HU221647B1 - Az EBV gp350 fehérjét kódoló DNS-szakasz - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya homogén gp350 fehérjét kódoló DNS-szekvencia; anevezett DNS-szekvenciát tartalmazó vektor; a nevezett vektorraltranszformált gazdasejt; a homogén gp350 fehérjét eredményező eljárás;maga a homogén gp350 fehérje; a nevezett homogén gp350 fehérjéttartalmazó, az EBV-vel kapcsolatos betegségek megelőzésére vagykezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény, illetve a fehérjékalkalmazása a gyógyszerkészítmények előállítására. ŕ

Description

A herpeszvírusok csoportjába tartozó Epstein-Barrvírus (EBV) fertőző mononukleózist okoz az emberben. Ez a betegség a népesség több mint 90%-át érinti. Megállapították, hogy az Amerikai Egyesült Államokban e betegség évi 100 millió dollár kiadást okoz. A vírus elsősorban a vírust hordozó egyének nyálán keresztül terjed. Az EBV-vel fertőzött gyerekeknél az állapot általában tünetmentes vagy nagyon enyhe tünetekkel jár, míg a fertőzött serdülőknél és felnőtteknél tipikus fertőző mononukleózis alakul ki, amit láz, garathurut és nyirokcsomó-elváltozás jellemez. Akik átesnek a fertőzésen, a további életük folyamán rendelkeznek az antiEBV-antitestekkel, így a későbbi fertőzéssel szemben már immunisak. Jelenleg nincs forgalomban EBVvakcina.

Fertőző tulajdonságai mellett, az EBV-ről kimutatták, hogy a limfocitákat gyorsan osztódó sejtekké alakítja át, és ezért közrejátszik néhány különféle limfóma ideértve a Burkitt-limfómát - és a száj-leukaplakia kialakulásában. Ugyancsak kimutatták az EBV-t az orrgarat daganatok szöveti mintáiban is. Világviszonylatban 80 000 orr-garat rákos megbetegedéssel számolnak, és különösen gyakori a kínaiak között.

Élő, legyengített EBV-vakcina van, de alkalmazása problematikus. Az EBV potenciális onkogén természete miatt a kutatók idegenkednek egy élő vakcina alkalmazásától. A találmány megkerüli az élő vakcinával járó problémát, minthogy a vakcina alegységére fejleszt ki olyan előállítási eljárást és készítményt, ami nem igényli a potenciálisan rákkeltő élő vírus felhasználását. A vakcinaalegység a vírus egy vagy több olyan antigénfehéijéjét alkalmazza, melyek immunválaszt váltanak ki és immunitást biztosítanak.

A több fontos antigén EBV-fehéqe közül kettő a gp350/300 és a gp220/200 glikoprotein, melyek a vírusköpeny membránjának képezik részét, és lehetővé teszik, hogy a vírus kapcsolatba lépve a CD21 sejtmembránfehérjével [Nemerow, J. Virology 61:1416 (1987)] hozzákötődjön a célsejthez és beléphessen a sejtbe. Ezek a fehérjék már régóta kiszemelt alegységvakcinajelöltek, de akadályozta a kutatók tevékenységét és a vakcina kifejlesztését, hogy nehéz aktív antigénfehéijét kitisztítani természetes forrásból, a rekombináns technika pedig alacsony hozammal jár. Az irodalomban különböző molekulatömeggel szerepelnek [az egyik fehérje 350 vagy 300 kilodaltonnal, a második 220 vagy 200 kilodaltonnal (kD)]. A gp35O vagy 300 fehérje a jelen találmányban mint gp350 fehéije, a gp220 vagy 200 fehérje, mint pg220 fehéije szerepel. A két fehéijét együtt gp350/220 fehérjé(k)nek nevezzük.

Egyetlen alternatívan illeszkedő (spliced) gén kódolja a gp350/220 fehérjéket és ettől származnak a gp350 és a gp220 mRNS-transzkriptumok; ismertek a gp350/220 gén illeszkedési helyeinek nem természetes változatai. A gén két expressziós terméket eredményez, a gp350 és a gp220 fehérjéket. A gp350/220 DNS-szekvencia nyílt leolvasási kerete 2721 bázispárú (bp). A teljes leolvasási keret kódolja a gp350 907 aminosavját [Kieflf, 4 707 358 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom (1987)]. A leolvasási keret összeillesztett változata (spliced version) 2130 bázist fed le és a

710 aminosavból álló gp220 fehérjére transzlálódik át.

A gp350 és a gp220 fehéije elméleti molekulatömege kD, illetve 70 kD. Az expresszált gp350 és gp220 fehérjék mért molekulatömege változó, de körülbelül

350 kD, illetve 220 kD. Az elméleti és a tényleges molekulatömeg közötti különbség a fehérje nagyfokú glikozilezettségének tulajdonítható. Bármelyik sejtben a gp350 és a gp220 fehéije 6:1 és 1:1 mólarányok közötti tartományon belül termelődik. így például a

B95-8 sejtekben, melyek állandóan fertőzöttek EBVvel, az arány változó, de néha megközelíti a 6:1 arányt _ [Miller, Proc. Natl. Acad. Sci., 69:383 (1972)].

Rekombináns technikával előállítva ezeket a glikoproteineket, ez ideig ugyancsak a gp350 és gp220 fehérjék keverékét kapták. A gp350/220 fehérjéket eddig patkány agyalapimirigy-sejtjeiben, kínaihörcsög petefészeksejtjeiben, VERŐ- (afrikai zöld majom veséje) sejtekben, valamint élesztősejtekben expresszálták [Whang, J. Virol., 61:1796 (1982), Motz, Gene,

44:353 (1986) és Emini, Virology, 166:387 (1988)].

Ugyancsak felhasználták a szarvasmarha-papillomavírus vírusexpressziós rendszerét a gp350/220 fehérjék egér-fibroblasztsejtben való előállítására [Madej,

Vaccine, 10:777 (1992)]. A vacciniavirus laboratóriumi és vakcinatörzseit ugyancsak alkalmazták a> gp350/220 fehérjék expresszálására. Az EBV gp350/220 DNS és fehéije módosított rekombináns változatai ismertek a szakterületen. Nevezetesen elkészítet* » ték a transzmembránszekvenciát nem tartalmazó/ gp350/220 gén megcsonkított rekombináns konstruk- | cióját. Ezek a konstrukciók még termelnek gp350 és, | gp220 keveréket, de a transzmembránrégió kiesése le* | hetővé teszi a fehérjék szekrécióját [Finerty, J. Gén. Vi- l rology, 73:449 (1992) és Madej, Vaccine, 10:777 | (1992)]. Ugyancsak elkészítették és E. coliban kifejez- f ték a különböző gp350/220 szekvenciákat tartalmazó, í rekombinációs technikával előállított restrikciós frakciókat, illetve fúziós fehérjéket [EP 0 173 254 szabadalmi bejelentés, közzétéve 1991. július 24-én],

A gp350/220 fehérjékkel kapcsolatos EBV-kutatás ez ideig a gp350/220 natív szekvencia hatékony kifejezésére, a transzmembrándomént nem tartalmazó módosított szekvenciára - mely esetek a natív, illetve a transzmembránrégiót nem tartalmazó, alternatív módon összeillesztett két fehéije keverékét eredményezik - vagy a β-galaktozidáz fúziós fehérjék epitóp fragmensszekvenciáinak előállítására irányult.

Részlegesen tisztított gp350/220 preparátum ismert _; [Finerty, J. Gén. Virology, 73:449 (1992)] (rekombinációs technikával előállítva, részlegesen tisztítva). A legtöbb esetben a natív gp350/220 fehéije tisztítási eljárásai a fehéije antigenitásának inaktiválódását eredményezik, alkalmatlanná téve a fehéijét az alegységvakcinában való felhasználásra. Aktív antigén hatású, nagy tisztaságú gp350 fehéije natív (azaz nem rekombináns) forrásból való előállításáról azonban beszámol a szakiroda- ;

lom [Dávid, J. Immunoi. Methods, 108:231 (1988)]. ^r

Továbbá gp350/220 proteint expresszáló, rekombináns vakcinavírust használtak az oroszlánmajmocskák

HU 221 647 Bl (Cottontop tamarin) vakcinálására EBV indukálta limfóma ellen [J. Med. Virology, 25:189 (1988); Mackett, EMBO J., 4:3229 (1985) és Mackett, „Vaccines ’86”

293. old. (szerk: Lemer RA, Chanock RM, Brown F., Cold Spring Harbor Laboratory, 1986)]. Mindmáig 5 azonban nem készítettek olyan vírus gp35O/22O DNSszekvenciát, mely képes lenne a gén eltérően összeillesztett változatainak csak egyikét kifejezni, ami lehetővé tenné és biztosítaná a tiszta gp35O vagy gp220 fehérje termelését. Nem készült olyan rekombináns vagy mu- 10 tált vírus sem, mely csak a gp350 vagy csak a gp220 fehérjét expresszálná.

Általában az illeszkedési (splice) helyek meggyorsítják a pre-mRNS-molekulák késői mRNS-molekulákká való alakulását. A poliomavírusban illeszkedési he- 15 lyekre van szükség a késői mRNS hatékony felgyűléséhez. A poliomavirusnál a 3’ és 5’ illeszkedési helyek megváltoztatása lassítja az átírást vagy teljesen leállítja az mRNS felszaporodását [Treisman, Natúré, 292:595 (1981)]. Az SV40 vírusnál kivágható köztes szekven- 20 ciák elősegítik az mRNS-magból történő kiszállítását és az mRNS-magban való stabilizációját, és minthogy ezek az intron/exon kapcsolódási szekvenciák gyorsítják a magban lévő, kis RNP-részecskék kötődését, úgy vélik, hogy az előre összeillesztett mRNS-ek nem képe- 25 sek megfelelően bekapcsolódni a feldolgozási folyamatokba. Kimutatták, hogy az exon/intron illeszkedési helyeknél történő pontmutációk csökkentik az exon/intron hasíthatóságát és megszakítják a pre-mRNS feldolgozási folyamatát, a magból történő kiszállítást és ront- 30 ják a stabilitást [Ryu, Virology, 63:4386 (1989) és Gross, Natúré 286:634 (1980)].

A jelen találmányig nem volt ismert és előre megjósolható, hogy milyen hatással lesz az illeszkedési helyek módosítása az EBV gp350/220 szekvencia által kó- 35 dőlt fehérjék funkcionális expressziójára és antigénaktivitásukra.

További háttérirodalom: Az EBV biológiájáról és az általa okozott betegségekről Straus ad összefoglaló áttekintést [Annál of Int. Med., 118:45 (1993)]. EBV 40 BLLTI open reading fiamé leírása: Baer, Natúré, 310:207 (1984). Epstein-Barr-vírus gp350/220 DNS és aminosavszekvencia leírása: Beisel, J. Virology, 54:665 (1985); Biggin, EMBO J., 3:1083 (1984) és Kieff és munkatársai, 4 707 358 számú amerikai egye- 45 sült államokbeli szabadalom (1987). Az A és B típusú Epstein-Barr-vírus gp350/220 fehérjét kódoló DNSszekvenciának összehasonlítása: Lees, Virology, 195:578 (1993). EBV gp350/220 glikoproteint semlegesítő monoklonális antitestek: Thorley-Lawson, Proc. 50 Natl. Acad. Sci., 77:5307 (1890). Donor és akceptor illeszkedési helyek konszenzusszekvenciái: Mount, Nucleic Acid Rés., 10:459 (1982).

A találmány egyik tárgya EBV gp350/220 DNSszekvencia nem illeszkedő (non-splicing) változatai. 55 A találmány szerinti DNS-szekvenciák magukban foglalhatnak egy izolált DNS-szekvenciát, ami homogén gp350 fehérje expresszióját kódolja. A gp350 fehéqét kódoló DNS-szekvenciát az 1. ábrán bemutatottal megegyező vagy azzal lényegében megegyező szekvencia 60

- ahol a donor és akceptor összeillesztési helyeknél a natív nukleotidokat nem natív nukleotidokkal helyettesítjük - vagy annak fragmensei jellemzik. Ez a DNS a kódolószekvencia 5’ és 3’ végén magában foglalhat nemkódoló szekvenciákat, továbbá egy aminoterminális szignálszekvenciát. Az 1. ábra bemutatja a nemkódoló szekvenciákat és csillaggal jelöli a vélt szignálszekvencia végét. A találmány szerinti DNS-szekvenciákba természetesen nem tartoznak bele ezek a szegélyző- vagy szignálszekvenciák. A találmány szerinti

DNS-szekvencia nem illeszkedő (non-splicing) változatát úgy állítjuk elő, hogy az 1. ábrán bemutatott DNS- _ szekvenciánál mutációkat hozunk létre a gp350/220 fehérjét kódoló gén donor és akceptor illeszkedési helyein. Ez megakadályozza a gp220 fehérje termelődését úgy, hogy csak a gp350 fehérje keletkezik.

A találmány további tárgya homogén gp350 fehéqe és eljárás e fehéqe előállítására oly módon, hogy az EBV gp350/220 DNS-szekvencia nem illeszkedő változatát megfelelő prokarióta- vagy eukarióta-gazdasejtben expresszáljuk az expressziót szabályozó megfelelő szekvenciák irányítása alatt. A „homogén gp350 fehérje” kifejezést itt olyan értelemben használjuk, hogy az* nem tartalmaz vagy lényegében nem tartalmaz gp220 fehéqét. Megjegyezzük, hogy rekombináns technikával emlős- vagy rovarsejtben előállított homogént gp350 fehéqét ismereteink szerint még nem írtak le a. szakirodalomban. 1

A találmány további tárgya olyan homogén.:· J, gp350 fehérje, mely deléciónak köszönhetően kiválaszt ;

tódik a sejtből. A delécióval vagy a transzmembránré* j gió vagy a transzmembránrégió és a pg350 C-termináli- f sán megmaradó rész esik ki. Az ilyen továbbmódosított

DNS-szekvenciák és az általuk kódolt fehérjék a talál?. | mány további tárgyát képezik. I

Szolgál továbbá a találmány olyan rekombináns f

DNS-szekvenciával is, mely a vektor-DNS-ből és a ho- ?

mogén gp35O fehéqét kódoló DNS-szekvenciából áll.

A gp350 szekvenciáját kitevő DNS-molekula olyan működőképes kapcsolatban van a megfelelő irányítószekvenciákkal, hogy a gazdasejtben a homogén gp350 fehérjét kódoló DNS-szekvencia replikációra és expresszálódásra képes. A rekombináns homogén gp350 expresszálására használt DNS-molekulával transzformált gazdasejtekkel ugyancsak szolgál a találmány.

A találmány szerinti DNS-molekulákat és a transzformáit gazdasejteket alkalmazzuk, mint új eljárást a rekombináns homogén gp35O fehéqe vagy fragmensei előállítására. Az eljárásnál a homogén gp350 fehéqét _; vagy fragmensét kódoló DNS-szekvenciával (vagy a fent leírt rekombináns DNS-molekulával) - ahol az a fehéqe kifejeződését kontrolláló alkalmas szabályozóés irányítószekvenciákkal működőképes kapcsolatban van - transzformált sejtvonalat a rekombináns DNS expresszálódását lehetővé tevő állapotok között tenyésztjük. Az expresszált fehéqét ezt követően ismert módszerekkel izoláljuk a gazdasejtből vagy a tenyészközegből. Az eljárás számos ismert gazdasejtet alkalmazhat: jelenleg előnyöseknek mutatkoznak a emlős- és rovarsejtek.

HU 221 647 Bl

A találmány szerinti DNS-szekvenciák és fehérjék alkalmasak EBV-antigén-determináns tulajdonságokkal rendelkező gyógyászati és immunogén vegyületek előállítására. Ezek a vegyületek felhasználhatók az EBV-vel összefüggő betegségek - például mononuk- 5 leózis, Burkitt-féle limfóma és orr-gége tájéki rák megelőzésére és kezelésére szolgáló alegységvakcinákban. A találmány további tárgya tehát terápiái és/vagy immunogén gyógyszerkészítmények EBV-vel összefüggő humán betegségek vagy állapotok - például fertőző 10 mononukleózis, Burkett-féle limfóma, orr-garat tájéki rák - megelőzésére vagy kezelésére. Az ilyen terápiái és/vagy immunogén gyógyszerkészítmények a jelen találmány szerinti egy vagy több homogén pg350 fehéije immunogén indukciót kiváltó mennyiségét tartalmaz- 15 zák gyógyászati szempontból alkalmazható ismert vivőanyagok - például alumínium-hidroxid, sóoldat vagy foszfátpufferes oldat - kíséretében. Az „immunogén indukciót kiváltó” kifejezésen azt a mennyiséget értjük, ami elegendő ahhoz, hogy az emlősszervezetben stimu- 20 lálja az EBV-vel szembeni antitestek képződését. Alternatív módon a hatóanyagot bejuttathatjuk liposzómát tartalmazó aggregátum alakjában is. Megelőző célra a gyógyszerkészítményt alegységvakcina alakjában adhatjuk be embernek. A betegeket olyan dózisú vakciná- 25 val oltjuk be, mely elegendő az antitestképződés stimulálásához, majd hat hónap vagy egy év elmúltával a védőoltást megismételjük.

A találmány további tárgya tehát a találmány szerinti DNS-szekvenciák és fehéijék alkalmazása EBV- 30 vei összefüggő betegségek és állapotok kezelésére alkalmas készítmények előállításával vivőanyag kíséretében. A találmány további tárgya a találmány szerinti DNS-szakaszok és fehérjék alkalmazása EBV-vel szembeni immunválasz stimulálására, alkalmas készitmé- 35 nyék előállításánál, ami abból áll, hogy a beteg szervezetébe a homogén gp350 fehéije immunogén indukciót kiváltó, hatásos mennyiségét juttatjuk be gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyag kíséretében.

Az 1. ábra szemlélteti a gp350/220 DNS és ami- 40 nosavszekvenciáját [Beisel, J. Virology 54:665 (1985)]. A donor és az akceptor illeszkedési helyek jelölve varrnak. A transzmembránrégiót vízszintes nyilakkal, a vélt szignálszekvencia végét csillaggal (*) jelöltük. A nukleotidok számozása bal oldalon, az aminosa- 45 vak számozása jobb oldalon látható.

A 2. ábra a gp350 deléciós és hely irányította mutánsának szerkezetét mutatja. A pMDTM és pMSTOP jelöléssel ellátott plazmidtérkép a találmány szerinti, nem illeszkedő gp350/220 variánst példázza. A 2A. ábrán a 50 gp350 fehéije lineáris modellje látható, megközelítőleg összehozva az alatta lévő BLLF1 kódolókiónnal. A fehérjén jelzünk egy N-terminális szignálszekvenciát (SS) és a transzmembrándoméneket (TM), valamint a géndiagramon feltüntetjük a fontosabb restrikciós he- 55 lyeket. A gp350 gént két szegmens klónozza: a HindlII/Bfal BLSH1 fragmens és a Banl/HindlII BLSH2 fragmens. Az SCYT fragmenst polimeráz-láncreakcióval készítjük a BLLF1 jelzett régiójából.

A 2B. ábrán a pDTM, pSTOP, pMDTM és a pMSTOP 60 klónozásának vázlata látható (a plazmidok nem méretarányosak). A klónozás részleteit az 1. és 2. példa írja le. A plazmidtérképen feltüntettük a lényeges restrikciós helyeket, az alkalmazott klónozóvektort és a gp350 génfragmenseket. A pMDTM és a pMSTOP plazmidokban az illeszkedési helyek mutációit csillagokkal jelöltük.

A 3. ábra a pMDTM-mel kapott homogén pg350 fehéije immunlecsapásos eredményeit mutatja, az analízishez SDS-PAGE-módszert alkalmazva. A gp350/220 fehéije csonkított alakját kiválasztó pozitív kontrollsejtek (GH3/ 19), a negatív kontrollsejtek (pEE14) és néhány _ pMDTM klón metabolikus jelölését 35S-metioninnal végezzük 5,5 órán keresztül. A homogén pg350 fehéije immunlecsapása a szövettenyészet felülúszójából történik.

Mindegyik sejttípusnál a jelölt szövettenyészeti felülúszót (S) és a gp350/220 csapadékokat (Ip) 5%-os SDS-PAGE-módszerrel (poliakrilamidos gélelektroforézis) elektroforizáljuk. A molekulatömegeket a bal oldalon tüntettük fel.

4. ábrán a pMDTM kiónokkal CHO-sejtekben kifejezett fehéije Northem-blot-analízise látható; részletesebben a 3.4 példában irtuk le.

A találmány a gp350 fehéije nem illeszkedő változatát kódoló klónozott EBV-DNS-szekvenciákat használó készítményeket és módszereket fedi fel. Mint említettük, a nem illeszkedő variánst itt homogén gp35O fehérjének nevezzük. Természetes körülmények között az t emlőssejtben kifejeződő gp350/220 gén az RNS- l illeszkedésnek (splicing) köszönhetően két terméket i eredményez: a gp350 és a gp220 fehéijéket. A talál- } mány szerint a gp350 génből eltávolítunk néhány vagy Γ valamennyi RNS illeszkedési szignált és alkalmas gazdasejtben kifejezzük a gént. A gp350/220 génben mutációkat hozunk létre, hogy ezzel megakadályozzuk a 220 kD fehéije változat termelődését, amikor a gp350/220 gén kifejeződik az emlőssejtben. Csak i gp350 fehéqét kódoló mRNS-transzkriptum képződik.

A gp350/220 gén nem illeszkedő variánsának alkalmazásával a gp220 expressziója nem történik meg, a gp350 aránya a gp220 fehérjével szemben megnő.

A gp220 termelődése nem lényeges a hatásos anti-EBV oltóanyag előállítása szempontjából, mert a gp350 tartalmazza mindazokat a potenciális antigénhelyeket, amelyek a pg220-on megtalálhatóak.

A találmány tehát egy olyan DNS-szekvenciával szolgál, mely lényegében a gp350 polipeptidszekvenciáját kódolja, azzal a különbséggel, hogy a donor illeszkedési hely 501. aminosavat kódoló kodonja és az _; akceptor illeszkedési hely 698. aminosavat kódoló kodonja módosult, minthogy a natív nukleotidokat nem natív nukleotidok helyettesítik. Előnyösen az eredeti nukleotidokat olyan nem natív nukleotidokkal helyettesítjük, hogy az aminosavszekvencia ugyanaz maradjon.

Például a donor illeszkedési helyénél (1500-1504. nukleotidok) az AAGT natív nukleotidokat és a GG akceptor illeszkedési helyet (2091-2094. nukleotidok) szegé- » lyező A és T nukleotidokat GTCA, illetve T és A nuk- * leotidokkal cseréljük ki. Következésképpen a donorhe- » lyen történő csere ellenére az 500. helyen lévő ami4

HU 221 647 Bl nosav továbbra is glutamin és az 501. helyen lévő aminosav is marad a szerin. Hasonló módon az akceptorhelyen is a 697. aminosav változatlanul treonin és a 697. helyen lévő aminosav változatlanul glicin.

A példaként említetten kívül más helyettesítések is 5 elvégezhetők, amint arra az alábbiakban részletesebben kitérünk.

A találmány tehát homogén gp350 fehérjét nyújt.

A gp350 fehérje aminosavszekvenciája azonos vagy lényegében azonos az 1. ábrán bemutatott szekvencia 1- 10 tői a 907. aminosavig vagy l-től a 862. aminosavig terjedő szakaszával vagy azzal az l-től a 907. aminosavig terjedő szakasszal, ahol a 863-881 rész hiányzik. Mindegyik szekvencia szerepelhet a 18 aminosavból álló, Nterminális szignálszekvenciával vagy anélkül. A talál- 15 mány továbbá a gp350 fehéije analógjaival és mutáns változataival is szolgál, melyeknél az aminosavszekvenciában változások történtek, de az antigénaktivitás megmarad. Ilyen esetben előnyös, ha a homológ gp350 fehérje megfelelő régiójával való homológia legalább 20 80%-os, még előnyösebb, ha 90%-os, de legelőnyösebb, ha a homológia 95%-os. A példák olyan fehéijéket és polipeptideket mutatnak be, ahol az 1. ábrán bemutatott aminosavszekvenciától kicsik az eltérések és különösen haló konzervatív aminosavcserék történtek. Konzerva- 25 tívnak tekintjük azokat a cseréket, ahol a hasonló oldallánccal rendelkező aminosavak alkotta csoport tagjai között történik a helyettesítés. A genetikailag kódolt aminosavakat általában négy csoportra osztják: 1) savas jellegűek - aszparaginsav, glutaminsav; 2) bázikus jelle- 30 gűek - lizin, arginin, hisztidin; 3) nem polárisak - alanin, valin, latcin, izoleucin, prolin, fenil-alanin, metionin, triptofán; 4) töltetlen polárisak - glicin, aszparagin, glutamin, cisztein, szerin, treonin, tirozin. A fenil-alanint, triptofánt és tirozint némelykor mint aromás ami- 35 nosavakat csoportosítják. így például indokoltan várható, hogy egy leucinnak izolált cseréje vagy egy más aminosavnak egy rokon szerkezetű aminosavval történő konzervatív helyettesítése nem lesz lényeges hatással az antigénaktivitásra vagy a fehérje funkcionalitására. 40

A találmány a gp350 egyszerű tisztítási eljárását kínálja. Minthogy a gp35O és a gp220 hasonló biokémiai tulajdonságokkal rendelkeznek, a gp350 preparátumot gyakran szennyezi gp220 fehérje. A kizárólag a gp350/220 nem illeszkedő változatát expresszáló sejtek 45 alkalmazása leegyszerűsíti a fehéije tisztítását Ez lecsökkenti a gp350 előállítási költségeit. A találmány könnyebbé teszi a gp35O tisztítás kiindulási anyagának biokémiai jellemzését is. Minthogy csak egyfajta anyag van jelen, a fehérjetartalom analízise és az aminosavszekvencia analí- 50 zise elvégezhető anélkül, hogy egy másik anyag jelenlétével számolni kellene.

A találmány továbbá a gp350-termelés fokozására is lehetőséget ad. Azáltal, hogy a gp350 gén „splicing”ja gátolt, a gp350 és gp220 fehérjéket termelő állapot- 55 tói a termelés eltolódik a csak gp350 fehéije keletkezése felé. Egyes sejteknél a gp220 koncentrációja kitette a gp350-koncentrációnak 30-100%-át. A gén „splicing” megszüntetésével a gp350 termelése fokozódott azáltal, hogy elmaradt a pg220 termelése. 60

A gp350/220 gén DNS-szekvenciáját Beisel [J. Virology, 54:665 (1985)] és Biggin [EMBO J., 3:1083 (1984)] írták le. A szekvenciát az 1. ábrán mutatjuk be. A gén egy 2721 bázisból álló nyitott leolvasási keret, ami 907 aminosavat kódol és a primer transzláció terméke körülbelül 95 kD nagyságú. A molekulatömeg számított és tényleges értéke közötti különbség a fehérje kimerítő glikozilezettségére utal. 591 bázis (197 aminosavat kódol) kihasításával jutunk a gp220-hoz. A gp350/220 géntermékek látszólagos molekulatömegei közötti eltéréseket az alkalmazott mérési rendszerek különbözősége, a különböző sejttípusoknál a glikozilezőhelyek eltérő kihasználtsága, a transzláció utáni átalakítások különbözősége vagy a szelektív génmutáció magyarázza. A különböző gp350/220 nem illeszkedő génvariánsainak termékei a mért értékekben különböznek, de a „homogén gp350 fehéije vagy fehérjék” kifejezés átfogja a nem illeszkedő génvariáns termékeit, idesorolva azokat is, melyeknél adott esetben további deléció vagy mutáció történt, például C-terminális deléció és/vagy a transzmembránszakasz módosulása. A „gp220 fehéije” kifejezés gp350/220 gén alternatív módon illeszkedő termékére vonatkozik, melynek molekulatömege körülbelül 220 kD. A gp350/220 gén illeszkedési helyeit oly módon állapítjuk meg, hogy a gp350/220 gént összehasonlítjuk más - elsősorban eukariótaszervezetekből származó - gének konszenzus donor- és akceptorhelyeinek szekvenciáival. Mount által leírt [Nucleic Acids Rés., 10:459 (1982)] konszenzusszekvenciák:

donor: A AG/G*T* A AGT C G akceptor: TN_n C A*G*/G C T

A csillaggal jelölt bázisok 100%-os valószínűséggel jelennek meg valamennyi illeszkedési helyen (nagyon konzervatívak). A két- vagy egybázisú helyek nem hangsúlyozottan konzervatívak. A vonal az illeszkedés tényleges helyét jelzi.

A gp350/220 génben a donor illeszkedési hely az 1501. nukleotid után, az akceptor illeszkedési hely a 2092. nukleotid után található [az 1. ábra számozása megfelel Biggin számozásának, EMBO J., 3:1083 (1984)]. Az illeszkedési hely az EBV B típusú törzsének megfelelő génrégiójában fordul elő (a donor illeszkedési hely az A_1S0I után, az akceptor illeszkedési hely a G₂₀₂9 után). A találmány kiteljed azokra a vegyületekre, melyek elkészültekor a gp350/220 génről származó egyetlen fajta mRNS képződésénél akár az A, akár a B törzs vagy más EBV-törzs illeszkedési helye érintett. A példákban a B95-8 törzs A típusú alakjának DNSszekvenciáját használjuk fel, de a B típus ugyanúgy felhasználható, mert az A típusú és a B típusú törzsek transzlációs génterméke 98%-ban azonos. A B törzsnél hiányzik az 507-520 és az 570-576 aminosavszekvencia. Azért használtuk az A típusú törzset, mert az tartalmazza valamennyi lehetséges gp350 antigénhelyet. Alternatív módon, törzsspecifikus szekvenciával rendelkező EBV gp350/220 DNS használható fel a jelen kitanítás szerint EBV-törzs-specifikus homogén gp350 fehérI Idilli».

HU 221 647 Bl jék előállítására, melyek immunogén viselkedése specifikus egy adott törzsre nézve, és ezáltal egy specifikus EBV-törzzsel kapcsolatos betegségek megelőzésére vagy kezelésére szolgáló immunogén és/vagy terápiái készítményhez használhatóak fel. Az I. táblázatban be- 5 mutatjuk a donor és akceptor illeszkedési helyek vad típusú nukleotid- és aminosavszekvenciáit.

Annak érdekében, hogy megakadályozzuk a gp350/220 gén RNS „splicing”-ját, az RNS illeszkedési hely fontos bázispáijait érintő mutációkat végzünk 10 a gp350/220 génben. Azért, hogy az illeszkedési helyet müködőképtelenné tegyük, előnyös a donor- vagy az akceptoifaelyet keretező két nagyon konzervatív bázis közül legalább az egyiket nem konzervatív bázisokkal kicserélni, de még előnyösebb, ha két nagyon konzerva- 15 tív bázist cserélünk ki nem konzervatív bázisokkal.

A hasítóhelytől több mint két bázissal távolabb lévő más konzervatív bázisok nem konzervatív bázisokra való lecserélésével tovább gyengíthető az illeszkedési hely felismerhetösége. Úgy a donor-, mint az akcep- 20 torhelyen végzett cserével tönkretehető a splicing mechanizmus. Előnyös, ha a donor- és az akceptorhelyen is történik legalább egy-egy csere, ami az illeszkedési hely négy nagyon konzervatív bázisát illeti, de még előnyösebb, ha két-két cserét hajtunk végre. Ha az egyik il- 25 leszkedési hely nem mutabilis, mert szükség van arra, hogy a vad típusú aminosavszekvenciát megőrizzük, akkor előnyös, ha másik illeszkedési helynél legalább két mutációt hajtunk végre.

A gp350/220 illeszkedési helyein történő mutáció megváltoztatja az expresszálódott gp350 fehéije aminosavszekvenciáját. Ezek a változások előnyösen a konzervatív aminosavcserét jelentenek. A konzervatív aminosavcsere - ellentétben a nem konzervatívval - segít megőrizni az antigénhelyeket Konzervatív aminosavcsere végezhető mindaddig, amíg a báziscsere (vagy báziscserék) megfelelő cserét eredményez az állandó donor/akceptor bázisoknál. Például a donor illesztési helynél a Ser₅₀₁ kicserélhető Gly-vel, bármelyik Gly-specifikus kodont alkalmazva, ami más, mint a GGU (GGU alkalmazásánál megmaradna a G nukleotid és nem eredményezné a kivánt GT-helyettesitést az illesztési jelben). Hasonlóképpen az akceptor illesztési helynél a Glyj^ Ala-ra való cseréje egy konzervatív cserét jelentene, de minthogy valamennyi Ala-kodon az erősen konzervatív G nukleotiddal kezdődik, ez nem eredményezné a kívánt helyettesítést. Noha a prolinnal szintén lehetne konzervatív aminosavcserét végezni, a prolin nem alkalmazható vad típusú aminosavcserére, mert a fehéije harmadlagos szerkezetét megváltoztatná, és ezáltal a gp350 egy vagy több antigénhelye elfedődne. Az 1. ábrán bemutatjuk az elfogadható konzervatív aminosavcseréket, melyek a vad típusú szekvenciában alkalmazhatók. A táblázat alján a mutáció egy példáját mutatjuk be.

donor

I. táblázat akceptor vad típus szekvenciája illeszkedés

GAA A,GT ACA

Glu Ser₅₀₁ Glu konzervatív aminosav cserék illeszkedés

G|GT ^Gly698 4 4

Asn Alá Asp Gly Gin Thr

Alá Ser Gly Thr Ser pl: GAC ACA

Asp Thr₅₀₁

TCG TCT Ser Ser₆₉₈

Noha a jelen találmány egyik szempontja, hogy a gp350/220 nem illeszkedő változatával szolgáljon, a gp350/220 kódolószekvencia további mutációja is kívánatos lehet. Annak érdekében, hogy oldható homogén gp350 fehéije (az „oldható fehéije” vagy szabad állapotban oldatban van vagy a membránhoz kapcsolódik, de nincs a membránba beépülve) termelődjön, elkerülendő a membránba beépült teljes hosszúságú gp350 expresszálódásával járó sejttoxicitási problémákat, a membránon átnyúló (vagy más néven transzmembrán) régiót kódoló DNS-szekvenciát módosítjuk, teljes egészében vagy részlegesen kiejtve azt. A gp350/220 transzmembránrégiója a 861. aminosavtól (metionin) a 881. aminosavig (alanin) terjed [Beisel, J. Virology, 54:665 (1985)]. Előnyös a transzmembránrégiónak legalább 8 aminosavját kiejteni, de előnyösebb, ha a deléció 12, még előnyösebben, ha 18-21 aminosavat érint. Ezek szerint a találmány olyan gp350/220 DNS nem illeszke6

HU 221 647 BI dő változatot és/vagy gp350 homogén fehéijét is nyújt, melyeknél legalább egy deléció történt a gp350/220 DNS és/vagy a gp350 homogén fehérje transzmembránrégiójában, aminek eredményeként oldható homogén gp350 fehéije expresszálódik.

A nem illeszkedő gp35O/22O variáns transzmembrándoménjében történt teljes vagy részleges deléción túlmenően, a transzmembránrégiót követő C-terminális szekvenciában - ami a 881. aminosavtól a 907. aminosavig tart - is történhet a találmánynak megfelelően teljes vagy részleges deléció, amint azt itt lettjük. Ezek szerint a találmány a gp350/220 DNS és/vagy homogén fehéije olyan nem illeszkedő variánsaival is szolgál, melyek tovább módosítottak a DNS és/vagy aminosavszekvencia transzmembránrégiójának teljes vagy részleges deléciójával, sőt a gp350/220 maradék C-terminális DNS és/vagy aminosavszekvenciájának további deléciójával is.

A találmány tehát a találmány szerinti homológ gp350 fehérjéket kódoló DNS-szekvencia nem illeszkedő változatát nyújtja. Ez a szekvencia az 1. ábrán bemutatott DNS-szekvenciából áll, mely az 1. aminosavtól a 907. aminosavig kódolja a fehéijét, továbbá a találmány kitanítása szerinti nukleotidcserék jellemzik, melyekkel megszűntéjük a donor és akceptor illeszkedési helyeket. A DNS-szekvencia adott esetben olyan csonkított szekvenciából áll, melynél a 861-907. aminosavak közé eső transzmembrándomént és C-terminális régiót kódoló nukleotidok részben vagy teljesen kiestek, illetve amelyeknél a 861-881. aminosavak közé eső transzmembrándomént kódoló nukleotidok részben vagy teljesen hiányoznak. A homogén gp350 fehérjéket kódoló, találmány szerinti DNS-szekvenciák magukban foglalhatják azokat a DNS-eket, melyek szigorúan meghatározott körülmények között képesek az 1. ábra szerinti izolált DNS-szekvenciával hibridizálódni vagy képesek lennének a hibridizációra, ha nem lenne a genetikai kód degeneráltsága. Vagyis a találmány szerinti DNS-szekvenciák tartalmazhatnak módosításokat a nemkódoló szekvenciákban, a szignálszekvenciákban vagy a kódolószekvenciákban, melyek származhatnak alléi különbözőségekből, species eltérésekből vagy tudatos módosításokból.

Az itt feltárt gp350/220 DNS-szekvenciák nem illeszkedő változatai ismert módszerekkel összeállíthatók. A találmány szerinti módosított DNS-szekvenciák ugyancsak ismert módszerek felhasználásával rekombináns technikát alkalmazva kifejezhetők, aminek eredményeként hozzájutunk a találmány szerinti homogén gp35O fehéijékhez. Ezek a rekombináns fehéijék tisztíthatóak és felhasználhatóak az EBP-vel kapcsolatos betegségek megelőzésére és kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények elkészítésénél.

A találmány szerinti gp350/220 DNS nem illeszkedő variánsai rekombináns technikával különböző típusú sejtekben kifejezhetők a megfelelő expressziét irányító, ismert rendszerek felhasználásával. Ismert és rendelkezésre álló gazdasejt lehet például a Saccharomyces cerevisiae élesztősejt, az E. coli és Bacillus subtilis baktériumok, a GH3, GHO, NSO, MDCK vagy C-127 emlőssejtek stb. A gazdasejtekhez használt vektorokat az adott sejttel való kompatibilitás és az expressziót irányító rendszer figyelembevételével választjuk meg. Előnyösek azok a sejtek és vektorok, melyek a gp350/220 gén szekretált termékét képesek expiesszálni. így például az E. coli sejteket a pBR322 olyan, a szokásos technikával előállított származékaival transzformáljuk, melyek a kívánt fehérjét expresszáló DNS-szekvenciát tartalmazzák, az adott esetben az EBV gp350 nem illeszkedő szekvenciáját, ami vagy tartalmazza vagy nem a C-terminális és/vagy a transzmembrális régiót kódoló szekvenciákat. A pBR322 plazmid ampicillin- és tetraciklinrezisztencia-géneket tartalmaz, amik markerekként használhatók [Bolivár, Gene, 2:95 (1977)]. Az általánosan használt expressziót irányító szekvenciák - azaz a transzkripciót megindító promoterek és adott esetben egy operátor vagy enhancer -β-laktamáz- és lac-promoter-rendszereket [Chang, Natúré, 198:1056 (1977)], triptofánpromoter-rendszert [Goeddel, Nucleic Acids Rés., 8:4057 (1980)] vagy lambda-PL-promotert és N-gén riboszóma kötőhelyet [Shimatake, Natúré, 292:128 (1981)] tartalmaznak. Azonban bármilyen rendelkezésre álló promoter- vagy expressziót irányító rendszer használható, ami kompatibilis a használt prokarióta-gazdasejttel. A gazdasejtre, plazmidokra és expressziós hordozókra további példákat találunk a 4 356 270 számit (Itakura, 1892), a 4 431 739 számú (Riggs, 1984) és a 4 440 859 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmakban.

Az expresszióhoz gazdasejtként használhatunk ra varsejtet is. A rovarsejtben történő expresszálásnál az expresszálórendszer általában áll egy transzfervektor— ból - rendszerint bakteriális plazmid -, ami egyaránt tartalmazza a baculovirus fragmensét és a kifejezendő heterológ gén vagy gének beépítéséhez alkalmas restrikciós helyet; a transzfervektorban lévő baculovírus-specifikus fragmenssel homológ szekvenciával rendelkező vad típusú baculovírusból (ez teszi lehetővé a heterológ gén homológ rekombinációját a baculovírus-genomba); a megfeleld gazdasejtekből és a tenyészközegből.

Jelenleg az idegen gének AcNPV-be való beviteléhez legáltalánosabban alkalmazott transzfervektor a pAc373, de sok más ismert vektor is számításba jöhet. Ilyen például a pVL985 plazmid [ez az ATG-től ATTig húzódó polihedrin startkodonban tér el, és egy BamHI-klónozó helyet visz be az ATT-töl 32 bázispárral lejjebb; Luckow és Summers, Virology, 17:31 (1989)].

A plazmid rendszerint tartalmaz polihedrin poliadenilációs szignált [Miller és munkatársai, Ann. Rév. Microbiol., 42:177 (1988)], prokarióta ampicillinrezisztencia-gént (amp), replikációs origót is, melyek lehetővé teszik az E. coli alkalmazásánál a szelekciót és a szaporítást.

A baculovírus-transzfervektorok rendszerint bacula vírus-promotert tartalmaznak. A baculovirus-promoter bármilyen, olyan DNS-szekvencia lehet, amihez képes hozzákötődni a baculovírus-RNS-polimeráz és megindítani a kódolószekvencia (például struktúrgén) lefelé irányuló (5’-től 3’ felé) átírást mRNS-re. A promotemek

HU 221 647 Bl egy transzkripciót iniciáló régiója van, ami rendszerint a kódolószekvencia 5’-végének közelében található. Ez a transzkripciót iniciáló régió tipikusan tartalmaz egy RNS-polimeráz kötőhelyet és egy transzkripciót iniciáló helyet. A baculovírus-transzfervektor tartalmazhat egy második domént is, amit enhancemek hívnak és ami - ha jelen van - disztális elhelyezkedésű a struktúrgénhez képest. Az expresszió lehet szabályozott vagy konstitutív. A rovarsejtekben végzett expresszió technológiáját lásd az EP 155 476 számú szabadalmi közleményben.

Ugyancsak használható gazdasejtként élesztősejt például Saccharomyces cerevisiae sejt - is. Különféle törzsek ismertek és alkalmazhatók. Ugyancsak ismertek az élesztősejtben történő expresszáláshoz használható plazmidok is, melyek a promotert és az expressziót irányító rendszert tartalmazzák; például: Myanohara, Proc. Natl. Acad. Sci., 80:1 (1983) (PHO5 promoter);

EP 012 873 szabadalmi közlemény (leaderszekvenciák); Kurzt, Mól. Cell. Bioi., 6:142 (1986); Ito, J. Bacteriol., 153:163 (1983); Hinnen, Proc. Natl. Acad.

Sci., 75:1929 (1979) (transzformációs eljárások és alkalmas vektorok).

A kérdéses fehérjéket és polipeptideket kódoló gének kifejezésére természetesen a soksejtű eukarióta- 25 szervezetek sejtjei is felhasználhatók mint gazdasejtek.

Erre alkalmas sejtvonalak lehetnek a VERŐ- és HeLasejtek, a kínai hörcsög petesejtje (CHO). Az ilyen sejtekkel kompatibilis expressziós vektorok ugyancsak hozzáférhetőek, és tipikusan tartalmaznak promotert és 30 expressziót irányító rendszert, mint amilyen például az SV40 korai és késői promotere [Fiers, Natúré, 273:113 (1978)], a poliomavírus, adenovírus 2, szarvasmarhapapillomavírus vagy szárnyasok szarkómavírusának promotere. A gazdasejtekre, promoterekre, szelekciós 35 markerekre és az alkalmazási technikákra példákat találunk az 5 122 469 számú (Mather, 1992), a 4 399 216 számú (Axel, 1983), a 4 634 665 számú (Axel, 1987), a 4 713 339 számú (Levinson, 1987), a 4 656 134 számú (Ringold, 1987), a 4 822 736 számú 40 (Kellems, 1989) és a 4 874 702 számú (Fiers, 1989) amerikai egyesült államokbeli szabadalmakban.

A gazdasejtek transzformációját a sejteknek megfelelő standard technikával végezzük, például kalciumkloridos kezeléssel a prokariótáknál [Cohen, Proc. 45 Natl. Acad. Sci., 69:2110 (1972)] és kalcium-foszfátos lecsapással az emlőssejteknél [Graham, Virology, 52:546 (1978)]. Az élesztő transzformálását Hsiao [Proc. Natl. Acad. Sci., 76:3829 (1979)] vagy Klebe [Gene, 25:333 (1983)] módszerével hajthatjuk végre. 50

A gp350 nem illeszkedő variánsának szekvenciáját (a C-terminális régióra és/vagy a transzmembrális régióra vonatkozó itt tárgyalt további módosításokkal vagy azok nélkül) tartalmazó alkalmas vektor összeállítására a jól ismert ligálási és restrikciós technikákat al- 55 kalmazzuk. A helyspecifikus DNS-hasítást a megfelelő restrikciós enzimekkel végezzük a szokásos körülmények között, melyeket a restrikciós enzimeket előállító cégek részletesen ismertetnek. A hasítással kapott fragmensek méret szerinti szétválasztására a poliakrilamid- 60 vagy agarózgélen végzett elektroforézis standard eljárásait alkalmazzuk; a fragmenseken nem ragadós végeket alakítunk ki az E. coli polimeráz I enzim Klenow-fragmensével a négy deoxinukleotid-trifoszfát jelenlétében. 5 Az Sl nukleázzal való kezelés bármelyik egyszálú részt hidrolizálja. Szintetikus oligonukleotidok készíthetők például az ismert dietil-foszfoamidos módszerrel [4 415 732 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom, (1983)]. A ligáció T4 DNS-ligázzal elvégezhető 10 a szokásos körülmények között és hőmérsékleten. A helyes ligálást E. coli vagy COS-sejteknek a ligátummal végzett transzformálásával ellenőrizhetjük. A sikeres transzformánsokat az ampicillin-, tetraciklin- vagy más antibiotikumrezisztencia alapján vagy ismert maikerek 15 felhasználásával választhatjuk ki.

Ezek a DNS-rekombináns technikák teljes mértékben illusztráltak a szakirodalomban; példaként említhetjük az alábbi munkákat: Sambrook, „Molecular Cloning; A Laboratory Manual”, 2. kiadás (1989); „DNA 20 Cloning” I-II. kötet, (szerk.: D. N. Glover, 1985); „Oligonucleotide Synthesis” (szerk.: M. J. Gaid, 1984); „Nucleic Acid Hybridization” (szerk.: B. D. Hames, 1984); „Transcription and Translation” (szerk.: B. D. Hames, 1984); ,Animál Cell Culture” (szerk.: R. I. Fresney, 1986); B. Perbál, ,Λ Practical Guide to Molecular Cloning” (1984); Gene Transfer Vectors fór Mammalian Celis (szerk.: J. H. Miller, 1987 Cold Spring Harbor Laboratory); Scopes, „Protein Purification: Principles and Practice” (2. kiadás, 1987, Springer-Verlag N.Y.); „Handbook of Experimental Immunology, I-IV. kötet. (D. M. Weired, 1986). Valamennyi itt említett közlemény referenciaként a találmányba beépített.

A találmány tehát a gp350/220 DNS-szekvenciák nem illeszkedő variánsait tartalmazó vektorokkal, gazdasejtekkel, valamint olyan eljárásokkal szolgál, ahol egy expressziós irányitószekvenciához működőképesen csatlakozó gp350/220 DNS-szekvencia nem illeszkedő variánsát hordozó vektort tartalmazó nevezett gazdasejt tenyésztésével a gp350/220 fehéije nem illeszkedő variánsát állítjuk elő, olyan tenyészkörülmények között végezve a sejttenyésztést, melyek lehetővé teszik a homogén gp350 fehéije kifejeződését.

Az expresszált homogén gp350 fehéijesejtektől és a tenyészközegtől való elválasztására a glikoproteineknél használt szokásos tisztítási eljárásokat alkalmazzuk, például ultraszűrést, szabad folyású elektroforézist, gélfiltrációs kromatográfiát, affinitáskromatográfiát, SDSPAGE-t, ammónium-szulfátos lecsapást, lektinoszlopot, ioncsere-kromatografálást, hidrofób oszlopokat és más hasonló ismert eljárásokat. A gp350 kis mennyiségének analitikai kinyerésére a legmegfelelőbb tisztítási eljárás az SDS-PAGE vagy a lektinaffinitási oszlopok alkalmazása. A vakcináláshoz vagy az immunválaszvizsgálatokhoz a kis mennyiség tisztítására legjobb folyadékkromatográfiát használni. A gp350 nagy léptékű, az oltóanyag kereskedelmi célú előállítására az ultraszűrést, gélfiltrációt, ioncserés és hidrofób kromatografálást kombinálva előnyös alkalmazni.

A találmány szerinti tisztított homológ gp350 fehérje az EBV-vel kapcsolatos betegségek megelőzésére és fc £

HU 221 647 Bl kezelésére szolgáló terápiás és/vagy immunogén készítményekben használható fel. Ilyen EBV-vel kapcsolatos betegség például a fertőző mononukleózis, a Barkittféle limfóma és az orr-garat tájéki rák. Ezek a készítmények a jelen találmány szerinti egy vagy több homogén gp350 fehérjének immunogén hatást kiváltó mennyiségét tartalmazzák gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyag kíséretében, ami például lehet egy adjuváns/antigén prezentációs rendszer, mint amilyen az aluminiumgél. További ilyen adjuváns/antigén rendszer lehet például az MF59 (Chiron Corp.), a QS-21 (Cambridge Bistech Corp.), a 3-DMPL (3-deacil-monofoszforil-lipid A) Ribimmuno-Chem Research, Inc.), klinikai minőségű inkomplett Freund-féle adjuváns (IFA), fúzogén liposzóma, vizoldékony polimerek vagy Iscomok (immuné stimulating complex).

Más gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyagok vagy oldatok, például az alumínium-hidroxid, a sóoldat vagy a foszfáttal pufferolt sóoldat. A készítmény a szervezetbe előnyösen szubkután vagy intramuszkuláris módon adható be, erre alkalmas oldat alakjában. Az oltás történhet felszíni bemetszéssel vagy testüregbe való beoltással is. Ezeknek az oldatoknak az elkészítése - figyelembe véve a kémhatást, izotóniát, stabilitást és hasonló tulajdonságokat - ismert módon történhet. Az adagolás rendszerét a kezelőorvos határozza meg a különféle, a hatóanyag működését módosító tényezők figyelembevételével, mint amilyen például a beteg fizikai állapota, testtömege, neme, étrendje, állapotának súlyossága, a bevitel ideje és más klinikai tényezők. A dózis tartalmazhat 1-1000 pg fehérjét.

A gyakorlatban a találmány szerinti kezelési mód a homológ gp350 fehérje immunogén hatású mennyiségének a kezelendő betegbe való bejuttatását jelenti megelőzési vagy kezelési céllal. A találmány szerinti vegyület immunogén hatású mennyisége dózisonként 1 pg és mg közé esik. A bevitt dózisok száma változhat a fent említett tényezőknek megfelelően.

Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban pél5 dákat adunk meg. A példák kizárólag szemléltető célzatúak, a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.

1. példa pDTM és pSTOP előállítása a gp350/220 transz10 membránrégiójának és a transzmembránrégió és Cterminális résznek deléciójával

Az EBV B95-8 törzs (Miller és munkatársai, 1972) gp350/220 génhez a BamHI könyvtárból juthatunk hozzá, mint BLLF1 nevű nyílt leolvasási keret [Baer, Na15 tűre, 310:207 (1984)]. Annak érdekében, hogy a kívánt szerkezetet (2B. ábra diagramja) összeállítsuk, a @>350/220 gént két részben klónozzuk: 1) BLSH1, egy 2,3 bp-ú HindHI/Bfal 3’ ffagmens és 2) BLSH2, egy 337 kb-ú Baml/Hindffi 5’ fragmens (2A. ábra). Ezeket a fragmenseket úgy klónozzuk az átmeneti vektorokba, hogy kiessen a C-terminális citoplazmikus és/vagy a transzmembrándomén. Minthogy a Bfal hely a pg350 transzmembrándoménjét (TM) kódoló régió 5’ végénél helyezkedik el, ezt használjuk fel a TM25 dómén, illetve a TM-domén és az azzal szomszédos Cterminális rész deléciójához. A Bfal felhasználásával elérhető delécióval a TM-régiónak csak két aminosayja marad vissza (II. táblázat).

1. A pDTM összeállítása pSTGl-ből és pSTG3-ból

A pDTM plazmid a gp350/220 nukleinsavszekvenciát tartalmazza a teljes TM-régió nélkül. Ezt a szerkezetet két köztes vektor, a pSTGl és a pSTG3 felhasználásával állítjuk össze. A 450 bp-ú PCR-termék, a SYCT elkészítéséhez, ami beviszi a TM-régió 3’ végénél lévő

Bfal helyet, a BLLF1 klón célszekvenciát használjuk fel (2. ábra). Az alkalmazott PCR primerek:

primer 1: GG ATC CTA GAG TGC GCC TTT AGG CGT A

BLLF1: ... GAC TGC GCC TTT AGG CGT A...

aminosav: ... Asp Cys Alá Phe Arg Arg ...

f_ TM régió vége primer 2: GGA TCC TCT GTT CCT TCT GCT CCA GTG

BLLF1: ......TCT GTT CCT TCT GCT CCA GTG

A primer 1 Bfal helyét használjuk a SCYT Bfal/Xmal ffagmensének a pSTGl-be való klónozására. A primer 1 maradéka megfelel a BLLF1 klón által klónozott aminosavszekvenciának. A primer 2 megfelel a gp350/220 nyílt leolvasási kereten kívüli rész- 60 nek a gén 3’ oldalán. A SCYT PCR fragmenst Bfal és Xmal enzimekkel hasítjuk, egy 136 bázispárú fragmenst nyerve, amit egy másik, a BLSH1 HindlII/Bfal fragmenssel a pMTll vektorba (Spaete és Mocarski, 1985) klónozunk; így kapjuk meg a pSTGl-t.

HU 221 647 Bl

A Bfal helyet tartalmazó részt szekvenálva, meggyőződhetünk róla, hogy a TM aminosavait kódoló régió teljesen kiesett, kivéve a Met és a Leu aminosavakat (II. táblázat). A harmadik BLLF1 fragmenst, a BLSH2-t pMTll-be klónozva, állítjuk elő a pSTG3-at. A gp350/220 gén kódolószekvenciáján kívüli 16 bázisú Banl/Xbal oligonukleotidlinkert használjuk a BLSH2 Banl/HindlII fragmensnek a pSTG3-ba való klónozásához. A 2,4 HindlII/Xmal pSTGl fragmenst a 0,3 Xbal/HindlII pSTG3 fragmenssel együtt egy pEE14 vektorba (Celltech, Anglia) klónozzuk a pDTM konstrukció összeállításához.

2. A pSTOP összeállítása pSTG2 és pSTG3 vektorok felhasználásával

A pSTOP plazmid egy olyan gp350/220 gént tartalmaz, amiből hiányzik a TM-régió és a TM-régióval szomszédos C-terminális citoplazmikus régió. A konstrukció összeállításához elkészítünk egy 16 bázispárú Bfal/EcoRI oligonukleotidlinkert stopkodonokkal (aláhúzva) három keretben, amit Bfal ragadós véget követő három keretben:

TAT AGA CTA GTC TAG G A TCT GAT CAG ATC CTT AA

A felső szekvencia 5’ nyúlványa (TA) egy Bfal restrikciós hely ragadós vége, az alsó szekvencia 5’ nyúlványa (TTAA) egy EcoRI hely ragadós vége. Ezt a 16 bázispárú linkért használjuk a BLSH1 HindlII/Bfal fragmensnek a pMTl 1-be való klónozásához, elkészítve ezzel a pSTG2-t. A 2,3 kb. pSTG2 HindlII/EcoRl fragmenst és a pSTG3 0,3 kb. Xbal/HindlII fragmenst klónozzuk pEE14-be, megalkotva a pSTOP-t.

3. A vad típusú, a pDTM és pSTOP szekvenciák összehasonlítása a TM-régiónál

A vad típusú gp350, a pSTOP és a pDTM DNSszekvenciák 3’ végét és a transzlációval kapott aminosavszekvenciákat a II. táblázatban mutatjuk be. A nyilak a vad típusú szekvencia transzmembrándoménjének (TM) kezdetét és végét jelzik A transzmembrális doménnak csak két aminosavja marad meg a pDTM és pSTOP szekvenciákban, a Met₈₆₁ és a Leu₈₆₂ (1. ábra). Megjegyzendő, hogy a pSTOP-ban egy stopkodon követi közvetlenül a Leu₈₆₂-t. A pDTM-ben „ATM” jelöléssel jelezzük a kiejtett transzmembránrégió korábbi helyét (a táblázatban a natív aminosavakat tüntettük fel).

II. táblázat gp350 vad típusú szekvencia 3’ vége

CTC TCC ATG CTA GTA CTG.....GTC ATG GCG GAC TGC GCC

Leu Ser Met Leu_8g2 Val Leu.....Val Met Alá Asp₈₈₂ Gys Alá

TM kezdete pSTOP 3¹ vége

TM vége

...AAC CTC TCC ATG CTA TAG ACT AGT TCT AGG.

...Asn

PDTM 3'

Leu Ser Met Leu_8g2 STOP .vége

...AAC CTC TCC ATG CTA GAC TGC GCC... ...Asn Leu Ser Met Leu₈₆₂ Asp₈₈₂ Cys Alá...

/Λ

ATM

2. példa 55

A pMDTM és a pMSTOP elkészítése a gp350/220 gén donor és akceptor illeszkedési helyeinek eltávolításával

Azért, hogy homogén gp350 fehéijét kapjunk, a gp350/220 gén illeszkedési helyének erősen konzerva- 60 tív és konzervatív bázisait kicseréljük. A donor illeszkedési helyen négy bázist cserélünk ki, köztük az erősen konzervatív GT-párt, ami az illeszkedési helyek 100%-ánál előfordul. A donorhely két konzervatív AA bázisát GT bázispárral cseréljük ki. A donor illeszkedési hely erősen konzervatív (változatlan) két

HU 221 647 Bl bázisát GT-ről CA-ra cseréljük. Az akceptor illeszkedési helyen az erősen konzervatív bázisoknak csak egyikét cseréljük ki, megtartva az aminosavszekvenciát. Az akceptor illeszkedési hely egy második konzervatív bázisának cseréjét mutatja a III. táblázat. A III. táblázatban foglaljuk össze a gp350/220 gén donor és akceptor illeszkedési helyein történő báziscseréket.

III. táblázat

Az EBV gp350/220 gén illeszkedési helyének cseréi donor illeszkedési hely:

donor vad típus: GAA AiGT

Glu Ser₅₀₁ akceptor illeszkedési hely akceptor vad típus: ACA GIGT

Thr Gly₆₉₈ mutáns: GAG*T*C*A* Glu Ser₈Q2_ akceptor mutáns: ACT*GGA*

Thr Gly₆₉₈

Az oligonukleotidalapú mutagenezissel kicserélt bázisokat a mutáns szekvenciában csillaggal jelöljük. Az illeszkedés tényleges helyét nyíllal jelöljük, és feltüntet- 30 jük a kódolt aminosavakat. Megjegyezzük, hogy a nukleotidok cseréje nem eredményez aminosavszekvenciaváltozást.

Ezeket a nukleotidcseréket oligonukleotid közvetítette mutagenezissel hajtjuk végre. Egy módosított fág vektort, az M13TACT vektort használjuk a mutációk végrehajtására, amint azt Μ. E. Zoller és M. Smith leírják [Methods of Enzymol. 100:468 (1983)].

A gp350/220 nukleotidszekvencia BamHI/XhoI fragmensét klónozzuk az M13TAC plazmid polilinkeiébe, a poli- 40

A mutagenezis oligonukleotidjai:

PrDonorl primer: GGT CAT GTC GGG GGC CTT

EBV: GGT CAT GTC GGG GGC CTT

PrAkceptorl primer: CTG TGT TAT ATT TTC ACC

EBV: CTG TGT TAT ATT TTC ACC

A mutagenezis oligonukleotidjait nevezzük „primer”-nek, a gp350/220 gén illeszkedési helyein áthúzódó DNS-szekvenciákat „EBV”-vel jelöltük. A mutalinker Asp718 és BamHI restrikciós helyeit felhasználva, összekapcsolva egy 19 bp-ú, Asp718 fe Xhol ragadós végeket tartalmazó oligonukleotidlinkerrel.

Az 1. példa M13DTM és M13STOP plazmidjait használjuk a mutagenezishez (2B. ábra).

Két 42-mer oligonukleotidot, a PrDonorl-et fe a; PrAkceptorl-et készítünk a mutagenezisben való feless használáshoz. Mindegyiket úgy tervezzük meg, hogy komplementer legyen a gp350/220 génszekvenciákkal akár a donor, akár az akceptor illeszkedési hely van a központban. Az oligonukleotidoknak csak az a régiója nem komplementer a gp350/220 génnel, ahol a bázisok

S '&a kívánt mutációkat adják.

TG * *	|A CTC	TGT	GCC	GTT GTC	CCA	TGG
1*	*
AC	|T	TTC	TGT	GCC	GTT	GTC	CCA	TGG
TC	|c	AGT	TGG	GTG	AGC	GGA	GGT	TAG
*	1	h
AG	|c	TGT	TGG	GTG	AGC	GGA	GGT	TAG

genezis eredményeként a kicserélődő bázisokat csillaggal jelöltük. A szaggatott vonal az illeszkedés helyét jelzi.

HU 221 647 Bl

PrDonorl és PrAkceptorl oligonukleotidokat az egyszálú M13DTM és M13STOP kiónokhoz hibridizáljuk. T4 DNS polimeráz holoenzimmel állítjuk elő a kétszálú M13DNS-t és E. coli-t transzformálunk vele. Az M13TAC vektort alkalmazva, bármelyik klón, mely tartalmazza a kívánt mutációt, azonosítható oly módon, hogy X-gal és izotiopropil-galaktát jelenlétében a színe fehérről kékre változik. Felszedjük a kde plakkokat, kinövesztjük őket és az illeszkedési helyek DNS-régióját szekvenálva elvégezzük az M13-MDTM és M13-MS0P jelöléssel ellátott mutáns kiónok végső azonosítását.

A kívánt mutációkat tartalmazó kiónok azonosítása után az M13-MDTM és az M13-MST0P BamHI/XhoI fragmenseit kivágjuk és visszaligáljuk a pDTM vagy pSTOP plazmidokba, elkészítve ezzel a pMDTM-t, illetve a pMSTOP-t. Ezeket a konstrukciókat CHO-sejtekbe transzfektáljuk, hogy kifejezhessük a gp350/220 DNSszekvencia nem illeszkedő variánsait, ahogyan azt a 3. példában ismertetjük.

3. példa

A gp350 kifejezése CHO-sejtekben

1. A gp 350/220 génkonstrukció transzfekciója

A találmány szerinti homogén gp350 fehérje emlőssejtben történő intenzív szintű előállításának egyik módja, hogy olyan sejteket állítunk össze, melyek a heterológ gp350 DNS-szekvenciát megsokszorozva tartalmazzák. A heterológ DNS-szekvenciát működőképesen kapcsoljuk egy sokszorosítható markerhez, ebben az esetben a glutamin-szintetáz-génhez, melyek sokszorosíthatók metionin-szulfoximin felhasználásával.

A 2. példa szerint elkészített pMDTM és pMSTOP vektorokat az alábbiakban leírt módon CHO-sejtekbe transzfektáljuk, Crockett [Bio/Technology, 8:662 (1991)], illetve a Celltech Instruction Manual (1992) glutamin-szintetáz-gén amplifikációs rendszerére leírt módszer szerint.

A CH0-K1 sejteket (ATCC CCR61) glutaminmentes EMEM (Eagles Minimál Essential Médium) tápközegben tartjuk fent, amit kiegészítünk 10% szarvasmarha-fetálszérummal, 100 egység/ml penicillinnel, 100 mg/ml sztreptomicinnel, MÉM (Modified Eagle’s Médium) nem esszenciális aminosavakkal és ImM nátrium-piruváttal (valamennyi JRH Biosciences). A közeget továbbá kiegészítjük 60 mg/ml glutaminsawal, 60 mg/ml aszparaginsavval, 7 mg/ml adenozinnal, 7 mg/ml guanozinnal, 7 mg/ml citidinnel, 7 mg/ml uridinnel és 2,4 mg/ml timidinnel (valamennyi Sigma). Ezt a közeget használjuk a transzfekció folyamán, az eltéréseket jelezzük.

Egy nappal a transzfekció előtt 3 x1ο⁶ CHO-K1 sejttel oltunk be 10 cm-es csészéket. A transzfekció napján a sejteket csészénként 10 ml szérummentes közeggel mossuk. A plazmid DNS-t (a pMDTM és a pMSTOP plazmidokból) a szokásos CaPÖ₄-lecsapással alkalmazzuk. Mindegyik plazmid DNS 10 pg-ját 4,5 órán át inkubáljuk a CHO-K1 sejtekkel 2 ml szérummentes közegben 37 °C hőmérsékleten. A négy plazmid DNStranszfekció mindegyikét három ismétlésben végezzük el. A sejteket ezután 15%-os glicerint tartalmazó

HEPES-pufferes sóoldatban kezeljük 1,5 percen át. Miután a sejteket szérummentes közeggel leöblítettük, ismét szérumot tartalmazó közegbe visszük őket, és 24 órán át inkubáljuk.

A következő napon a közeget lecseréljük 10% dializált szarvasmarha-fetálszérumot (JRH Biosciences) tartalmazó közeggel, és amplifikálunk 25 pM metioninszulfoximin (Sigma) hozzáadásával. 3-5 naponként a sejtek közegét friss, metionin-szulfoximint tartalmazó közeggel cseréljük ki, amíg az amplifíkált kiónok elég nagyok a felszedéshez. Ez körülbelül 13-14 napot vesz igénybe. A kiónokat felszedjük a telepek 200 μΐ-es pipetman steril csúcsokkal történő lekaparásával, és 96 lyukú lemez egyik lyukába visszük át, amiben metionin-szulfoximin-mentes közeg van. 1-2 nap elmúltával a közeget kicseréljük 25 μΜ metionin-szulfoximint tartalmazó közeggel. 4 nap múlva a tenyészet felülúszóját összegyűjtjük, és a fehéqetermékeket ELISA-módszerrel vizsgáljuk az alábbiakban leírtak szerint.

2. ELISA-vizsgálat

A transzfekció után 241 CHO-pMDTM és 158 CHO-pMSTOP kiónt szedtünk fel és tenyésztettünk. A kiónok felülúszóit gp35O fehéijetermékre vizsgáljuk. 96 lyukú lemezt bevonunk affinitással tisztított nyúl anti-gp350/220 antitesttel (MDP1 antitest, Andrew Morgan ajándéka), amit 1:2000 arányban hígítunk 50 mM nátrium-borát-pufferben, pH=9. A lemezeket 3-4 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten és 3-szor mossuk PBS+0,05% Tween 20-oldattal Nune ImmonoWashert alkalmazva. Leitatással való szárítás után, a. lemezeket blokkoljuk 2% BSA-t tartalmazó PBS+0,01% Thimerosal-oldatban félórás, 37 °C hőmérsékleten történő inkubálással, majd ismét mossuk. A lyukakhoz hozzáadjuk a transzfektált és a kontrollsejtek felülúszóját és 37 °C hőmérsékleten inkubálunk 1 órán át. A lemezeket azután a primer detekciós antitesttel, gp350/220-szal szembeni egér monoklonális antitesttel (antibody #C65221M; Biodesign International) - 1 mg/ml PBS mosópufferben - inkubáljuk 1 órán át 37 °C hőmérsékleten. Mosás után a lemezeket a szekunder antitesttel, az egér-immunoglobulinokkal szembeni torma-peroxidázzal konjugált kecske F(ab)2fragmensekkel (Humán lg absorbed; Biosource International) - 0,7 pg/ml 0,05% BSA-t és 0,01% Thimerosalt tartalmazó PBS-ben inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten egy órán át. A lemezeket mossuk és Stable Peroxide Substrate Bufferben (Pierce Chemicals) oldott ABTS-t (Pierce Chemicals) használva, szobahőmérsékleten 0,5 óra alatt előhívjuk. A reakciót 1%-os SDS-sel leállítjuk, és a lemezt 405 és 650 nm-en értékeljük, Molecular Devicies Vmax ELISA-lemezleolvasót használva. 24 pMDTM és 18 pMSTOP klón adott pozitív eredményt a gp350 szekrécióját illetően. A legnagyobb ELISA-jelet adó kiónokat méretnövelés céljából 24 lyukú lemezekre visszük és tovább vizsgáljuk Westem-blot- és radioimmunlecsapásos módszerekkel.

3. Westem-blot- és immunlecsapásos vizsgálat

Az aktivitásra vonatkozó bevezető szűrővizsgálatokban a pMDTM transzfekció szövettenyészetének felülúszóit Westem-blot-eljárással vizsgáljuk. A CHO-sej12

HU 221 647 Β1 tek felülúszóit 5%-os SDS-PAGE-gélen tisztítjuk, egy éjszaka alatt átvisszük nitrocellulózra és anti-gp350 antitestpróbát végzünk. A Westem-blot-analízisnél 7 pMDTM klón bizonyult gp350-re nézve pozitívnak.

A pozitívnak mutatkozó pMDTM kiónokat tovább vizsgáljuk a gp220 jelenléte szempontjából radioimmuno-lecsapásos eljárással. A kiválasztott transzformáit pMDTM sejteket, pEE14 kontrolisejteket és GH3A19 kontrolisejteket (alább leírva) egy éjszakán át növesztjük 6 lyukú lemezeken úgy, hogy a kísérlet napjára a sejtek a területnek körülbelül 3/4 részét összefüggően benőjék. Mindegyik lyuk körülbelül 5 χ 10⁶ sejtet tartalmaz. Jelöléshez mindegyik lyuk közegét kicseréljük 0,7 ml metioninmentes MÉM (10% szarvasmarhafetálszérum)+100 pCi ³⁵S-metionin közeggel. A sejteket 5,5 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, majd mikrocentrifugában 4000 percenkénti fordulatszámon centrifugáljuk 5 percen át. A felülúszóból a homogén gp350 fehéijét immunlecsapással leválasztjuk oly módon, hogy 10 μΐ Sepharose-Protein A (Sigma) 50%-os szuszpenzióját és 20 μΐ monoklonális anti-gp350/220at (antibody #C65221M, 100 mg/ml; Biodesign International) adunk a felülúszóhoz és egy éjszakán át forgatjuk 4 °C hőmérsékleten. A keveréket 2000 percenkénti fordulatszámmal ülepítjük, a mikrocentrifugálást szobahőmérsékleten végezve 2 percen át. Az üledéket négyszer mossuk néhányszoros térfogatú foszfáttal pufferolt sóoldattal. A végső mosás után valamennyi folyadékot eltávolítjuk az üledékről, és 50 μΐ fehérje-gél mintapuffert adunk hozzá. A lecsapódott immunkomplexet tartalmazó mintákat 5 percen át forraljuk és 5%-os SDSPAGE-gélen futtatjuk. A immunlecsapás eredményeit összehasonlítjuk a szövettenyészet felülúszó gélmintaés fehérjeminta-puffer 1:1 arányú elegyeivel kapott eredményekkel. A gélt megszárítjük és Hyperfilm βMax segítségével (Amersham) autoradiografáljuk.

A radioimmun-lecsapásos SDS-PAGE-analízis autoradiográf eredményeit a 3. ábrán mutatjuk be. Pozitív kontrollként a GH3A19 sejtvonalat (EUiot Keiff ajándéka; Whang és munkatársai, 1987) használjuk. A GH3A19 sejtek a transzmembrán és a C-terminális citoplazma domént nem tartalmazó, csonkított gp350/220 fehéijét választanak ki. Negatív kontrollként olyan CHO-sejteket használunk, melyeket a pMDTM-mel való transzfektálással párhuzamosan csak pEE14 vektorral transzfektáltunk és metioninszulfoximinnel szelektáltunk. A 3. ábrán páratlan számmal jelöltek a felülúszók („S”) és páros számmal az immunprecipitátumok („Ip”) autoradiogramjai. A kontroll 2-es sávban, mely a GH3A19 kontrollsejtek precipitátumának képe, két erős fehérjefoltot látunk körülbelül 220 és 350 kD-nál, bizonyítva a csonkított gp350 és gp220 fehéijék illeszkedő változatának körülbelül 1:1 arányú termelődését. Amint az várható, ezek az immunlecsapott fehérjék koncentrálódnak a radioaktívan jelölt szöveti felülúszóhoz (nem immunprecipitált minta) képest (1. sáv). Ugyancsak várható volt, hogy ezek a foltok hiányoznak a negatív kontrolinál (4. sáv), minthogy a pEE14 vektor nem tartalmaz semmiféle gp350/220 konstrukciót.

A pMDTM kiónok felülúszóiból származó immunprecipitátumok SDS-PAGE-analízise egyetlen erős foltot ad körülbelül a 350 kD magasságban (6., 8. és 10. sáv), ami hasonló, mint a GH3A19 kontroll (2. sáv) nagyobb molekulatömegű fehéqéjének foltja. A gH3A19 kontroll 220 kD magasságban lévő foltja ezzel szemben hiányzik a 6., 8. és 10. sávban, noha a 8. sávban egy alacsonyabb molekulatömegű fehéije gyenge foltja is látható. Ez egy lebomlási termék lehet, ami együtt csapódik le a sejttermékkel vagy egy kis mennyiségű gp220 fehérje is termelődik misztransziáció vagy olyan mutáció eredményeként, ami visszaállítja a natív nukleotid- vagy aminosav- _ szekvenciát a delatált donor és akceptor illeszkedési helyeknél. Öt másik MTDM klónnál is találtunk egyetlen erős foltot 350 kD molekulatömeg-magasságban (nem bemutatott adatok).

Nem valószínű, hogy a 6. és 10. sávban azért hiányzik teljesen a 220 kD fehéije foltja, mert az MDTM felülúszóiból nem megfelelően történt meg a lecsapás, minthogy a ³⁵S-jelzett GH3A19 kontrolinál (2. sáv) a 220 kD-os folt jól látható. Az 1. példa pDTM konstrukcióját használva további vizsgálatokhoz, a vad típusú illeszkedési helyeket tartalmazó konstrukciónál két erős foltot kapunk 350 és 220 kD-nál. Ezek az eredmények tehát azt mutatják, hogy az illeszkedési helyek deléciója a gp350 fehérjének gp220 fehéije nélkül történő termelődését eredményezi.

A homogén gp35O fehérje CHO-sejtben vagy más l emlős- vagy nem emlőssejtvonalban történő termelése 1 méreteiben tovább növelhető, és a gp350 fehérje jól is- í mert módon kinyerhető és tisztítható a sejtvonal közegé-⁷ bői. Ehhez használhatunk lektinaffinitási kromatográfiát, fordított fázisú HPLC-t, FPLC-t, gélszűrést és hasonló eljárásokat [Dávid, J. Immunoi. Methods,

108:231 (1988); Madej, Vaccine, 10:777 (1992)].

4. A pMDTM fehérje Northem-blot-analízise

Ebben a vizsgálatban Northem-blot-analízissel mutatjuk ki, hogy az MDTM-1 sejtek gp350 RNS-t készite- í nek és gp220 RNS-t nem. Ezzel egy másik szinten erősítjük meg, hogy az illeszkedési helyek mutációi megakadályozzák a gp220 termelését.

A gp350-nel komplementer DNS-próbákat a pDTM-ből készítjük (lásd 1. példa). Egy gp350/220 próbatemplátot, az XP464-et 464 bp-ú XhoI/PstI pDTM fragmensként izolálunk. Az XP464 felismeri mind a gp350-et, mind a gp220-at. Hogy elkészítsük a gp350 specifikus AN537 próbát, a pDTM-et Ncol és Ndel enzimekkel hasítjuk, két 580 bp-ú átfedőfragmenst nyerünk ki. Ezt a keveréket XmnI enzimmel ;

emésztjük, hogy az egyik szennyezőfragmenst eltüntessük, majd Alul enzimmel hasítunk, egy 537 bp-u Alul/Ndel fragmenshez jutva, benne a gp350/220 illeszkedési helyekkel. A DNS-próbákat ³²P-dCTP „nick” transzlációval (Amersham) jelöljük, Xp464 és AN537 DNS-fragmenseket használva.

A teljes sejt-RNS-t lényegében Chomczyunski és Sacchi módszerével állítjuk elő [Anal. Biochem., t

162:156-59 (1987)]. Két-két T-250 edényből, melye- ' két a CHO-pEE14 (negatív kontrollsejtvonala, lásd r

1. ábra), az MDTM-1, illetve a CHO-DTM-7 sejtek

HU 221 647 BI

90%-os összefüggő borítottsággal benőttek, leszívjuk a felülúszót, és a sejteket 10 ml denaturálópufferben (4M guanidin-tiocianát, 25 mM nátrium-citrát, pH=7,0, 0,5% szarkozil, 100 mM 2-merkapto-etanol) lizáljuk és lekaparjuk. Mindegyik 10 ml lizátumhoz hozzáadunk 5 1 ml 2M nátrium-acetát-oldatot, pH=4,10 ml telített fenolt, pH=4,5 és 2 ml kloroform/izoamil-alkohol elegyet. A lizátumot 15 percen át jégen inkubáljuk,

000 g-n centrifugáljuk 4 °C hőmérsékleten 20 percen át, fe a felső vizes fázist eltávolítjuk. A vizes fázis- 10 ból az RNS-t 1 térfogat izopropanol hozzáadásával 1 órán át 20 °C hőmérsékleten tartva lecsapjuk, 4 °C hőmérsékleten ülepítjük, denaturálópufferben ismét szuszpendáljuk fe újra lecsapjuk. Az RNS-üledéket 70%-os etanolban egyszer mossuk, Speed-Vac készülékben szá- 15 rítjuk fe DEPC kezelt vizben szuszpendáljuk.

A DTM-7 és az MDTM-1 teljes sejt RNS-t 15% formamidban fe 6% formaldehidben 15 percen át denaturáljuk 65 °C hőmérsékleten; 1% agarói'6,6% formaldehid gélen futtatjuk; kapillaritással nitrocellulózra visszük és 20 jelzett XP464 & AN537 próbákkal próbáljuk. A DNSpróbákat 5 perces forralással denaturáljuk, 5 χ SSPE-ben hibridizáljuk 65 °C hőmérsékleten egy éjszakán át, és a nitrocellulózt erőteljesen mossuk. Az autoradiográfiát Bio-Rad foszforimázser felhasználásával végezzük.

A CHO-MDTM sejtekből nyert teljes sejt RNS-Northem-blotja azt mutatja, hogy az illeszkedési hely mutációja hatékonyan gátolja a gp220-specifikus RNS keletkezését. A gp35O-specifikus próba, az AN537 az MDTM1 fe DTM-1 sejteknek csak egyfajta RNS-éhez kötődött 30 (4. ábra 1. fe 2. sáv), amint az egy gp350-specifikus próbától várható. Az XP464 próba, ami a gp350 és gp22O RNS-re egyaránt specifikus, két RNS-fajtát ismert fel a DTM-7 esetében fe egyetlen nagyobb molekulatömegűt az MDTM-1 esetében (4. ábra 4. és 3. sáv), amint 35 az válható, ha az illeszkedési hely mutációi megakadályozzák a gp220 mRNS képződését az MDTM-1 esetében. Annak ellenére, hogy az MDTM-1 sávja a gp350-specifikus RNS-re túltelített volt, nem látható gp220 RNS. Hogy az MDTM-1 fe a DTM7 sávok eseté- 40 ben mi az oka annak, hogy a gp350 mRNS eltérően vándorol, nem tudjuk. Az MDTM-1 túltelített a DTM-7-hez viszonyítva, fe ez befolyásolhatja a gélben történő migrációt. A gp350 mRNS egy nagy riboszomális RNS-folt közelébe fiit, ami ugyancsak eltorzíthatja a molekulatömeg megjelenését. Egyetlen gp350 DNS-sel komplementer jelenléte arra utal, hogy ez a gp350 mRNS. Ezek szerint a donor és akceptor illeszkedési helyek mutációi hatékonyan megakadályozzák a gp220 mRNS képződését, amit a Northem-blot igazol. Ezt az eredményt megerősíti a radioimmun-lecsapás, amihez gp350/220-ra specifikus monoklonális antitesteket használunk, továbbá az MDTM-1 fe a DTM-7 felülúszóinak Westem-blot-analízise is.

4. példa

A homogén gP350fehérjék immunogén aktivitásának vizsgálata

A tisztított homogén gp350 fehérjéket megfelelő hordozókba építjük be és egérbe visszük a következő módon.

2x adjuváns/hordozó koncentrátumot készítünk, Pluronic L121-t és szkvalént 0,4%-os (térfogat) Tween 80 foszfátpufferes sóoldatban elegyítve (Thr’jMDP-vel Dávid [J. Immunoi. Methods, 108:231 (1988)} és Allison [J. Immunoi. Methods, 95:157 (1986)} eljárásának megfelelően.

A bevitel napján azonos térfogatnyi proteinpreparátum fe adjuváns/hordozó elegyítésével elkészítjük a beviendő készítményt. A fehérjetartalomnak 5-50 pg közé kell esnie dózisonként.

BALB/c egereket immunizálunk a 0., 21. fe 42. napon 0,1-0,1 ml intramuszkuláris injektálással. Az immunizáció előtti vérvétel és az egyes injektálások utáni 25 10. napon végzett egymás utáni vérvételek a szemüreg. mögötti szinuszból történik.

A szérum antitestszintjét ELISA-módszerrel határoztuk meg a 3. példában leírtak szerint. Az EBV-t semlegesítő antitestek mennyiségi meghatározása szérumban azon képességük alapján történik, hogy megakadályozzák a magzatzsinórvér-limfociták EBV általi in* vitro átalakítását [Moss, J.Gen. Virol., 17:233 (1972)és De Schryver, Int. J. Cancer, 13:353 (1974)].

Ettől eltérő módon eljárhatunk úgy is, hogy újzélandi fehér nyulakat intramuszkulárisan oltunk be a 0., 21., 42., 63. és 84. napon az előző adjuvánsban emulgeált fehérjével. A dózisoknak 5-50 pg között kell lennie egy-egy oltás alkalmával. Az utolsó dózist követő két héten át gyűjtjük a szérumot, és teszteljük az antigénre adott antitesttiterre, a B95-8 sejtekből származó vírus gp350/220 fehéqével szembeni keresztreaktív antitestre és az in vivő EBV-neutralizáló aktivitásra Emini módszerét követve [Virology, 166:387 (1988)].

Minthogy az EBV gp350/220 fehérje protektiv im45 munitást indukáló képessége az EBV-fertőzés egy állati modelljénél már megállapítást nyert [Epstein, Clin. Exp. Immunoi 63:485 (1986)], hasonló pozitív eredmény várható a homogén gp35O fehérje bevitelétől is.

SZEKVENCIALISTA (1) Általános információk:

(i) szabadalmaztató: Spacte, Richard és Jackman, Winthrop T.

(ii) a találmány címe: Á gp350/220 nem illeszkedő változatai (iii) szekvenciák száma: 19 (iv) levelezési cím:

(A) címzett: Cooley Godvard Castro Huddleson et Tatum (B) utca: 5 Palo Alto Square (C) város: Palo Alto (D) állam: Califomia

HU 221 647 Bl (E) ország: USA (F) irányítószáma: 94306 (v) komputer olvasható formája:

(A) médium típus; floppy disk (B) komputer: IBM PC kompatibilis (C) operatív rendszer: PC-DOS/MS-DOS (D) software: Patent In Release #1,0, Version #1,25 (vi) folyamatban lévő benyújtás adatai:

(A) beadvány száma: 08/229 291 (B) iktatási ideje: 1994. április 18.

(C) klasszifikáció:

(viii) megbizott/ügynökség adatai: _ (A) név: Luann Cserr (B) regisztrációs száma: 31822 (C) referencia/lajstrom száma: AVIR-003/OOUS (ix) telekommunikációs adatok:

(A) telefon: 415-843-5163 (B) telefax: 415-857-0063 (C) telex: 380816 CooleyPA (2) A SEQ ID NO: 1 adatai:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 27 bázispár (B) típusa: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológiája: ismeretlen (ii) molekulatipus: oligomer DNS (xi) szekvencia leírása: SEQIDNO:1:

GGATCCTAGA CTGCGCCTTT AGGCGTA L (3) A SEQ ID NO:2 adatai: t (A) hossza: 19 bázispár í (B) típusa: nukleinsav | (C) száltípus: egyszálú (D) topológiája: ismeretlen (ii) molekulatípus: oligomer DNS (xi) szekvencia leírása: SEQ ID NO: 2:

GACTGCGCCT TTAGGCGTA (2) A SEQ ID NO:3 adatai:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 6 aminosav (B) típusa: aminosav (C) topológiája: lineáris (ii) molekulatípus: fehéije (xi) szekvencia leírása: SEQ ID NO: 3:

Asp Cys Ala Phe Arg Arg

5 (2) A SEQ ID NO:4 adatai:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 27 bázispár (B) típusa: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológiája: ismeretlen (ii) molekulatípus: oligomer DNS (xi) szekvencia leírása: SEQIDNO:4:

GGATCCTCTG TTCCTTCTGC TCCAGTG (2) A SEQ ID NO:5 adatai:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 27 bázispár í (B) típusa: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú f (D) topológiája: ismeretlen

HU 221 647 Bl (ii) molekulatípus: oligomer DNS (xi) szekvencia leírása: SEQ ID NO: 5:

TCTGTTCCTT CTGCTCCAGT G (2) A SEQ ID NO:6 adatai:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 16 bázispár (B) típusa: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológiája: ismeretlen (ii) molekulatipus: oligomer DNS (xi) szekvencia leírása: SEQIDNO:6:

TATAGACTAG TCTAGG L (2) A SEQ ID NO:7 adatai:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 18 bázispár (B) típusa: nukleinsav (C) szál típus: egyszálú (D) topológiája: ismeretlen (ii) molekulatípus: oligomer DNS (xi) szekvencia leírása: SEQ ID NO: 7:

ATCTGATCAG ATCCTTAA (2) A SEQ ID NO: 8 adatai:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 39 bázispár (B) típusa: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológiája: ismeretlen j (ii) molekulatípus: oligomer DNS l (xi) szekvencia leírása: SEQ ID NO: 8: J

AACCTCTCCA TGCTAGTACT GGTCATGGCG GACTGCGCC I (2) A SEQ ID NO:9 adatai: j (i) a szekvencia jellemzői: j (A) hossza: 13 aminosav J, (B) típusa : aminosav | (C) száltípus: lineáris | (ii) molekulatipus: fehéije | (xi) szekvencia leírása: SEQ ID NO: 9: *·

Asn Leu Ser Met Leu Val Leu Val Met Alá Asp Cys Alá 1 5 10 (2) A SEQ ID NO: 10 adatai:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 30 bázispár (B) típusa: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ii) molekulatipus: oligomer DNS (xi) szekvencia leírása: SEQ ID NO: 10:

AACCTCTCCA TGCTATAGAC TAGTTCTAGG (2) A SEQ ID NO: 11 adatai: j (i) a szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 5 aminosav (B) típusa: aminosav (C) száltípus: lineáris (ii) molekulatípus: fehéije (xi) szekvencia leírása: SEQ ID NO: 11:

Asn Leu Ser Met Leu

5 t (2) A SEQ ID NO: 12 adatai:

(i) a szekvencia jellemzői: r (A) hossza: 24 bázispár

HU 221 647 Bl (B) típusa: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ii) molekulatipus: oligomer DNS (xi) szekvencia leírása: SEQ ID NO: 12:

AACCTCTCCA TGCTAGACTG CGCC (2) A SEQ ID NO: 13 adatai:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 8 aminosav (B) típusa: aminosav (C) száltípus: lineáris (ii) molekulatipus: fehérje _ (xi) szekvencia leírása: SEQ ID NO: 13:

Asn Leu Ser Met Leu₈₆₂ Asp₈₈₂ Cys Alá

5 (2) A SEQ ID NO: 14 adatai:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 42 bázispár (B) típusa: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ii) molekulatipus: lineáris (xi) szekvencia leírása: SEQ ID NO: 14:

GGTCATGTCG GGGGCCTTTG ACTCTGTGCC GTTGTCCCAT GG (2) A SEQ ID NO: 15 adatai:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 42 bázispár í (B) típusa: nukleinsav i (C) száltípus: egyszálú i(D) topológiája: lineáris ;

(ii) molekulatípus: oligomer DNS | (xi) szekvencia leírása: SEQ ID NO: 15:

GGTCATGTCG GGGGCCTTAC TTTCTGTGCC GTTGTCCCCAT GG (2) A SEQ ID NO: 16 adatai:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 42 bázispár (B) típusa: nukleinsav * (C) száltípus: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ii) molekulatipus: oligomer DNS (xi) szekvencia leírása: SEQ ID NO: 16:

GTGTGTTATA TTTTCACCTC CAGTTGGGTG AGCGGAGGTT AG (2) A SEQ ID: 17 adatai:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 42 bázispár (B) típusa: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ii) molekulatipus: oligomer DNS :

(xi) szekvencia leírása: SEQ ID NO: 17:

CTGTGTTATA TTTTCACCAC CTGTTGGGTG AGCGGAGGTT AG (2) A SEQ ID: 18 adatai:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 3833 bázispár (B) típusa: nukleinsav (C) száltípus: kétszálú (D) topológiája: ismeretlen ♦ (ii) molekulatípus: cDNS (xi) jellegzetesség: r (A) név/kulcs: CDS

HU 221 647 Bl (B) lokáció: 1014...3734 (xi) szekvencia leírása: SEQ IDNO: 18:

GAATTCCATA AATGAAACAC GCTGGTCAGG TGTTAAAACT TCCTCCCAGA TTTTCGTGAG 60

GCTCCTGTGT ATAGCCATAT AGTCAAAGAA AATACTGTAG CGGGGATTAC AGCTCTGTAC 120

AATGTTACCC ACGGAGCTCT GAACATACAA CCACTGGCGA TCCCCGGGGG TACATCGCGG 180

CAGCTTAAAG GTGCCGGCGG AAAAGGTCAC GTGACACCTA CGGCCACCTG TGCACCCAAG 240

TGTCGCCTGG AGATGTACGA ATGTGGGAGT CGTCTGGTGA TCGGTGTAGC TGTACATCCA 300

GCTGCTGTAT GCCTGGTAAC CCATAGGCCA TCCGGCGGCC AGGGTTTGCA GTCTCCATTT 360

GGCCTGATCT CTACGAGAAG CTGGATTTCT CCGACGATCT CTAATGGCCT GTCGAATGGC 420

CATGGCATAC ATTATGTACA TCTCGGTATT TGAAATCTGG ATCCGAAAAA CTGGTCTATG 480

GCTCGTGTGT CGATGCGCTG AAACCAACGG CAACAAATTA CTTACCTTGT TGTTGTGTGA 540

TGGGTAAAAA CACACATCAC ACACTTAGGC CATAGGGATG CTCACCGTAG CCGCGGCTCC 600

AATCGCTTGA AGAAGTGTTC TTAGATCTAG TGGAAACCTG CGGAGAATGG CTTCTCGCCC 660

AGGGAGATCC GGCTGGGGTG GGAGCATGGG TCGTGCTGGA GCTGACCCAC CGGCATCATG 720

ATCGACCCGC TTTCTCTTCG TACCCTTCTG GGCCGGCTCC AGGTGGGCAT CTTCTGCTTC 780

CTTTTCTGAG CTGCTATCTG ATAACTCTAT GAGGACATTT TCCCAATCTC CCGCCGATAC 840

CTGTTCCTGC ACAACCGAGG TAGATGGGAC TTCTTCTTCC ATGTTGTCAT CCAGGGCCGG 900

GGGACCCGGC CTGTCCTTGT CCATTTTGTC TGCAACAAAA GTGTGACTCA CCAACACCGC 960

ACCCCCCTTG TACCTATTAA AGAGGATGCT GCCTAGAAAT CGGTGCCGAG ACA ATG 1016

Me t 1

GAG Glu

GCA Al a

GCC Al a

TTG Leu 5

CTT Leu

GTG Val

TGT Cys

CAG Gin

TAC Tyr 10

ACC Thr

ATC lle

CAG Gin

AGC Ser

CTG Leu 15

ATC lle

CAT His

1064

i

CTC

ACG

GGT

GAA

GAT

CCT

GGT

TTT

TTC

AAT

GTT

GAG

ATT

CCG

GAA

TTC

1112

Leu

Thr

Gly

Glu

Asp

Pro

Gly

Phe

Phe

Asn

Val

Glu

lle

Pro

Glu

Phe

J.

20

25

30

CCA

TTT

TAC

CCC

ACA

TGC

AAT

GTT

TGC

ACG

GCA

GAT

GTC

AAT

GTA

ACT

1160

r

Pro

Phe

Tyr

Pro

Thr

Cys

Asn

Val

Cys

Thr

Alá

Asp

Val

Asn

Val

Thr

35

40

45

ATC

AAT

TTC

GAT

GTC

GGG

GGC

AAA

AAG

CAT

CAA

CTT

GAT

CTT

GAC

TTT

1208

lle

Asn

Phe

Asp

Val

Gly

Gly

Lys

Lys

His

Gin

Leu

Asp

Leu

Asp

Phe

50

55

60

65

i

GGC

CAG

CTG

ACA

CCC

CAT

ACG

AAG

GCT

GTC

TAC

CAA

CCT

CGA

GGT

GCA

1256

Gly

Gin

Leu

Thr

Pro

Hi s

Thr

Lys

Alá

Val

Tyr

Gin

Pro

Arg

Gly

Al a

70

75

80

TTT

GGT

GGC

TCA

GAA

AAT

GCC

ACC

AAT

CTC

TTT

CTA

CTG

GAG

CTC

CTT

1304

Phe

Gly

Gly

Ser

Glu

Asn

Alá

Thr

Asn

Leu

Phe

Leu

Leu

Glu

Leu

Leu

85

90

95

GGT

GCA

GGA

GAA

TTG

GCT

CTA

ACT

ATG

CGG

TCT

AAG

AAG

CTT

CCA

ATT

1352

Gly

Al a

Gly

Glu

Leu

Al a

Leu

Thr

Me t

Arg

Ser

Lys

Lys

Leu

Pro

lle

100

105

110

1

AAC

GTC

ACC

ACC

GGA

GAG

GAG

CAA

CAA

GTA

AGC

CTG

GAA

TCT

GTA

GAT

1400

-

Asn

Val

Thr

Thr

Gly

Glu

Glu

Gin

Gin

Val

Ser

Leu

Glu

Se r

Va 1

Asp

115

120

125

GTC

TAC

TTT

CAA

GAT

GTG

TTT

GGA

ACC

ATG

TGG

TGC

CAC

CAT

GCA

GAA

1448

Val

Tyr

Phe

Gin

Asp

Val

Phe

Gly

Thr

Me t

Trp

Cys

Hi s

Hi s

Al a

Glu

130

135

140

145

E

HU 221 647 Bl

ATG Me t

CAA AAC

CCC GTG

TAC CTG ATA CCA

GAA ACA GTG CCA TAC ATA AAG

1496

Gin

Asn

Pro

Val 150

Tyr

Leu

Ile

Pro

Glu 155

Thr

Val

Pro

Tyr

Ile 160

Lys

TGG

GAT

AAC

TGT

AAT

TCT

ACC

AAT

ATA

ACG

GCA

GTA

GTG

AGG

GCA

CAG

1544

Trp

Asp

Asn

Cys 165

Asn

Ser

Thr

Asn

Ile 170

Thr

Al a

Val

Val

Arg 175

Ala

Gin

GGG

CTG

GAT

GTC

ACG

CTA

CCC

TTA

AGT

TTG

CCA

ACG

TCA

GCT

CAA

GAC

1592

Gly

Leu

Asp 180

Val

Thr

Leu

Pro

Leu 185

Ser

Leu

Pro

Thr

Ser 190

Al a

Gin

Asp

TCG

AAT

TTC

AGC

GTA

AAA

ACA

GAA

ATG

CTC

GGT

AAT

GAG

ATA

GAT

ATT

1640

Ser

Asn 195

Phe

Ser

Val

Lys

Thr 200

Glu

Met

Leu

Gly

Asn 205

Glu

Ile

Asp

Ile

GAG

TGT

ATT

ATG

GAG

GAT

GGC

GAA

ATT

TCA

CAA

GTT

CTG

CCC

GGA

GAC

1688

Glu 210

Cys

Ile

Me t

Glu

Asp 215

Gly

Glu

Ile

Ser

Gin 220

Val

Leu

Pr o

Gly

Asp 225

AAC

AAA

ttt

AAC

ATC

ACC

TGC

AGT

GGA

TAC

GAG

AGC

CAT

GTT

CCC

AGC

1736

Asn

Lys

Phe

Asn

Ile 230

Thr

Cys

Ser

Gly

Tyr 235

Glu

Ser

Hi s

Val

Pr o 240

Ser

GGC

GGA

ATT

CTC

ACA

TCA

ACG

AGT

CCC

GTG

GCC

ACC

CCA

ATA

CCT

GGT

1784

Gly

Gly

Ile

Leu

Thr 245

Ser

Thr

Ser

Pro

Val 250

Al a

Thr

Pro

He

Pro 255

Gly

ACA

GGG

TAT

GCA

TAC

AGC

CTG

CGT

CTG

ACA

CCA

CGT

CCA

GTG

TCA

CGA

1832

Thr

Gly

Tyr

Al a 260

Tyr

Ser

Leu

Arg

Leu 265

Thr

Pro

Arg

Pro

Val 270

Ser

Arg

TTT

CTT

GGC

AAT

AAC

AGT

ATC

CTG

TAC

GTG

TTT

TAC

TCT

GGG

AAT

GGA

1880

Phe

Leu

Gly 275

Asn

Asn

Ser

Ile

Leu 280

Tyr

Val

Phe

Tyr

Ser 285

Gly

Asn

Gly

CCG

AAG

GCG

AGC

GGG

GGA

GAT

TAC

TGC

ATT

CAG

TCC

AAC

ATT

GTG

TTC

1928

Pro

Lys 290

Al a

Ser

Gly

Gly

Asp 295

Tyr

Cys

Ile

Gin

Ser 300

Asn

Ile

Val

Phe 305

TCT

GAT

GAG

ATT

CCA

GCT

TCA

CAG

GAC

ATG

CCG

ACA

AAC

ACC

ACA

GAC

1976

Ser

Asp

Glu

Ile

Pro 310

Ala

Ser

Gin

Asp

Me t 315

Pro

Thr

Asn

Thr

Thr 320

Asp

ATC

ACA

TAT

GTG

GGT

GAC

AAT

GCT

ACC

TAT

TCA

GTG

CCA

ATG

GTC

ACT

2024

Ile

Thr

Tyr

Val 325

Gly

Asp

Asn

Al a

Thr 330

Tyr

Ser

Val

Pro

Me t 335

Val

Thr

TCT

GAG

GAC

GCA

AAC

TCG

CCA

AAT

GTT

ACA

GTG

ACT

GCC

TTT

TGG

GCC

2072

Ser

Glu

Asp 340

Al a

Asn

Ser

Pro

Asn 345

Val

Thr

Val

Thr

Al a 350

Phe

Trp

Al a

TGG

CCA

AAC

AAC

ACT

GAA

ACT

GAC

TTT

AAG

TGC

AAA

TGG

ACT

CTC

ACC

2120

Trp

Pro 355

Asn

Asn

Thr

Glu

Thr 360

Asp

Phe

Lys

Cys

Lys 365

Trp

Thr

Leu

Thr

TCG

GGG

ACA

CCT

TCG

GGT

TGT

GAA

AAT

ATT

TCT

GGT

GCA

TTT

GCG

AGC

2168

Ser 370

Gly

Thr

Pro

Ser

Gly 375

Cys

Glu

Asn

Ile

Ser 380

Gly

Al a

Phe

Al a

Ser 385

HU 221 647 Bl

AAT	CGG	ACA	TTT	GAC	ATT	ACT	GTC	TCG
Asn	Arg	Thr	Phe	Asp 390	Ile	Thr	Val	Ser
ACA	CTC	ATT	ATC	ACA	CGA	ACG	GCT	ACC
Thr	Leu	Ile	Ile 405	Thr	Arg	Thr	Alá	Thr 410
AAG	GTT	ATA	TTC	TCC	AAG	GCA	CCC	GAG
Lys	Val	Ile 420	Phe	Ser	Lys	Alá	Pro 425	Glu
TTG	AAT	ACA	ACT	GGA	TTT	GCT	GAT	CCC
Leu	Asn 435	Thr	Thr	Gly	Phe	Al a 440	Asp	Pro
AGC	TCT	ACT	CAC	GTG	CCT	ACC	AAC	CTC
Ser 450	Ser	Thr	His	Val	Pro 455	Thr	Asn	Leu
CCC	ACT	GTA	TCC	ACC	GCG	GAT	GTC	ACC
Pro	Thr	Val	Ser	Thr 470	Al a	Asp	Val	Thr
ACG	TCA	GGC	GCA	TCA	CCG	GTG	ACA	CCA
Thr	Ser	Gly	Al a 485	Ser	Pro	Val	Thr	Pro 490
GGC	ACA	GAA	AGT	AAG	GCC	CCC	GAC	ATG
Gly	Thr	Glu 500	Ser	Lys	Alá	Pro	As p 505	Me t
ACT	ACC	CCA	ACC	CCA	AAT	GCC	ACC	AGC
Thr	Thr 515	Pro	Thr	Pro	Asn	Al a 520	Thr	Ser
CCA	ACC	CCA	AAT	GCC	ACC	AGC	CCC	ACC
Pro 530	Thr	Pro	Asn	Al a	Thr 535	Ser	Pro	Thr
CCA	AAT	GCC	ACC	AGC	CCC	ACC	TTG	GGA
Pr o	Asn	Al a	Thr	Ser 550	Pro	Thr	Leu	Gly
GTG	ACT	ACC	CCA	ACC	CCA	AAT	GCC	ACC
Val	Thr	Thr	Pro 565	Thr	Pro	Asn	Al a	Thr 570
AGC	CCC	ACC	TCA	GCA	GTG	ACT	ACC	CCA
Ser	Pro	Thr 580	Ser	Al a	Val	Thr	Thr 585	Pro
ACC	TTG	GGA	AAA	ACA	AGC	CCC	ACC	TCA
Thr	Leu 595	Gly	Lys	Thr	Ser	Pro 600	Thr	Ser
AAT	GCC	ACC	GGC	CCT	ACT	GTG	GGA	GAA
Asn	Alá	Thr	Gly	Pro	Thr	Val	Gly	Glu

610 615

GGT Gly 395	CTT GGC	ACG Thr	GCC Al a	CCC Pro 400	AAG Lys	2216
Leu	Gly
AAT	GCC	ACC	ACA	ACA	ACC	CAC	2264
Asn	Al a	Thr	Thr	Thr 415	Thr	Hi s
AGC	ACC	ACC	ACC	TCC	CCT	ACC	2312
Ser	Thr	Thr	Thr 430	Ser	Pro	Thr
AAT	ACA	ACG	ACA	GGT	CTA	CCC	2360
Asn	Thr	Thr 445	Thr	Gly	Leu	Pro
ACC	GCA	CCT	GCA	AGC	ACA	GGC	2408
Thr	Al a 460	Pro	Al a	Se r	Thr	Gly 465
AGC	CCA	ACA	CCA	GCC	GGC	ACA	2456
Ser 475	Pro	Thr	Pro	Al a	Gly 480	Thr
AGT	CCA	TCT	CCA	TGG	GAC	AAC	2504
Ser	Pro	Ser	Pro	Trp 495	Asp	Asn
ACC	AGC	TCC	ACC	TCA	CCA	GTG	2552
Thr	Se r	Ser	Thr 510	Ser	Pro	Val
CCC	ACC	CCA	GCA	GTG	ACT	ACC	2600
Pro	Thr	Pro 525	Alá	Val	Thr	Thr
CCA	GCA	GTG	ACT	ACC	CCA	ACC	2648
Pro	Al a 540	Val	Thr	Thr	Pro	Thr 545
AAA	ACA	AGT	CCT	ACC	TCA	GCA	2696
Lys 555	Thr	Ser	Pr o	Thr	Ser 560	Al a
AGC	CCC	ACC	TTG	GGA	AAA	ACA	2744
Ser	Pr o	Thr	Leu	Gly 575	Lys	Thr
ACC	CCA	AAT	GCC	ACC	AGC	CCC	2792
Thr	Pro	Asn	Alá 590	Thr	Ser	Pr o
GCA	GTG	ACT	ACC	CCA	ACC	CCA	2840
Al a	Val	Thr 605	Thr	Pro	Thr	Pro
ACA	AGT	CCA	CAG	GCA	AAT	GCC	2888
Thr	Ser 620	Pr o	Gin	Al a	Asn	Al a 625

HU 221 647 Bl

ACC AAC CAC

ACC TTA GGA GGA

ACA AGT CCC ACC CCA GTA

GTT Val

ACC Thr 640

AGC Ser

2936

Thr

Asn

His

Thr

Leu 630

Gly Gly

Thr

Ser

Pro 635

Thr

Pro

Val

CAA

CCA

AAA

AAT

GCA

ACC

AGT

GCT

GTT

ACC

ACA

GGC

CAA

CAT

AAC

ATA

2984

Gin

Pro

Lys

Asn

Al a

Thr

Ser

Al a

Val

Thr

Thr

Gly

Gin

Hi s

Asn

lle

645

650

655

ACT

TCA

AGT

TCA

ACC

TCT

TCC

ATG

TCA

CTG

AGA

CCC

AGT

TCA

AAC

CCA

3032

Thr

Ser

Ser

Ser

Thr

Ser

Ser

Me t

Ser

Leu

Arg

Pro

Ser

Ser

Asn

Pro

660

665

670

GAG

ACA

CTC

AGC

CCC

TCC

ACC

AGT

GAC

AAT

TCA

ACG

TCA

CAT

ATG

CCT

3080

—

Glu

Thr

Leu

Ser

Pro

Ser

Thr

Ser

Asp

Asn

Ser

Thr

Ser

Hi s

Me t

Pr o

675

680

685

TTA

CTA

ACC

TCC

GCT

CAC

CCA

ACA

GGT

GGT

GAA

AAT

ATA

ACA

CAG

GTG

3128

Leu

Leu

Thr

Se r

Alá

His

Pro

Thr

Gly

Gly

Glu

Asn

lle

Thr

Gin

Val

690

695

700

705

ACA

CCA

GCC

TCT

ATC

AGC

ACA

CAT

CAT

GTG

TCC

ACC

AGT

TCG

CCA

GAA

3176

Thr

Pro

Alá

Ser

lle

Ser

Thr

His

His

Val

Ser

Thr

Ser

Ser

Pro

Glu

710

715

720

CCC

CGC

CCA

GGC

ACC

ACC

AGC

CAA

GCG

TCA

GGC

CCT

GGA

AAC

AGT

TCC

3224

.4

Pro

Arg

Pro

Gly

Thr

Thr

Ser

Gin

Al a

Ser

Gly

Pro

Gly

Asn

Ser

Ser

1

725

730

735

f

ACA

TCC

ACA

AAA

CCG

GGG

GAG

GTT

AAT

GTC

ACC

AAA

GGC

ACG

CCC

CCC

3272,

Thr

Ser

Thr

Lys

Pro

Gly

Glu

Val

Asn

Val

Thr

Lys

Gly

Thr

Pro

Pro

Í

740 745 750

Ü4

CAA AAT GCA ACG TCG CCC CAG

GCC CCC AGT GGC CAA AAG ACG

GCG Alá

GTT Val

3320

Gin

Asn Alá 755

Thr

Ser

Pro Gin 760

Alá

Pro

Ser

Gly

Gin 765

Lys

Thr

CCC

ACG

GTC

ACC

TCA

ACA

GGT

GGA

AAG

GCC

AAT

TCT

ACC

ACC

GGT

GGA

3368

Pro

Thr

Val

Thr

Se r

Thr

Gly

Gly

Lys

Al a

Asn

Ser

Thr

Thr

Gly

Gly

770

775

780

785

AAG

CAC

ACC

ACA

GGA

CAT

GGA

GCC

CGG

ACA

AGT

ACA

GAG

CCC

ACC

ACA

3416

Lys

His

Thr

Thr

Gly

His

Gly

Al a

Arg

Thr

Ser

Thr

Glu

Pr o

Thr

Thr

790

795

800

GAT

TAC

GGC

GGT

GAT

TCA

ACT

ACG

CCA

AGA

CCG

AGA

TAC

AAT

GCG

ACC

3464

Asp

Tyr

Gly

Gly

As p

Ser

Thr

Thr

Pro

Arg

Pro

Arg

Tyr

Asn

Al a

Thr

805

810

815

ACC

TAT

CTA

CCT

CCC

AGC

ACT

TCT

AGC

AAA

CTG

CGG

CCC

CGC

TGG

ACT

3512

Thr

Tyr

Leu

Pro

Pro

Ser

Thr

Ser

Ser

Lys

Leu

Arg

Pro

Arg

Trp

Thr

820

825

830

TTT

ACG

AGC

CCA

CCG

GTT

ACC

ACA

GCC

CAA

GCC

ACC

GTG

CCA

GTC

CCG

3560

Phe

Thr

Ser

Pro

Pro

Val

Thr

Thr

Alá

Gin

Al a

Thr

Val

Pro

Val

Pro

835

840

845

CCA

ACG

TCC

CAG

CCC

AGA

TTC

TCA

AAC

CTC

TCC

ATG

CTA

GTA

CTG

CAG

3608

Pro

Thr

Ser

Gin

Pro

Arg

Phe

Ser

Asn

Leu

Ser

Me t

Leu

Val

Leu

Gin

850

855

860

865

HU 221 647 Bl

TGG Trp

GCC Al a

TCT Ser

CTG GCT GTG CTG ACC CTT CTG CTG CTG CTG GTC ATG

GCG Al a

3656

Leu Alá 870

Val

Leu Thr

Leu

Leu 875

Leu

Leu

Leu

Val

Met 880

GAC

TGC

GCC

TTT

AGG

CGT

AAC

TTG

TCT

ACA

TCC

CAT

ACC

TAC

ACC

ACC

3704

Asp

Cys

Alá

Phe

Arg

Arg

Asn

Leu

Ser

Thr

Ser

His

Thr

Tyr

Thr

Thr

885

890

895

CCA

CCA

TAT

GAT

GAC

GCC

GAG

ACC

TAT

GTA

TAAAGTCAAT AAAAATTTAT

3754

Pro

Pro

Tyr

Asp

Asp

Al a

Glu

Thr

Tyr

Val

900 905

TAATCAGAAA TTTGCACTTT CTTTGCTTCA CGTCCCCGGG AGCGGGAGCG GGCACGTCGG 3814 GTGGCGTTGG GGTCGTTTG 38 33 (2) A SEQ ID NO: 19 adatai:

(A) hossza: 907 aminosav (B) típusa: aminosav (D) topológiája: lineáris (ii) molekulatípus: fehéije (xi) szekvencia leírása: SEQ ID: 19

Me t 1

Glu

Alá

Al a

Leu 5

Leu

Val

Cys

Gin

Tyr 10

Thr

Ile

Gin

Ser

Leu 15

Ile

His

Leu

Thr

Gly 20

Glu

Asp

Pro

Gly

Phe 25

Phe

Asn

Val

Glu

Ile 30

Pro

Glu

Phe

Pro

Phe 35

Tyr

Pro

Thr

Cys

Asn 40

Val

Cys

Thr

Alá

Asp 45

Val

Asn

Val

Thr

Ile 50

Asn

Phe

Asp

Val

Gly 55

Gly

Lys

Lys

Hi s

Gin 60

Leu

Asp

Leu

Asp

Phe 65

Gly

Gin

Leu

Thr

Pro 70

Hi s

Thr

Lys

Al a

Val 75

Tyr

Gin

Pro

Arg

Gly 80

Al a

Phe

Gly

Gly

Ser 85

Glu

Asn

Al a

Thr

Asn 90

Leu

Phe

Leu

Leu

Glu 95

Leu

Leu

Gly

Al a

Gly 100

Glu

Leu

Al a

Leu

Thr 105

Me t

Arg

Ser

Lys

Lys 110

Leu

Pro

Ile

Asn

Val 115

Thr

Thr

Gly

Glu

Glu 120

Gin

Gin

Val

Ser

Leu 125

Glu

Ser

Val

Asp

Val 130

Tyr

Phe

Gin

Asp

Val 135

Phe

Gly

Thr

Me t

Trp 140

Cys

Hi s

Hi s

Al a

Glu 145

Me t

Gin

Asn

Pro

Val 150

Tyr

Leu

Ile

Pro

Glu 155

Thr

Val

Pro

Tyr

Ile 160

Lys

Trp

Asp

Asn

Cys 165

Asn

Ser

Thr

Asn

Ile 170

Thr

Al a

Val

Val

Arg 175

Al a

Gin

Gly

Leu

Asp 180

Val

Thr

Leu

Pro

Leu 185

Ser

Leu

Pro

Thr

Ser 190

Al a

Gin

Asp

Ser

Asn 195

Phe

Ser

Val

Lys

Thr 200

Glu

Me t

Leu

Gly

Asn 205

Glu

Ile

Asp

Ile

Glu 210

Cy s

Ile

Me t

Glu

Asp 215

Gly

Glu

Ile

Ser

Gin 220

Val

Leu

Pro

Gly

HU 221 647 Bl

Asp 225

Asn

Lys

Phe

Asn

Ile 230

Thr

Cys

Ser

Gly

Tyr 235

Glu

Ser

Hi s

Val

Pr o 240

Ser

Gly

Gly

Ile

Leu 245

Thr

Ser

Thr

Ser

Pro 250

Val

Al a

Thr

Pro

Ile 255

Pro

Gly

Thr

Gly

Tyr 260

Al a

Tyr

Ser

Leu

Arg 265

Leu

Thr

Pro

Arg

Pro 270

Val

Se r

Arg

Phe

Leu 275

Gly

Asn

Asn

Se r

Ile 280

Leu

Tyr

Val

Phe

Tyr 285

Ser

Gly

Asn

Gly

Pro 290

Lys

Al a

Ser

Gly

Gly 295

Asp

Tyr

Cys

Ile

Gin 300

Ser

Asn

Ile

Val

Phe 305

Ser

Asp

Glu

Ile

Pro 310

Al a

Ser

Gin

Asp

Me t 315

Pro

Thr

Asn

Thr

Thr 320

Asp

Ile

Thr

Tyr

Val 325

Gly

Asp

Asn

Al a

Thr 330

Tyr

Ser

Val

Pro

Met 335

Val

Thr

Ser

Glu

Asp 340

Al a

Asn

Ser

Pr o

Asn 345

Val

Thr

Val

Thr

Ala 350

Phe

Trp

Al a

Trp

Pro 355

Asn

Asn

Thr

Glu

Thr 360

Asp

Phe

Lys

Cys

Lys 365

Trp

Thr

Leu

Thr

Ser 370

Gly

Thr

Pr o

Ser

Gly 375

Cys

Glu

Asn

Ile

Ser 380

Gly

Al a

Phe

Al a

Ser 385

Asn

Arg

Thr

Phe

Asp 390

Ile

Thr

Val

Ser

Gly 395

Leu

Gly

Thr

Al a

Pro 400

Lys

Thr

Leu

Ile

Ile 405

Thr

Arg

Thr

Al a

Thr 410

Asn

Al a

Thr

Thr

Thr 415

Thr

Hi s

Lys

Val

Ile 420

Phe

Ser

Lys

Al a

Pro 425

Glu

Ser

Thr

Thr

Thr 430

Ser

Pro

Thr

Leu

Asn 435

Thr

Thr

Gly

Phe

Al a 440

Asp

Pro

Asn

Thr

Thr 445

Thr

Gly

Leu

Pro

Ser 450

Ser

Thr

Hi s

Val

Pro 455

Thr

Asn

Leu

Thr

Al a 460

Pro

Al a

Ser

Thr

Gly 465

Pr o

Thr

Val

Ser

Thr 470

Al a

Asp

Val

Thr

Ser 475

Pro

Thr

Pr o

Al a

Gly 480

Thr

Thr

Ser

Gly

Al a 485

Ser

Pro

Val

Thr

Pro 490

Ser

Pro

Ser

Pro

Trp 495

Asp

Asn

Gly

Thr

Glu 500

Ser

Lys

Al a

Pro

Asp 505

Me t

Thr

Ser

Ser

Thr 510

Ser

Pro

Val

Thr

Thr 515

Pro

Thr

Pro

Asn

Al a 520

Thr

Ser

Pro

Thr

Pro 525

Al a

Val

Thr

Thr

Pro 530

Thr

Pro

Asn

Al a

Thr 535

Ser

Pro

Thr

Pro

Al a 540

Val

Thr

Thr

Pro

HU 221 647 Bl

Thr 545	Pro	Asn	Al a	Thr	Ser 550	Pro	Thr	Leu	Gly	Lys 555
Al a	Val	Thr	Thr	Pro 565	Thr	Pro	Asn	Al a	Thr 570	Ser
Thr	Ser	Pro	Thr 580	Ser	Al a	Val	Thr	Thr 585	Pro	Thr
Pro	Thr	Leu 595	Gly	Lys	Thr	Ser	Pro 600	Thr	Ser	Al a
Pro	Asn 610	Al a	Thr	Gly	Pro	Thr 615	Val	Gly	Glu	Thr
Al a 625	Thr	Asn	His	Thr	Leu 630	Gly	Gly	Thr	Ser	Pro 635
Ser	Gin	Pro	Lys	Asn 645	Alá	Thr	Ser	Al a	Val 650	Thr
Ile	Thr	Ser	Ser 660	Ser	Thr	Ser	Ser	Met 665	Ser	Leu
Pro	Glu	Thr 675	Leu	Ser	Pro	Ser	Thr 680	Ser	Asp	Asn
Pro	Leu 690	Leu	Thr	Ser	Al a	Hi s 695	Pro	Thr	Gly	Gly
Val 705	Thr	Pr o	Alá	Ser	Ile 710	Ser	Thr	His	His	Val 715
Glu	Pro	Arg	Pro	Gly 725	Thr	Thr	Ser	Gin	Al a 730	Ser
Ser	Thr	Ser	Thr 740	Lys	Pro	Gly	Glu	Val 745	Asn	Val
Pro	Gin	Asn 755	Al a	Thr	Ser	Pro	Gin 760	Alá	Pro	Se r
Val	Pro 770	Thr	Val	Thr	Ser	Thr 775	Gly	Gly	Lys	Alá
Gly 785	Lys	Hi s	Thr	Thr	Gly 790	Hi s	Gly	Al a	Arg	Thr 795
Thr	Asp	Tyr	Gly	Gly 805	Asp	Ser	Thr	Thr	Pro 810	Arg
Thr	Thr	Tyr	Leu 820	Pro	Pro	Ser	Thr	Ser 825	Ser	Ly s
Thr	Phe	Thr 835	Ser	Pro	Pro	Val	Thr 840	Thr	Alá	Gin
Pro	Pro	Thr	Ser	Gin	Pro	Arg	Phe	Ser	Asn	Leu

Thr	Ser	Pro	Thr	Ser 560
Pro	Thr	Leu	Gly 575	Lys
Pro	Asn	Al a 590	Thr	Ser
Val	Thr 605	Thr	Pro	Thr
Ser 620	Pro	Gin	Al a	Asn
Thr	Pro	Val	Val	Thr 640
Thr	Gly	Gin	Hi s 655	Asn
Arg	Pro	Ser 670	Ser	Asn
Ser	Thr 685	Ser	Hi s	Me t	1
Glu 700	Asn	Ile	Thr	Gin	í
Ser	Thr	Ser	Ser	Pro 720	p
Gly	Pro	Gly	Asn 735	Ser
Thr	Lys	Gly 750	Thr	Pro	j
Gly	Gin 765	Lys	Thr	Al a
Asn 780	Ser	Thr	Thr	Gly
Ser	Thr	Glu	Pro	Thr 800
Pro	Arg	Tyr	Asn 815	Alá	i
Leu	Arg	Pro 830	Arg	Trp
Al a	Thr 845	Val	Pro	Val	i
Ser	Me t	Leu	Val	Leu	i. F

850 855

860

HU 221 647 Bl

Gin 865	Trp	Al a	Ser	Leu	Al a 870	Val	Leu
Al a	Asp	Cys	Al a	Phe 885	Arg	Arg	Asn
Thr	Pro	Pro	Tyr	Asp	Asp	Alá	Glu

900

Thr	Leu	Leu 875	Leu	Leu	Leu	Val	Met 880
Leu	Ser	Thr	Ser	Hi s	Thr	Tyr	Thr
	890					895
Thr	Tyr	Val

905

Claims (18)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Az EBV gp350 fehérjét vagy az EBV gp35O fehérje egy rövidített verzióját kódoló izolált DNSszakasz, azzal jellemezve, hogy a membránon átnyúló 15 régióban egy deléciót hordoz; továbbá, a membránon átnyúló régióban és a fennmaradó C-terminálison egy deléciót hordoz és/vagy a szignálfragmens delécióját hordozza; és amely DNS-szakasz egy vagy több illeszkedési pontján a gp220 mRNS-transzkripciójának kialakulá- 20 sát megakadályozó csendes mutációt tartalmaz.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS-szakasz, azzal jellemezve, hogy az egy vagy több illeszkedési helyen található mutáció a donor illeszkedési helyen található mutáció.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti DNS-szakasz, azzal jellemezve, hogy az egy vagy több illeszkedési helyen található mutáció az akceptor illeszkedési helyen található mutáció.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti DNS-szakasz, azzal jelle- 30 mezve, hogy az egy vagy több illeszkedési helyen található mutáció az akceptor és a donor illeszkedési helyen található mutáció.
5. 5. A 4. igénypont szerinti DNS-szakasz, azzal jellemezve, hogy abban legalább egy, a 18. számú szekven- 35 cia 501-es kodonjánál található, szerint kódoló natív nukleotid és legalább egy, a 18. számú szekvencia 698as kodonjánál található, glicint kódoló natív nukleotid egy nem natív nukleotiddal helyettesített, és a DNSszakasz által kódolt aminosavsorrend változatlan.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy a DNS az EBV gp350 egy rövidített verzióját kódolja, amely a membránon átnyúló régióban legalább 8 aminosavas, szekretált terméket eredményező deléciót hordoz. 45
7. 7. A 6. igénypont szerinti DNS-szakasz, azzal jellemezve, hogy az egy vagy több illeszkedési helyen található mutáció a donor illeszkedési helyen található mutáció.
8. 8. A 6. igénypont szerinti DNS-szakasz, azzal jellemezve, hogy az egy vagy több illeszkedési helyen talál- 50 ható mutáció az akceptor illeszkedési helyen található mutáció.
9. 9. Az 1. igénypont szerinti DNS-szakasz, azzal jellemezve, hogy a DNS-szakasz az

   a) a 18. számú szekvencia 19-862 kodonjai, 55

   b) a 18. számú szekvencia 1-862 kodonjai,

   c) a 18. számú szekvencia 19-862 és 882-907 kodonjai, vagy

   d) a 18. számú szekvencia 1-862 és 882-907 kodonjai által kódolt aminosavfragmenssel megegyező aminosavfragmenst kódol.
10. 10. Vektor, azzal jellemezve, hogy a 3. vagy 5-9. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szakaszt tartalmazza.
11. 11. A 3. vagy 5-9. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szakasszal transzformált gazdasejt, azzal jellemezve, hogy működőképesen kapcsolt egy, az említett DNS-szakasz replikációját és expresszióját szabályozni képes expressziós kontrollszakaszhoz.
12. 12. Eljárás gp350 fehérje előállítására, αζζα/ jellemezve, hogy egy 11. igénypont szerinti gazdasejtet

    25 megfelelő tenyésztőközegben tenyésztünk, és a gp350es fehérjét az említett sejtből izoláljuk.
13. 13. Homogén EBV gp350 fehérje, azzal jellemezve, hogy egy a transzmemhrándoménben egy deléciót tartalmazó DNS-szakasz kódolja, és egy nem funkcionális illeszkedési hellyel rendelkezik, és így egy extracelluláris dómén és egy citoplazmatikus dómén fúziójaként, oldható formában EBV gp220 nélkül keletkezik.
14. 14. Profilaktikus gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a 13. igénypont szerinti homogén gp350 fehérjét tartalmazza egy gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt.
15. 15. A 13. igénypont szerinti homogén EBV gp350 alkalmazása EBV-vel kapcsolatos betegségek vagy tünetek profilaktikus kezelésére alkalmas, immunválaszt sti40 muláló gyógyszerkészítmény előállítására.
16. 16. A 13. igénypont szerinti EBV gp350 fehéije, azzaljellemezve, hogy a transzmembrándeléció az IC. ábrán (18. számú szekvencia) bemutatott Ser₈₆₀-Ala₈₈₁ deléciót tartalmazza.
17. 17. Készítmény, azzal jellemezve, gyógyászatilag elfogadható hordozót és olyan EBV gp350 fehérjét tartalmaz, amelyet egy olyan gazdasejt tenyésztőközegéből izolálunk, amely EBV gp350 fehérjét expresszál, illetve szekretál a tenyésztőközegbe, amely fehérjét egy olyan DNS-szakasz kódol, amely az EBV gp35O fehéije egy extracelluláris dómén és egy citoplazmatikus dómén fúziójaként, oldható formában EBV gp220 nélküli keletkezését lehetővé tévő deletált transzmembrándoménnel és egy nem funkcionális illeszkedési hellyel rendelkezik.
18. 18. A 17. igénypont szerinti készítmény alkalmazása EBV-vel kapcsolatos betegségek vagy tünetek profilaktikus kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.