 表１に示す組み換え鶏痘ウイルス１０4ＰＦＵを、穿刺
用針で７日齢ＳＰＦ鶏の右側翼膜に接種した。接種３週
後に血清を採取し、ニューキャッスル病の赤血球凝集抑
制（以下、ＨＩという）に代用される抗ＮＤＶ抗体価お
よび抗ＭＤＶ抗体価を測定した。抗ＮＤＶ抗体価の基礎
となるニューキャッスル病のＨＩ反応は、被検血清の２
倍段階希釈液２５μｌに、４赤血球凝集単位を含むＮＤ
Ｖ抗原を等量加えて混和し１０分間静置感作後、０．５
％鶏赤血球液５０μｌを加えて室温に４５分置き、赤血
球凝集を観察した。ＨＩ価は血球凝集抑制が認められた
血清の最高希釈倍率で表現した（表中ではＨＩ価）。
た鶏の抗ＮＤＶ抗体価および抗ＭＤＶ抗体価 表１に示す組み換え鶏痘ウイルス１０4ＰＦＵを、穿刺
用針で７日齢ＳＰＦ鶏の右側翼膜に接種した。接種３週
後に血清を採取し、ニューキャッスル病の赤血球凝集抑
制（以下、ＨＩという）に代用される抗ＮＤＶ抗体価お
よび抗ＭＤＶ抗体価を測定した。抗ＮＤＶ抗体価の基礎
となるニューキャッスル病のＨＩ反応は、被検血清の２
倍段階希釈液２５μｌに、４赤血球凝集単位を含むＮＤ
Ｖ抗原を等量加えて混和し１０分間静置感作後、０．５
％鶏赤血球液５０μｌを加えて室温に４５分置き、赤血
球凝集を観察した。ＨＩ価は血球凝集抑制が認められた
血清の最高希釈倍率で表現した（表中ではＨＩ価）。
【００３４】抗ＭＤＶ抗体価は、次の方法により測定し
た。ＭＤＶのｇＢ遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＶとＢａｍ
ＨＩで消化して得られた断片をｐＡＴＨ−１１のＳｍａ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片に挿入し、ＭＤＶのｇＢ遺伝子抗原
タンパク質の一部のポリペプチド（３５３アミノ酸分）
を発現させた。このポリペプチド７５μｌに１０％ＳＤ
Ｓを７５０μｌ、水６．６７５ｍｌを加え、１０分間沸
騰させる。これに０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）
を２９２．５ｍｌ加え、１００μｌ／ウエルづつＮｕｎ
ｃ社製の９６穴Ｕ底プレートＭａｘｉ−ｓｏｒｂに分注
し、４℃で一夜おいて、ＭＤＶのｇＢ抗原プレートとし
た。このプレートを２倍に希釈したＢｌｏｃｋ Ａｃｅ
（大日本製薬社製）で４℃で一夜おいてブロッキング
し、このそれぞれのＷｅｌｌに被検血清を１０倍希釈の
Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅにて２倍段階希釈をした液を３７℃
にて１時間反応させる。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含
有したＰＢＳ（以下、ＰＢＳ−Ｔという）で３度洗浄
し、２０００倍希釈のＢｅｔｈｙｌ社ＨＲＰ結合ウサギ
抗鶏ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を３７℃、１時間反応させた。Ｐ
ＢＳ−Ｔで３度洗浄した後、ＰＢＳで１度洗浄し、住友
ベークライト社の発色液（ＡＢＴＳ）にて反色させた。
３０分間暗所にて反応させた後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社Ｍｏ
ｄｅｌ３５５０にて４９０ｎｍの吸光度を対照として４
１５ｎｍの吸光度を測定し、その値をＭＤＶ抗体価とし
た。
た。ＭＤＶのｇＢ遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＶとＢａｍ
ＨＩで消化して得られた断片をｐＡＴＨ−１１のＳｍａ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片に挿入し、ＭＤＶのｇＢ遺伝子抗原
タンパク質の一部のポリペプチド（３５３アミノ酸分）
を発現させた。このポリペプチド７５μｌに１０％ＳＤ
Ｓを７５０μｌ、水６．６７５ｍｌを加え、１０分間沸
騰させる。これに０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）
を２９２．５ｍｌ加え、１００μｌ／ウエルづつＮｕｎ
ｃ社製の９６穴Ｕ底プレートＭａｘｉ−ｓｏｒｂに分注
し、４℃で一夜おいて、ＭＤＶのｇＢ抗原プレートとし
た。このプレートを２倍に希釈したＢｌｏｃｋ Ａｃｅ
（大日本製薬社製）で４℃で一夜おいてブロッキング
し、このそれぞれのＷｅｌｌに被検血清を１０倍希釈の
Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅにて２倍段階希釈をした液を３７℃
にて１時間反応させる。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含
有したＰＢＳ（以下、ＰＢＳ−Ｔという）で３度洗浄
し、２０００倍希釈のＢｅｔｈｙｌ社ＨＲＰ結合ウサギ
抗鶏ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を３７℃、１時間反応させた。Ｐ
ＢＳ−Ｔで３度洗浄した後、ＰＢＳで１度洗浄し、住友
ベークライト社の発色液（ＡＢＴＳ）にて反色させた。
３０分間暗所にて反応させた後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社Ｍｏ
ｄｅｌ３５５０にて４９０ｎｍの吸光度を対照として４
１５ｎｍの吸光度を測定し、その値をＭＤＶ抗体価とし
た。
【００３５】この結果、表１に示すようにニューキャッ
スル病ウイルスのＦおよびＨＮ遺伝子に加えマレック病
のｇＢ遺伝子を持つ組み換え鶏痘ウイルスｆＮＺ２９Ｒ
ＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢを接種した鶏血清中にはそれぞれ
単独の組み換え鶏痘ウイルスｆＮＺ６９２９Ｓｆｉ（ニ
ューキャッスル病ウイルスのＦおよびＨＮ遺伝子を発
現）あるいはｆＮＺ２９ＲＭＤｇＢ−Ｓ（マレック病の
ｇＢ遺伝子を発現；特開平６−７８７６４号公報、欧州
特許公開公報第５２０７５３号の実施例にて作製された
組み換えウイルスである。）を免疫したのと同等の免疫
応答が得られた。
スル病ウイルスのＦおよびＨＮ遺伝子に加えマレック病
のｇＢ遺伝子を持つ組み換え鶏痘ウイルスｆＮＺ２９Ｒ
ＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢを接種した鶏血清中にはそれぞれ
単独の組み換え鶏痘ウイルスｆＮＺ６９２９Ｓｆｉ（ニ
ューキャッスル病ウイルスのＦおよびＨＮ遺伝子を発
現）あるいはｆＮＺ２９ＲＭＤｇＢ−Ｓ（マレック病の
ｇＢ遺伝子を発現；特開平６−７８７６４号公報、欧州
特許公開公報第５２０７５３号の実施例にて作製された
組み換えウイルスである。）を免疫したのと同等の免疫
応答が得られた。
【００３６】
【表１】
【００３７】（実施例９） 組み換えウイルスを接種し
た鶏の強毒ＮＤＶに対する感染防御効果 組み換え鶏痘ウイルスは、穿刺用針で１０4ＰＦＵを７
日齢のＳＰＦ鶏の右側翼膜に接種した。接種後４週に１
０4ＰＦＵの強毒ＮＤＶ佐藤株をモモの筋肉中に接種し
た。その後、２週間ニューキャッスル病による死亡を記
録した。この結果は、表２に示す。ワクチン未接種、非
組み換え鶏痘ウイルス接種群の鶏は、強毒ＮＤＶの攻撃
試験に対し、すべてニューカッスル病で死亡したが、ニ
ューカッスル病のＦおよびＨＮ両遺伝子を含むｆＮＺ２
９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢおよびｆＮＺ６９２９Ｓｆｉ
はともに完全な防御を示した。このように複数の抗原遺
伝子を本発明の方法で組み込むことにより多価組み換え
ウイルスワクチンを簡便に作ることができる。
た鶏の強毒ＮＤＶに対する感染防御効果 組み換え鶏痘ウイルスは、穿刺用針で１０4ＰＦＵを７
日齢のＳＰＦ鶏の右側翼膜に接種した。接種後４週に１
０4ＰＦＵの強毒ＮＤＶ佐藤株をモモの筋肉中に接種し
た。その後、２週間ニューキャッスル病による死亡を記
録した。この結果は、表２に示す。ワクチン未接種、非
組み換え鶏痘ウイルス接種群の鶏は、強毒ＮＤＶの攻撃
試験に対し、すべてニューカッスル病で死亡したが、ニ
ューカッスル病のＦおよびＨＮ両遺伝子を含むｆＮＺ２
９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢおよびｆＮＺ６９２９Ｓｆｉ
はともに完全な防御を示した。このように複数の抗原遺
伝子を本発明の方法で組み込むことにより多価組み換え
ウイルスワクチンを簡便に作ることができる。
【００３８】
【表２】
【００３９】
【配列表】
配列番号：1
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列：
AGCTGCCCCC CCGGCAAGCT TGCA 24
【００４０】
配列番号：2
配列の長さ：17
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列：
TCGACATTTT TATGTAC 17
【００４１】
配列番号：3
配列の長さ：22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列：
AATTCGGCCG GGGGGGCCAG CT 22
【００４２】
配列番号：4
配列の長さ：14
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列：
GGCCCCCCCG GCCG 14
【００４３】
配列番号：5
配列の長さ：11
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列：
GATCCAGCAT G 11
【００４４】
配列番号：6
配列の長さ：10
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列：
GTCCATGCTG 10
【００４５】
配列番号：7
配列の長さ：31
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列：
CGGGAGATCT GCGATGTATG TACTACAATT A 31
【００４６】
配列番号：8
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列：
GGATCCCGCA TCGACAATAA ATT 23
【００４７】
配列番号：9
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列：
GGGGAGATCT CATAATGTGT GTTTTCCAAA TC 32
【００４８】
配列番号：10
配列の長さ：28
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列：
GGGGGTCGAC GTCCATATAC TATATCCC 28
【００４９】
配列番号：11
配列の長さ：14
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列：
AGCTAGATCT TGCA 14
【００５０】
【図１】ドナープラスミドｐＧＴＰｓおよびｐＧＴＰ
７．５の構築法を説明した図面である。
７．５の構築法を説明した図面である。
【図２】アクセプタープラスミドｐＮＺ１８２９Ｒの構
築法を説明した図面である。
築法を説明した図面である。
【図３】アクセプタープラスミドｐＮＺ６９２９Ｓｆｉ
の構築法を説明した図面である。
の構築法を説明した図面である。
【図４】ドナープラスミドｐＧＴＰｓＭＤｇＢの構築法
を説明した図面である。
を説明した図面である。
【図５】ドナープラスミドｐＧＴＰｓＭＤｇＥおよびｐ
ＧＴＰ７．５ＭＤｇＩの構築法を説明した図面である。
ＧＴＰ７．５ＭＤｇＩの構築法を説明した図面である。
【図６】多価組み換え鶏痘ウイルス作製用プラスミドｐ
ＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢ、ｐＮＺ２９ＲＮＤＦ
ＨＮ−ＭＤｇＢｇＥ、およびｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−
ＭＤｇＢｇＥｇＩの構築法を説明した図面である。
ＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−ＭＤｇＢ、ｐＮＺ２９ＲＮＤＦ
ＨＮ−ＭＤｇＢｇＥ、およびｐＮＺ２９ＲＮＤＦＨＮ−
ＭＤｇＢｇＥｇＩの構築法を説明した図面である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 昭63−68074（ＪＰ，Ａ)
Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．57，Ｎｏ．２−３
（1987），ｐ．193−201
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 １つの制限酵素ＳｆｉＩ認識部位を有す
るプラスミドのＳｆｉＩ認識部位に、一端は制限酵素Ｓ
ｆｉＩによる切断面であり、もう一端は制限酵素Ｓｆｉ
Ｉ以外の制限酵素Ｘによる切断面であるＤＮＡ断片が、
挿入されることにより得られるただ１つの制限酵素Ｓｆ
ｉＩ認識部位を有する組み換えプラスミド。 - 【請求項２】 ＳｆｉＩ以外の制限酵素ＸがＢｇｌＩ、
ＡｌｗＮＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｓｌＩ、お
よびＭｗｏＩのいずれかひとつである請求項１記載の組
み換えプラスミド。 - 【請求項３】 請求項１または２記載の組み換えプラス
ミドに、さらに一端は制限酵素ＳｆｉＩによる切断面で
あり、もう一端は制限酵素ＳｆｉＩ以外の制限酵素Ｘに
よる切断面であるＤＮＡ断片をひとつ以上挿入して得ら
れる多価組み換えプラスミド。 - 【請求項４】 １つの制限酵素ＳｆｉＩ認識部位を有す
るプラスミドのＳｆｉＩ認識部位に、一端は制限酵素Ｓ
ｆｉＩ切断面であり、もう一端は制限酵素ＳｆｉＩ以外
の制限酵素Ｘ切断面であるＤＮＡ断片を挿入することを
特徴とする組み換えプラスミドの作製方法。 - 【請求項５】 請求項３記載の多価組み換えプラスミド
によって形質転換した形質転換体。 - 【請求項６】 請求項３記載の多価組み換えプラスミド
を用いて作製された組み換えウイルス。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13108596A JP3458880B2 (ja) | 1995-04-28 | 1996-04-26 | 組み換え体、多価組み換え体、及びその作製方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12952395 | 1995-04-28 | ||
| JP7-129523 | 1995-04-28 | ||
| JP13108596A JP3458880B2 (ja) | 1995-04-28 | 1996-04-26 | 組み換え体、多価組み換え体、及びその作製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH099979A JPH099979A (ja) | 1997-01-14 |
| JP3458880B2 true JP3458880B2 (ja) | 2003-10-20 |
Family
ID=26464879
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13108596A Expired - Lifetime JP3458880B2 (ja) | 1995-04-28 | 1996-04-26 | 組み換え体、多価組み換え体、及びその作製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3458880B2 (ja) |
-
1996
- 1996-04-26 JP JP13108596A patent/JP3458880B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．５７，Ｎｏ．２−３（１９８７），ｐ．１９３−２０１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH099979A (ja) | 1997-01-14 |
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