JPH05192165A

JPH05192165A - 組換え鶏痘ウイルス

Info

Publication number: JPH05192165A
Application number: JP4227349A
Authority: JP
Inventors: Friedrich Dorner; ドルナーフリードリッヒ; Friedrich Scheiflinger; シェイフリンガーフリードリッヒ; Falko Gunter Falkner; ファルクナーファルコ−ギュンター
Original assignee: Immuno AG; Immuno AG fuer Chemisch Medizinische Produkte
Current assignee: Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
Priority date: 1991-08-26
Filing date: 1992-08-26
Publication date: 1993-08-03
Anticipated expiration: 2013-01-26
Also published as: JP2703853B2; DE69133333D1; AU661488B2; DE69133333T2; SK264092A3; US5670367A; EP0538496A1; EP0538496B1; ES2212795T3; DK0538496T3; HU9202753D0; CZ264092A3; EP1380651A2; AU1958092A; ATE253123T1; CA2076903A1; HUT62653A

Abstract

(57)【要約】【目的】蛋白質の発現用として、及びワクチンとして
の使用のための組換え鶏痘ウイルスを得る。【構成】ＦＰＶチミジンキナ−ゼ（ｔｋ）遺伝子と３
´−オープンリーディングフレームの間に位置する遺伝
子間領域を、外来ＤＮＡの挿入のために使用する。当該
遺伝子間領域は、１つ又はそれ以上の特有の制限部位を
構成するごとく拡張され、それにより外来ＤＮＡの挿入
を可能とし、その状態においてＦＰＶｔｋ−遺伝子がそ
の無傷性を維持し、完全なチミジンキナーゼをコードす
る。新規強制ポックスウイルスプロモーターが提供さ
れ、新規非必須部位としてのワクシニアウイルスチミ
ジンキナーゼ遺伝子及びＥ．ｃｏｌｉｌａｃＺ遺伝子
を運ぶ新規ＦＰＶ宿主ウイルス株もまた提供される。新
規鶏痘ウイルス宿主株は、ワクシニアウイルスｔｋ−遺
伝子側面領域を運ぶいずれかのプラスミドの使用を可能
とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、組換え鶏痘ウイルス
（ＦＰＶ）、特異的ベクター、新強制プロモーター、新
規ＦＰＶ宿主株、及び蛋白質の組換え生産方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】鳥類ポックスウイルスの原型として位置
付けられる鶏痘ウイルスは、典型的なポックスウイルス
構造を有する。ウイルスゲノムは、２００〜２４０×１
０⁶ダルトンであるとされている。

【０００３】鳥類の痘は、それが世界的な有病率をほこ
るものではあるが、鳥類ポックスウイルスの宿主範囲が
鳥類に限定され、哺乳類は除外されるため、公衆衛生の
問題としては取り上げられていない。宿主への感染後、
ウイルスＤＮＡの複製が開始され、初期蛋白質が感染後
６０〜９６時間の間に合成され、その後後期蛋白質が合
成される。感染性ビリオンの構築は７２〜９６時間の間
に起こる。

【０００４】組織培養細胞でのＦＰＶの増殖は、ニワト
リ胎芽線維芽（ＣＥＦ）細胞、ニワトリ胎芽皮膚（ＣＥ
Ｄ）細胞、加えて、ダック胎芽線維芽（ＤＥＦ）細胞に
て達成される。組織培養におけるウイルスサイクルは類
似し、鳥類中におけるサイクルよりも早い。ＣＥＤ細胞
におけるＤＮＡ複製は、１２〜１６時間の間に開始さ
れ、感染性ウイルス粒子は、１６時間後に初めて出現
し、感染後４８時間まで数的増加を続ける。

【０００５】マケット（Ｍａｃｋｅｔｔ）等（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７９，７４１５〜
７４１９（１９８２））に加えて、パニカリ及びパオレ
ッティ（Ｐａｎｉｃａｌｉ＆Ｐａｏｌｅｔｔｉ）（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７９，４９２７
〜４９３１（１９８２））も、オルソポックスウイルス
の原型に属するワクシニアウイルス（ＶＶ）について、
部位特異的組換えによるワクシニアウイルスゲノムへの
外来ＤＮＡの挿入を可能とする技術（インビボでの組
換えとして知られる）を開発している。この技術によれ
ば、組換え生ワクチンの生成のための真核性発現ベクタ
ーとして、ワクシニアウイルスを使用することが可能と
なる。組換えポックスウイルスは、細胞培養での増殖に
は必須でないウイルスゲノムの領域へ外来遺伝子を挿入
することにより通常構築される。組換えワクシニアウイ
ルスに関して、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子は、上
記非必須部位（ＮＥＳ）であり、加えてｔｋ−陰性組換
えウイルスの選択を可能にする。

【０００６】組換えＦＰＶの構築のためには、同様の原
理が組換えワクシニアウイルスについて記載したごとく
適用される。ＦＲＶ−Ｍ３株における鶏痘ウイルスチミ
ジンキナーゼ遺伝子（ボイル及びコウパー（Ｂｏｙｌｅ
＆Ｃｏｕｐａｒ）、ＰＣＴ／ＡＵ８７／００３２３；ボ
イル及びコウパー、ＶｉｒｕｓＲｅｓ．，１０，３４
３（１９８８））、野生型ウイルス株ＦＰ−１の９００
ｂｐＰｖｕＩＩ断片上に存在する領域（テイラー等（Ｔ
ａｙｌｏｒ），Ｖａｃｃｉｎｅ，６，４９７〜５０３，
５０４〜５０８（１９８８））、及びオープンリーディ
ングフレームｏｒｆ７とｏｒｆ９の間の遺伝子間領域
（ドリリエン等（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ），Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，１６０，２０３〜２０９（１９８７）；スペナー等
（Ｓｐｅｈｎｅｒ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４，５２７
〜５３３（１９９０））を包含するいくつかの非必須部
位が記載されている。

【０００７】近年、いくつかのグループが、ＦＰＶ組換
え体の構築について記載している。ノボル（Ｎｏｂｏｒ
ｕ）等は、欧州特許ＥＰ−２８４，４１６に、組織培養
におけるＦＰＶ増殖のために必須でないいくつかのゲノ
ム挿入部位について開示する。パオレッティは、ＰＣＴ
／ＷＯ−８９／０３４２９に、ＦＰＶ組換え体を生成す
るためのベクターについて記載している。それらには、
種々のワクシニアプロモーターの制御の下で異種抗原を
コードする遺伝子の発現が開示されている。

【０００８】更に、ビンス（Ｂｉｎｎｓ）等は、ＰＣＴ
／ＷＯ−９０／０４６３８に、β−ガラクトシダーゼで
のトランジェントアッセイを用いたいくつかのＦＰＶプ
ロモーターについて開示している。ドリリエン及びスペ
ナーは、欧州特許ＥＰ−３１４，５６９に、ワクシニア
プロモーターの制御の下麻疹Ｆ蛋白質をコードする遺伝
子を含むＦＰＶ組換え体の構築について記載している。
この遺伝子は、ＦＰＶゲノムの、組織培養において必須
でない部位に挿入された。

【０００９】コーエン（Ｃｏｈｅｎ）及びパニカリは、
ＰＣＴ／ＷＯ−９０／０２１９１に、病原体の免疫原性
蛋白質を発現可能な組換え鶏痘ウイルスについて記載し
ている。この組換えＦＰＶは、家禽及び他の動物用の生
ワクチンとして用立てられる。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、組換
え鶏痘ウィルス（ＦＰＶ）、特異ベクター、新強制プロ
モーター、新規ＦＰＶ宿主株及び蛋白質の組換え生産方
法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】本発明者等は、ＦＰＶ株
ＨＰｌ．４４１において、予測されるゲノムを有する安
定な組換え体を得るためには、無傷チミジンキナーゼ遺
伝子の存在が必要であることを明かにしている。

【００１１】ｔｋ−遺伝子が、どの程度種々のＦＰＶ株
にとって必須であるかは、今のところ科学的に明らかに
されていない。この不明確さを解消するために、本発明
者等は、外来ＤＮＡの挿入の更に他の部位について研究
し、無傷ｔｋ−遺伝子と３′オープンリーディングフレ
ームの間の遺伝子間領域が、挿入部位として好ましいこ
とを見出した。本発明はまた、新規非必須部位としてワ
クシニアウイルスチミジンキナーゼ遺伝子及びＥ．ｃｏ
ｌｉｌａｃＺ遺伝子を構成するように修飾された新規
ＦＰＶの宿主株を提供する。かかる宿主を用いることに
より、ワクシニアウイルスｔｋ側面領域を運ぶいずれの
挿入プラスミドも使用可能となる。本発明は更に、いく
つかの好ましいプラスミド構築物に加えて、新規強制プ
ロモーターを提供する。

【００１２】本発明の利点を示すために、分断ウイルス
チミジンキナーゼ遺伝子か又は無傷ｔｋ−遺伝子と３′
オープンリーディングフレームの間の遺伝子間領域のい
ずれかを外来マーカー遺伝子の挿入部位として用いるＦ
ＰＶ挿入プラスミドを構築した。両タイプの実験より誘
導された組換え体のゲノム構造を分析することにより、
無傷チミジンキナーゼ遺伝子の存在においてのみ、予測
されるゲノムを有する安定な組換え体が得られることが
明らかとなった。この結果は、ＦＰＶｔｋ−遺伝子がそ
の無傷な状態において、細胞培養におけるウイルスの増
殖に必須であることを顕著に示唆している。

【００１３】本発明は、ＦＰＶｔｋ−遺伝子と３′オ
ープンリーディングフレーム（３′ｏｒｆ）の間の遺伝
子間領域が広げられ、１又はそれ以上の特有の制限部位
を形成し、それにより、当該遺伝子間領域への異種ＤＮ
Ａの挿入による無傷ＦＰＶｔｋ−遺伝子の維持及び完全
な形でのチミジンキナーゼ（ＴＫ）のコード化を行うこ
とを特徴とする、組換え鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）挿入プ
ラスミドに関する。

【００１４】当該拡張遺伝子間領域は、例えば、以下の
表４の配列よりなる。

【遺伝子配列１】

【表４】

【００１５】野生型遺伝子間領域の上記のごとき修飾
は、部位特異的突然変異誘発により得られる。

【００１６】外来蛋白質を発現することができる組換え
ＦＰＶは、鶏痘ウイルスゲノムへ外来蛋白質をコードす
るＤＮＡ配列を組み込むことにより調製される。この外
来ＤＮＡ配列は、外来ＤＮＡ配列を運ぶ挿入プラスミド
とＦＰＶゲノムの側面配列の間のインビボにおける組
換え過程により、ＦＰＶゲノムへ組み込まれる。この挿
入プラスミドは、少なくとも、上記遺伝子間領域と相同
性を有するＤＮＡ配列と上記側面配列との間に位置する
鶏痘ウイルス又は他のポックスウイルスプロモーターへ
結合した外来ＤＮＡ配列よりなる。従って、選択可能な
挿入プラスミドは、少なくとも以下よりなる：（ａ）発現すべき外来ＤＮＡ配列へ結合した自然又は合
成ポックスウイルスプロモーター；（ｂ）組換えＦＰＶの選択のためのマーカー又は指標を
コードする遺伝子へ結合した第二のポックスウイルスプ
ロモーター；（ｃ）構成因子の構築物（ａ）及び（ｂ）の５′及び
３′末端の両側面に位置するＦＰＶのＤＮＡ配列（当該
側面ＤＮＡ配列は、拡張された遺伝子間領域の上流及び
下流の配列と相同性を有する。）。

【００１７】上記プラスミドは、好ましくは更に、原核
性宿主における複製のためのレプリコン、及び形質転換
された原核性宿主における選択のための選択能力を有す
るマーカー又は指標をコードする遺伝子よりなる。

【００１８】組換えＦＰＶにおけると同様に上記プラス
ミドにおいて使用されるプロモーターは、ポックスウイ
ルスプロモーターであり、特にはＦＰＶプロモーターで
ある。外来蛋白質の効果的な発現のためには、プロモー
ターは、外来ＤＮＡ配列のコーディング配列の直ぐ近傍
にあることが望ましい。

【００１９】今までに構築されたＶＶ組換え体の大部分
は、対象として重要な外来遺伝子を誘導するためにクロ
ーン化ＶＶプロモーターを用いる。クローン化ＶＶプロ
モーター及び外来遺伝子よりなる転写単位の、ＶＶゲノ
ムの非必須部位へのインビボでの組換えは、通常プロ
モーター要素の重複をもたらし、組換え体の第二の組換
え、分離及び不安定性をもたらし得る。従って、遺伝子
的に安定なポックスウイルス組換え体を構築するために
は、外来遺伝子の転写をコントロールする、非相同性あ
るいは短い合成ウイルスプロモーターを用いることが望
ましい。

【００２０】好ましいＦＰＶプロモーターは、Ｐ２プロ
モーターである（図１９）。このプロモーターは、その
上流部において、いくつかの臨界初期領域次いで後期プ
ロモーターコンセンサス配列を含む。機能分析を行い、
Ｐ２プロモーターが、ウイルス生活環における初期及び
後期で活性であることを確証した。

【００２１】図１９において、アンダーラインされた部
分は、図１８を参照のこと。上流域は、位置−１７４ま
で延びる。Ｐ２遺伝子のコーディング配列は、＋１〜＋
３９９まで延び、１３３のアミノ酸をコードする。Ｐ２
遺伝子の計算上の分子質量は、１４８０６Ｄａ．であ
る。下流域（４１５ｂｐ）は、Ａ及びＴが豊富であり、
４ｋＤａ．より大きい蛋白質をコードするオープンリー
ディングフレームを含まない。

【００２２】新規ＦＰＶプロモーターの活性力を、ワク
シニアウイルス組換え体におけるいくつかの既知の強制
ポックスウイルスプロモーターと比較した。Ｐ２プロモ
ーターが、ＶＶ感染細胞における最も強制力のある自然
プロモーターの一つに属することを見出した。

【００２３】Ｐ２プロモーターを最大にする試みにおい
て、、一連の突然変異体を構築した（図２６）。すべて
の突然変異体において、Ｐ２遺伝子融合配列を除去し、
ｌａｃＺ遺伝子の開始コドンを後期プロモーターシグナ
ルＴＡＡＡＴの近傍に位置させた。突然変異体ｍ０（Ｔ
ＡＡＡＴＧＡＡＴＴＣＣ）においては、ｌａｃＺ遺
伝子のＡＴＧを、後期プロモーターコア配列と直接融合
させ、これにより、野生型Ｐ２配列の位置−１のＣ残基
を削除し、後期プロモーターの有効性を向上させた突然
変異を得る。この構造は、多くの後期ＶＶプロモーター
において見出だされ、後期プロモーターコンセンサス及
び開始コドンの最良のコンテクストであると考えられる
（デヴィドソン，エー．ジェー．（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，
Ａ．Ｊ．）及びモス，ビー．（Ｍｏｓｓ，Ｂ．），分子
生物学雑誌（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１０：７４９，
１９８９）。

【００２４】突然変異体ｍ１（ＴＡＡＡＣＡＴＧＡＡ
ＴＴＣＣ）は、推定上のＰ２遺伝子のＡＴＧと直接に
融合したｌａｃＺ遺伝子のＡＴＧを有する。

【００２５】突然変異体ｍ２は、後期プロモーター領域
の上流に見出だされる初期プロモーター臨界領域の意義
を調査するために構築された。突然変異体プロモーター
ｍ２は、後期プロモーターモチーフの上流の機能的に重
要なＴ−豊富領域内の初期ＲＮＡ停止シグナルが、位置
−１８でのＴＴＧ挿入により不活化されること以外、ｍ
１の構造と同様である。

【００２６】従って、好ましいＦＰＶプロモーターは、
図１８及びその機能的同等物から誘導可能なＤＮＡ配列
を有するＰ２プロモーターである。プロモーターの活性
力についての実験データを、図２７に示す。

【００２７】プロモーター領域の次には、好ましくは外
来遺伝子の挿入が可能な多重クローニング部位（ＭＣ
Ｓ）が位置づけられる。

【００２８】Ｐ２遺伝子及び下流領域は、配列分析によ
り特徴づけられた（図１９）。Ｐ２遺伝子は、計算上の
分子質量が１４８０６Ｄａ．の１３３アミノ酸をコード
する。下流領域（４１５ｂｐ）は、ＡおよびＴが豊富で
あり、４ｋＤａ．以上の蛋白質をコードするオープンリ
ーディングフレームを含まない。即ち、ゲノムのこの領
域は、おそらく非コード化領域である。従って、Ｐ２遺
伝子の下流領域は、ＦＰＶゲノムへ外来遺伝子を挿入す
るために使用することができる、新規の非必須部位であ
る。

【００２９】好ましいプラスミドは、組換えＦＰＶの選
択を可能とする遺伝因子を含む。これらの因子は、選択
可能なマーカー又は指標をコードする遺伝子に加えて、
組換えウイルス中の当該遺伝子の発現をコントロールす
るポックスウイルスプロモーターより構成される。プロ
モーター及びマーカー又は指標遺伝子は、ＦＰＶゲノム
へ共に組み込まれ、側面ＦＰＶ配列間に位置付けられ
る。次いで、組換えＦＰＶは、マーカー又は指標の発現
に基づき選択される。

【００３０】同定のための好ましい遺伝子は、酵素β−
ガラクトシダーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉｌａｃＺ
遺伝子である。この酵素の発現に基づく同定の方法は、
文献において論述されている。選択方法としては、マイ
コフェノール酸に対する耐性を付与する、キサンチン
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコー
ドする遺伝子による選択のような薬剤耐性選択等が挙げ
られる。

【００３１】又、本発明に係るプラスミドは、好ましく
は、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核性宿主における選択及び
増幅を可能とする選択可能な指標又はマーカーをコード
する遺伝子に加えて、原核性宿主における複製のための
レプリコンを含む。レプリコンは、ｐＢＲ３２２のよう
な従来のいずれの原核性プラスミドからも得られる。選
択可能のマーカーは、抗生物質耐性を与える遺伝子であ
ることができる。

【００３２】本発明に係る特異的プラスミドは、挿入プ
ラスミドｐＴＫｍ−ｓｐ１１−ｇｐｔのｌａｃＺ遺伝子
を、対象として重要な外来遺伝子に置き換えることによ
り構築し得る。

【００３３】マーカー及び指標遺伝子と共に発現するＤ
ＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドは、適切なＦＰＶ配列
により側面配列化され、ＦＰＶでの組換え及び側面配列
化された遺伝子のＦＰＶゲノムへの組込みが許容され
る。この組換えは、真核性宿主細胞の細胞質において生
ずる。組換えのための適切な宿主細胞であるためには、
それらが（１）ＦＰＶによる感染性を有し、（２）ＤＮ
Ａベクターによるトランスフェクションが可能であるこ
とが要求される。そういった細胞の例としては、ニワト
リ胎芽線維芽細胞及びニワトリ胎芽皮膚細胞が挙げられ
る。

【００３４】インビボでの組換えのために、初めに細
胞をＦＰＶで感染させ、次いで、挿入プラスミドでトラ
ンスフェクトした。ウイルス感染は、ＦＰＶでの真核性
細胞の感染についての標準的方法により行われる。次い
で、従来のいずれかのトランスフェクション法の手段を
用いて、細胞を挿入プラスミドでトランスフェクトす
る。

【００３５】感染及びそれに次ぐトランスフェクション
の後、細胞を標準的条件下でインキュベートし、ウイル
スの複製を可能とする。この過程において、インビボ
での組換えが、挿入ベクターの相同性ＦＰＶ配列とＦＰ
Ｖの間で起こり、外来ＤＮＡ配列が、ＦＰＶゲノムに挿
入される。

【００３６】次いで組換えＦＰＶを、例えばβ−ガラク
トシダーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉｌａｃＺ遺伝子のよ
うな挿入マーカー又は指標の手段により選択する。この
酵素、例えば５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
−β−Ｄ−ガラクトシドに対する色素産生基質を用い
て、組換えウイルスをブループラークとして検出する。

【００３７】本発明の他の主要な態様によれば、組換え
ＦＰＶは、上記組込み領域内の挿入部位として、１又は
それ以上の外来ＤＮＡ配列の挿入のためには必須でない
部位（ＮＥＳ）として機能するワクシニアウイルスｔｋ
−遺伝子を含む。

【００３８】好ましい修飾としては、当該組換えＦＰＶ
は、当該拡張された遺伝子間領域に、選択マーカー及び
／又はレポーター遺伝子及びＶＶｔｋ−遺伝子を所望の
いずれかの順序で含む。

【００３９】大部分の好ましい修飾体は、拡張遺伝子間
領域内にワクシニアウイルスｔｋ−遺伝子及びｌａｃＺ
遺伝子挿入物を含む組換え鶏痘ウイルスよりなる。そう
いった２つの新規宿主株のゲノム構造を、図１５に示
す。鶏痘ウイルス又はワクシニアウイルスｔｋ−遺伝子
のいずれかを、外来遺伝子挿入のための非必須部位とし
て使用できる。ｆ−ＴＫ２ａ及びｆ−ＴＫ２ｂ株は、ワ
クシニアウイルスｔｋ−遺伝子の配向性においてのみ異
なる。これは、２つの配向において、対象として重要な
外来遺伝子の相同的組換えによる挿入を可能とする。こ
れは、転写干渉現象を研究する上で有利である。

【００４０】新規ＦＰＶ宿主株の上記修飾体が、２つの
無傷ｔｋ−遺伝子を含むことから、外来ＤＮＡの挿入の
ためにいずれか１つを用いることが可能である。これ
は、ＦＰＶｔｋ又はＶＶｔｋ側面配列のいずれかを有す
るプラスミドの拡大した範囲の適用を可能とする。

【００４１】従って、本発明は、上記新規ＦＰＶ宿主株
の相同的組換えにより得られた組換えＦＰＶ、及び、Ｆ
ＰＶｔｋ−遺伝子又はＶＶｔｋ−遺伝子のいずれかへ外
来ＤＮＡの挿入を可能とする、ここに記載されたあらゆ
るプラスミドを包含する。

【００４２】上述のように、外来蛋白質を発現可能な組
換えＦＰＶは、当該外来蛋白質をコードするＤＮＡ配列
をＦＰＶゲノムへ組み込むことにより製造される。これ
は、上記の挿入ベクターの手段によりインビボ組換え
によりなされる。本発明に係る特異的ベクターは図２８
に示すｐＴＺｇｐｔ−Ｆｌｓ又はｐＴＺｇｐｔ−Ｐ１１
Ｍ及び図２４に示すｐＰ２ｍｘｇｐｔのような挿入プラ
スミドの手段により構築される。

【００４３】構築物ｐＴＺｇｐｔ−Ｆｌｓ（図２８）
は、前に用いたプラスミドｐＴＫｇｐｔ−Ｆ１ｓ（図２
８の上部）との比較に有利であり、ｆ１複製起点（ｆ１
ｏｒｉ）がｐＵＣ部に代えてｐＴＺ部（ＰｖｕII断
片）を用いることにより導入されたプラスミドを示す。
ｆ１ｏｒｉの挿入は、配列決定及びインビトロ突然
変異誘発のために要求される一本鎖ＤＮＡの生成を可能
とする。この点で、Ｍ１３ベクターにおける時間を消費
する再クローニング実験は必要としない。

【００４４】プラスミドｐＴＺｇｐｔ−Ｐ１１Ｍ（図２
８）において、Ｐ１１“後期プロモーターコンセンサス
領域”ＴＡＡＡＴＧＡＡＴＴＣは変異を受け、以下の配
列ＴＡＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＴＣに変換される。この構
築物は、遺伝子がそれら自身の翻訳開始コドン（ＡＴ
Ｇ）の制御のもと発現できる利点を有する。

【００４５】プラスミドｐＴＺｇｐｔ−ｄＰ（図２８）
は、プロモーターｐ７．５の制御を受ける側面ＶＶｔｋ
配列及びｇｐｔ遺伝子のほか、単一ＨｐａＩ部位を含
む。この部位は、種々のプロモーター−外来−遺伝子カ
セットの挿入のために良好に機能する。

【００４６】図２８において、プラスミドは実験例に記
載するように構築した。ｔｋは、ワクシニアウイルス
チミジンキナーゼ遺伝子を意味する。Ｐ７．５は、ワク
シニアウイルス７．５ｋＤａ蛋白質の遺伝子のプロモー
ターを意味する。Ｐ１１は、ワクシニアウイルス１１ｋ
Ｄａポリペプチドの遺伝子のプロモーターを意味する。
Ｐ１１Ｍは、突然変異化Ｐ１１プロモーターを意味す
る。ｆ１ｏｒｉは、ｆ１複製起点を意味する。ｇｐｔ
は、Ｅ．ｃｏｌｉｇｐｔ遺伝子（酵素キサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコード
する）を意味する。ＭＣＳは、多重クローニング部位を
意味する。

【００４７】挿入プラスミドｐＰ２ｍ０ｇｐｔ、ｐＰ２
ｍ１ｇｐｔ、ｐＰ２ｍ２ｇｐｔ（ｐＰ２ｍｘｇｐｔ；図
２４）は、新規鶏痘ウイルス宿主株のワクシニアウイル
スｔｋ−遺伝子へ、対象として重要な外来遺伝子を導く
（図１５）。省略記号Ｐ２ｍｘは、図２６に記載した変
異Ｐ２プロモーターを意味する。これらの挿入プラスミ
ドは、それら自身翻訳開始及び終止コドンを欠くオープ
ンリーディングフレームの高レベルの発現のために適し
ている。３つのリーディングフレームのすべてにおいて
翻訳を終結させる翻訳終止コドンを、プラスミドにより
提供する。挿入プラスミドｐＰ２ｍ０ｇｐｔ，ｐＰ２ｍ
１ｇｐｔ，ｐＰ２ｍ２ｇｐｔの多重クローニング部位の
追加の造作は、ポックスウイルス初期遺伝子発現を終結
させる転写終止シグナルである。この多重クローニング
部位の配列を、図２５に示す。

【００４８】プラスミドｐＦＳｇｐｔ（図２２）もま
た、新規鶏痘ウイルス宿主株のワクシニアウイルスｔｋ
−遺伝子へ、対象として重要な外来遺伝子を導く（図１
５）。それは、ポックスウイルス−プロモーター外来遺
伝子カセットのクローニングのために使用し得る。プラ
スミドｐＦＳｇｐｔもまた、翻訳終止コドン及びポック
スウイルス初期転写終止シグナルを提供する。多重クロ
ーニング部位の配列を、図２３に示す。

【００４９】プラスミドｐＴＺｇｐｔ−ｓＰｘ（図２
９）は、種々の合成プロモーターをテストするために構
築された“プロモーターテストプラスミド”である
（ここでは、ｓＰｘと呼ぶ。）。省略記号ｓＰｘは、以
下の意味を有する：（１）ｓＰ１１は、合成ＶＶＰ１１プロモーター突然
変異体である：（２）ｓ４ｂは、合成ＦＰＶ４ｂプロモーター突然変
異体である：（３）ｓａｒｔは、合成プロモーター突然変異体であ
る。

【００５０】図２９において、ＦＰＶ−ｔｋは、鶏痘ウ
イルスのチミジンキナーゼ遺伝子を意味する。Ｐ７．５
は、ワクシニアウイルス７．５ｋＤａ蛋白質の遺伝子の
プロモーターを意味する。ｇｐｔは、キサンチングア
ニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードす
るＥ．ｃｏｌｉｇｐｔ遺伝子を意味する。矢印は、転
写の方向を示す。

【００５１】上記プロモーターは、ＦＰＶと同様にＶＶ
においても活性な強制後期プロモーターよりなる。これ
らのプロモーターは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）と
共に又は伴わずに摘出され、種々のベクターシステムへ
のクローン化ができる。これらの追加プロモーターは、
有用なプロモータープールを拡張し、多重発現を可能と
する。これらはまた、ウイルスゲノムと相同性を有する
領域が相当短い配列に制限される利点を有し、組換えの
蓋然性を減らし、それにより組換えウイルスの不安定性
を減少させる。

【００５２】上述のように、外来蛋白質の発現に用いら
れる組換えＦＰＶは、インビボ相同的組換えにより得
られる。

【００５３】本発明はまた、外来蛋白質の発現方法も包
含する。この方法は、適切な宿主細胞を本発明に係る組
換えＦＰＶで感染させることよりなる。次いで、宿主細
胞を培養し、所望の蛋白質を発現させ、その蛋白質を従
来法の手段により回収する。

【００５４】適した細胞又は細胞培養物は、ニワトリ胎
芽線維芽細胞又はニワトリ皮膚線維芽細胞である。

【００５５】所望の蛋白質はいずれも、上記組換えＦＰ
Ｖを使用することにより発現可能であり、十分量得るこ
とが出来る。翻訳後修飾をある程度必要とする蛋白質を
発現することは、それが宿主細胞で行われることから特
別重要な事項である。そういった蛋白質としては、例え
ば、因子ＩＩ，Ｖ，ＶＩＩ，ＶＩＩＩ，ＩＸ，Ｘ，Ｘ
Ｉ，ＸＩＩ，ＸＩＩＩ，蛋白質Ｃ，蛋白質Ｓ，フォンビ
ルブランド因子，プラスミノーゲン及び１又はそれ以上
のアミノ酸が置換えられ、削除され又は挿入されている
それらの誘導体，その部分配列及び活性形，アポＡＩ及
びアポＡＩＩのようなアポリポ蛋白質，肝炎Ｂ−抗原の
ようなウイルス抗原，肝炎Ｃ−ウイルス抗原，肝炎Ｅ−
ウイルス抗原，ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス抗原，
ＨＩＶ及びＨＳＶ抗原及びそれら抗原の全部又は部分配
列であって、百日咳，破傷風，マラリア，家禽病，マレ
ック病，ＩＬＴ，感染性気管支炎，コクシジュウム症及
びニューカッスル病をもたらすものが挙げられる。上記
抗原は、ワクチンとして利用できる。

【００５６】

【実験例】以下実験例により本発明を説明する。１．方法１．１．ウイルス及び細胞鶏痘ウイルス株ＨＰ１（マイルおよびマリッキ（Ｍａｙ
ｒ＆Ｍａｌｉｃｋｉ）；Ｚｅｎｔｒａｌｂｌａｔｔ
ｆ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｍｅｄｉｚｉｎ，Ｒｅｉｃｈ
Ｂ，１３，１〜１２（１９６６））及び弱毒株ＨＰ１−
４４１（ＨＰ１の継代番号４４１）を、プルフ．エー．
マイル，ムニッヒ（Ｐｒｏｆ．Ｍａｙｒ，Ｍｕｎｉｃ
ｈ）の好意により提供を受けた。初代ニワトリ胎芽線維
芽（ＣＥＦ）細胞を、欧州特許出願公開第０３３８８０
７号に記載されるように調製した。この細胞を、５％ウ
シ胎児血清、グルタミン及び抗生物質で補足された組織
培養液１９９（ＴＣＭ１９９；ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）Ｂ
ＲＬ）にて増殖させた。ワクシニアウイルス（ＡＴＣＣ
＃ＶＲ１１９，株ＷＲ）を、Ｄｒ．ビー．モス（Ｂ．Ｍ
ｏｓｓ）の好意により提供を受けた。このウイルスを、
マケット（Ｍａｃｋｅｔｔ）等（ディー．エム．グロー
バー（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒによる（ｅｄ）．（１９８
５），ＤＮＡクローニング：実践的アプローチ；ＩＲＬ
プレス，オックスフォード）により報告されたようにＣ
Ｖ−１細胞にて複製させ、精製した。アフリカグリーン
モンキー腎細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ７０）
を、ＡＴＣＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕ
ｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），ロックビル，メリーラ
ンド，より得た。

【００５７】１．２．鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）の精製精製を、以下の修正を加えて、基本的にはジョクリク
（Ｊｏｋｌｉｋ）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８，９〜１８
（１９６２））に記載されたように行った：ＣＥＦ単層
（２０コの１７５ｃｍ²細胞培養フラスコ）を、１ｐｆ
ｕ（プラーク形成単位）／細胞で感染させ、＋３７℃，
５％ＣＯ₂で４〜５日間インキュベートした。細胞を、
倍地に剥ぎ落とし、ソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＣ３
Ｃ遠心機のＨ６０００Ａ−ローターにて２，０００ｒｐ
ｍで２０分遠心することにより沈降させた。ペレット
を、５ｍｌの１０ｍＭトリス（ｐＨ９）に懸濁させ、超
音波処理し、１／１０量の２．５％トリプシンで補足
し、＋３７℃で３０分インキュベートした。細胞外ウイ
ルスをペレットにするために、上清をベックマンタイ
プ１９ローターにて＋４℃, ２時間, １７，０００ｒｐ
ｍで遠心した。細胞倍溶液上清のトリプシン処理細胞及
びウイルスペレットを、プールし、３６％スクロースク
ッション上に装填し、ベックマンＳＷ２８ローターにて
＋４℃で８０分１３，５００ｒｐｍで遠心した。ペレッ
トを、１ｍｌの１ｍＭトリス（ｐＨ９）に再懸濁し、超
音波処理し、２０〜４０％のスクロース勾配上に置き、
＋４℃で５０分間１２，０００ｒｐｍで遠心した。２つ
のウイルスバンド（ウイルスの細胞内及び細胞外形態）
を、集め、プールし、２容量の１０ｍＭトリス（ｐＨ
９）を加えた。ウイルスペレットを、１５，５００ｒｐ
ｍで６０分遠心の後集め、５００μｌの１ｍＭトリス１
ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ９）に再懸濁した。

【００５８】１．３．細胞感染及びプラークアッセイプラークアッセイを、ＣＥＦまたはＣＶ−１の融合性単
層上にて行った。条件は、ＣＥＦについては、６０ｃｍ
² 組織培養シャーレを用い約６×１０⁶細胞で行うか又
は１０ｃｍ²,６ウエルプレートを用い１ウエルにつき１
×１０⁶細胞で行う。ＣＶ−１細胞については、１０ｍ
²,６ウエルプレートを用いウエルあたり１×１０⁶細胞
で行う。ウイルス懸濁物を、１時間時々振動させなが
ら、０．６ｍｌ容量のＴＣＭ１９９中にて細胞に吸着さ
せた。懸濁物をアスピレーションで除去し、血清を含ま
ないＤＭＥＭ、抗生物質及び１％低融解性アガロ−ス
（ＬＭＡ；ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）よりなる培養
液といれかえた。ＣＥＦ細胞上にタイトレートされたＦ
ＰＶ−プラークを、感染後５又は６日目に３０μｇ／ｍ
ｌのニュートラルレッド（シグマ）で染色した。ＣＶ−
１細胞上にタイトレートされたワクシニアウイルスプラ
ークを、感染後３日目に５０μｇ／ｍｌのニュートラル
レッドで染色した。

【００５９】１．４．インビボ組換えＣＥＦ細胞又はＣＶ−１細胞（６０ｍ²組織培養シャー
レにて）を、細胞当たり１プラーク形成単位（ｐｆｕ）
のＨＰ１−４４１又はＶＶでぞれぞれ感染させた。ウイ
ルスを、＋３７゜Ｃで１時間２．５ｍｌのＴＣＭ１９９
中にて吸着させた。次いで、培養液を、アスピレート除
去し、感染単層を、グラハムおよびヴァンデルイー
ビ−（Ｇｒａｈａｍ＆ｖａｎｄｅｒＥｂ）（Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ，５２，４５６〜４６７（１９７３））によ
る終量１ｍｌにおけるヘペス緩衝食塩水中２０μｇのプ
ラスミドＤＮＡ及び５μｇのＨＰ１−４４１又はＶＶ野
生型ＤＮＡよりなるＤＮＡ−Ｃａ−ホスフェート沈降物
でオーバーレイした。室温で３０分のインキュベーショ
ンの後、９ｍｌのＴＣＭ１９９を加え、インキュベーシ
ョンを＋３７゜Ｃで更に４時間続けた。培養液を、１０
ｍｌの新鮮なＴＣＭ１９９と代え、プレートを２日イン
キュベートした。次いで、細胞を、培養液に剥ぎ落と
し、凍結及び解凍のサイクルを続けて３回行うことによ
りペレットを溶解した。次いで、後代ウイルスが、組換
え体の存在についてアッセイされた。

【００６０】１．５．組換え体の選択及びプラーク精製１．５．１．ブループラークスクリーニングｌａｃＺ遺伝子挿入物を有するウイルスを、以下の修正
を加えたチャクラバルティ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ）
等（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，３４０３〜３
４０９（１９８５））に記載されたブループラークスク
リーニングにより同定した：ＣＥＦ−細胞（６０ｃｍ²
組織培養シャーレにおける）又はＣＶ−１細胞（６ウエ
ルプレートにおける）を、組換え実験により誘導された
ウイルス粗製ストックで感染させ、１％ＬＭＡを含むＤ
ＭＥＭ（血清を含まない）でオーバーレイした。ＣＥＦ
については５〜６日、ＣＶ−１については３日の後、リ
ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１％ＬＭＡ及び色素産生基
質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−
ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）６００μｇ／ｍｌよりなる
第二のオーバーレイにて、単層を染色した。ブループラ
ークが、４〜１２時間後に現われた。

【００６１】１．５．２．ｇｐｔ−選択ｇｐｔ−遺伝子挿入物を有する組換えＦＰＶウイルス
を、以下の修正を加えて、基本的にはフォークナーおよ
びモス（Ｆａｌｋｎｅｒ＆Ｍｏｓｓ）（Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，６２，１８４９〜１８５４（１９８８））に記載
したように、薬剤マイコフェノール酸（ＭＰＡ）に対す
る耐性に基づいて同定した：ＣＥＦ細胞の単層を組換え
ウイルスで感染させ、１２５μｇ／ｍｌキサンチン，５
〜２５μｇ／ｍｌＭＰＡ及び１％ＬＭＡで補足されたＤ
ＭＥＭでオーバーレイした。５〜６日後、プラークを、
３０μｇ／ｍｌニュートラルレッドを含むＰＢＳ中１％
ＬＭＡよりなる第二のオーバーレイで染色することによ
り視覚化した。ｇｐｔ−及びｌａｃＺポジティブ組換え
体の場合は、オーバーレイは、加えて６００μｇ／ｍｌ
のＸ−ｇａｌを含んだ。プラークは、プラーク精製の数
回の循環工程をうけた。

【００６２】ＣＶ−１細胞の単層を、組換えワクシニア
ウイルスで感染させ、２５０μｇ／ｍｌキサンチン，１
５μｇ／ｍｌヒポキサンチン，２５μｇ／ｍｌＭＰＡ及
び１％ＬＭＡで補足したＤＭＥＭでオーバーレイした。
２〜３日後、プラークを、５０μｇ／ｍｌニュートラル
レッド及び６００μｇ／ｍｌＸ−ｇａｌを含むＰＢＳ中
１％ＭＰＡよりなる第二のオーバーレイにて染色するこ
とにより視覚化した。プラークは、プラーク精製の数回
の循環工程をうけた。

【００６３】１．６．トランジェント発現アッセイ以下の修正を加えて、基本的にはコクラン（Ｃｏｃｈｒ
ａｎ）等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８２，１９〜２３（１９８５））に記載したよう
にアッセイを行った：ＣＶ−１細胞（約１×１０⁷細
胞）の融合性単層を、５又は１０プラーク形成単位の野
生型ワクシニアウイルスで感染させ、グラハムおよびヴ
ァンデルイービー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５
６〜４６７（１９７３））にしたがって調製したＤＮＡ
−Ｃａ−沈降物の形態における３０μｇプラスミドＤＮ
Ａでトランスフェクトした。細胞を、感染後２４時間で
遠心によりハーベストし、１００μｌのＰＢＳに再懸濁
させた。感染細胞の細胞質抽出物を、超音波処理により
調整し、β−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイし
た。

【００６４】１．７．β−ガラクトシダーゼアッセイＣＶ−１細胞（８×１０⁶細胞）の融合性単層を、１０
プラーク形成単位のワクシニア組換え体で感染させ、感
染後２４時間で遠心によりハーベストし、１００μｌの
ＰＢＳに再懸濁した。細胞質抽出物の調製のために、細
胞を、凍結及び解凍の３回の繰返しサイクルにより、及
び、超音波処理により破壊した。蛋白質抽出物をブラド
フォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．７２，２４８〜２５４（１９７６））にしたがっ
て定量した。酵素アッセイを、以下の修正を加えて、基
本的にはミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（分子遺伝学における
実験において，コールドスプリングハーバーラボ
ラトリー，コールドスプリングハーバー，ニューヨ
ーク：３５２〜３５５（１９７２））に記載されたよう
に行った：すべての試薬を、２８゜Ｃへ予め加温し、溶
解物を氷上に保持した。反応を、７７０μｌｌｘＺ緩
衝液（０．６ＭＮａ₂ＨＰＯ₄，０．４ＭＮａＨ₂Ｐ
Ｏ₄，０．１ＭＫＣｌ、０．０１ＭＭｇＳＯ₄，
０．５Ｍβ−メルカプトエタノール，ｐＨ７）中にて行
った。２００μｌの色素産生基質ｏ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ；０．１Ｍリン
酸緩衝液ｐＨ７．０中４ｍｇ／ｍｌ）を加え、反応を３
０μｌの希釈（１：１００）細胞抽出物を加えることに
より開始させた。室温で３分後、アッセイを、ベックマ
ンＤＵ８光度計に移した。光学密度を、ＰＢＳサンプル
を参照して２８゜Ｃで１５分４２０μｍで記録した。結
果は、ＵＶ−Ｖｉｓデンシトメーター（ヒルシェマン
（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ））を用いてポリアクリルアミ
ドゲルのスキャンニングにより確認した。

【００６５】１．８．配列決定配列を、特異的プライマーを用いるジデオキシ鎖終結法
（サンガーおよびコールソン（Ｓａｎｇｅｒ＆Ｃｏｕｌ
ｓｏｎ）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９４，４４１，
（１９７５））によりＴ７ポリメラーゼ配列化キット
（ファルマシア）を用いて決定した。プラスミドの構築
を、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等（分子クロー
ニング；コールドスプリングハーバーラボラトリ
ープレス（１９８９））に記載した標準法にしたがっ
て行った。

【００６６】２．挿入プラスミドの構築２．１．ｐＦＰｔｋ５第１の工程として、ＦＰＶチミジンキナーゼ遺伝子を以
下のようにクローニングした：鶏痘ウイルスＤＮＡ（Ｈ
Ｐ１ムニヒ（Ｍｕｎｉｃｈ）株）のＥｃｏＲＩ消化物
を、ベクターｐＴＺ１９Ｒ（ファルマシア）のＥｃｏＲ
Ｉ部位へクローニングした。プラスミド（ｐＦＰｔｋ５
と呼ばれる。）を含むｔｋ−遺伝子を、オリゴヌクレオ
チドプローブ５′−ＣＡＧＴＴＡＴＴＧＴＧＧ
ＣＣＧＣＧＣＴＴＡＡＣＧＧＴＧＡ−３′を用
いるコロニーフィルターハイブリッド形成法により同定
した。プラスミドは、５．５ｋｂＥｃｏＲＩ断片を含ん
だ。

【００６７】２．２．ｐＦＰｔｋ１０．４ｐＦＰｔｋ５を、ＣｌａＩ，ＢａｍＨＩ及びＳｃａＩで
開裂させ、クレノーポリメラーゼで処理し、ＰｖｕＩ
Ｉ，ＥｃｏＲＩ及びホスファターゼで処理されたベクタ
ーｐＴＺ１９Ｒでライゲートした。得られたプラスミド
ｐＦＰｔｋ１０．４は、鶏痘ウイルスｔｋ−遺伝子を含
む２．８ｋｂＢａｍＨＩ−ＣｌａＩ挿入物を有した（ボ
イル（Ｂｏｙｌｅ）等；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５６，３
５５〜３５６（１９８７））。

【００６８】２．３．ｐＦＰ−ＵＶ２ｉｐＦＰｔｋ１０．４のｔｋ−コーディング領域内の特有
のＮｃｏＩ部位へ、ｐＵＶ１からの２．３ｋｂＳｓｐＩ
断片（フォ−クナー（Ｆａｌｋｎｅｒ）等；Ｎｕｃｌ．
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１５，７１９２（１９８７））
を、挿入した。断片は、Ｐ１１−プロモーター（バート
レット（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，２０９６〜２１
００（１９８５））、Ｐ７．５プロモーター（コクラン
（Ｃｏｃｈｒａｎ）等；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５４，３０
〜３７（１９８５））及びｌａｃＺの５′部分を含む。

【００６９】２．４．ｐＦＰ−ＵＶ２プラスミドｐＦＰ−ＵＶ２のクローニングを、中間体プ
ラスミドｐＦＰ−ＵＶ２ｉへ、２．３ｋｂｌａｃＺ断片
（ｌａｃＺ遺伝子の３′部分）を挿入することにより完
成させた。

【００７０】２．５．ｐＦＰ−ＵＶ２−ＰＴ以下の実験において、プロトロンビンのｃＤＮＡ配列
を、プラスミドｐＦＰ−ＵＶ２へクローニングした。こ
の実験は、欧州特許出願第９０１０１６２３．８号に記
載されるように、プラスミドｐＰｔ＃１２からのＥｃｏ
ＲＩ断片（２．０ｋｂ）を摘出することにより行われ
た。次いで、完全なヒトプロトロンビンｃＤＮＡを、Ｅ
ｃｏＲＩ及びホスファターゼ処理ベクターｐＦＰ−ＵＶ
２へクローニングした。この構築物においては、プロト
ロンビンｃＤＮＡの翻訳開始コドンが、ワクシニアウイ
ルス主要後期１１Ｋポリペプチドのプロモーターの自然
発生開始コドンと正確に融合されている。得られたプラ
スミドは、ｐＦＰ−ＵＶ２−ＰＴと呼ぶ。

【００７１】２．６．ｐＴＫｍこのプラスミドを、ホスホロチオエート−ベース突然変
異誘発法（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎ
ｃ．））を用いて、オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘
発によりｐＦＰｔｋ１０．４から構築した。ＦＰＶチミ
ジンキナーゼ遺伝子の遺伝子間領域を拡張し修飾するた
めに用いられる突然変異誘発プライマーは、配列５′−
ＴＴＡＣＡＣＴＡＡＡＣＣＧＧＴＡＣＣＣ
ＧＧＧＡＴＣＧＡＴＡＡＡＡＡＣＣＴＴＡＡ
ＴＴＡＣＴＡ−３′を有した。この突然変異体の構
造は、プライマーを用いて、変形配列の下流４６ｂｐに
位置する５′−ＣＣＡＴＴＣＣＧＴＧＴＡＴＡＡＴＧＴ
ＡＣ−３′を配列化することにより確認した。

【００７２】２．７．ｐＦＰ−ＺｓＰ１１プラスミドｐＦＰ−Ｚ２１（２．１５参照）において、
ｌａｃＺ遺伝子を、いくつかの制限部位により側面配列
化するが、それにはプロモータ配列は含まない。ｐＦＰ
−Ｚ２１のＰｓｔＩ及びＳｍａＩ部位へ、合成プロモー
ター（ワクシニアＰ１１プロモーターの修飾体）を、ア
ニーリングされたオリゴヌクレオチドＩ及びＩＩよりな
る合成リンカーのライゲーションによりｌａｃＺ遺伝子
の上流に挿入した。

【００７３】オリゴヌクレオチドＩの配列は以下の表５
のごとくである。

【遺伝子配列２】

【表５】

【００７４】オリゴヌクレオチドＩＩの配列は以下の表
６のごとくである。

【遺伝子配列３】

【表６】

【００７５】２．８．ｐＴＫｍ−ｓＰ１１合成ワクシニア後期プロモーターにより制御されるＥ．
ｃｏｌｉｌａｃＺ遺伝子を含む３．３ｋｂＳｍａＩ／
ＢａＩＩ断片を、プラスミドｐＦＰ−ＺｓＰ１１から調
製し、ＳｍａＩにて線状化されたベクターｐＴＫｍへ挿
入した。得られたプラスミドは、ｐＴＫｍ−ｓＰ１１と
呼ぶ。

【００７６】２．９．ｐＴＫｍ−ｓＰ１１−ｇｐｔｐＴＫｍ−ｓＰ１１を、ＳｍａＩを用いて線状化し、プ
ラスミドｐＴＫｇｐｔ−Ｆｌｓ（フォークナーおよびモ
ス，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２，１８４９〜１８５４（１
９８８））から摘出した１．１ｋｂＨｐａ１−Ｄｒａ
ＩＰ７．５−ｇｐｔ遺伝子カセットとライゲートし
た。得られたプラスミドは、ｐＴＫｍ−ｓＰ１１−ｇｐ
ｔと呼ぶ。

【００７７】２．１０．ｐＴＫｍ−ＶＶｔｋａ及びｂこれらのプラスミドを、ＳｍａＩにより線状化されたベ
クターｐＴＫｍ−ｓＰ１１ヘ、ｐＧＳ５０（マケット
およびスミス（Ｍａｃｋｅｔｔ＆Ｓｍｉｔｈ）Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６７，２０６７〜２０８１（１９８
６））からの１．１ｂＤｒａＩ断片として調整され
た完全なワクシニアチミジンキナーゼ遺伝子を挿入する
ことにより構築した。得られたプラスミドを、ｐＴＫｍ
−ＶＶｔｋａ及びｂと呼んだ。

【００７８】２．１１．Ｍ１３ｍｐ１８−ＵＶ１第１の工程として、挿入ベクターｐＦＰ−ＵＶ２（２．
４参照）から誘導された１．２ｋｂＰｓｔＩ／ＳａｕＩ
断片を、Ｍ１３ｍｐ１８へサブクローニングした。この
断片は、１１Ｋポリペプチドをコードするワクシニアウ
イルス遺伝子のプロモーター（Ｐ１１；バートレット
等；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８２，２０９６〜２１００（１９８５））及び７．５Ｋ
ポリペプチドをコードするワクシニアウイルス遺伝子の
プロモーター（Ｐ７．５；コクラン等；Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，５４，３０〜３７（１９８５））及びｌａｃＺ遺
伝子の断片を含む。得られたプラスミドは、Ｍ１３ｍｐ
１８−ＵＶ１と呼んだ。

【００７９】２．１２．Ｍ１３ｍｐ１８−Ｅｃｏ２オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発（アマシャム社）
を、Ｍ１３ｍｐ１８−ＵＶ１のｌａｃＺ遺伝子のＡＴＧ
の上流に第２のＥｃｏＲＩ部位７ｋｂを導入するために
用い、中間体プラスミドＭ１３ｍｐ１８−Ｅｃｏ２を調
製した。ｌａｃＺ上流域を改変するために用いられる突
然変異誘発プライマーは、配列５′−ＡＣＣＡＴＡ
ＴＧＴＡＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＧＡＴＡ
Ａ−３′を有した。

【００８０】２．１３．ｐＦＰ−ＵＶ２−Ｅｃｏ２Ｍ１３ｍｐ１８−Ｅｃｏ２から調製した修飾ＰｓｔＩ／
ＳａｕＩプロモーター断片を、ＰｓｔＩ／ＳａｕＩ切断
ｐＦＰ−ＵＶ２へ挿入した。得られたベクターは、ｐＦ
Ｐ−ＵＶ−２−Ｅｃｏ２と呼ぶ。

【００８１】２．１４．ｐＦＰ−Ｚ１プラスミドｐＦＰ−Ｚ１を、ｐＦＰ−ＵＶ２−Ｅｃｏ２
から０．９ｋｂＥｃｏＲＩＰ１１／Ｐ７．５断片を削
除することにより構築し、ｌａｃＺ遺伝子の上流近傍に
多重クローニング部位を配置した。

【００８２】２．１５．ｐＦＰ−Ｚ２１プラスミドｐＦＰ−Ｚ２１を、部分的にＣｌａＩで消化
したベクターｐＦＰ−Ｚ１へ、合成リンカー配列（５′
−ＣＧＡＴＴＧＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣ
ＧＡＣＡＧＧＣＣＴＡＴ−３′；相補鎖，５′−
ＣＧＡＴＡＧＧＣＣＴＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴ
ＣＣＴＧＧＣＣＡＡＴ−３′）を導入することに
より構築した。この修飾は、ｌａｃＺ遺伝子の単一切除
を可能とする。

【００８３】２．１６．ｐＦＰ−２プラスミドｐＦＰ−２を、ＳｍａＩで線状化したプラス
ミドｐＦＰ−Ｚ１へ、ＳｓｐＩ／ＥｃｏＲＶ消化ＦＰＶ
−ＤＮＡ（ＨＰ１−４４１）のランダム断片を挿入する
ことにより構築されたライブラリーから単離した。

【００８４】２．１７．ｐＦＰ−ＺＰ２Ｐ２プロモーター活性を含む０．６ｋｂＥｃｏＲＩ／Ｎ
ｓｉＩ断片を、ｐＦＰ−２から調製した。この断片を、
ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで線状化したベクターｐＦＰ−Ｚ
２１とライゲートした。

【００８５】２．１８．ｐＴＺｇｐｔ−Ｐ２ａ及びｐＴ
Ｚｇｐｔ−Ｐ２ｂこれらのプラスミドを、ＨｐａＩで線状化したプラスミ
ドｐＴＺｇｐｔ−ｄＰ（２．２７参照）へ、ｐＦＰ−Ｚ
Ｐ２から誘導したＰ２−ｌａｃＺ遺伝子カセット（３．
７ｋｂＳｍａＩ／ＳｔｕＩ断片）を挿入することにより
構築した。得られたベクターは、ｐＴＺｇｐｔ−Ｐ２ａ
及びｐＴＺｇｐｔ−Ｐ２ｂと呼ぶ。

【００８６】２．１９．ｐＦＳ５０第１の工程において、プラスミドｐＴＺ１９Ｒ（ファル
マシア）をＰｖｕＩＩで消化し、多重クローニング部位
及びその近接配列を含む３４９ｂｐ断片を削除した。こ
のベクター断片を、ＤｒａＩ消化によりｐＧＳ５０から
調製した１．１ｋｂワクシニアｔｋ−遺伝子断片とライ
ゲートした。得られたプラスミドは、ｐＦＳ５０と呼
ぶ。

【００８７】２．２０．ｐＦＳ５１ｐＦＳ５０を、ＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、合成
リンカー（Ｐ−ＭＣＳ１及び２）とライゲートした。こ
のベクターは、ｐＦＳ５１と呼ぶ。リンカー構築のため
に用いたオリゴヌクレオチドは、以下の表７の配列を有
する。

【００８８】

【遺伝子配列４】

【表７】

【００８９】２．２１．ｐＦＳｇｐｔプラスミドｐＦＳｇｐｔを、ＰｖｕＩＩ／ＮｄｅＩで切
断したプラスミドｐＦＳ５１へ、ＮｄｅＩ及びＤｒａＩ
での消化によりｐＴＫｇｔｐ−Ｆｌｓ（フォ−クナー＆
モス；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２，１８４９〜１８５４
（１９８８））から調製した０．９８ｋｂＰ７．５−
ｇｐｔ遺伝子カセットをサブクローニングすることによ
り生成した。

【００９０】２．２２．ｐＰ２ｍ０ｇｐｔ突然変異体ｍ０Ｐ２プロモーターをコードする合成オ
リゴヌクレオチドをアニーリングし、ＮｄｅＩ／Ｂａｍ
ＨＩにより線状化したベクターｐＦＳｇｐｔへ強制クロ
ーニングすることにより挿入した。これらのオリゴヌク
レオチドのヌクレオチド配列は、以下の表８のごとくで
ある。

【００９１】

【遺伝子配列５】

【表８】

【００９２】２．２３．ｐＰ２ｍ１ｇｐｔｐＰ２ｍ１ｇｐｔを構築するために、合成リンカー配列
ｍ１．１及びｍ１．２をアニーリングし、ＮｄｅＩ／Ｂ
ａｍＨＩで線状化したベクターｐＦＳｇｐｔでライゲー
トした。オリゴヌクレオチドは、以下の表９の配列を有
する。

【００９３】

【遺伝子配列６】

【表９】得られたプラスミドは、ｐＰ２ｍ１ｇｐｔと呼ぶ。

【００９４】２．２４．ｐＰ２ｍ２ｇｐｔベクターｐＰ２ｍ２ｇｐｔを、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで
切断されたプラスミドｐＦＳｇｐｔと、アニーリングさ
れたオリゴヌクレオチドｍ２．１及びｍ２．２をライゲ
ートすることにより生成した。クローニングのために使
用されるオリゴヌクレオチドは、以下の表１０の配列を
有する。

【００９５】

【遺伝子配列７】

【表１０】得られたプラスミドは、ｐＰ２ｍ２ｇｐｔと呼ぶ。

【００９６】２．２５．ｐＰ２ｍ０ｇｐｔ−ｌａｃＺ，
ｐＰ２ｍ１ｇｐｔ−ｌａｃＺ及びｐＰ２ｍ２ｇｐｔ−ｌ
ａｃＺ／ｐＰ２ｍｘｇｐｔ−ｌａｃＺｐＰ２ｍ０ｇｐｔ−ｌａｃＺ，ｐＰ２ｍ１ｇｐｔ−ｌａ
ｃＺ及びｐＰ２ｍ２ｇｐｔ−ｌａｃＺの構築を、Ｅｃｏ
ＲＩ／ＳｍａＩで線状化したベクターｐＰ２ｍ０ｇｐ
ｔ，ｐＰ２ｍ１ｇｐｔ及びｐＰ２ｍ２ｇｐｔへ、３．２
ｋｂＥｃｏＲＩ／ＢａＩＩ断片（プラスミドｐＦＰ−Ｚ
２１から誘導された）としてのＥ．ｃｏｌｉｌａｃＺ
遺伝子を挿入することにより行った。

【００９７】２．２６．ｐＴＺｇｐｔ−Ｆｌｓワクシニアウイルス挿入ベクターｐＴＺｇｐｔ−Ｆｌｓ
を、ｐＴＫｇｐｔ−Ｆｌｓ（フォークナーおよびモス；
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２，１８４９〜１８５４（１９８
８））の２．４ｋｂＰｖｕＩＩ断片（プラスミドｐＵＣ
１８から初めに誘導された）を、プラスミドｐＴＺ１９
Ｒ（ファルマシア社）からの２．５ｋｂＰｖｕＩＩ断片
に置き換えることにより構築した。アンピシリン耐性遺
伝子及びプラスミドの複製起点（２．４ｋｂｐＵＣＰ
ｖｕＩＩ断片上にも存在）に加えて、バクテリオファー
ジｆ１の複製起点を、このクローニング工程によりｐＴ
Ｋｇｐｔ−Ｆｌｓへ挿入した。

【００９８】２．２７．ｐＴＺｇｐｔ−ｄＰｐＴＺｇｐｔ−ＦｌｓのＰ１１プロモーターをＰｓｔＩ
及びＨｐａＩの消化により削除し、ラージベクター断片
をＨｐａＩリンカー（５′−ＧＧＴＴＡＡＣＣ−３′，
ファルマシア社）とライゲートした。得られたプラスミ
ドは、ｐＴＺｇｐｔ−ｄＰと呼ぶ。

【００９９】２．２８．Ｍ１３ｍｐ１８−ＵＶ３プラスミドＭ１３ｍｐ１８−ＵＶ３を、ベクターＭ１３
ｍｐ１８−ＵＶ１（２．１１参照）中のＰ１１プロモー
ターのインビトロにおけるオリゴヌクレオチド誘導突
然変異誘発（ファルマシア社）により構築した。プロモ
ーター領域を改変するために使用されるオリゴヌクレオ
チドは、配列５′−ＴＡＧＣＴＡＴＡＡＡＴＡＡＡＧＡ
ＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧ−３′を有する。

【０１００】２．２９．ｐＴＺｇｐｔ−Ｐ１１Ｍワクシニアウイルス組換えプラスミドｐＴＺｇｐｔ−Ｐ
１１Ｍを、ＨｐａＩで消化したｐＴＺｇｐｔ−ｄＰプラ
スミドへ、Ｍ１３ｍｐ１８−ＵＶ３から誘導したＨｉｎ
ｄＩＩＩ／Ａｓｐ７１８クレノーポリメラーゼ処理６０
０ｂｐ断片を挿入することにより構築した。この断片
は、突然変異Ｐ１１プロモーター（Ｐ１１Ｍ）を含む。

【０１０１】２．３０．ｐＦＰ−ＺｓＰ１１オリゴヌクレオチドｓＰ１１（３）及びｓＰ１１（４）
をアニーリングし、ＳｍａＩ／ＰｓｔＩで切断したベク
ターｐＦＰ−Ｚ２１（２．１５参照）へクローニングし
た。ｓＰ１１（３）及びｓＰ１１（４）の配列はそれぞ
れ以下表１１のごとくである。

【０１０２】

【遺伝子配列８】

【表１１】得られたプラスミドは、ｐＦＰ−ＺｓＰ１１と呼ぶ。

【０１０３】２．３１．ｐＴＺｇｐｔ−ｓＰ１１ｐＦＰ−ＺｓＰ１１を、ＳｍａＩ／ＢａＩＩで消化し、
ｌａｃＺ遺伝子へリンクした合成プロモーター配列を含
む３．３ｋｂ断片をワクシニアウイルス挿入ベクターｐ
ＴＺｇｐｔ−ｄＰ（２．２７参照）へクローニングし
た。得られたプラスミドは、ｐＴＺｇｐｔ−ｓＰ１１と
呼ぶ。

【０１０４】２．３２．ｐＦＰ−Ｚｓ４ｂオリゴヌクレオチドｓ４ｂ（３）及びｓ４ｂ（４）をア
ニーリングし、ＳｍａＩ／ＰｓｔＩ切断ベクターｐＦＰ
−Ｚ２１（２．１５参照）へクローニングした。ｓ４ｂ
（３）及びｓ４ｂ（４）の配列はそれぞれ以下表１２の
ごとくである。

【０１０５】

【遺伝子配列９】

【表１２】得られたプラスミドは、ｐＦＰ−Ｚｓ４ｂと呼ぶ。

【０１０６】２．３３．ｐＴＺｇｐｔ−ｓ４ｂｐＦＰ−Ｚｓ４ｂをＳｍａＩ／ＢａＩＩで消化し、ｌａ
ｃＺ遺伝子とリンクした合成プロモーター配列を含む
３．３ｋｂ断片をワクシニアウイルス挿入ベクターｐＴ
Ｚｇｐｔ−ｄＰ（２．２７参照）へクローニングした。
得られたプラスミドは、ｐＴＺｇｐｔ−ｓ４ｂと呼ぶ。

【０１０７】２．３４．ｐＦＰ−Ｚｓａｒｔオリゴヌクレオチドｓａｒｔ（３）及びｓａｒｔ（４）
をアニーリングし、ＳｍａＩ／ＰｓｔＩで切断したベク
ターｐＦＰ−Ｚ２１（２．１５参照）へクローニングし
た。ｓａｒｔ（３）及びｓａｒｔ（４）の配列は、それ
ぞれ以下の表１３のごとくである。

【０１０８】

【遺伝子配列１０】

【表１３】得られたプラスミドは、ｐＦＰ−Ｚｓａｒｔと呼ぶ。

【０１０９】２．３５．ｐＴＺｇｐｔ−ｓａｒｔｐＦＰ−ＺｓａｒｔをＳｍａＩ／ＢａＩＩで消化し、ｌ
ａｃＺ遺伝子へリンクした合成プロモーター配列を含む
３．３ｋｂ断片をワクシニアウイルス挿入ベクターｐＴ
Ｚｇｐｔ−ｄＰ（２．２７参照）へクローニングした。
得られたプラスミドは、ｐＴＺｇｐｔ−ｓａｒｔと呼
ぶ。

【０１１０】組換えウイルスｖｆｌｓβ，ｖＰ１１，ｖ
Ｐ１１ｍ，ｖ４ｂ及びｖａｒｔを、組換えプラスミドｐ
ＴＫｇｐｔＦ１β（フォークナーおよびモス等；Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．６２，１８４９〜１８５４（１９８８））、
ｐＴＺｇｐｔ−ｓＰ１１、ｐＰ１１ｍ−ｌａｃＺ（ティ
−．ロングマン（Ｔ．Ｌａｎｇｍａｎｎ），デュプロマ
ルベイト（Ｄｉｐｌｏｍａｒｂｅｉｔ），Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔａｔＷｉｅｎ１９９１）ｐＴＺｇｐｔ−ｓ４
ｂ及びｐＴＺｇｐｔ−ｓａｒｔからそれぞれ誘導した。

【０１１１】３．細胞培養における増殖のための鶏痘ウ
イルスチミジンキナーゼの適応性３．１．ＦＰＶ挿入プラスミドｐＦＰ−ＵＶ２及びｐＦ
Ｐ−ＵＶ２−ＰＴの構築構築されたプラスミドｐＦＰ−ＵＶ２及びｐＦＰ−ＵＶ
２−ＰＴの最初のタイプにおいては、鶏痘ウイルスｔｋ
−遺伝子のコーディング配列は、外来遺伝子挿入物によ
り２つの断片に分割される。プラスミドｐＦＰ−ＵＶ２
は、ワクシニアウイルス挿入プラスミドｐＵＶ１（フォ
ークナー等；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１５，
７１９２（１９８７））と同様の構造を有する。ｐＵＶ
１においては、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃＺレポーター遺伝
子が、ワクシニアウイルス初期／後期Ｐ７．５プロモー
ター（コクラン等；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５４，３０〜３
７（１９８５））により駆動する。ワクシニアウイルス
主要後期１１Ｋポリペプチドのプロモーター（ベルトレ
ット等；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８２；２０９６〜２１００（１９８５））は、多重
クローニング部位により追従され、挿入する外来遺伝子
の調節因子として機能する。両構成要素ともワクシニア
ウイルスｔｋ−遺伝子配列により側面配列化される（図
１のＡ）。プラスミドｐＦＰ−ＵＶ２は、ｌａｃＺレポ
ーター遺伝子及びプロモーターの配列と同様である。し
かしながらそのプラスミドは、鶏痘ウイルスｔｋ−遺伝
子配列により側面配列化される（図１のＡ）。インビ
ボ組換えによるＦＰＶのゲノムｔｋ−位置へのｐＦＰ−
ＵＶ２の挿入により、ｐＵＶ１の場合のように、ウイル
スｔｋ−遺伝子が不活性化される。このプラスミドを構
築するために、ｐＵＶ１のプロモーターｌａｃＺ遺伝子
カセットを、図１のＡに概説されるように、２工程によ
って、ＦＰＶｔｈ−遺伝子の範囲内の特有のＮｃｏＩ部
位へクローニングした。組換えプラスミドｐＦＰ−ＵＶ
２−ＰＴを構築するために、ヒトプロトロンビンｃＤＮ
Ａを、ワクシニア１１Ｋプロモーターの下流のベクター
ｐＦＰ−ＵＶ２へ挿入した。プラスミドｐＦＰ−ＵＶ２
−ＰＴを、初めの一連のＦＰＶ組換え体の構築のために
使用した。

【０１１２】図１において、略号は以下の意味を有す
る。ＦＰＶ−ｔｋ＝鶏痘ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子ＶＶ−ｔｋ＝ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ遺
伝子Ｐ１１＝ワクシニアウイルス主要後期１１ｋＤａポリペ
プチドのプロモーターＰ７．５＝ワクシニアウイルス７．５ｋＤａポリペプチ
ドのプロモーターｌａｃＺ＝β−ガラクトシダーゼをコードするＥ．ｃｏ
ｌｉ遺伝子（矢印は転写の方向を示す。）

【０１１３】３．２．ｐＦＰ−ＵＶ２−ＰＴから誘導さ
れたＦＰＶ組換え体のゲノム特性プラスミドｐＦＰ−ＵＶ２−ＰＴの機能特性を調査する
ために、ニワトリ胎芽線維芽細胞におけるインビボ組
換え実験を行った。ｌａｃＺレポーター遺伝子のため
に、組換えウイルスを、ブループラークスクリーニング
により同定した。いくつかのプラークを採取し、プラー
クを３回精製した。ＦＰＶｔｋ遺伝子及びｌａｃＺ遺伝
子プローブを有するＦＰＶ組換え体で感染させた細胞か
らの全ＤＮＡのサザンハイブリッド形成によっては、制
限断片の正確なバンドパターン（ｌａｃＺ遺伝子を有す
る約８．３ｋｂの１つの新規バンド及びＦＰＶｔｋ−遺
伝子プローブを有する約１．９及び８．３ｋｂの２つの
バンド）を観察できないことが示された。その代わり
に、野生型ｔｋ−遺伝子バンドを含む複合パターンのバ
ンドは見られた。１つの典型的なウイルス単離体（ｆ−
ＰＴ１ブルーと呼ばれる）を、プラーク精製及びサザン
分析のさらなるラウンドのために選択した。３回のプラ
ーク精製単離体から始まる全１１ラウンドのプラーク精
製によっては、意味あるほどには複合バンドパターンは
変化しなかった。図２及び図３のレーン１〜５におい
て、ＦＰＶｔｋ−遺伝子プローブ（図２）及びｌａｃＺ
遺伝子プローブ（図３）で視覚化された、３、５、７、
９及び１１回目のラウンドのプラーク精製のウイルスＤ
ＮＡのサザン分析を示す。他の単離体ｆ−ＰＴ２ブルー
は、同様の結果を示したが、同定可能なＤＮＡバンドパ
ターンではなかった（図２及び図３、レーン６）。

【０１１４】プラーク精製の全てのラウンドの際に、白
色プラークが頻繁に観察された。２種の白色プラークｆ
−ＰＴ１及び２ホワイトを、ｆ−ＰＴブルー単離体と共
に分析した。それらは、ｌａｃＺ遺伝子プローブとハイ
ブリッドを形成したが、青色を発現することはなかった
（図３，レーン８及び９）。ＦＰＶｔｋ−遺伝子プロー
ブとのハイブリッド形成は、全ての場合において、野生
型ｔｋ−遺伝子の存在を明らかにした（図２，レーン１
〜９，矢印）。ＦＰＶ野生型コントロールは、レーン７
に示され、ネガティブコントロール（ニワトリ胎芽線維
芽ＤＮＡ）は、レーン１０に示される。これらの意外な
結果が部分ＥｃｏＲＩ消化によるものでないことを実証
するために、図２に示されるのと同様のブロットを、プ
ロトロンビン遺伝子プローブへハイブリダイズした。図
４に示されるように、全ての場合において（レ−ン６を
除き、これらのより大きいバンドは、ｆ−ＰＴ２ブルー
ゲノムにおけるより複合的な組換え結果により形成され
たものである。）、制限的消化が完全であることを示す
唯一のバンド（２．０ｋｂプロトロンビンバンド）が検
出された。従って、図２及び図３に示される複合バンド
は、ウイルスＤＮＡの部分消化ゆえの人工的なものでは
なく、挿入プラスミドｐＦＰ−ＵＶ２−ＰＴを有するウ
イルスｔｋ遺伝子の不活性化により、ゲノム的にモノク
ローナルな鶏痘組換え体が得られなかったことを反映す
るものである。

【０１１５】図２〜４においてレーン１〜５は、プラー
ク精製の異なる段階（それぞれ３，５，７，９及び１１
回目のラウンド）でのＦＰＶ組換え体ｆ−ＰＴ１−ブル
ーからのＤＮＡを示す。レーン６は、異なる単離体ｆ−
ＰＴ２−ブルーを示す。レーン７，８及び９は、それぞ
れＦＰＶ野生型及び２つの別個のホワイトプラーク単離
体（ｆ−ＰＴ−ホワイト１及び２）を示す。ネガティブ
コントロールとして、ニワトリ胎芽線維芽細胞ＤＮＡが
レーン１０に示される。図２における矢印は、ＦＰＶ野
生型ｔｋ−遺伝子バンドを指す。右に記載した値は、キ
ロベースペアー（ｋｂ）での標準に対応する。

【０１１６】３．３．ＦＰＶ挿入プラスミドｐＴＫｍ−
ｓＰ１１−ｇｐｔの構築ｔｋ−遺伝子がＦＰＶ株ＨＰ１．４４１において必須で
あるとする仮説を調査するために、新規挿入プラスミド
ｐＴＫｍを構築した。このプラスミドにおける外来遺伝
子の挿入部位は、ｔｋ−遺伝子とｔｋ遺伝子の下流のオ
ープンリーディングフレーム（３′ｏｒｆ）の間の遺伝
子間領域に位置づける。ｔｋ−遺伝子と３′ｏｒｆの間
の野生型遺伝子間領域は、外来遺伝子挿入のための特有
な制限部位を含まない。従って、この領域を、図５，６
に示されるように修飾した。ｔｋ−遺伝子の停止コドン
のすぐ下流に、ワクシニアウイルス初期転写停止シグナ
ル（ロルマンジー．（ＲｏｈｒｍａｎｎＧ．）等，
Ｃｅｌｌ，４６：１０２９（１９８６））及び特有の制
限部位ＣｌａＩ、ＳｍａＩ及びＡｓｐ７１８を、部位誘
導突然変異形成により導入した。プラスミドｐＴＫｍの
修飾された拡張遺伝子間領域へ、合成Ｐ１１プロモータ
ー−ｌａｃＺ遺伝子カセット及びＰ７．５−ｇｐｔ遺伝
子カセットを、２工程により挿入した。最後に得られた
プラスミドは、ｐＴＫｍ−ｓＰ１１−ｇｐｔと呼び（図
７，８）、それは、ブループラークスクリーニングのた
めのｌａｃＺ遺伝子及び選択マーカーとしてのｇｐｔ−
遺伝子を含む。ウイルスゲノムへの挿入に際して、ＰＶ
ｔｋ−遺伝子を分裂させることも不活性化させることも
ない。

【０１１７】図７及び図８において、ｓＰ１１は、ワク
シニア主要後期１１ｋＤａポリペプチドのプロモーター
から誘導した合成ワクシニアウイルス後期プロモーター
を意味する。３′ｏｒｆは、鶏痘ウイルスｔｋ−遺伝子
の下流のオープンリーディングフレームを意味する。ｇ
ｐｔは、酵素キサンチン−グアニン−ホスホリボシル−
トランスフェラーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉ遺伝子を
意味する。他の略号は、図１に記載したのと同様であ
る。矢印は、転写の方向を示す。

【０１１８】３．４．無傷のＦＰＶｔｋ−遺伝子を有す
る組換え鶏痘ウイルス続いて、プラスミドｐＴＫｍ−ｓＰ１１−ｇｐｔを、ニ
ワトリ胎芽線維芽細胞におけるインビボ組換えによる
ＦＰＶ組換え体を構築するために用いた。ｇｐｔ選択に
より得られた全てのプラークを、オーバーレイ中Ｘ−ｇ
ａｌの存在下青色に染色した。プラーク精製（ｇｐｔ−
選択に基づく）の２回のラウンドのみがウイルス単離体
を得るために必要とされた。

【０１１９】次いで、ｆ−ｓＰ１１＃１と呼ばれる単離
体のうちの一つを、大量に増殖させ、精製した。組換え
体及び野生型のウイルスＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで消化
し、アガロースゲル上で分離し、サザンブロッティング
により分析した。図９のＡ〜Ｃにおいて、異なるプロー
ブを用い、個々のレーンは以下を示す。

【０１２０】（Ａ）ＦＰＶｔｋ−遺伝子プローブとのハ
イブリッド形成。レーン１は、ＦＰＶ組換え体ｆ−ｓＰ
１１＃１のＤＮＡを示す。レーン２は、ＦＰＶ野生型ウ
イルスＨＰ１．４４１のＤＮＡを示す。レーン３は、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩで消化したラムダＤＮＡを示す。（Ｂ）ｇｐｔ−遺伝子プローブとのハイブリッド形成。
レーン１は、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したラムダＤＮＡを
示す。レーン２は、ＦＰＶ組換え体ｆ−ｓＰ１１＃１の
ＤＮＡを示す。レーン３は、ＦＰＶ野生型ウイルスＨＰ
１．４４１のＤＮＡを示す。（Ｃ）ｌａｃＺ遺伝子及びファージラムダＤＮＡプロー
ブとのハイブリッド形成。レーン１は、ＨｉｎｄＩＩＩ
で消化したラムダＤＮＡを示す。レーン２は、ＦＰＶ組
換え体ｆ−ｓＰ１１＃１のＤＮＡを示す。レーン３は、
ＦＰＶ野生型ウイルスＨＰ１．４４１のＤＮＡを示す。
比較のために右に記載した値は、キロベースペアの基準
に従う。

【０１２１】図９のＡおいては、制限断片を、ＦＰＶｔ
ｋ−遺伝子プローブとハイブリッド形成させた。組換え
ＤＮＡにおいては、２つの新規断片５．２ｋｂ及び４．
７ｋｂが視覚化される（レーン１）。コントロールＤＮ
Ａにおいては、５．５ｋｂ野生型ｔｋ−バンドが示され
る。ｇｐｔ−遺伝子プローブとのハイブリッド形成後
（図９のＢ）、ｔｋ−遺伝子及びｇｐｔ配列の一部を含
む５．２ｋｂ断片を、シグナルが得られない野生型ウイ
ルス（レーン３）と共に、ライトアップする（レーン
２）。最後に、ｌａｃＺ遺伝子及びファ−ジラムダプロ
ーブとのハイブリッド形成（図９のＣ）は、組換えウイ
ルスの断片を含む４．７ｋｂｌａｃＺ遺伝子（レーン
２）及びマーカーバンド（レーン１）を明らかにする。
野生型ウイルスについては、ハイブリッド形成はなされ
ない（レーン３）。

【０１２２】この実験から、ＦＰＶｔｋ−遺伝子と３′
ｏｒｆの間の遺伝子間領域が必須なものでなく、無傷の
ｔｋ−遺伝子が真のＦＰＶ組換え体の精製を可能とする
ことが結論づけられた。

【０１２３】３．５．新規ＦＰＶ宿主株：ｆ−ＴＫ２ａ
及びｆ−ＴＫ２ｂ技術的及び生物学的理由により、組換えＦＰＶの構築の
ためには、より困難性を有し、より時間の消費を考慮す
る必要がある。従って、対象として重要な遺伝子をＦＰ
Ｖへ挿入する前に、同様のワクシニアウイルス組換え体
を通常それぞれの遺伝子の機能を調査するために構築し
た。鶏痘組換え体の構築のためにも同様のワクシニア挿
入プラスミドの使用を可能とするために、Ｅ．ｃｏｌｉ
ｌａｃＺ遺伝子と共にワクシニアウイルスｔｋ−遺伝子
を、鶏痘ウイルスのｔｋ−遺伝子と３′ｏｒｆの遺伝子
間領域に挿入した。プラスミドｐＴＫｍ−ＶＶｔｋａ及
びｐＴＫｍ−ＶＶｔｋｂを、中間体プラスミドｐＴＫｍ
−ｓＰ１１へ機能性ＶＶｔｋ−遺伝子をクローニングす
ることにより構築した（図７，８）。ＦＰＶ野生型ウイ
ルスとｐＴＫｍ−ＶＶｔｋａ及びｂの組換えに際して、
２つの新規ＦＰＶ宿主株（ｆ−ＴＫ２ａ及びｆ−ＴＫ２
ｂと呼ぶ）を作成した。従って、この新規宿主株は、２
つの機能性ｔｋ−遺伝子及びｌａｃＺ遺伝子を含み、そ
れら遺伝子の全ては、組換え基質として適切な挿入プラ
スミドに対する新規非必須部位として使用できる。この
新規株のサザンブロット分析を、図６Ａ〜Ｃに示す。野
生型ウイルスＨＰ１．４４１のＤＮＡ、２つのＦＰＶ組
換え体のＤＮＡ及びプラスミドｐＴＫｍ−ＶＶｔｋａ及
びｐＴＫｍ−ＶＶｔｋｂを、制限酵素ＰｓｔＩ、Ｃｌａ
Ｉ及びＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲル上にて
分離し、ニトロセルロースへ移した。図１０〜１２のブ
ロットは、ＦＰＶ−ｔｋ−遺伝子プローブ（図１０）、
ワクシニアウイルスｔｋ−遺伝子プローブ（図１１）及
びｌａｃＺ遺伝子及びラムダＤＮＡプローブ（図１２）
とハイブリダイズされた。

【０１２４】図１０〜１２において、レーン１は、Ｐｓ
ｔＩで消化したＦＰＶ野性型ＤＮＡ（ＨＰ１．４４１）
を示す。レーン２は、ＰｓｔＩで消化したｆ−ＴＫ２ａ
ＤＮＡを示す。レーン３は、ＰｓｔＩで消化したｆ−Ｔ
Ｋ２ｂＤＮＡを示す。レーン４は、ＣｌａＩで消化した
ＦＰＶ野性型ＤＮＡ（ＨＰ１．４４１）を示す。レーン
５は、ＣｌａＩで消化したｆ−ＴＫ２ａＤＮＡを示す。
レーン６は、ＣｌａＩで消化したｆ−ＴＫ２ｂＤＮＡを
示す。レーン７は、ＥｃｏＲＩで消化したＦＰＶ野性型
ＤＮＡ（ＨＰ１．４４１）を示す。レーン８は、Ｅｃｏ
ＲＩで消化したｆ−ＴＫ２ａＤＮＡを示す。レーン９
は、ＥｃｏＲＩで消化したｆ−ＴＫ２ｂＤＮＡを示す。
レーン１０は、マーカーＤＮＡを示す。レーン１１はＥ
ｃｏＲＩで消化したｐＴＫｍ−ＶＶｔｋａＤＮＡを示
す。レーン１２は、ＥｃｏＲＩで消化したｐＴＫｍ−Ｖ
ＶｔｋｂＤＮＡを示す。レーン１３は、ＣｌａＩで消化
したｐＴＫｍ−ＶＶｔｋａＤＮＡを示す。レーン１４
は、ＣｌａＩで消化したｐＴＫｍ−ＶＶｔｋｂＤＮＡを
示す。レーン１５は、ＰｓｔＩで消化したｐＴＫｍ−Ｖ
ＶｔｋａＤＮＡを示す。

【０１２５】全ての消化物について、正確なバンドパタ
ーン（図１３及び１４も参照）が、観察された。Ｃｌａ
Ｉ消化物の場合には、図１１のレーン５及び６における
約０．５及び０．７ｋｂの小ハイブリッド形成断片は、
ＣｌａＩ消化親プラスミドにおいて見出だせなかった
（図１１のレーン１３及び１４）。これは、プラスミド
ＤＮＡが、それぞれのＣｌａＩ部位をメチル化するＥ．
ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１から単離されたことによるもので
ある。コントロール実験において、この部位は、ＤＮＡ
がダムメチル化ネガティブＥ．ｃｏｌｉ株から調製され
た場合に切断可能であった。

【０１２６】図１３および１４において、数字は、断片
の予測されるサイズ（キロベースペア（ｋｂ））を示
す。ＦＰＶ−ｔｋは、鶏痘ウイルスチミジンキナーゼ
遺伝子を意味する。ＶＶ−ｔｋは、ワクシニアウイルス
チミジンキナーゼ遺伝子を意味する。ｓＰ１１は、合
成Ｐ１１プロモーターを意味する。ｌａｃＺは、Ｅ．ｃ
ｏｌｉｌａｃＺ遺伝子を意味する。矢印は、転写の方
向を示す。

【０１２７】４．ワクシニアウイルス組換え体における
鶏痘ウイルス初期／後期プロモーター４．１．鶏痘プロモーターの同定ワクシニアウイルスプロモーター及びｌａｃＺ遺伝子の
コーディング配列よりなる転写ユニットは、色素産生基
質Ｘ−ｇａｌの存在下増殖する細菌コロニーのβ−ガラ
クトシダーゼポジティブ表現型に帰結するＥ．ｃｏｌｉ
細胞において活性である。この現象は、ｌａｃＺネガテ
ィブＥ．ｃｏｌｉ株においてＥ．ｃｏｌｉｌａｃＺ遺
伝子を含むワクシニア挿入プラスミドを作用させる場合
に観察される（チャクラバルティ等；Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，５，３４０３〜３４０９（１９８
５））。ＦＰＶ及びワクシニアのプロモーター配列が、
機能的に等しいことから（ボイル＆カッパー；Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６７，１５９１〜１６００（１９８
６）；テイラー等；Ｖａｃｃｉｎｅ，６，４９７〜５０
３（１９８８））、鶏痘プロモーターもまた、Ｅ．ｃｏ
ｌｉにおいて活性である。これらの考察に基づいて、実
験計画が、鶏痘ウイルスＤＮＡにおけるプロモーター因
子の同定について提案される。

【０１２８】第１工程として、プラスミドｐＦＰ−Ｚ１
及びｐＦＰ−Ｚ２１を構築した（図１６）。図１６にお
いて、ＦＰＶ−ｔｋは、鶏痘ウイルスチミジンキナーゼ
遺伝子を意味する。Ｐ７．５は、ワクシニアウイルス
７．５ｋＤａ蛋白質遺伝子のプロモーターを意味する。
Ｐ１１は、ワクシニアウイルス１１ｋＤａポリペプチド
の遺伝子のプロモーターを意味する。ｓｓＤＮＡは、一
本鎖ＤＮＡを意味する。矢印は、転写の方向を示す。い
ずれのプラスミドも、プロモーターのないｌａｃＺ遺伝
子を含む。親プラスミドとして、ｐＦＰ−ＵＶ２が選択
された。これは、ワクシニアウイルスＰ７．５プロモー
ター、Ｐ１１プロモーター及び目的物をクローニングす
る多重クローニング部位により制御されるＥ．ｃｏｌｉ
ｌａｃＺ遺伝子を含み、鶏痘ウイルスｔｋ−配列によ
り側面配列化される。ワクシニアプロモーターを削除す
るために、新規ＥｃｏＲＩ部位を、ｌａｃＺ遺伝子の開
始コドンの上流７ｋｂに導入した。ＥｃｏＲＩでの切断
及びライゲーションにより、プロモーターのないｌａｃ
Ｚ遺伝子近傍に特有の制限部位を含むプラスミドｐＦＰ
−Ｚ１を形成した。次の工程においては、鶏痘ウイルス
株ＨＰ１．４４１のＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼ
ＳｓｐＩ及びＥｃｏＲＶにより消化し、プラスミドｐＦ
Ｐ−Ｚ１のｌａｃＺ遺伝子近傍の特有のＳｍａＩ部位に
クローニングした（図１７）。プラスミドを、β−ガラ
クトシダーゼネガティブＥ．ｃｏｌｉ株ＮＭ５２２へト
ランスフェクトし、アンピシリン及びＸ−ｇａｌを含む
寒天シャーレ上においた。一晩の増殖の後、低いパーセ
ンテージのコロニーが、青色を呈した。いくつかのコロ
ニーを集め、プラスミドＤＮＡを、ワクシニアウイルス
特異的遺伝子発現のためにＣＶ−１細胞におけるトラン
ジェント発現アッセイによりアッセイした（データは示
さない。）。プラスミドＤＮＡは、ワクシニアトランジ
ェント発現アッセイにおいてさまざまな量のβ−ガラク
トシダーゼ活性を誘発した。更に分析を行うために、最
も高い活性を示したクローン（クローン＃２）を選択
し、プロモーターを“Ｐ２”と呼び、プラスミドをｐＦ
Ｐ−２と呼んだ（図１７）。

【０１２９】図１７においてｇｐｔは、Ｅ．ｃｏｌｉキ
サンチングアニンホスホ−リボシルトランスフェラ
ーゼをコードする遺伝子を意味する。矢印は、転写の方
向を示す。

【０１３０】４．２．鶏痘ウイルスプロモーターＰ２の
構造プラスミドｐＦＰ−２の２．５ｋｂＰ２プロモーター
挿入物のＤＮＡを、制限地図によって分析した。５６０
ｋｂＥｃｏＲＩ−ＮｓｉＩ断片が、ｌａｃＺ遺伝子に近
く、それゆえにプロモーター配列を含み得る。この断片
を、ポリリンカー挿入物をｌａｃＺ遺伝子の３′末端で
有するｐＦＰ−Ｚ１の誘導体であるプラスミドｐＦＰ−
Ｚ２１へ挿入した（図１６）。次いで、プロモーターｌ
ａｃＺ遺伝子カセットを摘出し、プラスミドｐＴＺｇｐ
ｔ−ｄＰの単一ＨｐａＩ部位へクローニングし、プラス
ミドｐＴＺｇｐｔ−Ｐ２ａ及びｐＴＺｇｐｔ−Ｐ２ｂを
形成した（図１７）。プロモーター外来遺伝子転写ユニ
ットの配向性が、転写のレベルに影響され得ることか
ら、両プラスミドともさらなる研究のために使用され
た。プロモーター挿入物の配列化を、鋳型としてプラス
ミドｐＴＺｇｐｔ−Ｐ２ａを用いて行った。プロモータ
ーの一次構造及びＰ２遺伝子の最初の１０個のコドン
を、図１８に示す。５′非翻訳領域は、ＮｓｉＩ部位で
開始する１７４ｂｐの長さである。開始コドンの上流
に、保護されたポックスウイルスプロモーターコンセン
サス配列ＴＡＡＡＴが存在する（図１８，−６〜−２位
置）。その位置は後期プロモーターについて典型的であ
るが、いくつかの初期プロモーターにおいても見出せ
る。上流域の最初の１７４ｂｐの範囲に、初期転写停止
シグナルにより追従されるいくつかの“臨界初期領域”
（ＴＴＴＴＴＮＴ）もまた存在する。初期転写停止シグ
ナルは、後期プロモーターの機能的に重要なＴ−豊富領
域とオーバーラップする。

【０１３１】図１８において、開始コドン（肉太活字）
のＡ残基は、位置＋１と定義する。位置−６〜−２に
は、ワクシニアウイルス後期プロモーターコア配列が存
在し、位置−１９〜−１３には、ワクシニア初期ＲＮＡ
停止シグナルが存在する。最小１１ヌクレオチドにおい
て、１６ｂｐワクシニア初期プロモーター臨界領域へ一
致する配列は、下線がなされている。上流域は、位置−
１７４まで延びる。下流域（Ｐ２遺伝子の３０ヌクレオ
チドコーディング配列）は、＋１〜＋３０まで延びる。

【０１３２】プラスミドｐＴＺｇｐｔ−Ｐ２ａにおける
Ｐ２−ｌａｃＺ転写単位は、融合遺伝子であった。開始
コドンは、５′非翻訳範囲の３９ヌクレオチドを有する
フレームに融合したＰ２遺伝子及びコーディング領域ｌ
ａｃＺ遺伝子の３６０ｂｐにより追従された（データは
示さない。）。融合遺伝子の計算上の分子量は、１３３
ｋＤである。

【０１３３】４．３．Ｐ２プロモーターと他のポックス
ウイルスプロモーターの活性力の比較プラスミドｐＴＺｇｐｔ−Ｐ２ａ及びｐＴＺｇｐｔ−Ｐ
２ｂを、ワクシニアウイル組換え体ｖＰ２ａ及びｖＰ２
ｂの構築のために使用した。両組換え体におけるＰ２プ
ロモーターの活性力を、他の強制ポックスウイルスプロ
モーターと比較した。ワクシニア組換え体ｖＦｌｓβ
（フォークナー＆モス；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，１８４
９〜１８５４（１９８８））は、ワクシニアＰ１１プロ
モーターの野生型バージョンを含む。ワクシニア組換え
体ｖａｒｔは、Ｐ１１野生型プロモーターより１．４倍
高い活性力を有する合成後期プロモーターの修飾バージ
ョンを含む。すべてのウイルスにおいて、ｌａｃＺレポ
ーター遺伝子は、それぞれのポックスウイルスプロモー
ターの直ぐ近傍に存在した。

【０１３４】βガラクトシダーゼ活性アッセイのため
に、ＣＶ−１細胞を、方法の部に記載したようにウイル
スで感染させた。図２０は、ＣＶ−１細胞における異な
るウイルス構築物により誘発された酵素活性を示す。ヒ
ストグラムは、個々のポックスウィルスプロモーター−
ｌａｃｚ構築物により誘発されたβ−ガラクトシダーゼ
発現レベルを示す。ｖＦｌｓβにおける野生型Ｐ１１プ
ロモーターの活性を、１００％と規定する。きわだっ
て、ＦＰＶＰ２プロモーターの“ｂ”配向は、Ｐ２プ
ロモーターが最も活性力の高いポックスウイルスプロモ
ーターに属することを示す１９０％の活性を誘発した。
２４時間のインキュベーションの後において、β−ガラ
クトシダーゼは、最も豊富な蛋白質の一つであり、全可
溶性細胞蛋白質の約６．３％を示す。Ｐ２プロモーター
の“ａ”配向を有する組換えウイルスは、可溶性細胞蛋
白質の約５％を示す、１５０％のβ−ガラクトシダーゼ
活性を誘発した。ウイルスｖａｒｔは、ｖＦｌｓβによ
り誘発された標準値と比較して１４０％のβ−ガラクト
シダーゼ活性を誘発することが見出された。β−ガラク
トシダーゼ活性測定量は、３回の個々の実験の平均値と
する。別個の第２の方法によりこれらの値を確認するた
めに、感染ＣＶ−１細胞からの２４時間抽出物を、１０
％ポリアクリルアミドゲル上にて分離し、デンシトメー
ターでスキャンした。β−ガラクトシダーゼピークを、
内部標準としての４２ｋＤアクチンに対して定量した。
ｖＦｌｓβについて得られた値は、再び１００％標準と
した。スキャンニングデータは、以下の表１４に示した
ように、酵素的に測定した活性データと良好な一致を示
した。

【０１３５】

【表１４】

【０１３６】感染後２４時間の細胞抽出物におけるβ−
ガラクトシダーゼの豊富性を説明するために、全可溶性
蛋白質のコマッシー（ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）ブルーで染
色されたポリアクリルアミドゲルを、図２１に示す。参
考ウイルスｖＦｌｓβ及び組換えｖａｒｔは、野生型ウ
イルスコントロールでは示さない（レーン１及び２）１
１７ｋＤサイズ範囲の新規バンドを示した（レーン３，
４，９及び１０；下の矢印）。配列分析により示唆され
たように、ウイルスｖＰ２ａ及びｖＰ２ｂにより誘導し
たβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白質は、天然酵素よりも
大きく、その融合遺伝子特性を立証する（レーン５〜
８；上の矢印）。

【０１３７】図２１に関して、細胞を、実験の部に記載
したように感染させた。全可溶性蛋白質を調製し、５μ
ｌ及び１０μｌの各量を、１０％ポリアクリルアミドゲ
ル上にて分析した。レーン１及び２は、ワクシニア野生
型ウイルスにより誘発した蛋白質を示す。レーン３及び
４は、ワクシニア組換え体ｖＦｌｓβにより誘発した蛋
白質を示す。レーン５及び６は、ウイルスｖＰ２ａによ
り誘発した蛋白質を示す。レーン７及び８は、ＶＶ組換
え体ｖＰ２ｂにより誘発した蛋白質を示す。レーン９及
び１０は、ＶＶ組換え体ｖａｒｔにより誘発した蛋白質
を示す。参考ウイルスｖＦｌｓβ（レーン３及び４）
は、野生型ウイルス感染細胞においては観察されなかっ
た（レーン１及び２）１１７ｋＤａ範囲の（下の矢印）
新規蛋白質を誘発した。組換え体ｖＰ２ａ及びｖＰ２ｂ
により得られたβ−ガラクトシダーゼ／Ｐ２−遺伝子融
合蛋白質（レーン５〜８）は、約１３０ｋＤａであった
（上の矢印）。

【０１３８】４．４．Ｐ２プロモーターの最大限の利用Ｐ２遺伝子プロモーターを最大限に利用するために、ｌ
ａｃＺ遺伝子とリンクした突然変異化Ｐ２プロモーター
領域を含む新規挿入プラスミドのパネルを構築した。最
初の工程として、２本鎖プロモーターオリゴヌクレオチ
ドのサンプル挿入が可能であり、選択のための最小Ｐ
７．５−ｇｐｔ遺伝子カセットを含むプラスミドを生成
した。このプラスミドｐＦＳｇｐｔの構築は、図２２，
２３に示される。このプラスミドの特有のＮｄｅＩ及び
ＢａｍＨＩ部位へ、異なる突然変異体プロモーターオリ
ゴヌクレオチドｍ０，ｍ１及びｍ２を挿入した。得られ
たプラスミドを、ｐＰ２ｍ０ｇｐｔ，ｐＰ２ｍ１ｇｐｔ
及びｐＰ２ｍ２ｇｐｔ（ｐＰ２ｍｘｇｐｔ，図２４，２
５）と呼ぶ。次の工程において、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃＺ
遺伝子を、ｐＰ２ｍ０ｇｐｔ−ｌａｃＺ，ｐＰ２ｍ１ｇ
ｐｔ−ｌａｃＺ及びｐＰ２ｍ２ｇｐｔ−ｌａｃＺに帰結
するプロモーター配列の下流においた（ｐＰ２ｍｘｇｐ
ｔ−ｌａｃＺ，図２４）。

【０１３９】図２４において、野生型又は突然変異体Ｐ
２プロモーター配列のいずれかをコードするオリゴヌク
レオチドを、ｐＦＳｇｐｔへライゲートした。Ｅ．ｃｏ
ｌｉｌａｃＺ遺伝子を、種々のプロモーターの下流に配
置し、それにより、プロモーターテストプラスミドｐＰ
２ｍｘｇｐｔ−ｌａｃＺを生成した。Ｐ２ｍｘ．１及び
Ｐ２ｍｘ．２は、Ｐ２プロモーターをコードする合成リ
ンカー配列を意味する。他の略号については、図１を参
照のこと。

【０１４０】突然変異体プロモーターｍ０（ＴＡＡＡＴ
ＧＡＡＴＴＣＣ）においては、ｌａｃＺ遺伝子のＡ
ＴＧを、直接後期プロモーターコア配列と融合させ、野
生型Ｐ２配列の位置−１でのＣ−残基を除去し、後期プ
ロモーターの有効性を向上させた突然変異を得る（図２
６）。この構造は、多くのワクシニア後期プロモーター
において見出だされ、後期プロモーターコンセンサス及
び開始コドンの最適のコンテクストであると考えられ
る。

【０１４１】突然変異体ｍ１（ＴＡＡＡＣＡＴＧＡＡ
ＴＴＣＣ）においては、ｌａｃＺ遺伝子の２番目のコ
ドンを、推定上のＰ２遺伝子のＡＴＧと直接融合させ
る。この突然変異体において、ｌａｃＺ遺伝子は、Ｐ２
野生型プロモーターにより駆動する（図２６）。

【０１４２】突然変異体ｍ２を、Ｐ２遺伝子の上流領域
において見出だされた初期プロモーター臨界領域の役割
を調査するために構築した。突然変異体プロモーターｍ
２は、後期プロモーターモチーフの上流の機能的に重要
なＴ−豊富領域の範囲内の初期ＲＮＡ停止シグナルが、
位置−１８でのＴＴＧ挿入により不活性化されることを
除き、ｍ１と同様な構造を有する（図２６）。

【０１４３】４．５．初期及び後期β−ｇａｌ発現にお
ける突然変異体の効果プラスミドを、ワクシニアウイルス組換え体を構築する
ため、及びＣＶ−１細胞を感染させるために使用した。
細胞質抽出物を、β−ガラクトシダーゼ活性についてア
ッセイした。結果を、図２７（ａ），（ｂ）に示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】鶏痘ウイルス挿入プラスミドｐＦＰ−ＵＶ２及
びｐＦＰ−ＵＶ２−ＰＴの構築工程図である。

【図２】メンブランを³²Ｐ標識ＦＰＶｔｋ−遺伝子プロ
ープへハイブリダイズした場合の挿入プラスミドｐＦＰ
−ＵＶ２−ＰＴから誘導されたＦＰＶ組換え体のサザン
ブロック分析を示す図である。

【図３】メンブランを１ａｃＺ遺伝子プローブへハイブ
リダイズした場合の挿入プラスミドｐＦＰ−ＵＶ２−Ｐ
Ｔから誘導されたＦＰＶ組換え体のサザンブロック分析
を示す図である。

【図４】メンブランをプロトンビン遺伝子プローブへハ
イブリダイズした場合の挿入プラスミドｐＦＰ−ＵＶ２
−ＰＴから誘導されたＦＰＶ組換え体のサザンブロック
分析を示す図である。

【図５】野生型及び突然変異体鶏痘ウイルスｔｋ−遺伝
子座の構造で、５．５ｋｂＥ．ｃｏＲＩ断片及び２．４
８ｋｂＢａｍＨＩ／ＣｌａＩ断片におけるＦＰＶｔｋ−
遺伝子の位置付けを示し（ｔｋ−遺伝子のコーディング
領域の中ほどにある単一のＮｃｏＩ部位は、挿入ベクタ
ーｐＦＰ−ＵＶ２を構築するために用いられる。）、ｔ
ｋ−遺伝子のすぐ下流に、３′ｏｒｆ及びそれ自身無傷
なｔｋ−遺伝子を残してのオリゴヌクレオチド誘導突然
変異を誘発させ、転写停止シグナル及びいくつかの有用
な制限部位を導入して、遺伝子間領域を修飾し拡張した
ことを示す図である。

【図６】修飾遺伝子間領域が、組換えプラスミドｐＴＫ
ｍ及びその誘導体に存在する、ＦＰＶ野生型及び修飾し
た遺伝子間領域の配列を示す図である。

【図７】ＦＰＶ挿入プラスミドｐＴｋｍ−ｓＰ１１−ｇ
ｐｔの構築を示す図である。

【図８】ＦＰＶ挿入プラスミドｐＴＫｍ−ＶＶｔｋａ及
びｐＴＫｍ−ＶＶｔｋｂの構築を示す図である。

【図９】生成したＦＰＶ組換え体ｆ−ｓＰ１１＃１及び
ＦＰＶ野生型ウイルスＤＮＡのサザンブロット分析を示
す図である。

【図１０】ＦＰＶ組換え体ｆ−ＴＫ２ａ及びｆ−ＴＫ２
ｂのＤＮＡのサザンブロット分析で、ブロットがＦＰＶ
ｔｋ−遺伝子プローブとハイブリダイズされた場合の図
である。

【図１１】ＦＰＶ組換え体ｆ−ＴＫ２ａ及びｆ−ＴＫ２
ｂのＤＮＡのサザンブロット分析で、ブロットがＶＶ−
ｔｋ遺伝子プローブとハイブリダイズされた場合の図で
ある。

【図１２】ＦＰＶ組換え体ｆ−ＴＫ２ａ及びｆ−ＴＫ２
ｂのＤＮＡのサザンブロット分析で、ブロットが１ａｃ
Ｚ遺伝子及びラムダＤＮＡプローブとハイブリダイズさ
れた場合の図である。

【図１３】酵素ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ，及びＣｌａＩで
の鶏痘ウイルス宿主株ｆ−ＴＫ２ａの制限酵素開裂地図
である。

【図１４】酵素ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ及びＣｌａＩでの
鶏痘ウイルス宿主株ｆ−ＴＫ２ｂの制限酵素開裂地図で
ある。

【図１５】野生型ウイルス及び新規ＦＰＶ宿主株ｆ−Ｔ
Ｋ２ａ及びｆ−ＴＫ２ｂのＦＰＶチミジンキナーゼ（ｔ
ｋ）遺伝子座の周辺領域の概略構成を示し、ＦＰＶ宿主
株は、ＦＰＶｔｋ遺伝子と３′−オープンリーディング
フレーム（ｏｒｆ）の間の遺伝子間領域へ、２つの新規
挿入物ワクシニアウイルスｔｋ−遺伝子（ＶＶ−ｔｋ）
及びＥ．ｃｏｌｉｌａｃＺ遺伝子（ｌａｃＺ）を挿入
しており、矢印が、それぞれの遺伝子の転写の方向を示
す図である。

【図１６】“プロモータートラップ”プラスミドｐＦ
Ｐ−Ｚ１及びｐＦＰ−Ｚ２１の構築工程図である。

【図１７】ワクシニアウイルス挿入プラスミドｐＴＺｇ
ｐｔ−Ｐ２ａ及びｐＴＺｇｐｔ−Ｐ２ｂの構築工程図で
ある。

【図１８】ＦＰＶＰ２プロモーター及びＰ２遺伝子の
最初の１０のコドンの配列を示す図である。

【図１９】ＦＰＶＰ２プロモーター、Ｐ２遺伝子及び下
流域を含むＮｓｉＩ−ＥｃｏＲＩ断片の配列を示す図で
ある。

【図２０】Ｐ２プロモーターと他のポックスウイルスプ
ロモーターの比較を示す図である。

【図２１】個々のワクシニア組換え体で感染させたＣＶ
−１細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。

【図２２】挿入プラスミドｐＦＳｇｐｔの構築工程図で
ある。

【図２３】ｐＦＳｇｐｔの多重クローニング部位の配列
を示し、転写停止コドンを、肉太印字で示し、ポックス
ウイルス初期転写停止シグナルを、下線を付して示す図
である。

【図２４】突然変異かＰ２プロモーター（ｍｘ）配列を
含む挿入プラスミドｐＰ２ｍｘｇｐｔの構築を示す図で
ある。

【図２５】挿入プラスミドｐＰ２ｍｘｇｐｔの多重クロ
ーニング部位の配列を示し、翻訳開始及び停止コドン
を、肉厚印字にて示し、ポックスウイルス初期転写停止
シグナルを、下線を付して示す図である。

【図２６】野生型及び突然変異体Ｐ２プロモーターの構
造を示す図である。

【図２７】（ａ）は感染ＣＶ−１細胞におけるＰ２プロ
モーター突然変異体により誘発されたβ−ガラクトシダ
ーゼ活性の比較のための後期プロモーター活性を示す図
で、（ｂ）は初期プロモーター活性を示す図である。

【図２８】ワクシニアウイルス挿入プラスミドｐＴＺｇ
ｐｔ−Ｆｌｓ及びｐＴＺｇｐｔ−Ｐ１１Ｍの構築工程図
である。

【図２９】プロモーターテストベクターｐＴＺｇｐｔ−
ｓＰ１１，ｐＴＺｇｐｔ−ｓ４ｂ及びｐＴＺｇｐｔ−ｓ
ａｒｔ（ｐＴＺｇｐｔ−ｓＰｘ）の構築工程図である。

【図３０】突然変異化プロモーター領域のヌクレオチド
配列で、ワクシニアウイルス後期プロモーターコンセン
サス配列を細い線で、翻訳開始コドンを肉厚線で示す図
である。

【図３１】個々のポックスウイルスプロモーターｌａｃ
Ｚ遺伝子構築物により誘発されたβ−ガラクトシダーゼ
発現レベルの比較で、個々の組換え体の発現レベルを、
ｖＦｌｓβの標準レベル（１００％）と比較した図であ
る。

【符号の説明】

ＦＰＶ−ｔｋ鶏痘ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子ＶＶ−ｔｋワクシニアウイルスチミジンキナーゼ遺
伝子Ｐｌｌワクシニアウイルス主要後期１１ｋＤａポ
リペプチドのプロモーターＰ７．５ワクシニアウイルス７．５ｋＤａポリペプ
チドのプロモーター１ａｃＺプータ−ガラクトシダーゼをコードする
Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子ｓＰ１１ワクシニア主要後期１１ｋＤａポリペプチ
ドのプロモーターから誘導した合成ワクシニアウイルス
後期プロモーター３′ｏｒｆ鶏痘ウイルスｔｋ−遺伝子の下流のオープ
ンリーディングフレームｇｐｔ酵素キサンチン−グアニン−ホスホリボシ
ル−トランスフェラーゼをコードするＥ．ｌｉ遺伝子ｓｓＤＮＡ一本鎖ＤＮＡｔｋワクシニアウイルスチミジンキナーゼ遺
伝子Ｐ１１Ｍ突然異変化Ｐ１１プロモーターｆ１ｏｒｉｆ１複製起点ＭＣＳ多重クローニング部位Ｐ１１ｗｔＰ１１プロモーターの野性型配列Ｐ１１ｍ突然変異化Ｐ１１配列ｓＰ１１合成突然変異化Ｐ１１配列ｓ４ｂ合成ＦＰＶ４ｂプロモーターｓａｒｔ合成（人工的）後期プロモーター

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 5/10 7/01 15/12 15/38 15/48 15/50 15/51 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (72)発明者ファルコ−ギュンターファルクナーオーストリア国アー−2304 マンスドルフ番地なし

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくともＦＰＶｔｋ−遺伝子、下流遺
伝子間領域及びそれに続く鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）の
３′オープンリーディングフレーム（３′ｏｒｆ）より
なり、当該遺伝子間領域が修飾され、１又はそれ以上の
特有の制限部位を含む拡張遺伝子間領域を形成し、それ
により外来ＤＮＡの挿入が可能となり、その状態におい
てＦＰＶｔｋ−遺伝子はその無傷性が維持され、完全な
チミジンキナーゼ（ＴＫ）のコーディングを行うことを
特徴とするプラスミド。
【請求項２】ｔｋ−遺伝子の配列に続いて、ポックス
ウイルス初期転写停止シグナルが配列されることを特徴
とする請求項１記載のプラスミド。
【請求項３】当該拡張遺伝子間領域が、以下の表１の配
列よりなることを特徴とする請求項１記載のプラスミ
ド：【表１】
【請求項４】部位−誘導突然変異形成により得ること
が可能な請求項１記載のプラスミド。
【請求項５】プライマー配列５′−ＴＴＡＣＡＣＴＡＡ
ＡＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＧＡＴＡＡＡＡＡＣ
ＣＴＴＡＡＴＴＡＣＴＡ−３′を有する野生型配列の部
位−誘導突然変異形成により得ることが可能な請求項３
記載のプラスミド。
【請求項６】図７のｐＴＫｍであるプラスミド。
【請求項７】インビボにおける相同的組換えによる
ＦＰＶへの外来ＤＮＡの挿入用プラスミドであって、当
該プラスミドが、請求項１〜６のいずれか一つの項に記
載のプラスミドから調製され、以下の構成要素：（ａ）発現すべき外来ＤＮＡ配列へリンクした天然又は
合成ポックスウイルスプロモーター、（ｂ）組換え体Ｆ
ＰＶの選択のためのマーカー又は指標をコードする遺伝
子へリンクした第二のポックスウイルスプロモーター、
及び（ｃ）構成要素（ａ）及び（ｂ）の構築物の５′及
び３′末端の両側面に位置するＦＰＶのＤＮＡ配列であ
って、当該側面ＤＮＡ配列が、拡張遺伝子間領域の上流
及び下流の配列と相同性を有する、よりなることを特徴
とするプラスミド。
【請求項８】更に、原核性宿主におけるプラスミド複
製のためのレプリコン及び形質転換された原核性宿主に
おけるプラスミド選択のための選択可能なマーカー又は
指標をコードする遺伝子よりなる請求項７記載のプラス
ミド。
【請求項９】プロモーターが、外来遺伝子のコーディ
ング配列の直ぐ近傍に位置することを特徴とする請求項
７または８記載のプラスミド。
【請求項１０】ポックスウイルスプロモーターが、以
下の表２に示す部分又は完全ＤＮＡ配列【表２】を有するＦＰＶＰ２プロモーター又はその機能的同等
物であることを特徴とする請求項７〜９のいずれか一つ
の項に記載のプラスミド。
【請求項１１】ポックスウイルスプロモーターが、図
２６に示すＤＮＡ配列を有するＦＰＶプロモーターＰ２
の突然変異体であることを特徴とする請求項７〜１０の
いずれか一つの項に記載のプラスミド。
【請求項１２】ｌａｃＺ遺伝子が発現すべきＤＮＡ配
列に置き換えられている、図７の挿入プラスミドｐＴＫ
ｍ−ｓＰ１１−ｇｐｔにより特徴付けられる請求項７記
載のプラスミド。
【請求項１３】請求項７〜１２のいずれか一つの項に
記載するプラスミドを有する野生型インビボ組換え
により得ることが可能な、外来蛋白質の発現用として
の、又はワクチンとしての組換えＦＰＶ。
【請求項１４】少なくとも、ＶＶｔｋ−遺伝子に加え
て無傷のＦＰＶｔｋ−遺伝子よりなり、それらのいずれ
か一つが、１又はそれ以上の外来ＤＮＡ配列の挿入のた
めの非必須部位（ＮＥＳ）として機能することを特徴と
する宿主ウイルスとしての組換えＦＰＶｆ−ＴＫ２ａ及
びｆ−ＴＫ２ｂ。
【請求項１５】更に、選択マーカー及び／又はレポー
ター遺伝子を含むことを特徴とする請求項１４記載の組
換えＦＰＶ。
【請求項１６】図１７のｐＴＺｇｐｔ−Ｐ２ａである
プラスミド。
【請求項１７】図１７のｐＴＺｇｐｔ−Ｐ２ｂである
プラスミド。
【請求項１８】図２４のｐＰ２ｍ０ｇｐｔ，ｐＰ２ｍ
１ｇｐｔ及びｐＰ２ｍ２ｇｐｔ（ｐＰ２ｍｘｇｐｔ）で
あるプラスミド。
【請求項１９】図２２ＡのｐＦＳ５０であるプラスミ
ド。
【請求項２０】図２２ＡのｐＦＳ５１であるプラスミ
ド。
【請求項２１】図２２ＡのｐＦＳｇｐｔであるプラス
ミド。
【請求項２２】図２８ＡのｐＴＺｇｐｔ−Ｆｌｓであ
るプラスミド。
【請求項２３】図２８ＡのｐＴＺｇｐｔ−Ｐ１１Ｍで
あるプラスミド。
【請求項２４】外来ＤＮＡの挿入及びそれに次ぐイン
ビボ組換えによる請求項１４記載の宿主株への組込み
のためのプラスミドであって、以下のプラスミド：ａ）図１のｐＦＰ−ＵＶ２，図７のｐＴＫｍ，図２２の
ｐＦＳ５０，ｐＦＳ５１及びｐＦＳｇｐｔ，図２４のｐ
Ｐ２ｍｘｇｐｔ，及び図２８のｐＴＺｇｐｔ−Ｆｌｓ及
びｐＴＺｇｐｔ−Ｐ１１Ｍ，及びｂ）図７のｐＴＫｍ−ｓＰ１１−ｇｐｔ，図１７のｐＴ
Ｚｇｐｔ−Ｐ２ａ及びｐＴＺｇｐｔ−Ｐ２ｂ，及び図２
９のｐＴＺｇｐｔ−ｓＰｘであって、これらのプラスミ
ドにおけるｌａｃＺ遺伝子挿入物が、発現するＤＮＡ配
列に置き換えられている、のうちの一つであることを特
徴とするプラスミド。
【請求項２５】ｐＴＺｇｐｔ−ｓＰｘの構築物におけ
るｓＰｘは、図３０に示すように、ｓＰ１１，ｓ４ｂ，
ｓａｒｔを意味する請求項２４記載のプラスミド。
【請求項２６】請求項１４記載の宿主株及び請求項２
４記載のいずれかのプラスミドのインビボ組換えより
得ることが可能な、外来蛋白質の発現用としての又はワ
クチンとしての組換えＦＰＶ。
【請求項２７】請求項１３又は２６記載の組換えＦＰ
Ｖで感染させた脊椎動物細胞のインビトロ培養株。
【請求項２８】培養株が、ニワトリ胎芽線維芽（ＣＥ
Ｆ）細胞又はニワトリ胎芽皮膚（ＣＥＤ）細胞よりなる
ことを特徴とする請求項２７記載のインビトロ培養
株。
【請求項２９】蛋白質の組換え体による製造方法であ
って、当該蛋白質をコードするＤＮＡよりなる請求項１
〜２８のいずれか一つの項に記載した組換えウイルスで
脊椎動物細胞又は細胞培養株を感染させ、当該蛋白質を
ハーベストすることよりなることを特徴とする蛋白質の
組換え体による製造方法。
【請求項３０】因子ＩＩ，Ｖ，ＶＩＩ，ＶＩＩＩ，Ｉ
Ｘ，Ｘ，ＸＩ，ＸＩＩ，ＸＩＩＩ，蛋白質Ｃ，蛋白質
Ｓ，フォンビルブラント因子，プラスミノーゲン及び１
又はそれ以上のアミノ酸が置換えられ、削除され又は挿
入されているそれらの誘導体，その部分配列及び活性
形，アポＡＩ及びアポＡＩＩのようなアポリポ蛋白質，
肝炎Ｂ−抗原のようなウイルス抗原，肝炎Ｃ−ウイルス
抗原，肝炎Ｅ−ウイルス抗原，ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）
ウイルス抗原，ＨＩＶ及びＨＳＶ抗原，及び、百日咳，
破傷風，マラリア，家禽病，マレック病，ＩＬＴ，感染
性気管支炎，コクシジュウム症及びニューカッスル病を
もたらす有機体のそれら抗原の全部又は部分配列が挙げ
られ、上記抗原は、ワクチンとして利用できる、以上の
蛋白質の内の一つが発現することを特徴とする請求項２
９記載の方法。
【請求項３１】請求項１３〜１５及び請求項２６のい
ずれか一つの項に記載の組換えＦＰＶよりなることを特
徴とする鳥類及び脊椎動物に感染する病原体の抗原に対
するワクチン。
【請求項３２】請求項１０記載のＦＰＶＰ２プロモ
ーターのＤＮＡ配列，その部分配列又は機能的同等物。
【請求項３３】以下の表３に示すＦＰＶＰ２プロモ
ーター、Ｐ２遺伝子及び３′配列：【表３】よりなるＤＮＡ配列又はその部分配列、又は機能的同等
物。
【請求項３４】ＦＰＶＰ２遺伝子の下流の３′−領
域が、外来ＤＮＡの挿入のための非必須部位として使用
されることを特徴とする組換えＦＰＶ。