JP2818836B2 - Ｃｈｏ細胞において増殖可能な組換えワクシニアウイルスを用いる方法 - Google Patents
Ｃｈｏ細胞において増殖可能な組換えワクシニアウイルスを用いる方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＣＨＯ細胞におい
て増殖可能な組換えワクシニアウイルスを用いた、産業
上有用な蛋白質の製造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】ワクシニアウイルスは、動物細胞におけ
る発現ベクターとして、この系に特異的な方法が開発さ
れて以来（パニカリ（Ｐanicali ）及びパオレッティ
（Ｐaoletti ）、１９８２；マケット（Ｍacket ）等、
１９８２；スミス（Ｓmith）等、１９８３；パニカリ
（Ｐanicali ）等；キーニー（Ｋieney ）等、１９８
４）、用いられている。ヒト又は動物用医薬品分野で重
要な蛋白質を、コードする遺伝子を有するワクシニアウ
イルスの組換えウイルスの構築が特に探求されている。
該構築が完成すると、その遺伝子がワクシニアウイルス
のゲノム中に組込まれる異種蛋白質（foreign protein
）の合成は、追及される目的に従って、イン・ビトロ
の細胞培養物中或いは生体組織への接種後に得ることが
できる。ベクターとしてのワクシニアウイルスの利点の
一つは、大多数の種々のタイプの細胞内での増殖能であ
る。 【０００３】しかし、これには、幾つかの例外がある。
特に、野生型ワクシニアウイルスは、チャイニーズハム
スターの卵巣（Ｃhinese hamster ovary）、ＣＨＯ、細
胞系列では増殖できない（ドリリアン（Ｄrillien ）、
スペーナー（Ｓpehner）及びカーン（Ｋirn ）、１９７
８）。従って、ＣＨＯ細胞は、哺乳類細胞における蛋白
質合成のための最も有望なシステムの１つである。実
際、ＣＨＯ細胞は容易に培養でき、短い世代時間を持
ち、その遺伝は全ての類似のシステム中で最も良く知ら
れている。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＣＨＯ細胞
における増殖能をワクシニアウイルスに与える外来遺伝
子を該ウイルスのゲノムに組み込むことにより該ウイル
スを変異させることに関する。 【０００５】 【課題を解決するための手段】この新しい宿主特異性を
与える遺伝子は、ＣＨＯ細胞中で増殖可能な牛痘ウイル
ス（cowpox virus ）（又はワクシニアウイルスに関連
した牛ウイルス、牛天然痘（bovine smallpox）ウイル
ス）に由来する。牛痘及びワクシニアウイルスのゲノム
は、ＤＮＡの中心部分の１０万塩基対が特に非常に類似
している（マケット（Ｍackett）及びアーカード（Ａrc
hard）、１９７９）。しかし、牛痘ウイルスのゲノム
（約２３万bp）はワクシニアウイルスのそれ（約１９万
bp）よりも大きく、牛痘ウイルスのゲノムの有する付加
的遺伝子情報は、本質的にその両末端に存すると思われ
る。ワクシニアウイルスのゲノムと牛痘ウイルスのゲノ
ム間の類似性により、ＣＨＯ細胞に自然に順応されるベ
クターとしての牛痘ウイルスの使用が期待できる。 【０００６】しかし、牛痘ウイルスは、ワクシニアウイ
ルスの１／１０の力価で増殖し、このことは、結果とし
て、ワクシニアウイルスの組換えに比較して牛痘ウイル
スの組換えにより生産された発現蛋白質の低収率をもた
らすようである。 【０００７】更に、種痘にウイルスの組換え体を用いる
点から、ワクシニアウイルスの使用は周知であり、天然
痘が完全に根絶されていることが強調されるべきであ
る。 【０００８】本発明は、ワクシニアウイルスの既知の長
所及びＣＨＯ細胞における牛痘ウイルスの増殖能を有す
るベクターの開発に関する。 【０００９】 【発明の実施の形態】第一に、本発明は、牛痘ウイルス
にＣＨＯ細胞における増殖能を与える遺伝情報の同定及
び位置確認(localization）に関する。 【００１０】事実、実施された試験により、ＣＨＯ細胞
における牛痘ウイルスの増殖に関与する配列の同定が可
能となった。これをワクシニアウイルスに移入すると、
ＣＨＯ細胞における該ウイルスの増殖が確実に生じる。 【００１１】従って、本発明は、特に牛痘ウイルスから
単離され、ＣＨＯ細胞での該ウイルスの増殖に関与し、
図６〜図９に示される配列の全部又は機能的部分或いは
機能的に均等な配列を有するＤＮＡ配列に関する。 【００１２】この遺伝子の一部（以下「機能的部分」と
いう）は、増殖をさせるのに充分なものである。又、突
然変異又はポイント変異（point variation）によって
も機能が変化しない可能性があり、この場合、“機能的
に均等な配列”という。 【００１３】本明細書において、「図６〜図９に示され
る配列において１又は複数の塩基が欠失、置換若しくは
付加されているが機能は保持されているＤＮＡ配列」と
は、この遺伝子のウイルス増殖に関与する機能は変化せ
ず、突然変異、ポイント変異（point variation）など
により修飾を受けた配列をいう。 【００１４】このＤＮＡ配列は、ＣＨＯ細胞で発現させ
るそれ自身のコントロールシグナル（control signal）
を有することが好ましく、これは不可欠ではないが、該
ＤＮＡ配列が、異なる起源を持つ要素の制御下にあるこ
とが考えられる。 【００１５】上記の様に、該ＤＮＡ配列は、ＣＨＯ細胞
におけるその増殖を確実にする為に、ワクシニアウイル
ス内への組込みを意図したものである。この組込みは、
相同性組換え（homologous recombination ）によりな
される。従って、該ＤＮＡ配列は、ウイルスの細胞内増
殖中のこの相同性組換え過程に関与し得るワクシニアウ
イルスの配列に相同性を有する領域を少くとも１つ有す
ることを確認することが有用である。 【００１６】事実、牛痘ウイルスにおいて、ＣＨＯ細胞
中での増殖を可能にする遺伝子は、ワクシニアゲノムの
配列に相同である配列により包囲されていると思われ、
このことはプラスミド組換えベクターの製造を簡単化し
得る。 【００１７】ワクシニアウイルスの場合既に知られてい
るように、本発明のＤＮＡ配列中に、宿主細胞において
その発現を与える調節要素に依存する産業上有用な蛋白
質をコードする遺伝子を挿入することが可能である。こ
の技術は、特にフランス国特許第８４／０６，４９９
号、第８４／０７，９５９号及び第８５／０９，２２５
号に既に記載され、幾つかの適応及び利点を伴い、用い
ることが可能である。特に、前述の構築において、組換
えウイルスの選択は、発現されるべき遺伝子をワクシニ
アウイルスのＴＫ遺伝子に挿入することにより行われ
た。これにより、ＴＫ-となった組換えウイルスが得ら
れ、選択を既知の方法により行うことができる。 【００１８】本発明の場合、ＴＫ遺伝子への挿入は不可
欠ではない。何故なら、産業上有用な蛋白質をコードす
る遺伝子を、ＣＨＯ細胞内での増殖を可能とする遺伝子
に連結させる限り、組換えウイルスのみがＣＨＯ細胞で
増殖し、これにより、組換えウイルスの“自然”選択が
可能となるからである。 【００１９】上記後者の場合、組換えられる遺伝子を有
するＤＮＡブロックの側方に、ワクシニアウイルスの配
列に相同性のある配列を配置して該遺伝子が組換え中も
連結状態に保たれるようにすることが望ましい。 【００２０】本発明は、上記のＤＮＡ配列及び特に、産
業上有用な蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えワク
シニアウイルスで感染されたＣＨＯ細胞及び対応するウ
イルスに関する。 【００２１】本発明は、上記ＤＮＡ配列を含むプラスミ
ドベクターであって、イン・ビボにおける組換えを行う
ために用いることができるプラスミドベクターにも関す
る。 【００２２】又、本発明は、本発明のＤＮＡ配列に組込
まれており、且つ該細胞におけるワクシニアウイルスの
増殖を確認することができる、ＣＨＯ細胞に関するもの
である。 【００２３】最後に、本発明は、本発明の組換えウイル
スにより感染されたＣＨＯ細胞を培養することにより産
業上有用な蛋白質の製造することに関するものである。 【００２４】 【実施例】下記に実施例を示し、本発明のその他の特徴
及び長所について説明する。 【００２５】実施例１ＣＨＯ細胞において増殖を可能とする牛痘ウイルスゲノ
ムの領域の同定 ワクシニアウイルスと牛痘ウイルスとの組換え体を、各
ウイルスで鶏胚細胞（chick embryo cells ）の混合感
染後に選択した。組換え体のＤＮＡの分析により、ＣＨ
Ｏ細胞における増殖能が、牛痘ウイルスゲノムの左側末
端での制限サイトの保持（retention）と関連すること
が示される。 【００２６】第１期（primary）鶏胚細胞を、１１〜１
２日の受精卵から作製し、ワクシニアウイルスの温度感
受性突然変異、ｔｓＮ７（ドリリアン（Ｄrillien ）
等、１９８２）及び牛痘ウイルス（ブライトン（Ｂrigh
ton ）株）により、細胞当たり２プラク形成単位（ｐｆ
ｕ) で、同時に感染する。同時に、他の細胞ローン（la
wn）はこれらウイルスの各々で感染される。１時間吸着
後、過剰の非吸着ウイルスを除去し、新たな培地を細胞
に加える。 【００２７】これらの細胞を全細胞層に壊死が出現する
まで、１〜２日間３３℃で培養する。次に、感染細胞を
凍結し、解凍する。感染されたウイルスを３９．５℃に
て１％精製寒天を含有する培地層下に鶏胚細胞上で滴定
する。３９．５℃で２日後、２種のウイルスの混合物で
感染された細胞ローン上で形成されたウイルスのプラク
数は、対照細胞のローン上で形成されたプラク数よりも
大きい（ワクシニアウイルスの温度感受性変異体も牛痘
ウイルスも有意な数のプラクを与えない。）。従って、
混合感染より出現するプラクは牛痘ウイルスとワクシニ
アウイルスとの組換え体に相当する。 【００２８】次に、可能な組換え体のプラクを別々に再
び取り、それらが有するウイルスを、鶏胚細胞上で増殖
することにより、増幅する。ウイルスのＤＮＡを精製
し、制限酵素で切断し、次にアガロースゲル上で分析す
る。 【００２９】制限プロフィールより、各プラクはワクシ
ニアウイルスＤＮＡ及び牛痘ウイルスＤＮＡ間の組換え
体に対応することが確認される。関連ウイルスの既知の
制限地図（マケット（Ｍackett）及びアーカード（Ａrc
hard）、１９７８、ドリリアン（Ｄrillien ）及びスペ
ーナー（Ｓpehner）、１９８３）を用いれば、組換え体
の大部分のフラグメントの起源を確立し、その制限地図
を描くことができる（図１）。 【００３０】ＣＨＯ細胞内で増殖可能な組換え体４、
６、１４、１５及び１９は、牛痘ウイルスゲノムの左側
末端の特性部位（Ｃharacteristic site）を保持してい
ることがわかる。ＣＨＯ細胞内で増殖不可能な他の組換
え体２、７、１１、１６及び１８は、牛痘ウイルスゲノ
ムの左側末端の特性部位を一部しか有しないか、または
全く有さない。 【００３１】これらの結果から、牛痘ウイルスゲノムの
左側末端の制限部位の保持は、ＣＨＯ細胞内での増殖の
表現型と関連があることがわかる。 【００３２】実施例２牛痘ＤＮＡフラグメントを組込んだワクシニアウイルス
組換え体ゲノムの単離及び分析 有用な遺伝情報の位置確認をより正確に行うために、Ｃ
ＨＯ細胞で増殖できる組換え体をワクシニアウイルスで
感染し、牛痘ＤＮＡフラグメントで形質移入した後選択
した。 【００３３】重要な部分の分析に有用な制限フラグメン
ト、即ち、２種のウイルスの左側末端を図２に示す。実
施例１に記載された組換えは、該ゲノムのこの部分で起
こるものと予測される。 【００３４】第１期鶏胚細胞は、ワクシニアウイルス変
異体ｔｓＮ（ドリリアン（Ｄrillien ）等、１９８２）
により、細胞当たり０．１ｐｆｕの割合で感染され、野
生株ワクシニアウイルス（コペンハーゲン（Ｃopenhage
n ）株）のインタクトなＤＮＡ及びあらかじめ酵素Ｈin
d IIIで消化された牛痘ＤＮＡ（ブライトン（Ｂrighton
）株）の混合物で形質移入される。ＤＮＡを用いない
かワクシニアウイルスのＤＮＡのみを用いて形質移入を
行なった対照が作成される。３９．５℃で４８時間培養
後、細胞を凍結させ、解凍させる。こうして遊離したウ
イルスを、ＣＨＯ細胞の単層上で滴定し、次に１％寒天
を含む培地でＣＨＯ細胞をおおう。 【００３５】牛痘ウイルスＤＮＡで形質移入された細胞
由来の試料は、ＣＨＯ細胞上に多くの溶解プラクを与え
るが、対照試料はそのようなプラクを与えない。 【００３６】ＣＨＯ細胞上の目視できるプラクを再び個
別に取り、プラクの含有するウイルスを、鶏胚細胞上で
増幅させる。次にそのＤＮＡを抽出し、ワクシニア及び
牛痘の２種の関連菌のＤＮＡと比較して分析する。酵素
ＥｃｏＲＩで消化後、ＤＮＡフラグメントをアガロース
ゲル上の電気泳動によって分離し、次にニトロセルロー
ス膜に移行させて、32ｐで標識させているワクシニアウ
イルスのＳａｌＩ−Ｋフラグメントとハイブリッド形成
させる。 【００３７】非特異的に結合した放射能を除去するため
に、ニトロセルロースを洗浄した後、オースラジオグラ
フを作る。オートラジオグラフ（図３）は、牛痘ウイル
スを組込んだワクシニアウイルス組換え体が、ワクシニ
アウイルスに特有のＥｃｏＲＩ−Ｃフラグメントを失っ
ており、放射性ＳａｌＩ−Ｋワクシニアウイルスフラグ
メントを有する。このフラグメントの大きさは、牛痘ウ
イルスのＥｃｏＲＩ−Ａフラグメントとワクシニアウイ
ルスのＥｃｏＲＩ−Ｃフラグメントの中間である。 【００３８】この新しい牛痘−ワクシニアハイブリッド
ＥｃｏＲＩフラグメントは全ての組換え体に存在し、牛
痘ウイルスのＥｃｏＲＩ−Ａフラグメントとワクシニア
ウイルスのＥｃｏＲＩ−Ｃフラグメント間の二重組換え
（double recombination）に由来し、ＣＨＯ細胞内増殖
に要求される情報を有してなければならない。この組換
えを行うためには、ＣＨＯ細胞での増殖を可能とする遺
伝情報が、ワクシニアウイルスのゲノムの配列に相同で
ある牛痘ゲノムの配列によりいずれか一方の側において
取り囲まれていることが不可欠であった。 【００３９】実施例３ＣＨＯ細胞内での増殖を可能とする牛痘ウイルスゲノム
の領域を有する組換えプラスミドの構築 ＣＨＯ細胞内での増殖を可能とする遺伝情報を単離する
ため、実施例２に記載の組換え体の内の１つのＥｃｏＲ
Ｉ−ＡフラグメントをバクテリアのプラスミドｐＡＴ１
５３（トゥイック（twigg ）及びシェラット（Ｓherra
t）、１９８０）中でクローン化した。 【００４０】実施例２に記載の組換え体の内の１つのＤ
ＮＡを精製し、酵素ＥｃｏＲＩで切断する。ＥｃｏＲＩ
−Ａフラグメントをアガロースゲルから溶離し、次に、
あらかじめＥｃｏＲＩを作用させたプラスミドｐＡＴ１
５３に挿入する。ＨＢ１０１バクテリアをリゲーション
混合物で形質転換し、次に、得られたコロニーのＤＮＡ
をニトロセルロース膜上に移し、ワクシニアウイルスの
ＳａｌＩ−Ｋフラグメントとハイブリット形成させる。
ハイブリダイゼーション−ポジティブ（hybridization-
positive）であるコロニーを増幅し、それらが有するプ
ラスミドＤＮＡを精製する。２種のプラスミドを得た。
即ち、ｐＥＡ１及びｐＥＡ２であり、ベクターｐＡＴ１
５３内の２つの反対方向へのＥｃｏＲＩ−Ａフラグメン
トの挿入に対応する。 【００４１】これらプラスミドが、ＣＨＯ細胞上でのウ
イルスの増殖を可能にする遺伝情報を有することを確認
するために、プラスミドＤＮＡの挿入物とワクシニアウ
イルスとの間で組換えを誘発する。即ち、鶏胚細胞は、
ワクシニアウイルスの温度感受性変異体ｔｓＮ７を用
い、細胞あたり０．１ｐｆｕの割合で感染され、次に野
生型ワクシニアウイルスのＤＮＡ及びプラスミドｐＥＡ
１又はｐＥＡ２のＤＮＡで形質移入する。ワクシニアウ
イルスのＤＮＡを有さない、或いは、プラスミドを有さ
ない対照も又作成される。３９．５℃で４８時間培養
後、細胞を凍結させ、解凍する。感染の結果得られたウ
イルスをＣＨＯ細胞上で滴定する。ワクシニアウイルス
ＤＮＡ及びプラスミドｐＥＡ１又はｐＥＡ２で形質移入
された細胞由来の試料のもがＣＨＯ細胞上にプラクを形
成する。 【００４２】実施例４ワクシニアウイルスと組換えられるベクタープラスミド
におけるより小さいサイズのｐＥＡ１フラグメントのサ
ブクローニング ＣＨＯ細胞内での増殖を可能にする遺伝情報の位置確認
をするため、プラスミドｐＥＡ１のより小さい部分をカ
バーする制限フラグメントを、ワクシニアウイルスのチ
ミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を有するプラスミドｐＴ
Ｇ１８６ｐｏｌｙ内でクローン化した。 【００４３】ｐＴＧ１８６ｐｏｌｙの構築 ワクシニアウイルス（ＶＶ）のゲノムのＨind IIIフラ
グメント（Ｈｉｎ−Ｊ）は、ＶＶゲノム内での外来ＤＮ
Ａフラグメントの交換及び組換えを可能にするために以
前に用いられた完全なチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子
を有する（マケット（Ｍackett）等、１９８２）。 【００４４】挿入物をＶＶゲノムのＴＫ遺伝子に移入す
ることによりＴＫ−欠失ウイルスを生成し、そのことが
その選択を容易にすることに注目することは重要であ
る。 【００４５】ＶＶのＨin−Ｊフラグメントを組み込むの
に用いることができる唯一のＨindIII部位を担う小さい
サイズのプラスミドを作ることがなによりもまず必要で
あった。更に、プラスミドの不要な制限部位を、次の操
作が実施できるように、除去する必要があった。 【００４６】構築はプラスミドｐＭＬ２（ラスキー（Ｌ
usky）及びボッチャン（Ｂotchan）、１９８１）を出発
物質とした。該プラスミドはヌクレオチドの１０８９か
ら２４９１間のセグメントが自然発生的欠失（spontane
ous deletion）により失われたプラスミドｐＢＲ３２２
に由来するベクターである。最初に、ＰstＩ配列を、ｐ
ＵＣ８（ビオイラ（Ｖioira ）及びメシング（Ｍessin
g）、１９８２）のＡｈａIII−ＡｈａIIIフラグメント
をｐＭＬ３の２つのＡｈａIIIサイト間に挿入すること
により、除去し、１９塩基対を除いた。 【００４７】“リンカーテイリング（linker-tailin
g）”法（ラセ（Ｌathe) 等、１９８４）を用い、本プ
ラスミドのＳ１で処理されたＮｒｕＩ及びＥｃｏＲＩサ
イト間にＨind IIIアダプターを挿入し、ＢamＨＩサイ
トを除いた。これにより、２０４９塩基対を有し、機能
的β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性を与え
る）並びに更にイー・コリ（Ｅ．coli）中で活性である
複製起点及び唯一のＨind III制限サイトを有するプラ
スミドが得られる。この構築物をｐＴＧ１Ｈと称した。 【００４８】ＴＫ遺伝子を有するＶＶのＤＮＡのＨｉｎ
−ＪフラグメントはｐＡＴ１５３ベクター内でクローン
化された（ドリリアン（Ｄrillien ）及びスペーナー
（Ｓpehner）、１９８３）。この４．６−ｋｂフラグメ
ントをｐＴＧ１ＨのＨind IIIサイト中に再クローン化
した。ＴＫ遺伝子がアンピシリン耐性をコードする遺伝
子に比較して末端にあるクローンを選択した。この構築
物をｐＴＧ１Ｈ−ＴＫと称した。 【００４９】ｐＴＧ１Ｈ−ＴＫ構築物を、下記の構築の
ベクターとして用いた。 【００５０】次の操作は、ＶＶのプロモーターを単離す
ることであった。該プロモーターは、ＶＶ内に組み込ま
れるべき外来遺伝子の発現を制御するために用いること
ができるものである。７５００ダルトン（７．５Ｋ）蛋
白質をコードする初期遺伝子のためのプロモーターは、
同様の目的ですでに用いられ、好結果を得ている（スミ
ス（Ｓmith) 等、１９８３）。これにより、該プロモー
ターの単離が行われた。 【００５１】７．５Ｋ遺伝子は、ＷＲ型ＶＶのゲノムの
最小ＳａｌＩフラグメント（Ｓａｌ−Ｓフラグメント）
の１つに位置する（ベンカタサン（Ｖenkatasan ）等、
１９８１）。小フラグメントが優先的にクローン化され
たため、ＳａｌＩで切断したＷＲ型ＶＶのＤＮＡをｐＢ
Ｒ２２２プラスミド中に直接クローン化することにより
得られたクローンの殆んどがＳａｌ−Ｓフラグメントを
有する。このフラグメントをベクターバクテリオファー
ジＭ１３ｍｐ７０１（キーニー（Ｋieny）等、１９８
３）上に、ＳａｌＩ消化及びリゲーションにより移し、
ファージＭ１３．ＴＧ．Ｓａｌ−Ｓを得る。 【００５２】このクローンにおいて、ＳｃａＩサイト
が、７．５Ｋ遺伝子の開始ＡＴＧに極めて近接して存在
している。７．５Ｋ遺伝子の下流に、該ベクター由来の
２つの単一なＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩサイトがある。
該ＢａｍＨＩ及びＳｃａＩサイトを、イー．コリ ポリ
メラーゼのクレノーフラグメントでＢａｍＨＩ消化によ
り作られた末端中にフィリング（filling ）した後に、
ＢｇｌIIアダプター：５′−ＣＡＧＡＴＣＴＧ−３′を
用いて融合する。この方法でＳｃａＩサイトは除去され
るが、ＢａｍＨＩサイトを再構築し単一な、ＥｃｏＲＩ
サイトを下流に移動させる。同時に、下流のＳａｌＩ
（ＡｃｃＩ）サイトを除去し、従って、上流のＳａｌＩ
サイトが単一となる。この構築物をＭ１３．ＴＧ．７．
５Ｋと称する。 【００５３】ＶＶのＤＮＡのＨｉｎ−Ｊフラグメント
は、約３０塩基対により分離されるＣｌａＩ及びＥｃｏ
ＲＩサイトを有する（ウイア（Ｗeir ）及びモス（Ｍos
s ）、１９８３）。Ｍ１３．ＴＧ．７．５Ｋ中に存在す
る７．５ＫプロモーターフラグメントをＡｃｃＩ及びＥ
ｃｏＲＩで切除し、ｐＴＧ１Ｈ−ＴＫ−Ｐ７．５Ｋを作
るためにｐＴＧ１Ｈ−ＴＫのＣｌａＩサイトとＥｃｏＲ
Ｉサイトとの間にクローン化する。 【００５４】この構築において、Ｍ１３ベクターの単一
なＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩサイトが、７．５Ｋプロモ
ーター配列のすぐ下流に配置される。これらユニークな
ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩサイトを下記の構築に用い
る。 【００５５】バクテリオファージＭ１３ＴＧ１３１（キ
ーニー（Ｋieny）等、１９８３）のポリリンカーセグメ
ントをＥｃｏＲＩ及びＢｇｌIIで切除し、プラスミドｐ
ＴＧ１Ｈ−ＴＫ−Ｐ ７．５ＫのＥｃｏＲＩ及びＢａｍ
ＨＩサイト間に挿入し、ｐＴＧ１８６ｐｏｌｙを作る。
この構築物においては、５つの単一な制限サイト（Ｐｓ
ｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｓｔＩ、ＳｍａＩ及びＥｃｏＲ
Ｉ）をｐ７．５Ｋプロモーターのコントロール下での外
来遺伝子のクローニングに用いることができる。 【００５６】ｐＥＡ１フラグメントのｐＴＧ１８６ｐｏ
ｌｙへの挿入 プラスミドｐＥＡ１のＥｃｏＲＩＡフラグメントを種々
の酵素で消化し、種々の大きさのフラグメントをｐＴＧ
１８６ｐｏｌｙに挿入した。 【００５７】ｐＴＧ１８６ｐｏｌｙ由来で、組換えプラ
スミドｐＥＡ１のＥｃｏＲＩ−Ａフラグメントの部分を
有する組換えプラスミドを図４に示す。 【００５８】プラスミドｐＥＡ１を酵素ＢｇｌIIで切断
し、数個のフラグメントを得る。ＢｇｌIIフラグメント
の内の最大のものをｐＴＧ１８６ｐｏｌｙベクターのＢ
ａｍＨＩサイトに挿入し、挿入方向の異なるプラスミド
ｐＥＡ５ａ及びｐＥＡ５ｂを得る。 【００５９】プラスミドｐＥＡ６は、酵素ＰｓｔＩでｐ
ＥＡ５ａを切断し、次に最大フラグメントを再環化（re
circularization ）して得られ、これによりｐＥＡ５ａ
からＢｇｌII−ＰｓｔＩフラグメントが失われる。 【００６０】プラスミドｐＥＡ７は、プラスミドｐＥＡ
６を酵素ＣｌａＩで切断し、次に得られた大フラグメン
トを再環化（recircularization ）して得られ、この結
果、小フラグメントＣｌａＩが欠失する。 【００６１】プラスミドｐＥＡ８は、ｐＥＡ６をＳｐｈ
Ｉで切断し、大フラグメントを再環化して得られ、その
結果右側のＳｐｈＩ−ＢｇｌIIフラグメントの欠失が起
こる。 【００６２】プラスミドｐＥＡ９は、ｐＥＡ５ｂをＳｐ
ｈＩで切断し、再リゲーションすることにより得られ、
その結果左側のＳｐｈＩ−ＢｇｌIIフラグメントの欠失
が起こる。 【００６３】プラスミドｐＥＡ３６は、２段階で構築さ
れた。まず小フラグメントＨｐａＩがプラスミドｐＥＡ
９から単離され、これがＭ１３−１３０ベクターのＳｍ
ａＩサイトに挿入された。次に、ＨｐａＩフラグメント
を、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩサイトを用いて、Ｍ１３−
１３０ベクターから単離し、ベクターｐＴＧ１８６ｐｏ
ｌｙのＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩサイトに組み込んだ。 【００６４】これらプラスミドのそれぞれを、該プラス
ミドにより保有されるＴＫ遺伝子内に存在する挿入片を
ワクシニアウイルスゲノムに移入するために、実施例３
の方法に従って、形質移入試験で用いた。 【００６５】ワクシニアウイルスに対しＣＨＯ細胞内で
の増殖能を与えるプラスミドは、ｐＥＡ１、２、５ａ、
５ｂ、６、９及び３６である。 【００６６】上記性質を有する最小フラグメントはプラ
スミドｐＥＡ３６により保有される。それは２００４塩
基対を有する。 【００６７】実施例５ＣＨＯ細胞内でのワクシニアウイルスの増殖を可能にす
る遺伝子の配列決定 プラスミドｐＥＡ３６により保有され、２つのＨｐａ１
サイト間に位置する牛痘ウイルスＤＮＡは、図５に示さ
れる手法に従い、ファージＭ１３−１３０及びＭ１３−
１３１（キーニー（Ｋieney ）等、１９８３）に最小フ
ラグメントを挿入した後、ジデオキシヌクレオチド法
（サンガー（Ｓanger ）等、１９８０）を用いて完全に
配列決定した。 【００６８】７７０００ダルトンの蛋白質をコードする
ことのできるリーディングフレーム（reading frame）
は、図５の地図に示されるようにヌクレオチドＡＴＧで
始まり、ヌクレオチドＴＡＡで終わる。地図の下にある
矢印は、各クローンの読み取り（reading ）開始点、読
み取りの長さ及びその方向を示す。読み取り開始が制限
サイトで開始しない場合、配列の一部より推察される合
成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いた。 【００６９】本発明の遺伝子の完全な配列及び、該遺伝
子がコードし得る７７０００ダルトンの蛋白質の配列を
図６〜図９に示す。 【００７０】実施例６ＴＫ遺伝子外でのワクシニアＤＮＡへの牛痘ウイルス遺
伝子の組込み及び相同組換え 実施例４に記載され、ＣＨＯ細胞内で増殖し得る組換え
ウイルスの内、いくつかはＴＫ+で他はＴＨ-であること
が観察される。 【００７１】例えば、プラスミドｐＥＡ９を用いた細胞
の形質移入において、ＣＨＯ細胞での増殖により選択さ
れた組換えウイルスの２７のプラクの内、１６はＴＫ-
で、１１はＴＫ+であった。 【００７２】従って、ＣＨＯ細胞内増殖を可能にする情
報を導入する組換えは、チミジンキナーゼをコードする
遺伝子と異なる領域で起こったのである。 【００７３】この結果は、ＴＫ遺伝子以外のゲノムの領
域への外来遺伝子の挿入及び選択の可能性を意味し、同
時に、ＣＨＯ細胞上での増殖による選択を意味する。こ
の目的には、選ばれた遺伝子とＣＨＯ細胞上での成長を
可能にする遺伝子とを並列に並べれば充分である。 【００７４】ワクシニアウイルスゲノムを用いた相同性
組換え（homologous recombination）による、ＣＨＯ細
胞での増殖を可能にする遺伝子の挿入は、外来遺伝子の
共組込みを（co-integration）惹き起こす。 【００７５】本発明の代表的菌株の寄託 プラスミドｐＥＡ３６を有するイー．コリ（Ｅ．Ｃoli
）１１０６株を寄託No.Ｉ５９４で１９８６年９月２日
にコレクシオン ナシオナル ド クルチュール デ
ミクロオルガニスム（＝Ｃllection Ｎationale de Ｃ
ultures des Ｍicroorganismes、Ｎational Ｃollectio
n of Ｃultures of Ｍicroorganisms）に寄託した。 【００７６】プラスミドｐＥＡ３６は、ＣＨＯ細胞内で
ウイルスの増殖を可能にする２００４ｂｐ牛痘ウイルス
ＤＮＡフラグメントを有する。このＤＮＡフラグメント
は、ＣＨＯ細胞内で増殖しないワクシニアウイルスによ
る生体内組換えに用いられる。ＤＮＡプラスミドによる
細胞の形質移入及びワクシニアウイルスによる混合感染
（co-infection）により、ＣＨＯ細胞内増殖能を有する
ワクシニアウイルスの組換え体を選択することが可能で
ある。 【００７７】参考文献 ・ドリリアン，アール（Ｄrillien ，Ｒ．）、スペーナ
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tt，Ｄ．）、カーチス，ピー．（Ｃurtis ，Ｐ．）及び
ルコック，ジェイ−ピー．（Ｌecocq ，Ｊ−Ｐ．）、ジ
ャーナル オブモレキュラー アプライド ジェネティ
クス（Ｊ．Ｍolec．Ａppl ．Ｇenet．）２、３３１−３
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ティ，イー．（Ｐaoletti ，Ｅ．）、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．
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ックレン，エス．（Ｎicklen，Ｓ．）及びコンルソン，
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ト，エム．（Ｍackett，Ｍ．）及びモス，ビー（Ｍoss
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シェラット，ディ（Ｓherratt ，Ｄ．）、ネイチャー
（Ｎature ）、２８３、２１６−２１８、１９８０・ヴ
ェンカタサン，エス．（Ｖenkatasan ，Ｓ．）、バラウ
ディ，ビー．エム．（Ｂaroudy，Ｂ．Ｍ．）及びモス，
ビー（Ｍoss ，Ｂ．）、セル（Ｃell ）、２５、８０５
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アロロジー（Ｊ．Ｖirol．）、 ４６、５３０−５３
４、１９８３
て増殖可能な組換えワクシニアウイルスを用いた、産業
上有用な蛋白質の製造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】ワクシニアウイルスは、動物細胞におけ
る発現ベクターとして、この系に特異的な方法が開発さ
れて以来（パニカリ（Ｐanicali ）及びパオレッティ
（Ｐaoletti ）、１９８２；マケット（Ｍacket ）等、
１９８２；スミス（Ｓmith）等、１９８３；パニカリ
（Ｐanicali ）等；キーニー（Ｋieney ）等、１９８
４）、用いられている。ヒト又は動物用医薬品分野で重
要な蛋白質を、コードする遺伝子を有するワクシニアウ
イルスの組換えウイルスの構築が特に探求されている。
該構築が完成すると、その遺伝子がワクシニアウイルス
のゲノム中に組込まれる異種蛋白質（foreign protein
）の合成は、追及される目的に従って、イン・ビトロ
の細胞培養物中或いは生体組織への接種後に得ることが
できる。ベクターとしてのワクシニアウイルスの利点の
一つは、大多数の種々のタイプの細胞内での増殖能であ
る。 【０００３】しかし、これには、幾つかの例外がある。
特に、野生型ワクシニアウイルスは、チャイニーズハム
スターの卵巣（Ｃhinese hamster ovary）、ＣＨＯ、細
胞系列では増殖できない（ドリリアン（Ｄrillien ）、
スペーナー（Ｓpehner）及びカーン（Ｋirn ）、１９７
８）。従って、ＣＨＯ細胞は、哺乳類細胞における蛋白
質合成のための最も有望なシステムの１つである。実
際、ＣＨＯ細胞は容易に培養でき、短い世代時間を持
ち、その遺伝は全ての類似のシステム中で最も良く知ら
れている。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＣＨＯ細胞
における増殖能をワクシニアウイルスに与える外来遺伝
子を該ウイルスのゲノムに組み込むことにより該ウイル
スを変異させることに関する。 【０００５】 【課題を解決するための手段】この新しい宿主特異性を
与える遺伝子は、ＣＨＯ細胞中で増殖可能な牛痘ウイル
ス（cowpox virus ）（又はワクシニアウイルスに関連
した牛ウイルス、牛天然痘（bovine smallpox）ウイル
ス）に由来する。牛痘及びワクシニアウイルスのゲノム
は、ＤＮＡの中心部分の１０万塩基対が特に非常に類似
している（マケット（Ｍackett）及びアーカード（Ａrc
hard）、１９７９）。しかし、牛痘ウイルスのゲノム
（約２３万bp）はワクシニアウイルスのそれ（約１９万
bp）よりも大きく、牛痘ウイルスのゲノムの有する付加
的遺伝子情報は、本質的にその両末端に存すると思われ
る。ワクシニアウイルスのゲノムと牛痘ウイルスのゲノ
ム間の類似性により、ＣＨＯ細胞に自然に順応されるベ
クターとしての牛痘ウイルスの使用が期待できる。 【０００６】しかし、牛痘ウイルスは、ワクシニアウイ
ルスの１／１０の力価で増殖し、このことは、結果とし
て、ワクシニアウイルスの組換えに比較して牛痘ウイル
スの組換えにより生産された発現蛋白質の低収率をもた
らすようである。 【０００７】更に、種痘にウイルスの組換え体を用いる
点から、ワクシニアウイルスの使用は周知であり、天然
痘が完全に根絶されていることが強調されるべきであ
る。 【０００８】本発明は、ワクシニアウイルスの既知の長
所及びＣＨＯ細胞における牛痘ウイルスの増殖能を有す
るベクターの開発に関する。 【０００９】 【発明の実施の形態】第一に、本発明は、牛痘ウイルス
にＣＨＯ細胞における増殖能を与える遺伝情報の同定及
び位置確認(localization）に関する。 【００１０】事実、実施された試験により、ＣＨＯ細胞
における牛痘ウイルスの増殖に関与する配列の同定が可
能となった。これをワクシニアウイルスに移入すると、
ＣＨＯ細胞における該ウイルスの増殖が確実に生じる。 【００１１】従って、本発明は、特に牛痘ウイルスから
単離され、ＣＨＯ細胞での該ウイルスの増殖に関与し、
図６〜図９に示される配列の全部又は機能的部分或いは
機能的に均等な配列を有するＤＮＡ配列に関する。 【００１２】この遺伝子の一部（以下「機能的部分」と
いう）は、増殖をさせるのに充分なものである。又、突
然変異又はポイント変異（point variation）によって
も機能が変化しない可能性があり、この場合、“機能的
に均等な配列”という。 【００１３】本明細書において、「図６〜図９に示され
る配列において１又は複数の塩基が欠失、置換若しくは
付加されているが機能は保持されているＤＮＡ配列」と
は、この遺伝子のウイルス増殖に関与する機能は変化せ
ず、突然変異、ポイント変異（point variation）など
により修飾を受けた配列をいう。 【００１４】このＤＮＡ配列は、ＣＨＯ細胞で発現させ
るそれ自身のコントロールシグナル（control signal）
を有することが好ましく、これは不可欠ではないが、該
ＤＮＡ配列が、異なる起源を持つ要素の制御下にあるこ
とが考えられる。 【００１５】上記の様に、該ＤＮＡ配列は、ＣＨＯ細胞
におけるその増殖を確実にする為に、ワクシニアウイル
ス内への組込みを意図したものである。この組込みは、
相同性組換え（homologous recombination ）によりな
される。従って、該ＤＮＡ配列は、ウイルスの細胞内増
殖中のこの相同性組換え過程に関与し得るワクシニアウ
イルスの配列に相同性を有する領域を少くとも１つ有す
ることを確認することが有用である。 【００１６】事実、牛痘ウイルスにおいて、ＣＨＯ細胞
中での増殖を可能にする遺伝子は、ワクシニアゲノムの
配列に相同である配列により包囲されていると思われ、
このことはプラスミド組換えベクターの製造を簡単化し
得る。 【００１７】ワクシニアウイルスの場合既に知られてい
るように、本発明のＤＮＡ配列中に、宿主細胞において
その発現を与える調節要素に依存する産業上有用な蛋白
質をコードする遺伝子を挿入することが可能である。こ
の技術は、特にフランス国特許第８４／０６，４９９
号、第８４／０７，９５９号及び第８５／０９，２２５
号に既に記載され、幾つかの適応及び利点を伴い、用い
ることが可能である。特に、前述の構築において、組換
えウイルスの選択は、発現されるべき遺伝子をワクシニ
アウイルスのＴＫ遺伝子に挿入することにより行われ
た。これにより、ＴＫ-となった組換えウイルスが得ら
れ、選択を既知の方法により行うことができる。 【００１８】本発明の場合、ＴＫ遺伝子への挿入は不可
欠ではない。何故なら、産業上有用な蛋白質をコードす
る遺伝子を、ＣＨＯ細胞内での増殖を可能とする遺伝子
に連結させる限り、組換えウイルスのみがＣＨＯ細胞で
増殖し、これにより、組換えウイルスの“自然”選択が
可能となるからである。 【００１９】上記後者の場合、組換えられる遺伝子を有
するＤＮＡブロックの側方に、ワクシニアウイルスの配
列に相同性のある配列を配置して該遺伝子が組換え中も
連結状態に保たれるようにすることが望ましい。 【００２０】本発明は、上記のＤＮＡ配列及び特に、産
業上有用な蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えワク
シニアウイルスで感染されたＣＨＯ細胞及び対応するウ
イルスに関する。 【００２１】本発明は、上記ＤＮＡ配列を含むプラスミ
ドベクターであって、イン・ビボにおける組換えを行う
ために用いることができるプラスミドベクターにも関す
る。 【００２２】又、本発明は、本発明のＤＮＡ配列に組込
まれており、且つ該細胞におけるワクシニアウイルスの
増殖を確認することができる、ＣＨＯ細胞に関するもの
である。 【００２３】最後に、本発明は、本発明の組換えウイル
スにより感染されたＣＨＯ細胞を培養することにより産
業上有用な蛋白質の製造することに関するものである。 【００２４】 【実施例】下記に実施例を示し、本発明のその他の特徴
及び長所について説明する。 【００２５】実施例１ＣＨＯ細胞において増殖を可能とする牛痘ウイルスゲノ
ムの領域の同定 ワクシニアウイルスと牛痘ウイルスとの組換え体を、各
ウイルスで鶏胚細胞（chick embryo cells ）の混合感
染後に選択した。組換え体のＤＮＡの分析により、ＣＨ
Ｏ細胞における増殖能が、牛痘ウイルスゲノムの左側末
端での制限サイトの保持（retention）と関連すること
が示される。 【００２６】第１期（primary）鶏胚細胞を、１１〜１
２日の受精卵から作製し、ワクシニアウイルスの温度感
受性突然変異、ｔｓＮ７（ドリリアン（Ｄrillien ）
等、１９８２）及び牛痘ウイルス（ブライトン（Ｂrigh
ton ）株）により、細胞当たり２プラク形成単位（ｐｆ
ｕ) で、同時に感染する。同時に、他の細胞ローン（la
wn）はこれらウイルスの各々で感染される。１時間吸着
後、過剰の非吸着ウイルスを除去し、新たな培地を細胞
に加える。 【００２７】これらの細胞を全細胞層に壊死が出現する
まで、１〜２日間３３℃で培養する。次に、感染細胞を
凍結し、解凍する。感染されたウイルスを３９．５℃に
て１％精製寒天を含有する培地層下に鶏胚細胞上で滴定
する。３９．５℃で２日後、２種のウイルスの混合物で
感染された細胞ローン上で形成されたウイルスのプラク
数は、対照細胞のローン上で形成されたプラク数よりも
大きい（ワクシニアウイルスの温度感受性変異体も牛痘
ウイルスも有意な数のプラクを与えない。）。従って、
混合感染より出現するプラクは牛痘ウイルスとワクシニ
アウイルスとの組換え体に相当する。 【００２８】次に、可能な組換え体のプラクを別々に再
び取り、それらが有するウイルスを、鶏胚細胞上で増殖
することにより、増幅する。ウイルスのＤＮＡを精製
し、制限酵素で切断し、次にアガロースゲル上で分析す
る。 【００２９】制限プロフィールより、各プラクはワクシ
ニアウイルスＤＮＡ及び牛痘ウイルスＤＮＡ間の組換え
体に対応することが確認される。関連ウイルスの既知の
制限地図（マケット（Ｍackett）及びアーカード（Ａrc
hard）、１９７８、ドリリアン（Ｄrillien ）及びスペ
ーナー（Ｓpehner）、１９８３）を用いれば、組換え体
の大部分のフラグメントの起源を確立し、その制限地図
を描くことができる（図１）。 【００３０】ＣＨＯ細胞内で増殖可能な組換え体４、
６、１４、１５及び１９は、牛痘ウイルスゲノムの左側
末端の特性部位（Ｃharacteristic site）を保持してい
ることがわかる。ＣＨＯ細胞内で増殖不可能な他の組換
え体２、７、１１、１６及び１８は、牛痘ウイルスゲノ
ムの左側末端の特性部位を一部しか有しないか、または
全く有さない。 【００３１】これらの結果から、牛痘ウイルスゲノムの
左側末端の制限部位の保持は、ＣＨＯ細胞内での増殖の
表現型と関連があることがわかる。 【００３２】実施例２牛痘ＤＮＡフラグメントを組込んだワクシニアウイルス
組換え体ゲノムの単離及び分析 有用な遺伝情報の位置確認をより正確に行うために、Ｃ
ＨＯ細胞で増殖できる組換え体をワクシニアウイルスで
感染し、牛痘ＤＮＡフラグメントで形質移入した後選択
した。 【００３３】重要な部分の分析に有用な制限フラグメン
ト、即ち、２種のウイルスの左側末端を図２に示す。実
施例１に記載された組換えは、該ゲノムのこの部分で起
こるものと予測される。 【００３４】第１期鶏胚細胞は、ワクシニアウイルス変
異体ｔｓＮ（ドリリアン（Ｄrillien ）等、１９８２）
により、細胞当たり０．１ｐｆｕの割合で感染され、野
生株ワクシニアウイルス（コペンハーゲン（Ｃopenhage
n ）株）のインタクトなＤＮＡ及びあらかじめ酵素Ｈin
d IIIで消化された牛痘ＤＮＡ（ブライトン（Ｂrighton
）株）の混合物で形質移入される。ＤＮＡを用いない
かワクシニアウイルスのＤＮＡのみを用いて形質移入を
行なった対照が作成される。３９．５℃で４８時間培養
後、細胞を凍結させ、解凍させる。こうして遊離したウ
イルスを、ＣＨＯ細胞の単層上で滴定し、次に１％寒天
を含む培地でＣＨＯ細胞をおおう。 【００３５】牛痘ウイルスＤＮＡで形質移入された細胞
由来の試料は、ＣＨＯ細胞上に多くの溶解プラクを与え
るが、対照試料はそのようなプラクを与えない。 【００３６】ＣＨＯ細胞上の目視できるプラクを再び個
別に取り、プラクの含有するウイルスを、鶏胚細胞上で
増幅させる。次にそのＤＮＡを抽出し、ワクシニア及び
牛痘の２種の関連菌のＤＮＡと比較して分析する。酵素
ＥｃｏＲＩで消化後、ＤＮＡフラグメントをアガロース
ゲル上の電気泳動によって分離し、次にニトロセルロー
ス膜に移行させて、32ｐで標識させているワクシニアウ
イルスのＳａｌＩ−Ｋフラグメントとハイブリッド形成
させる。 【００３７】非特異的に結合した放射能を除去するため
に、ニトロセルロースを洗浄した後、オースラジオグラ
フを作る。オートラジオグラフ（図３）は、牛痘ウイル
スを組込んだワクシニアウイルス組換え体が、ワクシニ
アウイルスに特有のＥｃｏＲＩ−Ｃフラグメントを失っ
ており、放射性ＳａｌＩ−Ｋワクシニアウイルスフラグ
メントを有する。このフラグメントの大きさは、牛痘ウ
イルスのＥｃｏＲＩ−Ａフラグメントとワクシニアウイ
ルスのＥｃｏＲＩ−Ｃフラグメントの中間である。 【００３８】この新しい牛痘−ワクシニアハイブリッド
ＥｃｏＲＩフラグメントは全ての組換え体に存在し、牛
痘ウイルスのＥｃｏＲＩ−Ａフラグメントとワクシニア
ウイルスのＥｃｏＲＩ−Ｃフラグメント間の二重組換え
（double recombination）に由来し、ＣＨＯ細胞内増殖
に要求される情報を有してなければならない。この組換
えを行うためには、ＣＨＯ細胞での増殖を可能とする遺
伝情報が、ワクシニアウイルスのゲノムの配列に相同で
ある牛痘ゲノムの配列によりいずれか一方の側において
取り囲まれていることが不可欠であった。 【００３９】実施例３ＣＨＯ細胞内での増殖を可能とする牛痘ウイルスゲノム
の領域を有する組換えプラスミドの構築 ＣＨＯ細胞内での増殖を可能とする遺伝情報を単離する
ため、実施例２に記載の組換え体の内の１つのＥｃｏＲ
Ｉ−ＡフラグメントをバクテリアのプラスミドｐＡＴ１
５３（トゥイック（twigg ）及びシェラット（Ｓherra
t）、１９８０）中でクローン化した。 【００４０】実施例２に記載の組換え体の内の１つのＤ
ＮＡを精製し、酵素ＥｃｏＲＩで切断する。ＥｃｏＲＩ
−Ａフラグメントをアガロースゲルから溶離し、次に、
あらかじめＥｃｏＲＩを作用させたプラスミドｐＡＴ１
５３に挿入する。ＨＢ１０１バクテリアをリゲーション
混合物で形質転換し、次に、得られたコロニーのＤＮＡ
をニトロセルロース膜上に移し、ワクシニアウイルスの
ＳａｌＩ−Ｋフラグメントとハイブリット形成させる。
ハイブリダイゼーション−ポジティブ（hybridization-
positive）であるコロニーを増幅し、それらが有するプ
ラスミドＤＮＡを精製する。２種のプラスミドを得た。
即ち、ｐＥＡ１及びｐＥＡ２であり、ベクターｐＡＴ１
５３内の２つの反対方向へのＥｃｏＲＩ−Ａフラグメン
トの挿入に対応する。 【００４１】これらプラスミドが、ＣＨＯ細胞上でのウ
イルスの増殖を可能にする遺伝情報を有することを確認
するために、プラスミドＤＮＡの挿入物とワクシニアウ
イルスとの間で組換えを誘発する。即ち、鶏胚細胞は、
ワクシニアウイルスの温度感受性変異体ｔｓＮ７を用
い、細胞あたり０．１ｐｆｕの割合で感染され、次に野
生型ワクシニアウイルスのＤＮＡ及びプラスミドｐＥＡ
１又はｐＥＡ２のＤＮＡで形質移入する。ワクシニアウ
イルスのＤＮＡを有さない、或いは、プラスミドを有さ
ない対照も又作成される。３９．５℃で４８時間培養
後、細胞を凍結させ、解凍する。感染の結果得られたウ
イルスをＣＨＯ細胞上で滴定する。ワクシニアウイルス
ＤＮＡ及びプラスミドｐＥＡ１又はｐＥＡ２で形質移入
された細胞由来の試料のもがＣＨＯ細胞上にプラクを形
成する。 【００４２】実施例４ワクシニアウイルスと組換えられるベクタープラスミド
におけるより小さいサイズのｐＥＡ１フラグメントのサ
ブクローニング ＣＨＯ細胞内での増殖を可能にする遺伝情報の位置確認
をするため、プラスミドｐＥＡ１のより小さい部分をカ
バーする制限フラグメントを、ワクシニアウイルスのチ
ミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を有するプラスミドｐＴ
Ｇ１８６ｐｏｌｙ内でクローン化した。 【００４３】ｐＴＧ１８６ｐｏｌｙの構築 ワクシニアウイルス（ＶＶ）のゲノムのＨind IIIフラ
グメント（Ｈｉｎ−Ｊ）は、ＶＶゲノム内での外来ＤＮ
Ａフラグメントの交換及び組換えを可能にするために以
前に用いられた完全なチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子
を有する（マケット（Ｍackett）等、１９８２）。 【００４４】挿入物をＶＶゲノムのＴＫ遺伝子に移入す
ることによりＴＫ−欠失ウイルスを生成し、そのことが
その選択を容易にすることに注目することは重要であ
る。 【００４５】ＶＶのＨin−Ｊフラグメントを組み込むの
に用いることができる唯一のＨindIII部位を担う小さい
サイズのプラスミドを作ることがなによりもまず必要で
あった。更に、プラスミドの不要な制限部位を、次の操
作が実施できるように、除去する必要があった。 【００４６】構築はプラスミドｐＭＬ２（ラスキー（Ｌ
usky）及びボッチャン（Ｂotchan）、１９８１）を出発
物質とした。該プラスミドはヌクレオチドの１０８９か
ら２４９１間のセグメントが自然発生的欠失（spontane
ous deletion）により失われたプラスミドｐＢＲ３２２
に由来するベクターである。最初に、ＰstＩ配列を、ｐ
ＵＣ８（ビオイラ（Ｖioira ）及びメシング（Ｍessin
g）、１９８２）のＡｈａIII−ＡｈａIIIフラグメント
をｐＭＬ３の２つのＡｈａIIIサイト間に挿入すること
により、除去し、１９塩基対を除いた。 【００４７】“リンカーテイリング（linker-tailin
g）”法（ラセ（Ｌathe) 等、１９８４）を用い、本プ
ラスミドのＳ１で処理されたＮｒｕＩ及びＥｃｏＲＩサ
イト間にＨind IIIアダプターを挿入し、ＢamＨＩサイ
トを除いた。これにより、２０４９塩基対を有し、機能
的β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性を与え
る）並びに更にイー・コリ（Ｅ．coli）中で活性である
複製起点及び唯一のＨind III制限サイトを有するプラ
スミドが得られる。この構築物をｐＴＧ１Ｈと称した。 【００４８】ＴＫ遺伝子を有するＶＶのＤＮＡのＨｉｎ
−ＪフラグメントはｐＡＴ１５３ベクター内でクローン
化された（ドリリアン（Ｄrillien ）及びスペーナー
（Ｓpehner）、１９８３）。この４．６−ｋｂフラグメ
ントをｐＴＧ１ＨのＨind IIIサイト中に再クローン化
した。ＴＫ遺伝子がアンピシリン耐性をコードする遺伝
子に比較して末端にあるクローンを選択した。この構築
物をｐＴＧ１Ｈ−ＴＫと称した。 【００４９】ｐＴＧ１Ｈ−ＴＫ構築物を、下記の構築の
ベクターとして用いた。 【００５０】次の操作は、ＶＶのプロモーターを単離す
ることであった。該プロモーターは、ＶＶ内に組み込ま
れるべき外来遺伝子の発現を制御するために用いること
ができるものである。７５００ダルトン（７．５Ｋ）蛋
白質をコードする初期遺伝子のためのプロモーターは、
同様の目的ですでに用いられ、好結果を得ている（スミ
ス（Ｓmith) 等、１９８３）。これにより、該プロモー
ターの単離が行われた。 【００５１】７．５Ｋ遺伝子は、ＷＲ型ＶＶのゲノムの
最小ＳａｌＩフラグメント（Ｓａｌ−Ｓフラグメント）
の１つに位置する（ベンカタサン（Ｖenkatasan ）等、
１９８１）。小フラグメントが優先的にクローン化され
たため、ＳａｌＩで切断したＷＲ型ＶＶのＤＮＡをｐＢ
Ｒ２２２プラスミド中に直接クローン化することにより
得られたクローンの殆んどがＳａｌ−Ｓフラグメントを
有する。このフラグメントをベクターバクテリオファー
ジＭ１３ｍｐ７０１（キーニー（Ｋieny）等、１９８
３）上に、ＳａｌＩ消化及びリゲーションにより移し、
ファージＭ１３．ＴＧ．Ｓａｌ−Ｓを得る。 【００５２】このクローンにおいて、ＳｃａＩサイト
が、７．５Ｋ遺伝子の開始ＡＴＧに極めて近接して存在
している。７．５Ｋ遺伝子の下流に、該ベクター由来の
２つの単一なＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩサイトがある。
該ＢａｍＨＩ及びＳｃａＩサイトを、イー．コリ ポリ
メラーゼのクレノーフラグメントでＢａｍＨＩ消化によ
り作られた末端中にフィリング（filling ）した後に、
ＢｇｌIIアダプター：５′−ＣＡＧＡＴＣＴＧ−３′を
用いて融合する。この方法でＳｃａＩサイトは除去され
るが、ＢａｍＨＩサイトを再構築し単一な、ＥｃｏＲＩ
サイトを下流に移動させる。同時に、下流のＳａｌＩ
（ＡｃｃＩ）サイトを除去し、従って、上流のＳａｌＩ
サイトが単一となる。この構築物をＭ１３．ＴＧ．７．
５Ｋと称する。 【００５３】ＶＶのＤＮＡのＨｉｎ−Ｊフラグメント
は、約３０塩基対により分離されるＣｌａＩ及びＥｃｏ
ＲＩサイトを有する（ウイア（Ｗeir ）及びモス（Ｍos
s ）、１９８３）。Ｍ１３．ＴＧ．７．５Ｋ中に存在す
る７．５ＫプロモーターフラグメントをＡｃｃＩ及びＥ
ｃｏＲＩで切除し、ｐＴＧ１Ｈ−ＴＫ−Ｐ７．５Ｋを作
るためにｐＴＧ１Ｈ−ＴＫのＣｌａＩサイトとＥｃｏＲ
Ｉサイトとの間にクローン化する。 【００５４】この構築において、Ｍ１３ベクターの単一
なＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩサイトが、７．５Ｋプロモ
ーター配列のすぐ下流に配置される。これらユニークな
ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩサイトを下記の構築に用い
る。 【００５５】バクテリオファージＭ１３ＴＧ１３１（キ
ーニー（Ｋieny）等、１９８３）のポリリンカーセグメ
ントをＥｃｏＲＩ及びＢｇｌIIで切除し、プラスミドｐ
ＴＧ１Ｈ−ＴＫ−Ｐ ７．５ＫのＥｃｏＲＩ及びＢａｍ
ＨＩサイト間に挿入し、ｐＴＧ１８６ｐｏｌｙを作る。
この構築物においては、５つの単一な制限サイト（Ｐｓ
ｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｓｔＩ、ＳｍａＩ及びＥｃｏＲ
Ｉ）をｐ７．５Ｋプロモーターのコントロール下での外
来遺伝子のクローニングに用いることができる。 【００５６】ｐＥＡ１フラグメントのｐＴＧ１８６ｐｏ
ｌｙへの挿入 プラスミドｐＥＡ１のＥｃｏＲＩＡフラグメントを種々
の酵素で消化し、種々の大きさのフラグメントをｐＴＧ
１８６ｐｏｌｙに挿入した。 【００５７】ｐＴＧ１８６ｐｏｌｙ由来で、組換えプラ
スミドｐＥＡ１のＥｃｏＲＩ−Ａフラグメントの部分を
有する組換えプラスミドを図４に示す。 【００５８】プラスミドｐＥＡ１を酵素ＢｇｌIIで切断
し、数個のフラグメントを得る。ＢｇｌIIフラグメント
の内の最大のものをｐＴＧ１８６ｐｏｌｙベクターのＢ
ａｍＨＩサイトに挿入し、挿入方向の異なるプラスミド
ｐＥＡ５ａ及びｐＥＡ５ｂを得る。 【００５９】プラスミドｐＥＡ６は、酵素ＰｓｔＩでｐ
ＥＡ５ａを切断し、次に最大フラグメントを再環化（re
circularization ）して得られ、これによりｐＥＡ５ａ
からＢｇｌII−ＰｓｔＩフラグメントが失われる。 【００６０】プラスミドｐＥＡ７は、プラスミドｐＥＡ
６を酵素ＣｌａＩで切断し、次に得られた大フラグメン
トを再環化（recircularization ）して得られ、この結
果、小フラグメントＣｌａＩが欠失する。 【００６１】プラスミドｐＥＡ８は、ｐＥＡ６をＳｐｈ
Ｉで切断し、大フラグメントを再環化して得られ、その
結果右側のＳｐｈＩ−ＢｇｌIIフラグメントの欠失が起
こる。 【００６２】プラスミドｐＥＡ９は、ｐＥＡ５ｂをＳｐ
ｈＩで切断し、再リゲーションすることにより得られ、
その結果左側のＳｐｈＩ−ＢｇｌIIフラグメントの欠失
が起こる。 【００６３】プラスミドｐＥＡ３６は、２段階で構築さ
れた。まず小フラグメントＨｐａＩがプラスミドｐＥＡ
９から単離され、これがＭ１３−１３０ベクターのＳｍ
ａＩサイトに挿入された。次に、ＨｐａＩフラグメント
を、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩサイトを用いて、Ｍ１３−
１３０ベクターから単離し、ベクターｐＴＧ１８６ｐｏ
ｌｙのＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩサイトに組み込んだ。 【００６４】これらプラスミドのそれぞれを、該プラス
ミドにより保有されるＴＫ遺伝子内に存在する挿入片を
ワクシニアウイルスゲノムに移入するために、実施例３
の方法に従って、形質移入試験で用いた。 【００６５】ワクシニアウイルスに対しＣＨＯ細胞内で
の増殖能を与えるプラスミドは、ｐＥＡ１、２、５ａ、
５ｂ、６、９及び３６である。 【００６６】上記性質を有する最小フラグメントはプラ
スミドｐＥＡ３６により保有される。それは２００４塩
基対を有する。 【００６７】実施例５ＣＨＯ細胞内でのワクシニアウイルスの増殖を可能にす
る遺伝子の配列決定 プラスミドｐＥＡ３６により保有され、２つのＨｐａ１
サイト間に位置する牛痘ウイルスＤＮＡは、図５に示さ
れる手法に従い、ファージＭ１３−１３０及びＭ１３−
１３１（キーニー（Ｋieney ）等、１９８３）に最小フ
ラグメントを挿入した後、ジデオキシヌクレオチド法
（サンガー（Ｓanger ）等、１９８０）を用いて完全に
配列決定した。 【００６８】７７０００ダルトンの蛋白質をコードする
ことのできるリーディングフレーム（reading frame）
は、図５の地図に示されるようにヌクレオチドＡＴＧで
始まり、ヌクレオチドＴＡＡで終わる。地図の下にある
矢印は、各クローンの読み取り（reading ）開始点、読
み取りの長さ及びその方向を示す。読み取り開始が制限
サイトで開始しない場合、配列の一部より推察される合
成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いた。 【００６９】本発明の遺伝子の完全な配列及び、該遺伝
子がコードし得る７７０００ダルトンの蛋白質の配列を
図６〜図９に示す。 【００７０】実施例６ＴＫ遺伝子外でのワクシニアＤＮＡへの牛痘ウイルス遺
伝子の組込み及び相同組換え 実施例４に記載され、ＣＨＯ細胞内で増殖し得る組換え
ウイルスの内、いくつかはＴＫ+で他はＴＨ-であること
が観察される。 【００７１】例えば、プラスミドｐＥＡ９を用いた細胞
の形質移入において、ＣＨＯ細胞での増殖により選択さ
れた組換えウイルスの２７のプラクの内、１６はＴＫ-
で、１１はＴＫ+であった。 【００７２】従って、ＣＨＯ細胞内増殖を可能にする情
報を導入する組換えは、チミジンキナーゼをコードする
遺伝子と異なる領域で起こったのである。 【００７３】この結果は、ＴＫ遺伝子以外のゲノムの領
域への外来遺伝子の挿入及び選択の可能性を意味し、同
時に、ＣＨＯ細胞上での増殖による選択を意味する。こ
の目的には、選ばれた遺伝子とＣＨＯ細胞上での成長を
可能にする遺伝子とを並列に並べれば充分である。 【００７４】ワクシニアウイルスゲノムを用いた相同性
組換え（homologous recombination）による、ＣＨＯ細
胞での増殖を可能にする遺伝子の挿入は、外来遺伝子の
共組込みを（co-integration）惹き起こす。 【００７５】本発明の代表的菌株の寄託 プラスミドｐＥＡ３６を有するイー．コリ（Ｅ．Ｃoli
）１１０６株を寄託No.Ｉ５９４で１９８６年９月２日
にコレクシオン ナシオナル ド クルチュール デ
ミクロオルガニスム（＝Ｃllection Ｎationale de Ｃ
ultures des Ｍicroorganismes、Ｎational Ｃollectio
n of Ｃultures of Ｍicroorganisms）に寄託した。 【００７６】プラスミドｐＥＡ３６は、ＣＨＯ細胞内で
ウイルスの増殖を可能にする２００４ｂｐ牛痘ウイルス
ＤＮＡフラグメントを有する。このＤＮＡフラグメント
は、ＣＨＯ細胞内で増殖しないワクシニアウイルスによ
る生体内組換えに用いられる。ＤＮＡプラスミドによる
細胞の形質移入及びワクシニアウイルスによる混合感染
（co-infection）により、ＣＨＯ細胞内増殖能を有する
ワクシニアウイルスの組換え体を選択することが可能で
ある。 【００７７】参考文献 ・ドリリアン，アール（Ｄrillien ，Ｒ．）、スペーナ
ー，ディ（Ｓpehner，Ｄ）及びカーン、エー（Ｋirn ，
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４２、１９８４ ・ラスキー（Ｌusky）及びボッチャン（Ｂotchan）、ネ
イチャー（Ｎature ）、２９３、７９−８１、１９８１ ・マケット，エム．（Ｍackett，Ｍ．）及びアーカー
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ル オブ ゼネラル ヴィアロロジー （Ｊ．Ｇen．Ｖ
irol．）、４５、６８３、７０１、１９７９ ・マケット，エム．（Ｍackett，Ｍ．）、スミス，ジ
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ル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユナイ
ティッド ステイツオブ アメリカ（Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．
（ＵＳＡ））、７９、７４１５−７４１９、１９８２ ・マニアティス，ティ（Ｍaniatis ，Ｔ．）、フリッシ
ュ，イー．エフ．（Ｆritsch，Ｅ．Ｆ．）及びサンブル
ック，ジェイ（Ｓambrook ，Ｊ．）、“モレキュラー
クローニング（Ｍolecular Ｃloning）：ア ラボラト
リー マニュアル（Ａ Ｌaboratory Ｍanual ）”コー
ルド スプリング ハーバー ラボラトリー（Ｃold Ｓ
pring Ｈarbor Ｌoboratory ）、コールド スプリング
ハーバー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor ）、ニューヨーク
（Ｎ．Ｙ．）、１９８２ ・モス，ビー（Ｍoss ，Ｂ．）、“ヴィアロロジー（Ｖ
iralogy ）”（ビー．エヌ．フィールズ（Ｂ．Ｎ．Ｆie
lds ）編）、ＰＰ．６８５−７０３、ラヴェンプレス
（Ｒaven Ｐress）、ニューヨーク（Ｎew Ｙork ） ・パニカリ，ディ（Ｐanicali ，Ｄ．）及びパオレッテ
ィ，イー．（Ｐaoletti，Ｅ．）、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．
（ＵＳＡ）、７９、４９２７−４９３１、１９８２・パ
ニカリ，ディ（Ｐanicali ，Ｄ．）、ディヴィス，エ
ス．ダヴリュー（Ｄavis，Ｓ．Ｗ．）、ワインバーグ，
アール．エル．（Ｗeinberg ，Ｒ．Ｌ．）及びパオレッ
ティ，イー．（Ｐaoletti ，Ｅ．）、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．
（ＵＳＡ）、８０、５３６４−５３６８、１９８３ ・サンガー，エフ．エヌ．（Ｓanger ，Ｆ．Ｓ．）、ニ
ックレン，エス．（Ｎicklen，Ｓ．）及びコンルソン，
エー．アール．（Ｃonlson，Ａ．Ｒ．）、Ｐ．Ｎ．Ａ．
Ｓ．（ＵＳＡ）、７４、５４６３−５４６７、１９７７ ・スミス，ジー．エル．（Ｓmith，Ｇ．Ｌ．）、マケッ
ト，エム．（Ｍackett，Ｍ．）及びモス，ビー（Ｍoss
，Ｂ．）、ネイチャー（Ｎature ）、３０２、４９０
−４９５、１９８３ ・スミス，ジー．エル．（Ｓmith，Ｇ．Ｌ．）、マーフ
ィ，ビー．アール．（Ｍurphy ，Ｂ．Ｒ．）及びモス，
ビー（Ｍoss ，Ｂ．）、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ）、
８０、７１５５−７１５９、１９８３ ・トウィッグ，エー，ジェー（Ｔwigg，Ａ．Ｊ．）及び
シェラット，ディ（Ｓherratt ，Ｄ．）、ネイチャー
（Ｎature ）、２８３、２１６−２１８、１９８０・ヴ
ェンカタサン，エス．（Ｖenkatasan ，Ｓ．）、バラウ
ディ，ビー．エム．（Ｂaroudy，Ｂ．Ｍ．）及びモス，
ビー（Ｍoss ，Ｂ．）、セル（Ｃell ）、２５、８０５
−８１３、１９８１ ・ヴイアラ（Ｖiera）及びメシング（Ｍessing）、ジー
ン（Ｇene ）、１９、２５９−２６８、１９８２ ・ウィア，ジェイ．ピー．（Ｗier ，Ｊ．Ｐ．）及びモ
ス，ビー．（Ｍoss ，Ｂ．）、ジャーナル オブ ヴィ
アロロジー（Ｊ．Ｖirol．）、 ４６、５３０−５３
４、１９８３
【図面の簡単な説明】
【図１】ワクシニアウイルス及び牛痘ウイルス間の組換
え体のＤＮＡの制限地図を示す。上部の４本の横線は、
酵素ＨｉｎｄIII及びＸｈｏＩで切断後得られたワクシ
ニアウイルス（ＶＶ）及び牛痘ウイルス（ＣＰ）の制限
地図を示す。その下の１０本の横線は、実施例１に従っ
て単離されたＶＶ及びＣＰ間の組換え体ゲノムを示す。
矢印で示された制限サイトは牛痘ゲノムに特有のもので
あり、縦線で示された制限サイトはワクシニアウイルス
に特有のものである。これら２種のゲノムに共通のサイ
トは明示していない。破線は、測定の未確定領域を示
す。 【図２】酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII及びＳａｌＩで
切断後のワクシニアウイルス（ＶＶ）及び牛痘ウイルス
（ＣＰ）の左末端の制限地図を示す。フラグメントは、
慣用の方法に従って、大きさが減少する順にＡＢＣ…と
印されている。 【図３】ワクシニアウイルス及び牛痘ウイルス間の組換
え体のＤＮＡの制限プロフィールの特徴付けを示す。ワ
クシニアウイルス（ＶＶ）のＤＮＡ、牛痘ウイルス（Ｃ
Ｐ）のＤＮＡ並びに４種の組換え体ｒｅｃ２、ｒｅｃ
３、ｒｅｃ４及びｒｅｃ６のＤＮＡは、実施例２に従っ
て単離され、3Ｈ−チミジンの存在下に感染された鶏胚
細胞より作られた。 図中のＡ部分は、ＥｃｏＲＩによ
るＤＮＡの消化、フラグメントのアガロースゲル分離及
び１５日間の露出時間に亘るドライゲル（dry gel）の
オートラジオグラフィ後に得られたフラグメントのオー
トラジオグラフを示す。Ｂ部分において、Ａと同様に処
理されたＤＮＡを、ニトロセルロース上に移し、プラス
ミドｐＡＴ１５３により担われるＳａｌＩ−Ｋプローブ
とハイブリッド形成された。 【図４】ベクターｐＴＧ１８６ｐｏｌｙに組込まれたプ
ラスミドｐＥＡ１のＥｃｏＲＩ−Ａフラグメントの部分
を有する組換えプラスミドを示す。上部の２本の横線
は、酵素ＥｃｏＲＩの制限部位を持ちワクシニアウイル
ス及び牛痘ウイルスのＤＮＡの左末端を示す。３本目の
線は、連続線で示したＥｃｏＲＩ−Ａフラグメント及び
破線で示したプラスミドｐＡＴ１５３を有するプラスミ
ドｐＥＡ１の直線表示である。下の線は、連続線で示さ
れるｐＥＡ１由来のフラグメントと破線で示されるベク
ターｐＴＧ１８６ｐｏｌｙ由来のフラグメントとを有す
る種々の組換えプラスミドの直線表示である。７．５Ｋ
遺伝子プロモーターは、転写方向を指す白ぬき矢印によ
り示される。制限サイトは下記の文字で示される。 Ｂ ＢｇｌII Ｃ ＣｌａＩ Ｅ ＥｃｏＲＩ Ｈ ＨｐａＩ Ｐ ＰｓｔＩ Ｓ ＳａｌＩ Ｓｐ ＳｐｈＩ Ｘ ＸｈｏＩ 【図５】ＣＨＯ細胞内増殖を可能にする遺伝子の配列決
定法を示す。太い横線は、２つのＨｐａＩサイト（Ｈ
１）間に含められた配列決定されたＤＮＡフラグメント
を示す。他の制限サイトはＳ（Ｓａｕ３Ａ）、Ｈ２（Ｈ
ｐａ２）、Ｘ（ＸｈｏＩ）、Ｃ（ＣｌａＩ）及びＸｂ
（ＸｂａＩ）で示される。８００００ダルトンの蛋白質
をコードできるリーディングフレームは、地図に示され
る如く、ヌクレオチドＡＴＧで開始し、ＴＡＡで終了す
る。地図の下の矢印は、各クローンの読取り（readihg
）を開始する地点、読取りの長さ及びその方向性を示
す。 【図６】ＣＨＯ細胞における増殖を可能にする遺伝子の
配列を示す（図７、図８及び図９に続く）。 【図７】図６に続いて、ＣＨＯ細胞における増殖を可能
にする遺伝子の配列を示す（図８及び図９に続く）。 【図８】図７に続いて、ＣＨＯ細胞における増殖を可能
にする遺伝子の配列を示す（図９に続く）。 【図９】図８に続いて、ＣＨＯ細胞における増殖を可能
にする遺伝子の配列を示す。
え体のＤＮＡの制限地図を示す。上部の４本の横線は、
酵素ＨｉｎｄIII及びＸｈｏＩで切断後得られたワクシ
ニアウイルス（ＶＶ）及び牛痘ウイルス（ＣＰ）の制限
地図を示す。その下の１０本の横線は、実施例１に従っ
て単離されたＶＶ及びＣＰ間の組換え体ゲノムを示す。
矢印で示された制限サイトは牛痘ゲノムに特有のもので
あり、縦線で示された制限サイトはワクシニアウイルス
に特有のものである。これら２種のゲノムに共通のサイ
トは明示していない。破線は、測定の未確定領域を示
す。 【図２】酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII及びＳａｌＩで
切断後のワクシニアウイルス（ＶＶ）及び牛痘ウイルス
（ＣＰ）の左末端の制限地図を示す。フラグメントは、
慣用の方法に従って、大きさが減少する順にＡＢＣ…と
印されている。 【図３】ワクシニアウイルス及び牛痘ウイルス間の組換
え体のＤＮＡの制限プロフィールの特徴付けを示す。ワ
クシニアウイルス（ＶＶ）のＤＮＡ、牛痘ウイルス（Ｃ
Ｐ）のＤＮＡ並びに４種の組換え体ｒｅｃ２、ｒｅｃ
３、ｒｅｃ４及びｒｅｃ６のＤＮＡは、実施例２に従っ
て単離され、3Ｈ−チミジンの存在下に感染された鶏胚
細胞より作られた。 図中のＡ部分は、ＥｃｏＲＩによ
るＤＮＡの消化、フラグメントのアガロースゲル分離及
び１５日間の露出時間に亘るドライゲル（dry gel）の
オートラジオグラフィ後に得られたフラグメントのオー
トラジオグラフを示す。Ｂ部分において、Ａと同様に処
理されたＤＮＡを、ニトロセルロース上に移し、プラス
ミドｐＡＴ１５３により担われるＳａｌＩ−Ｋプローブ
とハイブリッド形成された。 【図４】ベクターｐＴＧ１８６ｐｏｌｙに組込まれたプ
ラスミドｐＥＡ１のＥｃｏＲＩ−Ａフラグメントの部分
を有する組換えプラスミドを示す。上部の２本の横線
は、酵素ＥｃｏＲＩの制限部位を持ちワクシニアウイル
ス及び牛痘ウイルスのＤＮＡの左末端を示す。３本目の
線は、連続線で示したＥｃｏＲＩ−Ａフラグメント及び
破線で示したプラスミドｐＡＴ１５３を有するプラスミ
ドｐＥＡ１の直線表示である。下の線は、連続線で示さ
れるｐＥＡ１由来のフラグメントと破線で示されるベク
ターｐＴＧ１８６ｐｏｌｙ由来のフラグメントとを有す
る種々の組換えプラスミドの直線表示である。７．５Ｋ
遺伝子プロモーターは、転写方向を指す白ぬき矢印によ
り示される。制限サイトは下記の文字で示される。 Ｂ ＢｇｌII Ｃ ＣｌａＩ Ｅ ＥｃｏＲＩ Ｈ ＨｐａＩ Ｐ ＰｓｔＩ Ｓ ＳａｌＩ Ｓｐ ＳｐｈＩ Ｘ ＸｈｏＩ 【図５】ＣＨＯ細胞内増殖を可能にする遺伝子の配列決
定法を示す。太い横線は、２つのＨｐａＩサイト（Ｈ
１）間に含められた配列決定されたＤＮＡフラグメント
を示す。他の制限サイトはＳ（Ｓａｕ３Ａ）、Ｈ２（Ｈ
ｐａ２）、Ｘ（ＸｈｏＩ）、Ｃ（ＣｌａＩ）及びＸｂ
（ＸｂａＩ）で示される。８００００ダルトンの蛋白質
をコードできるリーディングフレームは、地図に示され
る如く、ヌクレオチドＡＴＧで開始し、ＴＡＡで終了す
る。地図の下の矢印は、各クローンの読取り（readihg
）を開始する地点、読取りの長さ及びその方向性を示
す。 【図６】ＣＨＯ細胞における増殖を可能にする遺伝子の
配列を示す（図７、図８及び図９に続く）。 【図７】図６に続いて、ＣＨＯ細胞における増殖を可能
にする遺伝子の配列を示す（図８及び図９に続く）。 【図８】図７に続いて、ＣＨＯ細胞における増殖を可能
にする遺伝子の配列を示す（図９に続く）。 【図９】図８に続いて、ＣＨＯ細胞における増殖を可能
にする遺伝子の配列を示す。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｃ１２Ｒ 1:92）
(Ｃ１２Ｐ 21/00
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12P 21/00 - 21/06
C12N 5/00 - 5/28
C12N 7/00 - 7/08
C12N 15/00 - 15/90
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ
ＥＮＥＴＹＸ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．産業上有用な蛋白質をコードする遺伝子を含み、特
に牛痘ウイルスから単離され、ＣＨＯ細胞（チャイニー
ズハムスター卵巣細胞）における該ウイルスの増殖に関
与し、下に示される配列又は下に示される配列において
１又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されている
が機能は保持されている配列を含むＤＮＡを有する組換
えワクシニアウイルスで感染されたＣＨＯ細胞であっ
て、該遺伝子がＣＨＯ細胞において発現を可能とする要
素のコントロール下にあるＣＨＯ細胞を培養することを
特徴とする産業上有用な蛋白質の製造方法。 【表１】【表２】【表３】【表４】２．該ＤＮＡがＣＨＯ細胞内での発現を可能とする独自
のコントロールシグナルを更に含む請求項１に記載の製
造方法。 ３．該ＤＮＡがワクシニアウイルスの細胞内増殖中の相
同性組換え過程に係わることができる該ウイルスの領域
に相同性を有する領域を少なくとも１つ含む請求項１又
は２に記載の製造方法。 ４．産業上有用な蛋白質をコードする遺伝子が、ＣＨＯ
細胞におけるその発現を可能とするポックスウイルスコ
ントロールシグナルの下に置かれている請求項１〜３の
いずれかに記載の製造方法。 ５．該配列の末端が、組換えを可能とするワクシニアウ
イルスの領域に相同性を有する領域を含む、請求項１〜
４のいずれかに記載の製造方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8613272 | 1986-09-23 | ||
| FR8613272A FR2604183B1 (fr) | 1986-09-23 | 1986-09-23 | Sequence d'adn, vecteurs, virus recombinants et procede mettant en oeuvre des virus de la vaccine recombinants capables de se multiplier dans les cellules cho |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62240585A Division JP2683804B2 (ja) | 1986-09-23 | 1987-09-24 | Ｄｎａ配列、ベクター、組換えウイルス及びｃｈｏ細胞において増殖可能な組換えワクシニアウイルスを用いる方法 |
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|---|---|
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| JP2818836B2 true JP2818836B2 (ja) | 1998-10-30 |
Family
ID=9339184
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62240585A Expired - Lifetime JP2683804B2 (ja) | 1986-09-23 | 1987-09-24 | Ｄｎａ配列、ベクター、組換えウイルス及びｃｈｏ細胞において増殖可能な組換えワクシニアウイルスを用いる方法 |
| JP8245970A Expired - Lifetime JP2818836B2 (ja) | 1986-09-23 | 1996-09-18 | Ｃｈｏ細胞において増殖可能な組換えワクシニアウイルスを用いる方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62240585A Expired - Lifetime JP2683804B2 (ja) | 1986-09-23 | 1987-09-24 | Ｄｎａ配列、ベクター、組換えウイルス及びｃｈｏ細胞において増殖可能な組換えワクシニアウイルスを用いる方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5830688A (ja) |
| EP (1) | EP0262043B1 (ja) |
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