PL181881B1 - Wydzielona sekwencja DNA, wektor, transformowana komórka gospodarza, sposób wytwarzania bialka gp350, homogeniczne bialko gp350, srodek farmaceutyczny oraz kompozycja immunogenna PL PL PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Wydzielona sekwencja DNA, wektor, transformowana komórka gospodarza, sposób wytwarzania bialka gp350, homogeniczne bialko gp350, srodek farmaceutyczny oraz kompozycja immunogenna PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number
PL181881B1
PL181881B1 PL95316941A PL31694195A PL181881B1 PL 181881 B1 PL181881 B1 PL 181881B1 PL 95316941 A PL95316941 A PL 95316941A PL 31694195 A PL31694195 A PL 31694195A PL 181881 B1 PL181881 B1 PL 181881B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
protein
sequence
ebv
mutation
thr
Prior art date
Application number
PL95316941A
Other languages
English (en)
Other versions
PL316941A1 (en
Inventor
Richard Spaete
Winthrop T Jackman
Original Assignee
Aviron Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aviron Inc filed Critical Aviron Inc
Publication of PL316941A1 publication Critical patent/PL316941A1/xx
Publication of PL181881B1 publication Critical patent/PL181881B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Surgical Instruments (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

1 Wydzielona sekwencja DNA zawierajaca sekwencje nukleotydowa przedstawiona na figurze 1 lub jej fragment, kodujaca bialko EBV gp350 albo skrócona wersje bialka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada delecje w regionie blonowym, delecje w czesci lub calosci regionu blonowego 1 pozostawiajaca C-koniec i/lub delecje czesci lub calosci sekwencji sygnalowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutacje w jednym lub wiecej miejscu skladania II Wektor wedlug zastrz 10, znamienny tym, ze koduje sekrecyjna skrócona wersje EBV gp350 posiadajaca delecje przy- najmniej 8 aminokwasów w regionie blonowym, korzystnie od Met 861 do Ala 881 zgodnie z SEQ ID No 18 19 Komórka gospodarza transformowana sekwencja DNA pozostajaca w operacyjnym polaczeniu z sekwencja zdolna do kie- rowania jej replikacja i ekspresja, znamienna tym, ze sekwencja kodujaca zawiera sekwencje nukleotydowa przedstawiona na figurze 1 lub jej fragmenty, kodujaca bialko EBV gp350 albo skrócona wersje bialka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada delecje w regionie blonowym, delecje w czesci lub calosci regionu blonowego i pozostawiajaca C-koniec i/lub delecje czesci lub calosci se- kwencji sygnalowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutacje w jednym lub wiecej miejscu skladania 28 Sposób wytwarzania bialka gp350, znamienny tym, ze hoduje sie komórke gospodarza i wydziela sie bialko gp350 z t e j komórki, przy czym stosuje sie komórke gospodarza transformowana kodujaca sekwencja DNA pozostajaca w operacyjnym polaczeniu z sekwencja zdolna do kierowania jej replikacja i ekspresja, a sekwencja kodujaca zawiera sekwencje nukleotydowa przedstawiona na figurze 1 lub jej fragmenty, kodujaca bialko EBV gp350 albo skrócona wersje bialka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada delecje w regionie blonowym, delecje w czesci lub calosci regionu blonowego i pozostawiajaca C-koniec i/lub delecje czesci lub calosci sekwencji sygnalowej, przy czym Sekwencja DNA posiada mutacje w jednym lub wiecej miejscu skladania 37 Homogeniczne bialko gp350 bedace bialkiem EBV gp350 albo skrócona wersja bialka EBV gp350, zawierajace sekwencje aminokwasowa przedstawiona na figurze 1 lub jej fragment, przy czym skrócona wersja posiada delecje w regionie blonowym, delecje w czesci lub calosci regionu blonowego i pozostawiajaca C-koniec i/lub delecje czesci lub calosci sekwencji sygnalowej, natomiast kodujaca to bialko sekwencja DNA posiada mutacje w jednym lub wiecej miejscu skladania, która korzystnie jest mutacja zmiany sensu, przy czym zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmiana konserwatywna 38 Srodek farmaceutyczny przydatny w zapobiegawczym leczeniu choroby lub stanu zwiazanego z EBV, zawierajacy czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nosnik, znamienny tym, ze jako czynnik aktywny zawiera homogeniczne bialko gp350 bedace bialkiem EBV gp350 albo skrócona wersja bialka EBV gp350, zawierajace sekwencje aminokwasowa przedstawiona na figurze 1 lub jej fragment, przy czym skrócona wersja posiada delecje w regionie blonowym, delecje w czesci lub calosci regionu blonowego i pozosta- wiajaca C-koniec i/lub delecje czesci lub calosci sekwencji sygnalowej, natomiast kodujaca to bialko sekwencja DNA posiada mutacje w jednym lub wiecej miejscu skladania, która korzystnie jest mutacja zmiany sensu, przy czym zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmiana konserwatywna 40 Kompozycja immunogenna, znamienna tym, ze zawiera homogeniczne bialko gp350 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nosnik, przy czym homogeniczne bialko gp350 posiada delecje aminokwasów od 863 do 907 w pelnej dlugosci bialka EBV gp350 PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest wydzielona sekwencja DNA zawierająca sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, kodująca białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania.
Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp35O posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do Ala 881 zgodnie z SEQ ID No 18.
Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w donorowym miejscu składania.
Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w akceptorowym miejscu składania.
Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera sekwencję nukleotydową w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 501 kodującego serynę z SEQ ID No 18 oraz w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 698 kodującego glicynę z SEQ ID No 18.
Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, ze koduje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję wybraną z grupy obejmującej:
a) kodony od 19 do 862 z SEQ ID No 18;
b) kodony od 1 do 862 z SEQ ID No 18;
c) kodony od 19 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18; oraz
d) kodony od 1 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18.
Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, ze mutacja w miejscu składania jest mutacją synonimową.
Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, ze mutacja w miejscu składania jest mutacją zmiany sensu.
Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, ze zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną.
Przedmiotem wynalazku jest także wektor zawierający sekwencję DNA zawierającą sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, kodująca białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania.
181 881
Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp350 posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do Ala 881 zgodnie z SEQ ID No 18.
Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w donorowym miejscu składania.
Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w akceptorowym miejscu składania.
Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, ze sekwencja kodująca białko EBV gp35O albo skróconą wersję białka EBV gp350 zawiera sekwencję nukleotydową w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 501 kodującego serynę z SEQ ID No 18 oraz w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 698 kodującego glicynę z SEQ ID No 18.
Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja kodująca białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350 koduje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję wybraną z grupy obejmującej:
a) kodony od 19 do 862 z SEQ ID No 18;
b) kodony od 1 do 862 z SEQ ID No 18;
c) kodony od 19 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18; oraz
d) kodony od 1 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18.
Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją synonimową.
Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją zmiany sensu.
Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną.
Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza transformowana sekwencją DNA pozostającą w operacyjnym połączeniu z sekwencją zdolną do kierowania jej replikacją i ekspresją charakteryzująca się tym, ze sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragmenty, kodującą białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania.
Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp350 posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do Ala 881 zgodnie z SEQ ID No 18.
Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, ze mutacja w miejscu składania jest mutacją w donorowym miejscu składania.
Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w akceptorowym miejscu składania.
Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, ze sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową, w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 501 kodującego serynę z SEQ ID No 18 oraz w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 698 kodującego glicynę z SEQ ID No 18.
Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, ze rzeczona sekwencja koduje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję wybraną z grupy obejmującej:
a) kodony od 19 do 862 z SEQ ID No 18;
b) kodony od 1 do 862 z SEQ ID No 18;
c) kodony od 19 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18; oraz
d) kodony od 1 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18.
Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją synonimową.
Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją zmiany sensu.
181 881
Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania białka gp350, charakteryzujący się tym, że hoduje się komórkę gospodarza i wydziela się białko gp350 z tej komórki, przy czym stosuje się komórkę gospodarza transformowaną kodującą sekwencją DNA pozostającą w operacyjnym połączeniu z sekwencją zdolną do kierowania jej aplikacją i ekspresją, a sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragmenty, kodującą białko EBV gp35O albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania.
Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, ze sekwencja koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp350 posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do Ala 881 zgodnie z SEQ ID No 18.
Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w donorowym miejscu składania.
Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w akceptorowym miejscu składania.
Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 501 kodującego serynę z SEQ ID No 18 oraz w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 698 kodującego glicynę z SEQ ID No 18.
Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja koduje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję wybranąz grupy obejmującej:
a) kodony od 19 do 862 z SEQ ID No 18;
b) kodony od 1 do 862 z SEQ ID No 18;
c) kodony od 19 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18; oraz
d) kodony od 1 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18.
Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją synonimową.
Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, ze mutacja w miejscu składania jest mutacją zmiany sensu.
Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, ze zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną.
Przedmiotem wynalazku jest także homogeniczne białko gp350 będące białkiem EBV gp350 albo skróconą wersją białka EBV gp350, zawierające sekwencję aminokwasową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, natomiast kodująca to białko sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania, która korzystnie jest mutacją zmiany sensu, przy czym zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną.
Przedmiotem wynalazku jest także środek farmaceutyczny przydatny w zapobiegawczym leczeniu choroby lub stanu związanego z EBV, zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzujący się tym, ze jako czynnik aktywny zawiera białko gp350 będące białkiem EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, zawierające sekwencję aminokwasową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, natomiast kodująca to białko sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania, która korzystnie jest mutacją zmiany sensu, przy czym zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną.
Korzystnie środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że białko gp350 posiada delecję zarówno sekwencji membranowej jak i części cytoplazmatycznej.
181 881
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja immunogenna charakteryzująca się tym, ze zawiera homogeniczne białko gp350 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym homogeniczne białko gp350 posiada delecję aminokwasów od 863 do 907 w pełnej długości białka EBV gp350.
Korzystnie kompozycja immunogenna według wynalazku charakteryzuje się tym, ze zawiera homogeniczne białko gp350 posiadające sekwencję aminokwasową od 1 do 862 aminokwasu sekwencji aminokwasowej EBV gp350 przedstawionej na fig. 1.
Na figurze 1 zilustrowano sekwencję DNA i aminokwasów gp3 50/220 (z Beisel, J. Virology 54: 665 (1985)). Zaznaczono donorowe i akceptorowe miejsca składania. Obszar przezbłonowy zaznaczono poziomymi strzałkami, a gwiazdkami (*) zaznaczono koniec domniemanej sekwencji sygnałowej. Numery nukleotydów podano z lewej strony, a numery aminokwasów z prawej strony.
Na figurze 2 zilustrowano konstrukcję delecji gp350 i miejscowych mutantów. Mapy plazmidów oznaczonych jako pMDTM i pMSTOP stanowią przykłady nie składanych wariantów gp350/220 według wynalazku. W sekcji (A) liniowy model białka gp350 przedstawiono w przybliżeniu w takiej samej skali jak pokazany pod spodem kodujący klon, BLLF1. N-końcową sekwencję sygnałową (SS) i domeny przezbłonowe (TM) zaznaczono na białku, a istotne miejsca restrykcji zaznaczono na diagramie genu. Gen gp350 sklonowano w 2 segmentach, fragment BLSH1 Hindlll/Bfal i fragment BLSH2 Banl/Hindlll. SCYT stworzono przeprowadzając polimerazową reakcję łańcuchową z obszaru zaznaczonego jako BLLF1. W (B) zilustrowano schemat klonowania pDTM, pSTOP, pMDTM i pMSTOP (plazmidy nie są w tej samej skali). Szczegóły klonowania podano w przykładach 1 i 2. Na mapach plazmidów zaznaczono odpowiednie miejsca restrykcyjne, zastosowane wektory klonowania i fragmenty genu gp35O. Mutacje z miejscowym złączeniem w pMDTM i pMSTOP zaznaczono gwiazdkami.
Na figurze 3 zilustrowano wyniki immunostrącania homogenicznego białka gp350 z klonów pMDTM, na podstawie analizy SDS-PAGE. Dodatnie komórki kontrolne (GH3A19) wydzielające skróconą postać białek gp350/220, ujemne komórki kontrolne (pEE14) oraz szereg klonów pMDTM zaznaczono metabolicznie 35S-metioniną przez 5,5 godziny; z uzyskanego supematantu hodowli tkankowej wydzielono metodą immunostrącania homogeniczne białko gp35O. Dla każdego typu komórek próbki znaczonych supematantów z hodowli tkankowej (S) i wytrącone białka gp350/220 (Ip) poddawano elektroforezie na 5% SDSPAGE (elektroforeza na żelu poliakrylamidowym). Położenia markerów ciężaru cząsteczkowego zaznaczono z lewej strony.
Na figurze 4 zilustrowano wyniki analizy metodą blottingu Northema białka z klonów pMDTM uzyskanego w wyniku ekspresji w komórkach CHO, jak to opisano w przykładach 3 i 4.
Ujawniono kompozycje i sposoby obejmujące klonowane sekwencje DNA EBV, kodujące nie ulegające składaniu warianty gp350. Jak to zaznaczono, takie nie ulegające składaniu warianty określa się jako homogeniczne białka gp350. Zazwyczaj w wyniku ekspresji genu gp350/220 w komórkach ssaków powstają2 produkty genowe, gp350 i gp220, z uwagi na złożenie RNA genu. Wynalazek umożliwia wytwarzanie tylko jednego produktu genowego, gp350. Wynalazek obejmuje usuwanie części lub całości sygnałów miejsc składania RNA w genie gp350 i ekspresję genu w odpowiednich komórkach gospodarzach. Mutacje w genie gp350/220 wprowadzono, aby zapobiec wytwarzaniu wersji białka o 220 kD, gdy następuje ekspresja genu gp350/220 w komórkach ssaków. W efekcie powstajątranskrypty mRNA kodujące tylko gp350. Eliminacja ekspresji gp220 poprzez zastosowanie nie ulegającego składaniu wariantu genu gp350/220 powoduje wzrost ilości wytwarzanego gp350 w stosunku do gp220. Wytwarzanie gp220 nie ma decydującego znaczenia dla uzyskania skutecznej szczepionki przeciw EBV, gdyż gp350 zawiera wszystkie potencjalne antygenowe miejsca występujące w gp220.
Z tego względu w jednym wykonaniu przedmiotem wynalazku jest sekwencja DNA kodująca sekwencję polipeptydową zasadniczo taką samą jak gp350, z wyjątkiem tego, że kodon miejsca złączenia donora kodujący aminokwas 501 oraz kodon miejsca złączenia akceptora kodujący aminokwas 698, zostały zmodyfikowane przez zastąpienie rodzimych nu
181 881 kleotydów nukleotydami nie-rodzimymi. Korzystnie rodzime nukleotydy zastępuje się tak nie-rodzimymi nukleotydami, ze sekwencja aminokwasów pozostaje taka sama. W szczególności w przykładzie rodzime nukleotydy AAGT w miejscu złączenia donora (nukleotydy od 1500 do 1504) oraz rodzime nukleotydy A i T flankujące miejsce złączenia akceptora GG (nukleotydy 2091 do 2094) zastępuje się odpowiednio nukleotydami GTCA oraz T i A. W efekcie w wyniku podstawienia w miejscu donora pozostaje glutamina w pozycji aminokwasu 500 i seryna w pozycji aminokwasu 501. Również w wyniku modyfikacji w miejscu akceptora pozostaje treonina w pozycji aminokwasu 697 i glicyna w pozycji 698.
Specjalista może w analogiczny sposób wykonać podstawienia inne niż przykładowo podane powyżej, jak to zostanie opisane poniżej.
W związku z tym w jednym wykonaniu przedmiotem wynalazku jest homogeniczne białko gp350. Homogeniczne białko gp350 charakteryzuje się ponadto tym, że zawiera sekwencję aminokwasów zasadniczo taką samą jak sekwencja przedstawiona na fig. 1, od aminokwasu 1 do 907, od aminokwasu 1 do 862 lub od aminokwasu 1 do 907, z wyjątkiem aminokwasów 683 do 881, przy czym każda z nich zawiera lub nie zawiera N-końcową sekwencję sygnałową z 18 aminokwasów. Przedmiotem wynalazku są ponadto analogi homogenicznego białka gp350, w tym mutanty, w których występują warianty w sekwencji aminokwasów przy zachowaniu aktywności antygenowej, a korzystnie wykazujące homologię co najmniej 80%, jeszcze korzystniej 90%, a najkorzystniej 95%, z odpowiednim obszarem homogenicznych białek gp350. Przykładowo wymienić można białka i polipeptydy z niewielkimi wariantami aminokwasów w stosunku do sekwencji aminokwasów na fig. 1; w szczególności z konserwatywnymi zastąpieniami aminokwasów. Zastąpieniami konserwatywnymi są takie zastąpienia, które zachodzą w grupie aminokwasów o podobieństwie łańcuchów bocznych. Genetycznie kodowane aminokwasy ogólnie dzieli się na 4 grupy: (1) kwaśne + asparaginian, glutaminian; (2) zasadowe = lizyna, arginina, histydyna; (3) niepolame = alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan; oraz (4) nie naładowane polarne = glicyna, asparagina, glutamina, cysteina, seryna, treonina i tyrozyna. Fenyloalaninę, tryptofan i tyrozynę czasami klasyfikuje się łącznie jako aminokwasy aromatyczne. Tak np. rozsądne wydaj e się, że izolowane zastąpienie leucyny lub podobne konserwatywne zastąpienie aminokwasu strukturalnie podobnym aminokwasem nie będzie miało wpływu na aktywność antygenową lub funkcyjność.
Wynalazek stanowi zaletę w porównaniu z prostszym oczyszczaniem gp350. Z uwagi na to, ze gp350 i gp220 wykazują podobne właściwości biochemiczne, często następuje współoczyszczanie gp220 w preparatach gp350. Ekspresja w komórkach wyłącznie nie ulegającego składaniu wariantu genu gp350/220 upraszcza oczyszczanie białka. Spowoduje to spadek kosztów wytwarzania gp35O. Wynalazek zapewnia również łatwiejszą biochemiczną charakteryzację wyjściowego materiału do oczyszczania gp350. Z uwagi na obecność tylko jednego składnika analizę zawartości białka i analizę sekwencji aminokwasów można przeprowadzać bez uwzględniania obecności drugiego składnika.
Dodatkową zaletę wynalazku stanowi wzrost wytwarzania gp350. Zapobieganie składaniu genu gp350 spowoduje przesunięcie w komórce z równoczesnego wytwarzania gp350 i gp220 na wytwarzanie wyłącznie gp350. Ocenia się, że w pewnych komórkach stężenie gp220 stanowi 30-100% stężenia gp350. Przy wyeliminowaniu składnika genu nastąpi wzrost wytwarzania gp350 związany z brakiem wytwarzania gp220.
Sekwencję DNA genu gp350/220, którą opisali Beisel, J. Virology 54: 665 (1985) i Biggin, EMBO J. 3: 1083 (1984), przedstawiono na fig. 1. Gen stanowi otwartą ramkę odczytu o 2721 parach zasad, kodującą 907 aminokwasów oraz określającą pierwotny produkt translacji o pierwotny produkt translacji o około 95 kD. Różnica między wielkością przewidywaną i rzeczywistą związana jest z wyczerpującym glikozylowaniem białka. 591 zasad (kodujących 197 aminokwasów) odłącza się tworząc gp220. Rzeczywisty ciężar cząsteczkowy produktów genu gp350/220 może również zmieniać się w zależności od typu stosowanego układu pomiarowego, wykorzystania miejsc glikozylowania w różnych typach komórek, różnic w obróbce potranslacyjnej lub selektywnej mutacji genu. Zmierzone wielkości wahają się dla produktu różnych wariantów genu gp350/220 bez miejsca składania, z tym że określenie „homogenicz
181 881 ne białko lub białka gp350” obejmuje produkty genowe wariantu nie ulegającego składaniu, ewentualnie zawierające dodatkowe delecje lub mutacje takie jak C-końcowe delecje i/lub modyfikacje obszaru przezbłonowego, według wynalazku. Określenie „białko gp220” odnosi się do wariantowo złączonego produktu genowego gp3 50/220 o ciężarze cząsteczkowym około 220 kD. Miejsca złączenia w genie gp350/220 zidentyfikowano porównując gen gp350/220 z sekwencjami zgodności złączenia donora i akceptora opartymi na innych genach, przede wszystkim z organizmów eukariotycznych. Sekwencje zgodności ustalone przez Mounta, Nucleic Acids Res. 10: 459 (1982) na podstawie badań miejsc złączenia w innych genach, stanowią:
Donor — AG/G*T*—AGT
C G
Akceptor: T N,, E A * G * /G
Zasady zaznaczone gwiazdkami oznaczają zasady zachowane w 100% we wszystkich miejscach złączenia (zachowane w wysokim stopniu). Pozycje z dwoma zasadami lub z jedną zasadą oznaczają pozycje zachowane (pozycje nie mające decydującego znaczenia). Linia ukośna wskazuje rzeczywiste miejsca złączenia.
W genie gp350/220 miejsce złączenia donorowego występuje po nukleotydzie 1501, a złączenie akceptora występuje po nukleotydzie 2092, co wykazało sekwencjonowanie DNA genu gp350/220 (Biggin, EMBO J. 3: 1083 (1984)). (Liczby podane w opisie i na fig. 1 zgodne są z numeracją Biggina). Miejsce złączenia występuje w odpowiednim obszarze genu w szczepie EBV typu B (miejsce złączenia donora po A1501 oraz miejsce złączenia akceptora po G2029)· Wynalazek obejmuje swym zakresem kompozycje uzyskane z wykorzystaniem szczepu A lub B albo miejsca złączenia innego szczepu EBV w celu wytworzenia pojedynczego składnika mRNA z genu gp350/220. Sekwencję DNA formy typu A wirusa ze szczepu B95-8 zastosowano w przykładach, z tym, ze z równym powodzeniem zastosować można szczep typu B, gdyż produkty translacji genu ze szczepów typu A i B są identyczne w 98%. Szczep B nie zawiera aminokwasów od 507 do 520 i od 570 do 576. Według wynalazku można także zastosować gp350/220 EBV zawierający sekwencje specyficzne dla szczepu w celu uzyskania specyficznych dla szczepu EBV homogenicznych białek gp350 o właściwościach immunogenicznych specyficznych dla określonego szczepu i z tego względu przydatnych w immunogenicznych i/lub terapeutycznych kompozycjach do zapobiegania lub leczenia specyficznych dla szczepu chorób związanych z EBV. W tabeli 1 podano sekwencje nukleotydów i aminokwasów dzikiego typu miejsc złączenia donora i akceptora.
Aby zapobiec złączeniu RNA genu gp350/220 wprowadzono mutacje do sekwencji kwasów nukleinowych genu gp350/220 w celu zastąpienia odpowiednich par zasad miejsca złączenia RNA. Aby spowodować nie funkcjonowanie złączenia korzystnie co najmniej jedną z zasad spośród dwóch wysoce konserwatywnych zasad otaczających miejsce donorowe 1 miejsce akceptorowe należy zastąpić zasadą nie konserwatywną; jeszcze korzystniej co najmniej dwie wysoce konserwatywne zasady należy zmutować na zasady nie konserwatywne. Inne konserwatywne zasady, oddalone o więcej niz dwie zasady od miejsca złączenia, można również zastąpić nie konserwatywnymi zasadami z miejsca złączenia, aby jeszcze bardziej osłabić rozpoznawanie miejsca złączenia. W celu zakłócenia mechanizmów złączania zmienić można zarówno miejsce donorowe jak i akceptorowe. Korzystnie zarówno donor jak i akceptor zawierające najmniej po jednej zmianie w jednej z 4 wysoce konserwatywnych zasad miejsca złączenia, a jeszcze korzystniej co najmniej dwie zmiany w dwóch spośród 4 wysoce konserwatywnych zasad miejsca złączenia. Gdy jedno z miejsc złączenia nie może być mutowane z uwagi na konieczność zachowania sekwencji aminokwasów typu dzikiego, to korzystnie wprowadza się co najmniej dwie mutacje do drugiego miejsca złączenia.
181 881
Mutacja w miejscach złączenia gp350/220 może wprowadzić zmiany w sekwencji aminokwasów białka gp35O wytwarzanego w wyniku ekspresji. Korzystnie zmiany takie powinny stanowić podstawienia konserwatywnych aminokwasów. W przeciwieństwie do zmian niekonserwatywnych w sekwencji aminokwasów konserwatywne podstawienia w sekwencji aminokwasów ułatwiają zachowanie miejsc antygenowych. Zmiany konserwatywnych aminokwasów można wprowadzać, o ile zmiana zasady (lub zmiany zasad) doprowadzi do odpowiedniej zmiany w nie wariantowych zasadach donor/akceptor. Tak np. Gly można zastosować jako zamiennik Ser501 w miejscu złączenia donora z wykorzystaniem dowolnego kodonu specyficznego dla Gly z wyjątkiem GGU (zastosowanie GGU spowodowałoby zachowanie nukleotydu G i nie doprowadziło do pożądanego zastąpienia GT w sygnale złączenia). Podobnie w miejscu złączenia akceptora zmiana Gly698 na Ala mogłaby stanowić zmianę konserwatywną jednakże wszystkie kodony Ala zaczynają się od wysoce konserwatywnego nukleotydu G, a więc mogłoby to nie doprowadzić do pożądanego zastąpienia. Jakkolwiek prolina mogłaby również stanowić konserwatywną zmianę aminokwasu, to nie należy jej stosować do zastępowania aminokwasu dzikiego typu, gdyż mogłoby to doprowadzić do zmodyfikowania trzeciorzędowej struktury białka, a tym samym do zamaskowania jednego lub więcej z miejsc antygenowych w gp350. W tabeli 1 podano dopuszczalne zmiany konserwatywnych aminokwasów w sekwencjach typu dzikiego. Na dole tabeli podano przykład mutacji ze zmianami konserwatywnych aminokwasów.
Tabela 1
Donor Akceptor
Sekwencje typu dzikiego
złączenie złączenie
a| GT ACA g|gt
4 Zmiany konserwatywnych aminokwasów Ί
Asn Ala Ala Ser
Asp Gly Gly Thr
Gin Thr Ser
Przykład: GAC ACA TCG TCT
Asp Thr50χ Ser Ser698 .
Jakkolwiek w jednym wykonaniu wynalazek obejmuje nie ulegający składaniu wariant gp350/220, pożądane mogąbyć również dodatkowe mutacje sekwencji kodującej gp350/220. W celu uzyskania rozpuszczalnych homogenicznych białek gp3 50/220 („białka rozpuszczalne” znajdują się w roztworze lub są zasocjowane z błoną ale nie są zintegrowane z błoną), np. w celu uniknięcia problemów z toksycznością dla komórki, obszar przechodzący przez błonę (określany także jako obszar przezbłonowy) gp350 modyfikuje się na drodze delecji całości lub części kodującej sekwencji DNA. Obszar przechodzący przez błonę w gp350/220 obejmuje aminokwasy od 861 (metionina) do 881 (alanina), patrz Beisel, J. Virology 54: 665 (1985). Korzystnie wykonuje się delecję co najmniej 8 aminokwasów obszaru przezbłonowego, jeszcze korzystniej wykonuje się delecję co najmniej 12 aminokwasów, a najkorzystniej delecję od 18 do 21 aminokwasów. W związku z tym w innym wykonaniu przedmiotem wynalazku są nie ulegające składaniu warianty DNA gp350/220 i/lub homogenicznego białka gp350, zawierające dodatkowo co najmniej jedną delecję w obszarze przezbłonowym DNA
181 881 gp350/220 i/lub homogenicznego białka gp350, co powoduje ekspresję rozpuszczalnego homogenicznego białka gp35O.
Według wynalazku oprócz delecji całości lub części domeny przezbłonowej nie ulegającego składaniu wariantu gp350/220 wykonać można również delecję C-końcowej sekwencji za domeną przezbłonową, obejmującej aminokwasy od 881 do 907, w całości lub częściowo, jak to przedstawiono w opisie. W związku z tym w innym wykonaniu przedmiotem wynalazku są nie ulegające składaniu warianty DNA gp350/220 i/lub homogenicznego białka, zmodyfikowane przez delecję całości lub części kodującej sekwencji DNA i/lub sekwencji aminokwasów obejmującej obszar przezbłonowy gp350/220, a ponadto zmodyfikowane przez delecję reszty C-końcowej sekwencji DNA i/lub sekwencji aminokwasów w gp350/220.
W związku z tym w innym wykonaniu przedmiotem wynalazku są nie ulegające składaniu warianty sekwencji DNA kodujące białka gp35O według wynalazku. Takie sekwencje DNA obejmują sekwencję DNA przedstawioną na fig. 1, kodującą aminokwasy od 1 do 907, a ponadto zawierającą wymienione podstawienia w celu usunięcia miejsc złączenia donora i akceptora. Takie sekwencje DNA ewentualnie obejmują skrócone sekwencje DNA, w których nukleotydy kodujące całość lub część domeny przezbłonowej oraz koniec C, obejmujące aminokwasy od 861 do 907, zostały wycięte, a także warianty delecyjne, w których nukleotydy kodujące całość lub część domeny przezbłonowej obejmującej aminokwasy od 861 do 881, zostały wycięte. Sekwencje DNA według wynalazku kodujące homogeniczne białka gp350 mogą również obejmować DNA zdolny do hybrydyzacji w odpowiednio ostrych warunkach, albo takie, które mogłyby być zdolne do hybrydyzacji w takich warunkach, gdyby nie degeneracja kodu genetycznego, z wydzieloną sekwencją DNA z fig. 1. W związku z tym sekwencje DNA według wynalazku mogą zawierać modyfikacje w sekwencjach nie kodujących, sekwencjach sygnałowych lub sekwencjach kodujących, oparte na wariantach allelowych, wariantach gatunkowych lub przemyślanej modyfikacji.
Takie ujawnione sekwencje nie ulegającego złączeniu wariantu DNA gp350/220 można skonstruować znanymi sposobami. W przypadku takich zmodyfikowanych sekwencji DNA według wynalazku osiągnąć można rekombinacyjną ekspresję, także z wykorzystaniem znanych sposobów, uzyskując homogeniczne białka gp35O według wynalazku. Taicie zrekombinowane białka można oczyszczać i wprowadzać do kompozycji farmaceutycznych w celu profilaktycznego leczenia lub zapobiegania chorobom związanym z EBV.
Doprowadzić można do rekombinacyjnej ekspresji nie ulegających składaniu wariantów DNA gp3 50/220 w różnego typu komórkach, z wykorzystaniem odpowiednich znanych układów regulujących ekspresję. Do odpowiednich, znanych i dostępnych komórek należą, ale nie wyłącznie, komórki drożdżowe takie jak Saccharomyces cerevisiae, komórki bakteryjne takie jak E coli i Bacillus subtilis oraz komórki ssaków takie jak komórki GH3, CHO, NSO, MDCK i C-127. Wektory stosowane w przypadku różnych typów komórek dobiera się w oparciu o ich kompatybilność z typem komórki i stosowanym układem regulacji ekspresji. Korzystne są komórki i wektory umożliwiające ekspresję wydzielonych produktów genu gp350/220. W typowym przykładzie E. coli transformuje się z wykorzystaniem pochodnych pBR322 zmodyfikowanych znanymi sposobami tak, aby zawierały sekwencje DNA do ekspresji pożądanego białka, w danym przypadku nie ulegającego składaniu wariantu sekwencji gp350 EBV, zawierające lub nie zawierające sekwencje kodujące koniec C i/lub obszar przechodzący przez błonę. pBR322 zawiera geny oporności na ampicylinę i tetracyklinę, które można wykorzystać jako markery. Patrz Bolivar, Gene 2: 95 (1997). Do powszechnie wykorzystywanych sekwencji regulujących ekspresję, np. promotorów inicjowania transkrypcji oraz ewentualnie operatora i enhancera, należą układy β-laktamazy i promotora lac (patrz Chang, Naturę 198: 1056 (1977)), układ promotora tryptofanu (patrz Goeddel, Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980)) oraz promotor PL, pochodzący z λ i miejsca wiązania rybosomu genu N (patrz Shimatake, Naturę 292: 128 (1981)). Można jednak zastosować dowolny dostępny układ promotora lub układ regulacji ekspresją, kompatybilny z prokariotyczną komórką gospodarza. Inne przykładowe komórki gospodarze, plazmid i nośniki ekspresji ujawniono w patentach USA nr 4 356 270, Itakura (1982) oraz 4 431 739, Riggs (1984) i 4 440 859, Rutter (1984).
181 881
Komórki owadów można także zastosować jako komórki gospodarze, wykorzystując ekspresję w komórkach owadów. W przypadku ekspresji w komórkach owadów do składników układu ekspresji należy zazwyczaj wektor transferowy, zwykle plazmid bakteryjny, który zawiera zarówno genom bakulowirusa oraz dogodne miejsce restrykcyjne do insercji jednego lub więcej genów heterogenicznych, które mają ulec ekspresji; dzikiego typu bakulowirus z sekwencją homologiczną ze specyficznym względem bakulowirusa fragmentem w wektorze transferowym (co umożliwia homologiczną rekombinację heterogenicznego genu w genomie bakulowirusa) oraz odpowiednie komórki gospodarze i pożywki.
Obecnie do najczęściej stosowanych wektorów transferowych do wprowadzania obcych genów do AcNPV należy pAc373. Można także skonstruować wiele innych powszechnie znanych wektorów. Należy do nich pVL985 (który zmienia polihedrynowy kodon startowy z ATG na ATT i który wprowadza miejsce klonowania BamHI, 32 pary zasad w dół od ATT; patrz Lucków i Summers, Virology (1989) 17: 31).
Plazmid zazwyczaj zawiera również polihedrynowy sygnał poliadenylowania (Miller i inni (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42: 177) oraz prokariotyczny gen odporności na ampicylinę (amp) i źródło replikacji do selekcji i rozwoju w E. coli.
Bakulowirusowe wektory transferowe zazwyczaj zawierają promotor bakulowirusowy. Promotor bakulowirusowy stanowi dowolna sekwencja DNA zdolna do wiązania polimerazy bakulowirusowego RNA oraz inicjowania transkrypcji w dół (5' do 3') sekwencji kodującej (np. genu strukturalnego) do mRNA. Promotor będzie zawierać obszar inicjowania transkrypcji, który zazwyczaj znajduje się w sąsiedztwie końca 5' sekwencji kodującej. Taki obszar inicjowania transkrypcji zazwyczaj obejmuje miejsce wiązania polimerazy RNA oraz miejsce inicjowania transkrypcji. Bakulowirusowy wektor transferowy może również zawierać drugą domenę określaną jako enhancer, który, jeśli występuje, to znajduje się w oddaleniu od genu strukturalnego. Ekspresja może być regulowana lub konstytutywna. Technologię ekspresji w komórkach owadów opisano w publikacji patentowej EP 155 476.
Drożdże, np. Saccharomyces cerevisiae, można także stosować jako komórki gospodarze. Różne szczepy są dostępne i mogą być wykorzystywane. Znane są także wektory plazmidowe przydatne do ekspresji w drożdżach, a także promotory i układy regulujące ekspresję. Patrz np. Myanohara, Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 1 (1983) (promotor PHO5), publikacja patentowa EP 012 873 (sekwencje lidera), Kurz, Mol. Celi Biol. 6: 142 (1986), Ito, J. Bacteriol. 153: 163 (1983) oraz Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 1929 (1979) (procedury transformowania i odpowiednie wektory).
Komórki eukariotyczne z wielokomórkowych organizmów można oczywiście także stosować jako komórki gospodarze do ekspresji genów kodujących interesujące białka i polipeptydy. Do przydatnych linii komórkowych należą komórki VERO i HeLa oraz komórki jajowe chomika chińskiego (CHO). Wektory ekspresji kompatybilne z takimi komórkami są również dostępne, przy czym zazwyczaj należą do nich promotory i sekwencje regulujące ekspresję, takie jak np. wczesne i późne promotory z SV40 (patrz Fiers, Naturę 273: 113 (1978), a także promotory z wirusa poliomy, adenowirusa 2, bydlęcego wirusa brodawek i wirusa mięsaka ptasiego. Przykłady komórek gospodarzy, promotorów, markerów selekcji i technik ujawniono w patentach USA nr 5 122 469, Mather (1992), 4 399 216, Axel (1983), 4 634 665, Axel (1987), 4 713 339, Levinson (1987), 4 656 134, Ringold (1987), 4 822 736, Kellems (1989) i 4 874 702, Fiers (1989).
Transformację odpowiednich komórek gospodarzy przeprowadza się znanymi technikami odpowiednimi dla takich komórek, np. stosując obróbkę CaCfi w przypadku prokariotów, jak to ujawnił Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110 (1972) oraz wtrącanie CaPO4 w przypadku komórek ssaków, w sposób ujawniony przez Grahama, Virology 52: 546 (1978). Transformację drożdży można przeprowadzić w sposób opisany przez Hsiao, Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 3829 (1979) lub przez Klebego, Gene 25: 333 (1983).
Konstrukcję odpowiednich wektorów zawierających nie ulegający złączeniu wariant sekwencji gp350 (ewentualnie z dodatkowymi modyfikacjami ujawnionymi w opisie, powodującymi delecję końca C i/lub obszaru przechodzącego przez błonę) wykonuje się z wykorzystaniem zwykłych technik ligowania i restrykcji, obecnie dobrze znanych. Specyficzne
181 881 miejscowo rozszczepienie DNA przeprowadza się przez obróbkę jednym lub więcej odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi w odpowiednich warunkach, przy czym szczegóły obróbki są zazwyczaj podawane przez producenta enzymu restrykcyjnego. Ekektroforezę na żelu poliakryloamidowym lub na żelu agarozowym można przeprowadzić w celu rozdzielenia pod względem wielkości rozszczepionych fragmentów z wykorzystaniem standardowych technik, po czym wprowadza się tępe zakończenia fragmentów przez obróbkę fragmentem Klenowa polimerazy I z £ coli w obecności 4 trifosforanów dezoksynukleotydu. Obróbka nukleaząSl powoduje hydrolizę wszystkich jednoniciowych części. Syntetyczne oligonukleotydy można wytworzyć stosując np. znaną metodę z dietylofbsfoamidynem, patrz patent USA nr 4 415 732 (1983). Ligowanie można przeprowadzać stosując ligazę DNA T4 w standardowych warunkach i temperaturach, potwierdzając prawidłowe ligowanie przez transformowanie komórek E coli lub COS mieszaniną ligacyjną. Właściwe transformanty wybiera się na podstawie odporności na ampicylinę, tetracyklinę lub inny antybiotyk, albo z wykorzystaniem innych znanych markerów.
Takie techniki rekombinacji DNA są dokładnie wyjaśnione w literaturze. Patrz np. Sambrook, Molecular Cloning: a Laboratory Manuał, 2 Ed. (1989); DNA Cloning, Vol. I i Π (DN Glover, red., 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait, red., 1984); Nucleic Acid Hybridization (BD Hames, red., 1984); Transcription and Translation (BD Hames, red. 1984); Animal Celi Culture (RI Freshney, red., 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (JH Miller, red., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 2 wyd. (1987, Springer-Verlag NY) oraz Handbook of Experimental Immunology, Vol. I-IV (DM Weired, 1986). Wszystkie te wspomniane wyżej publikacje wprowadza się jako źródła literaturowe ujawnionej informacji.
Przedmiotem wynalazku są również wektory zawierające nie ulegające złączeniu warianty sekwencji DNA gp350/220 oraz komórki gospodarze, a także sposób wytwarzania nie ulegającego złączeniu wariantu białka gp350/220 na drodze hodowli takich komórek gospodarzy zawierających wektor przenoszący nie ulegający złączeniu wariant sekwencji DNA gp350/220 operacyjnie połączonej z sekwencją regulującą ekspresję w warunkach hodowli, co umożliwia ekspresję homogenicznego białka gp350.
Uzyskane w wyniku ekspresji homogeniczne gp350 oczyszcza się od składników komórki i ośrodka hodowli z wykorzystaniem zwykłych technik oczyszczania glikoprotein, takich jak np., ale nie wyłącznie, ultrafiltracja, elektroforeza ze swobodnym przepływem, chromatografia żelowa, chromatografia powinowactwa, SDS-PAGE, różnicowe wytrącanie NH4SO4, kolumny lektynowe, kolumny jonowymienne oraz kolumny hydrofobowości. Preparaty analityczne gp350 w małej skali najdogodniej oczyszcza się z wykorzystaniem SDSPAGE lub lektynowych kolumn powinowactwa, przy czym takie preparaty w małej skali do stosowania w zaszczepianiu lub w badaniu reakcji odpornościowej najdogodniej oczyszcza się z wykorzystaniem chromatografii cieczowej. Przy produkcji w dużej skali handlowo znaczących ilości gp350 do stosowania w kompozycjach szczepionek korzystnie stosuje się kombinację ultrafiltracji porach chromatografii żelowej, jonowymiennej i z oddziaływaniami hydrofobowymi.
Oczyszczone homogeniczne białka g5350 według wynalazku można stosować w kompozycjach terapeutycznych i/lub immunogenicznych do zapobiegania lub leczenia stanów i chorób związanych z EBV, takich jak mononukleoza zakaźna, chłoniak Burkitta i kosmata leukoplakia jamy ustnej. Takie kompozycje farmaceutyczne zawierają skutecznie wywołującą immunogeniczność ilość jednego lub więcej homogenicznych białek gp35O według wynalazku w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, np. z układem środek pomocniczy/preparat antygenowy, takim jak ałun. Stosować można również inne układy środek pomocniczy/preparat antygenowy, np. MF59 (Chiron Corp.), QS-21 (Cambridge Biotech Corp.), 3-DMPL (3-deacylomonofosforylowany lipid A) (RibilmmunoChem Research, Inc.), niepełny środek pomocniczy Freunda do zastosowań klinicznych (TFA) fusogeniczne liposomy, rozpuszczalne w wodzie polimery lub Iscomy (kompleksy stymulujące odporność). Do innych przykładowych farmaceutycznie dopuszczalnych nośników lub roztworów należy wo
181 881 dorotlenek glinu, roztwór soli lub roztwór soli buforowany fosforanem. Kompozycję można podawać doukładowo, korzystnie podskórnie lub domięśniowo, w postaci dopuszczalnego roztworu podskórnego lub domięśniowego. Można także przeprowadzać szczepienie przez skaryfikację lub zaszczepienie jamy ciała. Wytwarzanie takich roztworów wykazujących z uwagi na pH izotoniczność, a także stabilność, jest znane. Sposób dawkowania będzie ustalany przez nadzorującego lekarza przy uwzględnieniu różnych czynników, które mogą modyfikować działanie leków, takich jak np. stan fizyczny, waga ciała, płeć, odżywianie, ostrość stanu, czas podawania i inne czynniki kliniczne. Przykładowa dawka wynosi od około 1 do około 1000 pg białka.
Realizując sposób leczenia według wynalazku skutecznie wywołującą immunogeniczność ilość homogenicznego białka gp350 podaje się pacjentowi wymagającemu interwencji terapeutycznej lub profilaktycznej. Uważa się, że skutecznie wywołująca immunogeniczność ilość kompozycji według wynalazku wynosi od około 1 pg do około 1 mg/podawaną dawkę. Liczba podawanych dawek może wahać się w zależności od wyżej wspomnianych czynników. Wynalazek dokładniej opisują poniższe przykłady, które ilustrują wynalazek nie ograniczając jego istoty.
Przykład 1. Delecja obszaru przezbłonowego i obszaru przezbłonowego aż do końca C w gp350/220 w celu wytworzenia pDTM i pSTOP.
Gen gp350/220 ze szczepu EBV B95-8 (Miller i inni, 1972) dostępny jest w bibliotece BamHI jako otwarta ramka odczytu określana jako BLLF1 (Baer, Naturę, 310: 207 (1984)). W celu wytworzenia pożądanych konstruktów (pokazanych schematycznie na fig. 2B) gen gp350/220 sklonowano w dwóch częściach: 1) BLSH1, fragment Hindlll/Bfal o 2,3 kb oraz 2) BLSH2, fragment Banl/Hindlll o 337 bp (fig. 2A). Fragmenty te sklonowano w pośrednich wektorach, tak aby można było przeprowadzić delecje domen C-końcowych cytoplazmatycznych i/lub kodujących obszar przezbłonowy. Z uwagi na to, że miejsce Bfal występuje na końcu 5' obszaru kodującego domenę przezbłonową (TM) gp350, zastosowano je do konstruowania delecji domeny TM oraz delecji domeny TM wraz z delecjami sąsiedniego końca C. Wykorzystując Bfal można uzyskać delecje zachowujące jedynie 2 aminokwasy w obszarze TM (tabela 2).
1. Konstrukcja pDTM z pSTGl i pSTG3.
Plazmid pDTM zawiera sekwencję kwasów nukleinowych gp350/220 nie zawierającą pełnego obszaru kodującego TM. Konstrukt ten wytworzono stosując dwa wektory przejściowe pSTGl i pSTG3. Następnie wykonano produkt PCR o 450 bp. SCYT, który wprowadza miejsce Bfal na końcu 3' obszaru TM, stosując sekwencję docelową klonu BLLF1 (fig. 2). Zastosowano następujące startery PCR:
Bfal
Starter 1 GG ATC CTA GAC TGC GCC TTT AGG CGT
BLLF1: . . . GAC TGC GCC TTT AGG CGT
Aminokwasy: Asp Cys Ala Phe Arg Arg
t Koniec obszaru TM
Starter 2: GGA TCC TCT GTT CCT TCT GCT CCA GTG
BLLF1: ...... TCT GTT CCT TCT GCT CAA GTG
A
A. .
Miejsce Bgfal w starterze 1 zastosowano do klonowania fragmentu Bfal/Xmall SCYT do pSTGl. Starter 2 odpowiada obszarowi poza otwartą ramką odczytu gp350/220 po stronie 3' genu. Fragment PCR SCYT rozcięto Bfal i Xmall uzyskując fragment o 136 parach zasad, który sklonowano w wektorze pMTl 1 (Spaete i Mocarski, 1985) wraz z drugim fragmentem, fragmentem Hindlll/Bfal z BLSH1, uzyskując pSTGl. Sekwencjonowanie przez miejsce Bfal wskazało, ze całość obszaru TM kodującego aminokwasy została wycięta z wyjątkiem aminokwasów Met i Leu (patrz tabela 2). Trzeci fragment BLSH1, BLSH2, sklonowano wpMTll uzyskując pSTG3. Linker oligonukleotydowy Banl/Xbal o 16 parach zasad, poza sekwencją kodującą gen gp350/220, zastosowano do klonowania fragmentu Banl/Hindlll
181 881
BLSH2 w pSTG3. Fragment 2, 4 HindIII/XmaI z pSTGl sklonowano do wektora pEE14 (Celltech, Anglia) wraz z fragmentem XbaI/HindIII z pSTG3 uzupełniając konstrukt pDTM.
2. Konstrukcja pSTOP z wykorzystaniem pSTG2 i pSTG3.
Plazmid pSTOP zawiera gen gp350/220 pozbawiony obszaru TM i C-końcowego obszaru cytoplazmatycznego sąsiadującego z obszarem TM. W celu wytworzenia tego konstruktu wykonano linker oligonukleotydowy Bfal/EcoRI o 16 parach zasad, z kodonami stopu (podkreślonymi) w 3 ramkach po lepkim końcu Bfal, jak to opisano poniżej.
TAT AGA CTA GTC TAG G
A TCT GAT CAG ATC CTT AA
Zwisająca część 5' (TA) górnej sekwencji stanowi lepki koniec dla miejsca restrykcyjnego Bfal, a zwisająca część 3' (TTAA) dolnej sekwencji stanowi lepki koniec EcoRI. Ten linker o 16 parach zasad zastosowano do klonowania fragmentu Hindlll/Bfal do pMTll w celu wytworzenia pSTG2. Fragment Hindlll/EcoRI pST2 o 2,3 kb oraz fragment XbaI/HindII pSTG3 o 0,3 kb sklonowano w pEE14 uzyskując pSTOP.
3. Porównanie dzikiego typu sekwencji pDMT i pSTOP w obszarze TM.
Sekwencja oligonukleotydowa i translatowana sekwencja aminokwasów dzikiego typu, pSTOP oraz końce 3' pDTM sekwencji DNA gp350 i aminokwasów przedstawiono poniżej w tabeli 2. Strzałki oznaczają początek i koniec domeny przezbłonowej *TM) dzikiego typu. Tylko 2 aminokwasy z domeny przezbłonowej zachowane są w pDTM i pSTOP, Metsći i Leu862 (patrz także fig. 1). Należy zauważyć, ze kodon stopu następuje bezpośrednio za Leugćz w pSTOP. W pDTM poprzednia lokalizacja wyciętego obszaru przezbłonowego zaznaczona jest jako „ATM”. (W tabeli zaznaczono rodzime aminokwasy).
Tabela 2
Koniec 3' sekwencji gp350 typu dzikiego . . . AAC CTC TCC ATG CTA GTA CTG . . . GTC ATG GCG GAC TGC GCC . . . Asn Leu Ser Met Leugg2 Val Leu · · · Val Met Ala AsP862 CYS Ala t T
Start TM Koniec TM
Koniec 31 pSTOP . . . AAC CTC TCC ATG CTA TAG ACT AGT TCT AGG ...
. . . Asn Leu Ser Met Leugg2 STOP Val
Koniec 3' pDTM . . . AAC CTC TCC ATG CTA GAC TGC GCC . . .
. . . Asn Leu Ser Met Leu8g2 Aspgg2 Cys Ala ...
ΔΤΜ
Przykład 2. Usuwanie miejsc złączenia donora i akceptora genu gp350/220 w celu wytworzenia pMDTM i pMSTOP.
W celu uzyskania homogenicznego wytwarzania białka gp350 zmieniono wysoce konserwatywne i konserwatywne zasady z miejsca złączenia gp350/220. 4 zasady zmieniono w miejscu złączenia donora, w tym wysoce konserwatywną parę GT występującą w 100% we wszystkich miejscach złączenia. Dwie konserwatywne zasady miejsca donora, AA, zastąpiono GT. Dwie wysoce konserwatywne (bezwariantowe) zasady miejsca złączenia donora zmieniono z GT na CA. W miejscu złączenia akceptora zmieniono tylko jedną z wysoce kon
181 881 serwatywnych zasad miejsca złączenia akceptora, aby zachować sekwencję aminokwasów. Zmieniono drugą konserwatywną zasadę miejsca złączenia akceptora, jak to zaznaczono w tabeli 3. W tabeli 3 zestawiono zmiany zasad w miejscach złączenia donora i akceptora w genie gp3 50/220.
Tabela 3
Zmiany w miejscach złączenia genu gp350/220 EBV
Miejsce złączenia donora donor donor
Typ dziki GAA A>LgT mutant GAG* T*C*A* Glu Ser$Q% Glu Ser5Q%
Miejsce złączenia akceptora akceptor akceptor
Typ dziki ACA G^GT mutant ACT* GGA* Thr Glyggg Thr Glyggg
Zmiany w zasadach związane z mutagenezą opartą na oligonukleotydach zaznaczono gwiazdką w sekwencjach mutantowych. Rzeczywiste miejsce złączenia zaznaczono strzałką pokazano również kodowane aminokwasy. Należy zwrócić uwagę, ze sekwencja aminokwasów nie zmienia się w wyniku podstawienia nukleotydów.
Takie podstawienia nukleotydów w miejscu złączenia donora i miejscu złączenia akceptora w sekwencjach DNA gp350/220 typu dzikiego wykonano z wykorzystaniem mutagenezy z udziałem oligonukleotydów. W celu uzyskania mutacji zastosowano zmodyfikowany wektor fagowy M13TAC, jak to opisali M.E. Zoller i M. Smith (1983), Methods of Enzymol. 100: 468. Fragmenty BamHI/XhoI sekwencji nukleotydowej gp350/220 sklonowano wpolilinkerze plazmidu M13TAC wykorzystując miejsca restrykcyjne Asp718 i BamHI wpolilinkerze, w połączeniu z oligonukleotydowym linkerem o 19 bp, zawierającym lepkie końce Asp 718 i Xhol. W mutagenezie zastosowano plazmidy M13DTM i M13STOP z przykładu 1 (fig. 2B).
Do zastosowania w mutagenezie wykonano dwa 42-merowe oligonukleotydy, PrDonorl i PrAcceptorl. Każdy z nich skonstruowano tak, aby był komplementarny z sekwencjami genu gp350/220 ze środkami w miejscu złączenia donora lub akceptora. Jedyny obszar w oligonukleotydach, który nie był komplementarny z genem gp350/220, tworzyły zasady reprezentujące pożądane mutacje. W mutagenezie zastosowano następujące oligonukleotydy:
PrDonorl
Starter: GGT CAT GTC GGG GGC CTT Tg|a CTC TGT GCC GTT GTC CCA TGG
EBV: GGT CAT GTC GGG GGC CTT AC|T TTC TGT GCC GTT GTC CCA TGG
PrAcceptorl
Starter: CTG TGT TAT ATT TTC ACC TC|C AGT TGG GTG AGC GGA GGT TAG EBV: CTG TGT TAT ATT TTC ACC AC|C TGT TGG GTG AGC GGA GGT TAG
181 881
Sekwencję w oligonukleotydach do mutagenezy zaznaczono jako „Starter”, a sekwencję DNA obejmującą miejsca złączenia genu gp350/220 zaznaczono jako „EBV”. Zasady, które zostały zmienione w wyniku mutagenezy zaznaczono gwiazdką. Linia pionowa oznacza położenie złączenia.
Oligonukleotydy PrDonorl i PrAcceptorl zhybrydyzowano z jednoniciowymi klonami M13-DTM i M13-STOP. Holoenzym polimerazy DNA T4 zastosowano do wytworzenia dwuniciowego DNA Ml3, po czym wykonano transformowanie E coli dwunicowym DNA. Stosując wektor M13TAC można było zidentyfikować dowolny klon, który zawierał pożądaną mutację z uwagi na zmianę barwy z białej na błękitną w obecności X-gal i izotiopropylogalaktamu. Błękitne łysinki wyizolowano, a następnie hodowano; sekwencjonowanie DNA poprzez miejsca złączenia wykorzystano do ostatecznej identyfikacji mutantowych klonów, które oznaczono jako M13-MDTM i M13-MSTOP.
Po identyfikacji klonów zawierających pożądane mutacje z M13-MDTM i M13-MSTOP wycięto fragmenty BamHI/XhoI i ponownie zligowano ze szkieletami pDTM lub pSTOP uzyskując odpowiednio konstrukty pMDTM i pMSTOP. Konstrukty te zastosowano do transfekowania komórek CHO w celu osiągnięcia ekspresji nie ulegających rozszczepieniu wariantów sekwencji DNA gp350/220, w sposób opisany w przykładzie 3.
Przykład 3. Ekspresja gp350 w komórkach CHO.
1. Transfekcja konstruktów genu gp350/220.
Jeden ze sposobów wytwarzania w dużych ilościach homogenicznego białka gp350 według wynalazku w komórkach ssaków obejmuje konstrukcję komórek zawierających wielokrotne kopie heterologicznej sekwencji DNA gp350. Heterologiczna sekwencja DNA jest operacyjnie połączona z dającym się amplifikować markerem, w tym przykładzie z genem syntetazy glutaminowej, którego amplifikację w komórkach można przeprowadzić z wykorzystaniem sulfoksiminy metioninowej.
Wektory pMDTM i pMSTOP w przykładzie 2 zastosowano do transfekowania komórek CHO w sposób przedstawiony poniżej, zgodnie z procedurami Crocketta, Bio/Technology 8’ 662 (1990) i w sposób opisany w publikacji Celltech Instruction Manuał dotyczącej układu amplifikacji genu syntetazy glutaminowej (1992).
Komórki CHO-K1 (ATCC CCR61) utrzymywano na pozbawionej glutaminy pożywce EMEM (Eagles Minimal Essential Medium) uzupełnionej 10% płodowej surowicy cielęcej, 100 jednostek/rnl penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, nie podstawowymi aminokwasami MEM (Modified Eagle’s Medium) i 1 mM pirogronianem sodowym (wszystkie odczynniki z JHR Biosciences). Pożywkę uzupełniono ponadto dodając 60 mg/ml kwasu glutaminowego, 60 mg/ml asparaginy, 7 mg/ml adenozyny, 7 mg/ml guanozyny, 7 mg/ml cytydyny, 7 mg/ml urydyny i 2,4 mg/ml tymidyny (wszystkie odczynniki z Sigma). Taki preparat pożywkowy zastosowano w całej transfekcji, z podanymi odchyleniami od receptury.
Na dzień przed transfekcją 10-cm szalki zaszczepiono komórkami CHO-K1 w ilości 3 x 106. W dniu transfekcji komórki przemyto stosując 10 ml pożywki bez surowicy/szalkę. Plazmidowy DNA (z plazmidów pMDTM, pMSTOP) naniesiono przez wytrącanie CaPO4, zgodnie ze znanymi sposobami. Po 10 pg każdego z wytrąconych plazmidowych DNA inkubowano komórkami CHO-K1 z dodatkiem 2 ml pożywki nie zawierającej surowicy, w 37°C przez 4,5 godziny. Dla każdej z 4 transfekcji plazmidowym DNA wykonano po 3 repliki. Komórki poddawano następnie szokowi przez 1,5 minuty w 15% glicerynie w roztworze soli buforowanym HEPES. Po przemyciu pożywką nie zawierającą surowicy komórki ponownie wprowadzono do pożywki zawierającej surowicę i inkubowano przez 24 godziny.
Następnego dnia zmieniono pożywkę na ośrodek zawierający 10% dializowanej płodowej surowicy cielęcej (JHR Biosciences) i przeprowadzono amplifikację dodając 25 μΜ sulfoksiminę metioninową (Sigma). Komórki zasilano pożywką zawierającą sulfoksiminę metioninowąco 3-5 dni, tak długo, aż amplifikowane klony były na tyle duże, że można je było wyizolować (przez około 13-14 dni). Klony wydzielano zdrapując kolonie z szalki sterylną końcówką 200-μ1 pipety i przenoszono do jednej studzienki na płytce o 96 studzienkach w pożywce nie zawierającej sulfoksiminy metioninowej. Po upływie 1-2 dni pożywki zastępowano ośrodkiem z dodatkiem 25 mM sulfoksiminy metioninowej. Po 4 dniach supematanty z
181 881 hodowli zbierano i oznaczano w nich produkt białkowy w teście ELISA, w sposób przedstawiony poniżej.
Komórki CHO transfekowano również samym kontrolnym wektorem pEE14 (nie zawierającym sekwencji EBV), a 24 klony CHO-pEE14 również wydzielono i przeniesiono na płytki jako klony kontrolne. (Jako klony kontrolne zidentyfikowano te, które przeżyły w sulfoksiminie metioninowej).
2. Test ELISA.
Po transfekcji 241 klonów CHO-pMDTM oraz 158n klonów CHO-pMSTOP wydzielono i hodowano dalej. Supematanty z tych klonów zbadano w celu stwierdzenia wytwarzania białka gp35O. Płytki o 96 studzienkach powleczono oczyszczonym w kolumnie powinowactwa króliczym przeciwciałem przeciw-gp350/220 (przeciwciało MDP1, dar od Andrew Morgana) rozcieńczonym 1:2000 buforem w postaci 50 mM boranu sodowego, pH 9. Płytki inkubowano w 37°C przez 3-4 godziny, po czym przemyto 3 razy za pomocą PBS + 0,05% Tween 20 w aparacie Nunc ImmunoWasher. Po wyschnięciu plam płytki zablokowano prowadząc inkubację ź 2% BSA w PBS + 0,01% Thimerosalu w 37°C przez 0,5 godziny i ponownie przemyto. Supematanty z komórek transfekowanych i komórek kontrolnych dodano do studzienek i prowadzono inkubację przez 2 godziny w 37°C. Płytki inkubowano następnie z podstawowym przeciwciałem detekcyjnym, mysim monoklonalnym przeciwciałem przeciw gp350/220 (przeciwciało nr C65221M, Biodesign International) w stężeniu 1 mg/ml, rozcieńczonym buforem przemywającym PBS, w 37°C przez 1 godzinę. Po przemyciu płytki inkubowano z drugorzędowymi przeciwciałami, skoniugowanymi z peroksydazą chrzanową fragmentami koziego F(ab)2 przeciw mysim immunoglobulinom (zaadsorbowana Humań Ig; Biosource International), 0,7 pg/ml w PBS + 0,05% BSA i 0,01% Thimersolu, w 37°C przez 1 godzinę. Płytki przemyto i wywołano stosując ABTS (Pierce Chemicals) rozpuszczony w buforze Stable Peroxide Substrate Buffer (Pierce Chemicals) przez 0,5 godziny w temperaturze pokojowej. Reakcję przerwano 1% SDS i płytki sczytywano przy długościach fali 405 oraz 650 nm stosując czytnik płytek Molecular Device Vmax ELISA. W przypadku 24 klonów pMDTM i 18 klonów pMSTOP test na wydzielanie gp350 dał wynik dodatni. Klony wykazujące najwyższy sygnał w teście ELISA przeniesiono na płytki o 24 studzienkach w celu powiększenia skali i dokładniejszego zbadania metodą blottingu Westema i testu radioimmunostrąceniowego.
3. Blotting Westema i test radioimmunostrąceniowy.
Przy wstępnym selekcjonowaniu supematanty z hodowli tkankowych z transfekcji pMDTM oceniano pod względem aktywności metodą blottingu Westema. Supematanty komórek CHO oczyszczano na 5% żelach SDS-PAGE, przenoszono na noc na nitrocelulozę i sondowano przeciwciałami przeciw-gp350. W analizie metodą blottingu Westema stwierdzono dodatni odczyn 7 klonów względem gp35O.
Te klony pMDTM, które dały odczyn dodatni w blottingu Westema, zbadano w teście radioimmunostrąceniowym w celu stwierdzenia obecności gp220. Wybrane transformowane komórki pMDTM, kontrolne komórki pEE14 oraz kontrolne komórki GH3A19 (opisane poniżej) hodowano przez noc na płytkach z 6 studzienkami, tak, że w dniu eksperymentu osiągnięto stan zlania w 3/4. Każda studzienka zawierała około 5 χ 106 komórek. Przy znakowaniu ośrodki usunięto z każdej studzienki i zastąpiono je 0,7 ml wolnego od metioniny ośrodka MEM (10% płodowa surowica cielęca + 100 pCi 35S-metioniny). Komórki inkubowano 5,5 godziny w 37°C, po czym odwirowano w mikrowirówce z szybkością 4000 obrotów/minutę przez 5 minut. Immunostrącanie homogenicznego białka gp350 w supematancie przeprowadzono dodając 10 μΐ białka Sepharose-Protein (Sigma) w 50% zawiesinie oraz 20 μΐ monoklonalnego przeciw-gp350/220 (przeciwciało nr C65221M, 100 mg/ml, Biodesign International), po czym całość łagodnie wytrząsano przez noc w 4°C. Mieszaninę odwirowano z szybkością 2000 obrotów/minutę przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w mikrowirówce i przemyto 4 razy kilkoma objętościami roztworu soli buforowanego fosforanem. Po końcowym przemyciu całą ciecz usunięto znad osadu i zastąpiono 50 μΐ buforu dla próbki żelu białkowego. Próbki zawierające wytrącony immunokompleks gotowano przez 5 minut i wprowadzono na 5% SDS-PAGE. Immunoprecypitaty porównano z próbkami żelu z super
181 881 natantów hodowli tkankowych wymieszanymi w stosunku 1:1 z buforem próbki białkowej. Zel wysuszono, po czym wykonano autoradiografię z Hyperfilm β-Μπχ (Amersham).
Na figurze 3 przedstawiono wyniki autoradiograficzne analizy SDS-PAGE radioimmunostrącania. Jako dodatnią próbę kontrolną zastosowano linię komórek GH3A19 (dar od Elliota Keiffa; Whang i inni, 1987). Komórki ΟΗ3Δ19 wydzielają skróconą postać białka g5350/220 nie zawierającą domeny przezbłonowej i C-końcowej domeny cytoplazmatycznej. Do stosowania jako ujemna próba kontrolna komórki CHO transfekowano samym wektorem pEE14 przeprowadzając selekcję sulfoksiminą metioninową równolegle z transfekcją pMDTM. Na fig. 3 supematanty („S”) przedstawiono jako ścieżki o numerach nieparzystych na przemian z immunoprecypitatami („Ip”) przedstawiono jako ścieżki o numerach parzystych. Na ścieżce kontrolnej 2 w wyniku wytrącania komórek kontrolnych GH3A19 uzyskuje się dwa silne pasma białek przy około 220 i 350 kD, co wskazuje na wytwarzanie skróconych złączeniowych wariantów białek gp350 i gp220 w stosunku około 1:1. Zgodnie z oczekiwaniami takie immunostrącane pasma są zatężone w porównaniu z supematantem z radiozaznaczonej hodowli tkankowej (próbka nie poddana immunostrącaniu) na ścieżce 1. Podobnie zgodnie z oczekiwaniem nie zaobserwowano pasm w przypadku ujemnej próby kontrolnej (ścieżka 4), gdyż wektor pEE14 nie zawiera żadnego z konstruktów gp350/220.
W analizie SDS-PAGE immunostrącania z supematantów klonów pMDTM na ścieżkach 6, 8 i 10 uzyskuje się silne pojedyncze pasmo przy około 350 kD, takie samo jak dla składnika o wyższym ciężarze cząsteczkowym na ścieżce kontrolnej 2, z ΟΗ3Δ19. Jednakże w przeciwieństwie do ścieżki kontrolnej ΟΗ3Δ19 dodatkowe silne pasmo przy około 220 kD nie występuje na ścieżkach 6, 8 i 10, chociaż na ścieżce 8 widoczne jest bardzo słabe pasmo migrujące przy nieznacznie nizszym ciężarze cząsteczkowym. Mozę ono odpowiadać produktowi degradacji, współstrącanemu produktowi komórkowemu lub niewielkiej ilości białka gp220 w wyniku niepowodzenia translacji lub zajścia mutacji przywracającej wycięte miejsca złączenia donora i akceptora do rodzimych sekwencji nukleotydów lub aminokwasów. Silne pojedyncze pasma przy około 350 kD zaobserwowano w 5 innych zbadanych replikach MDTM (nie pokazanych).
Jest nieprawdopodobne, aby całkowity brak pasma przy 220 kD na ścieżkach 6 i 10 spowodowany był brakiem skutecznego strącania z supematantów MDTM, gdyż na ścieżce kontrolnej 35S-zaznaczonej ΟΗ3Δ19 (2) pasmo przy 220 kD jest wyraźnie widoczne. Również w dodatkowych testach z zastosowaniem konstruktów pDTM z przykładu 1, które zawierają miejsca złączenia dzikiego typu uzyskuje się dwa silne pasma przy 350 i 220 kD. Z tego względu wyniki te wskazują ze delecja miejsc złączenia powoduje wytwarzanie białka gp350 przy braku wytwarzania białka gp220.
Takie homogeniczne białko gp350 powstające w wyniku ekspresji w linii komórek CHO lub w innych liniach komórek ssaków lub organizmów nie będących ssakami, można uzyskiwać w większej skali, a homogeniczne białko gp350 można wydzielać i oczyszczać od ośrodka kondycjonowania z linii komórek z wykorzystaniem znanych metod obejmujących techniki takie jak chromatografia z powinowactwem lektynowym, HPLC z odwróceniem faz, FPLC, chromatografia żelowa, itp. Patrz David, J. Immunol. Methods 108: 231 (1988) oraz Madej, Vaccine 10: 777 (1992).
4. Analiza białka pMDTM metodą blottingu Northema.
W przeprowadzonym eksperymencie wykazano na podstawie blottingu Northema, ze komórki MDTM-1 wytwarzają RN A gp35O, a nie RNA gp220, co stanowi potwierdzenie na innym poziomie, ze mutacje miejsca złączenia zapobiegają wytwarzaniu gp220.
Sondy DNA komplementarne z gp350 otrzymano z pDTM, patrz przykład 1. Matrycę sondy gp350/220, ΧΡ464, wydzielono jako fragment Xhol/Pstl pDTM o 464 bp. ΧΡ464 rozpoznaje zarówno gp350 jak i gp220. W celu uzyskania sondy AN357 specyficznej względem gp350 pDTM rozcięto Ncol i Ndel, dwa zachodzące na siebie fragmenty o 580 wydzielono i uzyskaną mieszaninę rozcięto za pomocą Xmnl w celu wyeliminowania jednego zanieczyszczającego fragmentu oraz za pomocą Alul otrzymując fragment Alul/Ndel o 537 bp wewnętrzny w stosunku do miejsc złączenia gp350/220. AN537 jest specyficzny względem obszaru odłączonego od gp220 i w związku z tym jest specyficzny względem gp350. Sondy
181 881
DNA zaznaczono z wykorzystaniem 32P-dCTP nick-translacji (Amersham) wykorzystując fragmenty ΧΡ464 i AN537.
Pełny komórkowy RNA otrzymano w sposób podany przez Chomczyunskiego i Sacchi’ego, Anal. Biochem., 162: 156-59 (1987). Ośrodki z dwóch kolb T-250, z których każda zawierała komórki CHO-pEE14 (ujemna kontrolna linia komórkowa, patrz przykład 1), CHO-MDTM-1 i CHO-DTM-7, zlanie w 90%, odessano, a komórki poddano lizie i zdrapano do buforu denaturacyjnego (10 ml 4M tiocyjanianu guanidyny, 25 mM cytrynian sodowy, pH7, 0,5% sakrozylu, 100 mM 2-merkaptoetanol). Porcje po 10 ml lizatu uzupełniono 1 ml 2 M octanu sodowego, pH 4, 10 ml nasyconego fenolu, pH 4,5 i 2 ml mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy; lizat inkubowano w lodzie przez 15 minut, odwirowano przy 1000 x g przez 20 minut w 4°C i górną fazę wodną usunięto. RNA wytrącono z fazy wodnej przez dodanie 1 objętości izopropanolu w 20°C na 1 godzinę, odwirowano w 4°C, ponownie zawieszono w buforze denaturacyjnym i ponownie wytrącono. Osad RNA przemyto 1 x 70% etanolem, wysuszono w aparacie Speed-Vac i zawieszono w wodzie poddanej obróbce DEPC.
Pełny komórkowy RNA z DTM-7 i MDTM-1 denaturowano w 65°C przez 15 minut w 15% formamidzie i 6% formaldehydzie, wprowadzono na żele z 1% agarozy i 6,5% formaldehydu, po czym przeniesiono na nitrocelulozę z wykorzystaniem oddziaływań kapilarnych i dodano zaznaczony ΧΡ464 i AN537. Sondy DNA denaturowano przez 5-minutowe gotowanie, a następnie hybrydyzowano w 5 x SSPE w 65°C przez noc, po czym nitrocelulozę przemyto w ostrych warunkach. Autoradiografię wykonano w aparacie Phosphoimager z Bio-Rad.
Blotting Northema pełnego komórkowego RNA z komórek CHO-MDTM wykazuje skuteczność mutacji złączenia w zapobieganiu wytwarzania RNA specyficznego dla gp220. Sonda specyficzna dla gp350, AN537, wiąze się tylko z jednym rodzajem RNA w komórkach MDTM-1 i DTM-7 (fig. 4, ścieżki 1 i 2), zgodnie z przewidywaniem dla sondy specyficznej dla gp350. Sonda ΧΡ464, specyficzna zarówno dla RNA gp350 jak i gp220, rozpoznaje dwa składniki w DTM-7 oraz pojedyncze pasmo o wyższym ciężarze cząsteczkowym w MDTM-1 (fig. 4, ścieżki 4 i 3), zgodnie z oczekiwaniem, dla przypadku zapobiegania dzięki mutacjom złączenia wytwarzania matrycy gp220 w MDTM-1. Nawet mimo iz ścieżki MDTM-1 są przeładowane RNA specyficznym dla gp350, odrębny RNA gp220 nie jest widoczny. Przyczyna różnic we względnej ruchliwości matrycy gp350 na ścieżkach MDTM-1 i DTM-7 nie jest znana. Składniki z MDTM-1 są przeładowane w porównaniu z DTM-7, co może wpływać na migrację w żelu. Ponadto matryca gp350 przebiega w sąsiedztwie pasma dużego rybosomowego RNA na żelu, co może zniekształcić pozorny ciężar cząsteczkowy. Bez względu na przyczynę obecność pojedynczego składnika komplementarnego z sekwencjami DNA gp350 sugeruje, ze sygnał ten reprezentuje RNA gp350. W związku z tym mutacje w miejscach złączenia donora i akceptora skutecznie zapobiegają powstawaniu matrycy gp220, na co wskazuje blotting Northema. Wyniki te zostały potwierdzone przez radioimmunostrącanie z wykorzystaniem monoklonalnych przeciwciał specyficznych względem gp350/220, a także blotting Westema supematantów MDTM-1 i DTM-7.
Przykład 4. Badanie homogenicznych białek gp350 w aspekcie aktywności immunogenicznej.
Oczyszczone homogeniczne białka gp350 wprowadzono do odpowiednich nośników do podawania oraz podawano myszom w następujący sposób.
Dwukrotny koncentrat środków pomocniczych i nośnika otrzymano przez zmieszanie środka Pluronic L121 i skwalenu w 0,4% obj. Tween 80 w roztworze soli buforowanym fosforanem z (Thr1) MDP, zgodnie z procedurą, którą podali David, J. Immunol. Methods 108: 231 (1988) i Allison, J. Immunol. Methods 95: 157 (1986).
Kompozycję do podawania przygotowano przez dodanie równych objętości białka i mieszanki środków pomocniczych i nośnika w dniu podawania. Zawartość białka powinna wynosić od 5 do 50 pg/dawkę.
Myszy BALB/c immunizowano trzykrotnie wstrzykując im domięśniowo porcje po 0,1 ml w dniach 0, 21 i 42. Krew przed immunizacjąoraz kolejne próbki krwi pobierano w 10 dni po każdej iniekcji z zatoki tylno-oczodołowej.
181 881
Poziom przeciwciał w surowicy oznaczano metodą ELISA zgodnie z procedurą podaną w przykładzie 3. Przeciwciała zobojętniające działanie EBV oznaczano ilościowo na podstawie ich zdolności do inhibitowania transformacji limfocytów z płodowej krwi z serca przez EBV in vitro, zgodnie z metodami, które podali Moss, J. Gen. Virol. 17: 223 (1972) i De Schryver, Int. J. Cancer 13: 353 (1974).
W innym eksperymencie białe króliki nowozelandzkie zaszczepiano przez domięśniowe podawanie 5 dawek białka zemulgowanego w powyższym dodatku, w dniach 0, 21, 42, 63 i 84. Dawka powinna wynosić od około 5 do 50 pg/szczepionkę. Surowice pobrano w dwa tygodnie po ostatniej dawce i oznaczono w nich miano przeciwciał względem wirusowego gp350/220 z komórek B95-8 oraz aktywność w zobojętnianiu EBV in vitro, metodami podanymi przez Eminiego, Virology 166: 387 (1988).
Z uwagi na to, ze zdolność białka gp350/220 EBV do indukowania ochronnej odporności w przypadku zwierzęcego modelu infekcji EBV została potwierdzona, patrz Epstein, Clin. Exp. Immunol., oczekuje się uzyskania podobnych wyników przy podawaniu kompozycji homogenicznego białka gp350.
Ujawnienie wszystkich wymienionych publikacji wprowadza się formalnie jako źródła . literaturowe. Powyższy szczegółowy opis podano jedynie w tym celu, aby ułatwić zrozumienie wynalazku, tak ze nie można na jego podstawie wyciągać wniosków odnośnie jego ograniczenia, gdyż modyfikacje w ramach zakresu wynalazku są oczywiste dla specjalistów.
Zestawienie sekwencji (1) Informacje ogólne:
(i) Zgłaszający: Richard Spaete i Winthrop T. Jackman (ri) Tytuł wynalazku: Warianty gp350/220 me ulegające składaniu (ni) Liczba sekwencji: 19 (iv) Adres do korespondencji:
(A) Adresat: Cooley Godward Castro Huddleson & Tatum (B) Ulica: 5 Pało Alto Sguare (C) Miasto: Pało Alto (D) Stan: California (E) Państwo: USA (F) Kod: 94306 (v) Postać odczytywana komputerowo:
(A) Nośnik: Dyskietka (B) Komputer: Kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patent In Release #1.0, Version #1.25 (vi) Dane dotyczące zgłoszenia:
(A) Numer zgłoszenia: US 08/228 291 (B) Data zgłoszenia: 18 kwietnia 1994 (C) Klasyfikacja:
(viii) Informacja dotycząca pełnomocnika/rzecznika:
(A) Nazwisko: Luann Caerr (B) Numer rejestracyjny: 31 822 (C) Numer rzecznika: AVIR-003/00US
181 881 (ix) Informacja telekomunikacyjna:
(A) Telefon: 415-843-5163 (B) Faks: 415-857-0663 (C) Teleks: 380816 CooleyPA (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:1:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 27 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: nieznana (ii) Typ cząsteczki: Oligomer DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:1:
GGATCCTAGA CTGCGCCTTT AGGCGTA 27 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:2:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 19 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: nieznana (ii) Typ cząsteczki: Oligomer DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:2:
GACTGCGCCT TTAGGCGTA 19 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:3:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 6 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: Białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:3:
Asp Cys Phe Arg Arg
5
181 881 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:4:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 27 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: nieznana (ii) Typ cząsteczki: Oligomer DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:4:
GGATCCTCTG TTCCTTCTGC TCCAGTG 27 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:5:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 21 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: nieznana (ii) Typ cząsteczki: Oligomer DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:5:
TCTGTTCCTT CTGCTCCAGT G 21 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:6:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 16 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: nieznana (ii) Typ cząsteczki: Oligomer DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:6:
TATAGACTAG TCTAGG
181 881 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:7:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 18 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: nieznana (ii) Typ cząsteczki: Oligomer DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:7:
ATCTGATCAG ATCCTTAA 18 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:8:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 39 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: nieznana (ii) Typ cząsteczki: Oligomer DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:8:
AACCTCTCCA TGCTAGTACT GGTCATGGCG GACTGCGCC 39 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:9:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: Białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:9:
Asn Leu Ser Met Leu Val Leu Val Met Ala Asp Cys Ala
10 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:10:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy
181 881 (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: Oligomer DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:10:
AACCTCTCCA TGCTATAGAC TAGTTCTAGG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:11:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 5 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: Białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:II:
Asn Leu Ser Met Leu
5 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:12:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 24 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: Oligomer DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 12:
AACCTCTCCA TGCTAGACTG CGCC 24 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:13:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 8 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: Białko
181 881 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:13:
Asn Len Ser Met Leug62 Aspg82 Cys Ala
5 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:14:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 42 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: Oligomer DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:14:
GGTCATGTCG GGGGCCTTTG ACTCTGTGCC GTTGTCCCAT GG 42 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:15:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 42 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: Oligomer DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:15:
GGTCATGTCG GGGGCCTTAC TTTCTGTGCC GTTGTCCCAT GG 42 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:16:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 42 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: Oligomer DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:16:
CTGTGTTATA TTTTCACCTC CAGTTGGGTG AGCGGAGGTT AG 42
181 881 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:17:
(i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 42 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: Oligomer DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:17:
CTGTGTTATA TTTTCACCAC CTGTTGGGTG AGCGGAGGTT AG 42
181 881 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:18:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 3833 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz:CDS (B) Lokalizacja: 1014..3734 (xij Opis sekwencji: SEQ ID NO:18:
GAATTCCATA AATGAAACAC GCTGGTCAGG TGTTAAAACT TCCTCCCAGA TTTTCGTGAG60
GCTCCTGTGT ATAGCCATAT AGTCAAAGAA AATACTGTAG CGGGGATTAC AGCTCTGTAC12 0
AATGTTACCC ACGGAGCTCT GAACATACAA CCACTGGCGA TCCCCGGGGG TACATCGCGG180
CAGCTTAAAG GTGCCGGCGG AAAAGGTCAC GTGACACCTA CGGCCACCTG TGCACCCAAG240
TGTCGCCTGG AGATGTACCA ATGTGGGAGT CGTCTGGTGA TCGGTGTAGC TGTACATCCA300
GCTGCTGTAT GCCTGGTAAC CCATAGGCCA TCCGGCGGCC AGGGTTTGCA GTCTCCATTT360
GGCCTGATCT CTACGAGAAG CTGGATTTCT CCGACCATCT CTAATGGCCT GTCGAATGGC420
CATGGCATAC ATTATGTACA TCTCGGTATT TGAAATCTGG ATCCGAAAAA CTGGTCTATG480
GCTCGTGTGT CGACGCGCTG AAACCAACGG CAACAAATTA CTTACCTTGT TGTTGTGTGA540
TGGGTAAAAA CACACATCAC ACACTTAGGC CATAGGGATG CTCACCGTAG CCGCGGCTCC600
AATCGCTTGA AGAAGTGTTC TTAGATCTAG TGGAAACCTG CGGAGAATGG CTTCTCGCCC660
AGGGAGATCC GGCTGGGGTG GGAGCATGGG TCGTGCTGGA GCTGACCCAC CGGCATCATG720
ATCGACCCGC TTTCTCTTCG TACCCTTCTG GGCCGGCTCC AGGTGGGCAT CTTCTGCTTC780
CTTTTCTGAG CTGCTATCTG ATAACTCTAT GAGGACATTT TCCCAATCTC CCGCCGATAC840
CTGTTCCTGC ACAACCGAGG TAGATGGGAC TTCTTCTTCC ATGTTGTCAT CCAGGGCCGG 900
GGGACCCGGC CTGTCCTTGT CCATTTTGTT TGCAACAAAA GTGTGACTCA CCAACACCGC960
ACCCCCCTTG TACCTATTAA AGAGGATGCT GCCTAGAAAT CGGTGCCGAG ACA ATG1016
Met
GAG GCA GCC TTG CTT GTG TGT CAG TAC ACC ATC CAG AGC CTG ATC CAT10 64
Glu Ala Ala Leu Leu Val Cys Gin Tyr Thr Ile Gin Ser Leu IleCys
1015
CTC ACG GGT GAA GAT CCT GGT TTT TTC AAT GTT GAG ATT CCG GAA TTC1112
Leu Thr Gly Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Val Glu Ile Pro Glu Phe
25 30
181 881
CCA TTT TAC CCC ACA TGC AAT GTT TGC ACG GCA GAT GTC AAT GTA ACT 1160
Pro Phe Tyr Pro Thr Cys Asn Val Cys Thr Ala Asp Val Asn Val Thr
35 40 45
ATC AAT TTC GAT GTC GGG GGC AAA AAG CAT CAA CTT GAT CTT GAC TTT 1208
Ile Asn Phe Asp Val Gly Gly Lys Lys His Gin Leu Asp Leu Asp Phe
50 55 60 65
GGC CAG CTG ACA CCC CAT ACG AAG GCT GTC TAC CAA CCT CGA GGT GCA 1256
Gly Gin Leu Thr Pro His Thr Lys Ala Val Tyr Gin Pro Arg Gly Ala
70 75 80
TTT GGT GGC TCA GAA .AAT GCC ACC AAT CTC TTT CTA CTG GAG CTC CTT 1304
Phe Gly Gly Ser Glu Asn Ala Thr Asn Leu Phe Leu Leu Glu Leu Leu
85 90 95
GGT GCA GGA GAA TTG GCT CTA ACT ATG CGG TCT AAG AAG CTT CCA ATT 1352
Gly Ala Gly Glu Leu Ala Leu Thr Met Arg Ser Lys Lys Leu Pro Ile
100 105 110
AAC GTC ACC ACC GGA GAG GAG CAA CAA GTA AGC CTG GAA TCT GTA GAT 1400
Asn Val Thr Thr Gly Glu Glu Gin Gin Val Ser Leu Glu Ser Val Asp
115 120 125
GTC TAC TTT CAA GAT GTG TTT GGA ACC ATG TGG TGC CAC CAT GCA GAA 1448
Val Tyr Phe Gin Asp Val Phe Gly Thr Met Trp Cys His His Ala Glu
130 135 140 145
ATG CAA AAC CCC GTG TAC CTG ATA CCA GAA ACA GTG CCA TAC ATA AAG 1496
Met Gin Asn Pro Val Tyr Leu Ile Pro Glu Thr Val Pro Tyr Ile Lys
150 ! 55 160
TGG GAT AAC TGT AAT TCT ACC AAT ATA ACG GCA GTA GTG AGG GCA CAG 1544
Trp Asp Asn Cys Asn Ser Thr Asn Ile Thr Ala Val Val Arg Ala Gin
165 170 175
GGG CTG GAT GTC ACG CTA CCC TTA AGT TTG CCA ACG TCA GCT CAA GAC 1592
Gly Leu Asp Val Thr Leu Pro Leu Ser Leu Pro Thr Ser Ala Gin Asp
180 185 190
TOG AAT TTC AGC GTA AAA ACA GAA ATG CTC GGT AAT GAG ATA GAT ATT 1640
Ser Asn Phe Ser Val Lys Thr Glu Met Leu Gly Asn Glu Ile Asp Ile
195 200 205
GAG TGT ATT ATG GAG GAT GGC GAA ATT TCA CAA GTT CTG CCC GGA GAC 1688
Glu Cys Ile Met Glu Asp Gly Glu Ile Ser Gin Val Leu Pro Gly Asp
210 215 220 225
181 881
AAC AAA TTT AAC ATC ACC TGC AGT GGA TAC GAG AGC CAT GTT CCC AGC 1736
As η Lys Phe Asn Ile Thr Cys Ser Gly Tyr Glu Ser His Val Pro Ser
230 235 240
GGC GGA ATT CTC ACA TCA ACG AGT CCC GTG GCC ACC CCA ATA CCT GGT 1784
Gly Gly Ile Leu Thr Ser Thr Ser Pro Val Ala Thr Pro Ile Pro Gly
245 250 255
ACA GGG TAT GCA TAC AGC CTG CGT CTG ACA CCA CGT CCA GTG TCA CGA 1832
Thr Gly Tyr Ala Tyr Ser Leu Arg Leu Thr Pro Arg Pro Val Ser Arg
260 265 270
TTT CTT GGC AAT AAC AGT ATC CTG TAC GTG TTT TAC TCT GGG AAT GGA 1880
Phe Leu Gly Asn Asn Ser Ile Leu Tyr Val Phe Tyr Ser Gly Asn Gly
275 280 285
CCG AAG GCG AGC GGG GGA GAT TAC TGC ATT CAG TCC AAC ATT GTG TTC 1928
Pro Lys Ala Ser Gly Gly Asp Tyr Cys Ile Gin Ser Asn Ile Val Phe
290 295 300 305
TCT GAT GAG ATT CCA GCT TCA CAG GAC ATG CCG ACA AAC ACC ACA GAC 1976
Ser Asp Glu Ile Pro Ala Ser Gin Asp Met Pro Thr Asn Thr Thr Asp
310 315 320
ATC ACA TAT GTG GGT GAC AAT GCT ACC TAT TCA GTG CCA ATG GTC ACT 2024
Ile Thr Tyr Val Gly Asp Asn Ala Thr Tyr Ser Val Pro Met Val Thr
325 330 335
TCT GAG GAC GCA AAC TCG CCA AAT GTT ACA GTG ACT GCC TTT TGG GCC 2072
Ser Glu Asp Ala Asn Ser Pro Asn Val Thr Val Thr Ala Phe Trp Ala
340 345 350
TGG CCA AAC AAC ACT GAA ACT GAC TTT AAG TGC ΆΑΆ TGG ACT CTC ACC 2120
Trp Pro Asn Asn Thr Glu Thr Asp Phe Lys Cys Lys Trp Thr Leu Thr
355 360 365
TCG GGG ACA CCT TCG GGT TGT GAA AAT ATT TCT GGT GCA TTT GCG AGC 2168
Ser Gly Thr Pro Ser Gly Cys Glu Asn Ile Ser Gly Ala Phe Ala Ser
370 375 380 385
AAT CGG ACA TTT GAC ATT ACT GTC TCG GGT CTT GGC ACG GCC CCC AAG 2216
Asn Arg Thr Phe Asp Ile Thr Val Ser Gly Leu Gly Thr Ala Pro Lys
390 395 400
ACA CTC ATT ATC ACA CGA ACG GCT ACC AAT GCC ACC ACA ACA ACC CAC 2264
Thr Leu Ile Ile Thr Arg Thr Ala Thr Asn Ala Thr Thr Thr Thr His
405 410 415
181 881
AAG Lys
TTG Leu
AGC Ser 450 CCC Pro
ACG Thr
GGC Gly
ACT Thr
CCA Pro 530 CCA Pro
GTG Val
AGC Ser
ACC Thr
GTT ATA TTC TCC AAG GCA CCC GAG AGC ACC ACC ACC TCC CCT ACC
Val Ile 420 Phe Ser Lys Ala Pro 425 Glu Ser Thr Thr Thr 430 Ser Pro Thr
AAT ACA ACT GGA TTT GCT GAT CCC AAT ACA ACG ACA GGT CTA CCC
Asn 435 Thr Thr Gly Phe Ala 440 Asp Pro Asn Thr Thr 445 Thr Gly Leu Pro
TCT ACT CAC GTG CCT ACC AAC CTC ACC GCA CTT GGA AGC ACA GGC
Ser Thr His Val Pro 455 Thr Asn Leu Thr Ala 460 Pro Ala Ser Thr Gly 465
ACT GTA TCC ACC GCG GAT GTC ACC AGC CCA ACA CCA GCC GGC ACA
Thr Val Ser Thr 470 Ala Asp Val Thr Ser 475 Pro Thr Pro Ala Gly 480 Thr
TCA GGC GCA TCA CCG GTG ACA CCA AGT CCA TCT CCA TGG GAC AAC
Ser Gly Ala 485 Ser Pro Val Thr Pro 490 Ser Pro Ser Pro Trp 495 Asp Asn
ACA GAA AGT AAG GCC CCC GAC ATG ACC AGC TCC ACC TCA CCA GTG
Thr Glu 500 Ser Lys Ala Pro Asp 505 Met Thr Ser Ser Thr 510 Ser Pro Val
ACC CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC CCA GCA GTG ACT ACC
Thr 515 Pro Thr Pro Asn Ala 520 Thr Ser Pro Thr Pro 525 Ala Val Thr Thr
ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC CCA GCA GTG ACT ACC CCA ACC
Thr Pro Asn Ala Thr 535 Ser Pro Thr Pro Ala 540 Val Thr Thr Pro Thr 545
AAT GCC ACC AGC CCC ACC TTG GGA AAA ACA AGT CCT ACC TCA GCA
Asn Ala Thr Ser 550 Pro Thr Leu Gly Lys 555 Thr Ser Pro Thr Ser 560 Ala
ACT ACC CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC TTG GGA AAA ACA
Thr Thr Pro 565 Thr Pro Asn Ala Thr 570 Ser Pro Thr Leu Gly 575 Lys Thr
CCC ACC TCA GCA GTG ACT ACC CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC
Pro Thr 580 Ser Ala Val Thr Thr 585 Pro Thr Pro Asn Ala 590 Thr Ser Pro
TTG GGA AAA ACA AGC CCC ACC TCA GCA GTG ACT ACC CCA ACC CCA
Leu Gly Lys Thr Ser Pro Thr Ser Ala Val Thr Thr Pro Thr Pro
595
600
605
2312
2360
2408
2456
2504
2552
2600
2648
2696
2744
2792
2840
181 881
ΛΑΤ GCC ACC GGC CCT ACT GTG GGA GAA ACA AGT CCA CAG GCA AAT GCC 2888
As η Ala Thr Gly Pro Thr Val Gly Glu Thr Ser Pro Gin Ala Asn Ala
610 615 620 625
ACC AAC CAC ACC TTA GGA GGA ACA AGT CCC ACC CCA GTA GTT ACC AGC 2936
Thr Asn His Thr Leu Gly Gly Thr Ser Pro Thr Pro Val Val Thr Ser
630 635 640
CAA CCA AAA AAT GCA ACC AGT GCT GTT ACC ACA GGC CAA CAT AAC ATA 2984
Gin Pro Lys Asn Ala Thr Ser Ala Val Thr Thr Gly Gin His Asn Ile
645 650 655
ACT TCA AGT TCA ACC TCT TCC ATG TCA CTG AGA CCC AGT TCA AAC CCA 3032
Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Met Ser Leu Arg Pro Ser Ser Asn Pro
660 665 670
GAG ACA CTC AGC CCC TCC ACC AGT GAC AAT TCA ACG TCA CAT ATG CCT 3080
Glu Thr Leu Ser Pro Ser Thr Ser Asp Asn Ser Thr Ser His Met Pro
675 680 685
TTA CTA ACC TCC GCT CAC CCA ACA GGT GGT GAA AAT ATA ACA CAG GTG 3128
Leu Leu Thr Ser Ala His Pro Thr Gly Gly Glu Asn Ile Thr Gin Val
690 695 700 705
ACA CCA GCC TCT ATC AGC ACA CAT CAT GTG TCC ACC AGT TCG CCA GAA 3176
Thr Pro Ala Ser Ile Ser Thr His His Val Ser Thr Ser Ser Pro Glu
710 715 720
CCC CGC CCA GGC ACC ACC AGC CAA GCG TCA GGC CCT GGA AAC AGT TCC 3224
Pro Arg Pro Gly Thr Thr Ser Gin Ala Ser Gly Pro Gly Asn Ser Ser
725 730 735
ACA TCC ACA AAA CCG GGG GAG GTT AAT GTC ACC AAA GGC ACG CCC CCC 3272
Thr Ser Thr Lys Pro Gly Glu Val Asn Val Thr Lys Gly Thr Pro Pro
740 745 750
CAA AAT GCA ACG TCG CCC CAG GCC CCC AGT GGC CAA AAG ACG GCG GTT 3320
Gin Asn Ala Thr Ser Pro Gin Ala Pro Ser Gly Gin Lys Thr Ala Val
755 760 765
CCC ACG GTC ACC TCA ACA GGT GGA AAG GCC AAT TCT ACC ACC GGT GGA 3368
Pro Thr Val Thr Ser Thr Gly Gly Lys Ala Asn Ser Thr Thr Gly Gly
770 775 780 785
AAG CAC ACC ACA GGA CAT GGA GCC CGG ACA AGT ACA GAG CCC ACC ACA 3416
Lys His Thr Thr Gly His Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr Thr
790 795 800
181 881
GAT TAC GGC GGT GAT TCA ACT ACG CCA AGA CCG AGA TAC AAT GCG ACC 3464
Asp Tyr Gly Gly 805 Asp Ser Thr Thr Pro 810 Arg Pro Arg Tyr Asn 815 Ala Thr
ACC TAT CTA CCT CCC AGC ACT TCT AGC AAA CTG CGG CCC CGC TGG ACT 3512
Thr Tyr Leu 820 Pro Pro Ser Thr Ser 825 Ser Lys Leu Arg Pro 830 Arg Trp Thr
TTT ACG AGC CCA CCG GTT ACC ACA GCC CAA GCC ACC GTG CCA GTC CCG 3560
Phe Thr 835 Ser Pro Pro Val Thr 840 Thr Ala Gin Ala Thr 845 Val Pro Val Pro
CCA ACG TCC CAG CCC AGA TTC TCA AAC CTC TCC ATG CTA GTA CTG CAG 3608
Pro 850 Thr Ser Gin Pro Arg 855 Phe Ser Asn Leu Ser 860 Met Leu Val Leu Gin 865
TGG GCC TCT CTG GCT GTG CTG ACC CTT CTG CTG CTG CTG GTC ATG GCG 3656
Trp Ala Ser Leu Ala 870 Val Leu Thr Leu Leu 875 Leu Leu Leu Val Met 880 Ala
GAC TGC GCC TTT AGG CGT AAC TTG TCT ACA TCC CAT ACC TAC ACC ACC 3704
Asp Cys Ala Phe 885 Arg Arg Asn Leu Ser 890 Thr Ser His Thr Tyr 895 Thr Thr
CCA Pro CCA Pro TAT Tyr 900 GAT Asp GAC Asp GCC Ala GAG Glu ACC Thr 905 TAT Tyr GTA Val TAAAGTCAAT AAAAATTTAT
TAATCAGAAA TTTGCACTTT CTTTGCTTCA CGTCCCCGGG AGCGGGAGCG GGCACGTCGG 3814
GTGGCGTTGG GGTCGTTTG 3833
2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:19:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 907 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Topologia:
(ii) Typ cząsteczki:
(xi) Opis sekwencji:
Met Glu Ala Ala Leu Leu Val
5
His Leu Thr Gly Glu Asp Pro
Phe Pro Phe Tyr Pro Thr Cys liniowa
Białko
SEQ ID NO:19:
Cys Gin Tyr Thr Ile Gin Ser Leu Ile 1015
Gly Phe Phe Asn Val Glu Ile Pro Glu 2530
Asn Val Cys Thr Ala Asp Val Asn Val 4045
181 881
Thr Ile 50 Asn Phe Asp Val Gly 55 Gly Lys Lys His Gin 60 Leu Asp Leu Asp
Phe 65 Gly Gin Leu Thr Pro 70 His Thr Lys Ala Val 75 Thr Gin Pro Arg Gly 80
Ala Phe Gly Gly Ser 85 Glu Asn Ala Thr Asn 90 Leu Phe Leu Leu Glu 95 Leu
Len Gly Ala Gly 100 Glu Leu Ala Leu Thr 105 Met Arg Ser Lys Lys 110 Leu Pro
Ile Asn Val 115 Thr Thr Gly Glu Glu 120 Gin Gin Val Ser Leu 125 Glu Ser Val
Asp Val 130 Tyr Phe Gin Asp Val 135 Phe Gly Thr Met Trp 140 Cys His His Ala
Glu 145 Met Gin Asn Pro Val 150 Tyr Leu Ile Pro Glu 155 Thr Val Pro Tyr Ile 160
Lys Trp Asp Asn Cys 165 Asn Ser Thr Asn Ile 170 Thr Ala Val Val Arg 175 Ala
Gin Gly Leu Asp 180 Val Thr Leu Pro Leu 185 Ser Leu Pro Thr Ser 190 Ala Gin
Asp Ser Asn 195 Phe Ser Val Lys Thr 200 Glu Met Leu Gly Asn 205 Glu Ile Asp
Ile Glu 210 Cys Ile Met Glu Asp 215 Gly Glu Ile Ser Gin 220 Val Leu Pro Gly
Asp 225 Asn Lys Phe Asn Ile 230 Thr Cys Ser Gly Tyr 235 Glu Ser His Val Pro 240
Ser Gly Gly Ile Leu 245 Thr Ser Thr Ser Pro 250 Val Ala Thr Pro Ile 255 Pro
Gly Thr Gly Tyr 260 Ala Tyr Ser Leu Arg 265 Leu Thr Pro Arg Pro 270 Val Ser
Arg Phe Leu 275 Gly Asn Asn Ser Ile 280 Leu Tyr Val Phe Tyr 285 Ser Gly Asn
Gly Pro 290 Lys Ala Ser Gly Gly 295 Asp Tyr Cys Ile Gin 300 Ser Asn Ile Val
Phe 305 Ser Asp Glu Ile Pro 310 Ala Ser Gin Asp Met 315 Pro Thr Asn Thr Thr 320
Asp Ile Thr Tyr Val 325 Gly Asp Asn Ala Thr 330 Tyr Ser Val Pro Met 335 Val
Thr Ser Glu Asp 340 Ala Asn Ser Pro Asn 345 Val Thr Val Thr Ala 350 Phe Trp
181 881
Ala Trp Pro 355 Asn Asn Thr Glu Thr 360 Asp Phe Lys Cys Lys 365 Trp Thr Leu
Thr Ser 370 Gly Thr Pro Ser Gly 375 Cys Glu Asn Ile Ser 380 Gly Ala Phe Ala
Ser 385 Asn Arg Thr Phe Asp 390 Ile Thr Val Ser Gly 395 Leu Gly Thr Ala Pro 400
Lys Thr Leu Ile Ile 405 Thr Arg Thr Ala Thr 410 Asn Ala Thr Thr Thr 415 Thr
His Lys Val Ile 420 Phe Ser Lys Ala Pro 425 Glu Ser Thr Thr Thr 430 Ser Pro
Thr Leu Asn 435 Thr Thr Gly Phe Ala 440 Asp Pro Asn Thr Thr 445 Thr Gly Leu
Pro Ser 450 Ser Thr His Val Pro 455 Thr Asn Leu Thr Ala 460 Pro Ala Ser Thr
Gly 465 Pro Thr Val Ser Thr 470 Ala Asp Val Thr Ser 475 Pro Thr Pro Ala Gly 480
Thr Thr Ser Gly Ala 485 Ser Pro Val Thr Pro 490 Ser Pro Ser Pro Trp 495 Asp
Asn Gly Thr Glu 500 Ser Lys Ala Pro Asp 505 Met Thr Ser Ser Thr 510 Ser Pro
Val Thr Thr 515 Pro Thr Pro Asn Ala 520 Thr Ser Pro Thr Pro 525 Ala Val Thr
Thr Pro 530 Thr Pro Asn Ala Thr 535 Ser Pro Thr Pro Ala 540 Val Thr Thr Pro
Thr 545 Pro Asn Ala Thr Ser 550 Pro Thr Leu Gly Lys 555 Thr Ser Pro Thr Ser 560
Ala Val Thr Thr Pro 565 Thr Pro Asn Ala Thr 570 Ser Pro Thr Leu Gly 575 Lys
Thr Ser Pro Thr 580 Ser Ala Val Thr Thr 585 Pro Thr Pro Asn Ala 590 Thr Ser
Pro Thr Leu 595 Gly Lys Thr Ser Pro 600 Thr Ser Ala Val Thr 605 Thr Pro Thr
Pro Asn 610 Ala Thr Gly Pro Thr 615 Val Gly Glu Thr Ser 620 Pro Gin Ala Asn
Ala 625 Thr Asn His Thr Leu 630 Gly Gly Thr Ser Pro 635 Thr Pro Val Val Thr 640
Ser Gin Pro Lys Asn 645 Ala Thr Ser Ala Val 650 Thr Thr Gly Gin His 655 Asn
181 881
Ile Thr Ser Ser 660 Ser Thr Ser Ser Met 665 Ser Leu Arg Pro Ser 670 Ser Asn
Pro Glu Thr 675 Leu Ser Pro Ser Thr 680 Ser Asp Asn Ser Thr 685 Ser His Met
Pro Leu 690 Leu Thr Ser Ala His 695 Pro Thr Gly Gly Glu 700 Asn Ile Thr Gin
Val 705 Thr Pro Ala Ser Ile 710 Ser Thr His His Val 715 Ser Thr Ser Ser Pro 720
Glu Pro Arg Pro Gly 725 Thr Thr Ser Gin Ala 730 Ser Gly Pro Gly Asn 735 Ser
Ser Thr Ser Thr 740 Lys Pro Gly Glu Val 745 Asn Val Thr Lys Gly 750 Thr Pro
Pro Gin Asn 755 Ala Thr Ser Pro Gin 760 Ala Pro Ser Gly Gin 765 Lys Thr Ala
Val Pro 770 Thr Val Thr Ser Thr 775 Gly Gly Lys Ala Asn 780 Ser Thr Thr Gly
Gly 785 Lys His Thr Thr Gly 790 His Gly Ala Arg Thr 795 Ser Thr Glu Pro Thr~ 800
Thr Asp Tyr Gly Gly 805 Asp Ser Thr Thr Pro 810 Arg Pro Arg Tyr Asn 815 Ala
Thr Thr Tyr Leu 820 Pro Pro Ser Thr Ser 825 Ser Lys Leu Arg Pro 830 Arg Trp
Thr Phe Thr 835 Ser Pro Pro Val Thr 840 Thr Ala Gin Ala Thr 845 Val Pro Val
Pro Pro 850 Thr Ser Gin Pro Arg 855 Phe Ser Asn Leu Ser 860 Met Leu Val Leu
Gin 865 Trp Ala Ser Leu Ala 870 Val Leu Thr Leu Leu 875 Leu Leu Leu Val Met 880
Ala Thr Asp Pro Cys Pro Ala Tyr 900 Phe 885 Asp Arg Asp Arg Ala Asn Glu Leu Thr 905 Ser 890 Tyr Thr Val Ser His Thr Tyr 895 Thr
181 881
181 881
Fig. 1
EcoRI
GAATTCCATA AATGAAACAC GCTGGTCAGG TGTTAAAACT TCCTCCCAGA TTTTCGTGAG60
GCTCCTGTGT ATAGCCATAT AGTCAAAGAA AATACTGTAG CGGGGATTAC AGCTCTGTAC120
AATGTTACCC ACGGAGCTCT GAACATACAA CCACTGGCGA TCCCCGGGGG TACATCGCGG180
CAGCTTAAAG GTGCCGGCGG AAAAGGTCAC GTGACACCTA CGGCCACCTG TGCACCCAAG240
TGTCGCCTGG AGATGTACGA ATGTGGGAGT CGTCTGGTGA TCGGTGTAGC TGTACATCCA300
GCTGCTGTAT GCCTGGTAAC CCATAGGCCA TCCGGCGGCC AGGGTTTGCA GTCTCCATTT360
GGCCTGATCT CTACGAGAAG CTGGATTTCT CCGACGATCT CTAATGGCCT GTCGAATGGC420
CATGGCATAC ATTATGTACA TCTCGGTATT TGAAATCTGG ATCCGAAAAA CTGGTCTATG480
GCTCGTGTGT CGATGCGCTG AAACCAACGG CAACAAATTA CTTACCTTGT TGTTGTGTGA540
TGGGTAAAAA CACACATCAC ACACTTAGGC CATAGGGATG CTCACCGTAG CCGCGGCTCC600
AATCGCTTGA AGAAGTGTTC TTAGATCTAG TGGAAACCTG CGGAGAATGG CTTCTCGCCC660
AGGGAGATCC GGCTGGGGTG GGAGCATGGG TCGTGCTGGA GCTGACCCAC CGGCATCATG720
ATCGACCCGC TTTCTCTTCG TACCCTTCTG GGCCGGCTCC AGGTGGGCAT CTTCTGCTTC780
CTTTTCTGAG CTGCTATCTG ATAACTCTAT GAGGACATTT TCCCAATCTC CCGCCGATAC840
CTGTTCCTGC ACAACCGAGG TAGATGGGAC TTCTTCTTCC ATGTTGTCAT CCAGGGCCGG900
GGGACCCGGC CTGTCCTTGT CCATTTTGTC TGCAACAAAA GTGTGACTCT CCAACACCGC960
ACCCCCCTTG TACCTATTAA AGAGGATGCT GCCTAGAAAT CGGTGCCGAG ACA ATG 1016 koniec 5'Met
GAG GCA GCC TTG CTT GTG TGT CAG TAC ACC ATC CAG AGC CTG ATC CAT1064
Glu Ala Ma Leu Leu Val Cys Gin Tyr Thr Ile Gin Ser Leu IleHis
1015
CTC ACG GGT GAA GAT CCT GGT TTT TTC AAT GTT GAG ATT CCG GAA TTC1112
Leu Thr Gly Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Val Glu Ile Pro GluPhe
2530
CCA TTT TAC CCC ACA TGC AAT GTT TGC ACG GCA GAT GTC AAT GTA ACT1160
Pro Phe Tyr Pro Thr Cys Asn Val Cys Thr Ala Asp Val Asn ValThr
4045
ATC AAT TTC GAT GTC GGG GGC AAA AAG CAT CAA CTT GAT CTT GAC TTT1208
Ile Asn Phe Asp Val Gly Gly Lys Lys His Gin Leu Asp Leu AspPhe
55 6065
GGC CAG CTG ACA CCC CAT ACG AAG GCT GTC TAC CAA CCT CGA GGT GCA1256
Gly Gin Leu Thr Pro His Thr Lys Ala Val Tyr Gin Pro Arg GlyAla
7580
TTT GGT GGC TCA GAA AAT GCC ACC AAT CTC TTT CTA CTG GAG CTC CTT1304
Phe Gly Gly Ser Glu Asn Ala Thr Asn Leu Phe Leu Leu Glu LeuLeu
9095
GGT GCA GGA GAA TTG GCT CTA ACT ATG CGG TCT AAG AAG CTT CCA ATT1352
Gly Ala Gly Glu Leu Ala Leu Thr Met Arg Ser Lys Lys Leu ProIle
100 105110
AAC GTC ACC ACC GGA GAG GAG CAA CAA GTA AGC CTG GAA TCT GTA GAT1400
Asn Val Thr Thr Gly Glu Glu Gin Gin Val Ser Leu Glu Ser ValAsp
115 120125
GTC TAC TTT CAA GAT GTG TTT GGA ACC ATG TGG TGC CAC CAT GCA GAA1448
Val Tyr Phe Gin Asp Val Phe Gly Thr Met Trp Cys His His AlaGlu
130 135 140145
ATG CAA AAC CCC GTG TAC CTG ATA CCA GAA ACA GTG CCA TAC ATA AAG1496
Met Gin Asn Pro Val Tyr Leu Ile Pro Glu Thr Val Pro Tyr IleLys
150 155160
TGG GAT AAC TGT AAT TCT ACC AAT ATA ACG GCA GTA GTG AGG GCA CAG1544
Trp Asp Asn Cys Asn Ser Thr Asn Ile Thr Ala Val Val Arg AlaGin
165 170175
GGG CTG GAT GTC ACG CTA CCC TTA AGT TTG CCA ACG TCA GCT CAA GAC 1592
181 881
Fig._l
Gly Leu Asp Val Thr Leu Pro Leu 185 Ser Leu Pro Thr Ser 190 Ala Gin Asp
180
TCG AAT TTC AGC GTA AAA ACA GAA ATG CTC GGT AAT GAG ATA GAT ATT 1640
Ser Asn Phe Ser Val Lys Thr Glu Met Leu Gly Asn Glu Ile Asp Ile
195 200 205
GAG TGT ATT ATG GAG GAT GGC GAA ATT TCA CAA GTT CTG CCC GGA GAC 1688
Glu Cys Ile Met Glu Asp Gly Glu Ile Ser Gin Val Leu Pro Gly Asp
210 215 220 225
AAC AAA TTT AAC ATC ACC TGC AGT GGA TAC GAG AGC CAT GTT CCC AGC 1736
Asn Lys Phe Asn Ile Thr Cys Ser Gly Tyr Glu Ser His Val Pro Ser
230 235 240
GGC GGA ATT CTC ACA TCA ACG AGT CCC GTG GCC ACC CCA ATA CCT GGT 1784
Gly Gly Ile Leu Thr Ser Thr Ser Pro Val Ala Thr Pro Ile Pro Gly
245 250 255
ACA GGG TAT GCA TAC AGC CTG CGT CTG ACA CCA CGT CCA GTG TCA CGA 1832
Thr Gly Tyr Ala Tyr Ser Leu Arg Leu Thr Pro Arg Pro Val Ser Arg
260 265 270
TTT CTT GGC AAT AAC AGT ATC CTG TAC GTG TTT TAC TCT GGG AAT GGA 1880
Phe Leu Gly Asn Asn Ser Ile Leu Tyr Val Phe Tyr Ser Gly Asn Gly
275 280 285
1 ^11157
CCG AAG GCG AGC GGG GGA GAT TAC TGC ATT CAG TCC AAC ATT GTG TTC 1928
Pro Lys Ala Ser Gly Gly Asp Tyr Cys Ile Gin Ser Asn Ile Val Phe
290 295 300 305
TCT GAT GAG ATT CCA GCT TCA CAG GAC ATG CCG ACA AAC ACC ACA GAC 1976
Ser Asp Glu Ile Pro Ala Ser Gin Asp Met Pro Thr Asn Thr Thr Asp
310 315 320
ATC ACA TAT GTG GGT GAC AAT GCT ACC TAT TCA GTG CCA ATG GTC ACT 2024
Ile Thr Tyr Val Gly Asp Asn Ala Thr Tyr Ser Val Pro Met Val Thr
325 330 335
TCT GAG GAC GCA AAC TCG CCA AAT GTT ACA GTG ACT GCC TTT TGG GCC 2072
Ser Glu Asp Ala Asn Ser Pro Asn Val Thr Val Thr Ala Phe Trp Ala
340 345 350
TGG CCA AAC AAC ACT GAA ACT GAC TTT AAG TGC AAA TGG ACT CTC ACC 2120
Trp Pro Asn Asn Thr Glu Thr Asp Phe Lys Cys Lys Trp Thr Leu Thr
355 360 365
TCG GGG ACA CCT TCG GGT TGT GAA AAT ATT TCT GGT GCA TTT GCG AGC 2168
Ser Gly Thr Pro Ser Gly Cys Glu Asn Ile Ser Gly Ala Phe Ala Ser
370 375 380 385
AAT CGG ACA TTT GAC ATT ACT GTC TCG GGT CTT GGC ACG GCC CCC AAG 2216
Asn Arg Thr Phe Asp Ile Thr Val Ser Gly Leu Gly Thr Ala Pro Lys
390 395 400
ACA CTC ATT ATC ACA CGA ACG GCT ACC AAT GCC ACC ACA ACA ACC CAC 2264
Thr Leu Ile Ile Thr Arg Thr Ala Thr Asn Ala Thr Thr Thr Thr His
405 410 415
AAG GTT ATA TTC TCC AAG GCA CCC GAG AGC ACC ACC ACC TCC CCT ACC 2312
Lys Val Ile Phe Ser Lys Ala Pro Glu Ser Thr Thr Thr Ser Pro Thr
420 425 430
TTG AAT ACA ACT GGA TTT GCT GAT CCC AAT ACA ACG ACA GGT CTA CCC 2360
Leu Asn Thr Thr Gly Phe Ala Asp Pro Asn Thr Thr Thr Gly Leu Pro
181 881
Fig_i 3
435 440445
AGC TCT ACT CAC GTG CCT ACC AAC CTC ACC GCA CCT GCA AGC ACA GGC2408
Ser Ser Thr His Val Pro Thr Asn Leu Thr Ala Pro Ala Ser ThrGly
450 455 460465
CCC ACT GTA TCC ACC GCG GAT GTC ACC AGC CCA ACA CCA GCC GGC ACA2456
Pro Thr Val Ser Thr Ala Asp Val Thr Ser Pro Thr Pro Ala GlyThr
470 475480
ACG TCA GGC GCA TCA CCG GTG ACA CCA AGT CCA TCT CCA TGG GAC AAC2504
Thr Ser Gly Ala Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Ser Pro Trp AspAsn
485 490495 ψ Donor GGC ACA GAA AGT AAG GCC CCC GAC ATG ACC AGC TCC ACC TCA CCA GTG2552
Gly Thr Glu Ser Lys Ala Pro Asp Met Thr Ser Ser Thr Ser ProVal
500 505510
ACT ACC CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC CCA GCA GTG ACT ACC2600
Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Pro Ala Val ThrThr
515 520525
CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC CCA GCA GTG ACT ACC CCA ACC2648
Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Pro Ala Val Thr Thr ProThr
530 535 540545
CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC TTG GGA AAA ACA AGT CCT ACC TCA GCA2696
Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Leu Gly Lys Thr Ser Pro Thr SerAla
550 555560
GTG ACT ACC CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC TTG GGA AAA ACA2744
Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Leu Gly LysThr
565 570575
AGC CCC ACC TCA GCA GTG ACT ACC CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC2792
Ser Pro Thr Ser Ala Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr SerPro
580 585590
ACC TTG GGA AAA ACA AGC CCC ACC TCA GCA GTG ACT ACC CCA ACC CCA2840
Thr Leu Gly Lys Thr Ser Pro Thr Ser Ala Val Thr Thr Pro ThrPro
595 600605
AAT GCC ACC GGC CCT ACT GTG GGA GAA ACA AGT CCA CAG GCA AAT GCC2888
Asn Ala Thr Gly Pro Thr Val Gly Glu Thr Ser Pro Gin Ala AsnAla
610 615 620625
ACC AAC CAC ACC TTA GGA GGA ACA AGT CCC ACC CCA GTA GTT ACC AGC2936
Thr Asn His Thr Leu Gly Gly Thr Ser Pro Thr Pro Val Val ThrSer
630 635640
CAA CCA AAA AAT GCA ACC AGT GCT GTT ACC ACA GGC CAA CAT AAC ATA2984
Gin Pro Lys Asn Ala Thr Ser Ala Val Thr Thr Gly Gin His AsnIle
645 650655
ACT TCA AGT TCA ACC TCT TCC ATG TCA CTG AGA CCC AGT TCA AAC CCA3032
Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Met Ser Leu Arg Pro Ser Ser AsnPro
660 665670
GAG ACA CTC AGC CCC TCC ACC AGT GAC AAT TCA ACG TCA CAT ATG CCT3080
Glu Thr Leu Ser Pro Ser Thr Ser Asp Asn Ser Thr Ser His MetPro
675 680685
Akceptor--TTA CTA ACC TCC GCT CAC CCA ACA GGT GGT GAA AAT ATA ACA CAG GTG3128
Leu Leu Thr Ser Ala His Pro Thr Gly Gly Glu Asn Ile Thr GinVal
690 695 700705
181 881
Fig._l
ACA CCA GCC TCT ATC AGC ACA CAT Thr Pro Ala Ser Ile Ser Thr His 710
CCC CGC CCA GGC ACC ACC AGC CAA
Pro Arg Pro Gly Thr Thr Ser Gin
725
ACA TCC ACA AAA CCG GGG GAG GTT
Thr Ser Thr Lys Pro Gly GluVal
740745
CAA AAT GCA ACG TCG CCC CAGGCC
Gin Asn Ala Thr Ser Pro GinAla
755760
CCC ACG GTC ACC TCA ACA GGTGGA
Pro Thr Val Thr Ser Thr GlyGly
770775
AAG CAC ACC ACA GGA CAT GGAGCC
Lys His Thr Thr Gly His Gly Ala
790
III57<__
GAT TAC GGC GGT GAT TCA Z?CT ACG Asp Tyr Gly Gly Asp Ser Thr Thr 805
ACC TAT CTA CCT CCC AGC ACT TCT
Thr Tyr Leu Pro Pro Ser Thr Ser
820825
TTT ACG AGC CCA CCG GTT ACCACA
Phe Thr Ser Pro Pro Val ThrThr
835840
CCA ACG TCC CAG CCC AGA TTCTCA
Pro Thr Ser Gin Pro Arg PheSer
850855
TM
TGG GCC TCT CTG GCT GTG CTGACC
Trp Ala Ser Leu Ala Val Leu Thr
870
GAC TGC GCC TTT AGG CGT AAC TTG
Asp Cys Ala Phe Arg Arg Asn Leu
885
CAT GTG TCC ACC AGT TCG CCA GAA
His Val Ser Thr Ser Ser Pro Glu
715720
GCG TCA GGC CCT GGA AAC AGTTCC
Ala Ser Gly Pro Gly Asn SerSer
730735
AAT GTC ACC AAA GGC ACG CCCCCC
Asn Val Thr Lys Gly Thr ProPro
750
CCC AGT GGC CAA AAG ACG GCGGTT
Pro Ser Gly Gin Lys Thr AlaVal
765
AAG GCC AAT TCT ACC ACC GGTGGA
Lys Ala Asn Ser Thr Thr GlyGly
780785
CGG ACA AGT ACA GAG CCC ACCACA
Arg Thr Ser Thr Glu Pro ThrThr
795800
CCA AGA CCG AGA TAC AAT GCGACC
Pro Arg Pro Arg Tyr Asn AlaThr
810815
AGC AAA CTG CGG CCC CGC TGGACT
Ser Lys Leu Arg Pro Arg TrpThr
830
GCC CAA GCC ACC GTG CCA GTCCCG
Ala Gin Ala Thr Val Pro Val Pro
845
AAC CTC TCC ATG CTA GTA CTG CAG
Asn Leu Ser |>let Leu Val Leu Gin
860 865
CTT CTG CTG CTG CTG GTC ATG GCG
Leu Leu Leu Leu Leu Val Met Ala
875880
TCT ACA TCC CAT ACC TAC ACCACC
Ser Thr Ser His Thr Tyr ThrThr
890895
3176
3224
3272
3320
3368
3416
3464
3512
3560
3608
3656
3704
CCA CCA TAT GAT GAC GCC GAG ACC Pro Pro Tyr Asp Asp Ala Glu Thr 900 905
TAT GTA TTAAAGTCAA TAAAAATTTA TTA
Tyr Val *** PoliA koniec
3757 3'
ATCAGAATTT GCGTTGGGGT GCACCCAACA TTGCGGGTAG TGAGACGCCA GGCTCAGGCG CTGAGGACCT ATGTCTTCCA GACATGCTAT TTAAATATCC ATCAGGTAGA GCAAAGCTGG
GCACTTTCTT CGTTTGATTC TAGATACTTG TTACACCGTC AACGGCCCGT GAGGCACTGG GTTGCTTCAG TGCTCATGTC TGGTTTAACG CCATCTAATC TGGCTGAGGC TCAAAGAAGG
TGCTTCACGT TCGTGGTCGT AATGCGGAGG AACAGATTTC GGCCTGCGTA AGCAGAAGGA AGCCTTATTC AACAGCCTTA AGCAGAGAAG CGTCAGCAGC TATAATGACT CGAGAATGTG
CCCCGGGAGC GTTCCCTCAC GTCAGATTTT CGAACCTTGT ATCATTACCT ACAGAGGTAG TCAGACTCCA ACAGAAGGCA AAGTACAAAC GTGTTCACAA AAGACAAGCG TCCGCATTAC
GGGAGCGGGC CAGGGCTGGG GCAATATATT CTTCAATCTT CTCGCTGTCG ACGAGGCACA GGCGAGCCAG ATCTGACTTT AGCCGAGATT ACTTGTTAAA TCAGAAGTGC ATGTGTAGGA
ACGTCGGGTG TTGGCCTTTT TTCCATTTCA CTTCATAGCC AGCTGTAAGC GGCACCCCCT GCGGGCGGCC GCGTGGAGCT GCTGCCCCTT GCAGACGTAC CCAGATGGAG GTAGAACTGG
3817
3877
3937
3997
4057
4117
4177
4237
4297
4357
4417
4477
181 881
Fig._l
TCCTGGGCTT CAGTCAGGGA AGCCGCCGCC AGCACCCCGG TCAGAAGCCA GGTGGCGGCG GGCTTTCTTA GGACCTTCCC CATTTCGCAG ATAGCGCCGC CGTCCCTGTC TGTTAGATCA ACGCCTTCCA GAATGACAAG CTGTTGCTCC TCAGATATGC CACCCCCCTG CTGCGCCCGA ATGCCCGCCC ACCCGAGGGT CATGGGCTCA CGTCTCATGT TGGCATCATC GATCCCGGCT ATCAGCGGCG CTACAACTCC ACGCTGCGTC TCAGATATGC CACCCCCCAG ATGGAGGAGG CCGGGGACGT GGGCCTGGAC GTCTCTTTGC CCGTCTCAGT GACACTCACC GTGCCCCCCC TTGGCAGGTC GGGCCTGGCC ATGCAGGGTA GTGGGGTGGA CGTCAGCCTG ACCAACTTTA GGCGCTTCTG TCAGCTTGTT TACCTTCACA ACAGTGACGC GGGGGTCCTT GGCCCCAGAT AGGAGGTGCC GAGCCTGGCC ATGGGTGATA AGGGGAGGGG GTTTGGATCC TCGGGTCAAT AAATGTTTAT TTGGTGTGGA GTCTGGTTGC TGCTCCGGCT GCCGCACCAC GGGAGGCGGT AAGGCGGAGT TGATGAAAGG GGCCGAGGCT GAGATCTCTT GCGCCCAGGC ACCGGTCTCG ATCTCCATCA GGGCCAGGCT GTCGCCAGCC TCGTCCATCT CGATGCCGCT TACAGCCAGA ACGGCCTCAA GCTT Hmdlll
5931
GCGTTTGTGG GACTGGAAGC GCCGGCCGGC AGGAAGAGCA GTGGCACAGC CTTTGCAAAC TAAAGAGAGC CGGGTCTTGG GCTCTTATAT TCACCATGGA GGCCTGTCCA CACATACGCT AGCAGGAGCT CAAAATCCAC CTGGCTGCCT TGAAGACCAC AACTGTGGAC CTAGGCCTCT TGCTGTGGGG CAGCACCTCC CGTCCGGTCA ACACGGGGGA ACTCCGGCTA ATCCTCCAGA CATCGGAGCT CAAAATCCAC CTGGCTGCCT ACAAGGGTCC CATCAACCAC CCCCAGTACC CAAAGGACCT GGCCCTCTTC CCCCATCAGA CTTCTATCCC TCACCACAGG CCGACAATCT TTCTAGTGAA GCCCTGCAGG TGGCGCCGGG GTGACCAGAC CGTGTTCCTT AACAAGTACC AGCACCACCT CACCTCCTTC TACAGCCCCC CTCTCTTTAG GTGGGCCAGC TGCACCTTCG GTGGGCTGAG CGAGGCGCTC GAGGGGAGAC GACACCTTCA TATCCCTTGT TTTACCAATA TACGTTAACG CGAGCTCCGT GGGCCCAGAG GCAAGGACGG GGGTGGGCAC CTCGGGCTCA GAGGGGGCGG TCACCGATGA GACAACGGCC TCCATCTTGA GCGCCGTGGC CACCTTCTCC TGTTTGTCCA GCAGGGCCTT GAGCCCATTC GAGATCATGG TATTCCAGAT GACTGAGCGC
4537 4597
4657
4717
4777
4837
4897
4957
5017
5077
5137 5197
5257 5317 5377 5437
5497
5557
5617
5677
5737
5797
5857
5917
181 881 gp350
NHj--------------COOH
SS POZAKOMÓRKOWY ™
BLLF1
Xhol I Bani jHindm____________._______ Bfal Xmal
BLSH2 BLSH1 ______________________________| | ^ | ł SCYT ł
Bfal Xmal
V----------------------------_---------------------------/
Fig._ 2A
181 881
Fig._ 2B
181 881
2O5kD—
116kD—
80kD—
Fig. 3
181 881
ΡΓΑΝ537 prXP464
gp350 gp220
Fig. 4
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (41)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Wydzielona sekwencja DNA zawierająca sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, kodująca białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania.
  2. 2. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp350 posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do Ala 881 zgodnie z SEQ ID No 18.
  3. 3. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w donorowym miejscu składania.
  4. 4. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w akceptorowym miejscu składania.
  5. 5. Sekwencja DNA według zastrz. 4, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową, w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 501 kodującego serynę z SEQ ID No 18 oraz w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 698 kodującego glicynę z SEQ ID No 18.
  6. 6. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję wybraną z grupy obejmującej:
    a) kodony od 19 do 862 z SEQ ID No 18;
    b) kodony od 1 do 862 z SEQ ID No 18;
    c) kodony od 19 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18; oraz
    d) kodony od 1 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18.
  7. 7. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją synonimową.
  8. 8. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją zmiany sensu.
  9. 9. Sekwencja DNA według zastrz. 8, znamienna tym, że zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną.
  10. 10. Wektor zawierający sekwencję DNA zawierającą sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, kodującą białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania.
  11. 11. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp350 posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do Ala 881 zgodnie z SEQ ID No 18.
  12. 12. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w donorowym miejscu składania.
  13. 13. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w akceptorowym miejscu składania.
  14. 14. Wektor według zastrz. 13, znamienny tym, że sekwencja kodująca białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350 zawiera sekwencję nukleotydową, w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 501 kodującego serynę z SEQ ID No 18
    181 881 oraz w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 698 kodującego glicynę zSEQIDNol8.
  15. 15. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że sekwencja kodująca białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350 koduje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję wybranąz grupy obejmującej:
    a) kodony od 19 do 862 z SEQ ID No 18;
    b) kodony od 1 do 862 z SEQ ID No 18;
    c) kodony od 19 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18; oraz
    d) kodony od 1 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18.
  16. 16. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją synonimową.
  17. 17. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją zmiany sensu.
  18. 18. Wektor według zastrz. 7, znamienny tym, że zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną.
  19. 19. Komórka gospodarza transformowana sekwencją DNA pozostającą w operacyjnym połączeniu z sekwencją zdolną do kierowania jej replikacją i ekspresją, znamienna tym, że sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragmenty, kodującą białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania.
  20. 20. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że sekwencja koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp350 posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do Ala 881 zgodnie z SEQ ID No 18.
  21. 21. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w donorowym miejscu składania.
  22. 22. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją w akceptorowym miejscu składania.
  23. 23. Komórka według zastrz. 22, znamienna tym, że sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 501 kodującego serynę z SEQ ID No 18 oraz w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 698 kodującego glicynę z SEQ ID No 18.
  24. 24. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że rzeczona sekwencja koduje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję wybraną z grupy obejmującej:
    a) kodony od 19 do 862 z SEQ ID No 18;
    b) kodony od 1 do 862 z SEQ ID No 18;
    c) kodony od 19 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18; oraz
    d) kodony od 1 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18.
  25. 25. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją synonimową.
  26. 26. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją zmiany sensu.
  27. 27. Komórka według zastrz. 26, znamienna tym, że zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną.
  28. 28. Sposób wytwarzania białka gp350, znamienny tym, że hoduje się komórkę gospodarza i wydziela się białko gp350 z tej komórki, przy czym stosuje się komórkę gospodarza transformowaną kodującą sekwencją DNA pozostającą w operacyjnym połączeniu z sekwencją zdolną do kierowania jej replikacją i ekspresją a sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragmenty, kodującą białko EBV gp350 albo skróconą wersję białka EBV gp350, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, przy czym sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania.
    181 881
  29. 29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że sekwencja koduje sekrecyjną skróconą wersję EBV gp350 posiadającą delecję przynajmniej 8 aminokwasów w regionie błonowym, korzystnie od Met 861 do Ala 881 zgodnie z SEQ ID No 18.
  30. 30. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, ze mutacja w miejscu składania jest mutacją w donorowym miejscu składania.
  31. 31. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, ze mutacja w miejscu składania jest mutacją w akceptorowym miejscu składania.
  32. 32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że sekwencja kodująca zawiera sekwencję nukleotydową, w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 501 kodującego serynę z SEQ ID No 18 oraz w której został zmieniony co najmniej jeden nukleotyd kodonu 698 kodującego glicynę z SEQ ID No 18.
  33. 33. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, ze sekwencja koduje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję wybraną z grupy obejmującej:
    a) kodony od 19 do 862 z SEQ ID No 18;
    b) kodony od 1 do 862 z SEQ ID No 18;
    c) kodony od 19 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18; oraz
    d) kodony od 1 do 862 i od 882 z SEQ ID No 18.
  34. 34. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że mutacja w miejscu składania jest mutacją synonimową.
  35. 35. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, ze mutacja w miejscu składania jest mutacją zmiany sensu.
  36. 36. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, ze zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną.
  37. 37. Homogeniczne białko gp350 będące białkiem EBV gp350 albo skróconą wersją białka EBV gp350, zawierające sekwencję aminokwasową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, natomiast kodująca to białko sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania, która korzystnie jest mutacją zmiany sensu, przy czym zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną.
  38. 38. Środek farmaceutyczny przydatny w zapobiegawczym leczeniu choroby lub stanu związanego z EBV, zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera homogeniczne białko gp350 będące białkiem EBV gp350 albo skróconą wersją białka EBV gp350, zawierające sekwencję aminokwasową przedstawioną na figurze 1 lub jej fragment, przy czym skrócona wersja posiada: delecję w regionie błonowym, delecję w części lub całości regionu błonowego i pozostawiającą C-koniec i/lub delecję części lub całości sekwencji sygnałowej, natomiast kodująca to białko sekwencja DNA posiada mutację w jednym lub więcej miejscu składania, która korzystnie jest mutacją zmiany sensu, przy czym zmiana w sekwencji aminokwasowej jest zmianą konserwatywną.
  39. 39. Środek farmaceutyczny według zastrz. 38, znamienny tym, że białko gp350 posiada delecję zarówno sekwencji membranowej jak i części cytoplazmatycznej.
  40. 40. Kompozycja immunogenna, znamienna tym, ze zawiera homogeniczne białko gp350 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym homogeniczne białko gp350 posiada delecję aminokwasów od 863 do 907 w pełnej długości białka EBV gp350.
  41. 41. Kompozycja immunogenna według zastrz. 40, znamienna tym, że zawiera homogeniczne białko gp350 posiadające sekwencję aminokwasową od 1 do 862 aminokwasu sekwencji aminokwasowej EBV gp350 przedstawionej na fig. 1.
    ♦ * ♦
    Wirus Epsteina-Barra (EBV) należący do rodziny wirusów opryszczkowych powoduje zakaźną mononuklozę u ludzi. Choroba ta dotyka ponad 90% populacji. Analitycy w dziedzi
    181 881 nie ochrony zdrowia oceniają roczne koszty choroby w Stanach Zjednoczonych na 100 milionów dolarów. Wirus rozprzestrzenia się przede wszystkim przez wymianę śliny z osobnikami wydalającymi wirusy. U dzieci zainfekowanych przez EBV objawy nie występują lub są bardzo łagodne, natomiast u zainfekowanej młodzieży i ludzi dorosłych rozwija się typowa mononukleoza zakaźna charakteryzująca się gorączką zapaleniem gardła i adenopatią Osoby zainfekowane zatrzymują przeciwciała przeciw-EBV przez resztę życia i w związku z tym są uodpornieni na dalsze infekcje. Obecnie brak jest dostępnej w handlu szczepionki przeciw EBV. . . .
    Stwierdzono, że oprócz działania infekcyjnego EBV przekształca limfocyty w szybko dzielące się komórki i z tego względu odgrywa rolę w przypadku szeregu różnych chłoniaków, takich jak chłoniak Burkitta oraz kosmata leukoplakia jamy ustnej. EBV wykryto także w próbkach tkanek z nowotworów nosowo-gardłowych. Ocenia się, ze w świecie występuje 80000 przypadków nowotworu nosowo-gardłowego, przeważająco u populacji wywodzących się z Chin.
    Opracowanie żywej, osłabionej szczepionki przeciw EBV było i jest problematyczne. Z uwagi na potencjalny charakter onkogenny związany z EBV badacze niechętnie wykorzystywali rozwiązanie z uwzględnieniem szczepionki zawierającej atenuowane drobnoustroje. Wynalazek eliminuje problem związany ze szczepionką zawierającą atenuowane drobnoustroje poprzez stworzenie sposobów i kompozycji podjednostkowej szczepionki, co nie wymaga stosowania potencjalnie onkogennych żywych wirusów. W szczepionce podjednostkowej wykorzystuje się jedno lub więcej białek antygenowych z wirusa, które będą wywoływać reakcję odpornościową i nadawać odporność.
    Do dwóch spośród ważniejszych antygenowych białek EBV należą glikoproteiny gp350/300 i gp220/200, które tworzą część koperty błony wirusowej i umożliwiają wiązanie się cząstek wirusa z docelowymi komórkami ludzkimi i wchodzenie do nich w wyniku oddziaływania z białkiem błony komórkowej CD21. Patrz Nemerow, J. Virology 61: 1416 (1987). Od dawna zostały one wybrane jako potencjalne szczepionki podjednostkowe, jednak trudności w uzyskaniu antygenowo aktywnego białka oczyszczonego od źródeł rodzimych oraz niskie wydajności ze źródeł otrzymanych na drodze rekombinacji zniechęciły badaczy i opracowujących szczepionki. W literaturze białka te określa się podając różne zakresy ciężarów cząsteczkowych (350 lub 300 kilodaltonów (kD) dla jednego białka i 200 lub 220 kD dla drugiego białka). Białko gp350 lub 300 określa się w opisie jako białko gp350, a białko gp220 lub 200 określa się jako białko gp220. Łącznie obydwa białka określa się jako białko (białka) gp3 50/220.
    Wariantowo rozszczepiony pojedynczy gen koduje białka gp350/220, tak ze powstają transkrypty mRNA gp350 i gp220; nie są znane naturalne warianty w miejscach składania genu gp350/220. Gen wytwarza dwa produkty ekspresji, białka gp35O i gp220. Otwarta ramka odczytu dla sekwencji DNA gp350/220 zawiera 2721 par zasad (bp). Pełna ramka odczytu koduje 907 aminokwasów gp350. Patrz patent USA 4 707 358, Kieff (1987). Złożona wersja ramki odczytu pokrywa 2130 zasad i translatuje się na białko gp220, sekwencję o 710 aminokwasach. Teoretyczne ciężary cząsteczkowe białka gp350 i gp220 wynoszą odpowiednio 95 kD i 70 kD. Zmierzone ciężary cząsteczkowe wytworzonego w wyniku ekspresji białka gp350 i białka gp220 zmieniają się, ale wynoszą odpowiednio około 350 i 220 kD. Wyczerpujące glikozylowanie białek jest odpowiedzialne za różnicę między przewidywanymi i rzeczywistymi ciężarami cząsteczkowymi. W każdej komórce produkowane są obydwa białka, gp350 i gp220 w stosunku molowym w zakresie od 6/1 do 1/1. Tak np. w komórce B.95-8 trwale zainfekowanej EBV okazuje się, ze stosunek ten zmienia się, ale czasami dochodzi do 6:1. Patrz Miller, Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 383 (1972).
    Również przy wytwarzaniu na drodze rekombinacji tych glikoprotein dotychczas uzyskiwano zazwyczaj mieszaninę gp350 i gp220, przy czym białka gp350/220 wytworzone zostały w wyniku ekspresji w przysadce szczura, jajnikach chomika chińskiego, komórkach VERO (nerki zielonej małpy afrykańskiej) oraz w komórkach drozdzowych. Patrz Whang, J. Virol. 61: 1796 (1982), Motz, Gene 44: 353 (1986) oraz Emini, Virology 166: 387 (1988). Układ ekspresji wirusa brodawki bydlęcej również zastosowano do wytwarzania białek
    181 881 gp350/220 w komórkach fibroblastów myszy. Patrz Madej, Vaccine 10: 777 (1992). Laboratoryjne i szczepionkowe szczepy wirusa kro wianki również wykorzystano do ekspresji białek gp350/220. Zmodyfikowane zrekombinowane wersje DNA i białka gp350/220 z EBV są znane. W szczególności wykonano zrekombinowane, skrócone konstrukty genu gp350/220 nie zawierające sekwencji przenikającej przez błonę. Takie konstrukty w dalszym ciągu wytwarzają mieszaninę gp350 i gp220, z tym, że delecja obszaru przenikającego przez błonę umożliwia wydzielenie białek. Patrz Finerty, J. Gen. Virology 74: 449 (1992) oraz Madej, Vaccine 10: 777 (1992). Otrzymano także różne wytworzone na drodze rekombinacji fragmenty restrykcyjne i białka fuzyjne zawierające różne sekwencje gp350/220, przeprowadzając ich ekspresję w E. coli. Patrz publikacja patentowa EP 0 173 254 z 25 lipca 1991.
    W związku z tym dotychczasowe badania EBV dotyczące gp350/220 skupiały się na osiągnięciu wydajnej ekspresji natywnej sekwencji gp350/220 lub zmodyfikowanej sekwencji nie zawierającej domeny przezbłonowej, w wyniku czego uzyskiwano mieszaninę dwóch przemiennie złożonych wersji rodzimego lub pozbawionego domeny przezbłonowej białka, albo na wytwarzaniu sekwencji fragmentów epitopowych w β-galaktozydazowych białkach fuzyjnych.
    Częściowo oczyszczone preparaty gp350/220 są znane. Patrz Finerty, J. Gen. Virology 73: 449 (1992) (otrzymane na drodze rekombinacji, częściowo oczyszczone). W odniesieniu do rodzimego białka gp350/220 w większości przypadków procedury oczyszczania powodowały dezaktywację antygenowości białka, co powodowało, że były one nieprzydatne w szczepionce podjednostkowej. Jednakże w literaturze naukowej doniesiono o otrzymaniu wysoce oczyszczonych preparatów antygenowo aktywnego białka gp35O z rodzimych (czyli nie zrekombinowanych źródeł). Patrz David, J. Immunol. Methods 108: 231 (1988). Ponadto zrekombinowany wirus krowianki, w którym zachodzi ekspresja białka gp350/220, zastosowano do szczepienia dhigohiszki bawełnicowej przed chłoniakiem powodowanym przez EBV. Patrz Morgan, J. Med. Virology 25: 189 (1988), Mackett, EMBO J. 4: 3229 (1985) oraz Mackett, VACCINES ’86, str. 293 (Lemer RA, Chanock RM, Brown F, red., 1986, Cold Spring Harbor Laboratory). Jednakże jak dotychczas wirusowej sekwencji DNA gp350/220 nie zmodyfikowano tak, aby możliwa była ekspresja wyłącznie jednej z przemiennie składanych wersji genu, co umożliwiłoby i zapewniło wytworzenie czystego białka gp350 lub gp220. Nie otrzymano także zrekombinowanego lub mutantowego wirusa, w którym zachodziłaby ekspresja jednego z białek, gp350 lub gp220.
    Zazwyczaj miejsca składania ułatwiają przetwarzanie cząsteczek pre-mRNA w mRNA. W przypadku wirusa poliomy miejsca składania są niezbędne do wydajnego nagromadzenia późnego mRNA. Zamiana miejsca składania 3' i 5' w transkryptach wirusa poliomy osłabia lub całkowicie blokuje nagromadzanie mRNA. Patrz Treisman, Naturę 292: 595 (1981). W przypadku wirusa SV40 dające się wycinać interweniujące sekwencje ułatwiają transport mRNA poza jądro i stabilizację mRNA w jądrze, a w związku z tym, że takie sekwencje połączeń intron/egzon ułatwiają wiązanie małych jądrowych cząsteczek RNP, uważa się, ze wstępnie złozone mRNA mogą nie ulegać prawidłowej asocjacji na przeprowadzanej drodze przemian. Wykazano, ze punktowe mutacje w miejscach złożenia egzon/intron osłabiają rozszczepienie egzon/intron i mogą zdezintegrować obróbkę pre-mRNA, transport jądrowy i stabilność. Patrz Ryu, J. Virology 63: 4386 (1989) oraz Gross, Naturę 286: 634 (1980).
    Z tego względu przed dokonaniem niniejszego wynalazku wpływ modyfikacji miejsca składania na funkcyjną ekspresję i aktywność antygenową białek kodowanych przez sekwencję gp350/220 EBV był co najmniej nieznany i nie dawał się przewidzieć.
    Dodatkowe dane literaturowe obejmują następujące pozycje. Przegląd biologii EBV i związanych z nim chorób opublikował Strauss, Annal of Inst. Med. 118: 45 (1993). Opis otwartej ramki odczytu EBV BLLFI opublikował Baer, Naturę 310: 207 (1984). Opisy DNA gp350/220 wirusa Epsteina-Barra oraz sekwencji aminokwasów znaleźć można w artykułach Beisela, J. Virology 54: 665 (1985) oraz Biggina, EMBO J. 3: 1083 (1984), a także w patencie USA nr 4 707 358, Kieff i inni (1987). Porównanie sekwencji DNA kodujących gp350/220 w wirusach Epsteina-Barra typu A i B podał Less, Virology 195: 578 (1993). Monoklonalne przeciwciała wykazujące działanie zobojętniające na glikoproteinę gp350/220
    181 881
    EBV opisał Thorley-Lawson, Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 5307 (1980). Ponadto sekwencje konsensusu miejsca złączenia dla donorowych i akceptorowych miejsc złączenia przedstawił Mount, Nucleic Acids Res. 10: 459 (1982).
    W jednym wykonaniu wynalazek ujawnia nie ulegające składaniu warianty sekwencji DNA gp350/220 EBV. Sekwencje DNA ujawnione w wynalazku mogą obejmować wydzieloną sekwencję DNA, która koduje ekspresję homogenicznego białka gp350. Sekwencja DNA kodująca białko gp350 charakteryzuje się tym, że zawiera taką samą lub zasadniczo taką samą sekwencję nukleotydów, którą przedstawiono na figurze 1, w której rodzime nukleotydy w donorowych i akceptorowych miejscach składania zastąpione są nie-rodzimymi nukleotydami, albo jej fragmenty. Taka sekwencja DNA może obejmować 5' i 3' nie kodujące sekwencje flankujące sekwencję kodującą a ponadto obejmuje sekwencję sygnałową końca aminowego. Na fig. 1 przedstawiono nie kodujące sekwencje oraz zaznaczono gwiazdką koniec przypuszczalnej sekwencji sygnałowej. Należy jednak zdawać sobie sprawę, że z sekwencji DNA ujawnionej w wynalazku mogą być wyłączone pewne lub wszystkie takie sekwencje flankujące lub sygnałowe. Sekwencje wariantu DNA nie ulegającego składaniu według wynalazku wytwarza się wprowadzając mutacje do sekwencji DNA z fig. 1 w donorowych i akceptorowych miejscach składania genu kodującego gp350/220. Eliminuje to wytwarzanie białka gp220, tak że uzyskuje się jedynie białko gp350.
    W związku z tym w innym wykonaniu ujawnionym przedmiotem są homogeniczne białka gp350 oraz sposoby wytwarzania takich białek na drodze ekspresji nie ulegającego składaniu wariantu sekwencji DNA gp350/220 EBV w odpowiednich prokariotycznych lub eukariotycznych komórkach gospodarza pod kontrolą odpowiedniej sekwencji regulującej ekspresję. W opisie w odniesieniu do białka gp350 określenie homogeniczne oznacza wolne lub zasadniczo wolne od białka gp220. Należy podkreślić, że zgodnie z dostępną wiedzą w odniesieniu do homogenicznego białka gp350, wytworzonego na drodze rekombinacji w komórkach ssaków lub owadów brak jest jakichkolwiek doniesień w literaturze naukowej.
    W jeszcze innym wykonaniu przedmiotem ujawnienia są homogeniczne białka gp35O zawierające dodatkowo delecje uzyskane w wydzielonym produkcie. Takie delecje obejmują usunięcie obszaru przezbłonowego albo usunięcie obszaru przezbłonowego i reszty końca C gp350. Takie dodatkowo zmodyfikowane sekwencje DNA i kodowane przez nie białka stanowią kolejne rozwiązanie ujawnione w wynalazku.
    Przedmiotem ujawnienia jest także zrekombinowana cząsteczka DNA obejmująca DNA wektora i sekwencję DNA kodującą homogeniczne białko gp350. Cząsteczka DNA zawiera sekwencję gp350 w operacyjnym połączeniu z odpowiednią sekwencją regulującą zdolną do kierowania replikacją i ekspresją homogenicznego gp350 w wybranych komórkach gospodarzach. Komórki gospodarze transformowane takimi cząsteczkami DNA do stosowania w ekspresji zrekombinowanego homogenicznego gp35O są także objęte zakresem ujawnienia.
    Cząsteczki DNA i transformowane komórki gospodarze ujawnione w wynalazku wykorzystuje się zgodnie z innym wykonaniem wynalazku, nowym sposobem wytwarzania zrekombinowanego homogenicznego białka gp350 lub jego fragmentów. W takim procesie linię komórek transformowanych sekwencją DNA kodującą homogeniczne białko gp350 lub jego fragment (albo zrekombinowaną cząsteczkę DNA, jak to opisano powyżej) w operacyjnym połączeniu z odpowiednią sekwencją regulującą lub kontrolującą ekspresję, zdolną do regulowania ekspresji białka, hoduje się w odpowiednich warunkach umożliwiających ekspresję zrekombinowanego DNA. Uzyskane w wyniku ekspresji białko zbiera się z komórek gospodarza lub ośrodka hodowli odpowiednimi znanymi sposobami. W procesie można wykorzystywać szereg znanych komórek jako komórki gospodarze; obecnie korzystnie stosuje się komórki ssaków i komórki owadów.
    Sekwencje DNA i białka ujawnione w wynalazku są przydatne do wytwarzania związków terapeutycznych i immunogenicznych zawierających antygenowe determinanty EBV. Związki takie znajdują zastosowanie w szczepionkach podjednostkowych stosowanych do profilaktycznego leczenia oraz w zapobieganiu chorobom związanym z EBV, takim jak mononukleoza, chłoniak Burkitta i nowotwór nosowo-gardłowy. W związku z tym kolejnym przedmiotem ujawnienia są takie farmaceutyczne kompozycje terapeutyczne i/lub immuno
    181 881 geniczne do zapobiegania i leczenia związanych z EBV stanów i chorób u ludzi, takich jak mononukleoza zakaźna, chłoniak Burkitta i nowotwór nosowo-gardłowy. Takie farmaceutyczne kompozycje terapeutyczne i/lub immunogeniczne zawierają skutecznie wywołującą immunogeniczność ilość jednego lub więcej homogenicznych białek gp350 według wynalazku w mieszaninie ze znanym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem takim jak wodorotlenek glinu, roztwór soli i roztwór soli buforowany fosforanem. Określenie „ilość wywołująca immunogeniczność” oznacza ilość wystarczającą do pobudzania wytwarzania przeciwciał EBV u ssaka. Substancja czynna może być również podawana w postaci agregatu zawierającego liposom. W celach profilaktycznych takie kompozycje farmaceutyczne można przyrządzać jako szczepionki podjednostkowe do podawania ludziom. Pacjentów można szczepić dawką wystarczającą do pobudzenia wytwarzania przeciwciał oraz ponownie szczepić po upływie 6 miesięcy lub po roku.
    Wynalazek ujawnia także sposób leczenia chorób i stanów związanych z EBV poprzez podawanie pacjentowi, zwłaszcza człowiekowi, wywołującej immunogeniczność, terapeutycznie skutecznej ilości homogenicznego białka gp350 w odpowiednim farmaceutycznym nośniku. W jeszcze innym wykonaniu wynalazku przedmiotem ujawnienia jest sposób pobudzania reakcji odpornościowej na EBV poprzez podawanie pacjentowi skutecznie wywołującej immunogeniczność ilości homogenicznego białka gp350 w odpowiednim farmaceutycznym nośniku.
PL95316941A 1994-04-18 1995-04-13 Wydzielona sekwencja DNA, wektor, transformowana komórka gospodarza, sposób wytwarzania bialka gp350, homogeniczne bialko gp350, srodek farmaceutyczny oraz kompozycja immunogenna PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL181881B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22929194A 1994-04-18 1994-04-18
PCT/US1995/004611 WO1995028488A1 (en) 1994-04-18 1995-04-13 NON-SPLICING VARIANTS OF gp350/220

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL316941A1 PL316941A1 (en) 1997-02-17
PL181881B1 true PL181881B1 (pl) 2001-09-28

Family

ID=22860582

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95316941A PL181881B1 (pl) 1994-04-18 1995-04-13 Wydzielona sekwencja DNA, wektor, transformowana komórka gospodarza, sposób wytwarzania bialka gp350, homogeniczne bialko gp350, srodek farmaceutyczny oraz kompozycja immunogenna PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Country Status (25)

Country Link
US (3) US6054130A (pl)
EP (1) EP0769056B1 (pl)
JP (4) JP3447743B2 (pl)
KR (1) KR100380953B1 (pl)
CN (2) CN100415895C (pl)
AT (1) ATE210184T1 (pl)
AU (1) AU707837B2 (pl)
BR (1) BR9507473A (pl)
CA (1) CA2187908C (pl)
CZ (1) CZ292283B6 (pl)
DE (1) DE69524415T2 (pl)
DK (1) DK0769056T3 (pl)
ES (1) ES2170144T3 (pl)
FI (2) FI118224B (pl)
HU (1) HU221647B1 (pl)
LV (1) LV11803B (pl)
MY (1) MY114769A (pl)
NO (1) NO319382B1 (pl)
PL (1) PL181881B1 (pl)
PT (1) PT769056E (pl)
RU (1) RU2178807C2 (pl)
SK (1) SK283446B6 (pl)
TW (1) TW496897B (pl)
UA (1) UA47403C2 (pl)
WO (1) WO1995028488A1 (pl)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6692749B1 (en) * 1994-04-18 2004-02-17 Medimmune Vaccines, Inc. Non-splicing variants of gp350/220
MY114769A (en) 1994-04-18 2003-01-31 Aviron Inc Non-splicing variants of gp350/220
AU2582897A (en) * 1996-03-15 1997-10-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the diagnosis, prevention, and treatment of neoplastic cell growth and proliferation
AUPO784197A0 (en) * 1997-07-10 1997-08-07 Csl Limited Treatment of nasopharyngeal carcinoma
AU735763B2 (en) * 1997-12-05 2001-07-12 Immune Response Corporation, The Novel vectors and genes exhibiting increased expression
CA2331258C (en) * 1998-06-12 2011-09-20 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Enhancement of b cell activation and immunoglobulin secretion by co-stimulation of receptors for antigen and ebv gp350/220
GB0210682D0 (en) * 2002-05-09 2002-06-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel use
US20100297612A1 (en) * 2009-05-22 2010-11-25 Intelligent Medical Devices, Inc. Optimized probes and primers and methods of using same for the detection, screening, quantitation, isolation and sequencing of cytomegalovirus and epstein-barr virus
US10461635B1 (en) * 2018-05-15 2019-10-29 Analog Devices Global Unlimited Company Low VIN high efficiency chargepump

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0051079B1 (de) * 1980-11-03 1984-09-26 Deutsche ITT Industries GmbH Binäres MOS-Ripple-Carry-Parallel-Addier/Subtrahierwerk und dafür geeignete Addier/Subtrahierstufe
US4707358A (en) * 1984-01-30 1987-11-17 The University Of Chicago Vaccine against Epstein-Barr Virus
US5171568A (en) * 1984-04-06 1992-12-15 Chiron Corporation Recombinant herpes simplex gb-gd vaccine
US5244792A (en) * 1984-04-06 1993-09-14 Chiron Corporation Expression of recombinant glyoprotein B from herpes simplex virus
DE3583564D1 (de) * 1984-08-23 1991-08-29 Hans Joachim Wolf Dna-sequenzen des ebv-genoms, rekombinante dna-molekuele, verfahren zur herstellung von ebv-verwandten antigenen sowie diagnostische zusammensetzungen und pharmazeutische zusammensetzungen, die die genannten antigene enthalten.
EP0312164A1 (en) * 1987-10-16 1989-04-19 Merck & Co. Inc. Purification of recombinant epstein-barr virus antigens from vero cells, yeast cells or L cells
CA2090295A1 (en) * 1992-02-03 1993-08-04 Anthony B. Nesburn Process for the expression of herpes simplex virus type 1 glycoprotein e and methods of use
WO1993019092A1 (fr) * 1992-03-19 1993-09-30 Centre National De La Recherche Scientifique Adenovirus recombinants defectifs exprimant des proteines caracteristiques du virus epstein-barr
US5474914A (en) * 1992-07-29 1995-12-12 Chiron Corporation Method of producing secreted CMV glycoprotein H
MY114769A (en) 1994-04-18 2003-01-31 Aviron Inc Non-splicing variants of gp350/220

Also Published As

Publication number Publication date
NO319382B1 (no) 2005-07-25
US6054130A (en) 2000-04-25
AU707837B2 (en) 1999-07-22
EP0769056A1 (en) 1997-04-23
CZ292283B6 (cs) 2003-08-13
KR100380953B1 (ko) 2003-10-10
DE69524415T2 (de) 2002-08-01
ES2170144T3 (es) 2002-08-01
CZ305496A3 (en) 1997-10-15
CN1152940A (zh) 1997-06-25
FI964186A0 (fi) 1996-10-18
JP2003230396A (ja) 2003-08-19
NO964431D0 (no) 1996-10-18
FI118224B (fi) 2007-08-31
AU2383895A (en) 1995-11-10
HU9602894D0 (en) 1996-12-30
US5824508A (en) 1998-10-20
SK283446B6 (sk) 2003-07-01
DE69524415D1 (de) 2002-01-17
JP2005333990A (ja) 2005-12-08
CN100415895C (zh) 2008-09-03
ATE210184T1 (de) 2001-12-15
CN1495262A (zh) 2004-05-12
PT769056E (pt) 2002-05-31
PL316941A1 (en) 1997-02-17
JP4317786B2 (ja) 2009-08-19
NO964431L (no) 1996-12-11
HUT75831A (en) 1997-05-28
EP0769056B1 (en) 2001-12-05
JP3447743B2 (ja) 2003-09-16
FI20075338A (fi) 2007-05-10
CA2187908C (en) 2002-09-17
CN1118573C (zh) 2003-08-20
LV11803A (lv) 1997-06-20
US6458364B1 (en) 2002-10-01
SK134396A3 (en) 1997-06-04
WO1995028488A1 (en) 1995-10-26
TW496897B (en) 2002-08-01
UA47403C2 (uk) 2002-07-15
JP2004290199A (ja) 2004-10-21
HU221647B1 (hu) 2002-12-28
DK0769056T3 (da) 2002-04-02
CA2187908A1 (en) 1995-10-26
BR9507473A (pt) 1997-09-23
EP0769056A4 (en) 1998-03-04
LV11803B (en) 1998-01-20
FI964186A (fi) 1996-12-17
RU2178807C2 (ru) 2002-01-27
MY114769A (en) 2003-01-31
JPH10501687A (ja) 1998-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5420026A (en) Self-assembling replication defective hybrid virus particles
JP2003180385A (ja) コロナウイルスに対するワクチン接種用組成物および方法
IE58030B1 (en) Vaccines based on membrane bound proteins and process for making them
JP2005333990A (ja) ｇｐ３５０／２２０非スプライシング変異体
US20130064844A1 (en) Non-splicing variants of gp350/220
EP0471457A2 (en) Herpesvirus-based viral vector which expresses a foot &amp; mouth disease virus epitope
McGonigal et al. Expression of the gene coding for the major outer capsid protein of SA-11 rotavirus in a baculovirus system
WO1998015289A9 (en) Proteins of kaposi&#39;s sarcoma associated herpesvirus
WO1995029991A1 (en) A novel vzv gene, mutant vzv and immunogenic compositions
KR100263279B1 (ko) Ｔｒｏｖａｃ 계두 바이러스 재조합체 및 그것의 사용
CA2156719A1 (en) Recombinant epstein-barr virus protein and its use in vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20130413