JPH04504357A - ワクシニアベクター、ワクシニア遺伝子およびその発現産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組換えワクシニアウィルスベクターに関する。特に、本発明は該ウィル スの弱毒化、潜在的に増加された該ウィルスの免疫原性、該ウィルス中への異種 遺伝子配列の挿入のための部位の提供、およびそれにより提供される組換えウィ ルスベクターの利用に関する。更に、ワクシニア遺伝子の発現産物であるタンパ ク質にも関する。

従来技術の記載 天然痘に対して免疫し撲滅するためのワクチンとして生存ワクシニアウィルスが 使用された。ワクシニアウィルスはポックスウィルス科の基本型メンバーであり 、従って広く研究されている。それは宿主細胞の細胞質中で複製する大きいＤＮ Ａ含有ウィルスである。約１８５．０００塩基対の直線状二本鎖ゲノムは少なく とも２００種のタンパク質をコードする可能性を有する（Ｍｏｓｓ、Ｂ、　（１ ９８５）　Ｂ、Ｎ、Ｆｉｅｌｄｓ、　Ｄ、Ｍ、Ｋｎｉｐｅ、　Ｊ、Ｌ。

Ｍｅｌｎｉｃｋ、　Ｒ，Ｍ、Ｃｈａｎｎｏｃｋ、　Ｂ、Ｒ，Ｒｏｉｚｍａｎおよ びＲ，Ｅ、　５ｈａｐｅ　１７！。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、 ６８５−７０４　）　、細胞質部位での複製は、ワクシニアウィルスがＤＮＡ合 成に必要な多数の酵素とタンパク質因子をコニドすることを必要とする。

分子遺伝学の進歩は、他の生物体由来の遺伝子を含みそれを発現する組換えワク シニアウィルスの作製を可能にした〔概説については、Ｍａｃｋｅｔｔ、Ｍ、　 ＆　Ｓｍ１ｔｈ、Ｇ、Ｌ、　（１９８６）、　Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ｖｉｒｏｌ、、　６７、２０６７−２０８２を参照のこと〕。組換えウィルスは それらの感染力を保持しており、ウィルスの通常の複製周期中に１または複数の 外来遺伝子を発現する。組換えウィルスでの動物の免疫処置は°、ワクシニアウ ィルスにより発現されるタンパク質（外来遺伝子により発現されるタンパク質を 含む）に対する特異的免疫応答を引き起こし、そして幾つかの場合には、外来遺 伝子が由来する病原性生物に対する保護を付与した。

従って、組換えワクシニアウィルスは、ヒトまたはを椎動物医学において新規生 ワクチンとしての潜在的用途を有する。

このタイプの新規ワクチンの利点としては、ワクチン製造および投与が低費用で あること（ウィルスが自己複製するため）体液性と細胞性の両方の免疫応答の誘 導、冷蔵なしてのウィルスワクチンの安定性、および異なる生物体からワクシニ アウィルス中に多数の外来遺伝子を挿入して多数の病原体に対して有効な多価ワ クチンを作製できる実用性が挙げられる。

このアプローチの欠点は、稀にワクチン関連の合併症を引き起こすと認識されて いるウィルスワクチンの再利用である。

本出願人らは、ウィルスゲノムから削除することができる不明の遺伝子配列を同 定した。本出願人らは、それらの１または複数の遺伝子配列の全部もしくは部分 をウィルスゲノムから削除し、（ｉ）ウィルスの一層９弱毒化；および／または （ｉｉ）組換えワクシニアウィルスの免疫原性の増強：および／または（ｉｉｉ ）更に外来ＤＮＡを該ウィルス中に含めることができるような遺伝子配列挿入部 位の提供を可能にし得ることを提案する。しかしながら、該遺伝子配列がウィル スの複製にとって不可欠である場合には、ウィルス複製に機能的にタンパク質を 維持したまま病原性に影響を及ぼすタンパク質機能が不利な影響を受け°るよう に、遺伝子生産物を変更する（例えば遺伝子レベルでの操作により）ことにより 、ウィルスの弱毒化を行うことができる。

発明の要約 本発明の１観点によれば、ａ）次の１または複数のヌクレオチド配列の全部もし くは部分がウィルスゲノムから削除されており：そして／またはｂ）１または複 数の前記ヌクレオチド配列が突然変異または外来ＤＮＡの挿入により不活性化さ れており；そして／またはＣ）前記ヌクレオチド配列によりコードされるタンパ ク質生成物の機能を変えるために１または複数の前記ヌクレオチド配列が変更さ れており；ここで前記ヌクレオチド配列が、本明細書中でｉ）　Ｓａｌ　Ｆ　３ Ｒ，ｉｉ）　Ｓａｌ　Ｆ　９Ｒ。

１ｉｉ）　Ｓａｌ　Ｆ　１３Ｒ，ｉｖ）　Ｂ５Ｒ，ｖ）　Ｓａｌ　Ｆ　１５Ｒと 命名された配列である、ワクシニアウィルスベクターが提供される。

１または複数の異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列がウィルスゲノム中に 組み込まれてもよい。異種ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ウィルスゲノム からの１または複数の削除により生じた１または複尊の連結部位に挿入すること もできる。

本発明の組換えワクシニアウィルスは、増強された免疫原性の潜在能力を有する 。これは、免疫抑制を引き起こすワクシニア遺伝子（例えば補体相同体およびヒ トｒｇＥのＦｃＲ）の削除かまたは免疫応答を増強する遺伝子の挿入（例えばワ クシニアウィルス中で真正のＣＤ２３遺伝子を発現させる）のいずれかに起因し 得る。

従って、本発明は、ａ）免疫抑制を引き起こす１または複数のワクシニアヌクレ オチド配列の部分もしくは全部がウィルスゲノムから削除されており：そして／ またはｂ）１または複数の前記ヌクレオチド配列が突然変異または外来ＤＮＡの 挿入により不活性化されており；そして／またはＣ）前記ヌクレオチド配列によ りコードされるタンパク質生成物の機能を変えるために１または複数の前記ヌク レオチド配列が変更されており；ここで前記ヌクレオチド配列が、本明細書中で ｊ）ＳａｌＦ　３Ｒ，ｉｉ）　Ｓａｌ　Ｆ　９Ｒ，１ｉｉ）　Ｓａｌ　Ｆ　１３ Ｒ，、ｉｖ）　Ｂ５Ｒ，ｖ）　Ｓａｌ　Ｆ１５Ｒと命名された配列である、ワク シニアウィルスを提供する：。

特にワクシニアヌクレオチド配列は、Ｓａｌ　Ｆ　３Ｒと命名された配列である ことができる。

ワクシニアウィルスが免疫応答を増強する異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ 配列を含んで成る場合、該ＤＮＡ配列はＣＤ２３をコードすることができる。

本発明の組換えワクシニアベクターは、ウィルスゲノム中に連結されたＤＮＡ配 列によりコードされる異種ペプチドに対する特異性を有するモノクローナルもし くはポリクローナル抗体またはＴ細胞の生産のための免疫原として用いることが できる。本発明は、提供される組換えワクシニアウィルスベクターを使用して得 られるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清および／またはＴ細胞 も提供する。本発明の組換えウィルスベクターを使用して生産された抗体は、診 断試験および診断方法、例えば臨床試料中の抗原を検出する際に使用することが でき；それらは、受動免疫のための投与に治療的にまたは予防的に使用すること もできる。提供される組換えワクシニアウィルスベクターを使用して得られるモ ノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清および／またはＴ細胞を含んで 成る診断試験キットも提供される。

更に、本発明の組換えワクシニアウィルスを含んで成るワクチンおよび医薬も提 供される。それらは、指摘した理由で現存のワクシニアウィルス株よりも増強さ れた安全性と免疫原性を有するだろう。

本発明の別の観点によれば、上記で定義したものから選択されたヌクレオチド配 列によりコードされるポリペプチド並びに前記ポリペプチドの対立因子および変 異体が提供される。

前記ポリペプチド、それらの対立因子または変異体は、ＤＮＡリガーゼとしての 活性を有するＳａｌ　Ｆ　３Ｒと命名されたヌクレオチド配列によりコードされ 得る。

本発明は、ワクシニアウィルスを弱毒化する方法であって、ａ）１または複数の 下記ヌクレオチド配列の全部もしくは部分をウィルスゲノムから削除し；そ（て ／またはｂ）前記ヌクレオチド配列の突然変異または外来ＤＮＡの挿入により、 １または複数の前記ヌクレオチド配列を不活性化し：そして／またはＣ）前記ヌ クレオチド配列によりフードされるタンパク質生成物の機能を変更するために１ または複数の前記ヌクレオチド配列を変更することを含んで成り、ここで前記ヌ クレオチド配列がｉ）　Ｓａｌ　Ｆ　３Ｒ，ｉｉ）　Ｓａｌ　Ｆ　９Ｒ，１ｉｉ ）　Ｓａｌ　Ｆ　１３Ｒ。

ｉｖ）　Ｂ５Ｒ，ｖ）　Ｓａｌ　Ｆ　１５Ｒと命名された配列である方法も提供 する。

本発明は更に、本明細書中に定義したようなワクシニアウィルスベクターを使用 することを含んで成る、ワクチンまたは医薬の調製方法も提供する。

本発明は、ＤＮＡリガーゼとしての活性を有するポリペプチドの同定における、 Ｓａｔ　Ｆ　１３Ｒと命名されたヌクレオチド配列の全部もしくは部分または前 記ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の全部もしくは部分の利用 を提供する。更に、図】ｌのアミノ酸配列７６２５〜９２８０　（７６２５と９ ２８０を含む）により表されるポリペプチド、またはそれの対立因子もしくは変 異体は、組換え技術のＤＮＡ操作において酵素として用いることができる。

図面の簡単な説明 本発明をより明確に理解するために、図面を参照しながら、同定した遺伝子配列 を更に詳細に記載する。

図１は、ワクシニアウィルスゲノム内のＤＮＡリガーゼ遺伝子の位置および転写 方向を示す？　Ａ、　ワクシニアウィルスＨｉｎｄｌＩ［制限地図。Ｂ、　１３ ．４　ｋｂ　５ａｌＴ　Ｆ制限断片が拡大サレ、そしてＥｃｏＲＩ（Ｅ）、　Ｓ ｍａｌ（Ｓ）制限部位の位置が示されている。

Ｃ，３３００ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｓｍａｌ断片が拡大され、ＤＮＡリガーゼ遺伝 子の位置（矢印）並びにＥｃｏＲＩ（Ｅ）、　Ｃ１ａｌ（Ｃ）、　Ｂｅ１ｌ（Ｂ ｅ）。

Ｂｇｌ　ＩＩ（Ｂ）およびＳｍａｒ（Ｓ）制限部位の位置が示されている。

図２は、ワクシニアウィルスゲノム内のチミジレートキナーゼ遺伝子の位置およ −び転写方向を示す。Ａ、　Ｈｉｎｄｌ［制限地図。Ｂ、黒ぬりの箱として示さ れたＳａｌ　Ｆ　１３Ｒ（ＯＲＦ１３）の位置を有する拡大された１３．４　ｋ ｂ　５ａｌｔ　Ｆ断片。Ｃ９示された０ＲＦ１３の位置および転写方向を育する 拡大された２、４　ｋｂ　Ｄｒａｌ断片。スケールはこの断片を参考にする。Ｂ とＣの中の記号は制限酵素部位を示す：　ＥｃｏＲＩ（Ｅ）、　Ｄｒａｌ（Ｄ） 、　Ｂａｒｎｆ（Ｉ（Ｂ）およびＢｃｌｌ（Ｂｅ）。

図３は、１３．４　ｋｂ　ＳａＨＦ断片の１７７６ヌクレオチド領域のヌクレオ チド配列を示す。５５２アミノ酸転写解読枠の推定配列が示される。この転写解 読枠をＳａｌ　Ｆ　１５Ｒと命名する。

図４は、ワクシニアウィルス５ａｌｌＦ断片のｓｏｏ　ｂｐ領領域ヌクレオチド 配列を示す。Ｓａｌ　Ｆ　１３Ｒと命名された２２７アミノ酸転写解読枠の推定 アミノ酸配列が示される。上行および下行の数字は、それぞれ、ＯＲＦの始まり からのアミノ酸またはＤＮＡ断片の始まりからのヌクレオチドを指す。下線が引 かれたヌクレオチドは可能な初期転写終結配列を表し、そして星印はＳｌヌクレ アーゼ保護により決定された初期ｍＲＮＡの５′末端を表す。

図５は、Ｓａｌ　Ｆ　３Ｒ遺伝子のヌクレオチド配列とナミノ酸配列を示す。

図６は、遺伝子Ｓａｌ　Ｆ　３Ｒ己よりコード基れるタンパク質と、ｉ）　Ｉｇ Ｈに対するヒト低親和性Ｐｃレセプター［ｈｕＰｃＲ（ＩｇＢ）］　；ン（ＬＥ Ｃ）との間のアミノ酸配列相同性を示す。　゛図７は、ウィルスゲノム力）らの Ｓａｌ　Ｆ　３Ｒの削除のためのプラスミドｐＳＡＤ３Ｇの作製を示す。

図８は、ウィルスｖＳＡＤ３のサザンプロット分析を示す。精製したＷＴまたは ｖＳＡＤ３ウィルスからウィルスＤＮＡを抽出し、そして５ｐｅｌで消化した。

ＤＮＡ断片をアガロースゲル上で分離し、ニトロセルロース上に移行させ、ＥＣ Ｏｇｐｔ遺伝子からの放射能標識ＤＮＡ断片を用いて探査した。予想通り７ｋｂ のバンドが存在し、ＷＴウィルスからのＤＮＡとのハイブリダイゼーションは全 く起こらない。

図９は、偽感染細胞（レーン１）または感染後初期（レーン３）もしくは後期（ レーン２）のＷＴウィルス感染細胞からのｍＲＮＡのノーザンプロットを示す。

ＲＮＡをアガロースゲル上で分離し、ニトロセルロース上に移行させ、そしてＳ ａｌ　Ｆ　３Ｒ転写解読枠のみに相補的な一本鎖の放射能標識ＤＮＡ断片を用い て探査した。

図１Ｏは、Ｓａｌ　Ｆ　９Ｒ遺伝子のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。

図１１は、Ｓａｌ　Ｆ　９Ｒ遺伝子（Ｓａｉｌ　Ｆ　０ＲＦ９＞によりコードさ れるタンパク質と、ｉ）ウシ：およびｊｉ）ヒトのスーパーオキシドジスムター ゼ（ＳＯＤ）　（Ｃｕ−Ｚｎ）タンパク質との間のアミノ酸配列相同性を示す。

図１２は、Ｓａｌ　Ｆ　１３Ｒ遺伝子によりコードされるタンパク質と酵母チミ ジレートキナーゼ（ＴｍｐＫ）との間のアミノ酸配列相同性を示す。

図１３は、ワクシニアウィルスＳａｌ　Ｆ　１３Ｒ（Ｗ）およびサツカロミセス ・セレビシェ’　−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　 （ＳＣ）ＴｎｉｐＫの整列アミノ酸配列を示す。同一アミノ酸残基が枠で囲まれ ている。整列配列の上または下の数字は、それぞれｖｖまたはＳＣのアミノ酸位 置を指す。

図１４は、Ａ、ワクシニア（ＶＶ）およびサツカロミセス・セレビシェ−（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　（ＳＣ）のＴｍｐＫ、　Ｈ ＳＶＴＫ／ＴｍｐＫ並びにヒトおよびＶＶ　ＴＫの予想ＡＴＰ結合部位について の整列アミノ酸配列を示す。５配列全てに同じである残基が枠で囲まれている。

数字は、アミノ末端と示した領域との間のアミノ酸の数を指す。Ｂ、ワクシニア ウィルス（ＶＶ）まれだ、ヌクレオシド／ヌクレオチド結合に関与するＨ３Ｖ　 ＴＫ／ＴｍｐＫの領域のアミノ酸配列。それらの配列の２つまたは全部において 保存されたアミノ酸が枠で囲まれている。

図１５は、チミジレートキナーゼが活動するｄＴＴＰ合成の生化学経路を示す。

図１６は、プラスミドｐＡｃＶ１　とｐＡＣＶ２の作製を示す。

図１７は、ウィルスｖＡＣＨＢおよびｖＡＣ１のサザンプロット分析を示す。精 製ＷＴ、　ｖＡｃｌまたはｖＡＣＨＢウィルスからウィルスＤＮＡを抽出し、そ して５ａｌｌで消化した。ＤＮＡ断片をアガロースゲル上で分離し、ニトロセル ロース上に移行させ、そして完全にＴｍｐＫ遺伝子内部からの放射能標識ＤＮＡ 断片を用いて探査した。５ａｌＩ消化はＷＴウィルスでは１３゜４　ｋｂバンド を与えるが、組換えＶＡＣＨＢまたはＶＡＣＩウィルスでは８．８と６．７ｋｂ のバンドを与える（ＥＣＯｇｐｔカセットの３′末端に導入された余分な５ｉｉ １部位のため）。

図１８は、Ｂ５Ｒ遺伝子のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。

図１９は、Ｂ５Ｒ遺伝子によりコードされるタンパク質と、ｉ）第Ｘ■凝固因子 のＢ鎖（Ｆ１３　Ｂ）　；　１ｉｉ）補体因子Ｈ前駆体（ＣＦＡＨ）　；１ｉｉ ）補体Ｃ２前駆体（ＣＯ２）　；およびｉｖ）補体Ｃ４Ｂ結合タンパク質前駆体 （Ｃ４ＢＰ）との間のアミノ酸配列相同性を示す。

図２０は、Ｂ５Ｒ（Ｓａｌｔ　Ｇ　０ＲＦＩＯ）およびＨ３Ｃ２８にタンパク質 の疎水性分布を示す。

図２１は、感染中の初期（Ｅ）または後期（Ｌ）のウィルス感染細胞からのｍＲ ＮＡのノーザンプロットを示す。ＲＮＡをアガロースゲル上で分離し、ニトロセ ルロース上に移行させ、そしてＢ５Ｒ遺伝子のみに相補的な一本鎖の放射能標識 ＤＮＡ断片を用いて探査した。分子量サイズマーカーの位置はｋｂで示される。

図２２は、プログラムＭＵＬＴＡＬＩＧＩＮを使って作成した５ａｌ−Ｆ　１５ Ｒ遺伝子によりコードされるワクシニアウィルス（ＶＶ）タンパク質とＳ、ボン ベ（Ｓ、　ｐｏｍｂｅ）　（ｓｐ）おネびＳ、セレビシェ−（Ｓ、　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ　）　（ｓｃ）からの酵母ＤＮＡリガーゼノアミノ酸配列配列間のア ミノ酸配列相同性を示す。

図２３は、ワクシニアウィルスＤＮＡリガーゼタンパク質ノ同定を示す。Ｋｅｒ ｒおよびＳｍ１ｔｈにより記載されたような１００ｍＭＮａＣ１緩衝液中でのＤ ｏｕｎｃｅホモジナイゼーションにより、偽感染またはワクシニア感染された（ １００　ｐｆｕ／細胞）　ＣＶＩ細胞から粗抽出物を調製した。初期（レーン２ ）、後期（レーン３）にワクシニアウィルス感染されたまたは偽感染された（レ ーン３）　ＣＶＩ細胞抽出物、および精製した子ウシ胸腺ＤＮＡリガーゼＩ　（ Ｔ、Ｌｉｎｄａｈｌから寄贈）（レーン５）をａ　−（”Ｐ）Ａ　Ｔ　Ｐ　Ｑ（ ｅｔｈｏｄｓ）と共にインキュベートした。トリクロロ酢リベブチドを１２．５ ％ゲル上での５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

図２４は、６１　ｋＤポリペプチドがＤＮＡリガーゼであることを示す。感染後 後期（１５時間）にワクシニアウィルス感染細胞から部分精製したＤＮＡリガー ゼ調製物をα−Ｃ″Ｐ）ＡＴＰで標識した（レーン３）。平行して、子ウシ胸腺 ＤＮＡリガーゼ（Ｔ、Ｌｉｎｄａｈｌ、　ＩＣＲＦから寄贈）（レーンｌ）およ びバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａ ｔ＋ｓ）　（レーン２）の調製物を標識した。ワクシニア試料を４部分に等分し た。１部分は更なる操作なしで分析しくレーン３）、そして残りは５ｅｐｈａｄ ｅｘ−Ｇ２５を使用すること以外は（２５）に記載したようにしてカラムを通し て遠心し取り込まれなかったＡＴＰを除去した。排除容積を３部分に等分し、添 加なしくレーン４）、冷却ポリ（φＡ）：オリゴ（ｄＴ）　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ 基質（レーン５）または１００μＭビロリン酸ナトリウム（レーン６）のいずれ かと共に３７℃で３０分間インキュベートした。生成物を図１と同様に分析した 。

図２５は、ワクシニアウィルス感染細胞中のＤＮＡリガーゼ活性を示す。感染後 初期（３時間）、後期（１７時間）のワクシニアウィルス感染されたまたは偽感 染されたｃｖ−ｉ細胞からの粗抽出物をＤＮＡリガーゼ活性についてアッセイし た（ＫｅｒｒおよびＳｎ＋ｉｔｈ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　 １７．９０３９（１９８９））。

３０マーの（”Ｐ）オリゴｄＴ：ボリｄＡ基質がレーンｌに示され、これがモノ マーｎ＝１に相当する。４単位（レーン２）、０．４単位（レーン３）および０ ．０４単位（レーン４）のバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅ ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を平行してアッセイし、マーカーを提供した（ ｎ＝２．　ｎ＝３゜ｎ＝４）ｃ＋　レーン５，６および７は、それぞれ、Ｄｏｕ ｎｃｅホモジナイゼーションとＩＯＫでの２０分間の遠心後の初期、偽および後 期試料からの上溝分画を表す。レーン８．９および１０は、初期、偽および後期 試料からのベレット分画である。乾燥したゲルのオートラジオグラフを示す。

図２６は、Ａ：ワクシニアウィルス感染細胞からの（”Ｓ）−メチオニン標識ポ リペプチドの免疫沈澱を示す。ワクシニアウィルス（３０ｐｆｕ／細胞）により 感染または偽感染させたＴＫ細胞を感染後１．５〜４時間目に（”Ｓ）−メチオ ニンで標識した。細胞抽出物を調製し、そしてｐＥＸ　ＬＩＧ抗血清で免疫沈澱 させた（ＫｅｒｒおよびＳｍ１ｔｈ　１９８９）。レーン１は未感染細胞ヲ表し 、レーン２はワクシニアウィルス感染細胞を表す。

分子量マーカーがゲルの右側に示されている。Ｂ：（”Ｓ）−メチオニンおよび α−（”Ｐ）−ＡＴＰ標識タンパク質の同時移動を示す。項目Ａに記載したよう にしてｐＥＸ　ＬＩＧ抗血清で免疫沈澱させた、ワクシニアウィルス感染細胞か らの（”Ｐ）−標識ＤＮＡリガーゼ−ＡＭＰ付加物（レーン１）およびワクシニ アウィルス感染（レーン２）または偽感染（レーン３）細胞のい゛ずれかからの 感染後２．５〜６時間目に（”Ｓ）−メチオニンで標識した細胞抽出物を、１２ ．５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。

図２７は、標識ワクシニアウィルスＤＮＡリガーゼの免疫沈澱を示す。子ウシ胸 腺ＤＮＡリガーゼ（レーン１）、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（レー ン２）およびワクシニアウィルス感染細胞からのホスホセルロースカラム分画（ レーン３）をα−（”Ｐ）　−ＡＴＰと共にインキュベートした（Ｋｅｒｒおよ びＳｍ１ｔｈ　１９８９）　、各試料を４部分に等分し、そしてＴＣＡ沈澱と５ ＤＳ−ＰＡＧＥにより直接分析する（レーンｌ。

２および３）か、またはワクシニアウィルス感染細胞からの抽出物の場合には、 免疫前血清（レーン４　）　、ｐＥＸ　ＬＩＧ血清（レーン５）もしくは非特異 的ｐＥＸ免疫血清（レーン６）で免疫沈澱させた後５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析 した。

図２８は、プラスミドｐｓＫ１７を形成させるためのＰＣＲによるワクシニアウ ィルスＤＮＡリガーゼ遺伝子のクローニングを子の発現を示す。親ベクターｐＧ ＭＴ７またはプラスミドｐｓＫ１８のいずれかを含む細菌をＩＰＴＧと共に（＋ ）またはＩＰＴＧ無しで（−）インキュベートし、そして誘導４時間後に５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲル上で全細胞タンパク質を泳動した。ＩＰＴＧの添加後 のｐｓＫ１８含有菌中のほぼ６３　ｋＤａの追加のバンドの存在は明白である。

（ｉｉ）ＩＰＴＧの添加後のＤＮＡリガーゼの誘導の時間経過を示す。プラスミ ドｐｓＫ１８を含む細菌培養物をＩＰＴＧ添加後に０．　１．’２または４時間 インキュベートし、そして全細菌タンパク質をポリアクリルアミドゲル上で泳動 した。ＤＮＡリガーゼタンパク質は６３　ｋＤａタンパク質として現れる。（ｉ ｉｉ）図４ｂ（ｉ）に示した細胞抽出物をα−標識３ｔＰ−ＡＴＰと共にインキ ュベートし、ポリアクリルアミドゲル上で泳動し、オートラジオグラフを得た。

ＤＮＡリガーゼはＡＭＰを結合し、６３　ｋＤａタンパク質として現れる。

図３０は、ＷＴワタシニアウイルスで感染させモしてｐｓＫ１４を用いてトラン スフェクトせしめた細胞から誘導したウィルスからのウィルスＤＮＡのサザンプ ロットを示す。ＤＮＡを５ａｉｌで消化し、アガロースゲル上で泳動し、モして ｐｓＫ１４から削除されたＤＮＡリガーゼ遺伝子の領域を用いて探査した。

単離物３．　６．　７および８はＤＮＡリガーゼ配列を欠くが、組織培養におい て効率的に複製する。

図３１は、図３０に記載のウィルス１．５．７および８により感染させた細胞の 抽出物へのα−標識”Ｐ−ＡＴＰの共育結合を示す。ウィルス７および８は、図 ３０に示した遺伝子生産く。

態様の記載 下記に記載する全ての遺伝子操作は標準手順（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ ｇ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　＆Ｍａｎｉａｔｉｓ　編、　Ｃｏ １ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　１９ ８９）に従って実施し、そして酵素反応に使用した条件は製造業者（ＧＩＢＣＯ −ＢＲＬ　ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により勧められた通りであった 。

ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の決定ワクシニアウィルスゲノム（株ＷＲ）の ５ａｉｌ　Ｆおよび５ａｉｌ　Ｇ制限断片のヌクレオチド配列は、確立された方 法（Ｓａｎｇｅｔ、　Ｐｌ−３４，８１ｓｅｖｉｅｒ）により決定した。

例えば、ワクシニアウィルス（株ＷＲ）の１３．４　ｋｂ　５ａｉｌ　Ｆ断片を 、リファマイシン耐性変異体由来のウィルスＤＮＡを含むコスミド６　（Ｂａｌ ｄｉｃｋ、Ｃ，Ｊ、　＆　Ｍｏ５ｓ、Ｂ、　（１９８７）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。

１５６、１３８−１４５）から単離し、そして５ａｌｌで切断されたｐＵｃ１３ 中にクローニングし、プラスミドｐｓａｌｌ　Ｆを形成させた。プラスミド配列 から５ａｌＴ断片を分離し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて自己連結せしめた。

環状分子を超音波処理によりランダムに切断し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼおよ びフレノウ酵素を用いて末端修復し、そして３００ヌクレオチドより大きい断片 をＳｍａ　１切断Ｍ１３ｍｐ１８中にクローニングした。ジデオキシチェーンタ ーミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、　＆　Ｃｏｕ ｌｓｏｎ、Ａ、Ｒ。

（１９７７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、−７４，５４ ６３−５４６７）を使って、［”５ｌ−ｄＡＴＰおよび緩衝液勾配ポリアクリル アミドゲル（Ｂｉｇｇｉｎ、Ｍ、Ｄ、、　Ｇｉｂｓｏｎ、Ｔ、Ｊ、　＆　Ｈｏｎ ｇ、Ｇ、Ｆ、　（１９８３）、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、［ＪＳＡ、　８０．３６９３−３６９５）を用い て、−重鎖ＤＮＡを調製しそして配列決定した。更なる詳細につりては、Ｂａｎ ｋｉｅｒ、Ａ、Ｔ、、　Ｗｅｓｔｅｒｎ、に、Ｍ、　＆　Ｂａｒｒｅｌｌ、Ｂ、 Ｇ、　（１９８７）、　Ｗｕ、Ｒ。

Ｉｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｘｙｍｏｌｏｇｙ　１５５．５１−９３． 　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｌｏｎｄｏｎを参照のこと。１２．６　ｋｂ　５ａｉｌ　Ｇ断片も同様にして処 理した。

コンピューター分析 ヌクレオチド配列データを音波ジギタイザーによりオートラジオグラフから読み 取り、プログラムＤＢＡＵＴＯとＤＢＵＴＩＬ（Ｓｔａｄｅｎ、Ｒ，（１９８０ ）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８．３６７３−３６９４　；５ｔ ａｄｅｎ、Ｒ，（１９８２）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１０． ４７３１−４７５１　）を使ってＶＡＸ　８３５０コンピユーター上で連続配列 に組み立てた。

プログラム０ＲＰＦ　ＩＬＥとＤＥＬＩＢ　ＣＭ、Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌ、Ｉｎ５ ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＡｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ、　Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、υに、 ）を使って６フレームにおいて共通配列を翻訳した。プログラムＦＡＳＴＰ　（ Ｌｉｐｍａｎ、Ｄ、Ｊ、　＆Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｗ、Ｒ，（１９８５）　５ｃｉｅ ｎｃｅ　２２７．１４３５−１４４１）を使って、５ＷＩＳＳＰＲＯＴタンパク 質データベースに対しておよびワタシニアアミノ酸配列の出願人ら独自のデータ ベースに対して転写解読枠を比較した。複数のタンパク質配列の整列は、プログ ラムＭＵＬＴＡＬ［ＧＮ　（Ｂａｒｔｏｎ、Ｇ、Ｊ、　＆　Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ 、Ｍ、Ｊ、Ｅ、（１９８７）Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１９８．３２７−３３７ ）を使って行った。

本出願人らが同定した個々の遺伝子配列を下記に記載する。遺伝子は、（ｉ）そ れらが誘導される制限断片（即ちＳａｌ　Ｆは５ａｉｌ　Ｆ断片を意味し、また はＢはＨｉｎｄｌＩＩｌｒ　Ｂ断片を意味する）、（ｉｉ）左端から出発して制 限断片内部で始まる転写解読枠の数、および（ｉｉｉ）左側（Ｌ）または右側（ Ｒ）の転写方向、により命名される。

１、　Ｓａｌ　Ｆ　３Ｒ ３ａｌ　Ｆ　３Ｒと命名された遺伝子のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配 列を図５に示す。アミノ酸の表記には１文字表記が使用されている。該遺伝子の コード領域は、５ａｌｌＦ断片の左端からヌクレオチド５９５〜１０７１に位置 する。−次翻訳生成物の分子量は１８．１キロダルトン（ｋＤ）と予想される。

アミノ末端付近には、タンパク質を細胞膜と結合させるか、またはそこから分泌 さすると思われる一連の疎水性アミノ酸がある。

カルボキシ末端付近には、成熟遺伝子生産物が糖タンパク質であることを示す３ つの潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位が存在する。

推定アミノ酸配列とタンパク質データベース５ＷＩＳＳＰＲＯＴとの比較は、幾 つかの有意な相同性を確立した。それらの３つを図６に示す。Ｓａｌ　Ｆ　３Ｒ 遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は種々のレクチンとの配列相同性を示し 、そして最も近い相同体はヒトＣＤ２３である（下記参照）。特に、Ｓａｌ　Ｆ 　３Ｒ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は、【ｇＥのヒト低親和性Ｆｃレ セプターのアミノ酸配列（Ｋｉｔｕａｎｉ、Ｈ，ら（１９８６）、　Ｃｅ１ｌ。

ａｒｎｅｒｉｃａｎｓ　）由来の凍結防止ポリさプチドのアミノ酸配列［Ｎｇ、 　Ｎ、　Ｆ、ら（１９８６）、　Ｊ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６１．　１５ ６９０−５）　（５）およびメガバラヌスーローザ（Ｍｅｇａｂａｌａｎｕｓ　 ｒｏｓａ）　（フジッボ）由来のレクチンのアミノ酸配列（Ｍａｒａｔｎｏｔｏ 、に、　＆　Ｋａｍｉｙａ、！（。

（１９８６）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｂｙｓ、Ａｃｔａ、、　８７４．２ ８５−２９５　）と相同性を示す。Ｓａｌ　Ｆ　３ＲはＩｇＨのヒト低親和性Ｆ ｃレセプター（ＦｃＲ）の９２アミノ酸領域に渡り２６．１％のアミノ酸一致を 有し、ヘミトリブチラス・アメリカンス（Ｈｅｒｎｉｔｒｉｐｔｅｒｕｓ　ａｍ ｅｒｉｃａｎｓ　）由来の凍結防止ポリペプチドの９８アミノ酸領域に渡り２２ ，４％のアミノ酸一致を有し、そしてメガバラヌス・ローザ（八ｌｅｇａｂａｌ ａｎｕｓ　ｒｏｓａ）由来のレクチンの６３アミノ酸領域ニ渡り２７．０％のア ミノ酸一致を有する。

そのような相同性は、Ｓａｌ　Ｆ　３Ｒによりコードされるタンパク質がレクチ ンとしておよびＩｇＥに対するヒト低親和性Ｆｃレセプターの相同体として機能 することを暗示する。ＩｇＨのヒト低親和性ＦｃレセプターはＣＤ２３、即ちＢ 細胞の増殖を調節する際に主に重要であるＢリンパ球上で発現される細胞表面り 従って、Ｓａｌ　Ｆ　３Ｒによりコードされるワタシニアウイルスタンパク質は 、通常のＣＤ２３分子のアゴニストとして機能し、Ｂ細胞の増殖および／または 分化を制限し、よってウィルスによる感染に対する宿主免疫応答を減少させると 考えられる。

従って、ウィルスゲノムからのこの遺伝子の削除は、ウィルスに対する宿主免疫 応答を増強するであろう。この結果、ウィルス増殖の制限、よってウイル不の弱 毒化を得ることかできる。この遺伝子を欠く組換えワクシニアウィルスにより発 現される外来タンパク質に対する免疫応答が増強され、そしてそのような候補ワ クチンの効力が改善され得る。ＣＤ２３のワクシニア同族体を含むかまたは含ま ないワクシニア組換え体中での真正のヒトＣＤ２３タンパク質の発現は、異種病 原体から抗原を発現させる組換えワクシニアウィルスワクチンの免疫原性も増加 させることができる。

該タンパク質がレクチンとしての別のまたは追加の機能を有するならば、それは 標的細胞へのウィルスの付着において役割を果たすことができる。この可能性で の機能性遺伝子の削除は、細胞に感染するウィルス粒子の能力を減少させるであ ろうから、ウィルスの弱毒化をもたらす。

この遺伝子のコード領域が中断されそして部分的に削除されている変異ウィルス を作製した。ＥｃｏＲＩとＳａｉｌで消化したｐＵｃ１３中にワクシニアウィル ス５ａｌＴ　Ｆ断片の左側大部分の３５２４　ｂｐ　（Ｓａｉｌ−ＥｃｏＲ［Ｄ ＮＡ断片）を連結させることにより、プラスミドｐＰＲＯＦを作製した。このプ ラスミドはｓａｌ　Ｆ　３Ｈの全コード領域を含み、コード配列内で２か所のみ 切断するＮ５ｉｌでこのプラスミドを消化した（図７）。消化したＤＮＡをバク テリオファージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端にし、そして２断 片のうちの大きい方をアガロースゲル電気泳動により精製した。この断片を、ワ クシニアウィルス７．５にプロモーター配列に結合した大腸菌キサンチン−グア ニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）を含むゲル精製ＤＮ Ａ断片と連結せしめた。後者の断片は、プラスミドｐＧｐｔ０？／１４　（Ｂｏ ｙｌｅ、Ｄ、Ｂ、およびＣｏｕｐａｒ、Ｂ、Ｅ、Ｈ，、Ｇｅｎｅ　６５゜１２３ −８　（１９８８））のＥｃｏＲＩ消化後、消化したＤＮＡをＤＮＡポリメラー ゼ（フレノウ断片）で処理して平滑末端にし、２．１ｋｂｃ）Ｄ　Ｎ　Ａ断片を 単離することにより得られた。連結したＤＮＡを大腸菌中にクローニングし、生 じた細菌コロニーを、適当な制限酵素を使って所望のプラスミドの存在について スクリーニングした。この操作を通じて（図７に要約）　、１００ｂｐのＳａｌ 　Ｆ　３Ｒコ一ド配列がワクシニアウィルス７．５にプロモーターの支配下の機 能的なＥｃｏｇｐｔ遺伝子コピーにより置き換えられているプラスミドｐＳＡ０ ３Ｇを単離した。

野生型（ＷＴ）ワクシニアウィルスで感染させたＣＶ−１細胞中にプラスミドｐ ＳＡＤ３Ｇをトランスフェクトせしめ、モして３７°Ｃで４８時間後にそれらの 細胞から誘導したウィルス子孫を、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）　、キサンチン およびヒボキサンチンの存在下で新鮮なＣＶ−１細胞上に筒布した。それらの薬 剤は、ＥＣＯｇｐｔ遺伝子を含みそれを発現する組換えウィルスのみの複製を許 容する（Ｂｏｙｌｅ　＆　Ｃｏｕｐａｒ　１９８８前掲；　Ｆａｌｋｎｅｒ　＆ 　Ｍｏ５ｓ。

Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　６２．１８４９−５４．１９８８　）　、　３回のプラー ク精製後、ウィルスをＣＶ−１細胞の大量培養物中で増殖させた。ウィルスＤＮ Ａのサザンプロット分析は、ＥＣＯｇｐｔ遺伝子がウィルスゲノム中の予想位置 に存在し、機能的なＳａｌ　Ｆ　３Ｒ遺伝子のコピーは全く残されておらず、そ して他のゲノムＤＮＡ再配列は全く起こっていないことを確証した（図８参照） 。Ｓａｌ　Ｆ　３Ｒ遺伝子を欠くウィルスは生存可能であるため、それらのデー タはＳａｌ　Ｆ　０ＲＰ３遺伝子が試験管内マのウィルス複製にとって非本質的 であることを確立した。

Ｓａｌ　Ｆ　３Ｒコード領域の不活性化か弱毒化ウィルスを生成するだろうとい う可能性は、該領域が通常のウィルス複製中に発現されるかどうかに依存する。

この点を扱うために、感染の初期および後期の間にこの領域から転写されるウィ ルスｍＲＮＡをノーザンプロットにより分析した。その結果を図９に示す。Ｓａ ｌ　Ｆ　３Ｒコード鎖のみに相補的である一本鎖の放射能標識ＤＮＡプローブは 、約６００ヌクレオチドの初期ｍＲＮ人種を検出した。感染中の後期では、この ｍＲＮＡはノーサンプロット上にスミアとして現れる不均一な長さの幾つかのｍ ＲＮＡ種により置き換えられた。後期ワクシニアウィルスｍＲＮＡの不均一な長 さのため、これはＳａｌ　Ｆ　３Ｒプロモーターからまたは更に上流から始まる ｍＲＮＡを表すことができる。このデータは、Ｓａｌ　Ｆ　３Ｒ遺伝子が確実に 初期に転写され：そしておそらく後期にも転写されるとの結論を与える。

２、　Ｓａｔ　Ｆ　９Ｒ この遺伝子のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を図１０に示す。該遺伝子のコー ド領域は、５ａｌｌ　Ｆ断片の左端からヌクレオチド４４４７〜４８２１に及ぶ 。コードされるタンパク質は、１３．６ｋＤの予想分子量を有する。

ｆｆ１ｌｌは、Ｓａｌ　Ｆ　ＯＲによりコードされるタンパク質と、（ｉ）ウシ Ｃ３ｔｅｉｎｍａｎら（１９７４）、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２４９． ７３２６−３８　）および（ｉｉ）ヒト（Ｓｈｅｒｍａｎ、　Ｌ、ら（１９８３ ）、　ＰＮＡＳ、８０．５４６５−９）からの２つのスーパーオキシドシネムタ ーゼ（Ｃｕ−Ｚｎ）タンパク質との間のアミノ酸配列相同性を示す。５ａｌＴ　 Ｆ　０ＲＦ９によりコードされるタンパク質は、ウシスーパーオキシドジスムタ ーゼの５７アミノ酸領域に渡り３６．８％のアミノ酸一致を育し、そしてヒトス ーパーオキシドジスムターゼの５９アミノ酸領域に渡り３７．３％のアミノ酸一 致を有する。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、毒性の酸化ラジカル （０！−）を酸素と過酸化水素に変換する酵素である。微生物の吸収後、食細胞 は酸化的バーストを受け、０！−を生成して微生物の破壊を引き起こす。ウィル スの構造中のＳＯＤの存在、または感染後まもなくの発現は、この毒性ラジカル ０２″に対する防御機構（それを酸素と過酸化水素に変換することによる）を提 供し、従ってポックスウィルスが生存できウィルスの全身拡散を促進する場所で ある宿主マクロファージ（Ｆｅｎｎｅｒ、　Ｆ。

（１９８５）、“Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”、　Ｂ、Ｎ、Ｆｉｅｌｄ編、　ｐｐ、６６ １−６８４．　ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）中でのワクシニ アウィルスの生存力および複製を増加させるであろう。しかしながら、Ｓａｌ　 Ｆ　ＯＲによりコードされる予想タンパク質のアミノ酸構造の徹底分析は、それ が他のＳＯＤ酵素中の銅および亜鉛二価カチオンの結合に関与する幾つかの重要 なアミノ酸残基を欠くことを示した。

これに基づくと、ワクシニアウィルスＳＯＤ相同体がＳＯＤ様酵素活性を育する ことはありそうにないように思え、そして新規ウィルス誘導酵素活性は感染細胞 中で検出されなかった。

しかしながら、ウィルスゲノム中のこの遺伝子の存在はなお興味深いままであり 、そして他のポックスウィルスが機能性特表千４−５０４３５７　（８） ＳＯＤ酵素を保有するかもしれない；とを暗示する。例えば、アフリカブタコレ ラウィルス（ＡＳＦＶ）は、ブタのマクロファージ中で効率的に複製するので、 おそらくこの酵素を含む候補であろう。同定された遺伝子配列を含み且つスーパ ーオキシドジスムターゼ酵素活性を保有するウィルスからのこの遺伝子の削除は 、マクロファージ中で複製しそしてマクロファージによって散布されるウィルス の能力の減少のため、ウィルスの弱毒化をもたらす°だろう。

３、　Ｓａｌ　Ｆ　１３Ｒ 図４は、Ｓａｔ　Ｆ　１３Ｒと命名された２２７アミノ酸ＯＲＦの推定配列を示 す。図２は、ワクシニアウィルスゲノム中の５ａｌＩ　ＦＯＲＦ１３の位置を示 す。

該ＯＲＦの始まりのＡＴＧコドンの約４０ヌクレオチド上流および終結コドンの ２０ヌクレオチド下流に、初期転写の終結シグナルを表す配列ＴＴＴＴＴＧＴお よびＴＴＴＴＴＡＴ　（Ｙｕｅｎ、Ｌ、およびＭｏ５ｓ、Ｂ、　（１９８７）　 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、、　８４．６４１７−６４ ２１　）がそれぞれある。その次の下流のＴｓＮＴ配列は、ＤＮＡリガーゼ遺伝 子のプロモーター領域内に更に５４０ヌクレオチド離れて存在し、そして配列Ｔ ＴＴＴＴＴＴＡＴ中に２つの重複した終結シグナルを含む。Ｓａｔ　Ｆ　１３Ｒ の５′末端におけるそれらの初期転写終結シグナルの存在および後期転写開始部 位の配列ＴＡＡＡＴ（Ｇ）　（Ｒｏｓｅｌ、Ｊ、Ｌ、、　Ｅａｒｌ、Ｐ、１．お よびＭｏ５ｓ、Ｂ、　（１９８６）　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、、　６０．４３６−４４９　：　Ｈａｎｇｇｉ、Ｍ、、　Ｂａｎｎ ｗａｒｔｂ、Ｗ、およびＳｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ、Ｈ，Ｇ、　（１９８６）　Ｅ ＭＢＯＪ、、　５．１０７１−１０７６　）の不在は、該遺伝子が感染中の初期 に転写され得ることを暗示する。

Ｓａｌ　Ｆ　１３Ｒ遺伝子のコード領域は、５ａｉｌ　Ｆ断片の左端からヌクレ オチド６３１３〜７１１３に及ぶ。コードされるタンパク質は２６．１ｋＤの予 想分子量を有する。

プログラムＦＡＳＴＰ　（Ｌｉｐｍａｎ、Ｄ、Ｊ、およびＰｅａｒｓｏｎ、　Ｗ 、　Ｒ。

（１９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２７．１４３５−１４４１）を使ってＳａ ｌ　Ｆ　１３Ｒの推定アミノ酸配列をタンパク質データベース５ＷｒＳＳＰＲＯ Ｔおよびワクシニアウィルスタンパク質の我々独自のデータベースと比較した。

他のワクシニアタンパク質に対して強い一致は見つからなかったが、Ｓａｔ　Ｆ 　１３Ｒの推定アミノ酸配列はサツカロミセス・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のチミジレートキナーゼ（ＴｒｎｐＫ） 　（Ｊｏｎｇ、Ａ、Ｙ、Ｓ、、　Ｋｕｏ、Ｃ，Ｌ、およびＣａｍｐｂｅｌｌ、Ｊ 、Ｌ、　（１９８４）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５９．１１０５２−１ １０５９　；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、Ｒ，、Ｈｅ１ｍ５．Ｃ，およびＲｏｓｅｎｂ ｅｒｇ、Ｎ、　（１９８７）　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．、７．１１９８−１ ２０７　）に対して高いＦＡＳＴＰ相同性スコア（３７１）を有した。

図１２は、Ｓａｔ　Ｆ　１３Ｒによりコードされるタンパク質と酵母からのチミ ジレートキナーゼ（ＴｍｐＫ）　ＣＪｏｎｇら（１９８４）　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２５９．１１０５２−９）との間のアミノ酸配列相同性を示す。

２つのタンパク質は２００アミノ酸領域に渡り４２％のアミノ酸一致を占め、そ して多数の追加の保存性置換が存在する。

整列したアミノ酸配列は長さが非常に似ており（酵母で２１６アミノ酸に対しワ クシニアウィルスで２０４アミノ酸）、はとんど共直線性である。初期ｍＲＮＡ の５′末端の上流にある５ａｌＦ　１３Ｒのアミノ末端におけるコンピューター 推定した余分なアミノ酸残基は、酵母ＴｍｐＫとの相同性が全くなかった。これ は、それらのアミノ酸がワタシニアＴｍｐＫ酵素の部分ではないことと一致する 。２つのアミノ酸配列の整列は図１３に示され、同一アミノ酸が枠で囲まれてい る。

推定ワクシニアＴｍｐＫ酵素のアミノ酸残基１１〜１８は、２番目のグリシンが リジンであることを除いてＡＴＰ結合性タンパク質の共通配列ＧＸＸＧＸＧＫＳ ／Ｔ　（Ｏｔｓｕｋａ、Ｍ、およびＫｉｔ、Ｓ、　（１９８４）Ｖｉｒｏｌｏｇ ｙ、　１３５．３１６−３３０）と合致する。この領域の配列と、酵母Ｔｒｎｐ Ｋ　（Ｊｏｎｇ、Ａ、Ｙ、Ｓ、、　Ｋｕｏ、Ｃ，Ｌ、およびＣａｍｐｂｅｌｌ、 　Ｊ、　Ｌ。

（１９８４）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５９．１１０５２−１１０５９ 　；　Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、Ｒ，。

Ｈｅ１ｍ５．Ｃ，およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｎ、　（１９８７）　Ｍｏ１．Ｃ ｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　７゜１１９８−１２０７　）　、ＨＳＶチミジンキナー ゼ（ＴＫ）／ＴｍｐＫ　（Ｏｔｓｕｋａ、Ｍ。

およびＫｉｔ、Ｓ、　（１９８４）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１３５．３１６−３ ３０　；　ＭｃＫｎｉｇｈｔ。

Ｓ、Ｌ、　（１９８０）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８．５９４ ９−５９６４　；　Ｗａｇｎｅｒ、Ｍ。

Ｊ、、　５ｈａｒｐ、Ｊ、Ａ、およびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｗ、Ｃ，（１９８１）　 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、、　７８．１４４１−１４４５　；　Ｇｏｍｐｅｌｓ、Ｕ、 およびＭｉｎｓｏｎ、−Ａ、　Ｃ。

（１９８６）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１５３．２３−２４７　；　Ｄａｒｂｙ、 Ｇ、、　Ｌａｒｄｅｒ、Ｂ、Ａ、およびｒｎｇｌｉｓ、Ｍ、Ｍ、　（１９８６） 　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、　６７、７５３−７５８　；Ｋｉｔ。

Ｓ、、　Ｋｉｔ、Ｍ、、　Ｑａｖｉ、Ｈ，、Ｔｒｋｕｌａ、Ｄ、および０ｔｓｕ ｋａ、Ｈ，（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　７４１ ．１５８−１７０　；　Ｓｗａｉｎ、Ｍ、Ａ、およびＧａｌｌｏｗａｙ、Ｄ、Ａ 、　（１９８３）　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　４６．１０４５−１０５０）　、ワク シニアＴＫ　［Ｗｅｉｒ、　Ｊ、　Ｐ、およびＭｏ５ｓ、Ｂ、　（１９８３）　 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　４６゜５３０−５３７　）およびヒトＴＫ　（Ｂｒａｄｓ ｈａｗ、　Ｈ，Ｄ、およびＤｅｉｎｉｎｇｅｒ。

Ｐ、Ｌ、　（１９８４）　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　４．２３１６−２ ３２０）の推定ＡＴＰ結合部位を図１４Ａに示す。それらの配列の全てにおいて 、５および１０位のグリシン残基、１１位ｐリジン残基並びに１３位のスレオニ ン残基が不変である。単純ヘルペスウィルス（ＨＳＩ／）ＴＫ／ＴｍｐＫのみが 共通ＡＴＰ結合部位（上記）の二番目のグリシンを含む。この領域の整列は、非 常に相同の酵母およびワタシニアＴｍｐＫ配列並びにより分岐したＨＳＶ　ＴＫ ／ＴｍｐＫが幾つかの点でＴＫ配列と異なり、そのうちワクシニアとヒトのＴＫ 配列が代表例であることを示す。第一に、全てに関して一番目のグリシンの直前 に、ＴｎｉｐＫ酵素は酸性残基を含むが、ＴＫは疎水性残基を含む。第二に、６ 位〜８位において全てのポックスウィルス（Ｗｅｉｒ、　Ｊ、　Ｐ、およびＭｏ ５ｓ、Ｂ、　（１９８３）　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　４６゜５３０−５３７　；　 Ｂｏｙｌｅ、Ｄ、Ｂ、、　Ｃｏｕｐａｒ、Ｂ、Ｅ、Ｈ，、Ｇｉｂｂｓ、Ａ、、Ｊ 、。

Ｓｅｉｇｍａｎ、　Ｌ、Ｊ、およびＢｏｔｈ、Ｇ、Ｍ、　（１９８７）　Ｖｆｒ ｏｌｏｇｙ、　１５６．３３５−３６７　；　ＥＳｐＯ３ｉｔＯ，Ｊ、Ｊ、およ びにｎｉｇｈｔ、Ｊ、Ｃ，（１９８４）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。

１３５、５６１−５６７　；　０１）ｔｏｎ、Ｃ，およびＭｃＦａｄｄｅｎ、　 Ｇ、　（１９８６）Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　６０．９２０−９２７　）および細胞 性（Ｂｒａｄｓｈａｗ、　Ｈ，Ｄ、およびＤｅｉｎｉｎｇｅｒ、Ｐ、Ｌ、　（１ ９８４）　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　４．２３１６−２３２０　；Ｌｉ ｎ、Ｐ、Ｆ、、　Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｈ，Ｂ、、　Ｙｅｈ、Ｄ、Ｂ、、　Ｘｕ 、Ｔ、、　Ｚｈａｏ、Ｓ、Ｙ、およびＲｕｄｄｌｅ、Ｆ、Ｈ，（１９８５）　Ｍ ｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　５．３１４９−３１５６　；Ｋｗｏｈ、　Ｔ、 　Ｊ、およびＥｎｇｌｅｒ、Ｊ、Ａ、　（１９８４）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、。

１２、３９５９−３９７１　）のＴＫ酵素はＰＭＦ残基を含むが、酵母およびワ クシニアＴｍｐＫ配列はＬＤＫ／Ｒを含む。ここでＨ３Ｖ酵素はいずれのパター ンとも一致せず、これはより広範な基質特異性を反映するかもしれない。第三に 、１４位にポックスウィルスと細胞性ＴＫはグルタミン酸を含むがＨＳＶはスレ オニンを有する。

ＡＴＰ結合部位の外側では、ワクシニアのＴｍｐＫとＴＫ配列トの間に全く検出 可能な相同性がない。しかしながら、ワクシニアＴｍｐＫとＨＳＶ　ＴｍｐＫ／ ＴＫとは、第二のヌクレオチド／ヌクレオシド結合領域において相同性を存する 。この領域における酵母ＴｍｐＫ、ワクシニアＴｍｐＫおよびＨＳＶ　ＴＫ／Ｔ ｍｐＫからの配列の整列を図１４Ｂに示す。酵母とワクシニア酵素は明らかに相 同であるが、ワクシニアとＨＳＶとの間にはＴＬｒ）リブレット（３〜５位）が 保存されている。

Ｔにをコードする遺伝子はマツピングされ配列決定されている。それは試験管内 複製にとって非本質的な遺伝子であり、組換えワクシニアウィルス中への外来Ｄ ＮＡの挿入のための部位として広範に使用されている（Ｍａｃｋｅｔｔ、Ｍ、お よび５ｒｎｉｔｈ。

Ｇ、Ｌ、　（１９８６）　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、　６７、２０６７−２０８ ２）　、それはワクシニア（Ｂｕｌｌｅｒ、Ｒ，Ｍ、Ｌ、、　５ｏＩｉｔｈ、Ｇ 、Ｌ、、　Ｃｒｅｍｅｒ、に、、　Ｎｏｔｋｉｎｓ、Ａ。

Ｌ、およびＭｏ５ｓ、Ｂ、　（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ、　３１７．８１３− ８１５　）およびＨＳＶ　（Ｆｉｅｌｄ、Ｈｊ、およびＷｉｌｄｙ、Ｐ、　（１ ９７８）　Ｊ、Ｈｙｇ、Ｃａｍｂ、　８１゜２６７−２７７　；　Ｋｉｔ、Ｓ、 、　Ｑａｖｉ、Ｈ，、Ｄｕｂｂｓ、Ｄ、Ｒ，および０ｔｓｕｋａ、　Ｈ。

（１９８３）　Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、、　１２．２５−３６）の両者につい てのウィルス病原性の決定基でもある。ＴＫ遺伝子の削除はウィルス弱毒化をも たらす（Ｂｕｌｌｅｒら（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ、　３１７．８１３−５） 。

Ｔｍｐに酵素は、図１５に示した生化学経路中でチミジンモノリン酸（チミジレ ートまたはｄＴＭＰ）をチミジンニリン酸（ｄＴＤＰ）に変換する。ワクシニア ウィルスは、別の酵素、即ちこの経路の最初の部分においてチミジンをチミジン モノリン酸に変換する作用をするチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする。ＴＫ とＴｍｐＫが同じ生化学経路において連碑段階を実施するとすれば、本出願人ら は、おそらくワクシニアＴｍｐＫ遺伝子もウィルス複製にとって必須でなく、そ れの削除もウィルスの弱毒化をもたらすだろうことを悟った。従ってこの遺伝子 は、ワクシニアウィルス中への外来ＤＮＡの挿入のための追加の部位を提供し、 そしてウィルスの弱毒化を行うための標的となるであろう。

Ｓａｌ　Ｆ　１３Ｒ遺伝子が不活性化されているワクシニアウィルス変異体を作 製した。ワクシニアウィルスプロモーター９７．５Ｋに連結したＥｃｏｇｐｔ遺 伝子を、ヌクレオシド／ヌクレオチド結合に関与し従っておそらく酵素活性に不 可欠であろうと予想されるＴｍｐＫ遺伝子の領域（Ｓｍｉ　ｔｈら　Ｎｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

１７、７５８１　（１９８９）　）中に挿入した。方策はＳａｌ　Ｆ　１３Ｒ遺 伝子について上記に記載したものに準じた（図１６）。５ａｌｌＦ断片のＤｒａ 　Ｉ消化により誘導された２３９２　ｂｐのＤｒａＩ断片を、Ｓｍａ　Ｉで切断 したｐＵｃ１３中に連結せしめることにより、プラスミドｐＡｃＶ１を作製した 。ｐＡＣＶ　１は完全なＳａｌ　Ｆ　１３Ｒコード配列を含み、そしてｐＡｃＶ ｌを１回だけＴｍｐＫのコード領域内で切断する制限酵素ＭｕｌｌでｐＡｃｖｔ を消化した。。ワクシニアウィルスプロモーター９７．５Ｋに結合したＥＣＯｇ ｐｔ遺伝子をＥｃｏＲ１断片として単離しく上記と同様）　、ＤＮＡポリメラー ゼ（フレノウ断片）での処理により平滑末端にし、そしてＭｕｌｌで消化したｐ ＡｃＶｌ　と連結せしめた。生じたプラスミドｐＡｃＶ２は、Ｅｃｏｇｐｔによ り中断されたＴｒｎｐＫ遺伝子を含んだ。操作手順は図１６に要約されている。

このプラスミドを用いて、ＷＴワクシニアウィルスまたはＢ型肝炎つィルス表面 坑原遺伝子を発現するＴＫ−組換えウィルス（Ｓｍｉｔｈら、　Ｎａｔｕｒｅ　 ３０２．４９０−５．１９８３　）のいずれかにより感染させたＣＶ−１細胞を トランスフェクトせしめた。ＥＣＯｇｐｔ遺伝子を発現する組換えウィルスをＭ ＰＡの存在下でプラークアッセイにより選択し、そして株を増殖させた。

ＷＴウィルスに由来するウィルスをＶＡＣＩと命名し、ｖＨＢｓ４に由来するウ ィルスをｖＡＣＨＢと命名した。それらのゲノムＤＮＡをサザンブロッティング により分析した（図１７）。それらのデータは、両ウィルスとも予想の位置に組 み込まれたＥｃｏｇｐｔ遺伝子を含み、他のゲノムの変化は起こっていないこと を示し、そしてＳａｔ　Ｆ　１３Ｒの生産物が試験管内でのウィルス複製にとっ て非本質的であることを確立した。

ノーザンブロツティングおよびＳ１ヌクレアーゼ保護による転写マツピングは、 Ｓａｌ　Ｆ　１３Ｒ遺伝子が感染中の初期に転写されるが後期には転写されない ことを証明した。Ｓａｌ　Ｆ　１３Ｒのコード鎖に特異的なプローブを用いて約 ８５０ヌクレオチドの初期ｍＲＮＡが検出された。このサイズは、転写がＯＲＰ のすぐ上流で始まりそして最初の下流初期転写終結シグナルの５０ヌクレオチド 下流で終わるとすれば、予想されるｍＲＮＡのサイズと一致する。Ｓｔヌクレア ーゼマツピングは、初期ｍＲＮＡの５′末端を二番目のフレーム内ＡＴＧコドン のすぐ上流に正確に位置づけた。これは一番目のＡＴＧコドンのほぼ６５ヌクレ オチド下流であり、従って該タンパク質は以前に予想されたもの（Ｓｍｉｔｈら 、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１７．７５８１−９０　）よりも２３アミ ノ酸短い。

ワクシニアウィルス感染細胞中りＴｍｐＫ活性についてのアッセイを実施し、酵 素活性を検出した。該アッセイは、偽感染細胞またはウィルス感染細胞を三重水 素化チミジレートと共にインキュベートし、反応生成物を薄層クロマトグラフィ ー（ＴＬＣ）で分離しくＴＭＰ、ＴＤＰおよびＴＴＰを分離する）、そしてそれ らの化合物に対応するＴＬＣ中の三重水素の面積をカウントすることから成る（ Ｊｏｎｇら、　Ｊ、Ｂ、Ｃ，２５９，１１０５２−９、（１９８４）　）。

しかしながら、ＴｍｐＫは本質的な細胞性酵素であるため、本出願人らは未感染 細胞中の内因性活性と、ワクシニアウィルス感染細胞中に存在するものとの相違 を未だ証明していない。

この難点を克服するために、本出願人らは、合成オリゴヌクレオチドを使ってポ リメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）により遺伝子を再構成し、再配列決定し、そ してサツカロミセス・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）中での遺伝子の発現のために考案されたプラスミドｐＥＭＢＬｙｅ ｘ４　（Ｄｅｎｔｅら、　Ｎｕｃ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１１．１６４５−５５．１９８３）中にクローニングした 。このプラスミドは、ＴｍｐＫ活性が欠損している酵母変異体ＣＤＣ８（Ｊｏｎ ｇら１９８４）を補完するために用いる。この酵母株の補完は、Ｓａｌ　Ｆ　１ ３Ｒ遺伝子がＴｍｐＫ酵素活性をコードすることを直接的に示し、そして親の酵 母株は全く内因性細ｐＫ活性を持たないため、それらの酵母細胞の抽出物を使っ て試験管内で酵素活性を証明することが簡単である。

Ｂ５Ｒ遺伝子のヌクレオチド配列−とアミノ酸配列を図１８に示す。コードされ るタンパク質は３５゜１　ｋＤの予想分子量を存し、そのコード領域は５ａｌｒ Ｇ断片の左端からヌクレオチド６６５４〜７６０４に位置する。該タンパク質は アミノ末端とカルボキシ末端付近に疎水性アミノ酸配列を含み、このことは該タ ンパク質が感染細胞またはウィルス粒子の細胞膜に関連することを示す。成熟生 成物が糖タンパク質であることを示すＮ−結合グリコシル化のための−３つの可 能な部位も存在する。

該アミノ酸配列と５ＷＩＳＳＰＲＯＴタンパク質データベースとの比較は、補体 調節タンパク質および血液凝固因子の玉料に属する幾つかのタンパク質との有意 な相同性を確立した。図１９の整列は、Ｂ５Ｒ遺伝子（Ｓａｌｌ　Ｇ　０ＲＦＩ Ｏ）によりコードされるタンパク質と、第Ｘ■凝固因子Ｂ鎖、補体因子Ｈ前駆体 、補体Ｃ２前駆体、および補体Ｃ４Ｂ結合タンパク質前駆体との間のアミノ酸配 列相同性を示す。Ｂ５Ｒによりコードされるタンパク質は、第ＸＩ［凝固因子Ｂ 鎖の２４６アミノ酸領域に渡り２７．２％のアミノ酸一致を有し、補体因子Ｈ前 駆体の１２５アミノ酸領域に渡り２７．２％のアミノ酸一致を有し、補体Ｃ２前 駆体の１７８アミノ酸領域に渡り２６．４％のアミノ酸一致を有し、そして補体 Ｃ４Ｂ結合タンパク質前駆体の１７５アミノ酸領域に渡り２４．６％のアミノ酸 一致を有する。この玉料のタンパク質中にはほぼ６０アミノ酸の繰り返し領域が ある。Ｂ５Ｒ遺伝子によりコーＰされるワクシニアタンパク質は４つのそのよう な繰り返しを有する。

ワクシニアウィルスは、補体および血液凝固因子タンパク質の玉料との相同性を 示す別のタンパク質をコードする遺伝子Ｈ３Ｃ２８Ｋ　（Ｋｏｔｗａｌ、Ｇ、　 ＆　Ｍｏ５ｓ、Ｂ、　（１９８８）、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３５゜１７６〕を含 む。Ｂ５Ｒ遺伝子　によりコードされるタンパク質は、このタンパク質に関連す るが別個のものであり、２９％のアミノ酸相同性を有する。Ｈ２Ｏ２８にタンパ ク質は、Ｂ５Ｒによりコードされるタンパク質よりも補体Ｃ４Ｂ結合タンパク質 に密接に関連する。Ｂ５Ｒによりコードされるタンパク質はＨ５Ｃ２８にタンパ ク質よりも第ＸＩ凝固因子により密接に関連する。

５ａｉｌ　Ｇ　０ＲＦＩＯとＨ２Ｏ２８にタンパク質との間のもう一つの有意な 相違は、図２０に示した疎水性分布により例示される。Ｂ５Ｒによりコードされ るタンパク質のカルボキシ末端付近の余分な疎水性領域（これは）１３Ｃ２８Ｋ には存在せず）の存在は前者が細胞に関連したままであろうことを示し、一方後 者は分泌されることが知られている（Ｋｏｔｗａｌ、Ｇ、　＆　Ｍｏ５ｓ、Ｂ、 　（１９８８）。

Ｎａｔｕｒｅ、　３３５．１７６）。

上記に示した相同性は、Ｂ５Ｒによりコードされるタンパク質がおそらく補体活 性化（８３Ｃ２８にタンパク質もこれを行うことが知られている）または血液凝 固の正常過程を妨害するらしいことを指摘する。補体介在性細胞溶解の妨害はウ ィルスの生存力を増強するだろう。同様に、感染部位の周囲の凝血の防止は、感 染の封じ込めを防止し、そしてウィルスの散布を増加させるだろう。

Ｅｃｏｇｐｔでの挿入不活性化によりウィルス欠失変異体を作製する試みは不成 功であることがわかった。おそらく、証明されてないが、この遺伝子はウィルス 複製にとって不可欠であるらしい。

遺伝子がウィルス複製にとって不可欠である場合、遺伝子生産物を改変すること によりウィルスを弱毒化することも更に可能である。コードされるタンパク質が 補体因子を結合するため、ウィルス複製のためのタンパク質機能を維持したまま 、結合に特異的なタンパク質の領域を変更することができる。

ノーザンブロツティ゛ングによるＢ５Ｒ遺伝子の転写分析（図２１）は、１８５ ０ヌクレオチドの初期ｒｎＲＮＡの存在を示した。このサイズは、転写が８５Ｈ のすぐ上流で始まりそして最初の下流初期転写終結シグナルの５０ヌクレオチド 下流で終わるとすれば、予想されるｍＲＮＡのサイズと一致する。この領域から 不均一の長さの後期ＲＮＡも存在する。Ｓ１ヌクレア一ゼ分析は、Ｂ５Ｒプロモ ーターが感染中の初期にも後期にも発現されることを示した。初期と後期転写開 始部位を育する構成的に活性な７．５にプロモーターとは異なり、Ｂ５Ｒプロモ ーターは後期開始部位の上流に初期ＲＮＡ開始部位を有する。後期開始部位は保 存配列ＴＡＡＡＴ内に位置する。

該タンパク質はβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として大腸菌（Ｅ、ｃ ｏｌｉ）中で発現されており、そして現在はヒトシトメガロウイルス即時初期プ ロモーター／エンハンサ−により指令されるＣＨＯ細胞中で真正形において発現 されている。

ワクシニアタンパク質が凝固因子として機能するとすれば、このタンパク質、ま たはカルボキシ末端付近の疎水性領域が削除されている形態は、血液凝固牽防止 する際に有用な試薬であることができる。

５　、３ａｌ　Ｆ　１５Ｒ この遺伝子のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を図３に示す。該遺伝子のコード 領域は５ａｌＴＦ断片の左端からヌクレオチド７６２５〜９２８０に位置する。

コードされるタンパク質は約６３．３ｋＤの予想分子量を有する。

ノーザンブロツティング、Ｓ１ヌクレアーゼ保護およびプライマー伸長による５ ａｌｒ　０ＲＦ１５遺伝子の転写マツピングは、該遺伝子が感染中の初期に発現 されることを証明している（Ｓｍｉｔｈら、　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、 １７．９０５１−６２）。驚＜へきことに、該ｍＲＮＡの５′末端は、後期転写 開始部位に特徴的である配列ＴＡＡＡＴＧに位置する。（Ｒｏｓｅｌ、Ｊ、Ｌ、 、　Ｅａｒｌ、Ｐ、Ｌ、、　Ｗｅｉｒ、Ｊ、Ｐ、　＆Ｍｏ５ｓ、Ｂ、　（１９８ ６）　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６０．４３６−４４９　；　ＨａｎＨｉ、Ｍ、。

Ｂａｎｎｗａｒｔｈ、Ｗ、　＆　Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ、Ｈ，Ｇ、　（１９８ ６）　ＥＭＢＯＪ、　５．１０７１−１０７６　）。プライマー伸長により決定 されたｍＲＮＡの５′末端は、Ｓ１ヌクレアーゼ保護により決定された５′末端 より５ヌクレオチド上流に位置する。この初期ｍＲＮＡ上には、今まで単に後期 ｍＲＮＡの特徴として考えられていた５′オリゴ−アデニル酸残基が存在する。

プログラムＦＡＳＴＰ　ＣＬｉｐｍａｎ、Ｄ、Ｊ、およびＰｅａｒｓｏｎ、　Ｗ 、　Ｒ，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２２７．１４３５−１４４１　）を使 ったＳａｌ　Ｆ　１５Ｒのアミノ酸配列とワクシニアウィルスタンパク質の我々 のデータベースとの比較は、強い一致を全く示さなかった。しかしながら、タン パク質データベース５ＷＩＳＳＰＲＯ’ｒの調査は、サツカロミセガーゼ（Ｂａ ｒｋｅｒ、Ｄ、Ｇ、、　Ｗｈｉｔｅ、Ｊ、Ｈ，Ｍ、　＆　Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｌ、 Ｈ，（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３．８３２３−８ ３３７）との広範な相同性を明らかにした。５２７の最大ＦＡＳＴＰスコアが得 られ（１のＫＴＬＩＰ）、そして２つのタンパク質は４１２アミノ酸領域に渡り ３０％のアミノ酸一致を存した。分裂性酵母Ｓ、ボンベ（Ｓ、ｐｏｍｂｅ　）と 出芽性酵母Ｓ、セレビシェ−（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は発生学的に離れ ているけれども、５ａｉｌ　Ｆ　０ＲＦ１５とサツカロミセス・ボンベ（Ｓａｃ ｃｈａｒｏｒｎｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　）　ＤＮＡリガーゼ（Ｂａｒｋｅｒ、　 Ｄ、　Ｇ、　。

Ｗｈｉｔｅ、Ｊ、Ｈ，Ｍ、　＆　Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｌ、Ｈ，（１９８７）　Ｅｕ ｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６２゜６５９−６６７３との間にも同程度の相同 性があった。。バクテリオファージＴ４およびＴ７並びに大腸菌のＤＮＡリガー ゼとは弱い相同性しか検出されなかった。酵母とワクシニアウィルスのＤＮＡリ ガーゼのアミノ酸配列の整列を図２２に示す。この整列は、ワクシニアタンパク 質のアミノ末端領域が２つの酵母配列から離れており、そしてワクシニア中には 欠けているが両酵母中には存在する領域があることを示す。後者の点は該タンパ ク質の予想サイズに反映されており、ワクシニアＤＮＡリガーゼ（６３，３ｋＤ ）は、Ｓ、ボンベ（８６，２ｋＤ）とＳ、セレビシェ−（８４，８ｋＤ）のＤＮ Ａリガーゼよりも相当小さい。

酵母ＤＮＡリガーゼもアミノ末端領域が最も少なく保存される。対比して、３つ の配列はカルボキシ末端においてほとんど共直線性であり、そして広範なアミノ 酸一致と保存性置換を有する。３つの配列全てにおいて並びにＴ４およびＴ７　 ＤＮＡリガーゼにおいてＡＴＰ結合部位の所の推定される触媒作用性リジン（星 印で表示）が保存されている。補因子としてＡＴＰよりむしろＮＡＤを使用する 大腸菌酵素では、この部位はあまり保存されない。最も高度に保存される領域は 、カルボキシ末端に非常に近く、塩基性アミノ酸に富んでいる。１６アミノ酸領 域に渡り、ワクシニアタンパク質はＳ、ボンベアミノ酸のうちの１つはイソロイ シンからバリンへの保存性置換である。この領域はＴ４においても良く保存され ており、６個の同一残基と数個の保存性置換を有する。この領域の高い保存は、 それがＤＮＡリガーゼ機能において成る重要な役割を果たすことを暗示しており 、そしてその塩基性組成はＤＮＡ基質との相互作用と矛盾しない。

下記のデータは、ワクシニアウィルスがＤＮＡリガーゼをコードする直接証拠を 提供し、そしてワクシニアウィルス感染細胞の細胞質中のＤＮＡ’Ｊガーゼ活性 の１３倍の増加を示した初期のデータ（Ｓａｒｎｂｒｏｏｋ、、１．　＆　５ｈ ａｔｋｉｎ、Ａ、Ｊ、　（１９６９）　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、　４．７１９−７２６　）を支持する。５ｐａｄａｒｉ　（Ｓｐａ ｄａｒｉ、Ｓ。

（１９７６）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　３．２１５５−２１６ ７）は、該酵素が細胞性ＤＮＡリガーゼＩに類似した生化学的特徴を有するので 、ＤＮＡリガーゼ活性の増加がおそらくウィルスによりコードされたものでない だろうと結論づけたが、しかし、ウィルス感染細胞の細胞質中への該酵素の漏出 の増加に起因し得るかもしれない。

このワクシニア酵素のアミノ酸配列は、最初に報告された「哺乳類のＪＤＮＡＩ ＪＤＮＡリガーゼである。それはＤＮＡリガーゼをコードする真核ウィルスの唯 一の例でもある。

しかし、細胞質中で複製する他の大きいＤＮＡウィルス、例えばアフリカブタコ レラウィルスがおそらくこの酵素、をコードするだろう。哺乳類のＤＮＡリガー ゼは多数知られているが、それらの酵素をコードする遺伝子はまだマツピングさ れていない。

ワクシニアウィルスは、ＤＮＡ鎖封じ込め活性を有する２つの別の酵素（トポイ ソメラーゼおよびニック結合酵素）を含み、そして常用のＤＮＡリガーゼを要求 しないウィルスＤＮＡ複製モデルが提案されている（Ｍｏｙｅｒ、Ｒ，Ｗ、　＆ 　Ｇｒａｖｅｓ、Ｒ。

Ｌ、　（１９８１）　Ｃｅ１ｌ　２７．３９１−４０１　；　Ｂａｒｏｕｄｙ、 Ｂ、Ｍ、、　Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ。

Ｓ、　＆　Ｍｏ５ｓ、Ｂ、　（１９８２）　Ｃｅ１ｌ　２８．３１５−３２４） 。１つのモデルでは、共有結合により閉じたヘアピン末端を有する直線状の二本 鎖ＤＮＡゲノムを、一方または両方のヘアピン末端に近い一本鎖上にニックを入 れ、そこから重合を開始できる３′ＯＨを提供する。末端ペアピンあたり、線状 ゲノムの下方および反対のヘアピンあたりで伸長が進行し、鎖置換機構により連 鎖状のＤＮＡ分子を生じる。このモデルはラギング鎖合成を必要としないが、使 用することもできる。

図２３は、ワクシニアウィルス感染細胞からの抽出物がα−（”Ｐ）ＡＴＰとの インキュベーション後に約６１　ｋＤの分子量の新規放射能標識ポリペプチドを 含むことを示す。この活性は、粗抽出物と部分精製抽出物の両者において感染後 初期（レーン２）と後期（レーン３）！；検出可能である。５ＤＳ−ＰＡＧＥに より評価したサイズはＳａｌ　Ｆ　１５Ｒのアミノ酸組成から推定される６３　 ｋＤと良く合い、広範な翻訳後修飾の欠失と一致するであろう。放射能の取り込 みの程度は、約４６　ｋＤの不鮮明なバンドのみが可視できる偽感染細胞（レー ン１）のものよりずっと大きい。このポリペプチドはワクシニアウィルス感染細 胞からの抽出物にも弱い強度で存在する。レーン５は子ウシ胸腺から高度に精製 した１３０　ｋＤの哺乳類ＤＮＡリガーゼＩを示す。偽感染細胞は感染細胞抽出 物中の６１　ｋＤバンドと同時移動するポリペプチドを全（含まない。このこと は、このタンパク質の出現がワクシニアウィルスの感染の結果であることを示唆 する。

６１　ｋＤポリペプチドは予想されるＤＮＡリガーゼの性質を有する（図２４） 。感染中後期のワクシニアウィルス感染細胞の抽出物から得られたホスホセルロ ースカラム分画をα−（”Ｐ）ＡＴＰと共にインキュベートし、次いで５ｅｐｈ ａｄｅｘ　Ｇ−２５を使って過剰のＡＴＰを除去した。溶出したタンパク質を添 加なしで（レーン４）またはＤＮＡリガーゼ基質（レーン５）もしくはビロリン 酸ナトリウム（レーン６）と共にインキュベートした。ＤＮＡリガーゼ基質の存 在は、酵素から（”Ｐ）−ＡＭＰの消失を伴うリガーゼ反応を完全に進行させる 。反対に、高濃度のビロリン酸塩は、遊離酵素とＡＴＰの逆方向への平行を進行 させ、再びポリペプチドからの放射能の放出を結果として伴う（図２４）。この 結果は、６１　ｋＤポリペプチドがＤＮＡ鎖連結活性を有するＤＮＡリガーゼで あることを示す。

ポリｄＡにアニールした３０マーの（″”Ｐ）−ｄＴオリゴデオキシヌクレオチ ドの連結を測定するアッセイを用いて、ＤＮＡリガーゼの増加がワクシニアウィ ルス感染時に検出できるかどうかを測定した。活性は、ｄＴオリゴヌクレオチド （ｎ＝２）　、ｄＴのトリｖ−（ｎ＝３）およびより高級のオリゴマーの連結２ 分子に相当する標識生成物の出現により表される。バクテリオファージＴ４　Ｄ ＮＡリガーゼのアッセイはこの活性のための比較標準を提供する。偽感染細胞に おいて測定可能な基底レベルを上回るＤＮＡリガーゼ活性の増加がワクシニアウ ィルス感染後に観察される（図２５）。感染中初期のりガーゼ活性（レーン５お よび８）は、偽感染細胞（レーン６および９）中の細胞性活性よりもごくわずか に大きいだけであるが、感染中後期までに（レーン７および１０）活性は実質的 に高くなる。この低塩抽出緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣＩ）中で調製した抽出物 は、上溝（レーン５〜７）に比較して遠心後のベレット分画（レーン８〜１０） 中に全リガーゼ活性のかなりの部分を存する。しかし、ＩＭへの塩濃度の増加は 、全ＤＮＡリガーゼ活性の大部分を可溶性分画にシフトさせる（データは示して ない）。

Ｓａｌ　Ｆ　！ＳＲによりコードされるタンパク質の約１／３　（１８３アミノ 酸）を、以前に記載されたようにして（ＫｅｒｒおよびＳｍ１ｔｈ１９８９）細 菌性発現ベクターｐＥＸ３　（ＳｔａｎｌｅｙおよびＺｕｘｉｏ＋ＥＭＢＯＪ、 　３．１４２９　（１９８４））中にクローニングした。得られたβ−ガラクト シダーゼ／Ｓａｔ　Ｆ　１５Ｒ融合タンパク質に対してウサギポリクローナル抗 血清（ｐＥＸ　ｔ、ｒｃ）を惹起せしめた。

ｐＥＸ　ＬＩＧ抗血清は、感染後１．５〜４８Ｉ’１ｔｌＴ目Ｇ：　Ｃｓ５）　 −メチオニンで標識した細胞の抽出物から２つのウィルスポリペプチドを免疫沈 澱させた（図２６Ａ、レーン２）。５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分子量約６１　ｋＤの 上側のバンドは、約５４　ｋＤの下側のバンドよりもずっと強い。偽感染細胞に は全くタンパク質が認められない（レーン１）。ｐＥＸ　ＬＩＧ構成物中に挿入 された遺伝子の部分は、酵母ＤＮＡリガーゼと最も強力なアミノ酸配列相同性を 有する領域を含有しない。従って、哺乳類リガーゼとの交差反応は期待できない かもしれない。２つのポリペプチドは、ＤＮＡ複製の阻害剤であるシトシンアラ ビノシドでの細胞の処理がそれらの発現に影響を与えない（データは示してない ）ため、初期ウィルス遺伝子産物である。初めからの両タンパク質の合成は感染 後１．５〜２．５時間口に（”Ｓ）−メチオニンでの短期標識により感染中初期 に検出することができるが、感染後７〜８時間目くらい遅くてもごくわずかに減 少したレベルが観察される（データは示してない）。

ｐＥＸ　ＬＴＧ抗血清での免疫沈澱により検出された２つのポリペプチドのうち 大きい方は、５ＤＳ−ＰＡＧＩＥ上でワクシニアウィルス感染細胞からのＤＮＡ リガーゼ−ＡＭＰ付加物と同時移動する（図２６）。最大の分離を達成する電気 泳動上において検出することができる（’！Ｐ）−および（”Ｓ）−標識ポリペ プチド間のサイズのささいな違いは、おそら＜　（”Ｐ）−標識タンパク質中の ＡＭＰ成分の付加のためであろう。

ＤＮＡリガーゼは、それがもしＤＮＡＭ製に関与するとすれば、おそらく本質的 な遺伝子で多ろう。この場合、この遺伝子の特異的欠失を含む組換えウィルスを 選択することは不可能であろう。従って、Ｓａｌ　Ｆ　１５Ｒ遺伝子産物がワク シニアウィルス感染細胞におけるＤＮＡリガーゼ活性の増加の原因であることを 証明する別のアプローチを選択した。これは、放射能標識ＤＮＡリガーゼ−ＡＭ Ｐ付加物に対する免疫沈澱実験において、Ｓａｌ　Ｆ　１５Ｒによりコードされ るタンパク質に対して生起させたｐＥＸ　’ＬＩＧ抗血清を利用する。ｐＥＸ　 ＬＩＧ抗血清は、ワクシニアウィルス感染細胞からの抽出物において（”Ｐ）− 標：１ｉＤＮＡリガーゼタンパク質を効果的に免疫沈澱させることができ（図２ ７．レーン５）、一方で同じウサギからの免疫前血清（レーン４）または無関係 のｐＥＸ融合タンパク質に対して生起させた非特異的免疫血清（レーン６）は６ １　ｋＤポリペプチドを認識しない（図２８）。対照実験は、精製した子ウシ胸 腺ＤＮＡリガーゼ（レーンｌ）もバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼも共に 、ｐＥＸ　ＬＩＧ抗血清によって免疫沈澱できないことを示した（データは示し てない）。

Ｓａｌ　Ｆ　１５Ｒによりコードされるタンパク質に対して生起させた抗血清に よる新規ＤＮＡリガーゼ−ＡＭＰ付加物の免疫沈澱は、このワクシニアウィルス 遺伝子が観察されたＤＮＡリガーゼ活性をコードすることを証明する。

それらのデータは１９８９年に発表されているＣＳｍ１ｔｈら。

ワクシニアウィルスＤＮＡリガーゼの商業的可能性を評価するために、重比願人 らは該遺伝子を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で過剰発現させることを選んだ。これ を達成するために、該遺伝子をポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）により的確 に操作した（図２８）。コード鎖の５′末端を表すオリゴヌクレオチド（Ｂａｍ ＨＩとＮｄｅ　Ｉ部位を形成させるための余分な５′ヌクレオチドを含む）およ びほぼ１５０ヌクレオチド下流の該コード鎖に相補的なオリゴヌクレオチドをＰ ＣＲ反応に使用し、５ａｌｌＦ断片を鋳型としてプラスミドベクター中にクロー ニングした。

ＰＣＲ断片を５ａｉｌとＢｅ１ｌで消化し、モしてＳ’ａｌｌとＢｃｌｌで消化 されているｐｓＫ１６中にクローニングし、ｐｓＫ１７を作製した。

ｐｓＫ１６はｐＵｃ１３のＳｍａ　１部位中に挿入された全ＤＮＡリガーゼ遺伝 子を含み、そしてｐｓＫＩ３からのＣ１ａ［−Ｍｌｕｌ断片の単離により作製さ れた。ｐｓＫ１３は、ｐＵｃ１３中にクローニングされた５ａｌＴ　Ｆ断片の３ ．３ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−３ｒｎａｌ断片を含む、　ＰＣＲ断片を配列決定してＰ ｄＲにより全く突然変異が導入されなかったことを確認した。最後に、全ＤＮＡ リガーゼ遺伝子を５ａｌＩとＥｃｏＲＩによりρ５ＫＩ７から切り出し、そして ５ａｌｌとＥｃｏＲＩで消化されている細菌発現ベクターｐＧＭＴ？　（Ｒｏｓ ｅｎｂｅｒｇら、　Ｇｅｎｅ、　５６．１２５−１３５．１９８７）中にＴ７　 ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流にクローニングし、ｐｓＫ１８を作製し た。誘導性Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモーター遺伝子を所存する大腸菌株中 へのｐｓＫ１８の導入は、特異的誘導因子ＩＰＴＧの存在下で高レベルのＤＮＡ リガーゼ発現をもたらす。それらの誘導された細菌の粗溶解物は、ＡλＩＰを結 合した６１　ｋＤａの新規ポリペプチドを含んだ（図２９）。ワクシニアウィル スＤＮＡリガーゼが大腸菌中で活性であり、そして作製した細萌株が潜在的にこ の商業的に重要な酵素の大量供給を提供すると結論づけられる。

Ｓａｌ　Ｆ　３ＲおよびＳａｔ　Ｆ　１’３Ｒに使用したものと同じ方法により 、ＤＮＡリガーゼを欠くワクシニアウィルスの欠失変異体を作製した。プラスミ ドｐｓＫ１３をＮｒｕｌ　（リガーゼのメチオニン開始コドンのすぐ下流で切断 する）およびＢｇｌＩＩ　（更に９９７下流で切断する）で消化した。ＤＮＡポ リメラーゼ（フレノウ断片）により突出末端を平滑末端にし、そして２つの断片 のうち大きい方をＥＣＯｇｐｔ遺伝子と結合したワクシニアウィルス７．５にプ ロモーターに連結せしめた。後者はＥｃｏＲＩ断片として単離され、ＤＮＡポリ メラーゼ（フレノウ断片）により平滑末端化されている。ＤＮＡリガーゼ遺伝子 の１　ｋｂがＥＣＯｇｐｔ遺伝子により置き換えられている生成プラスミドをｐ ｓＫ１４と命名し、これを用いてＷＴワクシニアウィルス感染ＣＶ−１細胞をト ランスフェクトせしめた。ＥＣＯｇｐｔを発現するウィルスをＭＰＡ中での増殖 により単離し、幾つかの単離物のＤＮＡをサザンプロットにより分析した（図３ ０）。それらのデータは、幾つかのウィルス単離物がＤＮＡリガーゼ遺伝子の内 部１　ｋｂ領領域失ってしまっているが未だ組織培養において十分に増殖できる ことを示す。この知見と一致して、ウィルス感染細胞中のワクシニアウィルスＤ ＮＡリガーゼのアッセイ（Ｋｅｒｒ　＆Ｓｍ１ｔｈ、　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅ５＝、１７．９０３９．１９８９に記載された方法による）は、ＤＮＡリガー ゼＤＮＡを失っているそれらのウィルス中に検出可能なりＮＡリガーゼがないこ とを示す（図３１）。

それらのデータは、（驚くべきことに）該酵素が試験管内でのウィルス複製にと って非本質的であり、そしてＤＮＡリガーゼ遺伝子が外来遺伝子をウィルスゲノ ム中に挿入できる追加の部位であることを指摘している。多分、ＤＮＡリガーゼ 遺伝子は組織培養におけるウィルス複製にとって非本質的であるけれども、ＤＮ Ａリガーゼ欠損ウィルスの複製は生体内では減少するだろうし、そしてそのよう なウィルスは弱毒化されるだろう。

用途 予防接種計画においてまたは抗体の調製の際の免疫原として使用される組換えワ クシニアウィルスワクチンでは、常用の遺伝子工学技術によって免疫原をコード する遺伝子を単離しそしてウィルスベクター中に導入し、そして予防接種により 宿主、例えばヒトまたは動物に移行する。組換えウィルスワクチンを抗体生産の ために用いようとする場合、当業者に周知の標準技術を使って、宿主の抗血清か ら免疫原に対する抗体を単離する。当業者に周知の標準技術を使って、免疫処置 された動物の細胞からモノクローナル抗体を調製することもできる。

常用の遺伝子工学技術を使って、提供したヌクレオチド配列によりコードされる アミノ酸配列によりコードされるペプチドを生産することができる。

同定された該遺伝子配列は、ワクシニアウィルスゲノム中への「外来ｊ遺伝子配 列の挿入のための部位もまた提供し、そしてワクシニア遺伝子の不活性化により ウィルスの弱毒化を引き起こすことができる。

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Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）下記の１または複数のヌクレオチド配列の全部もしくは部分がウイルス ゲノムから除去されており；そして／または ｂ）１または複数の前記ヌクレオチド配列が突然変異または外来ＤＮＡの挿入に より不活性化されており；そして／または ｃ）前記ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質生産物の機能を改変す るために１または複数の前記ヌクレオチド配列が変更されており； ここで前記ヌクレオチド配列が、 ｉ）ＳａｌＦ３Ｒ ｉｉ）ＳａｌＦ９Ｒ ｉｉｉ）ＳａｌＦ１３Ｒ ｉｖ）Ｂ５Ｒ ｖ）ＳａｌＦ１５Ｒ と命名された配列である、ワクシニアウイルスベクター。
2. ２．１または複数の異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請 求項１に記載のワクシニアウイルス。
3. ３．１または複数の異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、前記１または 複数のヌクレオチド配列の全部もしくは部分を削除することにより生成した１ま たは複数の連結部位中に押入される、請求項２に記載のワクシニアウイルス。
4. ４．増強された免疫原性を有する、請求項１に記載のワクシニアウイルス。
5. ５．ａ）免疫抑制を引き起こす１または複数のワクシニアヌクレオチド配列の全 部もしくは部分がウイルスゲノムから除去されており；そして／または ｂ）免疫抑制を引き起こす１または複数の前記ワクシニアヌクレオチド配列が突 然変異または外来ＤＮＡの挿入により不活性化されており；そして／または ｃ）前記ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質生産物の機能を改変す るために１または複数の前記ワクシニアヌクレオチド配列が変更されており； ここで前記ヌクレオチド配列が、 ｉ）ＳａｌＦ３Ｒ ｉｉ）ＳａｌＦ９Ｒ ｉｉｉ）ＳａｌＦ１３Ｒ ｉｖ）Ｂ５Ｒ ｖ）ＳａｌＦ１５Ｒ と命名された配列である、請求項４に記載のワクシニアウイルス。
6. ６．前記ワクシニアヌクレオチド配列がＳａｌＦ３Ｒと命名された配列である、 請求項５に記載のワクシニアウイルス。
7. ７．免疫応答を増強する異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る 、請求項４に記載のワクシニアウイルス。
8. ８．前記ＤＮＡ配列がＣＤ２３をコードする、請求項７に記載のワクシニアウイ ルス。
9. ９．請求項１に記載のワクシニアウイルスベクターを含んで成るワクチン。
10. １０．請求項１に記載のワクシニアウイルスベクターを含んで成る医薬。
11. １１．下記ヌクレオチド配列のいずれかの全部または部分によりコードされるポ リペプチド 〔ここで前記配列は ｉ）ＳａｌＦ３Ｒ ｉｉ）ＳａｌＦ９Ｒ ｉｉｉ）ＳａｌＦ１３Ｒ ｉｖ）Ｂ５Ｒ ｖ）ＳａｌＦ１５Ｒ と命名された配列である〕；並びに前記ポリペプチドの対立因子および誘導体。
12. １２．ＳａｌＦ１５Ｒと命名されたヌクレオチド配列によりコードされ、そして ＤＮＡリガーゼとしての活性を有する、請求項１１に記載のポリペプチド。
13. １３．ワクシニアウイルスベクターの弱毒化方法であって、ａ）下記の１または 複数のヌクレオチド配列の全部もしくは部分をウイルスゲノムから除去し；そし て／またはｂ）前記ヌクレオチド配列の突然変異または外来ＤＮＡの挿入により １または複数の前記ヌクレオチド配列を不活性化し；そして／または ｃ）前記ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質生産物の機能を改変す るために１または複数の前記ヌクレオチド配列を変更し； ここで前記ヌクレオチド配列が、 ｉ）ＳａｌＦ３Ｒ ｉｉ）ＳａｌＦ９Ｒ ｉｉｉ）ＳａｌＦ１３Ｒ ｉｖ）Ｂ５Ｒ ｖ）ＳａｌＦ１５Ｒ と命名された配列である、ワクシニアウイルスベクターの弱毒化方法。
14. １４．請求項１に記載のワクシニアウイルスベクターを使用することを含んで成 る、ワクチンまたは医薬の調製方法。
15. １５．ウイルスゲノム中に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされる異種ポリペ プチドに対して特異性を有する抗血清、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗 体またはＴ細胞の調製のための免疫原として請求項１に記載のワクシニアウイル スベクターを使用する方法であって、前記ワクシニアウイルスベクターを用いて 動物を免疫処置することを含んで成る方法。
16. １６．請求項１５の方法を使って得られるモノクローナル抗体、ポリクローナル 抗体、抗血清および／またはＴ細胞。
17. １７．請求項１６に記載のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清お よび／またはＴ細胞を含んで成る診断試験キット。
18. １８．ＳａｌＦ１５Ｒと命名されたヌクレオチド配列の全部もしくは部分、また は前記ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の全部もしくは部分を 使用して、ＤＮＡリガーゼ活性を有するポリペプチドを同定する方法。