JP2002503251A

JP2002503251A - 単純ヘルペスウイルスｖｐ２２ワクチンおよび使用の方法

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Publication number: JP2002503251A
Application number: JP50253099A
Authority: JP
Inventors: リンバルケ，ラエ; エイ．ティッジェス，マイケル
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1997-06-02
Filing date: 1998-05-26
Publication date: 2002-01-29
Also published as: WO1998055145A1; CA2291010A1; AU7597998A; US6635258B2; US20030017174A1; EP0984790A1

Abstract

(57)【要約】細胞性免疫応答を誘発し得る、単純ヘルペスウイルス(HSV)VP22ポリペプチドを含むワクチン、およびワクチンを使用してHSV感染を処置および予防するための方法が、開示される。ワクチンは、HSV糖タンパク質のようなさらなるHSVポリペプチドを含み得る。DNA免疫の方法もまた、開示される。

Description

【発明の詳細な説明】単純ヘルペスウイルスVP22ワクチンおよび使用の方法発明の背景技術分野本発明は、一般にヘルペスウイルスワクチン組成物に関する。特に、本発明は、VP22ポリペプチドを含むワクチンおよびワクチンを使用する単純ヘルペスウイルス感染の処置および予防のための方法に関する。発明の背景単純ヘルペスウイルス(HSV)感染は、極めて流行性であり、そして免疫が損なわれた状態の個体および新生児において、明らかに無症候性獲得から重症疾患および生命を脅かす感染までの症状の範囲を有する。これらの感染は、２つのウイルス（単純ヘルペスウイルス１型(HSV-1)および単純ヘルペスウイルス２型(HSV- 2)）によって生じる。HSV-1は、経口感染の優性な原因であり、そして通常、幼児期において獲得されるが、HSV-2感染は、通常、性行為感染症である。しかし、これらの区別は不明確であり、そして陰部ヘルペスの２５％までが、HSV-1によって生じる。初期感染に続いて、ウイルスは生涯にわたって潜伏状態を確立し、そして周期的に再活性化する。これは臨床的に明らかな損傷性発症または無症候性ウイルス脱殻を生じる。抗ウイルス薬剤であるアシクロビルの有効性にもかかわらず、人口におけるHS V-2の出現率は、8〜50％の範囲にあり、そして増加している。この増加の明らかな理由は、ほとんどの個体が、これらの感染に気づかないでいることである。さらに、大多数の伝染は、脱殻したウイルスから無症候性で生じる。一般に、HSVは約150〜160kbpのゲノムを有する二本鎖DNAウイルスである。HSV -1およびHSV-2のウイルスゲノムは、同一線形順序に並んでおり、ゲノム全体に渡って50%を超える相同性を共有する。いくつかの遺伝子について、２つのウイルス型の間のアミノ酸同一性は、80〜90%程度である。この類似性の結果として、多くのHSV特異的抗体は、両方のウイルス型について交差反応性である。ウイルスゲノムは、膜に包まれている正二十面体のヌクレオカプシド内にパッケージングされる。膜（またはエンベロープ）は、少なくとも１０のウイルスコード糖タンパク質を含み、最も豊富な糖タンパク質は、ｇB、ｇC、ｇD、およびg Eである。ウイルス糖タンパク質は、細胞レセプターへのウイルス付着のプロセス、およびウイルスの細胞への侵入を許容するためのウイルス膜と宿主細胞膜との融合に関与する。これらの位置（ビリオンの表面上）およびこれらの役割の結果として、糖タンパク質が中和抗体および抗体依存性細胞細胞傷害性(ADCC)抗体の標的となる。ウイルス型内に、糖タンパク質遺伝子の限定された（１〜２％）系統から系統への配列可変性がある。ウイルスゲノムはまた、カプシドとエンベロープとの間に位置する、VP16およびVP22（これらは、ビリオンテグメントと関連する）を含む、70を超える他のタンパク質をコードする。（VPは「ビリオンタンパク質」を表す） HSVワクチン開発のための１つのアプローチは、単離された糖タンパク質の使用（これは、予防と治療の両方であることが示されてきた）である。例えば、Bu rkeら、Virology，(1991)181:793-797;Burkeら、Rev．Infect．Dis．(1991)13( 増補11):S906-S911;Strausら、Lancet（1994）343:1460-1463;Hoら、J．Virol． (1989)63:2951-2958;Stanberryら、J．Infect．Dis．(1988)157:156-163;および Stanberryら、（1987）J．Infect．Dis．155:914-920;Stanberry，L.R．「Subuni t Viral Vaccines:prophylactic and the rapeutic use.」Aurelian L(編)Herpes viruses，the Immune Systems and Aids．Kluwer，Boston，309-341頁を参照のこと。同様に、ワクチン組成物におけるVP16の使用が、最近記載されている。EP 公開第541,692号を参照のこと。さらに、ヘルペス障害から回復したT細胞クローンが、VP16と反応性であることが示されてきた（Koelleら、J．Virol．(1994)68 :2803-2810を参照のこと）。多くのウイルスに対するワクチン接種は、免疫系の細胞性および体液性両方の装備を標的化すべきであるという高まりつつある証拠がある。この点に関して、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は、細胞内病原体および特にウイルスに対して細胞媒介免疫防御において、重要な役割を果たす。CTLは、感染した細胞によって提示されるMHCクラスI分子との結合において認識されているウイルス決定基によって、ウイルス感染した細胞の細胞傷害性を媒介する。タンパク質の細胞質内発現は、一般に、MHCクラスIプロセシングおよびCTLに対する抗原ペプチドの提示のための必要条件であると考えられている。サブユニット糖タンパク質ワクチンでの免疫は、細胞内感染を阻止するために不可欠なCTLを効果的に産生し損ない得る。従って、細胞性免疫応答を誘発し得る、HSVに対する有効なワクチンの幅広い利用性は、それゆえ非常に所望される。発明の要旨本発明は、HSV感染を処置および予防するための方法、ならびにその方法において使用するための組成物を提供する。特に、組成物は、ウイルステグメントタンパク質VP22（これは、本明細書中で示されるように、細胞性免疫応答を誘発し得る）由来のポリペプチドを含む。組成物は、HSV糖タンパク質およびVP16のようなさらなるHSVポリペプチドを含み得る。このように、免疫は、細胞性免疫および体液性免疫の両方を誘発し、そしてHSV感染に対する予防および有SV感染を処置するための非常に有効な方法を提供する。従って、１つの実施態様において、本発明は、HSV VP22ポリペプチド（これは、哺乳動物被検体において細胞性免疫応答を誘導し得る）を含むサブユニットワクチン組成物、および薬学的に受容可能な賦形剤へ指向される。VP22ポリペプチドは、HSV-1またはHSV-2に由来し得る。別の実施態様は、HSV VP16ポリペプチドおよび/またはHSV糖タンパク質をさらに含む組成物に指向される。別の局面において、本発明は、以下： (a)哺乳動物被検体において細胞性免疫応答を誘導可能である単離されたVP22 ポリペプチドを提供する工程；および (b)薬学的に受容可能な賦形剤とともにVP22ポリペプチドを処方する工程、を含む、HSV感染の処置または予防のための組成物を産生するための方法に指向される。なお別の実施態様において、本発明は、上記で記載されるような組成物を、被検体に投与する工程を含む、哺乳動物被検体におけるHSV感染を処置または予防するための方法に指向される。組成物は、１次感染前および/または１次感染後に投与され得る。さらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物被検体において細胞性免疫応答を誘導可能である、HSV VP22ポリペプチドをコードする遺伝子を含むウイルスベクターに指向される。遺伝子はHSV-1またはHSV-2由来であり得る。なお別の実施態様において、本発明は、上記に記載されるようなウイルスベクターを被検体に投与する工程を含む、哺乳動物被検体におけるHSV感染を処置または予防するための方法に指向される。なおさらなる実施態様において、本発明は、組換えベクター(これは、哺乳動物宿主細胞において遺伝子の転写および翻訳を指向する制御要素に作動可能に連結されたHSV VP22ポリペプチドをコードする遺伝子を含む)を含むワクチン組成物および薬学的に受容可能な賦形剤に指向される。VP22ポリペプチドをコードする遺伝子は、HSV-1またはHSV-2由来であり得、そしてベクターは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターであり得る。なお別の実施態様において、本発明は、上記の組成物を投与する工程を含む、哺乳動物被検体において、HSV感染を処置または予防するための方法に指向される。本発明のこれらのおよび他の実施態様は、本明細書の開示を考慮して、容易に当業者に想到される。図面の簡単な説明図1A〜1B（配列番号：_）は、UL49 ORFの配列およびHSV-2 VP22の予測されたアミノ酸配列を示す。保存的なC→T塩基変化は、70位で下線を付される。図２は、バキュロウイルス発現ベクターであるpAc13（これは、VP22をコードするヌクレオチド配列を含む）を示す。図３は、ワクシニアシャトルベクターであるpHS232(これは、UL49を含み、HSV -2 VP22をコードする)を示す。図４は、実施例に記載されるような、HSV-2×HSV-1型間組換え体を使用して、 C D8+、HSV特異的CTLクローンによって認識される抗原の局在化を示す。発明の詳細な説明本発明の実施は、他に示されない限り、ウイルス学、微生物学、分子生物学の従来の方法、および当業者の範囲内の組換えDNA技術を使用する。このような技術は、文献で十分に説明される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A La boratory Manual（第2版、1989）；DNA Cloning:A Practical Approach,第I巻および第II巻（D．Glover編）；Oligonucleotide Synthesis（N．Gaitら編、1984 ）;Nucleic Acid Hybridization(B．HamesおよびS．Higglns編、1985)；Transc ription and Translation(B．HamesおよびS．Higgins編、1984)；Animal Cell C ulture（R．Freshney編、1986）；Perbal，A Practical Guide to Molecular Cl oning（1984）;Fundamental Virology,第2版、第I巻および第II巻（B．N．Field sおよびD．M．Knipe編）を参照のこと。本明細書中および添付の請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに他を記載しない限り、複数の言及を含む。Ｉ．定義本発明の記載において、以下の用語が使用される。これらは、以下に示されるように規定されることが意図される。 HSV VP22、VP16、gB、gDなどを参照して使用される場合、用語「ポリペプチド」は、任意の種々のHSV-1またはHSV-2株由来の、VP22、VP16、gB、gDなどのポリペプチド（天然のポリペプチド、組換えポリペプチド、または合成ポリペプチドのいずれか）をいう。この用語は、任意の種々のHSVタンパク質（糖タンパク質、外被タンパク質などを含む）由来のポリペプチドを意図する。ポリペプチドは参照分子の全長アミノ酸配列を含む必要はないが、ポリペプチドがその意図された目的を機能するために必要な分子のみを含む必要がある。従って、例えば、VP 22の場合、以下に規定されるように、細胞性免疫応答を惹起し得る１つ以上のエピトープが存在する必要がある。従って、ポリペプチドは、全長配列、フラグメント、短縮型配列および部分配列、アナログ、ならびに参照分子の前駆体形態、ならびに他のタンパク質とのポリペプチド融合体を含み得る。それゆえ、この用語は、ポリペプチドが意図されるように機能する限り、配列の欠失、付加、および置換を意図する。これに関して、特に好ましい置換は、一般に、天然において保存的である（すなわち、側鎖で関連性のあるアミノ酸ファミリー内で生じる置換）。特に、アミノ酸は、一般に、４つのファミリーに分けられる：（1）酸性--アスパラギン酸およびグルタミン酸；（2）塩基性--リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性--アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（4）無電荷極性--グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、七リン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、ときどき、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、単離された、イソロイシンまたはバリンでのロイシンの置換体、グルタミン酸でのアスパラギン酸の置換体、セリンでのスレオニンの置換体、または、構造的に関連するアミノ酸でのアミノ酸の類似した保存的置換体が、生物学的活性に主要な影響を及ぼさないことが合理的に予測される。参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、タンパク質の抗体結合能に実質的な影響を及ぼさない主要なアミノ酸置換を有するタンパク質は、それゆえ、参照ポリペプチドの定義内である。用語「HSV糖タンパク質」は、HSV-1およびHSV-2の膜領域に見られる任意の糖タンパク質由来である、上で規定されるようなポリペプチドをいう。現在好ましいHSV糖タンパク質は、HSV-1またはHSV-2のいずれか由来のgB、gC、gDおよびgE である。天然の供給源（例えば、感染細胞培養由来）、および合成的または組換え的に産生される糖タンパク質から抽出された糖タンパク質は、定義に含まれる。このような糖タンパク質は、化学的手段もしくは酵素学的手段（例えば、タンパク質分解による切断、脱グリコシル化など）によって、または変異によって、または組換えDNA技術（例えば、HSV糖タンパク質エピトープをコードする遺伝子を、互いに、もしくは融合タンパク質を提供する他の遺伝子と融合すること、またはDNA配列の欠失断片または置換断片によって）によってのいずれかで改変され得る。例えば、分子内に存在する膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの全てまたは一部を欠失することが所望され得る。例えば、国際公開番号WO 96/04382（1996 年2月15日公開）、およびWO 95/31555（1995年11月23日公開）を参照のこと。このような欠失は、分泌および可溶性の増強を可能にし、そしてそれゆえ、組換え的に産生される場合、分子の回収を増強させ、その一方で、HSV-1および/または HSV-2への抗体の反応性をなお維持する。所定のタンパク質における膜貫通ドメインの位置は、Kyteら、J．Mol．Biol．(1982)157:105-132;ならびにHoppおよび Woods，Proc．Natl．Acad．Sci．USA(1981)78:3824-3828に記載されるように、2 0アミノ酸の各々の疎水性および親水性特性を利用して、タンパク質のアミノ酸配列から疎水性親水性指標規模を定式化するコンピュータープログラムを使用して決定され得る。HSV gBおよびgDならびにその抗原性タンパク質は、以下にさらに記載される。「VP22ポリペプチド」は、HSV-1またはHSV-2VP22由来の上記に規定されるようなポリペプチドを意味する。VP22は、ウイルスのキャプシドとエンベロープとの間に位置するウイルス性外被タンパク質である。VP22をコードする遺伝子は、「 UL49」(HSVゲノムの特有の長いセグメントにおけるオープンリーディングフレーム49）と称される。例えば、ElliottおよびMeredith，J．Gen．Virol．(1992)73 :723-726を参照のこと。HSV-1 UL49のDNA配列およびHSV-1 VP22のアミノ酸配列が報告されている。例えば、McGeochら、J．gen．Virol．(1988)69:1531-1574を参照のこと。HSV-2 VP22のDNA配列および対応するアミノ酸配列は、本明細書中の図1A〜1B(配列番号＿）に示される。図1A〜1Bに示される配列は、参照HSV-2と比較した場合、70位で１つの保存的塩基置換（Ｃ→Ｔ、leu→leu）を有する。用語「VP22」は、分子が細胞性免疫応答を惹起する能力を保持する限り、上記のように、参照配列の置換、欠失、および付加を含む。HSV-1およびHSV-2 VP22は、それぞれ、301および300のアミノ酸を含む。２つのタンパク質は、約68.9％の相同性を共有する。「VP16ポリペプチド」は、HSV-1またはHSV-2 VP16由来である上記で規定されるポリペプチドを意味する。VP16は、ウイルスのキャプシドとエンベロープとの間に位置するウイルス性外被タンパク質であり、これは、ICP25、VmW65、および αトランス誘導性因子（αTIF）ともいわれる。HSV-1 VP16のDNA配列およびアミノ酸配列が報告されている。例えば、Campbellら、J．Mol．Biol．(1984)180:1; およびTriezenbergら、Genes and Develop．(1988)2:718を参照のこと。同様に、HSV-2 VP16のDNA配列および対応するアミノ酸配列が公知である。例えば、欧州公開番号541,692を参照のこと。HSV-1およびHSV-2 VP16は、489アミノ酸を含む。２つのタンパク質は、約85％の相同性を共有する。本明細書中での使用のためのVP16の例示的な短縮型誘導体は、アミノ酸１〜416を有するVP16ポリペプチドを含む。細胞性免疫応答を惹起し得る、このVP16ポリペプチドおよび他のVP16 ポリペプチドは、本発明の方法を用いる使用が見出されている。「gBポリペプチド」は、HSV-1 gB(gB1)またはHSV-2 gB(gB2)に由来する、上記で規定されるようなポリペプチドをいう。種々のHSV株由来のgB1およびgB2のDNA 配列および対応するアミノ酸配列が公知であり、例えば、米国特許第5,244,792 号、および同第4,642,333号；PCT公開番号WO88/02634(1988年4月21日に公開された)；Stuveら、J．Virol．(1987)61:326-335；Pellettら、J．Virol．(1985)53: 243-253；およびBzikら、Virology（1984）133:301-314に報告される。全長の前駆体gB1タンパク質は約904アミノ酸を含み、このうち約１〜30のアミノ酸は、シグナル配列を含む第１の疎水性領域を含み；31〜約726のアミノ酸が可変性極性領域を含み；アミノ酸727〜約795が膜貫通アンカーを含む第２の疎水性領域を含み；そしてアミノ酸796〜約904が細胞質ドメインを含む第２の可変性極性領域を構成する。同様に、全長gB2タンパク質は約904アミノ酸長である。最初の22のアミノ酸はシグナル配列を構成し、そしてこの配列の切断後、成熟の非グリコシル化タンパク質は、約98kDの推定分子量を有する。アミノ酸23〜約723は、可変性極性の第１の領域を構成し；アミノ酸724〜約798は膜貫通ドメインを含み；そしてアミノ酸799〜約904は、細胞質ドメインを含む、第２の可変性極性領域を構成する。膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの全てまたは一部を欠如するgBの例示的な短縮型誘導体は、例えば、米国特許第5,244,792号（例えば、遺伝子の3'末端から580bpを欠如し、且つ194のカルボキシル末端アミノ酸を欠如するタンパク質をコードするgB1遺伝子を含む、プラスミドpHS114（ATCC受託番号39651）；および3'末端から637bpを欠如するgB2遺伝子を含むプラスミドpHS210の記載を参照のこと）に記載されている。米国特許第5,171,568号は、1187塩基対のgB1遺伝子フラグメントを有するプラスミドpHS127A（ATCC受託番号39652）を記載する。任意のこれらの誘導体、ならびに免疫学的応答を惹起し得る他のものは、本発明の組成物および方法における使用を見出す。「gDポリペプチド」は、HSV-1 gD（gD1）またはHSV-2 gD（gD2）由来の上記で規定されるようなボリペプチドを意味する。gD1およびgD2のDNA配列および対応するアミノ酸配列は公知である。例えば、米国特許第4,818,694号および同第4,8 55,224号；LaskyおよびDowbenko，DNA(1984)3:23-29；Watsonら、Gene(1983)26: 307-312；およびWatsonら、Science(1982)218:381-384を参照のこと。gD1および gD2のタンパク質は、全体的に約86％の相同性を共有する。全長gD1およびgD2は両方とも、残基333から362に膜貫通ドメイン、および残基393にカルボキシ末端まで伸張した細胞質ドメインを有する、約393アミノ酸を含む。gD1およびgD2タンパク質は、１位〜25位に生じるシグナル配列を有する。膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの全てまたは一部を欠如するgDの例示的な短縮型誘導体は、米国特許第5,171,568号（例えば、プラスミドpHS211およびp HS213（これらは、それぞれ、gD2の最初の305アミノ酸および最初の352アミノ酸をコードするgD2遺伝子を含む）の記載；およびプラスミドpHS132（これは、gD1 の315アミノ酸をコードするgD1遺伝子を含む）の記載；Laskyら、Bio/Technolog y（1984年6月）：527-532（これは、最初の300アミノ酸残基を有するgD1ポリペプチドをコードする短縮型gD1遺伝子を記載する）を参照のこと）に記載されている。種々のgDポリペプチドもまた構築されており、これは、米国特許第4，618 ，578号（例えば、プラスミドpYHS116およびpYHS117（これらは、gD1のシグナル配列コード領域の欠失を含む600bpの5'欠失を含む）；プラスミドpYHS118（これは、上記の600bpの欠失を含み、ならびにgD1のアンカー配列のほとんどを含むコード領域の3'末端における1300bpの欠失を含む）；プラスミドpYHS119（これは、5'末端の600bpの欠失、ならびに全膜アンカー領域およびgD1のアンカー配列の約700bp上流の欠失を含む、3'末端の2400bpの欠失を含む）の記載を参照のこと）に記載されるように、シグナル配列の全てまたは一部を欠如する。任意のこれらの誘導体、ならびに免疫学的応答を惹起し得る他のものは、本発明の組成物および方法における使用を見出す。「エピトープ」は、特異的なＢ細胞およびＴ細胞が応答する抗原における部位を意味する。この用語はまた、互換的に「抗原決定基」または「抗原決定部位」として使用される。本明細書中で使用される用語「エピトープ」は、線状エピトープおよび構造エピトープの両方をいう。エピトープは、エピトープに特有の空間的構造において３以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸から成り、そしてより通常では、８〜10のこのようなアミノ酸から成る。所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、アミノ酸の空間的構造を決定する方法は当該分野で公知であり、これには、例えば、ｘ線結晶および２次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66巻（Glenn E．Morris編、1996）を参照のこと。エピトープを決定する他の方法もまた公知である。例えば、Geysenら、Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA(1984)81:3998-4002（所定の抗原において免疫原性エピトープの位置を決定するために、迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第4, 708,871号（抗原のエピトープを同定および化学的に合成するための手順）；およびGeysenら、Molecular Immunology(1986)23:709-715（所定の抗体に対する高親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照のこと。同じエピトープを認識する抗体は、片方の抗体が、別の抗体の標的抗原への結合をブロックする能力を示す、簡単なイムノアッセイにおいて同定され得る。本明細書中で使用される、組成物またはワクチンに対する「免疫学的応答」は、目的のワクチンに存在するポリペプチドに対する体液性および／または細胞性免疫応答の、被験体における発生である。本発明の目的についての「細胞性免疫応答」は、クラスIまたはクラスIIのMHC分子に関連して、細胞表面で目的の抗原の存在によって、哺乳動物の被験体を感作させる応答である。このように、CTL は、提示された分子に対して作成され得、免疫された宿主のさらなる保護を可能にする。細胞媒介性免疫学的応答の存在は、当該分野において周知である、CTL 細胞障害性細胞アッセイ（例えば、Ericksonら、J．Immunol．(1993)151:4189-4 19 9;Doeら、Eur．J．Immunol．(1994)24:2369-2376に記載されるアッセイ、および以下の実施例にさらに記載されるアッセイ）を使用して決定され得る。本発明の組成物におけるポリペプチドもまた、抗体媒介性免疫応答、または体液性免疫応答を惹起し得る。従って、本明細書中で使用される免疫学的応答は、 CTLの産生を刺激する応答であり、そして以下の効果の１つ以上もまた含む；Ｂ細胞による抗体の産生、目的の組成物またはワクチンに存在する抗原に特異的に指向されるヘルパーＴ細胞およびサプレッサーＴ細胞。これらの応答は、伝染性を中和するために、および/または免疫された宿主への保護を提供するための抗体-補体もしくは抗体依存的細胞障害性を媒介するために作用し得る。このような応答は、当該分野で周知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイ（例えば、ウェスタンブロット、ドットブロット、および免疫親和性アッセイ）を使用して決定され得る。「サブユニットワクチン」は、HSVに由来するかまたはHSVに相同な１つ以上の選択された免疫原性ポリペプチドを含むが全てのポリペプチドは含まない、ワクチン組成物を意味する。このような組成物は、インタクトな病原細胞もしくは病原粒子、またはこのような細胞もしくは粒子の溶解物を実質的に含まない。従って、「サブユニットワクチン」は、HSVから少なくとも部分精製された（好ましくは実質的に精製された）免疫原性ポリペプチドまたはそのアナログから調製され得る。サブユニットワクチンに含まれる抗原を得る方法は、従って、標準精製技術、組換え的生成、または合成的生成を含み得る。２つの核酸配列またはポリペプチド配列は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約70％、好ましくは少なくとも約80〜90％、そして最も好ましくは少なくとも約95％以上が分子の規定された長さにわたってマッチする場合、「実質的に相同性」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同性はまた、特定の核酸配列またはポリペプチド配列に同一性を示す配列をいう。実質的に相同性である核酸配列は、例えば、特定のシステムについて規定されるようなストリンジェントな条件下で、サザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。規定された適切なハイブリダイゼーション条件は、当該分野内である。例えば、Sambrookら、前出、DNA Cloning，第I巻および第II巻、前出；Nucleic Acid H yb ridization、前出を参照のこと。このような配列はまた、PCR産物の直接的な配列決定によって確認され得、そしてさらに特徴付けられ得る。例えば、相同性は、相同性領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって決定され得る。例えば、安定な二重鎖は、一本鎖特異的ヌクレアーゼ（例えば、S1）での消化に耐性を示す鎖である。このような二重鎖は、種々の方法（例えば、消化されたフラグメントのサイズ決定）によって分析され得る。「ストリンジェンシー」は、異なる配列にわたって非常に類似した配列の結合を好むハイブリダイゼーション反応における状態をいう。例えば、研究を下に計算されたハイブリッドのTmよりも約12〜20℃低い、温度と塩濃度との組み合わせが選択されるべきである。配列同一性を決定する他の技術は当該分野で周知であり、そしてこれは、目的のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を決定する工程およびそれを第２の配列と比較する工程を包含する。Wisconsin Sequence Analysis Package，Ver sion 8（Genetics Computer Group，Madison，WIから入手可能）において入手可能なプログラム、例えば、BESTFIT、FASTA、およびGAPプログラムは、２つの分子間の同一性を計算し得る。「精製された」または「単離された」ポリペプチドは、組換え的または合成的に産生されたポリペプチド、またはその天然供給源から単離されたポリペプチドであり、その結果、組成物中に存在するタンパク質の量は、粗ウイルス調製物に存在するものよりも実質的に高い。一般的に、精製タンパク質は、＞50％の相同性、そしてより好ましくは＞80％〜90％の相同性である。本発明のいくつかの組成物は、２つ以上の精製ポリペプチドを含む。本明細書中で使用される「処置（treatment）」は、任意の（i）伝統的なワクチンにおけるような、感染または再感染の予防、（ii）症候性疾患の低減または除去およびまたは無症候性ウイルス脱粒、ならびに（iii）目的の病原の実質的な除去または完全な除去をいう。処置は、予防的に（感染の前）または治療的に（感染の後）にもたらされ得る。「哺乳動物被験体」は、哺乳動物クラスの任意のメンバーを意味し、ヒトおよび非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、ならびに他のサル(ape)およびサル(mo nkey)種）；家畜（farm animal）（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）；家畜（domestic mammal）（例えば、イヌおよびネコ）：ならびにげっ歯類（例えば、マウス、ラット、およびモルモット）を含む研究用動物を含むが、これらに限定されない。この用語は、特に年齢を記載しない。従って、成体、新生仔、および胎仔の哺乳動物が含まれることが意図される。 II.発明を実施するための形態本発明は、VP22が主要なCTL標的であり、それゆえHSVに対するCTL応答において重要な抗原であるという発見に基づく。従って、本明細書中に記載されるワクチンは、MHCクラスＩ分子とVP22ポリペプチドとの会合による細胞性免疫を提供する。従って、抗原を将来認識するのを可能にするCTLの生成を刺激する、VP22 に対するインビボの細胞性免疫応答を、上昇させ得る。詳細には、クラスＩに拘束されるHSV特異的CTLであるCD8⁺を、ヘルペスを頻繁に再発する個体からクローニングし、１つ以上の細胞性応答の重要な標的を同定するためのツールとして使用した。CD8⁺のCTLは、細胞内プロセシングの後にウイルス抗原を認識するので、どの程度多くの、およびどのウイルス遺伝子産物が CTLによって認識されるかの同定は、試薬およびこのウイルス抗原がプロセシングされ、そして提示され得るように標的細胞の細胞質に同定可能なタンパク質を送達する方法論を必要とする。それゆえ、下記の実施例においてさらに記載されるように、いくつかのアプローチを、以下を含むこれらのクローンによって認識される抗原を同定するために使用した：(1)ウイルス遺伝子発現の転写クラス(例えば、前初期、初期、後期など)を薬物を使用して限定すること；(2)HSV-1ゲノムのバックグラウンド内にHSV-2ゲノムの異なるセグメントを含んだHSV-1×HSV- 2の型間組換えウイルス；(3)合成ペプチド；および(4)特異的HSV遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルス。このような技術を使用して、VP22がHSV特異的CD8⁺ CTLによって確かに認識され、そのためHSV感染の処置および予防のためのワクチン組成物において有用であることが見出された。さらに、本発明のVP22を含有する組成物は、細胞性免疫応答および/または体液性免疫応答を誘発し得る他のHSVポリペプチドを含み得る。例えば、テグメントタンパク質であるHSV VP16はまた、細胞性免疫応答を誘発することが示されてきた。従って、本発明のワクチンは、このような応答を誘発し得る、このテグメントタンパク質または他のテグメントタンパク質を含み得る。さらに、上記に定義したように、HSV gB、HSV gDなどのようなHSV糖タンパク質は、予防的状況および治療的状況の両方において有効であることが示されてきた。例えば、Burke ら、Virology(1991)181:793-797；Burkeら、Rev.Infect.Dis.(1991)13(増補11): S906-S911;Strausら、Lancet(1994)343:1460-1463；Hoら、J.Virol.(1989)63:29 51-2958；Stanberryら、J．Infect.Dis.(1988)157:156-163；およびStanberryら (1987)J.Infect.Dis．155:914-920；Stanberry,L.R「Subunit Viral Vaccines:p rophylactic and therapeutic use.」、Aurelian L(編)Herpesviruses,the Immu ne Systems and Aids、Kluwer,Boston,309-341頁を参照のこと。これらの糖タンパク質は、体液性免疫応答を誘発し、そして本発明の組成物に存在する場合、細胞性免疫および体液性免疫の両方を誘発し得るワクチンを提供する。本発明のワクチンにおいて使用するためのポリペプチドは、種々の技術を使用して生成され得る。例えば、所望のテグメントタンパク質および/または糖タンパク質のようなHSVポリペプチドは、当該分野で周知の方法を使用して天然の供給源から直接単離され得る。一般的には、このような方法は、目的のポリペプチドを感染血清または組織培養において増殖させたウイルスから単離することを必要とする。例えば、ビリオンは、SpearおよびRolizman、J.Virol.(1972)9:143-1 59に記載されるように精製され得る。簡潔には、この方法は、核の破壊を防ぐために注意深く細胞質を抽出すること、いくつかのデキストラン勾配を介した細胞質抽出物のレートゾーン遠心分離によって、可溶性タンパク質および膜ベシクルからエンベロープ型ヌクレオキャプシドを分離すること、ウイルス細片凝集物を解離させるために尿素で処理すること、ならびに不連続スクロース勾配において等密度の浮遊による裸のヌクレオキャプシドおよび遊離膜からビリオンを分離することを包含する。タンパク質は、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、HPLC 、免疫吸着技術、アフィニティークロマトグラフィー、および免疫沈降のような方法を使用してさらに精製され得る。任意の種々のHSV-1およびHSV-2株は、所望のテグメントおよび糖タンパク質の供給源として使用され得る。 HSVテグメントポリペプチドおよび糖タンパク質はまた、当該分野で周知の組換え方法を使用して産生され得る。例えば、いくつかのHSVのgBおよびgDポリペプチドを組換え的に産生する方法は、例えば、米国特許第5,171,568号；Stanber ryら、J.Infect.Dis(1987)155:914-920；およびStanberryら、J.Gen.Virol.(198 9)70:3177-3185に記載される。VP16ポリペプチドを組換え的に産生する方法は、例えば、EP公開第541,692号およびTriezenbergら、Genes and Develop.(1988)2: 718に記載される。HSV VP22を組換え的に産生するための方法は、例えば、Lesli eら、Virology(1996)220:60-68、ならびにElliottおよびMeredith、J.Gen.Virol .（1992）73:723-726に記載される。これらのおよび他のHSVテグメントポリペプチドおよび糖タンパク質は、以下のように組換え的に産生され得る。一般的に、組換え産生について、オリゴヌクレオチドプローブは、HSVゲノムの公知の配列に基づいて考案され得、そして本発明において有用なポリペプチドをコードするHSV遺伝子についてのゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーをプローブするために使用され得る。この点に関して、VP22をコードする遺伝子、HSV-1 UL49のヌクレオチド配列は、McGeoch ら、J.Gen.Virol.(1988)69:1531-1574において報告され、そしてプローブ設計のための基礎として使用され得る。次いで、この遺伝子は、標準的な技術を使用してさらに単離され得、所望されるならば、PCRアプローチまたは制限酵素が、全長配列の一部を欠失させるために使用され得る。例えば、HSV糖タンパク質の場合において、上記のように、膜貫通結合ドメインおよび細胞質ドメインの全てまたは一部を欠失させて、ポリペプチドの収量の増加を提供することが所望され得る。同様に、HSV遺伝子は、例えばフェノール抽出のような公知の技術を使用して、HSV遺伝子を含む細胞および組織から直接単離され得、そしてこの配列は、任意の所望の改変を生じるためにさらに操作され得る。例えば、DNAを得て単離するために使用される技術の記載については、Sambrookら、前出を参照のこと。最終的に、HSVポリペプチドをコードする遺伝子は、公知の配列に基づいて、合成的に産生され得る。このヌクレオチド配列は、所望される特定のアミノ酸配列に適切なコドンを使用して設計され得る。一般的に、この配列が発現されることが意図される宿主に好ましいコドンを選択し得る。完全配列は、一般的に、標準的な方法によって調製される重複オリゴヌクレオチドから構築され、そして完全なコード配列に構築される。例えば、Edge、Nature(l98l)292:756；Nambairら、scie nce(1984)223:1299；Jayら、J.Biol.Chem.(1984)259:6311を参照のこと。一旦、所望のHSVポリペプチドについてのコード配列が単離されるかまたは合成されると、それらは、種々の系(昆虫、哺乳動物、細菌、ウイルス、および酵母の発現系を含み、これらは、全て当該分野において周知である)における発現のための任意の適切なベクターまたはレプリコンにクローニングされ得る。特に宿主細胞は、所望のコード配列に作動可能に連結された制御配列を含む発現ベクターで形質転換される。制御配列は、使用される特定の宿主細胞と適合性である。例えば、哺乳動物細胞発現のための代表的なプロモーターとしては、とりわけ、SV40初期プロモーター、マウス乳腺癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP)、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが挙げられる。マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターのような他の非ウイルスプロモーターはまた、哺乳動物の構築物における使用を見いだす。哺乳動物の発現は、プロモーターに依存して、構成性であるか、または調節性(誘導性)であるかのいずれかであり得る。代表的には、転写終結およびポリアデニル化配列もまた存在し、翻訳停止コドンに対して3'に配置される。転写ターミネーター/ポリアデニル化シグナルの例としては、SV40およびウシ成長ホルモン由来のものが挙げられる(Sambrookら、前出)。スプライスドナーおよびアクセプター部位を含むイントロンはまた、本発明の構築物中に設計され得る。エンハンサーエレメントはまた、発現レベルを増加するために哺乳動物構築物において使用され得る。例としては、SV40初期遺伝子エンハンサー(Dijkemaら、 EMBO J.(1985)4:761)、ならびにラウス肉腫ウイルス(Gormanら、Proc.Natl.Acad .Scl.USA(l982b)79:6777)およびヒトサイトメガロウイルス(Boshartら、Cell(19 85)41:521)の長末端反復(LTR)由来のエンハンサー/プロモーターが挙げられる。シグナルペプチドをコードする配列を含むリーダー配列もまた存在して、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供し得る。好ましくは、リーダー配列がインビボまたはインビトロでのいずれかで切断され得るように、リーダーフラグメントと目的の遺伝子との間でコードされるプロセシング部位が存在する。アデノウイルスの三部分(tripartite)リーダーは、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。一旦完了すると、哺乳動物発現ベクターを使用して、任意のいくつかの哺乳動物細胞を形質転換し得る。哺乳動物細胞に異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は、当該分野で公知であり、そしてこれらの方法としては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、ポリブレン媒介トランスフエクション、プロトプラスト融台、エレクトロポレーション、リポソームにおけるポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのDNAの直接マイクロインジェクションが挙げられる。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株がまた公知であり、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、乳仔ハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞ガン細胞(例えば、Hep G2)などが挙げられるが、これらに限定されない、American Type Culture Collection (ATCC)から入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられる。本発明の構築物はまた、酵母において発現され得る。酵母ベクターの制御配列は、当該分野で公知であり、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)(EP公開第284,04 4号)、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPまたはGAPDH)、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ(PyK)(EP公開第329,203号)のようなプロモーターが挙げられる。酸性ホスファターゼをコードする酵母PH05遺伝子はまた、有用なプロモーター配列を提供する(Myanoharaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:1)。さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機能する。例えば、ある酵母プロモーターの上流活性化配列(UAS)は、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と結合されて、合成ハイブリッドプロモーターを作製し得る。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、GAP転写活性化領域に連結されたA DH 調節配列が挙げられる(米国特許第4,876,197号および同第4,880,734号)。ハイブリッドプロモーターの他の例としては、GAPまたはPyKのような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域と組み合わせて、ADH2、GAL4、GAL10、またはPH05遺伝子のいずれかの調節配列から構成されるプロモーターが挙げられる(EP公開第164,556号) 。さらに、酵母プロモーターは、酵母RNAポリメラーゼを結合し、転写を開始する能力を有する非酵母起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。酵母発現ベクターに含まれ得る他の制御エレメントは、ターミネーター(例えば、GAPDH由来のおよびエノラーゼ遺伝子由来の(Holland,J.Biol.Chem.(1981)25 6:1385))、ならびに分泌についてのシグナル配列をコードするリーダー配列である。適切なシグナル配列をコードするDNAは、例えば、酵母インベルターゼ遺伝子(EP公開第012,873号；JPO公開第62,096,086号)およびα因子遺伝子(米国特許第4,588,684号、同第4,546,083号、および同第4,870,008号；EP公開第324,274号；PCT公開WO89/02463)のような分泌型酵母タンパク質についての遺伝子に由来し得る。あるいは、非酵母起源のリーダー(例えば、インターフェロンリーダー)はまた、酵母における分泌を提供する(EP公開第060,057号)。染色体外レプリコンまたは組み込み型ベクターのいずれかの発現および形質転換ベクターが、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。例えば、とくに発現ベクターは、以下の酵母に関して開発されてきた：Saccharomyces cerevi siae(Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75:1929；Itoら、J.Bacteriol.( 1983)153:163)；Saccharomy cescarlsbergeneis；Candida albicans(Kurtzら、M ol.Cell.Biol.(1986)6:142)；Candida maltosa(Kunzeら、J.Basic Microbiol.(1 985)25:141;Hansenula polymorpha(Gleesonら、J.Gen.Microbiol.(1986)132:345 9；Roggenkampら、Mol.Gen.Genet.(1986)202:302)；Kluyveromyces fragilis(Da sら、J.Bacteriol.(1984)158:1165)；Kluyveromyces lactis(De Louvencourtら、J.Bacteriol.(1983)154:737；Van den Bergら、Bio/Technology(1990)8:135) ；Pichia guillerimondii(Kunzeら、J.Basic Microbiol.(1985)25:141)；Pichia pastoris(Creggら、Mol.Cell.Biol.(1985)5:3376；米国特許第4,837,148号および同第4,929,555号)；Shizosaccharomyces pombe(BeachおよびNurse、Nature(19 81)300:706)；ならびにYarrowia lipolytica(Davidowら、Curr.Genet.(1985) 10:380471；Gaillardinら、Curr.Genet.(1985)10:49))。外来DNAをこのような酵母宿主に導入する方法は、当該分野で周知であり、そして代表的には、スフェロプラストの形質転換またはアルカリカチオンを使用して処理したインタクトな酵母細胞の形質転換のいずれかが挙げられる。細菌発現系はまた、本発明の構築物とともに使用され得る。細菌における使用のための制御エレメントとしては、プロモーター(必要に応じて、オペレーター配列を含む)、およびリボソーム結合部位が挙げられる。有用なプロモーターとしては、糖代謝酵素由来の配列が挙げられる(例えば、ガラクトース、ラクトース(lac)、およびマルトース)。さらなる例としては、トリプトファン(trp)、β- ラクタマーゼ(bla)プロモーター系、バクテリオファージλPL.およびT5のような生合成酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。さらに、例えば、tacプロモーター(米国特許第4,551,433号)のような、天然には存在しない合成プロモーターはまた、細菌宿主細胞におけるように機能する。前述の系は、E.coliと特に適合性である。しかし、とりわけ、Bacillus spp., Streptococcus spp.,およびStreptomyces spp.のような細菌宿主において使用するための非常に多くの他の系もまた、公知である。外来DNAをこれらの宿主細胞に導入するための方法としては、代表的にCaCl₂または他の薬剤(例えば、二価カチオンおよびDMSO)の使用が挙げられる。DNAはまた、エレクトロポレーションによって細菌細胞へ導入され得る。所望のポリペプチドを発現するための他の系は、昆虫細胞およびこれらの細胞における使用に適切なベクターを含む。最も一般的に使用されるこの系は、バキュロウイルスAutographa Californica多核体病ウイルス(AcNPV)に由来する。一般的に、発現系の構成要素としては、バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および発現される異種遺伝子の挿入のための都合のよい制限部位の両方を含む移入ベクター(通常は細菌プラスミド)；移入ベクターにおけるバキュロウイルス特異的フラグメントに相同である配列を有する野生型バキュロウイルス(これは、バキュロウイルスゲノムへの異種遺伝子の相同組換えを可能にする)；ならびに適切な昆虫宿主細胞および増殖培地が挙げられる。ベクターにおける使用のためのプロモーターは、代表的には、構造遺伝子に由来し、ウイルス感染サイクルの後期において大量に転写される。例としては、ウイルス多角体タンパク質をコードする遺伝子に由来する配列が挙げられる(The M olecular Biology of Baculoviruses(Walter Doerfler編)のFriesenら、（1986 ）「The Regulation of Baculovirus Gene Expression」；EP公開第127,839号および同第155,476号；ならびにp10タンパク質をコードする遺伝子(Vlakら、J.Gen .Virol.(1988)69:765))。通常、このプラスミドはまた、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル(Millerら、Ann.Rev.Microbiol.(1988)42:177)ならびに原核生物のアンピシリン耐性(amp)遺伝子およびE.coliにおける選択および増殖のための複製起点を含む。適切なシグナル配列をコードするDNAもまた含まれ得、一般的に、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子(Carbonellら、Gene(1988)73:409)のような分泌型の昆虫またはバキュロウイルスタンパク質の遺伝子、ならびにヒト αインターフェロン、Maedaら,Nature(1985)315:592；ヒトガストリン放出ペプチド、Lebacq-Verheydenら、Molec.Cell.Biol.(1988)8:3129；ヒトIL-2、Smith ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:8404；マウスIL-3、(Miyajimaら、Gene(1 987)58:273)；およびヒトグルコセレブロシダーゼ、Martinら、DNA(1988)7:99をコードする遺伝子由来のもののような哺乳動物シグナル配列に由来する。現在、AcNPVに外来遺伝子を導入するために最も一般的に使用される移入ベクターは、pAc373である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた、設計されてきた。これらとしては、例えば、pVL985(これは、ポリヘドリン開始コドンをATG からATTに変更し、ATTから32bp下流にBamHIクローニング部位を導入する；Lucko wおよびSummers，Virology(1989)17:31を参照のこと)が挙げられる。所望のDNA配列は、公知の技術を使用して移入ベクターに挿入され(SummersおよびSmith、前出；Smithら、Mol.Cell.Biol.(1983)3:2156；ならびにLuckowおよびSummers(1989)を参照のこと)、そして昆虫細胞宿主は、移入ベクターの異種DN Aおよび野生型バキュロウイルスのゲノムDNAで同時形質転換される(通常は、同時トランスフェクションによる)。ベクターおよびウイルスゲノムは、組換えを可能にされる。パッケージされた組換えウイルスが発現され、組換えプラークは同定され、そして精製される。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系のための材料および方法は、例えば、Invitrogen,San Diego CAからキット形態で市販されている(「MaxBac」キット)。これらの技術は、一般的に、当業者に公知であり、Su mmersおよびSmith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555( 1987)において十分に記載される。組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞に感染させるために開発されてきた。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に：Aedes aegypt i，Autographa californica，Bombyx mori，Drosophila melanogaster，Spodopt era frugiperdaおよびTrichoplusia niについて開発されてきた。上記の系を使用して調製されたポリペプチドは融合ポリペプチドであることが、しばしば所望される。非融合タンパク質を用いる場合、これらのタンパク質は、細胞内で発現され得るか、または細胞から増殖培地へ分泌され得る。さらに、例えば、VP22ポリペプチドならびにVP16、HSVgB、HSV gDなどのポリペプチドのような他の目的のHSVポリペプチドをコードする、キメラ遺伝子配列を含むプラスミドが構築され得る。さらに、抗原提示を増強し得る免疫調節因子をコードする遺伝子、抗原にリンパ球を誘引し得る免疫調節因子をコードする遺伝子、または抗原に応答するリンパ球の集団の増殖を促進する免疫調節因子をコードする遺伝子もまた存在し得る。このような因子としては、サイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン(IL-2、改変型住-2(cys125→ser125)、GM-CSF、I L-12、γ-インターフェロン、IL-10、MIP1α、MIP1β、およびRANTESを含むが、これらに限定されない)が挙げられる。存在するならば、さらなる遺伝子配列は、ジシストロン性(dicistronic)遺伝子構造においてVP22ポリペプチドをコードする遺伝子の前または後ろのいずれかにあり得る。さらなる制御エレメントは、遠位のコード領域からRNAの効率的な翻訳のための種々の遺伝子の間に位置し得る。あるいは、VP22およびさらなるHS Vポリペプチドまたは他の免疫調節因子をコードする単一オープンリーディングフレームを有するキメラ転写ユニットもまた構築され得る。いずれかの融合物は、キメラタンパク質の合成を可能にさせ得るかまたは、あるいは、タンパク質プロセシングシグナルが操作されて、シグナルペプチダーゼのようなプロテアーゼによる切断を提供するため、鋳型RNAの翻訳から得られた２つ以上のタンパク質の遊離が可能になり得る。プロセシングプロテアーゼはまた、独立してまたは抗原および／またはサイトカインコード領域を有するキメラの一部としてかのいずれかでこの系において発現され得る。プロテアーゼ自体は、プロセシング酵素およびワクチン抗原の両方であり得る。一旦発現されると、このポリペプチドは、当該分野で公知の任意のいくつかの技術を使用して上記の宿主細胞から精製され得る。発現系が増殖培地中にタンパク質を分泌する場合、このタンパク質は、培地から直接精製され得る。タンパク質が分泌されない場合、細胞溶解物から単離される。次いで、このタンパク質は、当該分野で公知の技術(例えば、カラムクロマトグラフィー、HPLC、免疫吸着技術、アフィニティークロマトグラフィー、および免疫沈降)を使用してさらに精製され得る。精製されたタンパク質の活性は、種々のネイティブなタンパク質の特異的特性に基いて、標準的なアッセイを使用して決定され得る。 HSVポリペプチドはまた、当業者に公知の方法を使用して、固相または溶液ペプチド合成によるような化学合成によって生成され得る。ペプチドの化学合成は、問題のポリペプチドが比較的小さな場合、好適であり得る。例えば、固相ペプチド合成技術については、J.M.StewartおよびJ.D.Young、Solid Phase Peptide Synthesis,第２巻、Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984)ならびにG.Barany およびR.B.Merrifield、The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology、E.GrossおよびJ.Meienhofer編、第２版、Academic Press,New York,(1980)3-254頁；そして古典的な溶液合成については、M.Bodansky、Principles of Peptide Synthesi s、Springer-Verlag,Berlin(1984)ならびにE.GrossおよびJ.Meienhofer編、The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology、前出、第１巻を参照のこと。一旦得られると、HSVポリペプチドは、ワクチン組成物中に処方されて、哺乳動物被検体におけるHSV感染を処置または予防する。従って、この組成物は、予防用（感染を予防するため）または治療用（感染後の疾患を処置するためのいずれかであり得る。ワクチン組成物は、VP22ポリペプチドの「有効量」、および任意のさらなるHSVポリペプチドを含み、その結果、細胞性免疫応答、および他のH SVポリペプチドが存在するならば体液性免疫応答が、投与される個体において生成され得る。正確な必要量は、とりわけ、処置される被検体；処置される被検体の年齢および全体的な健康状態；被検体の免疫系の抗体を合成する能力；所望の保護の程度；処置される状態の重篤度；問題の特定のHSVポリペプチドおよびその投与の態様に依存して変化する。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。従って、「有効量」は、日常的な試行を通じて決定され得る比較的幅広い範囲にある。例えば、本発明の目的のための有効用量は、用量あたり約５μ g〜約250μgの抗原である。ワクチン組成物は、一般的には、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどのような１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」を含む。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝化物質など）が、このようなビヒクル中に存在し得る。キャリアは、必要に応じて存在し、これは、組成物を受容する個体に有害な抗体の産生をそれ自身誘導しない分子である。適切なキャリアは、代表的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム（以下にさらに記載される）、および不活化ウイルス粒子のような、大きく、ゆっくりと代謝される高分子である。このようなキャリアは、当業者に周知である。粒子状のキャリアは、本発明での用途を見出し、そしてポリメチルメタクリレートポリマーから誘導されるもの、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチドコグリコシド）（PLGとして公知）から誘導される微小粒子を含む。例えば、Jefferyら、Phrmn. Res.(1993)10:362-368；およびMcGeeら、J.Microencap.(1996)を参照のこと。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、抗原は、細菌性トキソイド（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラ、 E．coliなどに由来するトキソイド）に結合し得る。アジュバントもまた、ワクチン組成物の有効性を増強するために使用され得る。アジュバントは、ワクチン組成物に直接添加され得るか、またはワクチン組成物の投与と同時、またはわずかに前もしくは後に投与され得る。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン)(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど)；（２）水中油エマルジョン処方物（ムラミルペプチド(以下を参照のこと)または細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激剤を含むか含まない）（例えば、（a）MF59（国際公開第WO 90/14837号）（５％スクアラン、0.5％ Tween 80、および0.5％ Span 85を含み（必要ではないが、必要に応じて、種々の量のMTP-PE（以下を参照のこと）を含む）、110Y型ミクロフリーダイザー（Microfluidics，Newton，MA）のようなミクロフリーダイザーを使用してサブミクロン粒子に処方された）(b)SAF（10％スクアラン、0.4％ Tween 80、５％プルロニックブロック化（pluronic-blocked）ポリマーL121、およびthr-MDP （以下を参照のこと）を、サブミクロンエマルジョンにミクロフリーダイズされて、または大きな粒子サイズのエマルジョンを精製するためにボルテックスされてのいずれかで含む）、ならびに（c）Ribi^TMアジュバントシステム（RAS）（Ri bi Immunochem，Hamilton，MT）（２％スクアラン、0.2％ Tween 80、およびモノホスホリピドA（MPL）、トレハロースジミコレート（dimycolate）(TDM)、および細胞壁骨格（CWS）、好ましくはMPL＋CWS（Detox^TM）からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分を含む）；（３）サポニンアジュバント（例えば、Stimul on TM（Cambridge Bioscience，Worcester，MA）またはそれから精製した粒子、例えば、ISCOM（免疫刺激複合体）およびISCOMATRIXが使用され得る）；（４）完全フロイントアジュバント（CFA）および不完全フロイントアジュバント（IFA ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（IL-1、IL-2など））、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、腫瘍壊死因子(TNF)など；（６）細菌性ADPリボシル化毒素の解毒化変異体（例えば、コレラ毒素（CT）、百日咳毒素（PT）、またはE.coli熱不安定毒素（LT）、特にLT-K63（リジンが63位で野生型アミノ酸と置換されている）、LT−R72（アルギニンが72位で野生型アミノ酸と置換されている）、CT-S109（セリンが109位で野生型アミノ酸と置換されている）、およびPT-K9/G129（リジンが９位で野生型アミノ酸と置換されており、そしてグリシンが129位で置換されている）（例えば、国際公開第WO 93/13202号および同第WO 92/19265号を参照のこと））；ならびに（７）組成物の有効性を増強するための免疫刺激剤として作用するほかの物質。ミョウバンおよびMF59が好ましい。ムラミルペプチドとしては、以下を含むがこれらに限定されない：N-アセチル -ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン（thr-MDP）、N-アセチル−ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン（isogluatme）（nor-MDP）、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトイル −sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン（MTP-PE）など。一旦処方されると、本発明の組成物は、例えば、注射によって非経口的に投与され得る。組成物は、皮下、心膜内、静脈内、または筋肉内のいずれかで注射され得る。投与の他の態様としては、経口および肺投与、座薬、および経皮適用が挙げられる。投薬処置は、単一用量スケジュールまは複用量スケジュールであり得る。複用量スケジュールは、ワクチン接種の初回コースが１〜10の別々の用量であり、続いて、例えば、二回目の投薬について１〜4ヶ月免疫応答を維持および／または強化するために選択される続く時間間隔で他の用量、および必要ならば、数ヵ月後に続く用量が与えられるものである。投薬レジメンはまた、少なくとも部分的には、被検体の必要性によって決定され、そして開業医の判断に依存する。さらに、疾患の予防が所望される場合、ワクチンは、一般的には、HSVでの一次感染の前に投与される。処置が所望される場合（例えば、症状の軽減または再発）、ワクチンは、一般的には、HSVでの一次感染に続いて投与される。投与の別の経路は、核酸免疫化を含む。従って、目的のタンパク質（および、適切ならば、付随する調節エレメント）をコードするヌクレオチド配列は、標準的な遺伝子送達プロトコルを用いる核酸免疫化のために使用され得る。遺伝子送達のための方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第5,399,346号を参照のこと）。遺伝子は、哺乳動物被検体に直接送達されるか、あるいは、被検体に由来する細胞および被検体に再移植される細胞にエキソビボで送達され得る。多くのウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子導入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための都合の良いプラットホームを提供する。選択された遺伝子は、当該分野で公知の技術を使用して、ベクター中に挿入され、そしてレトロウイルス粒子中にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスは、単離され、そしてインビボまたはエキソビボのいずれかで、被験体の細胞に送達され得る。多くのレトロウイルス系が、記載されている（米国特許第5,219,740号；MillerおよびRosman，BioTechniques（1989）7: 980-990；Miller，A.D.，Human Gene Therapy（1990）1:5-14;Scarpaら、Virol ogy（1991）180:849-852;Burnsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1993）90:803 3-8037;およびBoris-LawrieおよびTemin，Cur．Opin．Genet．Develop．(1993)3 :102-109）。多くのアデノウイルスベクターもまた、記載されている。宿主ゲノム中に組み込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外に維持され、従って、挿入的な変異誘発に関連する危険を最小化している（Haj-Ah madおよびGraham、J．Viol．(1986)57:267-274;Bettら、J．Virol．(1993)67:59 11-5921；Mitterederら、Human Gene Therapy（1994）5:717-729;Sethら、J．Vl rol．(1994)68:933-940;Barrら、Gene Therapy（1994）1:51-58;Berkner，K.L． BioTechniques（1988）6:616-629;およびRichら、Human Gene Therapy（1993）4 :461-476）。さらに、種々のアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター系が、遺伝子送達のために開発されている。AAVベクターは、当該分野で周知の技術を使用して容易に構築され得る。例えば、米国特許第5,173,414号、および同第5,139,941号；国際公開第WO92/01070号（1992年１月23日に公開された）、および同第WO93/03769号（19 93年3月4日に公開された）；Lebkowskiら、Molec．Cell．Biol．(1988)8:3988-3 966;Vincentら、Vaccines 90(1990)(Cold Spring Harbor Laboratory Press);Ca rter，B.J．Current Opinion in Biotechnology（1992）3:533-539;Muzyczka，N ．Current Topics in Microbiol．and Immunol．(1992)158:97-129;Kotin，R.M ．Human Gene Therapy（1994）5:793-801;ShellingおよびSmith，Gene Therapy （1994）1:165-169;およびZhouら、J．Exp．Med．(1994)179:1867-1875を参照のこと。目的の抗原をコードする核酸分子を送達するための使用を見い出すさらなるウイルスベクターには、ウイルスのポックスファミリー（ワクシニアウイルスおよび鳥類ウイルスを含む）に由来するものが含まれる。例示のために、遺伝子を発現するワクシニアウイルス組換え体は、以下のように構築され得る。特定のポリペプチドをコードするDNAは、ワクシニアプロモーターに隣接し、そしてチミジンキナーゼ(TK)をコードする配列のようなワクシニアDNA配列に隣接するように、まず適切なベクター中に挿入される。次いで、このベクターは、ワクシニアに同時に感染した細胞をトランスフェクトするために使用される。相同組換えは、ワクシニアプロモーターおよびタンパク質をコードする遺伝子を、ウイルスゲノム中に挿入するのに役立つ。得られるTK^-組換え体は、5-ブロモデオキシウリジンの存在下で、細胞を培養し、そしてそれに耐性であるウイルスプラークを拾うことによって選択され得る。ワクシニアベースの感染/トランスフェクション系は、宿主細胞において目的の遺伝子の誘導性の、一過性の発現を提供するために都合良く使用され得る。この系において、細胞はまず、インビトロで、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体に感染される。このポリメラーゼは、T7プロモーターを有するテンプレートのみを転写する点において精巧な特異性を示す。感染の後、細胞を、T7プロモーターによって駆動される目的のポリヌクレオチドで感染させる。ワクシニアウイルス組換え体に由来する細胞質において発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトされたDNAを、RNA中に転写し、これは次いで、宿主翻訳機構によってタンパク質に翻訳される。この方法は、大量のRNAおよびその翻訳産物の、高レベルの、一過性の、細胞質産生を提供する。例えば、Elroy-SteinおよびMoss，Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1990）87:67 43-6747;Fuerstら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1986）83:8122-8126を参照のこと。あるいは、アビポックスウイルス（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリアポックスウイルス）がまた、遺伝子を送達するために使用され得る。哺乳動物病原体からの免疫原を発現する組換えアビポックスウイルスは、非鳥類種に投与された場合に、防護的免疫を付与することが知られている。アビポックスベクターの使用は、アビポックス属のメンバーが、感受性の鳥類種においてのみ生産的に複製し得、それゆえ哺乳動物細胞において感染性ではないので、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に所望される。組換えアビポックスウイルスを産生するための方法は、当該分野で公知であり、そしてワクシニアウイルスの産生に関して上記のように遺伝子組換えを利用する。例えば、WO91/12882；WO89/03429；およびWO 92/03545を参照のこと。 Michealら、J．Biol．Chem．(1993)268:6866-6869およびWagnerら、Proc．Nat l．Acad．Sci．USA（1992）89:6099-6103に記載されるアデノウイルスキメラベクターのような分子結合体ベクターもまた、遺伝子送達のために使用され得る。シンドビスおよびセムリキ森林ウイルスに由来するベクターのような（しかしこれらに限定されない）アルファウイルス属のメンバーもまた、VP22遺伝子を送達するためのウイルスベクターとしての使用を見い出す。本発明の方法の実施に有用なシンドビスウイルスに由来するベクターの記載については、Dubenskyら、 J．Vlrol．(1996)70:508-519;および国際公開第WO95/07995号および同第WO96/17 072号を参照のこと。ワクシニアまたはアビポックスウイルス組換え体での感染、または他のウイルスベクターを使用しての遺伝子の送達に替わるアプローチとして、宿主細胞への導入後に高レベルの発現を導く増幅系が、使用され得る。詳細には、T7 RNAポリメラーゼのコード領域に先行するT7 RNAポリメラーゼプロモーターが操作され得る。このテンプレートに由来するRNAの翻訳は、T7 RNAポリメラーゼを生成し、これは次いでより多くのテンプレートを転写する。同時に、その発現がT7プロモーターの制御下にあるcDNAが存在する。従って、増幅されたテンプレートRNAの翻訳から生成されるT7 RNAポリメラーゼのいくつかは、所望の遺伝子の転写を導く。T7 RNAポリメラーゼのいくつかは、増幅を開始するために必要とされるので、T7 RNAポリメラーゼは、転写反応を開始するためのテンプレートと共に細胞中に導入され得る。ポリメラーゼは、タンパク質として、またはRNAポリメラーゼをコードするプラスミド上において導入され得る。T7系、および細胞を形質転換するためのその使用のさらなる議論についは、例えば、国際公開第WO94/26911号；StudierおよびMoffatt、J．Mol．Biol．(1986)189:113-130;DengおよびWolff ，Gene（1994）143:245-249;Gaoら、Biochem．Biophys．Res．Commun．(1994)20 0:1201-1206;GaoおよびHuang，Nuc．Acids Res．(1993)21:2867-2872;Chenら、N uc．Acids Res．(1994)22:2114-2120;および米国特許第5,135,855号を参照のこと。目的の遺伝子をコードするベクターはまた、被験体またはそれに由来する細胞に送達する前にリポソーム中にパッケージングされ得る。脂質カプセル化は、一般に、核酸に安定に結合し、またはそれを捕捉し、そして保持し得るリポソームを使用して達成される。脂質調製物に対する凝縮したDNAの比は、様々であり得るが、一般に、約１：１（mg DNA:μモル脂質）であるか、または脂質はより多い。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用の概説については、 HugおよびSleight、Biochim．Biophys．Acta．(1991)1097:1-17;Straubingerら、Methods of Enzymology(1983)，第101巻、512−527頁を参照のこと。本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）、および中性の調製物を含み、カチオン性のリポソームが特に好ましい。カチオン性のリポソームは、プラスミドDNA(Felgner ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1987）84:7413-7416);mRNA(Maloneら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA（1989）86:6077-6081);および精製された転写因子(Deb sら、J．Biol．Chem．(1990)265:10189-10192)の細胞内送達を、機能的な形態で、媒介することが示されている。カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、N[1-2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウム(DOTMA)リポソームは、Lipo fectinの商標のもとに、GIBCO BRL，Grand Island，NY.から入手可能である(Fel gnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1987）84:7413-7416もまた参照のこと) 。他の市販のリポソームには、トランスフェクテース(DDAB/DOPE)およびDOTAP/D OPE（Boerhinger）が含まれる。他のカチオン性リポソームは、容易に入手可能な材料から、当該分野で周知の技術を使用して調製され得る。DOTAP(1,2-ビス( オレオイルオキシ)-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン)リポソームの合成の記載については、例えば、Szokaら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1978）75:4194 -4198;PCT公開第WO90/11092号を参照のこと。同様に、アニオン性および中性のリポソームは、例えば、Avanti Polar Lipid s（Birmingham，AL）から、容易に入手可能であり、または容易に入手可能な材料を使用して容易に調製され得る。このような材料には、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)が含まれる。これらの材料はまた、DOTMAおよびDOTAP開始材料と、適切な比で混合され得る。これらの材料を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。リポソームは、多層小胞(MLV)、小単層小胞(SUV)、または大単層小胞（LUV）を含み得る。種々のリポソーム-核酸複合体は、当該分野で公知の方法を使用して調製される。例えば、Straubingerら、METHODS OF IMMUNOLOGY(1983)，第101 巻，512-527頁；Szokaら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1978）75:4194-4198;P apahadjopoulosら、Biochim．Biophys．Acta（1975）394:483;Wilsonら、Cell（ 1979）17:77);DeamerおよびBangham，Biochim．Biophys．Acta（1976）443:629; Ostroら、Biochem．Biophys．Res．Commun．(1977)76:836;Fraleyら、Proc．Nat l．Acad．Sci．USA（1979）76:3348);EnochおよびStrittmatter，Proc．Natl．A cad．Sci．USA（1979）76:145);Fraleyら、J．Biol．Chem．(1980)255:10431;Sz okaおよびPapahadjopoulos,Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1978）75:145;および Schaefer-Ridderら、Science（1982）215:166を参照のこと。 DNAはまた、Papahadjopoulosら、Biochem．Biophys．Acta．(1975)394:483-49 1によって記載されるものに類似した渦巻き型の脂質組成物中において送達され得る。米国特許第4,663,161号および同第4,871,488号もまた参照のこと。 VP22遺伝子はまた、粒子状のキャリアにカプセル化されるか、吸収または結合され得る。このようなキャリアは、選択された抗原の複数のコピーを、免疫系に対して提示し、そして局所的なリンパ節において抗原の捕捉または保持を促進する。粒子は、マクロファージによって貧食され得、そしてサイトカイン放出を介して抗原提示を増強し得る。粒子状のキャリアの例には、ポリメチルメタクリレートポリマーから誘導されるもの、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチドコグリコリド）（PLGとして知られる）から誘導される微小粒子が含まれる。例えば、Jefferyら、Pharm．Res．(1993)10:362-368;およびMcGeeら、J．Micr oencap．(1996)を参照のこと。さらに、他の粒子系およびポリマーが、VP22遺伝子のインビボまたはエキソビボ送達のために使用され得る。例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジンのようなポリマー、ならびにこれらの分子の結合体が、VP22遺伝子を移入するのに有用である。同様に、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、または他の不溶性の無機塩（例えば、リン酸ストロンチウム、珪酸アルミニウム（ベントナイトおよびカオリンを含む）、酸化クロム、珪酸マグネシウム、タルクなどを使用する沈殿が、本発明の方法との使用を見出す。遺伝子移入に有用な送達系の概説については、例えば、Felgner，P.L.，Advanced Drug Delivery Reviews（1990）5:163-187を参照のこと。さらに、金およびタングステンのような粒子状キャリアを使用する微粒子銃送達系は、目的の遺伝子を送達するために特に有用である。粒子は、送達されるべき遺伝子とともにコートされ、そして一般に減圧下で、「遺伝子銃」からの銃粉末の発射を使用して高速にまで加速される。このような技術、およびそのために有用な装置の記載については、例えば、米国特許第4,945,050号；同第5,036,006 号；同第5,100,792号；同第5,179,022号；同第5,371,015号；および同第5,478,7 44号を参照のこと。組換えベクター（リポソーム中にカプセル化されているかいないかに関わらず）は、上記のように哺乳動物被験体への送達のための組成物中に処方される。組成物は、上記のように、それが投与される個体において免疫応答を生成するような抗原の量が生成され得るような、目的の遺伝子の「有効量」を含む。また、先に説明したように、必要な正確な量は、いくつかの因子に依存して変化し、そして当業者によって容易に決定され得る。本発明の目的のために、有効な用量は、 DNA構築物の約１μg〜約100mgまでであり、より好ましくは約10μg〜約1mgである。投薬レジメンは、上記のとおりである。 III．実験以下は、本発明を実施するための特定の態様の例である。これらの例は、例示的な目的のみで提供され、そしていかなる様式においても、本発明の範囲を限定することを意図されない。使用される数（例えば、量、温度など）に関する精度を確実にするための努力がなされているが、いくつかの実験誤差および偏差は、当然に許容されるべきである。実施例１材料および方法ウイルス： hr259を除く全てのHSVウイルスのストックを、Vero細胞で増殖させた。ウイルスストックを、低感染多重度で感染させることによりコンフルエント未満の単層上で調製し、そして超音波破砕により、ウイルスを濃縮された細胞から放出させた。同じ様式で、ICP4^-変異体hr259を、E5細胞（Vero系統）上で増殖させ、HSV- 1 ICPで安定にトランスフェクトさせ、そしてそれを発現させた(DeLucaら、J．V irol.(1985)56:558-570;SmithおよびSchaffer、J．Virol.(1987)61:1092-1097) 。HSV-1xHSV-2組換えウイルスを、Bernard Roizmanから入手した。これらを記載されるように、HSV-1（F株）DNA、およびHSV-2（G株）由来の制限フラグメントをウサギ皮膚細胞へ同時トランスフェクトし、そして増強型表面イムノアッセイにより組換え体を単離することにより構築した（Purvesら、J.Virol.(1994)65:5 757-5764;Ackermannら、Virology（1994）150：207-220）。組換えワクシニアウイルスを、HSV-2オープンリーディングフレーム（ORF）UL 48（VP16をコードする）、UL49（VP22をコードする）、UL46またはUL47を、ワクシニアシャトルベクターpSC11.1に挿入することにより構築した(Chakrabartiら、「Vaccinia virus expression vector:coexpression of beta-galactosldase provides visual screening of recombinant virus plaques」Mol．Cell Biol． 5(12):3403-3409(1985))。これは、初期/後期p7.5プロモーターにより駆動される隣接するポリリンカー部位を有するワクシニア後期p11プロモーターにより駆動されるE.coli lacZ遺伝子により分割されるワクシニアtk遺伝子を含む、pUC8 プラスミドである。HSV ORF-含有フラグメントをポリリンカーに挿入し、そして挿入物の適切な配向を、挿入物の存在および配向の両方を確認する診断的制限消化物により確認した。vac/VP16組換え物の構築は、EP公開第541,692号に記載されている。全長VP16のワクシニア組換え物（本明細書中で、「vac/VP16_FL」と呼ぶ）、および1〜416位のアミノ酸をコードする遺伝子を含む短縮型VP16組換え物（本明細書中で、「vac/VP16t」と呼ぶ）の両方を作製した。 UL49のクローニングおよび発現 HSV-2 UL49遺伝子を、UL49 ORFの5’および3’末端に相補的でそれぞれBglII 制限部位を含むプライマーを使用するPCRにより、Phil Pelletにより提供された HSV-2のEco RIフラグメントLを含むプラスミドpH2G-512からサブクローニングした。gluエピトープタグもまた、3’プライマーによりコードされた。このタグは、gluエピトープを特異的に認識する対応するモノクローナル抗体の使用により、そのタグを保有する任意のタンパク質の同定、定量および精製を容易にする。このPCR反応に使用したこのプライマー対は、以下の配列を含む27個のヌクレオチドのオリゴマー(GPUL49 5'）および54個のヌクレオチドオリゴマー(GPUL49 3' )から成った： UL49 ORFを5％ホルムアミド、0.2μg/mlのpH2G-512プラスミド、プライマーおよびvent Taqを含む標準的な緩衝液中で、以下の条件を使用して増幅した：97℃ で5分間；15サイクル×96℃で54秒；67℃で54秒；72℃で54秒；および72℃で10 分。予想した900bpのバンドを分取用アガロースゲルで分離し、抽出し、エタノール沈殿し、そしてBglIIで切断した。２回目のゲル精製後、フラグメントを、予めBglIIで切断し、そしてアルカリホスファターゼで処理したバキュロウイルスシャトルベクタープラスミドpAC13に、連結した（図2を参照のこと）。連結した DNAをE.coliの形質転換に使用した。20個のコロニーをランダムに選択し、そしてこれらのプラスミドDNAを単離し、そして5’-および3’-UL49プライマーを使用したPCRにより試験した。4個のクローンは、予想されたPCR産物を産生するプラスミドを含んでいた。UL49遺伝子の存在および完全性を、BglII、KpnI+StuIまたはPstIの制限消化により確認した。予測されたパターンを有するクローンの1 つに由来するプラスミドDNAを配列決定し、挿入物を確認した。このプラスミドをpAcUL49と名づけた。図１Ａ〜１Ｂ（配列番号＿）は、pAcUL49由来のUL49 ORF の配列およびHSV-22 vp22の予測されるアミノ酸配列を示す。1つの保存的塩基変化 (Ｃ-＞Ｔ leu-＞leu)を、70位で観察した。プラスミドpAcUL49をバキュロウイルスで感染した昆虫細胞をトランスフェクトするために使用した。5個のプラーク精製単離物を、ウエスタンブロットを抗- gluモノクローナル抗体を使用して、UL49発現についてスクリーニングした。5個のうち4個が、glu抗体と反応した40kDのタンパク質を発現した。タグ化UL49タンパク質の予測分子量は、32.7kDであるが、SDS-PAGEにおけるその移動度は、その高度に荷電した性質に起因して異常であり得る（10.75モル％-および17.6モル％ +、PI＝10.4）。ワクシニアシャトルベクターを、pAcUL49由来の927bpのBglIIフラグメントをゲル精製し、そしてそのフラグメントをBglII-切断、アルカリホスファターゼ処理したプラスミドpSC11.1.に連結することにより構築した。得られたベクターを E.colI HB101をトランスフェクトするために使用した。クローンを、AatIIの制限消化物によりUL49挿入物を含むプラスミドについてスクリーニングした。適切なパターンを有する1個のクローンを、pHS232（図3）と名づけ、トランスフェクションのために使用した。 HSV-2遺伝子であるUL46およびUL47をクローン化するために、HSV-2 ECoLのEco RIフラグメントLが含まれるプラスミドpHS2G-512を配列決定した。UL46およびUL 47のORFの位置を、対応するHSV-1ホモログ遺伝子に対するそれらの類似性により同定した(McKnightら、J.Virol.(1987)61:992-1001)。ORFを、BglII部位および3 ’プライマー上の「glu」タグもまた含む遺伝子の5’および3’領域と対になったプライマーを使用するPCRにより単離した。次いで、これらの遺伝子をプラスミドpAc13中にクローニングした。 pAc13にUL46およびUL47を含む組換えプラスミドを、形質転換したE.collより検出した。次いで、この遺伝子を、UL49について上述した工程と同じ一連の工程によりバキュロウイルスに組み込んだ。UL46およびUL47遺伝子もそれぞれのpAc1 3プラスミド誘導体からBglII消化により切り出してワクシニアウイルスシャトルベクターpSC11.1に連結した。 UL46、47または49遺伝子を発現するワクシニア組換えウイルスを、本質的にMa ckettら（1987）The construction and characterization of vaccinia virus r ecombinants expressing for eign genes．DNA Cloning(IRL Press)191-211頁に記載されるようにBSC-40細胞の感染-トランスフェクションにより作製した。コンフルエント未満の単層に、DNAの添加に先立って野生型ワクシニアウイルス（W R株）を感染多重度（m.o.i.）＝0.05を1時間感染させた。トランスフェクションを、ポリスチレンチューブ内で20μlの水中の30μlのLipofectin^TMと50μlの水中の10μgのプラスミドDNAを組み合わせて15分間室温で実施した。15分後、トランスフェクション混合物を、0.5mlのDulbeccoの最小イーグル培地（DME）に添加し、ついで洗浄したvacWR-感染単層に配置した。単層を、5mlのDME_F10（10％ウシ胎仔血清を含有するDME）を添加する前に、濃縮DNA：Lipofectin^TM混合物で30 分間処理した。2時間後、培地を除去し、単層を2回、DME_F10で洗浄し、そして培地を交換して培養物を3日間インキュベートした。次いで、培養物を収集し、そして今後の使用のために直ちに凍結するかまたはプラーク精製のために希釈前に３回超音波処理角製ソニケーター（設定７）（氷上で3×30秒間隔）するかのいずれかである。組換えウイルス（tk^-、β-gal⁺）の系列希釈を、12.5μg/mlのBuDR（ブロモデオキシウリジン）および1％低ゲル化温度（LGT）アガロースの存在下のTK-143b細胞上で選択した。プラークアッセイをセットアップした、2日後、組換えプラークを、1mlの1％LGTアガロース：DM E_F10オーバーレイでのX-gal（アッセイプレートのウェルあたり15μlの2％ストック）を使用して検出した。青色に染色したプラークをアガロースプラグおよびその下にあるプラーク、使い捨てのポリエチレン転移ピペットでの吸引により選択し、0.5mlのDME中に加える。選択したプラークを、BSC-40細胞での増幅および TK-143b細胞上での選択にさらに2回供する。 HSV-2遺伝子の発現を、抗-gluモノクローナル抗体および市販の抗HSV-2ポリクローナルウサギ抗体でプローブした感染細胞の抽出物のウェスタンブロットを使用して3個全ての組換え物（UL46、47および49）について確認した。一旦発現を確認したら、ウイルスのストックをBSC-40細胞上で増殖させ、そしてスクロースのクッション上で精製した。 HSV-特異的CD8⁺CTLクローンの調製再発性生殖器ヘルペスを有する3人のドナー由来のHSV-特異的CD8⁺CTLを、以前に記載(Tiggesら、J．Virol．(1992)66:1622-1634)のようにウイルス-感染性PBM Cの再刺激後にクローニングした。⁵¹Cr放出アッセイにおいて使用する前に、T細胞を凍結保存から回復し、そしてPHA（1μg/ml）、またはprotein-A-Sepharose ビーズに結合した10μgの抗-CD-3モノクローナル抗体（OKT3）および10μgの抗- CD-8モノクローナル抗体（leu2）のいずれかで再刺激した。再刺激した培養物は、2mlのRPMI-CM中に、2×10⁵個のT-細胞、2×10⁵個のB-LCL（7,500ラドでγ線放射された）、2×10⁶個の新鮮に調製された同種異系間のPBMC（3000ラドでγ線放射された）を含んでいた。（RPMI-CMは、2mM L-グルタミン、10mM HEPES、pH7.2 、1%MEM非必須アミノ酸、10mM MEM-ビタミン、1mMナトリウムピルビン酸、20μg /mlアスパラギン、2×10^-5M 2-メルカプトエタノール、50μg/mlゲンタマイシン、および10％熱不活化のプールされたヒト血清を補充したRPMI1640である）。PH A-刺激化ヒトPBMC由来のIL-2（32U/ml）をモノクローナル抗体で刺激した培養物に加えた。PHA-刺激化培養物については、培地を、48時間後にIL-2を含有する2m lのRPMI-CMと交換した。⁵¹ Cr放出アッセイ自系の標的B-LCLを適切なウイルス（HSVまたは組換えワクシニアウイルス）での感染により調製し、そして3〜18時間インキュベートした。次いで細胞を採取し、そして0.2mlの⁵¹Crを含有する培地中で濃縮した。90分のインキュベーション後、組み込まれなかった⁵¹Crを洗い流し、そして10⁴個の細胞を、CTLを含む96 ウェルのプレートの3組のウェルに加えた。CTLを前もって再刺激化培養物から採取し、洗浄し、そして10⁵個の細胞をＶ字型底部の96ウェルプレートに分配した。CTLの部分もまた2回の4倍工程で希釈して、10：1、2.5：1および0.625：1のエフェクター：標的比を達成した。標的B-LCLを加えた後、プレートを低速度で簡単に遠心分離し、次いで37℃で４時間インキュベートした。¹⁵Crの自発的放出を培地中に標的細胞のみを含むウェルから決定した。1％NP-40を、標的細胞を含むウェルに添加することにより全放出を決定した。インキュベーション時間後、10 0μl の上清を特異的放出の計数および計算するために除去した。限界希釈分析アッセイ（LDA）： CTLの定量的な決定を、Taswell、J．Immuol.(1981)126:1614-1619およびMacDo naldら、Immunol．Rev.(1980)51:93-123により記載されるようにシングルヒットポアッソンモデル(single hit Poison model)に基づく限界希釈アッセイを使用してなした。このアッセイをセットアップするために、選択した個体由来の3×1 0⁷個のPBMCを凍結保存から回復し、そして10⁶個の細胞を刺激細胞として使用するために保存した。これらのPBMCを、0.5mlのポリエチレンチューブ中の無血清R PMIに入れ、そしてHSV-2ウイルス株（HG52X163X12）を使用してm.o.i.＝2で感染させ、X12と命名した。これはICP47遺伝子を欠失し、この遺伝子はTAPペプチドトランスポーターのインヒビターをコードする（Yorkら、Nature(1995)375(6530 ):411-415;およびJohnsonら、Cell（1994）77：525-535）。HSV-2X12もまたvhs 遺伝子にフレームシフト変異を含む(EverettおよびFenwick、J.Gen.Virol.(1990 )71:1387-1390)。これら２つの変異の効果は、HSV感染細胞でのMHCクラスIの発現を延ばし、従って抗原提示細胞（APC）として作用する感染細胞の能力を改良する。1時間の吸収後、RPMI_F10を添加し、そして細胞を37℃で7％CO₂の雰囲気下で一晩培養した。次いで、残りの細胞をマウス抗-ヒトCD16モノクローナル抗体で処理し、ナチュラルキラー細胞を除去した。次に4℃で30分間回転させながらインキュベーションした後、CD16⁺細胞を磁気ビーズに結合された抗-マウスIgを使用して除去し、そして破棄した。次に、CD16枯渇細胞を、磁気ビーズに結合体化した抗CD8モノクローナル抗体で、4℃で30分間回転させながら処理した。次いで、結合したC D8⁺細胞をマグネットと用いて除去し、洗浄し、そして2％のプールされたヒトAB 血清および32U/mlのIL-2を含むAIM-V培地中の終夜培養物に加えた。未結合の細胞を3000Rのγ放射線で照射し、次いで2個のU字底の96ウェルのマイクロタイタープレートでウェルあたり100μlで分配した。翌日、感染した刺激細胞を7500Rのγ放射線で照射し、濃縮し、そして96ウェルのＵ字底のプレートに加えた。CD8⁺細胞を、Detach-A-Bead（Dynal）の1時間の処理により磁気ビーズから離し、そしてビーズを磁石で除去した。放出された CD8⁺Ｔ細胞の数を決定し、そして30,000〜50,000細胞/ウェルで開始した段階的な数の細胞を、7段階の希釈系列（それぞれ24個のレプリケート）でＵ字型底のプレートに加えた。希釈工程を、最初の数（例えば、50,000細胞/ウェル）と第７工程での500〜1,000細胞/ウェルとの間の数に均一に分配されるように調整した。さらなる24個のウェルはCD8⁺細胞を受けず、そしてこのアッセイについてのコントロールとして役立った。このプレートを、2％のプールされたヒトAB血清および32U/mlのIL-2を含有するAIM-V培地中で、37℃で7％CO₂中で、4日毎に培地を交換しながら13日間インキュベートした。標的細胞（目的の遺伝子を発現させるHSV-2または組換えワクシニアウイルスに感染した自系のB-LCLからなる）を、アッセイの前日に感染させ、上記のように⁵¹Crを負荷し、そしてＶ底アッセイプレート中に分配した。アッセイの当日にアッセイプレートを調製するために、2個の再刺激化プレートを4個のレプリケートに分配した。これを最初に50μlの培地を再刺激化プレートの各ウェルに添加し、次いで12チャンネルのマルチピペッターで適定することにより内容物を再懸濁し、そして50μlの再懸濁した細胞を4個のV底アッセイプレートに分配することにより達成した。さらなる50μlの培地を全てのプレートに添加したが、2番目のプレートの最後のカラムは吸引し、そして100μlの1％NP-40に交換した。⁵¹Cr を負荷した標的細胞（5000）を100μlの培地に加え、プレートをプレートホルダー中で1分間、900rpmで遠心分離し、そして37℃で4時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを簡単に再び遠心分離し、そして50μlを96ウェルのLumaPlates^TM(Packard Instruments)に移した。乾燥後、プレートをWallac MicroBetaカウンターで計数し、そしてデータを分析した。ほとんどのアッセイについて、陽性と陰性のウェルの間のカットオフを、自発的放出の平均より3SD 上ではなく、むしろ特異的放出の10〜15％上であるとして決定した。結果 HSV-2 VP22(UL49によってコードされる)を、再発性の生殖器ヘルペスを有するヒトから樹立された22個のCTLクローンのライブラリーからのVP22を認識したCTL クローンの数に基づいて、ヒトHSV-特異的CD8⁺CTL応答の主要な標的として同定した。これらのクローンをTiggesらにより記載されるように単離した。続いて、さらなるCTLをこの個体ならびに2つの他の個体、被験体3および4から単離した。合計で、22個のクローンを単離し、そしてそれらを部分的にまたは完全に特徴付けるために十分な時間増殖させた。 CTLにより認識される正確なHSVタンパク質の同定を介助するために、CTLクローンを、HSV-1またはHSV-2型特異性、標的細胞の感染後のエピトープ発現のタイミング、およびウイルスゲノム上の標的遺伝子の位置に関して特徴付けた。 CTLクローンのHSV型特異性を、HSV-1またはHSV-2感染細胞またはその両方を認識するそれらの能力により決定した。HSV遺伝子は、感染後の、即時初期遺伝子、初期遺伝子および後期遺伝子の時間的なカスケードで発現されるので、感染後のHSVタンパク質の提示のタイミングを決定することは標的タンパク質の同定を助ける。選択的薬物またはウイルス変異体の使用により、感染後の全てのウイルス性遺伝子の発現を阻止するか、または即時初期または即時初期+初期クラスの遺伝子の遺伝子発現を制限する可能性がある。このストラテジーの使用は、Tigg esら（1992）（前掲）に記載される。最終的には、HSV標的タンパク質をコードする遺伝子のおおまかな位置は、HSVタイプ1/タイプ2のタイプ間組換えウイルスを使用するHSV-タイプ特異的なCTLクローンについて決定され得る。細密なマッピングは、特異的HSV遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスに感染した標的細胞の使用により達成される。 22個のクローンのうち、13個がHSV-2に感染した標的細胞を認識し、そして残りがHSV-1またはHSV-2のいずれかに感染細胞を認識した。これらのクローンのうちの1つ（1−1H6）が、gD2（vac/gD2）を発現させるHSV または組換えワクシニアウイルスに感染した標的細胞を溶解したことから、これはgD2を認識した。2つ目は、vac/gB2（3-8G1）に感染した標的細胞を溶解したことから、gB2を認識した(表1)。他のクローンは、これら2つの糖タンパク質のいずれにも特異的ではなかった。 HSVウイルス粒子内部に含まれるタンパク質がCTL応答の優勢な標的を表すという観察は、転写インヒビターであるDRBを有するHSV-感染標的細胞における新規な遺伝子発現を完全にブロックすることにより決定された。新しいタンパク質が合成されるこれらの細胞においてはプロセシングされ得、そしてCD8⁺CTLに対してMHCクラスI分子に結合したペプチドとして提示され得るウイルスタンパク質のみが、これらはウイルスと細胞膜との融合および細胞質へのウイルス粒子の侵入の結果として細胞中に導入されたウイルスタンパク質である。表2は、9個のCD8⁺ CTLクローンが、HSV感染の前にDRBで処理した標的細胞を認識するこの能力について試験された実験結果を示す。9個全てのクローンは、薬物の非存在下において18時間でHSV-2に感染した細胞を溶解し、そしてそのうち8個の試験したクローンはまた、20％を超える特異的放出の値を有する薬物の非存在下で3時間感染した細胞を容易に溶解した。これらCTLクローンの7個全てもまた、DRB存在下では3 時間で感染した細胞を溶解し、この結果は、CTL認識の標的としてのビリオンタンパク質を意味する。DRB処理が、何らかの規定されない様式で、抗原のプロセシングおよび提示を変化させる可能性があることから、本発明者らは、感染細胞における新規のウイルス遺伝子発現を制限する第二のアプローチを使用した。HS V-2株hr259は、必須の即時初期遺伝子であるICP4の発現を抑圧する変異を有する。このウイルスが非相補的な細胞株に感染した場合、発現される唯一のHSV遺伝子は、さらに4個の即時初期遺伝子であるICP0、ICP22、ICP27およびICP47であった。必須の転写活性化因子であるICP4の非存在下では、早期または後期のHSV遺伝子が発現され、そして感染が抑止されない。表2で示されるように、HSV-特異的CTLクローンを、HSV-2 hr259に3時間感染させた標的細胞と培養した場合では、9個のCTLクローンのうち8個が20％を超える特異的放出で細胞を巧みに溶解した。これら標的細胞において、ビリオンタンパク質および残りの4個の即時初期タンパク質のみが、感作の標的であり得る。従って、薬物阻害またはウイルス変異によるウイルス遺伝子発現を制限する実験の結果は一致する。表2で示されるように、9個のHS-特異的CTLクローンのうちの1個である3-8GIは、18時間にわたって感染させた細胞を認識したが、3時間のみ感染させた細胞を不十分にしか溶解せず、そしてDRBの存在下で3時間感染した細胞または変異株hr25 9を欠くICP4に3時間感染させた細胞を溶解することは出来なかった。上記のように、このCTLクローンは、CTLクローンである3-8G1が組換えワクシニアウイルスであるVacgB感染細胞を溶解することから、糖タンパク質であるgBを認識する。これらの結果は、ウイルス糖タンパク質が、2つの膜が融合する場合に、ウイルス感染細胞の表面上に残ることを意味する。従って、これらは感染細胞の細胞質には入って、プロセシング機構（プロテオソームおよびTAPペプチドトランスポーター（これらは、MHCクラスＩ分子に結合するペプチドを提供する））のための基質になることはない。gD2特異的CTLクローンである1-1H6について同様の結果を、全てが予め示している。（Tiggesら、1992）。全ての残りのCTLクローンのうち、1-2E7クローンのみがウイルス遺伝子発現に対するブロックに感受性を提示した（Tiggesら、（1992）での表５を参照のこと）。 HSVビリオンは、タンパク質およびウイルスDNAの複雑なアセンブリである。このDNAは、ウイルスタンパク質のジデカ（dedeca）の正二十面体キャプシドにより囲まれている。このキャプシドはテグメントと呼ばれるウイルスタンパク質の無定形混合物に囲まれ、これは次いで、包理したウイルス性糖タンパク質を含むウイルス膜により包まれる。優勢なCTL標的としての糖タンパク質の除去は、ビリオンの一部であるテグメントおよびキャプシドでの25〜30個のさらなるタンパク質を残す。タンパク質を特定する遺伝子は、ゲノムの全体に分散される（RoizmanおよびSears、（1993）「Herpes simplex viruses and their replication．In The Human Herpesvirus es．B．Roizman，R.J．Whitley，and C．Lopez編(New York:Raven Press Ltd.) 、11-68頁）。最初のストラテジーは、標的タンパク質をコードする多くの遺伝子を可能な限り局在化させることであった。これを、表3に示されるようなHSV-1 （F株）中に挿入されたHSV-2DNAの入れ子の（nested）セグメントが含まれる6個の特に代表的（intertypic）な組換えウイルスを使用してHSV-2特異的であった1 2/13のクローンの標的について行った。6個の組換えウイルスは、入れ子様式でH SV-2ゲノムの6個の領域にまたがっていた。RH 1G7ウイルスは、入れ子の組換え物であるRH 1G8の間に0.3〜0.45のマップ単位を含み、そしてRH 1G44は、 0.385〜0.405および0.37および0.405の小領域をそれぞれ含んだ。同様に、RS 1G 25ウイルスは、0.59〜0.72のマップ単位由来のHSV-2DNAを含み、そして入れ子のウイルスは、0.68〜0.72の小領域を含んだ。最後に、組換えR7015は、完全なHSV -2独自の短い（US）領域、短い末端反復および内部反復配列ならびに長い内部反復を含んだ。これらクローンの3個のセットは、gB2、VP16およびgD2をコードするオープンリーディングフレームを含む。１個を残すクローンは、抗原特異的溶菌能力の損失を有するのでさらに特徴付けられ得ない。表３は、２つの型共通CTLクローン、1-3B3および3-8G1、および１３の型特異的クローンのうちの１２についてのマッピング研究の結果を列挙する。図4は、H SVゲノムおよび選択されたマーカー遺伝子（gB、gDおよびVP16）に関するマッピングの結果を表す。予想された通り、1-1H6 gD-2特異的クローンは、HSV-2XHSV- 1型間（intertypic）組換えウイルスR7015内に含まれるU_sセグメントにマップされた。２つの型共通クローン1-3B3および3-8G1は、全ての標的を認識した。なぜなら、エピトープが、１型および２型ウイルス間で同一だからである。残りのクローンのうち、１つ（3-3G2）は、マップ単位0.3〜0.385の間の領域にマップされ、４つは、マップ単位0.68〜0.72の間の領域にマップされた。しかし、これらのクローンの３つはまた、R7015感染標的を認識した。このことは、これらの組換えウイルスのゲノムは、マップされた程には単純ではないことを示す。残りの７クローンはマップされず、このことは、これらのクローンにエピトープを供給する遺伝子が、パネルに表される領域の外側に位置することを示す。 0.68〜0.72セグメントにマップされた4つのクローンはさらに、ΔVP16 HSV-1( KOS株)変異体中に組換えられたHSV-2由来のUL48(VP16)ORFを含む、型間組換えウイルス（RP-2）を用いて分析された（Weinheimerら、J．Virol．(1992)66:258-2 69;Koelleら、J．Virol．(1994)68:2803-2810）。２つのさらなる型共通クローンもまた、コントロールとしてこの実験に含まれた。表４に示す結果は、二重の表現型を共有する３つのクローン（すなわち、0.68〜0.72マップ単位およびU_sセグメントの両方にマップする）はRP-2感染標的細胞を溶解したが、一方、0.68〜 0.72セグメントのみにマップするクローン1-2F11は、溶解しなかったことを示す。興味深いことに、ドナー4（4-7B1）由来の型共通クローンは、３つのHSV -1株感染標的の全てを溶解したが、RP-2感染標的は溶解しなかった。 RP-2感染標的を溶解した３つのクローンが、VP16を認識したことを確認するため、そしてゲノムのこの領域にマップされる２つの別のCTLの標的を同定するために、HSV-2 ORF UL46、UL47、UL48(VP16)およびUL49(VP22)を発現する組換えワクシニアウイルスを構築した。VP16を発現する２つの別個のワクシニアウイルス組換え体を構築し、１つは全長タンパク質VP16_FLを発現し、そして１つはＣ末端短縮型タンパク質VP16tを発現する。 RP-2反応性CTLクローンを最初にvac/VP16tおよびvac/VP16_FL感染した自己性B- LCL（表５）を用いて試験し、そしていずれもVP16発現標的を認識しなかった。3 -6F9は、この実験において不活性であるにもかかわらず、クローンの能動的継代は、RP-2感染したB-LCLを溶解したが、vac/VP-16感染標的を溶解しなかった。これら同一CTLクローンが他のワクシニア組換え体とともに試験された場合（表6) 、ゲノムのこの領域にマップされる全ての５クローンは、ボールドタイプ書体によって示されるように、vac/UL49感染標的細胞を認識した。4-7B1クローンは、再刺激された場合、増殖を停止した。この実験において使用するために利用可能なＴ細胞の数は、非常に少なかった。そのため、エフェクター：標的の比率は、他のCTLクローンについて使用される１０：１の出発比率より、かなり少なかった。従って、特異的溶解は、６％のみであったが、これはおそらくポジティブな結果であり、それ故、箱を描くのに点線を用いた。領域にマップされなかったクローンは、これらのORFのいずれも認識もせず、調査した型共通クローンは、今のところUL49を認識もしなかった。この節に表される結果の要約において、２２のHSV特異的ＣＤ８⁺ＣＴＬを３つの陰部ヘルペスを頻繁に再発する個体から単離した。７５を超えるＨＳＶタンパク質のいずれがクローンによって認識されたか同定するために、ＨＳＶ型特異性について、内部ビリオンタンパク質の認識について、および個体のＨＳＶタンパク質ｇＢ、ｇＤ、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ４８（ＶＰ１６）およびＵＬ４９（ＶＰ２２）の認識について、クローンをスクリーニングした結果を表７にまとめる。２２クローンのうち１３は、ＨＳＶ−２型特異的であり、そして残りのクローンはＨＳＶ−２およびＨＳＶ−１タンパク質の両方を認識した。１９／２１クローンはビリオンタンパク質を認識した。１／１９は、ｇＢを認識し、そして１／１９は、ｇＤを認識した。クローンの１７／１９は、外被およびキャプシド領域を含む内部ビリオンタンパク質を認識した。これら１７クローンのうち１４を、遺伝子位置のマッピングをするために型間ＨＳＶ組み換え体を用いるか、または特異的タンパク質標的を同定するために、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ４８（ＶＰ１６）またはＵＬ４９（ＶＰ２２）を発現する個別の組み換えワクシニアウイルスを用いて、分析した。これらタンパク質の認識の頻度は、ＵＬ４６（０／１４）、ＵＬ４７（０／１４）、ＵＬ４８（ＶＰ１６）０／１４およびＵＬ４９（ＶＰ２２）５／１４であった。組み換えワクシニアウイルスを用いて、種々のウイルスタンパク質に応答する頻度を決定する実験も行った。１つの個体由来のＣＤ８⁺Ｔ細胞を用いる４つの実験の結果を表７に要約する。いくつかの複合体標的（ＨＳＶ−２変異体Ｘ１２およびｈｒ２５９、Ｘ１２ウイルスで感染したＮＫ細胞標的株Ｋ-５６２および同種異系なＢ−ＬＣＬを含む）を試験した。さらに、組み換えワクシニアウイルスの４／６を個別に試験し（ｇＤ２，ｇＢ２，ＶＰ１６およびＶＰ２２（ＵＬ４９））、そして他の２つを等量のｖａｃ／ＵＬ４６およびｖａｃ／ＵＬ４７ウイルスを用いて標的細胞の同時感染により試験した。結果を、１／ＣＤ８⁺Ｔ細胞の数に関して、および１０⁶ＣＤ８⁺Ｔ細胞あたりＣＴＬ数に関しての両方において、９５％の信頼限界（上限および下限）を用いて、表した。推定の質を、χ二乗値によって示す。なぜならば、頻度は、χ二乗の最小化によって推定されたからである。結果は、ｇＤおよびｇＢエピトープを認識するＣＴＬが以前考えられていたほどは、まれではないことを示す。実験１において、ｇＢ特異的ＣＴＬは、約５，０００のＣＤ８⁺Ｔ細胞中に１存在し、ｇＤ特異的ＣＴＬは、１０，０００のＣＤ８⁺Ｔ細胞中に１を含む、これに比べ、約２５０，０００のＣＤ８⁺Ｔ細胞中に１の非感染B-LCLの非特異的溶解のバックグラウンドに対してVP16を認識する細胞は、約６６，０００のＣＤ８⁺Ｔ細胞中に１であった。実験２において、ｇＤ特異的ＣＴＬは、同様のレベルで検出され（約６，０００のＣＤ８⁺Ｔ細胞中に１）、これに対し、Ｉ型抗原提示を保存するか（Ｘ１２）、または限られた数のＨＳＶ遺伝子を発現する（ｈｒ２５９/ＩＣＰ４^-）ＨＳＶ-２変異体に感染した標的Ｂ-ＬＣＬを認識したＣＴＬは、それぞれ、約３，０００のＣＤ８⁺Ｔ細胞中に１から、約１７，０００のＣＤ８⁺Ｔ細胞中に１であった。これらの値は、非感染Ｂ-ＬＣＬの非特異的溶解を示すＴ細胞の８０，０００中に１つのバックグラウンドに対して測定された。実験３において、ＶＰ−１６特異的ＣＴＬの数は、ナチュラルキラー細胞の数と同様であった。ナチュラルキラー細胞は、Ｋ-5 62細胞または非特異的Ｔ細胞を認識し、そして溶解する。最後に、実験４において、ＶＰ１６，ＵＬ４６またはＵＬ４７のエピトープは、この被験体におけるＣＴＬ応答においてはるかに少なく提示されたが、ＶＰ２２（ＵＬ４９）由来のエピトープは、ウイルス全体の場合に匹敵する頻度で認識された。このことは、ＶＰ２２が、ヒトＣＴＬ応答において免疫優勢な特異性であることを示唆する。従って、ＶＰ２２（ＵＬ４９によってコードされる）由来のエピトープを認識するＣＤ８⁺ＣＴＬの高い頻度を測定した。さらに、以前にＶＰ１６におけるエピトープを認識すると考えられていた４つのクローン化ＣＴＬはＶＰ２２を実際に認識した。従って、このタンパク質は、ＨＳＶ⁺被験体におけるＣＴＬ応答の誘導または増強のために特に有用である。実施例２この実施例は、ＶＰ２２がマウスにおいてＣＴＬ応答を誘導する能力を示す。この実験で使用されたワクチンは、組換えワクシニアウイルス、vac/UL49F（これは感染細胞において全長ＶＰ２２タンパク質を発現する）、およびＤＮＡワクチン、pCMV/UL49（CMV前初期プロモーターによって駆動されるUL49 ORFを含む）を、含む。vac/gB2およびpCMV/gB2をボジティブコントロールとして使用した。具体的には、１６匹の雌性C57BL/6系統マウス（H-2^b）（Charles Riverより）、６週齢を各々４匹の動物の４つの群に分け、そして表９に記載のように免疫した。C57BL/6マウスを、HSV gB2エピトープを認識する能力に基づき使用した（Ha nkeら、J．Virol．(1991)65:1177-1186）。全ての抗原を、ダルベッコ（Dulbecco）Ca⁺Mg⁺⁺非含有PBS中で、希釈または再構成した。免疫スケジュールは、ワクシニアを受けた動物につき１度の免疫化（群１および４）ならびにＤＮＡを用いる１度または２度の免疫を含む。初回の免疫の１ヶ月後、各群の２匹の動物に追加免疫した。他の２匹の動物を、１週間後（５週目）にＣＴＬアッセイに使用したが、追加免疫した動物を、追加免疫の２週間後に反復アッセイのために使用した。脾臓を収集し、そして脾細胞を以下のように再刺激した。収集された脾臓を、洗浄培地（RPMIおよびα-MEMの１：１混合物に、１０％熱非働化ウシ胎児血清、２×10^-5M 2-メルカプトエタノール、および５０μg/mlゲンタマイシンを添加）中に単一細胞懸濁液になるように、スクリーンに対して、分散させた。次に細胞を２４ウェル組織培養プレートに、１ウェルあたり5×10⁶細胞の密度でプレートした。抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、３×10⁶脾細胞を10μM gB2ペプチドでパルスするか、または細胞をvac/UL49ウイルスを用い10のm.o.i.で1時間感染させることにより、調製した。ＶＰ２２タンパク質はまた、反復アッセイにおいて、群３および４を再刺激するために、0.0125mg/mlの濃度で使用した。ConAを含まない２％Rat T-stim補充物（Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA）を、再刺激のために培地に添加した。培地を、３日目に交換した。再刺激の１週間後、表１０に記載のように、ＣＴＬを標的とのインキュベーションについて種々のＥ：Ｔ比率で９６ウェルプレートに分配した。ＭＣ５７（Ｈ２^b）細胞を１．５時間ｇＢ２ペプチドでパルスするか（⁵¹Crロードと同時）、１０のm.o.iで１６時間vac/UL49で感染させるか、またはネガティブコントロールとして１０のm.o.i.でワクシニア野生型（vac/Wr）で感染させ、コールド標的として用いたかのいずれかであった。コールド標的を、⁵¹Ｃｒロードした標的細胞とともに、３０：１の比で添加した。さらに、ＭＨＣ不一致のＳＶＢａｌｂ細胞（Ｈ２^d）を、同種異系標的として使用し、そしてペプチドでパルスするか、またはvac/UL49で感染させたかのいずれかであった。ＣＴＬ標的を、示されたＥ：Ｔ比率で４時間、全容量２００μlで同時に培養し、その後５０μｌの上清を収集し、そして計数のためのドライシンチラントを含むＬｕｍａプレート内に分配した。１回の免疫の後、vac/gB免疫マウス（群１）およびＤＮＡ免疫マウス（群２）において強力な陽性溶解が存在した。ＵＬ４９ＤＮＡ群（群３）またはvac/UL49 群(群４)も、vac/UL49感染の検出可能な特異的溶解を示さなかった。上記実験を繰り返したが、例外として、VP22タンパク質を脾細胞のさらなる再刺激手段として使用した（群３ｂおよび４ｂ、表１１）。群２および３の動物は、追加免疫を受けた。実験は、ｇＢ特異的ＣＴＬが、ｇＢ２免疫群の各々において誘導されたことを示した（群１〜２）。この実験のいずれのＵＬ４９群においても、ウイルスまたはＶＰ２２タンパク質のいずれで刺激しても、ＣＴＬ誘導は存在しなかった（群３および４）。上記の実験を、繰り返して、２匹のさらなるマウス系統（Balb/cおよびC3H）がＶＰ２２においてＣＴＬエピトープを認識する能力を評価した。１６匹のマウス（Charles Riverから）６週齢、を各４匹の動物の４つの群に分け、表１２に示されるように免疫した。８匹のマウスは、Balb/c(H-2^b)系統であり、８匹のマウスはC3H(H-2^k)であった。免疫化スケジュールは、以前の実験と同様であった。 ⁵¹Ｃｒ放出研究を、上記に、表１３に示す２つのマウス系統を加えて行った。ワクシニアまたはＤＮＡワクチンのいずれもＣ３ＨマウスにおいてＶＰ２２特異的ＣＴＬを誘導しなかったが（群３および４）、ＣＴＬはBalb/cマウスにおいて組換えワクシニアおよびＤＮＡワクチンの両方によって誘導され（群１および２）、このことは、このマウス系統のＶＰ２２において有意なエピトープが存在することを示す。表１４に記載のとおりに、実験を繰り返した。組換えワクシニア群におけるＶＰ２２の細胞障害性活性は、耐久性であることが検証されたが、細胞傷害性は、ＤＮＡワクチンを用いる第２の免疫によって、ブーストされなかった。ＶＰ２２に対するエピトープは、追加免疫ワクチン接種後でもまだＣ３Ｈマウスに出現しなかった。従って、ＨＳＶＶＰ２２ポリペプチドを含むワクチン組成物、およびこれを使用する方法が開示される。本発明の好ましい実施態様は、いくらか詳細に記載されたが、添付の請求の範囲に規定される本発明の精神および範囲から離れることなく、明白な改変がなされ得ることが、理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 31/22 Ａ６１Ｐ 31/22 Ｃ０７Ｋ 14/035 Ｃ０７Ｋ 14/035 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ティッジェス，マイケルエイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 94608, エミリービル，ホートンストリート―アール440 4560，カイロンコーポレイション内

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物被検体において細胞性免疫応答を誘発し得る単純ヘルペスウイルス (HSV)VP22ポリペプチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含む、サブユニットワクチン組成物。２．前記VP22がHSV１型(HSV-1)由来である、請求項１に記載の組成物。３．前記VP22がHSV２型(HSV-2)由来である、請求項１に記載の組成物。４．HSV VP16ポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。５．前記VP16ポリペプチドがHSV-1由来である、請求項４に記載の組成物。６．前記VP16ポリペプチドがHSV-2由来である、請求項４に記載の組成物。７．HSV糖タンパク質ポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。８．前記糖タンパク質がHSV-1由来のgBポリペプチドである、請求項７に記載の組成物。９．前記糖タンパク質がHSV-2由来のgBポリペプチドである、請求項７に記載の組成物。１０．前記糖タンパク質がHSV-1由来のgDポリペプチドである、請求項７に記載の組成物。１１．前記糖タンパク質がHSV-2由来のgDポリペプチドである、請求項７に記載の組成物。１２．アジュバントをさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。１３．単純ヘルペスウイルス(HSV)感染の処置または予防のための組成物を産生する方法であって、以下： (a)哺乳動物被検体において細胞性免疫応答を誘発し得る、単離されたHSV VP2 2ポリペプチドを提供する工程；および (b)薬学的に受容可能な賦形剤とともに該HSV VP22ポリペプチドを処方する工程を含む、方法。１４．前記VP22がHSV1型(HSV-1)由来である、請求項１３に記載の方法。１５．前記VP22がHSV2型(HSV-2)由来である、請求項１３に記載の方法。１６．前記組成物が、HSV VP16ポリペプチドをさらに含む、請求項１３に記載の方法。１７．前記VP16ポリペプチドが、HSV-1由来である、請求項１６に記載の方法。１８．前記VP16ポリペプチドが、HSV-2由来である、請求項１６に記載の方法。１９．前記組成物が、HSV糖タンパク質ポリペプチドをさらに含む、請求項１３に記載の方法。２０．前記糖タンパク質がHSV-1由来のgBポリペプチドである、請求項１９に記載の方法。２１．前記糖タンパク質がHSV-2由来のgBポリペプチドである、請求項１９に記載の方法。２２．前記糖タンパク質がHSV-1由来のgDポリペプチドである、請求項１９に記載の方法。２３．前記糖タンパク質がHSV-2由来のgDポリペプチドである、請求項１９に記載の方法。２４．アジュバントを添加する工程をさらに含む、請求項１３〜２３のいずれかに記載の方法。２５．哺乳動物被検体において、単純ヘルペスウイルス(HSV)感染を処置または予防するために有用な医薬の製造において、該哺乳動物被検体の細胞性免疫応答を誘発し得る、HSV VP22ポリペプチドの使用。２６．哺乳動物被検体において、単純ヘルペスウイルス（HSV）感染を処置または予防するために有用な医薬の製造において、哺乳動物被検体およびMSV VP16ポリペプチドの細胞性免疫応答を誘導し得る、HSV VP22ポリペプチドの使用。２７．哺乳動物被検体において、細胞性免疫応答を誘発し得る単純ヘルペスウイルス(HSV)VP22ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、ウイルスベクター。２８．前記VP22ポリペプチドをコードする遺伝子が、HSV1型（HSV-1）由来である、請求項２７に記載のウイルスベクター。２９．前記VP22ポリペプチドをコードする遺伝子が、HSV2型（HSV-2）由来である、請求項２７に記載のウイルスベクター。３０．哺乳動物被検体において、HSV感染を処置または予防するために有用な医薬の製造において、該哺乳動物被検体の細胞性免疫応答を誘発し得る、単純ヘルペスウイルス(HSV)VP22ポリペプチドをコードする遺伝子を含むウイルスベクターの使用。３１．哺乳動物宿主細胞において、遺伝子の転写および翻訳を指向する制御要素に作動可能に連結された単純ヘルペスウイルス(HSV)VP22ポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えベクター、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、ワクチン組成物。３２．前記VP22ポリペプチドをコードする遺伝子が、HSV1型（HSV-1)由来である、請求項３１に記載の組成物。３３．前記VP22ポリペプチドをコードする遺伝子が、HSV2型(HSV-2)由来である、請求項３１に記載の組成物。３４．前記組換えベクターが非ウイルスベクターである、請求項３１に記載の組成物。３５．前記組換えベクターがウイルスベクターである、請求項３１に記載の組成物。３６．前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項３５に記載の組成物。３７．前記組換えベクターがシンドビスウイルス由来である、請求項３１に記載の組成物。３８．前記組換えベクターがリポソーム調製物に被包される、請求項３１に記載の組成物。３９．哺乳動物被検体においてHSV感染を処置または予防するために有用な医薬に製造において、哺乳動物宿主細胞における遺伝子の転写および翻訳を指向する制御要素に作動可能に連結された単純ヘルペスウイルス(HSV)VP22ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、組換えベクターの使用。