PT98565B - Um processo de producao de uma composicao para o tratamento da infeccao por hsv - Google Patents

Description

Titular; CHIRON CORPORATION

Epígrafe: UM PROCESSO DE PRODUÇÃO DE DMA COMPOSIÇÃO PARA O

TRATAMENTO DA INFECÇÃO POR HSV

MEMÓRIA DESCRITIVA e

Campo Técnico

Esta invenção diz respeito a materiais e metodologias para alivio das infecções do Virus do Herpes. Mais especificamente, refere-se a composições contendo um polipeptídeo que compreende um epitopo imunogénico de VP16, incluindo VP16 e seus fragmentos, e a métodos para preparar polipeptídeos para a composição.

Antecedentes íAs viroses do Herpes incluem as viroses do Herpes Simplex (HSV), compreendendo duas variedades muito próximas designadas tipo 1 (HSV-1) e 2 (HSV-2). 0 Virus do Herpes Simplex (HSV) é uma causa predominante de infecção genital em humanos, com uma incidência anual estimada em 600.000 novos casos e com 10 a 20 milhões de indivíduos que sofrem desta doença sintomática crónica periódica. A taxa de infecção sub-clinica assintomática talvez possa ser ainda mais elevada. Utilizando um ensaio serológico do tipo especifico, os investigadores demostraram que

35% de uma população feminina nâo seleccionada, que frequentava uma clinica de manutenção da saúde em Atlanta, tinha anticorpos para o tipo 2 do HSV (HSV-2). Apesar da administração continua de fármacos anti-virais, tal como a acyclovir, melhorar a severidade da doença aguda do HSV e reduz a frequência e duração dos episódios periódicos, tal intervenção quimioterapeutica não destrói o estabelecimento da latência nem altera o estado do virus latente. Como consequência, o modelo da doença periódica é rapidamente estabelecido com a interrupção do tratamento por fármaco. Desde que a principal fonte de transmissão do virus surga a partir da doença recrudescente, qualquer aproximação para reprimir o grau de infecção deve obrigatoriamente requerer uma estratégia de vacina. Assim, ê um assunto de grande interesse clinico e cientifico proporcionar vacinas seguras e eficazes para os seres humanos, a fim de prevenir a infecção por HSV, e onde a infecção já tenha ocorrido, terapias para a doença.

HSV é um virus com DNA de cadeia dupla tendo um genoma de cerca de 150 a 160 kpb empacotados dentro de uma cápside icosaédrica rodeada por um envelope de membrana. 0 envelope virai inclui pelo menos sete glicoproteinas especificas do virus, incluindo gB, gC, gD, gE e gG, em que gB e gD são tipos reactivos cruzados entre os tipos 1 e 2. Uma tentativa de terapia por vacina tem sido o uso de glicoproteinas isoladas, que demonstraram dar protecção quando injectadas em ratos subsequentemente desafiados com virus vivos.

O produto do gene VP16 está associado com o· tegumento do virião, localizado entre a cápside e o envelope (ver Fig. 1).

VP16, que é um factor estimulante do virião, é uma proteina

abundante com perto de 500 a 1000 cópias por viriâo. Tem sido chamado alternativamente ICP25, ViciW65, e o factor α-trans-indutor (aTIF). A maioria dos estudos sobre VP16 têm explorado o seu papel em trans-activaçâo dos genes prococes imediatos na replicaçâo do HSV. Tendo em vista a localização interna de VP16 no virus, e o estado corrente do conhecimento ligado ao modo de replicaçao do HSV, nao se esperaria que o VP16 fosse um bom candidato para ser usado no tratamento de infecções de HSV.

Literatura Relevante

Spear e Roizman (1972) publicam a separaçHo electroforética de proteínas em HSV1 purificado. McLean et al. (1982) publica um anticorpo monoclonal que interage supostamente com VP16 do HSV1 e HSV2.

Eberle et al. (1984), publica estudos sobre a resposta do anticorpo a componentes de HSV durante as infecções primárias e periódicas genitais por HSV-2.

Campbell et al. (1984), supostamente descobre uma sequência de DNA codificando VmW65 de HSV1 e identifica VmW65 como o maior componente do tegumento do virus o qual trans-activa a transcrição prococe imediata (IE - immediate-early) de HSV.

Pellett et al. (1985), revela a expressão da sequência codificadora do HSV1 α—TIF clonado em sistemas de expressão transitória.

Triezenberg et al. (1988), descobre uma suposta sequência de aminoácidos para HSV1 VP16 e mutantes de delecçâo do mesmo.

McGeoch et al. (1988) apresenta uma sequência de DNA da —-q—ylonga região única (Ul) da cadeia 17 de HSV-1. Esta região inclui um segmento que supostamente codifica, no gene UL48, a maior proteína do tegumento (o qual é um activador da transcrição de genes IE na célula novamente infectada).

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Descrição da Invenção

A presente invenção resulta da descoberta de que um polipeptídeo do tegumento do HSV, o VP16, é imunogénico e reduz os efeitos da doença provocada pela infecçao por HSV. Assim a invenção inclui composições, que sao constituídas por um epitopo imunogénico de VP16 do HSV, e s3o úteis para o tratamento da infecçao por HSV, polipeptideos utilizados nestas composições, métodos de tratamento da infecçao por HSV utilizando estas composições, e métodos para as preparar assim como os polipeptideos imunogénicos nelas utilizados; estão também incluídos vectores constituídos por sequências polinucleotidicas codificando estes polipeptideos e células transformadas com estes vectores.

Consequentemente, um dos aspectos da invenção é uma composição para o tratamento de um individuo com uma infecçao pelo vírus do Herpes Simplex (HSV), compreendendo um polipeptídeo

imunogénico isolado contendo um epitopo imunogénico de VP16 do HSV, em que o polipeptideo está presente numa dose farmacologicamente eficaz, num excipiente farmaceuticamente aceitável.

Outro aspecto da invenção é uma composição compreendida pelo virus vaccinia recombinante, no qual o virus está compreendido por uma sequência codificando um polipeptideo imunogénico seleccionado do HSV VP16, HSV VP16 truncado, e seus mutantes, no qual o polinucleotideo que codifica o polipeptideo imunogénico está ligado operavelmente a uma sequência de controlo.

Ainda um outro aspecto da invenção é um método de produção de uma composição para tratamento da infecçao do HSV que compreende s (a) fornecer um polipeptideo imunogénico compreendido por um epitopo imunogénico HSV VP16;

(b) formular o polipeptideo num excipiente farmaceuticamente aceitável.

Outro aspecto da invenção é uma composição produzida pelo método acima descrito.

Ainda outro aspecto da invenção é um método de tratamento de um indivíduo para a infecçao do HSV, compreendendo a administração ao indivíduo das composiçoes acima descritas.

Um aspecto adicional da invenção ê um polipeptideo recombinante que codifica um polipeptideo compreendido por um epitopo imunogénico do HSV-2 VP16.

Ainda um outro aspecto da invenção é um vector recombinante compreendido pelo polinucleotideo acima descrito.

Ainda um aspecto adicional da invenção é um sistema de expressão recombinante compreendendo uma estrutura aberta de leitura (ORF) de DNA, codificando um polipeptideo composto por um epitopo imunogénico do HSV-2 VP16, no qual o ORF está ligado operacionalmente a uma sequência de controlo compatível com o hospedeiro desejado.

Ainda um outro aspecto da invenção é um método de produzir um polipeptideo imunogénico para usar no tratamento da infecção do HSV, compreendendo o método;

(a) fornecimento da célula hospedeira descrita acima;

(b) incubação da célula hospedeira sob condiçOes que permitam a expressão do polipeptideo; e (c) isolamento do polipeptideo expresso a partir da célula hospedeira.

Ainda um outro aspecto da invenção é um polipeptideo imunogénico para uso no tratamento da infecção do HSV, produzido pelo método descrito acima.

Breve Descrição dos Desenhos

A Fig. 1 é um desenho esquemático de um vir ião HSV.

A Fig. 2 mostra as supostas sequências de aminoácidos de VP16 do HSV-1 e do HSV-2.

A Fig. 3 mostra a sequência de nucleotideos que codifica VP16 de HSV-2, e os aminoácidos ai codificados.

A Fig. 4 é um mapa que mostra algumas caracteristicas significativas do vector pAC373, do pVL985 e a sequência que codifica os aminoácidos N-terminal do gene da polihedrina.

A Fig. 5 é um mapa que mostra algumas caracteristicas

significativas do vector pHS225.

A Fig. 6 è uma cópia da Fig. 4 do WO88/02634, que apresenta a sequência nucleotidica que codifica gB2 do HSV, e os aminoácidos ai codificados.

A Fig. 7 é um mapa que mostra algumas caracteristicas significativas do vector pHS218.

A Fig. 8 ê um mapa que mostra algumas caracteristicas significativas do vector pBCB07.

A Fig. 9 é um mapa que mostra algumas caracteristicas significativas do vector pVACC-gB2.

A Fig. 10 é uma vista esquemática que mostra o conteúdo dos poços num estudo do titulo de um anticorpo.

A Fig. 11 é um gráfico de barras que mostra o titulo do complemento especifico de HSV dependente dos titulos do anticorpo neutralizante que resultam da imunização com w-gB2 e vv-VP16.

A Fig. 12 é um gráfico que mostra a protecção ao longo do tempo que resulta da imunização com vv-gB2.

A Fig. 13 é um gráfico que mostra a protecção ao longo do tempo que resulta da imunização com w-VP16.

A Fig. 14 é um gráfico que mostra a protecção ao longo do tempo que resulta da imunização com w-gB2, W-VP16 e wgB2+w-VP16.

Modos de Realização da Invenção A terminologia que se segue é a aqui utilizada.

termo polipeptideo refere-se a um polimero de aminoácidos e não se refere a uma extensão especifica do produto;

assim peptldeos, oligopeptideos e proteínas estão incluídos na definição de polipeptídeo. Este termo também não se refere ou exclui modificações de expressão posteriores do polipeptídeo, por exemplo, glicosilações, acetilações, fosforilações e outras do mesmo género. Incluídos na definição estão, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos nao naturais, etc.), polipeptídeos com ligações substituídas, bem como outras modificações conhecidas na arte, ambas ocorrendo naturalmente ou nâo.

termo polipeptídeo isolado refere-se a um polipeptídeo que está substancialmente livre de outros componentes virais de HSV, particularmente polinucleotideos. Uma composição polipeptidica está substancialmente livre de um outro componente se o peso do polipeptídeo na composição é pelo menos 70% do peso do polipeptídeo e outro componente misturado, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente cerca de 90%, e o mais preferencialmente 95% ou mais. Por exemplo, uma composição contendo 100 gg/ml de VP16 e apenas 3 gg/componentes de HSV maternos (p.ex., DNA, lipidos, etc.) é substancialmente livre de outros componentes virais de HSV’’, e portanto ê uma composição de n peptideos isolados dentro do âmbito desta definição. Similarmente, algumas composições da invenção compreendem um polipeptídeo isolado de VP16 em combinação com uma ou mais glicoproteinas isoladas de HSV, p.ex., gB, gC, gD, e outras do género.

Um polinucleotideo recombinante refere-se a um polinucleotideo de origem genómica, de cDNA, semi-sintética ou sintética que, por virtude da sua origem ou manipulação: (1) não —_r está associado com o todo ou parte de um polinucleotideo com o qual está associado na natureza, (2) está ligado a um polinucleotideo que nâo aquele a que se liga na natureza, ou (3) não ocorre na natureza.

Um polinucleotideo é uma forma polimérica de nucleotideos de qualquer comprimento, tanto ribonucleotideos como desoxiribonucleotideos. Este termo refere-se sòmente à estrutura primária da molécula. Assim, este termo inclui o DNA de cadeia dupla e simples e o RNA. Também inclui tipos de modificaçOes conhecidos, por exemplo, marcas que sao conhecidas na arte, metilaçâo, cápsulas, substituição de um ou mais nucleotideos de ocorrência natural, por análogos, modificaçOes internucleotidicas tais como, por exemplo, aquelas com ligaçOes nâo carregadas (p.ex., fosforotiolatos, fosforoditiolatos, etc.), aquelas contendo metades pendentes, tais como, por exemplo, proteinas (incluindo p.ex., nucleases, toxinas, anticorpos, peptideos de sinal, poli-L-lisina, etc.), aquelas com intercaladores (p.ex., acridina, psoralene, etc.), aquelas que contêm quelantes (p.ex., metais, metais radioactivos, etc.), as que contêm alquiladores, as que contêm ligaçOes modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), bem como formas nâo modificadas do polinucleotideo.

Células hospedeiras recombinantes, células hospedeiras, células, linhas de células, culturas de células, e outros termos como estes indicando culturas de linhas de células de microorganismos ou de eucariontes superiores como entidades unicelulares referem-se a células que podem ser ou foram, usadas como receptores para um vector recombinante ou

outro polinucleotideo de transferência, e incluem a progenia da célula original que foi transfectada. E compreendido que, a progenia da célula parental singular pode nao ser necessariamente completamente idêntica na morfologia ou no complemento, genómico ou do DNA total, como o parente original, devido a uma mutaçao natural, acidental ou deliberada.

Um replicao é qualquer elemento genético, por exemplo, um plasmideo, um cromossoma, um virus, um cosmideo, etc., que se comporta como uma unidade autónoma de replicaçfio de polinucleotideos dentro da célula; por exemplo, capaz de replicaçSo sob seu próprio controlo.

Um vector é um replicao que ainda compreende sequências que providenciam replicaçâo e/ou expressão da estrutura aberta de leitura.

Sequência de controlo refere-se a sequências polinucleotidicas que sao necessárias para efectuar a expressão das sequências de codificação às quais estão ligadas. A natureza de tais sequências de controlo difere segundo o organismo hospedeiro; nos procariontes, tais sequências de controlo incluem geralmente promotor, sitio de ligaçao ribossomal, e terminadores; nos eucariontes, geralmente, tais sequências de controlo incluem promotores, terminadores e, nalguns casos, aumentadores. 0 termo sequências de controlo pretende incluir, no minimo, todos os componentes cuja a presença é necessária para a expressão, e pode também incluir componentes adicionais cuja a presença é vantajosa, por exemplo, sequências lider que controlam a secreção.

Um promotor é uma sequência nucleotidica que é compreendida por sequências consensuais que permitem a ligação do RNA polimerase ao molde de DNA, de tal maneira que a produção de mRNA se inicia no sitio de iniciação de transcripçâo normal para o gene estrutural adjacente.

Ligado operavelmente refere-se a uma justaposição em que os componentes assim descritos estão numa relação que lhes permite funcionarem da maneira que pretenderem. Uma sequência de controlo ligada operavelmente a uma sequência de codificação, é ligada de tal maneira que a expressão da sequência de codificação é alcançada sob condiçOes compatíveis com as sequências de controlo.

Uma estrutura aberta de leitura (ORF) é uma região de uma sequência polinucleotidica que codifica um polipeptideo; esta região pode representar uma porção ou o total de uma sequência de codificação.

Uma sequência de codificação é uma sequência polinucleotidica que é transcrita num mRNA, e/ou traduzida num polipeptideo quando sujeita ao controlo de sequências reguladoras apropriadas. As extremidades da sequência de codificação são determinadas por um codão de inicio da tradução no 5'-terminal e um codão de terminação da tradução no 3'-terminal. Uma sequência de codificação pode incluir, não sendo limitada ao mRNA, DNA (incluindo cDNA), e sequências polinucleotidicas recombinantes.

Tal como usado aqui, epitopo refere-se a um determinante antigénico de um polipeptideo. Um epitopo pode compreender três aminoácidos numa conformação espacial que é única ao epitopo. Geralmente, um epitopo consiste de pelo menos 5 destes aminoácidos, e mais usualmente, consiste de cerca de 8 a destes aminoácidos. Métodos para determinar a conformação espacial de tais aminoácidos são conhecidos na arte, e incluem, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional.

Um epitopo imunogénico é um epitopo num polipeptídeo que deduz uma resposta imune celular e/ou humoral; a resposta pode ser deduzida por um único polipeptídeo, ou pode requerer a presença de um transportador na presença ou ausência de um adjuvante.

Um epitopo é o equivalente imunológico de outro epitopo num polipeptídeo designado quando tem uma sequência de aminoácidos e uma conformação que permita reacção cruzada com anticorpos, que estão ligados imunologicamente ao epitopo no polipeptídeo designado.

Tal como usado aqui, um epitopo de um polipeptídeo designado denota epitopos com a mesma sequência de aminoácidos tal como o epitopo no polipeptídeo designado, e seus equivalentes imunológicos.

Um polipeptídeo que é compreendido por um epitopo imunogénico de VP16 de HSV é um polipeptídeo que contém uma sequência de aminoácidos de VP16 de HSV de pelo menos o número para formar o epitopo imunogénico, usualmente, pelo menos cinco aminoácidos, mais usualmente, pelo menos cerca de 8 aminoácidos, e ainda mais usualmente, cerca de 10 ou mais aminoácidos, não sendo o tamanho máximo critico. A sequência de aminoácidos de VP16 de HSV pode ser ligada no grupo amino terminal e/ou no grupo carboxilico terminal a outro polipeptídeo (por exemplo, uma proteína transportadora), tanto por ligação covalente ou por expressão de um polinucleotideo fundido para formar uma proteína fundida. Se desejado, pode-se inserir ou ligar múltiplas repetiçOes do epitopo e/ou incorporar uma variedade de epitopos. A proteína transportadora pode derivar de qualquer fonte mas será geralmente uma proteína imunogénica relativamente grande tal como a BSA, KLH, ou similares. Se desejado, pode-se empregar substancialmente um comprimento total da proteína VP16, como o transportador, multiplicando o número de epitopos imunogénicos. Alternativamente, a sequência de aminoácidos de VP16 de HSV pode ser ligada ao grupo amino terminal e/ou grupo carboxílico terminal a uma sequência de aminoácidos de VP16 de nao-HSV, assim o polipeptideo seria um polipeptideo de fusão. Tipos análogos de polipeptideos podem ser construídos usando epitopos de outras proteínas virais designadas.

Um mutante de um designado polipeptideo refere-se a um polipeptideo no qual a sequência de aminoácidos do polipeptideo designado tem sido alterada pela delecçSo ou substituição de um ou mais aminoácidos na sequência, ou pela adição de um ou mais aminoácidos à sequência. Métodos pelos quais os mutantes ocorrem (por exemplo, por recombinaçâo) ou sêto feitos (por exemplo, pelo sitio de mutagénese dirigida) s3o conhecidos no ramo.

Transformação refere-se à inserção de um polinucleotideo exógeno numa célula hospedeira, independentemente do método usado para a inserção, por exemplo, absorção directa, transducçâo (incluindo infecçâo virai), F-MATING ou electroporaçâo. 0 polinucleotideo exógeno pode ser mantido como um vector nao integrado, por exemplo, um plasmídeo ou um genoma pode ser integrado

virai, ou alternativamente, pode ser integrado no genoma do hospedeiro.

Um indivíduo refere-se a um vertebrado, particularmente a um membro de espécies mamiferas, e inclui, mas nao é limitado a aminais domésticos, animais de desporto, e primatas, incluindo humanos.

Tal como aqui usado, tratamento refere-se a qualquer dos (i) a prevenção da infecçâo ou reinfecçao, tal como numa vacina tradicional, (ii) a redução ou eliminação dos sintomas e (iii) a eliminação substancial do virus. 0 tratamento pode ser efectuado profilacticamente (antes ou precedendo a infecçâo) ou terapeuticamente (durante ou logo após a infecçâo).

termo quantidade eficaz refere-se a uma quantidade suficiente do polipeptideo que transporta o epitopo para induzir uma resposta imunológica no sujeito ao qual é administrada. A resposta imunológica pode consistir, sem limitação, na indução de imunidade humoral e/ou celular. De preferência, a quantidade eficaz é suficiente para efectuar o tratamento, tal como acima definido. A quantidade exacta necessária há-de variar de indivíduo para indivíduo, consoante a espécie, a idade, e condição geral do individuo, a severidade da situação a ser tratada, o polipeptideo particular escolhido e o seu modo de administração, etc.. Então, nao é possível especificar a quantidade eficaz exacta. No entanto, é possivel, para um especialista no ramo, determinar a quantidade eficaz apropriada, utilizando apenas experimentação de rotina.

termo glicoproteina do HSV refere-se a qualquer das glicoproteinas que se encontram na região da membrana dos virus

HSV-1, HSV-2 e virus de herpes relacionados. As glicoproteinas presentemente preferidas são gB, gC, gD e gE. Estão também incluídos nesta definição as glicoproteinas extraídas de virus naturais (p.ex., a partir de culturas de células ou soros infectados) e as glicoproteinas produzidas por métodos de recombinação. Tais glicoproteinas podem ser modificadas, quer por métodos quimicos ou enzimáticos (por exemplo, por clivagem proteolitica, desglicosilaçâo, etc.), ou por mutação, ou por técnicas de DNA recombinante (por exemplo, por fusão dos genes de glicoproteina de HSV com outros genes para providenciar proteínas de fusão, ou por delecção ou substituição de secções da sequência de DNA).

Na prática da presente invenção serão empregues, excepto indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, bioquímica, e imunologia, que se encontram no âmbito deste ramo. Estas técnicas encontram-se completamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook, Maniatis e Fitsch, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, segunda edição (1989); DNA CLONING, volumes I e II (D.N. Glover, Ed. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait Ed. (1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney ed. 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986; B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); a série, METHODS IN ENZYMOLOGY (ACADEMÍC Press, Inc.), e particularmente, o Vol. 154 e o Vol. 155 (Wu e Grossaman, e Wu, eds., respectivamente); GENETRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller e M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), IMMUNOCHEMICAL

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As composiçoes da invenção, as quais são usadas para o tratamento da infecção por HSV em indivíduos, são constituídas por um polipeptideo, o qual contém um ou mais epitopos imunogénicos VP16 de HSV. 0 surpreendente resultado de que o VP16 de HSV é imunogénico, e protector, é demonstrado nos Exemplos 4 e 5, abaixo. Assim, as composições compostas por polipeptideos contendo pelo menos um epitopo imunogénico de VP16 de HSV, podem ser usadas para o tratamento de indivíduos evitando ou atenuando os sintomas de doença associados âs infecçOes por HSV. Mais ainda, os resultados mostram também que a adição de uma glicoproteina de HSV à vacina composta por VP16 de HSV, aumenta tanto os efeitos imunogénico como o protector. Assim, preferencialmente, as vacinas serão ainda compostas de, pelo menos, um epitopo imunogénico de uma glicoproteina de HSV. 0 epitopo da glicoproteina pode existir no mesmo polipeptideo do epitopo do VP16 ou pode existir num segundo polipeptideo. Preferencialmente, o epitopo da glicoproteina é proveniente de gB de HSV ou gD de HSV.

De modo a preparar a vacina, é fornecido um polipeptideo contendo um ou mais epitopos imunogénicos de VP16 de

HSV. Se se desejar, também, na vacina, um epitopo imunogénico de

uma glicoproteina de HSV, este pode ser incluído no polipeptideo contendo o epitopo VP16 de HSV, ou em alternativa, pode ser fornecido num segundo polipeptideo.

Os polipeptideos fornecidos podem ser glicoproteinas de HSV e/ou VP16 de HSV de comprimento total. Se os polipeptideos tiverem o comprimento total poderão ser isolados a partir do virus. 0 isolamento e purificação podem ser conseguidos através de técnicas conhecidas no ramo. Ver por exemplo, Methods in Enzymology, e Scopes, PROTEIN PURIFICATION, gue discute uma variedade de métodos para purificação de proteínas.

Alternativamente, os polipeptideos de comprimento total podem ser sintetisados usando técnicas de DNA recombinante bem como as sequências conhecidas que codificam as glicoproteinas e VP16 de HSV-1, ou a sequência para VP16 de HSV-2 aqui fornecida. Os polipeptideos de comprimento total podem conter uma ou mais substituições na sequência de aminoácidos desde que a imunogenicidade do polipeptideo designado seja ainda evidente.

A invenção coptempla ainda o uso de polipeptideos compostos por sequências truncadas de aminoácidos da glicoproteina e/ou VP16 de HSV. 0 tamanho dos polipeptideos compostos das sequências truncadas de VP16 de HSV ou glicoproteina podem variar largamente, o tamanho minimo sendo uma sequência de tamanho suficiente para fornecer o desejado epitopo imunogénico, enquanto que tamanho máximo não é critico. Por conveniência, o tamanho máximo não é, em geral, substancialmente maior do que o requerido para fornecer os epitopos · e funções desejados da sequência heteróloga, se houver alguma. Tipicamente, a sequência truncada de aminoácidos de HSV variará entre 5 e

cerca de 400 aminoácidos em comprimento. Mais tipicamente, contudo, a sequência virai contendo o epitopo imunogénico terá um máximo de 100 aminoácidos em tamanho e preferencialmente um máximo de cerca de 50 aminoácidos.

As sequências truncadas de aminoácidos de glicoproteina de HSV ou de VP16 de HSV as quais sao imunogênicas, podem ser identificadas de várias maneiras. Por exemplo, toda a sequência da proteina virai pode ser rastreada através da preparaçao de uma série de pequenos peptídeos que juntos ir3o abarcar toda a sequência proteica. Ao começar, por exemplo, com polipeptideos de 100 mer, seria rotina testar cada polipeptideo para a presença de epitopo(s) mostrando a reactivadade desejada e testando então progressivamente fragmentos cada vez mais pequenos o sobrepostos a partir de um 100 mer identificado para mapear o epitopo de interesse. 0 rastreio de tais peptídeos num ensaio imunológico encontra-se no âmbito deste ramo e os ensaios imunolôgicos apropriados para a imunogenicidade sao descritos nos Exemplos. S3o também conhecidos métodos de análise computorizada de sequência de uma proteina para identificar potenciais epitopos. Por exemplo, foram determinados a partir da suposta sequência de aminoácidos da Fig. 2, supostos epitopos de VP16 de HSV-2, usando como critérios a probabilidade de superficie, Índice de antigenes, hidrofilicidade, carga, ou falta da estrutura de abertura das regiões do polipeptideo de VP16 de HSV-2. Estes supostos epitopos estão localizados desde o aminoácido (aa) 15 ao 34; desde aa 193 ao 220; desde aa 320 ao 330; desde aa 360 ao 371; desde aa 378 ao 390; desde aa 400 ao 410; e desde aa 480 ao 490, aproximadamente. Depois da identificação destes supostos

epitopos podem ser preparados oligopeptideos para rastreio constituídos pelas regiOes identificadas.

Se desejado, um único polipeptídeo pode incluir pelo menos uma sequência de VP16 de HSV truncada, aqual inclui um epitopo imunogénico e também, pelo menos, uma sequência de glicoproteina de HSV truncada a qual inclui um epitopo imunogénico. Alternativamente, as sequências de glicoproteina e de VP16 de HSV podem encontrar-se em polipeptideos separados. Enquanto que as sequências truncadas podem ser produzidas por vários tratamentos conhecidos sobre proteina(s) viral(s) nativa(s) do sujeito em causa, é normalmente preferido fazer polipeptideos por sintese ou recombinantes constituídos pelos epitopos imunogénicos desejados.

Os polipeptideos recombinantes constituídos pelas sequências de VP16 de HSV truncadas podem ser feitas inteiramente de sequência de VP16 (um ou mais epitopos, sejam ou nSo contiguos), ou a sequência ou sequências de VP16, numa proteína de fusão. Duma forma similar, polipeptideos constituídos de sequências glicoproteicas de HSV truncadas podem ser feitas inteiramente da sequência glicoproteica (um ou mais epitopos, quer contiguos ou nao contiguos), ou a sequência ou sequências glicoproteicas numa proteína de fusão.

Em proteínas de fusão, sequências heterólogas úteis, incluindo sequências que providenciam a secreção de um hospedeiro recombinante, aumentam a reactividade imunológica de VP16 ou epitopo(s) de glicoproteinas, ou facilitam o acopu-lamento do polipeptídeo a um suporte ou a um transportador de vacinas. Ver, por exemplo, Publicação EPO No. 116.201; Patente Americana No.

4.722.840; Publicação EPO No. 253.149; Patente Americana No. 4.629.783, cujas descrições são aqui incorporadas para referência.

comprimento total, tal como os polipeptideos compreendidos de VP16 truncados de HSV e/ou sequências de glicoproteinas de HSV, e seus mutantes, podem ser preparados por tecnologia recombinante. Uma suposta sequência de DNA codificando o VP16 de HSV-1 (também conhecido como VmW65) é descoberto em Campbell et al. (1984), sendo esta descoberta aqui incorporada para referência, uma sequência de DNA codificando VP16 de HSV-2, descoberto por estes inventores e descrito no Exemplo 1, está fornecida na Fig. 3, abaixo. Nesta figura a Met indicada por uma seta é a suposta metionina de iniciação. 0 método para o obtenção da sequência de VP16 de HSV-2 é simplesmente de interesse histórico, desde que a informação nos dados da sequência está disponível na Fig. 3 e no Depósito da ATCC No. 68.372, os quais estão aqui incorporados para referência. As sequências que codificam um número de glicoproteinas de HSV, incluindo gB e gD, são conhecidas. Por exemplo, sequências de codificação de gB de HSV-1 e HSV-2 são mostradas na Patente Americana No. 4.642.333; sequências codificando gD de HSV estão descritas em Watson et al. (1982). Métodos para expressão de gB e gD, e seus fragmentos, estão descritos em WO88/02634. A disponibilidade destas sequências permite a construção de polinucleotideos codificando regiões imunogénicas dos polipeptideos de VP16 de HSV e glicoproteinas de HSV. ·

Polinucleotideos codificando o desejado polipeptideo compreendido por um ou mais epitopos imunogénicos de VP16 de HSV

e/ou um ou mais epitopos imunogénicos da glicoproteina podem ser sintetizados ou isolados quimicamente e inseridos num vector de expressão. Os vectores podem ou não conter porções de sequências de fusão tais como β-galactosidase ou superóxido dismutase (SOD). Métodos e vectores que são úteis para a produção de polipeptídeos que contêm sequências de fusão de SOD são descritos na European Patent Office Publication No. 0.196.056, publicado em 1 de Outubro de 1986.

O DNA que codifica o polipeptídeo desejado, quer na forma fundida ou madura ou não, contendo uma sequência de sinal para permitir a secreção, pode ser ligada nos vectores de expressão adequados para qualquer hospedeiro conveniente. Os hospedeiros são então transformados com os vectores de expressão. Tanto os sistemas de hospedeiros eucarióticos como os procarióticos são presentemente usados na formação de polipeptídeos recombinantes e um resumo de alguns dos sistemas de controlo mais comuns e linhas de células hospedeiras são apresentadas infra. As células hospedeiras são incubadas sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo desejado. 0 polipeptídeo é depois isolado a partir das células lisadas ou a partir do meio de cultura, e purificado na extensão necessária para o uso pretendido.

As técnicas gerais usadas na extraeção do genoma de um virus, preparação e sondagem da informação de DNA, clones de sequenciaçâo , construção de vectores de expressão, transformação de células, execução de imunoensaios assim como radioimunoensaios e ensaios ELISA, para crescimento de células em cultura e similares, são conhecidas na arte e estão disponíveis em manuais

I

de laboratório descrevendo estas técnicas. No entanto, como um guia geral, os seguintes conjuntos adiante são algumas fontes correntemente disponíveis para tais procedimentos e materiais úteis para os levar a cabo.

Oligonucleotideos sintéticos podem ser preparados usando um sintetizador de oligonucleotideos automatizado como descrito por Warner (1984). Se desejado, as cadeias sintéticas 32 podem ser marcadas com [ P] por tratamento com cinase 32 polinucleotidica na presença de [ P]-ATP, usando condiçOes padrao para a reacção.

No sentido de criar mutantes, ou sequências funcionais desejáveis, ou retirá-las (p.ex., sitios de restrição enzimática) podem ser modificadas sequências de DNA, incluindo as isoladas a partir de clones através de técnicas conhecidas, como por exemplo, sitio de mutagenese dirigida, como descrito por Zoller (1982). Suncintamente, o DNA a ser modificado é inoculado num fago como uma sequência de cadeia simples e convertido num DNA de cadeia dupla com DNA polimerase, usando como oligonucleotideo iniciador um oligonucleotideo sintético complementar à porção de DNA a ser modificada e tendo a modificação desejada incluída na sua própria sequência. 0 DNA em cadeia dupla resultante é transformado numa bactéria hospedeira de suporte do fago. Culturas de bactérias transformadas que contém replicaçOes de cada cadeia de fago são plaqueadas em agar para obter placas. Teoricamente, 50% das novas placas contém fagos com a sequência mutada e os restantes 50% contém a sequência normal. Réplicas das placas sao hibridizadas a sondas sintéticas marcadas a temperatura e condiçOes que permitem a hibridização com a cadeia

correcta, mas nao com a sequência n3o modificada. As sequências que foram identificadas por hibridizaçao foram recuperadas e clonadas.

Geralmente, na análise de hibridizaçao, o DNA a ser sondado é imobilizado em filtros de nitrocelulose, desnaturado, e pré-hibridizado com um tampao contendo 0-50% de formamida, 0.75 M de NaCl, 75 mM de citrato de Na, 0.02% (p/v) de albumina de soro de bovino, pirolidona de polivinil e ficol, 50 mM de fosfato de Na (pH 6.5), 0.1% de SDS, e 100 ug/ml de transportador de DNA desnaturado. A percentagem de formamida no tampao, assim como o tempo e condições de temperatura dos passos de pré-hibridizaçao e subsequente hibridizaçao e lavagem depende do rigor requerido. Sondas oligoméricas que requerem condições de rigor inferiores, sao usadas geralmente com baixas percentagens de formamida, baixas temperaturas e longos tempos de hibridizaçao. Sondas contendo mais do que 30 ou 40 nucleotideos, tais como aquelas derivadas de DNAs clonados, empregam temperaturas altas, p.ex.,, cerca de 40-42°C, e uma percentagem alta, p.ex.,, 50% de formamida. Seguidamente à pré-hibridizaçao, a sonda marcada é adicionada ao tampao e os filtros s3o incubados nesta mistura sob condições de hibridizaçao. Após lavagem, os filtros tratados sao sujeitos à autoradiografia para localizar a sonda hibridizada; o DNA nos locais correspondentes nas placas originais de agar é usado como fonte do DNA desejado.

A construção de vectores emprega técnicas que sao conhecidas na arte. A clivagem do DNA em sitios específicos é realizada por tratamento com enzimas de restrição apropriados sob condições que sao geralmente especificadas pelo produtor destes enzimas comercialmente desponiveis. Em geral, cerca de 1 gg de plasmideo ou sequência de DNA é clivada por uma unidade do enzima em cerca de 20 μΐ de solução tampão por incubação durante la 2 horas a 37°C. Apôs incubação com enzima de restrição, a proteina é removida por extracção (p.ex., com fenol/clorofõrmio) e o DNA recuperado (p.ex., por precipitação com etanol). Os fragmentos clivados podem ser separados, p.ex., usando técnicas de electroforese em gel ou por sedimentação, de acordo com os procedimentos gerais encontrados em Methods in Enzymology (1980) 65: 499-560.

As extremidades viscosas dos fragmentos clivados podem ser extremidades abruptas usando DNA polimerase I (Klenow) de E. coli na presença do desoxinucleotideo trifosfatos (dNTPs) apropriados presentes na mistura. Tratamento com uma nuclease de cadeia simples (p.ex., SI nuclease) pode também ser usado para hidrolizar quaisquer porções de DNA de cadeia simples.

As ligações podem ser lavadas a cabo usando tampão e condições de temperatura padrões, usando ligase de DNA de T4 e ATP. Quando os fragmentos do vector são usados como parte de uma mistura de ligação, sendo o fragmento do vector frequentemente tratado com fosfatase alcalina bacteriana (BAP) ou fosfatase alcalina intestinal de vitelo para remover 5'-fosfato e assim evitar a religaçâo do vector; alternativamente, a digestão do enzima de restrição dos fragmentos não desejados pode ser usada para evitar a ligação.

Misturas de ligação são usadas para transformar hospedeiros apropriados para clonagem, os quais são conhecidos na arte, p.ex., E. coli, e os transformantes bem sucedidos são

seleccionados através de um marcador apropriado, por exemplo, resistência a antibióticos e verificados para a correcta construção.

De forma a verificar as construções, as misturas de ligações são transformadas num hospedeiro apropriado, p.ex.,

E.coli HB101 e os transformantes bem sucedidos seleccionados por resistência a antibióticos ou outras marcas. Plasmideos dos transformantes sao então preparados de acordo com o método de Clewell et al. (1969), seguindo usualmente, amplificação de cloramfenicol (Clewell (1972)). 0 DNA é isolado e analisado, usualmente por análise dos enzimas de restrição e/ou por sequenciaçâo. A sequenciaçâo pode ser feita pelo método de desoxi de Sanger et al. (1977), como posteriormente descrito por Messing et al. (1980) ou pelo método de Maxam et al. (1980). Problemas com a compressão de bandas, como sâo por vezes observados nas regiões ricas em GC podem ser superados pelo uso de Tdeazoguanosina de acordo com Barr et al. (1986).

A transformação do vector contendo a sequência desejada no hospedeiro apropriado pode ser feita por qualquer método conhecido para a introdução de polinucleotideos numa célula hospedeira, incluindo, por exemplo, empacotammento do polinucleotideo num virus e transduçâo da célula hospedeira pelo virus, ou por absorção directa do polinucleotideo, 0 procedimento de transformação usado depende do hospedeiro a ser transformado. Por exemplo, na transformação in vivo, usando o virus vaccinia como agente transformante para polinucleotideos, codificando VP16 de HSV-2 está descrito infra., nos Exemplos. A transformação pode também ser acompanhada em sistemas in vitro. A transformação '4 bacteriana por absorçao directa, geralmente emprega tratamento com cloreto de cálcio ou rubidio (Cohen (1972); Sambrook (1989)). A transformação em leveduras por absorçao directa pode ser levada a cabo usando o método de Hinnen et al. (1978). Transformações em mamíferos por absorçao directa pode ser conduzida usando o método de precipitação de fosfato de cálcio, de Graham e Van der Eb (1978), ou as suas várias modificações conhecidas. Outros métodos para a introdução de polinucleotideo recombinantes em células, particularmente em células de mamíferos, os quais sao conhecidos na arte, incluem transfecçâo mediada por dextrano, transfecçâo mediada por fosfato de cálcio, transfecçao mediada por polibreno, fusão de protoplastos, electroporaçao, encapsulaçâo do(s) polinucleotideo(s) nos lipossomas, e microinjecçao directa no núcleo dos polinucleotideos.

De modo a obter expressão da sequências codificadoras desejadas, células hospedeiras são transformadas com polinucleotideos (os quais podem ser vectores de expressão), que estão compreendidas pelas sequências de controlo ligadas operavelmente às desejadas sequências de codificação. As sequências de controlo sao compatíveis com o designado hospedeiro. Entre os hospedeiros procarióticos, E. coli é o mais frequentemente usado. Sequências de controlo de expressão para procariontes incluem promotores, contendo opcionalmente porções operadoras, e sitios de ligaçao do ribossoma. Vectores de transferência compatíveis com os hospedeiros procarióticos são geralmente derivados de, por exemplo, pBR322, um· plasmideo contendo operões que conferem resistência à ampicilina e tetraciclina, e os vários vectores pCU, que também contêm ΰ

V.'

sequências que conferem marcadores de resistência antibiótica. Sequências promotoras podem naturalmente ocorrer, por exemplo, a β-lactamase (penicinilase) (Weissman (1981)), lactose (lac) (Chang et al. (1977)) e triptofano (trp) (Goeddel et al. (1980)) e sistema promotor derivado de lambda Pl e sitio de ligaçao do ribossoma do gene N (Shimatake et al. (1981)). Além do mais, promotores sintéticos que não ocorrem na natureza também funcionam como promotores bacterianos. Por exemplo, sequências de activaçao da transcrição de um promotor pode ser acompanhada por sequências operao de um outro promotor, criando um promotor hibrido sintético (p. ex., o promotor tac, que é derivado de sequências dos promotores trp e lac (De Boer et al. (1983)). Os sistemas anteriores sao particularmente compativeis com E. coli; se desejado, outros hospedeiros procarióticos tais como as estirpes de Bacillus ou Pseudomonas podem ser usados, com as sequências de controlo correspondentes.

Hospedeiros eucariotas incluem células de leveduras e de mamíferos em sistemas de cultura. Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces carlsbergensis sao as leveduras hospedeiras mais comummente usadas e sâo hospedeiras fúngicas convenientes. Vectores compativeis de leveduras transportam marcadores que permitem selecção de transformantes bem sucedidos ao conferir prototrofia a mutantes auxotróficos ou resistência a metais pesados às estirpes do tipo selvagem. Vectores compativeis de leveduras podem empregar 2 microns da origem da replicação (Broach et al. (1983)), a combinação de CEN3 e ARS1 -ou outros meios para assegurar a replicaçao, tais como sequências que resultarão na incorporação de um fragmento apropriado dentro do

genoma da célula hospedeira. Sequências de controlo para vectores de leveduras são conhecidas no ramo e incluem promotores para a sintese de enzimas glicoliticos (Hess et al. (1968)); por exemplo, álcool desidrogenase (ADH) (Publicação EPO No. 284044), enolase, glucocinase, glucose-6-fosfato isomerase, gliceraldeido3-fosfato desidrogenase (GAP ou GAPDH), hexocinase, fosfofrutocinase, glicerol-3-fosfato mutase e piruvato cinase (PyK) (Publicação EPO No. 329203). 0 gene de levedura PHO5, codificando a ácido fosfatase, também produz sequências promotoras úteis (Miyanohara et al. (1983)). Além do mais, promotores sintéticos que nao ocorrem na natureza também funcionam como promotores de leveduras. Por exemplo, as sequências activadoras a montante (UAS) de um promotor de levedura podem ser acompanhadas com a região de activação da transcrição de outro promotor de levedura, criando um promotor hibrido sintético. Exemplos de tais promotores híbridos incluem a sequência reguladora ADH ligada à região de activação da transcrição do GAP (Patentes Americanas Nos. 4.876.197 e 4.880.734). Outros exemplos de promotores hibridos incluem promotores que consistem de sequências reguladoras de quer ADH2, GAL4, GAL10, ou genes PHO5, combinadas com a região de activação transcripcional de um gene de enzima glicolitico tal como o GAP ou PyK (Publicação EPO No. 164556). Além disso, um promotor de levedura pode incluir promotores de ocorrência natural de uma origem que não de leveduras, que tenham a capacidade de se ligar à RNA polimerase da levedura para a apropriada iniciação da transcripçâo.

Outros elementos de controlo que podem ser incluídos no vector de expressão de levedura são terminadores (p.ex., de GAPDH e do gene da enolase (Holland (1981)) e sequências lideres. 0 fragmento da sequência lider codifica tipicamente vim peptideo de sinal compreendido por aminoácidos hidrofóbicos que dirigem a secreção da proteina a partir da célula. 0 DNA codificando as sequências de sinal adequadas pode ser derivado de genes para proteínas de leveduras secretadas, tal como o gene de levedura da invertase (Publicação EPO No. 12.873) e o gene do factor-a (Patente Americana No. 4.588.684). Alternativamente, lideres de origem que não a de levedura, tal como um lider interferâo, também providencia a secreção em leveduras (Publicação EPO No. 60057). Uma classe preferida de lideres de secreção são aqueles que empregam um fragmento do gene do factor-α de levedura, que contém tanto uma sequência de sinal pre como uma região pro. Os tipos de fragmentos de factor-α que podem ser empregues incluem o lider do factor-α pre-pro em todo o seu comprimento, tal como os lideres do factor-α truncados (Patentes Americanas Nos. 4.546.083 e 4.870.008; e Publicação EPO No. 324274). Lideres adicionais, empregam um fragmento lider do factor-α que providencia a secreção, incluem lideres do factor-α híbridos feitos com uma sequência pre de uma primeira levedura, mas uma região pro de um factor-α de uma segunda levedura (ver, por exemplo, P.C.T. WO 89/02463).

Vectores de expressão, quer replicões extracromossómicos ou vectores integrantes, têm sido desenvolvidos para transformação em muitas leveduras. Por exemplo, vectores de expressão têm sido desenvolvidos para Candida albicans (Kurtz et al. (1986)), Candida maltosa (Kunze et

al. (1985)), Hanzenula polymorpha (Gleeson et al. (1986)), Kluyveromyces fragilis (Das et al. (1984)), Kluyveromyces lactis (De Louvencourt et al. (1983)), Pichia guillerimondii (Kunze et al. (1985)), Pichia pastoris (Cregg et al. (1985); Patentes Americanas Nos. 4.837.148 e 4.929.555), Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse (1981)) e Yarrowia lipolytica (Davidow et al. (1985)).

Linhas de células de mamiferos disponíveis como hospedeiros para expressão sao conhecidos na arte e incluem muitas linhas de células imortalizadas disponíveis do American Type Culture Collection (ATCC), incluindo, por exemplo, células HeLa, células de ovário de hamster chinês (CHO), células de rim de hamster bebé, células de macaco COS e um número de outras linhas de células. Promotores adequados para células de mamiferos sao também conhecidos na arte e incluem promotores virais tais como o Virus 40 de Simio (SV40), virus do sarcoma Rous (RSV), adenovirus (ADV) e virus do papiloma de bovinos (BPV) (ver, Sambrook (1989) para exemplos de promotores adequados). Células de mamiferos podem também requerer sequências terminadoras e sequências de adiçao poly A; sequências aumentadoras que incrementam a expressão podem também ser incluídas e sequências que causem amplificação do gene podem também ser desejáveis. Estas sequências sao conhecidas na arte.

Vectores adequados para a replicaçao em células de mamiferos sao conhecidos na arte e podem incluir replicões virais, ou sequências que assegurem a integração das · sequências apropriadas codificando os polipeptideos desejados no genoma hospedeiro.

Um vector que é usado para expressar DNA estranho, o qual pode ser usado na preparação da vacina, é o virus Vaccinia. Neste caso, o DNA heterólogo é inserido no genoma Vaccinia. Técnicas para a inserção do DNA estranho no genoma do virus vaccinia sâo conhecidas na arte, e utilizam por exemplo, recombinaçâo homóloga. A inserção do DNA heterólogo está geralmente num gene que nâo é essencial na natureza, por exemplo, o gene timidina cinase (tk), que também providencia um marcador seleccionável. Vectores plasmidicos que facilitam grandemente a construção de viroses recombinantes têm sido descritos, (ver, por exemplo, Mackett et al. (1984), Chakrabarti et al. (1985); Moss (1987)). A expressão dos polipeptideos desejados, constituídos pelas regiOes imunogénicas, ocorre depois em células ou indivíduos que são infectados e/ou imunizados com o recombinante do virus da vaccinia vivo.

Outros sistemas para expressão de polipeptideos incluem células de insectos e vectores adequados para uso nestas células. Estes sistemas sâo conhecidos na arte, e incluem, por exemplo, vectores de transferência de expressão de insecto derivados do vírus da polihedrose nuclear do baculovirus Autographa californica, (AcNPV), que é um vector de expressão virai, auxiliador independente. Vectores de expressão derivados deste sistema usam normalmente o promotor virai forte do gene da poliedrina para conduzir a expressão dos genes heterólogos. Frequentemente, o vector de transferência mais vulgarmente usado para introduzir genes estranhos no AcNPV é pAc373, mostrado na Fig. 4. Muitos outros vectores, conhecidos dos peritos no ramo têm sido também designados para expressão melhorada. Estes

incluem, por exemplo, pVL985 (que altera o codão de inicio da polihedrina de ATG a ATT, e que introduz sitios de clonagem BamHI, 32 pb a jusante de ATT; ver Luckow e Summers (1989)). Vectores de transferência de AcNPV para elevado nivel de expressão de proteinas estranhas não fundidas, são mostrados na Fig. 4. Na Figura, os números mostrados, referem-se a posiçOes nas quais o gene nativo, onde o A do codão ATG é mais um. A Fig. 4, também mostra o mapa da endonuclease de restrição do vector de transferência pAc373. O mapa mostra que um único sitio BamHI é localizado a seguir à posiçao-8, no que respeito à tradução do codão de iniciação ATG do gene da polihedrina. Nao existem sitios de clivagem para Smal, PstI, Bgll, Xbal ou SstI. Uma boa expressão de proteinas estranhas não fundidas, normalmente requer genes estranhos que têm idealmente uma pequena sequência lider contendo sinais de iniciação da tradução adequados, que precedem um sinal de iniciação ATG. 0 plasmideo também contém o sinal da poliadenilaçâo da polihedrina e o gene de resistência à ampicilina resistente (amp) e origina a replicaçao e selecçao na E. coli.

Métodos para a introdução de DNA heterólogo no sitio desejado do baculovirus, são conhecidos na arte, (ver Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555; Ju et al. (1987); Smith et al. (1983); e Luckow e Summers (1989)). Por exemplo, a inserção pode ser num gene tal como no gene da polihedrina, por recombinação homóloga; a inserção também pode ser num sitio enzimático de restrição produzido no gene baculovirus desejado. As sequências inseridas podem ser as que codificam todos ou alguns segmentos de VP16 do HSV e/ou

ί;

glicoproteina do HSV.

Os sinais para modificações pós-translaccionais, tais como clivagem do peptideo de sinal, clivagem proteolitica, e fosforilação, parecem ser reconhecidos por células de insectos. Os sinais requeridos para secreção e acumulação nuclear também parecem ser conservados entre as células de invertebrados e vertebrados. Exemplos de sequências de sinal a partir de células de vertebrados que sao eficazes em células de invertebrados sao conhecidas na arte, por exemplo, o sinal da interleuquina 2 humana (IL2_S) que é um sinal para transportar para fora se a célula é reconhecida e removida apropriadamente em células de insecto.

E normalmente desejável que os polipeptídeos preparados, usando as células hospedeiras acima referidas e vectores, sejam polipeptídeos de fusão. Tal como os polipeptídeos de nao-fusao, os polipeptídeos de fusão podem permanecer intracelulares depois da expressão. Alternativamente, as proteinas de fusão podem também ser secretadas a partir da célula para o meio de crescimento, se elas forem compreendidas por um fragmento de uma sequência lider. Preferivelmente, existem sitios de processamento, entre o fragmento lider e o remanescente do gene estranho, que podem ser clivados quer in vivo, quer in vitro.

Em situações em que o polipeptídeo sintetisado é configurado correctamente por forma a prover o epitopo correcto, mas é muito pequeno para ser imunogénico, o polipeptídeo pode ser ligado a um transportador adequado. Um número de técnicas para obter tal ligação são conhecidas na arte, incluindo a formação de ligaçOes dissulfureto usando N-succinamidil-3-(2-piridil-tio) propionato (SPDP) e succinamidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilato (SMCC) (se no peptideo faltar um grupo sulfidrilo, isto pode ser conseguido por adiçao de um residuo de cisteina). Estes reagentes formam ligaçOes disulfureto entre eles próprios, e o peptideo cisteina consiste numa proteina e numa ligação amida através do €-amino da lisina, ou outro grupo aminoácido livre em outros aminoácidos. E conhecida uma variedade de tais agentes formadores de dissulfito/amido. Ver, por exemplo, Immum. Rev. (1982) 62:185. Outros agentes acopuladores bifuncionais para um tioéter em vez de ligaçOes de dissulfureto. Muitos destes agentes formadores tioéter estão comercialmente disponíveis e incluem ésteres reactivos do ácido 6maleimidocaproico, ácido 2-bromoacético, ácido 2-iodoacético, ácido 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilico, e similares. Os grupos carboxilicos podem ser activados por combinação com succinamida ou ácido l-hidroxilo-2—nitro-4sulfónico ou sal de sódio. Métodos adicionais de acopulamento de antigenes, empregam o sistema rotavirus/peptideo de ligação descrito em Publicação E.P.O. No. 259.149. A lista que se segue, não pretende ser exaustiva, e modificaçOes dos compostos designados podem ser claramente usadas.

Pode ser usado qualquer transportador que não induza ele próprio a produção de anticorpos nocivos ao hospedeiro. Transportadores adequados são tipicamente grandes, macromoléculas lentamente metabolizáveis, tais como proteínas; polissacarideos, tais como a sefarose funcionalizada de latex, agarose, celulose, esferas de celulose e similares; aminoácidos poliméricos tais como o ácido poliglutâmico, polilisina, e similares; copolimeros

de aminoácidos; e partículas inactivas de virus (ver infra.). Substratos de proteínas especialmente úteis, são soro de albuminas, hemocianina de ligação especifica, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, toxoide de tétano, e outras proteínas conhecidas dos peritos no ramo.

A imunogenic idade dos epitopos de VP16 de HSV, particularmente de VP16 de HSV-2, e de glicoproteinas de HSV, particularmente de gB de HSV e/ou gD de HSV, podem também ser incrementadas por sua preparação em sistemas eucarióticos fundidos ou agregados com proteínas que formam as partículas, tais como, por exemplo, as associadas com a superfície do antigene da hepatite B. Ver, p.ex., Patente Americana No. 4.722.840. O constructo, no qual a VP16 de HSV ou epitopo de glicoproteina está ligado directamente às sequências codificadoras de proteína formadoras de partículas, produz híbridos que são imunogénicos em relação ao epitopo de HSV. Além disso, todos os vectores preparados incluem epitopos específicos ao HBV, possuindo vários graus de imunogenecidade, tal como, por exemplo, o pêptido pre-S. Consequentemente, as partículas construídas a partir da proteína que forma a partícula, que incluem as sequências de HSV, são imunogénicas em relação ao HSV e ao HBV.

A superfície do antigene da hepatite (HBSAg) tem sido mostrada como sendo formada e agregada por partículas em S. cerevisiae (Valenzuela et al. (1982)), assim como, por exemplo, em células de mamíferos (Valenzuela et al. (1984). A formação de tais partículas tem mostrado que aumenta a imunogenecidade da subunidade monomérica. Os constructos podem também incluir o epitopo imunodominante de HBSAg, compreendendo os 55 aminoácidos da região da pré-superficie (pre-S) (Neurath et al. (1984)). Constructos da partícula pré-S-HBSAg, expressáveis em leveduras, sao revelados na Publicação E.P.O. No. 174.444; hibridos incluindo sequências virais heterólogas para expressão de levedura sao revelados na Publicação E.P.O. No. 175.261. Estes constructos podem também ser expressos em células de mamíferos, tais como células CHO, usando um vector SV40-dihidrofolato redutase (Michelle et al. (1984)).

Além disso, porções de sequências codificadoras de proteína, formadoras de partículas, podem ser substituídas com codOes que codificam uma VP16 de HSV ou um epitopo de glicoproteina de HSV. Nesta substituição, as regiOes que nao sao requeridas para mediar a agregação de unidades para formar partículas imunogénicas em leveduras ou mamíferos podem ser delectadas, eliminando, assim, sitios antigénicos de HBV adicionais da competição com o(s) epitopo(s) de HSV.

A preparaçao de vacinas que contêm um(ns) polipeptídeo(s) imunogénico como um(ns) ingrediente(s) activo(s) é conhecida dos peritos no ramo. Tipicamente, tais vacinas sao preparadas como injecções, tanto como em soluções liquidas ou suspensões; formas sólidas adequadas para solução em ou suspensão em liquido antes da injecção podem também ser preparadas. A preparaçao pode também ser emulsionada, ou o(s) polipeptideo(s) encapsulados em lipossomas. Os ingredientes imunogénicos activos sao muitas vezes misturados com excipientes que sao farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo. Excipientes aceitáveis são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, ou similares e suas combinações. Em adição, se desejado, a vacina pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes emulsionantes ou agentes humidificantes, agentes de tampão de pH, e/ou adjuvantes que aumentam a eficácia da vacina. Exemplos de adjuvantes que podem ser eficazes incluem, mas não estão limitados as hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-trionil— D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-Disoglutamina (CGP 11637, referido como nor-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2- (1' -2' -dipalmitoil-snglicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, referido como MTP-PE), e RIBI, que contém trôs componentes extraidos de uma bactéria, lipido A monofosforil, dimicolato de trialose e esqueleto da parede celular (MPL + TDM + CWS), numa emulsão 2% de esqualeno/Tween 80. A eficiência de um adjuvante pode ser determinada por medição da quantidade de anticorpos dirigida contra um polipeptideo imunogénico contendo um epitopo de HSVVP16 de HSV, e/ou epitopo de glicoproteina de HSV, e os anticorpos que resultam da administração deste polipeptideo em vacinas são também constituídos por vários adjuvantes.

As proteinas podem ser formuladas numa vacina como formas neutras ou salinas. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adição ácida (formados com grupos de amino livres do peptideo) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos hidroclórico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, rnaleico, e similares. Sais formados com grupos carboxílicos livres podem

também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónia, cálcio ou férrico, e de bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2etilamino etanol, histidina, procaina, e similares.

As vacinas são convencionalmente administradas parenteralmente por injecção, por exemplo, tanto subcutâneamente como intramuscularmente. Formulações adicionais que são adequadas para outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações orais. Para supositórios, ligantes e transportadores tradicionais podem incluir, por exemplo, glicóis de polialquileno ou triglicéridos; tais supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo o ingrediente activo numa gama de 0.5 a 10%, preferivelmente la 2%. Formulações orais incluem tais excipientes, normalmente empregues, como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, e similares. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, tabletes, comprimidos, cápsulas, formulações de libertação controlada, ou pôs e contendo 10-95% de ingrediente activo, preferivelmente, 25-70%.

Em adição ao acima referido, também é possível preparar vacinas de microorganismos vivos atenuados, que expressam um ou mais polipeptideos recombinantes, compreendidos de VP16 de HSV e/ou epitopos de glicoproteina de HSV. Microorganismos atenuados adequados, sâo conhecidos na arte e incluem, por exemplo, viroses (p.ex., virus vaccinia) bem como bactérias.

As vacinas são administradas de uma maneira compatível com a formulação doseada, e em tais quantidades que serão

profilaticamente e/ou terapeuticamente eficazes. A quantidade a ser administrada, que está geralmente numa gama de 5 gg a 250 gg do antigene por dose, depende do sujeito a ser tratado e capacidade do sujeito; sistemas imunes para sintetisar anticorpos, e o grau de protecção desejado. Quantidades precisas de ingrediente activo requerido para ser administrado podem depender do julgamento do médico e podem ser particulares a cada individuo.

A vacina pode ser dada num esquema de dose simples, ou, preferivelmente, num esquema de dose dupla. Um esquema de dose múltipla é aquele em que a primeira dose de vacinação pode ser com 1-10 doses separadas, seguida por outras doses dadas em subsequentes intervalos de tempo requeridos para manter e/ou reforçar a resposta imune, por exemplo, de 1 a 4 meses para uma segunda dose, e se necessário, uma dose(s) subsequente após vários meses. 0 regime de dosagem poderá também, pelo menos em parte, ser determinado pela necessidade do individuo e depender da opinião do médico.

Além disso, a vacina contendo o polipeptideo, compreendido por um epitopo imunogénico de VP16 de HSV, pode ser administrada juntamente com outro agente imunoregulador, por exemplo, imunoglobulinas.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Isolamento e Sequenciação de um Gene Codificando VP16 de HSV-2 fragmento EcoRI L da cadeia G de HSV-2 foi inserido no pUC19 para produzir pH2G512, a fonte do polinucleotideo que codifica VP16 de HSV-2. A sequência de codificação do polinucleotideo de HSV-2 foi identificada por análise Southern blot, utilizando como sonda um segmento de pRB3458, a qual contém a sequência que codifica VP16 de HSV-1. Os plasmideos pH2G512 e pRB3458 foram obtidos pelo Dr. P. Pellett (Centro de Controlo de Doenças, Atlanta, Da.) e por Dr. B. Roizman (Universidade de Chicago, Chicago, 111.), respectivamente. A construção de pRB3458 é descrita em Pellett et al. (1985).

Mais especificamente, o polinucleotideo de codificação de VP16 de HSV-2, pH2G512, foi digerido com EcoRI, e EcoRI e

Saci, SacII, BamHI, Ncol, e Smal, respectivamente. Os fragmentos do plasmideo digerido foram separados por electroforese em gel de agarose a 1%, em solução tampão de triacetato. Depois da electroforese, o DNA no gel ficou desnaturado em meio alcalino, neutralizado, e transferido para uma membrana de Ecran Positivo de Gene (Dupont NEN), usando o protocolo de transferência descrito em Sambrook et al. (1989). 0 DNA na membrana foi hibridizado com uma sonda durante a noite, usando as instruções do fabricante; a sonda era um fragmento traduzido por corte,

EcoRI-HindIII de 2,9 Kb, isolado a partir de pRB3458. Os resultados da hibridização mostraram que a VP16 de HSV-2 é codificada num fragmento EcoRI-SacI de 3.5 Kb de pH2G512.

Subsequentemente, o fragmento EcoRI-SacI que codifica a VP16 foi isolado em 1% de gel de agarose, e extraido do gel usando Gene

Clean (Bio 101). A sequenciação do fragmento foi realizada pelo * método do dideoxi. Desde que o DNA de HSV seja rico em G-C (i.e., > 70% G—C), sequências em áreas de compressão nos géis sequenciais foram resolvidas por sequenciação com polimerase Tac

a 65 °C. A sequência da cadeia codificadora do fragmento, e os aminoácidos ai codificados, sao mostrados na Fig. 3. Na figura, o primeiro nucleotideo do suposto codâo da metionina de iniciação é assinalado por uma seta.

Homologias entre as supostas sequências de aminoácidos para VP16 de HSV-1 e VP16 de HSV-2 s3o mostradas na Fig. 2.

Exemplo 2

Construção de um Vector de Expressão do Virus Vaccinia

Compreendido por um Sequência Codificadora de VP16 de HSV-2

Um vector vaccinia, compreendido por uma sequência codificadora de VP16 de HSV-2, foi construído como se segue. Inicialmente, a sequência codificadora de VP16 foi subclonada no vector de expressão vaccinia pSCll, para gerar o plasmideo pHS225 (um mapa parcial disto é mostrado na Fig. 5). 0 vector pSCll foi obtido a partir do Dr. Bernard Moss, Instituto Nacional de Saúde, Bethesda, Maryland. Antes da introdução da sequência de codificação de VP16 de HSV-2, o vector pSCll foi modificado por delecção do sitio HindIII no pSCll por digestão com HindIII, seguido de tratamento com o fragmento Klenow de DNA polimerase I e ligaçao. 0 vector foi depois modificado introduzindo no sitio Smal um poli-ligador contendo sitios de enzimas de restrição para Smal, Kpnl, BglII, e HindIII. 0 fragmento contendo a VP16 foi isolado como um fragmento Xhol-Sphl de 201 Kb a partir de pH2G512. 0 sitio Xho foi preenchido usando o fragmento Klenow do DNA polimerase I, e o sitio Sphl foi cortado usando DNA polimerase de T4. O fragmento com a extremidade abrupta foi depois ligado no sitio Smal do pSCll modificado. Vectores

contendo a sequência modificadora de VP16 foram obtidos por clonagem; eles foram transformados em DH5a e foram seleccionados transformantes usando selecçâo Ap ; clones positivos foram seleccionados com base na presença do fragmento de tamanho apropriado depois da análise do enzima de restrição. Um dos clones positivos foi designado pHS225. Um mapa mostrando algumas das características significativas de pHS225 é mostrado na Fig. 5.

A fim de obter um vector recombinante de virus vaccinia, que fosse adequado para expressão de VP16 em indivíduos, a sequência codificadora de VP16 do pHS225 foi inserida nos locus TK da cadeia da estirpe selvagem vaccinia, WR, por recombinaçâo usando a transfecçSo Lipofectina, protocolo descrito pelo fabricante de Lipofectina (Laboratórios BRL). Viroses recombinantes TK^- foram isoladas por selecçâo BUDR e purificadas por plaqueamento, usando o protocolo de Mackett et al. (1987). Um clone recombinante vaccinia/VP16 foi seleccionado por hibridizaçao dot blot do DNA. A expressão de VP16 foi verificada por Western Blot e radioimunoprecipitaçao, e o clone recombinante foi subsequentemente purificado. Os detalhes deste procedimento sao como se segue.

A fim de obter recombinantes de pHS225 com WR vaccinia, monocamadas confluentes de células BSC40 em frascos T—25 foram infectadas com WR numa multiplicidade de infecção (moi) de .05; a adsorçao foi executada por duas horas à temperatura ambiente com agitaçao. Três soluções de pHS225 foram preparadas com Lipofectina (Laboratórios BRL) como se segue; 50 μΐ de uma solução de DNA, contendo tanto 1, 10 ou 100 μg de pHS225 em água,

foram misturados com 30 gg de Lipofectina e mais 20 gl de água. Deixou-se as soluçOes incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos. As células infectadas foram lavadas duas vezes em meio livre de soro; 3 ml de meio livre de soro foram adicionados a cada frasco; depois 100 gl de um complexo de DNA-lipofectina foram adicionados gota-a-gota a cada frasco com agitaçao. As transfecçoes foram incubadas a 37°C sob uma atmosfera contendo 7% de C02 por 5 horas. Depois, 3 ml de DME contendo 20% de soro fetal de vitelo (FCS) foi adicionado a cada frasco (a concentração final de FCS foi de 10%), e as transfecçoes foram incubadas durante 48-72 horas. Após a incubação, o virus recombinante foi colhido por raspagem das células no meio. 0 virus foi libertado das células por congelamento e descongelamento das mesmas, por três vezes.

Viroses recombinantes contendo VP16 foram seleccionadas usando a técnica de Mackett et al. (1987). Resumidamente, o stock de virus gerado por cada transfecçao foi descongelado, sonicado e incubado durante 30 min. a 37°C na presença de 0,1 do volume de 0,25% de tripsina. Monocamadas de células de TK-143 foram infectadas com uma série de 10 diluições do stock com tripsina. Após adsorção as células foram cobertas com DME contendo 1% de agarose de baixo ponto de fusSo, 5% de FCS e 25 gg de BUDR (Sigma Chemical Co.). 48 horas após a infecçao (p.i.), as células foram coradas com 1% de agarose contendo 0.1% de vermelho neutro. Após 3 a 5 horas as placas virais foram visualizadas como halos límpidos no tapete celular. As placas foram repicadas e sujeitas a purificação em placa usando BUDR por mais duas vezes.

A verificação de que os recombinantes seleccionados continham a sequência de codificação de VP16 foi acompanhada por hibridização dot blot. A técnica dot blot estava essencialmente de acordo com a de Mackett et al. (1987), excepto que a detecção foi feita com um fragmento que codifica VP16. Resumidamente, as células infectadas com os supostos recombinantes foram marcadas por pontos de nitrocelulose usando um dot blot, múltiplas vezes, e foram lisadas e desnaturadas. Os filtros foram cozidos a 80°C in vacuo por 2 horas, tendo sido tratados antes da hibridização com uma solução contendo 60% de formamida, 1% de dodecil sulfato de sódio (SDS), NaCl 1M, 10% de sulfato de dextrano e

32 hibridizadas com VP16 marcada com 10 cpm/ml de [ P]. As hibridizações foram levadas a cabo durante a noite a 42°C numa solução contendo 60% de formamida, 1% de dodecil sulfato de sódio (SDS), NaCl 1M, 10% de sulfato de dextrano, 10 mg/ml de DNA de esperma de salmão, 10 mg/ml de DNA poli A⁺, 50 ml/ml de tRNA de levedura. Após a hibridização, os filtros foram lavados 4 vezes, com 2 x SSC durante 5 min. à temperatura ambiente, uma vez com 2 x SSC, 0.1% de SDS durante 30 min. a 65°C, e uma vez com 0.1 x ( SSC, 0.1% de SDS durante 30 min. a 65°C. Os resultados da hibridização mostraram que 6 dos 12 isolados eram positivos para a sequência de codificação de VP16 de HSV-2, e que 2 dos 12 isolados eram fortemente positivos. Seis isolados, preparados tal como acima descrito, foram escolhidos para análise posterior da expressão de VP16.

Exemplo 3

Expressão de VP16 a partir de Vectores Recombinantes de w-VP16

A expressão de VP16 a partir dos clones w-VP16 descritos no Exemplo 2 foi detectada por radioimunoprecipitação 35 de lisado de célula infectada marcada com [ S], usando titulo positivo elevado de soros humanos seguido de electroforese de gel

SDS-poliacrilamida dos produtos precipitados e a subsequente 35 visualização de VP16 marcado com [ S] por autoradiografia. Mais especificamente, as amostras foram sujeitas a electroforese em (_'/ 8%, com géis de poliacrilamida de espessura de 1,5 mm (Novex

Corp.) durante 90 min. a 40 mA. Após a electroforese, os géis foram fixados, incrementados e secos antes de serem expostos ao filme. O peso molecular aparente do recombinante de VP16 (Vmw65) é de 65 KD. A identidade de VP16 foi confirmada pela radioimunoprecipitação da proteina do HSV-2 de células Vero infectadas, usando o anticorpo monoclonal especifico de VP16, LP1, para a precipitação. 0 LP1, que está descrito em MacLean et al. (1982), foi obtido por A. Minson, da Universidade de Cambridge. 0 produto precipitado, marcado a partir de células í

infectadas de W-VP16, co-migraram durante a electroforese com o produto precipitado marcado a partir de células Vero. Esta comigraçâo durante a electroforese de VP16 expressado em células Vero, e a partir de células recombinantes do virus da vacciniaVP16 (W-VP160), indicam que que o produto de W-VP16 é de comprimento total.

Não interessa que o anticorpo LP1 reconheça o VP16 expressado nas células vv-VP16, enquanto reconhece o VP16 expressado em células Vero infectadas por HSV. E possivel que a *

mudança no reconhecimento do anticorpo no produto W-VP16 resulte de uma falta de fosforilação do polipeptídeo produzido recombinantemente, ou de outras diferenças no processamento da proteína, desde que o virus vaccinia replique no citoplasma da célula infectada.

Exemplo 4

Imunogenicidade e Efeito de Protecção da Imunização com VP16 ou aB2

A fim de comparar o efeito da imunização com VP16 e com gB2, no que diz respeito à sua imunogenicidade e protecção contra a doença causada por HSV-2, recombinantes do virus vaccinia codificando cada polipeptídeo, foram usados para imunizar porquinhos da índia. 0 recombinante vaccinia usado, que contém o gene que codifica o VP16 foi o descrito no Exemplo 2, i.e., wVP16 (também chamado W-VP16-TK^-). 0 recombinante gB foi preparado por subclonagem de um polinucleotideo que codifica gB2 num vector pUC13. 0 polinucleotideo que codifica gB2, que era um fragmento HindIII-BamHI de 3.2 Kb, contendo nucleotideos da posição -136 a 3088, como se mostra na Fig. 4 em WO88/02634; a última figura é aqui incluída como Fig. 6. Características significativas do vector resultante, pHS218, sao mostradas na Fig.7. A fim de produzir o vector de expressão do virus vaccinia que codifica gB2, um fragmento HindIII-BamHI de 3.2 Kb excisado de pHS218, foi cortado com as extremidades abruptas e ligado a um sitio HincII do pCB07 produzindo o vector pVACC-gB2”. Características significativas dos vectores pCB07 e pVACC-gB2 s3o mostradas na Fig. 7 e 9, respectivamente. Similarmente ao constructo W-VP16, este coloca o promotor da vaccinia, 7.5, a montante do gene; as sequências flanqueadoras de timidina cinase (TK) providenciam a recombinaçao de um virus de estirpe selvagem neste locus. A construção do pVACC-gB2 a partir de pHS218 foi realizada pelo Dr. Ian Ramshaw, da Escola de Investigação Médica John Curthin, da Universidade Nacional Australiana, Canberra, Austrália. Os procedimentos para a produção do vector de expressão do vaccinia, w-gB2, a partir do virus vaccinia da estirpe selvagem foram similares àqueles usados para a produção de W-VP16, excepto que a recombinaçao foi feita com pVACC-gB2, e a selecção para clones positivos realizou-se por hibridizaçâo com um fragmento marcado radioactivamente que codifica gB2.

Porquinhos da índia fêmeas foram imunizados, quer intradermalmente (por sacarificação da pele abaixo da margem intercostal direita com uma agulha bifurcada), quer interperitonialmente, ou intravenosamente (numa veia do ouvido usando uma agulha de calibre 30). 0 protocolo para cada um dos grupos em estudo é mostrado na tabela seguinte.

Tabela

Imunização com w-gB2 ou W-VP16

Grupo ia de Imunização munizaçOes I & II

I.D.

I.P.

I.V.

I.D.

I.P.

I.V.

Os animais foram imunizados duas vezes com um intervalo de um mês entre cada imunização. Tiraram-se amostras de sangue aos animais, para determinar os anticorpos neutralizadores específicos de HSV e de vaccinia, a 3 a 6 semanas depois da segunda imunização. Os animais do grupo 1 ao 6 foram inoculados 5 com 3x10 pfu de HSV-2 da estirpe MS; a inoculação foi no dia 64, 6 semanas depois do segundo reforço de imunização. A inoculação de HSV-2 foi intravaginal. Os animais foram registados para a doença aguda nos primeiros 14 dias após inoculação.

Para poder medir a imunogenicidade de VP16 e de gB2, os titulos de neutralização dos anticorpos resultantes das imunizações, tanto o complemento dependente como o independente, foram determinados como se segue. Uma suspensão de 150 μΐ de células Vero (Ι.ΙχΙΟθ células por 15 ml de meio contendo 10% soro fetal de vitelo (FCS)) foram inoculadas em duas placas de fundo plano de 96 poços (Microtest III placas de cultura de tecido da Falcon) e incubadas durante a noite numa incubadora de CO2 a 37°C. No dia seguinte prepararam-se amostras numa terceira placa de 96 poços, estando os conteúdos do poço como se mostra na Fig. 10. Na figura, o meio, era meio de cultura de tecido DME-H21, soro fetal de vitelo inativado por calor (Hl FCS) foi preparado por incubação de FCS (Hyclone Corp.) a 56°C por 30 min. 0 complemento de porquinhos da índia estava numa diluição de 1:125 de complemento de porquinhos da índia rehidratado (Gibco Corp., preparado de acordo com as instruções do fabricante). Foi também preparada uma quarta placa, a qual era análoga à terceira placa mas sem o complemento porquinho da índia. As placas foram incubadas por 2 horas. A absorção e replicação virais foram conseguidas por aspiração dos meios de cultura a partir das monocamadas de células das placas 1 e 2. 0 conteúdo dos poços correspondentes nas placas 3 e 4 foi transferido para as placas 1 e 2, respectivamente, e estas foram mantidas na incubadora de CO2 a 37°C durante 3 dias. No sentido de detectar a citólise da célula devido à replicação virai, o meio de cultura foi aspirado das células, apôs o terceiro dia de incubação, e foram adicionados a cada poço ΙΟΟμΙ de uma solução salina tamponizada com fosfato, contendo 10% de soluçSo de formaldeído, e 0,09% de violeta cristal. As placas foram entSo incubadas durante 15 min. à temperatura ambiente, após o que se removeu a soluçSo de violeta cristal e os poços lavados três vezes com água e as placas secas ao ar. Os titulos virais foram respectivamente 3(2ⁿ) e 2(2ⁿ) para as amostras dependentes e independentes de complemento, respectivamente; n é igual à diluição de soro que inibe a citólise da monocamada de células em 50%.

Os resultados da titulação dos anticorpos, expressos como os titulos neutralizantes médios encontrados nas amostras de sangue 1 e 2, para titulos de anticorpos neutralizantes, dependentes de complemento específicos de HSV, são mostrados na Fig. 11. Como se pode ver na figura, em três semanas (amostra de sangue 1), a administração de I.V. de W-VP16 aumentou os anticorpos neutralizantes dependentes de complemento aproximadamente cinco vezes mais do que a w-gB2.

Os titulos de anticorpos neutralizantes independentes de complemento específicos de HSV, para a Sangria 1, são mostrados na seguinte tabela. Como se pode ver na tabela, a administração I.V. de w—VP16 resultou em titulos de anticorpos que excederam os titulos específicos de HSV induzidos pelo recombinante vv-gB2 em >10 vezes. A neutralização foi determinada como a redução em 50% na formação de placas. Os animais imunizados com vaccinia não recombinante da estirpe selvagem, WR, n3o apresentam quantidades mensuráveis de anticorpos neutralizantes.

Tabela

Titulos de Anticorpos Neutralizantes Independentes de Complemento

Específicos de HSV

Grupo	Vacina	Administração	Titulo 2·^*
1	w-gB2	I.D.	32 + 0
2	w-gB2	I.P.	32 + 0
3	w-gB2	I.V.	32 + 0
4	W-VP16	I.D.	32 ± 0
5	W-VP16	I.P.	40 + 8
6	W-VP16	I.V.	565 + 53
* titulo	2β significa o	titulo médio após 3 semanas.
	0 efeito da	imunização com W-VP16 e	w-gB2 na
protecção, como reflectida em lesões, e a severidade de doenças
agudas,	foi também comparado. 0 decurso clinico	da infecção
genital	primária por	HSV-2 é normalmente como se segue. Em
primeiro	lugar, aparecem lesões na genitália externa	de todos os
animais,	três a quatro	dias após a inoculação virai	. · As lesões
começam	como vesículas discretas, com uma base eritematosa e

rápidamente evoluem para lesões vesiculo-ulcerativas múltiplas em

5-8 dias. Entre os dias 8-10, as lesões ulcerativas sao cobertas por crostas hemorrágicas. A caida das crostas acompanhada de cura completa da pele genital externa ocorre aos 13-15 dias. A maioria dos animais desenvolvem retenção urinária entre o dia 5 e o dia 10; no entanto, este sintoma é resolvido à volta dos 10-15 dias. Cerca dos dias 7-10, pode ser evidente paralisia nos membros posteriores em 0 a 20% dos animais; este sintoma desaparece à volta dos 15-20 dias. A infecçâo e as lesões genitais externas ocorrem em 80-100% dos animais inoculados, com taxas de morte de 0-50%. A graduação das lesões para os estudos foi estabelecida de acordo com a seguinte escala:

0.5 = vermelhidão, inchaço;

1.0 = 1-2 vesiculas, ou 1 vesicula acompanhada de vermelhidão e inchaço;

1.5 = 2-4 pequenas vesiculas (diâmetro 1-2 mm) ou 2 vesiculas acompanhadas por vermelhidão e inchaço;

2.0 = 4-6 vesiculas;

2.5 = 4-6 vesiculas grandes (diâmetro > 2mm) com vermelhidão e inchaço;

3.0 = mais do que 6 grandes vesiculas;

3.5 = mais do que 6 grandes vesiculas acompanhadas por pequenas vesiculas adicionais;

4.0 = vesiculas confluentes, cobrindo mais do que metade do perineu;

4.5 = vesiculas extremas com ulceração.

Os resultados, comparando os efeitos da imunização por

W-VP16 e por vv-gB2 na protecção contra a doença, indicados pela

ocorrência e severidade das lesOes, bem como pela mortalidade, podem ser vistos na tabela seguinte. No estudo, todos os animais desenvolveram lesOes; o score de lesões para o grupo de controlo n3o imunizado foi de 3.10.

Tabela

Efeito da imunização com w-gB2 ou W-VP16 no decurso clinico da infecçao genital aguda por HSV-2

	Grupe	> Vacina	Via	Score das	Protecção Mortalidade
rí>·				lesOes
	1	w-gB2	I.D.	1.89+.19	39%	1/4
	2	w-gB2	I.P.	1.33+.15	57%	0
	3	w-gB2	I.V.	1.29+.13	58%	0
	4	W-VP16	I.D.	2.85+.16	8%	1/4
	5	W-VP16	I.P.	2.33+.17	25%	0
	6	W-VP16	I.V.	1.62+.14	48%	0
		A	variação	da protecção ao	longo do tempo	com as

diferentes administrações da imunização com vv-gB2 e vv-VP16 sao mostradas na Fig.12 e Fig.13, respectivamente.

Exemplo 5

Imunogenicidade e Efeito Protector da Imunização com VP16 e gB2

A imunogenicidade e o efeito protector do vv-VP16 e vvgB2, contra a doença provocada por HSV-2, foram examinados usando um protocolo semelhante ao do Exemplo 4, excepto em que a administração de vacinas foi I.V., e a dose com a estirpe MS de

HSV-2 inoculada foi de 6x10 pfu. As vacinas foram administradas a quatro grupos, como se segue: grupo 1, sem tratamento, grupo 2, W-VP16 + vv-gB2; grupo 3, apenas w-gB2; e grupo 4, apenas vvVP16.

Os resultados do estudo na produção de titulos de anticorpos neutralizantes dependentes de complemento são mostrados na tabela que se segue. No estudo, a neutralização foi determinada como sendo a redução em 50% da capacidade de formação de placas. Os animais imunizados com vaccinia WR não exibem quantidades mensuráveis de anticorpos neutralizantes (<16). Estes resultados indicam que, três semanas após a imunização, o tratamento com vacinas, constituído simultaneamente por W-VP16 e w-gB2, causou maiores titulos de anticorpos neutralizantes do que os tratamentos com apenas W-VP16 ou w-gB2; à sexta semana, a imunização com vv-VP16 parecia quase equivalente à com W-VP16 e w-gB2, no que respeita aos titulos de anticorpos.

Tabela

Efeitos	de W-VP16 e	w-gB2 nos Titulos	de Anticorpos
	Neutralizantes	Dependentes de Complemento
grupo	vacina	Titulo Médio (3 semanas)	Titulo Médio l6 semanas)
1	nenhuma	13+6	14+2
2	W-VP16 + w-gB2	: 590+57	500+61
3	vv-gB2	113+12	224+34
4	W-VP16	213+39	6-15 + 61

efeito protector da vacina combinada, constituída pelos vv-VP16 e w-gB2, relativamente às vacinas subunitárias simples, foi também monitorizado, usando os procedimentos (com as modificaçOes descritas acima) e graduaçao descrita no exemplo 4. No estudo, todos os animais apresentaram lesOes. Contudo, os resultados mostrados na tabela seguinte, indicam que a doença aguda foi melhorada pelas vacinas e que o efeito protector da vacina combinada foi incrementado em relação ao tratamento com apenas w-gB2 ou apenas W-VP16. A evolução do efeito protector ao longo do tempo está representada na Fig. 14.

Tabela

Efeito de W-VP16 e w-gB2 na Infecção Genital Aguda por HSV

Grupo

Vacina

Score das LesOes

Protecção

Mortalidade

1	nenhuma	2.27+.28	—	4/8 (50%)
2	W-VP16 + w-gB2	0.59+.09	74%	0/8 (0%)
3	w-gB2	1.12+.14	50.7	0/8 (0%)
4	W-VP16	1.05+.11	53.8%	0/8 (0%)

A seguinte lista de materiais encontra-se depositada nos termos do Tratado de Budapeste com a American Type Culture

Collection (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852, e tem sido e foram-lhe concedidos os seguintes Números de Acesso:

Material pHS226 em E.coli DH5a

Data de Depósito No. ATCC de Julho de 1990 68372

Após permissão e emissão deste Pedido Patente dos Estados Unidos, todas as restrições como um Pedido de à disponibilidade destes depósitos serão irrevogavelmente retiradas; e o acesso aos depósitos designados será possivel durante a pendência do Pedido acima mencionado para o determinado pelo comissário a ser intitulado para o efeito sob 37 CRF 1.14 e 35 USC 1.22. Além disso, os depósitos designados serão mantidos por um período de trinta (30) anos a partir da data de depósito, ou por cinco (5) anos após a último pedido de depósito; ou durante a vida da Patente Norte Americana em vigor, o que durar mais. Os materiais depositados aqui mencionados são pretendidos apenas por conveniência e não são necessários para praticar a presente invenção em termos das descrições aqui feitas e, além disso, estes materiais são aqui incorporados por referência.

Aplicabilidade Industrial

As composições aqui descritas, as quais contêm um polipeptideo imunogénico, constituído por um epitopo de VP16 de HSV, são úteis para o alivio dos sintomas resultantes de infecções pelo virus do Herpes Simplex. Os vectores recombinantes, sistemas de expressão, e células hospedeiras transformadas por estes vectores, são úteis para a preparação dos polipeptideos imunogénicos, os quais pos sua vez são úteis na preparação das vacinas acima descritas.

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES

   1- Um processo de produção de uma composição para o tratamento da infecção por HSV, caracterizado pelo facto de compreender:

   (a) fornecer um polipéptido imunogénico constituído por um epitopo imunogénico do HSV VP16;

   (b) formular o polipéptido num excipiente farmaceuticamente aceitável.
2. 2- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o polipéptido fornecido ser seleccionado a partir do HSV VP16, do HSV VP16 truncado, e de mutantes dos mesmos.
3. 3- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o HSV VP16 ser HSV-2 VP16.
4. 4- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender, além disso, o fornecimento de um polipéptido constituído por um epitopo imunogénico de uma glicoproteina de HSV.
5. 5- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender, ainda, um segundo polipéptido escolhido a partir de uma glicoproteina de HSV, de uma primeira glicoproteina de HSV truncada, e de mutantes das mesmas.
6. 6- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterizado pelo facto da glicoproteina de HSV fornecida ser a gB de HSV.
7. 7- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterizado pelo facto da glicoproteina de HSV fornecida ser a gD de HSV.
8. 8- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterizado pelo facto de compreender, ainda, o fornecimento de um terceiro polipéptido seleccionado de uma segunda glicoproteina, de uma segunda glicoproteina truncada, e de mutantes das mesmas.
9. 9- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o terceiro polipéptido ser gB de HSV.
10. 10- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto do terceiro polipéptido ser gD de HSV.