JPH06502989A - 単純ヘルペスウィルスのｖｐ１６のワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４２、請求項３９に記載の組換え発現系により形質転換された宿主細胞。

４３、Ｈ３Ｉ／感染の治療に用いられる免疫原性ポリペプチドを生産する方法で あって、 （ａ）請求項４１に記載の宿主細胞を提供する工程；（ｂ）該ポリペプチドを発 現させる条件下で、該宿主細胞をインキュベートする工程：および （Ｃ）該宿主細胞から発現したポリペプチドを単離する工程、 を包含する、方法。

４４、ＨＳＶ感染の治療に用いられる免疫原性ポリペプチドを生産する方法であ って、 （ａ）請求項４２に記載の宿主細胞を提供する工程；（ｂ）該ポリペプチドを発 現させる条件下で、該宿主細胞をインキュベートする工程；および （Ｃ）該宿主細胞から発現したポリペプチドを単離する工程、 を包含する、方法。

４５、請求項４３に記載の方法により生産される、ＨＳＶ感染の治療に用いられ る免疫原性ポリペプチド。

４６、請求項４４に記載の方法により生産される、ＨＳＶ惑染の治療に用いられ る免疫原性ポリペプチド。

明細書 ヘルペスウィルスのＶＰ１６のワクチン技術分野 本発明は、ヘルペスウィルス感染を軽減する物質および方法に関する。より詳細 には、本発明は、ＶＰ１６およびそのフラグメントを含むｖｐｉａの免疫原性エ ピトープを含むポリペプチドを含有する組成物、およびその組成物に使用するポ リペプチドの調製方法に関する。

ヘルペスウィルスには単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）　カ含１れ、このＥ［Ｓ Ｖには非常に近縁の変異体であるＩ　Ｗ　（ＨＳＶ−１）　オよび２型（ＨＳＶ −２）がある。単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）はヒトの性器感染症の流行の原 因であり、１年間に新しく発生する推定件数は６００．０００件にのぼり、１千 万〜２千万人が症候性の慢性的な回帰発症を経験している。無症候性の不顕性感 染の比率はさらに高い。型特異的血清学的アッセイを用いることにより、研究者 は、アトランタの健康維持組織の診療所に通う無作為抽出の女性集団のうちの３ ５％にＨ３’／２型（１ｉｓＶ−２）に対する抗体を確認した。アシクロビルの ような抗ウィルス剤を連続投与すると急性のＨＳ’／疾患の重症度が改善し、再 発が起こる頻度と期間が減少するが、このような化学療法を介在させると潜伏の 定着を抑えこめず、この潜伏性ウィルスの状態も変化させ得ない。その結果、薬 剤治療を中止すると、回帰発症のパターンがただちに復活する。ウィルス伝播の 主たる源は再発性疾患からのものであるため、感染率に影響を与えるいかなる方 法も結局ワクチン法を必要とする。したがって、ｕｓｖ＠染を予防するためのヒ トに対して安全で有効なワクチン、および感染が起きたときの疾患の治療法を提 供することは、医学および科学の両面からの大きな関心事である。

１１ｓＶ１１．２本！ＤＮＡウィルスであり、メンブレンエンベロープで囲まれ た正二十面体のカプシド内に約１５０〜１６０にｂｐのゲノムヲ有シている。そ のウィルスエンベロープは、ｇＢ、　ｇＣ，ｇＤ、ｇＥおよびｇＧを含む少なく とも７種のウィルス特異的糖タンノくり質を含有し、そのうちｇＢとｇＤはｌ型 と２型に対し交差反応性である。ワクチン治療の１つの方法は、単離した糖タン ７＜り質を使用する方法であるが、この糖タン、ｆり質は、マウスに注射し、続 いてこのマウスに生きたウィルスを感染させたときに防御が生じることが分かつ ている。

１７Ｐ１６遺伝子産物は、カプシドとエンベロープの間に位置するビリオンテグ メントと結合している（図１参照）。ＶＰ１６は、ピリオン刺激因子であるが、 １ピリオン当り約５００〜１０００コピー生じる豊富なタンパク賃である。それ は、別名１ｃＰ２ｓ、’／ｍＷ６５およびα−トランス誘発因子（αＴＩＦ）と も呼ばれてきた。

ＶＰ１６の研究の大部分は、ＨＳＶが複製する際の”即時型遺伝子（ｉｍｍｅｄ ｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ｇｅｎｅ）　”のトランス活性化におけるＶＰ１６の役 割を探求している。ＶＰ１６がピリオン内部に位置してｔ）ることと、１１ＳＶ の複製モードに関する現在の知見に基づくと、ｖｐｉａは、ＨＳＹ感染の治療に 用いられる優れた候補とは考えられな閲」しζ献 ５ｐｅａｒおよびＲｏｉｚｍａｎ（１９７２）は、精製ＥＩＳＶＩ中のタンパク 質の電気泳動分離を開示している。ＭｃＬｅａｎら（１９８２）は、ＨＳＶＩお よびＨＳＶ２由来のＶＰ１６との相互作用が推定されるモノクローナル抗体を開 示している。

Ｅｂｅｒｌｅら（１９８４）は、初回時および再発時のＦｉＳＶ−２による性器 感染症罹患中の、ＦＩＳＶ成分に対する抗体応答についての研究を開示している 。

Ｃａ＋ｍｐｂｅ１１ら（１９ｇ４）は、ＨＳＶｌの’／＋ｍＷ６Ｓをコードする ＤＮＡ配列を推定的に開示し、および１ｆＳＶ即時型（ＩＥ）転写をトランス活 性化する主たるテグメントビリオン成分としてのＶａ＋ｆ６５を同定している。

Ｐｅｌ　ｌｅｔ　ｔら（１９８５）は、一過性の発現系中での、クローニングさ れた１（ＳＶＩα−ＴＩＦコーディング配列の発現を開示している。

Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇら（１９８８）は、［［Ｓ’／Ｉ　ＶＰ１６の推定アミ ノ酸配列およびその欠失変異体を開示している。

ＭｃＧｅｏｃｈら（１９８８）は、１（ＳＶ−１株１７の長いユニーク領域（Ｕ Ｌ　）のＤＮＡ配列を提示している。この領域は、遺伝子ＵＬ４１１中の、主た るテグメントタンパク！（これは、新たに感染された細胞中でのＩＥ遺伝子の転 写のアクチベーターである）をコードすると推定されるセグメントを含む。

１１文厘 Ｂａｒｒら（１９８６）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：４２ｇ。

ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ　３００ゴ０６゜Ｂｒ ｏａｃｈ（１９８１）　：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｖｏｌ、１、ｐ、４４５、Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｂｒｏａｃｈら＜１９８３＞、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、　）Ｊｐ：３０７゜Ｃａｍｐ ｂｅｌｌら（１９８４）、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｌ、　１１：１゜Ｃｈａｋｒ ａｂａｒｔ　ｉら（１９８５）、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、ｉ＋３４０ ３゜Ｃｈａｎｇら（１９７７）、Ｎａｔｕｒｅ　ｌｊｉ：１０５６゜Ｃ１ｅｖｅ ｌｌら（１９６９）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ　６２ ：１１５９゜Ｃ１ｅｖｅｌｌ（１９７２）、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、ｌｌ ：６６７゜Ｃｏｈｅｎ（１９７２）、Ｔ’ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　６９：２１１０゜Ｃｒｅｇｇら（１９８５”）、Ｍｏ１．　 Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、ｉ：３３７６゜Ｄａｓら（１９８４）、Ｊ、　Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌ、　ｌｊｉ：１１６５゜Ｄａｖｆｄｏｖら（１９１１５）、Ｃｕｒｒ 、Ｇｅｎｅｔ、ｌｊ；ｊ：３９゜Ｄａ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３） 、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｔｏｌ、１５４ニア３７゜ｄａ　Ｂｏｅｒら（１９８３）、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ　８０：２１゜ｇｂｅｒｌｅら （１９１１４）、Ｊ、ｇｅｎ、Ｖｉａｌ、６５：ＩＥ９゜Ｇｌｅｅｓｏｎら（１ ９８５）、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｊｃｒｏｂｆｏｌ　ｌｊ、ｊ：３４５９゜Ｇｒａｈａ ｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ（１９７８）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：５４６ ゜Ｇｏｅｄｄｅ　Ｉら（１９８０）、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８：４０ ５７゜［１ｅｓｓら（１９６４１）、Ｊ、Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、７： １４９゜Ｈｏｌ　１ａｎｄ（１９８１）、Ｊ、　Ｊｏｌ、　Ｃｂｅｒａ、　釘値 ：１３８５゜Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）、Ｊ、　Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｗ＋ｅ　Ｒ ｅｇ、ヱ：１９２９゜Ｊｕ（１９＋１７）、ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲＶＥＣ ＴＯＲＳ　ＦＯＲＭＡＭＭＡＬＩＡＮ　ＣＥＬＬＳ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌ ｏｓ編、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、）Ｋｕｎｚｅら（１９８５） 、Ｊ、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｆｏｌ　２５：１４１゜Ｋｕｒｔｚら（１９８ ５）、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌＢｉｏｌ　ｆｉ：１４２゜ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍ ｍｅｒｓ（１９８９）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　ＬＺ：３１゜Ｍａｃｋｅｔｔら（１ ９８４）、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４９＋８５７゜Ｍａｃｋｅｔｔら（１９８７）、” ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−１Ｖｏ１．　Ｉｌ、ＩＲＩ、　Ｐｒｅｓｓ。

１）、１９１゜ Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８９）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮ＋ＮＧ；　Ａ　 ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、、５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　（Ｃ ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓｓ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、）。

Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９８１）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、ｆｉ： ３０９゜ＭｃＧｅｏｃｈら（１９８ｇ＞、Ｊ、ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ、６９：１５ ３１゜ＭｃＬｅａｎら（１９８２）、Ｊ、ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ、６３：２９７゜ Ｍｉｃｈｅｌｌｅら、　Ｉｎｔ、Ｓｙ＋ｉｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｖｉｒｔｓｌ　 Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ。

Ｍｏ５ｓ＜１９８７）、ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲＩＩＥｃＴＯＲ３ＦＯＩ？ 　ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ　ＣＥＬＬＳ　（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａ１ｏｓｊｌ、　 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｌｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒｓ　Ｎ、Ｙ、）　ｐ、１０゜Ｎｅｕｒａｔｈら（１９８ ４）、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：３９２゜Ｐｅ１ｌｅｔｔら（１９８５）、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８２：５８Ｓａｎｇｅｒら（ １９７７）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ　ｔｌｓＡ　７４：５４６ ３゜５ｈｉｉａｔａｋｅら（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２１１゜Ｓ ｍ１ｔｈら（１９８３）、Ｍｏ１．　＆　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　！＋２１５６ ゜５ｐｅａｒおよびＲｏｉｚｍａｎ（１９７２）、Ｊ、　’／１ｒｏ１．　ｉ＋ １４３゜Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇら＜１９８８）、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄａ− ｖｅｌｏｐｍｅｎＬ　２ニア１ａ。

Ｖａｌｅｒ＋ｚｕｅｌａら（１９ｇ２）、Ｎａｔｕｒｅ　２９８：３４４゜Ｙａ ｌｅｎｚｕｅｌａら＜１９８４＞、ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ　Ｂ（Ｍｉｌｌｍａｎ、 １．ら編、ＰｉｅｎｕＩＩＰｒｅｓｓ）　ｐ２２５゜ Ｗａｒｎｅｒ　（１９８４）、ＤＮＡ　３−：４０１゜ｆａｔｓｏｎら（１９１ １２）、５ｃｉｅｎｃｅ　ｉｌ：３８１−Ｖｌｅｊｓｓｒａａｎ　（１９８１） 、”Ｔｈｅ　ａｔｏｎｉｎｇ　ｏｆ　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ａｎｄ　ｏｔｈｅ ｒｍｔｓｔａｋｅｓ、−Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　３　（［、Ｇｒｅｓｓｅｒｉｉ ）。

Ｚｏｌｌｅｒ（１９８２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　ｌｉ：６ ４８７゜発μしとｌ示 本発明は、ｌｌ５ＶのテグメントポリペプチドであるＶＰ１６が免疫原性であり 、ＨＳＶの感染によって起こる疾患を改善させた発見に基づく。したがって、本 発明には、■ｓｖ惑染症の治療に有用なＨＳＶ　’１Ｐ１６の免疫原性エピトー プを含有する組成物、これらの組成物に用いるポリペプチド、これらの組成物を 用いるｌＩｓ■感染の治療法、ならびにこれらの組成物およびこれらの組成物に 用いる免疫原性ポリペプチドのｗ４製方法が含まれ、さらにこれらのポリペプチ ドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターおよび該ベクターで形質転 換された細胞も含まれる。

したがって、本発明の１つの局面は、ＨＳＶ　ＶＰ１６の免疫原性エピトープを 含有する単離された免疫原性ポリペプチドを含み、該ポリペプチドが製薬的に受 容可能な賦形剤中に薬学的に前動な用量で存在している、個体の単純ヘルペスウ ィルス（１’ｌｓＩ／）　＠染を治療するために用（為る組成物である。

本発明の他の局面は、ウィルスが、ＨＳＶ　ＶＰ１６、別型のＦＩＳ’／ＶＰ１ ６およびその変異体から選択される免疫原性ポ１ノペプチドをコードする配列を 含有し、該免疫原性ポ１ノペプチドをコードするポリヌクレオチドが制御配列ζ こ作動可能（こ連結されている組換えワクシニアウィルスを含む組成物である。

本発明のさらに他の局面は、 （ａ）ＨＳＶ　ＶＰｌｆｉの免疫原性エピトープを含む免疫原性ポリペプチドを 提供し； （ｂ）そのポリペプチドを製薬的に受容可能な賦形剤で製剤する； ことからなるＨＳＶ感染の治療に用−＼る組成物の調製方法である。

本発明の他の局面は上記の方法↓こより調製される組成物である。

本発明のさらに他の局面は、上記組成物を個体（こ投与することからなる、）Ｉ ｓｖ＠染に対して個体を治療する方法である。

本発明の別の局面は、ＨＳＶ−２ＶＰ１６の免疫原性エピトープを含むポリペプ チドをコードする組換えボ！ノヌクレオチドである。

本発明のさらに他の局面は、上記のボ１ノヌクレオチドを含有する組換えベクタ ーである。

本発明のさらに池の局面は、Ｈｓ’／−２ＶＩ’Ｌ６の免疫原性エピトープを含 むポリペプチドをコードするＤＮＡのオーブン１ノーデイングフレーム（ＯＲＦ ）を含み、そのＯＲＦが所望の宿主と適合性の制御配列と作動可能に連結されて いる組換え発現系である。

本発明の他の局面は、請求項３８の組換え発現系により形質転換された宿主細胞 である。

本発明のさらに他の局面は、 （ａ）上記宿主細胞を提供し； （ｂ）該宿主細胞を、ポリペプチドを発現できる条件下でインキュベートし；お よび （ｃ）発現されたポリペプチドを宿主細胞から単離する；ことからなる、■Ｓｖ 感染の治療に用いる免疫原性ポリペプチドの調製方法である。

本発明のさらに池の局面は、上記の方法で調製される、ｌｌ５Ｖ感染の治療に用 いる免疫原性ポリペプチドである。

」ｉ旦１星星鳳ユ 図１はＨ３ｖピリオンの概略図である。

図２はＨＳＶ−１’／Ｐ１６およびＨＳＶ−２ＶＩ’１６（７）推定アミノ酸配 列を示す。

図３はＨＳＶ−２’／Ｐ１６をコードするヌクレオチド配列およびそのヌクレオ チドにコードされたアミノ酸を示す。

図４はベクターのｐＡＣ３７３およびｐＶＩ、９８５のいくつかの重要な特徴と 、そのポリヘトリン遺伝子のＮ末端アミノ酸をコードする配列を示す地図である 。

図５はベクターｐＨ５２２５のいくつかの重要な特徴を示す地図である。

図６はＷＯ３８１０２６３４（７）図４の写しであり、ＨＳ’／　ｇＢ２をコー ドするヌクレオチド配列、およびその配列にコードされたアミノ酸を示す。

図７はべ’）　９−　ｐＨ５２１８のいくつかの重要な特徴を示す地図である。

図８はベクターｐＢＣＢＯ７のい（つかの重要な特徴を示す地図である。

図９はベクターｐＶＡＣＣ−ｇＢ２のいくつかの重要な特徴を示す地図である。

図１０は抗体の力価試験におけるウェル含宵量を示す図である。

図１１はｖｖ−ｇＢ２およびｖｖ−ＶＰ１６による免疫化により生じるＨ３Ｖ特 異的補体依存性中和抗体の力価を示す棒グラフである。

図１２はｖｖ−ｇＢ２による免疫化により生じる防御の時間的経過を示すグラフ である。

図１３はｖｖ−’ＶＰ１６による免疫化により生じる防御の時間的経過を示すグ ラフである。

図１４はｖｖ−ｇＢ２、ｖｖ−ＶＰ１５、およびｖｖ−ｇＢ２＋ｖｖ−ＶＰ１６ による免疫化により生じる防御の時間的経過を示すグラフである。

Ｂる 下記の用語が本願で用いられる。

”ポリペプチド“という用語は、アミノ酸のポリマーを意味し、特定の長さの生 成物を意味しない。したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は ポリペプチドの定義に含まれる。またこの用語は、ポリペプチドの発現後の修飾 物、例えばグリフシル化物、アセチル化物、リン酸化物などを意味せず、すなわ ち除外する。この定義に含まれるものとして、例えば１つ以上のアミノ酸類似体 （例えば非天然のアミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、置換された連 鎖を有するポリペプチド、ならびに当該技術分野で知られている天然および非天 然の他の修飾物がある。

”単離されたポリペプチド”という用語は、ＨＳＶウィルスのその他の成分、特 にポリヌクレオチドを実質的に含有していないポリペプチドを意味する。組成物 中のポリペプチドの重量がそのポリペプチドおよび混合されている他の成分の重 量の少な（とも７０％、好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは約９ ０％および最も好ましくは９５％以上である場合、そのポリペプチドの組成物は 他の成分を”実質的に含有していない”。例えば１００μｇ／＊ｌ＋７）ｌ／Ｐ １６とわずか３μｇ／母液ノｕｓｖ成分（例えばＤＮＡ、脂質など）を含有する 組成物は、”　）ＩｓＶウィルスのその他の成分”を実質的に含有していないの で、この定義の適用範囲内にある単離されたポリペプチドの組成物である。

同様に、本発明のいくつかの組成物は、単離されたＶＰ１６ポリペプチドを、１ つ以上の単離されたＨＳＶＮタンパク質、例えばｇＢ、　ｇＣ，ｇＤなどと組合 わせて含有している。

”組換えポリヌクレオチド”は、ゲノムの、ｃＤＮＡの半合成の、もしくは合成 の起源のポリヌクレオチドを意味し、その起源または操作によって、（１）それ が天然では会合するポリペプチドのすべてもしくは一部と会合しない、（２）天 然では連結するのと異なるポリヌクレオチドと連結する、または（３）天然には 生成しない、ポリペプチドである。

”ポリヌクレオチド”は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態であり、リ ボヌクレオチドまたはデオキシ１ノボヌクレオチドのいずれかである。この用語 は、その分子の一次構造のみを意味する。したがってこの用語には、二本鎖およ び一本鎖のＤＮＡならびにＲＮＡが含まれる。またこの用語に（±、公知の種類 の修飾物：例えば当該技術分野で公知の標識、メチル化物、−ｃａｐｓ”、１つ 以上の天然ヌクレオチドの類似体ζこよる置換物、介在ヌクレオチド修飾物、例 えば電荷のな℃＼連鎖（例えばチオリン酸、ジチオリン酸などの連鎖）を有する もの、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド 、ポリーＬ−リシンなどを含む）のようなペンダント部分を有するもの、挿入物 （例えばアクリジン、ブノラレンなど）を有するもの、キレート化剤（例え（ｆ 金属、放射性金属など）を含有するもの、アルキルの、修飾連鎖（例えばαアノ マー核酸など）を有するもの；ならびに未修飾形のポリヌクレオチドが含まれる 。

”組換え宿主細胞”、”宿主細胞”、”細胞”、”細胞系”、”細胞培養物”な どのような単細胞生物として培養される微生物も（２くは高等真核細胞系を示す 用語（よ、組換えベクターなどの運搬ポリヌクレオチド用の受容生物として使用 し得るか、または使用されている細胞を意味し、トランスフェクトされた元の細 胞の子孫が含まれる。単一の親細胞の子孫が、その形態またはゲノム相補体もし くは全ＤＮＡ相補体において、天然の、偶発的な、または意図的な変異のために 、元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよい。

”レプリコン”は遺伝子のエレメント、例えばプラスミド、染色体、ウィルス、 コスミドなどであり、ポリヌクレオチドの複製の自律単位として細胞内で挙動す る。すなわちそれ自体の制御下で複製することができる。

”ベクター”は、さらにオーブンリーディングフレームの複製および／または発 現を行う配列を有するレプリコンである。

”制御配列”は、連結されているコーディング配列の発現を行うのに必要なポリ ヌクレオチド配列を意味する。このような制御配列の性質は宿主生物によって異 なる。すなわち原核生物では、そのような制御配列は一般にプロモーター、リポ ソーム結合部位およびターミネータ−を含んでおり、真核生物では一般に、その ような制御配列はプロモーター、ターミネータ−、およびいくつかの例ではエン ハンサ−を含んでいる。７制御配列”という用語は、最小限、発現のために存在 することが必要なすべての要素を含み、および存在することが有利な追加の要素 、例えば分泌を支配するリーダー配列も含み得ることを意味する。

”プロモーター”は、隣接する構造遺伝子に対する正常転写開始部位でｄＮＡ産 生が始まる様式で、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡ鋳型に結合させるコンセンサス 配列で構成されているヌクレオチド配列である。

“作動可能に連結された”という用語は、このように記載された要素を、意図す る形態に機能できる関係に並列させることである。コーディング配列に”作動可 能に連結された”制御配列は、そのような並列がなされるために、コーディング 配列の発現が制御配列と適合性の条件下で達成される方式で連結されている。

”オーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）”はポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド配列の領域である。この領域はコーディング配列の一部、または全 コーディング配列を表し得る。

”コーディング配列“は、適切な調節配列の制御下におかれた場合にｍＲＮＡに 転写される、および／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列で ある。コーディング配列の境界は、５“未満における翻訳開始コドンおよび３° 末端における翻訳停止コドンによって決定される。コーディング配列にはｍＲＮ Ａ，　ＤＮＡ　（ｃＤＮＡを含む）、および組換えポリヌクレオチド配列が含ま れるが、これらに限定されない。

”エピトープという用語は、本願で用いられる場合、ポリペプチドの抗原決定基 を意味する。エピトープは、そのエピトープ固有の立体コンホメーションに３個 のアミノ酸を含有し得る。一般にエピトープはこのようなアミノ酸の少なくとも ５個で構成され、通常はこのようなアミノ酸８〜１０個で構成される。このよう なアミノ酸の立体フンホメーシコンを決定する方法は、当該技術分野で公知であ り、例えばＸ線結晶学法および二次元核磁気共鳴法がある。

”免疫原性エピトープは、細胞性免疫および／または液性免疫応答を誘発するポ リペプチド中のエピトープであり、その応答はこのポリペプチド単独でも誘発し 得、または、アジュバントが存在するか存在しないかにかかわらずキャリアーを 必要とし得る。

エピトープが、指定のポリペプチド中のエピトープに免疫学的に結合する複数の 抗体と交差反応を行わせるアミノ酸配列およびフンホメーシミンを有していると き、そのエピトープは、指定のポリペプチド中の他のエピトープの”免疫学的に 当量”のエピトープである。

指定のポリペプチドのエピトープという用語は、本願で用いる場合、措定のポリ ペプチド中のエピトープおよびその免疫学的当量物と同じアミノ酸配列を有する エピトープを意味する。

Ｉ（ＳＶ　ＶＰ１６の免疫原性エピトープを含む”ポリペプチドは、少な（とも 免疫原性エピトープを形成する数のＨＳＶ　ＶＰ１６のアミノ酸配列を有するポ リペプチドであり、通常少なくとも約５個のアミノ酸を含有し、より通常的には 少なくとも約８個のアミノ酸を含有し、さらに一層通常的には約１０個以上のア ミノ酸を含有し、最大の大きさは決定的ではない。ＨＳＶ　ＶＰ１６由来のアミ ノ酸配列は、そのアミノ末端および／またはカルボキシ末端に、他のポリペプチ ド（例えばキャリアータンパク質）を共有結合させるか、または融合ポリヌクレ オチドを発現させて融合するタンパク質を形成させることによって連結し得る。

所望により、エピトープの多数の反復物を挿入もしくは結合するか、および／ま たは各種のエピトープを組み込み得る。キャリアータンパク質はどのようなソー スからでも誘導することができるが、一般に、ＢＳＡ、　ＫＬ■などのような比 較的大きな免疫原性タンパク質である。所望により、キャリアーとして実質的に 全長のＶＰ１６タンパク質を用いて、免疫原性エピトープの数を増やすことがで きる。あるいは、ＨＳＶＶＰ１６由来のアミノ酸配列は、アミノ末端および／ま たはカルボキシ末端で、非ｎｓｖ　ＶＰ１５アミノ酸配列に連結し得、その場合 このポリペプチドは融合ポリペプチドである。類似のタイプのポリペプチドが、 他の指定のウィルスタンパク質由来のエピトープを使って構築し得る。

指定のポリペプチドの”変異体”とは、その指定されたポリペプチドのアミノ酸 配列が、その配列の１つ以上のアミノ酸の欠失もしくは置換によって、またはそ の配列に１つ以上のアミノ酸を付加することによって改変されたポリペプチドを 意味する。変異体を生成させる（例えば組換え法によって）または作製する（例 えば部位突異的変異誘発法によって）方法は当該技術分野で公知である。

”形質転換”は、挿入に使用した方法、例えば直接取込み、形質導入（ウィルス 感染、ｆ交配もしくはエレクトロポレーションを含む）に関わらず、宿主細胞に 外来性ポリヌクレオチドを挿入することを意味する。その外来性ポリスクレオチ ドは、非組込みベクター、例えばプラスミドもしくはウィルスゲノムとして保持 させるか、またあるいは、宿主ゲノム中に組込んでもよい。

”個体“は、を椎動物、特に哺乳類の種のメンバーを意味し、家畜、競技用動物 、およびヒトを含む霊長類が含まれるがこれらに限定されない。

”治療”という用語は、本願で用いる場合、（ｉ）従来のワクチンと同様に感染 もしくは再感染の防止、（ｉｔ）症状の軽減もしくは除去、および（ｉｉｉ）ウ ィルスの実質的な除去のいずれかを意味する。治療は、予防的に（感染前に）ま たは治療的に（感染中もしくは感染後に）行われ得る。

”有効量”という用語は、投与された被験体に免疫応答を誘発するのに充分なエ ピトープ食前ポリペプチドの量を意味する。その免疫応答は、制限なしに、細胞 性免疫および／または液性免疫の誘発を含み得る。有効量は、好ましくは上記の ような治療を行うのに充分な量である。正確な必要量は、被験体の種、年齢およ び一般症状、治療される症状の重症度、選択される特定のポリペプチドおよびそ の投与形態などによって、被験体ごとに変わる。したがって正確な有効量を指定 することは不可能である。しかし適切な有効量は、単なるルーチンの試験法を用 いて当業者により決定し得る。

″ＨＳＶ糖タンパク質”という用語は、■５Ｖ−１，ｌｌｌ５Ｖ−２および近縁 のヘルペスウィルスの膜領域に見出されるあらゆる糖タンパク質を意味する。本 発明において好ましいＨＳＩ／糖タンパク質はｇＢＳｇｃ、　ｇＩ）およびｇＥ である。この定義には、天然のウィルス（例えば感染した血清または細胞培養物 由来のウィルス）から抽出される糖タンパク質、および組換え法によって生成さ れる糖タンパク質が含まれる。このような糖タンパク質は、化学的もしくは酵素 的な手段（例えばタンパク質分解による開裂、脱グリコジル化など）、または突 然変異、または組換えＤＮＡ法（例えばＨ３ｖ糖タンパク質遺伝子を他の遺伝子 と融合させて融合タンパク質を生成させるか、もしくはＤＮＡ配列の一部を欠失 もしくは置換することによる方法）によって修飾し得る。

本発明の実施には、特別に他に指定しないない限り、当該技術分野の範囲に含ま れる分子生物学、微生物学、生化学および免疫学の通常の方法を利用する。この ような方法は文献に充分説明されている［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｍａｎ ｉａｔｉｓおよびＦｉｔｓｃｈ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ　ＬＡ ＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、第２版、１９８９年；　ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩ ＮＧ、　１巻および■巻（Ｄ、　Ｎ、　Ｇｌｏｖｅｒ編集、１９８５年）；　０ ＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　５ＹＮＴＨＥＳＩＳ　（Ｍ、Ｊ、Ｇａｌｔ編集 、１９８４年）；ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤ　ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ、 Ｄ、ＨａｍｅｓおよびＳ、　Ｊ、　Ｉ’ｌ　ｉｇｇ　ｉｎｓｍ集、１９８４年） 　ＡＮＩＭＡＬ　ＣＥＬＬ　ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ，１，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集、 １９８６年）　；　ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ　ＣＥＬＬＳ　ＡＮＤ　ＥＮＺＹＭ ＥＳ（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；　Ｂ、Ｐｅｒｂａｌ、Ａ　ＰＲＡＣ ＴＩＣＡＬ　ＧＵＩＤＥ　Ｔｏ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ、１９８４ 年；シリーズのＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｓｉ ｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、）特に１５４巻と１５５巻（それぞれＮｕとＧｒｏ ｓｓｍａｎ、およびＷｕが編集）　；　ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲＶＥＣＴＯ ＲＳ　Ｆｏｇ　ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ　ＣＥＬＬＳ（Ｊ、Ｈ，Ｍｉｌ　１ｅｒおよ びＭ、　Ｐ、　Ｃａ１ｏｓｉｉ集、１９８７年、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＭＥＴＨ ＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｃａ ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）、　５ｃｏｐｅｓ、１９８７年；　Ｐ ＲＯＴＥＩＮ　ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ　ＡＮＤ　Ｐ ＲＡＣＴＩＣＥ、　東２版（Ｓｐｒｉｎｇ６ｒ−Ｖｅｒ　ｌａｇ、　Ｎ、　Ｙ、 　）　：およびＨＡＮＤＢＯＯＫ　ＯＦ　ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ　ＩＭＭＵ ＩＩＩＯ［。

ＯＧＹ、　Ｉ−ｒＶ巻（Ｄ、Ｍ、ＷｅｉｒおよびＣ，Ｃ，Ｂｌａｃｋｗｅｌ１編 集、１９８６年）参照］。上記および下記で述べられている全ての特許、特許出 願および刊行物は、本明細書中で参考として援用される。

本発明の組成物は、ＨＳＶに感染した個体を治療するために用いられるもので、 １ｌｓＶ　ＶＰ１６の免疫原性エピトープを１つ以上含有するポリペプチドを含 有している。ＨＳＶ　ＶＰ１６が免疫原性かつ防御性であるという驚（べき結果 は、後記の実施例４および５に明示されている。したがって、１ｆｓＶ　ＩＩＶ １６の少なくとも１つの免疫原性エピトープを含むポリペプチドを含有する組成 物は、ＨＳＶｇ染症に付随する疾患の症状を予防もしくは軽減するための個体の 治療に使用し得る。さらに試験結果は、ＨＳＶ　ＶＰ１６を含むワクチンにＨ３ ｖ糖タンパク質を添加すると、免疫原性作用と防御作用の両方を増大させること も示している。それ故に、好ましい態様では、ワクチンは、ざらにＨＳＶ糖タン パク質の少なくとも１つの免疫原性エピトープを含有している。その糖タンパク 質のエピトープはｙｐｔａのエピトープと同じポリペプチド上に存在し得、また は別のポリペプチド上に存在し得る。より好ましい信様では、この糖タンパク質 エピトープはＨＳＶ　ｇＢもしくはＩ（ＳＶ　ｇＤ由来のものである。

ワクチンを調製するために、１つ以上のＨＳＶ　ＶＰ１６の免疫原性エピトープ を含むポリペプチドが提供される。ＨＳｖ糖タンパク質の免疫原性エピトープも ワクチンに含ませたい場合は、）１ｓＶ　ＶＰ１６エピトープを含むポリペプチ ド中に含ませてもよく、あるいは別のポリペプチド中に含ませてもよい。

提供されるポリペプチドは、全長のＨＳＶ　ＶＰＬ６および／またはＨＳＶ　Ｉ ！タンパク質であり得る。提供されるペプチドが全長の場合、ウィルスから単離 することができる。単離とその後の精製は当該技術分野で公知の方法で達成し得 る（例えばＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ａｎｄ　５ｃｏｐｅ ｓ、ＰＲＯＴＥｆＮ　ＰＵＲＦＩＣＡＴＩＯＮ参照。

この文献は、タンパク質の各種の精製法について考察している）。

あるいは、全長のポリペプチドは、組換えＤＮＡ法ならびに、糖タンパク質およ びＨＳＶ−Ｉ　ＶＰ１６をコードする公知の配列または本願で提供されるＨＳ’ ／−２ＶＰ１６の配列を用いて合成し得る。

その全長ポリペプチドは、指定されたポリペプチドの免疫原性が明白である限り 、アミノ酸配列に１つ以上の置換基を有し得る。

本発明はまた、切望のｌｌ５Ｖ　ＶＰ１５および／または糖タンパク質のアミノ 酸配列からなるポリペプチドを用いる。切望のＩｓＶ　ＶＰ１５の配列または糖 タンパク質の配列を含有するポリペプチドの大きさは大幅に変えることができ、 最小の大きさは所望の免疫性原性エピトープを提供するのに充分な大きさの配列 であり、一方最大の大きさは決定的ではない。便宜上、最大の大きさは、通常も し存在する場合、実質的に異種配列の所望のエピトープおよび機能を提供するの に必要な程度までの大きさである。一般に上記の切望のＨＳＶのアミノ酸配列は 、長さが約５〜約４００個のアミノ酸の範囲内である。しかしさらに一般には、 免疫原性エピトープを含有するウィルス配列は、長さが最大で約１００個のアミ ノ酸であり、好ましくは最大約５０個のアミノ酸である。

切望の、ＨＳ’／　’／Ｐ１５もしくはＨ３ｖ糖タンパク質のアミノ酸配列で免 疫原性のものは、いくつかの方法で同定することができる。例えばウィルスタン パク質の全配列は、タンパク質の全配列にわたる一連の短いペプチドを調製する ことによってスクリーニングすることができる。例えば１００１１体のポリペプ チドから出発することによって、所望の反応性を示すエピトープが存在するか否 かについて各ポリペプチドを試験し、次いで固定された１００量体由来の次第に 小さくて重複しているフラグメントを試験して対象のエピトープの地図を描くの が通常の方法である。このようなペプチドをイムノアッセイでスクリーニングす ることは、当該技術分野の範囲内にあり、免疫原性についての適切なイムノアッ セイは本願の実施例に記載しである。タンパク質の配列をコンピューターで分析 して潜在的なエピトープを同定する方法もまた公知である。例えば、ＨＳＶ−２ ＶＰ１６ｆ７）推定エピトープは、基準として、ａｓｖ−ｘ　ｖｐ１６ポリペプ チド領域の、表面プロパビリティ−１抗原指数、親水性、電荷、または明白な構 造の欠如を用いて、図２に示す推定アミノ酸配列から決定した。これらの推定エ ピトープは、はぼアミノ酸（ａａ０５〜はぼａａ３４；はぼａａ１９３〜はぼａ ａ２２０；はぼａａ３２０〜はぼａａ３３０　；はぼａａ３６０〜はぼａａ３７ １　；はぼａａ３７８〜はぼａａ３９０；はぼａａ４００〜はぼａａ４１０　； およびほぼａａ４８０〜約ａａ４９０に位置している。推定エピトープを同定し た後、同定された領域を含むオリゴヌクレオチドをスクリーニング用に調製でき る。

所望により、単一のポリペプチドは、免疫原性エピトープを含有する切望のＨＳ Ｖ　ＶＰ１６配列を少なくとも１つ、および免疫原性エピトープを含有する切望 のＦＩＳＶ糖タンパク質の配列を少なくとも１つ有し得る。あるいは、切望のＨ ＳＶ　ＶＰ１６とＨＳＶ糖タンパク質の配列は別個のポリペプチド上にあり得る 。切望の配列は、被験体の未変性ウィルスタンパク質を種々の公知の方法で処理 して調製し得るが、所望の免疫原性エピトープを含む合成ポリペプチドまたは組 換えポリペプチドを調製することが一般に好ましい。

切望の）ＩＳＶ　ＶＰ１５配列を含む組換えポリペプチドはすべて、ＶＰ１６の 配列（連続的もしくは非連続的な１つ以上のエピトープ）または融合タンパク質 中の単一もしくは複数のＶＰ１６配列で調製し得る。同様に、切望のＨ３ｖ糖タ ンパク質の配列を含むポリペプチドはすべて、糖タンパク質の配列（連続的もし くは非連続的な１つ以上のエピトープ）、または融合タンパク質中の単一もしく は複数の糖タンパク質の配列で調製し得る。

融合タンパク質中では、有用な異種配列は、組換え宿主からの分泌を行い、ＶＰ １６もしくは糖タンパク質のエピトープ（単数または複数）の免疫反応性を増大 し、またはポリペプチドを支持体もしくはワクチン牛ヤリアーへ容易に結合させ る配列を含んでいる（例えばヨーロッパ特許出願公開第１１６．２０１号；米国 特許第４．７２２．８０４号；ヨーロッパ特許出願公開第２５９、１４９号；米 国特許第４．５２９．７８３号を参照。これら文献の開示事項は本明細書中に参 考として援用される。）切望のＨＳＶ　ＶＰ１６および／またはｌ（Ｓ　ＶＮタ ンパク質の配列を含む全長のポリペプチド、およびその変異体は、組換え法で調 製することができる。ＨＳＶ−１’／Ｐ１６をフードすると推定されるＤＮＡ配 列（ＶｍＷ６５としても知られている）はＣａｍｐｂｅｌｌら（１９８４年）の 文献に開示されている。その開示事項は本明細書中に参考として援用される。本 願の発明者らが発見し、実施例１に記載している、ＨＣＶ−２ＶＰ１６をフード するＤＮＡの配列は下記の図３に示す。図３中、矢印で示すＭｅｔは推定の開始 メチオニンである。ＨＳＶ−２ＶＰ１６の配列を提供する方法は、単に歴史的に 重要なだけである。というのは、配列データの情報は、図３およびＡＴＣＣ受託 番号６８，３７２の両方より入手可能だからである０なお、このＡＴＣＣの情報 は本明細書中に参考として援用されるＯｇＢとｇＤを含むいくつかのＨＳＶＳ少 糖、ｆり質をコードする配列＋１既知である０例えば、Ｉｓ　Ｖ−１とＨＳＶ− ２のｇＢをコードする配列は米国特許第４．６４２．３３３号に示されており、 ｌｌ５Ｖ　ｇＤをコードする配列はｗａｔｓｏｎら（１９８２年）の文献に記載 されている。ｇＢおよびｇＤならびにそのフラグメントを発現する方法は、ＷＯ ３８１０２５３４に開示されている。これらの配列は入手可能なため、ＨＳＶ　 ＶＰ１６ポリペプチドおよびＨＳＶ糖タンパク質の免疫原性領域をコードするポ リヌクレオチドを構築し得る。

１つ以上の免疫原性ＨＳＶ　ＶＰ１６エピトープおよび／または１つ以上の免疫 原性糖タンパク質エピトープを含む所望のポリペプチドをコードするポリヌクレ オチドは、化学的に合成もしくは単離し、および発現ベクター中に挿入すること ができる。

そのベクターは、β−ガラクトシダーゼもしくはスーパーオキシドジスムターゼ （ＳＯＤ）のような融合配列の一部分を含有し得、または含有し得ない。ＳＯＤ の融合配列を含有するポリペプチドを産生ずるのに有用な方法とベクターは、１ ９８６年１０月１日に公開されたヨーロッパ特許出願公開第０１９６０５６号に 記載されている。

所望のポリペプチドをコードするＤＮＡは、融合形もしくは成熟形であっても、 および分泌を可能にするシグナル配列を含有するか、または含有しないかに関わ らず、好都合な宿主に適した発現ベクター中に連結することができる。次いでそ の宿主はその発現ベクターで形質転換される。真核および原核の宿主系の両方が 、組換えポリペプチドの作製に現在使用されており、より一般的な制御系および 宿主細胞系のいくつかの要約を下記で示す。その宿主細胞は、所望のポリペプチ ドを発現させる条件下でインキュベートされる。次に、そのポリペプチドは、溶 解された細胞もしくは培養培地から単離され、その目的とする用途に必要な程度 まで精製される。

ウィルスからゲノムを抽出し、ＤＮＡライブラリーを作製およびプローブし、ク ローンの配列を決定し、発現ベクターを構築し、細胞を形質転換し、培養中に増 殖する細胞についてラジオイムノアッセイおよびＥＬＩＳＡアフセイのようなイ ムノアッセイを実施するなどに用いる一般的な方法は当該技術分野で公知であり 、これらの方法を記載しである実験マニュアルは入手可能である。しかし、一般 的な案内として、そのような方法およびそれらの方法を実施するのに有用な材料 を得るため現在利用できるいくつかのソースについて以下に説明する。

合成のオリゴヌクレオチドは、Ｗａｒｎｅｒ（１９８４年）の文献に記載されて いる自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製し得る。所望により、反応のた めの標準条件を用いて、３２Ｐ−ＡＴＰの存在下ポリヌクレオチドキナーゼで処 理することにより、合ストランドは３２ｐで標識し得る。

変異体を作製する、または所望の機能配列（例えば制限酵素部位）を作製、もし くは除去するために、クローンから単離されたものを含むＤＮＡ配列は、例えば Ｚｏｌｌｅｒ（１９８２年）の文献に記載されているような部位特異的変異誘発 法を含む公知の方法で修飾し得る。蘭単にいえば、修飾すべきＤＮＡを一本鎖配 列としてファージ中に包み込み、修飾すべきＤＮＡの一部分に相補的な合成オリ ゴヌクレオチドをプライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼにより二本鎖ＤＮＡに 変換し、こうしてそれ自体の配列中に所望の修飾を含有させる。得られた二本鎖 ＤＮＡにより、ファージを保持する宿主細菌を形質転換させる。形質転換された 細菌の培養物は、ファージの各ストランドの複製物を含んでおり、寒天中にプレ ートされてプラークを得る。理論的には、新しいプラークの５０％が変異された 配列を有するファージを含有し、残りの５０％はもとの配列を有している。その プラークのレプリカを、正しいストランドとはノーイブリダイズできるが未修飾 の配列とはハイブリダイズできない温度と条件下で、標識した合成プローブと／ ％イブリダイズさせる。／％イブリダイゼーシツンによって同定された配列を回 収しクローニングする。

一般に、ハイブリダイゼーション分析を行う際に、プローブすべ！ＤＮＡ１ｔ、 ニトロセルロースフィルター上に固定化Ｌ、変性し、次いで０〜５０％のホルム アミド、０．７５ＭのＮａＣ１，７５ｎ＋Ｍのクエン酸ナトリウム、各々０．０ ２％（Ｗｔ／ｖ）のウシ血清アルブミンとポリビニルビクリトンとフィコール、 ５０ＩＩＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）、０．１％ＳＯＳ、および１００μ ｇ／＋ｓｌのキャリアーで変性されたＤＮＡを含有するバッファーでプレハイブ リダイズさせる。バッファー中のホルムアミドの百分率、ならびに上記のハイブ リダイゼーションとその後の工程および洗浄の時間と温度条件は、必要な緊縮性 によって決まる。低い緊縮条件を要するオリゴマープローブは、一般に、ホルム アミドの百分率が低く、低温でかつハイブリダイ上−２１フ時間が長い場合に用 いられる。クローニングされたＤＮＡ由来のプローブのような３０もしくは４０ 個を越えるヌクレオチドを含有するプローブは、一般に、例えば約４０〜４２℃ のような高温と、例えば５０％のような高い百分率のホルムアミドを利用する。

プレハイプリダイゼーシヲンの後、標識プローブを、前記バッファーに添加し、 次いでフィルターを、ハイブリダイゼーション条件下で上記の混合物中でインキ ュベートする。洗浄後、処理されたフィルターをオートラジオグラフィーに付し てハイブリダイズされたプローブの位置を知り、もとの寒天プレート上の対応す る位置のＤＮＡを所望のＤＮＡの起源として用いる。

ベクターの構築には当該技術分野で公知の方法を用いる。

部位特異的ＤＮＡ開裂は、適切な制限酵素で処理することによって行われるが、 その処理はこれらの市販されている酵素の製造者が一般に指定する条件下で行わ れる。一般に、約１μｇのプラスミドもしくはＤＮＡ配列が、約２０μｍのバッ ファー中の１単位酵素を用いて、１〜２時間３７℃でインキュベートすることに よって開裂される。制限酵素とともにインキュベートした後、タンパク質を抽出 （例えばフェノール／クロロホルムを用いる）して除去し、ＤＮＡを回収する（ 例えばエタノールで沈澱させる）。開裂されたフラグメントは、Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｅｌｏｇｙ、６５巻、４９９〜５６０頁、　１９８０年に見 られる一般的な方法によって、例えばゲル電気泳動法または沈降法を用いて分離 し得る。

付着末端を有する開裂フラグメントは、混合物中に存在する適切なデオキシヌク レオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）ノ存在下、Ｌ匹且のＤＮＡポリメラーゼＩ　（フ レノウ）を用いて、平滑末端にし得る。−重鎖ズクレアーゼ（例えばＳ１ヌクレ アーゼ）による処理も一本鎖ＤＮＡ部分を加水分解するために使用し得る。

連結反応は、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼとＡＴＰを用い、標準のバッフｒ−と温度の 条件を利用して実施し得る。ベクターフラグメントを連結混合物の一部として使 用する場合、そのベクターフラグメントは、５°−リン酸を除去してベクターが 再連結するのを防止するために、細菌アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）また は仔つシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理される。あるいは、連結を防止する ために望ましくないフラグメントの制御酵素による消化を利用し得る。

連結混合物は、当該技術分野で知られている適切なりローニング宿主、例えばＥ 、　ｃｏｌｉを形質転換するのに用いられ、次いで成功した形質転換細胞は、適 切なマーカー、例えば抗生物耐性によって選択され、そして正しい構築について スクリーニングされる。

（以下余白） 構築を確認するために、連結混合物によって適切な宿主、例えばＥ、　ｅｏｌｉ のＦＩＢＩＯＩ中に形質転換され、次に成功し、た形質転換細胞が抗生物質耐性 などのマーカーにより選択される。

その形質転換細胞由来のプラスミドは通常、クロラムフェニコールによる増幅（ Ｃｌｅｗｅ１１の１９７２年の文献）の後、Ｃ１ｅｗｅｌｌらの方法（１９６９ 年の文献）にしたがって調製される。そのＤＮＡは通常、制限酵素分析法および ／または配列決定法によって、単離され分析される。配列決定法は、Ｓａｎｇｅ ｒらのジデオキシ法（１９７７年の文献）（さらにＭｅｓｓｉｎｇらの１９８１ 年の文献に記載されている）、またはｌｔａｘａｍらの方法（Ｍａｘａ＋ｍらの １９８０年の文献）による方法で行われ得る。バンド圧縮の問題は、ＧＣが豊富 な領域で時々観察されるが、Ｂａｒｒらの１９８６年の文献に記載の方法にした がい、Ｔ−デアジグアノシンを用いることにより克服し得る。

所望の配列を含有するベクターによる適切な宿主の形質転換は、ポリヌクレオチ ドを宿主細胞に導入するいずれかの公知の方法で行われ、例えばポリヌクレオチ ドをウィルスに包み込み、次に宿主細胞を該ウィルスで形質導入するか、または 該ポリヌクレオチドを直接取込むことによって行い得る。

利用される形質転換法は形質転換される宿主によって決まる。

例えばｌｌ５Ｖ−２ＶＰ１６をフードするポリヌクレオチドの形質転換媒体とし てワクンニアウィルスを用いるインビボでの形質転換法は、下記のいくつかの実 施例に記述されている。形質転換は、インビトロの系でも達成し得る。直接取込 みによる細菌の形質転換には、一般に塩化カルシウムもしくは塩化ルビジウムに よる処理が利用される（Ｃｏｈｅｎ、　１９７２年とＳａｍｂｒｏｏｋ、　１９ ８９年の文献）。直接取込みによる酵母の形質転換は、Ｈｉｎｎｅｎらの１９７ ８年の文献の方法を用いて実施し得る。直接取込ろによる哺乳類の形質転換は、 ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂのリン酸カルシウム沈澱法またはその 種々の公知の改変法を用いて実施し得る。組換えポリヌクレオチドを細胞中、特 に哺乳類の細胞中に導入する他の方法は、当該技術分野で公知であり、デキスト ランによるトランスフェクション法、リン酸カルシウムによるトランスフェクシ ョン法、ポリブレンによるトランスフェクション法、プロトプラスト融合法、エ レクトロボレーレジン法、ポリヌクレオチドのリポソームによる被包法、および ポリヌクレオチドの核内への直接マイクロインジェクション法がある。

所望のコーディング配列の発現を得るために、宿主細胞はポリヌクレオチド（発 現ベクターで有り得る）で形質転換されるが、そのボＩノヌクレオチドは所望の コーディング配列に作動可能に連結された制御配列を含有している。その制御配 列は指定の宿主と適合性である。原核宿主の中でＥ、　ｃｏｌｉが最も多く用い られる。原核宿主のための発現制御配列はプロモーターを含有し、任意にオペレ ータ一部分およびリポソーム結合部位を含有している。原核宿主と適合性の転移 ベクターは、通常、例えばアンピンリンおよびテトラサイクリンに対する耐性を 与えるオペロンを含有するプラスミドであるｐＢＲ３２２、および抗生物耐性の °７−カーを与える配列を含有する種々のｐＵＣベクターから誘導し得る。プロ モーター配列は天然のもの、例えばβ−ラクタマーゼ（ベニシリナーゼ）　（Ｗ ｅｉｓｓｍａｎの１９８１年の文献）、ラクトース（ｌａｃ）　（Ｃｈａｎｇら の１９７７年の文献）およびトリプトファン（ｔｒｐ）　（Ｇｏｅｄｄｅｌらの １９８０年の文献）、ならびにλ由来ＰＬ　プロモーター系およびＮ遺伝子リポ ソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅらの１９８１年の文献）であり得る。

さらに、天然には産しない合成のプロモーターも細菌のプロモーターとして機能 する。例えば、１つのプロモーターの転写活性化配列は、他のプロモーターのオ ペロン配列と結合させて合成のハイプリ、ドブロモーターを形成させ得る〔例え ばｔａｃプロモーターは、当プロモーターおよびｌａｃプロモーターの配列に由 来する（Ｄｅ　Ｂｏｅｒらの１９８３年の文献）〕。上記の系ハ特１：Ｅ、　ｃ ｏｌｉ、と適合性であるが、所望により、バシラス属（３ａ−ｃｉｌｌｕｓ）ま たはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の菌株のような他の原核宿主 が、対応する制御配列とともに使用長が最も普通に用いられる酵母の宿主であり 、便利な真菌の宿主である。酵母と適合性のベクターは、栄養素要求性突然変異 体に原栄養性を与えるか、または野生型菌株に重金属に対する抵抗性を与えるこ とによって、成功した形質転換細胞を選択できるマーカーを有している。酵母と 適合性のベクタ−は、２ミクロンのｌ１１１！起点（Ｂｒｏａｃｈらの１９８３ 年の文献）、ＣＥＮ３およびＡＲ３Ｉの組合せ、あるいは適切なフラグメントを 宿主細胞ゲノムに組込む配列のような複製を保証する他の手段を利用し得る。酵 母ベクターの制御配列は、当該技術分野で公知であり、解糖酵素（Ｈｅｓｓらの １９６８年の文献）、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）　（ヨーロ ッパ特許出願公開第２８４０４４号）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコー ス６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ （ＧＡＰもしくはＧＡＰＤｌ（）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、 ３−グリセロリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）　（ヨーロ ッパ特許出願公開第３２９２０３号）を合成するためのプロモーターが含まれる 。酵母ＰＦＩ０５遺伝子は、酵性ホスファターゼをコードしており、有用なプロ モーター配列をも与える（　Ｍｉｙａｎｏｈａｒａらの１９８３年の文献）。さ らに、天然に産しない合成プロ芸−ターも酵母プロモーターとして機能する。例 えば、１つの酵母プロモーターの上流の活性化配列（ＬＩＡＳ）は、他の酵母プ ロモーターの転写活性化領域と結合させて合成のハイブリッドプロモーターを作 製し得る。

このようなバイブＪノットプロモーターの例には、ＧＡＰ転写活性化領域に連結 したＡＤＨＩ節配列（米国特許第４．８７６、１９７号および同第４．８８０． ７３４号）がある。ハイブリッドプロモーターの他の例としては、ＧＡＰまたは ＰｙＫのような糖解酵素遺伝子の転写活性化領域と組合わせた、ＡＤＨ２、ＧＡ Ｌ４、ＧＡＬＩＯもしくはＰＨ０５（７）遺伝子の調節配列で構成されたプロモ ーター（ヨーｏ　ｙパ特許出願公開第１６４５５６号）がある。さらに酵母プロ モーターは、転写を適切に開始させるために酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合させ る性能を有する、非酵母起源の天然産プロモーターを含有し得る。

酵母発現ベクターに含有させる他の制御要素は、ターミネータ−（例えばＧＡＰ Ｄ［ｌ由来のもの、およびエノラーゼ遺伝子由来のもの（Ｈｏｌｌａｎｄらの１ ９８１年の文献））およびリーダー配列である。リーダー配列の７ラグメントは 一般に、細胞からタンパク質を分泌させる疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチ ドをコードしている。適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、酵母インベル ターゼ遺伝子（ヨーロッパ特許出願公開第１２．８７３号）およびα−因子遺伝 子（米国特許第４．５８８．６８４号）のような分泌される酵母タンパク質の遺 伝子から誘導し得る。インターフェロンリーダーのような非酵母起源のリーダー も、酵母に分泌を起こさせる（ヨーロッパ特許出願公開第６００５７号）。好ま しい種類の分泌リーダーは、”プレ”シグナル配列および”プロ°領域の両方を 含有する酵母α因子遺伝子のフラグメントを利用するリーダーである。利用する ことができるタイプのα因子のフラグメントには、全長のブレープロα因子リー ダーおよび可塑のα因子リーダーが含まれる。　（米国特許第４．５４６．０８ ３号および同第４．８７０．００８号；ヨーロッパ特許出願公開第３２４２７４ 号）。分泌を行うα因子リーダーフラグメントを用いる別のリーダーには、第１ の酵母のプレ配列と、第２の酵母のα因子からのプロ領域とで作製されるハイブ リッドα因子リーダーがある（例えばＰ、Ｃ，Ｔ、　ＷＯ３９１０２４６３参照 ）。

発現ベクターである、染色体外レプリコンもしくは組込みベクターが、多（の酵 母を形質転換させるために開発されている。例えば、発現ベクターとして、次の 各種のもの：紐回ｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　（Ｋｕｒｔｚら１９８６年の文献 ）　；　Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら１９８５年の文献）　 ；　ｈ」ｌ匡口泣江鯰■ｎ（Ｇｌｅｅｓｏｎら１９８６年の文献）；■旺胆匹牡 ！眩江■ユコ（Ｄａｓら１９８４年の文献）　：　Ｋ　ｕ　ｖｅ　ｍ　ｃｅｓ　 １ａｃｔｉｓ（Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら１９８３年の文献）　；　Ｐｉ ｅｈｉａ　ｕｉｌ　ｅｒｉｍｏｎｄｉ’（ｌ（ｕｎｚｅら１９８５年の文献）； ムｃＸＪＵ■ロ肛艮（Ｃｒｅｇｇら１９８５年の文献、米国特許第４．８３７． １４８号および同簗４．９２９．５５５号）　；　Ｓｃ　１ｚｏｓａｃｃ　ｏ　 ｃｅｓ　匹亙Ｉ（ＢｅａｃｈとＮｕｒｓｅの１９８１年の文献）；およびＹａｒ ｒｏｗｉａ　Ｌａ駈−泣１Ｂａ（Ｄａｖｉｄｏｖら１９８５年の文献）が開発さ れている。

発現用の宿主として利用可能な哺乳類の細胞系は当該技術分野で公知であり、ア メリカンタイプカルチャーコレクンラン（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの永代 化細胞系があり、例えばＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ） 細胞、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＣＯＳサル細胞などの多数の細胞系が 含まれる。哺乳類細胞に対し適切なプロモーターも当該技術分野で公知であり、 シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）　、アデノ ウィルス（ＡＤＶ）、およびウシ乳頭腫ウィルス（ＲＰＶ）由来のプロモーター のようなウィルスプロモーターが含まれる（適切なプロモーターの例としてＳａ ｍｂｒ。

Ｏｋの１９８９年の文献寥照）。また哺乳類細胞は、ターミネータ−配列とポリ Ａ付加配列も必要であり、発現を増大させるエンハンサ−配列も含まれ、遺伝子 の増幅を起こす配列も必要とされ得る。これらの配列は当該技術分野で公知であ る。

哺乳類細胞中での複製に適したベクターは当該技術分野で公知であり、ウィルス のレプリコン、または所望のポリペプチドをコードする適切な配列を宿主ゲノム に組込むことを保証する配列が含まれ得る。

外来性ＤＮＡを発現させるのに使用されかつワクチン調製に利用し得るベクター はワクシニアウィルスである。この場合、異！ＤＮＡがワクシニアのゲノムに挿 入される。外来性ＤＮＡをワクシニアウィルスのゲノムに挿入する技術は当該技 術分野で公知であり、例えば相同組換え法を利用する。異種ＤＮＡの挿入は一般 に、自然では必須ではない遺伝子、例えばチミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）にな されるが、この遺伝子も選択可能なマーカーを提供する。組換えウィルスの構築 を著しく容易にするプラスミドベクターは従来報告されている（例えばＭａｃｋ ｅｔｔらの１９８４年の文献；　Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉらの１９８５年の文献 ：　Ｍｏ５ｓの１９８７年の文献参照）。このようにして免疫原性領域を含む所 望のポリペプチドの発現が、生きている組換えワクシニアウィルスに感染してい るかおよび／または免疫化されている細胞もしくは個体に起こる。

ポリペプチドを発現させる他の系としては、昆虫細胞と、これらの細胞内で使用 するのに適したベクターがある。これらの系は当該技術分野では公知であり、例 えばバ牛二口ウィルスの組昆ムｍ　ｃａ土」Ｑｒｎ１ｃ３核多面性ウィルス（Ａ ｅＮＰ’／）由来の昆虫発現転移ベクターがある。これはヘルパー非依存性のウ ィルス発現ベクターである。この系由来の発現ベクターは、異種遺伝子を発現さ せるために、ウィルスの強力なポリヘトリン遺伝子のプロモーターを通常使用す る。外来性遺伝子をＡｃＭＰＶに導入するのに現在量も一般に使用されている転 移ベクターは、図４に示すｐＡｃ３７３である。また、当業者に周知の多（の他 のベクターも発現を改良するように工夫されている。

これらのベクターには例えばｐＶＬ９８５が含まれる（このベクターはポリヘト リンの開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変更し、Ｂａｍ１’Ｉ■クロ一ニング部 位をＡＴＴから３２塩基対下流に導入している；ＬｕｃｋｏｖおよびＳｕ＋ｇｍ ｅｒｓの１９８９年の文献参照）。非融合外来性タンパク質を高レベルで発現す るＡｅＮｌ’Ｖ転移ベクターを図４に示す。図４において、数字は未変性遺伝子 内の位置を示し、未変性遺伝子内でＡＴＧコドンのＡの位置は＋１である。また 図４は転移ベクターｐＡｃ３７３の制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。

この地図は、唯一のＢａｍＨ１部位が、ポリヘトリン遺伝子の翻訳開始コドンＡ ＴＧに関する−８の位置の後に位置することを示しているｏ　Ｓｍａｌ、　Ｐｓ ｔｌ、　Ｂｇｌｌ、　Ｘｂａｌまたは５ｓｔｌの開裂部位は全く存在しない。非 融合の外来性タンパク質を良好に発現するには通常、理想的にはＡＴＧ開始シグ ナルに先立って適切な翻訳開始シグナルを含有する短いリーダー配列を有してい る外来性遺伝子を必要とする。またそのプラスミドは、Ｌ坦■内で選択および増 殖を行うために、ポリヘトリンのポリアデニル化シグナル、アンピシリン耐性＜ 工）遺伝子および複製起点を有している。

異種ＤＮＡを、バキュロウィルスの所望の部位に導入する方法は当該技術分野で 公知である（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈ、　Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌ ｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ 、１５５５；ＪＵらの１９８７年の文献；　Ｓｉ＋ｉｔｈらの１９８３年の文献 ；ならびにＬｕｃｋ。

ＷおよびＳｕ＋Ｉ＋５ｅｒｓの１９８９年の文献参照）。例えば、挿入は、相同 組換え法によって、ポリヘトリン遺伝子のような遺伝子に行い得、また挿入は、 所望のバキ１０ウィルス遺伝子中に作製した制限酵素部位にも実施し得る。挿入 される配列は、ＵＳＶ　ＶＰ１６および／または［ｌＳＶ糖タンパク質のすべて もしくは種々のセグメントをコードする配列で有り得る。

シグナルペプチドの開裂、タンパク質分解による開裂およびリン酸化のような翻 訳後修飾のシグナルは、昆虫細胞によって認識されるようである。分泌と核蓄積 に必要なシグナルも、無を椎動物とを椎動物の細胞間に保存されるようである。

無を椎動物細胞内で宵効なを椎動物細胞由来のシグナル配列の例は当該技術分野 で公知であり、例えば、ヒトインターロイ牛ン２　（ｌＬ２ｓ）のシグナルがあ り、それはを椎動物細胞が昆虫細胞内で認識され適切に除去される場合の外部へ の輸送のシグナルである。

上記の宿主細胞とベクターを用いて調製されるポリペプチドは融合ポリペプチド であることが望ましいことが多い。非融合ポリペプチドの場合のように、融合ポ リペプチドは発現後に細胞内に残留し得る。あるいは、融合タンパク質は、それ がリーダー配列フラグメントを含有している場合、細胞から増殖培地に分泌され 得る。リーダーフラグメントと、インビボもしくはインビトロで開裂することが できる外来性遺伝子の残りの部分との間に、プロセソンング部位があるのが好ま しい。

合成されたポリペプチドが正しいエピトープを与えるように正しく形成されてい るが小さすぎて免疫原性でない場合、そのポリペプチドは適切なキャリアーに連 結される。このような結合を行ういくつかの方法は当該技術分野で公知であり、 Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ビリジルーチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ ）およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロへ牛サンー１− カルボ牛シラート（ＳＭＣＣ）を用いてジスルフィド結合を生成させる方法があ る（ペプチドにスルフヒドリル基がない場合、この結合はシスティン残基を付加 することによって行うことができる）。これらの試薬は、それ自体と１つのタン パク質のペプチドシスティン残基との間のジスルフィド結合；およびリシンのε −アミノ基または他のアミノ酸の他の遊離アミノ基によるアミド結合を形成する 。このようなジスルフィド／アミド形成薬剤は各種知られている（例えば１ｗ＋ ｗｕｎ、　Ｒｅｖ、　、　６２巻、１８５頁、１９８２年参照）。ジスルフィド 結合ではな（てチオエーテル結合を生成する他の二官能性カップリング剤がある 。これらのチオエーテル形成剤は多数市販されており、６−マレイミドカプロン 酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロ ヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステルが含まれる。そのカルボキシル 基は、それをスクシンイミド、または１−ヒドロキシ−２−二トロー４−スルホ ン酸のナトリウム塩と結合させることによって活性化し得る。抗原をカップリン グする別の方法は、ヨーロッパ特許出願公開第２５９．１４９号に記載されてい るロタウィルス／ｎ結合ペプチド”系を利用する。

上記化合物のリストで余すことなく示された訳ではなく、示された化合物の修ｔ Ｍ物も明らかに使用し得る。

キャリアーとしては、それ目体が宿主に対して有害な抗体を産生じないものはい ずれも使用し得る。適切なキャリアーは、タンパク質のような一般に大きくて徐 々に代謝される巨大分子；ラテックスで官能基化されたセファロース、アガロー ス、セルロース、セルロースビーズなどのようなｐｓｉ；ポリグルタミン酸、ポ リリシンなどのような高分子アミノ酸；アミノ酸コポリマー；および不活性のウ ィルス粒子である（後記説明参照）。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブ ミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブ リン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、および当業者によく知られている他 のタン１＜り質である。

Ｈｓｖ　ｖｐｔａ特ニＨＳＶ−２ＶＰ１６ノｚピトーブ、およびＨＳＶの糖タン パク賃特にｌｌ５Ｖ　ｇＢおよび／またはＥＩＳ’／　ｇＤのエピトープの免疫 原性もまた、例えばＢｆｆｉ肝炎表面抗原に関連するような粒子形成タンパク質 と融合させるかまたは組合せて、真核系中でこれらエピトープを作製することに より増大させることができる（例えば米国特許第４．７２２．８４０号参照）。

ＩＩｓ’／　’／Ｐ１６もしくは糖タンパク質のエピトープが粒子形成タンパク 質をコードする配列に直接連結されている構築物は、ＨＳＶエピトープに対して 免疫原性であるハイブリッドを生成する。さらに、作製されたベクターはすべて 、例えばプレーＳペプチドのように種々の免疫原性を有する、ＩＩＢＹに対する 特異的なエピトープを含んでいる。したがって、ＨＳＶ配列を含有する粒子形成 タンパク質で構築された粒子は、ｌ（Ｓ’／およびＩＩＢＹに対して免疫原性で ある。

肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）は、Ｓ、　組江■■ｕ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａらの １９８２年の文献）および例えば哺乳類の細胞（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａらの１９ ８４年の文献）中で生成して粒子に形成されることが分かっている。このような 粒子が生成すると、モノマーサブユニットの免疫原性を増大することが分かつて いる。またその構築物はＨＢＳＡｇの免疫原性エピトープを含有し、これはプレ 表面（プレＳ）領域の５５アミノ酸を含有している（　Ｎｅｕｒａｔｈらの１９ ８４年の文献）。酵母内で発現可能なプレーＳ−ＨＢ５Ａｇ粒子の構築物はヨー ロッパ特許出願公開第１７４．４４４号に開示されており；酵母で発現する異種 のウィルス配列を有するハイブリ１ドがヨーロッパ特許出願公開第１７５．２６ １号に開示されている。またこれらの構築物は、５Ｖ４０−ジヒドロ葉酸レダク ターゼベクターを用いて、Ｃｌｌ０細胞のような哺乳類細胞内で発現させ得る（ Ｍｉｃｈｅｌ　ｌｅらの１９８４年の文献）。

さらに、粒子形成タンパク質をコードする配列の各部分を、ＨＳＶ　ＶＰ１６モ しくはＨＳＶ糖タンパク質のエピトープをコードスルコドンで置換し得る。この 置換反応において、酵母もしくは哺乳類中に免疫原性粒子を形成させるためのユ ニットの凝集を介在させる必要がない領域は、欠失させることができ、したがっ て、それ以外のＨＢＶ抗原部位が［ｌＳＶエピトープ（単数または複数）と競合 することがないようにすることができる。

活性成分として免疫原性ポリペプチドを含有するワクチンの製剤は当業者に公知 である。典型的に、このようなワクチンは注射用として、すなわち液体の水剤も しくは懸濁剤として調製され、注射する前に液体の水剤もしくは懸濁剤中に入れ るのに適した固体の形態としても調製され得る。またその製剤は、乳化してもよ く、またはリポソーム内に被包されるポリペプチドでもよい。活性な免疫原性成 分は、製薬的に受容可能で、活性成分と適合性の賦形剤と混合することが多い。

適切な賦形剤としては例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エ タノールなど、およびその混合物がある。

さらに、所望により、ワクチンは、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤および／ またはワクチンの有効性を高めるアジュバントのような補助物質を少量含有して いてもよい。有効なアジユバントの例としては、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセ チル−ムラミル−Ｌ−トレオニルーＤ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ −アセチル−／ルームラミルーし一アラニルーＤ−イソグルタミン（ＣＧＰ　１ １６３７、ツルーＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル− Ｄ−イソグルタミニルーし一アラニンー２−（１°−２−ジノｆルミトイルーｓ ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ 　１９８３５Ａ、　ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、およびＲＩＢｌ（細菌から抽出 された次の３成分：モノホスホリルリビドＡ、トレハロースシミコール酸、およ び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋Ｃ１ｆＳ）を、２％スクワレン／Ｔｖｅｅｎ　 ８０乳懸濁中に含有して−Ａる）が挙げられるが限定するものではない。アジ二 ノイントの有効性は、ＨＳＶ−’／Ｐ１６のエピトープおよび／またはｌｌ５Ｖ 糖タンノくり質のエピトープを含有する免疫原性ポリペプチドに特異的な抗体の 量を測定することによって測定することができ、その抗体は、種々のアジュバン トも含有するワクチン中の上記ボＩＪペプチドを投与することによって生成する 。

そのタンパク質は、ワクチンに、中性すなわち塩の形態で処方してもよい。製薬 的に受容可能な塩としては酸付加塩（ペプチドの遊離のアミン基で形成される） があり、この塩（ま例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シ ュウ酸、酒石酸、マレイン酸などのような有機酸で形成される。また遊離のカル ボ牛シル基で形成される塩は、例え（ｆ水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水 酸化アンモニウム、水酸化カルシウムもしくは水酸化第二鉄のような無機塩基、 およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、 ヒスチジン、プロ力インなどのような有機塩基から誘導される。

ワクチンは通常、例えば皮下もしくは筋肉内に注射することによって非経口的に 投与される。他の投与方法に対して適切なその他の製剤としては全開があり、ま た場合によっては経口の製剤が用いられる。全開については、慣習的な結合剤と キャリアーには、例えばポリアルキレングリコール類もしくはトリグリセド類が 含有されており、このような全開は、活性成分を、０．５％〜１０％、好ましく は１％〜２％の範囲内で含有する混合物から形成することができる。経口製剤に は、通常利用される賦形剤が含有されているが、その賦形剤としては、例えば製 剤グレードの、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウ ム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどがある。これら の組成物は、水剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または散剤 、の形態を有し、活性成分を１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％含有し ている。

上記の他に、１ｌｓＶ　ＶＰ１６および／または１（ＳＶ糖タンパク質のエピト ープを含む１つ以上の組換えポリペプチドを発現する弱毒化微生物の生ワクチン を調製することができる。適切な弱毒化微生物は当該技術分野で知られており、 例えばウィルス（例えばワクシニアウィルス）と細菌がある。

ワクチンは、投薬製剤に適合した方法で、かつ予防上および／または治療上有効 な量で投与される。投与量は、一般に１回用量当り抗原が５μｇ〜２５０μｇの 範囲内であり、治療される被験体、被験体の免疫系の抗体を合成する能力、およ び所望の防御の程度によってきまる。投与される活性成分の正確な必要量は、医 師の判断によって決まり、各個体ζこ特宵なものである。

ワクチンは一回投与計画で投与してもよ（Ａ力ｆ、多数回投与計画で投与する方 が好ましい。多数回投与計画（±、ワクチン注射の一部コースが１〜１０回の別 個の投与で行われ、次（Ｘで時間間隔をとって、免疫応答を維持および／また（ ま再強化するのに必要な別の投与を、例えば１〜４ケ月間第２の投与として行い 、次いで必要に応じて、数ケ月後（こその次の投与を行う。

また投与の計画は、少なくとも一部は、個体の必要性で決まり、医師の判断に依 存している。

さらに、免疫原性のＨＳＶ　ＶＰ１６エピトーブを含むボ１ノペプチドを含有す るワクチンは、他の免疫調節薬剤、例１え（ｆ免疫グロブリンとともに投与して もよい。

（以下余白） 実］Ｌ匹 東上Ｉｌｌ １１ｓ’／−２ＶＰ１６をフート　る゛　の　および　ド１（ＳＶ−２Ｇ株のＥ ｅｏＲＩ”Ｌ″フラグメントｐＵｃ１９に挿入することにより、Ｅ［５Ｖ−２Ｖ Ｐ１６をコードするポリスクレオチド源であるｐＨ２０５１２を生産した。　Ｈ ＳＶ−Ｉ　ＶＰ１６をコートする配列を含むｐＨ８３４５８の１つのセグメント をプローブとして用いた、サザンプロット分析により、）ＩＳＶ−２ポリヌクレ オチドをコードする配列を同定した。プラスミドｐＨ２Ｇ５１２およびｐＲＢ３ ４５ｇを各々、Ｄｒ。

Ｐ、　ＰｅＬｌｅｔｔ　（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒ ｏｌ、　Ａｔ１ａｎｔａ、　Ｇａ、）およびＤｒ、　Ｂ、　Ｒｏｉｚｍａｎ　（ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｃａｇｏ、　Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌ、） より入手した。ｐＨ８３４５８の構築は、Ｐｅ１ｌｅｔらにより記載されている （１９８５）。

より具体的には、ｌｌ５Ｖ−２ＶＰ１６をコードするポリヌクレオチドであるｐ Ｈ２Ｇ５ＬＺを、ＥｃｏＲＩＳＥｃｏＲＩと５ａｃｌ、５ａｃｌｌ、Ｂａ＋ｓＨ １，Ｎｃｏｌ、そしてＳｍａｌにより各々消化した。消化されたプラスミドのフ ラグメントを、トリスアセテートバフファー中の１％アガロースゲル上での電気 泳動により分離した。電気泳動後、ゲル中のＤＮＡをアルカリで変性させ、中和 し、そしてＳａ＋ａｂｒｏｏｋらが記載している転移プロトコール（１９８９） を用いて、ｒＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎ　Ｐ１ｕｓＪ膜に移した。膜上のＤＮＡを、 製造者の指示を用いて、−晩プローブとハイブリダイズした。プローブは、ｐＨ ８３４５８から単離した、二・７クトランスレーシ貰ンされた２、９ＫｂＥｅｏ Ｒ［−Ｂｔｎｄｌｌｌフラグメントであった。ハイブリダイゼーションの結果は 、ＨＳＩ／−２ＶＰ１６が、ｐＩｉ２Ｇ５１２の３．５　Ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｓ ａｃ１７ラグメント中でコードされていることを示した。続いて、ＶＰ１６をコ ードするＥｃｏＲＩ−Ｓａｃｌフラグメントを１％アガロースゲル上で単離し、 ”Ｇｅｎｅ　Ｃ１ｅａｎ−（Ｂｉｏ　１０１）を用いてゲルから抽出した。上記 フラグメントの配列決定を、ジデオキシ法を用いて行った。ＨＳＶ　ＤＮＡはＧ −ＣＩｉｎ富んティる（すなわち、＞７０％　Ｇ−Ｃ）ため、配列決定ゲル中の 圧縮領域中の配列は、６５℃でＴａｑポリメラーゼにより配列決定することによ って解明した。上記フラグメントのコーディングストランドの配列、およびそれ によりコードされたアミノ酸を図３に示す。図において、推定される開始のメチ オニンコドンの第１ヌクレオチドを矢印で示す。

ＨＳＶ−Ｉ　ＶＰ１６ノ推定されルアミノ酸配列とＨＳＶ−２ＶＰ１６ノ推定さ れるアミノ酸配列との間の相同性を図２に示す。

支立且ユ ＨＳＶ−２１／Ｐ１６をコード　る　むワクシニアウィルス　ベタ　−の ＨＳＶ−２ＶＰ１６をコードする配列を含むワクシエアベクターを以下のように 構築した。まず、ＶＰ１６をコードする配列を、ワクシニア発現ベクターである ｐｓｃｌｌにサブクローニングすることにより、プラスミドｐＨ５２２５（部分 地図を図５に示す）を生産した。ベクターｐｓｃ１１は、Ｄｒ、　Ｂｅｒｎａｒ ｄ　Ｍｏ５ｓ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｔｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔ ｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄから入手した。ＪＩＳＶ−２ＶＰ１ ６をフードする配列を導入する前に、Ｂｉｎｄｌｌｌζこよる消化によってｐｓ ｃｌｌ中の旧ｎｄｌ１１部位を欠失することにより、ｐＳＣ１ｌベクターを改変 し、続いて、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントによる処理および連 結を行った。その後、５ｓａｔ、　ＫｐｎｌＳＢｇｌｌｌ、およびＨｉｎｄｌｌ ｌに対する制限酵素部位を含むポリリンカーを、Ｓ■ａ［部位に導入することに より、ｐｓｃ１１ベクターをさらに改変した。ＶＰ１６を含むフラグメントを、 ｐＨ２０５１２から、２．Ｉ　Ｋｂ（７）Ｘｈｏｌ−Ｓｐｈ１７　ラグメントと して単離した。

ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメントを用いてＸｈｏ部位を満たし、Ｔ ４　ＤＮＡポリメラーゼを用いて５ｐｈ１部位を平滑末端化した。その後、平滑 末端フラグメントを、改変されたｐｓｃｌｌの５Ｌｌａ１部位に連結した。ＶＰ １６をコードする配列を含むベクターを、クローニングにより得た。上記ベクタ ーをＤＨ５αに形質転換し、Ａ　ｐ　ｒ選択を用いて形質転換細胞を選択した。

制限酵素分析の後、適切なサイズのフラグメントの存在に基づいて、陽性のクロ ーンを選択した。上記陽性のクローンの１つをｐＨ３２２５と命名した。ｐＨ３ ２２５の重要な特徴のいくつかを示す地図を図５に示す。

個体中でＶＰ１６を発現するために適した組換えワクシニアウィルスを得るため に、リポフェクチンの製造会社（ＢＲＬ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が記載し ているリポフェクチントランスフエクシコンブロトフールを用いた組換えにより 、ｐＨ３２２５の、ＶＰ１６をコードする配列を、野生型のワクシニア株である ＷＲのＴＫ座に挿入した。組換えＴＫ−ウィルスを、ＢｕＤＲ選択により単離し 、Ｍａｃｋｅｔｔらのプロトコール（１９８？）を用いてプラーク精製した。Ｄ ＮＡドノトプロットハイブリダイゼーシヲンにより、ワタシニア／ＶＰ１６組換 えクローンを選択した。ＶＰ１６の発現を、ウェスターンプロットおよび放射線 免疫沈降により確認し、続いて組換えクローンを精製した。この処置の詳細は以 下の通りである。

ワクシニアＷＲを用いてｐＨ５２２５の組換え体を得るために、Ｔ−２５フラス コ中のＢ５Ｃ４０細胞のコンフルエントな単層を、０．０５という感染の多重度 （ｍｏｉ）でＷＨに感染させた。室温で２時間振りながら、吸着を行った。３つ のｐＨ５２２５溶液を、リポフェクチン（ＢＲＬ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） を用いて以下のように調製した：　１．１０、または１００μｇのｐＨ５２２５ を含む５０μｌのＤＮＡ水溶液を、３０μｇのりポフェクチンおよび２０μｌの 水と混合した。得られた溶液を室温で１５分間インキュベートした。感染した細 胞を、血清を含まない媒体中で２回洗浄し、３　ｍｌの血清を含まない媒体を各 フラスコに添加した。その後、１００μｌのＤＮＡ−リポフェクチン複合体を各 フラスコに渦を巻（ように攪拌しながら滴下した。３７°Ｃで５時間、７％ＣＯ ２を含む雰囲気下でトランスフェクシヨンされたものをインキコベートした。そ の後、２０％ウシウシ血清（ＦＣＳ）を含む３　ｍｉｓのＤＭＥを各フラスコに 添加しく最終ＦＣＳ濃度は１０％であった）、トランスフェクシヨンされたもの を４８−７２時間インキュベートした。インキ二ベーシヲンの後、上記媒体中に 細胞をかき集めることにより、組換えウィルスを得た。上記細胞を３回凍結解凍 することにより、細胞からウィルスを放出した。

ＶＰ１６を含む組換えウィルスを、Ｍａｃｋｅｔ　ｔらの技術（１９８７）を用 いて選択した。簡単に述べると、各トランスフェクシヨンにより生産したウィル スのストックを解凍し、音波破砕し、そして、０．１容量の０．２５％トリプシ ンの存在下において、３７℃で３０分間インキュベートした。ＴＫ−１４３細胞 の単層を、トリプシン処理したストックを１０倍に連続希釈したものに感染させ た。

吸着後、１％低融点アガロース、５％ＦＣＳ、　および２５μｇＢＵＤＲ（Ｓｉ ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）を含むＤＭＥで細胞を覆った。感染から（ ｐ、　ｉ、）４８時間後、０．１％中性赤を含む１ｚアガロースで細胞を着色し た。３から５時間後、細胞叢生の透明な点（ｃｌｅａｒｉｎｇ）として、ウィル スのプラークが観察された。プラークを取り出し、ＢυＤＲを用いたプラーク精 製をさらに２回行った。

選択された組換え体がＶＰ１６をコードする配列を含んでいたということを、ド 、トブロットハイプリダイゼーシ曹ンを用いて確認した。ドツトプロット技術は 、ＶＰ１６をフードするフラグメントを用いて検出を行ったこと以外は、実質的 にＭａｃｋｅｔｔら（１９８７）の技術によった。簡単に述べると、推定される 組換え体に感染した細胞を、ドツトプロ７トを複数回行うことによりニトロセル ロース上に散在させ、溶解し、そして変性させた。フィルターを８０℃で２時間 減圧下で焼き、ハイブリダイゼータ１ンの前に、６０％ホルムアミド、１％硫酸 ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，１０％硫酸デキストランを 含む溶液で処理し、１０’　ｃａｐ／■ｌの３２ｐ標ｆｉＶＰ１６とハイブリダ イズした。

ハイブリダイゼータ１ンは、４２℃で一晩、６０％ホルムアミド、１％硫酸ドデ シルナトリウム（ＳＤＳ）、ＬＭ　ＮａＣ１，１０％硫酸デキストラン、１０　 ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、　１０　ｍｇ／ｍｌポリＡ”ＤＮＡ、および５０μ ｌ１ｇ／ｌ１１酵母ｔＲＮＡを含む溶液中で行った。ハイブリダイゼーションの 後、フィルターを室温で５分間、２ｘのＳＳＣを泪いて４回洗浄し、６５℃で３ ０分間、２ｘのＳＳＣ，０，１％ＳＤＳを用いて１回洗浄し、６５℃で３０分間 、Ｏ，ｌｘのＳＳＣ，０，１％ＳＤＳを用いて１回洗浄した。ハイブリダイゼー ションの結果は、１２の単離体のうち６体が、ＨＳＶ−２’／Ｐ１６をコードす る配列について陽性であり、１２の単離体のうち２体は極度に陽性であったこと を示した。

上記のように調製した６体の単離体を、ＶＰ１６の発現のさらなる分析のために 選択した。

支施五１ °ｖｖ−ｖＰ１６ベク　−か゛のＶＰ１６の実施例２に記載されるｖｖ−ＶＰ１ ６クローンからのＶＰ１５の発現を、高力価陽性ヒト血清を用いる、［３５ｓ］ で標識された感染細胞溶解産物を放射線免疫沈降させ、次いで沈降した産物を５ ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、オートラジオグラフィーにより 浮かび上がったｐｓｓ］で標識されたＶＰ１６により検出した。さらに詳細に説 明すると、試料を、８％の厚さ１．５ｍｍのポリアクリアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ 　Ｃｏｒｐ、　）で、４ｈＡで９０分間電気泳動にかけた。電気泳動後、ゲルを 固定し、「増強（”ｅｎｈａｎｃｅｄ゛）」シ、フィルムに露光する前に乾燥さ せた。組換えＩ／Ｐ１６　（Ｖｆｖ６５）の見かけの分子量は、５５ｋＤである 。ＶＰ１６の同定は、ＶＰ１６に特異的なモノクローナル抗体ＬＰ１を沈降のた めに用いて、ＨＳＶ−２に感染したＶｅｒｏ細胞からのタンパク質を放射線免疫 沈降させることにより確認した。ＭｃＬｅａｎら（１９ｇ２）に記載されている ＬＰＩを、Ａ、　Ｍｉｎｓｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙか ら入手した０ｖｖ−ＶＰ１６に感染した細胞からの標識された沈降産物は、Ｖｅ ｒ６細胞からの標識された沈降産物と電気泳動中に共移動した。Ｖｅｒｏ細胞に おいて発現したＶＰ　ｉ６、および組換えワクシニアライｋ　、Ｃ−ＶＰＬ６　 （ｖｖ−ＶＰ１６）細胞からのＶＰ１６の、電気泳動中のこの共移動は、ｖｖ− ＩＰ１６産物が全長であることを示している。

抗体ＬＰＩは、ｖｖ−ＶＰ１６細胞において発現したＶＰ１６を認識しないが、 ＨＳＶに感染したＶｅｒｏ細胞において発現したＶＰ１６を認識することは、興 味深いことである。ｖｖ−ＶＰ１６産物での抗体認識における変化は、組換えに より生産されたポリペプチドのリン酸化の欠如、またはタンパク質プロセッシン グにおける他の相違に起因すると思われる。なぜなら、ワクシニアウィルスは、 感染細胞の細胞質において複製するからである。

ＨＳＶ−２により引き起こされた疾病に対する免疫原性および防御に関して、Ｖ Ｐ１６による免疫効果とｇＢ２による免疫効果とを比較するために、各ポリペプ チドをコードするワクシニアウィルス組換え体を用いてモルモットを免疫した。

ＶＰ１６をコードする遺伝子を含む使用したワタシニア組換え体は、実施例２に おいて記載されたもの、すなわち、ｖｖ−ＩＰ１６　（ｖｖ−ＶＰ１６−ＴＩ− とも呼ばれる）であった。ｇＢ組換え体は、ｇＢ２をコードするボリスクレオチ ドをｐｔｌｃ１３ベクターにサブクローニングすることにより調製した。３．２ ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ−Ｂａｎ旧フラグメントである、ｇＢＺをコードするポリ ヌクレオチドは、ＷＯ３８１０２６３４の図４に示されるように、−１３６位か ら３０８８位までのヌクレオチドを含んでいた。この図面は、本明細書では、図 ６として採用している。得られるベクターｐＨ３２１８の主な特徴を図７に示す 。ｇＢＺをコードするワクシニアウィルス発現ベクターを生産するために、ｐｉ （Ｓ２１ｇから切り出した３、２にｂの旧ｎｄｌ　ＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメン トを平滑末端化し、ベクターｐＶＡｃｃ−ｇＢ２−を産生するｐｃＢＯ７の■１ ｎｃ１１部位に連結した。ベクターｐｃＢＯ７およびｐＶＡｃｃ−ｇＢＺの主な 特徴を、それぞれ図８および図９に示す。ｖｖ−ＶＰ１ｇ構築物と同隣接するチ ミジンキナーゼ（ＴＫ）配列が、野生型ウィルスにこの遺伝子座において組換え を行わせる。ｐＨ５２１８からのｐｖＡｃＣ−ｇＢＺの構築は、Ｄｒ、ｆａｎ　 Ｒａ１ｓｈａｖ、　Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎ　Ｃｕｒｔｉｎ　５ｃｈｏｏｌｏｆ　Ｍｅ ｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｔｈａ　Ａｕ５ｔｒａｌｉａｎ　Ｎａｔｉｏ ｎａｌ　ｔｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｃａｎｂａｒｒａ、　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ により行われたＯ野生型ワタシニアウィルスからのワクンニア発現ベクターｖｖ −ｇＢ２の生産方法は、組換えがｐＶＡｃｃ−ｇＢＺを用いて行われ、陽性クロ ーンの選択が、ｇＢＺをフードする放射能標識されたフラグメントとのノ＼イブ リダイゼーシ冒ンにより行われたこと以外は、ｖｖ−ＶＰ１６の生産方法と同様 であった。

雌のモルモットを、院内（分岐針を用いて右肋間縁の下の皮膚を乱刺）、腹膜腔 内、または経静脈的に（３０ゲージの針を用いた耳静脈への注射）免疫した。研 究対象の各グループにおけるプロトコールは、以下の表に示す。

表 ｖｖ−たはｖｖ−ｖ６による グループ　灸臣旦旦丘　免臣」ＬＬ医■１　１、Ｄ、　１０　ｐｆｕ　ｖｖ−ｇ ＢＺ２　１、Ｐ、　１０”ｐｆｕ　ｖｖ−ｇ８２３　１４、　１０　ｐｆｕ　ｖ ｖ−ｇＢ２４　１．０．　１０８ｐｆｕ　ｖｖ−ＶＰ１６Ｓ　１．Ｐ、　１０８ ｐｆｕ　ｖｖ−ＶＰ１６６　１、Ｖ、　１０　ｐｆｕ　ｖｖ−ＶＰ１６免疫と免 疫との間を１力月おいて、動物を２回免疫した。ＨｓＶ特異的およびワクシニア 特異的中和抗体を測定するために、２回目の免疫後３週間目および６週間目に動 物から採血した。グループ１から６の動物を、３　ｘ　ＬＯ５ｐｆｕのＨＳ’／ −２ＭＳ株で誘発した。

この誘発は、２回目の追加免疫後６４日目、６週間目に行った。

誘発は、ｌｌ５Ｖ−２の膣内接種により行った。誘発後最初の１４日間、動物に 急性疾患があるか否かを調べた。

ＶＰ１６およびｇＢＺの免疫原性を測定するために、補体依存性および補体非依 存性免疫の結果得られた中和抗体の力価を以下のように決定した。１０％のウシ 胎児血清（ＦＣＳ）を含む１５ｓｌ培地当りＬ　ｘ　１０’個のＶｅｒｏ細胞１ ５０μｍの懸濁液を、２つの９６ウエル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎから入手し た組織培養プレート”Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ　ｆ［−）　に蒔き、ＣＯ２インキュ ベーター中３７℃で一晩インキユベートした。翌日、試料を３番目の９６ウエル プレートでＨ製した。ウェルの内容は、図１０に示す。この図では、培地は、Ｄ ＭＥ−Ｈ２１組織培養培地であり、熱不活性化したウシ胎児血清（ＩＩＩ　ＦＣ Ｓ）は、ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ　Ｃｏｒｐ、）を５６°Ｃで３０分間インキュ ベートすることにより調製し、モルモットの補体は、再水和したモルモットの補 体（Ｇｉｂｃｏ　Ｃｏｒｐ、、製造者の指導に従って調製した）の１：１２５希 釈物であった。４番目のプレートも調製した。４番目のプレートは３番目のプレ ートと類似していたが、モルモ・１トの補体は省かれていた。両プレートを２時 間インキュベートした。プレート１および２の細胞単層から培地を吸引すること により、ウィルスの吸収および複製を行った。

プレート３および４のそれぞれのウェルの内容物を、フレート１および２にそれ ぞれ移し、プレートを、ＣＯ２インキコベコク−ター中７°Ｃで３日間維持した 。ウィルスの復製による細胞溶解を検出するために、インキユベーションの３日 後、培地を細胞から吸引し、１０％のホルムアルデヒド溶液および０．０９％の クリスタルバイオレットを含むリン酸緩衝化生理食塩水１００μｌを、各ウェル に加えた。プレートを室温で１５分間インキュベートし、クリスタルバイオレッ ト溶液を除去し、ウェルを水で３回洗浄し、プレートを風乾した。補体依存性お よび補体非依存性試料の、それぞれのウィルス力価は、３（Ｚ’）および２（２ ”）であった。ｎは、細胞単層の細胞溶解を５０％阻害する血清希釈倍数に等し い。

Ｈ３ｖ特異的補体位存性中和抗体力価の、採血１および２において見いだされた 平均中和力価として表現される、抗体滴定の結果を図１１に示す。図から理解さ れるように、３週間目（採血１）において、ｖｖ−ｖＰ１６の＋、Ｖ、投与は、 補体依存性中和抗体をｖｖ−ｇＢＺの約５倍に増加させた。

採血１のＨＳＶ特異的補体非依存性中和抗体力価は、以下の表に示す。表から理 解されるように、ｖｖ−１／Ｐ１６の１．　ｖ、投与は、Ｖｖ−ｇＢＺ組換え体 により誘導されたｌｌ５Ｖ特異的力価を〉１０倍上回る抗体の力価を生じた。中 和を、プラーク形成の５０％減少として測定した。野生型非組換えワクシニアＷ Ｈにより免疫した動物は、測定可能な中和抗体を誘発しない。

表 Ｈ３ｖ、　・ グループ　ワクチン　■　立ｊ１已 １　ｖｖ−ｇＢＺ　１．　Ｄ、　３２±０２　ｖｖ−ｇＢＺ　［、Ｐ、　３２± ０３　ｖｖ−ｇＢＺ　１．　Ｖ、　３２±０４　ｖｖ−ＶＰ１６　１．Ｄ、　３ ２　±　０５　ｖｖ−ＶＰ１６　１．　Ｐ、　４０±８６　ｖｖ−ＶＰ１６　１ ．Ｖ、　５６５　±　５３＊力価２３は、３週間目の平均力価を示す。

病巣において示される、防御に対するｖｖ−ＶＰ１６およびｖｖ−ｇＢＺによる 免疫の効果、および急性疾患の重篤度もまた比較した。

主要な性器の［ｌ５Ｖ−２感染の臨床的推移は、一般に以下の通りである。まず 、病巣は、ウィルス接種後３から４日目に、すべての動物の外性器に現れる。病 巣は、紅斑基部を有する個別の小胞として発生し、５から８日目までには、急速 に多数の小胞性潰瘍の病巣に発達する。出血性面皮は、８から１００日目でには 、潰瘍性病巣を覆う。１３から１５５日目でには、外性器の皮膚が完全に治癒し て面皮がなくなる。大抵の動物は、５日目から１００日目間に深閑を起こすが、 この症状は、１０から１５５日目でに消散する。７から１００日目でには、動物 の０％から２０％において、後脚の麻痺が起こり得るが、この症状は、１５から ２００日目でに消散する。感染および外性器病巣は、接種を受けた動物の８０か ら１００％において発生し、その死亡率は、Ｏから５０％である。研究のための 病巣の測定は、以下の尺度に従った。

０．５・発赤、腫脹； １．０　＝　１から２個の小胞、または発赤および腫脹を伴った１個の小胞； １．５・２から４個の小さな小胞（直径１から２１１１＋Ｉ）、または腫脹およ び発赤を伴った２個の小胞； ２．０・４から６個の小胞： ２．５・腫脹および発赤を伴った４から６個の大きな小胞（直径２ｍｍより大き い）； ３．０−６個より多くの大きな小胞； ３．５茸付加的な小さな小胞を伴った、６個より多（の大きな小胞 ４．０＝会陰の２分の１より多くを覆う融合性の小胞；４．５・潰瘍を伴った極 端な小胞。

病巣の発生および重篤性により示される、疾病の防御および死亡率に対する、ｖ ｖ−ｖＰ１６による免疫効果と、ｖｖ−ｇＢ２による免疫効果とを比較した結果 を以下の表に示す。この研究では、スヘての動物において、病巣は発達し、免疫 していないコントロールグループの病巣スコアは、３．１０であった。

表 Ｌ　ｖｖ−ｇＢ２　１．０．　１．１１９±、１９　３９％　１／４２　ｖｖ− ｇＢ２　１．Ｐ、１３３±、１５　５７％　０３　ｖｖ−ｇＢ２　＋４．　１２ ９±、１３　５８％　Ｑ４　ｖｖ−ＶＰ１６　１．Ｄ、２．８５±、１６８％　 １／４５　ｖｖ−ＶＴ’１６　１．Ｐ、２．３３±、１７　２５％　０６　ＶＶ −ＩＰ１６　１．Ｖ、１．６２±、１４　４８％　Ｏｖｙ−ｇＢ２およびｖｖ− ＶＰ１６による異なる免疫経路での防御の時間経過を、それぞれ図１２および図 １３に示す。

ＥｓＶ−２により引き起こされた疾病に対する、ｖｖ−ＶＰ１５およびｖｖ−ｇ Ｂ２の免疫原性および防御効果を、ワクチンの投与が１．　Ｉ／。

であり、ＨＳＶ−２ＭＳ株による誘発投与が、６　Ｘ　１０’ｐｆｕであったこ と以外は実施例４と同様のプロトコールを用いて調べた。

ワクチンを、以下のように４つのグループに投与したニゲループ１、非処理；グ ループ２、ｖｖ−ＶＰ１６−　ｖｖ−ｇＢ２；　グループ３、Ｖｖ−ｇＢ２のみ ；およびグループ４、ｖｖ−ｖＰ１６のみ。

生じる補体依存性中和抗体力価に関する研究の結果を以下の表に示す。この研究 では、中和をプラーク形成の５０％減少として測定した。ワクシニアＷＲで免疫 した動物は、測定可能な中和抗体（＜１６）を誘発しない。これらの結果から以 下のことが示される。免疫後３週間目には、ｖｖ−ＶＰＬ６およびｖｖ−ｇＢ２ を含むワクチンによる処理では、ｖｖ−ｇＢ２またはｖｖ−Ｖｉａのみの場合と 比較してより高い中和抗体力価を生じ、６週間目には、ｖｖ−ＶＰ１６による免 疫は、抗体力価に関して、ｖｖ−ＶＰ１６およびｖｖ−ｇＢ２による免疫とほと んど同様であった。

表 に・　る ｖｖ−１／Ｐ　１６およびｖ＝Ｂの 平均力価　平均力価 グループ　ワクチン　−エム■ｎ−−工１１工１　なし　１３±６１４±２ ２　ｖｖ−ＶＰ１６　＋　ｖｖ−ｇＢ２　５９０±５７　５００±６１３　ｖｖ −ｇＢ２　１１３±１２　２２４±３４４　ｖｖ−ＶＰ１６　２１３±３９　６ １５土６１ｖｖ−ＶＰ１６およびｖｖ−ｇＢ２を含む混合ワクチンの、単一サブ ユニットワクチンと比較した場合の防御効果もまた、実施例４に記載される手法 （上記のように改変を加えて）およびスコアを泪いてモニターした。この研究で は、すべての動物が病巣を示した。しかし、以下の表に示される結果は、急性疾 患がワクチンにより改善され、かつ混合ワクチンの防御効果が、ｖｖ−ｇＢ２ま たはｖｖ−ＶＰ１６のみと比較して向上しているのが示された。防御効果の時間 経過を図１４に示す。

表 １　なし　２．２７±、　２８　４７８　（５０％）２　ｖｖ−ｖＰ１６ −ｖｖ−ｇＢ２　０．５９±、０９　７４％　Ｏ／８（ＯＳ）３　ｖｖ−ｇＢ２ 　１．１２±、１４　５０．７％　Ｏ／８（０％）４　ｖｖ−ＶＰ１６　１．０ ５＋、１１　５３．８％　Ｏ／８　（０％）以下に示す物質は、ブタベスト条約 に基づいて、アメリカンタイプカルチャーコレンクシコン（ＡＴＣＣ）、１２３ ０１　Ｐａｒｋｌａｖｎ　Ｄｒ、、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　 ２０８５２に寄託され、以下の受託番号を与えられている。

１！Ｅ　ｉ丘１　［銭」ム ｇ、　並置ＤＨ５ａにおける　１９９０年７月１５日　５８３７２ｐＥ［５２Ｚ ６ 本出願が米国特許として許可および発行されると、これらの寄託物の入手に対す るすべての制限が確実に取り除かれ、指定の寄託物は、米国特許法施行規則第１ ．１４条および米国特許法第１．２２条に基づき、本出願の係属中、長官により 決定されるすべての有資格者に入手可能となる。さらに、指定の寄託物は、寄託 日から３０年間もしくは最後の寄託請求日から５年間、または米国特許の有効期 間のうち、いずれか長い期間保存される。本明細書に記載の寄託物質は便宜上記 載したもので、本明細書の説明を考慮して本発明の実施に必要なものではない。

さらに、これらの物質は、本願では参考のために援用している。

直１」３−ζ月 ＨＳＶ　ＶＰ１６のエピトープを含む免疫原性ポリペプチドを含む、生じる症状 の緩和に有用である。組換えベクター、発現系、およびこれらのベクターにより 形質転換された宿主細胞は、免疫原性ポリペプチドの調製に有用であり、この免 疫原性ポリペプチドは、上記のワクチンを調製するのに有用である。

ＨＳＶ−２ピリオン ｃ（）　Ｏ（００１−＋（Ｊ　Φ（Ｊ　−ｕ　＞ｕ　ｃｕ　＝ａｍ（Ｊ　ｔ、＋ Ｑ　１．ＩｃＪ　ＩＩＩ（ｊ　ｇ＋　噂←　−ｏ　−ＣＪ　ロ←＜ｔ、３　ｃｔ ｕ　ｅＩ＋（Ｊ　ＩＩＩ＜　Ｃ−←　＞Ｕ　（ｊｃｊ　＜Ｕ　−；トａｕ−１＋ ｌｃＪ　１．Ｉａ　（１（Ｊ　＞ａ　ｏ、ｕ　ｌ１ｌ（Ｊ　ｚｕ　−ｍｃｉ仁　 ε足　よ？　ま仁　Ｇ８　；ご　；ご　６ご　；＄５０　ｅ（Ｊ　ＯＣＪ　＞Ｃ Ｊ　Ｌ、＋ｌ−’　１ｉ（Ｊ　４（Ｊ　１ｉ（Ｊ　１ｉＬｌａ←　−＜　１．Ｉ ＣＪ　ｘｕ　ａｌ（Ｊ　ロＱ　−Ｑ　シ＜二〇Ｊ（Ｊ　＜＜　ＬＬＩ　ｌ＋Ｉｌ ｊ　リド　りく　くＱ　ト←　←（αＥ−ＨＣｊ　Ｑｕ　コａ　ｖｕ　ｏｕ　σ ’（Ｊ　ｍｕ　ｏｔ。

＝百　：：乏　主シ　３七　ｉに　と８　＝８　ζ＝　堀ビ片足　巳８　＝？　 訃セ　巳＝　ｚ？　上駒　＝８　ミ足＜Ｕ　Ｑ−ＣＪ　ＪＣＪ　（Ｑ　＝ｕ　− ｃ、＋　ｍ（Ｖｌ←　←トＩ−ＣＪ　Ｏｔｊ　１．ＩｃＪ　ｍＬＩ　ｕｌｊ　Ｑ ’ＬＩ　−’９　０（Ｊ　：ｅ；ＱＩ＋ｕ　；ｕ　−（Ｊ　Φ＋ＬＵ　弓＝　Ｗ Ｕ　−＜←（Ｃ−（Ｊ　←く　くり　Σ＜　＜ＩＪ　）Ｕ　乙ｕ　ＱＣＯ（０＜ 　ｌ０ＣＪ　４リ　−（Ｊ　１．、（Ｊ　ＩＩＩｃＪ　コシ洲←１−ＣＪ　１． ＋ｕ　−ＩＣＪ　−ｕ　ｊ（Ｊ　？＋≦　−く　Φ−−ｃｃ−ｕ　ｃ＝ｕ　＜ａ 　＜ａ　←＜　ｅ−ｅ−＝ｕ　＝ｖ　ｖｃｏ＋ｕ　−ｏ　−ｕ　ｏｃ、＋　ｗｓ 　ＪＪＵ　ｃｕ　ｍｕ　ｏ’ｃψく　Φ（Ｊ　）Ｎ（ＬＣＪ　＞ロ　■←　−ｕ 　：（Ｊ　Ｌりく０　ψ←　←←　−Ｑ　Ｑ←　工＜　＜ａ　←＜　（（Ｊロロ 　−←　：＋＊　Ｏ（Ｊ　ｚＣｊＣＬ（Ｊ　Ｉ：ＬＥ−ＯＣＪ　ｃｔｕ−ｕ　４ ｅ−Φ←　−Ｑ　Φ←　ψく　ψ（１−＋Ｌｌ　−ヒ０−（Ｊ　＞Ｕ　、ｊ（Ｊ 　ｃｔｕ　−２ＣＪ　（（ｊ　＜ＯＱ、Ｃ，＋　（Ｌ７ａ＋ｕ　＞ｕ　ｏｃ　− ＣＪ　４＋５　＜ＣＪ　＞ｌｊ　ＩＩＩＬＩ　ＱＪト；←　−０−Ｑ　勺←　− ＣＪ　−（Ｊ　−ｍｕ　＝←　；ト０＋←　ｍｕ　ｃ−ｕ　＞ｏ　＜ａ　＜ａ　 じＱ　龜←　−←コ＜　ＣＬＣＪ　ＯＥ＋Ｏ（Ｊ　ｏｃ、＋　ｃｖ　ｃ−ｕ　ｐ ａｕ　ｃ。

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Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. １．単離された免疫原性ポリペプチドを含む、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ） 感染の個体を治療するための組成物であって、該ポリペプチドがＨＳＶ　ＶＰ１ ６のエピトープを含み、および該ポリペプチドが製薬的に受容可能な賦形剤中に 有効な量で存在する、組成物。
2. ２．前記免疫原性エピトープが単純ヘルペスウィルス２型（ＨＳＶ−２）由来の ＶＰ１６に存在する、請求項１に記載の組成物。
3. ３．前記ポリペプチドが免疫原性であり、単離されたＨＳＶＶＰ１６、切型のＨ ＳＶ　ＶＰ１６、およびその変異体から選択される、請求項１に記載の組成物。
4. ４．前記ＨＳＶ　ＶＰ１６がＨＳＶ−２由来である、請求項３に記載の組成物。
5. ５．第２の免疫原性エピトープをさらに含む組成物であって、該第２の免疫原性 エピトープがＨＳＶ糖タンパク質のものである、請求項１に記載の組成物。
6. ６．前記ＨＳＶ糖タンパク質がｇＢである、請求項５に記載の組成物。
7. ７．前記ＨＳＶ糖タンパク質がｇＤである、請求項５に記載の組成物。
8. ８．第３の免疫原性エピトープをさらに含む組成物であって、該第３の免疫原性 エピトープが第２のＨＳＶ糖タンパク質のものである、請求項５に記載の組成物 。
9. ９．前記第１のＨＳＶ糖タンパク質がｇＢであり、および前記第２のＨＳＶ糖タ ンパク質がｇＤである、請求項１０に記載の組成物。
10. １０．第１の単離されたＨＳＶ糖タンパク質、切型の第１のＨＳＶ糖タンパク質 、およびその変異体から選択される第２の免疫原性ポリペプチドをさらに含む、 請求項３に記載の組成物。
11. １１．前記第１のＨＳＶ糖タンパク質がｇＢである、請求項１０に記載の組成物 。
12. １２．前記第１のＨＳＶ糖タンパク質がｇＤである、請求項１０に記載の組成物 。
13. １３．前記第１の単離されたＨＳＶ糖タンパク質とは異なる第２の単離されたＨ ＳＶ糖タンパク質、切型の第２のＨＳＶ糖タンパク質、およびその変異体から選 択される第３の免疫原性ポリペプチドをさらに含む、請求項１０に記載の組成物 。
14. １４．前記第２の単離されたＨＳＶ糖タンパク質がｇＢである、請求項１３に記 載の組成物。
15. １５．前記第２の単離されたＨＳＶ糖タンパク質がｇＤである、請求項１４に記 載の組成物。
16. １６．組換えワクシニアウイルスを含む組成物であって、該ウィルスが、ＨＳＶ 　ＶＰ１６、切型のＨＳＶ　ＶＰ１６、およびその変異体から選択される免疫原 性ポリペプチドをコードする配列を含み、該免疫原性ポリペプチドをコードする ポリヌクレオチドが制御配列に作動可能に連結されている、組成物。
17. １７．ＨＳＶ糖タンパク質、切型のＨＳＶ糖タンパク質、およびその変異体から 選択される第２の免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組 換えワクシニアウイルスをさらに含む組成物であって、該第２の免疫原性ポリペ プチドをコードする該ポリヌクレオチドが制御配列に作動可能に連結されている 、請求項１６に記載の組成物。
18. １８．ＨＳＶ感染を治療するための組成物を生産する方法であって、 （ａ）ＨＳＶ　ＶＰ１６の免疫原性エピトープを含む免疫原性ポリペプチドを提 供する工程； （ｂ）製薬的に受容可能な賦形剤中に該ポリペプチドを製剤する工程、 を包含する、方法。
19. １９．前記提供されるポリペプチドが、ＨＳＶ　ＶＰ１６、切型のＨＳＶ　ＶＰ １６、およびその変異体から選択される、請求項１８に記載の方法。
20. ２０．前記ＨＳＶ　ＶＰ１６がＨＳＶ−２ＶＰ１６である、請求項１９に記載の 方法。
21. ２１．ＨＳＶ糖タンパク質の免疫原性エピトープを含むポリプチドを提供する工 程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
22. ２２．第１のＨＳＶ糖タンパク質、切型の第１のＨＳＶ糖タンパク質、およびそ の変異体から選択される第２のポリペプチドを提供する工程をさらに包含する、 請求項１８に記載の方法。
23. ２３．前記提供されるＨＳＶ糖タンパク質がＨＳＶ　ｇＢである、請求項２２に 記載の方法。
24. ２４．前記提供されるＨＳＶ糖タンパク質がＨＳＶ　ｇＤである、請求項２２に 記載の方法。
25. ２５．第２の糖タンパク質、切型の第２の糖タンパク質、およびその変異体から 選択される第３のポリペプチドを提供する工程をさらに包含する、請求項２２に 記載の方法。
26. ２６．前記第３のポリペプチドがＨＳＶ　ｇＢである、請求項２５に記載の方法 。
27. ２７．前記第３のポリペプチドがＨＳＶ　ｇＤである、請求項２５に記載の方法 。
28. ２８．請求項１８に記載の方法に従って調製される組成物。
29. ２９．請求項２１に記載の方法に従って調製される組成物。
30. ３０．請求項２５に記載の方法に従って調製される組成物。
31. ３１．請求項１に記載の組成物を個体に投与する工程を包含する、該個体のＨＳ Ｖ感染を治療する方法。
32. ３２．請求項８に記載の組成物を個体に投与する工程を包含する、該個体のＨＳ Ｖ感染を治療する方法。
33. ３３．請求項１３に記載の組成物を個体に投与する工程を包含する、該個体のＨ ＳＶ感染を治療する方法。
34. ３４．ＨＳＶ−２ＶＰ１６の免疫原性エピトープを含むポリペプチドをコードす る、組換えポリヌクレオチド。
35. ３５．前記ポリペプチドが、ＨＳＶ−２ＶＰ１６、切型のＨＳＶ−２ＶＰ１６、 およびその変異体から選択される、請求項３４に記載の組換えポリヌクレオチド 。
36. ３６．請求項３４に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
37. ３７．請求項３５に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
38. ３８．ＨＳＶ−２ＶＰ１６の免疫原性エピトープを含むポリペプチドをコードす るＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む組換え発現系であっ て、該ＯＲＦが所望の宿主と適合する制御配列に作動可能に連結されている、組 換え発現系。
39. ３９．前記ＯＲＦが、ＨＳＶ−２ＶＰ１６、切型のＨＳＶ−２ＶＰ１６、および その変異体から選択される免疫原性ポリペプチドをコードする、請求項３８に記 載の組換え発現系。
40. ４０．前記発現系がワクシニアウイルスである、請求項３８に記載の組換え発現 系。
41. ４１．請求項３８に記載の組換え発現系により形質転換された宿主細胞。
42. ４２．請求項３９に記載の組換え発現系により形質転換された宿主細胞。
43. ４３．ＨＳＶ感染の治療に用いられる免疫原性ポリペプチドを生産する方法であ って、 （ａ）請求項４１に記載の宿主細胞を提供する工程；（ｂ）該ポリペプチドを発 現させる条件下で、該宿主細胞をインキュベートする工程；および （ｃ）該宿主細胞から発現したポリペプチドを単離する工程、 を包含する、方法。
44. ４４．ＨＳＶ感染の治療に用いられる免疫原性ポリペプチドを生産する方法であ って、 （ａ）請求項４２に記載の宿主細胞を提供する工程；（ｂ）該ポリペプチドを発 現させる条件下で、該宿主細胞をインキュベートする工程；および （ｃ）該宿主細胞から発現したポリペプチドを単離する工程、 を包含する、方法。
45. ４５．請求項４３に記載の方法により生産される、ＨＳＶ感染の治療に用いられ る免疫原性ポリペプチド。
46. ４６．請求項４４に記載の方法により生産される、ＨＳＶ感染の治療に用いられ る免疫原性ポリペプチド。