JP2003230396A - ｇｐ３５０／２２０非スプライシング変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 gp220 タンパク質が随伴しないgp350 タンパ
ク質の新規な製造方法の提供。 【解決手段】 gp350 タンパク質をコードする遺伝子の
スプライシング部位に変異を導入することにより、スプ
ライシングの発生を防止して、gp220 タンパク質の生成
を抑制して、gp220 タンパク質が随伴しないgp350 タン
パク質を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野及び従来の技術】ヘルペスウイ
ルス属の一種であるエプスタイン−バーウイルス（ＥＢ
Ｖ）はヒトにおいて感染性単核球症を引き起こす。この
病気は集団の90％以上に感染する。健康分析者は米国に
おけるこの病気の費用が年100 万ドルであると見積も
る。このウイルスは主にウイルスを放出する個体から唾
液の交換によって蔓延する。ＥＢＶに感染した子供はほ
とんど無症状であるかまたはごく弱い症状を有するが、
感染した若者と成人は、発熱、咽頭炎およびアデノパシ
ーにより特徴付けられる典型的な感染性単核球症を発病
する。感染した人はその後の生涯ずっと抗ＥＢＶ抗体を
維持するので、次の感染に対して免疫がある。現在のと
ころ商業的に利用可能なＥＢＶワクチンはない。

【０００２】その感染性に加えて、ＥＢＶはリンパ球を
急速に分裂する細胞に形質転換させることが証明されて
おり、従って、バーキットリンパ腫や口腔毛髪状白斑を
はじめとする幾つかの異なるリンパ腫に関係があるとさ
れている。世界的に見て、80,000の鼻咽頭癌症例が存在
すると推定され、中国民族に流行している。

【０００３】ＥＢＶの弱毒化生ワクチンの開発は行われ
ているがまだ問題がある。ＥＢＶに関連する潜在的な腫
瘍形成性質のため、研究者らは生ワクチン法を使うのを
嫌がっていた。本発明は、潜在的に腫瘍形成性の生存ウ
イルスの使用を必要としないサブユニットワクチンのた
めの方法および組成物を考案することにより、生ワクチ
ンの開発に関連する問題を回避する。サブユニットワク
チンは、免疫応答を惹起しそして免疫を付与するであろ
うウイルスからの１または複数の抗原性タンパク質を使
用する。

【０００４】より重要な２つの抗原性ＥＢＶタンパク質
は、ウイルス膜のエンベロープの部分を構成しており、
細胞膜タンパク質CD21と相互作用することによりウイル
ス粒子がヒト標的細胞に結合しそしてその中に入るのを
可能にする、糖タンパク質gp350/300 とgp220/200 であ
る。Nemerow, J. Virology 61:1416 (1987)を参照のこ
と。それらはサブユニットワクチン候補として選ばれて
から久しいが、本来の源から精製された抗原的に活性な
タンパク質を得ることの難しさと、組換え生産された源
からの収率が低いことが、研究者やワクチン開発者の努
力を妨害していた。

【０００５】文献中には様々な分子量範囲（一方のタン
パク質には350 または300 キロダルトン（kD）、他方の
タンパク質には220 または200 kD）を使ってそれらのタ
ンパク質が呼称されている。本明細書中ではgp350 また
は300 タンパク質をgp350 タンパク質と呼び、gp220 ま
たは200 タンパク質をgp220 タンパク質と呼ぶ。集合的
に、両タンパク質を本明細書中ではgp350/220 タンパク
質と呼称する。

【０００６】択一的にスプライスされる単一の遺伝子が
gp350/220 タンパク質をコードし、gp350 mRNA転写物と
gp220 mRNA転写物の生成をもたらす。天然に存在するgp
350/220 遺伝子スプライス部位変異体は１つも知られて
いない。該遺伝子は２つの発現産物、即ちgp350 タンパ
ク質とgp220 タンパク質を産生する。gp350/220 ＤＮＡ
配列の転写解読枠（ＯＲＦ）は2721塩基対（bp）であ
る。全読み枠は907 アミノ酸のgp350 をコードする。Ki
eff に発行された米国特許第4,707,358 号（1987）を参
照のこと。転写解読枠のスプライス形は2130塩基を含
み、710 アミノ酸配列のgp220 タンパク質に翻訳され
る。

【０００７】gp350 タンパク質とgp220 タンパク質の理
論分子量はそれぞれ95 kDと70 kDである。発現されたgp
350 タンパク質とgp220 タンパク質の測定分子量は異な
るけれどもそれぞれ約350 キロダルトンと220キロダル
トン（kD）である。推定分子量と実分子量の差の理由は
両タンパク質の多大なグリコシル化である。どの細胞で
も、gp350 タンパク質とgp220 タンパク質は約6:1 〜1:
1 の範囲のモル比で生産される。例えば、ＥＢＶが持続
的に感染したB95-8 細胞では、その比は異なるように見
えるが時々6:1 の範囲に近づく。Miller, Proc．Natl.
Acad. Sci.69:383 (1972) を参照のこと。

【０００８】同様に、それらの糖タンパク質の組換え生
産は、今までは一般に生産させる予定のgp350 タンパク
質とgp220 タンパク質の混合物をもたらした。従来、gp
350/220 タンパク質はラット下垂体、チャイニーズハム
スター卵巣、VERO（アフリカミドリザル腎臓）細胞、並
びに酵母細胞中で発現されている。Whang, J. Virol.
61:1796(1982), Motz, Gene 44:353 (1986)および Emin
i, Virology 166:387(1988)を参照のこと。マウス繊維
芽細胞中でgp350/220 タンパク質を生産させるのにウシ
乳頭腫ウイルスのウイルス発現系も使われている。Made
j, Vaccine 10:777 (1992) を参照のこと。

【０００９】gp350/220 タンパク質を発現させるのにワ
クシニアウイルスの実験株とワクチン株も使われてい
る。ＥＢＶのgp350/220 ＤＮＡおよびタンパク質の変異
組換え形は当業界で既知である。詳しくは、膜貫通配列
を欠いている先端が切り取られたgp350/220 遺伝子の組
換え構成物が作製された。そのような構成物はgp350 と
gp220 の２つの混合物をまだ生産するが、膜貫通領域の
欠如が該タンパク質の分泌を可能にする。Finerty, J.
Gen. Virology 73:449 (1992)および Madej, Vaccine 1
0:777 (1992) を参照のこと。また、様々なgp350/220
配列を含んで成る組換え生産された様々な制限断片およ
び融合タンパク質が作製されＥ．コリ中で発現されてい
る。1991年７月24日に公開されたＥＰ特許公開0 173 25
4 を参照のこと。

【００１０】従って、gp350/220 に関するＥＢＶ研究
は、今まで生来のgp350/220 配列の効率的な発現を得る
ことか、生来のタンパク質または膜貫通領域欠失タンパ
ク質の２つの択一的スプライス形の混合物を生じる膜貫
通領域を欠く変異配列に集中し、あるいはβ−ガラクト
シダーゼ融合タンパク質としてのエピトープ断片配列の
生産に集中していた。

【００１１】gp350/220 の部分精製調製物は既知であ
る。 Finerty, J. Gen. Virology 73:449 (1992)を参照
のこと（組換え生産され、部分精製されたもの）。生来
のgp350/220 タンパク質については、ほとんどの場合、
精製作業が該タンパク質の抗原性を不活性化してしま
い、そのためサブユニットワクチンでの使用が認められ
なくなる。しかし、生来の（即ち、非組換え）源からの
抗原的に活性なgp350 タンパク質の高度精製調製物が科
学文献中に報告されている。David, J. Immunol. Metho
ds 108:231 (1988)を参照のこと。

【００１２】ＥＢＶ誘発リンパ腫に対してコットントッ
プタマリン（cottontop tamarin ）を予防接種するのに
gp350/220 タンパク質を発現する組換えウイルスワクチ
ンが使われた。Morgan, J. Med. Virology 25:189 (198
8), Mackett, EMBO J. 4:3229 (1985)および Mackett,
VACCINES '86, pp293 (Lerner RA, Chanock RM, Brown
F 編, 1986, Cold Spring Harbor Laboratory)を参照の
こと。しかしながら、該遺伝子の択一的スプライス形態
のうちのいずれか１つだけの発現を可能にし、それによ
って純粋なgp350 またはgp220 タンパク質の生産を可能
にし且つ保証するようにウイルスgp350/220 ＤＮＡ配列
が操作されたことはない。また、gp350またはgp220 タ
ンパク質の一方または他方を発現する組換えまたは変異
ウイルスも作製されていない。

【００１３】一般に、スプライス部位はプレmRNA分子か
らmRNAへのプロセシングを促進する。ポリオーマウイル
スでは、後期mRNAの効率的蓄積のためにスプライス部位
が必要とされる。ポリオーマウイルス転写物中の３′お
よび５′スプライス部位の変更はmRNA蓄積を減少させる
かまたは完全に妨げる。Treisman, Nature 292:595 (19
81) を参照のこと。SV40ウイルスでは、切除可能な介在
配列が核外へのmRNAの輸送と核中でのmRNAの安定化を促
進し、それらのイントロン／エキソン接合配列が小さな
核ＲＮＰ粒子の結合を促進するため、事前にスプライス
されたmRNAはプロセシング経路と正しく連携することが
できないだろうと考えられる。エキソン／イントロンス
プライス部位のところの点変異は、エキソン／イントロ
ン開裂を低下させ、そしてプレmRNAプロセシング、核輸
送および安定性を破壊する可能性がある。Ryu, J. Viro
logy 63:4386 (1989)および Gross, Nature 286:634 (1
980)を参照のこと。

【００１４】従って、本発明までは、ＥＢＶのgp350/22
0 配列によりコードされるタンパク質の機能的発現と抗
原活性に対するスプライス部位変更の影響は最善の状態
では未知であり、且つ予測できない。

【００１５】追加の背景文献としては次のものが挙げら
れる。ＥＢＶの生物学と病気はStraus, Annal of Int.
Med. 118:45 (1993)中に大体概説されている。ＥＢＶの
BLLFI 転写解読枠の記載はBaer, Nature 310:207 (198
4)中に見つかる。エプスタイン−バーウイルスのgp350/
220 ＤＮＡおよびアミノ酸配列の記載はBeisel, J. Vir
ology 54:665(1985)とBiggin, EMBO J. 3:1083 (1984)
による文献中並びにKieff他に発行された米国特許第4,7
07,358 号（1987）中に見つかる。

【００１６】エプスタイン−バーウイルスＡ型とＢ型中
のgp350/220 をコードするＤＮＡ配列の比較はLees, Vi
rology 195:578 (1993) 中に開示されている。ＥＢＶの
gp350/220 糖タンパク質に対して中和活性を示すモノク
ローナル抗体はThorley-Lawson, Proc. Natl. Acad. Sc
i. 77:5307 (1980)中に開示されている。最後に、供与
体および受容体スプライス部位についてのスプライス部
位共通配列は Mount,Nucl. Acids Res. 10:459 (1982)
中に開示されている。

【００１７】一観点によれば、本発明はＥＢＶのgp350/
220 ＤＮＡ配列の非スプライシング変異体を提供する。
本発明のＤＮＡ配列は、均一gp350 タンパク質の発現を
コードする単離されたＤＮＡ配列を含むことができる。
gp350 タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、供与体お
よび受容体スプライス部位のところの生来のヌクレオチ
ドが生来でないヌクレオチドにより置換されている図１
〜図７の配列と同じまたは実質的に同じヌクレオチド配
列を含んで成るもの、およびその断片として特徴づけら
れる。

【００１８】このＤＮＡ配列はコード配列に隣接する
５′および３′非コード配列を含むことができ、更にア
ミノ末端シグナル配列を含むことができる。図１〜図７
は非コード配列を表し、推定上のシグナル配列の終わり
を星印（＊）で示す。しかしながら、本発明のＤＮＡ配
列は、それらの隣接配列またはシグナル配列のうちの幾
らかまたは全部を除外することもあると解釈される。本
発明の非スプライシング変異体ＤＮＡ配列は、図１〜図
７のＤＮＡ配列のgp350/220 をコードする遺伝子の供与
体および受容体スプライス部位に変異を導入することに
より製造される。これはgp220 タンパク質の生産を排除
し、その結果gp350 タンパク質だけが生産される。

【００１９】従って、別の観点では、本発明は、均一gp
350 タンパク質、および適当な原核または真核宿主細胞
中で適当な発現調節配列の支配下でのＥＢＶのgp350/22
0 ＤＮＡ配列の非スプライシング変異体の発現により該
タンパク質を生産する方法を含んで成る。本明細書中で
gp350 タンパク質について用語を使う時、均一とは、gp
220 タンパク質を全く含まないかまたは実質的に含まな
いことを意味する。哺乳類または昆虫細胞において組換
え生産された均一gp350 タンパク質は確かに今まで文献
中に報告されたことがないと本発明者らは認める。

【００２０】更に別の観点によれば、分泌生成物をもた
らす欠失を更に有する均一gp350 タンパク質が提供され
る。そのような欠失は、gp350 の膜貫通領域の除去か、
膜貫通領域と残りのＣ末端の除去のいずれかを含んで成
る。そのような更に変更されたＤＮＡ配列およびそれに
よりコードされるタンパク質は、本発明のまた別の観点
である。

【００２１】ベクターＤＮＡと均一gp350 タンパク質を
コードするＤＮＡ配列とを含んで成る組換えＤＮＡ分子
も提供される。該ＤＮＡ分子は、選ばれた宿主細胞中で
の均一gp350 の複製と発現を指令することができる適当
な調節配列と作用可能に連結したgp350 配列を提供す
る。組換え均一gp350 タンパク質を発現させる際に使わ
れるそのようなＤＮＡ分子により形質転換された宿主細
胞も、本発明により提供される。

【００２２】本発明のＤＮＡ分子および形質転換された
宿主細胞は、本発明の別の観点である組換え均一gp350
タンパク質またはその断片の新規生産方法において使わ
れる。この方法では、均一gp350 タンパク質の発現を調
節することができる適当な調節配列または発現調節配列
と作用可能に連結した均一gp350 タンパク質またはその
断片をコードするＤＮＡ配列によって形質転換された細
胞系を、組換えＤＮＡの発現を可能にする適当な条件下
で培養する。次いで発現されたタンパク質を適当な常用
手段により宿主細胞からまたは培地から収得する。この
方法は宿主細胞として多数の既知の細胞を使うことがで
きるが、現在のところ好ましいのは哺乳類細胞と昆虫細
胞である。

【００２３】本発明のＤＮＡ配列およびタンパク質は、
ＥＢＶ抗原決定基を有する治療化合物および免疫原性化
合物の製造に有用である。そのような化合物はＥＢＶ関
連疾患、例えば単核球症、バーキットリンパ腫および鼻
咽頭癌の予防処置のためのサブユニットワクチンに利用
される。従って、別の観点によれば、本発明は、感染性
単核球症、バーキットリンパ腫および鼻咽頭癌のような
ヒトのＥＢＶ関連状態や疾患を予防または治療するため
の治療および／または免疫原性医薬組成物を含んで成
る。

【００２４】そのような治療および／または免疫原性医
薬組成物は、医薬上許容される担体、例えば当業界で知
られるような水酸化アルミニウム、塩溶液およびリン酸
塩緩衝化塩溶液と共に、免疫原的誘発有効量の本発明の
１または複数の均一gp350 タンパク質を含んで成る。
「免疫原的誘発」量とは、哺乳類においてＥＢＶに対す
る抗体の産生を刺激するのに十分な量を意味する。ある
いは、活性成分はリポソーム含有凝集物の形で投与して
もよい。予防用途には、そのような医薬組成物はヒトの
患者への投与のためのサブユニットワクチンとして処方
することができる。患者の抗体形成を刺激するのに十分
な用量で患者に予防接種し；そして６か月〜１年後に再
接種することができる。

【００２５】従って、本発明の更なる観点は、適当な医
薬担体中の免疫原的誘発治療有効量の均一gp350 タンパ
ク質を患者に（特にヒト患者に）投与することにより、
ＥＢＶ関連疾患および状態を治療する方法である。本発
明の更に別の観点は、適当な医薬賦形剤中の免疫原的誘
発有効量の均一gp350 タンパク質を患者に投与すること
により、ＥＢＶに対する免疫応答を刺激する方法であ
る。

【００２６】

【発明の実施の形態】gp350 タンパク質の非スプライシ
ング変異体をコードするクローン化されたＥＢＶのＤＮ
Ａ配列を含んで成る組成物および方法が開示される。既
に指摘した通り、そのような非スプライシング変異体は
本明細書中では均一gp350タンパク質と呼称される。通
常、gp350/220 遺伝子が哺乳類細胞中で発現されると、
該遺伝子のＲＮＡスプライシングのためにgp350 とgp22
0 という２つの遺伝子産物が生じる。本発明は１つの遺
伝子産物gp350 だけが生産されるようにする。本発明は
gp350 遺伝子中のＲＮＡスプライス部位シグナルの一部
または全部を除去し、そして適当な宿主細胞中で該遺伝
子を発現させることを含む。

【００２７】哺乳類細胞中でgp350/220 遺伝子が発現さ
れる時に該タンパク質の220 kD形態の生産を防止するた
めにgp350/220 遺伝子中に変異が導入された。結果とし
て、gp350 のみをコードするmRNA転写物が生産される。
gp350/220 遺伝子の非スプライシング変異体を使うこと
によるgp220 発現の除去は、gp220 に比較して増加した
gp350 の生産を引き起こすだろう。gp350 はgp220 上に
見られる潜在的な抗原部位を全て含むので、gp220 の生
産は効果的な抗ＥＢＶワクチンの製造にとって不可欠な
ものではない。

【００２８】従って、本発明の一観点は、アミノ酸501
をコードする供与体スプライス部位コドンとアミノ酸69
8 をコードする受容体スプライス部位コドンが、生来で
ないヌクレオチドによる生来のヌクレオチドの置換によ
って変更されていること以外、gp350 と実質的に同じポ
リペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を提供する。好
ましくは、アミノ酸配列が同じままであるように、生来
のヌクレオチドが生来でないヌクレオチドにより置換さ
れる。詳しくは、一例として、供与体スプライス部位の
ところの生来のヌクレオチドＡＡＧＴ（ヌクレオチド15
00〜1504）と、ＧＧ受容体スプライス部位に隣接する生
来のヌクレオチドＡ＆Ｔ（ヌクレオチド2091〜2094）
が、それぞれＧＴＣＡとＴ＆Ａにより置換された。

【００２９】従って、供与部位におけるこの置換の結果
として、アミノ酸500 位のグルタミンと501 位のセリン
は同じままであった。同様に、受容部位におけるこの置
換の結果として、アミノ酸697 位のスレオニンと698 位
のグリシンは同じままであった。同様にして、下記に更
に詳述するように、当業者はそれらの明確に例示したも
の以外の置換も容易に実施することができよう。

【００３０】従って、本発明は一観点によれば、均一gp
350 タンパク質に関する。均一gp350 タンパク質は、ア
ミノ酸１から907 まで、アミノ酸１から862 まで、また
はアミノ酸１から907までで且つアミノ酸863 から881
までを欠く図１〜図７に示されるのと実質的に同じアミ
ノ酸配列を有し、各々Ｎ末端の18アミノ酸のシグナル配
列を持つかまたは持たないことにより更に特徴づけられ
る。加えて、均一gp350 タンパク質の類似体が提供され
る。それらとしては、抗原活性を保持しており、且つ均
一gp350 タンパク質の対応領域と好ましくは少なくとも
80％、より好ましくは90％、最も好ましくは95％の相同
性を有する、アミノ酸配列中に変更がある変異体が挙げ
られる。例としては、図１〜図７のアミノ酸配列からの
少数のアミノ酸変更、特に保存的アミノ酸置換、を有す
るタンパク質およびポリペプチドが挙げられる。保存的
置換は、それらの側鎖が類似している（同族の）アミノ
酸ファミリー内で起こるものである。

【００３１】遺伝的にコードされるアミノ酸は一般に４
つのファミリーに分類される：(1)酸性＝アスパラギン
酸、グルタミン酸；(2)塩基性＝リジン、アルギニン、
ヒスチジン；(3)無極性＝アラニン、バリン、ロイシ
ン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチ
オニン、トリプトファン；および(4)非荷電で極性＝グ
リシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリ
ン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプ
トファンおよびチロシンは時々芳香族アミノ酸として一
緒に分類される。例えば、ロイシンの孤立置換または構
造的に同族のアミノ酸によるアミノ酸の保存的置換が抗
原活性または機能性に対して重大な影響がないだろうと
予想することは筋が通っている。

【００３２】本発明はgp350 の簡単な精製という利点を
提供する。gp350 とgp220 は同様な生化学的性質を有す
るため、gp220 はしばしばgp350 の調製物中に一緒に精
製される。gp350/220 遺伝子の非スプライシング変異体
のみを発現する細胞はタンパク質精製を平易にする。こ
れはgp350の生産費用を減少させるであろう。本発明は
また、gp350 精製のための出発材料の生化学的特徴づけ
を一層容易にする。１つの種だけが存在するため、第二
の種の存在理由を説明することなく、タンパク質含量分
析とアミノ酸配列分析を行うことができる。

【００３３】本発明はその上、増加されたgp350 生産と
いう利点を提供する。gp350 遺伝子のスプライシングの
防止は、細胞をgp350 とgp220 の二元生産からgp350 の
単独生産に移し変えるだろう。ある細胞では、gp220 の
濃度はgp350 濃度の30％〜100 ％であると推定されてい
る。遺伝子スプライシングが除去されると、gp220 生産
の欠如によってgp350 生産が増加されるだろう。

【００３４】gp350/220 遺伝子のＤＮＡ配列はBeisel,
J. Virology 54:665 (1985)およびBiggin, EMBO J. 3:1
083 (1984) により記載されており、それは図１〜図７
に描写される。該遺伝子は907 アミノ酸をコードしそし
て約95 kD の一次翻訳産物を指定する2721塩基の転写解
読枠（ＯＲＦ）である。推定値と実測値の間の差は、該
タンパク質の多大なグリコシル化を表している。591 塩
基（197 アミノ酸をコードする）がスプライシングによ
り除去されるとgp220を生じる。gp350/220 遺伝子産物
の見かけ分子量は、使用する測定方法の種類、異なる細
胞系中のグリコシル化部位の利用状態、翻訳後プロセシ
ングの差または選択的な遺伝子変異によって異なり得
る。

【００３５】gp350/220 遺伝子スプライス部位変異体の
生産物についての測定値は異なるが、「均一gp350 タン
パク質」という語は、場合により追加の欠失または変
異、例えば本明細書中で開示されるＣ末端欠失および／
または膜貫通領域変更を有することがある、非スプライ
シング変異体の遺伝子産物を包含する。「gp220 タンパ
ク質」という語は、約220 kDの分子量を有する択一的に
スプライスされたgp350/220 遺伝子産物を指す。gp350/
220 遺伝子中のスプライス部位は、他の遺伝子（主に真
核生物からのもの）を基にした共通の供与体および受容
体スプライス配列とgp350/220 遺伝子との比較により同
定された。他の遺伝子中のスプライス部位を調べること
から Mount, Nucleic Acids Res. 10:459 (1982)により
発見された共通配列は、下記のものである：

【００３６】

【表１】

【００３７】右肩に星印を付けた塩基は全スプライス部
位の100 ％に現れる塩基を表す（高度に保存された塩
基）。２塩基または１塩基を有する位置は保存された位
置を表す（強調してない位置）。スラッシュ（／）は実
際のスプライシング部位を示す。

【００３８】gp350/220 遺伝子中では、gp350/220 遺伝
子のＤＮＡ配列決定〔Biggin, EMBOJ. 3:1083 (1984)
〕により示されたように、供与体スプライス部位はヌ
クレオチド1501の後ろにあり、そして受容体スプライス
部位はヌクレオチド2092の後にある。（ここと図１〜図
７中で使用した番号付け法はBigginの番号付け法に従
う）。スプライス部位はＥＢＶのＢ型株の対応する遺伝
子領域中に存在する（供与体スプライス部位はＡ₁₅₀₁の
後、そして受容体スプライス部位はＧ₂₀₂₉の後）。本発
明は、gp350/220 遺伝子から単一種のmRNAを生産させる
のにＡもしくはＢ株または別のＥＢＶ株のスプライス部
位のいずれかを使って製造した組成物を包含する。

【００３９】B95-8 株からのウイルスＡ型のＤＮＡ配列
を実施例で使ったが、Ｂ型株のＤＮＡ配列も同様に使う
ことができただろう。何故なら、Ａ型株とＢ型株の遺伝
子翻訳産物は98％同じであるからである。Ｂ株はアミノ
酸507 〜520 と570 〜576 を欠いている。Ａ型株はgp35
0 抗原部位を全て含むため、Ａ型株を使った。あるい
は、本明細書の教示に従って株特異的配列を有するＥＢ
Ｖ gp350/220を使って、特定株に特異的な免疫原性を有
し、従って株特異的ＥＢＶ関連疾患の予防または治療用
の免疫原性および／または治療組成物において有用であ
る、ＥＢＶ株特異的均一gp350 タンパク質を生産させる
ことができる。表１は、供与体および受容体スプライス
部位の野性型ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。

【００４０】gp350/220 遺伝子のＲＮＡスプライシング
を防止するために、gp350/220 遺伝子中に核酸配列を導
入してＲＮＡスプライス部位の関連塩基対を置換した。
スプライス部位を非機能的にするためには、好ましくは
供与部位または受容部位を構成する２つの高度に保存さ
れた塩基群の中から少なくとも１個の塩基を非保存的塩
基で置換すべきであり、より好ましくは少なくとも２個
の高度に保存された塩基を非保存的塩基に変異させるべ
きである。別の保存的塩基であるスプライス部位から離
れた２個以上の塩基を非保存的スプライス部位塩基によ
り置換して、スプライス部位の認識を更に弱くすること
もできる。

【００４１】供与部位と受容部位の両方を変更してスプ
ライシング機構を傷つけることができる。好ましくは、
供与体と受容体が両方とも、４箇所の高度に保存された
スプライス部位塩基位置のうちの１箇所に各々少なくと
も１個の変更を含み、より好ましくは４箇所の高度に保
存されたスプライス部位塩基位置のうちの２箇所に少な
くとも２個の変化を含む。一方のスプライス部位が野性
型アミノ酸配列を維持するために変異できないならば、
他方のスプライス部位に少なくとも２つの変異を導入す
ることが好ましい。

【００４２】gp350/220 スプライス部位のところの変異
が、その後発現されるgp350 タンパク質のアミノ酸配列
中に変化を導入してもよい。好ましくは、そのような変
化は保存的アミノ酸置換であるべきである。アミノ酸配
列中の保存的置換は、アミノ酸配列中の非保存的変化と
は反対に、抗原部位の保存を助けるだろう。保存的アミ
ノ酸変化は、塩基変化（または複数塩基変化）が不変の
供与体／受容体塩基中に適当な変化を引き起こす限りに
おいて行うことができる。例えば、供与体スプライス部
位では、ＧＧＵ以外のどのGly 特異的コドンを使っても
Ser₅₀₁をGly に置換することができる（ＧＧＵの使用は
Ｇヌクレオチドを保存し、スプライスシグナル中に所望
のＧＴ置換を引き起こさないだろう）。

【００４３】同様に、受容体スプライス部位では、Gly
₆₉₈からAla への変化は保存的置換であろうが、全てのA
la コドンは高度に保存されるＧヌクレオチドで始まる
ので、これは所望の置換を引き起こさないだろう。プロ
リンも保存的アミノ酸変化であるかもしれないが、プロ
リンはタンパク質の三次構造の変更を引き起こし、それ
によって１または複数のgp350 抗原部位を隠蔽してしま
うので、プロリンは野性型アミノ酸を置換するのに使わ
れないだろう。表２は、野性型配列中の許容される保存
的アミノ酸置換を示す。表２の一番下は、保存的アミノ
酸置換を伴う変異の例である。

【００４４】

【表２】

【００４５】本発明の一観点はgp350/220 の非スプライ
シング変異体を含んで成るけれども、gp350/220 コード
配列の追加の変異も望ましいかもしれない。可溶性均一
gp350 タンパク質（「可溶性タンパク質」は溶液中で遊
離形態であるか、または膜会合形態であるが膜統合形態
でない）を生産するために、例えば、統合型膜タンパク
質としての全長gp350 の発現によって生じる細胞毒性問
題を回避するために、gp350をコードするＤＮＡ配列の
全部または部分の削除によりgp350 の膜貫通領域（経膜
領域としても知られる）が変更される。

【００４６】gp350/220 の膜貫通領域はアミノ酸861
（メチオニン）から881（アラニン）までを含んで成
る。Beisel, J. Virology 54:665 (1985) を参照のこ
と。好ましくは、膜貫通領域の少なくとも８アミノ酸が
削除され、より好ましくは少なくとも12アミノ酸が削除
され、最も好ましくは18〜21アミノ酸が削除される。従
って、別の観点では、本発明は、可溶性均一gp350 タン
パク質の発現をもたらすgp350/220 ＤＮＡおよび／また
はgp350 均一タンパク質の膜貫通領域中に少なくとも一
つの削除を更に含んで成るgp350/220 ＤＮＡおよび／ま
たはgp350 均一タンパク質の非スプライシング変異体を
提供する。

【００４７】非スプライシングgp350/220 変異体の膜貫
通領域の全部または一部分を削除することに加えて、本
発明に従って、本明細書に記載の通り、膜貫通領域の後
ろのアミノ酸881 〜907 を含んで成るＣ末端配列を完全
にまたは部分的に削除することもできる。よって、別の
観点では、本発明は、gp350/220 の膜貫通領域をコード
するＤＮＡおよび／または該膜貫通領域を含んで成るア
ミノ酸配列の全部もしくは一部分の削除により更に変更
されており、その上gp350/220 の残りのＣ末端ＤＮＡお
よび／またはアミノ酸配列の削除により更に変更されて
いる、gp350/220 ＤＮＡおよび／または均一タンパク質
の非スプライシング変異体に関する。

【００４８】従って、別の観点では、本発明は、本発明
の均一 gp350タンパク質をコードする非スプライシング
変異体ＤＮＡ配列に関する。そのようなＤＮＡ配列は、
アミノ酸１〜907 をコードする図１〜図７のＤＮＡ配列
を含んで成り、そして供与体および受容体スプライス部
位を除去するように本明細書中に教示したヌクレオチド
置換を更に含んで成る。そのようなＤＮＡ配列は、所望
により、アミノ酸861〜907 を含んで成る膜貫通領域と
Ｃ末端の全部または一部分をコードするヌクレオチドが
削除されている端が切り取られたＤＮＡ配列、およびア
ミノ酸861 〜881 を含んで成る膜貫通領域の全部または
一部分をコードするヌクレオチドが削除されている欠失
変異体を含んで成る。

【００４９】均一gp350 タンパク質をコードする本発明
のＤＮＡ配列は、適当な緊縮条件下で図１〜図７の単離
ＤＮＡ配列にハイブリダイスすることができるＤＮＡを
含んでもよく、または遺伝暗号の縮重がなければそのよ
うな条件下で図１〜図７の単離ＤＮＡ配列にハイブリダ
イズすることができるだろうＤＮＡを含んでもよい。従
って、本発明のＤＮＡ配列は、対立遺伝子変異、種変異
または計画的変更に基づいて、非コード配列、シグナル
配列またはコード配列中に変更を含むことができる。

【００５０】本明細書中で開示されるそれらの非スプラ
イシング変異体gp350/220 ＤＮＡ配列は、当業界で公知
の方法を使って作製することができる。本発明の変異Ｄ
ＮＡ配列を、同様に既知の方法を使って組換え的に発現
させ、本発明の均一gp350 タンパク質を製造することが
できる。そのような組換えタンパク質を精製し、ＥＢＶ
関連疾患の予防処置と防止のための医薬組成物中に配合
することができる。

【００５１】本発明のgp350/220 ＤＮＡの非スプライシ
ング変異体は、当業界で既知であるようにして適当な発
現調節配列を使って様々な種類の細胞中で組換え発現さ
せることができる。当業界で既知であり且つ入手可能で
ある適当な細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）のような酵母細胞、Ｅ．
コリ（E. coli）やバシラス・サチリス（Bacillus su
btilis）のような細菌細胞、並びにGH3, CHO, NSO, MDC
K およびC-127 細胞のような哺乳類細胞が挙げられる。
細胞型と共に使われるベクターは、細胞型との適合性お
よび使用する発現調節系に基づいて選択される。gp350/
220 遺伝子の分泌産物の発現を考慮に入れた細胞とベク
ターが好ましい。

【００５２】典型的には、例えば、Ｃ末端および／また
は膜貫通領域をコードする配列と共にまたは伴わずに、
所望のタンパク質（この場合ＥＢＶ gp350の非スプライ
シング変異体配列）の発現のためのDNA 配列を含むよう
に常用技術を使って変更されているpBR322の誘導体を使
ってＥ．コリが形質転換される。pBR322はアンピシリン
とテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、これをマーカー
として使うことができる。Bolivar, Gene 2:95 (1977)
を参照のこと。

【００５３】常用される発現調節配列、即ち転写開始の
ためのプロモーターおよび場合によりオペレーターまた
はエンハンサーとしては、β−ラクタマーゼおよびlac
プロモーター系〔Chang, Nature 198:1056 (1977)を参
照のこと〕、トリプトファンプロモーター系〔Goeddel,
Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980)を参照のこと〕、
およびラムダ由来ＰＬプロモーターとＮ遺伝子リボソー
ム結合部位〔Shimatake, Nature 292:128 (1981)を参
照のこと〕が挙げられる。しかしながら、原核宿主細胞
と適合できるいずれの入手可能なプロモーター系または
発現調節系も使うことができる。他の典型的な宿主細
胞、プラスミドおよび発現ビヒクルは、Itakura(1982)
に発行された米国特許第4,356,270 号、Riggs に発行さ
れた同第4,431,739 号およびRutter1984）に発行された
同第4,440,859 号に開示されている。

【００５４】昆虫細胞発現系を使用する宿主細胞として
昆虫細胞を使ってもよい。昆虫細胞での発現の場合、発
現系の構成要素としては一般に、バキュロウイルスゲノ
ムの断片と発現させようとする１または複数の異種遺伝
子の挿入のための便利な制限部位の両方を含有する伝達
ベクター、通常は細菌プラスミド；前記伝達ベクター中
のバキュロウイルス特異的断片と相同の配列を有する野
性型バキュロウイルス（これはバキュロウイルスゲノム
中への異種遺伝子の相同組換えを考慮に入れる）；並び
に適当な昆虫宿主細胞および増殖培地が挙げられる。

【００５５】現在、AcNPV 中に外来遺伝子を導入するた
めに最もよく使われる伝達ベクターはpAc373である。当
業者が知るところの多数の他のベクターもデザインされ
ている。それらとしては、例えばpVL985が挙げられる
（これはポリヘドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴへ
変更し、そして該ＡＴＴから32塩基対下流にBamHI クロ
ーニング部位を導入する；Luckowおよび Summers, Viro
logy (1989) 17:31 を参照のこと）。

【００５６】該プラスミドは普通、ポリヘドリンポリア
デニル化シグナル〔Miller他 (1988) Ann. Rev. Microb
iol., 42:177〕並びにＥ．コリの選択と繁殖のための原
核生物のアンピシリン耐性（amp ）遺伝子および複製開
始点も含有する。

【００５７】バキュロウイルス伝達ベクターは通常バキ
ュロウイルスプロモーターを含有する。バキュロウイル
スプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラー
ゼを結合することができ且つコード配列（例えば構造遺
伝子）からｍＲＮＡへの下流（５′→３′）転写を開始
することができる任意のＤＮＡ配列である。プロモータ
ーは通常コード配列の５′末端の近位に置かれる転写開
始領域を有するだろう。この転写開始領域は典型的には
ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位を含む。バ
キュロウイルス伝達ベクターは、存在するなら普通は構
造遺伝子に対して遠位である、エンハンサーと呼ばれる
第二の領域を有することもできる。発現は調節的か構成
的のいずれであってもよい。昆虫細胞発現技術について
は、ＥＰ特許公開155 476 を参照のこと。

【００５８】酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）を宿主細胞として使って
もよい。様々な株が入手可能でありそして利用可能であ
る。同様に、酵母発現に適当なプラスミドベクターは既
知であり、プロモーターや発現調節系も知られている。
例えば、Myanohara, Proc. Natl. Acad. Sci. 80:1(19
83)（PHO5プロモーター）、ＥＰ特許公開012 873 （リ
ーダー配列）、Kurtz,Mol. Cell Biol. 6:142 (1986)、
Ito, J. Bacteriol. 153:163 (1983)およびHinnen, Pro
c. Natl. Acad. Sci. 75:1929 (1979)（形質転換方法お
よび適当なベクター）を参照のこと。

【００５９】多細胞生物からの真核細胞ももちろん、着
目のタンパク質およびポリペプチドをコードする遺伝子
の発現のための宿主細胞として使うことができる。有用
な宿主細胞系としてはVEROおよびHeLa細胞、並びにチャ
イニーズハムスター卵巣(CHO) 細胞が挙げられる。その
ような細胞と適合する発現ベクターも入手可能であり、
それらは典型的にはプロモーターおよび発現調節配列、
例えばSV40からの初期および後期プロモーター〔Fiers,
Nature 273:113 (1978) 参照〕、ポリオーマウイル
ス、アデノウイルス２、ウシ乳頭腫ウイルスまたはトリ
肉腫ウイルスからのプロモーターを含む。

【００６０】典型的な宿主細胞、プロモーター、選択マ
ーカーおよび技術は、Mather(1992)に発行された米国特
許第5,122,469 号、Axel(1983)に発行された同第4,399,
216号、Axel(1987)に発行された同第4,634,665号、Levi
nson(1987)に発行された同第4,713,339 号、Ringold(19
87) に発行された同第4,656,134 号、Kellems(1989) に
発行された同第4,822,736 号およびFiers(1989) に発行
された同第4,874,702 号を参照のこと。

【００６１】適当な宿主細胞の形質転換は、そのような
細胞に適当な標準技術、例えば Cohen, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. 69:2110 (1972) に開示されたような原核生物
用のCaCl₂ 処理や、Graham, Virology 52:546 (1978)中
に開示されたような哺乳類細胞用のCaPO₄ 処理を使って
達成される。酵母形質転換は、Hsiao, Proc. Natl. Aca
d. Sci. 76:3829 (1979) 中に記載されたようにまたは
Klebe, Gene 25:333 (1983)中に記載されたように行う
ことができる。

【００６２】非スプライシング変異体gp350 配列（Ｃ末
端領域および／または膜貫通領域の削除を引き起こすよ
うな本明細書中に開示された追加の変異を有するかまた
は有さない）を含有する適当なベクターの作製は、当業
界で現在周知である常用の連結および制限技術を使って
行われる。部位特異的ＤＮＡ開裂は標準条件下で１また
は複数の適当な制限酵素で処理することにより行われ、
その詳細は典型的には制限酵素製造業者により明記され
ている。標準技術を使って開裂された断片をサイズ分離
するためにポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲ
ル電気泳動を実施することができ、そして４種のデオキ
シヌクレオチド三リン酸の存在下でＥ．コリのポリメラ
ーゼＩクレノウ断片での処理により該断片を平滑末端に
することができる。

【００６３】Ｓ１ヌクレアーゼでの処理はいずれの一本
鎖部分も加水分解する。例えば当業界で既知のジエチル
ホスホアミダイト法を使って、合成オリゴヌクレオチド
を製造することができる。米国特許第4,415,732号（198
3）を参照のこと。標準条件および温度の下でT4 DNAリ
ガーゼを使って連結を実施し、そして連結混合物を用い
てＥ．コリまたはＣＯＳ細胞を形質転換させることによ
り正しい連結を確認することができる。好結果の形質転
換体はアンピシリン、テトラサイクリンもしくは他の抗
生物質耐性により、または当業界で既知であるような別
のマーカーを使って選択される。

【００６４】そのような組換えＤＮＡ技術は文献中に詳
しく説明されている。例えば、Sambrook, MOLECULAR CL
ONING: A LABORATORY MANUAL, 2DED.(1989) ; DNA CLON
ING,I & II 巻 (DN Glover 編 1985)；OLIGONUCLEOTIDE
SYNTHESIS (MJ Gait編 1984)；NUCLEIC ACID HYBRIDIZ
ATION (BD Hames 編 1984)；TRANSCRIPTION AND TRANSL
A-TION (BD Hames編 1984)；ANIMAL CELL CULTURE (RI
Freshney編 1986) ；B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO
MOLECULAR CLONING(1984)；GENE TRANSFER VECTORS FO
R MAMMALIAN CELLS (JH Miller編 1987 Cold Spring Ha
rbor Laboratory)；Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PR
INCIPLES AND PRACTICE,第２版 (1987Springer-Verlag
NY)；およびHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY Ｉ
〜IV巻（DM Weired 1986）を参照のこと。本明細書中に
言及される全ての刊行物はそれらが開示するものの内容
についての参照のため組み込まれる。

【００６５】従って別の観点では、本発明はgp350/220
ＤＮＡ配列の非スプライシング変異体を含有するベクタ
ーと宿主細胞を含んで成り、また均一gp350 タンパク質
の発現を可能にする培養条件下で、発現調節配列に作用
可能に連結されたgp350/220ＤＮＡ配列の非スプライシ
ング変異体を担持しているベクターを含む前記宿主細胞
を培養することによりgp350/220 タンパク質の非スプラ
イシング変異体を生産する方法を更に含んで成る。

【００６６】従来の糖タンパク質精製技術を使って、例
えば非限定的に、当業界で既知である限外濾過、フリー
フロー電気泳動、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、SDS-PAGE、分別NH₄SO₄沈
澱、レクチンカラム、イオン交換カラムおよび疎水性カ
ラムを使って、細胞および培地成分から、発現された均
一gp350 が精製される。gp350 の小規模分析用調製物は
SDS-PAGEまたはレクチンアフィニティーカラムを使って
最も容易に精製され、そして予防接種または免疫応答実
験用のそのような小規模調製物は液体クロマトグラフィ
ーを使って最も容易に精製される。ワクチン組成物に使
われる商業的に有意な量のgp350 の大規模生産には、限
外濾過、ゲル濾過、イオン交換および疎水的相互作用ク
ロマトグラフィーの組合せが好ましい。

【００６７】本発明の精製された均一のgp350 タンパク
質は、感染性単核球症、バーキットリンパ腫および鼻咽
頭癌のようなＥＢＶ関連状態および疾患を予防または治
療するための治療および／または免疫原性組成物に使う
ことができる。そのような医薬組成物は、医薬上許容さ
れる担体、例えばアジュバント／抗原提示系、例えばミ
ョウバンと共に、免疫原的誘発有効量の１または複数の
本発明の均一gp350 タンパク質を含んで成る。他のアジ
ュバント／抗原提示系、例えばMF59(Chiron Corp.), QS
-21 (Cambridge Biotech Corp.), 3-DMPL（３−デアシ
ルモノホスホリルリピドＡ）（RibiImmunoChem Researc
h,Inc.），臨床用不完全フロイントアジュバント（ＩＦ
Ａ），フゾゲニックリポソーム，水溶性ポリマーまたは
Iscoms（免疫刺激複合体）を使ってもよい。

【００６８】他の典型的な医薬上許容される担体または
溶液は水酸化アルミニウム、食塩水およびリン酸塩緩衝
化食塩水である。該組成物は全身投与することができ、
好ましくは許容される皮下または筋内溶液の形で皮下ま
たは筋内に投与することができる。また表面乱切により
または体腔の接種により接種を行うことができる。ｐ
Ｈ、等張性、安定性などに十分な注意をしたそのような
溶液の調製は、当業者の技術の範囲内である。投薬法
は、薬の作用を変えることが知られている様々な要因、
例えば健康状態、体重、性別、食事、症状の重さ、投与
の期間および他の臨床的要因を考慮して担当医により決
定されるだろう。典型的な用量範囲は約１μｇから約10
00μg のタンパク質を含んで成る。

【００６９】本発明の処置方法を実施する場合、免疫学
的誘発有効量の均一gp350 タンパク質が治療または予防
処置の必要なヒト患者に投与される。本発明の組成物の
免疫学的誘発有効量は、投与１回分あたり約１μｇ〜約
１mgの範囲内であると予想される。投与量の数字は上述
した要因によって異なるだろう。本発明を次の実施例に
おいて更に説明するが、本発明の範囲を限定するのでは
なく本発明を例証することを意図したものである。

【００７０】実施例１．pDTMおよびpSTOP を作製するた
めのgp350/220 の膜貫通領域および膜貫通領域からＣ末
端までの削除 ＥＢＶ B95-8株（Miller他, 1972）からのgp350/220 遺
伝子は、BLLF1 と呼ばれる転写解読枠としてBamHI ライ
ブラリーにおいて入手可能である（Baer, Nature 310:2
07, 1984）。所望の構成物（図９に略図として示され
る）を作製するため、gp350/220 遺伝子を２部分におい
てクローニングした：(1) 2.3 kb HindIII／Bfa Ｉ３′
断片であるBLSH1 および(2)337 bp BanＩ／HindIII
５′断片であるBLSH2 （図８）。

【００７１】Ｃ末端の細胞質および／または膜貫通コー
ド領域の削除を行えるようにそれらの断片を足場（stag
ing）ベクター中にクローニングした。BfaＩ部位はgp35
0 膜貫通（ＴＭ）領域をコードする領域の５′末端に存
在するので、それを使ってＴＭ領域欠失体および近隣の
Ｃ末端欠失を含むＴＭ領域欠失体を作製した。BfaＩを
使って、ＴＭ領域の２アミノ酸だけを保持している欠失
体を作製することができた。

【００７２】1. pSTG1 とpSTG3 からのpDTMの作製 プラスミドpDTMは、完全なＴＭコード領域を欠くgp350/
220 核酸配列から構成される。この構成物は２つの足場
ベクターpSTG1 とpSTG3 を使って作製した。BLLF1 クロ
ーン標的配列を使って、ＴＭ領域の３′末端のところに
BfaＩ部位を導入する450 bpのＰＣＲ生成物SYCTを作製
した（図８および図９）。使用したＰＣＲプライマーは
次の通りである：

【００７３】

【表３】

【００７４】プライマー１のBfaＩ部位を使ってSCYTのB
faI／XmaI断片をpSTG1 中にクローニングした。プライ
マー１の残部はクローンBLLF1 によりコードされるアミ
ノ酸配列に相当する。プライマー２は、gp350/220 転写
解読枠の外側の該遺伝子の３′側の領域に相当する。SC
YT ＰＣＲ断片をBfaIとXmaIで切断して136 塩基対の断
片を得、それを第二の断片であるBLSH1 HindIII ／BfaI
断片と一緒にpMT11 ベクター（SpaeteおよびMocarski,
1985）中にクローニングしてpSTG1 を作製した。

【００７５】BfaI部位を横切る配列分析は、アミノ酸Me
t とLeu を除くＴＭアミノ酸コード領域の全てが削除さ
れたことを示した（表２を参照のこと）。第三のBLLF1
断片であるBLSH2 をpMT11 中にクローニングしてpSTG3
を作製した。gp350/220 遺伝子コード配列の外側の16塩
基対のBanI／XbaIオリゴヌクレオチドリンカーを使っ
て、BLSH2 BanI／HindIII 断片をpSTG3 中にクローニン
グした。2.4 kbのHindIII ／XmaI pSTG1断片を0.3 kbの
XbaI／HindIII pSTG3断片と一緒にpEE14 ベクター（Ce
lltech, 英国）中にクローニングし、pDTM構成物を完成
させた。

【００７６】2. ベクターpSTG2 とpSTG3 を使ったpSTO
P の作製 プラスミドpSTOP は、ＴＭ領域とＴＭ領域に隣接したＣ
末端細胞質領域を欠くgp350/220 遺伝子を含んで成る。
この構成物を作製するために、下記に示すようにBfaI粘
着末端の後の３フレームに終止コドン（下線を引いた部
分）を有する16塩基対のBfaI／EcoRI オリゴヌクレオチ
ドリンカーを作った。

【００７７】

【表４】

【００７８】上側の配列の５′突出部（TA）はBfaI制限
部位のための粘着末端であり、そして下側の配列の５′
突出部（TTAA）はEcoRI 粘着末端である。この16塩基対
リンカーを使って、BLSH1 HindIII ／BfaI断片をpMT11
中にクローニングしてpSTG2を作製した。pSTG2の 2.3 k
b HindIII ／EcoRI 断片とpSTG3 の 0.3 kb XbaI／Hind
III 断片をpEE14 中にクローニングしてpSTOP を作製し
た。

【００７９】3. 野性型、pDTMおよびpSTOP 配列のＴＭ
領域のところの比較 野性型、pSTOP およびpDTMのgp350 ＤＮＡ配列とアミノ
酸配列の３′末端のオリゴヌクレオチド配列と翻訳され
るアミノ酸配列を下の表５に示す。矢印は野性型の膜貫
通領域（ＴＭ）の始まりと終わりを示す。膜貫通領域か
らの２つのアミノ酸、Met₈₆₁とLeu₈₆₂だけがpDTMとpSTO
P 中に保持される（図１〜図７も参照のこと）。pSTOP
中ではLeu₈₆₂の直後に終止コドンがあることに注目され
たい。pDTM中では、削除された膜貫通領域より先の位置
が「ΔＴＭ」と記されている。（この表では、生来のア
ミノ酸が示される。）

【００８０】

【表５】

【００８１】実施例２．pMDTM およびpMSTOPを作製する
ためのgp350/220 遺伝子の供与体および受容体スプライ
ス部位の除去 gp350 タンパク質の均一生産を得るために、gp350/220
遺伝子スプライス部位の高度に保存された塩基と保存さ
れた塩基を変更した。全スプライス部位の100％に存在
する高度に保存されたＧＴ対を含む、供与体スプライス
部位中の４塩基を変更した。２つの保存された供与体部
位塩基ＡＡをＧＴで置き換えた。２つの高度に保存され
た（不変の）供与体スプライス部位塩基をＧＴからＣＡ
に変更した。受容体スプライス部位では、アミノ酸配列
を維持するために高度に保存された受容体スプライス部
位塩基のうちの１つだけを変更した。第二の保存された
受容体スプライス部位塩基は表６に指摘されるように変
更した。表３はgp350/220遺伝子の供与体および受容体
スプライス部位の中の変更された塩基を要約する。

【００８２】

【表６】

【００８３】オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発によ
り変更された塩基は変異体配列中に星印が付けられてい
る。スプライシングの実際部位は矢印により示され、コ
ードされるアミノ酸が記載されている。ヌクレオチド置
換の結果としてアミノ酸配列が変わらないことに注目の
こと。

【００８４】野性型gp350/220 供与体スプライス部位と
受容体スプライス部位ＤＮＡ配列に対するそれらのヌク
レオチド置換は、オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発
を使って達成された。変異ファージベクターM13TACを使
ってZoller, M.E.および Smith, M. (1983) Methods of
Enzymol. 100:468に記載のようにして変異を導入し
た。Asp718とXhoI粘着末端を含む19 bp オリゴヌクレオ
チドリンカーと組み合わせて、ポリリンカー上のAsp718
制限部位とBamHI 制限部位を使ってプラスミドM13TACの
ポリリンカー中にgp350/220 ヌクレオチド配列の BamHI
／XhoI断片をクローニングした。実施例１のプラスミド
M13DTMとM13STOP（図９）を突然変異誘発に使った。

【００８５】突然変異誘発に使用するために２つの42マ
ーオリゴヌクレオチドPrDonor1とPrAcceptor1 を作製し
た。各々、供与体または受容体スプライス部位のいずれ
かの中心を占めるgp350/220 遺伝子配列に相補的である
ようにデザインした。gp350/220 遺伝子に相補的でない
該オリゴヌクレオチドの唯一の領域は所望の変異を示す
塩基であった。突然変異誘発オリゴヌクレオチドは次の
ものから成った：

【００８６】

【表７】

【００８７】突然変異誘発オリゴヌクレオチドの配列は
「プライマー」と標示され、一方でgp350/220 遺伝子ス
プライス部位を含むＤＮＡ配列は「ＥＢＶ」と標示され
ている。突然変異誘発の結果として変更された塩基は星
印が付けられている。点線はスプライスの位置を示して
いる。

【００８８】オリゴヌクレオチドPrDonor1とPrAcceptor
1をM13-DTMとM13-STOPの一本鎖クローンにハイブリダイ
ズさせた。T4 DNAポリメラーゼホロ酵素を使って二本鎖
のM13 ＤＮＡを製造し、その二本鎖ＤＮＡを使ってＥ．
コリを形質転換せしめた。ベクターM13TACを使って、所
望の変異を含まないいずれのクローンも、X-gal とイソ
チオプロピルガラクテートの存在下で白から青への色の
変化により同定することができた。青色プラークを取
り、増殖させ、そしてスプライス接合部にまたがるＤＮ
Ａ配列決定を使って、M13-MDTMおよびM13-MSTOPと命名
された変異体クローンを最終同定した。

【００８９】所望の変異を含むクローンを同定した後、
M13-MDTMとM13-MSTOPから BamHI／XhoI断片を切り取
り、それらをpDTMまたはpSTOP 骨格中に連結し直してそ
れぞれpMDTM とpMSTOPを作製した。それらの構成物をCH
O 細胞中にトランスフェクションし、実施例３に記載の
ように非スプライシング変異体gp350/220 ＤＮＡ配列を
発現させた。

【００９０】実施例３．CHO 細胞中でのgp350 の発現 1. gp350/220 遺伝子構成物のトランスフェクション 哺乳類細胞からの本発明の均一gp350 タンパク質を高レ
ベルで生産する１つの方法は、多重コピーの異種gp350
ＤＮＡ配列を含む細胞の作製を必要とする。異種ＤＮＡ
配列は増幅可能なマーカー（この実施例では、細胞をメ
チオニンスルホキシミンを使って増幅させることができ
るグルタミンシンセターゼ遺伝子）に作用可能に連結さ
れる。

【００９１】実施例２において作製したpMDTM およびpM
STOPベクターを、Crockett, Bio/Technology 8:662 (19
90) の手順に従って且つグルタミンシンセターゼ遺伝子
増幅系についてのCelltech Instruction Manual (1992)
に記載の通りに、後述のごとくCHO 細胞中にトランス
フェクションせしめた。

【００９２】CHO-K1細胞（ATCC CCR61）を、10％ウシ胎
児血清、100 単位／mlのペニシリン、100 mg／mlのスト
レプトマイシン、ＭＥＭ（改良イーグル培地）非必須ア
ミノ酸および１mMピルビン酸ナトリウム（全てJRH Bios
ciences から）が補足されたグルタミン不含有ＥＭＥＭ
（イーグル最少必須培地）中に維持した。該培地に60mg
／mlのグルタミン酸、60 mg／mlのアスパラギン、７mg
／mlのアデノシン、７mg／mlのグアノシン、７mg／mlの
シチジン、７mg／mlのウリジンおよび2.4 mg／mlのチミ
ジン（全てSigma から）も補足した。この培地調製物を
トランスフェクションの間終始使用するが、指摘される
ようなこの処方箋からの変化を伴う。

【００９３】トランスフェクションの１日前に、10cm皿
に３×10⁶ 個のCHO-K1細胞を接種した。トランスフェク
ションの当日、細胞を皿あたり10mlの無血清培地で洗っ
た。常用技術を使ったCaPO₄ 沈澱により、プラスミドＤ
ＮＡ（pMDTM, pMSTOP プラスミドから）を適用した。10
μg の各プラスミドＤＮＡ沈澱物をCHO-K1細胞と２mlの
無血清培地と共に37℃で4.5 時間インキュベートした。
４回のプラスミドＤＮＡトランスフェクションの各々に
３つの複製物を作った。次いでHEPES 緩衝化食塩水中の
15％グリセロールを使って細胞を1.5 分間刺激した。無
血清培地で洗浄した後、細胞に血清含有培地を再び与え
て24時間インキュベートした。

【００９４】翌日、10％透析済ウシ胎児血清（JRH Bios
ciences）を含むように培地を交換し、25μＭメチオニ
ンスルホキシミン（Sigma）の添加により増幅させた。
増幅したクローンが採集に十分な位大きくなるまで（約
13〜14日後）３〜５日毎に細胞にメチオニンスルホキシ
ミン含有培地を再供給した。無菌の200 μｌピペットマ
ンチップを使って皿からコロニーを掻き取ることにより
クローンを採集し、メチオニンスルホキシミン不含有培
地の入った96ウエルプレートの１つのウエルに移した。
１〜２日後、その培地を培地＋25μＭメチオニンスルホ
キシミンと交換した。４日後、培養上清を取り、後述す
るようなELISA アッセイにおいてタンパク質産物につい
てアッセイした。

【００９５】CHO 細胞をpEE14 対照ベクターだけ（ＥＢ
Ｖ配列を全く含まない）でトランスフェクションし、同
様にCHO-pEE14 の24クローンを採集し、プレートに移し
て対照とした。（対照クローンはメチオニンスルホキシ
ミン中での生存に基づいて同定された。）

【００９６】2. ELISA アッセイ トランスフェクション後、241 クローンのCHO-pMDTM と
158 クローンのCHO-pMSTOPを採取し、増殖させた。それ
らのクローンからの上清をgp350 タンパク質生産につい
て試験した。96ウエルプレートを、50 mM ホウ酸ナトリ
ウム緩衝液, pH9中に1:2000希釈されたアフィニティー
精製済ウサギ抗gp350/220 抗体（抗体MDP1；Andrew Mor
gan氏より）でコーティングした。プレートを37℃で３
〜４時間インキュベートし、そしてNunc Immuno Washer
を使ってＰＢＳ＋0.05％Tween 20で３回洗浄した。ブロ
ッティング乾燥後、ＰＢＳ＋0.01％Thimerosal中の２％
ＢＳＡと共に37℃で0.5 時間インキュベートすることに
よりプレートをブロックし、次いで再び洗浄した。

【００９７】トランスフェクションされた細胞と対照細
胞からの上清を該ウエルに添加し、37℃で２時間インキ
ュベートした。次いで、ＰＢＳ洗浄緩衝液中に希釈され
た１mg／mlの一次検出抗体、即ちgp350/220 に対するマ
ウスモノクローナル抗体（抗体#C65221M ; Biodesign I
nternational）と共にプレートを37℃で１時間インキュ
ベートした。洗浄後、該プレートをＰＢＳ＋0.05％ＢＳ
Ａ＋0.01％Thimerosal中0.7 mg／mlの二次抗体、即ちマ
ウス免疫グロブリンに対して向けられた西洋ワサビペル
オキシダーゼ結合ヤギＦ(ab)₂ 断片（ヒトIg吸着精製
済；Biosource International）と共に37℃で１時間イ
ンキュベートした。

【００９８】プレート洗浄後、Stable Peroxide Substr
ate Buffer (Pierce Chemicals) 中に溶かしたABTS (Pi
erce Chemicals）を使って室温で0.5 時間発色させた。
１％ＳＤＳを使って反応を停止させ、Molecular Device
s ELISA プレートリーダーを使って405 nmと650 nmの波
長でプレートを読んだ。24個のpMDTM クローンと18個の
pMSTOPクローンが分泌型gp350 について陽性であった。
最大のELISA シグナルを示すクローンをスケールアップ
のため24ウエルプレートに移し、ウエスタンブロットと
放射線免疫沈澱アッセイにおいて更に試験した。

【００９９】3. ウエスタンブロットおよび放射線免疫
沈澱アッセイ 最初のスクリーニングでは、ウエスタンブロットを使っ
てpMDTM トランスフェクションからの組織培養上清を活
性についてアッセイした。CHO 細胞上清を５％SDS-PAGE
ゲル上で精製し、ニトロセルロースに一晩移行させ、そ
して抗gp350 抗体を使って探査した。このウエスタンブ
ロット分析において７個のpMDTM クローンがgp350 陽性
であるとわかった。

【０１００】ウエスタンブロットで陽性であったpMDTM
クローンを更にgp220 の存在について放射線免疫沈澱法
により試験した。選択された形質転換されたpMDTM 細
胞、pEE14 対照細胞および GH3Δ19対照細胞（後述）
を、実験の日に約3/4 周密的であるように６ウエルプレ
ート上で一晩増殖させた。各ウエルは5 ×10⁶ 細胞を含
んだ。標識のため、各ウエルから培地を取り除き、0.7
mlのメチオニン不含有ＭＥＭ（10％ウシ胎児血清）＋10
0 μCiの³⁵Ｓ−メチオニンで置き換えた。細胞を37℃で
5.5 時間インキュベートし、次いで4000 rpmで５分間遠
心した。

【０１０１】50％スラリーでの10μｌのセファロース−
プロテインＡ（Sigma）と20μｌのモノクローナル抗gp3
50/220 抗体（抗体#C65221M, 100 mg／ml ; Biodesign
International）の添加により、４℃で一晩揺り動かし
ながら、上清中の均一gp350タンパク質を免疫沈澱せし
めた。次いで超遠心機中で2000 rpm, 室温で２分間混合
物をペレットにし、数倍容のリン酸塩緩衝化食塩水で４
回洗浄した。最終洗浄後、ペレットから全ての液体を除
去し、50μｌのタンパク質ゲル試料緩衝液で置換した。
沈澱した免疫複合体を含む試料を５分間煮沸し、５％SD
S-PAGE上で泳動した。免疫沈澱物を、タンパク質試料緩
衝液と１：１で混合した組織培養上清のゲル試料と比較
した。ゲルを乾燥し、次いでHyperfilm β-Max (Amersh
am)を使ってオートラジオグラフィーを行った。

【０１０２】図10は、放射線免疫沈澱のSDS-PAGE分析の
オートラジオグラフ結果を示す。陽性対照として使った
細胞系は GH3Δ19（Elliot Keiffより提供；Whang 他,
1987）であった。 GH3Δ19細胞は、膜貫通領域とＣ末端
細胞質領域を欠いている端が切り取られた形のgp350/22
0 タンパク質を分泌する。陰性対照として使用するため
に、pMDTM トランスフェクションと並行して、CHO 細胞
をpEE14 ベクターのみでトランスフェクションしそして
メチオニンスルホキシミンにより選択した。

【０１０３】図10には、偶数のレーンに示された免疫沈
澱物（「Ｉｐ」）と互い違いに、奇数のレーンに上清
（「Ｓ」）が示される。対照レーン２において、 GH3Δ
19対照細胞からの沈澱物は約220 kDと350 kDのところに
２本の強いタンパク質バンドを生じ、端が切り取られた
スプライス変異体gp350 およびgp220 タンパク質の約
１：１の比での生産を証明する。予想通り、免疫沈澱さ
せたそれらのバンドはレーン１の放射能標識した組織培
養上清（免疫沈澱させてない試料）に関して濃縮され
る。また、予想通り、pEE14 ベクターはgp350/220 構成
物のいずれも含まないので、陰性対照（レーン４）には
全くバンドが観察されない。

【０１０４】レーン６，８および10におけるpMDTM クロ
ーンの上清からの免疫沈澱のSDS-PAGE分析は、約350 kD
のところに一本の強いバンドを生じる。この分子量は G
H3Δ19対照レーン２の大きい方の分子量の種と同じであ
る。しかしながら、 GH3Δ19対照レーンとは異なり、レ
ーン６，８および10には約220 kDのところに追加の強い
バンドが見られない。ただし、レーン８には、わずかに
小さい分子量で移動するごく弱いバンドが観察される。
これは、欠失した供与体および受容体スプライス部位を
生来のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列に戻す変異現
象または誤翻訳から生じる少量のgp220 タンパク質、分
解産物、または共沈した細胞産物を表す可能性がある。
約350 kDのところの強い一本のバンドは試験した他の５
つのMDTM複製物にも観察された（データは示してな
い）。

【０１０５】レーン６とレーン10における220 kDのバン
ドの完全な欠失は、MDTM上清からの不完全な沈澱のため
ではないようである。何故なら、³⁵Ｓ−標識 GH3Δ19対
照レーン２には220 kDのバンドが容易に認められるから
である。また、野性型スプライス部位を含む実施例１の
pDTM構成物を使った追加の分析は、350 kDと220 kDのと
ころに２つの強いバンドを生じた。従って、それらの結
果は、スプライス部位の欠失がgp220 タンパク質生産の
不在下でのgp350 タンパク質生産を引き起こすことを証
明する。

【０１０６】CHO 細胞系、または他の哺乳類もしくは非
哺乳類細胞系中で発現されたこの均一gp350 タンパク質
を更にスケールアップすることができ、レクチンアフィ
ニティークロマトグラフィー、逆相HPLC、FPLC、ゲル濾
過等といった技術をはじめとする当業者によく知られた
方法を使って、該細胞系からの順化培地より精製するこ
とができる。 David, J. Immunol. Methods 108:231 (1
988)および Madej, Vaccine 10:777 (1992) を参照のこ
と。

【０１０７】4. pMDTM タンパク質のノーザンブロット
分析 この実験では、MDTM-1細胞がgp350 RNA を生産しgp220
RNA を生産してないことをノーザンブロットにより証明
し、スプライス部位の変異がgp220 生産を防ぐという別
の段階での確証を提供する。

【０１０８】gp350 に相補的なＤＮＡプローブをpDTMか
ら作製した。実施例１を参照のこと。464 bpのXhoI／Ps
tI pDTM 断片としてgp350/220 プローブ鋳型XP464 を単
離した。XP464 はgp350 とgp220 の両方を認識する。gp
350 特異的プローブAN537 を作製するために、pDTMをNc
oIとNdeIで切断し、２つの重複する580 b.p.断片を単離
し、そして１つの混入断片を除去するためにXmnIと、gp
350/220 スプライス部位の内部の537 b.p. AluI ／NdeI
断片を得るためにAluIで該混合物を切断した。AN537 は
gp220 からスプライシングで除去される領域に特異的で
あり、従ってgp350 情報に特異的である。ＤＮＡ断片XP
464 とAN537 を使ってＤＮＡプローブを ³²P-dCTPニック
トランスレーション（Amersham）により標識した。

【０１０９】全細胞ＲＮＡは、ChomczyunskiおよびSacc
hi, Anal. Biochem., 162:156-59 (1987) の方法に本質
的に従って調製した。CHO-pEE14（陰性対照細胞系、実
施例１参照）、CHO-MDTM-1およびCHO-DTM-7 細胞（90％
集密的）の各々２本ずつのT-250 フラスコから培地を吸
引し、細胞を溶解させ、そして変性緩衝液（10mlの４Ｍ
グアニジンチオシアネート，25mMクエン酸ナトリウム，
pH 7.0，0.5 ％サルコシル，100mM ２−メルカプトエタ
ノール）中で削り落とした。

【０１１０】各10mlの溶解物に１mlの２Ｍ酢酸ナトリウ
ム（pH 4）、10mlの飽和フェノール（pH 4.5）および２
mlのクロロホルム／イソアミルアルコールを補足し；該
溶解物を氷上で15分間インキュベートし、４℃にて1000
0 ×g で20分間遠心し、そして上側の水相を取り出し
た。この水相から１容のイソプロパノールの添加により
20℃で１時間ＲＮＡを沈澱させ、４℃でペレット化し、
変性緩衝液中に再懸濁し、そして再沈澱させた。ＲＮＡ
ペレットを70％エタノール中で１回洗浄し、Speed-Vac
中で乾燥し、そしてDEPC処理した水に再懸濁した。

【０１１１】DTM-7 およびMDTM-1全細胞ＲＮＡを15％ホ
ルムアミドと６％ホルムアルデヒド中で65℃にて15分間
変性させ、１％アガロース／6.6 ％ホルムアルデヒドゲ
ル上で泳動し、次いで毛管作用によりニトロセルロース
に移行させ、そして標識したXP464 とAN537 を使って探
査した。５分間煮沸することによってこれらのＤＮＡプ
ローブを変性させ、５×ＳＳＰＥ中で65℃にて一晩ハイ
ブリダイズさせ、そしてニトロセルロースを高緊縮条件
下で洗浄した。Bio-Rad Phosphor-imagerを使ってオー
トラジオグラフィーを行った。

【０１１２】CHO-MDTM細胞からの全細胞ＲＮＡのノーザ
ンブロットは、gp220 特異的ＲＮＡ生産を抑制すること
に対するスプライス変異の有効性を示す。gp350 特異的
プローブであるAN537 は、gp350 特異的プローブに予想
される通り、MDTM-1細胞とDMT-7 細胞中の１種類のＲＮ
Ａだけに結合した（図11，レーン１と２）。スプライス
変異がMDTM-1中でgp220 情報の生産を抑制しているとす
れば予想通り、gp350ＲＮＡとgp220 ＲＮＡの両方に特
異的であるXP464プローブはDTM-7 では２つの種を認識
し、MDTM-1では一本の大きい方の分子量バンドを認識し
た（図11，レーン４と３）。MDTM-1レーンはgp350 特異
的ＲＮＡに対して過負荷であるにもかかわらず、明瞭な
gp220 ＲＮＡは全く検出不可能であった。

【０１１３】MDTM-1とDTM-7 レーンにおいてgp350 情報
の見かけ移動度に差がある理由は明らかでない。MDTM-1
種はDTM-7 に比較して過負荷であるので、それがゲル上
での移動に影響したのかもしれない。また、gp350 情報
はゲル上で大きなリボソームＲＮＡバンドに接近して移
動するため、それが見かけ分子量をゆがめるのかもしれ
ない。いずれにせよ、gp350 ＤＮＡ配列に相補的な単一
種の存在は、このシグナルがgp350 mRNAを表すことを示
唆する。よって、ノーザンブロットから判断すると、供
与体および受容体スプライス部位における突然変異はgp
220 情報の生産を抑制するのに有効である。この結果
は、gp350/220 に特異的なモノクローナル抗体を使った
放射線免疫沈澱により並びにMDTM-1上清とDTM-7 上清の
ウエスタンブロットにより更に確証される。

【０１１４】実施例４．免疫原性活性についての均一gp
350 タンパク質の試験 精製した均一gp350 タンパク質を次のようにして投与に
適当な賦形剤中に配合しそしてマウスに投与する。Davi
d, J. Immunol. Methods 108:213 (1988)および Allis
on, J. Immunol.Methods 95:157 (1986) の手順に従っ
て、Pluronic L121 とスクアランを（Thr¹）MDP と共に
リン酸塩緩衝化食塩水中の0.4 ％(v/v) Tween 80中で混
合することにより、２×アジュバント−賦形剤濃縮物を
調製する。

【０１１５】投与用組成物は、同容量のタンパク質とア
ジュバント−賦形剤の添加により投与日に調製する。タ
ンパク質含量は用量あたり５μｇ〜50μｇの範囲内であ
るべきである。０，21および42日目の３回の0.1 ml筋肉
内注射によりBALB/cマウスを免疫する。後眼窩洞から免
疫前の血液と各注射の10日後に採血した血液を得る。実
施例３に記載の手順に従ったELISA により血清抗体価を
測定する。血清中のＥＢＶ中和抗体は、Moss, J. Gen.
Viol. 17:233 (1972)および De Schryver, Int. J. Can
cer 13:353 (1974)の方法に従って、試験管内でＥＢＶ
による胎児臍帯血リンパ球の形質転換を阻害するそれら
の能力により定量する。

【０１１６】あるいは、前述のアジュバント中に乳化さ
せたタンパク質の０，21，42，63および84日目の５回の
筋肉内投与によりニュージーランド白ウサギに接種す
る。用量は接種１回あたり約５μｇ〜50μｇの範囲内で
ある。最後の投与の二週間後に血清を得、抗原に対する
抗体価について、B95-8 細胞からのウイルスgp350/220
に対する交差反応性抗体について、および Emini, Viro
logy 166:387 (1988) の方法に従った試験管内ＥＢＶ中
和活性について試験する。

【０１１７】ＥＢＶのgp350/220 タンパク質は既に確立
されているＥＢＶ感染の動物モデル〔Epstein, Clin. E
xp. Immunol. 63:485 (1986) を参照のこと〕において
防御免疫を誘導することができるので、均一gp350 タン
パク質組成物の投与からも同様な良性結果が期待され
る。本明細書中に指定した全ての刊行物の開示は本明細
書中に組み込まれる。本発明の範囲内での変更は当業者
にとって明白であろうから、上述の詳細な説明は理解の
明確化のために与えられるのであって、そこから無用な
制限が解釈されたり推測されたりしてはならない。

【０１１８】 配 列 表 一般情報： 出願人：Spaete, Richard およびJackman, Winthrop, T. 発明の名称：gp350/220 の非スプライシング変異体 配列番号１： 配列の長さ：27塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：未定 配列の種類：オリゴマーＤＮＡ 配列 GGATCCTAGA CTGCGCCTTT AGGCGTA 27

【０１１９】 配列番号２： 配列の長さ：19塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：未定 配列の種類：オリゴマーＤＮＡ 配列 GACTGCGCCT TTAGGCGTA 19

【０１２０】 配列番号３： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Asp Cys Ala Phe Arg Arg 1 5

【０１２１】 配列番号４： 配列の長さ：27塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：未定 配列の種類：オリゴマーＤＮＡ 配列 GGATCCTCTG TTCCTTCTGC TCCAGTG 27

【０１２２】 配列番号５： 配列の長さ：21塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：未定 配列の種類：オリゴマーＤＮＡ 配列 TCTGTTCCTT CTGCTCCAGT G 21

【０１２３】 配列番号６： 配列の長さ：16塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：未定 配列の種類：オリゴマーＤＮＡ 配列 TATAGACTAG TCTAGG 16

【０１２４】 配列番号７： 配列の長さ：18塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：未定 配列の種類：オリゴマーＤＮＡ 配列 ATCTGATCAG ATCCTTAA 18

【０１２５】 配列番号８： 配列の長さ：39塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：未定 配列の種類：オリゴマーＤＮＡ 配列 AACCTCTCCA TGCTAGTACT GGTCATGGCG GACTGCGCC 39

【０１２６】 配列番号９： 配列の長さ：13アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Asn Leu Ser Met Leu Val Leu Val Met Ala Asp Cys Ala 1 5 10

【０１２７】 配列番号10： 配列の長さ：30塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴマーＤＮＡ 配列 AACCTCTCCA TGCTATAGAC TAGTTCTAGG 30

【０１２８】 配列番号11： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Asn Leu Ser Met Leu 1 5

【０１２９】 配列番号12： 配列の長さ：24塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴマーＤＮＡ 配列 AACCTCTCCA TGCTAGACTG CGCC 24

【０１３０】 配列番号13： 配列の長さ：８アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Asn Leu Ser Met Leu₈₆₂ Asp₈₈₂ Cys Ala 1 5

【０１３１】 配列番号14： 配列の長さ：42塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴマーＤＮＡ 配列 GGTCATGTCG GGGGCCTTTC ACTCTGTGCC GTTGTCCCAT GG 42

【０１３２】 配列番号15： 配列の長さ：42塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴマーＤＮＡ 配列 GGTCATGTCG GGGGCCTTAC TTTCTGTGCC GTTGTCCCAT GG 42

【０１３３】 配列番号16： 配列の長さ：42塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴマーＤＮＡ 配列 CTGTGTTATA TTTTCACCTC CAGTTGGGTG AGCGGAGGTT AG 42

【０１３４】 配列番号17： 配列の長さ：42塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴマーＤＮＡ 配列 CTGTGTTATA TTTTCACCAC CTGTTGGGTG AGCGGAGGTT AG 42

【０１３５】 配列番号18： 配列の長さ：3833塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：未定 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：1014..3734 配列

【化１】

【０１３６】

【化２】

【０１３７】

【化３】

【０１３８】

【化４】

【０１３９】

【化５】

【０１４０】

【化６】

【０１４１】

【化７】

【０１４２】

【化８】

【０１４３】

【化９】

【０１４４】

【化１０】

【０１４５】

【化１１】

【０１４６】

【化１２】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はgp350/220 のＤＮＡおよびアミノ酸配列
を表す〔Beisel, J. Virology 54:665 (1985) より〕。
ヌクレオチドの番号は左側に示され；アミノ酸の番号は
配列の下に示される。

【図２】図２はgp350/220 のＤＮＡおよびアミノ酸配列
を表す〔Beisel, J. Virology54:665 (1985) より〕。
星印（＊）は推定上のシグナル配列の終わりを表す。ヌ
クレオチドの番号は左側に示され；アミノ酸の番号は配
列の下に示される。

【図３】図３はgp350/220 のＤＮＡおよびアミノ酸配列
を表す〔Beisel, J. Virology54:665 (1985) より〕。
ヌクレオチドの番号は左側に示され；アミノ酸の番号は
配列の下に示される。

【図４】図４はgp350/220 のＤＮＡおよびアミノ酸配列
を表す〔Beisel, J. Virology54:665 (1985) より〕。
供与体スプライス部位が指示される。ヌクレオチドの番
号は左側に示され；アミノ酸の番号は配列の下に示され
る。

【図５】図５はgp350/220 のＤＮＡおよびアミノ酸配列
を表す〔Beisel, J. Virology54:665 (1985) より〕。
受容体スプライス部位が指示される。ヌクレオチドの番
号は左側に示され；アミノ酸の番号は配列の下に示され
る。

【図６】図６はgp350/220 のＤＮＡおよびアミノ酸配列
を表す〔Beisel, J. Virology54:665 (1985) より〕。
膜貫通領域は横の矢印で輪郭が描かれる。ヌクレオチド
の番号は左側に示され；アミノ酸の番号は配列の下に示
される。

【図７】図７はgp350/220 のＤＮＡおよびアミノ酸配列
を表す〔Beisel, J. Virology54:665 (1985) より〕。
ヌクレオチドの番号は左側に示され；アミノ酸の番号は
配列の下に示される。

【図８】図８は、gp350 の欠失および部位特異的変異体
の作製を表す。およそ一定のスケールで下のコードクロ
ーンBLLF1 と共にgp350 タンパク質の直鎖状モデルが示
される。タンパク質上にはＮ末端シグナル配列（ＳＳ）
と膜貫通領域（ＴＭ）が示され、遺伝子地図上には重要
な制限部位が示されている。gp350 遺伝子はHindIII ／
BfaＩBLSH1 断片と BanＩ／HindIII BLSH2断片の２部
分においてクローニングした。SCYTは指摘されたBLLF1
の領域からポリメラーゼ連鎖反応を使って作製した。

【図９】図９は、gp350 の欠失および部位特異的変異体
の作製を表す。pMDTM およびpMSTOPと表示されたプラス
ミド地図は本発明の非スプライシングgp350/220 変異体
を例示する。pDTM, pSTOP, pMDTMおよびpMSTOPのクロー
ニングスキームが描写されている（プラスミドは一定の
スケールではない）。クローニングの詳細は実施例１と
２に記載される。プラスミド地図には、関連する制限部
位、使用したクローニングベクター、およびgp350 遺伝
子断片が標示されている。pMDTM とpMSTOP中のスプライ
ス部位の変異は星印により示される。

【図１０】図10は、SDS-PAGEにより分析した時のpMDTM
クローンからの均一gp350 タンパク質の免疫沈澱の結果
を表す。gp350/220 タンパク質の端が切り取られた形を
分泌する陽性対照（GH3Δ19）細胞、陰性対照（pEE14）
細胞および幾つかのpMDTMクローンを、5.5 時間³⁵Ｓ−
メチオニンで代謝的に標識し；得られた組織培養上清か
ら均一gp350 タンパク質を免疫沈澱させた。各細胞型に
ついて、標識された組織培養上清（Ｓ）とgp350/220 沈
澱物（Ｉｐ）の試料を５％ SDS-PAGE （ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動）上で電気泳動した。分子量マーカー
の位置が左側に示されている。

【図１１】図11は、実施例3.4 に記載されるような、Ｃ
ＨＯ細胞中で発現されたpMDTM クローンからのタンパク
質のノーザンブロット分析の結果を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/05 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ジャックマン，ウィンスロップ ティー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94703, バークレー，デラウェア ストリート ＃１ 1828 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA32 CA04 CA06 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA04 GA11 4B064 AG01 CA02 CA05 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AA95Y AB01 BA02 CA24 CA45 4C084 AA02 AA06 AA07 BA44 CA01 DC50 NA14 ZA342 ZA592 ZB262 ZB332 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA86 EA31 FA74

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 EBV gp350タンパク質をコードするか、
   あるいは生成物の分泌をもたらす膜貫通領域の欠失、膜
   貫通領域と残りのＣ末端の欠失、及び／又はシグナル断
   片の欠失、により短縮された形のEBV gp350をコード
   し、且つgp220 mRNA転写物の生成を回避するようにスプ
   ライス部位もしくはその近傍の１もしくは複数の塩基に
   変異を有する単離されたDNA断片において、このスプラ
   イス部位もしくはその近傍の変異が、 (1) ドナースプライス部位を含む野生型配列：GAA[Glu]
   −A|GT[Ser]₅₀₁におけるGluをコードするコドンからAs
   n、AspもしくはGlnをコードするコドンへの変更又はSer
   をコードするコドンからAla、GlyもしくはThrをコード
   するコドンへの変更；あるいはアクセプタースプライス
   部位を含む野生型配列：ACA[Thr]−G|GT[Gly]₆₉₈におけ
   るThrをコードするコドンからAla、GlyもしくはSerをコ
   ードするコドンへの変更又はGlyをコードするコドンか
   らSerもしくはThrをコードするコドンへの変更；あるい
   は(2) ドナースプライス部位を含む野生型配列：GAA[Gl
   u]−A|GT「Ser]₅₀₁におけるGAA[Glu]からGAG[Glu]への
   変更又はAGT[Ser]からTCA[Ser]への変更、あるいはアク
   セプタースプライス部位を含むACA[Thr]−G|GT[Gly]₆₉₈
   のACA[Thr]からACT[Thr]への変更又はGGT[Gly]からGGA
   [Gly]への変更、から選択れる１又は複数の変異である
   ことを特徴とするDNA断片。
2. 【請求項２】 スプライス部位もしくはその近傍の１も
   しくは複数の塩基における前記変異が、ドナースプライ
   ス部位又はその近傍における変異である、請求項１に記
   載のDNA断片。
3. 【請求項３】 スプライス部位もしくはその近傍の１も
   しくは複数の塩基における前記変異が、アクセプタース
   プライス部位又はその近傍における変異である、請求項
   １に記載のDNA断片。
4. 【請求項４】 スプライス部位もしくはその近傍の１も
   しくは複数の塩基における前記変異が、ドナースプライ
   ス部位又はその近傍及びアクセプタースプライス部位又
   はその近傍の両方における変異である、請求項１に記載
   のDNA断片。
5. 【請求項５】 生成物が分泌されるように、膜貫通領域
   中の18〜21個のアミノ酸が除去された短縮形のEVD gp35
   0をコードする請求項１〜４のいずれか１項に記載のDNA
   断片。
6. 【請求項６】 スプライス部位もしくはその近傍の１も
   しくは複数の塩基における前記変異が、前記ドナースプ
   ライス部位を含むその近傍域における変異である、請求
   項５に記載のDNA断片。
7. 【請求項７】 スプライス部位もしくはその近傍の１も
   しくは複数の塩基における前記変異が、前記アクセプタ
   ープライス部位を含むその近傍域における変異である、
   請求項５に記載のDNA断片。
8. 【請求項８】 （ａ）配列番号18：のコドン19〜862； （ｂ）配列番号：18のコドン１〜862； （ｃ）配列番号：18のコドン19〜862及び882〜907；並
   びに （ｄ）配列番号：18のコドン１〜862及び882〜907； から成る群から選択された断片と同じアミノ酸配列断片
   コードする、請求項１に記載のDNA断片。
9. 【請求項９】 請求項１〜８の何れか１項に記載のDNA
   断片を含んで成るベクター。
10. 【請求項１０】 請求項１〜８の何れか１項に記載のDN
    A断片であって、該DNA断片の複製及び発現を指令するこ
    とが出来る発現制御断片に作用可能に関連しているDNA
    断片、により形質転換された宿主細胞。
11. 【請求項１１】 適切な培地中で請求項10に記載の宿主
    細胞を培養し、そして該細胞から前記gp350タンパク質
    を単離することを含んで成る、gp350タンパク質の製造
    方法。
12. 【請求項１２】 EBV gp350が細胞外ドメインと細胞質
    ドメインとの融合体として発現されるように膜貫通ドメ
    インにおける欠失を含み、そして非機能的スプライス部
    位を含むDNA断片によりコードされ、可溶性形でありそ
    してEBV gp220を伴わない、均一なEBV gp350タンパク
    質。
13. 【請求項１３】 請求項12に記載の均一なEBV gp350タ
    ンパク質を含んで成る、EBV関連疾患又は状態の予防的
    処置のための医薬組成物。
14. 【請求項１４】 前記膜貫通ドメインの除去が、配列番
    号：18におけるSer860からAla881までの除去を含んで成
    る、請求項12に記載のEBV gp350タンパク質。
15. 【請求項１５】 EBV gp350が細胞外ドメインと細胞質
    ドメインとの融合体として発現されるように膜貫通ドメ
    インにおける欠失を含み、そして非機能的スプライス部
    位を含むDNA断片によりコードされたEBV gp350タンパク
    質を発現し、そしてそれを培地中に分泌する細胞の培地
    から単離された、可溶性でありそしてEBV gp220を含ま
    ない均一なEVB gp350タンパク質を含んで成る、EBV関連
    疾患又は状態の予防的処置のための組成物。