JPS63157988A - Ｄｎａ配列、ベクター、組換えウイルス及びｃｈｏ細胞において増殖可能な組換えワクシニアウイルスを用いる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクシニアウィルスは、動物細胞における発現ベクター
として、この系に特異的な方法が開発されて以来（パニ
カリ（Ｐ　ａｎｉｃａｌｉ　）及びパオレッティ（Ｐａ
ｏｌｅｔｔｉ　）　、１９８２　；７ケツト（Ｍａｃｋ
ｅｔ　）等、１９８２．スミス（Ｓ　ｍ１ｔｈ）等、１
９８３；パニカリ（Ｐ　ａｎｉｃａｌｉ　）等；キーニ
ー（Ｋｉｅｎｅｙ　）等、１９８４）、用いられている
。

ヒト又は動物用医薬品分野で重要な蛋白質を、コードす
る遺伝子を有するワクシニアウィルスの組換えウィルス
の構築が特に探求されている。該構築が完成すると、そ
の遺伝子がワクシニアウィルスのゲノム中に組込まれる
異種蛋白質（ｆｏｒｅｉｇｎｐｒｏｔｅｉｎ　）の合成
は、追及される目的に従って、イン・ヒドロの細胞培養
物中或いは生体組織への接種後に得ることができる。ベ
クターとしてのワクシニアウィルスの利点の一つは、大
多数の種々のタイプの細胞内での増殖能である。

しかし、これには、幾つかの例外がある。特に、野生型
ワクシニアウィルスは、チャイニーズハムスターの卵巣
（Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａ［１Ｉｓｔｅｒ　ｏｖａｒｙ）
　、ＣＨ−り　　− Ｏ１細胞系列では増殖できない（ドリリアン（Ｄｒｉｌ
ｌｉｅｎ　）　、スペーナー（Ｓ　ｐｅｈｎｅｒ）及び
カーノ（Ｋｉｒｎ　）　、１９７８）　ｏ従って、ＣＨ
Ｏ細胞は、哺乳類細胞における蛋白質合成のための最も
有望なシステムの１つである。実際、ｃＨｏ細胞は容易
に培養でき、短い世代時間を持ち、その遺伝は全ての類
似のシステム中で最も良く知られている。

本発明は、ＣＨ○細胞における増殖能をワクシニアウィ
ルスに与える外来遺伝子を該ライスルのゲノムに組み込
むことにより該ウィルスを変異させることに関する。こ
の新しい宿主特異性を与える遺伝子は、ＣＨＯ細胞中で
増殖可能な牛痘ウィルス（ｃｏｗｐｏｘ　　ｖｉｒｕｓ
　）　　（又はワクシニアウィルスに関連した牛ウィル
ス、牛天然痘（ｂｏｖｉｎｅｓｍａｌ　１ｐｏｘ）ウィ
ルス）に由来する。牛痘及びワクシニアウィルスのゲノ
ムは、ＤＮＡの中心部分の１０万塩基対が特に非常に類
似している（マゲッ）　（Ｍ　ａｃｋｅｔｔ）及びアー
カード（Ａｒｃｈａｒｄ）　、１９７９）。しかし、牛
痘ウィルスのゲノム（約２３万ｂｐ）はワクシニアウィ
ルスのそれ（約１９万ｂｐ）よりも大きく、牛痘ウィル
スのゲノムの有する付加的遺伝子情報は、本質的にその
両末端に存すると思われる。ワクシニアウィルスのゲノ
ムと牛痘ウィルスのゲノム間の類似性により、ＣＯＨ細
胞に自然に順応されるベクターとしての牛痘ウィルスの
使用が期待できる。

しかし、牛痘ウィルスは、ワクシニアウィルスの１／１
０の力価で増殖し、このことは、結果として、ワクシニ
アウィルスの組換えに比較して牛痘ウィルスの組換えに
より生産された発現蛋白質の低収率をもたらすようであ
る。

更に、種痘にウィルスの組換え体を用いる点から、ワク
シニアウィルスの使用は周知であり、天然痘が完全に根
絶されていることが強調されるべきである。

本発明は、ワクシニアウィルスの既知の長所及びＣＨＯ
細胞における牛痘ウィルスの増殖能を有するベクターの
開発に関する。

第一に、本発明は、牛痘ウィルスにＣＨＯ細胞における
増殖能を与える遺伝情報の同定及び位置確認（Ｉｏｃａ
ｌｉｚａｔｉｏｎ　）に関する。

事実、実施された試験により、ＣＨＯ細胞における牛痘
ウィルスの増殖に関与する配列の同定が可能となった。

これをワクシニアウィルスに移入すると、ＣＨＯ細胞に
おける該ウィルスの増殖が確実に生じる。

従って、本発明は、特に牛痘ウィルスから単離され、Ｃ
ＨＯ細胞での該ウィルスの増殖に関与し、第６図に示さ
れる配列の全部又は機能的部分或いは機能的に均等な配
列を有するＤＮＡ配列に関する。

この遺伝子の一部（以下「機能的部分」という）は、増
殖をさせるのに充分なものである。又、突然変異又はポ
イント変異（ｐｏｉｎｔ　　ｖａｒｉａｔｉｏｎ）によ
っても機能が変化しない可能性があり、この場合、“機
能的に均等な配列“という。

このＤＮＡ配列は、ＣＨＯ細胞で発現させるそれ自身の
コントロールシグナル（ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉｇｎａｌ
）を有することが好ましく、これは不可欠ではないが、
該ＤＮＡ配列が、異なる起源を持つ要素の制御下にある
ことが考えられる。

上記の様に、該ＤＮＡ配列は、ＣＨＯ細胞におけるその
増殖を確実にする為に、ワクシニアウィルス内への組込
みを意図したものである。この組込みは、相同性組換え
（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　
）によりなされる。従って、該ＤＮＡ配列は、ウィルス
の細胞内増殖中のこの相同性組換え過程に関与し得るワ
クシニアウィルスの配列に相同性を有する領域を少くと
も１つ有することを確認することが有用である。

事実、牛痘ウィルスにおいて、ＣＨＯ細胞中での増殖を
可能にする遺伝子は、ワクシニアゲノムの配列に相同で
ある配列により包囲されていると思われ、このことはプ
ラスミド組換えベクターの製造を簡単化し得る。

ワクシニアウィルスの場合既に去られているように、本
発明のＤＮＡ配列中に、宿主細胞においてその発現を与
える調節要素に依存する産業上有用な蛋白質をコードす
る遺伝子を挿入することが可能である。この技術は、特
にフランス国特許第８４１０６．４９９号、第８４１０
７．９５９号及び第８５１０９，２２５号に既に記載さ
れ、幾つかの適応及び利点を伴い、用いることが可能で
ある。特に、前述の構築において、組換えウィルスの選
択は、発現されるべき遺伝子をワクシニアウィルスのＴ
Ｋ遺伝子に挿入することにより行われた。これにより、
ＴＫ−となった組換えウィルスが得られ、選択を既知の
方法により行うことができる。

−８一 本発明の場合、ＴＫ遺伝子への挿入は不可欠ではない。

何故なら、産業上有用な蛋白質をコードする遺伝子を、
ＣＨＯ細胞内での増殖を可能とする遺伝子に連結させる
限り、組換えウィルスのみがＣＨＯ細胞で増殖し、これ
により、組換えウィルスの“自然”選択が可能となるか
らである。

上記後者の場合、組換えられる遺伝子を有するＤＮＡブ
ロックの側方に、ワクシニアウィルスの配列に相同性の
ある配列を配置して該遺伝子が組換え中も連結状態に保
たれるようにすることが望ましい。

本発明は、上記のＤＮＡ配列及び特に、産業」二有用な
蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウィ
ルスで感染されたＣＨＯ細胞及び対応するウィルスに関
する。

本発明は、上記ＤＮＡ配列を含むプラスミドベクターで
あって、イン・ビボにおける組換えを行うために用いる
ことができるプラスミドベクターにも関する。

又、本発明は、本発明のＤＮＡ配列に組込まれており、
且つ該細胞におけるワクシニアウィルスの増殖を確認す
ることができる、ＣＨＯ細胞に関するものである。

最後に、本発明は、本発明の組換えウィルスにより感染
されたＣＨＯ細胞を培養することにより産業上有用な蛋
白質の製造することに関するものである。

実施例 下記に実施例を示し、本発明のその他の特徴及び長所に
ついて説明する。

実施例１ ワクシニアウィルスと牛痘ウィルスとの組換え体を、各
ウィルスで鶏胚細胞（ｃｈｉｃｋ　ｅｍｂｒｙ。

ｃｅｌｌｓ　）の混合感染後に選択した。組換え体のＤ
ＮＡの分析により、ＣＨＯ細胞における増殖能が、牛痘
ウィルスゲノムの左側末端での制限サイトの保持（ｒｅ
ｔｅｎｔｉｏｎ　）　）関連することが示される。

第１期（ｐｒｉｍａｒｙ　）鶏胚細胞を、１１〜１２日
の受精卵から作製し、ワクシニアウィルスの温度感受性
突然変異、ｔｓＮ７（ドリリアン（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ　
）等、１９８２）及び牛痘ウィルス（ブライトン（Ｂ　
ｒｉｇｈｔｏｎ　）株）により、細胞光たり２プラク形
成単位（ｐ　ｆ　ｕ）で、同時に感染する。同時に、他
の細胞ローン（ｌａｗｎ）はこれらウィルスの各々で感
染される。１時間吸着後、過剰の非吸着ウィルスを除去
し、新たな培地を細胞に加える。

これらの細胞を全細胞層に壊死が出現するまで、１〜２
日間３３℃で培養する。次に、感染細胞を凍結し、解凍
する。感染されたウィルスを３９．５°Ｃにて１％精製
寒天を含有する培地層下に鶏胚細胞上で滴定する。３９
．５℃で２日後、２種のウィルスの混合物で感染された
細胞ローン上で形成されたウィルスのプラク数は、対照
細胞のローン上で形成されたプラク数よりも大きい（ワ
クシニアウィルスの温度感受性変異体も牛痘ウィルスも
有意な数のプラクを与えない。）。従って、混合感染よ
り出現するプラクは牛痘ウィルスとワクシニアウィルス
との組換え体に相当する。

次に、可能な組換え体のプラクを別々に再び取り、それ
らが有するウィルスを、鶏胚細胞上で増殖することによ
り、増幅する。ウィルスのＤＮＡを精製し、制限酵素で
切断し、次にアガロースゲル上で分析する。

制限プロフィールより、各プラグはワクシニアウィルス
ＤＮＡ及び牛痘ウィルスＤＮＡ間の組換え体に対応する
ことが確認される。関連ウィルスの既知の制限地図（マ
ケット（Ｍａｃｋｅｔｔ）及びアーカード（Ａｒｃｈａ
ｒｄ）　、１９７８、ドリリアン（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ　
）及びスペーナ−（Ｓｐｅｈｎｅｒ）　、１９８３）を
用いれば−、組換え体の大部分のフラグメントの起源を
確立し、その制限地図を描くことができる（第１図）。

ＣＨＯ細胞内で増殖可能な組換え体４．６．１４．１５
及び１９は、牛痘ウィルスゲノムの左側末端の特性部位
（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　５ｉｔｅ）を保持し
ていることがわかる。ＣＨＯ細胞内で増殖不可能な他の
組換え体２．７．１１．１６及び１８は、牛痘ウィルス
ゲノムの左側末端の特性部位を一部しか有しないか、ま
たは全く有さない。

これらの結果から、牛痘ウィルスゲノムの左側末端の制
限部位の保持は、ＣＨＯ細胞内での増殖の表現型と関連
があることがわかる。

実施例２ 有用な遺伝情報の位置確認をより正確に行うために、Ｃ
ＨＯ細胞で増殖できる組換え体をツクシニアウィルスで
感染し、牛痘ＤＮＡフラグメントで形質移入した後選択
した。

重要な部分の分析に有用な制限フラグメント、即ち、２
種のウィルスの左側末端を第２図に示す。

実施例１に記載された組換えは、該ゲノムのこの部分で
起こるものと予測される。

第１期鶏胚細胞は、ワクシニアウィルス変異体ｔｓＮ（
ドリリアン（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ　）等、１９８２）によ
り、細胞当たり０，１ｐｆｕの割合で感染され、野生株
ワクシニアウィルス（コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａ
ｇｅｎ　）株）のインタクトなりＮＡ及びあらかじめ酵
素ＨｉｎｄｌＩＩで消化された牛痘ＤＮＡ（ブライトン
（Ｂ　ｒｉｇｈｔｏｎ　）株）の混合物で形質移入され
る。ＤＮＡを用いないかワクシニアウィルスのＤＮＡの
みを用いて形質移入を行なった対照が作成される。３９
．５°Ｃで４８時間培養後、細胞を凍結させ、解凍させ
る。こうして遊離したウィルスを、ＣＨＯ細胞の単層上
で滴定し、次に−１戸　　　− １％寒天を含む培地でＣＨＯ細胞をおおう。

牛痘ウィルスＤＮＡで形質移入された細胞由来の試料は
、ＣＨＯ細胞上に多くの溶解プラクを与えるが、対照試
料はそのようなプラクを与えない。

ＣＨＯ細胞上の目視できるプラクを再び個別に取り、プ
ラクの含有するウィルスを、鶏胚細胞上で増幅させる。

次にそのＤＮＡを抽出し、ワクシニア及び牛痘の２種の
関連菌のＤＮＡと比較して分析する。酵素ＥｃｏＲＩで
消化後、ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上の電気
泳動によって１し、次にニトロセルロース膜に移行させ
て、３２ｐで標識させているワクシニアウィルスの５ａ
ＱＩ−にフラグメントとハイブリッド形成させる。

非特異的に結合した放射能を除去するために、ニトロセ
ルロースを洗浄した後、オースラジオグラフを作る。オ
ートラジオグラフ（第３図）は、牛痘ウィルスを組込ん
だワクシニアウィルス組換え体が、ワクシニアウィルス
に特有のＥｃｏＲＩ−１ｃ＋− −Ｃフラグメントを失っており、放射性５ａ９Ｉ−にワ
クシニアウィルスフラグメントを有する。

このフラグメントの大きさは、牛痘ウィルスのＥｃｏＲ
Ｉ−ＡフラグメントとワクシニアウィルスのＥｃｏＲＩ
−Ｃフラグメントの中間である。

この新しい牛痘−ワクシニアハイブリッドＥｃｏＲＩフ
ラグメントは全ての組換え体に存在し、牛痘ウィルスの
ＥｃｏＲＩ−ＡフラグメントとワクシニアウィルスのＥ
ｃｏＲＩ−Ｃフラグメント間の二重組換え（ｄｏｕｂｌ
ｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）に由来し、ＣＨＯ細
胞内増殖に要求される情報を有してなければならない。

この組換えを行うためには、ＣＨＯ細胞での増殖を可能
とする遺伝情報が、ワクシニアウィルスのゲノムの配列
に相同である牛痘ゲノムの配列によりいずれか一方の側
において取り囲まれていることが不可欠であった。

実施例３ スゲツムの領域を有する組替えプラスミドの構築ＣＨＯ
細胞内での増殖を可能とする遺伝情報を単離するため、
実施例２に記載の組換え体の内の１つのＥｃｏＲＩ−Ａ
フラグメントをバクテリアのプラスミドｐＡＴ１５３　
（トウイック（ｔｗｉｇｇ　）及びシエラット（Ｓｈｅ
ｒｒａｔ）　、１９８０）中でクローン化した。

実施例２に記載の組換え体の内の１つのＤＮＡを精製し
、酵素ＥｃｏＲＩで切断する。ＥｃｏＲＩ−Ａフラグメ
ントをアガロースゲルから溶離し、次に、あらかじめＥ
ｃｏＲＩを作用させたプラスミドｐＡＴ１５３に挿入す
る。ＨＢＩＯＩバクテリアをリゲー、ジョン混合物で形
質転換し、次に、得られたコロニーのＤＮＡをニトロセ
ルロース膜上に移し、ワクシニアウィルスの５ａＱＩ−
にフラグメントとハイブリット形成させる。ハイブリダ
イゼーション−ポジティブ（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であるコロニーを増幅し、それ
らが有するプラスミドＤＮＡを精製する。２種のプラス
ミドを得た。即ち、ｐＥＡｌ及びｐＥＡ２であり、ベク
ターｐＡＴ１５３内の２つの反対方向へのＥｃｏＲＩ−
Ａフラグメントの挿入に対応する。

これらプラスミドが、ＣＨＯ細胞上でのウィルスの増殖
を可能にする遺伝情報を有することを確認するために、
プラスミドＤＮＡの挿入物とワクシニアウィルスとの間
で組換えを誘発する。即ち、鶏胚細胞は、ワクシニアウ
ィルスの温度感受性変異体ｔ　ｓＮ７を用い、細胞あた
り０．１ｐｆｕの割合で感染され、次に野生型ワクシニ
アウィルスのＤＮＡ及びプラスミドｐＥＡ１又はｐＥＡ
２のＤＮＡで形質移入する。ワクシニアウィルスのＤＮ
Ａを有さない、或いは、プラスミドを有さない対照も又
作成される。３９．５℃で４８時間培養後、細胞を凍結
させ、解凍する。感染の結果得られたウィルスをＣＨＯ
細胞上で滴定する。ワクシニアウィルスＤＮＡ及びプラ
スミドｐＥＡ１又はｐＥＡ２で形質移入された細胞由来
の試料のもがＣＨＯ細胞上にプラグを形成する。

実施例４ ＣＨＯ細胞内での増殖を可能にする遺伝情報の位置確認
をするため、プラスミドｐＥＡ１のより小さい部分をカ
バーする制限フラグメントを、ワクシニアウィルスのチ
ミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を有するプラスミドｐＴ
Ｇ１８６ｐｏ　１　ｙ内でクローン化した。

ｐＴＧ１８６ｐｏ　１　ｙの構築 ワクシニアウィルス（ＶＶ）のゲノムのＨｉｎｄ■フラ
グメント（Ｈｉｎ−Ｊ）は、ｖＶゲノム内での外来ＤＮ
Ａフラグメントの交換及び組換えを可能にするために以
前に用いられた完全なチミジンキナーゼ（Ｔ　Ｋ）遺伝
子を有する（マケット−２０＝ （Ｍａｃｋｅｔｔ）等、１９８２）。

挿入物をＶＶゲノムのＴＫ遺伝子に移入することにより
ＴＫ−欠失ウィルスを生成し、そのことがその選択を容
易にすることに注目することは重要である。

ＶＶのＨｉｎ−Ｊフラグメントを組み込むのに用いるこ
とができる唯一のＨｉｎｄｕ部位を担う小さいサイズの
プラスミドを作ることがなによりもまず必要であった。

更に、プラスミドの不要な制限部位を、次の操作が実施
できるように、除去する必要があった。

構築はプラスミドｐＭＬ２（ラスキー（Ｌ　ｕｓｋｙ）
及びボッチャン（Ｂｏｔｃｈａｎ）　、１９８１　）を
出発物質とした。該プラスミドはヌクレオチドの１０８
９から２４９１間のセグメントが自然発生的欠失（ｓｐ
ｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ）により失われ
たプラスミドｐＢＲ３２２に由来するベクターである。

最初に、ＰｓｔＩ配列を、ｐＵＣ８（ビオイラ（Ｖｉｏ
ｉｒａ　）及びメシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、１９８
２）のＡｈａｍ−ＡｈａｍフラグメントをｐＭＬ３の２
つのＡｈａｍサイト間に挿入することにより、除去し、
１９塩基対を除いた。

“リンカ−ティリング（ｌｉｎｋｅｒ−ｔａｉｌｉｎｇ
）　”法（ラセ（Ｌ　ａｔｈｅ）等、１９８４）を用い
、本プラスミドの８１で処理されたＮｒｕ　Ｉ及びＥｃ
ｏＲ■サイト間にＨｉｎｄｌｌＩアダプターを挿入し、
ＢａｍＨＩサイトを除いた。これにより、２０４９塩基
対を有し、機能的β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリ
ン耐性を与える）並びに更にイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌ
ｉ）中で活性である複製起点及び唯一のＨｉｎｄｕ制限
サイトを有するプラスミドが得られる。この構築物をｐ
ＴＧＩＨと称した。

ＴＫ遺伝子を有すルＶＶ（７）ＤＮＡ（７）Ｈｉ　ｎ−
ＪフラグメントはｐＡＴ１５３ベクター内でクローン化
された（ドリリアン（ＤｒＮｌｉｅｎ　）及びスペーナ
−（Ｓｐｅｈｎｅｒ）　、１９８３）　ｏこの４．６−
ｋｂフラグメントをｐＴＧＩＨのＨｉｎｄ■サイト中に
再クローン化した。ＴＫ遺伝子がアンピシリン耐性をコ
ードする遺伝子に比較して末端にあるクローンを選択し
た。この構築物をｐＴＧＩＨ−ＴＫと称した。

ｐＴＧＩＨ−ＴＫ構築物を、下記の構築のベクターとし
て用いた。

次の操作は、Ｖｖのプロモーターを単離することであっ
た。該プロモーターは、Ｖｖ内に組み込まれるべき外来
遺伝子の発現を制御するために用いることができるもの
である。７５００ダルトン（７，５Ｋ）蛋白質をコード
する初期遺伝子のためのプロモーターは、同様の目的で
すでに用いられ、好結果を得ている（スミス（Ｓ　ｍ１
ｔｈ）等、１９８３）。これにより、該プロモーターの
単離が行われた。

７．５に遺伝子は、ＷＲ型ＶＶのゲノムの最小５ａＱＩ
フラグメント（ＳａＱ−Ｓフラグメント）の１つに位置
する（ペン力タサン（Ｖ　ｅｎｋａｔａｓａｎ　）等、
１９８１）。小フラグメントが優先的にクローン化され
たため、５ａＱＩで切断したＷＲ型ＶＶのＤＮＡをｐＢ
Ｒ２２２プラスミド中に直接クローン化することにより
得られたクローンの殆んどが５ａＱ−Ｓフラグメントを
有する。このフラグメントをベクターバクテリオファー
ジＭｌ　３ｍｐ７０１　Ｃキー−−−（Ｋｉｅｎｙ）等
、１９８３）上に、５ａＱＩ消化及びリゲーションによ
り移し、ファージＭ１３．ＴＧ、５ａＱ−８を得る。

このクローンにおいて、Ｓｃａ■サイトが、７．５に遺
伝子の開始ＡＴＧに極めて近接して存在している。７．
５に遺伝子の下流に、該ベクター由来の２つの単一なり
ａｍＨＩ及びＥ　ｃ　ｏ　ＲＩサイトがある。該Ｂａｍ
ＨＩ及び５ｃａＩサイトを、イー、コリ　ポリメラーゼ
のクレノーフラグメントでＢａｍＨＩ消化により作られ
た末端中にフィリング（ｆｉｌｌｉｎｇ　）　シた後に
、ＢｇＱ　ＩＩアダプター：　５’−ＣＡＧＡＴＣＴＧ
−３’を用いて融合する。この方法で５ＣａＩサイトは
除去されるが、ＢａｍＨＩ　　サイト　を再構築し単一
な、ＥｃｏＲＩサイトを下流に移動させる。同時に、下
流の５ａＱＩ　（Ａｃｃ　Ｉ）サイトを除去し、従って
、上流のＳｃ９　Ｉサイトが単一となる。この構築物を
Ｍ１３．ＴＧ、７．５にと称する。

ＶＶのＤＮＡのＨｉｎ−Ｊ７ラグメントは、約３０塩基
対により分離されるＣＱａＩ及びＥｃ。

ＲＩサイトを有する（ウイア（Ｗｅｉｒ　）及びモス（
Ｍｏｓｓ　）　、１９８３）、Ｍ１３．ＴＧ、７．５に
中に存在する７、５にプロモーターフラグメントをＡｃ
ｃＩ及びＥｃｏＲＩで切除し、ｐＴＧＩＨ−ＴＫ−Ｐ７
．５Ｋを作るためにｐＴＧＩＨ−ＴＫの（ｌａＩサイト
とＥｃｏＲＩサイトとの間にクローン化する。

この構築において、Ｍ１Ｂベクターの単一なりａｍＨＩ
及びＥＣ０ＲＩサイトが、７．５にプロモーター配列の
すぐ下流に配置される。これらユニークなりａｍＨＩ及
びＥｃｏＲＩサイトを下記の構築に用いる。　バクテリ
オファージＭｌ　３ＴＧ１３１　（キー＝−（Ｋｉｅｎ
ｙ）等、１９８Ｂ）のポリリンカーセグメントをＥｃｏ
Ｒ４及びＢｇＱ■で切除し、プラスミドｐＴＧＩＨ−Ｔ
Ｋ−Ｐ７．５にのＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩサイト間に
挿入し、ｐＴＧ１８６ｐｏ　１　ｙを作る。この構築物
においては、５つの単一な制限サイト（ＰｓｔＩ、Ｂａ
ｍＨＩ、Ｓｓ　ｔ　Ｉ、ＳｍａＩ及びＥｃ。

ＲＩ）をｐ７．５にプロモーターのコントロール下での
外来遺伝子のクローニングに用いることができる。

ｐＥＡｌフラグメントのｐＴＧ１８６ｐｏ　１ｙへの挿
入 プラスミドｐＥＡ１のＥｃｏＲＩＡフラグメントを種々
の酵素で消化し、種々の大きさのフラグメントをｐＴＧ
１８６ｐｏ　Ｉ　Ｙに挿入した。

ｐＴＧ１８６ｐｏ　Ｉ　Ｙ由来で、組換えプラスミドｐ
ＥＡ１のＥｃｏＲＩ−Ａフラグメントの部分を有する組
換えプラスミドを第４図に示す。

プラスミドｐＥＡ１を酵素ＢｇＱＴ１で切断し、数個の
フラグメントを得る。ＢｇＱＩＩフラグメントの内の最
大のものをｐＴＧ１８６ｐｏ　ＩＹベクターのＢａｍＨ
Ｉサイトに挿入し、挿入方向の異なるプラスミドｐＥＡ
５ａ及びｐＥＡ５ｂを得る。

プラスミドｐＥＡ６は、酵素ＰｓｔＩでｐＥＡ５ａを切
断し、次に最大フラグメントを再環化（ｒｅｃｉｒｃｕ
ｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　）　して得られ、これによりｐ
ＥＡ５ａからＢｇＱＩＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉフラグメントが
失われる。

プラスミドｐＥＡ７は、プラスミドｐＥＡ５を酵素ＣＱ
ａＩで切断し、次に得られた大フラグメント牽再環化（
ｒｅｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　）　Ｌ、て得ら
れ、この結果、小フラグメントＣＱａＩが欠失する。

プラスミドｐＥＡ８は、ｐＥＡ６をｓｐｈ　Ｉで−つ７
− 切断し、大フラグメントを再環化して得られ、その結果
右側のＳｐｈＩ−Ｂｇ９ＩＩフラグメントの欠失が起こ
る。

プラスミドｐＥＡ９は、ｐＥＡ５ｂをｓｐｈ　Ｉで切断
し、再すゲーションすることにより得られ、その結果左
側のＳｐｈＩ−ＢｇＱＩＩフラグメントの欠失が起こる
。

プラスミドｐＥＡ３６は、２段階で構築された。

まず小フラグメントＨｐａＩがプラスミドｐＥＡ９から
単離され、これがＭｌＢ−１３０ベクターのＳｍａ　Ｉ
サイトに挿入された。次に、ＨｐａＩフラグメントを、
ＥｃｏＲＩ及びｐｓｔＩサイトを用いて、ＭｌＢ−１３
０ベクターから単離し、ベクターｐＴＧ１８６ｐｏ　１
　ｙのＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩサイトに組み込んだ。

これらプラスミドのそれぞれを、該プラスミドにより保
有されるＴＫ遺遺伝円内存在する挿入片をワクシニアウ
ィルスゲノムに移入するために、実施例３の方法に従っ
て、形質移入試験で用いた。

ワクシニアウィルスに対しＣＨＯ細胞内での増殖能を与
えるプラスミドは、ｐＥＡｌ、２．５ａ１５ｂ１６．９
及び３６である。

上記性質を有する最小フラグメントはプラスミドｐＥＡ
３６により保有される。それは２００４塩基対を有する
。

実施例５ プラスミドｐＥＡ３６により保有され、２つのＨｐａｌ
ルミｌサイト置する牛痘ウィルスＤＮＡは、第５図に示
される手法に従い、ファージＭ１３−１３０及びＭｌＢ
−１３１（キーニー（Ｋｉｅｎｅｙ　）等、１９８３）
に最小フラグメントを挿入した後、ジデオキシヌクレオ
チド法（サンガー（Ｓ　ａｎｇｅｒ　）等、１９８０）
を用いて完全に配列決定した。

７７０００ダルトンの蛋白質をコードすることのできる
リーディングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ　　ｆｒａｍｅ
）は、第５図の地図に示されるようにヌクレオチドＡＴ
Ｇで始まり、ヌクレオチドＴＡＡで終わる。

地図の下にある矢印は、各クローンの読み取り（ｒｅａ
ｄｉｎｇ　）開始点、読み取りの長さ及びその方向を示
す。読み取り開始が制限サイトで開始しない場合、配列
の一部より推察される合成オリゴヌクレオチドからなる
プライマーを用いた。

本発明の遺伝子の完全な配列及び、該遺伝子がコードし
得る７７０００ダルトンの蛋白質の配列を第６図に示す
。

実施例６ 実施例４に記載され、ＣＨＯ細胞内で増殖し得る組換え
ウィルスの内、いくつかはＴＫ＋で他はＴＨ−であるこ
とが観察される。

例えば、プラスミドｐＥＡ９を用いた細胞の形質移入に
おいて、ＣＨＯ細胞での増殖により選択された組換えウ
ィルスの２７のプラクの内、１６はＴＫ−で、１１はＴ
Ｋ十であった。

従って、ＣＨＯ細胞内増殖を可能にする情報を導入する
組換えは、チミジンキナーゼをコードする遺伝子と異な
る領域で起こったのである。

この結果は、ＴＫ遺伝子以外のゲノムの領域への外来遺
伝子の挿入及び選択の可能性を意味し、同時に、ＣＨＯ
細胞上での増殖による選択を意味する。この目的には、
選ばれた遺伝子とＣＨＯ細胞上での成長を可能にする遺
伝子とを並列に並べれば充分である。

ワクシニアウィルスゲノムを用いた相同性組換え（ｈｏ
ｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によ
る、ＣＨＯ細胞での増殖を可能にする遺伝子の挿入は、
外来遺伝子の共組込みを（ｃｏ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏ
ｎ）惹き起こす。

　３１一 本発明の代表的菌株の寄託 プラスミドｐＥＡ３６を有するイー、コリ（Ｅ。

Ｃｏ１１）１１０６株を寄託Ｎｏ、　Ｉ　５９４で１９
８６年９月２日にコレクシオン　ナシオナル　ド　クル
チュール　デ　ミクロオルガニスム （＝　Ｃｌ１ｅｃｔｉｏｎ　　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄ
ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅｓｌｖＨｃｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｍｅｓＳＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
　ｏｆＣｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａ
ｎｉｓｍｓ　）に寄託した。

プラスミドｐＥＡ３６は、ＣＨＯ細胞内でウィルスの増
殖を可能にする２００４ｂｐ牛痘ウイルスＤＮＡフラグ
メントを有する。このＤＮＡフラグメントは、ＣＨＯ細
胞内で増殖しないワクシニアウィルスによる生体内組換
えに用いられる。ＤＮＡプラスミドによる細胞の形質移
入及びワクシニアウィルスによる混合感染（ｃｏ−ｉｎ
ｆｅｃｔｉｏｎ）により、ＣＨＯ細胞内増殖能を有する
ワクシニアウィルスの組換え体を選択することが可能で
ある。

参考文献 ０ドリリアン、アール（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ　、　　Ｒｏ
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イアロロジ−（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　）　、
４５．６８３．７０１．１９７９ ０マケットエム、　　（Ｍａｃｋｅｔｔ、　Ｍ、　）　
、スミス。

ジー、エル、　　（Ｓｍｉｔｈ、　　Ｇ、　　Ｌ、　）
及びモス。

ビー（Ｍｏｓｓ　、　　Ｂ、　）　、プロシーディング
スオン　ザ　ナショナル　アカデミ−オン　サイエンス
　オン　ザ　ユナイティッド　ステイツ　オン　アメリ
カ（Ｐ、Ｎ、　Ａ、　Ｓ。

（ＵＳＡ））　、７９．７４１５−７４１９．１０マニ
アティス、ティ（Ｍａｎｉａｔｉｓ　、　Ｔ、　）　、
フリッシュ、イー、エフ、　　（Ｆｒｉｔｓｃｈ、　　
Ｅ、　　Ｆ、　）及びサンプルツク、ジェイ（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ　、　　Ｊ、　）、“モレキュラー　クローニ
ング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｉｎｇ）　　ニア　
ラボラトリ−マニュアル（Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｍａｎｕａｌ　）”コールド　スプリング　ハーバ−
ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ　）　、：７−ルドスプリング　
ハーバ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓ　ｐｒｉｎｇＨａｒｂＯｒ）
、ニューヨーク（Ｎ、Ｙ、）　、１９０モス、ビー（Ｍ
ｏｓｓ　、　Ｂ、）、′ヴイアｏｏジー　（Ｖｉｒａｌ
ｏｇｙ　）”　（ビー、エフ、フィールズ（Ｂ、Ｎ、　
Ｆｉｅｌｄｓ　）編）　、ＰＰ、６８５−７０３、ラヴ
エン　プレス（Ｒａｖｅｎ　　Ｐ　ｒｅｓｓ）、ニュー
ヨーク（Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　）０パニカリ、ディ（Ｐ
ａｎｉｃａｌｉ　、　Ｄ、　）及びパオレツテイ、イー
、　　（Ｐａｏｌｅｔｔｉ　、　Ｅ、　）　、Ｐ。

Ｎ、Ａ、Ｓ、　　（ＵＳＡ）　、７９．４９２７−４９
３１．１９８２ 〇パニカリ、ディ（Ｐａｎｉｃａｌｉ　、　Ｄ、　）　
、ディヴイス、ニス、ダヴリ：ｙ−（Ｄａｖｌｓ、　　
Ｓ、　Ｗ、　）、ワインバーグ、アール、エル、（Ｗｅ
ｉｎｂｅｒｇ　。

Ｒ，Ｌ、　）及びパオレッティ、イー、　　（Ｐａｏｌ
ｅｔｔｉ　、Ｅ、）　、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　　（ＵＳＡ
）、８０．５３６４−５３６８．１９８３ ０サンガー、エフ、エフ、　　（Ｓａｎｇｅｒ　、　　
Ｆ、Ｓ、）、ニックレン、ニス、　　（Ｎｉｃｋｌｅｎ
、　　Ｓ、　）及びコンルソン、ニー、アール、　　（
Ｃｏｎｌｓｏｎ、　Ａ。

Ｒ，）　、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　　（ＵＳＡ）　、７４．
５４６Ｂ−５４６７，１９７７ ０スミス、ジー、エル、　　（Ｓｍｉｔｈ、　　Ｇ、　
　Ｌ、　）、マケット、エム、（Ｍａｃｋｅｔｔ、　Ｍ
、　）及びモス。

ビー（Ｍｏｓｓ　、　　Ｂ、　）　、ネイチ＋　−（Ｎ
ａｔｕｒｅ　）、３０２．４９Ｃ１−４９５，１９８３
０スミス、ジー、エル、　　（Ｓｍｉｔｈ、　　Ｇ、　
　Ｌ、　）、マーフィ、ビー、アール、　　（Ｍｕｒｐ
ｈｙ　、　　Ｂ、　Ｒ。

）及びモス、ビー（Ｍｏｓｓ　、　　Ｂ、　）　、Ｐ、
Ｎ。

＝　　３６　− Ａ、　　Ｓ、　　（ＵＳＡ）　　、８０．７１５５−７
１５９．１９８３ ０トウィッグ、ニー、ジェー（Ｔｗｉｇｇ、　　Ａ、　
　Ｊ、　）及びシエラット、ディ（Ｓｈｅｒｒａｔｔ　
、　Ｄ、　）、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ　）、２８
３．２１６−２１８．１９８ｂ ○ヴエンカタサン、ニス、　　（Ｖｅｎｋａｔａｓａｎ
　、　　Ｓ、　）、バラウディ、ビー、エム、　　（Ｂ
　ａｒｏｕｄｙ、　　Ｂ　。

Ｍ、　）及びモス、ビー（Ｍｏｓｓ　、Ｂ、　）　、セ
ル（Ｃｅｌｌ　　）　　、２５．８０５−８１３．１９
８１０ヴイアラ（Ｖ　１ｅｒａ）及びメシング（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ）、ジーン（Ｇｅｎｅ　）　、１９．２５９−
２６８．１０ウィア、ジエイ、ピー、　　（Ｗｉｅｒ　
、　　Ｊ、　　Ｐ、　）及びモス、ビー、　　（Ｍｏｓ
ｓ　、　　Ｂ、　）　、ジャーナル　オン　ヴイアロロ
ジ−（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　）、４６．５３０−５３４
．１９８３ 図面の簡単な説明 第１図：ワクシニアウィルス及び牛痘ウィルス間の組換
え体のＤＮＡの制限地図。

」二部の４本の横線は、酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びｘｈｏ
Ｉで切断後得られたワクシニアウィルス（ＶＶ）及び牛
痘ウィルス（ＣＰ）の制限地図を示す。その下の１０本
の横線は、実施例１に従って単離されたＶＶ及びＣＰ間
の組換え体ゲノムを示す。矢印で示された制限サイトは
牛痘ゲノムに特有のものであり、縦線で示された制限サ
イトはワクシニアウィルスに特有のものである。これら
２種のゲノムに共通のサイトは明示していない。破線は
、測定の未確定領域を示す。

第２図：酵素ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ■及び５ａＱＩで切
断後のワクシニアウィルス（ＶＶ）及び牛痘ウィルス（
ｃ　ｐ）の左末端の制限地図。

フラグメントは、慣用の方法に従って、大きさが減少す
る順にＡＢＣ・・・と印されている。

第３図：ワクシニアウィルス及び牛痘ウィルス間の組換
え体のＤＮＡの制限プロフィールの特徴付け。

ワクシニアウィルス（ＶＶ）のＤＮＡ５牛痘ウイルス（
ＣＰ）のＤＮＡ並びに４種の組換え体ｒｅｃ２、ｒｅｃ
３、ｒｅｃ４及びｒｅｃ６のＤＮＡは、実施例２に従っ
て単離され、３Ｈ−チミジンの存在下に感染された鶏胚
細胞より作られた。

図中のＡ部分は、ＥｃｏＲＩによるＤＮＡの消化、フラ
グメントのアガロースゲル分離及び１５日間の露出時間
に亘るドライゲル（ｄｒｙ　　ｇｅｌ）のオートラジオ
グラフィ後に得られたフラグメントのオートラジオグラ
フを示す。Ｂ部分において、Ａと同様に処理されたＤＮ
Ａを、ニトロセルロース」二に移し、プラスミドｐＡＴ
１５３により担われる５ａ（１！Ｉ−にプローブとハイ
ブリッド形成された。

第４図二ベクターｐＴＧ１８６ｐｏ　１　ｙに組込まれ
たプラスミドｐ’ＥＡ１のＥｃｏＲＩ−Ａフラー　　　
：５　ソ　　　− グメントの部分を有する組換えプラスミド。

上部の２本の横線は、酵素ＥｃｏＲＩの制限部位を持ち
ワクシニアウィルス及び牛痘ウィルスのＤＮＡの左末端
を示す。３木目の線は、連続線で示したＥｃｏＲＩ−Ａ
フラグメント及び破線で示したプラスミドｐＡＴ１５３
を有するプラスミドｐＥＡ１の直線表示である。

下の線は、連続線で示されるｐＥＡ１由来のフラグメン
トと破線で示されるベクターｐＴＧ１８６ｐｏｌｙ由来
のフラグメントとを有する種々の組換えプラスミドの直
線表示である。７．５に遺伝子プロモーターは、転写方
向を指す白ぬき矢印により示される。

制限サイトは下記の文字で示される。

Ｂ　　　ＢｇＱＩＩ ＣＣＱａＩ Ｅ　　　　ＥｃｏＲＩ ＨＨｐａＩ Ｐ　　　　　ＰｓｔＩ Ｓ　　　　ＳａＱ　Ｉ ｓｐ　　　５ｐｈＩ Ｘ　　　　ＸｈｏＩ 第５図：　ＣＨＯ細胞内増殖を可能にする遺伝子の配列
決定法。

太い横線は、２つのＨｐａＩサイト（Ｈｌ）間に含めら
れた配列決定されたＤＮＡフラグメントを示す。他の制
限サイトはＳ　（Ｓａｕ３Ａ）　、Ｈ２（Ｈｐａ２）　
、Ｘ　（Ｘｈｏ　Ｉ）　、Ｃ（ＣＱａ　Ｉ）及びＸｂ（
ＸｂａＩ）で示される。８００００ダルトンの蛋白質を
コードできるリーディングフレームは、地図に示される
如く、ヌクレオチドＡＴＧで開始し、ＴＡＡで終了する
。地図の下の矢印は、各クローンの読取り（ｒｅａｄｉ
ｈｇ　）を開始する地点、読取りの長さ及びその方向性
を示す。

第６図：　ＣＨＯ細胞における増殖を可能にする遺伝子
の配列。

（以　　　−１−） ＴＴ６　ＧＴＡ　［ｉＡＡ　ＣＡＴ　［ｉ６Ａ　ＴＴＴ
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　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　ｌｉｅ　　Ｔｉｅ　　！／ａＬ
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ＡＳｎ　Ｐｒｏ　６１ｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔ
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Ｔπ３ＴＴＡＡＣ 手続補正書動式） ％式％ ２　発明の名称 ＤＮＡ配列、ベクター、組換えウィルス及びＣＨＯ細胞
において増殖可能な組換え事件との関係　　特許出願人 トランスジーン　ソシエテ　アノニム ４代理人 大阪市東区平野町２の１０　沢の鶴ビル昭和６２年１２
月２２日 ６　補正の対象 図　　　面 ７　補正の内容

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）特に牛痘ウイルスから単離され、ＣＨＯ細胞（チ
   ャイニーズハムスター卵巣細胞）における該ウイルスの
   増殖に関与し、第６図に示される配列又は機能的にそれ
   と均等な配列の全てもしくは一部を含む、ＤＮＡ配列。
2. （２）ＣＨＯ細胞内での発現を可能とする独自のコント
   ロールシグナルを更に含む、特許請求の範囲第１項に記
   載のＤＮＡ配列。
3. （３）ワクシニアウイルスの細胞内増殖中の相同性組換
   え過程に係わることができる該ウイルスの領域に相同性
   を有する領域を少なくとも１つ含む特許請求の範囲第１
   項又は第２項に記載のＤＮＡ配列。
4. （４）更に産業上有用な蛋白質をコードする遺伝子を含
   む特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の
   ＤＮＡ配列。
5. （５）産業上有用な蛋白質をコードする遺伝子が、ＣＨ
   Ｏ細胞におけるその発現を可能とするポックスウイルス
   コントロールシグナルの下に、置かれている特許請求の
   範囲第４項に記載のＤＮＡ配列。
6. （６）配列の末端が、組換えを可能とするワクシニアウ
   イルスの領域に相同性を有する領域を含む、特許請求の
   範囲第４項又は第５項に記載のＤＮＡ配列。
7. （７）特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記
   載のＤＮＡ配列を有するプラスミドベクター。
8. （８）特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記
   載のＤＮＡ配列を有する組換えワクシニアウイルス。
9. （９）特許請求の範囲第８項に記載の組換えワクシニア
   ウイルスで感染されたＣＨＯ細胞。
10. （１０）産業上有用な蛋白質をコードする遺伝子を含む
    組換えワクシニアウイルスで感染された特許請求の範囲
    第９項に記載のＣＨＯ細胞であって、該遺伝子がＣＨＯ
    細胞において発現を可能とする要素のコントロール下に
    あるＣＨＯ細胞を培養することを特徴とする産業上有用
    な蛋白質の製造方法。
11. （１１）特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに
    記載のＤＮＡ配列を組み込んだ形質転換されたＣＨＯ細
    胞。
12. （１２）ワクシニアウイルスの増殖を可能にする特許請
    求の範囲第１１項に記載のＣＨＯ細胞。