KR100380953B1

KR100380953B1 - gp350/220의스플리싱되지않은변형체

Info

Publication number: KR100380953B1
Application number: KR1019960705822A
Authority: KR
Inventors: 리차드 스파에트; 윈트롭 티 잭맨
Original assignee: 메드이뮨 백신즈 인코포레이티드
Priority date: 1994-04-18
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 2003-10-10
Also published as: US5824508A; JP4317786B2; ES2170144T3; PL181881B1; AU2383895A; CZ292283B6; CN1152940A; MY114769A; JP2005333990A; US6458364B1; EP0769056A1; CZ305496A3; CN1118573C; AU707837B2; NO964431L; US6054130A; CN1495262A; HU221647B1; LV11803A; FI118224B

Abstract

본 발명은 gp 350 변형체 DNA 및 아미노산 서열을 포함하는 조성물, 및 이 서열을 함유하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 또한, gp 220 단백질은 생산하지 않고 균질한 gp 350 단백질을 재조합 생산하는 방법, 이 단백질을 함유하는 약학 조성물 및 예방치료적 용도를 제공한다.

Description

gp 350/220의 스플리싱되지 않는 변형체

허피스 바이러스 군의 일원인 엡스타인-바 바이러스(EBV)는 인간에게 감염성 단핵세포증가증을 유발시킨다. 전체 인구의 90%이상이 이 질병에 감염된다. 보건 연구원들은 미국에서 이 질병으로 연간 1억 달러 이상의 비용이 드는 것으로 추정한다. 상기 바이러스는 주로 바이러스를 퍼트리는 개인의 타액 교환으로 전파된다. EBV에 감염된 어린이들은 대개 증상이 없거나 매우 약한 증상을 갖는 반면, 이 바이러스에 감염된 청소년 및 어른들은 열, 인두염 및 선증의 특징을 갖는 전형적인 감염성 단핵세포증가증을 나타낸다. 감염된 이들은 나머지 생애동안 항-EBV 항체를 보유하며 따라서 더 이상의 감염에 대해 면역을 갖는다. 현재 시판되는 EBV 백신은 없다.

EBV는 이와 같이 감염성 질병을 일으키는 외에, 림프구를 빨리 분열하는 세포로 변형시키고 따라서 버킷의 림프종(Burkitt's lymphoma) 및 구강 모양(毛樣)백반을 포함하는 여러 다른 림프종에 관련된 것으로 밝혀졌다. EBV는 또한 비인두(nasopharyngeal) 암의 조직 시료에서도 탐지된다. 세계적으로 80,000 건의 비인두 암이 발생하고 중국 인종에게는 보다 많은 것으로 추정된다.

EBV에 대한 살아있고 약화된 백신의 개발은 계속되고 있으나, 여전히 문제가 있다. EBV와 연관된 강한 종양원성 성질 때문에 연구원들은 살아있는 백신 수단을사용하기를 꺼린다. 본 발명은 암을 유발시킬 가능성이 있는 살아있는 바이러스를 이용할 필요가 없는 서브유니트(subunit) 백신에 대한 조성물 및 제조 방법을 제공함으로써, 살아있는 백신 개발과 연관된 문제를 극복한다. 서브유니트 백신은 면역 반응을 일으키고 면역성을 부여하는, 바이러스의 하나 이상의 항원성 단백질을 이용한다.

보다 중요한 항원성 EBV 단백질중 두가지는 바이러스의 막 엔벨로프(envelope)의 일부를 형성하고 바이러스 입자가 세포의 막 단백질인 CD21과 상호작용하여 인간의 목표 세포에 결합하여 들어가게 하는 당단백질(들) gp 350/300 및 gp 220/200이다. 네메로우(Nemerow)의 문헌[J. Virology, 61:1416(1987)]을 참조할 수 있다. 이들은 오랫동안 서브유니트 백신 후보자로 선택되었으나, 천연 공급원으로부터 항원 활성이 있는 단백질을 정제하여 수득하기 어렵고 재조합적으로 제조된 공급원으로부터는 수율이 낮아서 연구원 및 백신 개발자들의 노력을 방해하였다. 상기 문헌에서는 이들 단백질을 다양한 분자량 범위(단백질 중의 한 단백질은 350 또는 300kD이고 나머지 다른 단백질은 220 또는 200kD이다)를 사용하여 언급하고 있다. gp 350 또는 300 단백질은 본원에서는 gp 350 단백질로 언급되고 gp 220 또는 200 단백질은 본원에서는 gp 220 단백질로 언급된다. 두 단백질 모두를 총괄하여 본원에서 gp 350/220 단백질(들)로 언급된다.

다르게 스플리싱되는 단일 유전자가 gp 350/220 단백질을 코딩하고 결과적으로 gp 350 및 gp 220 mRNA 전사물이 생성된다; gp 350/220 유전자 스플리스 부위에서 천연적으로 발생하는 변이체는 공지되어 있지 않다. 상기 유전자는 2개의 발현산물, 즉 gp 350 단백질 및 gp 220 단백질을 생산한다. gp 350/220 DNA 서열에 대한 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 2721 염기쌍(bp)이다. 전체 리딩 프레임은 gp 350의 907개의 아미노산을 코딩한다. 키에프(Kieff)에게 허여된 미국특허 제 4,707,358 호(1987)를 참조할 수 있다. 스플리싱된 리딩 프레임은 2130개의 염기를 포함하며 710개 아미노산의 서열을 갖는 gp 220 단백질로 해독된다. gp 350 단백질 및 gp 220 단백질의 이론적인 분자량은 각각 95kD 및 70kD이다. 발현된 gp 350 단백질 및 gp 220 단백질의 측정된 분자량은 다양하지만 각각 대략 350kD 및 220kD이다. 예측된 분자량과 실제 분자량의 이러한 차이는 단백질의 광범위한 글라이코실화에 의한 것이다. 어떤 한 세포에서는 gp 350 및 gp 220 단백질 둘 모두가 약 6:1 내지 1:1 범위의 몰 비율로 생산되었다. 예를 들면 EBV에 지속적으로 감염된 B95-8 세포에서는, 비율이 다양하지만 다소간 6:1 범위에 근접한다. 밀러(Miller)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci.,69:383(1972)]을 참조할 수 있다.

유사하게, 이들 당단백질의 재조합 생산은 따라서 일반적으로 gp 350 단백질 및 gp 220 단백질의 혼합물로 생산된다. 이때까지 gp 350/220 단백질은 효모세포뿐만이 아니라, 래트(rat)의 뇌하수체, 중국 햄스터 자궁 세포, VERO(아프리카 푸른 원숭이 신장)세포에서 발현되어 왔다. 왕(Whang)의 문헌[J. Virol.,61:1796(1982)], 모즈(Motz)의 문헌[Gene,44:353(1986)] 및 에미니(Emini)의 문헌[Virology,166:387(1988)]을 참조할 수 있다. 마우스(mouse)의 섬유아 세포에서 gp 350/220 단백질을 제조하기 위해 소의 유두종 바이러스의 바이러스 발현 시스템이 또한 사용되어 왔다. 마데즈(Madej)의 문헌[Vaccine,10:777(1992)]을 참조할 수 있다. 백시니아(Vaccinia) 바이러스의 실험실 균주 및 백신 균주도 또한 gp 350/220 단백질을 제조하기 위해 사용되어 왔다. EBV gp 350/220 DNA의 변형된 재조합 DNA 및 단백질은 당분야에 공지되어 있다. 구체적으로, 막에 걸쳐지는 영역의 서열이 없는 gp 350/220 유전자의 절단된 재조합 구축물이 제조되어 왔다. 이런 구축물은 여전히 2개의 gp 350 및 gp 220의 혼합물을 생산하지만, 막에 걸쳐지는 영역을 결실시켜 단백질이 분비되게 한다. 피너티(Finerty)의 문헌[J. Gen. Virology,73:449(1992)] 및 마데즈의 문헌[Vaccine,10:777(1992)]을 참조할 수 있다. 또한 다양한 gp 350/220 서열을 포함하는, 재조합적으로 제조된 여러가지 제한 단편 및 융합 단백질들이 제조되었고 이. 콜라이(E. Coli)에서 발현되었다. 1991년 7월 24일자로 공개된 유럽 특허 공개 공보 제 0 173 254 호를 참조할 수 있다.

따라서, 지금까지 gp 350/220에 연관된 EBV 연구는 천연 gp 350/220 서열 또는 트랜스멤브레인 도매인(transmembrane domain)이 결실된 개질된 서열을 효과적으로 발현시켜, 결과적으로 천연 단백질 또는 트랜스멤브레인 부분이 결실된 단백질의 2개의 다르게 스플리싱된 단백질들의 혼합물을 수득하거나, 또는 β-갈락토시데이즈 융합 단백질로서 항원결정성 절편 서열을 생산하는데 주력하여 왔다.

도 1a 내지 1d는 gp 350/220의 DNA 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다.

도 2a 및 2b는 gp 350의 결실되고 부위 지향적 돌연변이된 구축물을 나타낸다.

도 3은 SDS-PAGE로 분석된 pMDTM 클론에서의 균질한 gp 350 단백질을 면역 침전시킨 결과를 나타낸다.

도 4는 하기 실시예 3.4에서 개시된 바와 같은 CHO 세포에서 발현되는 pMDTM 클론에서의 단백질의 노던 블럿 분석 결과를 나타낸다.

gp 350/220의 부분 정제 방법은 공지되어 있다. 피너티의 문헌[J. Gen. Virology,73:449(1992)]을 참조할 수 있다(재조합 생산되고 부분 정제됨). 천연 gp 350/220 단백질의 경우에는, 대부분의 경우 정제함으로써 단백질의 항원성이 불활성화되어 서브유니트 백신에서 사용할 수 없게 되었다. 그러나 천연(즉, 재조합이 아닌) 공급원으로부터 항원적으로 활성이 있는 gp 350 단백질의 매우 정제된 제조물이 과학 문헌에 보고되어 왔다. 데이비드(David)의 문헌[J. Immunol. Methods,108:231(1988)]을 참조할 수 있다. 또한 gp 350/220 단백질을 발현하는 재조합 백신 바이러스를 사용하여 EBV-유도성 림프종에 대해 코튼탑 타마린(cottontop tamarin)을 백신화시켰다. 모간(Morgan)의 문헌[J. Med. Virology,25:189(1988)], 마케트(Mackett)의 문헌[EMBO. J.,4:3229(1985)] 및 마케트의 문헌[Vaccines'86 pp293(Lerner RA, Chanock RM, Brown F 편집, 1986, Cold Spring Harbor Laboratory)]을 참조할 수 있다. 그러나, 이때까지 유전자의 다르게 스플리싱된 형태중의 하나를 단독으로 발현시켜서 순수한 gp 350 단백질 또는 순수한 gp 220 단백질을 생산할 수 있도록 바이러스의 gp 350/220 DNA 서열을 유전공학적으로 조작한 적은 없었다. gp 350 단백질 또는 gp 220 단백질중의 하나 또는 다른 하나를 발현하는 재조합 또는 돌연변이 바이러스도 제조되지 않았다.

일반적으로, 스플리스 부위는 예비-mRNA 분자를 mRNA 분자로 가공하는 것을 용이하게 한다. 폴리오마 바이러스에서는, 후기 mRNA가 효율적으로 축적되게 하기 위해서 스플리스 부위가 필요하다. 폴리오마 바이러스 전사물에서 3' 또는 5' 스플리스 부위가 변화되면 mRNA의 축적이 감소되거나 완전히 차단된다. 트레이스만(Treisman)의 문헌[Nature,292:595(1981)]을 참조할 수 있다. SV 40 바이러스에서는, 제거가능한 간섭 서열이 mRNA를 핵 밖으로 이동시키고 핵에서의 mRNA의 안정화를 도우며, 이들 인트론/엑손 연결 서열이 작은 핵 RNP 입자들의 결합을 촉진시키므로, 스플리싱 전의 mRNA는 가공 경로에서 적절하게 결합하지 못하는 것으로 생각된다. 엑손/인트론 스플리스 부위에서의 점 돌연변이는 엑손/인트론 절단을 감소시켜 예비-mRNA의 가공, 핵 이동 및 안정화를 방해할 수 있는 것으로 알려졌다. 류(Ryu)의 문헌[J. Virology,63:4386(1989)] 및 그로스(Gross)의 문헌[Nature,286:634(1980)]을 참조할 수 있다.

따라서, 본 발명 전에는, EBV gp 350/220 서열에 의해 코딩되는 단백질의 기능적 발현 및 항원 활성에 대한 스플리스 부위의 변화에 따른 효과는 알려져 있지 않으며 예상된 적도 없었다.

추가의 배경 문헌은 하기를 포함한다. EBV 생물학 및 질병은 일반적으로 스트라우스(Straus)의 문헌[Annal of Int. Med.,118:45(1993)]에 고찰되어 있다. EBV BLLFI의 오픈 리딩 프레임의 설명은 바에르(Baer)의 문헌[Nature,310:207(1984)]에서 발견된다. 엡스테인-바 바이러스 gp 350/220 DNA 서열 및 아미노산 서열에 대한 설명은 베이즐(Beisel)의 문헌[J. Virology,54:665(1985)] 및 비긴(Biggin)의 문헌[EMBO J.,0:1083(1984)] 및 키에프 등에게 허여된 미국 특허 제 4,707,358 호(1987)에서 찾아볼 수 있다. 엡스타인-바 바이러스 유형 A 및 B에서의 gp 350/220을 코딩하는 DNA 서열의 비교는 리스(Lees)의 문헌[Virology,195:578(1993)]에 개시되어 있다. EBV의 gp 350/220 당단백질에 대해 중화 활성을 나타내는 단일 클론 항체는 토를리-로슨(Thorley-Lawson)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci,77:5307(1980)]에 개시되어 있다. 최근에는 스플리스 공여 부위 및 스플리스 수용 부위에 대한 스플리스 부위의 컨센서스(consensus) 서열이마운트(Mount)의 문헌[Nucleic Acids Res.,10:459(1982)]에 개시되어 있다.

본 발명의 한 양태에서는 EBV gp 350/220 DNA 서열의 스플리싱되지 않는 변형체를 제공한다. 본 발명의 DNA 서열은 균질한 gp 350 단백질의 발현을 코딩하는 단리된 DNA 서열을 포함할 수 있다. gp 350 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 스플리스 공여 부위 및 스플리스 수용 부위에서의 천연 뉴클레오티드가 천연이 아닌 뉴클레오티드로 치환된 도 1에서의 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 또는 거의 동일한 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 단편을 포함함을 특징으로 한다. 이 DNA 서열은 코딩 서열의 양측에 5' 및 3'의 비코딩 서열을 포함하며, 아미노 말단의 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다. 도 1a 내지 1d는 비코딩 서열을 나타내고 *로 추정 신호 서열의 말단을 나타낸다. 그러나, 본 발명의 DNA 서열은 이들 측위 서열 또는 신호 서열의 일부 또는 모두를 배제할 수 있다. 본 발명의 스플리싱되지 않는 DNA 서열 변형체는 gp 350/220을 코딩하는 유전자의 스플리스 공여 부위 및 스플리스 수용 부위에서 도 1a 내지 1d의 DNA 서열에 돌연변이를 도입하여 생성될 수 있다. 이는 gp 220 단백질을 생산하지 않고 오직 gp 350 단백질만을 생산한다.

따라서, 본 발명의 다른 양태는 균질한 gp 350 단백질, 및 적합한 발현 제어 서열의 제어하에 적절한 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포에서 EBV gp 350/220 DNA 서열의 스플리싱되지 않는 변형체를 발현시켜 균질한 gp 350 단백질을 제조하는 방법을 포함한다. gp 350 단백질에 대해 본원에서 사용되는 용어에서, 균질함은 gp 220 단백질이 없거나 실질적으로 없음을 의미한다. 본 발명자들이 아는 한 포유동물 또는 곤충의 세포에서 재조합 생산된 균질한 gp 350 단백질은 이제까지 과학문헌에서 보고된 바 없음에 주목한다.

또다른 양태에서, 생성물이 분비되도록 추가로 결실된 균질한 gp 350 단백질이 제공된다. 이런 결실은 gp 350의 트랜스멤브레인 영역의 제거, 또는 gp 350의 트랜스멤브레인 영역 및 나머지 C 말단의 제거를 포함한다. 이와 같이 추가로 개질된 DNA 서열 및 이에 의해 코딩되는 단백질은 본원의 또다른 양태이다.

벡터 DNA 및 균질한 gp 350 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자가 또한 제공된다. 상기 DNA 분자는 선택된 숙주 세포에서 균질한 gp 350의 복제 및 발현을 유도할 수 있는 적합한 조절 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 gp 350 서열을 제공한다. 재조합 균질 gp 350을 발현시키는데 사용할 수 있는 이런 DNA 분자로 형질전환된 숙주 세포가 또한 본 발명에 의해 제공된다.

본 발명의 DNA 분자 및 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 다른 양태인 균질한 재조합 gp 350 단백질 또는 그의 단편을 생산할 수 있는 신규한 방법에 사용된다. 이 방법에서 단백질의 발현을 제어할 수 있는 적합한 조절 서열 또는 발현 제어 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 균질한 gp 350 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA 서열(또는 상기 개시된 바와 같은 재조합 DNA 분자)로 형질전환된 세포주는 재조합 DNA의 발현을 허용하는 적절한 조건하에서 배양된다. 그런 다음, 발현된 단백질을 적합한 종래의 수단에 의해 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 수확한다. 이 방법은 숙주 세포로서 공지된 다양한 세포를 사용할 수 있고; 현재 포유 동물 세포 및 곤충 세포가 바람직하다.

본 발명의 DNA 서열 및 단백질은 EBV 항원 결정성을 갖는 치료제 및 면역원성 화합물의 제조에 이용된다. 이런 화합물은 단핵세포증가증, 버킷의 림프종 및 비인두 암종과 같은 EBV 연관된 질병의 예방 치료 및 예방용 서브유니트 백신에 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 다른 양태는 인간에서 감염성 단핵세포증가증, 버킷의 림프종 및 비인두 암종과 같은 EBV 연관된 질병 및 질환을 예방하고 치료하기 위한 치료제 및/또는 면역원성 약학 조성물을 포함한다. 이런 치료제 및/또는 면역원성 약학 조성물은 당분야에 공지되어 있는 바와 같은 수산화 알루미늄, 염수 및 인산 완충된 염수와 같은 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된, 면역원성 유도 효과량의 본 발명의 균질한 gp 350 단백질 하나 이상을 포함한다. "면역원적으로 유도되는"은 포유동물에서 EBV에 대한 항체의 생산을 자극하는데 충분한 양을 의미한다. 다르게는 활성 성분은 리포좀을 함유한 응집물의 형태로 투여될 수 있다. 예방학적 용도를 위해서는 이런 약학 조성물은 인간 환자에게 투여하기 위한 서브유니트 백신으로 제형화될 수 있다. 환자에게 항체 형성을 자극하기에 충분한 투여량으로 백신 접종하고 6달 또는 1 년뒤에 다시 백신 접종할 수 있다.

따라서 본 발명의 다른 양태는 적합한 약학적 담체중의 면역원성 유도성 치료 효과량의 균질한 gp 350 단백질을 환자 특히 인간 환자에게 투여하여 EBV와 연관된 질병 및 질환을 치료하는 방법이다. 본 발명의 또다른 양태는 적합한 약학적 비히클(vehecle)중의 면역원성 유도성 치료 효과량의 균질한 gp 350 단백질을 환자에게 투여하여 EBV에 대한 면역 반응을 자극하는 방법이다.

도 1a 내지 1d는 gp 350/220의 DNA 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(베이즐의 문헌[J. Virology,54:665(1985)]에서). 스플리스 공여 부위 및 스플리스 수용 부위가 명시되어 있다. 트랜스멤브레인 영역(TM)은 수평 화살표로 표시되고 *는 추정 신호 서열의 말단을 나타낸다. 뉴클레오티드 번호가 왼쪽에 나타나 있고; 아미노산 번호는 오른쪽에 나타나 있다.

도 2a 및 2b는 gp 350의 결실되고 부위 지향적 돌연변이된 구축물을 나타낸다. pMDTM 및 pMSTOP로 나타난 플라즈미드 지도는 스플리싱되지 않는 본 발명의 gp 350/220 변형체를 예시한다. 도 2a에서, gp 350 단백질의 선형 모델은 하기 BLLF1, 코딩 클론으로 대략적인 크기를 나타내면서 도시된다. N-말단 신호 서열(SS) 및 트랜스멤브레인 도메인(TM)은 단백질상에 나타나 있고 중요한 제한 부위는 유전자 다이아그램에 나타나 있다. gp 350 유전자는 2개의 분절, HindIII/BfaI BLSH1 단편 및 BanI/HindIII BLSH2 단편으로 클로닝되었다. SCYT는 명시된 BLLF1 영역으로부터 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 제조되었다. 도 2b에서, pDTM, pSTOP, pMDTM 및 pMSTOP에 대한 클로닝 개략도가 나타나 있다(플라즈미드 크기는 도시되지 않음). 클로닝의 상세한 설명은 실시예 1 및 2에 개시되어 있다. 플라즈미드 지도는 상대적인 제한 부위, 사용된 클로닝 벡터 및 gp 350 유전자 단편으로 나타나 있다. pMDTM 및 pMSTOP에서의 스플리스 부위 돌연변이는 *로 도시되어 있다.

도 3은 SDS-PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동)로 분석된 pMDTM 클론에서의 균질한 gp 350 단백질을 면역침전시킨 결과를 나타낸다. gp 350/220 단백질의 절단된 형태를 분비하는 양성 대조군(GH3△19) 세포, 음성 대조군(pEE14) 및 여러 pMDTM 클론은 5.5 시간동안³⁵S-메티오닌으로 대사적으로 표지되었다; 균질한 gp350 단백질은 생성된 조직 배양 상층액에서 면역 침전되었다. 각각의 세포 유형에 대해 표지된 조직 배약 상층액(S) 및 gp 350/220 침전물(Ip)의 시료를 5% SDS-PAGE상에서 전기영동시켰다. 분자량 지표의 위치는 왼쪽에 나타나 있다.

도 4는 하기 실시예 3.4에서 개시된 바와 같이 CHO 세포에서 발현되는 pMDTM 클론에서의 단백질의 노던 블럿(Northern blot) 분석 결과를 나타낸다.

gp 350 단백질의 스플리싱되지 않은 변형체를 코딩하는 클로닝된 EBV DNA 서열을 포함하는 방법 및 조성물이 개시되어 있다. 언급된 바와 같이, 이런 스플리싱되지 않은 변형체는 본원에서는 균절한 gp 350 단백질로 언급된다. 일반적으로 gp 350/220 유전자가 포유동물 세포에서 발현될 때, 유전자의 RNA 스플리싱에 의해 gp 350 및 gp 220의 2개의 유전자 산물이 생산된다. 본 발명은 오직 하나의 유전자 산물인 gP 350만이 생성되도록 한다. 본 발명은 gp 350 유전자에서 RNA 스플리스 부위 신호의 일부 또는 전부를 제거하고 유전자를 적합한 숙주 세포에서 발현시킴을 포함한다. gp 350/220 유전자에서의 돌연변이는 gp 350/220 유전자가 포유동물에서 발현되었을 때 220kD의 단백질을 생성하지 않도록 방지하기 위해 도입된다. 결과적으로 오직 gp 350만을 코딩하는 mRNA 전사체가 생성된다. 스플리싱되지 않는 gp 350/220 유전자 변형체를 사용하여 gp 220의 발현을 불능시키면 gp 220에 대해 gp 350의 생산이 크게 증가할 것이다. gp 350이 gp 220상에서 발견된 모든 잠재적인 항원성 부위를 함유하므로 gp 220의 생산은 효과적인 항-EBV 백신의 생산에 필수적이지 않다.

따라서, 본 발명의 한 양태는 아미노산 501을 코딩하는 스플리스 공여 부위및 아미노산 698을 코딩하는 스플리스 수용 부위가 천연 뉴클레오티드에서 비-천연 뉴클레오티드로 치환되어 개질된 점을 제외하고는 실질적으로 gp 350과 동일한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 제공한다. 바람직하게는 천연 뉴클레오티드는 아미노산 서열이 동일하게 남아있도록 비-천연 뉴클레오티드로 치환되어 개질된다. 구체적으로, 실시예에서, 스플리스 공여체 부위(뉴클레오티드 1500 내지 1504)에서 천연 뉴클레오티드 AAGT를 뉴클레오티드 GTCA로 치환하고, GG 스플리스 수용 부위(뉴클레오티드 2091 내지 2094)의 측면의 천연 뉴클레오티드 A 및 T를 각각 T 및 A로 치환하였다. 결과적으로 이렇게 치환되어도 아미노산 위치 500에서의 글루타민 및 위치 501에서의 세린은 공여 부위에서 동일하게 남아있다. 비슷하게, 아미노산 위치 697에서의 트레오닌 및 위치 698에서의 글리신도 상기와 같이 개질되어도 수용체 부위에서 동일하게 남아있다.

유사하게, 특정하게 예시된 것들을 제외한 치환도 이하에 보다 자세하게 개시된 바와 같이 당 분야에 숙련된 이들에 의해 보다 용이하게 수행될 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 양태에서는 균질한 gp 350 단백질을 포함한다. 균질한 gp 350 단백질은 각각 N-말단의 18개의 아미노산 신호 서열이 있거나 없는, 아미노산 1에서 907까지, 아미노산 1에서 862까지, 또는 아미노산 863에서 881까지를 제외한 아미노산 1에서 907까지의 도 1에서 도시된 바와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가짐을 더욱 특징으로 한다. 또한 균질한 gp 350 단백질의 유사체가 제공되며, 이는 항원 활성이 유지되도록 아미노산 서열을 변형시켜, 균질한 gp 350 단백질의 상응하는 부분과 바람직하게는 80%이상, 보다 바람직하게는 90%이상, 및 가장바람직하게는 95%이상의 상동성을 갖는 돌연변이를 포함한다. 이들 예는 도 1의 아미노산 서열로부터 소수의 아미노산이 변화된, 특히 보존성 아미노산이 치환된 단백질 및 폴리펩티드를 포함한다. 보존성 치환은 서로 연관성 있는 측쇄를 갖는 아미노산 계열 내에서 치환이 일어나는 것이다. 유전적으로 코딩되는 단백질은 일반적으로 4가지 계열로 분류된다: (1) 산성 = 아스파테이트, 글루타메이트; (2) 염기성 = 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성 = 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 전하가 없는 극성 = 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 때때로 방향족 아미노산으로 연계되어 분류된다. 예를 들면, 루신을 단독 치환하거나 또는 아미노산을 구조적으로 연관된 아미노산으로 유사하게 보존성 치환하는 것은 항원 활성 또는 기능에 중요한 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다.

본 발명은 gp 350을 단순하게 정제할 수 있는 이점을 제공한다. gp 350 및 gp 220은 유사한 생화학적 성질을 가지므로, gp 220은 종종 gp 350의 정제시 함께 정제된다. gp 350/220 유전자의 스플리싱되지 않는 변형체만을 발현시키는 세포는 단백질 정제를 단순화시킬 것이다. 이는 gp 350의 생산비용을 감소시킬 것이다. 본 발명은 또한 gp 350 정제를 위한 출발 물질의 생화학적 특징을 분석하기에 더 쉽게 만든다. 오직 한가지 종류만이 존재하므로 단백질 함량 분석 및 아미노산 서열 분석은 제 2 종의 존재에 대한 고려없이 수행될 수 있다.

발명은 또한 gp 350을 다량으로 생산하는 이점을 제공한다. gp 350 유전자의스플리싱을 억제하여 세포가 gp 350 및 gp 220의 이중 생산으로부터 gp 350 단백질만의 생산으로 이동되게 할 것이다. 일부 세포에서는, gp 220의 농도는 gp 350의 농도의 30% 내지 100%인 것으로 측정된다. 유전자 스플리싱이 억제됨으로써 gp 350의 생산성은 gp 220의 생산성의 손실만큼 증가할 것이다.

gp 350/220 유전자의 DNA 서열이 베이즐의 문헌[J. Virology,54:665(1985)] 및 비긴(Biggin)의 문헌[EMBO J.,3:1083(1984)]에서 개시되고 도 1에 나타나 있다. 유전자는 907개의 아미노산을 코딩하고 약 95kD의 1차 해독 산물을 명시하는 2721개 염기의 오픈 리딩 프레임이다. 예정값과 실제값의 차이는 단백질의 광범위한 글라이코실화에 의한 것이다. 591개 염기(197개의 아미노산을 코딩함)가 스플리싱되어 제거되어 gp 220을 생산한다. gp 350/220 유전자 산물의 겉보기 분자량은 사용하는 측정 시스템의 유형, 다양한 세포 유형에서의 글라이코실화 부위, 해독 후 처리의 차이 또는 선택적인 유전자 돌연변이에 따라 또한 다를 수 있다. 측정된 값은 상이한 gp 350/220 유전자의 스플리싱되지 않은 부위 변형체의 산물에 따라 다르지만 "균질한 gp 350 단백질 또는 단백질들"이란 용어는 선택적으로 본원에 또한 개시된 C-말단 결실 및/또는 트랜스멤브레인 부분의 개질과 같은 추가의 결실 또는 돌연변이를 갖는 스플리싱되지 않는 변형체의 유전자 산물을 또한 포함한다. "gp 220 단백질"이란 용어는 약 분자량 220kD의 다르게 스플리싱된 gp 350/220 유전자 산물을 의미한다. gp 350/220 유전자에서의 스플리스 부위는 gp 350/220 유전자를 주로 진핵 생물체에서의 다른 유전자를 기초로 한 컨센서스 스플리스 공여 부위 및 스플라이스 수용 부위의 서열을 비교하여 결정되었다. 다른 유전자에서의 스플리스 부위에 대한 연구로부터 마운트(Mount)의 문헌[Nucleic Acids Res.,10:459(1982)]에 의해 밝혀진 컨센서스 서열은

이다. 이때 *된 염기들은 모든 스플리스 부위에서 100% 나타나는(매우 보존되어 있는) 염기를 나타낸다. 2개의 염기 또는 1개의 염기가 있는 위치는 보존된 위치(강조되지 않은 위치)를 나타낸다. 빗금은 실제로 스플리싱이 일어나는 부위를 나타낸다.

gp 350/220 유전자에서 스플리스 공여 부위는 gp 350/220 유전자의 DNA 서열 분석(비긴의 문헌[EMBO J.3:1083(1984)])에서 나타나는 바와 같이, 뉴클레오티드 1501 뒤에 존재하며, 스플리스 수용 부위는 뉴클레오티드 2092 뒤에 존재한다(본원 및 도 1에서 사용된 번호는 비긴의 번호에 따른 것이다). 스플리스 부위는 EBV의 B형 균주에서도 상응하는 유전자 영역(스플리스 공여 부위는 A₁₅₀₁뒤, 스플리스 수용 부위는 G₂₀₂₉뒤)에 존재한다. 본 발명은 gp 350/220 유전자로부터 단일 종류의 mRNA를 생산하도록 A 또는 B형 EBV 균주, 또는 다른 EBV 균주에서의 스플리스 부위를 이용하여 제조된 조성물을 포함한다. B95-8 균주의 바이러스로부터 A형의 DNA 서열이 하기 실시예에서 사용되었지만, A형 및 B형 균주의 해독된 유전자 산물이 98% 동일하므로, B형 균주의 DNA 서열을 동일하게 사용할 수 있다. B형 균주는 아미노산 507 내지 520 및 570 내지 576이 없다. A형 균주는 모든 가능한 gp 350 항원성 부위를 함유하므로 A형 균주가 사용되었다. 다르게는 본원의 개시 내용에 따라 균주 특이적 서열을 갖는 EBV gp 350/220을 사용하여 특정한 균주에 특이적인 면역원성 성질을 가져 균주 특이적 EBV 연관된 질병의 예방 또는 치료를 위한 면역원성 및/또는 치료적 조성물에 유용한 EBV 균주에 특이적인 균질한 gp 350 단백질을 생산할 수 있다. 하기 표 1은 스플리스 공여 부위 및 스플리스 수용 부위의 야생형 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

gp 350/220 유전자의 RNA 스플리싱을 방지하기 위해, gp 350/220 유전자의 핵산 서열에 돌연변이를 도입하여 RNA 스플리스 부위의 적절한 염기쌍을 치환하였다. 스플리스 부위가 기능하지 못하게 하기 위해, 바람직하게는 공여 부위 또는 수용 부위의 2개의 매우 보존된 염기 프레임중에 1개 이상의 염기가 비보존성 염기로 치환되어야 하고, 보다 바람직하게는 2개 이상의 매우 보존된 염기가 비보존성 염기로 돌연변이되어야만 한다. 스플리스 부위의 인식을 더욱 감소시키기 위해, 스플리스 부위로부터 2개 염기 이상 떨어진 다른 보존된 염기가 또한 비보존성 스플리스 부위 염기로 치환될 수 있다. 공여 부위 및 수용 부위 둘 모두가 스플리싱 메카니즘을 손상시키기 위해 변화될 수 있다. 바람직하게는, 공여 부위 및 수용부위 둘 모두는 각각 4개의 매우 보존된 스플리스 부위 염기 위치중 하나에서 하나 이상의 변화를 포함하고, 보다 바람직하게는 4개의 매우 보존된 스플리스 부위 염기 위치중 둘에서 둘 이상의 변화를 포함한다. 만약 야생형 아미노산 서열을 유지시키기를 원해서, 하나의 스플리스 부위를 돌연변이시키지 않는다면 다른 스플리스 부위에 2개 이상의 돌연변이를 도입하는 것이 바람직하다.

gp 350/220 스플리스 부위에서의 돌연변이는 후속적으로 발현되는 gp 350 단백질의 아미노산 서열을 변화시킬 수 있다. 바람직하게는 이런 변화는 보존성 아미노산 치환이어야만 한다. 아미노산 서열에서의 보존성 치환은, 아미노산 서열에서의 비보존성 치환과는 다르게 항원 부위를 보존시키는 것을 도울 것이다. 보존성 아미노산 변화는 염기 변화(또는 염기 변화들)가 불변성 공여 부위/수용 부위 염기에서 적합한 변화를 생성하는 한 가능하다. 예를 들면, GGU가 아닌 다른 Gly에 대한 코돈을 이용하여(GGU의 사용은 G 뉴클레오티드를 보존하여 스플리싱 신호에서의 원하는 GT 치환이 일어나지 않을 것이다) 스플리스 공여 부위에서 Ser₅₀₁을 Gly로 치환할 수 있다. 유사하게, 스플리스 수용 부위에서 Gly₆₉₈에서 Ala로의 변화는 보존성 변화이지만, 모든 Ala 코돈은 매우 보존되는 G 뉴클레오티드로 시작되므로, 이는 원하는 치환을 일으키지 않을 것이다. 비록 프롤린도 또한 보존성 아미노산 변화일 수 있지만, 프롤린은 단백질의 3차 구조를 변화시켜 하나 이상의 gp 350 항원 부위를 가릴 수 있으므로 야생형 아미노산을 치환하는데 사용되지 않는다. 하기 표 1은 야생형 서열에서의 허용가능한 보존성 아미노산 치환을 나타낸다. 하기 표 1의 하부에는 보존성 아미노산 변화에 의한 돌연변이의 예가 있다.

[표 1]

비록 본 발명의 한 양태가 gp 350/220의 스플리싱되지 않은 변형체를 포함하지만, gp 350/220을 코딩하는 서열의 추가의 돌연변이가 또한 바람직할 수 있다. 가용성의 균질한 gp 350 단백질("가용성 단백질"은 용액중에서 유리 상태이거나 막에 결합되어 있지만 막에 삽입되어 있지는 않다)을 제조하기 위해, 예를 들면 삽입형 막 단백질로서 gp 350의 전체 길이가 발현되어서 일어나는 세포 독성 문제를 피하기 위해 gp 350의 막에 걸쳐지는 영역(트랜스멤브레인 영역)을 코딩하는 DNA 서열의 전부 또는 일부를 결실시켜 변형시킬 수 있다. gp 350/220의 막에 걸쳐지는 영역은 아미노산 861(메티오닌)에서 881(알라닌)을 포함한다. 베이즐의 문헌[J. Virology,54:665(1985)]을 참조할 수 있다. 바람직하게는 트랜스멤브레인 영역의 8개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 12개 이상의 아미노산, 가장 바람직하게는 18 내지 21개의 아미노산이 결실된다. 따라서, 다른 양태에서는, 본 발명은 gp 350/220 DNA 및/또는 균질한 gp 350 단백질의 트렌스멤브레인 영역에서 하나 이상의 결실을 추가로 포함하여 가용성의 균질한 gp 350 단백질을 생성하는 gp 350/220의 스플리싱되지 않는 DNA 변형체 및/또는 균질한 gp 350 단백질을 제공한다.

스플리싱되지 않은 gp 350/220 변형체의 트랜스멤브레인 도메인의 전부 또는 일부를 결실시키는데 추가하여, 트랜스멤브레인 도메인 이후의 아미노산 881 내지 907을 포함하는 C-말단 서열을 본원에 개시된 바와 같이 본 발명에 따라 전체 또는 일부를 결실시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양태에서는 gp 350/220의 트랜스멤브레인 영역을 코딩하는 DNA 서열 및/또는 이 영역을 포함하는 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 결실시킴으로써 더욱 개질시킨, 심지어는 gp 350/220의 남은 C-말단 DNA 및/또는 아미노산을 결실시켜 더욱 개질시킨 gp 350/220의 스플리싱되지 않은 DNA 변형체 및/또는 균질한 단백질을 포함한다.

따라서, 본 발명의 다른 양태는 본 발명의 균질한 gp 350 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 스플리싱되지 않는 변형체를 포함한다. 이런 DNA 서열은 도 1a 내지 1d에서 아미노산 1 내지 907을 코딩하고 추가로 스플리스 공여 부위 및 스플리스 수용 부위를 제거하기 위해 본원에서 개시된 뉴클레오티드 치환을 포함하는 DNA 서열을 포함한다. 이런 DNA 서열은 선택적으로 아미노산 861 내지 907을 포함하는 트랜스멤브레인 도메인 및 C-말단의 전체 또는 일부를 코딩하는 뉴클레오티드가 결실된 절단된 DNA 서열, 및 아미노산 861 내지 881을 포함하는 트랜스멤브레인 도메인의 전체 또는 일부를 코딩하는 뉴클레오티드가 결실된 결실 변형체를 포함한다. 균질한 gp 350 단백질을 코딩하는 본 발명의 DNA 서열은 또한 적절히 엄격한 조건하에서 도 1a 내지 1d의 단리된 DNA 서열에 혼성화될 수 있거나, 또는 엄격하나 유전코드의 디제너러시(degeneracy)를 허용하는 조건하에서 도 1a 내지 1d의 단리된 DNA 서열에 혼성화될 수 있는 DNA를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 DNA 서열은 대립 인자 변형, 종 변형 또는 고의적인 개질에 기초한 비-코딩 서열, 신호 서열 또는 코딩 서열의 개질을 함유할 수 있다.

본원에 개시된 바와 같은 이들 스플리싱되지 않는 gp 350/220 변형체의 DNA 서열은 당분야에 공지된 방법을 사용하여 구축될 수 있다. 본 발명의 개질된 DNA 서열은 공지된 방법을 사용하여 본 발명의 균질한 gp 350 단백질을 생성하도록 재조합적으로 발현될 수 있다. 이런 재조합 단백질은 정제되어 EBV 관련 질병의 예방적 치료 또는 예방용 약학 조성물에 혼입될 수 있다.

본 발명의 gp 350/220 DNA의 스플리싱되지 않는 변형체는 당분야에 공지된 바와 같은 적절한 발현 제어 시스템을 사용하여 다양한 유형의 세포에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 당분야에서 공지되고 사용될 수 있는 적합한 세포는 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모 세포; 이. 콜라이 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 박테리아 세포; 및 GH3, CHO, NSO, MDCK 및 C-127 세포와 같은 포유동물 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 세포 유형에 사용되는 벡터는 사용되는 세포 유형 및 발현 제어 시스템과의 상용성을 기준으로 하여 선택된다. gp 350/220 유전자의 분비되는 생성물을 발현하게 하는 세포 및 벡터가 바람직하다. 전형적으로는, 예를 들면 C-말단 및/또는 막에 걸쳐지는 영역을 코딩하는 서열이 있거나 없는 EBV gp 350의 스플리싱되지 않는 변형체 서열의 경우에, 종래의 기술을 이용하여 원하는 단백질을 발현시키기 위한DNA 서열을 함유하도록 개질된 pBR322의 유도체를 사용하여 이. 콜라이를 형질전환시킨다. pBR322는 표지로서 사용될 수 있는 암피실린 및 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 유전자를 함유한다. 볼리바(Bolivar)의 문헌[Gene,2:95(1977)]을 참조할 수 있다. 일반적으로 사용되는 발현 제어 서열, 즉 전사 개시를 위한 프로모터(promoter) 및 선택적으로 오퍼레이터(operator) 또는 인핸서(enhancer)는 베타-락타메이즈, lac 프로모터 시스템(장(Chang)의 문헌[Nature,198:1056(1977)] 참조), 트립토판 프로모터 시스템(고에들(Goeddle)의 문헌[Nucleic Acids Res.,8:4057(1980)] 참조) 및 람다-유도된 PL 프로모터 및 N-유전자 리보솜 결합 부위(시마타케(Shimatake)의 문헌[Nature,292:128(1981)] 참조)를 포함한다. 그러나 원핵 숙주 세포와 상용성이 있는 임의의 사용가능한 프로모터 시스템 또는 발현 제어 시스템을 사용할 수 있다. 다른 예시적인 숙주 세포, 플라즈미드 및 발현 비히클은 이타쿠라(Itakura)에게 허여된 미국 특허 제 4,356,270호(1982) 및 리그(Riggs)에게 허여된 제 4,431,739 호 및 루터(Rutter)에게 허여된 제 4,440,859 호(1984)에 개시되어 있다.

곤충 세포는 곤충 세포 발현 시스템을 이용하여 숙주 세포로서 또한 사용될 수 있다. 곤충 세포에서의 발현의 경우, 발현 시스템의 성분은 일반적으로 바큘로바이러스 게놈(genome)의 단편 및 발현될 이종 유전자 또는 유전자들이 삽입될 수 있는 편리한 제한 부위를 둘 모두 갖고 있는 일반적인 박테리아 플라즈미드인 이동 벡터; 이동 벡터에서 바큘로바이러스-특이적 단편과 상동성인 서열(이는 이종 유전자를 바큘로바이러스 게놈으로 상동 재조합시킨다)을 갖는 야생형 바큘로바이러스,및 적절한 곤충 숙주 세포 및 성장 배지를 포함한다.

현재, 외부 유전자를 AcNPV에 도입하는데 가장 일반적으로 사용되는 이동 벡터는 pAc373이다. 당분야에 숙련된 이들에게 공지된 많은 다른 벡터들이 또한 고안되어 왔다. 이들은 예를 들면 pVL985(이는 폴리헤드린 출발 코돈을 ATG에서 ATT로 변화시키고, ATT의 하부 32염기쌍에서 BamHI 클로닝 부위를 도입한다)를 포함한다; 루코우(Luckow) 및 섬머스(Summers)의 문헌[Virology,17:31(1989)]을 참조할 수 있다.

플라즈미드는 또한 일반적으로 폴리헤드린 폴리아데닐화 신호(밀러(Miller) 등의 문헌[Ann. Rev. Microbiol.,42:177(1988)]) 및 이. 콜라이에서의 선택성 및 전파를 위한 진핵 암피실린 내성 유전자(amp) 및 복제 기원을 함유한다.

바큘로바이러스 이동 벡터는 일반적으로 바큘러바이러스 프로모터를 함유한다. 바큘로바이러스 프로모터는 바큘로바이러스 RNA 폴리머레이즈를 결합할 수 있고 코딩 서열(즉, 구조 유전자)을 mRNA로 하부(5'에서 3'으로) 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 일반적으로 코딩 서열의 5' 말단에 가깝게 위치하는 전사 개시 영역을 가질 것이다. 이 전사 개시 영역은 전형적으로 RNA 폴리머레이즈 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 바큘로바이러스 이동 벡터는 또한 존재시 구조 유전자에서 일반적으로 멀리 위치하는 인핸서라 불리는 제 2 도메인을 가질 수 있다. 발현은 조절되거나 항구적일 수 있다. 곤충 세포 발현 기술의 경우 유럽 특허 공개공보 제 155 476 호를 참조할 수 있다.

사카로마이세스 세르비시아에와 같은 효모가 또한 숙주 세포로 이용될 수 있다. 다양한 균주가 시판되고 사용가능하다. 유사하게 효모 발현에 적합한 플라즈미드 벡터는 공지되어 있으며, 그에 따른 프로모터 및 발현 제어 시스템도 공지되어 있다. 예를 들면, 미아노하라(Myanohara)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci.,80:1(1983)](PHO5 프로모터), 유럽 특허 공개공보 제 012 873 호(리더(leader) 서열), 쿠츠(Kurtz)의 문헌[Mol. Cell. Biol.,6:142(1986)], 이토(Ito)의 문헌[J. Bacteriol.,153:163(1983)] 및 힌넨(Hinnen)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci.,75:1929(1979)](형질전환 공정 및 적합한 벡터)을 참조할 수 있다.

다세포 생물체로부터의 진핵 세포도 물론 대상 폴리펩티드 및 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 위한 숙주 세포로서 이용될 수 있다. 유용한 숙주 세포주는 VERO 세포, HeLa 세포 및 중국 햄스터 자궁 세포(CHO)를 포함한다. 이런 세포와 상용성이 있는 발현 벡터를 또한 사용할 수 있고, 예를 들면 SV40으로부터의 초기 및 후기 프로모터(피어스(Fiers)의 문헌[Nature,273:113(1978)]) 및 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 2, 소의 유두종 바이러스 또는 조류의 육종 바이러스에 대한 프로모터와 같은 프로모터 및 발현 제어 서열을 전형적으로 포함한다. 예시적인 숙주 세포, 프로모터, 선택적 표지 및 기술은 마터(Mather)에게 허여된 미국 특허 제 5,122,469 호(1992), 아셀(Axel)에게 허여된 제 4,399,216 호(1983), 아셀에게 허여된 제 4,634,665 호(1987), 레빈슨(Levinson)에게 허여된 제 4,713,339 호(1987), 린골드(Ringold)에게 허여된 제 4,656,134 호(1987), 켈렘스(Kellems)에게 허여된 제 4,822,736 호(1989) 및 피어스에게 허여된 제 4,874,702 호(1989)에 또한 개시되어 있다.

적합한 숙주 세포의 형질전환은 이런 세포에 적절한 표준 기술, 예를 들면 코헨(Cohen)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci.,69:2110(1972)]에서 개시된 바와 같은 원핵 세포에 대한 CaCl₂처리, 및 그라함(Graham)의 문헌[Virology,52:546(1978)]에서 개시된 바와 같은 포유동물 세포에 대한 CaPO₄침전과 같은 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 효모 형질전환은 시아오(Hsiao)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci.,76:3829(1979)] 또는 클레베(Klebe)의 문헌[Gene,25:333(1983)]에서 개시된 바와 같이 수행될 수 있다.

gp 350의 스플리싱되지 않은 변형체 서열(C-말단 및/또는 막에 걸쳐지는 영역을 결실시키는 본원에서 개시된 추가의 개질이 있거나 없는)을 함유한 적합한 벡터의 구축은 당분야에 잘 공지된 종래의 리게이션(ligation) 및 제한 기술을 사용하여 수행된다. 부위 특이적 DNA 절단은 제한 효소의 제조자에 의해 전형적으로 내용이 명시되는 표준 조건하에서 적합한 제한 효소(들)로 처리하여 수행된다. 폴리아크릴아미드 겔 또는 아가로즈 겔 전기 영동은 표준 기술을 사용하여 절단된 단편을 크기대로 분리하게 할 수 있고, 4개의 디옥시뉴클레오티드 삼인산염의 존재하에서 이. 콜라이 폴리머레이즈 I의 클레노우(Klenow) 단편으로 처리하여 절편이 블런트 엔드(blunt end)를 갖게 한다. S1 뉴클레이즈로 처리하면 임의의 단선 부위가 가수분해된다. 합성된 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 당분야에 공지된 디에틸포스포아미다이트 방식을 사용하여 제조될 수 있다. 미국 특허 제 4,415,732 호(1983)를 참조할 수 있다. 리게이션은 표준 조건 및 온도하에서 T4 DNA리게이즈(ligase)를 사용하여 수행될 수 있고, 정확한 리게이션은 리게이션 혼합물로 이. 콜라이 또는 COS 세포를 형질전환시켜 확인된다. 성공적인 형질전환체는 암피실린, 테트라사이클린 또는 다른 항생 물질 내성 또는 당분야에 공지된 바와 같은 다른 표지를 이용하여 선택된다.

이런 재조합 DNA 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌[Sambrook, Molecular cloning: a laboratory manual, 2D ed.(1989)]; 문헌[DNA cloning, Vol. I 및 II(DN Glover ed 1985)]; 문헌[Oligonucleotide synthesis(MJ Gait ed 1984)]; 문헌[Nucleic acid hybridization (BD Hames ed 1984)]; 문헌[Transcription and translation (BD Hames ed 1984)]; 문헌[Animal cell culture(RI Freshney ed 1986)]; 문헌[B. Perbal, A practical guide to molecular cloning(1984)]; 문헌[Gene transfer vectors for mammalian cells(JH Miller ed 1987, Cold Spring Habor Laboratory)]; 문헌[Scopes, Protein Purification: Principles and practice, 2nd ed, (1987 Springer-Verlag NY)] 및 문헌[Handbook of experimental immunology, vols I - IV(DM weired 1986)]을 참조할 수 있다. 이런 모든 언급된 문헌은 이들이 개시한 물질에 대해 참고로 본원에 인용된다.

따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 gp 350/220 DNA 서열의 스플리싱되지 않는 변형체를 함유하는 벡터 및 숙주 세포를 포함하고, 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 스플리싱되지 않는 gp 350/220 변형체 DNA 서열을 갖는 벡터를 함유한 상기 숙주 세포를 균질한 gp 350 단백질을 발현할 수 있게 하는 배양 조건하에서 배양하여 스플리싱되지 않는 gp 350/220 변형체의 단백질을 제조하는 방법을 추가로 포함한다.

발현된 균질한 gp 350은 한외여과, 유리 유동 전기영동, 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, SDS-PAGE, NH₄SO₄차별 침전, 렉틴 칼럼, 이온 교환 칼럼 및 소수성 칼럼과 같은 당분야에 공지된 종래의 당단백질 정제 방법을 사용하여(그러나 이에 한정되지는 않는다) 세포 및 배양 배지 조성물에서 정제된다. gp 350의 소규모 분석용 제제물은 SDS-PAGE 또는 렉틴 친화성 칼럼을 사용하여 가장 쉽게 정제되고, 백신화 또는 면역 반응시험에서 사용되는 이런 소규모 제제물은 액체 크로마토그래피를 이용하여 가장 손쉽게 정제된다. 백신 조성물에 사용하기 위해 gp 350의 상업적인 상당량을 생산하기 위한 대규모 제조에는, 한외여과, 겔 여과, 이온 교환 및 소수성 상호작용 크로마토그래피의 조합이 바람직하다.

정제되고 균질한 본 발명의 gp 350 단백질은 감염성 단핵세포증가증, 버킷의 림프종 및 비인두 암종과 같은 EBV 연관된 질병 및 질환의 예방 및 치료를 위한 치료제 및/또는 면역원성 약학 조성물에 사용될 수 있다. 이런 약학 조성물은 알룸과 같은 보조제/항원 제시 시스템과 같은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 면역원성 유도 효과량의 본 발명의 균질한 gp 350 단백질 하나 이상을 포함한다. 다른 보조제/항원 제시 시스템은, 예를 들면 MF59(키론 코포레이션(Chiron Corp.)), QS-21(캠브리지 바이오테크 코포레이션(Cambridge Biotech Corp.)), 3-DMPL(3-데아실-모노포스포릴 리피드 A)(리비이뮤노켐 리서치인코포레이티드(RibiImmunoChemResearch, Inc.)), 임상 등급의 불완전 프롱드 보조제(IFA), 퓨소제닉(fusogenic)리포좀, 수용성 중합체 또는 이스콤(Iscom, 면역 자극성 착물)을 또한 사용할 수 있다. 다른 약학적으로 허용가능한 담체 또는 용액의 예는 수산화 알루미늄, 염수 및 인산염 완충 염수이다. 조성물은 바람직하게는 허용가능한 피하 투여 용액 또는 근육내 투여 용액의 형태로 피하 또는 근육내로 전신 투여될 수 있다. 또한 표면 난절법 또는 신체 강의 접종에 의해 접종될 수 있다. pH, 등장성, 안정성 등에 대한 성질을 만족하는 이런 용액의 제조는 당분야에 공지되어 있다. 투여 요법은 신체적 상태, 체중, 성별, 식사, 병의 심각성, 투여 시간 및 다른 임상 요인과 같은 약물의 활성을 변화시키는 것으로 공지된 다양한 인자를 고려하여 진찰의에 의해 결정될 것이다. 예시적인 투여량 범위는 단백질 약 1㎍ 내지 약 1000㎍ 사이의 범위이다.

본 발명의 치료 방법을 실시하는데 있어, 균질한 gp 350 단백질의 면역적 유도 효과량을 치료 또는 예방적 치료가 필요한 인간 환자에게 투여한다. 본 발명의 조성물의 면역적 유도 효과량은 투여되는 투여량당 약 1㎍ 내지 약 1mg의 범위일 것으로 생각된다. 투여되는 투여 회수는 상기 언급된 요인에 따라 상이할 수 있다. 본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 개시되며, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않고 본 발명을 예시하기 위해 제공된다.

실시예 1

gp 350/220의 트랜스멤브레인 영역 및 트랜스멤브레인 영역 내지 C- 말단을 결실시킨 pDTM 및 pSTOP의 제조

EBV B95-8 균주(밀러 등, 1972)에서의 gp 350/220 유전자는 BLLF1으로 불리는 오픈 리딩 프레임으로서 BamHI 라이브러리에서 사용가능하다(바에르의 문헌[Nature,310:207, 1984]). 원하는 구축물을 제조하기 위해(도 2b에 개략적으로 도시되어 있다), gp 350/220 유전자는 2부분으로 클로닝되었다: 1) BLSH1, 2.3kb HindIII/BfaI 3'단편 및 2) BLSH2, 337 b.p. BanI/HindIII 5'단편(도 2a). 이들 단편은 엇갈리게 배열된 벡터에 클로닝되어서 C-말단 세포질 부분 및/또는 트랜스멤브레인 부분을 코딩하는 도메인을 결실시킬 수 있다. BfaI 부위는 gp 350의 트랜스멤브레인(TM) 도메인을 코딩하는 영역의 5' 말단에 있으므로, 이 부위를 사용하여 TM 도메인을 결실시키고, 인접한 C-말단과 함께 TM 도메인을 결실시켰다. BfaI을 사용하여 TM 영역의 오직 2개의 아미노산이 남아있도록 결실시킬 수 있다(하기 표 2).

1. pSTG1 및 pSTG3으로부터 pDTM의 구축

플라즈미드 pDTM은 TM 코딩 영역이 완전히 없는 gp 350/220 핵산 서열로 구성되어 있다. 이 구축물은 2개의 엇갈리게 배열된 벡터인 pSTG1 및 pSTG3을 이용하여 제조되었다. TM 영역의 3'말단에 BfaI 부위가 도입된 450 bp PCT 생성물인 SYCT는 BLLF1 클론 대상 서열을 사용하여 제조되었다(도 2a 및 2b). 사용된 PCR 프라이머는 하기와 같다:

프라이며 1의 BfaI 부위는 SCYT의 BfaI/XmaI 단편을 pSTG1으로 클로닝하기 위해 사용되었다. 프라이머 1의 나머지는 클론 BLLF1에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 상응한다. 프라이머 2는 운전자의 3'쪽에서의 gp 350/220의 오픈 리딩 프레임 바깥쪽의 영역에 상응한다. SCYT PCR 단편을 BfaI 및 XmaI으로 절단하여 136 염기쌍 단편을 제조하고, 이를 제 2 단편인 BLSH1 HindIII/BfaI 단편과 함께 pMT11 벡터(스파에트 및 모카르스키, 1985)로 클로닝하여 pSTG1을 제조하였다. BfaI 부위를 가로질러 서열을 분석한 결과, 모든 TM 아미노산 코딩 영역이 Met 및 Leu을 제외하고 결실되었음을 나타내었다(하기 표 2 참조). 제 3의 BLLF1 단편인 BLSH 2를 pMT11로 클로닝하여 pSTG3을 제조하였다. gp 350/220 유전자 코딩 서열의 바깥쪽에있는 16 염기쌍 BanI/XbaI 올리고뉴클레오티드 링커(linker)를 BLSH2 BanI/HindIII 단편을 pSTG3로 클로닝하는데 이용하였다. 2.4kb의 HindIII/XmaI pSTG1 단편을 0.3kb의 XbaI/HindIII pSTG3 단편과 함께 pEE14 벡터(영국 소재의 셀테크(Celltech))로 클로닝하여 pDTM 구축물을 완성하였다.

2. 벡터 pSTG2 및 pSTG3을 사용한 pSTOP의 구축

플라즈미드 pSTOP은 TM 영역, 및 TM 영역에 인접한 C-말단 세포질 영역이 없는 gp 350/220 유전자를 포함한다. 이 구축물을 만들기 위해 16 염기쌍의 BfaI/EcoRI 올리고뉴클레오티드 링커를 하기에서 도시되는 바와 같이 BfaI의 스티키(sticky) 말단에 이은 세 개의 프레임에서 중단 코돈(밑줄)과 함께로 제조하였다:

위쪽 서열의 5'에 매달린 (TA)가 BfaI 제한 부위에 대한 스티키 말단이고 아래쪽 서열의 5'에 매달린 (TTAA)가 EcoRI 스티키 말단이다. 이 16 염기쌍 링커를 사용하여 BLSH1 HindIII/BfaI 단편을 pMT11로 클로닝하여 pSTG2를 제조하였다. 2.3kb의 pSTG2 HindIII/EcoRI 절편 및 0.3kb의 pSTG3 XbaI/HindIII 절편을 pEE14로 클로닝하여 pSTOP를 제조하였다.

3. TM 영역에서의 야생형, pDTM 및 pSTOP 서열의 비교

gp 350 DNA 서열 및 아미노산 서열의 야생형, pDTM 및 pSTOP 3' 말단에서의 올리고뉴클레오티드 서열 및 해독된 아미노산 서열이 하기 표 2에 도시되어 있다.화살표는 야생형의 트랜스멤브레인 도메인(TM)의 출발 및 말단을 나타낸다. 트랜스멤브레인 도메인에서 오직 2개의 아미노산, Met₈₆₁및 Leu₈₆₂이 pDTM 및 pSTOP에 남아있다(도 1을 또한 참조할 수 있다.). pSTOP에서는 Leu₈₆₂의 바로 뒤에 중단 코돈이 있음을 명심해야 한다. pDTM에서는 결실된 트랜스멤브레인 영역의 이전 위치가 "△TM"으로 표시되어 있다. (표에서는, 천연 아미노산이 표시되어 있다.)

[표 2]

실시예 2

gp 350/220 유전자의 스플리스 공여 부위 및 스플리스 수용 부위를 제거한 pMDTM 및 pMSTOP의 제조

gp 350 단백질의 균질한 생성물을 수득하기 위해 gp 350/220 유전자 스플리스 부위의 매우 보존된 염기 및 보존된 염기를 변화시켰다. 모든 스플리스 부위에 100% 존재하는 매우 보존된 GT 염기쌍을 포함하여 4개의 염기를 스플리스 공여 부위에서 변화시켰다. 2개의 보존된 공여 부위 염기인 AA를 GT로 변화시켰다. 2개의 매우 보존된(변하지 않는) 스플리스 공여 부위 염기가 GT에서 CA로 변화되었다. 스플리스 수용 부위에서 매우 보존된 스플리스 수용 부위 염기들 중 오직 하나만을 변화시켜 아미노산 서열을 보존하였다. 제 2의 보존된 스플리스 수용 부위염기는 하기 표 3에 도시된 바와 같이 변화시켰다. 하기 표 3은 gp 350/220 유전자의 스플리스 공여 부위 및 스플리스 수용 부위에서의 염기 변화를 요약한 것이다.

[표 3]

EBV gp 350/220 유전자 스플리스 부위의 변화

올리고뉴클레오티드에 기준한 돌연변이에 의한 염기 변화는 돌연변이체 서열에서 *로 표지된다. 스플리싱이 실제로 일어나는 부위는 화살표로 표지되고 코딩된 아미노산이 도시된다. 아미노산 서열이 뉴클레오티드 치환의 결과로 변화하지 않았음을 명심해야 한다.

야생형 gp 350/220 스플리스 공여 부위 및 스플리스 수용 부위의 DNA 서열에 대한 이들 뉴클레오티드 치환은 올리고뉴클레오티드-매개된 돌연변이에 의해 수행되었다. 졸러(Zoller, M.E.) 및 스미스(Smith, M)의 문헌[Methods of Enzymol.,100:468(1983)]에 개시된 바와 같이 개질된 파지 벡터, M13TAC를 사용하여 돌연변이를 생성하였다. gp 350/220 뉴클레오티드 서열의 BamHI/XhoI 단편을 Asp718 및 XhoI 스티키 말단을 함유한 19염기쌍의 올리고뉴클레오티드 링커와 함께, 플라즈미드 M13TAC의 폴리링커상의 Asp718 및 BamHI 제한 부위를 사용하여 상기 폴리링커로 클로닝하였다. 실시예 1의 플라즈미드 M13DTM 및 M13STOP(도 2b)을 돌연변이에 이용하였다.

2개의 42량체 올리고뉴클레오티드인 Pr공여체 1 및 Pr수용체 1을 돌연변이에 이용하기 위해 제조하였다. 각각은 스플리스 공여 부위 또는 스플리스 수용 부위중의 하나에 중점을 두어 gp 350/220 유전자 서열에 상보되게 고안되었다. gp 350/220 유전자에 상보적이지 않은 올리고뉴클레오티드의 유일한 부분은 원하는 돌연변이를 나타내는 염기들이다. 돌연변이용 올리고뉴클레오티드는 하기로 구성되었다:

돌연변이용 올리고뉴클레오티드의 서열은 "프라이머"로 표시되는 반면, gp 350/220 유전자 스플리스 부위에 걸친 DNA 서열은 "EBV"로 표시되었다. 돌연변이의 결과로서 변화되었던 염기는 *로 표지된다. 빗금 선은 스플리싱 위치를 나타낸다.

올리고뉴클레오티드 Pr공여체 1 및 Pr수용체 1을 M13-DTM 및 M13-STOP의 단선 클론에 혼성화시켰다. T4 DNA 폴리머레이즈 완전 효소를 사용하여 이중 나선 M13 DNA를 제조하고, 이중 나선 DNA로 이. 콜라이를 형질전환시켰다. 벡터 M13TAC를 이용하여 원하는 돌연변이를 함유한 임의의 클론을 X-gal 및 이소티오프로필갈락테이트의 존재하에 백색에서 청색으로의 색변화에 의해 검증할 수 있었다. 청색 플라크를 따서 성장시키고 스플리싱 연결점을 가로질러 DNA 서열을 분석하여 최종 돌연변이 클론을 검증하고, M13-MDTM 및 M13-MSTOP으로 표지하였다.

원하는 돌연변이를 함유한 클론을 검증한 후에, BamHI/XhoI 단편을 M13-MDTM 및 M13-MSTOP에서 절단하여 다시 pDTM 또는 pSTOP 주쇄에 리게이션하여서 구축물 pMDTM 및 pMSTOP를 각각 제조하였다. 이들 구축물로 CHO 세포를 형질전환시켜 하기 실시예 3에서 개시된 바와 같이 스플리싱되지 않는 gp 350/220 변형체의 DNA 서열을 발현시켰다.

실시예 3

CHO 세포에서의 gp 350의 발현

1. gp 350/220 유전자 구축물의 형질감염

포유동물의 세포에서 본 발명의 균질한 gp 350 단백질을 다량으로 생산하는 방법은 이종 gp 350 DNA 서열의 여러 복사물을 함유하는 세포의 구축을 포함한다.이종 DNA 서열은 증식 표지(본 실시예에서는 세포가 메티오닌 설폭시민을 사용하여 증식할 수 있게 하는 글루타민 합성효소 유전자이다)에 작동가능하게 연결되었다.

글루타민 합성효소 유전자 증식 시스템에 대해 크로켓(Crockett)의 문헌[Bio/Technology,8:662(1990)]의 방법 및 셀테크 인스트럭션 매뉴얼(Celltech Instruction Manual)에서 개시된 바와 같이, 실시예 2에서 제조된 pMDTM 및 pMSTOP 벡터들로 하기에 개시된 바와 같은 CHO 세포를 형질감염시켰다.

CHO-K1 세포(ATCC CCR61)를 10% 송아지 태아 혈청, 100 units/㎖ 페니실린, 100 mg/㎖ 스트렙토마이신, MEM(개질된 이글스 배지), 불필수 아미노산 및 1mM 피루브산 나트륨(모두 JHR 바이오사이언시즈(JRH Biosciences)에서 구입)이 보충된 글루타민이 없는 EMEM(이글스 최소 필수 배지)에서 유지시켰다. 상기 배지에 또한 60 mg/㎖ 글루탐산, 60mg/㎖ 아스파라긴, 7mg/㎖ 아데노신, 7mg/㎖ 구아노신, 7mg/㎖ 시티딘, 7mg/㎖ 우리딘 및 2.4mg/㎖ 티미딘(모두 시그마(Sigma) 제품)을 보충하였다. 이 배지 제조물을 형질감염동안 이용하였고 명시된 바와 같이 이를 변형시켜 이용하였다.

형질감염시키기 하루전에 10cm 디쉬에 3× 10⁶의 CHO-K1 세포를 접종하였다. 형질감염시키는 날 세포를 1개의 디쉬당 10㎖의 무혈청 배지로 세척하였다. 플라즈미드 DNA(pMDTM, pMSTOP 플라즈미드로부터)를 종래의 기술을 사용하여 CaPO₄침전시켰다. 각각의 플라즈미드 DNA 침전물 10㎍을 CHO-K1 세포+ 2㎖의 무혈청 배지와 함께 37℃에서 4.5시간동안 배양하였다. 4개의 플라즈미드 DNA 형질감염물 각각의 복제물을 3개씩 제조하였다. 그런 다음 세포를 HEPES 완충된 염수중의 15% 글리세롤로 1.5분동안 쇼크를 주었다. 무혈청 배지로 세정한 다음 세포를 다시 혈청이 있는 배지에 주입하여 24시간동안 배양하였다.

그 다음날, 배지를 투석된 10% 송아지 태아 혈청(JRH 바이오사이언시즈)을 함유하도록 변화시켰고 25μM 메티오닌 설폭시민(시그마)을 첨가하여 증식시켰다. 증식된 클론이 수집될 수 있을 만큼 커질때까지 약 13 내지 14일 후까지 매 3일 내지 5일마다 세포에 메티오닌 설폭시민을 함유한 배지를 재공급하였다. 멸균된 200㎕의 피펫맨 팁(pipetman tip)으로 디쉬에서 콜로니를 긁어내어서 클론을 수집하고 메티오닌 설폭시민이 없는 배지중에서 96 웰 플레이트중의 한 웰로 이동시켰다. 1 내지 2일 후에 배지를 배지 + 25μM 메티오닌 설폭시민으로 교환하였다. 4일후에 배양물 상층액을 수확하고 하기에 개시된 바와 같이 ELISA 분석을 하여 단백질 생성물에 대해 분석하였다.

CHO 세포들을 또한 pEE14 대조군 벡터(EBV 서열을 함유하지 않은 벡터) 단독으로 형질감염시키고, CHO-pEE14의 24개의 클론을 또한 수집하여 플레이트로 이동시켜 대조군으로 이용하였다. (대조군 클론을 메티오닌 설폭시민에서의 생존을 기준으로 검증하였다.)

2. ELISA 분석

형질감염 후에, 241개 클론의 CHO-pMDTM 및 158개 클론의 CHO-pMSTOP을 수집하여 성장시켰다. 이들 클론으로부터 상층액을 gp 350 단백질 생성물에 대해 시험하였다. 96 웰 플레이트를 pH 9의 50mM 붕산 나트륨 완충용액에 1:2000으로 희석된친화성-정제된 토끼 항-gp 350/220 항체(항체 MDP1; 앤드류 모간(Andrew Morgan)의 선물)로 피복시켰다. 이 플레이트를 37℃에서 3 내지 4시간동안 항온처리하였고 넝크 이뮤노와셔(Nunc ImmunoWasher)를 사용하여 PBS+0.05% 트윈(Tween)20으로 3회 세척하였다. 블럿팅(blotting)을 건조시킨후, 플레이트를 PBS+0.01% 티머로살중의 2% BSA로 37℃에서 0.5시간동안 항온처리하고 다시 세척하여 차단시켰다. 형질감염된 세포 및 대조군 세포로부터의 상층액을 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간동안 항온처리하였다. 그런 다음 플레이트를 PBS 세척 완충용액에 1mg/㎖로 희석된 1차 탐지용 항체인 gp 350/220에 대한 마우스 단일클론 항체(항체 #C65221M; 바이오디자인 인터내셔날(Biodesign International))로 37℃에서 1시간동안 항온처리하였다. 세척한 후에, 플레이트를 PBS+0.05% BSA중의 2차 항체인 마우스의 면역글로불린에 대한 서양고추냉이 과산화효소-공액된 염소 F(ab)₂단편(인간 Ig에 흡착; 바이오소스 인터내셔날(Biosource International)) 0.7㎕/㎖ 및 0.01% 티머로살로 37℃에서 1시간동안 항온처리하였다. 플레이트를 세척하고 안정한 과산화물 기질 완충용액(피어스 케미칼즈(Pierce Chemicals))에 용해시킨 ABTS(피어스 케미칼즈)를 사용하여 실온에서 0.5시간동안 전개시켰다. 반응을 1% SDS로 중단시키고 플레이트를 몰레귤라 디바이시즈(Molecular Devices) Vmax ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 405 및 650nm에서 판독하였다. 24개의 pMDTM 및 18개의 pMSTOP 클론이 분비된 gp 350에 대해 양성으로 시험되었다. 가장 높은 ELISA 신호를 나타낸 클론을 규모를 키우기 위해 24 웰 플레이트로 이동시키고 웨스턴 블럿(Western Blot) 및 방사성면역침전 분석에 대해 더욱 시험하였다.

3. 웨스턴 블럿 및 방사성면역침전 분석

초기 스크리닝에서, pMDTM 형질감염체로부터의 조직 배양액 상층액을 웨스턴 블럿에서의 활성에 대해 분석하였다. CHO 세포 상층액을 5% SDS-PAGE 겔에서 정제하고, 니트로셀룰로즈로 하룻밤동안 이동시키고, 항-gp 350 항체로 탐색하였다. 웨스턴 블럿 분석에서 7개의 pMDTM 클론이 gp 350에 대해 양성인 것으로 발견되었다.

웨스턴 블럿에서 양성인 pMDTM 클론을 gp 220의 존재에 대해 방사성면역침전법으로 더욱 시험하였다. 선택된 형질전환된 pMDTM 세포, pEE14 대조군 및 GH3△19 대조군 세포(하기 개시됨)를 6 웰 플레이트상에서 하룻밤 성장시켜 이들은 시험하는 날에는 대략 3/4 콘플루언트(confluent) 상태였다. 각각의 웰은 약 5×10⁶세포를 함유하였다. 표지하기 위해서, 배지를 각각의 웰에서 제거하고 0.7㎖의 메티오닌이 없는 MEM(10% 송아지 태아 혈청) + 100μCi³⁵S-메티오닌으로 대체하였다. 세포를 37℃에서 5.5시간동안 배양한 후, 4000 rpm 에서 5분동안 원심분리하였다. 상층액에 있는 균질한 gp 350 단백질을 50% 슬러리인 10㎕의 세파로즈-단백질 A(시그마) 및 20㎕ 단일 클론 항-gp 350/220 (항체 #C65221M, 100 mg/㎖; 바이오디자인 인터내셔날)을 첨가하고 4℃에서 하룻밤 흔들어서 면역침전시켰다. 그런다음 혼합물을 마이크로원심분리기에서 실온에서 2분동안 2000 rpm에서 원심분리하여 펠렛으로 만들고 몇배의 인산염 완충용액의 염수로 4회 세척하였다. 최종 세척 후에, 모든 액체를 펠렛으로부터 제거하고 50㎕의 단백질 겔 시료 완충용액으로 대체하였다. 침전된 면역-착물을 함유한 시료를 5분간 끓인 후 5% SDS-PAGE에서 작동시켰다. 면역침전물을 단백질 시료 완충용액과 1:1로 혼합된 조직 배양액 상층액의 겔 시료와 비교하였다. 겔을 건조시키고 하이퍼필름(Hyperfilm) β-Max(아머샴(Amersham))로 방사선 사진을 찍었다.

도 3은 방사성면역침전물의 SDS-PAGE 분석한 방사선 사진의 결과를 나타낸다. 양성 대조군으로 사용된 세포주는 GH3△19(엘리어트 케이프(Elliot Keiff)의 선물; 왕(Whang) 등, 1987)를 사용하였다. GH3△19 세포는 트랜스멤브레인 도메인 및 C-말단 세포질 도메인이 없는 gp 350/220 단백질의 절단된 형태를 분비한다. 음성 대조군으로 사용하기 위해, CHO 세포를 pEE14 벡터 단독으로 형질감염시키고 pMDTM 형질간염과 같이 메티오닌 설폭시민으로 선택하였다. 도 3에서, 상층액("S")은 짝수 줄에서 도시되는 면역침전물("Ip")과 교대로 홀수 줄에서 도시된다. 대조군 줄 2에서, GH3△19 대조군 세포로부터의 침전물은 약 1:1의 비율로 절단된 스플리싱된 변형체 gp 350 및 gp 220 단백질의 생성을 나타내는 약 220 및 350kD에서 2개의 강한 단백질 밴드를 나타낸다. 예상한 바와 같이, 이들 면역침전된 밴드는 줄 1에서의 방사성표지된 조직 배양액 상층액(면역침전되지 않은 시료)에 대해서 농축되어 있다. 또한, 예상한 바와 같이, pEE14 벡터는 gp 350/220 구축물을 함유하지 않으므로, 음성 대조군(줄 4)에는 아무 밴드도 나타나지 않는다.

줄 6, 8 및 10의 pMDTM 클론의 상층액에서부터의 면역침전물의 SDS-PAGE 분석 결과는 줄 2의 GH3△19 대조군에서의 더 높은 분자량 종과 동일한 약 350kD에서 하나의 강한 밴드를 나타낸다. 그러나, GH3△19 대조군 줄과는 대조적으로, 비록줄 8에서는 약간 더작은 분자량으로 이동한 희미한 밴드가 나타나기는 했지만, 줄 6, 8 및 10에는 약 220kD에서 추가의 강한 밴드가 없다. 이는 분해된 생성물, 같이 침전되는 세포 생성물, 또는 잘못 해독되거나, 결실된 스플리스 공여 부위 및 스플리스 수용 부위를 천연 뉴클레오티드 또는 아미노산으로 돌려놓은 돌연변이에 의한 소량의 gp 220 단백질을 나타낼 수 있다. 약 350kD에서의 강한 단일 밴드는 시험한 5개의 다른 MDTM 복제물에서 발견되었다(자료는 도시되지 않음).

³⁵S 표지된 GH3△19 대조군 줄(2)에서는, 220kD에서의 밴드가 쉽게 나타나므로, 줄 6 및 10에서 220kD에서 밴드가 완전히 없는 것은 MDTM 상층액으로부터 불충분하게 침전되었기 때문은 아니다. 또한, 야생형 스플리스 부위를 함유하는 실시예 1의 pDTM 구축물을 사용한 추가의 분석은 350 및 220kD에서 2개의 강한 밴드를 나타낸다. 따라서, 이들 결과는 스플리스 부위의 결실이 gp 220 단백질을 생산하지 않으면서 gp 350 단백질을 생산함을 입증하는 것이다.

CHO 세포주, 또는 임의의 다른 포유동물 또는 포유동물이 아닌 세포주에서 발현된 이 균질한 gp 350 단백질은 더욱 다량으로 생산될 수 있으며. 이 균질한 gp 350 단백질은 렉틴-친화성 크로마토그래피, 역상 HPLC, FPLC, 겔 여과 등과 같은 기술을 포함한 당분야에 익숙한 방법을 사용하여 세포주로부터 콘디쇼닝된 (conditioned) 배지에서 단리 및 정제될 수 있다. 데이비드의 문헌[J. Immunol. Methods,108:231(1988)] 및 마데즈의 문헌[Vaccine,10:777(1992)]을 참조할 수 있다.

4. pMDTM 단백질의 노던 블럿 분석

본 실험에서 스플리스 부위의 돌연변이가 gp 220 생산을 방해한다는 것을 다른 면에서 확인하는 노던 블럿에 의해 MDTM-1 세포가 gp 350 RNA를 생성하지만 gp 220 RNA는 생성하지 않음을 알았다.

gp 350에 대해 상보적인 DNA 프로브(probe)는 pDTM에서 제조되었다. 실시예 1을 참조할 수 있다. gp 350/220 프로브 주형, XP464를 464 염기쌍 XhoI/PstI pDTM 단편으로서 단리하였다. XP464는 gp 350 및 gp 220 둘 모두를 인식한다. gp 350에 특이적인 프로브 AN537을 제조하기 위해 NcoI 및 NdeI으로 pDTM을 절단하고, 2개의 겹치는 580 염기쌍 단편을 단리하고, 이 혼합물을 XmnI으로 절단하여 하나의 오염 단편을 제거하고 AluI으로 절단하여 537 염기쌍의 AluI/NdeI 단편을 gp 350/220 스플리스 부위 내부에 생성시켰다. AN537은 gp 220에서 스플리싱되어 제거되는 영역에 특이성을 갖고 따라서 gp 350 메시지에 특이성을 갖는다. DNA 프로브를 XP464 및 AN537의 DNA 단편을 사용하여³²P-dCTP 닉(nick) 해독(아머샴)하여 표지시켰다.

세포 전체의 RNA는 실질적으로 콤지운스키(Chomczyunski) 및 사치(Sacchi)의 문헌[Anal. Biochem.,162:156-59(1987)]의 방법에 따라 제조되었다. 각각 CHO-pEE14(음성 대조군 세포주, 실시예 1 참조), CHO-MDTM-1 및 CHO-DTM-7 세포, 90% 콘플루언트 상태의 2개의 T-250 플라스크에서 배지를 흡인하고 세포를 용해시키고 변성 완충용액(10㎖의 4M 구아니딘 티오시아네이트, 25mM 시트르산 나트륨, pH 7, 0.5% 사코실, 100mM 2-머캅토에탄올)중으로 긁어냈다. 각각 10㎖의 용해물에 1㎖의2M 아세트산 나트륨(pH 4), 10㎖ 포화 페놀(pH 4.5) 및 2㎖의 클로로포름/이소아밀 알콜을 보충하고; 용해물을 얼음에서 15분간 항온처리하고 4℃에서 10000 × g에서 20분간 회전시켜서 상층의 수상을 제거하였다. 1배 부피의 이소프로판올을 20℃에서 1시간동안 첨가하여 수성상에서 RNA를 침전시키고, 4℃에서 펠렛으로 만든 후, 변성 완충용액에 재현탁시키고 재침전시켰다. RNA 펠렛을 70% 에탄올 1x로 세척하고 스피드-백(Speed-Vac)으로 건조시키고 DEPC-처리된 물에 재현탁시켰다.

DTM-7 및 MDTM-1 전체 세포의 RNA를 15% 포름아미드 및 6%의 포름알데히드로 65℃에서 15분간 변성시켜 1% 아가로즈/6.6% 포름알데히드 겔에서 전기영동시키고 모세관 현상으로 니트로셀룰로즈로 이동시키고 표지된 XP464 및 AN537로 탐색하였다. DNA 프로브를 5분간 끊여서 변성시키고 65℃에서 하룻밤동안 5x SSPE에서 혼성화시킨 후, 니트로셀룰로즈를 매우 엄격한 조건으로 세척하였다. 바이오-라드 포스포르이메이저(Bio-Rad phosphorimager)를 사용하여 방사선 사진을 찍었다.

CHO-MDTM 세포로부터의 총 세포 RNA의 노던 블럿은 gp 220 특이적 RNA 생산을 방해하는 스플리싱 돌연변이의 효과를 나타낸다. gp 350 특이적 프로브, AN 537은 gp 350 특이적 프로브에 대해 예상한 바와 같이 MDTM-1 및 DTM-7 세포에서 오직 한종의 RNA에만 결합한다(도 4, 줄 1 및 2). 스플리싱 돌연변이가 MDTM-1에서의 gp 220 메시지 생성을 방해할 때 예상되는 바와 같이, gp 350 및 gp 220 RNA 둘 모두에 대해 특이적인 XP464 프로브는 DTM-7에서 2가지 종류를 인식하고 MDTM-1에서는 더 높은 분자량의 밴드 하나만을 인식한다(도 4, 줄 4 및 3). 비록 MDTM-1 줄이 gp 350 특이적 RNA에 대해 과부하되더라도, 명확한 gp 220 RNA가 가시화되지 않았다.MDTM-1 대 DTM-7줄에서 gp 350 메시지의 겉보기 이동에서의 차이의 이유는 밝혀지지 않았다. MDTM-1 종이 DTM-7에 비해 과부하되었고, 이것이 아가로즈 겔에서의 이동에 영향을 미쳤을 수 있다. 또한 gp 350 메시지는 겔상에서 큰 리보좀 RNA 밴드에 매우 가깝게 이동하고, 이것이 겉보기 분자량을 변형시킬 수 있다. 어느쪽이던, gp 350 DNA 서열에 상보적인 단일 종의 존재는 이 신호가 gp 350 mRNA를 나타냄을 제안한다. 따라서, 노던 블럿에서 결정된 바와 같이, 스플리스 공여 부위 및 스플리스 수용 부위에서의 돌연변이는 gp 220 메시지의 생산을 방해하는데 효과적이다. 이 결과는 MDTM-1 및 DTM-7 상층액의 웨스턴 블럿에서뿐만 아니라, gp 350/220에 특이적인 단일클론 항체를 이용한 방사성면역침전법에 의해 더욱 확인된다.

실시예 4

면역원성 활성에 대한 균질한 gp 350 단백질의 시험

정제된 균질한 gp 350 단백질을 적절한 투여용 비히클에 혼입하고 하기와 같이 마우스에 투여한다.

2x 보조제/비히클 농축물을 데이비드의 문헌[J. Immunol. Methods,108:231(1988)] 및 알리슨(Allison)의 문헌[J. Immunol. Methods,95:157(1986)]의 방법에 따라, (Thr¹)MDP가 있는 인산염 완충 염수중의 0.4% (v/v) 트윈 80중의 플루로닉(Pluronic) L121 및 스쿠알란을 혼합하여 제조하였다.

투여용 조성물을 투여일에 같은 부피의 단백질과 보조제-비히클을 첨가하여 제조하였다. 단백질 함량은 투여량당 5㎍ 내지 50㎍의 범위이어야 한다.

BALB/c 마우스를 0, 21 및 42일째에 3회 0.1㎖를 근육내 주사하여 면역화시켰다. 각각 주사한지 10일 후에 예비-면역화된 혈액 및 이후의 혈액을 안와 후동에서 수득하였다.

혈청 항체 수준은 실시예 3에서 개시된 바와 같은 방법에 따른 ELISA에 의해 결정되었다. 혈청에서 EBV 중화 항체는 모스(Moss)의 문헌[J. Gen. Virol.,17:233(1972)] 및 드 쉬리버(De Schryver)의 문헌[Int. J. Cancer,13:353(1974)]의 방법에 따라, 시험관내에서의 EBV에 의한 태아 척수 혈액 림프구의 형질전환을 억제하는 능력에 의해 정량화된다.

다르게는, 뉴질랜드의 흰토끼에 0, 21, 42, 63 및 84일에 전술한 보조제에 유화된 단백질을 5회 근육내 투여하여 접종한다. 투여량은 접종 1회 당 약 5㎍ 내지 50㎍의 범위이어야만 한다. 마지막 투여후 2주일이 지난다음 혈청을 수득하고, 항원에 대한 항체의 적정량, B95-8 세포에서 바이러스의 gp 350/220에 대한 교차 반응 항체 및 에미니(Emini)의 문헌[Virology,166:387(1988)]의 방법에 따른 시험관내 EBV 중화 활성에 대해 시험한다.

EBV에 감염된 동물 모델에서 보호적 면역성을 유도하는 EBV gp 350/220 단백질의 능력은 이미 확립되었으므로(엡스타인의 문헌[Clin. Exp. Immunol,63:485(1986)]을 참조할 수 있다), 균질한 gp 350 단백질 조성물을 투여하여 유사한 양성 결과가 예상된다.

본원에서 언급된 모든 문헌의 명세서는 본원에 참고로 인용된다. 전술한 본 발명의 명세서는 이해를 돕기 위해 제공되었고, 본 발명의 범위 내에서의 개질이당분야에서 숙련된 이들에게 명확한 바와 같이, 그로부터 이해되거나 언급된 내용을 제한하는 것은 불필요하다.

Claims

엡스타인-바 바이러스(EBV) gp 350 단백질; 또는

(a) 생성물이 분비되도록 막에 걸쳐지는 영역(membrane spanning region)이 결실되거나, (b) 막에 걸쳐지는 영역 및 잔존하는 C 말단이 결실되거나, (c) 신호 서열이 결실되거나, (d) 막에 걸쳐지는 영역 및 신호 서열이 결실되거나, 또는 (e) 막에 걸쳐지는 영역, 잔존하는 C 말단 및 신호 서열이 결실된 EBV gp 350 단백질의 짧은 단편

을 코딩하고, gp 220 mRNA 트랜스크립트의 형성이 억제되도록 스플리스(splice) 부위 하나 이상이 돌연변이된 단리된 DNA 서열.
제 1 항에 있어서,

도 1a 내지 1d의 위치 501의 세린을 코딩하는 천연 뉴클레오티드 하나 이상이 비-천연 뉴클레오티드로 치환되고, 위치 698의 글리신을 코딩하는 천연 뉴클레오티드 하나 이상이 비-천연 뉴클레오티드로 치환된 뉴클레오티드 서열을 가짐을 특징으로 하는 DNA 서열.
제 1 항에 있어서,

균질한 gp 350 단백질로서, (a) 도 1a 내지 1d의 아미노산 19 내지 아미노산 862, (b) 도 1a 내지 1d의 아미노산 1 내지 아미노산 862, (c) 도 1a 내지 1d의 아미노산 19 내지 아미노산 862 및 아미노산 882 내지 아미노산 907, (d) 도 1a 내지 1d의 아미노산 1 내지 아미노산 862 및 아미노산 882 내지 아미노산 907, 및 (e) 도 1a 내지 1d의 트랜스멤브레인(transmembrane) 영역에서 8개 이상의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드가 결실된 아미노산 1 내지 아미노산 907로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩함을 특징으로 하는 DNA 서열.
제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 따른 DNA 서열을 포함하는 벡터.
DNA 서열의 복제 및 발현을 유도할 수 있는 발현 제어 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 따른 DNA 서열로 형질전환된, 인간세포를 제외한 숙주 세포 또는 인간세포주.
제 5 항의 인간세포를 제외한 숙주 세포 또는 인간세포주를 적합한 배양 배지에서 배양하고 이 세포로부터 균질한 gp 350 단백질을 단리함을 포함하는, 균질한 gp 350 단백질을 생산하는 방법.
제 6 항의 방법에 따라 생산되고, (a) 막에 걸쳐지는 영역이 결실되거나, (b) 막에 걸쳐지는 영역 및 잔존하는 C 말단이 결실되거나, 또는 (c) 막에 걸쳐지는 영역 및 신호 서열이 결실된 균질한 gp 350 단백질.
스플리스 공여 부위 및 스플리스 수용 부위를 코딩하는 천연 뉴클레오티드 하나 이상이, 이들 천연 뉴클레오티드(들)와는 상이하나 상기 공여 부위 및 수용 부위의 아미노산 서열은 보존하는 치환 뉴클레오티드(들)로 치환된 DNA 서열로부터 코딩되고, (a) 막에 걸쳐지는 영역이 결실되거나, (b) 막에 걸쳐지는 영역 및 잔존하는 C 말단이 결실되거나, 또는 (c) 막에 걸쳐지는 영역 및 신호 서열이 결실된 균질한 gp 350 단백질.
약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된 제 7 항 또는 제 8 항의 균질한 gp 350 단백질을 포함하는 엡스타인-바 바이러스(EBV)-관련 질병 또는 질환의 예방적 치료용 약학 조성물.