KR100263278B1 - Ａｌｖａｃ 카나리아폭스 바이러스 재조합체 및 그것의 사용 - Google Patents

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Abstract

증가된 안전성을 갖는 재조합체 폭스바이러스 특히 재조합체 카나리아폭스 바이러스 같은 변형된 벡터가 기술되었다. 변형된 재조합체 바이러스는 바이러스가 약독화된 병독성을 갖도록 그 안에 불활성화된 비필수 바이러스-암호화된 유전기능들을 가진다. 한 구체예에서는 병독성 인자를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 삭제시킴으로써 유전기능들이 불활성화되었다. 또 다른 구체예에서는 병독성 인자를 암호화하는 오픈 리딩프레임의 삽입적 불화성화에 의해 유전기능들이 불활성화 되었다. 또한 백신이 알려진 재조합체 바이러스 백신과 비교하여 증가된 수준의 안전성을 갖도록 그 안에 불활성화된 비필수 바이러스-암호화된 유전기능들을 가진 변형된 재조합체 바이러스를 포함하는 백신이 기술되었다.

Description

ＡＬＶＡＣ 카나리아폭스 바이러스 재조합체 및 그것의 사용{ALVAC Canarypox Virus Recombinants and uses thereof}
DNA SEQUENCE
＜110＞ VIROGENETICS CORPORATION
＜120＞ ALVAC CANARYPOX VIRUS RECOMBINANTS AND USES THEREOF
＜130＞ 1
＜150＞ US 666,056
＜151＞ 1991-03-07
＜150＞ US 713,967
＜151＞ 1991-06-11
＜150＞ US 847,951
＜151＞ 1992-03-06
＜160＞ 468
＜170＞ KOPATIN 1.5
＜210＞ 1
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 1 taattaacta gctacccggg 20
＜210＞ 2
＜211＞ 28
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 2 aattcccggg tagctagtta attacatg 28
＜210＞ 3
＜211＞ 73
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 3 agcttcccgg gtaagtaata cgtcaaggag aaaacgaaac gatctgtagt tagcggccgc 60 ctaattaact aat 73
＜210＞ 4
＜211＞ 69
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 4 attagttaat taggcggccg ctaactacag atcgtttcgt tttctccttg acgtattact 60 tacccggga 69
＜210＞ 5
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 5 ttagttaatt aggcggccgc 20
＜210＞ 6
＜211＞ 22
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 6 cgattactat gaaggatccg tt 22
＜210＞ 7
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 7 aacggatcct tcatagtaat 20
＜210＞ 8
＜211＞ 41
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 8 cgattactag atctgagctc cccgggctcg agggatccgt t 41
＜210＞ 9
＜211＞ 39
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 9 aacggatccc tcgagcccgg ggagctcaga tctagtaat 39
＜210＞ 10
＜211＞ 16
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 10 gatccgaatt ctagct 16
＜210＞ 11
＜211＞ 12
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 11 agctagaatt cg 12
＜210＞ 12
＜211＞ 75
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 12 tatgagtaac ttaactcttt tgttaattaa aagtatattc aaaaaataag ttatataaat 60 agatctgaat tcgtt 75
＜210＞ 13
＜211＞ 73
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 13 aacgaattca gatctattta tataacttat tttttgaata tacttttaat taacaaaaga 60 gttaagttac tca 73
＜210＞ 14
＜211＞ 49
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 14 aaaatgggcg tggattgtta actttatata acttattttt tgaatatac 49
＜210＞ 15
＜211＞ 67
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 15 acacgaatga ttttctaaag tatttggaaa gttttatagg tagttgatag aacaaaatac 60 ataattt 67
＜210＞ 16
＜211＞ 51
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 16 tctatcaact acctataaaa ctttccaaat actttagaaa atcattcgtg t 51
＜210＞ 17
＜211＞ 46
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 17 tgtaaaaata aatcactttt tatactaaga tctcccgggc tgcagc 46
＜210＞ 18
＜211＞ 66
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 18 ggccgctgca gcccgggaga tcttagtata aaaagtgatt tatttttaca aaattatgta 60 ttttgt 66
＜210＞ 19
＜211＞ 50
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 19 tttctgtata tttgcaccaa tttagatctt actcaaaata tgtaacaata 50
＜210＞ 20
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 20 tgtcatttaa cactatactc atattaataa aaataatatt tatt 44
＜210＞ 21
＜211＞ 72
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 21 gatcctgagt actttgtaat ataatgatat atattttcac tttatctcat ttgagaataa 60 aaagatctta gg 72
＜210＞ 22
＜211＞ 72
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 22 aattcctaag atctttttat tctcaaatga gataaagtga aaatatatat cattatatta 60 caaagtactc ag 72
＜210＞ 23
＜211＞ 72
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 23 gatccagatc tcccgggaaa aaaattattt aacttttcat taatagggat ttgacgtatg 60 tagcgtacta gg 72
＜210＞ 24
＜211＞ 72
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 24 aattcctagt acgcatcata cgtcaaatcc ctattaatga aaagttaaat aatttttttc 60 ccgggagatc tg 72
＜210＞ 25
＜211＞ 40
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 25 gggagatctc tcgagctgca gggcgccgga tcctttttct 40
＜210＞ 26
＜211＞ 40
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 26 agaaaaagga tccggcgccc tgcagctcga gagatctccc 40
＜210＞ 27
＜211＞ 59
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 27 cgatatccgt taagtttgta tcgtaatggg ctccagatct tctaccagga tcccggtac 59
＜210＞ 28
＜211＞ 55
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 28 cgggatcctg gtagaagatc tggagcccat tacgatacaa acttaacgga tatcg 55
＜210＞ 29
＜211＞ 17
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 29 aattcgagct ccccggg 17
＜210＞ 30
＜211＞ 13
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 30 cccggggagc tcg 13
＜210＞ 31
＜211＞ 26
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 31 ctttttataa aaagttaact acgtag 26
＜210＞ 32
＜211＞ 34
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 32 gatcctacgt agttaacttt ttataaaaag agct 34
＜210＞ 33
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 33 cttaactcag ctgactatcc 20
＜210＞ 34
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 34 tacgtagtta actttttata aaaatcatat ttttgtagtg gctc 44
＜210＞ 35
＜211＞ 67
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 35 aattcaggat cgttccttta ctagttgaga ttctcaagga tgatgggatt taatttttat 60 aagcttg 67
＜210＞ 36
＜211＞ 67
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 36 aattcaagct tataaaaatt aaatcccatc atccttgaga atctcaacta gtaaaggaac 60 gatcctg 67
＜210＞ 37
＜211＞ 68
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 37 ctagacactt tatgtttttt aatatccggt cttaaaagct tcccggggat ccttatacgg 60 ggaataat 68
＜210＞ 38
＜211＞ 65
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 38 attattcccc gtataaggat cccccgggaa gcttttaaga ccggatatta aaaaacataa 60 agtgt 65
＜210＞ 39
＜211＞ 5
＜212＞ PRT
＜213＞ Newcastle disease virus
＜400＞ 39 Arg Arg Gln Arg Arg 1 5
＜210＞ 40
＜211＞ 39
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 40 gactatccta cttcccttgg gatgggggtt atctttgta 39
＜210＞ 41
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 41 tatccgttaa gtttgtatcg taatgggtct caaggtgaac gtct 44
＜210＞ 42
＜211＞ 17
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 42 gatccattcc atggttg 17
＜210＞ 43
＜211＞ 16
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 43 tagcaaccat ggaatg 16
＜210＞ 44
＜211＞ 61
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 44 agcttgatat ccgttaagtt tgtatcgtaa tgcccgctgg tggcggtctt tggcgcgggc 60 c 61
＜210＞ 45
＜211＞ 53
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 45 cgcgccaaag accgccaacc agcgggatta cgatacaaac ttaacggata tca 53
＜210＞ 46
＜211＞ 14
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 46 cccagatctc cttg 14
＜210＞ 47
＜211＞ 22
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 47 gtacgggtct agaggaacct ag 22
＜210＞ 48
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 48 ggcactacca gcgcctcgag agcgaggacc ccgacgccct gtagaatttt tatcggccga 60 60
＜210＞ 49
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 49 agcttcggcc gataaaaatt ctacagggcg tcggggtcct cgctctcgag gcgtagtgcc 60 60
＜210＞ 50
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 50 agcttctgca gccatggcgt tcgg 24
＜210＞ 51
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 51 aattccgatc gccatggctg caga 24
＜210＞ 52
＜211＞ 33
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 52 gcgagcgagg ccatgcatcg tgcgaatggc ccc 33
＜210＞ 53
＜211＞ 37
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 53 ggggggacgc gcgggtctag aaggccccgc ctggcgg 37
＜210＞ 54
＜211＞ 29
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 54 atcatcggat ccggtggttt gccattccg 29
＜210＞ 55
＜211＞ 19
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 55 gattaaacct aaataattg 19
＜210＞ 56
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 56 gggctgaagc ttgcggccgc tcattagaca agcgaatgag ggac 44
＜210＞ 57
＜211＞ 61
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 57 agatctcccg ggctcgagta attaattaat ttttattaca ccagaaagac ggcttgagat 60 c 61
＜210＞ 58
＜211＞ 58
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 58 taattactga gcccgggaga tataatttaa tttaatttat ataactcatt ttttcccc 58
＜210＞ 59
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 59 tatctcgaat tcccgcggct ttaaatggac ggaactcttt tccc 44
＜210＞ 60
＜211＞ 46
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 60 taaagtcaat aaatttttat tgcggccgct accgagctcg aattcg 46
＜210＞ 61
＜211＞ 55
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 61 gcttgcatgc ctgcagatat ccgttaagtt tgtatcgtaa tggaggcagc cttgc 55
＜210＞ 62
＜211＞ 55
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 62 ccctacgccg agtcattacg atacaaactt aacggatatc agagtcgtac gtagg 55
＜210＞ 63
＜211＞ 51
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 63 ctggaaacac ttgggaattc aagcttcata aaaagggtta tagaagagtc c 51
＜210＞ 64
＜211＞ 36
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 64 acacagagca actgcagatc tcccgatttc ccctct 36
＜210＞ 65
＜211＞ 33
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 65 gggcaaagcc acaaaatatg caggatttct gcg 33
＜210＞ 66
＜211＞ 40
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 66 gccagggttt tcccagatct gataaaaacg acggccagtg 40
＜210＞ 67
＜211＞ 53
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 67 gggtcaaaat tgaaaatata taattacaat ataaaatgca gttgctctgt gtt 53
＜210＞ 68
＜211＞ 19
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 68 atggatcctt cagagacag 19
＜210＞ 69
＜211＞ 7
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 69 ctaatag 7
＜210＞ 70
＜211＞ 15
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 70 gatcctatta gagct 15
＜210＞ 71
＜211＞ 74
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 71 atccgttaag tttgtatcgt aatgcgcggg gggggcttga tttgcgcgct ggtcgtgggg 60 gcgctggtgg ccgc 74
＜210＞ 72
＜211＞ 72
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 72 ggccaccagc gcccccacga ccagcgcgca aatcaagccc cccccgcgca ttacgataca 60 aacttaacgg at 72
＜210＞ 73
＜211＞ 59
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 73 atccgttaag tttgtatcgt aatggccctt ggacgggtgg gcctagccgt gggcctgtg 59
＜210＞ 74
＜211＞ 56
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 74 aggcccacgg ctaggcccac ccgtccaagg gccattacga tacaaactta acggat 56
＜210＞ 75
＜211＞ 41
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 75 atccgttaag tttgtatcgt aatggggcgt ttgacctccg g 41
＜210＞ 76
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 76 cgccggaggt caaacgcccc attacgatac aaacttaacg gat 43
＜210＞ 77
＜211＞ 146
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 77 ggcagtaccc tggcggcgct ggtcatcggc ggtattgcgt tttgggtacg ccgccggcgc 60 tcagtggccc ccaagcgcct acgtctcccc cacatccggg atgacgacgc gcccccctcg 120 caccagccat tgttttacta gctgca 146
＜210＞ 78
＜211＞ 142
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 78 gctagtaaaa caatggctgg tgcgaggggg gcgcgtcgtc atcccggatg tgggggagac 60 gtaggcgctt gggggccact gagcgccggc ggcgtaccca aaacgcaata ccgccgatga 120 ccagcgccgc cagggtactg cc 142
＜210＞ 79
＜211＞ 10
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 79 tcgatctaga 10
＜210＞ 80
＜211＞ 10
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 80 agcttctaga 10
＜210＞ 81
＜211＞ 38
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 81 ctcgcgatat ccgttaagtt tgtatcgtaa tgcagtgg 38
＜210＞ 82
＜211＞ 46
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 82 aattccactg cattacgata caaacttaac ggatatcgcg aggtac 46
＜210＞ 83
＜211＞ 29
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 83 cccagatcta tcgattgcca tggggcaga 29
＜210＞ 84
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 84 tctgaaggct ggatccaact 20
＜210＞ 85
＜211＞ 17
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 85 caatcttctc gaggatt 17
＜210＞ 86
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 86 aacaagaaga accccgcc 18
＜210＞ 87
＜211＞ 1142
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The DNA sequence of the 13L promoter/S12/core gene.
＜400＞ 87 tacatcatgc agtggttaaa caaaaacatt tttattctca aatgagataa agtgaaaata 60 tatatcatta tattacaaag tacaattatt taggtttaat catgggaacg aacctatctg 120 ttcccaaccc acttggattt tttcctgatc atcagttaga ccctgctttc ggagccaact 180 caaacaatcc tgactgggat tttaaccccg tcaaagacga ttggcctgca gccaaccaag 240 taggtgtggg agctttcgga ccaaggctca ctcctccaca cggcggtata ttaggttggt 300 ctccacaagc tcaaggcata ttgaccacag tgtcaacaat tcctccacca gcctctacta 360 atcggcagtc tggtagacag ccaactccca tctctcctcc tctaagagac agtcacccac 420 aagctatgca gtggaattca actgcttttc accagacact tcaagaccct agagtcaggg 480 gtctatatct tcctgcaggt ggatctagtt ctggaactgt aaacccagct ccgaatattg 540 ccagtcacat ctcgtctatc tccgcgagga ctggagaccc agtgacgaac atggacatcg 600 acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct tctgacttct 660 ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa gccttagagt 720 ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt tgctgggggg 780 aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg ttaatttgga agatccagca tctagagacc 840 tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt caggcaactc ttgtggtttc 900 acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa ccgttataga gtatttggtg tctttcggag 960 tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta tcaacacttc 1020 cggaaactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc 1080 gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt 1140 ag 1142
＜210＞ 88
＜211＞ 51
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 88 gatctcaatc tcgggaatct caatgttaga taactaattt ttatcccggg t 51
＜210＞ 89
＜211＞ 51
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 89 aattacccgg gataaaaatt agttatctaa cattgagatt cccgagattg a 51
＜210＞ 90
＜211＞ 48
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 90 agcttgtaca attatttagg tttaatcatg ggaacgaacc tatctgtt 48
＜210＞ 91
＜211＞ 48
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 91 cccaacccac ttggattttt tcctgatcat cagttagacc ctgctttc 48
＜210＞ 92
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 92 ggagccaact caaacaatcc tgactgggat tttaaccccg tcaaagacga ttggcctgca 60 60
＜210＞ 93
＜211＞ 57
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 93 gccaaccaag taggtgtggg agctttcgga ccaaggctca ctcctccaca cggcggt 57
＜210＞ 94
＜211＞ 53
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 94 atattaggtt ggtctccaca agctcaaggc atattgacca cagtgtcaac ccg 53
＜210＞ 95
＜211＞ 48
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 95 agcttgtcaa caattcctcc accagcctct actaatcggc agtctggt 48
＜210＞ 96
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 96 agacagccaa ctcccatctc tcctcctcta agagacagtc acccacaagc tatgcagtgg 60 60
＜210＞ 97
＜211＞ 71
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 97 agcttgggaa ttcaactgct tttcaccaga cacttcaaga ccctagagtc aggggtctat 60 atcttcctgc a 71
＜210＞ 98
＜211＞ 56
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 98 ggtggatcta gttctggaac tgtaaaccca gctccgaata ttgccagtca catctc 56
＜210＞ 99
＜211＞ 45
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 99 gtctatctcc gcgaggactg gagacccagt gacgaacatg gacat 45
＜210＞ 100
＜211＞ 40
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 100 ccccccaagc ttcccgggct acatcatgca gtggttaaac 40
＜210＞ 101
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 101 actttgtaat ataatgat 18
＜210＞ 102
＜211＞ 49
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 102 aattcagatc tcaaaattga aaatatataa ttacaatata aaatggggc 49
＜210＞ 103
＜211＞ 49
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 103 ttctgcccca ttttatattg taattatata ttttcaattt tgagatctg 49
＜210＞ 104
＜211＞ 50
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 104 agaatctttc caccagcaat cctctgggat tctttcccga ccaccagttg 50
＜210＞ 105
＜211＞ 50
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 105 gatccaactg gtggtcggga aagaatccca gaggattgct ggtggaaaga 50
＜210＞ 106
＜211＞ 29
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 106 gcttcccggg aattctagct agctagttt 29
＜210＞ 107
＜211＞ 46
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 107 actctcaaaa gcttcccggg aattctagct agctagtttt tataaa 46
＜210＞ 108
＜211＞ 50
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 108 gatctttata aaaactagct agctagaatt cccgggaagc ttttgagagt 50
＜210＞ 109
＜211＞ 71
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 109 ctgaaattat ttcattatcg cgatatccgt taagtttgta tcgtaatggt tcctcaggct 60 ctcctgtttg t 71
＜210＞ 110
＜211＞ 48
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 110 cattacgata caaacttaac ggatatcgcg ataatgaaat aatttcag 48
＜210＞ 111
＜211＞ 73
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 111 accccttctg gtttttccgt tgtgttttgg gaaattccct atttacacga tcccagacaa 60 gcttagatct cag 73
＜210＞ 112
＜211＞ 51
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 112 ctgagatcta agcttgtctg ggatcgtgta aatagggaat ttcccaaaac a 51
＜210＞ 113
＜211＞ 45
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 113 caacggaaaa accagaaggg gtacaaacag gagagcctga ggaac 45
＜210＞ 114
＜211＞ 34
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 114 tcgagcccgg gatgactaaa aaaccaggag ggcc 34
＜210＞ 115
＜211＞ 26
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 115 ctcctggttt tttagtcatc ccgggc 26
＜210＞ 116
＜211＞ 22
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 116 cttgattttt attgacggcc ga 22
＜210＞ 117
＜211＞ 30
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 117 agcttcggcc gtcaataaaa atcaagcatg 30
＜210＞ 118
＜211＞ 91
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 118 gggatgggcg ttaacgcacg agaccgatca attgctttgg ccttcttagc cacaggaggt 60 gtgctcgtgt tcttagcgac caatgtgcat g 91
＜210＞ 119
＜211＞ 87
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 119 cacattggtc gctaagaaca cgagcacacc tcctgtggct aagaaggcca aagcaattga 60 tcggtctcgt gcgttaacgc ccatccc 87
＜210＞ 120
＜211＞ 128
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 120 agcttcttta ttctatactt aaaaagtgaa aataaataca aaggttcttg agggttgtgt 60 taaattgaaa gcgagaaata atcataaatt atttcattat cgcgatatcc gttaagtttg 120 tatcgtac 128
＜210＞ 121
＜211＞ 128
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 121 tcgagtacga tacaaactta acggatatcg cgataatgaa ataatttatg attatttctc 60 gctttcaatt taacacaacc ctcaagaacc tttgtattta ttttcacttt ttaagtatag 120 aataaaga 128
＜210＞ 122
＜211＞ 13
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 122 ttcttcttct tgt 13
＜210＞ 123
＜211＞ 69
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 123 agcttctcga gcatcgatta ctatgtctgg tcgtaaagct cagggaaaaa ccctgggcgt 60 caatatggt 69
＜210＞ 124
＜211＞ 65
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 124 accatattga cgcccagggt ttttccctga gctttacgac cagacatagt aatcgatgct 60 cgaga 65
＜210＞ 125
＜211＞ 22
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 125 ctagatgatt tttatcggcc ga 22
＜210＞ 126
＜211＞ 22
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 126 agcttcggcc gataaaaatc at 22
＜210＞ 127
＜211＞ 64
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 127 agcttcccgg gatgctcctc atgctgctgc ccacagccct ggcgttccat ctgaccaccc 60 gagt 64
＜210＞ 128
＜211＞ 64
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 128 ctagactcgg gtggtcagat ggaacgccag ggctgtgggc agcagcatga ggagcatccc 60 ggga 64
＜210＞ 129
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 129 agctgatatc cgttaagttt gtatcgtaat gaacaggagg aaaa 44
＜210＞ 130
＜211＞ 45
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 130 gatcttttcc tcctgttcat tacgatacaa acttaacgga tatca 45
＜210＞ 131
＜211＞ 38
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 131 ttcccaagct tgtcgacgat aatatggatc ctcatgac 38
＜210＞ 132
＜211＞ 32
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 132 ttcccagatc tatgagtata gtgttaaatg ac 32
＜210＞ 133
＜211＞ 26
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 133 gatccttgtt aacccgatat cccggg 26
＜210＞ 134
＜211＞ 26
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 134 aattcccggg atatcgggtt aacaag 26
＜210＞ 135
＜211＞ 50
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 135 tcgagaattc ccgggtcaaa attgaaaata tataattaca atataaaata 50
＜210＞ 136
＜211＞ 50
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 136 gatctatttt atattgtaat tatatatttt caattttgac ccgggaattc 50
＜210＞ 137
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 137 atggtagaaa ttaattgtac 20
＜210＞ 138
＜211＞ 42
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 138 atcatcgaat tcaagcttat tattttgctc tactaatgtt ac 42
＜210＞ 139
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 139 atgaatgtga cagaaaattt taacatgtgg aaaaatgtag aaattaattg tacaagaccc 60 60
＜210＞ 140
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 140 gggtcttgta caattaattt ctacattttt ccacatgtta aaattttctg tcacattcat 60 60
＜210＞ 141
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 141 agtaatgtga cagaaaattt taac 24
＜210＞ 142
＜211＞ 31
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 142 aggcaagctt tcaaaaaaat ataaatgatt c 31
＜210＞ 143
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 143 tttatattgt aattatatat tttc 24
＜210＞ 144
＜211＞ 37
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 144 gttttaattg tggaggggaa ttcttctact gtaattc 37
＜210＞ 145
＜211＞ 37
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 145 atcatctcta gaataaaaat tatagcaaaa tcctttc 37
＜210＞ 146
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 146 tgctactcct aatggttc 18
＜210＞ 147
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 147 catatgcttt agcatctgat g 21
＜210＞ 148
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 148 atgaaagagc agaagacagt g 21
＜210＞ 149
＜211＞ 29
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 149 atcatcggta ccgattcttt attctatac 29
＜210＞ 150
＜211＞ 19
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 150 tacgatacaa acttaacgg 19
＜210＞ 151
＜211＞ 37
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 151 gaattacagt agaagaattc ccctccacaa ttaaaac 37
＜210＞ 152
＜211＞ 19
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 152 caatagataa tgatactac 19
＜210＞ 153
＜211＞ 34
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 153 gtattatatc aagtttatat aataatgcat attc 34
＜210＞ 154
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 154 gttgatgatc tgtagtgc 18
＜210＞ 155
＜211＞ 58
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 155 atcatctcta gaataaaaat tatggttcaa tttttactac ttttatatta tatatttc 58
＜210＞ 156
＜211＞ 23
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 156 caataatctt taagcaaatc ctc 23
＜210＞ 157
＜211＞ 27
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 157 agaggggaat tcttctactg caataca 27
＜210＞ 158
＜211＞ 17
＜212＞ PRT
＜213＞ Newcastle disease virus
＜400＞ 158 Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln 1 5 10 15 Leu
＜210＞ 159
＜211＞ 29
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 159 ttggaaaggc ttttggcatg ccacgcgtc 29
＜210＞ 160
＜211＞ 42
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 160 acagtctggg gcatcaagca gctagggatt tggggttgct ct 42
＜210＞ 161
＜211＞ 40
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 161 ccgttaagtt tgtatcgtaa tgaaagtgaa ggggaccagg 40
＜210＞ 162
＜211＞ 54
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 162 atgagtggta aaattcagct gcttgttgcc tttctgctaa ctagtgcttg ctta 54
＜210＞ 163
＜211＞ 54
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 163 taagcaagca ctagttagca gaaaggcaac aagcagctga attttaccac tcat 54
＜210＞ 164
＜211＞ 29
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 164 atcatcaagc ttgattcttt attctatac 29
＜210＞ 165
＜211＞ 39
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 165 cagctgaatt ttaccactca ttacgataca aacttaacg 39
＜210＞ 166
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 166 taagcaagca ctagttag 18
＜210＞ 167
＜211＞ 17
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 167 ccgcctcttg accagac 17
＜210＞ 168
＜211＞ 39
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 168 atcatctcta gaataaaaat tacaggaggg caatttctg 39
＜210＞ 169
＜211＞ 40
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 169 atcatctcta gaataaaaat tatctcttat gtctccctgg 40
＜210＞ 170
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 170 aattaacttt acagcacc 18
＜210＞ 171
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 171 cgatatccgt taagtttgta tcgtaatggg atgtcttggg aatc 44
＜210＞ 172
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 172 caaggcttta ttgaggtctc 20
＜210＞ 173
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 173 cctggccttg gcagatag 18
＜210＞ 174
＜211＞ 58
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 174 atcatcgaat tcaaaaatat tacaaagagc gtgagctcaa gtccttgcct aatcctcc 58
＜210＞ 175
＜211＞ 26
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 175 ccccccaagc tttttattct atactt 26
＜210＞ 176
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 176 caaggcttta ttgaggtctc 20
＜210＞ 177
＜211＞ 29
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 177 cagttggtac cactggtatt ttatttcag 29
＜210＞ 178
＜211＞ 61
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 178 tatctgaatt cctgcagccc gggtttttat agctaattag tcaaatgtga gttaatatta 60 g 61
＜210＞ 179
＜211＞ 66
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 179 tcgctgaatt cgatatcaag cttatcgatt tttatgacta gttaatcaaa taaaaagcat 60 acaagc 66
＜210＞ 180
＜211＞ 30
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 180 ttatcgagct ctgtaacatc agtatctaac 30
＜210＞ 181
＜211＞ 70
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 181 tcgagtgaga taaagtgaaa atatatatca ttatattaca agtacaatta tttaggttta 60 atcatgggcg 70
＜210＞ 182
＜211＞ 65
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 182 cccatgatta aacctaaata attgtacttt gtaatataat gctatatatt ttcactttat 60 ctcac 65
＜210＞ 183
＜211＞ 16
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 183 aatcagagag caggct 16
＜210＞ 184
＜211＞ 23
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 184 ttggatccct atgccacctc tct 23
＜210＞ 185
＜211＞ 56
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 185 agaccaacag caccatctag cggcagagga ggaaattact aatttttatt ctagag 56
＜210＞ 186
＜211＞ 58
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 186 gatcctctag aataaaaatt agtaatttcc tcctctgccg ctagatggtg ctgttggt 58
＜210＞ 187
＜211＞ 79
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 187 tagacaaaat tgaaaatata taattacaat ataaaatgcc agtacaacaa ataggtggta 60 actatgtcca cctgccatt 79
＜210＞ 188
＜211＞ 80
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 188 gcttaatggc aggtggacat agttaccacc tatttgttgt actggcattt tatattgtaa 60 ttatatattt tcaattttgt 80
＜210＞ 189
＜211＞ 16
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 189 tggatgtaca gacaac 16
＜210＞ 190
＜211＞ 33
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 190 aaggatccga attcttacat taatctagcc ttc 33
＜210＞ 191
＜211＞ 68
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 191 ctagacactt tatgtttttt aatatccggt cttaaaagct tcccggggat ccttatacgg 60 ggaataat 68
＜210＞ 192
＜211＞ 65
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 192 attattcccc gtataaggat cccccgggaa gcttttaaga ccggatatta aaaaacataa 60 agtgt 65
＜210＞ 193
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 193 tcattatcgc gatatccgtg ttaactagct agctaatttt tattcccggg atccttatca 60 60
＜210＞ 194
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 194 gtataaggat cccgggaata aaaattagct agctagttaa cacggatatc gcgataatga 60 60
＜210＞ 195
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 195 gacaatctaa gtcctatatt agac 24
＜210＞ 196
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 196 ggatttttag gtagacac 18
＜210＞ 197
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 197 tcatcgtctt catcatcg 18
＜210＞ 198
＜211＞ 29
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 198 gtcttaaact tattgtaagg gtatacctg 29
＜210＞ 199
＜211＞ 61
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 199 aacgattagt tagttactaa aagcttgctg cagcccgggt tttttattag tttagttagt 60 c 61
＜210＞ 200
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 200 gactaactaa ctaataaaaa acccgggctg cagcaagctt tttgtaacta actaatcgtt 60 60
＜210＞ 201
＜211＞ 99
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 201 gcacggaaca aagcttatcg cgatatccgt taagtttgta tcgtaatgct atcaatcacg 60 attctgttcc tgctcatagc agagggctca tctcagaat 99
＜210＞ 202
＜211＞ 99
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 202 attctgagat gagccctctg ctatgagcag gaacagaatc gtgattgata gcattacgat 60 acaaacttaa cggatatcgc gataagcttt gttccgtgc 99
＜210＞ 203
＜211＞ 66
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 203 gaaaaattta aagtcgacct gttttgttga gttgtttgcg tggtaaccaa tgcaaatctg 60 gtcact 66
＜210＞ 204
＜211＞ 66
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 204 tctagcaaga ctgactattg caaaaagaag cactatttcc tccattacga tacaaactta 60 acggat 66
＜210＞ 205
＜211＞ 87
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 205 atccgttaag tttgtatcgt aatggaggaa atagtgcttc tttttgcaat agtcagtctt 60 gctagaagtg accagatttg cattggt 87
＜210＞ 206
＜211＞ 49
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 206 taccacgcaa acaactcaac aaaacaggtc gactttaaat ttttctgca 49
＜210＞ 207
＜211＞ 132
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 207 gtacaggtcg acaagcttcc cgggtatcgc gatatccgtt aagtttgtat cgtaatgaat 60 actcaaattc taatactcac tcttgtggca gccattcaca caaatgcaga caaaatctgc 120 cttggacatc at 132
＜210＞ 208
＜211＞ 132
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 208 atgatgtcca aggcagattt tgtctgcatt tgtgtgaatg gctgccacaa gagtgagtat 60 tagaatttga gtattcatta cgatacaaac ttaacggata tcgcgatacc cgggaagctt 120 gtcgacctgt ac 132
＜210＞ 209
＜211＞ 51
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 209 ataacatgcg gtgcaccatt tgtatataag ttaacgaatt ccaagtcaag c 51
＜210＞ 210
＜211＞ 51
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 210 gcttgacttg gaattcgtta acttatatac aaatggtgca ccgcatgtta t 51
＜210＞ 211
＜211＞ 72
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 211 gatcagaaaa actagctagc tagtacgtag ttaacgtcga cctgcagaag cttctagcta 60 gctagttttt at 72
＜210＞ 212
＜211＞ 72
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 212 agctataaaa actagctagc tagaagcttc tgcaggtcga cgttaactac gtactagcta 60 gctagttttt ct 72
＜210＞ 213
＜211＞ 970
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This DNA sequence of the synthetic spsAg gene and modified synthe tic vaccinia virus H6 early/late promoter.
＜400＞ 213 ttctttattc tatacttaaa aagtgaaaat aaatacaaag gttcttgagg gttgtgttaa 60 attgaaagcg agaaataatc ataaattatt tcattatcgc gatatccgtt aagtttgtat 120 cgtaatgcag tggaattcta ctacttttca ccaaacttta caagatccta gagtaagagg 180 attatatttt cctgctggag gatcttcttc tggagctgta aatcctgtac ctactactgc 240 ttctccttta tcttctattt ttagtagaat tggagatcct gctttaaata tggaaaatat 300 tacttctgga tttttaggac ctttattagt attacaagct ggattctttc tattaactag 360 aattttaact attcctcaat ctctagattc ttggtggact tctttaaatt ttttaggagg 420 aactactgtt tgtttaggac aaaattctca atctcctact tctaatcact ctcctacttc 480 ttgtcctcct acttgtcctg gatatcgttg gatgtgttta agaagattta ttattttctt 540 atttatttta ttattgtgtt taattttctt attagtatta ttagattatc aaggaatgtt 600 acctgtttgt cctttaattc ctggatcctc tactacttct actggacctt gtagaacttg 660 tatgactact gctcaaggaa cttctatgta tccttcttgt tgttgtacta aaccttctga 720 cggaaattgt acttgtattc ctattccttc ttcttgggct tttggaaaat tcttgtggga 780 gtgggcttct gctagatttt cttggttatc tttattagta ccttttgtac agtggtttgt 840 aggattatct cctactgttt ggttatctgt aatttggatg atgtggtatt ggggaccttc 900 tttatattct attttatctc cttttttacc tttattacct attttctttt gtttgtgggt 960 atatatttaa 970
＜210＞ 214
＜211＞ 281
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The predicted amino acid sequence of the DNA sequence of SEQ ID N o.213.
＜400＞ 214 Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg 1 5 10 15 Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala Val 20 25 30 Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg 35 40 45 Ile Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu 50 55 60 Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile 65 70 75 80 Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe 85 90 95 Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr 100 105 110 Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg 115 120 125 Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu 130 135 140 Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro 145 150 155 160 Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys 165 170 175 Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys 180 185 190 Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro 195 200 205 Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg 210 215 220 Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly 225 230 235 240 Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp 245 250 255 Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro 260 265 270 Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile 275 280
＜210＞ 215
＜211＞ 1285
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This DNA sequence of the u promtoer/lpsAg gene
＜400＞ 215 gtagactgtt tatacaagat tgaaaatata tttcttttta ttgagtggtg gtagttacgg 60 atatctaata ttaatattag actatctcta tcgtcacaca acaaaatcga ttgccatggg 120 gcagaatctt tccaccagca atcctctggg attctttccc gaccaccagt tggatccagc 180 cttcagagca aacaacgcaa atccagattg ggacttcaat cccaacaagg acacctggcc 240 agacgccaac aaggtaggag ctggagcatt cgggctgggt ttcaccccac cgcacggagg 300 ccttttgggg tggagccctc aggctcaggg catactacaa actttgccag caaatccgcc 360 tcctgcctcc accaatcgcc agacaggaag gcagcctacc ccgctgtctc cacctttgag 420 aaacactcat cctcaggcca tgcagtggaa ttccacaacc tttcaccaaa ctctgcaaga 480 tcccagagtg agaggcctgt atttccctgc tggtggctcc agttcaggag cagtaaaccc 540 tgttccgact actgcctctc ccttatcgtc aatcttctcg aggattgggg accctgcgct 600 gaacatggag aacatcacat caggattcct aggacccctt ctcgtgttac aggcggggtt 660 cttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc gcagagtcta gactcgtggt ggacttctct 720 caattttcta gggggaacta ccgtgtgtct tggccaaaat tcgcagttcc caacctccaa 780 tcactcacca acctcctgtc ctccaacttg tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg 840 ttttatcatc ttcctcttca tcctgctgct atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga 900 ctatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct aattccagga tcctcaacca ccagcacggg 960 accatgccga acctgcatga ctactgctca aggaacctct atgtatccct cctgttgctg 1020 taccaaacct tcggacggaa attgcacctg tattcccatc ccatcatcct gggctttcgg 1080 aaaattccta tgggagtggg cctcagcccg tttctcctgg ctcagtttac tagtgccatt 1140 tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac tgtttggctt tcagttatat ggatgatgtg 1200 gtattggggg ccaagtctgt acagcatctt gagtcccttt ttaccgctgt taccaatttt 1260 cttttgtctt tgggtataca tttaa 1285
＜210＞ 216
＜211＞ 389
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The predicted amino acid sequence of the DNA sequence of SEQ ID N o.213.
＜400＞ 216 Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp 1 5 10 15 His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Asn Ala Asn Pro Asp Trp 20 25 30 Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly 35 40 45 Ala Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu 50 55 60 Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr Leu Pro Ala Asn 65 70 75 80 Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Thr Gly Arg Gln Pro Thr Pro 85 90 95 Leu Ser Pro Pro Leu Arg Asn Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn 100 105 110 Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu 115 120 125 Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala Val Asn Pro Val Pro 130 135 140 Thr Thr Ala Ser Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro 145 150 155 160 Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu 165 170 175 Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro 180 185 190 Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr 195 200 205 Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser 210 215 220 Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu 225 230 235 240 Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe 245 250 255 Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu 260 265 270 Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met 275 280 285 Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys 290 295 300 Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala 305 310 315 320 Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu 325 330 335 Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr 340 345 350 Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu 355 360 365 Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys 370 375 380 Leu Trp Val Tyr Ile 385
＜210＞ 217
＜211＞ 346
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The predicted amino acid sequence of the DNA sequence of SEQ ID N o. 87.
＜400＞ 217 Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp 1 5 10 15 His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp 20 25 30 Asp Phe Asn Pro Val Lys Asp Asp Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly 35 40 45 Val Gly Ala Phe Gly Pro Arg Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu 50 55 60 Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile 65 70 75 80 Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro 85 90 95 Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn 100 105 110 Ser Thr Ala Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu 115 120 125 Tyr Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro 130 135 140 Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro 145 150 155 160 Val Thr Asn Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val 165 170 175 Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp 180 185 190 Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro 195 200 205 Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys 210 215 220 Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu 225 230 235 240 Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met 245 250 255 Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr 260 265 270 Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp 275 280 285 Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser 290 295 300 Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg 305 310 315 320 Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg 325 330 335 Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 340 345
＜210＞ 218
＜211＞ 1201
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The DNA sequence of the EPV 42 Dka promoter/lpsAg gene
＜400＞ 218 caaaattgaa aatatataat tacaatataa aatggggcag aatctttcca ccagcaatcc 60 tctgggattc tttcccgacc accagttgga tccagccttc agagcaaaca acgcaaatcc 120 agattgggac ttcaatccca acaaggacac ctggccagac gccaacaagg taggagctgg 180 agcattcggg ctgggtttca ccccaccgca cggaggcctt ttggggtgga gccctcaggc 240 tcagggcata ctacaaactt tgccagcaaa tccgcctcct gcctccacca atcgccagac 300 aggaaggcag cctaccccgc tgtctccacc tttgagaaac actcatcctc aggccatgca 360 gtggaattcc acaacctttc accaaactct gcaagatccc agagtgagag gcctgtattt 420 ccctgctggt ggctccagtt caggagcagt aaaccctgtt ccgactactg cctctccctt 480 atcgtcaatc ttctcgagga ttggggaccc tgcgctgaac atggagaaca tcacatcagg 540 attcctagga ccccttctcg tgttacaggc ggggttcttc ttgttgacaa gaatcctcac 600 aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat tttctagggg gaactaccgt 660 gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac tcaccaacct cctgtcctcc 720 aacttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt atcatcttcc tcttcatcct 780 gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat caaggtatgt tgcccgtttg 840 tcctctaatt ccaggatcct caaccaccag cacgggacca tgccgaacct gcatgactac 900 tgctcaagga acctctatgt atccctcctg ttgctgtacc aaaccttcgg acggaaattg 960 cacctgtatt cccatcccat catcctgggc tttcggaaaa ttcctatggg agtgggcctc 1020 agcccgtttc tcctggctca gtttactagt gccatttgtt cagtggttcg tagggctttc 1080 ccccactgtt tggctttcag ttatatggat gatgtggtat tgggggccaa gtctgtacag 1140 catcttgagt ccctttttac cgctgttacc aattttcttt tgtctttggg tatacattta 1200 a 1201
＜210＞ 219
＜211＞ 389
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The predicted amino acid sequence of the DNA sequence of SEO ID N o. 219.
＜400＞ 219 Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp 1 5 10 15 His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Asn Ala Asn Pro Asp Trp 20 25 30 Asn Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly 35 40 45 Ala Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu 50 55 60 Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr Leu Pro Ala Asn 65 70 75 80 Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Thr Gly Arg Gln Pro Thr Pro 85 90 95 Leu Ser Pro Pro Leu Arg Asn Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn 100 105 110 Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu 115 120 125 Thr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala Val Asn Pro Val Pro 130 135 140 Thr Thr Ala Ser Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro 145 150 155 160 Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu 165 170 175 Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro 180 185 190 Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr 195 200 205 Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser 210 215 220 Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu 225 230 235 240 Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe 245 250 255 Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu 260 265 270 Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met 275 280 285 Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys 290 295 300 Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala 305 310 315 320 Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu 325 330 335 Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr 340 345 350 Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu 355 360 365 Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys 370 375 380 Leu Trp Val Tyr Ile 385
＜210＞ 220
＜211＞ 3209
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The DNA sequence of a canarypox PvuII fragment containing the C5 ORF.
＜400＞ 220 tgaatgttaa atgttatact ttggatgaag ctataaatat gcattggaaa aataatccat 60 ttaaagaaag gattcaaata ctacaaaacc taagcgataa tatgttaact aagcttattc 120 ttaacgacgc tttaaatata cacaaataaa cataattttt gtataaccta acaaataact 180 aaaacataaa aataataaaa ggaaatgtaa tatcgtaatt attttactca ggaatggggt 240 taaatattta tatcacgtgt atatctatac tgttatcgta tactctttac aattactatt 300 acgaatatgc aagagataat aagattacgt atttaagaga atcttgtcat gataattggg 360 tacgacatag tgataaatgc tatttcgcat cgttacataa agtcagttgg aaagatggat 420 ttgacagatg taacttaata ggtgcaaaaa tgttaaataa cagcattcta tcggaagata 480 ggataccagt tatattatac aaaaatcact ggttggataa aacagattct gcaatattcg 540 taaaagatga agattactgc gaatttgtaa actatgacaa taaaaagcca tttatctcaa 600 cgacatcgtg taattcttcc atgttttatg tatgtgtttc agatattatg agattactat 660 aaactttttg tatacttata ttccgtaaac tatattaatc atgaagaaaa tgaaaaagta 720 tagaagctgt tcacgagcgg ttgttgaaaa caacaaaatt atacattcaa gatggcttac 780 atatacgtct gtgaggctat catggataat gacaatgcat ctctaaatag gtttttggac 840 aatggattcg accctaacac ggaatatggt actctacaat ctcctcttga aatggctgta 900 atgttcaaga ataccgaggc tataaaaatc ttgatgaggt atggagctaa acctgtagtt 960 actgaatgca caacttcttg tctgcatgat gcggtgttga gagacgacta caaaatagtg 1020 aaagatctgt tgaagaataa ctatgtaaac aatgttcttt acagcggagg ctttactcct 1080 ttgtgtttgg cagcttacct taacaaagtt aatttggtta aacttctatt ggctcattcg 1140 gcggatgtag atatttcaaa cacggatcgg ttaactcctc tacatatagc cgtatcaaat 1200 aaaaatttaa caatggttaa acttctattg aacaaaggtg ctgatactga cttgctggat 1260 aacatgggac gtactccttt aatgatcgct gtacaatctg gaaatattga aatatgtagc 1320 acactactta aaaaaaataa aatgtccaga actgggaaaa attgatcttg ccagctgtaa 1380 ttcatggtag aaaagaagtg ctcaggctac ttttcaacaa aggagcagat gtaaactaca 1440 tctttgaaag aaatggaaaa tcatatactg ttttggaatt gattaaagaa agttactctg 1500 agacacaaaa gaggtagctg aagtggtact ctcaaaatgc agaacgatga ctgcgaagca 1560 agaagtagag aaataacact ttatgacttt cttagttgta gaaaagatag agatataatg 1620 atggtcataa ataactctga tattgcaagt aaatgcaata ataagttaga tttatttaaa 1680 aggatagtta aaaatagaaa aaaagagtta atttgtaggg ttaaaataat acataagatc 1740 ttaaaattta taaatacgca taataataaa aatagattat acttattacc ttcagagata 1800 aaatttaaga tatttactta tttaacttat aaagatctaa aatgcataat ttctaaataa 1860 tgaaaaaaaa gtacatcatg agcaacgcgt tagtatattt tacaatggag attaacgctc 1920 tataccgttc tatgtttatt gattcagatg atgttttaga aaagaaagtt attgaatatg 1980 aaaactttaa tgaagatgaa gatgacgacg atgattattg ttgtaaatct gttttagatg 2040 aagaagatga cgcgctaaag tatactatgg ttacaaagta taagtctata ctactaatgg 2100 cgacttgtgc aagaaggtat agtatagtga aaatgttgtt agattatgat tatgaaaaac 2160 caaataaatc agatccatat ctaaaggtat ctcctttgca cataatttca tctattccta 2220 gtttagaata cttttcatta tatttgttta cagctgaaga cgaaaaaaat atatcgataa 2280 tagaagatta tgttaactct gctaataaga tgaaattgaa tgagtctgtg ataatagcta 2340 taatcagaga agttctaaaa ggaaataaaa atctaactga tcaggatata aaaacattgg 2400 ctgatgaaat caacaaggag gaactgaata tagctaaact attgttagat agaggggcca 2460 aagtaaatta caaggatgtt tacggttctt cagctctcca tagagctgct attggtagga 2520 aacaggatat gataaagctg ttaatcgatc atggagctga tgtaaactct ttaactattg 2580 ctaaagataa tcttattaaa aaaaaataat atcacgttta gtaatattaa aatatattaa 2640 taactctatt actaataact ccagtggata tgaacataat acgaagttta tacattctca 2700 tcaaaatctt attgacatca agttagattg agaaaatgag attatgaaat taaggaatac 2760 aaaaatagga tgtaagaact tactagaatg ttttatcaat aatgatatga atacagtatc 2820 tagggctata aacaatgaaa cgattaaaaa ttataaaaat catttcccta tatataatac 2880 gctcatagaa aaattcattt ctgaaagtat actaagacac gaattattgg atggagttat 2940 aaattctttt caaggattca ataataaatt gccttacgag attcagtaca ttatactgga 3000 gaatcttaat aaccatgaac taaaaaaaat tttagataat atacattaaa aaggtaaata 3060 gatcatctgt tattataagc aaagatgctt gttgccaata atatacaaca ggtatttgtt 3120 tttattttta actacatatt tgatgttcat tctctttata tagtatacac agaaaattca 3180 taatccactt agaatttcta gttatctag 3209
＜210＞ 221
＜211＞ 3661
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The nucleotide sequence of a 2356 base pair fragment of TROVAC DN A containing the F7 ORF.
＜400＞ 221 gatatctgtg gtctatatat actacaccct accgatatta accaacgagt ttctcacaag 60 aaaacttgtt tagtagatag agattctttg attgtgttta aaagaagtac cagtaaaaag 120 tgtggcatat gcatagaaga aataaacaaa aaacatattt ccaaacagta ttttggaatt 180 ctcccaagtt gtaaacatat tttttgccta tcatgtataa gacgttgggc agatactacc 240 agaaatacag atactgaaaa tacgtgtcct gaatgtagaa tagtttttcc tttcataata 300 cccagtaggt attggataga taataaatat gataaaaaaa tattatataa tagatataag 360 aaaatgattt ttacaaaaat aacctataag aacaataaaa atataattac atttacggaa 420 aatagctggt tttagtttac caacttagag taattatcat attgaatcta tattgttttt 480 tagttatata aaaacatgat tagcccccaa tcggatgaaa atataaaaga tgttgagaat 540 ttcgaataca acaaaaagag gaatcgtacg ttgtccatat ccaaacatat aaataaaaat 600 tcaaaagtag tattatactg gatgtttaga gatcaacgtg tacaagataa ttgggcttta 660 atttacgcac aacgattagc gttaaaactc aaaatacctc taagaatatg cttttgtgtc 720 gtgccaaaat ttcacactac tacttctaga cactttatgt tttttaatat ccggtcttaa 780 agaagtcgcg gaagaatgta aaagactatg tatagggttt tcattgatat atggcgtacc 840 aaaagtaata attccgtgta tagtaaaaaa atacagagtc ggagtaatca taacggattt 900 ctttccatta cgtgttcccg aaagattaan gaaacagact gtaatatctc ttccagataa 960 catacctttt atacaagtag acgctcataa tatagtacct tgttgggaag cttctgataa 1020 agaagaatac ggtgcacgaa ctttaagaaa aaagatattt gataaattat atgaatatat 1080 gacagaattt cctgttgttc gtaaacatcc atacggtcca ttttctatat ctattgcaaa 1140 acccaaaaat atatcattag acaagacggt attacccgta aaatgggcaa cgcctggaac 1200 aaaagctgga ataattgttt taaaagaatt tataaaaaac agattaccgt catacgacgc 1260 ggatcataac aatcctacgt gtgacgcttt gagtaactta tctccgtggc tacattttgg 1320 tcatgtatcc gcacaacgtg ttgccttaga agtattaaaa tgtatacgag aaagcaaaaa 1380 aaacgttgaa acgtttatag atgaaataat tgtaagaaga gaactatcgg ataatttttg 1440 ttactataac aaacattatg atagtatcca gtctactcat tcatgggtta gaaaaacatt 1500 agaagatcac attaatgatc ctagaaagta tatatattcc attaaacaac tcgaaaaagc 1560 ggaaactcat gatcctctat ggaacgcgtc acaaatgcag atggtgagag aaggaaaaat 1620 gcatagtttt ttacgaatgt attgggctaa gaagatactt gaatggacta gaacacctga 1680 agacgctttg agttatagta tctatttgaa caacaagtac gaactagacg gcacggatcc 1740 taacggatac gtaggttgta tgtggtctat ttgcggatta cacgatagag cgtggaaagc 1800 aagaccgata tttggaaaga taagatatat gaattatgag agttctaaga agaaatttga 1860 tgttgctgta tttatacaga aatacaatta agataaataa tatacagcat tgtaaccatc 1920 gtcatccgtt atacggggaa taatattacc atacagtatt attaaatttt cttacgaaga 1980 atatagatcg gtatttatcg ttagtttatt ttacatttat taattaaaca tgtctactat 2040 tacctgttat ggaaatgaca aatttagtta tataatttat gataaaatta agataataat 2100 aatgaaatca aataattatg taaatgctac tagattatgt gaattacgag gaagaaagtt 2160 tacgaactgg aaaaaattaa gtgaatctaa aatattagtc gataatgtaa aaaaaataaa 2220 tgataaaact aaccagttaa aaacggatat gattatatac gttaaggata ttgatcataa 2280 aggaagagat acttgcggtt actatgtaca ccaagatctg gtatcttcta tatcaaattg 2340 gatatctccg ttattcgccg ttaaggtaaa taaaattatt aactattata tatgtaatga 2400 atatgatata cgacttagcg aaatggaatc tgatatgaca gaagtaatag atgtagttga 2460 taaattagta ggaggataca atgatgaaat agcagaaata atatatttgt ttaataaatt 2520 tatagaaaaa tatattgcta acatatcgtt atcaactgaa ttatctagta tattaaataa 2580 ttttataaat tttataaatt ttaataaaaa atacaataac gacataaaga tatttaatct 2640 ttaattcttg atctgaaaaa cacatctata aaactagata aaaagttatt cgataaagat 2700 aataatgaat cgaacgatga aaaattggaa acagaagttg ataagctaat ttttttcatc 2760 taaatagtat tattttattg aagtacgaag ttttacgtta gataaataat aaaggtcgat 2820 ttttactttg ttaaatatca aatatgtcat tatctgataa agatacaaaa acacacggtg 2880 attatcaacc atctaacgaa cagatattac aaaaaatacg tcggactatg gaaaacgaag 2940 ctgatagcct caatagaaga agcattaaag aaattgttgt agatgttatg aagaattggg 3000 atcatcctca acgaagaaat agataaagtt ctaaactgga aaaatgatac attaaacgat 3060 ttagatcatc taaatacaga tgataatatt aaggaaatca tacaatgtct gattagagaa 3120 tttgcgttta aaaagatcaa ttctattatg tatagttatg ctatggtaaa actcaattca 3180 gataacgaac attgaaagat aaaattaagg attattttat agaaactatt cttaaagaca 3240 aacgtggtta taaacaaaag ccattacccg gattggaaac taaaatacta gatagtatta 3300 taagatttta aaaacataaa attaataggt ttttatagat tgacttatta tatacaatat 3360 ggataaaaga tatatatcaa ctagaaagtt gaatgacgga ttcttaattt tatattatga 3420 ttcaatagaa attattgtca tgtcgtgtaa tcattttata aatatatcag cgttactagc 3480 taagaaaaac aaggacttta atgaatggct aaagatagaa tcatttagag aaataataga 3540 tactttagat aaaattaatt acgatctagg acaacgatat tgtgaagaac ttacggcgca 3600 tcacattcca gtgtaattat tgaggtcaaa gctagtaact taatagatga caggacagct 3660 g 3661
＜210＞ 222
＜211＞ 2356
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The DNA sequence of a 2356 base pair fragment of TROVAC DNA conta ining the F7 ORF.
＜400＞ 222 tgtctggact aactgatttc atggaacaat tttcatcaaa aatatcagtt atacctagtt 60 ctacaaagac agaactttga tgttatgttt gtgtttgtat agaaaatttt gggatactaa 120 ctgatatttc tgaatatttc tgaatatttc atgttactta cttactccta tcttagacga 180 taataaaatt cgaggcgtaa tatgtttttc caaatatttg aaattcttat acgtatcggc 240 gaagaaaagt aacatactat aagtgttatg caagtaaggt atgttaatga tattggattt 300 aatttcattg acaatacata tgtccaaaca ttccactcgt aattatgtac ggaacgactt 360 tagttaaata cttagtcaca aaaaacttat gactgtcatt atctgaaaac ggtgattccc 420 ataaatcaga atacttaata ttaaatagaa tgctcgcttc tggaggtttc cggatactag 480 ataacatatc ttctgtatta tagtttaatt cactcatttt attacataat acagtaacat 540 ctcccgaaac caatgatgtt atattagatt tacttacata cttcttgtaa ctatcatgaa 600 tacgtttgtt atgatctata aagaagatgg atgtatattc tgttctagat agcaagttct 660 ttaagttatt ctttgtctgt attactatca tcgtcttcat catcgtctaa aggtagcatt 720 atataataaa tctaatagtt gatttctcga tctatcagta ctcgctttca ataacatttt 780 tactataagc ataatagaag gcggtgatat cactatattt ttatcgggta ttcttttagt 840 aattagttag ttcgtagaat ttcgtagaga taaaagccaa tttgttgttg atactgctta 900 cgttactcat gtttcttgtt tctgttaatt aacaggtata cccttacaat aagtttaatt 960 aacttttagg tttttgtgaa gaacttttag cttctagttc ccttatccat aattgggtct 1020 tagatctaga ttcttcccat gtataaaggg ggacataccc aaaatcttta aatgctttgt 1080 ccgtttctat agtaaatgtc gtacattcct taatcaaagt ataaggattt agtaaaggcg 1140 tgtaagaaca aataggtgat agtaatactc ttaaaccttt attaatatta gcgataaacc 1200 ttaaacacca taaaggaaga catgtattcc gtagatccat ccctaattga ttaaagaaat 1260 gcatgttaaa atcatgataa tgttcagtag gagaggtatc gtaacagtaa tacacgttat 1320 tgcagagagg actatgttga ccattttcta tcatatttct tgctgctaaa atatgcatcc 1380 aagctacgtt tcctgcatag actctgctat gaaatacttt atcatccgca tatttataca 1440 ttttcctgct tttatacgat cttctgtata aagtttctag tactggacag tattctccga 1500 aaacacctaa tgggcgtagc gacaagtgca taatctaagt cctatattag acatagtacc 1560 gttagcttct agtatatatt tctcagataa cttgtttact aagaggataa gcctctttat 1620 ggttagattg ataatacgta ttctcgtttc ctcttatcat cgcatctccg gagaaagtta 1680 ggacctaccg cagaataact actcgtatat actaagactc ttacgccgtt atacagacaa 1740 gaatctacta cgttcttcgt tccgttgata ttaacgtcca ttatagagtc gttagtaaac 1800 ttacccgcta catcatttat cgaagcaata tgaatgacca catctgctga tctaagcgct 1860 tcgtccaaag tacttttatt tctaacatct ccaatcacgg gaactatctt tattatatta 1920 catttttcta caagatctag taaccattgg tcgattctaa tatcgtaaac acgaacttct 1980 ttttaaagag gattcgaaca agataagatt atttataatg tgtctaccta aaaatccaca 2040 ccctccggtt accacgtata ctagtgtacg cattttgagt attaactata taagaccaaa 2100 attatatttt cattttctgt tatattatac tatataataa aaacaaataa atatacgaat 2160 attataagaa atttagaaca cgttattaaa gtattgcctt ttttattaac ggcgtgttct 2220 tgtaattgcc gtttagaata gtctttattt actttagata actcttctat cataaccgtc 2280 tccttattcc aatcttcttc agaagtacat gagtacttac cgaagtttat catcatagag 2340 attatatatg aagaaa 2356
＜210＞ 223
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 223 atgtcctctg gttgccgttc t 21
＜210＞ 224
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 224 gacggtggat ccggtaggcg g 21
＜210＞ 225
＜211＞ 42
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 225 tttttctaga ctgcagcccg ggacatcatg cagtggttaa ac 42
＜210＞ 226
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 226 gattaaacct aaataattgt 20
＜210＞ 227
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 227 tatagctgca taatagag 18
＜210＞ 228
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 228 aattaagctt gatatcacaa aaactaaaaa gtcagacttc ttg 43
＜210＞ 229
＜211＞ 65
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 229 atccgttaag tttgtatcgt aatgtctacc ttcaagctta tgatggatgg acgtttggtt 60 tttgc 65
＜210＞ 230
＜211＞ 69
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 230 catggcaaaa accaaacgtc catccatcat aagcttgaag gtagacatta cgatacaaac 60 ttaagcgat 69
＜210＞ 231
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 231 tgtgtgatga gagatcag 18
＜210＞ 232
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 232 aactcgagtt aacaaaaatt acggaagctg ggtatattta acat 44
＜210＞ 233
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 233 ctctatgacc tcatccac 18
＜210＞ 234
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 234 atgtctacct tcaagcttat g 21
＜210＞ 235
＜211＞ 17
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 235 tttatattgt aattata 17
＜210＞ 236
＜211＞ 30
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 236 tttggatccg ttaactcaaa aaaataaatg 30
＜210＞ 237
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 237 aggccaagct tgaagaggct c 21
＜210＞ 238
＜211＞ 40
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 238 aaaggatccg ttaacacaaa aattaaacca ttttttcatt 40
＜210＞ 239
＜211＞ 94
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 239 tcgagcttaa gtcttattaa tatgcaaggg ccgacattgg ccgtgctggg cgcgctgctc 60 gccgttgcgg tgagcttgcc tacacccgcg ccgc 94
＜210＞ 240
＜211＞ 88
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 240 ggcgcgggtg taggcaagct caccgcaacg gcgagcagcg cgcccagcac ggccaatgtc 60 ggcccttgca tattaataag acttaagc 88
＜210＞ 241
＜211＞ 11
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 241 gggtgactgc a 11
＜210＞ 242
＜211＞ 7
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 242 gtcaccc 7
＜210＞ 243
＜211＞ 53
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 243 atccgttaag tttgtatcgt aatggccgct cgcggcggtg ctgaacgcgc cgc 53
＜210＞ 244
＜211＞ 51
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 244 ggcgcgttca gcaccgccgc gagcggccat tacgatacaa acttaacgga t 51
＜210＞ 245
＜211＞ 15
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 245 ccatggttta atgca 15
＜210＞ 246
＜211＞ 15
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 246 ttaaaccatg gtgca 15
＜210＞ 247
＜211＞ 16
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 247 catggtttaa gatctc 16
＜210＞ 248
＜211＞ 16
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 248 catggagatc ttaaac 16
＜210＞ 249
＜211＞ 63
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 249 gatcctgaga taaagtgaaa atatatatca ttatattaca aagtacaatt atttaggttt 60 aat 63
＜210＞ 250
＜211＞ 63
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 250 catgattaaa cctaaataat tgtactttgt aatataatga tatatatttt cactttatct 60 cag 63
＜210＞ 251
＜211＞ 62
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 251 tcgagcccgg gtaatccaac ccggtcttac tcgcgctcgc gccctcggct ccgcgcccta 60 gg 62
＜210＞ 252
＜211＞ 62
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 252 gtaccctagg gcgcggagcc gagggcgcga gcgcgagtaa gaccgggttg gattacccgg 60 gc 62
＜210＞ 253
＜211＞ 54
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 253 agcttagtat ccgttaagtt tgtatcgtaa tgggcaaact agagaaagcc ctgt 54
＜210＞ 254
＜211＞ 47
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 254 gggctttctc tagtttgccc attacgatac aaacttaacg gatatca 47
＜210＞ 255
＜211＞ 10
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 255 tcgaggatcc 10
＜210＞ 256
＜211＞ 33
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 256 cgattactat gggcaaacta gagaaagccc tgt 33
＜210＞ 257
＜211＞ 28
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 257 gggctttctc tagtttgccc atagtaat 28
＜210＞ 258
＜211＞ 101
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 258 cgattactat ggagttgatt acaaatgaac ttttatacaa aacatacaaa caaaaacccg 60 ctggagtgga ggaaccagta tataaccaag caggtgaccc t 101
＜210＞ 259
＜211＞ 103
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 259 ctagagggtc acctgcttgg ttatatactg gttcctccac tccagcgggt ttttgtttgt 60 atgttttgta taaaagttca tttgtaatca actccatagt aat 103
＜210＞ 260
＜211＞ 51
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 260 tttcgcgata tccgttaagt ttgtatcgta atgctcccag tttgcaaacc c 51
＜210＞ 261
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 261 tctccacctt tacaccacac t 21
＜210＞ 262
＜211＞ 56
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 262 gcctcatcgc tgctggatat ccgttaagtt tgtatcgtaa tggaatccag gatctg 56
＜210＞ 263
＜211＞ 37
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 263 gacagattgt gatttttata agcatcgtaa gctgtca 37
＜210＞ 264
＜211＞ 14
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 264 ggtcgacgga tcct 14
＜210＞ 265
＜211＞ 22
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 265 gatcaggatc cgtcgacctg ca 22
＜210＞ 266
＜211＞ 37
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 266 tccggtaccg cggccgcaga tatttgttag cttctgc 37
＜210＞ 267
＜211＞ 33
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 267 tcgctcgagt aggataccta cctactacct acg 33
＜210＞ 268
＜211＞ 29
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 268 tcgctcgagc tttcttgaca ataacatag 29
＜210＞ 269
＜211＞ 30
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 269 taggagctct ttatactact gggttacaac 30
＜210＞ 270
＜211＞ 39
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 270 tcgggatccg ggttaattaa ttagttatta gacaaggtg 39
＜210＞ 271
＜211＞ 41
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 271 taggaattcc tcgagtacga tacaaactta agcggatatc g 41
＜210＞ 272
＜211＞ 17
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 272 aattcctcga gggatcc 17
＜210＞ 273
＜211＞ 15
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 273 cgggatccct cgagg 15
＜210＞ 274
＜211＞ 54
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 274 tcgggtacct cgcgatatcc gttaagtttg tatcgtaatg agtgatggag cagt 54
＜210＞ 275
＜211＞ 36
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 275 taggaattcc tcgagttaat ataattttct aggtgc 36
＜210＞ 276
＜211＞ 32
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 276 atcagatctg agacattggg tttctatcca tg 32
＜210＞ 277
＜211＞ 39
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 277 ttagtctaca tggtttacaa tcaaagaaga atgttcctg 39
＜210＞ 278
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 278 atcatcctgc agagcaaaag cagg 24
＜210＞ 279
＜211＞ 1759
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The nucleotide sequence of EIV HA(A1/Prague/56).
＜400＞ 279 agcaaaagca ggggatacat aatgaacact caaattctaa tattagccac ttcggcattc 60 ttctatgtac gtgcagataa aatctgccta ggacatcatg ctgtgtctaa tggaaccaaa 120 gtagacaccc ttactgaaaa aggaatagaa gttgtcaatg caacagaaac agttgaacaa 180 acaaacatcc ctaagatctg ctcaaaagga aaacagacta ttgaccttgg tcaatgtgga 240 ttactaggga ccgttattgg tcctccccaa tgtgaccaat ttcttgaatt ctctgctaat 300 ttaatagttg aaagaaggga aggtaatgac atttgttatc caggcaaatt tgacaatgaa 360 gaaacattga gaaaaatact cagaaaatcc ggaggaatta aaaaggagaa tatgggattc 420 acatataccg gagtgagaac caatggagag actagcgcat gtagaaggtc aagatcttcc 480 ttttatgcag agatgaaatg gcttctatcc agcacagaca atgggatatt tccacaaatg 540 acaaagtcct acaagaacac taagaaggta ccagctctga taatctgggg aatccaccac 600 tcaggatcaa ctactgaaca gactagatta tatggaagtg ggaataaatc gataacagtt 660 tggagctcca aataccaaca atcttttgtc ccaaatcctg gaccaaggcc gcaaatcaat 720 ggacaatcag gaagaattga ctttgactgg ctgatggtag atcccaatga tactgtgact 780 ttcagtttta atggggcctt tatagcacct gaccgcgcca gttttctaag aggtaaatct 840 ctaggaattc aaagtgacgc acagcttgac aataattgtg aaggtgaatg ctatcatatt 900 ggaggtacta taattagcaa cttgcccttt caaaacatta atagtagggc aatcggaaaa 960 tgccccagat acgtgaagca gaagagctta atgctagcaa caggaatgaa aaatgttcct 1020 gaagctcctg cacataaaca actaactcat cacatgcgca aaaaaagagg tttatttggt 1080 gcaatagcag gattcattga aaatgggtgg gaaggattaa tagacggatg gtatggatat 1140 aagcatcaga atgcacaagg agaagggact gctgcagact acaaaagtac acaatctgct 1200 atcaaccaaa taaccgggaa attgaacaga ctaatagaaa aaaccaacca gcaattcgaa 1260 ctaatagata atgagttcaa tgaaatagaa aaacaaattg gcaatgttat taactggact 1320 agagattcta tcatcgaagt atggtcatat aatgcagaat tcctcgtagc agtggagaat 1380 caacacacta ttgatttaac tgactcagaa atgaacaaac tatatgaaaa ggtaagaaga 1440 caactgagag aaaatgctga ggaagatggt aatggctgtt ttgaaatatt ccaccaatgt 1500 gacaatgatt gcatggccag cattagaaac aatacatatg atcataaaaa atacagaaag 1560 gaggcaatac aaaacagaat tcagattgat gcagtaaagt tgagcagcgg ttacaaaata 1620 atactttggt ttagcttcgg ggcatcatgt ttcttatttc ttgccattgc aatggttctt 1680 gctttcatat gcataaaaaa tggaaacatg cggtgcacta tttgtatata agtttgaaaa 1740 aacacccttg ttttctact 1759
＜210＞ 280
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 280 gttggttttt tctattag 18
＜210＞ 281
＜211＞ 52
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 281 cgatatccgt taagtttgta tcgtaatgaa gactcaaatt ctaatattag cc 52
＜210＞ 282
＜211＞ 40
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 282 atcatcggat ccataaaaat tatatacaaa tagtgcaccg 40
＜210＞ 283
＜211＞ 25
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 283 atcatcaagc ttagtagaaa caagg 25
＜210＞ 284
＜211＞ 1762
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The nucleotide sequence of EIV HA(A2/Fontainebleu/79).
＜400＞ 284 agcaaaagca ggggatattt ctgtcaatca tgaagacaac cattattttg atactactga 60 cccattgggt ctacagtcaa aacccaacca gtggcaacaa cacagccaca ctatgtctgg 120 gacaccatgc agtagcaaat ggaacattgg taaaaacaat aactgacgac caaattgagg 180 tgacaaatgc tactgaatta gttcagagca cttcaatagg gaaaatatgc aacaacccat 240 atagggttct agatggaaga aactgcacat taatagatgc aatgctagga gatccccact 300 gtgatgtttt tcagtatgag aattgggacc tcttcataga aagaagcagc gctttcagca 360 attgctaccc atatgacatc cctgactatg catcgctccg gtctattgtg gcatcttcag 420 gaacattaga attcacagca gagggattca catggacagg tgtcactcaa aacggaagaa 480 gtggcgcctg cagaagggga tcagccgata gtttctttag ccgactgaat tggctaacag 540 aatctggaaa ttcttacccc acattgaatg taacaatgcc taacaataac aatttcgata 600 aactatacat ctgggggatc catcacccga gcacaaacaa tgagcagaca aaattgtatg 660 tccaagaatt agggcgagta acagtctcaa caaaaagaag tcaacaaaca ataatcccca 720 acatcggatc tagaccgggg gtcaggggtc aatcaggcag gataagcata tattggacca 780 ttgtgaaacc tggagatatc ctaatgataa acagtaatgg caacttagtt gcaccgcggg 840 gatatttcaa aatgcgaaca ggaaaaagct ctataatgag atcagatgca cccatagaca 900 cttgtgtgtc cgagtgtatt acaccaaatg gaagcatccc caacgacaaa ccatttcaaa 960 atgtgaacaa agttacatat ggaaaatgcc ccaagtatat caagcagaat actttgaagc 1020 tggccactgg gatgaggaat gtaccagaaa agcaaatcag aggaatcttt ggagcaatag 1080 cgggattcat agaaaatggc tgggagggaa tggttgatgg gtggtatgga ttccgatatc 1140 agaattcgga aggaacagga caagctgcag atctaaagag cactcaagca gccatcgacc 1200 agatcaatgg aaaattgaac agagtgattg agaggaccaa tgagaaattc catcaaatag 1260 agaaggaatt ctcagaagta gaagggagaa tccaggactt ggagaagtat gtagaagaca 1320 ccaaaataga cctatggtcc tacaatgcag agttactggt ggctctagaa aatcaacata 1380 cgattgactt aacagatgca gagatgaata aattattcga gaagactagg cgccagttaa 1440 gagaaaacgc ggaagacatg gggggtggat gtttcaagat ttatcacaaa tgtgataatg 1500 catgcattgg atcaataaga aatgggacat atgaccatta catatacaga gatgaagcat 1560 taaacaaccg atttcaaatt aaaggtgttg agttgaaatc aggctacaaa gattggatac 1620 tgtggatttc attcgccata tcatgcttct taatttgcgt tgttctattg ggtttcatta 1680 tgtgggcttg ccaaaaaggc aacatcagat gcaacatttg catttgagta aactgatagt 1740 taaaaacacc cttgtttcta ct 1762
＜210＞ 285
＜211＞ 49
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 285 atcatcacta gtataaaaat caaatgcaaa tgttgcatct gatgttgcc 49
＜210＞ 286
＜211＞ 38
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 286 atcatcggat ccatcacccg agcacaaaca atgagcag 38
＜210＞ 287
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 287 ttgacttaac agatgcag 18
＜210＞ 288
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 288 atgaagacaa ccattatttt g 21
＜210＞ 289
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 289 tgttgagact gttactcg 18
＜210＞ 290
＜211＞ 1125
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The nucleotide sequence of the FHV-1 CO strain gD homolog gene.
＜400＞ 290 atgatgacac gtctacattt ttggtggtgt ggaatctttg cggtcctgaa atatctggta 60 tgtacttcaa gccttacgac cacgccaaaa acaactacgg tttatgtgaa gggatttaat 120 atacctccac tacgctacaa ttatactcaa gccagaatcg tgccaaaaat tccccaggcg 180 atggatccga agataacagc tgaagtacgt tatgtaacat caatggattc atgtgggatg 240 gtggcattga tatcagagcc ggatatagac gctactattc gaaccataca actatctcaa 300 aaaaaaacat ataacgcgac tataagttgg tttaaggtaa cccagggttg tgaataccct 360 atgtttctta tggatatgag actttgtgat cctaaacggg aatttggaat atgtgcttta 420 cggtcgcctt catattggtt ggaaccttta acaaagtata tgttcctaac agacgatgaa 480 ctgggtttga ttatgatggc cccggcccaa tttaatcaag gacaatatcg aagagttata 540 accatcgatg gttccatgtt ttatacagat tttatggtac aactatctcc aacgccatgt 600 tggttcgcaa aacccgatag atacgaagag attctacatg aatggtgtcg aaatgttaaa 660 actattggcc ttgatggagc tcgtgattac cactattatt gggtacccta taacccacaa 720 cctcaccata aagccgtact cttatattgg tatcggactc atggccgaga acccccagta 780 agattccaag aggccattcg atatgatcgt cccgccatac cgtctgggag tgaggattcg 840 aaacggtcca acgactctag aggagaatcg agtggaccca attggataga cattgaaaat 900 tacactccta aaaataatgt gcctattata atatctgacg atgacgttcc tacagcccct 960 cccaagggca tgaataatca gtcagtagtg atacccgcaa tcgtactaag ttgtcttata 1020 atagcactga ttctaggagt gatatattat attttgaggg taaagaggtc tcgatcaact 1080 gcatatcaac aacttcctat aatacataca actcaccatc cttaa 1125
＜210＞ 291
＜211＞ 19
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 291 tacgatacaa acttaacgg 19
＜210＞ 292
＜211＞ 79
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 292 ggttgggttt tgactgtaga cccaatgggt cagtagtatc aaaataatgg ttgtcttcat 60 tacgatacaa acttaacgg 79
＜210＞ 293
＜211＞ 67
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 293 caatttcgat aaactataca tctggggcat ccatcacccg agcacaaaca atgagcagac 60 aaaattg 67
＜210＞ 294
＜211＞ 35
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 294 atcatcgaat tctgaatgtt aaatgttata ctttg 35
＜210＞ 295
＜211＞ 28
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 295 gggggtacct ttgagagtac cacttcag 28
＜210＞ 296
＜211＞ 35
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 296 atcatcctgc aggtattcta aactaggaat agatg 35
＜210＞ 297
＜211＞ 35
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 297 atcatcctgc aggtattcta aactaggaat agatg 35
＜210＞ 298
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 298 atgaagacaa ccattatttt g 21
＜210＞ 299
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 299 tcaaatgcaa atgttgcatc t 21
＜210＞ 300
＜211＞ 1762
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The nucleotide sequence of EIV HA(A2/Suffolk/89)
＜400＞ 300 agcaaaagca ggggatattt ctgtcaatca tgaagacaac cattattttg atactactga 60 cccattgggt ctacagtcaa aacccaacca gtggcaacaa cacagccaca ttatgtctgg 120 gacaccatgc agtagcaaat ggaacattgg taaaaacaat aactgatgac caaattgagg 180 tgacaaatgc tactgaatta gttcagagca tttcaatagg gaaaatatgc aacaatccat 240 atagggttct agatggaaga aattgcacat taatagatgc aatgctagga gacccccact 300 gtgatgtttt tcngtatgag aattgggacc tcttcataga aagaagcagc gctttcagca 360 attgctaccc atatgacatc cctgactatg catcgctccg gtccattgta gcatcctcag 420 gaacattaga attcacagca gagggattca catggacagg tgtcactcaa aacggaagaa 480 gtggagcctg caaaagggga tcagccgata gtttctttag ccgactgaat tggctaacaa 540 aatctggaaa ttcttacccc atattgaatg tgacaatgcc taacaataaa aatttcgata 600 aactatacat ctgggggatt catcacccga gctcaaacaa agagcagaca aaattgtata 660 tccaagaatc aggacgagta acagtctcaa cagaaagaag tcaacaaaca gtaatcccta 720 acatcggatc tagaccgtgg gtcaggggtc aatcaggcag gataagcata tactggacca 780 ttgtaaaacc tggagatatt ctaacgataa acagtaatgg caacttagtt gcaccgcggg 840 gatattttaa attgagaaca gggaaaagct ctgtaatgag atcagatgca cccatagaca 900 cttgtgtgtc tgaatgtatt acaccaaatg gaagcatccc caacgacaaa ccatttcaaa 960 atgtgaacaa agttacatat ggaaaatgcc ccaagtatat caggcaaaac actttaaagc 1020 tggccaccgg gatgaggaat gtaccagaaa agcaaatcag aggaatcttt ggagcaatag 1080 cgggattcat agaaaacggc tgggaaggaa tggttgatgg gtggtatgga ttccgatatc 1140 aaaactcgga aggaacagga caagctgcag atctaaagag cactcaagca gccatcgacc 1200 agatcaatgg aaaattaaac agagtgattg aaaggaccaa tgagaaattc catcaaatag 1260 agaaggaatt ctcagaagta gaagggagaa tccaggattt ggagaagtat gtagaagaca 1320 ccaaaataga cctatggtcc tacaatgcag aattgctggt ggctctagaa aatcaacata 1380 caattgactt aacagatgca gaaatgaata aattattcga gaagactagg cgccagttaa 1440 gagaaaacgc ggaagacatg ggaggtggat gtttcaagat ttaccacaaa tgtgataatg 1500 catgcattgg atcaataaga aatgggacat atgaccatta catatacaga gatgaagcat 1560 taaacaaccg atttcaaatc aaaggtgttg agttgaaatc aggctacaaa gattggatac 1620 tgtggatttc attcgccata tcatgcttct taatttgcgt tgttctattg ggtttcatta 1680 tgtgggcttg ccaaaaaggc aacatcagat gcaacatttg catttgagta aactgatagt 1740 taaaaacacc cttgtttcta ct 1762
＜210＞ 301
＜211＞ 33
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 301 gtttaatcat gaagacaacc attattttga tac 33
＜210＞ 302
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 302 agcaattgct gaaagcgc 18
＜210＞ 303
＜211＞ 36
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 303 atcatcggat cccgggacat catgcagtgg ttaaac 36
＜210＞ 304
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 304 caaaataatg gttgtcttca tgattaaacc taaataattg tac 43
＜210＞ 305
＜211＞ 69
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 305 ccggttaatt aattagttat tagacaaggt gaaaacgaaa ctatttgtag cttaattaat 60 taggtcacc 69
＜210＞ 306
＜211＞ 70
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 306 ccggggtcga cctaattaat taagctacaa atagtttcgt tttcaccttg tctaataact 60 aattaattaa 70
＜210＞ 307
＜211＞ 46
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 307 aataaatcac tttttatact aattctttat tctatactta aaaagt 46
＜210＞ 308
＜211＞ 46
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 308 cgctataggc aattcaaaca tagcatggaa ggtccaaacg caccca 46
＜210＞ 309
＜211＞ 111
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 309 acctccctct ctgaggtagt ctatgcagat cacaccggac tcgtccgaga caatatggct 60 aaattaagag aaagactaaa acagcggcag caactgtttg actcccaaca g 111
＜210＞ 310
＜211＞ 2499
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The nucleotide sequence of FeLV-B Envelope Gene
＜400＞ 310 ccccagctca gacgatctgt caagatggaa ggtccaacgc acccaaaacc ctctaaagat 60 aagactttct cgtgggacct aatgattctg gtgggggtct tactaagact ggacgtggga 120 atggccaatc ctagtccgca ccaaatatat aatgtaactt ggacaataac caaccttgta 180 actggaacaa aggctaatgc cacctccatg ttgggaaccc tgacagacgc cttccctacc 240 atgtattttg acttatgtga tataatagga aatacatgga acccttcaga tcaagaacca 300 ttcccagggt atggatgtga tcagcctatg aggaggtggc gacagagaaa cacacccttt 360 tatgtctgtc caggacatgc caaccggaag caatgtgggg ggccacagga tgggttctgc 420 gctgtatggg gttgcgagac caccggggaa acctattgga gacccacctc ctcatgggac 480 tacatcacag taaaaaaagg ggttactcag ggaatatatc aatgtagtgg aggtggttgg 540 tgtgggccct gttacgataa agctgttcac tcctcgacaa cgggagctag tgaagggggc 600 cggtgcaacc ccttgatctt gcaatttacc caaaagggaa gacaaacatc ttgggatgga 660 cctaagtcat gggggctacg actataccgt tcaggatatg accctatagc cctgttctcg 720 gtatcccggc aagtaatgac cattacgccg cctcaggcca tgggaccaaa tctagtcctg 780 cctgatcaaa aacccccatc caggcaatct caaatagagt cccgagtaac acctcaccat 840 tcccaaggca acggaggcac cccaggtgta actcttgtta atgcctccat tgcccctcta 900 cgtacccctg tcacccccgc aagtcccaaa cgtataggga ccggaaatag gttaataaat 960 ttagtgcaag ggacatacct agccttaaat gccaccgacc ccaacaaaac taaagactgt 1020 tggctctgcc tggtttctcg accaccttat tacgaaggga ttgcaatctt aggtaactac 1080 agcaaccaaa caaacccctc cccatcctgc ctatctactc cgcaacataa gctaactata 1140 tctgaggtgt cagggcaagg actgtgcata gggactgttc ctaagaccca ccaggctttg 1200 tgcaataaga cacaacaggg acatacaggg gctcactatc tagccgcccc caatggcacc 1260 tattgggcct gtaacactgg actcacccca tgcatttcca tggcagtgct caattggacc 1320 tctgattttt gtgtcttaat cgaattatgg cccagagtga cctaccatca acccgaatac 1380 atttacacac atttcgacaa agctgtcagg ttccgaagag aaccaatatc actaaccgtt 1440 gcccttataa tgggaggact cactgtaggg ggcatagccg cgggggtcgg aacagggact 1500 aaagccctcc ttgaaacagc ccagttcaga caactacaaa tggctatgca cgcagacatc 1560 caggccctag aagagtcaat tagtgcctta gaaaaatccc tgacctccct ctccgaggta 1620 gtcttacaaa atagacgggg cctagatatt ctgttcttac aaaagggagg gctctgtgcc 1680 gccttaaagg aagaatgctg cttctatgca gatcacaccg gactcgtcag agacaatatg 1740 gctaaattaa gagaaagact gaaacagcga caacaactgt ttgactccca acagggatgg 1800 tttgaaggat ggttcaacaa gtccccctgg tttacaaccc taatttcctc cattataggc 1860 cccttactaa tcctactcct aattctcctc ttcggcccat gcatccttaa ccgattagtg 1920 caattcgtaa aagacagaat atctgtggta caagccttaa ttttaaccca acagtaccaa 1980 cagatacagc aatatgatcc ggaccgacca tgatttccaa ttaaatgtat gattccattt 2040 agtccctaga agaagggggg aatgaaagac cccccccacc ccaaaactta gccagctact 2100 gcagtgatgc catttcacaa gacatggaaa attacccaag catgttcccg tgagatataa 2160 ggaagttaga agctaaaaca ggatatctgt ggttagacac ctaggccccg gcttgaggcc 2220 aagaacagtt aagccccgga tatagctgaa acagcagaag tttcaaggcc actgccagca 2280 gtctccaggc tccccagttg accagagttc gaccttccgc ctcatttaaa ctaaccaatc 2340 cccacgcctc tcgcttctgt acgcgcgctt tttgctataa aacgagccat cagcccacca 2400 ccaggcgcgc aagtctttgc agagacttga cgccccgggc ccacgcctct cgcttctgta 2460 cgcgcgcttt ttgctataaa acgagccatc agcccacca 2499
＜210＞ 311
＜211＞ 39
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 311 gggtgcgttg gaccttccat tacgatagaa acttaacgg 39
＜210＞ 312
＜211＞ 35
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 312 ccgttaagtt tgtatcgtaa tggaaggtcc aagcg 35
＜210＞ 313
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 313 gggtaaattg caagatcaag g 21
＜210＞ 314
＜211＞ 57
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 314 ccccatgcat ttccatggca gtgctcaatt ggacctctga tttctgtgtc ttaatag 57
＜210＞ 315
＜211＞ 37
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 315 atcatctcta gaataaaaat catggtcggt ccggatc 37
＜210＞ 316
＜211＞ 37
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used for mutagenesis
＜400＞ 316 ccgttaagtt tgtatcgtaa tggaaagtcc aacgcac 37
＜210＞ 317
＜211＞ 46
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 317 ccataattcg attaagacac agaattcaga ggtccaattg agcacc 46
＜210＞ 318
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 318 caagatgggt tttgtgcg 18
＜210＞ 319
＜211＞ 46
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 319 ggtgctcaat tggacctctg aattctgtgt cttaatcgaa ttatgg 46
＜210＞ 320
＜211＞ 27
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 320 atcatcaagc tttcatggtc ggtccgg 27
＜210＞ 321
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 321 taagactact tcagaaag 18
＜210＞ 322
＜211＞ 77
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 322 gtcctgttgg gtatgagtct gctggaaata agagggtggg gaagagaaca ctggcctata 60 cccctgcctt aacttag 77
＜210＞ 323
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 323 gcggatcaca ccggactc 18
＜210＞ 324
＜211＞ 3674
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The nucleotide sequence of FeLV-A gag and partial pol genes.
＜400＞ 324 ctgcagtggt gtcatttcac aaggcatgga aaattactca agtatgttcc catgagatat 60 aaggaagtta gaggctaaaa caggatatct gtggttaagc acctgggccc cggcttgagg 120 ccaagaacag ttaaaccccg gatatagctg aaacagcaga agtttcaagg ccgctgccag 180 cagtctccag gctccccagt tgaccagagt tcgaccttcc gcctcattta aactaaccaa 240 tgcccacgcc tctcgcttct gtgcgcgcgc tttctgctat aaaacgagcc atcagccccc 300 aacggcgcgc aagtctttgc tgagacttga ccgccccggg tacccgtgta cgaataaacc 360 tcttgctgat tgcatctgac tgtggtctcg gtgttccgtg ggcacggggt ctcatcgccg 420 aggaagacct agttcggggg tctttcattt aggggctcgt ccgggataga gacccccaac 480 ccccgggacc accgacccac caccatcagg aggtaagctg gccggcgacc atacctgttg 540 tccttgtata agtgtctctg tcaattgatc tgattttggc ggtgggatcg aaggagctga 600 cgagctcgta cttcgccccc gcaaccctgg aagacattcc acgggtgtct gatgtctgga 660 gcctctagtg ggacagccat tggggctcat ctgtttgggg tctcacctga atacagggtg 720 ttgatcggag acgagggagc cggaccctca aggtctcttt ctgaggtttc attttcggtt 780 tggtaccaaa gacgcgcggc acgtcttgtc attttttgtc tggttgcgtc ttttcttgtc 840 ccttgtctaa cctttttaat tgcagaaacc gtcatgggcc aaactataac taccccctta 900 agcctcaccc ttgatcactg gtctgaagtc cgggcacgag cccataatca aggtgtcgag 960 gtccggaaaa agaaatggat taccttatgt gaggccgaat gggtgatgat gaatgtgggc 1020 tggccccgag aaggaacttt ttctcttgat agcatttccc aggttgaaaa gaagatcttc 1080 gccccgggac catatggaca ccccgaccaa gttccttaca ttactacatg gagatcctta 1140 gccacagacc ccccttcgtg ggttcgtccg ttcctacccc ctcccaaacc tcccacaccc 1200 ctccctcaac ctctttcgcc gcagccctcc gcccctctta cctcttccct ctaccccgtt 1260 ctccccaagc cagacccccc caaaccgcct gtgttaccgc ctgatccttc ttccccttta 1320 attgatctct taacagaaga gccacctccc tatccggggg gtcacgggcc accgccatca 1380 ggtcctagga ccccaaccgc ttccccgatt gcaagccggc taagggaacg acgagaaaac 1440 cctgctgaag aatcgcaagc cctccccttg agggaaggcc ccaacaaccg accccagtat 1500 tggccattct cagcttcaga cttgtataac tggaagtcgc ataacccccc tttctcccaa 1560 gatccagtgg ccctaactaa cctaattgag tccattttag tgacgcatca accaacctgg 1620 gacgactgcc agcagctctt gcaggcactc ctgacaggcg aagaaaggca aagggtcctt 1680 cttgaggccc gaaagcaggt tccaggcgag gacggacggc caacccaact acccaatgtc 1740 attgacgaga ctttcccctt gacccgtccc aactgggatt ttgctacgcc ggcaggtagg 1800 gagcacctac gcctttatcg ccagttgcta ttagcgggtc tccgcggggc tgcaagacgc 1860 cccactaatt tggcacaggt aaagcaggtt gtacaaggga aagaggaaac gccagcagca 1920 tttttagaaa gattaaaaga ggcttataga atgtacactc cctatgaccc tgaggaccca 1980 gggcaagcgg ctagtgttat cctatccttt atataccagt ctagcccaga tataagaaat 2040 aagttacaaa ggctagaagg cctacaaggg ttcaccctat ctgatctgct aaaagaggca 2100 gaaaagatat acaacaaaag ggagacccca gaggaaaggg aagaaagatt atggcagcga 2160 caggaagaaa gagataaaaa gcgccacaag gagatgacta aagttctggc cacagtagtt 2220 gctcagaata gagataagga tagagaagaa agtaaactgg gggatcaaag gaaaatacct 2280 ctggggaaag accagtgtgc ctattgcaag gaaaaggggc attgggttcg cgattgcccc 2340 aaacgaccca ggaagaaacc cgccaactcc actctcctca acttaggaga ttaggagagt 2400 cagggccagg accccccccc ctgagcccag gataacctta aaaatagggg ggcaaccggt 2460 gacttttctg gtggacacgg gagcccagca ctcagtactg actcgaccag atggacctct 2520 cagtgaccgc acagccctgg tgcaaggagc cacgggaagc aaaaactacc ggtggaccac 2580 cgacaggagg gtacaactgg caaccggtaa ggtgactcat tcttttttat atgtacctga 2640 atgtccctac ccgttattag ggagagacct attaactaaa cttaaggccc aaatccattt 2700 taccggagaa ggggctaatg ttgttgggcc caggggttta cccctacaag tccttacttt 2760 acaattagaa gaggagtatc ggctatttga gccagaaagt acacaaaaac aggagatgga 2820 cacttggctt aaaaactttc cccaggcgtg ggcagaaaca ggaggtatgg gaatggctca 2880 ttgtcaagcc cccgttctca ttcaacttaa ggctactgcc actccaatct ccatccgaca 2940 gtatcctatg ccccatgaag cgtaccaggg aattaagcct catataagaa gaatgctaga 3000 tcaaggcatc ctcaagccct gccagtcccc atggaataca cccttattac ctgttaagaa 3060 gccagggacc gaggattaca gaccagtgca ggacttaaga gaagtaaaca aaagagtaga 3120 agacatccat cctactgtgc caaatccata taacctcctt agcaccctcc cgccgtctca 3180 cccttggtac actgtcctag atttaaagga cgcttttttc tgcctgcgac tacactctga 3240 gagtcagtta ctttttgcat ttgaatggag agatccagaa ataggactgt cagggcaact 3300 aacctggaca cgccttcctc aggggttcaa gaatagcccc accctatttg atgaggccct 3360 gcactcagac ctggccgatt tcagggtaag gtacccggct ctagtcctcc tacaatatgt 3420 agatgacctc ttgctggctg cggcaaccag gactgaatgc ctggaaggga ctaaggcact 3480 ccttgagact ttgggcaata aggggtaccg agcctctgga aagaaggccc aaatttgcct 3540 gcaagaagtc acatacctgg ggtactcttt aaaagatggc caaaggtggc ttaccaaagc 3600 tcggaaagaa gccatcctat ccatccctgt gcctaaaaac ccacgacaag tgagagagtt 3660 ccttggaact gcag 3674
＜210＞ 325
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 325 gatctccatg tagtaatg 18
＜210＞ 326
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 326 cgatatccgt taagtttgta tcgtaatgtc tggagcctct agtg 44
＜210＞ 327
＜211＞ 78
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 327 ctagctaagt taaggcaggg gtataggcca gtgttctctt ccccaccctc ttatttccag 60 cagactcata cccaacag 78
＜210＞ 328
＜211＞ 11
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 328 aattcaaccg c 11
＜210＞ 329
＜211＞ 62
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 329 gatcttttgt taacaaaaac taatcagcta tcgcgaatcg attcccgggg gatccggtac 60 cc 62
＜210＞ 330
＜211＞ 62
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 330 tcgagggtac cggatccccc gggaatcgat tcgcgatagc tgattagttt ttgttaacaa 60 aa 62
＜210＞ 331
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 331 atgatgacac gtctacattt t 21
＜210＞ 332
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 332 tgttacataa cgtacttcag c 21
＜210＞ 333
＜211＞ 53
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 333 aattttctcg agaagcttgt taacaaaaat cattaaggat ggtagattgc atg 53
＜210＞ 334
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 334 gaggattcga aacggtcc 18
＜210＞ 335
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 335 atggggatat ggaagtgg 18
＜210＞ 336
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 336 catgttcctt tcaagtcaac 20
＜210＞ 337
＜211＞ 39
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 337 atcatgagtc caagagacaa aggtttctta tgccctgag 39
＜210＞ 338
＜211＞ 48
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 338 atcatcgaat tcataaaaac tatgattttt tatgcttcct tacgggac 48
＜210＞ 339
＜211＞ 66
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 339 agaaaaatca gttagctaag atctcccggg ctcgagggta ccggatcctg attagttaat 60 ttttgt 66
＜210＞ 340
＜211＞ 70
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 340 gatcacaaaa attaactaat caggatccgg taccctcgag cccgggagat cttagctaac 60 tgatttttct 70
＜210＞ 341
＜211＞ 28
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 341 cagttggtac ctatgttaag gaggacga 28
＜210＞ 342
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 342 tatctgaatt cctgcagccc gggtttttat agctaattag tcatatgata ttatctctat 60 60
＜210＞ 343
＜211＞ 68
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 343 tcgatgaatt cgatatcaag cttatcgatt tttatgatta actagtcaag tgattttatt 60 caattacg 68
＜210＞ 344
＜211＞ 29
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 344 ttatcgagct catttacatt tctaaactc 29
＜210＞ 345
＜211＞ 5
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector
＜400＞ 345 ggttg 5
＜210＞ 346
＜211＞ 47
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 346 ccctctgtaa ttcctccata gttgccatta cgatacaaac ttaacgg 47
＜210＞ 347
＜211＞ 35
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 347 ccgttaagtt tgtatcgtaa tggcaactat ggagg 35
＜210＞ 348
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 348 ggacacgtaa agatgttttg g 21
＜210＞ 349
＜211＞ 31
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 349 gtcctgcagg atggaaaaga atgccccaag c 31
＜210＞ 350
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 350 gggggaggca aactaccaag g 21
＜210＞ 351
＜211＞ 35
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 351 atcatctcta gaataaaaat tagagtttca aaggc 35
＜210＞ 352
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 352 cgccagcatg cagaagcagc 20
＜210＞ 353
＜211＞ 11
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 353 gatccccggg a 11
＜210＞ 354
＜211＞ 11
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 354 gatctcccgg g 11
＜210＞ 355
＜211＞ 54
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 355 atcatcgcga tatccgttaa gtttgtatcg taatgaaaaa tctggattgt tggg 54
＜210＞ 356
＜211＞ 19
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 356 gtaatagtta tgaaaaccc 19
＜210＞ 357
＜211＞ 19
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 357 gggttttcat aactattac 19
＜210＞ 358
＜211＞ 42
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 358 ggatggacaa atgattaatt tttatctcga gcccgggatg at 42
＜210＞ 359
＜211＞ 82
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 359 gtacgtgact aattagctat aaaaaggatc cggtaccctc gagtctagaa tcgatcccgg 60 gtttttatga ctagttaatc ac 82
＜210＞ 360
＜211＞ 82
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 360 ggccgtgatt aactagtcat aaaaacccgg gatcgattct agactcgagg gtaccggatc 60 ctttttatag ctaattagtc ac 82
＜210＞ 361
＜211＞ 39
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 361 tcgggatccg ggttaattaa ttagtcatca ggcagggcg 39
＜210＞ 362
＜211＞ 40
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 362 tagctcgagg gtacctacga tacaaactta acggatatcg 40
＜210＞ 363
＜211＞ 12
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 363 aattgcggcc gc 12
＜210＞ 364
＜211＞ 35
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 364 actactaagc ttctttattc tatacttaaa aagtg 35
＜210＞ 365
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 365 ttaacggata tcgcgataat g 21
＜210＞ 366
＜211＞ 27
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 366 tctgagctcg aaaatagaat tgatcag 27
＜210＞ 367
＜211＞ 26
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 367 tctggtacct ttctgaatgc aggatg 26
＜210＞ 368
＜211＞ 26
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 368 tctgagctcc aatacaacac agaacc 26
＜210＞ 369
＜211＞ 26
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 369 tctggtaccg cattcactat tactca 26
＜210＞ 370
＜211＞ 1685
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The consensus F nucleotide sequence (mumps) reqresented by pURF3.
＜400＞ 370 gagctcgaaa atagaattga tcagtaatca tgaaggcttt tttagttact tgcttaagct 60 ttgcagtctt ttcatcttct gtatgtgtga atatcaacat cttgcagcaa attggatata 120 tcaagcaaca agtcaggcaa ctaagctatt actcacaaag ttcaagctcc tacatagtgg 180 tcaagctttt accgaatatc caacccattg ataacagctg tgaatttaag agtgtaactc 240 aatacaataa gaccttgagt aatttgcttc ttccaattgc agaaaacata aacaatattg 300 catcgccctc atctgggtca agacggcata aaaggtttgc tggtattgct attggcattg 360 ctgcgctcgg tgttgcgacc gcagcacaag taactgccgc tgtctcatta gttcaagcac 420 agacaaatgc acgtgcaata gcggcgatga aaaattcaat acaagcaact aatcgagcag 480 tcttcgaagt gaaggaaggc actcaacagt tagctatagc ggtacaagca atacaagacc 540 acatcaatac tattatgaac acccaattga acaatatgtc ttgtcagatc cttgataacc 600 agcttgcaac tttcctagga ttatacctaa cagaattaac aacagtgttt cagccacaat 660 taattaatcc ggcattgtca ccgattagta tacaagcctt gaggtctttg cttggaagta 720 tgacgcctgc agtggtccaa gcaacattat ctacttcaat ctctactgct gaaatactaa 780 gtgccggtct aatggagggt cagattgttt ctgttctgct agatgagatg cagatgatag 840 ttaagataaa tattccaact attgtcacac aatcaaatgc attggtgatt gacttctact 900 caatttcgag ctttattaat aatcaggaat ccataatcca attgccagac agaatcttgg 960 agatcgggaa tgaacaatgg agctatccag ctaaaaattg taagttgaca agacaccaca 1020 tattctgcca atacaatgag gcagagaggc tgagcctaga atcaaaacta tgccttgcag 1080 gtaatataag tgcctgtgtg ttctcaccca tagcagggag ttatatgagg cgatttacgg 1140 cactggatgg aacaattgtt gcaaactgtc gaagtctaac gtgtctatgc aagaatccat 1200 cttatcctat ataccaacct gaccatcatg cagtcacgac cattgatcta accgcatgtc 1260 aaacattgtc cctagacgga ttggatttca gcattgtctc tctaagcaac atcacttacg 1320 ctgagaacct taccatttca ttgtctcaga caatcaatac tcaacccatt gacatatcaa 1380 ctgaactgag taaggttaat gcatccctcc aaaatgccgt taagtacata aaggagagca 1440 accatcagct ccaatctgtg agtgtaaact ccaaaatcgg agctataatt gtagcagcct 1500 tagttttgag cattctgtca attatcattt cgctattgtt ttgctgctgg gcttacattg 1560 caactaaaga aatcagaaga atcaacttca aaacaaatca tatcaataca atatcaagta 1620 gtgtcgatga tctcattagg tactaatcct aacattgtga ttcatcctgc attcagaaag 1680 gtacc 1685
＜210＞ 371
＜211＞ 1830
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ The consensus F uncleotide sequence (mumps) reqresented by pURHN5 .
＜400＞ 371 gagctccaat acaacacaga accccagctg ccatcacaac tgttctctgg ccgctcgaaa 60 gatggagccc tcaaaactct tcacaatgtc agacaatgcc acctttgcac ctggaccttt 120 tatcaatgcg gcagacaaga agacgttccg aacctgcttc cgaatattgg tactgtctgt 180 acaagctgtt acccttatat tagttattgt cactttaggt gagcttgtga ggatgatcaa 240 tgatcaaggc ttgagcaatc agttgtcttc aattgcagac aagataagag agtcagctac 300 tatgattgca tctgctgtgg gagtaatgaa tcaagttatt cacggagtaa cggtatcctt 360 acccctacaa attgagggaa accaaaatca attgttatcc acacttgcca caatctgtac 420 aggcaaaaaa caagtctcaa actgctctac aaacatcccc ttagttaatg accttaggtt 480 tataaatggg atcaataaat tcatcattga agattatgca actcatgatt tctctatcgg 540 ccatccactc aacatgccta gctttatccc aactgcaact tcacccaatg gttgcacaag 600 aattccatcc ttttctctag gtaagacaca ctggtgctac acacataatg taattaatgc 660 caactgcaag gatcatactt cgtctaacca atatatttcc atggggatac tcgttcagac 720 cgcgtcaggg tatcctatgt tcaaaacctt aaaaatccaa tatctcagtg atggccttaa 780 tcggaaaagc tgctcaattg caacagtccc tgatggatgc gcaatgtact gttacgtctc 840 aactcaactt gaaaccgacg actatgcggg gtccagccca cctacccaga aacttaccct 900 gttattctat aatgataccg tcacagaaag gacaatatct ccaactggtc ttgaagggaa 960 ttgggctact ttggttccag gagtggggag tggaatatat ttcgagaata aattgatttt 1020 tcctgcatat gggggtgtct tgcccaatag tacactcgga gttaaatcag caagagaatt 1080 tttccggcct gttaatccat ataatccatg ttcaggacca caacaagatt tagatcagcg 1140 tgctttgaga tcatacttcc caagttactt ctctaatcga agagtacaga gtgcatttct 1200 tgtctgtgcc tggaatcaga tcctagttac aaattgcgag ctagttgtcc cctcaaacaa 1260 tcagacactg atgggtgcag aaggaagagt tttattgatc aataatcgac tattatatta 1320 tcagagaagt accagctggt ggccgtatga actcctctat gagatatcat tcacatttac 1380 aaactctggt caatcatctg tgaatatgtc ctggatacct atatattcat tcactcgtcc 1440 tggttcaggc aactgcagtg gtgaaaatgt gtgcccaact gcttgtgtgt caggggttta 1500 tcttgatccc tggccattaa ctccatatag ccaccaatca ggcattaacc gaaatttcta 1560 tttcacaggc gcactattaa attcaagcac aactagagta aatcctaccc tttatgtctc 1620 tgcccttaat aatcttaaag tactagcccc atatggtaat cagggactgt ttgcctcgta 1680 caccacaacc acctgctttc aagataccgg tgatgctagt gtgtattgtg tttatattat 1740 ggaactagca tcgaatatcg ttggagaatt ccaaattcta cctgtgctaa ccagattgac 1800 catcacttga gtaatagtga atgcggtacc 1830
＜210＞ 372
＜211＞ 31
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 372 ttagatatcc ggaccgcccg ggctgcagaa t 31
＜210＞ 373
＜211＞ 31
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 373 attctgcagc ccgggcggtc cggatatcta a 31
＜210＞ 374
＜211＞ 32
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 374 tatgaattcc catggttaat taattagtca tc 32
＜210＞ 375
＜211＞ 26
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 375 tctcccgggc ggatatcgcg ataatg 26
＜210＞ 376
＜211＞ 95
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 376 taaccatggt ttattgggaa gaatatgata atattttggg atttcaaaat tgaaaatata 60 taattacaat ataaaatgaa ggctttttta gttac 95
＜210＞ 377
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 377 ccactgcagg cgtcatac 18
＜210＞ 378
＜211＞ 49
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 378 ttatcgcgat atccgttaag tttgtatcgt aatggagccc tcaaaactc 49
＜210＞ 379
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 379 aaacctaagg tcattaac 18
＜210＞ 380
＜211＞ 31
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 380 ttcccgggag atctctatgc catttctcca t 31
＜210＞ 381
＜211＞ 11
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 381 ggttccccgg g 11
＜210＞ 382
＜211＞ 16
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 382 cttgattttt attgat 16
＜210＞ 383
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 383 ctagatcaat aaaaatcaag catg 24
＜210＞ 384
＜211＞ 21
＜212＞ PRT
＜213＞ Human immunodeficiency virus
＜400＞ 384 Cys Asn Thr Arg Lys Arg Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala 1 5 10 15 Phe Val Thr Gly Lys 20
＜210＞ 385
＜211＞ 20
＜212＞ PRT
＜213＞ Human immunodeficiency virus
＜400＞ 385 Cys Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Thr Thr Lys Asn 20
＜210＞ 386
＜211＞ 20
＜212＞ PRT
＜213＞ Human immunodeficiency virus
＜400＞ 386 Cys Asn Thr Arg Lys Ser Ile Tyr Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe His 1 5 10 15 Thr Thr Gly Arg 20
＜210＞ 387
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 387 gggttattaa tgatctgtag 20
＜210＞ 388
＜211＞ 30
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 388 atcatcgagc tctgttcctt gggttcttag 30
＜210＞ 389
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 389 atcatctcta gaataaaaat tatagcaaag ccctttccaa gcc 43
＜210＞ 390
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 390 atcatcgagc tcctatcgct gctc 24
＜210＞ 391
＜211＞ 55
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 391 agcttcttta ttctatactt aaaaagtgaa aataaataca aaggttcttg agggt 55
＜210＞ 392
＜211＞ 73
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 392 tgtgttaaat tgaaagcgag aaataatcat aaattatttc attatcgcga tatccgttaa 60 gtttgtatcg tac 73
＜210＞ 393
＜211＞ 56
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 393 tcgagtacga tacaaactta acggatatcg cgataatgaa ataatttatg attatt 56
＜210＞ 394
＜211＞ 72
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 394 tctcgctttc aatttaacac aaccctcaag aacctttgta tttattttca ctttttaagt 60 atagaataaa ga 72
＜210＞ 395
＜211＞ 17
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 395 aatacgactc actatag 17
＜210＞ 396
＜211＞ 45
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 396 atcatctcta gaataaaaat tatctttttt ctctctgcac cactc 45
＜210＞ 397
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 397 gaaataataa aacaataatc 20
＜210＞ 398
＜211＞ 35
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 398 gctcctattc ccactgcagt tttttctctc tgcac 35
＜210＞ 399
＜211＞ 33
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 399 gtgcagagaa aaaactgcag tgggaatagg agc 33
＜210＞ 400
＜211＞ 47
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 400 atcatctcta gaataaaaat tacaaacttg cccatttatc caattcc 47
＜210＞ 401
＜211＞ 47
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 401 atcatctcta gaataaaaat tacaaacttg cccatttatc taattcc 47
＜210＞ 402
＜211＞ 38
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 402 gcctcctact atcattatga ataatctttt tctctctg 38
＜210＞ 403
＜211＞ 87
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 403 ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa tagtttttgc tgtactctct 60 gtagtgaata gagttaggca gggataa 87
＜210＞ 404
＜211＞ 87
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 404 ttatccctgc ctaactctat tcactacaga gagtacagca aaaactattc ttaaacctac 60 caagcctcct actatcatta tgaataa 87
＜210＞ 405
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 405 atcatctcta gaataaaaat tatccctgcc taactctatt cac 43
＜210＞ 406
＜211＞ 70
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 406 gatcttaatt aattagtcat caggcagggc gagaacgaga ctatctgctc gttaattaat 60 taggtcgacg 70
＜210＞ 407
＜211＞ 70
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 407 gatccgtcga cctaattaat taacgagcac atagtctcgt tctcgccctg cctgatgact 60 aattaattaa 70
＜210＞ 408
＜211＞ 16
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 408 tgtggcaaag aagggc 16
＜210＞ 409
＜211＞ 26
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 409 ttggatcctt attgtgacga ggggtc 26
＜210＞ 410
＜211＞ 106
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 410 gatcttgaga taaagtgaaa atatatatca ttatattaca aagtacaatt atttaggttt 60 aatcatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa ttagat 106
＜210＞ 411
＜211＞ 104
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 411 cgatctaatt ctcccccgct taatactgac gctctcgcac ccatgattaa acctaaataa 60 ttgtactttg taatataatg atatatattt tcactttatc tcaa 104
＜210＞ 412
＜211＞ 68
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 412 ctgacacagg acacagcaat caggtcagcc aaaattacta atttttatct cgaggtcgac 60 aggacccg 68
＜210＞ 413
＜211＞ 72
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 413 gatccgggtc ctgtcgacct cgagataaaa attagtaatt ttggctgacc tgattgctgt 60 gtcctgtgtc ag 72
＜210＞ 414
＜211＞ 16
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 414 aagaaaatta taggac 16
＜210＞ 415
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 415 ttggatccct aatcctcatc ctgt 24
＜210＞ 416
＜211＞ 25
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 416 aaagtcgacc catatcacct agaac 25
＜210＞ 417
＜211＞ 29
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 417 tttggatcct tacaaaactc ttgccttat 29
＜210＞ 418
＜211＞ 105
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 418 tcgagcaaaa ttgaaaatat ataattacaa tataaaatgc ctatagtgca gaacatccag 60 gggcaaatgg tacatcaggc catatcacct agaactttaa atgca 105
＜210＞ 419
＜211＞ 97
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 419 tttaaagttc taggtgatat ggcctgatgt accatttgcc cctggatgtt ctgcactata 60 ggcattttat attgtaatta tatattttca attttgc 97
＜210＞ 420
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 420 gcctcctact atcattatga ataaactgat gggaggggca tac 43
＜210＞ 421
＜211＞ 9
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 421 ggccgcaac 9
＜210＞ 422
＜211＞ 9
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 422 tcgagttgc 9
＜210＞ 423
＜211＞ 8
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 423 ggccaaac 8
＜210＞ 424
＜211＞ 8
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 424 tcgagttt 8
＜210＞ 425
＜211＞ 32
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 425 ccccccaagc ttacatcatg cagtggttaa ac 32
＜210＞ 426
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 426 gattaaacct aaataattgt 20
＜210＞ 427
＜211＞ 22
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 427 acaattattt aggttaactg ca 22
＜210＞ 428
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 428 gttaacctaa ataattgt 18
＜210＞ 429
＜211＞ 75
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 429 taatcatgaa acaaattatt aatatgtggc aagaagagga aaagctatgt acgcttgact 60 agttaatcac tcgag 75
＜210＞ 430
＜211＞ 80
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 430 gatcctcgag tgattaacta gtcaagcgta catagctttt cctacttctt gccacatatt 60 aataatttgt ttcatgatta 80
＜210＞ 431
＜211＞ 78
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 431 atccgttaag tttgtatcgt aatgcacgaa gatattattt ctttgtggga tcaatcttta 60 aaatgactag ttaatcag 78
＜210＞ 432
＜211＞ 82
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 432 gatcctgatt aactagtcat tttaaagatt gatcccacaa agaaataata tcttcgtgca 60 ttacgataca aacttaacgg at 82
＜210＞ 433
＜211＞ 40
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 433 aattaattag ctgcagcccc gggtcaaaaa aatataaatg 40
＜210＞ 434
＜211＞ 53
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 434 ccttgtacta cttcaattac tctatccatt ttatattgta attatatatt ttc 53
＜210＞ 435
＜211＞ 107
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 435 tcaaaaaaat ataaatgatt caccatctga tagaaaaaaa atttattggg aagaatatga 60 taatattttg ggatttcaaa attgaaaata tataattaca atataaa 107
＜210＞ 436
＜211＞ 73
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 436 atggatagag taattgaagt agtacaagga gcttatagag ctattagatg actagttaat 60 cactcgagga tcc 73
＜210＞ 437
＜211＞ 73
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 437 ggatcctcga gtgattaact agtcatctaa tagctctata agctccttgt actacttcaa 60 ttactctatc cat 73
＜210＞ 438
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 438 atcatcggat cctcgagtga ttaaactagt catctaatag ctc 43
＜210＞ 439
＜211＞ 84
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 439 ttaatcagga tccttaatta attagttatt agacaaggtg aaaacgaaac tatttgtagc 60 ttaattaatt agctgcagcc cggg 84
＜210＞ 440
＜211＞ 84
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 440 cccgggctgc agctaattaa ttaagctaca aatagtttcg ttttcacctt gtctaataac 60 taattaatta aggatcctga ttaa 84
＜210＞ 441
＜211＞ 34
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 441 ttaatcagga tccttaatta attagttatt agac 34
＜210＞ 442
＜211＞ 42
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 442 atcatcggat cctcgagtga ttaactagtc atctaatagc tc 42
＜210＞ 443
＜211＞ 51
＜212＞ PRT
＜213＞ Human immunodeficiency virus
＜400＞ 443 Met Lys Gln Gln Lys Thr Val Ala Met Arg Val Lys Glu Lys Tyr Gln 1 5 10 15 His Leu Trp Arg Trp Gly Trp Arg Trp Gly Thr Met Leu Leu Gly Met 20 25 30 Leu Met Ile Cys Ser Ala Thr Glu Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr 35 40 45 Gly Val Pro 50
＜210＞ 444
＜211＞ 62
＜212＞ PRT
＜213＞ Human immunodeficiency virus
＜400＞ 444 Pro Phe Arg Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala 1 5 10 15 Met Tyr Ala Pro Pro Phe Arg Lys His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp 20 25 30 Asp Gln Ser Leu Lys Pro Pro Phe Arg Lys Asp Arg Val Ile Glu Val 35 40 45 Val Gln Gly Ala Tyr Arg Ala Ile Arg Pro Pro Phe Arg Lys 50 55 60
＜210＞ 445
＜211＞ 28
＜212＞ PRT
＜213＞ Human immunodeficiency virus
＜400＞ 445 Leu Phe Ile Met Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe 1 5 10 15 Ala Val Leu Ser Val Val Asn Arg Val Arg Gln Gly 20 25
＜210＞ 446
＜211＞ 46
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 446 catattaatt tgttttctaa aaggaggtac cccataatag actgtg 46
＜210＞ 447
＜211＞ 94
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 447 gctcctcctt ttagaaaaca cgaagatatt atttctttgt gggatcaatc tttaaaacct 60 ccttttagaa aagatagagt aattgaagta gtac 94
＜210＞ 448
＜211＞ 94
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 448 gtactacttc aattactcta tcttttctaa aaggaggttt taaagattga tcccacaaag 60 aaataatatc ttcgtgtttt ctaaaaggag gagc 94
＜210＞ 449
＜211＞ 70
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 449 aaacaaatta ttaatatgtg gcaagaagta ggaaaagcta tgtacgctcc tccttttaga 60 aaacacgaag 70
＜210＞ 450
＜211＞ 56
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 450 actacttcta gattatctaa tagctctata agctccttgt actacttcaa ttactc 56
＜210＞ 451
＜211＞ 74
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 451 tactatcatt atgaataatt ttctaaaagg aggtctaata gctctataag ctccttgtac 60 tacttcaatt actc 74
＜210＞ 452
＜211＞ 32
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 452 atcatcggat ccaagcttac atcatgcagt gg 32
＜210＞ 453
＜211＞ 49
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 453 cgttttgacc atttgccacc catgattaaa cctaaataat tgtactttg 49
＜210＞ 454
＜211＞ 46
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 454 agtacaatta tttaggttta atcatgggtg gcaaatggtc aaaacg 46
＜210＞ 455
＜211＞ 30
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 455 atcatcggat cctaacactt ctctctccgg 30
＜210＞ 456
＜211＞ 55
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 456 atcatcggat cctaacactt ctctctccgg gtcatccatc catgctggct catag 55
＜210＞ 457
＜211＞ 70
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 457 aattaacccg ggatccaagc ttctagctag ctaattttta tagcggccgc tataatcgtt 60 aacttattag 70
＜210＞ 458
＜211＞ 28
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 458 gctagaaatc tcttagtttt tatagttg 28
＜210＞ 459
＜211＞ 28
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 459 gttacatatg tacagaatct gatcatag 28
＜210＞ 460
＜211＞ 67
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 460 ctagctagaa gcttggatcc cgggttaatt aattaataaa aagcggccgc gttaaagtag 60 aaaaatg 67
＜210＞ 461
＜211＞ 67
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 461 cgcccatgat taaacctaaa taattgtact ttgtaatata atgatatata ttttcacttt 60 atctcac 67
＜210＞ 462
＜211＞ 17
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 462 atggcagttc attgcat 17
＜210＞ 463
＜211＞ 31
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 463 ttcccgggag atctctatgc catttctcca t 31
＜210＞ 464
＜211＞ 5
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 464 ggttg 5
＜210＞ 465
＜211＞ 11
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 465 aattcaaccg c 11
＜210＞ 466
＜211＞ 78
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 466 ctagctaagt taaggcaggg gtataggcca gtgttctctt ccccaccctc ttatttccag 60 cagactcata cccaacag 78
＜210＞ 467
＜211＞ 77
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used to prepare a recombinant vector.
＜400＞ 467 gtcctgttgg gtatgagtct gctggaaata agagggtggg gaagagaaca ctggcctata 60 cccctgcctt aacttag 77
＜210＞ 468
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ This oligonucleotide is used as a PCR primer.
＜400＞ 468 taagactact tcagaaag 18
(관련출원 상호참조)
본출원은 1991년 6월 11일 출원된 특허출원 07/713,967의 일부 계속출원이며, 07/713,967은 1991년 3월 7일 출원된 특허출원 07/666,056의 일부 계속출원이다. 둘다 참고문헌으로 여기에 통합되어 있다. 또한 1991. 6. 14 출원된 715,921, 1991. 7. 26 출원된 736,254, 1991. 10.22. 출원된 776,867, 및 1992. 1. 13 출원된 820,077의 계류중인 미합중국 특허출원도 참조되었으며, 이것들 모두 참고문헌으로 여기에 통합되어 있다.
본발명은 변형된 폭스바이러스(poxvirus) 및 그것의 제조 및 이용방법에 관한 것이다. 더 특이적으로는 본발명은 다양한 병원체에 대해서 보호하기 위해 안전한 면역화 매체로서 이용하기 위한 외부유전자의 삽입 및 발현을 위한 개선된 벡터에 관한 것이다.
본 출원에서는 몇가지 간행물이 참조되었다. 이러한 참고문헌의 완전한 인용문은 특허청구의 범위 바로전의 명세서 말단에서 또는 간행물이 언급된 곳에서 발견된다. 이 간행물 각각은 참고문헌으로 여기에 통합되어 있다. 이러한 간행물들은 본발명이 속하는 기술과 관계된다.
(발명의 배경)
외부유전자의 삽입 및 발현을 우두(牛痘)바이러스(Vaccinia virus) 및 보다 최근에는 다른 폭스바이러스가 이용되어 왔다. 외부 유전자를 살아있는 병원성 폭스바이러스 속에 삽입하는 기본기술은 도너(donor) 플라스미드의 외부유전요소 측면의 폭스 DNA 서열과 레스큐(rescue) 폭스바이러스에 존재하는 상동 서열 사이의 재조합을 포함한다(Piccini등, 1987).
특이적으로 재조합체 폭스바이러스는 참고문헌으로 여기에 그 개시내용이 통합되어 있는 미합중국 특허 4,769,330; 4,772,848 및 4,603,112, 1990 년 6월 14 일 출원된 계류중인 특허출원 07/537,882에서 기술된 우두 바이러스의 합성재조합체를 제조하는 방법과 유사하며 당업계에서 공지된 2 단계로 구성되었다. 이것과 관련하여 1990 년 6월 14 일 출원된 계류중인 미합중국 특허출원 537,890을 참조하였으며 이것은 또한 참고문헌으로 여기에 통합되어 있다.
먼저, 바이러스속에 삽입되는 DNA 유전자 서열, 특히 비-폭스 공급원의 오픈 리딩프레임이 E.coli 플라스미드 구조체 속에 놓여지는데 이 구조체속에 폭스바이러스 DNA 부분과 상동적인 DNA가 삽입된다. 별도로 삽입되는 DNA 유전자 서열이 프로모터와 결합된다. 플라스미드 구조체에 프로모터-유전자 결합부를 위치시켜서 프로모터-유전자 결합부가 양쪽 말단에서 비필수적인 유전자좌를 포함하는 폭스 DNA 부위의 측면의 DNA 서열과 상동적인 DNA에 의하여 측면에 위치되도록 한다. 그 다음에는 결과적으로 생긴 플라스미드 구조체를 E. coli 박테리아내에서 생장에 의해 증폭시키고(Clewell, 1972) 분리한다(Clewell 등, 1969; Maniatis등, 1982).
두번째로, 삽입되는 DNA 유전자 서열을 포함하는 분리된 플라스미드를 폭스 바이러스와 더불어 세포배양물 예컨대 병아리 배(胚) 피브로블라스트속으로 트랜스펙션(transfection)시킨다. 각각 바이러스 게놈과 플라스미드의 상동적인 폭스 DNA 사이의 재조합은 그 게놈의 비필수적인 부위내에 외부 DNA 서열의 존재에 의해 변형된 폭스바이러스를 나타낸다. 용어 '외부' DNA는 외인성의 DNA 특히 비-폭스 공급원의 DNA를 표시하며, 이것은 통상적으로는 외인성의 DNA가 놓여진 게놈에 의하여 생성되지 않는 유전자 산물을 암호화한다.
유전자 재조합은 일반적으로 DNA 두 가닥사이에서 DNA의 상동부분의 교환이다. 어떤 바이러스에서는 RNA가 DNA를 대치할수 있다. 핵산의 상동부분은 동일한 뉴클레오티드염기 서열을 가지는 핵산(DNA 또는 RNA) 부분이다.
유전자 재조합은 감염된 숙주세포내에서 새로운 바이러스 게놈의 복제 또는 제조동안에 자연적으로 발생할수도 있다. 그리하여 바이러스 유전자 사이의 유전자 재조합은 둘 또는 그 이상의 다른 바이러스 또는 기타 유전자 구조체들로 공-감염된 숙주 세포에서 일어나는 바이러스 복제 사이클 동안에 일어날수 있다. DNA가 제1 바이러스 게놈의 그것과 상동적인 제2 공-감염 바이러스의 게놈부분을 구성하는데 제1 게놈의 DNA 부분이 상호 교환할수 있도록 사용된다.
그러나 재조합은 또한 완전하게 상동적이지 않은 다른 게놈의 DNA 부분사이에서 발생할수 있다. 하나의 그러한 부분이 예컨대 상동 DNA 부분속에 삽입된 항원 결정기를 암호화하는 유전자 또는 유전자 표지(marker)가 첫번째 부분내에 존재하는 것을 제외하고는 또 다른 게놈부분과 상동인 첫번째 게놈의 부위라면, 여전히 재조합이 일어날수 있고, 그 다음 그 재조합 산물은 재조합체 바이러스 게놈내의 유전자 또는 그 유전자 표지의 존재에 의하여 검출가능하다.
변형된 감염성 바이러스에 의한 삽입 DNA 유전자 서열의 성공적인 발현에는 두가지 조건이 필요하다.
첫번째, 변형된 바이러스가 생존가능하도록 삽입이 바이러스의 비필수적인 부위속으로 행해져야 한다. 삽입된 DNA의 발현을 위한 두번째 조건은 프로모터가 삽입된 DNA와 적당한 관계로 존재하는 것이다. 프로모터는 발현될 DNA 서열 위쪽에 위치되도록 존재하여야 한다.
우두 바이러스를 천연두에 대하여 면역화하는데 성공적으로 이용하여, 결국 1980년 천연두를 전세계적으로 박멸시켰다. 그것의 역사과정에서 우두 바이러스의 많은 균주들이 생겨났다. 이러한 다른 균주들은 다른 면역원성을 나타내며 가능성 있는 합병증에 다른 정도로 빠져들게 되는데, 그것의 가장 전형적인 것이 우두후 뇌염과 전신 우두이다(Behbehani, 1983).
천연두의 박멸과 함께 우두 바이러스의 새로운 역할이 중요해지게 되었는데 외부유전자의 발현을 위한 유전공학벡터가 그것이다. 다수의 이형 항원을 코딩하는 유전자들이 우두 바이러스에서 발현되어 종종 대응하는 병원체에 의한 공격 (challenge)에 대해 보호면역으로 된다(Tartaglia등, 1990a).
우두 바이러스 벡터의 유전적 배경은 발현된 외부면역원의 보호효능에 영향을 미친다는 것이 보여졌다. 예컨대 우두 바이러스의 와이어스(Wyeth) 백신균주내에서 엡스타인 바르 바이러스(EBV)의 발현은 EBV 바이러스 유도 림프종에 대해 코튼톱 타마린(cottontop tamarin)을 보호하지 못하는 반면에, 우두 바이러스의 WR 실험실 균주내에서 동일한 유전자의 발현은 보호적이었다(Morgan 등, 1988).
우두 바이러스-기초 재조합체 백신후보의 효능과 안전성 사이의 정밀한 균형은 극히 중요하다. 재조합체 바이러스는 종두를 맞은 동물에서 보호면역반응을 일으키지만 어떤 상당한 병원성은 결핍되는 방법으로 면역원(들)을 제공해야 한다. 그러므로 벡터균주의 약독화가 현재 기술상태로는 매우 바람직한 진보일 것이다.
조직배양물에서 바이러스 생장에 비-필수적인 그리고 그것의 삭제 또는 비활성화는 다양한 동물시스템에서 독성을 감소시키는 많은 우두 바이러스 유전자가 밝혀졌다.
우두 바이러스 티미딘 키나제(TK)를 코딩하는 유전자가 유전자 지도화되었고 (Hruby등, 1982) 서열결정되었다(Hruby 등, 1983; Weir등, 1983). 티미딘 키나제유전자의 불활성화 또는 완전 삭제는 조직배양물의 다양한 세포에서 우두 바이러스 생장을 방해하지는 않는다. TK-우두 바이러스는 또한 다양한 경로로 다양한 숙주에서 접종부위에서 생체내 복제할수 있다.
헤르페스 심플렉스 바이러스 유형2에 대해서 기니아피그를 TK-바이러스로 질내 접종하면 TK+바이러스로 접종한 것보다 척수에서 상당히 더 낮은 바이러스 적정량를 나타낸다는 것이 보여졌다(Stanberry등, 1985). 헤르페스 바이러스 암호화된 TK 활성은 생체외에서 활발하게 대사하는 세포에서의 바이러스 생장에는 중요하지 않지만, 휴지세포에서의 바이러스 생장에는 필요하다는 것을 나타내었다(Jamieson 등, 1974).
TK-우두 바이러스의 약독화는 뇌내의 경로 및 복강내의 경로에 의해 접종된 마우스에서 보여졌다(Buller 등, 1985). WR 신경독성 실험실 균주 및 와이어스 백신균주에 대해서 약독화가 관찰되었다.
피내의 경로에 의해 접종된 마우스에서, TK-재조합체 우두 바이러스는 어버이 TK+우두 바이러스와 비교했을때 동등한 항-우두 바이러스 중화항체를 생성하였는데, 이 시험시스템에서는 TK 기능의 상실은 우두 바이러스 벡터의 면역원성을 크게 감소시키지 않는다는 것을 나타낸다. TK_및 TK+재조합체 우두 바이러스(WR 균주)로 마우스를 비내 접종시키면, 뇌를 포함하여 다른 부위로 바이러스가 상당히 보다 적게 산재되는 것이 발견되었다(Taylor 등, 1991a).
뉴클레오티드 대사와 관련된 다른 효소는 리보뉴클레오티드 리덕타제 (ribonucleotide reductase)이다. 대(大) 서브유니트를 암호화하는 유전자의 삭제에 의한 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)에서 바이러스 암호화된 리보뉴클레오티드 리덕타제 활성의 상실은 생체외에서 분열하는 세포에서의 바이러스 생장 및 DNA 합성에 영향을 갖지 않는다는 것이 보여졌다. 그러나 바이러스가 혈청 결핍된 세포에서 생장할 수 있는 능력을 심하게 손상시켰다(Goldstein등, 1988). 눈의 급성 HSV 감염 및 삼차 신경절에서의 활성화가능 잠복성 감염에 대한 마우스 모델을 이용하여 야생형 HSV에 의해 나타내지는 병독성과 비교할때, 리보뉴클레오티드 리덕타제의 대 서브유니트가 삭제된 HSV는 감소된 병독성을 나타냈다(Jacobson 등, 1989).
리보뉴클레오티드 리덕타제의 소(小) 서브유니트(Slabaugh 등, 1988) 및 대 서브유니트(Schmitt등, 1988)가 우두 바이러스에서 밝혀졌다. 우두 바이러스의 WR 균주에서 리보뉴클레오티드 리덕타제의 대 서브유니트의 삽입적 불활성화는 마우스의 두개내의 접종에 의해 측정되었을때 바이러스의 약독화로 이끌었다(Child 등, 1990).
우두 바이러스 헤마글루티닌 유전자(HA)가 매핑(mapping)되었고 서열결정되었다(Shida, 1986). 우두 바이러스의 HA 유전자는 조직배양에서의 생장에 비필수적이다(Ichihashi등, 1971). 우두 바이러스의 HA 유전자의 불활성화는 두개내의 경로에 의해 접종된 토끼에서 신경독성이 감소되었고 피내의 접종부위에서 토끼에서 병변(病變)이 더 작았다(Shida등, 1988). 우두 바이러스의 WR 균주(Shida 등, 1987), 리스터 균주의 유도체(Shida등, 1988) 및 코펜하겐 균주(Guo등, 1989)에서 외부유전자의 삽입에 HA 유전자좌가 이용되었다.
외부 유전자를 발현하는 재조합 HA-우두 바이러스가 면역원성이 있다는 것이 보여졌고(Guo등, 1989; Itamura 등, 1990; Shida 등, 1988; Shida 등, 1987) 적당한 병원체에 의한 침범에 대해 보호적이라는 것이 보여졌다(Guo등, 1989; Shida 등, 1987).
우두 바이러스(Brighton red 균주)는 계란의 융모요막상에 적색(출혈성) 두진(痘疹)을 생성한다. 우두 바이러스 게놈내의 자연발생적인 삭제는 백색두진을 생성하는 돌연변이체를 만든다(Pickup 등, 1984). 출혈성 기능(u)은 초기 유전자에 의해 암호화되는 38kDa 단백질로 매핑된다(Pickup 등, 1986). 세린 프로테아제 억제인자와 상동성을 갖는 이 유전자는 우두 바이러스에 대한 숙주염증반응을 억제한다는 것을 나타냈고(Palumbo등, 1989) 혈액응고의 억제인자이다.
u유전자는 우두 바이러스의 WR 균주내에 존재한다(Kotwal 등, 1989b).u부위가 외부유전자의 삽입에 의해 불활성된 WR 우두 바이러스 재조합체로 접종된 마우스는u유전자가 손상되지 않은 유사한 재조합체 우두 바이러스로 접종된 마우스와 비교할 때, 외부 유전자산물에 대해 보다 높은 항체수준를 생성한다(Zhou 등, 1990).u부위는 우두 바이러스의 코펜하겐 균주에서 결함있는 비기능적인 형태로 존재한다(Goebel 등, 1990a,b에서 발표된 명명법에 의하여 오픈 리딩프레임 B13 및 B14).
우두 바이러스는 세포질성 A 유형 봉입체(ATI)에서 감염된 세포내에서 국한된다(Kato 등, 1959). ATI의 기능은 동물에서 동물로 전염되는 동안 우두 바이러스 비리온(virion)의 보호인 것으로 생각된다(Bergoin등, 1971). 우두 바이러스 게놈의 ATI 부위는 ATI체의 매트릭스를 형성하는 160kDa 단백질을 암호화한다 (Funahashi등, 1988; Patel 등, 1987). 우두 바이러스는 그것의 게놈내에 상동부위를 포함하고 있음에도 불구하고 일반적으로 ATI를 생성하지 않는다. 우두 바이러스의 WR 균주에서는 게놈의 ATI 부위가 94kDa 단백질로서 번역된다(Patel등, 1988). 우두 바이러스의 코펜하겐 균주에서는 ATI 부위에 해당하는 DNA 서열 대부분이 삭제되고, 남아있는 부위의 3' 말단이 ATI 부위로 부터의 윗쪽 서열과 결합되어 오픈 리딩 프레임(ORF) A26L을 형성한다(Goebel 등, 1990a,b).
우두 바이러스 게놈의 좌측 말단 가까이에서 다양한 자연 발생 삭제 (Altenburger등, 1989; Drillien등, 1981; Lai 등, 1989; Moss등, 1981; Paez등, 1985; Panicali 등, 1981) 및 유전공학적 삭제(Perkus 등, 1991; Perkus등, 1989; Perkus등, 1986)가 발표되었다. 10Kb 자연 발생 삭제가 일어난 우두 바이러스의 WR 균주(Moss등, 1981; Panicali등, 1981)는 마우스에서 두개내의 접종에 의해 약독화되는 것이 보여졌다(Buller 등, 1985). 이 삭제는 후에 17 개의 잠재적인 ORF를 포함하는 것이 보여졌다(Kotwal 등, 1988b). 삭제된 부위내의 특이적인 유전자는 비로킨(virokine)N1L 및 35kDa 단백질(Goebel 등, 1990a,b에서 발표된 명명법에 의하여 C3L)을 포함한다. N1L의 삽입적 불활성화는 정상 및 누드 마우스에 대한 두개내의 접종에 의해 병독성을 감소시켰다(Kotwal 등, 1989a). 35kDa 단백질은 N1L처럼 우두 바이러스 감염세포의 배지속으로 분비된다. 이 단백질은 보체(complement) 조절 단백질 족, 특히 보체 4B 결합 단백질(C4bp)과 상동성을 포함한다(Kotwal 등, 1988a). 세포성 C4bp처럼 우두 바이러스 35kDa 단백질은 보체의 네번째 성분과 결합하여 고전적인 보체 캐스케이드를 억제한다(Kotwal 등, 1990). 그리하여 우두 바이러스 35kDa 단백질은 바이러스가 숙주 방어기작을 벗어나는데 도움을 주는데 포함되는 것 같다.
우두 바이러스 게놈의 좌측말단은 숙주 범위유전자 K1L (Gillard 등, 1986) 및 C7L (Perkus 등, 1990)로서 밝혀진 두 유전자를 포함한다. 이 유전자들의 삭제는 우두 바이러스가 다양한 인간 세포주에서 생장할수 있는 능력을 감소시킨다 (Perkus 등, 1990).
계두 바이러스(Fowlpox virus)(FPV)는 폭스바이러스과의 아비폭스 속(Avipox genus)의 원형 바이러스이다. 이 바이러스는 살아있는 약독화된 백신의 이용에 의해 1920년대 이후로 잘 조절되어온 가금의 경제적으로 중요한 질병을 일으킨다. 아비폭스 바이러스의 복제는 조류종에 제한되며(Matthews, 1982b) 인간을 포함한 비-조류종에서 바이러스가 생산적 감염을 일으킨다는 문헌상의 보고는 없다. 이러한 숙주제한은 바이러스의 다른 종으로의 전염에 대해 본질적인 안전성 장벽을 제공하며 가금에서의 백신 벡터로서 FPV를 이용하는 것은 매력적인 제안이다.
FPV는 가금병원체의 항원을 발현하는 벡터로서 유용하게 이용되어 왔다. 병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 단백질이 FPV 재조합체에서 발현되었다(Taylor 등, 1988a). 재조합체를 병아리와 칠면조속에 접종한후 상동성 또는 이형성 병원성 인플루엔자 바이러스 침입에 대해서 보호적인 면역반응이 유도되었다(Taylor 등, 1988a). 뉴캐슬질병 바이러스의 표면 당단백질을 발현하는 FPV 재조합체가 또한 개발되었다(Taylor 등, 1990; Edbauer 등, 1990).
살아있는 약독화된 벡터 백신의 이용은 많은 가능성있는 이점을 제공한다. 백신을 제조하는데 비용이 보다 저렴하며 많은 가금 병원체가 한 벡터속으로 잠재적으로 투입될수 있다. 면역원이 믿을만한 방법으로 면역시스템에 제공되어 액소성 및 세포매개 반응이 유도될수 있다. 질병원이 복제하지 않기 때문에 백신접종의 부작용이 최소이며 질병원의 환경으로의 계속적인 재-도입이 제거된다.
증가된 안전성을 갖는 새로운 백신균주의 공급이 현재의 기술수준상에서 매우 바람직한 개선일 것이라는 것이 기대될수 있다. 예컨대 바이러스에 의해 하나의 유전자 또는 유전자들의 발현으로부터 보다 안전한 산물 또는 보다 안전한 백신을 제공하기 위해서이다.
본발명의 목적은 증가된 안전성을 가지는 변형된 재조합체 바이러스를 제공하고 그러한 재조합체 바이러스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본발명의 다른 목적은 알려진 재조합체 카나리아폭스 바이러스 백신과 비교할때 증가된 안전성 수준을 갖는 재조합체 폭스 바이러스 백신을 제공하는 것이다.
본발명의 다른 목적은 벡터가 숙주에서 약화된 병독성을 갖도록 벡터가 변형된, 숙주내에서 유전자 산물을 발현하기 위한 변형벡터를 제공하는 것이다.
본발명의 또 다른 목적은 증가된 안전성 수준을 갖는 변형된 벡터 또는 변형된 재조합체 바이러스를 이용하여 생체외에서 배양된 세포에서 유전자산물을 발현하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 이러한 본발명의 목적들 및 기타 목적들과 이점들은 하기의 고찰후에 보다 용이하게 명백해 질 것이다.
증가된 실시예에 의하여 주어진 하기의 상세한 설명(그러나 기술된 특이적인 구체예에만 유일하게 본발명이 제한되도록 의도되지는 않음)은 첨부된 도면들과 관련하여 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1은 티미딘 키나제 유전자의 삭제를 위한 플라스미드 pSD460의 제조 및 재조합체 우두 바이러스 vP410의 생성 방법을 도식적으로 나타낸다.
도 2는 출혈성 부위의 삭제를 위한 플라스미드 pSD486의 제조 및 재조합체 우두 바이러스 vP553의 생성방법을 도식적으로 나타낸다.
도 3은 ATI 부위의 삭제를 위한 플라스미드 pMP494△의 제조 및 재조합체 우두 바이러스 vP618의 생성방법을 도식적으로 나타낸다.
도 4는 헤마글루티닌 유전자의 삭제를 위한 플라스미드 pSD467의 제조 및 재조합체 우두 바이러스 vP723의 생성방법을 도식적으로 나타낸다.
도 5는 유전자 클러스터(Cluster)[C7L-K1L]의 삭제를 위한 플라스미드 pMPCSK1△의 제조 및 재조합체 우두 바이러스 vP804의 생성방법을 도식적으로 나타낸다.
도 6은 대 서브유니트, 리보뉴클레오티드 리덕타제의 삭제를 위한 플라스미드 pSD548의 제조 및 재조합체 우두 바이러스 vP866(NYVAC)의 생성방법을 도식적으로 나타낸다.
도 7은 광견병 당단백질 G유전자의 TK 삭제 유전자좌 속으로의 삽입을 위한 플라스미드 pRW842의 제조 및 재조합체 우두 바이러스 vP879의 생성방법을 도식적으로 나타낸다.
도 8은 EBV 트리플.1 플라스미드 속에 삽입된 EBV 코딩부위의 유전자지도이다.
도 9는 예상되는 아미노산 서열(SEQ ID NO :214)과 합성 spsAg 유전자 및 변형된 합성 우두 바이러스 H6 초기/후기 프로모터의 DNA 서열(SEQ ID NO: 213)을 나타낸다.
도 10은 재조합체 우두 바이러스 vP856의 제조방법을 도식적으로 나타낸다.
도 11은 예상되는 아미노산 서열(SEQ ID NO: 216)과u프로모터/1psAg 유전자의 DNA 서열(SEQ ID NO: 215)을 나타낸다.
도 12는 재조합체 우두 바이러스 vP896의 제조방법을 도식적으로 나타낸다.
도 13은 예상되는 아미노산 서열(SEQ ID NO: 217)과 I3L 프로모터/S12/코어 유전자의 DNA 서열(SEQ ID NO: 87)을 나타낸다.
도 14는 재조합체 우두 바이러스 vP919의 제조방법을 도식적으로 나타낸다.
도 15는 예상되는 아미노산 서열(SEQ ID NO: 219)과 EPV 42kDa 프로모터/1psAg 유전자의 DNA 서열(SEQ ID NO: 218)을 나타낸다.
도 16은 C5 ORF를 포함하는 카나리아폭스PvuII 단편의 DNA 서열(SEQ ID NO: 217)을 나타낸다.
도 17은 재조합체 카나리아폭스 바이러스 vCP65 (ALVAC-RG)의 제조방법을 도식적으로 나타낸다.
도 18은 우두 바이러스 vP555, vP825, vP908, vP923, vP857 및 vP864에 삽입된 JEV 코딩부위의 모식도이다.
도 19은 우두 바이러스 vP766, vP764, vP869, vP729 및 vP725에 삽입된 YF 코딩부위의 모식도이다.
도 20은 우두 바이러스 vP867, vP962 및 vP955에 삽입된 DEN 코딩부위의 모식도이다.
도 21은 F8 ORF를 포함하는 TROVAC DNA의 3661 염기쌍 단편의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 221)을 나타낸다.
도 22는 F7 ORF를 포함하는 TROVAC DNA의 2356 염기쌍 단편의 DNA 서열(SEQ ID NO: 222)을 나타낸다.
도 23은 EIV HA (A1/Prague/56)의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 279)을 나타낸다.
도 24는 EIV HA (A2/Fontainebleu/79)의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 284)을 나타낸다.
도 25는 EIV HA (A2/Suffolk/89)의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 300)을 나타낸다.
도 26은 FeLV-B 엔벨로프(Envelope) 유전자의 뉴클레오티드서열(SEQ ID NO: 310)을 나타낸다.
도 27은 FeLV-Agag및 부분poℓ유전자의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 324)을 나타낸다.
도 28은 FHV-1 CO 균주 gD 상동 유전자의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 290)을 나타낸다.
도 29는 pURF3로서 표시되는 컨센서스(consensus)F 뉴클레오티드 서열 (mumps)(SEQ ID NO: 370)을 나타낸다.
도 30은 pURHN5로서 표시되는 컨센서스 HN 뉴클레오티드 서열(mumps)(SEQ ID NO: 371)을 나타낸다.
도 31은 HIVIII B env를 발현하는 카나리아폭스 바이러스 재조합체 또는 우두 바이러스 재조합체(vCP112, vP911)로 또는 카나리아폭스 바이러스 벡터 또는 우두 바이러스 벡터(ALVAC, NYVAC)로 면역화된 마우스의 비장세포의 세포독성 반응을 나타낸다.
도 32는 세포독성 T 임파구 세포 표면항원 Thy 1.2 및 Lyt 2.2에 대한 항체에 대한 vCP112로 면역화된 마우스 비장의 세포독성효과인자 세포의 민감도를 나타낸다.
도 33은 gp120의 HIVIII B 초변이성(hypervariable)V3 루프에 대한, 그러나 HIV MN 또는 SF2의 V3 루프에 대해서는 아닌 세포독성 T 임파구 항원 리셉터의 특이성을 나타낸다.
도 34는 HIV-1 env를 발현하는 카나리아폭스 재조합체 vCP112 또는 우두 바이러스 재조합체 vP911 또는 벡터(NYVAC, ALVAC)로 면역화된 마우스의 HIVIII B gp120에 대한 항체 반응을 나타낸다(역삼각형은 2차 접종의 투여시간을 나타낸다).
도 35는 동일한 백신 또는 다른 백신으로 이전에 면역화된 지원자들에서의 광견병 중화항체 역가(RFFIT, IU/mℓ), HDC 및 vCP65의 추가접종효과(105.5TCID50)의 그래프를 나타낸다(백신은 0일, 28일 및 180일째날 주어짐, 항체 역가는 0일, 7 일, 28일, 35일, 56일, 173 일, 187 일 및 208일째날 측정됨).
도 36은 vP908, vP555, vP923 및 vP829에 포함된 JEV cDNA 서열을 나타낸다.
도 37은 vP908, vP923, vP866 및 PBS로 0일 및 28 일째날 면역화된 돼지에서 관찰된 NEUT 및 HAI 활성을 나타낸다(화살표는 접종일을 나타낸다).
도 38은 PBS, vP866, vP908 또는 vP923으로 면역화시키고 그 다음 JEV의 B-2358/84 균주를 투여한 각 그룹의 개체 돼지에서 검출된 바이러스혈증의 시간경과를 나타낸다.
도 39는 삭제되어 NYVAC를 생성한 ORF를 도식적으로 나타낸다.
본발명의 한면은 재조합체 바이러스가 약화된 병독성 및 강화된 안전성을 갖도록 바이러스-암호화된 유전기능을 불활성화시킨 변형된 재조합체 바이러스에 관련된다. 기능은 비-필수적이거나 또는 병독성과 관련될수도 있다. 바이러스는 유용하게는 폭스바이러스, 특히 계두바이러스 및 카나리아폭스 바이러스 같은 아비폭스 바이러스 또는 우두 바이러스이다.
본발명의 다른면은 백신으로 접종된 숙주동물에서 면역학적 반응을 유도하기 위한 백신에 관련되는데, 상기의 백신은 재조합체 바이러스가 약화된 병독성 및 강화된 안전성을 갖도록 비필수적인 바이러스-암호화된 유전기능을 비활성화시킨 변형된 재조합체 바이러스 및 담체를 포함한다. 본발명에 따른 백신에서 이용된 바이러스는 유용하게는 폭스바이러스, 특히 계두 바이러스 및 카나리아폭스 바이러스 같은 아비폭스 바이러스 또는 우두 바이러스이다.
본발명의 또다른 면은 재조합체 바이러스가 약화된 병독성 및 강화된 안전성을 갖도록 비필수적인 바이러스-암호화된 유전기능을 비활성화시킨 변형된 재조합체 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 변형된 재조합체 바이러스는 바이러스 게놈의 비-필수적인 부위내에 병원체로부터 추출된 항원성 단백질을 암호화하는 외인성 DNA 서열을 포함하는데, 여기서 숙주에 투여되었을때 조성물은 병원체에 의해 암호화된 단백질에 특이적인 면역학적 반응을 유도할수 있다.
본발명의 또다른 면은 악화된 병독성 및 강화된 안전성을 갖는 변형된 재조합체 바이러스를 세포속으로 도입함으로써 생체외에서 배양한 세포에서 유전자 산물을 발현시키는 방법에 관한 것이다.
본발명의 또다른 면은 바이러스가 약화된 병독성을 갖도록 그 안에서 비활성화된 비필수적인 바이러스-암호화된 유전기능을 갖는 변형된 재조합체 바이러스에 관한 것인데, 여기서 변형된 재조합체 바이러스가 추가로 바이러스 게놈의 비필수적인 부위에 이형 공급원의 DNA를 포함한다. 특히 병독성 인자를 암호화하는 오픈리딩 프레임을 삭제함으로써 또는 자연적으로 숙주 제한된 바이러스를 이용함으로써 유전기능이 비활성화된다. 본발명에 따라 이용된 바이러스는 유용하게는 폭스바이러스, 특히 계두바이러스 및 카나리아폭스 바이러스 같은 아비폭스 바이러스 또는 우두 바이러스이다. 유용하게는 J2R, B13R+ B14R, A26L, A56R, C7L-K1L 및 I4L(Goebel 등, 1990 a, b에서 발표된 명명법에 의함)으로 구성되는 그룹으로부터 오픈 리딩 프레임이 선택된다. 이것과 관련하여, 오픈 리딩 프레임은 티미딘 키나제 유전자, 출혈성 부위, A 유형 봉입체 부위, 헤마글루티닌 유전자, 숙주범위 유전자 부위 또는 대 서브유니트, 리보뉴클레오티드 리덕타제를 포함한다.
새로운 우두 바이러스 백신균주 NYVAC(vP866)를 개발하기 위하여 우두 바이러스의 코펜하겐 백신균주를 알려진 또는 가능성 있는 독성인자를 암호화하는 게놈의 6 비필수적 부위를 삭제하여 변형시켰다. 순차적인 삭제가 하기에서 세부적으로 기술된다. 우두 바이러스 제한단편, 오픈 리딩 프레임 및 뉴클레오티드 위치의 모든 표기는 Goebel등, 1990 a, b에서 발표된 명명법에 근거하고 있다.
삭제 유전자좌는 또한 외부유전자의 삽입을 위한 수용체 유전자좌로서 처리되었다.
NYVAC에서 삭제된 부위는 하기에 나열되어 있다. 또한 삭제된 부위에 대한 약자 및 오픈 리딩 프레임 표기(Goebel 등, 1990 a,b), 특정 삭제를 거쳐 모든 삭제를 포함하는 우두 바이러스 재조합체의 표기(vP)도 나열되어있다.
(1) 티미딘 키나제 유전자(TK; J2R) vP410;
(2) 출혈성 부위(u; B13R + B14R) vP553;
(3) A 유형 봉입체 부위(ATI; A26L) vP618;
(4) 헤마글루티닌 유전자(HA; A56R) vP723;
(5) 숙주 범위 유전자 부위(C7L -K1L) vP804; 및
(6) 대 서브유니트, 리보뉴클레오티드 리덕타제(I4L) vP866(NYVAC).
DNA 클로닝 및 합성
플라스미드를 표준방법에 의하여 제조, 스크리닝 및 생장시켰다(Maniatis 등, 1982; Perkus 등, 1985; Piccini 등, 1987), 제한 엔도뉴클레아제는 Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN에서 구입했다. E. coli 중합효소의 클리나우(Klenow) 단편은 Boehringer Mannheim Biochemicals에서 구입하였다. BAL-31 엑소뉴클레아제 및 파지 T4 DNA 리가제는 New England Biolabs에서 구입하였다. 시약들은 다양한 공급처에 의해 특정화된 대로 사용하였다.
합성 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 이전에 기술한 대로(Perkus 등, 1989) 바이오서치 8750 또는 Applied Biosystems 380B DNA 합성기에서 제조되었다. DNA 서열결정은 이전에 기술한 대로 (Guo등, 1989) 시쿼나제(Sequenase)를 사용하여 (Tabor등, 1987) 디데옥시-체인 종결방법(Sanger 등, 1977)에 의하여 수행되었다. 서열확인(Engelke등, 1988)을 위한 중합효소 사슬반응(PCR)에 의한 DNA 증폭은 자동화된 Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler에서 통상 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 GeneAmp DNA 증폭시약 키트(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT)를 이용하여 수행되었다.
과량의 DNA 서열은 플라스미드로부터 제한효소 분해 및 BAL-31 엑소뉴클레아제에 의한 제한된 분해 및 합성 올리고뉴클레오티드를 이용한 돌연변이 유발 (Mandecki, 1986)에 의하여 삭제되었다.
세포, 바이러스 및 트랜스펙션
우두 바이러스의 코펜하겐 균주의 배양조건 및 기원은 이전에 기술되었다 (Guo등, 1989). 재조합에 의한 재조합체 바이러스의 생성, 니트로셀룰로스 필터의 인시투 혼성화(in situ hybridization) 및 β-갈락토시다제 활성에 대한 스크리닝은 이전에 기술된 것과 같다(Panicali 등, 1982; Perkus등, 1989).
본발명 및 그것의 많은 이점에 대한 보다 나은 이해가 실례에 의해 주어진 하기의 실시예로부터 가능할 것이다.
실시예1
티미딘 키나제 유전자(J2R)의 삭제를 위한 플라스미드 pSD460의 제조
이제 도 1에 대해 언급하면, 플라스미드 pSD 406은 pUC8 속에 클로닝된 우두 바이러스HindIII J (pos. 83359-88377)를 포함한다. pSD406을HindIII 및PvuII로 절단하고, pUC8속에 클로닝된HindIII J의 좌측면으로부터의 1.7kb 단편이HindIII/SmaI으로 절단되어 pSD447을 형성한다. pSD447은 J2R에 대한 전체 유전자를 포함한다(pos. 83855 -84385). 개시코돈이NℓaIII 위치내에 포함되며 중지코돈이SspI 위치내에 포함된다. 전사의 방향은 도 1의 화살표에 의해 나타내진다.
좌측 측면암(flanking arm)을 얻기 위하여, pSD447로부터 0.8kbHindIII/EcoRI 단편을 분리한 다음,NℓaIII로 절단하고 0.5kbHindIII/NℓaIII 단편을 분리하였다. 어닐링된 합성 올리고뉴클레오티드 MPSYN43/MPSYN44 (SEQ ID No:1/SEQ ID No:2)
가HindIII/EcoRI 절단된 pUC18 벡터 플라스미드 속으로 0.5kbHindIII/NℓaIII 단편과 결합되어, 플라스미드 pSD449를 생성하였다.
우두 바이러스 우측 측면 암 및 pUC 벡터 서열을 포함하는 제한 단편을 얻기 위해서, pSD447을 우두 바이러스 서열내에서SspI으로(부분) 그리고 pUC/우두 바이러스 접합부에서HindIII로 절단하여, 2.9kb 벡터 단편을 분리하였다. 이 벡터 단편을 어닐링된 합성 올리고뉴클레오티드 MPSYN45/MPSYN46(SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4)과 결합하여 pSD459를 생성하였다.
좌측 및 우측 측면 암을 한 플라스미드속에 결합하기 위하여, pSD449로부터 0.5kbHindIII/SmaI 단편을 분리하였고,HindIII/SmaI으로 절단된 pSD 459 벡터 플라스미드와 결합시켜서 플라스미드 pSD 460을 생성하였다. pSD 460은 야생형 어버이 우두 바이러스 코펜하겐 균주 VC-2와의 재조합을 위한 도너 플라스미드로서 이용되었다.32P 표지된 프로브가 주형으로서 MPSYN45(SEQ ID NO:3) 및 프라이머로서 상보적인 20mer 올리고뉴클레오티드 MPSYN47(SEQ ID NO:5) (5' TTAGTTAATTAGGCGGC-CGC 3')를 사용하여 프라이머 연장에 의하여 합성되었다. 재조합체 바이러스 vP410은 플라크 혼성화에 의해 확인되었다.
실시예2
출혈성 부위(B13R + B14R)의 삭제를 위한 플라스미드 pSD486의 제조
이제 도 2에 대해 언급하면, 플라스미드 pSD419는 pUC8 속에 클로닝된 우두 바이러스SaℓI G(pos. 160,744 -173,351)를 포함한다. pSD422는 pUC8 속에 클로닝된 우측SaℓI J(pos. 173,351 -182,746)에 인접하는 우두 바이러스SaℓI 단편을 포함한다. 출혈성 부위u, B13R-B14R (pos. 172,549-173,552)에 대해 삭제된 플라스미드를 제조하기 위하여, 좌측 측면 암의 공급원으로서 pSD419를 이용하였고 우측 측면 암의 공급원으로서 pSD422를 이용하였다.u부위에 대한 전사의 방향이 도 2에서 화살표로서 나타내어진다.
pSD419에서 원하지 않는 서열을 제거하기 위해서,NcoI 위치의 좌측서열 (pos. 172,253)을 pSD419를NcoI/SmaI으로 분해함으로써 제거하고 E.coli 중합효소의 클리나우 단편으로 블런트 말단화(blunt-ending)하고 결합하여 플라스미드 pSD476을 생성하였다. 우두 바이러스 우측 측면 암은 B14R의 중지코돈에서HpaI으로 pSD422를 분해하고 우측 0.3kb를NruI으로 분해함으로써 얻어졌다. 이 0.3kb 단편을 분리하고, pSD476으로부터 분리한 3.4kbHincII 벡터 단편과 결합시켜서 플라스미드 pSD477을 생성하였다. pSD477에서 우두 바이러스u부위의 부분삭제의 위치가 삼각형으로 표시된다. pSD477에서 남아있는 B13R 코딩서열은CℓaI/HpaI으로 분해함으로써 제거하였고, 결과적인 벡터단편이 어닐링된 합성 올리고뉴클레오티드 SD 22mer/SD 20mer (SEQ ID NO:6/SEQ ID NO:7)
과 결합되어 pSD479가 생성되었다. pSD479는 개시코돈(밑줄친부분) 다음에BamHI 위치를 포함한다. B13-B14(u) 삭제 유전자좌내의 E. coli 베타-갈락토시다제를u프로모터 조절하에 놓기 위해서, 베타-갈락토시다제 유전자(Shapira등, 1983)를 포함하는 3.2kbBamHI 단편이 pSD479의BamHI 위치속에 삽입되어 pSD479BG를 생성하였다. 우두 바이러스 vP410과의 재조합을 위한 도너 플라스미드로서 pSD479BG를 이용하였다. 재조합 우두 바이러스 vP533은 발색기질 X-gaℓ 존재하에 청색플라크로서 분리되었다. vP533에서 B13R-B14R 부위가 삭제되고 베타-갈락토시다제에 의해 대체되었다.
vP533에서 베타-갈락토시다제 서열을 제거하기 위해서, 폴리링커 부위를 포함하지만u삭제 접합부에 있는 개시코돈은 없는 pSD477의 유도체인 플라스미드 pSD486이 이용되었다. 먼저 상기에서 언급한 pSD477의CℓaI/HpaI 벡터 단편이 어닐링된 합성 올리고뉴클레오티드 SD 42mer/SD 40mer (SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:9)와 결합되어 플라스미드 pSD478이 생성되었다.
pUC/우두 바이러스 접합부의EcoRI 위치 다음이 pSD478의EcoRI으로의 분해에 의해 파괴되고 E. coli 중합효소의 클리나우 단편으로 블런트 말단화시키고 결합시켜서 플라스미드 pSD478E-를 생성했다. pSD478E-가BamHI 및HpaI으로 분해되었고 어닐링된 합성 올리고뉴클레오티드 HEM5/HEM6(SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:11)과 결합되어 플라스미드 pSD486을 생성하였다.
pSD486이 재조합체 우두 바이러스 vP533과의 재조합을 위한 도너 플라스미드로서 사용되어 vP553을 생성하였고 이것은 X-gaℓ존재하에서 투명한 플라크로서 분리되었다.
실시예3
ATI 부위(A26L)의 삭제를 위한 플라스미드 pMP494 △의 제조
이제 도 3에 대해 언급하면, pSD414는 pUC8 속에 클로닝된SaℓI B를 포함한다. A26L부위의 좌측의 원하지 않는 DNA 서열을 제거하기 위해서 pSD414가 우두 바이러스 서열내에서(pos. 137,079)XbaI으로, pUC/우두 바이러스 접합부에서HindIII로 절단되었다. 그 다음에는 E.coli 중합효소의 클리나우 단편으로 블런트 말단화되고 결합되어 플라스미드 pSD483을 생성하였다. A26L 부위의 우측의 원하지 않는 우두 바이러스 DNA 서열을 제거하기 위해서 pSD483이EcoRI으로(pos. 140,665 및 pUC/우두 바이러스 접합부에서) 절단되고 결합되어, 플라스미드 pSD484를 형성하였다.
A26L 코딩부위를 제거하기 위해서 pSD484가 A26L ORF로부터 다소 윗쪽에서 (pos. 139,004)NdeI(부분)으로, A26L ORF로부터 다소 아래쪽에서(pos. 137,889)HpaI으로 절단되었다. 5.2kb 벡터 단편이 분리되었고 어닐링된 합성 올리고뉴클레오티드 ATI3/ATI4 (SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:13)
와 결합되어 A26L로부터 윗쪽 부위를 재구성하고 A26L ORF를 제한위치BgℓⅡ,EcoRI 및HpaI을 포함하는 짧은 폴리링커 부위로 상기에 나타낸 것처럼 대체하였다. 결과적인 플라스미드는 pSD485로 표시되었다. pSD485의 폴리링커 부위내의BgℓⅡ 및EcoRI 위치가 유일하지 않기 때문에, 원하지 않는BgℓⅡ 및EcoRI 위치가 플라스미드 pSD483(상기에 기술된)으로부터BgℓⅡ(pos. 140,136)로, PUC/우두 바이러스 접합부에서EcoRI으로 분해되어 제거되고, E. coli 중합효소의 클리나우 단편으로 블런트 말단화되고 결합되었다. 결과적인 플라스미드는 pSD489로 표시되었다. A26L ORF를 포함하는 pSD489의 1.8kbClaI(pos. 137,198)EcoRV(pos. 139,048) 단편을 pSD485의 대응하는 0.7kb 폴리링커-포함ClaI/EcoRV 단편으로 대체하여 pSD492를 생성하였다. pSD 492의 폴리링커 부위에서BgℓⅡ 및EcoRI 위치는 특이하다.
우두 바이러스 11KDa 프로모터(Bertholet 등, 1985; Perkus 등, 1990)의 조절하에서 E.coli 베타-갈락토시다제 유전자(Shapira 등, 1983)를 포함하는 3.3kbBgℓⅡ 카세트가 pSD492의BgℓⅡ 위치 속에 삽입되어, pSD493KBG를 형성하였다. 플라스미드 pSD493KBG가 레스큐 바이러스(rescuing virus) VP553과의 재조합에 사용되었다. A26L삭제 부위내에 베타-갈락토시다제를 포함하는 재조합체 우두 바이러스 VP581이 X-gaℓ존재하에서 청색 플라크로서 분리되었다.
우두 재조합체 바이러스 vP581로부터 베타-갈락토시다제 서열의 제거를 위한 플라스미드를 생성하기 위해서, 플라스미드 pSD492의 폴리링커 부위가 합성 올리고 뉴클레오티드 MPSYN177(SEQ ID N0:14) (5' AAAATGGGCGTGGATTGTTAACTTTATATAACTT-ATTTTTTGAATATAC 3')를 사용하여 돌연변이 유발(Mandecki, 1986)에 의하여 삭제되었다. 결과적인 플라스미드 PMP494 △에서는, 전체 A26L ORF를 포함하여 우두 DNA포함위치 [137,889-138,937]가 삭제되었다. PMP494 △과 베타-갈락토시다제 포함 우두 재조합체 vP581사이의 재조합에 의하여 우두 바이러스 삭제 돌연변이체 vP618이 생성되었고, 이것은 X-gaℓ 존재하에서 투명한 플라크로서 분리되었다.
실시예 4
헤마글루티닌 유전자(A56R)의 삭제를 위한 플라스미드 pSD467의 제조
도 4에 대해 언급하면, 우두 바이러스SaℓI G 제한 단편(pos. 160,744-173,351)은Hind Ⅲ A/B 접합부(pos. 162,539)를 가로지른다. pSD419는 PUC8 속에 클로닝된 우두 바이러스SaℓI G를 포함한다. 헤마글루티닌(HA) 유전자에 대한 전사의 방향이 도 4에서 화살표에 의해 표시된다.
HindⅢ B로부터 유래한 우두서열은 pSD419를 우두서열 내에서 그리고 PUC/ 우두 접합부에서HindⅢ로 분해하고 결합시킴으로써 제거되었다. 결과적인 플라스미드 PSD456은 좌측으로 우두서열 0.4kb 및 우측으로 우두서열 0.4kb가 측면위치된 HA 유전자 A56R을 포함한다. A56R 코딩서열은 pSD456을 A56R 코딩서열로부터 윗쪽에서RsaI(부분; pos. 161,090)으로, 유전자 말단가까이에서EagI(pos. 162,054)으로 절단함으로써 제거되었다. pSD456으로부터 3.6kbRsaI/EagI 벡터 단편을 분리하였고 어닐링된 합성 올리고뉴클레오티드 MPSYN 59(SEQ ID NO:15), MPSYN 62(SEQ ID NO:16), MPSYN 60(SEQ ID NO:17), 및 MPSYN 61(SEQ ID NO:18)
과 결합시켜서 A56R ORF로부터 윗쪽 DNA서열을 재구성하고 A56R ORF를 상기에 나타낸 것처럼 폴리링커 부위로 대체하였다. 결과적인 플라스미드는 pSD466이다. pSD466에서 우두 삭제는 위치[161,185-162,053]를 포함한다. pSD466에서는 삭제위치가 도 4에서 삼각형으로서 나타내진다.
우두 바이러스 11KDa 프로모터(Bertholet 등, 1985: Guo 등, 1989)의 조절하에서 E.coli 베타-갈락토시다제 유전자(Shapira 등, 1983)를 포함하는 3.2kbBgℓⅡ/BamHI(부분) 카세트가 pSD466의BgℓⅡ 위치속에 삽입되어 pSD466KBG를 형성하였다. 플라스미드 pSD466KBG가 레스큐 바이러스 vP618과의 재조합에서 사용되었다. A56R삭제에서 베타-갈락토시다제를 포함하는 재조합체 우두 바이러스 vP708은 X-gaℓ의 존재하에 청색 플라크로서 분리되었다.
베타-갈락토시다제 서열이 도너플라스미드 pSD467을 이용하여 vP708로부터 삭제되었다.EcoRI,SmaI 및BamHI 위치가 pSD466을EcoRI/BamHI으로 분해하고 E.coli 중합효소의 클리나우단편으로 블런트 말단화시키고 결합시켜서 PUC/우두 바이러스 접합부로부터 제거된 것을 제외하고는, pSD467은 pSD466과 동일하다. vP708과 pSD467 사이의 재조합에 의해 재조합체 우두삭제 돌연변이체 vP723으로 되었고 이것은 X-gaℓ존재하에서 투명한 플라크로서 분리되었다.
실시예 5
오프리딩 프레임 [C7L-K1L]의 삭제를 위한 플라스미드 PMPCSK1△의 제조
도 5에 대해 기술하면, PMPCSK1 △의 제조에 하기의 우두 바이러스클론을 이용하였다. pSD420은 PUC8 속에 클로닝된SaℓIH이다. pSD435는 PUC18속에 클로닝된KpnIF이다. pSD435를SphI으로 절단하고 다시 결합시켜서 pSD451을 형성하였다.
pSD451에서는,HindⅢ M의SphI 위치(pos. 27,416)의 좌측 DNA서열이 제거된다(Perkus 등, 1990). pSD409는 PUC8 속에 클로닝된HindⅢ M이다.
우두 바이러스로부터[C7L-K1L] 유전자 클러스터의 삭제를 위한 기질을 제공하기 위해서, 먼저 E.coli 베타-갈락토시다제가 하기와 같이 우두 바이러스 M2L삭제 유전자좌(Guo 등, 1990) 속에 삽입되었다. pSD409에서BgℓⅡ 위치를 제거하기 위해서, 플라스미드를 우두 바이러스 서열내에서(pos. 28,212)BgℓⅡ로, PUC/우두 바이러스 접합부에서BamHI으로 절단하고, 그 다음 결합시켜서 플라스미드 PMP409B를 형성하였다. PMP409B는 유일한SphI 위치(pos. 27,416)에서 절단되었다. M2L 코딩서열은 합성 올리고뉴클레오티드
를 이용하여 돌연변이 유발(Guo 등, 1990; Mandecki, 1986)에 의하여 제거되었다.
결과적인 플라스미드 PMP409D는 상기에 나타낸 것처럼 M2L삭제 유전자좌 속에 삽입된 유일한BgℓⅡ 위치를 포함한다. 11KDa 프로모터(Bertholet 등, 1985) 조절하에서 E. coli 베타-갈락토시다제 유전자(Shapira 등, 1983)를 포함하는 3.2kbBamHI( 부분)/BgℓⅡ카세트가BgℓⅡ로 절단된 PMP409D 속에 삽입되었다. 결과적인 플라스미드 PMP409DBG(Guo등, 1990)가 레스큐 우두 바이러스 vP723과의 재조합을 위한 도너 플라스미드로서 이용되었다. M2L 삭제 유전자좌 속에 삽입된 베타-갈락토시다제를 포함하는 재조합 우두 바이러스 vP784가 X-gaℓ존재하에서 청색 플라크로서 분리되었다.
우두 바이러스 유전자[C7L-K1L]에 대해 삭제된 플라스미드는SmaI,HindⅢ로 절단된 PUC8에서 조립되고 E.coli 중합효소의 클리나우 단편으로 블런트 말단화되었다. 우두 바이러스HindⅢ C서열로 구성되는 좌측측면 암은 pSD420을XbaI (pos. 18,628)으로 분해시키고 E.coli 중합효소의 클리나우 단편으로 블런트 말단화시키고BgℓⅡ(pos. 19,706)로 분해시킴으로써 얻어졌다. 우두 바이러스HindⅢ K서열로 구성되는 우측측면암은 pSD451을BgℓⅡ(pos. 29,062) 및 EcoRV(pos. 29,778)로 분해시켜서 얻어졌다. 결과적인 플라스미드 PMP581CK는HindⅢC에서BgℓⅡ위치(pos. 19,706)와HindⅢK에서BgℓⅡ위치(pos. 29,062) 사이에서 우두 바이러스 서열에 대해 삭제된다. 플라스미드 PMP581CK에서 우두 바이러스 서열의 삭제 위치는 도 5에서 삼각형으로 표시된다.
우두 바이러스 삭제 접합부에서 과량의 DNA를 제거하기 위해서 플라스미드 PMP581CK는 우두서열(pos. 18,811; 19,655)내의NcoI 위치에서 절단되었고, Baℓ-31 엑소뉴클레아제로 처리되고, 합성 올리고뉴클레오티드 MPSYN233 (SEQ ID NO: 20) 5'-TGTCATTTAACACTATACTCATATTAATAAAAATAATATTTATT-3'을 사용하여 돌연변이발 (Mandecki, 1986)시켰다.
결과적인 플라스미드 PMPCSK1△는 12 우두 오픈 리딩 프레임[C7L-K1L]을 포함하여 우두서열위치 18,805-29,108에 대해서 삭제된다. PMPCSK1 △과 베타-갈락토시다제 포함 우두 재조합체 vP784사이의 재조합에 의해 우두삭제 돌연변이체 vP804가 생성되었고, 이것은 X-gaℓ의 존재하에서 투명한 플라크로서 분리되었다.
실시예 6
대 서브유니트, 리보뉴클레오티드 리덕타제(I4L)의 삭제를 위한 플라스미드 pSD 548의 제조
도 6에 대해 설명하면, 플라스미드 pSD405는 PUC8 속에 클로닝된 우두HindⅢI(pos. 63,875-70,367)을 포함한다. pSD405는 우두서열(pos. 67,933)내에서EcoRV로, PUC/우두 접합부에서SmaI으로 분해되고 결합되어 플라스미드 pSD518을 형성하였다. pSD548의 제조에 사용된 모든 우두 제한 단편들의 공급원으로서 pSD518이 이용되었다.
우두 바이러스 I4L 유전자는 위치 67,371-65,059로부터 연장된다. I4L에 대한 전사의 방향은 도 6에서 화살표로 표시된다. I4L 코딩서열의 일 부분에 대해 삭제된 벡터플라스미드 단편을 얻기 위해서, pSD518을BamHI(pos. 65,381) 및HpaI (pos. 67,001)으로 분해시키고 E.coli 중합효소의 클리나우 단편을 이용하여 블런트 말단화시켰다. 이 4.8kb벡터단편이 우두 바이러스 11KDa 프로모터(Bertholet 등, 1985; Perkus 등, 1990) 조절하에서 E.coli 베타-갈락토시다제 유전자(Shapira 등, 1983)를 포함하는 3.2kbSmaI카세트와 결합되어 플라스미드 pSD524KBG를 형성하였다. pSD524KBG는 우두 바이러스 vP804와의 재조합을 위한 도너 플라스미드로서 이용되었다. I4L 유전자의 부분삭제에 베타-갈락토시다제를 포함하는 제조합 우두 바이러스 vP855가 X-gaℓ의 존재하에 청색 플라크로서 분리되었다.
vP855로부터 I4L ORF의 나머지 및 베타-갈락토시다제를 삭제하기 위해 삭제 플라스미드 pSD548을 구성하였다.
좌측 및 우측 우두 바이러스 측면 암을 하기에 상세히 기술되고 도 6에서 도식적으로 나타낸 것처럼 PUC8에서 별도로 조립하였다.
좌측 우두 바이러스 측면 암을 수용하기 위한 벡터 플라스미드를 구성하기 위해서, PUC8을BamHI/EcoRI으로 절단하고 어닐링된 합성 올리고뉴클레오티드 518A1/518A2(SEQ ID NO:21/SEQ ID NO:22)
와 결합시켜서 플라스미드 pSD531을 형성하였다. pSD531을 RsaI(부분) 및BamHI으로 절단시키고 2.7kb벡터 단편을 분리하였다. pSD518을BgℓⅡ(pos. 64,459)/RsaI (pos. 64,994)로 절단시키고 0.5kb단편을 분리하였다. 두 단편을 함께 결합시켜서 pSD537을 형성하였고, 이것은 I4L 코딩서열의 완전한 우두 바이러스 좌측 측면암을 포함한다.
우측 우두 바이러스 측면 암을 수용하기 위한 벡터플라스미드를 구성하기 위해서, PUC8을BamHI/EcoRI으로 절단하고 어닐링된 합성 올리고뉴클레오티드 518B1/ 518B2(SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24)
와 결합시켜서 플라스미드 pSD532를 형성하였다.
pSD532를RsaI(부분)/EcoRI으로 절단하고 2.7kb 벡터단편을 분리하였다. pSD518을 우두 바이러스 서열내에서(pos. 67,436)RsaI, 우두 바이러스/PUC접합부에서EcoRI으로 절단하고 0.6kb 단편을 분리하였다. 두 단편을 함께 결합시켜서 pSD538을 형성하였는데, 이것은 I4L코딩서열의 완전한 우두 바이러스 우측 측면 암을 포함한다.
우측 우두 측면 암은 pSD538로부터 0.6kbEcoRI/BgℓⅡ 단편으로서 분리되었고EcoRI/BgℓⅡ로 절단된 pSD537 벡터플라스미드 속에 결합되었다. 결과적인 플라스미드 pSD539에서는 I4L ORF(pos. 65,047-67,386)이 폴리링커 부위에 의해 대체되는데, 이것은 PUC 백그라운드에서 모두 좌측으로는 0.6kb 우두 DNA 그리고 우측으로는 0.6kb 우두 DNA에 의해 측면위치된다. 우두 바이러스 서열내의 삭제 위치는 도 6에서 삼각형으로 표시된다. 재조합 우두 바이러스 vP855에 있는 베타-갈락토시다제 서열과 pSD539의 PUC-유래된 부분에 있는 베타-갈락토시다제 서열의 가능한 재조합을 피하기 위해서, 우두 바이러스 I4L 삭제 카세트가 pSD539로부터 PRC11속으로 움직여지는데, 이 pRC11은 모든 베타-갈락토시다제 서열이 제거되고 폴리링커 부위로 대체된 PUC 유도체이다(Colinas 등, 1990).
pSD539를EcoRI/PstI으로 절단하고 1.2kb단편을 분리하였다. 이 단편을EcoRI/PstI으로 절단된 pRC11(2.35kb) 속에 결합시켜서 pSD548을 형성하였다.
pSD548과 베타-갈락토시다제 포함 우두재조합체 vP855사이의 재조합에 의해 우두 바이러스 삭제 돌연변이체 vP866이 형성되었고, 이것은 X-gaℓ 존재하에 투명한 플라크로서 분리되었다.
재조합 우두 바이러스 vP866의 DNA를 제한 분해와 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 분석하였다. 제한 패턴은 기대한 것과 같았다. 상기에서 세부화된 6 삭제 유전자좌 측면위치된 프라이머 및 주형으로서 vP866을 사용한 중합효소 사슬반응(PCR) (Engelke 등, 1988)은 기대된 크기의 DNA단편들을 생성하였다. 삭제 접합부 영역 부근의 PCR생성된 단편들의 서열분석은 접합부가 기대한 것과 같다는 것을 확인시켰다. 상기에서 기술된 것처럼 6처리된 삭제돌연변이를 포함하는 재조합 우두 바이러스 vP866를 우두 바이러스 백신 균주'NYVAC' 라고 표시하였다.
실시예 7
광견병 당단백질 G 유전자의 NYVAC 속으로의 삽입
우두 바이러스 H6 프로모터(Taylor 등, 1988 a,b) 조절하에서 광견병 당단백질 G를 암호화하는 유전자가 TK 삭제 플라스미드 pSD513 속으로 삽입되었다. pSD513은 폴리링커 부위의 존재를 제외하고는 플라스미드 pSD460(도 1)과 동일하다.
도 7를 언급하면, pSD460을SmaI으로 절단하고 플라스미드 벡터를 어닐링된 합성 올리고뉴클레오티드 VQ1A/VQ1B(SEQ ID NO:25/SEQ ID NO:26)
과 결합시켜서 폴리링커 부위가 삽입되어 벡터 플라스미드 pSD513을 형성하였다. pSD513을SmaI으로 절단하고 우두 바이러스 H6 프로모터(Taylor 등, 1988 a,b) 조절하에서 광견병 당단백질 G유전자를 암호화하는 유전자를 포함하는SmaI 말단 1.8kb카세트와 결합시켰다. 결과적인 플라스미드를 pRW842라고 나타냈다. pRW842는 NYVAC레스큐 바이러스(vP866)와의 재조합을 위한 도너 플라스미드로서 이용되었다. 재조합 우두 바이러스 vP879는 광견병 당단백질 G코딩서열에 대한32P-표지된 DNA프로브를 이용하여 플라크 혼성화에 의해 확인되었다.
본 발명의 변형된 재조합 바이러스는 재조합 백신 벡터로서 이점을 제공한다. 벡터의 약화된 병독성이 유용하게 백신접종된 개체에서 접종에 기인한 도피 감염 가능성에 대한 기회를 감소시키고 또한 접종된 개체에서 비접종된 개체로의 전염 또는 환경의 오염을 감소시킨다.
변형된 재조합체 바이러스는 또한 유용하게, 세포에서 유전자 산물을 암호화하고 발현하는 외부 DNA를 갖는 변형된 재조합체 바이러스를 세포속에 도입시킴으로써, 생체외 배양한 세포에서 유전자 산물을 발현하기 위한 방법에도 이용된다.
실시예 8
뉴캐슬병 바이러스의 융합 및 헤마글루티닌-뉴라미니다제 당 단백질을 발현하는 TROVAC-NDV의 제조
독성이 있는 NDV균주 텍사스의 F 및 HN 유전자를 발현하는 계두바이러스 (FPV) 벡터가 구성되었다. 생성된 재조합체는 TROVAC-NDV라고 표기되었다. TROVAC -NDV는 재조합체 바이러스로 감염된 조류세포에서 믿을만하게 프로세싱된 NDV 당단백질을 발현하고, 데이올드 병아리의 접종은 계속되는 독성 NDV 침범에 대해 보호해준다.
세포 및 바이러스
NDV의 텍사스 균주는 벨로겐(velogen)성 균주이다. F 및 HN 유전자의 cDNA 클론의 제조는 이전에 기술되었다(Taylor 등, 1990; Edbauer 등, 1990). FP-1으로 표시되는 FPV 균주는 이전에 기술되었다(Taylor 등, 1988a). 그것은 데이올드 병아리의 백신접종에 유용한 약독화된 백신균주이다. 어버이 바이러스 균주 Duvette는 병아리에서 계두 딱지로서 프랑스에서 얻어졌다. 이 바이러스는 병아리 발육란 (embryonated eggs)에서 대략 50번의 연속 계대접종 다음에는 병아리 배 피르보블라스트 세포상에서 25번의 계대접종에 의하여 약독화되었다. 바이러스를 네번 연속적으로 플라크 정제시켰다. 하나의 플라크 분리물을 일차 CEF세포에서 더욱 증폭시켰고, TROVAC으로 표시되는 스톡바이러스를 확립하였다. TROVAC-NDV를 생성하기 위한 생체외 재조합 테스트에서 이용되는 스톡 바이러스를 플라크 분리물의 일차 CEF 세포에서 열두번 계대접종시켰다.
NDV-F에 대한 카세트의 제조
F 단백질 코딩서열의 5' 말단으로부터 거의 22 뉴클레오티드를 포함하는 1.8kbpBamHI 단편이 pNDV81 (Taylor 등, 1990)으로부터 제거되고 pUC18의BamHI 위치에서 삽입되어 pCE13을 형성하였다. 이전에 기술된 우두 바이러스 H6 프로모터(Taylor 등, 1988 a,b; Guo 등, 1989; Perkus등, 1989)가 pCE13을SaℓI으로 분해하고, 접착성(sticky) 말단을E.coliDNA 중합효소의 클리나우 단편으로 채우고HindIII로 분해하여 pCE13 속으로 삽입되었다. 그 다음 H6 프로모터 서열을 포함하는HindIII-EcoRV 단편을 pCE13속에 삽입시켜서 pCE38을 형성하였다. pCE38을KpnI 및NruI으로 분해하고 어닐링되고 키나제화된 올리고뉴클레오티드 CE75 (SEQ ID NO:27) 및 CE76 (SEQ ID NO:28)을 삽입하여 완전한 5' 말단을 생성하여 pCE47을 생성하였다.
NDV-F의 3' 말단으로부터 비-코딩서열을 제거하기 위해서 pCE13에서SmaI 내지PstI 단편을 pUC18의SmaI 및PstI 위치속에 삽입시켜서 pCE23을 형성하였다. pCE23을SacI,BamHI, 엑소뉴클레아제 III, SI 뉴클레아제 및EcoRI으로 연속분해시켜서 비-코딩 서열을 제거하였다. 그다음 어닐링되고 키나제화된 올리고뉴클레오티드 CE42(SEQ ID NO:29) 및 CE43(SEQ ID NO:30)을 삽입시켜서 pCE29를 형성하였다.
그 다음 NDV-F 서열의 3'말단이 NDV-F의 5'말단을 이미 포함하는 플라스미드 pCE20 속에 pCE29의PstI-SacI 단편을 pCE20의PstI 및SacI 위치속에 클로닝함으로써 삽입되어 PCE32를 형성하였다. pCE20의 생성은 이전에 Taylor 등, 1990에서 기술되었다.
pCE32 속에 포함된 3'NDV-F 서열과 pCE47속에 포함된 H6 프로모터 및 NDV-F 5'서열을 정렬하기 위해서, pCE47의HindIII-PstI 단편을 pCE32의HindIII 및PstI 위치속에 삽입시켜서 pCE49를 형성하였다. 그 다음 H6 프로모터-NDV-F 서열이 pCE49의HindIII-NruI 단편을 pJCA002 (하기에 기술됨)의HindIII 및SmaI 위치속에 클로닝함으로써 탈-ORF된 F8 유전자 좌 (하기에 기술됨)로 이동되어 pCE54를 형성하였다. 전사종결 시그날은 pCE54를SacI으로 분해하고, 특히BamHI으로 부분 분해하고 어닐링되고 키나제화된 올리고뉴클레오티드 CE166(SEQ ID NO:31) 및 CE167 (SEQ ID NO:32)을 삽입함으로써 pCE54속에 삽입되어 pCE58을 생성하였다.
NDV-F에 대한 완전한 3' 말단은 주형으로서 pCE54를 그리고 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 CE 182 (SEQ ID NO:33) 및 CE183(SEQ ID NO:34)를 이용하는 중합효소 사슬반응(PCR)에 의하여 얻어졌다.
PCR 단편은PvuII 및HpaI으로 분해되었고,HpaI으로 분해되고PvuII로 부분 분해된 pCE58 속에 클로닝되었다. 결과적인 플라스미드는 pCE64로 나타냈다. 번역 종결 시그날은 pCE64의 완전한 H6 프로모터와 F코딩서열을 포함하는HindIII-HpaI 단편을 pRW846의HindIII 및HpaI 위치속에 클로닝함으로써 삽입되었고 NDV-F에 대한 최종 카세트인 pCE71을 생성하였다. 플라스미드 pRW846은 본질적으로 플라스미드 pJCA002 (하기에 기술됨)와 같지만 H6 프로모터 및 전사 및 번역 종결시그날을 포함하고 있다. pRW846을HindIII 및HpaI으로 분해하면 H6 프로모터는 제거되지만 종결 시그날은 온전하게 남아있게 된다.
NDV-HN에 대한 카세트의 제조
플라스미드 pRW802의 제조는 이전에 Edbauer등, 1990에서 기술되었다. 이 플라스미드는 pUC9 벡터에서 우두 바이러스 H6 프로모터의 3' 말단에 결합된 NDV-HN 서열을 포함한다. 우두 바이러스 H6 프로모터의 5' 말단을 포함하는HindIII-EcoRV 단편은 pRW802의HindIII 및EcoRV 위치속에 삽입되어 pRW830을 하였다. NDV-HN에 대한 완전한 3'말단은 어닐링되고 키나제화된 올리고뉴클레오티드 CE162(SEQ ID NO:35) 및 CE163(SEQ ID NO:36)을 pRW830의EcoRI 위치속에 삽입함으로써 얻어졌고, NDV-HN에 대한 최종 카세트인 pCE59를 형성하였다.
FPV 삽입벡터의 제조
플라스미드 pRW731-15는 게놈 DNA로부터 클로닝된 10kbPvuII-PvuII 단편을 포함한다. 3660bpPvuII-EcoRV 단편의 양쪽 사슬상의 뉴클레오티드 서열이 결정되었다. 여기서 F8로서 표시된 오픈 리딩 프레임의 경계가 결정되었다. 플라스미드 pRW761은 2430bpEcoRV-EcoRV 단편을 포함하는 pRW731-15의 서브-클론이다. pRW761에서XbaI 위치와SspI 위치 사이에 F8 ORF가 완전하게 포함되었다. TROVAC 게놈 DNA와의 재조합으로 F8 ORF를 제거한 삽입 플라스미드를 만들기 위하여 하기의 단계들을 수행하였다. 플라스미드 pRW761을XbaI으로 완전히 분해하고SspI으로 부분 분해하였다. 겔로부터 3700bpXbaI-SspI 밴드를 분리하고 어닐링된 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 JCA017(SEQ ID NO:37) 및 JCA018(SEQ ID NO:38)과 결합시켰다.
이 결합에 의해 생성된 플라스미드는 pJCA002로서 표시되었다.
NDV F 및 HN에 대한 이중 삽입벡터의 제조
H6 프로모터-NDV-HN 서열이E.coliDNA 중합효소의 클리나우 단편으로 채워진 pCE59의HindIII 단편을 pCE71의HpaI 위치속에 클로닝함으로써 H6 프로모터-NDV-F 카세트 속에 삽입되어 pCE80을 형성하였다. 플라스미드 pCE80을NdeI으로 완전분해하고BgℓII로 부분분해하여, 양쪽이 H6 프로모터에 의해 구동되고 F8 측면부암에 연결된 NDVF와 HN 유전자를 포함하는NdeI-BgℓII 4760bp 단편을 생성하였다. pRW731-15의 4900bpPvuII-HindII 단편을 pBSSK+의SmaI 및HindII 위치속에 삽입시켜서 플라스미드 pJCA021을 얻었다. 그 다음에는 플라스미드 pJCA021을NdeI 및BgℓII로 분해시키고 pCE80의 4760bpNdeI-BgℓII 단편에 결합시켜서 pJCA024를 형성하였다. 따라서 플라스미드는 pJCA024는 FPV 측면부암 사이에서 인접한 3' 말단과 반대방향으로 삽입된 NDV-F와 HN 유전자를 포함한다. 양쪽 유전자가 우두 바이러스 H6 프로모터에 연결된다. NDV-F 서열에 인접한 우측 측면암은 FPV 서열의 2350bp로 구성된다. NDV-HN 서열에 인접한 좌측 측면암은 FPV 서열의 1700bp로 구성된다.
TROVAC-NDV의 개발
이전에 기술된 인산칼슘 침전방법(Panicali 등, 1982; Piccini 등, 1987)을 이용하여 플라스미드 pJCA024를 TROVAC 감염된 일차 CEF 세포속에 트랜스펙션시켰다. 포지티브 플라크가 특이적인 NDV-F 및 HN 방사성 표지된 프로브에 대한 혼성화에 기초하여 선택되었으며 순수집단에 도달할때까지 플라크 정제를 5번 연속 수행하였다. 그 다음 하나의 대표적인 플라크를 증폭시키고 결과적인 TROVAC 재조합체를 TROVAC-NDV (vFP96)으로 표시하였다.
면역 형광성
간접적인 면역형광은 폴리클로날 항-NDV 혈청 및 단일-특이적인 시약으로서 NDV-F 또는 NDV-HN을 발현하는 우두 바이러스 재조합체에 대한 토끼에서 생성된 혈청을 이용하여 기술한 대로 (Taylor등, 1990) 수행되었다.
면역 침전
면역 침전반응은 SPAFAS Inc., Storrs, CN에서 얻은 폴리클로날 항-NDV 혈청을 이용하여 기술한 대로 (Taylor 등, 1990) 수행되었다. F8 ORF가 삭제된 것을 확인하기 위해 스톡 바이러스를 인시투(insitu) 플라크 혼성화에 의하여 스크리닝하였다. NDV 유전자의 TROVAC 게놈속으로의 정확한 삽입 및 F8 ORF의 삭제는 또한 서던 블롯(southern blot) 혼성화에 의해 확인되었다.
NDV-감염된 세포에서, F 당단백질은 카르복실 터미날 가까이에서 소수성 횡단막 부위를 경유하여 막내에 고정되고 그 이황화물 연결된 폴리펩티드 F1과 F2속으로의 선구물질 F0의 번역-후 절단을 요구한다.
F0의 절단은 주어진 NDV 균주의 병원성을 결정하는데 중요하며 (Homma 및 Ohuchi, 1973; Nagai 등, 1976; Nagai 등, 1980), 절단위치에 있는 아미노산들의 서열이 바이러스 독성을 결정하는데 중요하다. FPV 속에 삽입되어 재조합체 vFP29를 형성하는 NDV-F 서열내의 절단위치에 있는 아미노산은 서열 Arg-Arg-Gln-Arg-Arg(SEQ ID NO:39)(Taylor 등, 1990)을 갖는 것으로 결정되었는데 이것은 독성 NDV 균주에 대한 필수조건으로 밝혀진 서열과 일치한다 (Chambers 등, 1986; Espion등, 1987;Le 등, 1988;Mc Ginnes and Morrison, 1986; Toyoda등, 1987). NDV의 독성균주로 감염된 세포에서 합성된 HN 당단백질은 74KDa의 비절단된 당단백질이다. Ulster 및 Queensland 따위의 극히 비병원성인 균주들은 활성화를 위해 절단을 요구하는 HN 선구물질 (HNo)를 암호화한다(Garten등, 1980).
TROVAC-NDV에서의 F 및 HN 유전자의 발현을 분석하여 유전자 산물이 믿을만하게 프로세싱되고 제공된다는 것을 확인하였다. 폴리클로날 항-NDV 병아리 혈청을 이용한 간접 면역형광은 감염된 세포표면에서 면역반응성 단백질이 제공된다는 것을 확인하였다. 양쪽 단백질이 원형질막에서 주어지는 것을 결정하기 위해서, 단일-특이적인 토끼혈청이 F 또는 HN 당단백질을 발현하는 우두 바이러스 재조합체에 대해 생성되었다. 이 혈청을 이용한 간접 면역형광은 양쪽 단백질의 표면제공을 확인시켰다.
어버이 및 재조합 바이러스로 감염된 CEF 세포의 (35S)메티오닌 표지된 용해물을 사용함으로써 면역침전 실험을 수행하였다. F1과 F2의 글리코실화 형태의 겉보기 분자량의 기대값은 각기 54.7과 10.3KDa이다(Chambers등, 1986). 폴리클로날 항-NDV 혈청을 이용한 면역침전 실험에서, 적당한 크기의 융합 특이적 생성물이 NDV-F 단일 재조합체 vFP29로부터 검출되었고(Taylor 등, 1990) TROVAC-NDV 이중 재조합체 vFP96으로부터 검출되었다. 또한 적당한 크기의 HN 당단백질이 NDV-HN 단일 재조합체 VFP-47(Edbauer 등, 1990) 및 TROVAC-NDV로부터 검출되었다. 비감염되고 어버이 TROVAC 감염된 CEF 세포로부터는 어떤 NDV 특이적인 생성물도 검출되지 않았다.
CEF 세포에서 F 및 HN 당단백질은 NDV 면역 혈청에 의해 인식되는 감염세포 표면상에서 명백하게 제공된다. 면역침전 분석은 F0단백질이 변원성 균주에서 필요한 F1및 F2성분으로 실제로 절단되는 것을 나타냈다. 유사하게 HN 당단백질도 재조합체 TROVAC-NDV로 감염된 CEF 세포에서 실제로 프로세싱되었다.
이전의 보고서들 (Taylor등, 1990;Edbauer등, 1990;Boursnell등, 1990 a,b,c; Ogawa 등, 1990)은 HN 또는 F만의 발현이 NDV 침범에 대한 보호면역을 일으키는데 충분하다는 것을 나타내었다. 그러나 다른 파라믹소 바이러스에 대한 연구는 양쪽 단백질에 대한 항체가 완전한 보호면역에 필요할 수 있다는 것을 나타냈다. SV5 바이러스는 HN 당단백질에 대한 그러나 F 당단백질에 대해서는 아닌 항체의 존재하에서 조직 배양물에서 전파될 수 있다는 것을 알게되었다(Merz등,1980). 부가적으로, 사멸된 홍역 바이러스 백신의 백신 실패는 융합성분의 불활성화에 기인된다는 것이 제안되었다(Norrby등, 1975). 양쪽 NDV 당단백질이 바이러스 중화 항체를 끌어낼수 있다는 것이 보여지고(Avery 등, 1979) 양쪽 당단백질은 계두 바이러스 벡터에서 개별적으로 발현될때 보호면역 반응을 유도할 수 있기 때문에, 가장 효과적인 NDV 백신은 양쪽 당단백질을 발현해야 한다고 생각할 수 있다.
실시예 9
홍역융합 및 헤마글루티닌 당단백질을 발현하는 NYVAC-MV 재조합체의 제조
홍역 바이러스 MV(Edmonston 균주)의 HA 및 F 단백질을 암호화하는 서열의 cDNA 카피가 NYVAC 속에 삽입되어 NYVAC-MV로서 표시된 이중 재조합체가 생성되었다. 재조합체는 감염 세포표면에서 두 홍역 당단백질을 실제로 발현하였다. 면역 침전 분석은 F 및 HA 당단백질의 정확한 프로세싱을 나타냈다. 또한 재조합체는 신시튬 형성을 유도한다는 것이 보여졌다.
세포 및 바이러스
NYVAC-MV의 생성에 사용된 레스큐바이러스는 NYVAC로서 표시된 우두 바이러스의 변형된 코펜하겐 균주였다. 모든 바이러스는 VERO 세포 단일층으로 생장되었고 정량되었다.
플라스미드 제조
플라스미드 pSPM2LHA(Taylor등, 1991C)는 이전에 기술된 우두 바이러스 H6 프로모터(Taylor 등, 1988 a,b; Guo 등, 1989; Perkus등, 1989)와 정확한 ATG 대 ATG 배열로 연결된 전체 홍역 HA 유전자를 포함한다. 3' 대부분의 26bp가 결핍된 HA 유전자와 정확한 ATG:ATG 배열로 융합된 H6 프로모터의 3' 대부분의 24bp를 포함하는 1.8kbpEcoRV/SmaI 단편이 pSPM2LHA로부터 분리되었다. 이 단편이 pSPMHHA11(Taylor 등, 1991C)의 1.8kbpEcoRV/SmaI 단편을 대체하는데 이용되어 pRW803을 생성하였다. 플라스미드 pRW803은 전체 홍역 HA 유전자에 정확하게 연결된 전체 H6 프로모터를 포함한다.
홍역 HA 유전자를 갖는 이전의 구조체의 확인에서 코돈 18(CCC)의 서열이 발표된 서열(Alkhatib 등, 1986)과 비교했을때 삭제된 것이 주지되었다. CCC 서열이 올리고뉴클레오티드 RW117(SEQ ID NO:40)
을 이용하여 쿤켈방법(Kunkel, 1985)을 경유한 올리고뉴클레오티드 돌연변이 유발에 의하여 대체되었다. 단일 가닥 주형은 플라스미드 pRW819로부터 유래되었는데, 이것은 pIBI25(International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT)에서 pRW803으로부터의 H6/HA 카세트를 포함한다. 코돈 18에서 프롤린 잔기를 암호화하도록 삽입된 (CCC)를 포함하는 돌연변이된 플라스미드를 pRW820으로 표시하였다. pRW820의HindIII 및XbaI 위치 사이의 서열은 뉴클레오티드 서열분석에 의해 확인되었다.HindIII 위치는 H6 프로모터의 5' 경계에 위치하는 반면에XbaI 위치는 HA 유전자의 개시코돈으로부터 230bp 아랫쪽에 위치한다.XbaI (상기)으로부터 아랫쪽 HA 코딩서열을 포함하고 중지코돈을 포함하는 pRW803의 1.6kbpXbaI/EcoRI 단편이 pRW820의 동등한 단편을 대체하는데 이용되어 pRW837을 생성하게 되었다. pRW837내에 포함된 돌연변이된 발현카세트는HindIII 및EcoRI으로 분해시키고, 2mM dNTP 존재하에 E. coli DNA 중합효소의 클리나우 단편을 이용하여 블런트 말단화시키고, pSD513의SmaI 위치속에 삽입시켜서 만들어져서 pRW843을 생성하게 되었다. 플라스미드 pSD513은 폴리링커 서열의 첨가에 의해 플라스미드 pSD460으로부터 유도되었다. 플라스미드 pSD460은 우두 바이러스로부터 티미딘 키나제 유전자의 삭제가 가능하도록 유도되었다.
홍역 바이러스 F유전자를 HA 삽입 플라스미드 속에 삽입시키기 위해서 pSPHMF 7 상에 조작을 행하였다. 플라스미드 pSPHMF7(Taylor 등, 1991C)은 이전에 기술된 우두 바이러스 H6 프로모터에 3' 병렬된 홍역 F 유전자를 포함한다. ATG 배열에 대해 완전한 ATG를 이루고 프로모터의 3' 말단과 홍역 F 유전자의 ATG사이의 개재 서열을 제거하기 위해서 올리고뉴클레오티드 SPMAD(SEQ ID NO:41)을 이용하여 올리고뉴클레오티드 지시되는 돌연변이 유발을 수행하였다.
결과적인 플라스미드는 pSPMF75M20으로 표시하였다. 이제 H6 프로모터와 ATG 배열에 대해 정확한 ATG로 연결된 홍역 F 유전자를 포함하는 플라스미드 pSPMF75M20을NruI과EagI로 분해시켰다. H6 프로모터의 3' 대부분의 27bp 및 전체 융합 유전자를 포함하는 결과적으로 생긴 1.7kbp 블런트말단 단편을 분리하였고,NruI 및XbaI으로 분해되고 블런트말단인 중간 생성물 플라스미드 pRW823 속에 삽입시켰다. 결과적인 플라스미드 pRW841은 pIBI25 플라스미드 벡터(International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT)내의 홍역 F 유전자에 연결된 H6 프로모터를 포함한다. H6/홍역 F 카세트는 pRW841에서SmaI 분해에 의해 삭제되었고 결과적인 1.8kb 단편이 pRW843 (홍역 HA 유전자를 포함하는) 속에 삽입되었다. 플라스미드 pRW843은 먼저NotI으로 분해되고 2mM dNTP 존재하에서 E. coli DNA 중합효소의 클리나우 단편으로 블런트-말단화시켰다. 따라서 결과적인 플라스미드 pRW857은 테일-테일 배열로 연결된 홍역 바이러스 F와 HA 유전자를 포함한다. 양쪽 유전자는 우두 바이러스 H6 프로모터에 연결된다.
NYVAC-MV의 개발
이전에 기술한 인산칼슘 침전방법(Panicali 등, 1982; Piccini 등, 1987)을 이용하여 플라스미드 pRW857을 NYVAC 감염된 VERO 세포속에 트랜스펙션시켰다. 특이적인 MVF 및 HA 방사성 표지된 프로브에 대한 인시투 플라크 혼성화의 기초하에 포지티드 플라크를 선택하고 순수집단에 도달할때까지 6번 연속하여 플라크 정제하였다. 그다음 하나의 대표적인 플라크를 증폭시키고 결과적인 재조합체를 NYVAC-MV(vP913)으로 나타냈다.
면역형광
이전에 기술된 것처럼(Taylor 등, 1990) 간접적 면역형광을 수행하였다. 사용된 단일-특이적 시약은 홍역 F 또는 HA 유전자를 발현하는 카나리아폭스 재조합체로 토끼를 접종하여 생성된 혈청이었다.
면역침전
면역 침전 반응은 이전에 기술된 것처럼(Taylor 등, 1990) 기니아-피그 항-홍역 혈청(Whittaker M.A. Bioproducts, Walkersville, MD)을 이용하여 수행되었다.
세포융합실험
60mm 접시의 VERO 세포 단일층이 어버이 또는 재조합 바이러스로 세포 당 1pfu의 다양성으로 접종되었다. 37℃에서 1시간 흡수시킨후에 접종물을 제거하고, 겉면 배지를 대체하고, 접시를 37 ℃에서 하룻밤 동안 접종하였다. 감염 20 시간후에 접시를 조사하였다.
홍역 바이러스 F 및 HA 유전자의 발현산물이 감염된 세포표면상에서 주어지는지를 결정하기 위해서, 홍역 F 또는 HA 유전자를 발현하는 카나리아폭스 재조합체에 대해 토끼에서 생성된 단일-특이적인 혈청을 이용하여 간접 면역형광 분석을 수행하였다. 그 결과는 단일-특이적인 혈청으로 강한 표면형광에 의해 나타내지는 것처럼 F와 HA 유전자 산물이 감염된 세포표면에서 발현된다는 것을 나타냈다. 어버이 NYVAC균주로 접종된 세포상에서는 어느 혈청으로도 백그라운드 염색은 명백하지 않았으며, HA 또는 F 유전자를 발현하는 우두 바이러스 단일 재조합체에 대해서 단일-특이적인 혈청이 시험되었을때 상호-반응하는 염색이 없었다.
NYVAC-MV에 의해 발현된 단백질이 홍역 바이러스 특이적인 혈청과 면역반응하며 실제적으로 감염된 세포에서 프로세싱되는지를 알아보기 위해서 면역침전 분석을 수행하였다. VERO 세포 단일층이35S-메티오닌 존재하에 어버이 또는 재조합체 바이러스의 10pfu/세포 다양성으로 접종되었다. 면역침전 분석은 대략 76KDa의 HA 당단백질 및 각기 44KDa과 23KDa의 분자량을 갖는 절단된 융합생성물 F1과 F2를 나타냈다. 비감염된 VERO 세포 또는 어버이 NYVAC 바이러스로 감염된 VERO 세포에서는 어떤 홍역 특이적인 생성물도 검출되지 않았다.
MV 세포병리학의 특성은 감염된 세포의 주위 감염된 또는 비감염된 세포와의 융합에 의해 일어나는 신시튬의 형성과 신시튬의 중심부를 향한 핵의 이동이다 (Norrby 등, 1982). 이것은 바이러스 전파의 중요한 방법인 것으로 보여지는데, 파라믹소 바이러스에서는 HA-특이적인 바이러스 중화 항체의 존재하에 일어날 수 있다(Merz 등, 1980). 우두 바이러스에서 발현되는 MV 단백질이 기능적으로 활성이 있는지를 결정하기 위해서, VERO 세포 단일층이 NYVAC 및 NYVAC-MV로 접종되고 세포병리학적 영향에 대해 관찰되었다. 감염후 대략 18 시간후에는 NYVAC-MV 감염 VERO 세포에서 강한 세포융합활성이 명백해졌다. 어버이 NYVAC로 감염된 세포에서는 어떤 세포융합 활성도 명백하지 않았다.
실시예10
가성 광견병 바이러스의 당단백질을 발현하는 NYVAC 재조합체의 제조
개별적으로 또는 조합하여 PRV gpⅡ, gpⅢ, 및 gp50 당단백질을 발현하는 우두 바이러스 재조합체는 그것들이 살아있는 PRV로 병원성 침범으로부터 돼지를 보호한다는 점에서 효과적인 백신후보를 제공한다는 것이 입증되었다.
NYVAC벡터가 돼지 세포 배양물에서 생산적으로 복제할 수 없고 알려진 가능성있는 병독성 유전자의 삭제에 기인한 벡터의 본질적인 안전성을 고려하여, 홀로 또는 다양한 조합으로 PRVgpⅡ, gpⅢ, 및 gp50을 포함하는 NYVAC-기초한 재조합체가 생성되었다. 돼지에 대해 안전하고 환경으로의 전염이 제거된 또는 심하게 제한된 PRV에 대하여 효과적인 백신후보를 제공하도록 이 재조합체가 생성되었다.
바이러스 및 세포
NYVAC의 조작 및 분자클로닝은 표준방법에 의하여 수행되었다(Piccini등, 1987; Maniatis 등, 1982). NYVAC 및 NYVAC-기초한 재조합체의 배양은 이전에 기술된 것과 같다(Piccini등, 1987).
PRV gpⅡ, gpⅢ, 및 gp50 유전자의 클로닝
PRV의 생장, PRV 게놈 DNA의 추출, 및 PRVgpⅡ, gpⅢ, gp50의 유전자의 확인은 기술되었다.
가성 광견병 바이러스(PRV) 유전자의 NYVAC(vP866) 속으로의 클로닝 및 발현
인간 및 돼지 숙주 범위유전자(C7L 및 K1L)를 포함하는 부위가 결핍된 NYVAC삭제 돌연변이체인 vP866은 PRV 유전자를 삽입하는데 이용된 기본 벡터였다. 이 벡터는 또한 우두 바이러스tk유전자, 헤마글루티닌 유전자, 출혈성 유전자, 리보뉴클레오티드 리덕타제(대서브유니트) 유전자, 및 A-유형 봉입유전자가 결핍되어 있다. 중요하게도 vP866은 인간 또는 돼지 신장(LLC-PK1)세포상에서 전혀는 아니지만 효율적으로 복제하지 못한다.
각기 헤르페스 심플렉스 바이러스 gB(Robbins 등, 1987), gC(Robbins 등, 1986b), gD(Wathen 및 Wathen, 1984)에 상동적인 PRV 유전자 gpⅡ, gpⅢ, gp50이 하기에 개괄된 것처럼 vP866속에 삽입되었다.
vP866의 헤마글루티닌 유전자좌 속으로의 PRV gpⅡ유전자의 삽입
PRV gpⅡ유전자를 암호화하는 DNA서열은 PRV 게놈의BamHI 단편 1내에 위치한다(Mettenleiter 등, 1986).
pBR322의BamHI 위치속에 삽입된 PRVBamHI 단편 1을 포함하는 pPR 9.25로서 표시되는 플라스미드를NcoI으로 분해하였다. 결과적인 제한 단편들이 0.8% 아가로스 겔에서 분류되었고 6.5kbNcoI DNA 단편이 Geneclean(Bio101, Inc., LaJolla, CA)을 이용하여 정제되었고 다음에는 CiAP로 처리된 pBR328(Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN)의NcoI 위치속에 삽입되었다. 결과적인 플라스미드 pPR2.15FMFSphI으로 분해시키고 아가로스 겔상에서 분류하였다. 2.7kb 및 1.8kb단편을 정제하여 PUC18의SphI 위치속에 삽입시켜서 각기 pPR1 및 pPR2를 생성하였다.
pPR1의 1060bp PRVSphI/NheI 단편을 아가로스 겔로부터 분리하고 어닐링된 올리고뉴클레오티드 MRSYN1 (SEQ ID NO:42)(5'-GATCCATTCCATGGTTG-3') 및 MRSYN2 (SEQ ID NO:43) (5'-TAGCAACCATGGAATG-3')와 pIBI25의BamHI/SphI 위치속에 삽입하여 pPR6를 생성하였다. pPR6를HindⅢ 및 ApaI으로 분해하였다. ApaI위치는 PRV gpⅡ의 ATG개시 코돈으로부터 32bp 아랫쪽에 위치한다. 이 3920bp 단편은 어닐링된 올리고뉴클레오티드 MRSYN3(SEQ ID NO:44)(5'-
에 결합시켜서 pPR9를 생성하였다. 이 어닐링된 올리고뉴클레오티드는EcoRV 위치부터 ATG를 지나 우두 바이러스 H6 프로모터를 특정하는 DNA서열, 다음에는 PRV gpⅡ코딩 서열을 제공한다. 플라스미드 pPR9를BamHI과NheI으로 분해시키고 송아지장내 알칼리 포스파타제(CiAP)로 처리하고, 어닐링된 올리고뉴클레오티드 MRSYN7 (SEQ ID NO:46) (5'-CCCAGATCTCCTTG-3') 및 MRSYN8 (SEQ ID NO:47) (5'-GTACGGGTC-TAGAGGAACCTAG-3')과 pPR1에서 얻은 1640bpSphI/NheI 단편에 결합시켜서 플라스미드 pPR12를 생성하였다. pPR2의 1030bpHindⅡ/SphI 단편을 아가로스 겔로부터 분리하고HincⅡ/SphI PUC18 벡터속에 삽입시켰다.
결과적인 플라스미드 pPR10을HindⅢ 및NaeI으로 분해시키고 CiAP로 처리하였다.NaeI 위치는 중지코돈(TAG)의 44bp 윗쪽에 위치한다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드 MRSYN9(SEQ ID NO:48)
을 pPR10의 3720bpNaeI/HindⅢ 단편에 결합시켜서 플라스미드 pPR11을 생성하였다. pPR2의 770bpSphI/HincⅡ 단편을 아가로스겔에서 정제하였고BamHI/SphI 포스포릴화 링커MRSYN7(SEQ ID NO:46) 및 MRSYN8(SEQ ID NO:47)을 이용하여 CiAP 처리된 pPR11의BamHI/HincⅡ 위치속에 삽입시켜서 pPR13을 생성하였다.EcoRI 및SphI으로 분해된 플라스미드 pPR12를 MRSYN19 (SEQ ID NO:50) (5'-AGCTTCTGCAGCCA-TGGCGATCGG-3') 및 MRSYN20 (SEQ ID NO:51) (5'-AATTCCGATCGCCATGGCTGCAGA-3')을 이용하여 pPR13의 990bpHindⅢ/SphI 단편에 결합시켜서 플라스미드 pPR15를 생성하였다. 플라스미드 pPR15를HindⅢ/EcoRV로 분해시켜서 2780bp 단편을 생성하였다. 이 단편을 XmaⅢ 및EcoRV로 분해된 PTP15(Guo등, 1989) 속에 삽입시켜서 pPR18을 생성하였다. pPR18에서는, HA삭제 플라스미드내의 우두 바이러스 H6 프로모터와 PRVgpⅡ가 연결된다. vP881을 생성하기 위한 레스큐바이러스로서 vP866과의 생체외 재조합 실험에서는 pPR18이 사용되었다.
NYVAC의 TK 유전자좌 속으로의 PRV gpⅢ 유전자의 삽입
PRV gpⅢ유전자를 암호화하는 서열은 PRV 게놈의BamHI 2 및 9단편으로 매핑되었다(Robbins 등, 1986b). 플라스미드 pPR 9.9 및 pPR7.35는 pBR322의BamHI 위치속에 삽입된 각각 PRVBamHI 단편 2 및 9를 포함한다. PRV gpⅢ 유전자의 5' 말단을 포함하는SphI/BamHI 단편은 pPR9.9로부터 분리되었다. gpⅢ 유전자의 나머지를 포함하는NcoI/BamHI 단편은 pPR7.35로부터 분리되었다. 전체 PRV gpⅢ유전자는 이 2단편을 pIBI25 속에 결합시켜서 조립되어 pPR17을 생성하였다.
PRV gpⅢ유전자를 조작하여HindⅢB 부위에 위치된 초기 우두 바이러스 출혈성 프로모터의 조절하에서 발현되도록 하였다(Goebel 등, 1990 a,b). 위치-지시되는 돌연변이 유발에 의하여, PRV gpⅢ의 서열 CGC(염기 192-194)를 ATG로 변환시켜서NsiI 위치가 도입되었고 서열 GTCACGT를 TTCTAGA (염기 1632-1638)로 변화시켜서XbaI 위치가 도입되었다. 돌연변이유발 반응을 수행하기 위하여, 헬퍼 파지 R408(Stratagene, LaJolla, CA)을 이용하여 플라스미드 pPR17로부터 단일-가닥DNA가 생성되었다. 위치-지시되는 돌연변이 유발은 MRSYN5 (SEQ ID NO:52) (5'-GCGA- GCGAGGCCATGCATCGTGCGAATGGCCCC-3') 및 MRSYN6 (SEQ ID NO:53) (5'-GGGGGGACGC-GCGGGTCTAGAAGGCCCCGCCTGGCGG-3')을 이용하고 E.colidut - ung-균주 CJ236 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT)에서 선택하여 행하여졌다. 돌연변이 유발은 kunkel(1985)의 프로토콜에 따라서 수행하였다. 이 돌연변이에 의하여 플라스미드 pPR28가 생성되었다.
플라스미드 pPR28을NsiI 및XbaI으로 절단하고 녹두뉴클레아제로 처리하였다. 녹두 뉴클레아제 및 송아지-장내 알칼리 포스파타제로 처리한 후에 1440bp 단편을 정제하고BgℓⅡ/HpaI 분해된 pSD478VC 속에 삽입시켰다. 결과적인 플라스미드를 pPR24로서 표시하였다.
플라스미드 pPR24를SnaB1 및DraI으로 분해시켜서 u프로모터 및 PRV gpⅢ유전자를 포함하는 1500bp 블런트-말단 단편을 방출시켰다. 이 단편을SmaI 분해된 pSD513VC 속에 결합시켜서 pPRVⅢVCTK를 생성하였다. 생체외 재조합실험은 vP883을 생성하도록 레스큐 바이러스로서 vP866 및 pPRVⅢVCTK로 수행되었다. vP883에서는, 우두 바이러스 tk 코딩서열은 120bp 우두 바이러스 u프로모터 요소의 조절하에서 게놈에 대해 우측대 좌측방향으로 삽입된 PRV gpⅢ유전자에 의하여 대체된다.
NYVAC의 ATI유전자좌 속으로의 PRV gp50 유전자의 삽입
PRV 당단백질 gp50 유전자를 암호화하는 DNA는 PRV 게놈의BamHI 단편 7에 위치한다(Petrovskis 등, 1986a,b). 플라스미드 pPR7.1은 pBR322의BamHI위치속으로 삽입된 PRVBamHI 단편 7을 포함한다. 전체 gp50유전자를 포함하는 pPR7.1의 StuI/NdeI서브-단편을 pIBI25 속에 서브클로닝하여 플라스미드 #856을 생성하였다.
PRV gp50에 대한 코딩서열이 초기/중간-우두 바이러스 프로모터 I3L(Schmitt 및 Stunnenberg, 1988; Vos 및 Stunnenberg, 1988)의 조절하에 놓여졌다. 이 프로모터 요소는 우두 바이러스 재조합체에서 외부 유전자를 발현하는데 이전에 사용되었다(Perkus 등, 1985; Bucher등, 1989). I3L 오픈리딩 프레임으로부터 윗쪽의 프로모터 서열에 해당하는 DNA(Schmitt 및 Stunnenberg, 1988)는 합성올리고뉴클레오티드 P50PPBAM (SEQ ID NO:54) (5'-ATCATCGGATCCGGTGGTTTGCCATTCCG-3') 및 P50PPATG (SEQ ID NO:55) (5'- GATTAAACCTAAATAATTG-3') 및 주형으로서 코펜하겐HindⅢI 부위의 서브클론 pMPIVC를 이용하여 PCR(Saiki등, 1988)에 의하여 유래되었다. 결과적인 126bp단편을BamHI으로 분해시켜서 프로모터 서열의 5' 말단에서BamHI 접착성 말단을 생성하였다. 3'말단은 블런트-말단으로 남았다. PRV gp50 코딩부위는 플라스미드 #856으로부터 절단되었다. 플라스미드 #856을 초기에는NsiI으로 분해시켰는데, 이것은 ATG로부터 7bp윗쪽을 절단하여 3'돌출부를 생성한다. 3'돌출부는 2mM dNTP 존재하에 T4 DNA 중합효소로 블런트-말단화되었다. 결과적인 DNA는 부분적으로BgℓⅡ로 분해되었고, PRV gp50유전자를 포함하는 1.34kb 블런트/BgℓⅡ 단편이 분리되었다.
126bp I3L프로모터 단편(BamHI/블런트) 및 1.3kb gp50 유전자포함 단편(블런트/BgℓⅡ)을BamHI으로 분해된 pBS-SK(Stratagene, La Jolla, CA) 속에 결합시켰다. 결과적인 플라스미드는 pBSPRV50I3으로 표시되었다. PRV gp50유전자에 연결된 I3L프로모터를 포함하는 발현카세트가BamHI/부분SmaI 분해에 의하여 절단되었다. I3L 프로모터/PRV gp50유전자를 포함하는 1.4kb단편이 분리되었고 2mM dNTP 존재하에 E.coli DNA 중합효소의 클리나우 단편을 이용하여 블런트-말단화시켰다.
I3L 프로모터/PRV gp50 유전자를 포함하는 1.4kb 블런트-말단화 단편이 ATI 삽입 플라스미드 pSD541속에 삽입되었다. ATI 부위에 대한 측면부암은 주형으로서 코펜하겐HindIII A 부위의 서브클론을 이용한 PCR에 의하여 생성되었다.
올리고뉴클레오티드 MPSYN267(SEQ ID NO:56)
는 ATI 삭제의 우측에 420bp 우두 바이러스 암을 유도하는데 이용되었다. 합성 올리고뉴클레오티드 MPSYN269 (SEQ ID NO:58)(5'-
는 삭제의 좌측에 420bp 우두 바이러스 암을 유도하는데 이용되었다. 좌측암 및 우측암이 PCR에 의하여 함께 융합되었고BglII,SamI,XhoI에 대한 제한 위치를 특정하는 폴리링커 부위에 의하여 분리된다. PCR-생성 단편을HindIII 및EcoRI으로 분해하여 접착성 말단을 형성하고,HindIII 및EcoRI으로 분해된 pUC8 속에 결합시켜서 pSD541을 생성하였다.
I3L/PRV gp50 유전자를 포함하는 pSD541 플라스미드는 pATIgp50으로 표시하였다. vP900을 생성하기 위한 생체외 재조합 실험에서 이 플라스미드를 이용하였다. vP900은 ATI 유전자 대신에 PRV gp50 유전자를 포함한다.
NYVAC에서 이중 및 삼중 PRV 재조합체의 생성
다수의 PRV 유전자를 포함하는 NYVAC-기초 재조합체를 생성하기 위하여 생체외 재조합 실험이 수행되었다. 각기 vP912, vP916 및 vP925를 생성하기 위하여 vP881, vP883 및 vP915로 도너 플라스미드 pATIP50을 이용하는 생체외 재조합 실험이 수행되었다(표 1). vP915를 생성하기 위하여 플라스미드 pPR18 및 레스큐바이러스로서 vP883으로 실험이 행해졌다(표 1).
NYVAC/PRV 재조합체 감염세포의 면역침전
VERO 세포가 개별적인 재조합 바이러스로, NYVAC 어버이 바이러스로 세포당 10pfu의 m.o.i.로 감염되었고, 또는 모의로 감염되었다. 1시간 흡수기간 후에, 접종물을 제거하였고35S-메티오닌(20uCi/mℓ)을 포함하는 메티오닌-없는 배지로 감염세포위에 씌웠다. 감염 8시간 후에 모든 샘플을 수집하였다. 양의 항-gpII 혈청으로 분석되는 샘플에 대해, 원심분리에 의하여 세포들을 모으고 RIPA 완충액(1% NP-40, 1% Na-데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 0.01M 메티오닌, 5mM EDTA, 5mM 2-메르캅토에탄올, 1m/mℓ BSA, 및 100u/mℓ아프로티닌)으로 분리시켰다. 샘플을 양의 항-gpIII으로 분석하고 gp50에 대해 특이적인 모노클로날항체를 1X 완충 용액 A (1% NP40, 10mM Tris (pH7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.0% Na아지드, 0.2mg/ml PMSF) 속에 용해시켰다. 모든 혈청을 vP866 감염된 VERO 세포로 미리 흡착시키고 모든 용해물을 정상 혈청 (양 또는 마우스) 및 이차 항체에 연결된 단백질 A-세파로스로 미리 흡착시켰다.
감염된 세포의 용해물이 양의 항-gpII 혈청을 이용한 PRV gpII 발현에 대하여 분석되었다. 이 일차 항혈청이 토끼 항-양 IgG와 결합된 단백질 A-세파로스 (Boehringer-Mannheim)와 배양되었다. 4℃에서의 하룻밤 동안의 배양후에, 샘플을 1X RIPA 완충용액으로 4번, LiCl-요소 (0.2M LiCl, 2M 요소, 10mM Tris, pH8.0)로 2번 세척하였다. 마이크로 원심분리에 의해 침전물을 모았다. 침전된 단백질은 면역 복합체로부터 2X Laemmli 완충용액 (125mM Tris(pH6.8), 4%(SDS), 20% 글리세롤, 10% 2-메르캅토에탄올)을 첨가하고 5분간 끓여서 분리되었다. 10% Dreyfuss 겔 시스템(Dreyfuss 등, 1984)에서 단백질을 분류하고, 고정시키고, 형광사진법을 위해 1M Na-살리실산으로 처리했다.
양의 항-gpIII 혈청을 이용하여 PRV gpIII 발현에 대해 용해물을 분석하였다. 이 일차 항혈청을 토끼의 항-양 IgG와 결합된 단백질 A-세파로스 (Boehringer -Mannheim)와 배양하였다. 4℃에서 하룻밤동안 배양한 후에 샘플을 1X 완충용액 A로 4번, LiCl-요소 완충용액으로 2번 세척하였다. 상기에서 기술한 것처럼 침전물을 처리하고 형광사진법에 의해 분석하였다.
용해물을 단일클로날 항체, 22M4 (Rhone merieux, Lyon, France)를 이용하여 PRVgp50 발현에 대해 분석하였다. 이 일차 항체를 염소의 항-마우스 IgG 및 IgM과 결합된 단백질 A-세파로스 (Boehringer-Mannheim)와 배양하였다. PRV gpIII 면역침전에 대하여 상기에서 기술한 것처럼 침전물을 회수하고 분석하였다.
NYVAC/PRV 재조합체로 감염된 세포에서의 PRV 당단백질의 발현
PRV gpⅡ, gpⅢ, 및 gp50 산물은 PRV 감염세포에서 막구조와 연관된 전형적인 당단백질이다. 항-gpⅡ, 항-gpⅢ 및 항-gp50 특이적인 단일클로날항체 다음에는 플루오레세인-결합된 염소 항-마우스IgG가 재조합체 감염된 VERO 세포표면상의 PRV 당단백질 발현을 분석하는데 이용되었다. 어떤 gpⅡ, gpⅢ, gp50의 표면 발현도 모의 감염된 세포 또는 NYVAC (vP866)어버이 바이러스로 감염된 세포의 표면에서 검출할 수 없었다. vP881, vP912, vP915, 및 vP925 감염세포의 표면에서 PRV gpⅡ 발현이 관찰되었다. vP883, vP915, vP916, 및 vP925 감염세포에서 PRV gpⅢ표면 발현이 관찰되었다. vP900, vP912, vP916, vP925 감염세포에서는 PRV gp50 표면 발현이 관찰되었다. 요약하면 특이한 PRV 당단백질의 표면 발현은 단지 적당한 PRV 유전자 (들)를 포함하는 NYVAC/PRV 재조합체로 감염된 세포에서 검출할 수 있다.
NYVAC/PRV 재조합체로 감염된 세포로부터 PRV 당단백질의 면역침전
NYVAC/PRV 재조합체로 감염된 VERO 세포에서 발현된 PRV gpⅡ, gpⅢ, 및 gp50 당단백질의 확실성은 면역침전에 의하여 분석되었다. PRV gpⅡ유전자 산물은 PRV-감염된 세포내에 암호화된 주요 당단백질중의 하나를 나타낸다. 완성된 단백질은 이황화물 결합에 의해 연결된 당단백질 복합체로 구성된다(hampl 등, 1984; Lukacs 등, 1985). 환원조건하에서는 이러한 복합체로부터 세 종류가 분해된다. 이 종류들 (Ⅱa-Ⅱc)은 SDS-폴리아크릴아미드겔상에서 각각 120KDa, 74-67KDa, 및 58KDa의 겉보기 크기로 이동한다(Hampl등, 1984).
항-PRV gpⅡ 특이적인 혈청을 이용한 면역침전 분석에서, 모의감염세포 또는 NYVAC (vP866) 어버이 바이러스로 감염된 세포로부터는 어떤 PRV-특이적인 단백질 종도 침전되지 않았다. 또한 PRV gpⅡ는 비-gpⅡ포함 NYVAC/PRV 재조합체 vP916,vP883,vP900으로 감염된 세포에서 검출할수 없었다. PRV gpⅡ가 PRV gpⅡ유전자를 이용하는 모든 NYVAC/PRV 재조합체에서 발현되는 것이 명백하다. 이것은 vP925, vP912, vP915 및 vP881이다. PRV gpⅡ포함 재조합체로 감염된 VERO 세포의 용해물은 모두 gpⅡ의 적당한 발현과 gpⅡa(120kDa), gpⅡb(74-67kDa), 및 gⅡc(58kDa)로의 프로세싱과 일치하는 단백질종들을 포함하였다. 45kDa와 10kDa의 두 부가적인 단백질종이 항-gpⅡ혈청과 특이적으로 침전되었다. 이러한 단백질종은 재조합체 감염된 세포에서 후기에 PRV gpⅡ의 변종의 단백질분해 프로세싱에 의하여 나타나는것 같다.
PRV gpⅢ생성물은 다른 주요 PRV 당단백질이다. gpⅢ은 단량체로서 존재하고 다른 바이러스 단백질과 복합체화되지 않으며, 이것은 92kDa의 겉보기 분자량으로 이동한다(Hampl등,1984;Robbins 등,1986b). gpⅢ에 대해 특이적인 항혈청을 이용하는 NYVAC/PRV 재조합체 감염세포의 면역침전 분석에서, 모의 감염된 세포, 비재조합체 감염세포, 또는 gpⅢ를 포함하지 않는 NYVAC/PRV 재조합체로 감염된 세포 (각각 vP912,vP881, 및 vP900)의 용해물에서는 어떤 항-gpⅢ특이적인 단백질종도 존재하지 않았다. vP925,vP915, vP916, 및 vP883 감염세포의 용해물은 모두 92kDa PRV gpⅢ유전자 산물을 포함하였다.
완성된 PRV gp50유전자 산물은 대략 50 내지 60kDa이고(Petrovskis 등, 1986a;Wathen 등, 1984) 대부분은 0-결합된 탄수화물을 포함한다 (Petrovskis 등,1986b). PRV gp50 유전자산물에 대해 특이적인 항혈청을 이용하는 NYVAC/PRV 재조합체로 감염된 세포의 용해물의 면역침전에서, gp50은 모의 감염세포, 비재조합체 감염된 세포, 및 gp50 유전자를 포함하지 않는 재조합체로 감염된 세포 (각각 vP915,vP881, 및 vP883)의 용해물에서는 존재하지 않았다. PRV gp50 유전자를 포함하는 재조합체 NYVAC 바이러스로 감염된 세포의 용해물 (각각 vP925, vP912, vP916, 및 vP900)은 모두 항-PRV gp50 혈청과 특이적으로 침전되는 50-60kDa 단백질종을 발현하였다.
실시예11
엡스타인-바르바이러스의 gp340, gB 및 gH 유전자를 발현하는 NYVAC 재조합체의 제조
EBV gp340, gB, gH 유전자를 포함하는 NYVAC도너플라스미드가 제조되었다. 이 도너플라스미드가 두 재조합체:vP941과 vP944를 생성하는데 이용되었다.
제한효소는 Bethesda Research Laboratories,Inc.(Gaithersburg,MD),New England BioLabs, Inc.(Beverly,MA) 또는 Boehringer-Mannheim(Indianapolis,IN)으로부터 구입하였다. T4DNA 리가제와 DNA 중합효소 I 클리나우 단편은 New England BioLabs,Inc.로부터 구입하였다. 클로닝, 스크리닝 및 플라스미드정제에 대해서 약간 변형시켜서 표준재조합 DNA기술을 이용하였다(Maniatis 등,1982). 핵산서열은 알칼리-변성된 이중-가닥플라스미드 주형상에서 표준 디데옥시사슬-종결 반응 (Sanger,1977)을 이용하여 확인되었다.
M13mp18파지, pIBI24 및 pIBI25 플라스미드는 International Biotechnologies, Inc., CT로부터 구입하였다.
세포주 및 바이러스균주
재조합체를 생성하기 위한 레스큐 바이러스로서 NYVAC가 사용되었다. 모든 우두 바이러스 스톡은 5-10% 새로 태아인 송아지 혈청으로 보충된 Eagles MEM 배지 (Flow Laboratories,Mclean,VI)에서 VERO (ATCC CCL81)세포에서 생성되었다.
올리고뉴클레오티드-지시되는 돌연변이유발
돌연변이 유발반응에 대해 사용된 우라실-치환된 단일-가닥 DNA주형은 CJ236 변환된 세포의 것이었다. 돌연변이는 Kunkel 등(1987)의 프로토콜을 이용함으로써 이루어졌다. 다양한 올리고 뉴클레오티드가 표준화학을 이용하여 합성되었다 (Biosearch 8700,San Rafael, CA; Applied Biosystems 380B, Foster City, CA).
우두 바이러스 재조합체의 제조
레스큐 우두 바이러스로 감염된 조직배양 세포속으로 재조합 도너플라스미드를 트랜스펙션시키는 방법 및 니트로셀룰로스 필터상에 인시투 혼성화시킴으로써 재조합체를 확인하는 방법은 이전에 기술된 것과 같았다(Panicali 등, 1982; Piccini 등, 1987).
EBV 유전자 gp340, gB, 및 gH의 우두 바이러스 재조합체에서의 변형 및 발현
gp340 유전자는 완전한 EBV서열의 BLLF1a 오픈 리딩 프레임에 해당한다 (Baer 등,1984). gp220 유전자는 내부의 스플라이싱에 의하여 gp340 mRNA로부터 유래한다 (오픈 리딩 프레임 BLLF1b). gp340 및 gp220유전자는 Dr.Perricaudet (Centre de Recherche sur le cancer-IRSG,7rue Guy Mocquet,94802 Villejuif, France)에 의해 제공된 cDNA 클론 (각각 플라스미드 pMLPgp340과 PMLPgp220)으로부터 분리되었다.
pMLPgp220의 2100bp XmaI/ClaI 단편이 XmaI/ClaI M13 mp18속에 삽입되었는데, 결과적인 플라스미드를 mp18gp220이라고 하였다. 올리고뉴클레오티드 CM4 및 CM5를 사용한 생체외 돌연변이 유발에 의하여 gp220 유전자의 5' 및 3' 말단이 우두 바이러스 H6 프로모터의 조절하에서 발현되도록 변형되었다. 변형된 gP220유전자를 포함하는 플라스미드를 mp 18gp220(4 ＋5)라고 하였다. CM4(SEQ ID NO=60) 및 CM5(SEQ ID NO:61)의 뉴클레오티드 조성은 하기와 같다:
mp18gp220(4＋5)의 2300bpNarI/EcoRV 단편이NarI/EcoRV 플라스미드 SP131NotI속으로 클로닝되었다. SP131NotI은 이전에 정의한것 처럼(Taylor 등,1988a,b) 완전한 H6우두 바이러스 프로모터를 포함한다. 결과적인 플라스미드를 SP131gp220이라고 하였다.
pMLPgp340의 2360bpScaI/XhoI 단편이ScaI/XhoI SP131gp220 플라스미드 속으로 클로닝되었다. 결과적인 플라스미드를 SP131gp340이라고 하였다.
SP131gp340의 2800bpNotI/NotI 단편이SmaI 분해된 우두 바이러스 도너 플라스미드 pSD486속으로 클로닝되었다. 결과적인 플라스미드를 486H6340이라고 하였다.
EBV gB유전자는 완전한 EBV 서열의 오픈리딩프레임 BALF4에 해당한다(Baer 등,1984). EBVBamHI A 단편으로부터 3500bpEcoRI/XmnI 단편을 분리하여HincⅡ/EcoRI 플라스미드 pIBI25 속에 클로닝하였다. 결과적인 플라스미드를 p25gB라고 하였다.
올리고뉴클레오티드 EBVM5(SEQ ID NO=62) 및 EBVM 3(SEQ ID NO=63)을 이용한 생체외 돌연변이 유발에 의하여 EBV gB 유전자를 우두 바이러스 H6 프로모터의 조절하에서 발현되도록 하였다. EBVM5(SEQ ID NO=62) 및 EBVM3(SEQ ID NO:63)의 뉴클레오티드 조성은 하기와 같다:
결과적인 플라스미드는 p25gB(5＋3)이라고 하였다.
p25gB (5＋3)의 2600bpEcoRV/EcoRI 단편이EcoRV/EcoRI SP131 플라스미드 속으로 클로닝되었다. 결과적인 플라스미드는 SP131gB라고 하였다.
EBV gH유전자는 완전한 EBV서열의 BXLF2 오픈 리딩프레임에 해당한다(Baer 등,1984). 완전한 BXLF2 오픈리딩프레임은 두BamHI EBV 단편:BamHI X 및BamHI T 내에 포함된다. EBVBamHI T 단편의 830bpSmaI/BamHI 단편을SmaI/BamHI pIBI24 플라스미드속에 클로닝함으로써 완전한 BXLF2 오픈리딩 프레임을 재구성하였다. 결과적인 플라스미드를 24gH5 라고 하였다. EBVBamHI X 단편의 1850bpBamHI/HindⅢ 단편이BamHI/HindⅢ 24gH5 플라스미드 속에 클로닝되었다. 결과적인 플라스미드를 24gH라고 하였다.
올리고뉴클레오티드 HM5, HM4 및 HM3를 이용한 생체외 돌연변이유발에 의하여, 우두 바이러스 B13R 출혈성 프로모터(Goebel 등,1990 a,b)의 조절하에서 발현되도록 EBV gH 유전자를 변형시켰다. 올리고뉴클레오티드 HM4를 이용하여 우두 바이러스 초기 전사종결 시그날에 해당하는 서열을 변형시켰다. HM5(SEQ ID NO:64), HM4(SEQ ID NO:65), 및 HM3(SEQ ID NO:66)의 뉴클레오티드 조성은 하기와 같다:
변형된 gH를 포함하는 결과적인 플라스미드는 24gH(5 ＋4 ＋3)라고 하였다.
우두 바이러스 출혈성 프로모터는 다른 폭스프로모터와 비교할때 강한 프로모터인 것 같지는 않다. EBV gH 유전자는 42KDa 엔토모폭스 프로모터의 조절하에 놓인다. 이것은 중합효소 사슬반응(PCR), 특이적인 올리고뉴클레오티드 42gH(SEQ ID NO=67) 및 BAMgH(SEQ ID NO:68) 및 주형으로서 플라스미드 24gH(5＋4 ＋3)을 이용함으로써 이루어졌다.
(첫번째 A잔기는 gH 코딩서열의 위치 292에 해당한다)
PCR 반응은 열사이클러(PerKin Elmer Cetus,Norwalk,CT)에서 94℃에서 1분, 42℃에서 1.5 분,72 ℃에서 3분,72 ℃에서 5분간 최종 연장단계로 36사이클로 진행되었다. PCR 생성물을 정제하고,BamHI으로 분해하고,24gH(5 ＋4 ＋3)의 4550bpSmaI/BamHI 단편속에 클로닝하였다. 결과적인 플라스미드는 24BXLF2.42K라고 표시하였다.
EBV gp340, gB 및 gH 유전자의 우두 바이러스 도너 플라스미드 pSD542 속으로의 삽입 및 vP941과 vP944의 분리
우두 바이러스 도너 플라스미드 pSD542는 확대된 폴리링커 부위를 가진 pSD460의 유도체이다. 그것을 우두 바이러스 TK유전자좌 속에 외부유전자를 재조합하는데 이용하였다.
486H6340 플라스미드의 2820bpBamHI/BgℓⅡ 단편은BamHI/BgℓⅡ pSD542 플라스미드 속에 클로닝되었다. 결과적인 플라스미드는 542.340이라고 나타냈다.
24BXLF2.42K 플라스미드의 2150bpSmaI/BgℓⅡ 단편은SmaI/BgℓⅡ 542.340플라스미드 속으로 클로닝되었다. 결과적인 플라스미드는 542.340gH라고 나타냈다.
SP131gB 플라스미드의 2700bpHindⅢ/HindⅢ 단편은BgℓⅡ 542.340gH 플라스미드 속으로 클로닝되었다. 결과적인 플라스미드는 EBV 트리플.1이라고 나타냈다. EBV 트리플.1 플라스미드속으로 삽입된 EBV 코딩부위의 유전자지도가 도 8에서 주어진다. 전사의 방향이 도 8에서는 화살표로서 나타내진다.
EBV 트리플.1플라스미드를NotI으로 분해하고 3개의 HBV 유전자를 포함하는 NYVAC-기초한 우두 바이러스 재조합체인 vP919 또는 NYVAC로 감염된 VERO 세포속으로 트랜스펙션시켰다. 대응되는 재조합 우두 바이러스 vP944 및 vP941을 분리하여다.
실시예12
헤르페스 심플렉스 바이러스 유형 2의 gB, gC 및 gD 유전자를 발현하는 NYVAC 재조합체의 제조
HSV2 gB, gC 및 gD 유전자를 발현하는 재조합체 우두 바이러스가 제조되었다.
세포 및 바이러스
HSV 2(균주G)를 VERO 세포(ATCC CCL81)에서 증식시키고 수크로스 구배 원심분리에 의하여 정제하였다(Powell 등,1975).
우두 바이러스 (코펜하겐) 및 그것으로부터 유래된 재조합체를 이전에 기술된 것과 같이 (Panicali 등,1982;Guo 등,1989) VERO 세포(ATCC CCL81)에서 증식시켰다.
HSV 2 gB유전자의 분리
HSV 2 gB유전자를 포함하는 12 KbBgℓⅡ 단편을 HSV 2게놈 DNA로부터 분리하고 pSD 48 PUC19의BamHI 위치속에 삽입하였다. 결과적인 플라스미드를 pJ4로 표시하였다.
그 다음 gB 유전자를 우두 바이러스 측면부 암사이에 클로닝하였다. 이것은 pJ4의 2,700bP SstⅡ-SacI(부분)단편을 pMP409DVC의 SstⅡ-SacI 단편속에 클로닝 함으로써 수행되었다(Guo등,1989).
이것에 의해 M2L유전자 측면부의 우두 바이러스 서열사이에 gB 유전자를 위치시켰다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pGB1으로 표시했다. 그다음 gB 유전자의 3'-말단에 인-프레임 중지코돈을 첨가하였다. 이것은 올리고뉴클레오티드 GBL3(SEQ ID NO:69) 5'-CTAATAG-3' 및 GBL4(SEQ ID NO:70) 5'-GATCCTATTAGAGCT-3'을 pGB1의 6,300bpBamHI-SacI(부분)단편 속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pGB2로 표시했다.
그 다음 우두 바이러스 H6 프로모터 (Taylor 등,1988a,b;Perkus 등, 1989)를 gB 유전자의 윗쪽에 클로닝하였다. 이것은 H6 프로모터를 포함하는 PBLVH14 (Portetelle 등,1991)의 370bpBgℓⅡ 단편을 pGB2의BgℓⅡ위치 속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pGB3으로 표시하였다. 그다음 H6 프로모터의 개시코돈을 gB 유전자의 개시 코돈과 정렬시켰다. 이것은 올리고뉴클레오티드 GBL1(SEQ ID NO:71) 5'-
을 pGB3의 6,300bp SstⅡ-EcoRV (부분)단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pGB5로서 나타냈다.
그다음 H6-프로모터 gB 유전자를 다른 우두 바이러스 도너플라스미드 속에 클로닝하였다. 이것은 H-6프로모터 gB 유전자를 포함하는 pGB5의 2,800bpBgℓⅡ-BamHI 단편을 pSD513VCVQ의BgℓⅡ 위치속에 클로닝함으로써 수행되었다 (pSD513VCVQ는 티미딘 키나제(tk) 유전자가 폴리링커 부위에 의해 대체된 우두 바이러스HindⅢ J단편의 서브클론이다). 이것에 의해 tk 유전자 측면부의 우두 바이러스 서열사이에 H6-프로모터 gB유전자가 놓여졌다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pGB6로서 표시하였다.
HSV2 gC 유전자의 분리
HSV2 gC 유전자를 포함하는 2,900bpSaℓI 단편을 HSV2 게놈 DNA로부터 분리하고 pIBI25의SaℓI 위치속에 삽입하였다. 결과적인 플라스미드를 pGC3으로 나타냈다. 그다음 gC 유전자를 우두 바이러스 측면부 암사이에 클로닝하였다. 이것은 pGC3의 2,900bpXhoI-BamHI 단편을 pGC2의XhoI-BamHI 위치속에 클로닝함으로써 수행되었다.
pGC2는 H6 프로모터를 포함하는 pBLVH14(Portetelle 등,1991)의 370bpBgℓⅡ 단편을 pSD486의BgℓⅡ위치속에 클로닝함으로써 생성되었다(도 2). 이것은 u유전자 측의 우두 바이러스 서열사이에 gC 유전자를 위치시켰다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pGC5로 나타냈다.
그 다음 H6 프로모터의 개시코돈을 gC 유전자의 개시코돈과 정렬시켰다. 이것은 올리고뉴클레오티드 GCL1(SE1 ID NO:73) 5'-
을 pGC5의 5,400 bPNruI-SfiI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pGC10으로 나타냈다.
그다음 외래의 3'-비코딩서열을 pGC10으로부터 제거하였다. 이것은 pGC10의 E.coli DNA중합효소 I(클리나우 단편)으로 채워진 4,900bpSaℓI-SmaI (부분)단편을 재서클화시켜서 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pGC11로서 표시하였다.
그다음 부가적인 3'-비코딩서열을 pGC11에서 제거하였다. 이것은 올리고뉴클레오티드 GCL3 5'-CTAGGGCC-3'을 pGC11의 4,900bpXbaI-ApaI (부분) 단편속에 클로닝하여 수행되었다. 이조작에 의해 생성된 플라스미드는 pGC12로서 표시하였다.
HSV2 gD 유전자의 분리
HSV2 gD 유전자를 포함하는 7.5KbXbaI 단편을 HSV2 게놈 DNA에서 분리하고 pIBI25의XbaI 위치속에 삽입하였다. 결과적인 플라스미드를 pGD1으로 나타냈다.
그다음 gD 유전자를 H6 프로모터의 아랫쪽 및 우두 바이러스 측면부암 사이에 클로닝하였다. 이것은 pGD1의 1,500bp DraI-PstI 단편을 pTP15(Guo등,1989)의 3,700bpSmaI-PstI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이것은 gD 유전자를 H6 프로모터의 아랫쪽 및 HA 유전자 측면부의 우두 바이러스 서열사이에 위치시켰다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pGD2로서 표시했다.
그 다음에는 H6 프로모터의 개시코돈을 gD 유전자의 개시코돈과 정렬시켰다. 이것은 올리고뉴클레오티드
를 pGD2의 5,100bpEcoRV-Aha(부분)단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pGD5로서 표시하였다.
그 다음 외래의 3'-비코딩서열을 제거하였다. 이것은 올리고뉴클레오티드 GDL3(SEQ ID NO:77) 5'-
를 pGD5의 4,800bpNaeI-PstI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pGD7으로 표시했다.
그 다음에는 부가적인 서열을 H6 프로모터의 윗쪽에 첨가하였다. 이것은 pGB6 (상기 참조)의 150bpBgℓⅡ-EcoRV단편을 pGD7의 4,800bpBgℓⅡ-EcoRV 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pGD8로서 나타냈다.
HSV2 gB, gC 및 gD 유전자를 포함하는 우두 바이러스 도너 플라스미드의 제조
gC 및 gD 유전자를 포함하는 플라스미드가 제조되었다. 이것은 H6-프로모터 gC 유전자를 포함하는 pGC12의 1,850bpPstI 단편을 pGD8의PstI 위치속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pGCD1이라고 표시하였다.
그 다음에는 gB, gC 및 gD 유전자를 포함하는 플라스미드가 제조되었다. 이것은 H6-프로모터 gB 유전자를 포함하는 pGB6의 2,800bpBgℓⅡ-BamHI 단편을 pGCD1의 6,800bpBamHI (부분)단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pGBCD1으로 표시하였다.
그 다음 외래의 DNA가 제거되었다. 이것은 H6-프로모터 gB, gC 및 gD 유전자를 포함하는 pGBCD1의 E.coli DNA 중합효소I(클리나우단편)으로 채워진 6,000bpHindⅢ-BamHI (부분) 단편을 pMP831의SmaI 위치속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pGBCDC1으로 표시했다.
그 다음에는 H6-프로모터 gB, gC 및 gD 유전자를 우두 바이러스 측면부 암사이에 클로닝하였다. 이것은 올리고뉴클레오티드 HSVL1(SEQ ID NO:79) 5'-TCGAT- CTAGA-3'및 HSVL2 (SEQ ID NO:80) 5'-AGCTTCTAGA-3', H6-프로모터 gB, gC, gD 유전자를 포함하는 pGBCDC1의 5,700bpHindⅢ-BamHI (부분)단편을 pSD541의 3,600bpXhoI-BgℓⅡ단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이것은 ATI유전자 측면부의 우두 바이러스 서열사이에 H6-프로모터 gB, gC 및 gD 유전자를 위치시켰다. 이러한 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pGBCD4라고 표시하였다.
vP914의 제조
HSV2 gB, gC 및 gD 유전자를 포함하는 우두 바이러스 재조합체 vP914가 제조되었다. 우두 바이러스 재조합체를 제조하는데 이용된 방법은 이전에 기술되었다 (Panicali 등, 1982;Guo등, 1989;Guo 등, 1990). 우두 바이러스 재조합체 vP914는 pGBCD4를 vP866(NYVAC) 감염된 세포속에 트랜스펙션시킴으로써 생성되었다. 이 재조합체내의 HSV2 유전자는 우두 바이러스 H6 프로모터의 전사 조절하에 있다.
vP914 감염세포의 면역형광 및 면역침전
면역형광 및 면역침전은 이전에 기술된 대로 수행하였다 (Guo등,1989). 토끼의 HSV2에 대한 항혈청은 DAKO Corp.(code no.B116)으로부터 얻었다. HSV2 gB(H233) 및 HSV2 gD(HD1)에 대한 모노클로날 항체(Meignier 등,1987)는 B.Meignier(Institut Merieux, Lyon,France)으로부터 얻었다. HSV2감염된 세포에서 gB, gC 및 gD(뿐만아니라 기타 HSV2 당단백질)는 세포표면에서 발현된다. HSV2 gB(H233) 및 HSV2 gD(HD1)에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 이용하여 vP914 감염세포로 면역형광 연구를 한 결과는 이 세포에서 생성된 HSV2 gB 및 gD 당단백질이 또한 세포표면에서 발현된다는 것을 나타냈다.
HSV2 감염된 세포에서 gB, gC 및 gD는 각각 대략 117KDa, 63KDa 및 51KDa의 분자량을 가진다(Marsden등, 1978; Marsden 등, 1984; Zweig 등, 1983).
gB-특이적 모노클로날항체(H233)와 vP914감염세포의 면역침전은 다른 소수의 단백질들 뿐만 아니라 대략 117KDa, 110KDa 및 100KDa의 분자량을 갖는 세개의 주요 단백질을 침전시켰다. gD-특이적 모노클로날 항체(HD1)와의 면역침전은 대략 51KDa의 분자량을 갖는 주요단백질 및 대략 55KDa와 46KDa의 분자량을 갖는 소수의 단백질을 침전시켰다. 부가적으로 HSV2에 대한 폴리클로날 항혈청과 vP914 감염세포의 면역침전은 gC와 유사한 분자량 63KDa를 갖는 단백질(뿐만 아니라 85KDa단백질) 및 크기에서 gB와 gD에 해당하는 단백질들을 침전시켰다. 따라서 vP914로 감염된 세포는 gB, gC 및 gD와 유사한 분자량을 갖는 HSV2 단백질을 발현하는 것 같다.
실시예13
B형 간염바이러스 유전자를 발현하는 NYVAC재조합체의 제조
DNA 클로닝 및 합성
플라스미드는 표준방법에 의하여 제조되고, 스크리닝되고, 생장되었다 (Maniatis 등,1982; Perkus등,1985;Piccini 등,1987). 제한 엔도뉴클레아제는 Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg,MD), New England Biolabs (Beverly,MA) 및 Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis,IN)에서 구입하였다. T4 DNA리가제는 New England Biolabs에서 구입하였다. T4 폴리뉴클레오티드 키나제는 Bethesda Research Laboratories로부터 구입하였다. 플라스미드 pGEM-3Z는 Promega(Madison,WI)로부터 구입하였다. pBR322에 클로닝된 HBV 게놈을 포함하는 플라스미드 pTHBV의 기원은 이전에 기술되었다(Paoletti 등, 1984). 합성올리고데옥시리보뉴클레오티드는 이전에 기술된 것과 같이(Perkus 등,1989) Biosearch 8750 또는 Applied Biosystems 380B DNA합성기 상에 제조되었다. DNA서열 결정은 이전에 기술된 것과 같이(Guo등,1989) 시쿼나제를 이용하여(Tabor 및 Richardson, 1987) 디데옥시-사슬종결방법(Sanger 등,1977)에 의하여 수행되었다. 클로닝 및 서열확인 (Engelke등,1988)을 위한 중합효소사슬반응(PCR)에 의한 DNA증폭은 자동화된 Perkin Elmer Cetus DNA 열사이클러에서 통상합성되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 GeneAmp DNA 증폭시약키트(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT)를 이용하여 수행되었다.
바이러스 및 트랜스펙션
우두 바이러스의 NYVAC균주 및 그것의 중간어버이 vP804 (도 5)가 사용되었다. 재조합 바이러스의 생성 및 프로세싱은 이미 기술되었다(Panicali 등,1982).
면역침전
VERO 세포를 재조합체 우두 바이러스로, NYVAC어버이 바이러스(vP866)로 세포당 10pfu의 m.o.i.로 감염되었고, 또는 모의 감염되었다. 1시간 흡착시간 후에 접종물을 제거하고 감염세포를35S-메티오닌(20uci/mℓ)을 포함하는 메티오닌-없는 배지로 덮었다. 모든 샘플을 감염 8시간 후에 수집하였다.
50mℓ아프로티닌(Sigma Chemical Co.,St.Louis, MO, #A6279)을 포함하는 트리톤 및 DOC 함유 3X 완충용액 A(3%NP-40, 3% 트리톤, 3% DOC, 30mM Tris pH 7. 4, 450mM NaCl, 3mM EDTA, 0.03% Na아지드, 0.6mg/mlPMSF)에서 용해시켰다. 모든 용해물을 단백질 A-세파로스에 결합된 정상 토끼혈청에 대하여 미리 제거시켰다.
HBV 코어 항원에 대해 그리고 HBV S2 펩티드(aa 120-153)에 대해 생긴 토끼의 항혈청은 R.Neurath로부터 얻어졌다 (뉴욕혈액센터의 Lindsley F.Kimball Research Institute). 항-S2 항혈청은 vP866 감염된 VERO 세포로 미리 흡착되었다. HBV 단백질은 항-코어 또는 항-S2 항혈청을 이용하여 면역침전되었고 전기영도 및 그 다음의 방사선사진을 위하여 2X Laemmli 샘플 완충용액(Laemmli,1970)에 재현탁되었다.
혈청학
토끼와 기니아피그를 피내의, 피하의 또는 근육내의 경로에 의하여 두 세트로 108pfu 재조합 우두 바이러스 vP919로 접종하였다. 일차 접종하고 6주일 후에 토끼를 똑같은 경로와 투여량으로 한번 추가항원 자극하였다. 일차 접종하고 7주일 후에 기니아피그를 똑같은 경로와 투여량으로 한번 추가항원자극 했다. 12마우스의 그룹을 피내의, 피하의 또는 근육내의 경로에 의하여 107pfu 재조합 우두 바이러스 vP919로 접종시켰다. 일차 접종하고 7주일 후에 마우스를 똑같은 경로에 의하여 한번 추가 항원자극하였다. 혈청을 일주일 간격으로 모았다. 마우스의 각 그룹으로부터 매주 사혈을 모았다. AUSAB 방사면역분석시험 키트(Abbott, North Chicago, IL)를 이용하여 HBV표면 항원에 대한 항체에 대하여 모든 혈청을 분석하였다. 표준기술을 이용한 CORAB 경쟁적 방사면역 분석시험 키트(Abbott)를 이용하여 HBV코어 항원에 대한 항체에 대하여 모든 혈청을 분석하였다.
vP919의 제조
우두 바이러스 재조합체 vP919는 NYVAC우두 바이러스 벡터속에 삽입된 B형 간염 바이러스의 3 유전자를 포함한다. 유전자가 바이러스의 3다른 위치속에 개별적으로 삽입되었다.
3HBV 유전자는 하기의 단백질 산물을 암호화한다: (1)HBV M 단백질 (여기서는 작은 프리 S항원(Small pre S antigen), 또는 spsAg으로 언급됨), (2)HBV L 단백질 (여기서는 큰 프리 S항원(large pre S antigen), 또는 1psAg으로 언급됨) 및 (3)코어 항원의 아미노 터미날에 결합된 전체프리-S부위(S1＋S2)로 구성된 융합 단백질 (여기서는 S12/코어로서 언급됨).
우두 바이러스는 단일 우두 바이러스 게놈 속에 인접하여 삽입된 똑같은 이형의 DNA 서열의 다수의 카피를 유지하지 않는다 (Panicali 등,1982). spsAg에 대한 코딩서열이 1psAg에 대한 코딩서열내에 포함되기 때문에, 단일 우두 바이러스 게놈 속으로의 양쪽 유전자의 삽입은 게놈의 불안정성으로 이끌게 될 것이다. 유사하게 하이브리드 S12/코어 유전자내에 존재하는 S1＋S2DNA부위는 1psAg의 동등한 S1＋S2부위와 재조합을 겪을수 있다. 이러한 가능성있는 문제는 두방법으로 방지되었다. (1) 필수유전자포함 우두 바이러스 DNA의 큰 부위에 의해 서로 분리된 우두 바이러스 게놈내의 3다른 유전자좌 속에 3유전자를 삽입하였다. 그리하여 HBV 유전자 사이의 어떤 재조합은 생존 가능한 우두 바이러스 자손을 생성하지 않는 불완전한 우두 바이러스 게놈으로 될 것이다. (2) S12/코어 하이브리드 유전자의 S1＋S2부위 및 spsAg 유전자를 암호화하는 DNA는 1psAg를 암호화하는 본래의 HBV 유전자와 그리고 서로서로와 DNA상동성을 최소화하도록 다른 코돈용법으로 화학적으로 합성되었다. 1psAg를 암호화하는 본래의 HBV 유전자 및 spsAg를 암호화하는 합성유전자는 ayw서브유형에 속한다; 융합S12/코어유전자에 대한 S1＋S2부위는 adw2 서브유형에 해당하도록 합성되었다(Valenzuela 등,1979).
폭스바이러스 프로모터의 조절하에서 3개의 개별적인 HBV 유전자를 포함하는 카세트가 다른 우두 바이러스 도너 플라스미드내에 조립되었고 하기에서 세부적으로 기술된 것처럼 우두 바이러스속으로 순서적으로 삽입되었다.
HBV SpsAg를 암호화하는 유전자의 합성형은 하기의 변형을 지닌 우두 바이러스 선호코돈을 이용하여 합성되었다. (1) sAg(HBV S단백질)의 아미노산 19 내지 21에 존재하는 T5NT 초기 전사 종결인자 TTTTTCT가 TTCTTTC로 변경되었고, 다른 T5NT 종결시그날의 생성을 방지하기 위해 코돈이용이 조정되었다(Yuen 등,1987). (2) 가능한 변형된 번역생성물을 피하기 위하여, 어느 방향으로도 어떤 프레임밖의 ATG 개시코돈의 생성을 방지하도록 코돈이용이 조정되었다. 합성 spsAg유전자가 변형된 합성 우두 바이러스 H6 초기/후기 프로모터에 정확하게 결합되었다 (Perkus 등, 1989). 프로모터와 유전자의 완전한 서열이 도 9에서 보여진다. 아미노산 서열은 플라스미드 pTHBV의 서열에 기초하는데, 이것은 S2 부위의 2 아미노산 위치에서 공표된 ayw서열(Galibert 등, 1979)과 다르다: Galibert,aa31 thr;aa 36 leu; pTHBV, aa 31 ala; aa 36 pro.
플라스미드 pGJ15는 우두 바이러스 ATI삽입 유전자좌내에 H6 프로모터/합성 spsAg유전자를 포함한다(Perkus 등, 1990). pGJ15는 pGEM-3Z에 합성 spsAg유전자 부분을 조립하고, 그 다음 조립된 유전자를 삽입플라스미드 pMP494H로 운반하였는데, 이것은 ATI삭제 유전자좌내에 합성 H6 프로모터를 포함하는 pSD492의 유도체이다.
도 10에 대해 기술하면, 합성 HBV spsAg는 3부분으로 조립되었다. 플라스미드 pGJ5, pGJ3, 및 pGJ7은 하기와 같이 각각 상보적인 올리고뉴클레오티드의 6, 5, 및 8쌍으로부터 생성되었다. 표준화학으로 합성된 상보적인 올리고뉴클레오티드 쌍이 표준조건하에서 키나제화되고 65℃에서 가열되고 실온으로 천천히 냉각시켜서 어닐링시켰다. 각 단편을 포함하는 어닐링된 염기쌍의 분액을 적당히 분해된 pGEM-3Z(Promega)와 혼합하여 표준 조건하에서 결합시켰다.
SphI 및XbaI 제한 위치에 의해 경계지워진 단편 SX (검게칠한 부분으로 나타냄)를 그 효소로 분해된 pGEM-3Z 벡터플라스미드에 결합시켜서 플라스미드 pGJ5를 생성하였다. 벡터플라스미드 서열은 열린 부위로 표시된다. 유사하게 단편 XB(사선그물모양) 및 BH(수평선그물모양)를 각각XbaI과BamHI, 또는BamHI과HindⅢ로 분해된 플라스미드 pGEM-3Z내에 조립시켜서 플라스미드 pGJ3 및 pGJ7을 생성하였다. 각 플라스미드에서의 삽입체의 상태는 DNA 서열의 결정에 의해 확인되었다.
합성 HBV 유전자 단편은 플라스미드 pGJ5, pGJ3 및 pGJ7을 적당한 제한 효소로 분해하여 SX,XB 및 BH 유전자 단편을 측면부 위치시키고 다음에는SphI 및HindⅢ로 분해된 pGEM-3Z에 결합시켜서 인접하는 HBV합성 spsAg서열을 포함하는 플라스미드 pGJ9를 생성하였다. 개시 메티오닌에서 첫 코돈으로부터 9bp 아랫쪽EcoRI위치까지 합성 spsAg에 첨부된 H6 프로모터의 3' 28bp(사선그물모양)를 포함하는 올리고뉴클레오티드 H6LINK(SEQ ID NO:81)
를KpnI(pGEM-3Z에서 유도된 다수의 클로닝부위내의SphI 위치의 5')으로 그리고EcoRI으로 분해된 pGJ9에 결합시켜서 플라스미드 pGJ12를 생성하였다.NruI/HpaI 단편을 pGJ12에서 분리하고 유사하게 분해된 pMP494H에 결합시켜서 플라스미드 pGJ15를 생성하였다. pMP494H는 ATI삭제부위내에 우두 바이러스 H6 프로모터를 포함하는 ATI 삽입플라스미드이다. pGJ15는 ATI유전자좌를 둘러싸는 우두서열 (점으로 표시된)에 의해 측면위치된 H6 프로 모터-구동되는 HBV합성 spsAg를 포함한다.
pGJ15가 우두 재조합체 vP804와의 재조합을 위한 도너플라스미드로서 이용되어 재조합 우두 바이러스 vP856이 생성되었다. vP804는 TK, HA,u및 [C7L-K1L]에 대한 NYVAC삭제를 포함한다. 재조합 바이러스 vP856은 ATI부위를 대체하는 HBV합성 spsAg의 삽입과 함께 상기 삭제를 포함한다. I4L부위내에 삽입체를 포함하는 하기에서 기술된 자손 바이러스 재조합체는 삭제의 견지에서 NYVAC와 동등할 것이다 (TK, HA, ATI, I4L,u, [C7L-K1L]).
HBV 1psAg를 암호화하는 유전자는 플라스미드 pTHBV로부터 유도되었다. 상기에서 언급한 S2 부위의 아미노산 변화 뿐만아니라 pTHBV는 S1부위의 하나의 아미노산 위치에서 공표된 ayw 서브유형과 다르다: Galibert등,1979,aa90 ser;pTHBV aa 90 thr. 상기에서 언급한 sAg의 초기 번역종결 시그날이 TTTTTCT에서 TTCTTCT로 변형되었다. 전체의 1psAg유전자는 105bp 우두u프로모터의 조절하에 위치되었다 (Pickup 등,1986).u프로모터/1psAg 유전자 카세트의 전체서열은 도 11에서 보여진다.
플라스미드 pMP 550u1ps는 우두 바이러스 I4L삭제 유전자좌내에u프로모터/ 1psAg 유전자를 포함한다. PMP550 u1ps의 구성은 도 12에서 도식적으로 나타냈다. PMP550 u1ps에서 I4L 삭제는 NYVAC에서 I4L 삭제와 동등하다.
제 12(A)도에 대해 기술하면, 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 MPSYN322 (SEQ ID NO:83), MPSYN323 (SEQ IN NO:84) 및 주형 플라스미드 pBScow를 이용한 PCR에 의하여 HBV 1psAg 유전자의 5'말단을 우두 바이러스u프로모터에 첨가하여 (방향은 화살표로서 표시) pMPuS1을 생성하였다 (검게 칠한 부분은u프로모터를 나타내고 줄무늬 부분은 HBV 서열을 나타낸다). pSD550은 I4L 삭제부위에 대한 우두 바이러스 삽입 플라스미드이다 (삼각형은 삭제위치를 나타내고 열린 부분은 우두 바이러스 서열을 나타낸다).u프로모터/HBV 접합부를 포함하는SnaBI/BamHI 단편이 분리되었고SmaI/BamHI으로 절단된 pSD550속에 삽입되어 pMP550u를 형성하였다.
이제 제 12(B)도를 설명하면, 전체의 HBV 1psAg를 포함하는 1.1kbDraI 단편이 PTHBV로부터 분리되고 pUC8속에 삽입되어 pMP8S가 생성되었다. 번역개시코돈과 중지코돈을 나타냈다. (*)는 T5NT 전사 종결 시그날 위치를 나타낸다(Yuen 등, 1987). 전사 종결 시그날은 표시된 대로 PCR 돌연변이 유발에 의하여 pMP8S로부터 제거되어 pMP8ST를 생성하였다. 1psAg 유전자 부분을 포함하는 1.1kbBamHI (부분)단편이 pMP8ST로부터 분리되었고BamHI으로 절단된 플라스미드 pMP550u 속에 삽입되어 pMP550ulps를 생성하였다. 우두 바이러스 재조합체 vP856과의 재조합을 위해 pMP550ulps를 이용하여 vP896을 생성하였다. 합성 올리고뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:
MPSYN322 (SEQ IN NO:83)에서 HBV 개시코돈은 밑줄친 부분이며 MPSYN331 (SEQ IN NO:86)에서 돌연변이된 염기는 밑줄친 부분이며 제한위치가 표시되어 있다.
상기에서 기술한 레스큐바이러스 vP856과의 재조합을 위한 도너플라스미드로서 pMP550ulps를 이용하여 재조합 바이러스 vP896을 생성하였다. vP896은 NYVAC 백그라운드 (TK, HA, ATI, I4L,u, [C7L-K1L]의 삭제)에서 HBV spsAg 및 HBV lpsAg 유전자를 포함한다. 다가의 HBV 우두 바이러스 재조합체와 비교할 목적으로 단지 HBV lspAg 유전자를 포함하는 재조합체를 생성하기 위하여, pMP550ulps가 vP866(NYVAC)과의 재조합에 이용되어 재조합 바이러스 vP897이 생성되었다.
우두 바이러스속에 삽입된 세번째 HBV 유전자는 융합단백질을 암호화한다. HBV S1 및 S2 부위를 특정하는 합성 DNA가 HBV 코어 항원을 특정하는 유전자의 5'말단에 클로닝되었다. 합성 DNA는 aa 위치 12에서 met으로 시작하여(ayw 서브유형의 위치 1과 동등한) (Galibert등, 1979), adw 서브유형의 S1 + S2 부위를 암호화하도록 고안되었다 (Valenzuela등, 1979). S1 + S2의 전체번역부위는 163 코돈이다. 다가의 HBV 우두 재조합체 바이러스의 HBV 유전자 사이에서 원하지 않는 분자내 재조합을 방지하기 위해서, pGJ15의 합성 S2 부위뿐만 아니라 pHTBV에 존재하는 본래의 ayw S1 + S2 부위와 합성 S1 + S2 부위의 DNA 상동성을 최소화하도록 코돈이용이 조정되었다.
코어항원을 암호화하는 전체유전자가 pTHBV로부터 얻어졌다. pTHBV에 의해 암호화된 코어항원의 아미노산 서열은 공표된 ayw 서열과 일치한다 (Galibert등, 1979). S12/코어를 암호화하는 간염융합 유전자는 우두 바이러스 I3L 초기/중간 프로모터의 조절하에 위치되었다 (Vos 등, 1988; Goebel등, 1990b 위치 64,973 -65,074). I3L 프로모터/S12/코어 유전자 카세트의 전체서열이 도 13에서 주어진다 (SEQ IN NO:87).
플라스미드 pMP544I3S12C는 HA 삭제 유전자좌내에 I3L 프로모터/S1 + S2/코어 유전자를 포함한다 (Guo 등, 1989). pMP544I3S12C의 구성은 도 14에서 도식적으로 주어졌다.
도 14에 대해 기술하면, 플라스미드 pMPCA-B는 pUC9의SmaI 위치속에 삽입된 pTHBV의 1kb HhaI 단편을 포함한다. pMP9CA-B는 HBV 코어 항원의 전체 코딩서열 뿐만 아니라 그 유전자 윗쪽 및 아랫쪽의 측면부 HBV DNA를 포함한다. pMP9CA-B는 유전자의 3'말단으로부터 윗쪽 30bp가BgℓII (부분)로 그리고 HBV/pUC 접합부의 폴리링커 부위내에서EcoRI으로 절단되었다. HBV 유전자 부분을 포함하는 3.4kb 벡터단편을 분리하고 어닐링된 합성 올리고뉴클레오티드 MPSYN275/MPSYN276 (SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:89)
와 결합시켜서 pMP9CA-C를 생성하였다. 제한위치가 표시되었고 번역중지코돈은 밑줄친 부분이며 초기 우두 바이러스 전사종결인자는 윗줄친 부분이다.
pMP9CA-C는 HBV 코어항원에 대한 전체 코딩서열을 포함하고, 상기에 나타낸 대로 그 유전자 대부분에 대한 공급원으로서 이용되었다.
합성 S1 + S2 부위는 하기에 나타낸 대로 합성 올리고뉴클레오티드 MPSYN290부터 MPSYN308 (SEQ ID NO:90)-(SEQ ID NO:99)을 이용하여 상기에 나타낸 것처럼 5 이중가닥섹션(section)A 부터 E에 조립하였다. 올리고뉴클레오티드는 크기에서 46mer부터 71mer까지에 속하고, 4 내지 8bp 접착성 말단을 가진다.
일 섹션내의 내부위치에 있는 올리고뉴클레오티드의 5'말단은 그 섹션의 어닐링전에 키나제화되었다. 섹션 A부터 E를 제조하는데 이용된 합성 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에서 주어진다. 단지 코딩사슬만이 보여진다. 적당한 제한위치가 표시된다. S1 (섹션 A), S2 (섹션 C) 및 코어 (섹션 E)에 대한 개시코돈은 밑줄친 부분이다.
우두 바이러스 I3L 프로모터는 PCR 프라이머로서 합성 올리고뉴클레오티드 MPSYN310(SEQ ID NO:100), MPSYN311 (SEQ ID NO:101), 주형으로서HindIII I의 서브클론인 pMP1을 이용하여 합성되었다. 제한위치가 표시되었다.
I3 프로모터/HBV S1 + S2/코어 발현카세트는 상기에서 세부화된 중간단계의 플라스미드 클론을 이용하여 단계적으로 pUC8 및 pUC9에서 조립되어 pMP9I3A12core가 생성되었다. 제한위치는 적당한 곳에서만 표시되었다.
플라스미드 pMP9I3S12core를SmaI으로 분해하고 전체 프로모터/유전자 카세트를 포함하는 1.2kb 단편을 분리하였다. 우두 바이러스 HA 삭제 플라스미드 pSD544를SmaI으로 절단하고 1.2kb 단편과 결합시켜서 플라스미드 pMP544I3S12C를 생성하였다.
pMP544I3S12C는 상기에서 기술된 우두재조합체 vP896과의 재조합을 위한 도너플라스미드로서 이용되어 재조합 우두 바이러스 vP919를 생성하였다. vP919는 모두 3 개의 HBV 삽입체를 포함한다: NYVAC 백그라운드내의 spsAg, lpsAg 및 S12/코어융합. vP919의 모든 HBV 삽입의 서열은 주형으로서 vP919를 이용한 중합효소 사슬반응(PCR) 다음 PCR 생성된 물질의 디데옥시 서열결정에 의해 확인되었다. 부가적으로 pMP544I3S12C는 상기에서 기술한 vP804와의 재조합에서 이용되어 단지 HBV S12/코어 융합을 포함하는 재조합 우두 바이러스 vP858을 생성하였다. pMP544I3S12C는 또한 재조합 우두 바이러스 vP856과의 재조합에 이용되어 재조합 우두 바이러스 vP891을 생성하였다. vP891은 두 HBV 유전자 삽입체 spsAg 및 S12/코어를 포함한다.
vP919에 의한 HBV 단백질의 발현
삼중 HBV 재조합체에 의해 합성된 다양한 HBV 단백질을 정량하기 위하여, 단일 및 이중 HBV 유전자 삽입체를 포함하는 적당한 우두 재조합체 및 vP919로 감염된 세포의 대사적으로 표지된 용해물을 면역침전시키고 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 다음 방사선사진법에 의해 분석하였다. 미감염 세포 및 vP866(NYVAC), vP856(spsAg), vP896(spsAg + lpsAg) 또는 vP919(spsAg, lpsAg, S12/코어)로 감염된 세포에서의 단백질이 토끼의 항-S2 항혈청을 이용하여 면역침전되었다. 부가적인 미감염 세포 및 vP919(spsAg, lpsAg, S12/코어), vP858(S12/코어) 또는 vP866(NYVAC)로 감염된 부가적인 세포에서의 단백질이 토끼의 항-코어 항혈청을 이용하여 면역침전되었다. 항-S2 혈청은 spsAg 유전자를 포함하는 우두 바이러스 단일 재조합체 vP856으로부터 33kDa의 주요단백질을 침전시킨다. 이것은 HBV spsAg의 단일글리코실화 형태의 기대되는 크기에 해당한다. spsAg의 이중글리코실화 형태에 대한 기대되는 크기에 대응하는 단백질 36kDa는 보다 적은 양으로 침전된다. 항-S2 혈청은 spsAg 및 lpsAg 유전자를 포함하는 우두 바이러스 이중조합체 vP896으로부터 동일한 단백질을 침전시킨다. 부가적으로 38kDa 및 41kDa의 두개의 보다 큰 단백질이 침전되는데 이것은 lpsAg의 기대되는 크기 (비글리코실화된 것은 39kDa 그리고 글리코실화된 것은 42kDa)와 잘 대응한다. vP856 및 vP896의 항-S2 혈청에 의해 침전되는 모든 단백질은 또한 우두 바이러스 HBV 삼중 재조합체 vP919로부터 침전된다.
HBV S12/코어 융합 단백질의 예상되는 크기는 38kDa이다. 토끼의 항-코어 항혈청은 예상되는 크기의 단백질뿐만 아니라 HBV 융합 유전자 S12/코어를 포함하는 우두 바이러스 단일재조합체 vP858로부터 다양한 보다 작은 단백질들을 침전시켰다. 항-코어 혈청에 의하여 vP858로부터 침전되는 가장 풍부한 단백질은 27kDa의 크기를 가진다. 이것은 융합단백질 유전자의 번역이 두번째(S2)ATG에서 시작된다면 예상될 수 있는 번역산물과 크기에서 대응한다. vP858에서 침전된 20kDa 단백질은 27kDa 단백질의 글리코실화 형태일 수 있다. 크기에서 코어 단백질만에 대한 번역산물에 해당하는 20kDa의 보다 작은 단백질도 또한 보다 더 적은 양으로 vP858로부터 침전되었다. 3개의 HBV 유전자 모두(spsAg, lpsAg 및 S12/코어 융합)를 포함하는 우두 바이러스 재조합체 vP919는 항-코어 항혈청과의 면역침전에서 vP858로 관찰된 것과 동일한 패턴을 나타냈다. 항-코어 항혈청에 의해 vP858과 vP919로부터 침전된 27kDa와 29kDa 단백질은 기대된 것처럼 항-S2 항혈청에 의해 vP919로부터 침전되었다.
vP919에 대한 항체반응
vP919에 의해 생성된 HBV 단백질에 대한 혈청학적 반응을 시험하기 위하여 바이러스를 토끼, 기니아피그 및 마우스속에 접종하였다. 토끼와 기니아피그는 피내의, 피하의 또는 근육내의 경로에 의해 두 세트로 108pfu 재조합 우두 바이러스 vP919로 접종되었다. 일차 접종 6주일후에 똑같은 경로 및 투여량으로 토끼를 한번 추가 항원 자극하였다. 일차 접종 7주일후에 똑같은 경로 및 투여량으로 기니아피그를 한번 추가 항원자극하였다. 12 마우스의 그룹을 피내의, 피하의 또는 근육내의 경로에 의해 107pfu 재조합 우두 바이러스 vP919로 접종하였다. 일차접종 7주일후에 동일한 경로에 의하여 마우스를 한번 추가항원 자극하였다. 혈청을 매주간격으로 모았다. 각 마우스 그룹으로부터 매주마다의 사혈을 모았다. 모든 혈청은 AUSAB 방사성 면역검사키드(Abbott)를 이용하여 HBV 표면항원에 대한 항체에 대해 분석되었다. 모든 혈청은 CORAB 경쟁적 방사성 면역검사 키드(Abbott)를 이용하여 HBV 코어항원에 대한 항체에 대해 분석되었다. 검사는 표준기술을 이용하여 수행되었다. 이러한 분석의 결과는 표 2 (토끼), 3 (기니아피그) 및 4 (마우스)에서 주어진다.
표 2에 주어진 결과를 요약하면, 6 토끼 모두 vP919로 단일 접종했을때 항-코어 항체 반응을 나타냈다. 6 토끼중 5에서 항-코어 항체 반응이 vP919의 두 번째 접종에 의해 추가항원자극되었다. 6 토끼중 4는 vP919의 단일접종시 항 sAg 반응을 나타냈다. 이 4 토끼 + 하나의 부가적인 토끼는 두번째 접종시 항 sAg 반응의 증가를 보였다.
표 3에 주어진 결과를 요약하면, 하나의 기니아피그는 vP919로 초기접종시 항-코어반응을 나타냈다; 7 주일경 추가항원자극시, 3 기나아피그 전체가 항-코어 반응을 보였다. 이 동물중 하나는 단지 8 주일경에 항-sAg 항체반응을 보였다.
표 4에서 주어진 결과를 요약하면, 마우스의 세그룹 모두 vP919로 접종한 후 다양한 시간마다 항-코어 항체반응을 보였다; 세 그룹중 둘이 항-sAg 반응을 보였다.
AUSRIA 검사
HBV-포함 우두 재조합체로 감염된 세포로부터 특정 HBV 표면항원의 발현을 상업적으로 구입가능한 AUSRIA II-125 키트(Abbott Laboratories, North Chicago, IL)를 이용하여 검사하였다. 2 x 106VERO 세포를 포함하는 접시를 2 pfu/세포로 재조합 우두 바이러스로 삼중으로 감염시켰다. 24시간후에 배양배지를 제거하고, 세포를 2㎖ PBS로 세척하고, 세척물을 배지와 결합하여 10분간 1000 rpm에서 원심분리하였다. 상층액을 배지분획이라고 하였다. 접시에 2㎖ PBS를 첨가하고 세포를 긁어내서 상기의 세포 펠렛과 합쳐서 세포 분획을 제조하였다. 배지 및 세포 분획의 최종 체적을 PBS로 4㎖로 조정하였다. 세포 분획을 검사전에 2 분동안 초음파처리하였다. 세포 분획 및 배지 분획을 AUSRIA 키트를 이용하여 1:5 희석하여 HBV 표면항원의 존재에 대해 검사하였다. 키트에서 공급된 2.1 x 네가티브 대조군의 차단값 이하의 샘플을 네가티브로 간주하였다. 모든 접시의 세포 및 배지 분획의 생성 바이러스를 VERO 세포상에서 적정하였다. 결과가 표 5에서 보여진다.
EPV 42kDa 프로모터의 조절하에서 HBV lpsAg를 발현하는 우두 바이러스 재조합체의 제조
우두 재조합체 vP919는 감염후 초기에 작용하는 3가지 다른 폭스바이러스 프로모터 조절하의 3가지 별개의 HBV 유전자를 포함한다. 똑같은 우두 바이러스 백그라운드에서 감염후 초기에 외부유전자를 발현하는 다양한 폭스바이러스 프로모터의 상대적인 강도를 비교하기 위하여, 테스트 유전자로서 광견병 당단백질 G 유전자를 이용하는 샌드위치 ELISA 검사가 개발되었다. 이 테스트 시스템을 이용하여, 우두 바이러스 H6 프로모터 및 우두 바이러스 I3L 프로모터가 우두 바이러스u프로모터보다 보다 강한 프로모터인 것으로 밝혀졌다. vP919에서 H6 프로모터는 HBV spsAg의 발현을 지시하고, I3L 프로모터는 HBV S12/코어 융합의 발현을 지시하고,u프로모터는 HBV lpsAg의 발현을 지시한다. 비교적 약한u프로모터가 HBV lpsAg의 발현에 대해서 의도적으로 선택되었는데, 그것은 lpsAg의 공발현이 입자형성 및 sAg 또는 spsAg의 분비를 방해하기 때문이라는 것이 보여졌다 (Ou등, 1987; Cheng 등, 1986; McLachlan 등, 1987; Chisari 등, 1986).
AUSRIA 방사성 면역검사 키트를 이용하여 HBV 유전자를 발현하는 재조합 우두 바이러스에 의한 sAg 또는 spsAg 포함 입자의 생체외 생성을 측정하였다. 예비조사는 AUSRIA 반응성 입자형성 및 분비가 vP856(spsAg 포함), vP896(spsAg + lpsAg) 및 vP919(spsAg + lpsAg + S12/코어)에서 일어난다는 것을 보였다. vP896 및 vP919에서는 AUSRIA-반응성 입자의 분비의 상대적 수준이 vP856으로 관찰된 것보다 더 낮았다.
AUSRIA-반응성 입자의 형성 및 분비가 lpsAg 발현의 보다 높은 수준의 존재에서 관찰될 수 있는지를 결정하기 위해서, lpsAg 유전자가 엔토모폭스 (EPV)42kDa 프로모터의 조절하에 위치되었다. 상기에서 기술된 비교 ELISA 테스트에 의해, 우두 재조합 바이러스내의 EPV 42kDa 프로모터가 우두 H6 프로모터 또는 우두 I3L 프로모터로 관찰된 것과 동등한 수준으로 외부유전자의 발현을 지시하였다.
플라스미드 pMP550ulps는 우두 I4L 삭제 유전자좌의 우두u프로모터의 조절하에 있는 lpsAg 유전자를 포함한다(도 12). 플라스미드 pMP550ulps에 존재하는 우두u프로모터가 하기와 같이 EPV 42kDa 프로모터에 의해 대체되었다: 상보적인 올리고 뉴클레오티드 MPSYN371-374가 내부의 5'말단 (MPSYN372; MPSYN373)에서 키나제화되고, 어닐링되고,EcoRI/BamHI으로 절단된 pUC8 속에 클로닝되어 플라스미드 pMP371/374를 형성하였다. MPSYN372 (SEQ ID NO:102), MPSYN373 (SEQ ID NO:103), MPSYN372 (SEQ ID NO:104), 및 MPSYN374 (SEQ ID N0:105)
는 31bp EPV 42kDa 프로모터 요소를 포함하고, 다음에는 HBV S1 부위 (ATG 밑줄친 부분)에서BamHI 위치까지를 포함한다. DNA 서열 확인하고,BamHI/BgℓII로 분해시켜서 pMP371/374로부터 삽입체를 분리하였고, 하기와 같이 pMP550ulps내의 대응하는u프로모터/HBV 서열을 대체하는데 이용하였다: pMP550ulps를BamHI(부분)/BgℓII로 분해시키고, 적당한 5kb 벡터 단편을 분리하고 pMP371/374로부터BamHI/BgℓII 단편과 결합시켰다. 결과적인 플라스미드 pMP550E31lps에서, HBV lpsAg는 EPV 42kDa 프로모터의 조절하에 있다. EPV 42kDa 프로모터/lpsAg 유전자 카세트의 전체서열은 도 15에서 주어졌다.
이중 HBV 재조합 우두 바이러스 vP932를 생성하기 위해 spsAg 유전자를 포함하는 우두 재조합체 vP856과 함께 도너 플라스미드로서 pMP550E31lps를 이용하였다. vP932를 S12/코어 융합 포함 도너플라스미드 pMP544I3S12C와 함께 레스큐 바이러스로서 이용하여 삼중 HBV 재조합 우두 바이러스 vP975를 생성하였다. 단지 EPV 42kDa 프로모터/lpsAg를 포함하는 우두 재조합체를 생성하기 위하여, vP866과 함께 도너 플라스미드로서 pMP550E31lps를 이용하여 재조합 우두 바이러스 vP930을 생성하였다.
재조합 우두 바이러스에 의한 HBV 표면 항원의 생체외 분비
VERO 세포를 포함하는 접시가 삼중으로 HBV spsAg 및/또는 HBV lpsAg를 발현하는 재조합 우두 바이러스 또는 NYVAC (vP866)으로 감염되었다. 감염세포와 연관된 HBV 표면항원입자의 상대적 양을 AUSIR II-125 키트를 이용하여 배지속으로 분비된 양을 비교하였다(표 5). 배지내의 HBV 표면항원의 존재는 바이러스 감염성의 99.8% 이상이 세포연관된 상태로 남아 있기 때문에 감염세포의 용해에 기인하지 않는다. 세포펠렛 및 배지의 체적을 직접적인 비교를 위하여 같게 하였다. spsAg를 발현하는 재조합 우두 바이러스 vP856으로 감염된 세포에서는 AUSRIA 반응성 표면항원의 42%가 배지속으로 분비되었다. 비교적 약한u프로모터의 조절하에서 lpsAg의 공발현 (vP896)은 세포연관된 AUSRIA 반응성 물질의 양을 심하게 변화시키지는 않지만, 분비되는 물질의 상대적인 양을 전체의 24%로 감소시켰다. 비교적 강한 EPV 42kDa 프로모터의 조절하에서 lpsAg의 공발현 (vP932)은 분비되는 물질의 상대적인 양을 전체의 6%까지 감소시켰다. vP896의 경우와 같이 vP932에서 spsAg와 lpsAg의 공발현은 AUSRIA 반응성 세포 연관된 물질의 양을 감소시키지 않았다. 흥미있게도, EPV 42kDa 프로모터 조절하에서 lpsAg 만의 발현 (vP930)은 검사의 백그라운드 이상으로 상당히 세포연관된 AUSRIA 반응성 물질의 양을 생성한 반면,u프로모터 조절하에서 lpsAg의 발현 (vP896)은 그렇지 않았다. 이것은 내부의 (S2 또는 S) 개시코돈에서의 개시때문에 vP930 감염세포에서 생성되는 spsAg 또는 sAg의 보다 높은 수준에 기인하는 것같다.
실시예 14
B형 간염 바이러스 및 엡스타인 바르 바이러스를 발현하는 NYVAC 재조합체의 제조
엡스타인 바르 바이러스(EVB) 및 B형 간염 바이러스(HBV)는 아프리카를 포함하여 유사한 지리학적 지역에 걸쳐 풍토성이 있기 때문에, 양쪽 병원체에 대한 면역원을 발현하는 재조합 우두 바이러스를 생성하는 것이 유용할 것이다. 이러한 목적으로 NYVAC 백그라운드내에서 3 EBV 유전자와 3 HBV 유전자를 포함하는 재조합 우두 바이러스 vP941이 생성되었다.
HBV 단백질의 면역침전
HBV 단백질의 대사적 표지화 및 면역침전은 하기의 변경과 실시예13에서 vP919에 대해 기술된 것과 같다. 재조합체 우두 바이러스, 어버이 NYVAC 바이러스 (vP866) 감염 및 모의 감염은 VERO 세포가 아닌 RK-13 세포상에서 수행되었다. 항-S2 및 항-코어 항혈청이 vP866 감염된 RK-13 세포로 미리 흡착되었다.
재조합 우두 바이러스 vP941의 생성
우두 바이러스 재조합체 EBV 트리플릿(triplet) vP944를 생성하는데 이용된 3 EBV 유전자를 포함하는 도너 플라스미드인 플라스미드 EBV 트리플.1이 레스큐 바이러스로서 우두 바이러스 재조합체 HBV 트리플릿 vP919와의 재조합에서 이용되었다. 결과적인 바이러스 vP941이32P-표지된 EBV DNA에 의해 확인되었다. vP944처럼 vP941은 엔토모폭스 바이러스 42kDa 프로모터의 조절하에서 EBV 유전자 gH, 우두 바이러스 H6 프로모터의 조절하에서 gB, 우두 바이러스 H6 프로모터의 조절하에서 gp340을 포함하는데, 모두 우두 바이러스 TK 삭제 유전자좌 속에 삽입되었다. vP919처럼 vP941은 ATI 삭제 유전자좌내에 삽입된 우두 바이러스 H6 프로모터의 조절하의 합성 HBV spsAg, I4L 삭제 유전자좌 속에 삽입된 우두u프로모터의 조절하의 HBV lpsAg, 및 HA 삭제 유전자좌 속에 삽입된 I3L 프로모터의 조절하의 HBV S12/코어 융합 유전자를 포함하였다. 재조합 우두 바이러스 vP941의 게놈의 상태는 DNA의 제한분석에 의하여 확인되었다.
vP941에 의한 HBV 단백질의 발현
6 중의 HBV/EBV 우두 바이러스 재조합체 vP941에 의해 생성되는 다양한 HBV 단백질을 검사하기 위하여, vP941 및 적당한 단일의, 이중의 및 삼중의 HBV 재조합체로 감염된 RK-13 세포에서 합성된 대사적으로 표지된 단백질을 면역침전시켰다. 미 감염세포 및 vP866 (NYVAC), vP856 (spsAg), vP896 (spsAg + lpsAg), vP919 (spsAg + lpsAg + S12/코어), 또는 vP941로 감염된 세포에서의 단백질을 토끼의 항-S2 항혈청을 이용하여 면역침전시켰다. 부가적인 미 감염세포 및 vP941, vP919, vP858 (S12/코어), 또는 vP866으로 감염된 부가적인 세포를 항-코어 항혈청을 이용하여 면역침전시켰다.
항-S2 혈청은 spsAg 유전자를 포함하는 우두 바이러스 단일 재조합체 vP856으로부터 33kDa와 36kDa의 두 단백질을 침전시킨다. 이것들은 HBV spsAg의 단일 및 이중 글리코실화 형태에 대한 기대되는 크기에 해당한다. 항-S2 혈청은 spsAg 및 lpsAg 유전자를 포함하는 우두 바이러스 이중 재조합체 vP896으로부터 동일한 단백질을 침전시킨다. 부가적으로, lpsAg의 단일 글리코실화 형태에 해당하는 42kDa의 단백질은 침전되고 뿐만 아니라 45kDa 및 48kDa의 보다 큰 단백질도 침전된다. lpsAg의 비글리코실화 형태에 해당하는 39kDa 단백질은 글리코실화 형태와 비교할 때 소량으로 침전된다. vP856 및 vP896의 항-S2 혈청에 의해 침전되는 모든 단백질은 HBV 삼중 재조합체 vP919 및 HBV/EBV 6중 재조합체 vP941로부터 침전되었다. 방사선 사진에서, HBV 단백질은 우두 재조합체로 감염된 RK-13 세포로부터 항-S2 혈청에 의해 면역침전되었다. HBV 단백질이 동일한 우두 바이러스 재조합체 (vP856, vP896 및 vP919)로 감염된 VERO 세포로부터 면역침전되었을때 동일한 단백질이 관찰되었지만 다른 상대적인 양으로 관찰되었다. 일반적으로 이러한 재조합 우두 바이러스에 의하여 발현된 spsAg 및 lpsAg는 VERO 세포에서 보다도 RK-13 세포에서 더 완전하게 글리코실화되는 것같다.
vP858로 감염된 VERO 세포에서 보여지듯이, vP858로 감염된 RK-13 세포로부터 항-코어 혈청에 의하여 침전된 가장 풍부한 단백질은 27kDa의 크기를 갖는다. 이것은 S12/코어 융합 유전자의 번역이 두번째 (S2)ATG에서 시작되면 예상될 수 있는 번역산물의 크기에 해당한다. VERO 세포의 vP858 감염의 경우 관찰되는 상태와는 달리, RK-13 세포의 vP858 감염과 항-코어 혈청과의 면역침전은 크기에 있어 완전한 S12/코어 번역산물에 대해 기대되는 38kDa에 해당하는 눈에 보이는 밴드로 되지는 않는다. 또한 HBV 단일 재조합체 vP858로부터 항-코어 혈청에 의해 침전되는 모든 단백질은 HBV 삼중 재조합체 vP919 및 HBV/EBV 육중 재조합체 vP941로부터 침전된다.
실시예 15
광견병 바이러스 당단백질 G를 발현하는 ALVAC 재조합체의 제조
본 실시예는 ALVAC-RG (VCP65)로서 표시되는 카나리아폭스-광견병 재조합체의 개발 및 그것의 안전성과 효능을 기술한다.
세포 및 바이러스
어버이 카나리아폭스 바이러스(Rentschler 균주)는 카나리아를 위한 백신균주이다. 백신균주는 야생형 분리체로부터 얻어졌고 병아래 배 피브로블라스트에서 200 번이상 연속 계대접종을 통해서 약독화되었다. 마스터 바이러스 시드(seed)는 한천하에서 네 번 연속적인 플라크 정제시키고 플라크 클론은 다섯번의 부가적인 계대접종을 통해서 증폭되었고 그후 스톡바이러스가 생체외 재조합 시험에서 어버이 바이러스로서 이용되었다. 플라크 정제된 카나리아폭스 분리체는 ALVAC로서 표시하였다.
카나리아폭스 삽입 벡터의 제조
880bp 카나리아폭스PvuII 단편을 pUC9의PvuII 위치 사이에 클로닝하여 pRW764.5를 형성하였다. 이 단편의 서열은 위치 1372와 2251 사이에서 도 16에서 보여진다. C5로서 표시되는 오픈 리딩 프레임의 한계가 정의되었다. 오픈 리딩 프레임은 단편내에서 위치 166에서 개시되고 위치 487에서 종결된다는 것이 결정되었다. C5 삭제는 오픈 리딩 프레임의 방해없이 만들어졌다. 위치 167부터 위치 455까지의 염기가 서열(SEQ ID NO:106) GCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAGTTT로 대체되었다. 이 대체서열은HindIII,SmaI 및EcoRI 삽입위치, 다음에는 번역 종결 시그날 및 우두 바이러스 RNA 중합효소에 의해 인식되는 전사종결 시그날을 포함한다 (Yuen등, 1987).
C5 ORF의 삭제는 하기에 기술된 대로 수행되었다. 플라스미드 pRW764.5를RsaI으로 부분적으로 절단하였고 직선상의 산물을 분리하였다.RsaI 직선상 단편을BgℓII로 다시 절단하였고, 위치 156에서 위치 462까지 BgℓI 내지 BgℓII 삭제를 지닌 pRW764.5 단편을 분리하였고, 하기의 합성 올리고뉴클레오티드에 대한 벡터로서 이용하였다:
올리고뉴클레오티드 RW145 및 RW146을 어닐링시키고 상기에서 기술한 pRW764.5RsaI 및BgℓII 벡터속에 삽입하였다. 결과적인 플라스미드를 pRW831로 표시했다.
광견병 G 유전자를 포함하는 삽입 벡터의 제조
pRW838의 제조는 하기에서 기술되었다. 광견병 G의 ATG와 H6 프로모터의 번역 개시코돈을 겹치게 하는 올리고뉴클레오티드 A 내지 E가 pUC9속으로 pRW737로서 클로닝되었다. 올리고뉴클레오티드 A 내지 E는 H6 프로모터,NruI에서 시작하여 광견병 G의HindIII 위치까지 다음에는BgℓII 위치를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 A 내지 E (SEQ ID NO:109)-(SEQ ID NO:113)의 서열은 다음과 같다:
어닐링된 올리고뉴클레오티드 A 내지 E의 도해는 다음과 같다:
올리고뉴클레오티드 A 내지 E가 키나제화되고, 어닐링되고(5분간 95℃, 그 다음 실온까지 냉각), pUC9의PvuII 위치 사이에 삽입되었다. 결과적인 플라스미드 pRW737를HindIII 및BgℓII로 절단하고, ptg155PRO (Kieny등, 1984)의 1.6kbpHindIII-BgℓII 단편에 대한 벡터로서 이용되어 pRW739를 생성하였다. ptg155PROHindIII 위치는 광견병 G 번역개시코돈의 86bp 아랫쪽이다.BgℓII는 ptg155PRO에서 광견병 G 번역 중지코돈의 아랫쪽이다. pRW739를NruI으로 부분적으로 절단하고,BgℓII로 완전히 절단하고, 이전에 기술된 H6 프로모터 (Taylor등, 1988a,b; Guo등, 1989; Perkus등, 1989)의 3'말단부터 전체 광견병 G 유전자를 포함하는 1.7kbpNruI-BgℓII 단편을 pRW824의NruI과BamHI 사이에 삽입하였다. 결과적인 플라스미드를 pRW832로서 나타냈다. pRW824 속으로의 삽입은NruI의 5'에 H6 프로모터를 첨가하였다.BamHI 다음의SmaI의 pRW824 서열은 GGATCCCCGGG이다. pRW824는 우두 바이러스 H6 프로모터에 정확하게 결합된 적절하지 않은 유전자를 포함하는 플라스미드이다.NruI과BamHI으로 분해시키면 이 적절하지 않은 유전자를 완전히 절단한다. H6 프로모터 구동되는 광견병 G를 포함하는 1.8kbp pRW832SmaI 단편을 pRW831의 pRW831의SmaI속에 삽입하여 플라스미드 pRW838을 형성하였다.
ALVAC-RG의 개발
플라스미드 pRW838을 이전에 기술된 인산칼슘 침전방법 (Panicali등, 1982; Piccini 등, 1987)을 이용하여 ALVAC 감염된 일차 CEF 세포속에 트랜스펙션시켰다. 포지티브 플라크는 특이적인 광견병 G 프로브와의 혼성화에 근거하여 선택되었고 순수 집단에 도달할 때까지 플라크 정제를 6번 연속적으로 수행하였다. 그 다음 하나의 대표적인 플라크를 증폭시키고, 결과적인 ALVAC 재조합체를 ALVAC-RG (vCP65)로서 나타냈다. 돌연변이없는 ALVAC 게놈속으로의 광견병 G 유전자의 정확한 삽입이 서열분석에 의하여 확인되었다.
면역형광
완전한 광견병 바이러스 입자의 조립의 마지막 단계동안, 당단백질 성분은 골지체로부터 원형질막으로 운반되는데, 원형질막에서 그것은 카르복시 터미날은 세포질속으로 연장되고 단백질의 대부분은 세포막의 외부표면상에 존재하도록 축적된다. ALVAC-RG에서 발현되는 광견병 당단백질이 정확하게 제공되는지를 확인하기 위해서, ALVAC 또는 ALVAC-RG로 감염된 일차 CEF 세포상에서 면역형광법이 수행되었다. 면역형광법은 광견병 G 단일클로날 항체를 이용하여 이전에 기술된 대로 수행되었다(Taylor 등, 1990). ALVAC-RG로 감염된 CEF 세포상에서는 강한 표면형광이 검출되었지만 어버이 ALVAC로는 그러하지 않았다.
면역 침전
일차 CEF, VERO (아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 ATCC # CCL 81) 및 MRC-5 세포(정상 인간 태아폐 조직에서 추출된 피브로블라스트-같은 세포주 ATCC # CCL171)의 미리 형성된 단일층을 10 pfu/세포로 방사성 표지된35S-메티오닌의 존재하에서 어버이 바이러스 ALVAC 및 재조합 바이러스 ALVAC-RG로 접종하였고 이전에 기술된 대로 처리하였다 (Taylor등, 1990). 면역 침전반응은 광견병 G 특이적인 단일클로날 항체를 이용하여 수행되었다. 대략 67kDa의 분자량을 가지는 광견병 특이적인 당단백질의 효율적인 발현은 재조합체 ALVAC-RG로 검출되었다. 미감염 세포 또는 어버이 ALVAC 바이러스로 감염된 세포에서는 어떤 광견병 특이적인 산물도 검출되지 않았다.
순차적인 계대접종 실험
비-조류 종 범위에서의 ALVAC 바이러스 연구에는 어떠한 증식감염 또는 공공연한 질병이 관찰되지 않았다 (Taylor등, 1991b). 그러나 어떠한 어버이나 재조합 바이러스가 비-조류 세포에서 생장하도록 적응할 수 없는 것을 확립하기 위하여 순차적인 계대접종시험을 생성하였다.
두 바이러스 ALVAC와 ALVAC-RG를 3 세포주에서 10순차적인 블라인드 계대접종(blind passage)으로 접종하였다:
(1) 11일째의 화이트레그혼 배로부터 생성된 일차 병아리 배 피브로블라스트 (CEF)세포;
(2) VERO 세포-아프리카 녹색원숭이 신장세포의 연속적인 세포주(ATCC # CCL81);
(3) MRC-5-세포-인간 태아 폐 조직에서 추출된 2 배체 세포주(ATCC # CCL171).
초기 접종은 접시당 2×106세포를 포함하는 각 세포주의 3개의 60mm 접시를 사용하여 세포당 0.1 pfu의 m. o. i.로 수행되었다. 한 접시는 DNA 복제의 억제인자인 시토신 아라비노시드(Ara C)40μg/㎖의 존재하에서 접종되었다. 37℃에서 1 시간의 흡수기간 후에, 접종물을 제거하고 단일층을 세척하여 흡수되지 않는 바이러스를 제거하였다. 이때 배지를 두접시(샘플 t0 및 t7 )상에서는 5㎖의 EMEM + 2% NBCS 그리고 세 번째 접시(샘플 t7A )상에서는 40μg/㎖ AraC를 포함하는 5㎖의 EMEM + 2% NBCS로 대체하였다. 샘플 t0는 잔류투입 바이러스의 표시를 제공하도록 -70℃에서 동결되었다. 샘플 t7 및 t7A를 37℃에서 7일간 배양하고 그후 내용물을 수거하고 세포를 간접적인 초음파 처리에 의해 파열시켰다.
각 세포주의 샘플 t7 1㎖을 동일한 세포주의 세접시상에 희석하지 않고 접종하였고(샘플 t0, t7 및 t7A를 제공하도록) 그리고 일차 CEF 세포의 한접시상에 접종하였다. 샘플 t0, t7 및 t7A는 계대접종 1에 대해서와 같이 처리되었다. 비-조류세포에 존재할 수 있는 바이러스를 보다 더 민감하게 검출하기 위한 증폭단계를 제공하도록 CEF 세포에의 부가적인 접종이 포함되었다.
이러한 과정이 10 (CEF 및 MRC-5) 또는 8 (VERO) 순차적인 블라인드 계대접종에 대해서 반복되었다. 그 다음 샘플을 세번 동결시키고 녹이고 일차 CEF 단일층에서의 적정에 의하여 검사하였다. 그 다음 각 샘플내의 바이러스 수율이 아가로스하의 CEF 단일층에서의 플라크 적정에 의해 결정되었다.
실험의 요약된 결과가 표 6 및 7에서 보여진다.
이 결과들은 어버이 ALVAC 및 재조합 ALVAC-RG가 적정량의 상실없이 CEF 단일층에서 지속되는 복제를 할수 있다는 것을 나타낸다. VERO 세포에서 바이러스 수준은 ALVAC에 대해서 2 계대접종 및 ALVAC-RG에 대해서 1 계대접종 후에는 검출수준 이하로 감소된다. MRC-5 세포에서는 유사한 결과가 명백해졌고 1 계대접종 후에 어떤 바이러스도 검출되지 않았다. 단지 4 계대접종 결과가 표 6 및 7에서 보여짐에도 불구하고 비-조류세포에서의 생장에 대한 바이러스의 검출가능 적응이 없는 시리즈가 8 (VERO) 및 10 (MRC-5)계대접종에 대하여 계속되었다.
계대접종 1에서 비교적 높은 수준의 바이러스가 MRC-5 및 VERO 세포의 t7 샘플에 존재하였다. 그러나 이러한 바이러스 수준은 t0 샘플에서 보여지는 것과 동등하였고, 어떤 바이러스 복제도 일어날 수 없는 시토신 아라비노시드의 존재하에서 t7A 샘플을 배양하였다. 이것은 비-조류세포에서 7일경에 보여지는 바이러스 수준은 잔류 바이러스를 나타내고 새로 복제된 바이러스를 나타내는 것이 아니라는 것을 증명하였다.
검사를 보다 민감하게 하기 위해서, 각 세포주로 부터의 7일경의 수거물 일부를 허용(permissive) CEF 단일층에 접종하였고, CPE가 명백하지 않으면 7일경에 또는 세포병리학적 효과(CPE)에서 수거하였다. 이 실험의 결과는 표 8에서 보여진다. 허용세포주를 통한 증식후 조차도 바이러스가 단지 두번의 부가적인 계대접종에 대하여 MRC-5 및 VERO 세포에서 검출되었다. 이러한 결과는 사용조건하에서 베로 또는 MRC-5 세포에서의 생장에 대한 바이러스의 적응이 없다는 것을 나타냈다.
짧은꼬리 원숭이의 접종
4 HIV 혈청양성 짧은꼬리 원숭이를 처음에는 표 9에서 기술한 대로 ALVAC-RG로 접종하였다. 100일 후에 추가항원 자극효과를 결정하기 위해 이 동물을 재접종하고, 부가적인 7동물을 일정한 범위의 투여량으로 접종하였다. 혈액을 적당한 간격으로 모아서, 30분동안 56℃에서 열불활성화시킨 후에 고속형광 포커스 억제검사 (Rapid Fluorescent Focus Inhibition Assay)(Smith 등, 1973)를 이용하여 항-광견병 항체의 존재에 대하여 혈청을 분석하였다.
침팬지의 접종
두 성체 수컷 침팬지(50 내지 65kg 중량 범위)를 1×107pfu의 VCP 65로 근육내 경로로 또는 피하의 경로로 접종하였다. 동물들을 반응에 대해 관찰하고 RFFI 테스트(Smith등, 1973)로 항-광견병 항체의 존재를 분석하기 위하여 규칙적인 간격마다 사혈하였다. 초기접종 13주일 후에 동물을 동일한 투여량으로 재-접종하였다.
마우스의 접종
마우스의 그룹을 다른 배치의 VCP 65의 일정한 범위의 희석물 50 내지 100μℓ로 접종하였다. 풋패드에서 마우스가 접종되었다. 14일경에 광견병 바이러스 병원성 CVS 균주의 15 내지 43 마우스 LD50의 두개내 접종에 의하여 마우스가 침범되었다. 마우스의 생존을 측정하고 접종 28일 후 보호투여량(protective dose) 50% (PD50)을 계산하였다.
개 및 고양이의 접종
5개월된 10마리의 비글개 및 4개월된 10마리의 고양이를 ALVAC-RG의 6.7 또는 7.7log10TCID50으로 피하내 경로로 접종하였다.
4마리의 개 및 4마리의 고양이는 접종되지 않았다. 접종후 14일 그리고 28일 경에 동물들을 사혈하여 RFFI 테스트로 항-광견병 항체를 측정하였다. ALVAC-RG의 6.7log10TCID50을 받아들인 동물이 백신접종 29일 후에 NYGS 광견병 바이러스 공격균주의 3.7log10마우스 LD50(개) 또는 4.3log10마우스 LD50(고양이)으로 공격되었다.
다람쥐 원숭이의 접종
4다람쥐 원숭이(Saimiri sciureus)의 3 그룹을 세 바이러스중 하나로 접종하였는데 세 바이러스는 (a)어버이 카나리아 폭스 바이러스인 ALVAC, (b)광견병 G 당단백질을 발현하는 재조합체인 ALVAC-RG 또는 (c)고양이 백혈병 바이러스의 외피 당단백질을 발현하는 카나리아 폭스 재조합체인 VCP37이다. 접종은 케타민 마취하에서 수행되었다. 각 동물은 동시에 수용하였다: (1) 난절없이 우측 눈 표면에 주입된 20μℓ; (2) 입에서 몇 비말로서 100μℓ; (3) 우측팔의 외부면의 면도된 피부에서 두피내의 주입위치의 각각에서 100μℓ; (4)우측 대퇴부의 앞쪽 근육에서 100μℓ.
4원숭이를 각 바이러스로 접종하였는데, 둘은 전체 5.0log10pfu로 그리고 둘은 전체 7.0log10pfu로 접종하였다. 동물을 규칙적인 간격마다 사혈하였고 RFFI 테스트(smith등,1973)를 이용하여 항광견병 항체의 존재에 대하여 혈청을 분석하였다. 백신접종에 대한 반응에 대해서 매일 동물을 관찰하였다. 초기 접종 6개월후 하나의 실험을 받은 적이 없는 원숭이 뿐만 아니라 ALVAC-RG 수용한 4원숭이, 초기에 VCP37을 수용한 2원숭이, 초기에 ALVAC를 수용한 2원숭이를 피하내 경로로 ALVAC-RG의 6.5log10pfu로 접종하였다. RFFI테스트(smith 등,1973)에서 광견병 중화항체의 존재에 대해 혈청을 검사하였다.
인간세포주의 ALVAC-RG로의 접종
바이러스가 생산적으로 복제하지 못하는 비-조류 세포에서 외부유전자의 효율적인 발현이 얻어질수 있는 지를 결정하기 위해서, 5세포유형 (하나는 조류, 넷은 비-조류)을 바이러스 수율, 외부 광견병 G유전자의 발현 및 바이러스 특이적인 DNA축적에 대하여 분석하였다.
접종된 세포는 하기와 같다:
(a) Vero, 아프리카 녹색원숭이 신장세포,ATCC # CCL81;
(b) MRC-5,인간 태아의 폐,ATCC # CCL 171;
(c) WISH인간양막,ATCC # CCL 25;
(d) Detroit-532,인간표피, 다운즈 증후군,ATCC # CCL 54;
(e) 일차 CEF세포
11일째의 화이트 레그혼 배로부터 생성된 병아리 배 피브로블라스트 세포가 포지티브 컨트롤로서 포함되었다. 모든 접종은 하기에서 논의되는 것처럼 2×106세포의 미리 형성된 단일층에서 수행되었다.
A.DNA분석방법
각 세포주의 3접시가 테스트하의 바이러스의 5pfu/세포로 접종되었는데, 각 세포주의 하나의 여분의 접시는 접종되지 않았다. 하나의 접시를 시토신 아리비노시드(Arac) 40μg/mℓ존재하에 배양하였다. 37℃에서 60 분간의 흡착기간후에 접종물을 제거하고 미흡착된 바이러스를 제거하기 위해 단일층을 두번 세척하였다. 그다음 배지(Ara C 존재 또는 부재)를 대체하였다. 한 접시의 세포(Ara C부재)를 타임제로 샘플로서 수집하였다. 남아있는 접시들을 72시간 동안 37℃에서 배양하였고, 그때 세포를 수집하여 DNA축적을 분석하는데 사용하였다. 2×106세포의 각 샘플을 40mM EDTA를 포함하는 0.5mℓ인산완충된 함염물 (phosphate buffered saline; PBS)에 재현탁시키고 37℃에서 5분간 배양하였다. 42℃에서 예열되고 120mM EDTA를 포함하는 동일체적의 1.5% 아가로스를 세포현탁액에 첨가하고 천천히 혼합하였다. 현탁액을 아가로스플러그몰드로 옮기고 적어도 15분간 경화되게 하였다. 그다음 아가로스 플러그를 제거하고 완전하게 플러그를 덮고 있는 일정 부피의 용해 완충용액(1% 사르코실,100μg/mℓ 단백질 가수분해효소 K,10mM Tris Hcl pH7.5,200mM EDTA)에서 50℃에서 12-16시간 동안 배양하였다. 그다음 용해 완충용액을 5.0mℓ멸균한 0.5 X　TBE(44.5mM Tris-붕산염 44.5mM붕산,0.5mM EDTA)로 대체하였고 TBE 완충용액을 3번 변화시키면서 6시간 동안 4℃에서 평형시켰다. 플러그 내의 바이러스 DNA가 펄스필드 전기영동시스템을 이용하여 세포 RNA 및 DNA로부터 분리되었다. 전기영동은 0.5 X TBE에서 15℃에서 50-90초 램프로 180V에서 20시간 동안 수행되었다. DNA는 λ DNA분자량 표준물과 함께 전개되었다. 전기영동 후에 바이러스 DNA밴드는 보롬화 에티듐으로 염색함으로써 시각화되었다. 그다음 DNA가 니트로셀룰로스막으로 옮겨졌고, 정제한 ALVAC 게놈 DNA로부터 제조된 방사성 표지된 프로브로 조사하였다.
B.바이러스 수율의 평가
투입다중도가 0.1pfu/세포인 것을 제외하고는 접시를 상기에서 기술한 대로 정확하게 접종하였다.
감염 72시간 후에 세포를 동결 및 해빙의 세번의 연속적인 사이클에 의해 용해시켰다. 바이러스 수율은 DEF단일층에서의 플라크 적정에 의하여 평가하였다.
C.광견병 G유전자 발현의 분석
10pfu/세포의 다중도로 접시를 재조합체 또는 어버이 바이러스로 접종하였는데, 부가적인 한 접시는 감염되지 않은 바이러스 컨트롤로 하였다. 한시간 흡수시간 후에 배지를 제거하고 메티오닌 없는 배지로 대체하였다. 30분 후에 이 배지를35S-메티오닌 25uci/mℓ을 포함하는 메티오닌-없는 배지로 대체하였다. 감염세포를 하룻밤 동안 (대략16시간)표지화시키고, 그다음 완충용액 A용해 완충액의 첨가에 의하여 용해시켰다. 면역 침전은 광견병 G특이적인 모노클로날 항체를 이용하여 이전에 기술한 대로(Taylor 등,1990) 수행되었다.
결과
바이러스 수율의 평가
0.1 pfu/세포로 접종하고 72시간 후에 수율에 대한 적정의 결과가 표10에 주어져 있다. 이 결과는 조류세포에서 생산적인 감염이 이루어질수 있는 반면 4 비-조류 세포시스템에서는 이 방법에 의하여 바이러스 수율의 증가가 검출될 수 없다는 것을 나타낸다.
바이러스 DNA축적의 분석
비-조류세포에서 생산적인 바이러스 복제에 대한 차단이 DNA복제 전 또는 후에 일어나는지를 결정하기 위하여, 세포 용해물의 DNA를 전기영동에 의해 분류하고, 니트로셀룰로스로 옮기고, 바이러스 특이적인 DNA의 존재에 대해 조사하였다. 비감염된 CEF 세포, 타임제로에서 ALVAC-RG 감염된 CEF세포, 시토신 아리비노시드 40μg/mℓ의 존재하에서 감염후 72시간경 ALVAC-RG 감염된 CEF세포 및 감염후 72시간경 ALVAC-RG 감염된 CEF 세포의 DNA는 모두 약간의 백그라운드 활성을 나타냈는데, 이것은 아마도 방사성 표지된 ALVAC DNA 프로브 제조에서 오염된 DEF세포 DNA때문이다. 그러나 감염후 72시간경에 ALVAC-RG 감염된 CEF세포는 ALVAC-특이적인 바이러스 DNA축적을 나타내는 대략 350Kbp의 부위에서 강한 밴드를 나타냈다. DNA 합성 억제인자인 시토신 아리비노시드의 존재하에서 배양물을 배양하였을 때에는 그같은 밴드가 검출가능하지 않았다. VERO 세포에서 생성된 동등한 샘플은 타임제로에서 ALVAC-RG감염된 VERO 세포에서 대략 350Kbp에서 매우 희미한 밴드를 보였다. 이러한 수준은 잔류바이러스를 나타냈다. 감염후 72시간 경에는 밴드의 강도가 증폭되었는데, 이것은 바이러스 특이적인 DNA 복제의 일부수준은 VERO 세포에서 일어났고 이것은 바이러스 자손의 증가로 되지 않았다는 것을 나타낸다. MRC-5 세포에서 생성된 동등한 샘플은 이 세포주에서 이러한 조건하에서는 어떤 바이러스 특이적인 DNA 축적이 검출되지 않는다는 것을 나타냈다. 그 다음에는 이 실험이 부가적인 인간 세포주, 특이적으로 WISH 및 Detroit-532세포를 포함하도록 확장되었다. ALVAC 감염된 CEF세포가 포지터브 컨트롤로서 제공되었다. ALVAC-RG로 접종된 WISH 또는 Detroit세포에서는 어떤 바이러스 특이적인 DNA축적도 검출되지 않았다.
이 방법의 검출한계는 완전히 확인되지 않았고 바이러스 DNA축적이 이 방법의 감도이하의 수준으로는 일어날수 있다는 것이 주지되어야 한다. 바이러스 DNA 복제가3H-티미딘 삽입에 의해 측정되는 다른 실험은 베로 및 MRC-5세포를 얻어진 결과를 지지한다.
광견병 유전자 발현의 분석
어떤 바이러스 유전자 발현, 특히 삽입된 외부유전자의 발현이 바이러스 DNA복제의 부재하에서 조차 인간세포주에서 일어나는지를 결정하기 위하여, 면역침전실험이 ALVAC 및 ALVAC-RG로 감염된 조류 및 비-조류세포의35S-메티오닌 표지된 용해물에서 수행되었다. 광견병 G특이적인 모노클로날 항체를 이용한 면역침전결과는 ALVAC-RG로 감염된 CEF, 베로 및 MRC-5, WISH 및 Detroit세포에서 67KDa 당단백질의 특이적인 면역침전을 나타낸다. 비감염세포 및 어버이감염세포 용해물에서는 어떤 그러한 특이적인 광견병유전자산물이 검출되지 않았다. 이 실험의 결과는 분석된 인간 세포주에서 ALVAC-RG 재조합체가 H6 초기/후기 우두 바이러스 프로모터의 전사조절하에서 감염을 개시하고 외부유전자 산물을 발현할 수 있음에도 불구하고, 복제는 DNA복제를 통해서 진행하지 못하고, 어떤 검출가능한 바이러스 자손이 생성되지 않는다는 것을 나타냈다. VERO 세포에서는, ALVAC-RG 특이적인 DNA 축적의 일부 수준이 관찰되었음에도 불구하고, 이 방법에 의해 어떤 바이러스 자손도 검출되지 않았다. 이러한 결과는 분석된 인간세포주에서는 바이러스 복제의 차단이 DNA복제의 개시전에 일어나고, 반면에 VERO 세포에서는 차단이 바이러스 DNA 복제의 개시 후에 일어난다는 것을 나타낼 것이다.
ALVAC-RG에서 발현되는 광견병 당단백질이 면역원성이 있는 지를 결정하기 위하여, 많은 동물종이 재조합체의 접종에 의하여 검사되었다. 현재 광견병 백신의 효능은 마우스 모델시스템에서 평가된다. 그러므로 유사한 테스트가 ALVAC-RG를 이용하여 수행되었다. 1mℓ당 6.7내지 8.4 log10TCID50범위의 감염적 정량으로 9가지 다른 바이러스 제조물(시드 바이러스의 10번의 순차적인 조직배양 계대접종 후에 생성된 하나의 백신(J)를 포함)을 순차적으로 희석하고, 50 내지 100μℓ의 희석물을 4 내지 6주일된 마우스의 풋패드 속에 접종하였다. 컨트롤 마우스그룹에서 치사율 적정에 의해 결정된대로 15 내지 43마우스 LD50을 포함하는 광견병 바이러스의 CVS균주 300μℓ로 두개내 경로에 의해 14일후에 마우스를 공격하였다. PD50(보호투여량 50%)으로 표현되는 효능은 공격후 14 일경에 계산되었다. 실험결과는 표11에서 보여진다. 이 결과는 ALVAC-RG가 평균값 3.73(STD 0.48)의 3.33 내지 4.56 범위의 PD50값을 갖는 광견병 바이러스 공격에 대항하여 마우스를 일관되게 보호할수 있다는 것을 나타낸다. 이 연구의 연장으로서 수컷 마우스를 ALVAC-RG 6.0 ℓog10TCID50을 포함하는 바이러스 50μℓ로 또는 동등한 부피의 비감염세포 현탁액으로 두개내 경로로 접종하였다. 마우스를 접종후 1일, 3일 및 6일경에 희생하여 뇌를 제거하고, 고정하고, 절개하였다. 조직병리학적 조사는 마우스에서 ALVAC-RG의 신경독성에 대한 증거를 보이지 않았다.
개와 고양이에 대한 ALVAC-RG의 안전성과 효능을 평가하기 위하여, 14,5개월된 비글 및 14,4 개월된 고양이 그룹을 분석하였다. 각 종에서 4마리의 동물은 백신접종되지 않았다. 5 동물은 6.7ℓog10TCID50을 피하경로에 의해 수용하였고 5동물은 동일한 경로에 의해 7.7ℓog10TCID50을 수용하였다. 항-광견병 항체에 대한 분석을 위해 동물들이 사혈되었다. 어떤 접종물도 수용하지 않은 동물 또는 ALVAC-RG의 6.7ℓog10TCID50을 수용한 동물이 백신접종후 29일경에 NYGS 광견병 바이러스 공격균주의 3.7ℓog10마우스 LD50(개, 측두 근육에서)또는 4.3ℓog10마우스 LD50(고양이, 목에서)으로 공격되었다. 실험결과는 표12에서 보여진다.
접종물 바이러스의 어느 투여량으로도 고양이나 개에서 어떠한 접종에 대한 해가 되는 반응들이 보여지지 않았다.
6.7ℓog10TCID50으로 면역화된 5마리개중 4이 백신접종후 14일경에 항체 역가를가졌고 모든 개가 29일 경에는 역가를 가졌다. 모든 개들이 4컨트롤로부터 3을 사멸시킨 공격으로부터 보호되었다. 고양이에서는 6.7ℓog10TCID50을 수용한 5고양이중 3은 14일경에 특이적인 항체역가를 가졌고 평균 항체역가가 2.9IU로 낮음에도 불구하고 모든 고양이가 29일경에는 양성이었다. 5 고양이중 3이 모든 컨트롤을 사멸시킨 공격에서 생존하였다.
7.7ℓog10TCID50으로 면역화된 모든 고양이는 14일경에 항체역가를 가졌고 29일경에 기하학적 평균역가는 8.1국제 단위로 계산되었다.
ALVAC, ALVAC-RG 및 관련없는 카나리아폭스 바이러스 재조합체로의 접종에 대한 다람쥐 원숭이(Saimiri sciureus)의 면역반응을 조사하였다. 원숭이 그룹은 상기에서 기술한 대로 접종되었고 광견병 특이적인 항체의 존재에 대해 혈청이 분석되었다. 피내의 경로에의한 접종에 대한 약간의 전형적인 피부 반응과는 별도로 원숭이중 어떤것에서도 해가되는 반응성은 보여지지 않았다. 단지 접종후 2일경 및 4일경에 피내접종후 피부상처로부터 소량의 잔류 바이러스가 분리되었다. 7일경 및 그 이후에는 모든 표본이 음성이었다. 근육내 주사에 대해서도 어떤 국부적인 반응이 없었다.
ALVAC-RG로 접종된 네마리의 원숭이 모두 RFFI 테스트에서 측정된 것처럼 항-광견병 혈청중화 항체를 발달시켰다. 초기접종후 대략 6개월경에 모든 원숭이 및 하나의 부가적인 새로운 원숭이를 ALVAC-RG의 6.5ℓog10TCID50으로 좌측대퇴부의 외부면에서 피하 경로에 의해 재-접종하였다. 항-광견병 항체의 존재에 대해서 혈청을 분석하였다.
결과는 표13에서 보여진다.
광견병에 대해 5원숭이중 4는 ALVAC-RG 접종후 7일경에 혈청학적 반응을 발달시켰다. 접종후 11일경에는 모든 5원숭이가 검출가능한 항체를가졌다. 광견병 당단백질에 미리 노출시킨 4원숭이중에서 모두 백신접종후 3일과 7일사이에 혈청중화 역가의 상당한 증가를 보였다. 이 결과는 ALVAC-RG로의 다람쥐 원숭이의 백신접종은 해가되는 부작용을 생성하지 않고일차 중화 항체반응이 유도될 수 있다는 것을 나타낸다. 또한 재-백신접종으로 마취반응이 유도된다. 관련없는 외부유전자를 발현하는 카나리아폭스 재조합체 또는 ALVAC에 전에 노출시키면 재-백신접종으로 항-광견병 면역반응의 유도를 방해하지 않는다.
ALVAC-RG 접종에 대한 HIV-2 혈청양성 짧은꼬리 원숭이(macaque)의 면역학적 반응을 평가하였다. 동물을 상기에서 기술한대로 접종하고 RFFI 테스트에서 항-광견병 혈청 중화 항체의 존재를 평가하였다.
표14에서 보여지는 결과는 피하의 경로에 의해 접종된 HIV-2 양성동물은 일 접종후 11일경에 항-광견병 항체를 발달시킨다는 것을 나타낸다. 일차접종후 대략 3개월경 주어진 추가항원자극 접종후에는 마취반응이 검출되었다. 경구의 경로에 의해 재조합체를 수용한 동물에서는 어떤 반응도 검출되지 않았다. 부가적으로 일련의 6동물을 근육내 경로 또는 피하의 경로에의하여 ALVAC-RG의 감소하는 투여량으로 접종하였다. 접종한 6동물중 다섯이 백신접종후 14일경에 항체 역가에서 상당한 차이를 나타내지 않고 반응하였다.
HIV 에 미리 노출시킨 두 침팬지를 ALVAC-RG의 7.0ℓog10pfu로 피하 또는 근육내 경로에 의해 접종하였다. 접종후 3개월경에 양 동물이 동일한 방법으로 재-백신접종되었다. 결과는 표15에서 보여진다.
근육내의 또는 피하의 경로에의하여 접종에 대해 어떤 해가되는 반응성도 보여지지 않았다. 두 침팬지는 14일경 일차 접종에 반응하였고 재-백신접종후 강하게 일어나는 반응이 검출되었다.
실시예16
플라비 바이러스 단백질을 발현하는 NYVAC 재조합체의 제조
본 실시예는 일본뇌염 바이러스(JEV), 황열 바이러스(YF) 및 뎅그열 유형1 (Dengue type 1)의 유전자를 포함하는 NYVAC 도너플라스미드의 제조, 대응하는 NYVAC 플라비 바이러스 재조합체의 분리 및 상동 바이러스의 치명적인 공격에 대항하여 마우스를 보호하기 위해 JEV 또는 YF 게놈 부분을 발현하는 우두 바이러스 재조합체의 능력을 기술한다.
세포주 및 바이러스 균주
우두 바이러스 vP410의 코펜하겐 균주의 티미딘 키나제 돌연변이체(Guo등, 1989)가 재조합체 vP825, vP829, vP857및 vP864를 생성하는데 이용되었다(하기 참조). vP555의 생성은 이전에 기술되었다(Mason등, 1991). 생합성 연구는 FBS및 항생제로 보충된 Eagle 최소필수배지에서 37 ℃에서 생장된 HeLa 세포를 이용하여 수행되었다. 모든 생체외 실험에서 사용된 JEV 바이러스는 JEV의 나카야마 균주의 계대접종 55 젖먹이 새끼 마우스 뇌 현탁액으로 감염된 C6/36 세포로 부터 제조되고 정화된 배양액이었다(Mason, 1989). 동물 공격실험은 JEV의 고병원성 P3 균주를 이용하여 수행되었다(하기 참조).
우두 바이러스 도너 플라스미드 속으로의 JEV 유전자의 클로닝
JEV-우두 재조합체 바이러스를 제조하는데 이용된 JEV cDNA는 JEV의 나카야마 균주로부터 유도되었다(McAda등, 1987).
pUC18의SmaI 및EcoRI 위치에서 JEV cDNA(뉴클레오티드-28 내지 1000)를 포함하는 플라스미드 pDr20을BamHI과EcoRI으로 분해하고 JEV cDNA 삽입체를 pIBI25 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) 속에 클로닝하여 플라스미드 JEV18을 생성하였다. JEV 18을 JE 서열내에서 (뉴클레오티드 23)ApaI 및 pIBI25 내에서 XhoI으로 분해하고 어닐링된 올리고뉴클레오티드 J90 (SEQ ID NO: 114) 및 J91 (SEQ ID NO: 115)(XhoI 접착성 말단,SmaI 위치 및 JE 뉴클레오티드 1내지 23을 포함)에 결합시켜서 플라스미드 JEV19를 생성하였다. JEV19를 pIBI25 내에서XhoI 그리고 JE 서열내에서(뉴클레오티드 602)AccI으로 분해시키고 결과적인 613bp단편을 플라스미드 오리진 및 E(뉴클레오티드 602내지 2124)의 아미노-터미날 2/3와 카르복시-터미날 40% prM을 암호화하는 JEV cDNA를 포함하는 JEV2 (Mason등, 1991)의XhoI 및AccI 단편속에 클로닝하여 플라스미드 JEV20을 생성하였는데,이것은 C의 ATG로부터 E의 마지막 1/3에서 발견되는SacI 위치(뉴클레오티드2124)까지 JE 서열을 포함한다.
E의 마지막 1/3로부터 NS2B(뉴클레오티드 2124 내지 4126)의 첫번째 두 아미노산까지 JE 서열을 포함하고 플라스미드 오리진 및 우두 바이러스 서열을 포함하는 JEV8 (TTTTTGT 뉴클레오티드 1304 내지 1310이 TCTTTGT로 변화된 JEVL Mason 등, 1991에 유사한 플라스미드)의SmaI-SacI 단편이 JEV20의 정제한SmaI-SacI 삽입체에 결합되어 JEV22-1이 생성되었다. JEV22-1을 제조하는데 이용한 특이한SmaI 위치에 해당하는 6bp가 올리고뉴클레오티드-지시되는 이중-가닥 절단 돌연변이유발(Mandecki, 1986)을 이용하여 제거되었고 H6 프로모터가 ATG 개시코돈 바로앞에 위치하는 JEV24가 생성되었다.
플라스미드 JEV7 (Mason등, 1991)을 JE 서열내에서(뉴클레오티드 2180)SphI 그리고 IBI24 내에서HindIII로 분해시켰다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드 J94및 J95 [SphI 접착성 말단, 번역종결, 우두 바이러스 초기 전사종결시그날(TTTTTAT; Yuen등, 1987) 번역종결,EagI 위치 및HindIII 접착성 말단을 포함]와의 결합에 의해 E의 마지막 1/3에 있는SacI 위치(뉴클레오티드 2124)로부터 E의 카르복시-터미날까지 연장된 JE cDNA를 포함하는 플라스미드 JEV25가 생성되었다. JEV25의SacI-EagI 단편을 JEV8 (E 뉴클레오티드 337내지 2124의 아미노-터미날 2/3 및 15 aa C, prM을 암호화하는 JE cDNA, 플라스미드 오리진 및 우두 바이러스 서열을 포함)의SacI-EagI 단편에 결합시켜서 플라스미드 JEV26을 생성하였다.
ATG 개시코돈 앞의 특이한SmaI 위치가 상기에서 기술한 대로 제거되어 H6 프로모터가 ATG 개시코돈 바로앞에 있는 JEV27이 생성되었다.
올리고뉴클레오티드 J96, J97, J98및 J99(SphI 접착성 말단을 갖는 JE 뉴클레오티드 2243내지 2380을 포함)가 키나제화되고, 어닐링되고,SmaI-SphI 분해되고 알칼리 포스파타제 처리된 pIBI25에 결합되어 플라스미드 JEV28을 생성하였다. JEV28을 JE 서열내에서 (뉴클레오티드 2301)HpaI으로 그리고 pIBI25 서열내에서HindIII로 분해하고 알칼리 포스파타제 처리하였다. JEV1의HpaI-Hind III 단편 또는 JEV7의 HpaI-Hind III 단편(Mason등, 1991)과의 결합은 JEV29(SmaI 위치 다음에는 30 aa E, NS1, NS2A를 암호화하는 JE cDNA 뉴클레오티드 2293 내지 4126을 포함) 및 JEV30(SmaI 위치 다음에는 30 aa E, NS1, NS2A, NS2B를 암호화하는 JE cDNA 뉴클레오티드 2293 내지 4512를 포함)을 생성하였다.
JEV 29의SmaI-EagI 단편을SmaI-EagI 분해된 pTP15(Mason등, 1991)에 결합시켜서 JEV31을 생성하였다.
JEV31을 생성하는데 이용된 특이한SmaI 위치에 해당하는 6bp가 상기에서 기술한대로 WP거되어, H6 프로모터가 ATG 개시코돈 바로 앞에 있는 JEV33을 생성하였다.
JEV 30의SmaI-EagI 단편을SmaI-EagI 분해된 pTP15에 결합시켜서 JEV32를 생성하였다. JEV32을 생성하는데 이용된 특이한SmaI 위치에 해당하는 6bp를 상기에서 기술한대로 제거하여 H6 프로모터가 ATG개시 코돈 바로앞에 있는 JEV34를 생성하였다. 올리고뉴클레오티드 J90 (SEQ ID NO: 114), J91(SEQ ID NO: 115), J94 (SEQ ID NO: 116), J95(SEQ ID NO: 117), J96및 J97 (SEQ ID NO: 118), J99및 J98(SEQ ID NO: 119)는 다음과 같다:
우두 바이러스 JEV 재조합체의 제조
플라스미드 JEV24, JEV27, JEV33 및 JEV34를 vP410 감염세포속에 트랜스펙션시켜서 각각 우두 재조합체 vP825, vP829, vP857 및 vP864를 생성하였다(도 18).
생체외 바이러스 감염 및 방사성표지화
HeLa 세포 단일층을 35mm 직경접시에 제조하고 방사성 표지화전에 우두 바이러스(세포당 2pfu의 m.o.i.)또는 JEV(세포당 5pfu의 m.o.i.)로 감염시켰다.
세포를35S-Met을 포함하는 배지로 펄스 표지화하고 Mason등, 1991에서 기술된 대로 정확하게 정량의 비표지화된 Met의 존재하에서 6시간동안 추적하였다.
방사성 면역침전, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 및 엔도글리코시다제 처리
방사성 표지된 세포용해물 및 배양액을 모아서 바이러스 단백질을 면역침전시키고, 엔도글리코시다제로 분해시키고, Mason(1989)에 의해 기술된대로 정확하게 SDS-포함 폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE)에서 분리시켰다.
동물보호실험
마우스 보호실험은 Mason등(1991)에 의해 기술된 대로 정확하게 수행되었다. 간단하게는, 3-주일된 마우스그룹을 우두 바이러스 재조합체 107pfu로 복막내(ip)주사에 의해 면역화시키고, 3 주일후에 혈청을 선택된 마우스로부터 수거하였다. 그 다음 마우스가 재조합 바이러스로 재-접종되고 또는 JEV의 P3 균주로 감염된 젖먹이 새끼마우스 뇌현탁액으로 복막내 주사에 의해 1.3×103LD50으로 공격되었다.
3 주일후에 추가 항원 자극된 동물이 재사혈되었고 JEV의 P3 균주 4.9×105LD50으로 공격되었다. 공격시킨다음, 3 주일동안 마우스가 매일 간격으로 관찰되었고, 실험동물의 한배에서 난 새끼를 이용한 각 공격실험에서 치사-투여량 적정이 수행되었다.
부가적으로 공격 4주일후 생존 동물 모두로부터 혈액을 모았다.
재조합 우두 바이러스에 대한 면역반응의 평가
Mason 등(1991)에 의해 기술된 대로 정확하게35S-Met-표지된 JEV-감염세포로부터 얻어진 배양액 또는 세정제-처리된 세포 용해물의 JEV 단백질을 침전시킬수 있는 능력에 대해 혈청을 검사하였다. 혈구응집억제(HAI) 및 중화(NEUT) 테스트는 NEUT테스트에 대해 윗쪽에 씌운 배지에서 카르복시 메틸셀룰로스가 사용된 것을 제외하고는 Mason 등(1991)에 의해 기술된 것처럼 수행되었다.
재조합 우두 바이러스의 구조
C로부터 NS2B까지 연장되는 JEV 코딩부위 부분을 발현하는 4 다른 우두 바이러스 재조합체(HA 유전자좌에서)가 제조되었다. 이 재조합 바이러스에서 포함된 JEV cDNA 서열은 도 18에서 보여진다. 4 개의 재조합 바이러스 모두에서 JEV cDNA의 센스가닥은 우두 바이러스 초기/후기 H6프로모터 뒷쪽에 위치되었고, 번역은 바이러스 cDNA 서열의 5' 말단에 위치한 자연적으로 존재하는 JEV Met 코돈으로부터 개시되도록 기대되었다.
재조합체 vP825는 캡시드 단백질, 구조단백질 전구체 prM, 구조 당단백질 E, 비구조 당단백질 NS1, 및 비구조 단백질 NS2A(McAda 등, 1987)를 암호화하였다. 재조합체 vP829는 prM 뿐만아니라 prM의 아미노-터미날 앞쪽의 추정되는 15 aa 시그날 서열, 및 E를 암호화하였다(McAda 등, 1987). 재조합체 vP857은 E의 30 aa 소수성 카르복시-터미날을 암호화하는 cDNA, 다음에는 NS1 및 NS2A을 포함하였다. 재조합체 vP864는 NS2B의 첨가와 vP857과 동일한 단백질을 암호화하는 cDNA를 포함했다. 재조합체 vP825및 vP829에서는 E의가능한 우두 바이러스 초기 전사 종결 시그날(TTTTTGT ; 뉴클레오티드 1304-1310)이 aa 서열을 변경시키지 않고 TCTTTGT로 변화되었다. 이 서열이 생체외 전사시험(Yuen 등, 1987)에서 전사종결을 증가시킨다고 보여지기 때문에 E의 발현수준을 증가시키려는 시도로 이러한 변화가 행해졌다.
재조합 우두 바이러스에 의해 발현될때 E및 prM이 정확하게 프로세싱된다.
펄스-체이스(pulse-chase) 실험은 E와 크기에서 동일한 단백질이 E유전자를 포함하는 모든 재조합 우두 바이러스로 감염된 세포에서 합성된다는 것을 나타냈다 (표16). JEV, vP555및 vP829로 감염된 세포의 경우에는 SDS-PAGE에서 보다 느리게이동되는 E 단백질이 또한 감염된 세포로부터 수집된 배양액에서 검출되었다 (표16). JEV-및 vP555-감염된 세포에 의해 생성되는 E의 이러한 세포외 형태는 vP829-감염된 세포에 의해 생성되는 E의 세포외 형태에 대해 확인된 것처럼, 완전한 N-결합된 글리칸을 포함하였다(Mason, 1989; Mason 등, 1991). 흥미있게도 prM 및 E 뿐만아니라 C 코딩 부위를 포함한 vP825는 세포외 유체속으로 방출되지 않는 형태로 E의 합성을 특정화하였다(표16). M(및 prM)에 대해 특이적인 MAb를 이용하여 방사성 표지된 재조합 우두 바이러스-감염된 세포로부터 마련된 면역침전은 prM이 vP555, vP825, 및 vP829로 감염된 세포에서 합성되고, M이 vP555또는 vP829로 감염된 세포의 배양액에서 검출된다는 것을 나타냈다(표16).
vP555 및 vP829로 감염된 세포로부터 수집된 세포외 액은 vP410, vP825, vP857또는 vP864로 감염된 세포의 배양액에서는 검출되지 않는 HA 활성을 포함하였다. 이 HA는 그것의 항-JEV 항체에의한 억제 및 그것의 pH 최적치에 근거하면 JEV 감염된 세포에서 생성된 HA와 유사한것 같다(Mason등, 1991). 우두 바이러스 JEV 재조합체 vP829, vP825, vP857 및 vP864로 감염된 세포의 배양약으로 수크로스 밀도 구배가 만들어졌다. 이 구배의 분석은 JEV 배양액에서 발견된 느리게-침강하는 헤마글루티닌(SHA)의 피크(peak)와 같이-이동하는 vP829 감염 샘플내의 HA 활성의 피크를 확인시켰다(데이타는 보여지지 않음). 이러한 결과는 vP829 감염세포가 vP555 감염세포로부터 수집된 배양액에서 관찰된 E와 M을 포함하는 비어있는 바이러스 엔벨로프와 유사한 세포외 입자를 제조한다는 것을 나타냈다(표16 및 Mason등, 1991).
재조합 우두 바이러스에 의해 발현될때 NS1은 정확하게 프로세싱되고 분비된다.
펄스-체이스 실험의 결과는 실제의 NS1및 NS1'과 크기에서 동일한 단백질이 vP555, vP825, vP857및 vP864로 감염된 세포에서 생성된다는 것을 나타냈다. vP555-감염된 세포에 의해 생성되는 NS1은 보다 고분자량 형태로 감염세포의 배양액으로 방출되었다. 또한 NS1은 vP857및 vP864로 감염된 세포의 배양액속으로 방출되었고, 반면에 NS1은 vP825로 감염된 세포로부터 방출되지 않았다(표16). NS2A(vP857) 또는 NS2A 및 NS2B 코딩부위를 포함하는 재조합 우두 바이러스로부터 NS1의 생성의 비교는 NS2B 코딩부위의 존재 또는 부재가 NS1 발현에 어떤 영향도가지지 않는다는 것을 보였는데, 이것은 NS1의 실제적인 프로세싱에는 단지 NS2A 유전자만이 필요하다는 것을 보여주는이전의 데이타와 일치한다 (Falgout등, 1989; Mason 등, 1991).
재조합 우두 바이러스가 JEV항원에 대한 면역반응을 유도하였다.
각 그룹에서 선택된 동물로부터 모아진 전(前)-공격혈청을 방사성 표지된 E및 NS1을 면역침전시킬수 있는 능력에 대해 검사하였다. 이 연구의 결과는 (표16) 하기와 같은 것을 나타낸다:
(1) E에 대해 유도된 면역반응의 크기는 vP829 > vP555 > vP825였다.
(2) NS1 및 NS2A를 암호화하는 모든 바이러스가 NS1에 대한 항체를 유도했다. 및
(3) 모든 면역반응은 재조합 바이러스로이차 접종시켰을때 증가되었다.
이 동물로부터 수집된 혈청에 대한 중화 및 HAI 데이타의 분석(표17)은 면역침전 분석결과를 확인시켰는데, 이것은 RIP에 의해 증명된 것처럼 E에 대한 면역반응이 이러한 다른 혈청학적 시험과 잘 관련된다는 것을 보여준다(표17).
재조합 바이러스로의 백신접종이 치사의 JEV감염으로부터 보호를 제공하였다.
모든 재조합 우두 바이러스는 마우스에 JEV의 말초 병원성 P3 균주(Huang, 1982)에 의한 치사감염으로부터 어떤 보호를 제공할수 있었다(표17).
이러한 연구는 vP555의 보호가능성을 확인시켰고(Mason등, 1991) vP825 및 vP829로 접종된 동물에서 유사한 보호를 나타냈다. NS1에 대한 강한 면역반응을 유도한 재조합 바이러스 vP857및 vP864는 보다 낮은 수준의 보호를 나타냈고, 그러나 이 재조합체로 접종된 마우스는 컨트롤 바이러스 vP410으로 접종된 마우스와 비교했을때 여전히 상당하게 보호되었다(표17).
공격후 면역반응은 JEV복제 수준을 제공한다.
이러한 재조합 바이러스로 접종된 동물에서 치사적인 공격으로부터의 보호기작을 보다 더 잘이해하기 위하여, 공격후 혈청의 항체가 JEV항원을 인식할수 있는 능력을 평가하였다. 이러한 연구를 위하여 방사성 표지된 JEV-감염된 세포의 용해물에 존재하는 항원을 이용하였고, 초면역화된 마우스에서 높은 수준의 항체를 유도하는 NS3 단백질에 대한 반응(Mason등, 1987a)을 조사하였다. 이러한 연구의 결과(표18)는 높은 수준의 보호를 유도하는 재조합 바이러스(vP829, vP555, vP825)로 백신접종된 동물의 그룹이 NS3에 대한 낮은 공격후 반응을 보이는 반면에, NS1 만을 발현하는 재조합체(vP857및 vP864)로 백신접종된 그룹의 생존동물의 혈청은 NS3에 대한 보다 더 높은 공격후 반응을 보인다는 생존 데이타와 서로 관련한다.
JEV 단백질을 발현하는 우두 재조합체에 의해 발현되는 단백질의 특정화 및 그것의 면역반응
a: 우두 바이러스 JEV 재조합체 감염세포의 방사성 표지된 세포용해물 및 배양액을 수집하고, E,M 및 NS1 단백질에 대한 mAb를 이용하여 JEV-특이적인 단백질을 면역침전시켰다.b: 명세서에 기술된 것과 같은 HA 활성을 갖는 세포외 입자의 형성.c: 표시된 우두 바이러스 JEV 재조합체의 하나(단일) 또는 둘(이중) 접종을 수용한 마우스의 혈청에 의해 방사성 표지된 JEV-감염세포로부터 JEV 단백질이 면역침전되었다.
JEV 단백질을 발현하는 재조합 우두 바이러스로 단일의 또는 이중의 접종후의 마우스의 보호 및 면역반응
a: 20 마우스 그룹을 ip 경로에 의해 표시된 우두 바이러스 JEV 재조합체의 107pfu로 접종하였다. 3 주일후에 혈청을 모았다. 이때 그룹당 10 마우스를 명세서에서 나타낸 대로(단일 접종) JEV로 공격하였다. 각 그룹의 남아있는 10 마우스는 동일한 우두 바이러스 JEV 재조합체(이중 접종)로 추가 항원자극시켰다. 3 주일후에 혈청을 모으고 마우스를 JEV로 공격하였다. 모든 마우스를 공격후 21일동안 관찰하였다.b: 보호는 전체당 공격후 21일경에 생존한 마우스 수로서 표현된다.c: 중화역가는 90% JEV 플라크 감소를 나타내는 최고 희석도의 역수로서 표현된다.d: HAI 역가는 적혈구의 혈구응집의 측정가능한 억제를 나타내는 최고 희석도의 역수로서 표현된다.
JEV 단백질을 발현하는 재조합 우두 바이러스로 단일 또는 이중의 접종후의 공격후 면역반응
+ : 공격-후 혈청내에 존재하는 NS3항체a : 생존 마우스가 없음b : 공격-후 혈청내에 존재하는 매우 낮은 수준의 NS3 항체
우두 바이러스 JEV 재조합체로 단일 또는이중의 접종후의 JEV 공격에서 생존한 마우스의 공격-후 21일경의 혈청(표17)을 JEV NS3에 대한 항체의 존재에 대해 분석하였다.
우두 바이러스(NYVAC) 도너 플라스미드속으로의 JEV유전자의 클로닝
플라스미드 pMP2VCL (K1L 숙주 범위 유전자 윗쪽의 우두 바이러스 서열내에 폴리링커 부위를 포함)을 폴리링커내에서HindIII 및XhoI으로 분해시키고 어닐링된 올리고 뉴클레오티드 SPHPRHA A 내지 D에 결합시켜서HindIII 위치, H6 프로모터-124 내지-1(Perkus 등, 1989) 및XhoI,KpnI,SmaI,SacI 및EcoRI 위치를 포함하는 SP126을 생성하였다.
플라스미드 pSD544VC(폴리링커 부위로 대체된 HA 유전자 위치를 둘러싸는 우두 바이러스 서열 및 6리딩 프레임내에 번역 종결코돈을 포함)를 폴리링커내에서XhoI으로 분해시켰고, DNA 중합효소 I의 클리나우 단편으로 채우고 알칼리 포스파타제로 처리하였다. SP126을HindIII로 분해하고, 클리나우로 처리하고, H6 프로모터가SmaI 분해에 의해 분리되었다. pSD544VC와 H6 프로모터 단편의 결합에 의해 폴리링커 부위내에(HA 전사의 방향으로) H6 프로모터를 포함한 SPHA-H6가 생성되었다.
플라스미드 JEVL14VC를 H6 프로모터에서EcoRV 그리고 JEV 서열에서 (뉴클레오티드 2124)SacI으로 분해시키고 1789bp 단편을 분리하였다. JEVL14VC (Mason 등, 1991)를 T5NT 다음의EagI 위치에서EcℓXI으로 분해시키고, DNA 중합효소I의 클리나우 단편으로 채우고, JEV 서열내에서(뉴클레오티드 2124)SacI으로 분해시켜서 2005bp 단편을 생성하였다. 1789 bpEcoRV-SacI 및 2005 bp (SacI-채워진EcℓXI) 단편을EcoRV(H6 내에서) 및SmaI 분해되고(폴리링커내에서) 알칼리 포스파타제 처리된 SPHA-H6에 결합시켜서 JEV35를 생성하였다. JEV 35를 vP866(NYVAC) 감염된 세포속으로 트랜스펙션시켜서 우두재조합체 vP908을 생성하였다(도 18).
JEV35를SacI (JE 서열내 뉴클레오티드 2124)및EcℓXI) (T5NT 다음)으로 분해시키고 5497bp 단편을 분리하고 JEV25(E의 남아있는 2/3, 번역종결 및 T5NT를 포함)의SacI(JEV 뉴클레오티드 2124) 내지EagI 단편에 결합시켜서 JEV36을 생성하였다. JEV36을 vP866(NYVAC) 감염 세포속에 트랜스펙션시켜서 우두 재조합체 vP923(도 18)을 생성하였다.
SPHPRHA A 내지 D 올리고뉴클레오티드 SPHPRHA: A+B (SEQ ID NO: 120) 및 SPHPRHA: C+D (SEQ ID NO: 121)은 다음과 같다.
YF 유전자를 포함하는 플라스미드의 제조
YF우두 재조합체 바이러스를 제조하는데 이용한 YF17D cDNA 클론(클론 10III 및 클론 28III)은 Charles Rice (Washington University School of Medicine, St. Louis, MO)로부터 얻어졌다. 모든 뉴클레오티드 동등한 것들은 Rice 등, 1985에서 주어진 서열 데이타로부터 유래한다.
카르복시-터미날 80% prM, E 및 아미노-터미날 80% NS1을 암호화하는 YF cDNA(뉴클레오티드 537-3266)를 포함하는 플라스미드 YF0는 YF cDNA의AvaI 내지NsiI 단편(뉴클레오티드 537-1659) 및 YF cDNA의NsiI 내지KpnI 단편(뉴클레오티드 1660-3266)을AvaI 및KpnI 분해된 IBI25(International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) 속에 클로닝함으로써 얻어졌다. C 및 아미노-터미날 20% prM을 암호화하는 YF cDNA (뉴클레오티드 119-536)를 포함하는 플라스미드 YF1은 YF cDNA의RsaI 내지AvaI 단편(뉴클레오티드 166-536) 및 어닐링된 올리고뉴클레오티드 SP46 및 SP47 (무력하게된HindIII 접착성 말단,XhoI 및CℓaI위치, YF 뉴클레오티드 119-165를 포함)을AvaI 및HindIII 분해된 IBI25속에 클로닝함으써 얻어졌다. E의 카르복시-터미날 60% 및 NS1의 아미노-터미날 25%를 암호화하는 YF cDNA를 포함하는 플라스미드 YF3는 YF cDNA의ApaI 내지BamHI 단편(뉴클레오티드 1604-2725)을ApaI 및BamHI 분해된 IBI25 속에 클로닝함으로써 생성되었다. 카르복시-터미날 20% NS1 NS2a, NS2B 및 아미노-터미날 20% NS3을 암호화하는 YF cDNA를 포함하는 플라스미스 YF8은 YF cDNA의KpnI 내지XbaI 단편(뉴클레오티드 3267-4940)을KpnI 및XbaI 분해된 IBI25 속에 클로닝함으로써 얻어졌다. 카르복시-터미날 60% NS2B 및 아미노-터미날 20% NS3을 암호화하는 YF cDNA를 포함하는 플라스미드 YF9는 YF cDNA의SacI 내지XbaI 단편(뉴클레오티드 4339-4940)을SacI 및XbaI 분해된 IBI25 속에 클로닝함으로써 생성되었다. C, prM의 카브복시-터미날 25% 및 E의 아미노-터미날 40%를 암호화하는 YF cDNA를 포함하는 플라스미드 YF13은 YF cDNA의BaℓI 내지ApaI 단편 (뉴클레오티드 384-1603)을ApaI 및SmaI 분해된 IBI25 속에 클로닝함으로써 얻어졌다.
올리고뉴클레오티드-지시되는 돌연변이유발(Kunkel, 1985)이 하기의 가능한 우두 바이러스 초기 전사종결 시그날(Yuen 등, 1987)을 변화시키는데 이용되었다.
(1) YF1의 C 유전자의 아미노-터미날로부터 49 aa (TTTTTCT 뉴클레오티드 263-269및 TTTTTGT 뉴클레오티드 269-275)가 (SEQ ID NO: 122) TTCTTCTTCTTGT로 변화되어 플라스미드 YF1B를 생성하고, (2) YF3의 E 유전자에서(뉴클레오티드 1886-1893 TTTTTTGT가 카르복시-터미날로부터 TTCTTTGT 189 aa로 그리고 뉴클레오티드 2429-2435 TTTTTGT가 카르복시-터미날로부터 TTCTTGT 8 aa로) 각기 플라스미드 YF3B와 YF3C를 생성하였다. YF3C의PstI 내지BamHI 단편(뉴클레오티드 1965-2725)이 YF3B의 대응하는 단편에 대해 교환되어 YF4를 생성하였는데, YF4는 둘다 돌연변이화된 전사종결 시그날을 갖는 카르복시-터미날 60% E 및 아미노-터미날 25% NS1을 암호화하는 YF cDNA (뉴클레오티드 1604-2725)를 포함한다.
YF4의ApaI 내지BamHI 단편(뉴클레오티드 1604-2725)이 YF0의 동등부위에 대해 치환되어 플라스미드 YF6를 생성하였는데,이것은 둘다 돌연변이화된 전사 종결시그날을 갖는 카르복시-터미날 80% prM, E 및 아미노-터미날 80% NS1을 암호화하는 YF cDNA (뉴클레오티드 537-3266)를 포함한다. 플라스미드 YF6를 IBI25 서열내에서EcoRV 그리고 뉴클레오티드 537에서AvaI로 분해시키고 YF1B의EcoRV 내지AvaI 단편 (IBI25 내의EcoRV 내지 뉴클레오티드 536에서AvaI)에 결합시켜서 YF2를 생성하였는데,이것은 119에서XhoI 및CℓaI 위치를 갖고 C부터 NS1의 아미노-터미날 80%를 암호화하는 YF cDNA (뉴클레오티드 119-3266)를 포함하고 4 돌연변이화된 전사종결 시그날을 포함한다.
상기에서 기술한 올리고뉴클레오티드-지시되는 돌연변이 유발이 (1)플라스미드 YF3C에서 E (뉴클레오티드 2402-2404)의 카르복시-터미날로부터 ATG 17 aa 앞에XhoI 및CℓaI위치를 삽입하여 YF5를 생성하고, (2) 플라스미드 YF13에서 prM(뉴클레오티드 917-919) 카르복시-터미날로부터 ATG 19 aa 앞에XhoI 및CℓaI 위치를 삽입하여 YF14를 생성하고, (3) 플라스미드 YF3C에서 E (뉴클레오티드 2384-2386)의 카르복시-터미날로부터 ATG 23 aa 앞에XhoI 위치를 삽입하여 플라스미드 YF25를 생성하고, (4) C의 카르복시-터미날로부터 21 aa 플라스미드 YF1에서 ATG (뉴클레오티드 419) 및XhoI 위치를 삽입하여 YF45를 생성하는데 이용되었다.
YF5의ApaI 내지BamHI 단편(뉴클레오티드 1604-2725)이 YF0의 대응하는 부위에 대해 교환되어 YF7을 생성하였는데, YF7은 2402(E의 카르복시-터미날로부터 17 aa)에XhoI 및CℓaI 위치 그리고 2429-2435(E의 카르복시-터미날로부터 8 aa)에 돌연변이화된 전사 종결 시그날을가지며 카르복시-터미날 80% prM, E 및 아미노-터미날 80% NS1(뉴클레오티드 537-3266)을 암호화하는 YF cDNA를 포함한다. YF25의ApaI 내지BamHI 단편 (뉴클레오티드 1604-2725)이 YF0의 대응하는 부위에 대해 교환되어 YF26을 생성하였는데, YF26은 뉴클레오티드 2384(E의 카르복시-터미날로부터 23 aa)에XhoI 위치 그리고 2428-2435(E의 카르복시-터미날로부터 8 aa)에 돌연변이화된 전사 종결시그날을가지며 카르복시-터미날 80% prM, E 및 아미노터미날 80% NS1 (뉴클레오티드 537-3266)을 암호화하는 YF cDNA를 포함한다.
YF14의AvaI 내지ApaI 단편(뉴클레오티드 537-1603)이 YF6에서 대응하는 부위에 대해 치환되어 YF15를 생성하였는데, YF15는 뉴클레오티드 917 (prM의 카르복시-터미날로부터 19 aa)에XhoI 및CℓaI 위치 그리고 두 돌연변이화된 전사 종결 시그날을가지며 카르복시-터미날 80% prM, E 및 아미노-터미날 80% NS1(뉴클레오티드 537-3266)을 암호화하는 YF cDNA를 포함한다. YF6을 IBI25내에서EcoRV로 그리고 뉴클레오티드 537에서 YF 내에서AvaI으로 분해시키고 YF45의EcoRV (IBI25내에서)내지AvaI단편에 결합시켜서 YF46이 생성되었는데, YF46은 419 (C의 카르복시-터미날로부터 21 aa)에XhoI 위치를가지고 그리고 두 전사 종결시그날이 제거되고 C부터 아미노-터미날 80% NS1 (뉴클레오티드 119-3266)을 암호화하는 YF cDNA를 포함한다.
상기에서 기술된 올리고뉴클레오티드-지시되는 돌연변이유발이 플라스미드 YF9에서 NS2B의 카르복시-터미날에SmaI 위치를 삽입하여 (뉴클레오티드 4569) YF11을 생성하고, 플라스미드 YF8에서 NS2A의 카르복시-터미날에SmaI 위치를 삽입하여(뉴클레오티드 4180)YF10을 생성하는데 이용되었다. YF11의SacI 내지XbaI 단편(뉴클레오티드 4339-4940)및 YF8의Asp718 내지SacI 단편 (뉴클레오티드 3262-4338)을Asp718 및XbaI 분해된 IBI25에 결합시켜서 YF12를 생성하였는데, YF12는 NS2B의 카르복시-터미날 뒤의SmaI 위치(뉴클레오티드 4569)와 함께 카르복시-터미날 20% NS1, NS2A, NS2B 및 아미노-터미날 20% NS2B (뉴클레오티드 3262-4940)을 암호화하는 YF cDNA를 포함한다.
pHES 시스템 우두 바이러스 도너 플라스미드 속으로의 YF 유전자의 클로닝
YF 클로닝 서열을 NYVAC 도너 플라스미드 속에 삽입시키기전에, YF코딩 서열을 우두 바이러스 플라스미드 pHES4속에 삽입시켰다(Perkus 등, 1989).
카르복시-터미날 20% NS1, NS2A 및 NS2B를 암호화하는 YF12의KpnI 내지SmaI 단편(뉴클레오티드 3267-4569), 19 aa prM, E 및 아미노-터미날 80% NS1을 암호화하는 YF15의XhoI 내지KpnI 단편(뉴클레오티드 917-3266)및XhoI-SmaI 분해된 pHES4가 결합되어 YF23이 생성되었다.
23 aa E, 아미노-터미날 25% NS1을 암호화하는 YF26의XhoI 내지BamHI 단편(뉴클레오티드 2384-2725)이 YF23의XhoI 내지BamHI 단편(카르복시-터미날 75% NS1, NS2A및 NS2B, 복제의 오리진 및 우두서열을 포함)에 결합되어 YF28이 생성되었다.
XhoI-SmaI 분해된 pHES4가 17 aa E 및 아미노-터미날 80% NS1을 암호화하는 YF7의 정제된XhoI 내지KpnI 단편(뉴클레오티드 2402-3266) + 카르복시-터미날 20% NS1 및 NS2A를 암호화하는 YF10의KpnI 내지SmaI 단편(뉴클레오티드 3267-4180)에 결합되어 YF18이 생성되었다. C, prM, E 및 아미노-터미날 25% NS1을 암호화하는 YF2의XhoI 내지BamHI 단편(뉴클레오티드 119-2725)은 YF18의XhoI 내지BamHI 단편(카르복시-터미날 75% NS1 및 NS2A, 복제의 오리진 및 우두 바이러스 서열을 포함)에 결합되어 YF19가 생성되었다.
YF2의 동일한XhoI 내지BamHI 단편을 YF28의XhoI 내지BamHI 단편(카르복시-터미날 75% NS1 및 NS2A,복제의 오리진 및 우두 바이러스 서열을 포함)에 결합시켜서 YF20을 생성하였다. 21 aa C, prM, E및 아미노-터미날 25% NS1을 암호화하는 YF46의XhoI 내지BamHI 단편(뉴클레오티드 419-2725)을 YF18의XhoI 내지BamHI 단편에 결합시켜서 YF47을 생성하였다. 올리고뉴클레오티드 SP46(SEQ ID NO: 123) 및 SP47(SEQ ID NO: 124)은 다음과 같다:
재조합 YF 우두 바이러스의 제조
C부터 NS2B까지 연장되는 YF 코딩부위의 일부를 발현하는 5가지 다른 우두 바이러스 재조합체가 숙주범위 선택시스템을 이용하여 제조되었다(Perkus 등, 1989).
플라스미드 YF18, YF23, YF20, YF19 및 YF47을 vP293감염된 세포속에 트랜스펙션시켜서 우두 재조합체 vP725, vP729, vP764, vP766 및 vP869를 생성하였다. 이러한 재조합체에 포함된 YF cDNA 서열은 도 19에서 보여진다. 모든 5 재조합체 바이러스에서 YF cDNA의 센스가닥은 우두 바이러스 초기/후기 H6 프로모터 뒤쪽에 위치되고, 번역은 바이러스 cDNA 서열의 5' 말단에 위치된 Met 코돈으로부터 개시되도록 기대되었다(도 19).
재조합체 vP725는 비구조 단백질 NS1의 N-터미날 앞쪽의 추정되는 17-aa 시그날 서열 및 비구조 단백질 NS1과 NS2A를 암호화하였다(Rice 등, 1985). 재조합체 vP729는 E의 N 터미날 앞쪽의 추정되는 19-aa 시그날 서열, E, NS1, NS2A 및 NS2B를 암호화하였다(Rice 등, 1985). 재조합체 vP764는 C, prM, E, NS1, NS2A 및 NS2B를 암호화했다(Rice 등, 1985). 재조합체 vP766은 C, prM, E, NS1 및 NS2A를 암호화하였다(Rice 등, 1985). 재조합체 vP869는 prM, E, NS1 및 NS2A 뿐만아니라 prM 구조 단백질 전구체의 N-터미날 앞쪽의 추정되는 21-aa 시그날 서열을 암호화하였다 (Rice 등, 1985).
치사적인 YF 공격으로부터의 보호
vP869는 다른 재조합체중 어느것으로 감염된 세포의 배양액에서 발견되지 않는 HA 활성을 분비하였다. 이 HA는 항-YF 항체에의한 그것의 억제와 pH 최적치에 근거하여 YF 감염된 세포에서 생성되는 HA와 유사한 것 같다.
3 주일된 마우스를 복강내 경로로 107pfu vP869, vP764 또는 YF-17D로 접종하고 3 주일후에 YF의 불란서 신경친화성 균주 100 LD50으로 공격하였다. vP869는 상당한 보호를 제공한 반면에 (표19) vP764는 YF 유전자가 결핍된 컨트롤 우두 바이러스(vP457) 보다 더 나은 보호를 제공하지 않았다.
YF 공격으로부터 재조합 우두 바이러스에의한 마우스의 보호
NYVAC 도너 플라스미드 속으로의 YF 유전자의 클로닝
21 아미노산 C, prM, E, NS1, NS2A (NS1에서는 뉴클레오티드 2962가 결실되어 있는)를 암호화하는 YF cDNA를 포함하는 YF 47의XhoI 내지SmaI 단편(뉴클레오티드 419-4180)이XhoI-SmaI 분해된 SPHA-H6(HA 부위 도너 플라스미드)에 결합되어 YF48이 생성되었다. YF48을SacI으로 (뉴클레오티드 2490) 및Asp718로 부분적으로(뉴클레오티드 3262)분해시켰고 6700 bp 단편을 분리하였고(플라스미드 복제의 오리진, 우두서열, 21 아미노산 C, prM, E, 아미노-터미날 3.5% NS1, 카르복시-터미날 23% NS1, NS2A를 포함), YF18의SacI-Asp718 단편(2962에 존재하는 염기를 갖는 NS1의 나머지를 포함)에 결합시켜서 YF51을 생성하였다. YF51의 특이한XhoI 위치에 해당하는 6bp가 올리고뉴클레오티드-지시되는이중-가닥 절단 돌연변이 유발 (Mandecki, 1986)을 이용하여 제거되어 HA 유전자좌 도너 플라스미드내에 YF21 아미노산 C, prM, E, NS1, NS2A를 암호화하는 플라스미드 YF50이 생성되었다. 도너 플라스미드 YF50은 vP866(NYVAC) 감염된 세포속에 트랜스펙션되어 우두재조합체 vP984를 생성하였다.
YF48에서 특이한XhoI 위치에 해당하는 6bp가 올리고뉴클레오티드-지시되는이중-가닥 절단 돌연변이 유발을 이용하여 제거되어 YF49가 생성되었다. 올리고뉴클레오티드-지시되는 돌연변이 유발(Kunkel, 1985)이 YF4에서 E의 카르복시-터미날에SmaI 위치를 삽입하는데(뉴클레오티드 2452) 이용되어 YF16이 생성되었다. YF49의ApaI-SmaI 단편(플라스미드 복제 오리진, 우두서열 및 21 아미노산 C, prM, 아미노-터미날 43% E를 암호화하는 YF cDNA를 포함)을 YF16의ApaI-SmaI 단편(카르복시-터미날 57% E를 포함하는 뉴클레오티드 1604-2452)에 결합시켜서 HA 유전자좌내에 C의 21 아미노산, prM, E를 포함하는 YF53을 생성하였다.
도너 플라스미드 YF53을 vP 913 (NYVAC-MV) 감염세포 속에 트랜스펙션시켜서 우두 재조합체 vP997을 생성하였다.
우두 바이러스 도너 플라스미드 속으로의 뎅그 유형1의 클로닝
카르복시-터미날 84% NS1 및 아미노-터미날 45% NS2A를 암호화하는 DEN cDNA를 포함하는 플라스미드 DEN1(뉴클레오티드 2559-3745, Mason 등, 1987b)은 DEN cDNA의EcoRI-XbaI 단편(뉴클레오티드 2559-3740) 및 어닐링된 올리고뉴클레오티드 DEN1(SEQ ID NO: 125)및 DEN2 (SEQ ID NO: 126) (XbaI 접착성 말단, 번역중지코돈, T5AT 우두 바이러스 초기전사종결시그날(Yuen 등, 1987),EagI위치 및HindIII 접착성 말단을 포함)을HindIII-EcoRI 분해된 pUC8 속에 클로닝함으로써 얻어졌다. DEN1의EcoRI-HindIII 단편(뉴클레오티드 2559-3745) 및 E의 카르복시-터미날 36%와 아미노-터미날 16% NS1을 암호화하는 DEN cDNA의SacI-EcoRI 단편(뉴클레오티드 1447-2559, Mason등, 1987b)을HindIII-SacI 분해된 IBI24 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT)에 결합시켜서, NS1(뉴클레오티드 2467)에 하나의 염기가 결실되고 카르복시-터미날 64% E부터 아미노-터미날 45% NS2A를 암호화하는 DEN3을 생성하였다.HindIII-XbaI 분해된 IBI24를 어닐링된 올리고뉴클레오티드 DEN9(SEQ ID NO: 127)및 DEN 10(SEQ ID NO: 128) [HindIII 접착성 말단,SmaI 위치, DEN 뉴클레오티드 377-428 (Mason등, 1987b) 및XbaI 접착성 말단을 포함]에 결합시켜서 SPD 910을 생성하였다. SPD 910을SacI (IBI24 내에서) 및AvaI (뉴클레오티드 423에서 DEN 내에서)으로 분해시키고 DEN cDNA의AvaI-SacI 단편 (뉴클레오티드 424-1447 Mason등, 1987)에 결합시켜서 카르복시-터미날 11 aa C, prM 및 아미노-터미날 36% E를 암호화하는 DEN4를 생성하였다.
카르복시-터미날 64% E및 아미노-터미날 18% NS1을 암호화하는 DEN cDNA를 포함하는 플라스미드 DEN6(Mason 등, 1987b에 존재하는 뉴클레오티드 2467과 함께 뉴클레오티드 1447-2579)은 DEN cDNA의 SacI-XhoI 단편을 IBI25(International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT)속에 클로닝함으로써 얻어졌다.
DEN 5' 비번역되는 부위의 51염기, C, prM 및 아미노-터미날 36% E를 암호화하는 DEN cDNA를 포함하는 플라스미드 DEN 15는 DEN cDNA의HindIII-SacI 단편(뉴클레오티드 20-1447, Mason 등, 1987b)을HindIII-SacI 분해된 IBI25속에 클로닝 함으로써 얻어졌다. 카르복시-터미날 55% NS2A 및 아미노-터미날 28% NS2B를 암호화하는 DEN cDNA를 포함하는 플라스미드 DEN23(뉴클레오티드 3745-4213)은 DEN cDNA의XbaI-SphI 단편을XbaI-SphI 분해된 IBI25 속에 클로닝하여 얻어졌다. 카르복시-터미날 55% NS2A, NS2B 및 아미노-터미날 24 아미노산 NS3을 암호화하는 DEN cDNA를 포함하는 플라스미드 DEN 20 (뉴클레오티드 3745-4563)은 DEN cDNA의XbaI 내지EcoRI 단편을XbaI-EcoRI 분해된 IBI25속에 클로닝함으로써 얻어졌다.
올리고뉴클레오티드-지시되는 돌연변이유발(Kunkel, 1985)을 이용하여 하기의 가능한 우두 바이러스 초기 전사 종결 시그날을 변화시켰다(Yuen 등, 1987). DEN 4에서 prM 유전자의 두 T5NT 서열이 (1) 카르복시-터미날로부터 29 aa (뉴클레오티드 822-828 TTTTTCT가 TATTTCT로) (2) 카르복시-터미날로부터 13 aa (뉴클레오티드 870-875 TTTTTAT가 TATTTAT로) 돌연변이되어 플라스미드 DEN 47이 생성되었다.
아미노-터미날로부터 17 aa DEN 6에서 NS1 유전자의 단일 T5NT 서열이 돌연변이되어(뉴클레오티드 2448-2454 TTTTTGT가 TATTTGT로) 플라스미드 DEN 7이 생성되었다.
상기에서 기술한 올리고뉴클레오티드-지시되는 돌연변이유발을 이용하여;
(1) 플라스미드 DEN 23에서 NS2A의 카르복시-터미날에(뉴클레오티드 4102)EagI 및EcoRI 위치를 삽입시켜서 DEN 24를 생성하고,
(2) DEN 7(뉴클레오티드 2348)에서 E의 카르복시-터미날로부터 ATG 15 aa 및SmaI 위치를 삽입시켜서 DEN 10을 생성하고,
(3) 플라스미드 DEN 20에서 NS2B(뉴클레오티드 4492)의 카르복시-터미날에EagI 및HindIII 위치를 삽입시켜서 플라스미드 DEN 21을 생성하고,
(4) 플라스미드 DEN 15에서 뉴클레오티드 63-67을 우두 바이러스 초기/후기 H6 프로모터 일부(위치-1 내지-21, Perkus 등, 1989)로 대체하여 DEN 16 (DEN 뉴클레오티드 20-59,EcoRV 위치부터 H6 프로모터의-1까지, DEN 뉴클레오티드 68-1447을 포함)을 생성하였다.
DEN 7의SacI-XhoI 단편(뉴클레오티드 1447-2579)이 DEN 3에서 대응하는 부위에 대해 대체되어 DEN 19가 생성되었는데, DEN 19는 뉴클레오티드 2467이 존재하고 변경된 전사 종결시그날(뉴클레오티드 2448-2454)을 가지며 카르복시-터미날 64% E 및 아미노-터미날 45% NS2A를 암호화하는 DEN cDNA(뉴클레오티드 1447-3745)를 포함한다. DEN 19의XhoI-XbaI 단편(뉴클레오티드 2579-3745) 및 DEN 24의XbaI-HindIII 단편(XbaI 뉴클레오티드 3745 DEN 부터 IBI25에서HindIII까지)을XbaI-HindIII 분해된 IBI25에 결합시켜서 DEN 25를 생성하였는데, DEN 25는 4102에EagI 위치가 있고 뉴클레오티드 2467이 존재하고 돌연변이된 전사 종결시그날(뉴클레오티드 2448-2454)이 있으며 카르복시-터미날 82% NS1, NS2A 및 아미노-터미날 28% NS2B를 암호화하는 DEN cDNA(뉴클레오티드 2579-4213)를 포함한다. DEN 19의XhoI-XbaI 단편(뉴클레오티드 2579-3745)을XhoI (IBI25 내에서) 및XbaI(DEN 뉴클레오티드 3745)분해된 DEN 21에 결합시켜서 DEN 22를 생성했는데, DEN22는 뉴클레오티드 2467이 존재하고, 변화된 전사종결시그날(뉴클레오티드 2448-2454)이 있고, 4492에 EagI 위치가 있으며, 카르복시-터미날 82% NS1, NS2A, NS2B 및 아미노-터미날 24 aa NS3 (뉴클레오티드 2579-4564)을 암호화한다.
DEN16의HindIII-PstI 단편(뉴클레오티드 20-494)을 DEN47의HindIII-PstI 단편(카르복시-터미날 83% prM 및 E의 아미노-터미날 36% 뉴클레오티드 494-1447 및 플라스미드 복제 오리진을 암호화)에 결합시켜서 DEN 17을 생성하였는데,이것은 C의 아미노-터미날 앞에EcoRV 위치 및 H6 프로모터의 일부와 함께 C, prM 및 아미노-터미날 36% E를 암호화한다. 카르복시-터미날 13 aa C, prM 및 아미노-터미날 36% E를 암호화하는 DEN 17의HindIII-BgℓII 단편(뉴클레오티드 370-1447)을 어닐링된 올리고뉴클레오티드 SP111 및 SP112(무력화된HindIII 접착성 말단,EcoRV 위치 내지 H6 프로모터의 -1까지,BgℓII 접착성 말단을 갖는 DEN 뉴클레오티드 350-369를 포함)에 결합시켜서EcoRV 위치부터 H6 프로모터의 -1까지, 카르복시-터미날 20 aa C, prM 및 아미노-터미날 36% E를 암호화하는 DEN 33을 생성하였다.SmaI-EagI 분해된 pTP15 (Mason 등, 1991)를 카르복시-터미날 11 aa C, prM 및 아미노-터미날 36% E (뉴클레오티드 377-1447)를 암호화하는 DEN 4의SmaI-SacI 단편 및 카르복시-터미날 64% E, NS1 및 아미노-터미날 45% NS2A를 암호화하는 DEN3의SacI-EagI 단편에 결합시켜서 DENL을 생성하였다. 카르복시-터미날 64% E 및 아미노-터미날 18% NS1 (뉴클레오티드 1447-2579)을 암호화하는 DEN 7의SacI-XhoI 단편을 DEN 47의BstEII-SacI 단편(카르복시-터미날 55% prM 및 아미노-터미날 36% E 뉴클레오티드 631-1447을 암호화) 및 DENL의BstEII-XhoI단편(카르복시-터미날 11 aa C, 아미노-터미날 45% prM, 카르복시-터미날 82% NS1, 카르복시-터미날 45% NS2A, 복제오리진 및 우두 서열을 포함)에 결합시켜서 DEN 8을 생성하였다. 특이한SmaI 위치(H6 프로모터와 ATG사이에 위치)는 올리고뉴클레오티드-지시되는 이중-가닥절단 돌연변이유발(Mandecki, 1986)을 이용하여 제거되어 H6 프로모터가 ATG 개시코돈 바로앞에 위치한 DEN 8 VC가 생성되었다.
DEN 17의EcoRV-SacI 단편(위치-21내지-1 H6 프로모터 DEN 뉴클레오티드 68-1447)을 DEN 8 VC의EcoRV-SacI 단편(우두서열,-21 부터-124까지 H6 프로모터, 복제오리진 및 아미노-터미날 64% E, NS1, 아미노-터미날 45% NS2A 뉴클레오티드 1447-3745를 포함)에 결합시켜서 DEN 18을 생성하였다.
DEN 25의XhoI-EagI 단편(뉴클레오티드 2579-4102)을 DEN 18의XhoI-EagI 단편(복제 오리진, 우두 서열 및 DEN C, prM, E 및 아미노-터미날 18% NS1 뉴클레오티드 68-2579를 포함)에 결합시켜서 DEN26을 생성하였다. DEN8VC의EcoRV-SacI 단편 (위치-21 내지-1 H6 프로모터 DEN 뉴클레오티드 377-1447)을 DEN26의EcoRV-SacI 단편 (복제 오리진, 우두서열 및 뉴클레오티드 2894에서 NS1에서 하나의 염기가 결실되고 카르복시-터미날 64% E, NS1 및 NS2A를 암호화하는 DEN 부위를 포함)에 결합시켜서 DEN32를 생성하였다. DEN32를 vP410 감염세포속에 트랜스펙션시켜서 재조합체 vP867을 생성하였다 (도 20).
DEN10의SacI-XhoI 단편 (뉴클레오티드 1447-2579)이 DEN3에서 대응부위에 대해 치환되어 DEN11을 생성하였는데, 이것은 E의 카르복시-터미날로부터 ATG 15 aa 및SmaI 위치와 함께 카르복시-터미날 64% E, NS1 및 아미노-터미날 45% NS2A를 암호화하는 DEN cDNA를 포함한다. DEN11의SamI-EagI 단편 (카르복시-터미날 15aa E, NS1 및 아미노-터미날 45% NS2A 뉴클레오티드 2348-3745를 암호화)을SmaI-EagI 분해된 pTP15에 결합시켜서 DEN12를 생성하였다.
DEN22의XhoI-EagI 단편 (뉴클레오티드 2579-4492)을 상기에서 기술한 DEN18의XhoI-EagI 단편에 결합시켜서 DEN27을 생성하였다. DEN12의EcoRV-PstI 단편 (위치-21내지-1 H6 프로모터 DEN 뉴클레오티드 2348-3447)을 DEN27의EcoRV-PstI 단편 (복제오리진, 우두서열, H6 프로모터-21 내지-124 및 NS2A와 NS2B를 암호화하는 DEN cDNA를 포함)에 결합시켜서 DEN31을 생성하였다.
DEN8VC의EcoRV-XhoI 단편 (카르복시-터미날 11 aa C, prM E, 아미노-터미날 18% NS1을 암호화하는 위치-21 내지-1 H6 프로모터 DEN 뉴클레오티드 377-2579)을 DEN31의EcoRV-XhoI 단편 (복제 오리진, 우두서열 및 위치 2894에서 NS1에 존재하는 염기와 함께 카르복시-터미날 82% NS1, NS2A, NS2B를 암호화하는 DEN cDNA를 포함)에 결합시켜서 DEN35를 생성하였다. DEN35를 vP410 감염세포 속에 트랜스펙션시켜서 재조합체 vP955를 생성하였다 (도 20). DEN33의EcoRV-SacI 단편 (카르복시-터미날 20 aa C, prM 및 아미노-터미널 36% E를 암호화하는 위치-21 내지 -1 H6 프로모터 DEN 뉴클레이드 350-1447) 및 DEN32의SacI-XhoI 단편 (카르복시-터미날 64% E 및 아미노-터미날 18% NS1 뉴클레오티드 1447-2579를 암호화)이 상기에서 기술된 DEN31의EcoRV-SacI 단편에 결합되어 DEN34가 생성되었다. DEN34를 vP410 감염세포에 트랜스펙션시켜서 재조합체 vP962를 생성하였다 (도 20). 올리고뉴클레오티드 DEN1 (SEQ ID NO:125), DEN2 (SEQ ID NO:126), DEN9 (SEQ ID NO:127), DEN10 (SEQ ID NO:128), SP111 (SEQ ID NO:129), 및 SP112 (SEQ ID NO:130)은 하기와 같다:
실시예 17-변형된 NYVAC 바이러스의 제조
NYVAC는 우두 바이러스의 좌측 말단가까이의 [C7L-K1L] 삭제의 크기를 다른 정도로 증가시킴으로써 그리고 우측 말단가까이의 삭제를 도입함으로써 변형되었다. 모든 삭제는 일시적 선택시스템에서 E. coli 구아닌포스포리보실 전이효소 유전자 및 미코페놀산을 이용하여 수행되었다.
일시적 우성 선택 (Transient Dominant Selection)
원형의 도너 플라스미드를 이용하여, 우두 바이러스와의 재조합은 우두 바이러스-감염된 VERO세포속으로 인산칼슘 침전된 플라스미드 DNA를 트랜스펙션시키는 표준방법에의하여 수행되었다. 24시간후에 감염된 세포를 모아서 용해물을 1μg/㎖ 미코페놀산(MPA)의 존재하에서 플레이팅하였다. 개개의 플라크를 피킹 (picking)하고 MPA 존재하에서 VERO세포에서 증식시켰다. 바이러스를 모아서 MPA 부재하에서 두번의 플라크 피킹에 의해 플라크 정제하였다. MPA 없는 매번 피킹된 플라크를 VERO세포에서 프레이팅하였고 적절한 유전자의 존재에 대해 필터 혼성화시켰다.
NYVAC.1.vP866(NYVAC)에 존재하는 [C7L-K1L] 삭제가 우측으로 다음 두 ORF K2L 및 K3L를 포함하도록 확대되었다. K2L ORF에 대한 추정되는 번역산물은 세린 프로테아제 억제 인자족과 상동성을 보인다 (Boursnell 등, 1988). 그러나 우두 바이러스 게놈의 이러한 부위의 전사매핑은 K2L ORF가 발현되지 않는 것을 제안한다 (Morgan등, 1984).
K3L에 대한 번역산물은 세린 (아미노산 51) 포스포릴화 위치에 미치는 87 아미노산 오버랩에 걸쳐 진핵생물 개시인자 2 알파 (eIF-2 알파)와 28% 상동성을 보여준다. eIF-2 알파의 포스포릴화는 인터페론에 의해 유도되는 항바이러스 상태의 한 단계인데,이것은 우두 바이러스 K3L 유전자 산물이 우두 바이러스가 인터페론 효과를 회피하는 기작에 포함될 수 있다는 것을 제안한다. 우두 바이러스의 코펜하겐 균주의 K3L 유전자가 삭제되었다 (Beattie 등, 1991). 결과적인 바이러스는 단백질 합성의 바이러스 유도의 억제 및 바이러스 복제의 억제에 의해 측정되었을때 생체외에서 인터페론에 대한 증가된 민감성을 나타냈다. 이것은 우두 바이러스로부터 K3L의 삭제는 백신접종 합병증의 경우 인터페론 처리에 의해 조절될 수 있는 보다 안전한 백신으로 될 수 있는 것을 제안한다.
C7L 부터 K3L까지 삭제를 위한 플라스미드 pMPC7K3GPT의 제조
[C7L-K3L] 삭제 측면부의 좌측 및 우측 우두 바이러스 암이 별도로 구성되었다. 좌측 암은 pSD420으로부터 유도되었고 (Perkus등, 1990) 중간생성 삭제 플라스미드 pMP256/257에서 구성되었다 (Perkus등, 1991), 합성 올리고뉴클레오티드 MPSYN379 (SEQ ID NO:131), MPSYN380 (SEQ ID NO:132).
는 주형으로서 플라스미드 pSD420을 이용하여 PCR 반응에서 프라이머로서 이용되었다. 결과적인 0.14 kb 단편을HindIII/BgℓII로 절단하였고 pMP256/257속에 삽입하여 플라스미드 좌측암을 대체하였다. 결과적인 플라스미드를 pMP379/380으로 나타냈다. 0.7 kb SaℓI/BamHI 단편을 pSD420에서 분리하고SaℓI/BamHI으로 절단한 pMP379/380속에 결합시켜서 플라스미드 pMPC7F4를 형성하였다.
K3L의 우측까지의 서열을 포함하는 우측 삭제 접합부를 구성하기 위해 합성 올리고뉴클레오티드 MPSYN381/MPSYN382 (SEQ ID NO:133/ SEQ ID NO:134)
가 어닐링되고BamHI/EcoRI으로 절단된 pUC8 속에 결합되어 플라스미드 pMP381/382가 형성되었다. 1.0 kbHpaI(부분)/EcoRV 단편을 클로닝된 우두 바이러스HindIII K에서 분리하고 pMP381/382 속에 결합시켜서 플라스미드 pMPK3R을 형성하였는데,이것은 전체의 우측 우두 바이러스 측면부 암을 포함한다. 좌측 우두 바이러스 측면부 암은 pMPC7F4로부터 0.8 kbBgℓII (부분)/HindIII 단편으로서 분리되었고,BamHI/HindIII로 절단된 pMPK3R속에 삽입시켰다. 결과적인 플라스미드 pMPC7K3은 14 유전자 [C7L-K3L]에 대해 삭제되었다.
선택가능한 표지로서 이용하기 위하여, 구아닌 포스포리보실 전이효소를 암호화하는E. coli유전자 (Ecogpt) (Pratt등, 1983)가 폭스바이러스 프로모터의 조절하에 놓였다. 엔토모폭스 42kDa 단백질을 암호화하는 유전자로부터 바로 윗쪽의 31bp 프로모터 요소는 감염후 초기에 재조합 우두 바이러스에서 강한 프로모터로서 작용할 수 있다. 어닐링된 합성 올리고뉴클레오티드 MPSYN369/370 (SEQ ID NO: 135/SEQ ID NO:136)
는 31bp EPV 42kDa 프로모터를 포함하는데 이것을 pBS-SK 백그라운드에서Ecogpt 유전자로부터 윗쪽에서 결합시켜서 플라스미드 pMP42GPT로 되었다. 42kDa 프로모터/Ecogpt 유전자 발현카세트를 포함하는SmaI 단편을 pMP42GPT에서 분리하고 pUC/우두 접합부의SmaI 위치에서 우두 삭제 플라스미드 pMPC7K3 속에 결합시켰다. 결과적인 플라스미드 pMPC7K3GPT를 vP866 (NYVAC) 속에 트랜스펙션시켰다. 일시적인 우성 선택시스템 (Falkner 등, 1990)에서 재조합의 중간산물의 선택을 위해 배양 배지에서 미코페놀산이 이용되었다. 선택암의 제거후 자손 바이러스는 K2L DNA 서열의 상실 및 K4L의 보유에 대한 플라크 혼성화에 의해 스크리닝되었다. 삭제접합부의 충실도는 pCR과 DNA 제한 및 서열분석에 의해 증명되었다. 재조합 우두 바이러스 vP954(NYVAC.1)는 [C7L-K3L] 삭제뿐만 아니라 NYVAC에 존재하는 다른 삭제 (TK, HA, ATI, I4L, [B13-B14])를 포함한다.
NYVAC.2.NYVAC에 존재하는 [C7L-K1L] 삭제는 38 ORF 전체 [C23L-F4L]를 포함하도록 양쪽방향으로 확대되었다. 이것은 우두 삭제 돌연변이체 vP796에서이전에 발표된 동일한 삭제이다 (Perkus등, 1991). 확대된 삭제부위에서 제거된 ORF는 주목할만하게 NYVAC 삭제의 좌측에 위치된 우두생장인자 (VGF; C11R)를 포함한다. VGF 두 카피를 포함하는 우두 바이러스 WR균주와는 반대로, C11R은 우두 바이러스 코펜하겐 균주에서 VGF를 암호화하는 유일한 ORF이다. WR에서 우두생장인자의 두 카피의 삭제는 토끼의 피내의 접종에 대한 피부손상의 정도를 감소시키고 마우스에서 바이러스의 신경독성을 감소시키는 것이 보여졌다 (Buller등, 1988). [C23L-F4L] 삭제의 우측 ORF 인 F4L은 리보뉴클레오티드 리덕타제의 소 서브유니트에 대한 유전자를 암호화한다 (Slabaugh등, 1988). 또한 뉴클레오티드 대사에 포함된 다른 효소 E. coli dUTP아제와 상동성을 보이는 ORF F2L이 이러한 삭제에 포함된다 (Goebel등, 1990 a,b). F2L도 또한 레트로바이러스 프로테아제와 상동성을 보인다 (Slabaugh 등, 1989).
C23L부터 F4L까지의 삭제를 위한 플라스미드 pMPTRF4GPT의 제조
우두 삭제 돌연변이체 vP796의 생성에서 중간생성물로서 이용되는 플라스미드 pMPLEND△ (Perkus등, 1991)를 pUC/우두 접합부에서 EPV 42kDa 프로모터/Ecogpt 유전자를 포함하는SmaI 발현카세트의 첨가에 의해 변형시켰다. 결과적인 플라스미드 pMPTRF4GPT를 NYVAC 속에 트랜스펙션시켰다. MPA를 이용한 선택후 자손바이러스는 F4L DNA 서열의 상실 및 FSL의 보유에 대한 플라크 혼성화에 의해 스크리닝되었다. 삭제접합부의 충실도는 PCR 및 DNA 제한분석에 증명되었다. 재조합 바이러스 vP938 NYVAC.2)은 [C23L-F4L] 삭제뿐만 아니라 NYVAC에 존재하는 다른 삭제를 포함한다.
ORF B13R-B29R의 삭제
NYVAC에 존재하는 u 삭제 [B13R-B14R]가 우측의 모든 ORF 전체 17ORF [B13R-B29R]을 포함하도록 확대되었다. 이것은 우두 삭제 돌연변이체 vP759에서이전에 발표된 동일한 삭제이다(Perkus 등, 1991). 확대된 삭제 부위는 그 산물들이 서로 20% 아미노산 동일성을 나타내는 두 유전자를 포함한다 (Smith 등, 1991). 이 유전자 산물을 암호화하는 ORF를 코펜하겐에서 B16R 및 B19R로 표시했고 (Goebel 등, 1990 a,b),이것은 WR균주에서는 각기 DRF B15R 및 B18R에 해당한다 (Smith 등, 1991). 두 유전자 산물이 전형적인 시그날 서열을 포함하는 우두 바이러스의 WR균주와는 다르게, 코펜하겐 ORF B16의 예상되는 번역산물은 아미노 터미날에서 절단되어 시그날 서열을 포함하지 않는다. B19R은 감염후 초기에 발현되는 우두 표면 단백질(S항원)을 암호화한다 (Ueda등, 1990). B16R과 B19R은 면역글로빈 수퍼패밀리 특히 IL-1 리셉터와 상동성을 보인다. 우두 바이러스 유전자 산물의 하나 또는 둘은 시토킨에 결합하여 숙주 염증성 반응을 감소시킴으로써 우두 바이러스가 면역시스템을 피하는데 도움을 줄 수 있다는 것이 제안되었다 (Smith 등, 1991).
B13R부터 B29R까지의 삭제를 위한 플라스미드 pMPTRB13GPT의 제조
우두삭제 돌연변이체 vP759 및 vP811의 생성에서 중간물로서 이용되는 플라스미드 pMPREND△ (Perkus등, 1991)은 pUC/우두 접합부에서 EPV 42kDa 프로모터/Ecogot 유전자를 포함하는SmaI 발현카세트의 첨가에 의해 변형되었다. 결과적인 플라스미드 pMPTRB13GPT를 NYVAC 속에 트랜스펙션시켰다. MPA를 이용한 선택후 자손바이러스는 B15 DNA 서열의 상실 및 B12의 보유에 대해 플라크 혼성화에 의해 스크리닝되었다. 삭제 접합부의 충실도는 PCR 및 DNA 제한분석에 의해 증명되었다. 재조합 바이러스 vP953은 [B13R-B29R] 삭제뿐만 아니라 NYVAC에 존재하는 다른 삭제를 포함한다.
좌측 [C23L-F4L] 및 우측 [B13R-B29R] 삭제의 결합
우두 바이러스의 좌측 [C23L-F4L] 및 우측 [B13R-B29R] 터미날에서의 삭제를 포함하는 우두 삭제 돌연변이체 vP811의 생성이 기술되었다 (Perkus등, 1991). vP811은 우두 숙주범위 유전자 C7L 및 선택가능 표지Ecogpt를 포함한다. NYVAC 백그라운드에서 C7L 또는Ecogpt없이 큰 터미날 삭제를 포함하는 바이러스를 생성하기 위해서, pMPTRF4GPT가 vP953과의 재조합을 위한 도너 플라스미드로서 이용되었다. 자손 바이러스는 상기에서 기술한 일시적 우성 선택시스템에서 MPA에 의해 선택되고 F4L DNA 서열의 상실 및 F5L의 보유에 대해서 플라크 혼성화에의하여 스크리닝되었다. 재조합 바이러스 vP977은 [B13R-B29R] 및 [C23L-F4L]에 대한 삭제뿐만 아니라 NYVAC에서 존재하는 다른 삭제를 포함한다. vP811 처럼 vP977은 우두터미날 반복체의 양 카피로부터 모든 유전자에 대해 삭제되었다.
실시예 18-숙주-제한된 폭스바이러스에의한 HIV 유전자 산물의 발현
본 실시예는 HIV-1 유전자 산물을 발현하는 숙주-제한된 폭스바이러스의 생성을 기술한다. 이용된 벡터는 NYVAC 및 ALVAC이다.
세포 및 바이러스
NYVAC 및 ALVAC 바이러스 벡터 및 그것의 유도체는이전에 기술된 대로 증식되었다(Piccini등, 1989; Taylor등, 1988 a,b). VERO세포 및 일차 병아리 배 피브로블라스트(CEF)는이전에 기술된 대로 증식되었다 (Taylor등, 1988 a,b). P815 마우스의 비만세포종 세포(H-2//10d//11)는 ATCC로부터 얻어졌고 (#TIB64) 10% 태아소의 혈청 CFBS 및 100Iu/㎖ 페니실린 및 100μg 스트렙토마이신/㎖으로 보충된 Eagles MEM에서 유지되었다.
마우스.암컷 BALB/cJ (H-2//10d//11) 마우스는 Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)로부터 구입하였고, 임의로 마우스 먹이와 물로 유지되었다. 6 개월과 15개월 사이의 마우스를 이용하였다.
배지.면역학적 검사를 위한 검사배지는 10% FBS, 4mM L-글루타민, 20mM HEPES (N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술포네이트) 5×10-5M 2-메르캅토에탄올, 100Iu 페니실린/ ㎖, 및 100μg/㎖ 스트렙토마이신으로 보강된 RPMI 1640 배지로 구성되었다.
스팀(stim) 배지는 10% FBS, 4mM L-글루타민, 10-4M 2-메르캅토에탄올, 100Iu 페니실린/㎖, 100μg 스트렙토마이신/㎖로 보강된 Eagle 최소 필수배지로 구성되었다.
HIV-1 (IIIB) 엔벨로프의 V3 루프 및 에프토프 88을 포함하는 ALVAC 및 NYVAC 재조합체
HIV-1(IIIB)의 V3 루프 (아미노산 299-344; Javeherian등, 1989)를 둘러싸는 150 bp 단편은 주형으로서 pHXB.2D(III)과 (Dr. R.C. Gallo, NCI-NIH, Bethesda, MD에 의해 제공됨)올리고뉴클레오티드 HIV3BLS (SEQ ID NO:137) (5'-ATGGTAGAAATT-AATTGTAC-3') 및 HIV3BL3 (SEQ ID NO:138) (5'-ATCATCGAATTCAAGCTTATTATTTTGCTCTA-CTAATGTTAC-3')을 이용한 PCR에 의해 만들어졌다. 올리고뉴클레오티드 HIV88A (SEQ ID NO:139) (5'-ATGAATGTGACAGAAAATTTTAACATGTGGAAAAATGTAGAAATTAATTGTACA-AGACCC-3') 및 HIV88B (SEQ ID NO:140) (5'-GGGTCTTGT ACAATTAATTTCTACATTTTTCCA-CATGTTAAAATTTTCTGTCACATTCAT-3')가 함께 어닐링되어 HIV-1 에피토프 88 (아미노산 95-105, Shaffermann 등, 1989)을 포함하는 이중-가닥 단편이 생성되었다. 에피토프를 포함하는 150bp V3-포함 PCR 단편 및 88에피토프 서열을 포함하는 42bp 단편이 상보적인 서열의 존재에 의하여 PCR에 의해 함께 융합되었다. 반응은 올리고뉴클레오티드 HIV88C (SEQ ID NO:141) (5'-AGTAATGTGACAGAAAATTTTAAC-3') 및 HIV3BL3 (SEQ ID NO:138)을 이용하여 수행되었다. 192bp PCR-유도된 단편은 V3 루프서열 윗쪽에서 융합된에피토프 88 서열을 포함한다. 중지코돈(TAA)이 올리고뉴클레오티드 HIV3BL3P 속에 삽입되어 오픈리딩 프레임의 번역을 종결시키고 개시코돈이 올리고뉴클레오티드 HIV88C 속에 삽입되어 에피토프 88/V3 루프 융합 단백질을 발현하는데 번역의 출발점으로 제공되었다. 부가적으로 올리고뉴클레오티드 HIV3BL3가 192bp PCR 단편의 3'-말단에EcoRI 위치가 존재하도록 합성되었다.
엔토모폭스 바이러스 42kDa(초기) 프로모터는 주형으로서 플라스미드 pAM12와 올리고뉴클레오티드 RG273 (SEQ ID NO:142) (5'-AGGCAAGCTTTCAAAAAAATATAAATGA-TTC-3') 및 RG274(SEQ ID NO:143) (5'-TTTATATTGTAATTATATATTTTC-3')를 이용한 PCR에의하여 생성되었다. 42kDa 프로모터를 포함한 108bp 단편은 5'-말단에HindIII 위치를 포함하도록 합성되었다. 42kDa 프로모터 포함 절편이 키나제 처리되고 EcoRI으로 분해된 에피토프88/V3 단편 및HindIII와EcoRI으로 분해된 pRW831에 결합시키기 전에HindIII로 분해되었다. 결과적인 플라스미드를 pC5HIVL88로서 나타냈다. 이 플라스미드가 vCP95를 생성하기 위한 레스큐 바이러스로서 CPpp와 함께 생체외 재조합검사에 이용되었다. ALVAC 재조합체 vCP95는 CPpp의 탈-ORF된 C5 유전자좌내에 에피토프 88/V3 루프를 포함한다.
플라스미드 pC5HIVL88을HindIII 및EcoRI으로 분해시켜서 상기에서 기술한 에피토프 88/V3 발현카세트를 포함하는 300bp 단편을 방출하였다. 이 단편이 LMP-아가로스 겔에서 절단되고 페놀추출(2X) 및 에테르 추출(1X)에 의해 분리되었다. 분리된 단편이 2mM dNTP 존재하에 E.coli DNA 중합효소의 클리나우 단편을 이용하여 블런트-말단화시켰다. 이 단편을SmaI으로 분해된 pSD548 유도체 pSD550에 결합시켜서(도 6) 플라스미드 pHIVL88VC를 생성하였다. 이 플라스미드가 vP878을 생성하기 위한 레스큐 바이러스로서 vP866과 함께 이용되었다. vP878은 NYVAC의 탈-ORF된 I4L 유전자좌에 에피토프 88/v3 루프 카세트를 포함한다.
HIV-1(III B) 엔벨로프 당단백질을 발현하는 ALVAC- 및 NYVAC-기초된 재조합체
우두 바이러스 H6 프로모터의 3'에 병치된 HIV-1(III B)env유전자로 구성된 발현카세트 (Guo 등, 1989; Taylor등, 1988 a,b)는 ALVAC 및 NYVAC 벡터에 의해 HIV-1으로부터 gp160의 발현을 위하여 고안되었다. 1.4kb 단편은 올리고뉴클레오티드 HIV3B1(SEQ ID
을 이용하여 pHXB.2D(III)(Dr.R.C. Gallo, NCI-NIH, Bethesda, MD에 의해 제공됨)으로부터 증폭되었다. 이 단편은env유전자의 3' 부분을 포함한다. 이 프라이머로의 PCR 증폭은 우두 바이러스 초기 전사 종결 T5NT 서열 모티프를 코딩서열 뒷쪽에 놓았고, 아미노산 서열을 변화시키지 않고 위치 6146 내지 6152에 위치된 T5NT 모티프를 제거했다 (Ratner 등, 1985). 이러한 변화 (T가 C로 됨)는 이 위치에서EcoRI(GAATTC)를 생성한다. 이 1.4kb 단편을EcoRI (5'-말단) 및XbaI(3'-말단)으로 분해시키고EcoRI 및XbaI 분해된 pBS-SK(Stratagene, La Jolla, CA) 속에 삽입하였다. 결과적인 플라스미드를 pBSHIVENV1.5로 표시했다. 이 단편의 뉴클레오티드 서열분석은이 서열이 위치 7848에서 T가 C로 트랜지션된 것을 제외하고는 완전히 정확하다는 것을 나타냈다. 이 트랜지션은 하기와 같이 정정되었다:
250bp 단편은 주형으로서 pHXB.2D(III)과 올리고뉴클레오티드 HIV3B1 (SEQ ID NO:144)(5'-
을 이용한 PCR에의하여 얻어졌다. 이 단편을BgℓII 및EcoRI으로 분해시켰다. 이 단편을BgℓII 및EcoRI으로 분해된 pBSHIV3B1.5 속에 삽입하고, 부정확한 뉴클레오티드를 갖는 부위에 대해 치환시켜서 플라스미드 pBSHIV3BBP를 생성하였다.
주형으로서 pHXB.2D(III)과 올리고뉴클레오티드 HIV3B9
와 함께env유전자의 5' 부분을 포함하는 150bp 단편을 유도하기 위해 PCR을 이용하였다. 또한 PCR을 이용하여 pC3FGAG로부터 우두 바이러스 H6 프로모터를 포함하는 128bp 단편을 올리고뉴클레오티드 VVH65P (SEQ ID NO:149)(5'-ATCATCGGTACCGAT-TCTTTATTCTATAC-3') 및 VVH63P (SEQ ID NO:150)(5'-TACGATACAAACTTAACGG-3')을 이용하여 생성하였다.
두 단편을KpnI으로 분해하고,이 단편들을KpnI으로 분해된 pBS-SK 속에 공-삽입하기 전에 150bp 단편을 키나제처리하였다. 결과적인 플라스미드를 pBSH6HIV3B5P로 표시했다.
PCR을 이용하여 올리고뉴클레오티드 HIV3B2 (SEQ ID NO:151)(5'-GAATTACAGT-AGAAGAATTCCCCTCCACAATTAAAAC-3') 및 HIV3B7(SEQ ID NO:152)(5'-CAATAGATAATG-ATACTAC-3')와 pHXB.2D(III)으로부터 600bp 단편을 생성하였다. 이 단편을EcoRI으로 분해시키고 키나제 처리하였다. 또한 PCR을 이용하여 동일한 주형으로 그러나 올리고뉴클레오티드 HIV3B6 (SEQ ID NO:153)(5'-GTATTATATCAAGTTTATATAA-TAATGCATATTC-3') 및 HIV3B8 (SEQ ID NO: 154)(5'-GTTGATGATCTGTAGTGC-3')으로 500bp단편을 유도하였다. 이 단편을KpnI으로 분해시켰다. 이 단편은 함께 뉴클레오티드 5878 내지 6368에 해당한다 (Ratner등, 1985). 이 프라이머로의 이 단편의 고안은 또한 아미노산 서열을 변화시키지 않고 뉴클레오티드 6322 내지 6328에 위치된 T5NT 서열을 제거한다. 이 두 단편을KpnI 및EcoRI으로 분해된 pBSHIV3B3P 속에 삽입하였다. 이 플라스미드를 pBSHIV3BP2768로 표시했다.
플라스미드 pBSH6HIV3B5P를KpnI으로 분해하여 HIV-1env유전자의 5' 부분 (150bp) 및 H6 프로모터를 포함하는 360bp 단편을 방출시켰다. 이KpnI 단편을KpnI으로 분해된 pBSHIV3B3P2768 속에 결합시켜서 플라스미드 pBSHIV3BEAII를 생성하였다. 2.8Kb 단편은 pBSHIV3BEAII로부터XbaI 분해와KpnI 부분 분해에 의해 얻어졌다. 이 단편은 블런트-블런트였고SmaI 분해된 pSD550 속에 삽입되었다. 플라스미드 pI4LH6HIV3B가 생성되었고 레스큐바이러스로서 vP866과의 생체외 재조합 실험에서 이용되었다. 이것은 NYVAC 게놈의 I4L 유전자좌에서 HIV-1env유전자를 포함하는 vP911을 생성하였다.
HIV-1env유전자를 ALVAC 벡터속에 삽입하기 위하여 pBSHIV3BEAII를NruI 및XbaI으로 분해하였다. 만들어진 2.7kb 단편을 2mM dNTP 존재하에서 E.coli DNA 중합효소의 클리나우 단편으로 블런트-말단화시켰다. 이 단편은 우두 H6 프로모터의 3'-대부분 21bp (NruI 위치)의 3' 쪽에 병치된 전체 HIV-1env유전자를 포함한다. pRW838을NruI 및EcoRI으로 분해시키고 그다음 클리나우로 블런트-말단화시켜서 만들어진 3.1kb 단편에이 단편을 결합시켰다.
pRW838 유도된 단편은 C5 유전자좌까지의 외부유전자를 지시하도록 카나리아폭스에서 유도된 상동성이 있는 암을 포함한다. 그것은 또한 H6 프로모터의 5'-대부분 100bp를 포함한다. 따라서 이 단편의 결합은 HIV-1env유전자를 위한 발현카세트를 포함하는 삽입 플라스미드로 되었고 pC5HIV3BE로 나타냈다. 이 플라스미드는 vCP112를 생성하기 위한 레스큐 바이러스로서 ALVAC와의 생체외 재조합 실험에서 사용되었다.
HIV-1(III B) gp120을 발현하는 NYVAC-기초 재조합체
플라스미드 pBSHIV3BEAII를EcoRI 및XbaI으로 분해시켜서 4.3kb 단편을 방출시켰다. 이 단편은 뉴클레오티드 6946까지 HIV-1env유전자에 연결된 우두 바이러스 H6 프로모터를 포함한다 (Ratner 등, 1985). 4.3kb 단편은 gp120 코딩서열의 3'부분에 해당하는 300bpEcoRI/XbaI 분해된 PCR-유도된 단편에 결합되었다. 300bp PCR 단편은 주형으로서 pHXB.2D을 가지고 올리고뉴클레오티드 HIV1-120A (SEQ ID NO:155)(5'
을 이용하여 만들어졌다. 4.3kbXbaI/EcoRI 단편 및 300bpXbaI/EcoRI 단편의 결합에 의해 플라스미드 pBSHIVB120이 생성되었다.
1.6kbKpnI/XbaI 단편은 처음에 플라스미드를XbaI으로 선상화시키고KpnI 부분 분해시켜서 pBSHIVB 120에서 유도되었다. 1.6kb 단편은 2mM dNTP 존재하에서 E.coli DNA 중합효소의 클리나우 단편으로 처리하여 블런트-말단화시켰다. 이 단편을SmaI으로 분해된 pSD54IVC 속에 삽입시켜서 pATIHIVB120을 생성하였다. 이 플라스미드가 vP921을 생성하기 위해 생체외 재조합 실험에서 이용되었다. 이 재조합체는 NYVAC의 ATI 유전자좌 내에 gp120을 암호화하는HIV-1env유전자 부분을 포함한다.
면역침전vP911, vP921 및 vCP112에 의해 발현되는 HIV-1 유전자 산물의 확실성을 결정하기 위해 면역 침전 분석을 수행하였다. VERO세포 단일층을 10PFU/ 세포의 m.o.i.로 재조합 바이러스로 감염시키고 또는 모의 감염시키고, 어버이 바이러스 vP866으로 감염시켰다. 1 시간 흡착기간 후에 접종물을 빨아드리고 세포를 2ml의 MEM (2% FBS 및 [35S]-메티오닌(20uCi/mℓ)을 포함하는 마이너스 메티오닌)으로 덮었다. 세포를 감염 18 시간후에 1mℓ의 3X 완충액 A (3% NP-40, 30mM Tris pH7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.03% Na아지드, 및 0.6mg/mℓ PMSF)의 첨가후 세포 단일층을 긁어내서 수집하였다.
감염세포에서 추출된 용해물을 HIV-1 혈청 양성 개체의 수집된 혈청 (Dr. Genoveffa Franchini NCI-NIH, Bethesda MD로부터 얻어짐)을 이용하여 HIV-1env유전자 발현에 대해 분석하였다. 혈청을 vP866-감염된 VERO세포로 미리 흡착시켰다. 미리 흡착된 인간혈청이 4℃에서 하룻밤동안 배양하여 단백질 A-세파로스에 결합되었다. 어떤 경우에는 gp120에 특이적인 모노클로날 항혈청(Dupont)이 일차 혈청으로 이용되었고 이차 항체로서 마우스(rat) 항-마우스가 이용되었다. 이러한 배양기간 다음 물질을 1X 완충액 A로 4번 세척하였다. 정상 인간 혈청 및 단백질 A-세파로스로 미리 제거된 용해물을 단백질 A-세파로스에 결합된 혈청 양성 개체의 인간 혈청과 4 ℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 하룻밤 동안의 배양기간후 샘플을 1X 완충액 A 및 2X LiCℓ2/요소 완충액으로 4번 세척하였다. 2X Laemmli 완충액 (125mM Tris (pH6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤; 10% 2-메르캅토에탄올)의 첨가 및 5분 동안의 비등에 의하여 면역 복합체로부터 침전 단백질이 분리되었다. 단백질들은 10% Dreyfuss 겔 시스템 (Dreyfuss등, 1984)에서 분류되었고, 고정되었고, 형광사진법을 위해 1M Na-살리실산염으로 처리하였다.
HIV-1 혈청양성 개체로부터 수집된 혈청을 이용한 면역 침전의 결과는 vP911 감염된 세포용해물로부터 gp160 엔벨로프 당단백질의 gp120 및 gp41 완전한 형태의 특이적인 침전을 보였다. 어버이 (NYVAC: vP866) 감염된 세포용해물에서는 그러한 특이적인 유전자 산물이 검출되지 않았다. gp120의 특이적인 침전은 또한 vP921 감염된 세포용해물에서 발견되었다.
동일한 혈청으로 면역형광 분석하면 각각 vP911 및 vP921에 의해 발현되는 gp160 및 gp120 종은 감염된 세포의 표면에 존재한다는 것을 나타냈다.
면역 침전은 또한 vCP112 감염된 CEF 세포로 수행되었다. ALVAC 어버이 바이러스로 감염된 세포 및 감염되지 않은 CEF 세포의 gp120 세포외 부분에 대해 향해진 모노클로날 항체로 어떤 HIV-특이적인 폴리펩티드도 침전되지 않았다. 그러나 vCP112 감염세포로부터는 두 HIV-특이적인 폴리펩티드 종이 침전되었다. 이 종류는 160KDa 및 120KDa의 겉보기 이동성으로 이동되는데, 이것은 각기 전구체 env 유전자 산물 및 완전한 세포외 형태에 해당한다.
접종.마우스를 꼬리 옆 정맥을 경유하여 인산-완충 식염수 0.1mℓ에서 5×107플라크 형성단위(PFU)로 정맥내 접종하였다.
비장세포 제조.경관 탈구에 의한 안락사 후 마우스 비장을 무균적으로 Hank 균형 염욕액을 포함하는 멸균된 플라스틱 주머니로 옮겼다. 단일의 실험그룹의 개별적인 비장 또는 모아진 비장이 Stomacher 혼합기에서의 1분 사이클에 의해 단일세포 현탁액으로 처리하였다. 비장세포 현탁액을 검사배지 또는 스팀배지에서 적당히 여러번 세척하였다. 비장세포는 코울터 계수기(Coulter Counter)의 사용에 의해 또는 헤마시토미터 및 현미경을 사용한 트리판 블루 염료 배제에 의해 계수되었다.
혈청.마우스를 에테르로 약하게 마취시키고 후안와 총에서 혈액을 모았다.
하나의 실험그룹을 이루는 마우스의 혈액을 수집하고 응고시켰다. 혈청을 모아서 사용할때까지 -70℃에서 저장하였다.
이차 세포독성 T 임파구(CTL)의 생성을 위한 생체외 자극
다양한 실험그룹 (반응자)으로부터 모아진 비장세포를 스팀배지에서 5×106세포/ml로 희석하였다. 공통 유전자의, 실험을 받은 적이 없는 마우스 (자극자)의 비장 세포를 1×107세포/ml로 희석하고 37℃에서 2% FBS를 포함하는 조직배양 배지에서 1 시간동안 세포당 25pfu의 m.o.i.의 적당한 우두 바이러스로 감염시켰다. 감염후 자극자 세포를 스팀배지에서 여러번 세척하고 스팀배지로 1ml당 1×106세포로 희석하였다. 5ml의 자극자 세포 및 5ml의 반응자 세포를 25cm3조직배양 플라스크에 첨가하고 5일동안 5% CO2에서 37℃로 수직으로 배양했다. 검사일에는 비장세포를 검사배지에서 여러번 세척하고 현미경을 이용하여 트리판 블루에서 헤마 시토미터상에서 계수하였다.
표적 세포제조.우두 바이러스 특이적인 CTL 활성을 위해, 조직배양세포를 37℃에서 1 시간동안 세포당 25pfu의 m.o.i. 로 2% FBS 포함조직 배양배지에서 1ml당 1×107세포로 배양함으로써 하룻밤 동안 감염시켰다. 배양후 세포를 10% FBS를 포함하는 조직배양 배지로 1ml당 1-2×106세포 사이로 희석하고 사용시까지 5% CO2에서 37℃로 더욱 배양하였다. HIV 특이적인 CTL 활성을 위해, 조직배양 세포를 각각 HIV-1 분리물 IIIB, SF2, 및 MN의 gp120의 V3 루프 부위에 해당하는 펩티드 HBX2 (American Biote-chnologies, Cambridge, MA), SF2 (American Biotechnologies, Cambridge, MA) 또는 MN (American Biotechnologies, Cambridge, MA)의 20μg/ml로 하룻밤동안 배양하였다. 검사일에는 표적을 검사 배지에서의 원심분리에의하여 여러번 세척하였다. 최종 세척후에 세포를 대략 100μCi의 Na2 51CrO4(51Cr)에 재현탁시켰다. 1 시간동안 37 ℃에서 배양하고, 세포를 원심분리에 의해 검사배지에서 적어도 3번 세척하고, 헤마시토미터 상에서 계수하고, 검사배지에서 1×105/ml로 희석하였다.
세포독성검사. 일차 CTL 검사를 위하여 새로 제조된 비장세포를 1ml당 1×107세포로 검사배지로 희석하였다. 이차 CTL 검사 (생체내 접종 또는 생체외 자극 다음)를 위하여 비장세포를 검사배지에서 2 ×106/ml로 희석하였다. 비장세포 현탁액 0.1ml을 96 웰(well) 라운드-보텀(round-bottom) 마이크로타이터 플레이트 (EXP)의 웰내에서51Cr 표지된 표적세포에 첨가하였다. 대부분의 경우 일차 CTL 활성에 대해 검사된 비장세포를 표적 세포의 첨가전에 마이크로타이터 플레이트의 웰에서 2-배 더 희석하였다.51Cr의 자연방출(SR)의 척도로서 표적세포를 단지 검사 배지에서만 배양하였다.51Cr의 최대방출(MAX)을 결정하기 위해 적당한 웰에 10% 황산도데실나트륨 0.1ml을 첨가함으로써 검사 초기에 표적세포를 고의로 용해시켰다. 검사를 개시하기 위해 마이크로 타이터 플레이트를 2분간 200×g에서 원심분리하고 5% CO2에서 37℃로 4 또는 5시간동안 배양하였다. 배양후 각 웰의 배양상층액을 스카트론 상승액 컬렉션 시스템을 이용하여 수집하였다. 방출된51Cr은 베크만 5500B 감마 카운터에 의해 결정되었다. 퍼센트 비 세포독성은 하기의 식에의한 계수로부터 결정되었다:
% 세포독성 = (EXP-SR)/(MAX-SR)×100
모노클로날 항-CD4 및 모노클로날 항-CD8을 이용한 T 헬퍼세포 및 세포독성 T 임파구의 소모
비장세포 현탁액을 Cedar Lane Low-Tox 토끼 보체의 1:16 희석물 및 항-CD4(모노클로날항체 172.4)의 1:5 희석물 또는 항-CD8 (모노클로날 항체 항-Lyt 2.2)의 1:200 희석물을 포함하는 세포독성 배지 (0.2% BSA 및 5mM HEPES를 포함하는 RPMI 1640)에서 107/ml의 밀도로 희석하였다. 단일성분 (보체, 항-CD4, 항-CD8)에 대한 적당한 컨트롤이 포함되었다.
항-HIV-1 gp160 ELISA
ELISA 플레이트 웰 (Immulon II)을 탄산완충액 pH9.6에서 100ng의 정제한 HIV-1 gp160(Dr. D. Bolognesi, Duke University, Durham NC에 의해 제공됨)으로 4℃에서 하룻밤동안 코팅하였다. 그다음 플레이트를 0.05% Tween 20을 포함하는 인산-완충 식염수(PBST)로 세척하였다. 그다음 플레이트를 1% 소의 혈청 알부민 (BSA)을 포함한 PBST로 37℃에서 2시간동안 차단시켰다. PBST로 세척한 후 0.1% BSA를 포함한 PBST (희석 완충액)로 혈청을 처음에 1:20으로 희석하였다. 혈청을 ELISA 플레이트의 웰에서 2-배 순차적으로 희석하였다. 플레이트를 2 시간동안 37℃에서 배양하고 PBST로 세척하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다제 결합된 토끼 항-마우스 면역글로불린(DAKO)을 희석 완충액에서 1:2000으로 희석하고 ELISA 플레이트의 웰에 첨가하고 1시간동안 37℃에서 배양하였다. PBST로 세척한 후 기질완충액내의 OPD (0-페닐렌디아민 디히드로클로라이드)를 첨가하고 약 20분간 주위온도에서 색깔이 나타나도록 하였다. 2.5M H2SO4의 첨가에 의하여 반응을 종결시켰다. 490nm에서의 흡광도가 Bio-Tek EL-309 ELISA 리딩기 상에서 결정되었다. 혈청 종료점 (Serum endpoint)은 1.0의 흡광도 값을 나타내는 희석도의 역수로서 정의되었다.
임파구 증식검사. 개별적인 마우스의 비장세포의 단일 세포 현탁액을 검사배지에서 2 ×106/ml로 희석하고, 정제한 HIV-1 gp160(Immuno)의 1 또는 10μg 및 HIV-1 펩티드 T1의 1,5, 또는 10μg, 또는 HIV-1 펩티드 T2의 1,5, 또는 10μg, 검사배지만을 포함하는 96 웰 플랫-버텀 마이크로타이터 플레이트의 웰에 0.1ml을 첨가하였다. 세포를 5% CO2에서 5일동안 37℃로 배양하였다. 각 웰에 배양의 최종 6시간동안 1.0μCi의 [3H]-티미딘을 첨가하였고 그다음 Cambridge PHD 세포 수집기 (cell harvester)를 이용하여 베크만 레디필터 (Beckman Ready Filter)상에서 수집하였다. 필터 디스크를 액체 신틸레이션 계수기에서 건조-계수하였다.
자극지수 = CPMSEXP/CPMS배지
결과 : HIV gp120을 발현하는 재조합 우두 바이러스가 일차 HIV-특이적인 세포독성 T 임파구 활성을 유도한다
5 ×107PFU의 우두 바이러스 재조합체 vP878, vP911,또는 vP921로, 또한 컨트롤로서 벡터 NYVAC로 iv 투여한 다음, BALB/C 마우스의 비장 CTL 활성을 펩티드 HBX2와 하룻밤동안 배양한 공통유전자의 P815 세포에 대해서 평가하였다(표 20). 크지 않지만 상당한 (P＜0.05) 일차 CTL 활성이 HIV gp120을 발현하는 vP921을 투여한 마우스의 비장에서 생성되었다. 어떤 다른 재조합 우두 바이러스나 NYVAC 어버이 벡터도 일차 HIV-특이적인 CTL 활성을 유도할 수 없었다. 이것은 우두 바이러스를 투여한 마우스의 각 그룹이 일차 우두 바이러스-특이적인 CTL 활성과 반응하기 때문에 불충분한 감염에 기인하지는 않는다. 컨트롤, 비면역화된 마우스는 어떤 표적에도 반응하지 않았다.
HIV env 펩티드를 발현하는 재조합 폭스바이러스가 HIV-특이적인 메모리 세포독성 T 임파구를 생성한다.
재조합 우두 바이러스중 하나로 단일 접종하고 적어도 1개월 경에, 마우스 비장세포를 NYVAC로 이전에 감염된 공통 유전자의 새로운 비장세포로 또는 HIV 재조합 우두 바이러스의 각각으로 생체외 자극시켰다 (표 21). 강한 HIV-특이적인 CTL 활성은 동일한 우두 바이러스 HIV 재조합체(vP878, vP911, 또는 vP921)중 하나로 감염된 세포에 의해 생체외에서 재자극된 vP878, vP911, 및 vP921로 면역화된 마우스의 비장세포 배양물에서만 검출되었다. HIV gp120 또는 gp160을 발현하는 우두 바이러스 재조합체는 단지 88에피토프에 융합된 V3 루프를 발현하는 우두 바이러스 재조합체보다 더 잘 메모리 CTL을 생성할 수 있다. HIV-특이적인 메모리 CTL 활성은 비면역화된 컨트롤 또는 NYVAC 면역화된 비장세포로부터 유도될 수 없다. 벡터 면역화된 마우스로부터 HIV-특이적인 CTL 활성의 결핍은 우두 바이러스-특이적인 메모리 CTL 활성이 사용된 우두 바이러스 중 어느 것으로 감염된 비장세포로 생체외 자극시킨 후에 명백하기 때문에 부족한 면역화에 원인이 있다고 할수는 없다.
유사한 연구에서는, 88에피토프에 융합된 V3 루프 부위를 발현하는 카나리아폭스 재조합체(vCP95)가 HIV-특이적인 메모리 CTL을 생성할 수 있는 능력이 조사되었다(표 22). 108PFU의 vCP95 또는 ALVAC 벡터 CPpp의 단일접종후 3주일경에 HIV-특이적인 메모리 CTL 반응이 재조합 우두 바이러스 유사체 vP878에 의해 유도된 것과 비교되었다. 적당한 면역화에 대한 컨트롤로서 우두 및 카나리아폭스 CTL 반응이 포함되었다. 단지 vP878 및 vCP95 면역화된 마우스의 비장세포만이 vP878에 의해 자극될 수 있는 HIV-특이적인 메모리 CTL 활성을 생성하였다. vCP95가 존재하는 메모리 CTL을 기능적인 세포용해 CTL로 자극시킬수 없음은 우두 바이러스 재조합체의 사용에 근거하여 최대화된 이용 생체외 조건과 관련될 수도 있다. 그럼에도 불구하고 vCP95는 면역화된 마우스의 비장에서 상당한 HIV-특이적인 메모리 CTL을 완전하게 생성할 수 있었다.
생체외 자극된 세포독성 세포의 특정화
HIV 펩티드-펄스 표적 세포에 대한 세포독성을 매개하는 세포는 자연 킬러세포 따위의 CTL에 관련없는 비특이적인 효과 인자 세포집단을 나타낸다고 생각된다. 이것을 시험하기 위해 vP921로 면역화되고 vP921 감염된 비장세포로 생체외 재자극된 마우스의 비장세포는 T헬퍼 임파구(CD4) 또는 세포독성 T임파구(CD8)에 특유한 표면항원을 가지는 T-임파구가 결핍되었고, V3루프 펩티드 펄스 표적 세포에 대해서 검사하였다 (표 23). 전처럼 단지 vP921 면역화된 마우스만이 vP921 감염된 동류의 비장세포로 생체외 자극될 수 있는 메모리 HIV-특이적인 CTL 활성을 생성하였다. 보체 제조물 (C') 및 모노클로날 항-CD4 및 항-CD8이 일부 독성 효과를 생성함에도 불구하고, CD8-함유 세포가 결핍된 배물양만이 (항-CD8+C') 또한 HIV-특이적인 세포독성 효과인자 세포가 결핍되었다. 그리하여 HIV-펩티드-펄스 표적세포에 대한 세포용해 활성을 매개하는 세포는 MHC 클래스 I 제한된 CTL의 특징인 세포막상의 CD8 항원을 가졌다.
HIV gp120의 V3 루프 부위의 CTL 항원 리셉터 인식의 특이성
T 임파구 항원 리셉터는에피토프 단편의 일차 아미노산 서열의 작은 변형에 정교하게 민감하다. HIV gp120의 V3 루프 부위는 초-가변성적(hypervariable)이고 HIV 분리물 사이에서 면역학적으로 다르다. 초-가변성은 단지 몇 아미노산의 치환과 첨가에 속한다. HIV 우두 바이러스 재조합체에 의해 생성되는 세포독성 세포의 특이성을 조사하기 위하여 CTL 활성에 대한 감수성이 HIV 분리물 IIIB, SF2, 및 MN의 V3 루프 부위에 해당하는 펩티드로 펄스된 p815 표적세포 사이에서 비교되었다. 단지 vP911 및 vP921로의 면역화가 HIV 특이적인 일차 CTL 활성을 유도하였다 (표24). 더욱 HIV 특이적인 CTL 활성은 HIV 분리물 IIIB의 V3 루프에 해당하는 펩티드로 펄스된 P815 표적 세포에만 제한되었다. 우두 바이러스 재조합체 vP878, vP911 및 vP921로의 면역화에 의해 유도되는 생체외 자극된 HIV-특이적인 이차 CTL 활성으로 유사한 결과가 얻어졌다 (표 25). 그리하여 HIV 분리물 IIIB의env유전자의 다양한 부분을 발현하는 재조합 우두 바이러스에 의해 생기는 HIV 특이적인 CTL은 단지 동일한 항원 분리물로부터 유래된 표적에피토프를 인식한다.
우두 바이러스 HIV 재조합체로 면역화시킨 후 HIV 에피토프에 대한 임파구 증식반응
항원에 대한 임파구 증식은 세포-매개 면역의 생체외 상관물이다. 적당한 항원의 제공은 항원에 대한 리셉터를 발현하는 면역 세포집단에서 세포성 증식을 유도한다. 증식의 개시 및 계속은가용성 매개인자를 경유한 T 헬퍼 임파구의 관여를 요구한다. HIV 항원을 발현하는 재조합 우두 바이러스로 면역화된 마우스에서 HIV 항원에 대한 세포-매개 면역을 평가하기 위하여, 27일이전에 면역화된 마우스의 비장세포를 정제한 HIV gp160과 뿐만아니라 T1및 T2로 표시된 T 헬퍼 임파구 에피토프에 관련된 펩티드와 5일동안 배양하였다 (표 26). T 헬퍼 세포에피토프 T1및 T2에 대한 어떤 증식적 반응도 비장세포 배양물 어느 것에서도 관찰되지 않았다. 그러나 이전에 vP921 면역화된 마우스의 비장세포는 [3H]-티미딘의 삽입에 의해 결정되었을때 HIV gp160에 강하게 반응하였다. 2.0 보다 더 큰 자극지수(SI)는 면역을 표시한다고 간주된다. 그리하여 vP921로 마우스를 접종하면 HIV gp160에 대한 세포-매개 면역을 일으켰다.
우두 바이러스 HIV 재조합체로 접종된 마우스의 항체반응
HIV에 대한 체액성 반응을 평가하기 위하여, 마우스를 우두 바이러스 HIV 재조합체 중 하나로 0일에 면역화시키고 5주일경에 이차 면역화시켰다. 초기 면역화후 9주일까지 다양한가격으로 마우스를 방혈하였다. 각 처리 그룹으로부터 모아진 혈청을 정제한 gp160을 항원으로 이용한 ELISA에 의하여 HIV에 대한 항체에 대해 검사하였다(표 27). 일차 항체 반응은 일반적으로 컸지만 vP911에 의해 유도되는 최고 수준으로 검출가능하였다. 이차 면역화 후 vP911 및 vP921로 면역화된 마우스의 항체역가는 증가했고 9주일경까지 다소 감소하기 전에 각기 4,600 및 3,200이상의 역가로 7주일경에 피크를 나타냈다. 그리하여 두 우두 바이러스 HIV 재조합체 vP911 및 vP921은 상당한 항체반응을 유도할 수 있었다.
HIV-1 gp120의 V3 루프부위에 해당하는 펩티드로 펄스된 표적 및 우두 바이러스 감염된 표적에 대한 우두 바이러스 재조합체로 면역화된 마우스 비장 세포의 일차 CTL 활성.
우두 바이러스 재조합체로 생체외 자극후 비장세포의 이차 CTL 활성.
표시된 우두 바이러스 재조합체로 대략 1개월 전에 면역화된 마우스의 BALB/cJ 비장세포를 5일동안 감염된 동류의 비장세포와 배양하고 20:1의 효과인자 대 표적세포 비율로 세포독성을 검사했다.
*P＜0.05는 컨트롤에 비교됨, 스튜던트 t-테스트.
HIV gp120의 V3 루프를 발현하는 재조합 우두 또는 카나리아 폭스 바이러스의 단일 접종물을 투여한 마우스의 비장세포의 기왕증(anamnestic)CTL 반응
면역화 후 23일경, 비장세포를 바이러스 감염된 또는 펩티드-펄스 동류 비장세포로 5일간 생체외 자극시키고, 그다음 20:1의 효과 인자 대 표적세포 비율로 바이러스 감염된 또는 펩티드-펄스 P815 표적세포에 대한 특이적인 세포독성을 검사하였다.
*P,0.05는 적당한 컨트롤에 비교됨, 스튜던트 t-테스트
CD8 + 보체에 대한 모노클로날 항체로의 세포독성 활성의 소모
HIV 재조합 우두 바이러스로 단일 접종후 HIV-1 분리물 IIIB의 V3 루프에 대한 일차 CTL 활성의 특이성.
마우스를 표시한 우두 바이러스 재조합체로 단일 iv 접종물을 투여하고, HIV-1 분리물 IIIB, SF2, 및 MN의 V3 루프 부위에 해당하는 3 펩티드 중 하나로 펄스된 P815 표적 및 P815 표적에 대한 7일후의 CTL 활성에 대해 검사하였다. 100:1, 50:1, 및 25:1의 효과인자 대 표적세포 비율로 검사했음에도 불구하고 단지 100:1 데이타 만이 보여진다.
* P＜0.05 적당한 컨트롤, 스튜던트 t-테스트
HIV 재조합 우두 바이러스로 단일 접종후 HIV-1 분리물 IIIB의 V3 루프에 대한 이차 CTL 활성의 특이성.
HIV 재조합 우두 바이러스로 단일 면역화시킨후 27일경의 HIV gp160 에피토프에 대한 임파구 증식반응
SI-자극지수
*P＜0.05 비자극된 컨트롤 배양물에 비교됨
스튜던트 t-테스트
HIV 재조합 우두 바이러스로 면역화된 마우스의 HIV gp160 ELISA 역가
실시예 19-ALVAC, TROVAC 및 NYVAC 벡터에서 HIV-1 (ARV-2 또는 SF-2 균주) env 유전자의 발현
플라스미드 제조. 전체의 HIV-1 (ARV-2 또는 SF-2 균주) 게놈을 포함하는 람다 클론은 J. Levy에 의해 제공되었고 이전에 기술되었다(Sanchez-Pescador 등, 1985).env서열이 pUC13속에 서브클로닝되어 플라스미드 pMP7MX373을 생성하였는데, 이것은env유전자 산물의 개시코돈(ATG)에 상대적으로 -1에서env유전자의 중지코돈(TAA)의 아랫쪽 715bp까지의 서열을 포함한다. 이env서열은 pMP7MX373으로부터EcoRI 및Hind III 분해시키고 플라스미드 벡터 pIBI25 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) 속에 삽입시켜서 플라스미드 pIBI25env를 생성하였다.
재조합 플라스미드 pIBI25env가 적절한 E.coli CJ 236(dut-ung-)세포를 형질전환하는데 이용되었다. 형질전환된 E.coli CJ 236 세포의 헬퍼파지 MG408로의 감염에 의해 유도된 파지로부터 단일-가닥 DNA를 분리하였다. 이 단일-가닥 주형이 올리고뉴클레오티드 MUENVT12 (SEQ IN NO:157)(5'-AGAGGGGAATTCTTCTACTGCAA-TACA-3')로 생체외 돌연변이 유발반응 (Kunkel 등, 1985) 시키는데 이용되었다. 이 올리고뉴클레오티드로의 돌연변이유발은 T의 C로의 트랜지션을 생성하고 ARV-2 게놈의 뉴클레오티드 위치 6929-6935에서 T5CT 모티프를 파괴한다(Sanchez-Pescador등, 1985).이 돌연변이는env유전자의 아미노산 서열을 변화시키지는 않고EcoRI 위치를 생성하며,이것은 돌연변이화된 플라스미드 클론을 스크리닝하는데 이용되었다. 서열 확인은 디데옥시뉴클레오티드 사슬종결방법 (Sanger등, 1977)에 의해 행해졌다. 결과적인 돌연변이화된 플라스미드는 pIBI25 mutenv11로서 나타냈다.
1.45kbBgℓII 단편은 pIBI25mutenv11에서 유도되었다. 이 단편은 돌연변이된env서열을 포함한다. 그것은 pIBIenv에서 대응되는 돌연변이되지 않은 단편을 치환하는데 이용되었다.
결과적인 플라스미드를 pIBI25mutenv8로서 표시했다. pIBImutenv8에 추가로 변형이 행해졌다. 생체외 돌연변이 유발을 수행하여 rex 단백질을 코딩하는 서열 및 그 유전자의 3'-말단에서 LTR 서열 (LTR 부위)을 제거하고 추정되는 면역-억제(IS)부위 아미노산 583 내지 599(SEQ ID NO:158) Leu-Gln-Ala-Arg-Val-Leu-Ala-Val-Glu-Arg-Tyr-Leu-Arg-Asp-Gln- Gln-Leu)(Klass등, 1988)을 삭제하였다. 이 반응은 올리고뉴클레오티드 LTR2(SEQ ID NO:159) (5'-TTGGAAAGGCTTTTGGCATG-CCACGCGTC-3') 및 MUENSVISR (SEQ ID NO:160)(5'-ACA GTCTGGGGCATCAAGCAGCTAGGGA-TTTGGGGTTGCTCT-3')와 pIBImutenv8로부터 유래된 단일-가닥 주형으로 행해졌다. 돌연변이된 클론은 혼성화 및 제한분석에 의하여 확인되었다. IS 및 LTR 부위가 삭제되도록 돌연변이된 클론과 LTR이 삭제된 다른 클론은 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 확인되었고, 각기 pIBI25mut3env40 및 pIBI25mutenv22로 나타냈다.
전체의env유전자를 포함하는 3.4kbSmaI/HindIII 단편은 pIBI25mut3env40 및 pIBImut2env22로부터 유도되었고SmaI/HindIII로 분해된 pCPCV1 속에 삽입하였다. 플라스미드 pCPCV1은 CP 재조합체의 생성을 가능하게 하는 삽입 플라스미드이다. 외부 유전자가 C3 삽입 유전자좌에 향하여 졌다. 플라스미드 pCPCV1 및 pFPCV2는 1989년 4월 20일 발표된 PCT 국제공개 WO 89/03429에서 이전에 기술되었고 여기서 참고문헌으로 통합되어 있다.
올리고뉴클레오티드 PROVECNS (SEQ ID NO:161)(5'-CCGTTAAGTTTGTATCGT-AATGAAAGTGAAGGGGACCAGG-3')은 VVH6 프로모터 및env서열과 정확한 ATG:ATG 구성을 만들도록 Mandecki (1986) 방법을 경유한 생체외 돌연변이 유발 반응을 위해 이용되었다. 가능한 돌연변이체가SmaI 위치의 상실에 대해서 스크리닝되었다.SmaI 위치가 없는 플라스미드 클론이 밝혀졌고 뉴클레오티드 서열분석에 의해 확인되었다. 적당히 돌연변이된 플라스미드 클론을 확인하였고 pCPenvIS+ 또는 pCVenvIS-및 pFPenvIS+ 또는 pFPenvIS-로서 나타냈다.
HIV-1env유전자는NruI 및HindIII로 분해시켜서 pCPenvIS-로부터 절단되었다. 각기 2.5kb (envIS+) 및 2.4kb (envIS-)의 두env단편을 분리하고 2mMdNTP 존재하에서 E.coli DNA 중합효소의 클리나우 단편과의 반응에 의해 블런트-말단화시켰다. 이 단편은 pSIVenvVV의NruI 및PstI 분해후 2mM dNTP 존재하에서 E.coli DNA 중합효소의 클리나우 단편으로 블런트-말단화시켜서 유도된 3.5kb 단편과 결합되었다. 플라스미드 pSIVenvVV는 ATI 삽입 유전자좌 내의 우두 바이러스 H6 프로모터에 의해 조절되는 SIVenv유전자 발현카세트를 포함한다. pSIVenvVV의NruI 및PstI 분해는 전체의 SIVenv코딩서열 및 프로모터 요소의 3'-대부분 20bp를 절단한다.envIS-및envIS+ 단편과의 결합은 H6 프로모터의 20bp를 회복하고 ATI 삽입 플라스미드 속에 HIV-1env유전자를 삽입한다. 결과적인 플라스미드를 각기envIS+ 및envIS-에 대해서 pAR5VV+ 및 pAR6VV-로서 표시했다.
생체외 재조합 및 재조합체의 정제
재조합은 이전에 기술된 대로 (Piccini 등, 1987) CP(ALVAC) 그리고 FP(TROVAC) 재조합체에 대해서 인산칼슘 침전에 의해 플라스미드 DNA를 감염세포속에 도입하여 수행되었다. 각기 재조합체 vCP61 및 vCP60을 만드는데 플라스미드 pCPenvIS+ 및 pCPenvIS-(CS 유전자좌, 도 16)을 이용하였다. 각기 재조합체 vFP63 및 vFP62를 만드는데 플라스미드 pFPenvIS+ 및 pFPenvIS-(F7유전자좌, 도 22)을 이용하였다. 플라스미드 pAR5VV+ 및 pAR6VV는 레스큐로서 vP866(NYVAC)과의 생체외 재조합 실험에서 이용되어 각각 vP939 및 vP940이 생성되었다. 재조합체 플라크는32p-표지된env특이적인 프로브와의 혼성화후 방사선 사진법에 의해 선택되고 이전에 기술된 대로 (Piccini 등, 1987) 순수도를 확인하기 위해 세번 순차적으로 계대접종되었다.
방사성면역 침전분석
세포 단일층을 변형된 Eagle 메티오닌-결핍배지 (MEM met-)에서 10pfu/세포로 감염시켰다. 감염 2시간 후 2% 투석된 태아소의 혈청(Flow)을 포함한 MEM(-met)에 20uCi/mℓ의 [35S]-메티오닌을 첨가하였다. 세포를 에펜돌프튜브(eppendorf tube) 속에 넣어진 용해 완충액 (150mM NaCl, 1mM EDTA pH8, 10mM Tris-Hcl pH7.4, 0.2mg/ml PMSF, 1% NP40, 0.01% Na 아지드) 및 50μl 아프로티닌에 재현탁시켜서 감염 15 시간 후 세포를 수거하고, 용해물을 4℃에서 20분간 급속 회전시켜서 정화시키고, 60mm 직경 페트리 접시의 상층액 1/3을 실온에서 2시간동안 1μl 정상 인간혈청 및 100μl 단백질 A-세파로스 CL-4B(SPA) (Pharmacia)와 배양하였다. 1분간의 급속 회전후 상층액을 4℃에서 1시간 30분동안 100μl SPA 및 HIV 혈청양성 개체의 미리 흡착된 인간혈청(열-불활성화된) 2μl와 배양하였다.
펠렛을 용해완충액으로 4번 그리고 염화리튬/요소 완충액(0.2M LiCl, 2M 요소, 10mM Tris-HCl pH8)으로 2번 세척하고 침전된 단백질을 60μl Laemmli 완충액 (Laemmli, 1970)에 녹였다. 100℃에서 5분간가열하고 1분간 급속회전시켜 세파로스를 제거한 후, 상층액의 단백질을 SDS 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하고 형광사진법으로 분석하였다.
HIV-1 env 유전자의 발현
ARV-2 또는 SF-2 균주의 HIVenv유전자가 우두 초기-후기 프로모터 H6에서 아랫쪽에 삽입된 6개의 다른 재조합 바이러스가 제조되었다. 간소함을 위하여 두 ALVAC-기초 재조합 바이러스 vCP61 및 vCP60은 CPIS+ 및 CPIS-로서, 두 TROVAC-기초 재조합체 vFP63 및 vFP62는 FPIS+ 및 FPIS-로서, 두 NYVAC-기초 재조합체 vP939 및 vP940은 VV - 및 VV+로서 나타냈다.
HIV-1env유전자의 ATG 개시코돈이 우두 H6 프로모터의 ATG에 포개진다는 점에서 모든 구조체는 정확하였다. 더욱 종결 코돈의 3'쪽 모든 외래의 유전정보가 제거되었다. CPIS-, FPIS-, 및 VV-는 모두 gp41 유전자 산물의 5' 부위가까이 위치한 아미노산 583-599에 해당하는 51pb 부위의 삭제에 의해 얻어졌다. 이 부위는 다른 레트로바이러스 당단백질의 트랜스막 폴리펩티드에 존재하는 (Cianciolo 등, 1985; Ruegg 등, 1989 a,b) 추정되는 면역억제 부위와 상동성을 공유한다 (Klasse 등, 1988, Ruegg 등, 1989 b). 6 재조합체 바이러스의 발현분석은 CEF, VERO, 및 MRC-5 세포 단일층에서 수행되었다. HIV 혈청양성 개체에서 수거된 혈청을 이용한 면역-침전 실험은 재료 및 방법에서 기술된 대로 수행하였다. 6 재조합체 모두 HIV-1 gp161 엔벨로프 전구체의 생성을 지시했다.
그러나 gp160 내지 gp120 및 gp41의 프로세싱 효율은 세포유형마다 달랐고 또한 면역억제 부위의 삭제에 의해 영향을 받았다. 또한 HIV 혈청 양성 개체에서 모아진 혈청에의한 gp41의 인식은 바이러스 백그라운드 및 세포 유형에 따라 다르게 나타났다.
실시예 20-NYVAC에서 HIV-2 (ISSY 균주) env 유전자의 발현
gp160의 발현
올리고뉴클레오티드 HIV25PA (SEQ ID NO. 162) (5'-ATGAGTGGTAAAATTCAGCTG-CTTGTTGCCTTTCTGCTAACTAGTGCTTGCTTA-3') 및 HIV25PB (SEQ ID NO:163)(5'-TAAGCA-AGCACTAGTTAGCAGAAAGGCAACAAGCAGCTGAATTTTACCACTCAT-3')을 어닐링시켜서 HIV-2 SBL/ISY 분리물 (Franchini 등, 1989)env코딩서열의 처음 54bp를 구성하였다. 이 단편을 주형으로서 pTP15 (Guo 등, 1989)를 이용하여 올리고뉴클레오티드 H65PH (SEQ ID NO:164)(5'-ATCATCAAGCTTGATTCTTTATTCTATAC-3') 및 H63PHIV2 (SEQ ID NO:165)(5'-CAGCTGAATTTTACCACTCATTACGATACAAACTTAACG-3')로 PCR에 의해 유도된 129bp 단편의 3'에 융합시켰다. 이 두 단편의 융합은 올리고뉴클레오티드 HIV25PC (SEQ ID NO:166)(5'-TAAGCAAGCACTAGTTAG-3') 및 H65PH (SEQ ID NO:164)를 이용하여 PCR에 의해 행해졌다. 174bp PCR 유도된 단편을HindIII 및SacI으로 분해하고HindIII 및SacI으로 분해된 PBS-SK (Stratagene, La Jolla, CA)속에 삽입시켰다. 결과적인 플라스미드를 pBSH6HIV2로 나타냈다. 삽입체는 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 확인되었다.
HIV-2env유전자의 3' 부분도 또한 PCR에 의해 얻어졌다. 이 반응에서는 주형으로 pISSY-KPN (Dr. Genoveffa Franchini, NCI-NIH, Bethesda, MD에 의해 제공됨)을 이용하여 올리고뉴클레오티드 HIV2B1 (SEQ ID NO:167)(5'-CCGCCTCTTGACC-AGAC-3') 및 HIV2B2 (SEQ ID NO:168)(5'-ATCATCTCTAGAATAAAAATTACAGGAGGGCAA-TTTCTG-3')로 270bp 단편이 증폭되었다. 이 단편을BamHI 및XbaI으로 분해하였다. 이 분해로부터 생긴 150bp 단편은 5'BamHI 및 3'XbaI 접착성 말단을 포함하였다. 이 단편은 우두 바이러스 초기전사 종결 시그날로서 인식된다고 알려진 T5NT 서열 모티프 (Yuen 등, 1987), 다음에는 중지코돈 (TAA)를 포함하도록 고안되었다.
대부분의 HIV-2env유전자는 pISSY-KPN으로부터SacI 및BamHI으로 분해시켜서 얻어졌다. 이 분해에 의해 생성된 2.7kb 단편이 그 유전자의 3' 말단에 해당하는 150bpBamHI/XbaI 단편과SacI 및XbaI으로 분해된 pBS-SK 속에 공삽입되었다. 결과적인 플라스미드를 pBSHIV2ENV로 나타냈다.
pBSH6HIV2의 174bpSpeI/HindIII 단편 및 pBSHIV2ENV의 2.5kbSpeI/XbaI 단편을HindIII 및XbaI으로 분해된 pBS-SK 속에 삽입하여 pBSH6HIV2ENV를 생성하였다.
pBSH6HIV2ENV의 2.7kbHindIII/XbaI 삽입체를 분리하고 2mM dNTP의 존재하에 E.coli DNA 중합효소의 클리나우 단편으로 블런트-말단화시켰다. 블런트-말단 단편을SmaI 분해된 pSD5HIVC 삽입벡터 속에 삽입시켰다. 결과적인 플라스미드를 pATIHIV2ENV로서 나타냈다. 이 플라스미드가 레스큐 바이러스로서 vP866(NYVAC)과의 생체외 재조합실험에 이용되어 vP920이 생성되었다.
vP920이 실제 HIV-2 gp160을 발현하는지를 결정하기 위해 면역 침전 분석을 수행하였다. VERO세포 단일층을 모의 감염시키고, 어버이 바이러스 vP866으로 감염시키고, 또는 10PFU/ 세포의 m.o.i로 vP920으로 감염시켰다. 한시간 흡착시킨 후 접종물을 빨아내고 세포를 2% 소 태아 혈청 및 [35S]-메티오닌 (20μCi/ml)을 포함하는 변형된 Eagle 배지 (-메티오닌) 2ml로 덮었다. 세포를 감염 18시간 후에 1ml 3×완충액 A (3% NP-40, 30mM Tris pH7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.03% Na 아지드 및 0.6mg/ml PMSF)의 첨가와 세포 단일층의 긁어냄에 의해 수거하였다.
감염된 세포의 용해물을 HIV-2 혈청 양성 개체로부터 모은 혈청 (Dr. Genoveffa Franchini로부터 얻음)을 이용하여 HIV-2env유전자 발현에 대해 분석하였다. 혈청을 vP866 감염된 VERO세포로 미리 흡착시켰다. 미리 흡착된 인간 혈청이 4℃에서의 하룻밤동안의 배양에서 단백질 A-세파로스에 결합되었다. 이 배양기간 후 물질을 1X 완충액 A로 4X 세척하였다. 그 다음 정상인간 혈청 및 단백질 A-세파로스로 미리 제거된 용해물을 단백질 A-세파로스에 결합된 혈청 양성 개체로부터의 인간 혈청과 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 하룻밤 동안의 배양기간 후 샘플을 1X 완충액 A로 4X 및 LiCl2/요소완충액으로 2X 세척하였다. 침전된 단백질이 면역복합체로부터 2X Laemmlis 완충액 (125mM Tris (pH6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-메르캅토에탄올)의 첨가와 5분간의 비등에 의하여 분해되었다. 단백질은 10% Dreyfuss 겔 시스템 (Dreyfuss등, 1984)에서 분리되고, 고정되고, 형광사진법을 위해 1M Na-살리실산염으로 처리되었다.
HIV-2 혈청 양성 개체의 인간혈청은 특이적으로 vP920 감염세포의 HIV-2 gp160 엔벨로프 당단백질을 침전시켰다. 더욱 발현된 HIV-2 env 유전자 산물의 확실성이 확인되었는데, gp160 폴리단백질이 완전히 gp120 및 gp41 단백질종으로 프로세싱되기 때문이다. 모의-감염된 세포 또는 NYVAC 어버이 바이러스로 감염된 세포로부터 어떤 HIV-특이적인 단백질종도 침전되지 않았다. 또한 유전자 산물이 vP920 감염된 세포의 표면에서 발현된다는 관찰은 vP920에의한 HIV-2 env의 적당한 발현을 지지한다.
gp120의 발현
HIV-2env유전자의 5'-말단에 융합된 우두 바이러스 H6 프로모터를 포함하는 플라스미드 pBSH6HIV2를SpeI 및HindIII로 분해하여이 서열을 포함하는 180bp 단편을 방출하였다. 이 단편을 pBSHIV2120A의 1.4kbSpeI/XbaI 단편과 함께HindIII/XbaI으로 분해된 pBS-SK 속에 결합시켜서 pSHIV2120B를 생성하였다.
플라스미드 pBSHIV2120A는 PCR에 의해 gp120 코딩서열의 3' 부분을 초기에 유도함으로써 얻어졌다. 주형으로서 pISSY-KPN으로 올리고뉴클레오티드 HIV2120A (SEQ ID NO:169) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAATTATCTCTTATGTCTCCCTGG-3') 및 HIV2120B (SEQ ID NO:170) (5'-AATTAACTTTACAGCACC-3')을 이용하여 PCR을 수행하였다.
PCR-유도된 단편을EcoRI 및XbaI으로 분해하고, 5'-EcoRI 접착성 말단 및 3'-XbaI 접착성 말단을 포함한 300bp 단편을 생성하였다. 단편은XbaI 위치의 5'에 T5NT 서열 모티프 및 번역 종결 서열 (TAA)을 갖도록 고안되었다. 300bpXbaI/EcoRI PCR 단편을 pISSY-KPN에서 얻어진 1.4kbSacI/EcoRI 단편과 함께SacI/XbaI으로 분해된 pBS-SK 속에 결합시켜서 pBSHIV2120A를 생성하였다.
플라스미드 pBSHIV2120B를HindIII 및XbaI으로 분해하여 우두 바이러스 H6 프로모터에 3' 병치된 HIV-2 gp120 코딩서열을 포함하는 1.8kb 단편을 생성하였다. 이 단편을 2mM dNTP의 존재하에 E.coli DNA 중합효소의 클리나우 단편으로 블런트-말단화시켰다. 블런트-말단 단편을SmaI 분해된 pSDSHIVC에 결합시켜서 pATI HIV 2120을 생성하였다. 이 플라스미드를 생체외 재조합 실험에 이용하여 vP922를 생성했다.
vP922 감염세포의 면역 침전실험은 전체의 HIV-2 env 유전자의 발현에 대해서 상기에서 기술한 대로 수행되었다. 모의 감염된 또는 vP866 감염된 VERO세포로부터 어떤 HIV-특이적인 종이 침전되지 않았다. 그러나 vP922로 감염된 세포에서 유도된 용해물로부터 120KDa의 단백질종이 침진되었다. vP920에 의해 발현된 HIV-2 gp120은 vP920 감염된 VERO세포의 세포표면에 존재한다는 것이 발견되었다.
실시예 21-NYVAC에서 SIV 유전자의 발현
NYVAC/SIV gp 140 재조합체의 생성
SIV(Mac142)env유전자를 포함하는 플라스미드 pSSIIE는 Dr.Genoveffa Franchini (NCI-NIH, Bethesda, MD)로부터 얻어졌다. 이 플라스미드를HindIII 및PstI으로 분해시키고 SIVenv유전자의 뉴클레오티드 220에서 번역 중지코돈 아랫쪽으로 160bp 부위까지를 포함하는 2.2kbp를 방출시켰다. 이 단편을 포함하는 발현카세트는 gp160 종류보다 gp140 단백질종류를 발현시킬 것이라는 것이 주지되어야 한다. 트랜스막 부위의 이러한 40% 삭제는 게놈의 뉴클레오티드 7,934에서 조기 종결로부터 생긴다 (Franchini 등,1987). 배양물에서 SIV의 증식후에env유전자 산물의 그러한 조기 종결이 주지되었다 (Kodama 등, 989).
유전자의 아미노 부분이 주형으로서 pSSIIE를 이용하고 올리고 뉴클레오티드 SIVENV1 (SEQ ID NO:171) (5'-CGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGATGTCTTGGGAATC-3') 및 SIVENV2 (SEQ ID NO:172) (5'-CAAGGCTTTATTGAGGTCTC-3')을 이용하여 PCR에의하여 유도되었다. 결과적인 250bp 단편은 우두 바이러스 H6 프로모터 (NruI 위치의 3'-말단)의 3'-대부분 20bp로부터 아랫쪽에 병치된 SIVenv유전자의 5'-대부분 230bp를 포함한다. 170bp 단편은 그 단편을HindIII로 분해시켜서 SIVenv서열의 80bp를 제거하여 얻어졌다.
SIVenv유전자의 나머지 다음에는 조기 종결 시그날을 포함하는 서열은 PCR에 의해 pSS35E (Dr. Genoveffa Franchini로부터 얻어짐)에서 얻어졌다. 이 플라스미드는env유전자에서 아랫쪽의 LTR 부위속의 SIVenv유전자 C-터미날 부분을 포함하는 서열을 포함한다. 360bp 단편을 유도하는데 이용된 올리고 뉴클레오티드 SIVENV3 (SEQ ID NO:173)(5'-CCTGGCCTTGGCAGATAG-3') 및 SIVENV4A (SEQ ID NO:174) (5'-ATCATCGAATTCAAAAATATTACAAAGAGCGTGAGCTCAAGTCCTTGCCTAATCCTCC-3')이었다. 이 단편을PstI 및EcoRI으로 분해하여 5'PstI 접착성 말단 및 3'EcoRI 접착성 말단을 갖는 260bp 단편을 생성하였다.
pSSIIE의 2.2kbHindIII/PstI 단편, 그 유전자의 5' 말단을 포함하는 170bpNruI/HindIII 단편, 및 그 유전자의 3' 말단을 포함하는 260bpPstI/EcoRI을 pRW838에서 유도된 3.1kbNruI/EcoRI 단편과 결합시켰다. pRW838은 C5 유전자좌 속으로의 유전자의 삽입을 가능하게 하는 카나리아 폭스 바이러스 서열에 의해 측면 위치된 광견병 G 유전자에 결합된 우두 바이러스 H6 프로모터를 포함한다.NruI 및EcoRI 분해는 광견병 G 유전자를 방출하고 H6 프로모터의 3'-대부분 20bp를 제거한다. 우두 바이러스 H6 프로모터에 연결된 SIVenv유전자를 포함하는 결과적인 C5 삽입 플라스미드를 pC5SIVENV로서 나타냈다.
플라스미드 pC5SIVENV를HindIII 및EcoRI으로 분해하고 SIVenv유전자의 뉴클레오티드 150부터 전체 유전자의 말단까지를 포함하는 2.2kb 단편을 방출시켰다. PCR을 이용하여 올리고 뉴클레오티드 MPSYN286 (SEQ ID NO:175) (5'-CCCCCC-AAGCTTFTTTATTCTATACTT-3') 및 SIVENV2 (SEQ ID NO:176) (5'-CAAGGCTTTATTGAG-GTCTC-3')과 pC5SIVENV로부터 우두 바이러스 H6 프로모터/SIVenv결합을 유도하였다. 320bp 단편을HindIII로 분해하여 240bp 단편을 유도했다. 2.2kbHindIII/EcoRI 및 240bpHindIII 단편을HindIII 및EcoRI으로 분해된 pC3I 속에 공결합시켰다. SIVenv코딩서열에 상대적으로 적당한 방향으로HindIII 단편을 포함하는 결과적인 플라스미드를 pC3SIVEM으로 표시했다. 플라스미드 pC3I는 하기와 같이 유도되었다. 2.5kbBalII 카나리아폭스 바이러스 게놈 단편의 뉴클레오티드 서열분석은 전체의 C3 오픈 리딩 프레임 및 5' 및 3' 비코딩 부위를 나타냈다. C3 오픈리딩 프레임의 완전한 절단과 함께 C3 유전자좌내로의 외부 유전자의 삽입을 위한 도너 플라스미드를 제조하기 위하여, PCR 프라이머를 이용하여 C3에 상대적으로 5'및 3' 서열을 증폭시켰다. 5'서열에 대한 프라이머는 RG 277(SEQ ID NO:177) (5'-CAGTTGGTACCACTGGTATTTTATTTCAG-3') 및 RG278 (SEQ ID NO:178) (5'-TATCTGAA-TTCCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCAAATGTGAGTTAATA TTAG-3')이었다.
3'서열에 대한 프라이머는 RG279 (SEQ ID NO:179)(5'-TCGCTGAATTCGATATCAA-GCTTATCGATTTTTATGACTAGTTAATCAAATAAAAAGCATACAAGC-3') 및 RG280(SEQ ID NO:180) (5'-TTATCGAGCTCTGTAACATCAGTATCTAAC-3')이었다. 프라이머는 우두 바이러스 전사 및 번역 종결 시그날에 의해 측면 위치된 다수의 클로닝 위치를 포함하도록 고안되었다. 또한 좌측암 및 우측암의 5'-말단과 3'-말단에 두 암이Asp718/SacI 분해된 pBS-SK 플라스미드 벡터속에 결합될 수 있게 하는 적당한 제한위치 (좌측암에 대해서는Asp718 및EcoRI 그리고 우측암에 대해서는EcoRI 및SacI)가 포함되었다. 결과적인 플라스미드를 pC3I로서 나타냈다.
플라스미드 pC3SIVEM은EcoRI 분해에 의해 산성화되었다. 다음의HindIII 부분 분해는 2.7kbHindIII/EcoRI 단편을 방출하였다.
이 단편을 2mM dNTP 존재하에서 E.coli DNA 중합효소의 클리나우 단편으로 처리하여 블런트-말단화시켰다. 이 단편을SamI으로 분해된 pSD550VC 속에 결합시켰다. 결과적인 플라스미드를 pSIVEMVC로서 나타냈다. 이 플라스미드를 레스큐 바이러스로서 vP866과의 생체외 재조합 실험에서 사용하여 vP873을 생성하였다. vP873은 I4L 유전자좌 내에 SIVenv유전자를 포함한다.
NYVAC/gag/pol 및 gag 재조합체의 생성
gag 및 pol 유전자를 둘러싸는 SIV cDNA 서열을 포함하여 플라스미드 pSIVAGSSIIG는 Dr. Genoveffa Franchini (NCI-NIH, Bethesda,MD)로부터 얻어졌다. 이 플라스미드의 gag 및 pol 유전자는 우두 바이러스tk측면부 암 사이에서 우두 바이러스 I3L 프로모터에 3' 병치되었다. 이것은 I3L 프로모터에 해당하는 올리고뉴클레오티드 SIVL1 (SEQ ID NO:181) (5'-TCGAGTGAGATAAAGTGAAAATATATATC-ATTATATTACAAGTACAATTATTTAGGTTTAATCATGGGCG-3') 및 SIVL2 (SEQ ID NO:182)(5'-CCCATGATTAAACCTAAATAATTGTACTTTGTAATATAATGCTATATATTTTCACTTT ATCTCAC-3') 및gag을 포함하는 pSIVGAGSSIIG의 4,800bpCfoI/TagI 단편을 pSD460(도 1)의 유도체 pSD542의 4,070bpXhoI/AccI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pSIVG1으로 나타냈다.
pol유전자를 제거하기 위하여, 215bp PCR 단편이 올리고뉴클레오티드 SIVP5 (SEQ ID NO: 183) (5'-AATCAGAGAGCAGGCT-3') 및 SIVP6 (SEQ ID NO:184) (5'-TTGGATCCTATCCACCTCTCT-3')을 이용하여 pSIVGAGSSIIG로부터 얻어졌다. PCR-유도된 단편을BamHI 및StuI으로 분해하고 SIVG1의 5,370bpBamHI/StuI 부분단편과 결합시켰다. 이것은 pSIVG2를 생성하였다. pSIVG2는 레스큐 바이러스로 vP873과 생체외 재조합 실험에서 이용되어 vP948을 생성하였다.
NYVAC-기초 벡터속으로gag및pol을 삽입하기 위한 플라스미드가 하기의 방법으로 고안되었다. 상기에서 기술된 pSIVG1은 1KHpab PCR 단편을 이용하여 제거된 외래의 3'-비코딩 서열을 포함한다. 이 단편은 올리고뉴클레오티드 SIVP5 및 SIVP6와 플라스미드 pSIVGAGSSIIG로부터 생성되었다.pol유전자의 3' 말단을 포함하는 이러한 PCR 유도된 단편을BamHI 및HpaI으로 분해시켰다. 1KbBamHI/HpaI 단편을 pSIVG1의 7,400bpBamHI/HpaI 부분단편에 결합시켜서 pSIVG4를 생성하였다.
pSIVG4의 서열분석은 pol 유전자내에 단일 염기쌍 삭제를 나타냈다. 이 오류를 정정하기 위해 pSIVG1의 2,300bpBglII/StuI 단편을 pSIVG4의 6,100bpBglII/StuI 부분 단편속에 삽입시켜서 pSIVG5를 생성하였다. 플라스미드 pSIVG5는 레스큐로서 vP873과 생체외 재조합 실험에서 이용되어 vP943을 생성하였다.
NYVAC/SIV p16 및 p28 재조합체의 생성
p28, p2, p8, p1,및 p6를 암호화하는gag유전자 부분 및pol유전자가 pSIVG1에서 제거되었다. 이것은 올리고뉴클레오티드 SIVL10 (SEQ ID NO:185)(5'-AGACCAACAGCACCATCTAGCGGCAGAGGAGGAAATTACTAATTTTTATTCTAGAG-3') 및 SIVL11 (SEQ ID NO:186) (5'-GATCCTCTAGAATAAAAATTAGTAATTTCCTCCTCTGCCGCTAGATGGTGCTGTTGGT-3')을 pSIVG1의 4,430bpAccI/BamHI 단편속에 클로닝함으로써 수행되어 pSIVG3를 생성하였다. 이 플라스미드는 우두 바이러스 I3L 프로모터에 의해 발현되는 SIV p17 유전자 산물에 대한 발현카세트를 포함한다.
엔토모폭스바이러스 42KDa-프로모터 구동되는 SIV p28 유전자 (단지 5' 말단)가 I3L-프로모터 구동되는 p17 유전자로부터 아랫쪽에 삽입되었다. 이것은 엔토모폭스 42KDa 프로모터를 포함하는 올리고 뉴클레오티드 pSIVL14 (SEQ ID NO:187) (5'-TAGACAAAATTGAAAATATATAATTACAATATAAAATGCCAGTACAACAAATAGGTGGTAACTA-TGTCCACCTGCCATT-3') 및 SIVL15 (SEQ ID NO:188)(5'-GCTTAATGGCAGGTGGACATAGTT-ACCACCTATTTGTTGTACTGGCATTTTATATTGTAATTATATATTTTCAATTTTGT-3') p28 유전자의 5' 말단을 포함하는 pSIVG1의 360bpBspMI/BamHI 단편을 pSIVG3의 4,470bpXbaI/BamHI 부분 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 결과적인 플라스미드를 pSIVG6로서 나타냈다.
그 다음 p28 유전자의 3'부분을 pSIVG6 속으로 삽입시켰다. SIV p28 유전자의 3'말단을 포함하는 290bp PCR 단편은 올리고뉴클레오티드 SIVP12(SEQ ID NO:189) (5'-TGGATGTACAGACAAC-3') 및 SVIP13 (SEQ ID NO:190) (5'-AAGGATCCGAATT-CTTACATTAATCTAGCCTTC-3')을 이용하여 pSIVG1으로부터 유도되었다. 이 단편을BamHI으로 분해하고 pSIVG7의 4,830bpBamHI 단편에 결합시키고, 레스큐 바이러스로서 vP866 및 vP873과 생체외 재조합 실험에 이용되어 각기 vP942 및 vP952를 생성하였다.
발현분석SIV gp140env유전자 산물은 감염된 세포의 원형질막과 연관된 전형적인 당단백질이다. 그것은 112KDa의 세포외 종과 28KDa의 트랜스막 부위로 단백질 분해에 의해 절단되는 140KDa의 폴리 단백질로서 발현된다 (Franchini 등, 1987). SIV 다음 플루오레세인 결합된 토끼 항-원숭이 IgG에 대해 혈청 양성인 레수스 짧은꼬리 원숭이(rhesus macaque)의 혈청을 이용한 면역 형광분석은 재조합체 감염된 VERO세포 표면에서의env유전자 산물의 발현을 나타냈다. 표면 발현은 모의 감염된 세포 또는 NYVAC (vP866) 어버이 바이러스로 감염된 세포의 표면에서 검출할 수 없었다. 더욱 단지gag유전자만을 포함하는 재조합체로 감염된 세포는 표면에서 어떤 SIV 성분을 발현하는 것이 보여지지 않았다. vP873, vP943, vP948 및 vP952로 감염된 세포에서의 표면발현은 모두 표면 발현을 나타냈고 중요하게도 모두 SIVenv유전자를 포함한다.
NYVAC/HIV 재조합체로 감염된 VERO세포에서 발현된 SIV 유전자산물 (env및gag)의 확실성은 면역 침전에 의해 분석되었다. VERO세포를 10의 m.o.i.로 각 재조합 바이러스로, NYVAC 어버이 바리러스로 감염되고, 또는 모의 감염되었다. 1 시간 흡착기간 후에 접종물을 제거하고, 감염된 세포를 [35S]-메티오닌 (20μCi/ml)을 포함하는 2ml 메티오닌-결핍 배지로 덮었다. 모든 샘플을 감염 17시간 후에 1ml의 3×완충액 A의 첨가에 의해 수거하였다. 감염된 세포의 용해물을gagp24 유전자 산물에 대해 특이적인 모노클로날 항체 또는 SIV 혈청양성 레수스 짧은꼬리 원숭이의 수집된 혈청 (둘다 Dr. Genoveffa Franchini, NCI-NIH, Bethesda MD에서 얻어짐)으로 분석하였다.
SIV 혈청양성 짧은꼬리 원숭이 혈청의 면역 침전은 하기의 방법으로 수행되었다. 짧은꼬리 원숭이 혈청을 16시간동안 4℃에서 단백질 A-세파로스와 배양하였다. 완충액 A로 세척한후, 단백질A 세파로스에 결합된 혈청을 정상 원숭이 혈청 및 단백질 A 세파로스로 미리 정화된 용해물에 첨가하였다. 4 ℃에서 하룻밤동안 배양한 다음 침전물을 완충액 A로 4× 그리고 LiCℓ/요소 완충액으로 2×세척하였다. 항체로부터 침전된 단백질을 분리하기 위하여, 샘플을 5분동안 80μℓ 2×Laemmli 완충액에서 비등하였다. 샘플을 Dreyfuss 겔 시스템(Dreyfuss 등, 1984)을 이용하여 12.5% 겔에서 분리시켰다. 겔을 고정시키고 형광사진법을 위해 1M Na-살리실산염으로 처리하였다.
SIV 유전자를 포함하는 모든 재조합체는 적절한 유전자산물을 발현하였다. SIVenv유전자를 포함하는 NYVAC 재조합체 vP873, vP943, vP948 및 vP952는 모두 확실한 gp140을 발현하였다. 그러나 gp140 단백질이 112 kDa와 28kDa 완전한 형태로 프로세싱되는 것을 평가하는 것은 어렵다. 모의 감염된 VERO세포, vP866 감염된 VERO세포 및 SIVenv유전자를 포함하지 않는 NYVAC/SIV 재조합체로 감염된 VERO세포의 짧은꼬리 원숭이 항-SIV 혈청에 의해서는 140 kDa의 겉보기 분자량을 갖는 어떤 종도 침전되지 않았다. vP942, vP943, vP948,및 vP952에의한 SIV gag 암호화된 유전자 산물의 발현은 p28gag성분에 특이적인 모노클로날항체 및 SIV로 감염된 짧은꼬리 원숭이로부터 수집된 혈청을 이용하여 증명되었다. VERO세포에서 NYVAC(vP948)에 의해 프로테아제 기능을 포함하는 poℓ부위없는 전체의 p55 gag 단백질의 발현은 명백하다. 이 결과는 SIV 프로테아제 발현의 결핍은 p55의 그것의 완전한 형태로의 완전한 단백질 분해를 방해한다는 것을 나타낸다. 이것은 p28에 특이적인 모노클로날 항체가 vP948 감염된 VERO세포로부터gag특이적인 유전자 산물을 침전시키는데 이용될때 훨씬 더 명백하게 나타난다. 이 결과와는 반대로, vP943 감염된 VERO세포에서poℓ유전자와(프로테아제를 포함한다) SIVgag의 발현은 발현된 p55gag전구체 폴리펩티드가 그것의 완전한 형태로 단백질 분해에 의해 절단될수 있게 하였다.
vP942 및 vP952 감염된 VERO세포에서 p16 및 p28 SIV 유전자 산물의 발현은 SIV로 감염된 마카로크로부터 수집된 혈청을 이용하여 확인되었다. p28에 특이적인 모노클로날 항체를 이용한 것은 명백하게 단지 p28 발현 성분을 인식하였다.
실시예22
조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 당단백질을 발현하는 TROVAC 재조합체의 제조
본 실시예는 조류 인플루엔자 바이러스의 3 혈청형의 헤마글루티닌 유전자를 발현하는 계두 바이러스 재조합체의 개발을 기술한다.
세포 및 바이러스
H4, H5 및 H7 헤마글루티닌 유전자의 cDNA 클론을 포함하는 플라스미드는 Dr. Robert Webster, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, Tennessee로부터 얻어졌다. FP-1으로 표시된 FPV의 균주는 이전에 기술되었다 (Taylor 등, 1988a,b). 그것은 병아리의 백신접종에 유용한 약독화된 백신균주이다. 어버이 바이러스 균주 Duvette는 병아리에서 우두 딱지로 프랑스에서 얻어졌다. 바이러스는 병아리 배를가진 알에서 대략 50 순차적인 계대접종후 병아리 배 피브로블라스트(CEF) 세포에서 25 계대접종에의하여 약독화되었다. 이 바이러스는 1980 년 9월에 프랑스 리용의 Rhone Merieux에 의해 얻어졌고, 마스터 바이러스 시드가 확립되었다. 네번의 연속적인 플라크 정제된 바이러스가 1989년 9월 Virogenetics에 의하여 수용되었다. 하나의 플라크 분리물을 추가로 일차 CEF 세포에서 증식시키고 TROVAC로서 표시된 스톡(stock) 바이러스가 확립되었다. TROVAC-AIH5(vFP89) 및 TROVAC-AIH4(vFP92)를 생성하기 위한 생체외 재조합 테스트에서 이용한 스톡 바이러스를 추가로 일차 CEF 세포에서 8 계대접종을 통해서 증식시켰다. TROVAC-AIH7(vFP100)을 생성하는데 이용된 스톡 바이러스를 추가로 일차 CEF 세포에서 12 계대접종을 통해서 증식시켰다.
F8 유전자좌에서 계두 삽입 플라스미드의 제조
플라스미드 pRW 731.15는 TROVAC 게놈 DNA로부터 클로닝된 10 kbpPvuII-PvuII 단편을 포함한다. 뉴클레오티드 서열은 3661 bpPvuII-EcoRV 단편에 대해 양가닥에서 결정되었다. 이 서열은 도 21에서 보여진다.
본 실험실에서 F8로 표시된 오픈리딩 프레임의 한계가이 서열내에서 결정되었다. 오픈 리딩 프레임은 위치 704에서 개시되고 위치 1888에서 종결된다. 이웃하는 오픈 리딩 프레임을 방해하지 않기 위해서 하기에 기술된 대로 위치 781에서 위치 1928까지 삭제가 행해졌다.
플라스미드 pRW 761은 2430 bpEcoRV-EcoRV 단편을 포함하는 pRW 731.15의 서브-클론이다. F8 ORF는 pRW 761에서XbaI 위치와SspI 위치 사이에 완전히 포함되었다. TROVAC게놈 DNA와의 재조합으로 F8 ORF를 제거한 삽입 플라스미드를 생성하기 위하여 하기의 단계들이 수행되었다. 플라스미드 pRW 761을XbaI으로 완전 분해하고SspI으로 부분 분해하였다. 3700 bpXbaI-SspI 밴드를 분리하고 어닐링된 중-가닥 올리고뉴클레오티드 JCA 017(SEQ ID NO: 191) 및 JCA 018 (SEQ ID NO: 192)와 결합시켰다.
이 결합으로 생긴 플라스미드를 pJCA 002로 나타냈다. 플라스미 pJCA 004는 플라스미드 pJCA 002에서 우두 바이러스 H6 프로모터에 연결된 부적절한 유전자를 포함한다. 우두 바이러스 H6 프로모터의 서열은 이전에 기술되었다(Taylor 등, 1988 a,b; Guo 등, 1989; Perkus등, 1989). 플라스미드 pJCA 004를EcoRV-BamHI으로 분해시켰는데 이것은 H6 프로모터의 3' 말단의 일부 및 부적절한 유전자를 삭제한다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드 RW 178 (SEQ ID NO: 193) 및 RW 179 (SEQ ID NO: 194)를EcoRVBamHI으로 절단하고 JCA 004의EcoRV 및BamHI 위치 사이에 삽입시켜서 pRW 846을 형성하였다.
따라서 플라스미드 pRW 846은 탈-ORF 된 F8 유전자좌내에EcoRV의 5' H6 프로모터를 포함한다. pRW 846에서 H6 프로모터의 3'HincII 위치 다음에는 번역 중지코돈, 우두 바이러스 초기 프로모터에 의해 인식되는 전사 종결 서열(Yuen 등, 1987) 및SmaI 위치가 있다.
F7 유전자좌에서 계두 삽입 플라스미드의 제조
본래의 F7 비-탈-ORF된(non-de-ORFed)삽입 플라스미드 pRW 731.13은 pUC9의PvuII 위치에 5.5kb 게놈PvuII 단편을 포함하였다. 삽입위치는 이 서열내의 유일한HincII 위치였다. 도 22에서 보여지는 뉴클레오티드 서열은 유일한HincII 위치를 둘러싸는 2356bp 부위에 대해 결정되었다. 이 서열의 분석은 90 아미노산의 폴리펩티드를 암호화하는 ORF내에 유일한HincII 위치(도 22, 밑줄친 부분)가 있다는 것을 나타냈다. ORF는 위치 1531에서 ATG로 시작하고 위치 898에서 종결된다(도 22의 화살표 표시위치).
탈-ORF된 삽입 플라스미드에 대한 암은 주형으로서 pRW 731.13을 이용한 PCR에의하여 유도되었다. ORF로부터 윗쪽의 부위에 해당하는 596 bp 암(HB로서 표시됨)이 올리고뉴클레오티드 F73PH2 (SEQ ID NO: 195) (5'-GACAATCTAAGTCCTATA-TTAGAC-3') 및 F73PB (SEQ ID NO: 196) (5'-GGATTTTTAGGTAGACAC-3')으로 증폭되었다. ORF로부터 아래쪽의 부위에 해당하는 270bp 암 (EH로서 표시됨)이 올리고뉴클레오티드 F75PE (SEQ ID NO: 197) (5'-TCATCGTCTTCATCATCG-3') 및 F73PH1 (SEQ ID NO: 198) (5'-GTCTTAAACTTATTGTAAGGGTA TACCTG-3')을 이용하여 증폭되었다.
단편 EH를EcoRV로 분해시켜 126 bp 단편을 생성하였다.EcoRV 위치가 3'-말단에 있고 5'-말단이 PCR에의하여HincII 위치가 3'-말단을 포함하도록 형성되었다. 이 단편을HincII로 분해된 pBS-SK (Stratagene, La Jolla, CA) 속에 삽입시켜서 플라스미드 pF7D1을 형성하였다. 그 서열은 디데옥시 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 확인되었다. 플라스미드 pF7D1을ApaI으로 선상화시키고, T4 DNA 중합효소를 이용하여 블런트-말단화시키고, 596bp HB 단편에 결합시켰다. 결과적인 플라스미드를 pF7D2로 표시했다. 전체 서열과 방향은 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 확인되었다.
플라스미드 pF7D2를EcoRV 및BgℓII로 분해하여 600bp 단편을 생성하였다. 이 단편을ApaI으로 분해되고, T4 DNA 중합효소로 블런트-말단화되고, 다음에는BamHI으로 분해된 pBS-SK 속에 삽입시켰다. 결과적으로 플라스미드를 pF7D3으로 나타냈다. 이 플라스미드는 404bp의 HB 암 및 126bp의 EH 암을 포함한다.
플라스미드 pF7D3을XhoI으로 선상화시키고 2mM dNTP의 존재하에서E. coliDNA 중합효소의 클리나우 단편으로 블런트-말단화시켰다. 이 선상화된 플라스미드를 어닐링된 올리고뉴클레오티드 F7MCSB (SEQ ID
이것은 EH와 HB 암 사이에HindIII,PstI 및SmaI에 대한 제한위치를 포함하는 다수의 클로닝 부위를 삽입하도록 수행되었다. 결과적인 플라스미드를 pF7D0로서 나타냈다.
F8 유전자좌에서 H4 헤마글루티닌에 대한 삽입 플라스미드의 제조
A/Ty/Min/833/80에서 유도된 조류 인플루엔자 H4를 암호화하는 cDNA 카피는 플라스미드 pTM4H833에서 Dr. R. Webster로부터 얻었다. 플라스미드를HindIII 및NruI으로 분해하고 dNTP 존재하에서 DNA 중합효소의 클리나우 단편을 이용하여 블런트-말단화시켰다. H4 코딩 부위를 포함하는 블런트-말단2.5 kbpHindIII-NruI단편이 pIBI25(International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT)의HincII 위치속에 삽입되었다. 결과적인 플라스미드 pRW 828을BanII로 부분 절단시키고, 직선형 산물을 분리하고HindIII로 재절단시켰다. 이제 100 bpHindIII 및BanII 삭제를 지닌 플라스미드 pRW828을 합성 올리고뉴클레오티드 RW152 (SEQ ID NO: 201) 및 RW 153 (SEQ ID NO: 202)에 대한 벡터로서 이용하였다. 이 올리고뉴클레오티드는EcoRV 위치로부터 H6 프로모터의 3' 부분을 나타내고 H4 cDNA의 ATG와 프로모터의 ATG를 정렬시킨다.
올리고뉴클레오티드가 어닐링되고, BanII 및 HindIII로 절단되고, 상기에서 기술된HindIII-BanII 삭제된 pRW828 속에 삽입되었다. 결과적인 플라스미드 pRW844를EcoRV 및DraI으로 절단하고, 3' H6 프로모터 구동되는 H4 코딩서열을 포함하는 1.7 kbp 단편을 pRW 846(이전에 기술됨)의EcoRV 및HincII 위치 사이에 삽입하여 플라스미드 pRW 848을 형성하였다. 따라서 플라스미드 pRW 848은 계두바이러스의 탈-ORF된 F8 유전자좌에서 우두 바이러스 H6 프로모터에 연결된 H4 코딩서열을 포함한다.
F8 유전자좌에서 H5 헤마글루티닌에 대한 삽입 플라스미드의 제조
A/터키/아일랜드/1378/83에서 유도된 조류 인플루엔자 H5의 cDNA 클론은 Dr. R. Webster로부터 플라스미드 pTH29에서 수용되었다. 합성 올리고뉴클레오티드 RW10(SEQ ID NO: 203) 내지 RW13(SEQ ID NO: 206)은 이전에 기술된 우두 바이러스 H6 프로모터의 번역 개시코돈을 H5 유전자의 ATG와 겹치도록 고안되었다. 이 서열은 H5 유전자의 5'SaℓI 위치를 지나서 계속되며 H5 종결 코돈을 포함하는 3' H5DraI 위치에서 다시 시작된다.
올리고뉴클레오티드를 3분간 95 ℃에서 어닐링시킨후 실온에서 서서히 냉각시켰다. 이것에 의해 표시된 말단을 갖는 하기의 이중사슬 구조가 되었다.
pRW742B의EcoRV 및PstI 위치사이에 올리고뉴클레오티드의 클로닝에 의해 pRW744가 생성되었다. 플라스미드 pRW742B는 이전에 기술된 pRW 731.15의HincII 위치에서 삽입된 부적절한 유전자에 연결된 우두 바이러스 H6 프로모터를 포함한다.PstI 및EcoRV 분해는 부적절한 유전자와 H6 프로모터의 3'-말단을 제거한다. 플라스미드 pRW744는 이제 조류 인플루엔자 H5의 ATG와 겹치는 H6 프로모터의 3' 부분을 포함한다. 플라스미드는 또한 5'SaℓI 위치까지의 HS 서열 및 H5 종결코돈의 3' 서열(DraI 위치를 포함)을 포함한다.DraI 위치의 이용은 H5 3' 비-코딩 말단을 제거한다. 올리고뉴클레오티드가 초기 우두 바이러스 RNA 중합효소에 의해 인식되는 전사 종결시그날을 첨가한다(Yuen 등, 1987). H6 프로모터 구동되는 H5 구조체를 완결시키기 위하여, pTH29로부터 H5 코딩부위가 1.6 kbpSaℓI-DraI 단편으로서 분리되었다. 플라스미드 pRW744를DraI으로 부분분해하고, 직선형 단편을 분리하고,SaℓI으로 재절단시키고, 이제SaℓI과DraI 사이에서 삭제된 8염기를 갖는 플라스미드가 1.6kbp pTH29SaℓI 및DraI 단편에 대한 벡터로서 이용되었다. 결과적인 플라스미드 pRW759를EcoRV 및DraI으로 절단하였다. 3' H6 프로모터 및 H5 유전자를 포함하는 1.7 kbp pRW 759EcoRV -DraI 단편을 pRW846(이전에 기술됨)의EcoRV 및HincII 위치 사이에 삽입시켰다. 결과적인 플라스미드 pRW 849는 탈-ORF 된 F8 유전자좌에 H6 프로모터 구동되는 조류 인플루엔자 바이러스 H5 유전자를 포함한다.
F7 유전자좌에서 H7 헤마글루티닌에 대한 삽입 벡터의 제조
A/CK/VIC/1/85로부터 H7 헤마글루티닌을 포함하는 플라스미드 pCVH71은 Dr. R. Webster로부터 받았다. H7 유전자를 포함하는EcoRI -BamHI 단편을 DNA 중합효소의 클리나우 단편으로 블런트-말단화시키고 pRW827로서 pIBI25의HincII 위치속에 삽입시켰다. 합성 올리고뉴클레오티드 RW 165 (SEQ ID NO: 207) 및 RW 166 (SEQ ID NO: 208)이 어닐링되고,HincII 및StyI으로 절단되고, pRW827의EcoRV 및StyI 위치 사이에 삽입되어 pRW 845가 생성되었다.
올리고뉴클레오티드 RW 165 (SEQ ID NO: 207) 및 RW 166 (SEQ ID NO: 208)은 H6 프로모터의 3'부분을 H7 유전자에 연결한다. H7 유전자의 3' 비-코딩 말단은 pRW845의ApaLI 분해의 직선형 산물을 분리하고, 그것을EcoRI으로 재절단하고, 가장 큰 단편을 분리하고 합성 올리고뉴클레오티드 RW 227 (SEQ ID NO: 209) 및 RW 228 (SEQ ID NO: 210)과 어닐링시킴으로써 제거되었다. 결과적인 플라스미드는 pRW 854 였다.
pRW 854에서 H7의 종결 코돈 다음에HpaI 위치가 있다. 탈-ORF된 F7 유전자좌의 중간단계 H6 프로모터 구동되는 H7 구조체(하기에 기술됨)는 pRW 854EcoRV -HpaI 단편을EcoRV로 절단되고 그것의PstI 위치에서 블런트-말단화된 pRW 858 속으로 이동시킴으로써 생성되었다. 플라스미드 pRW858(하기에 기술됨)은 F7 탈-ORF된 삽입 플라스미드내에 H6 프로모터를 포함한다.
플라스미드 pRW 858은 부적절한 유전자에 연결된 H6 프로모터를 포함하는 850 bpSmaI/HpaI 단편을 이전에 기술한 pF7D0의SmaI 위치속에 삽입함으로써 제조되었다. 부절적한 서열이 pRW 858의EcoRV (H6 프로모터의 3'-말단의 위쪽 24 bp 위치) 및PstI 분해에 의해 절단되었다. 3.5 kb 결과적인 단편을 분리하고 2mM dNTP의 존재하에서E. coliDNA 중합효소의 클리나우 단편을 이용하여 블런트-말단화시켰다. 이 블런트-말단 단편을 pRW854 (이전에 기술됨)에서 유도된 1700 bpEcoRV/HpaI 단편에 결합시켰다. 이EcoRV/HpaI 단편은 VV H6 프로모터의 3'-대부분 24bp의 3'에 병치된 전체의 AIV HA (H7) 유전자를 포함한다. 결과적인 플라스미드를 pRW861로 표시했다.
게놈 TROVAC DNA와의 재조합 빈도를 증가시키기 위해 pRW861에서 126bp EH암 (이전에 정의됨)이 연장되었다. 이것을 수행하기 위해 pRW 731.13 (이전에 정의됨)으로부터 575bpAccI/SnaBI 단편이 유도되었다. 이 단편을 분리하고 pRW861의AccI 및NaeI 위치 사이에 삽입시켰다. AIV H7 유전자 측면부의 HB 암 404 bp 및 EH 암 725bp를 포함하는 결과적인 플라스미드는 pRW869로서 나타냈다. 따라서 플라스미드 pRW 869는 우두 바이러스 H6 프로모터와 5' 말단에서 결합된 H7 코딩서열로 구성된다. 좌측 측면부 암은 TROVAC 서열의 404bp로 구성되며 우측 측면부 암은 탈-ORF된 F7 유전자좌에 삽입을 유도하는 TROVAC 서열의 725bp로 구성된다.
TROVAC-조류 인플루엔자 바이러스 재조합체의 개발
조류 인플루엔자 바이러스 HA 코딩서열을 포함하는 삽입 플라스미드를 이전에 기술된 인산칼슘 침전방법( Panicali등, 1982; Piccini 등, 1987)을 이용함으로써 TROVAC 감염된 일차 CEF 세포속에 개별적으로 트랜스펙션시켰다. 포지티브 플라크를 HA 특이적인 방사성 표지된 프로브에 대한 혼성화의 기초하에 선택하였고 순수한 집단에 도달할때까지 순차적으로 여러번 플라크 정제하였다. 그 다음 하나의 대표적인 플라크를 증폭시켜서 스톡 바이러스를 생성하였다. 플라스미드 pRW 849가 H5 헤마글루티닌을 발현하는 재조합체 TROVAC-AIH5 (vFP 89)를 생성하기 위한 생체외 제조합 테스트에서 이용되었다. 플라스미드 pRW848을 이용하여 H4 헤마글루티닌을 발현하는 재조합체 TROVAC-AIH4(vFP92)를 생성하였다. 플라스미드 pRW 869를 이용하여 H7 헤마글루티닌을 발현하는 재조합체 TROVAC-AIH7 (vFP100)을 생성하였다.
면역형광
인플루엔자 바이러스 감염된 세포에서는 HA 분자가 조원형질 망에서 전구체 분자로서 합성되고 글리코실화된다. 원형질막으로 이동되는 동안 그것은 광범위한 번역-후 변형되어 이황화물 결합된 HA1및 HA2서브유니트로 단백질 분해에 의해 절단되고 숙주 세포막속에 삽입되고 여기서 다음에는 완전한 바이러스 엔벨로프속에 투입된다. TROVAC-AIV 재조합 바이러스로 감염된 세포에서 생성되는 HA 분자가 세포표면에서 발현되는지를 결정하기 위해서, 면역형광 연구를 수행하였다. 간접적 면역형광법은 기술된대로 수행되었다(Taylor 등, 1990).
TROVAC-AIH5에서 H5 헤마글루티닌, TROVAC-AIH4에서 H4 헤마글루티닌 및 TROVAC-AIH7에서 H7 헤마글루티닌의 표면 발현은 간접적 면역형광법에 의하여 확인되었다. H5 헤마글루티닌의 발현은 H5HA에 대해 특이적인 모노글로날 항체의 푸울 (pool)을 이용하여 검출되었다. H4HA의 발현은 염소의 단일 특이적인 항-H4 혈청을 이용하여 분석되었다. H7HA의 발현은 H7 특이적인 모노클로날 항체 제조물을 이용하여 분석되었다.
면역침전
헤마글루티닌 분자의 절단위치의 서열 및 주위의 서열은 헤마글루티닌 폴리펩티드의 절단이 바이러스 입자의 감염성에 필요하기 때문에 바이러스 독성을 결정하는데 중요한 역할을 한다는 것이 결정되었다. 병원성 H5 및 H7 바이러스의 헤마글루티닌 단백질은 HA1의 카르복시 터미날에 하나 이상의 염기성 아미노산을 가진다. 이것은 일련의 염기성 아미노산을 인식하는 세포성 프로테아제가 헤마글루티닌을 절단하게 하며 감염성 바이러스가 생체외 및생체내에서 퍼지게 한다고 생각된다. H4 비병원성 균주의 헤마글루티닌 분자는 외래의 트립신이 첨가되지 않으면 조직배양물에서 절단되지 않는다.
TROVAC 재조합체에 의해 발현되는 헤마글루티닌 분자가 확실하게 프로세싱되는지를 결정하기 위해서, 상기에서 기술한 특이적인 시약을 이용하여 기술된 대로 면역 침전실험을 수행하였다(Taylor 등, 1990).
TROVAC-AIH5 (vFP 89)에 의해 발현되는 H5 헤마글루티닌의 면역침전분석은 당단백질이 각각 44 및 23kDa의 대략적인 분자량을 갖는 두 절단산물 HA1및 HA2로서 명백하다는 것을 보였다. 감염되지 않은 세포 또는 어버이 TROVAC으로 감염된 세포로부터는 그러한 단백질들이 침전되지 않았다.
TROVAC-AIH7 (vFP 100)에 의해 발현되는 헤마글루티닌의 면역침전분석도 유사하게 HA2절단산물의 특이적인 침전을 보였다. HA1절단산물은 인식되지 않았다. 감염되지 않은 CEF 세포 또는 TROVAC 감염된 CEF 세포로부터는 어떤 단백질도 특이적으로 침전되지 않았다. 반대로 TROVAC-AIH4 (vFP 92)의 발현산물의 면역 침전분석은 단지 전구체 단백질 HAO의 발현을 보였다. 이것은 조직배양에서 비병원성 서브유형의 헤마글루티닌 절단의 결핍과 일치한다. 감염되지 않은 CEF 세포 또는 TROVAC으로 감염된 세포에서는 어떤 H4 특이적인 단백질도 검출되지 않았다.
실시예 23
3 조류 인플루엔자 유전자를 발현하는 삼중의 재조합체의 개발
플라스미드 제조.
플라스미드 pRW849는 이전에 논의되었고 H6 프로모터 구동되는 조류 인플루엔자 H5 유전자를 포함한다. 이 플라스미드가 vFP 89의 개발을 위해 이용되었다. 플라스미드 pRW861은 vFP 100의 개발에서 사용되었고 이전에 기술되었던 중간생성 플라스미드였다. 플라스미드는 H6 프로모터 구동되는 조류 인플루엔자 H7 유전자를 포함한다. 플라스미드 pRW849는SmaI으로 분해되었고, H6 프로모터의 5' 말단부터 H5 유전자까지의결과적인 1.9 kbp 단편을 pRW 861의SmaI 위치에 삽입시켜서 pRW865를 생성하였다. H4 코딩서열을 삽입하기 위하여 플라스미드 pRW848을 이용하였다. 플라스미드 pRW848은 vFP 92의 개발에 이용되었고 H6 프로모터 구동되는 H4 유전자를 포함한다(이전에 기술됨). 플라스미드 pRW848을 SmaI으로 분해하고 그 다음 H6 프로모터 구동되는 H4 코딩서열을 포함하는 1.9 kbp 단편을 H6 프로모터 구동되는 H5 서열의 5'SmaI 위치에서 pRW865속에 삽입시켰다. 따라서 결과적인 플라스미드 pRW872는 F7 탈-ORF 된 삽입 플라스미드에서 H4, H5 및 H7 코딩서열을 포함한다.
유전자의 삽입이 탈-ORF 된 F8 유전자좌로 향하도록 하기 위해 pRW872를SmaI으로 부분 분해하고 직선형 단편을 분리하고HindIII로 다시 절단하였다. 세 H6 프로모터 구동되는 조류인플루엔자 유전자 모두를 포함하는 5.7 kbpSmaI 내지HindIII pRW872 단편을 블런트-말단화시키고, HincII로 절단된 pCEN 100 속에 삽입시켰다. 플라스미드 pCEN 100은 전사 및 번역종결시그날 및 다수의 삽입 위치를 포함하는 탈-ORF 된 F8 삽입 벡터이다. 플라스미드 pCEN 100은 하기에 기술된 대로 생성되었다. 합성 올리고뉴클레오티드 CE 205 (SEQ ID NO: 211) 및 CE 206 (SEQ ID NO: 212)가 어닐링되고, 포스포릴화되고, pJCA 002(이전에 기술됨)의BamHI 및HindIII 위치속에 삽입되어 pCE72가 형성되었다. pCE72의BgℓII 내지EcoRI 단편을 pJCA 021의BgℓII 및EcoRI 위치속에 삽입시켜서 pCEN 100을 형성하였다.
플라스미드 pJCA 021은 pRW 731-15 (이전에 기술됨)의 4900bpPvuII -HindII 단편을 pBSSKT의SmaI 및HindII 위치속에 삽입시켜서 얻어졌다.
최종 삽입 플라스미드 pRW874는 삭제된 F8 ORF와 동일한 방향으로 전사되는 세 개의 조류 인플루엔자 HA 유전자를 가진다. H4 유전자에 인접한 플라스미드의 좌측 측면부 암은 계두 서열의 2350bp로 구성되었다. H7 유전자에 인접한 우측 측면부 암은 계두 서열의 1700bp로 구성되었다. 플라스미드의 선형 표현이 하기에서 보여진다.
재조합체 vFP 122의 개발
플라스미드 pRW874를 이전에 기술된 인산칼슘 침전방법(Panicali 등, 1982; Piccini등, 1987)을 사용함으로써 TROVAC 감염된 일차 CEF 세포속에 트랜스펙션시켰다. 특이적인 H4, H5 및 H7 방사성 표지된 프로브에 대한 혼성화의 기초하에 포지티브 플라크를 선택하고, 순수한 집단을 얻을때까지 5번 순차적인 플라크 정제를 하였다. 모든 세 당단백질의 표면 발현은 이전에 기술된 특이적인 시약을 이용한 플라크 면역스크리닝에 의해 확인되었다. 삽입된 유전자의 안정성은 두번의 증폭후에 확인되었고 재조합체를 vFP 122로서 나타냈다.
실시예 24
다양한 우두 바이러스 균주와 ALVAC 및 NYVAC의 LD 50 의 비교
마우스.
수컷 이계교배된 스위스 웹스터 마우스는 Taconic Farms(Germantown, NY)에서구입되었고, 3 주일되어('정상' 마우스) 사용할때까지 임의로 마우스 먹이와 물로 유지되었다. 새로 태어난 이계 교배된 스위스 웹스터 마우스는 양쪽성이었고, Taconic Farms에 의해 수행된 정기의 수태후에 얻어졌다. 사용된 모든 새로 태어난 마우스는 2일의 기간내에 인도되었다.
바이러스.
ALVAC는 카나리아폭스 바이러스 집단의 플라크 정제에 의해 유도되었고 일차 병아리 배 피브로블라스트 세포(CEF)에서 제조되었다. 수크로스 밀도 구배 원심분리에 의한 정제후, ALVAC가 CEF 세포에서 플라크 형성단위에 대해 계수되었다. 우두 바이러스의 WR(L) 변체는 WR의 대 플라크 표현형의 선택에 의해 유도되었다 (Panicali 등, 1981). 우두 바이러스의 Wyeth New York State Board of Health 백신균주는 제약송아지 림프 유형백신 Dryvax, 컨트롤 번호 302001B로부터 얻어졌다. 코펜하겐 균주 우두 바이러스 VC-2는 Institut Merieux, France로부터 얻었다. 우두 바이러스 균주 NYVAC는 코펜하겐 VC-2로부터 유도되었다. Wyeth 균주를 제외한 모든 우두 바이러스 균주는 수크로스 구배 밀도 원심분리에 의해 정제된 베로 아프리카 녹색 원숭이 신장세포에서 배양되고 VERO 세포상에서플라크 형성 단위에 대해 계수되었다. Wyeth 균주는 CEF 세포에서 생장되고 CEF 세포에서 계수되었다.
접종.
10정상 마우스 그룹을 멸균한 인산-완충된 식염수에서 스톡 제조물을 10-배 순차적으로 희석함으로써 제조된 바이러스의 여러 희석물중 하나 0.05 mℓ로 두개내(ic) 접종시켰다. 어떤 경우에는 희석되지 않은 스톡 바이러스 제조물을 접종에 이용하였다.
1일 내지 2일된 10 마리의 새로 태어난 마우스 그룹을 0.03mℓ의 주입부피가 이용된 것을 제외하고는 정상 마우스와 유사하게 ic 접종시켰다.
접종후 14 일(새로 태어난 마우스) 또는 21 일(정상 마우스)의 기간동안 사망률에 대해 모든 마우스를 매일 관찰하였다. 접종후 아침에 사망한 것으로 발견된 마우스는 외상에 의한 가능한 사망때문에 배제되었다. 실험 집단의 50%의 사망율을 나타내는데 필요한 치사량(LD50)은 Read 및 Muench의 비례방법에 의하여 결정되었다.
ic 경로에 의한 정상새끼 이종교배 마우스에 대한 다양한 우두 바이러스 균주와 ALVAC 및 NYVAC의 LD 50 의 비교
정상 새끼 마우스에서 NYVAC 및 ALVAC의 병원성을 시험한 다른 우두 바이러스 균주보다 몇차수의 크기가 더 낮았다(표 28). NYVAC 및 ALVAC는 Wyeth 균주보다 정상 마우스에서 3,000 배이상, 덜 병원성이 있는 것이 발견되었다; 어버이 VC-2 균주보다 12,500 배이상 덜 병원성이 있고; WR(L) 변체보다 63,000,000 배이상 덜 병원성이 있는 것이 발견되었다.이러한 결과는 NYVAC가 다른 우두 균주에 비교하여 매우 약독화되었고, ALVAC가 두 개내 투여되었을때 일반적으로 새끼 마우스에 대해서 비병원성이지만, 둘다 이러한 접종경로에 의해 결정되지 않은 기작에 의하여 극히 높은 투여량에서는(3.85×108PFU, ALVAC 및 3×108PFU, NYVAC) 마우스에서 사망을 일으킬수 있다는 것을 제안한다.
ic 경로에 의한 새로 태어난 이종교배 마우스에 대한 다양한 우두 바이러스 균주와 ALVAC 및 NYVAC의 LD 50 의 비교
정상인 새로 태어난 마우스에 대한 5 폭스 바이러스 균주의 상대적인 병원성은 두개내의(ic) 공격 모델 시스템에서의 적정에 의해 테스트되었다(표29). 종결점으로서 사망율로, LD값은 ALVAC가 우두 바이러스의 Wyeth 백신 균주보다 100,000 배이상 덜 병원성이 있고; 우두 바이러스의 코펜하겐 VC-2 균주보다 200,000배 이상 덜 병원성이 있고; 우두 바이러스의 WR-L 변체보다 25,000,000 배이상 덜 병원성이 있는 것을 나타냈다. 그럼에도 불구하고 테스트된 가장 높은 투여량 6.3×107PFU에서는 100% 사망율이 된다. 6.3×106PFU에서는 33.3%의 사망율이 관찰되었다. 실제로 결정되지 않은 사망의 원인은 가장 높은 투여량 그룹(대략 6.3 LD50)의 마우스의 평균 생존시간(MST) 이 6.7 ± 1.5 일 이었기 때문에 독물학적 또는 외상의 원인같지는 않았다. MST가 4.8 ± 0.6일인 5 LD50의 공격 투여량에서 WR(L)과 비교했을때, ALVAC 공격된 마우스의 MST는 상당히 보다 길었다(P = 0.001).
NYVAC에 비해서, Wyeth는 15,000 배이상 더 병원성이 있고; VC-2는 35,000 배이상 더 병원성이 있고; WR(L)은 3,000,000배 이상 더 병원성이 있는 것으로 발견되었다. ALVAC와 유사하게, NYVAC의 두 가장높은 투여량, 6 ×108및 6 ×107PFU는 100% 사망을 이끌었다. 그러나, 380 LD50에 해당하는 가장 높은 투여량으로 공격된 마우스의 MST는 단지 2 일이었다 (2일경에는 9사망 및 4일경에는 1사망). 반대로 500 LD50과 등가인 WR-L의 가장 높은 투여량으로 공격된 모든 마우스는 4일까지 생존했다.
실시예25
EHV-1 gB, gC및 gD 당단백질 상동체를 발현하는 NYVAC-기초 재조합체의 제조
EHV-1 gB 당단백질의 발현은 EHV-1 gB 상동체 유전자를 우두 바이러스 I3L 프로모터의 조절하에 놓음으로써 수행되었다. EHV-1 gC 당단백질의 발현은 EHV-1 gC 상동체 유전자를 우두 바이러스 H6 프로모터의 조절하에 놓음으로써 수행되었다. EHV-1 gD 당단백질의 발현은 EHV-1 gD 상동체 유전자를 엔토모폭스 바이러스 42K 유전자 프로모터의 조절하에 놓음으로써 수행되었다.
vP 1025(ATI 유전자좌에 gB 및 gC; HA 유전자좌에 gD)의 제조
도너 플라스미드 pJCA 042의 제조
EHV-1 gB 코딩서열의 430 bp 5'-대부분 부위는 주형으로서 플라스미드 pJCA 011 (ATI 유전자좌에 카세트 H6-EHV-1 gB) 및 올리고뉴클레오티드 JCA 156 (SEQ ID NO: 223)(5'-ATGTCCTCTGGTTGCCGTTCT-3') 및 JCA 157 (SEQ ID NO: 224) (5'-GACGG-TGGATCCGGTAGGCGG-3')를 이용하여 PCR- 유도되고,BamHI으로 분해되고, 키나제 처리되었다. 이 430bp 단편을 주형으로 플라스미드 pMP 691(I3L101RAB) 및 올리고뉴클레오티드 JCA 158 (SEQ ID NO: 225) (5'-TTTTTCTAGACTGCAGCCCGGGACA-TCATGCAGTGGTTAAAC-3') 및 MP 287 (SEQ ID NO: 226)(5'-GATTAAACCTAAATAATTGT-3')을 이용하여 얻어진 I3L 프로모터 요소를 포함하는 120bp PCR-유도된 단편에 융합시켰다. 이 120bp 단편을XbaI으로 분해시키고 EHV-1 gB 단편의 430bp 5'-대부분 부위와 결합되기 전에 키나제 처리되었다. 결과적인 플라스미드를 pJCA 034로 나타냈다. I3L 프로모터의 서열, 접합부 I3L-ATG의 서열 및 EHV-1 5'-대부분 부위의 서열은 pJCA 034의 직접적인 서열 결정에 의해 확인되었다. 플라스미드 pJCA 034를SmaI 및BamHI으로 분해하여 550bpSmaI - I3L-EHV-1 gB 5'-BamHI 단편(A)를 절단하였다. 플라스미드 pMP 665(COPCS 시스템의 카세트 H6-EHV-1 gB)를BamHI 및XhoI으로 분해하여 2530bpBamHI-EHV-1 gB 3' 단편(B)를 절단하였다. 그 다음 단편 A와 B를SmaI 및XhoI으로 분해된 벡터 pSD 541VC (ATI 탈-ORF 된 유전자좌) 속에 결합시켜서 pJCA 037을 생성하였다. 플라스미드 pJCA 037은 ATI 탈-ORF된 유전자좌에 카세트 I3L-EHV-1 gB를 포함하는 도너 플라스미드이다. 플라스미드 pJCA 037을SmaI 및XhoI으로 분해시켜서 3050bpSmaI -I3L-EHV1 gB-XhoI 단편(C)를 분리하였다. 225bpKpnI- EHV-1 gC 3'말단 제거된-HindIII 단편이 플라스미드 pVHAH6g13 (HA 탈 ORF 된 유전자좌내의 카세트 H6-EHV-1 gC) 및 올리고뉴클레오티드 JCA 154 (SEQ ID NO: 227)(5'-TATAGCTGCATAATAGAG-3') 및 JCA 163 (SEQ ID NO: 228)(5'-AATTAAGCTTGATATCACAAAAACTAAAAAGTCAGACTTCTTG-3')을 이용하여 PCR- 유도되고,KpnI 및HindIII로 분해되고,KpnI 및HindIII로 분해된 벡터 pBS - SK+속에 결합시켜서 pJCA 033을 생성하였다. 클로닝된 PCR 단편의 서열은 pJCA 033의 직접적인 서열 결정에 의해 확인되었다. 플라스미드 pJCA 033을KpnI 및EcoRV로 분해시키고 220 bpKpnI-EHV-1 gC 3'말단-EcoRV 단편 (D)을 분리하였다. 플라스미드 pVHAH6g13을BgℓII 및KpnI으로 분해하고 1330 bpBgℓII-H6-EHV-1 gC 5'-KpnI 단편(E)을 분리하였다.
단편 C, D 및 E를 최종적으로BgℓII 및XhoI으로 분해된 벡터 pSD541VC 속에 함께 결합시켜서 플라스미드 pJCA 042를 생성하였다. 플라스미드 pJCA 042는 NYVAC ATI 탈-ORF된 유전자좌에 I3L-EHV-1 gB - - H6-EHV-1 gC 이중 구조체를 삽입하는 도너 플라스미드이다. 플라스미드 pJCA 042는 IVR 전에NotI을 이용하여 선형화되었다.
생체외 재조합 실험은 레스큐 바이러스로서 vP 866(NYVAC) 및 도너 플라스미스로서 pJCA 042를 이용하여 VERO 세포상에서 수행되었다. 재조합 바이러스를 확인하고 정제하는데 표준 프로토콜을 이용하였다(Piccini등, 1987). ATI-탈-ORF된 유전자좌에 EHV-1 gB 및 gC 유전자를 포함하는 NYVAC-기초 재조합체를 vP 956으로 나타냈다.
도너 플라스미드 pJCA 064의 생성
플라스미드 pEHV1BamHID (EHV-1BamHI D 단편을 포함)를HindIII로 분해시켜서 15 5'-대부분 bp를 제외한 전체의 EHV-1 gD 코딩 서열을 포함하는 1240bpHindIII-HindIII를 절단하였다. 1240bpHindIII -HindIII 단편을 클리나우 중합효소로 블런트-말단화시키고SmaI으로 분해된 벡터 pCOPCS657속에 결합시키고 포스파타제 처리하였다. 결과적인 플라스미드를 pJCA 006으로 나타냈다. 플라스미드 pJCA 006을BgℓII 및HindIII로 분해하여 1500bpHindIII - H6-EHV-1gD-BgℓII 단편을 절단하였다. 이 단편을BamHI 및HindIII로 분해된 벡터 PIBI24 속에 결합하여 플라스미드 pEHV1gp50a를 생성하였다. 플라스미드 pEHV1gp50a를 둘다 특유한 위치인EcoRV 및NcoI으로 분해하여 4100bp단편을 절단하였다. 이 단편은 올리고뉴클레오티드 JCA 052 (SEQ ID
사이의 혼성화에 의해 얻어진 합성 이중가닥 올리고뉴클레오티드와 결합되었다. 결과적인 플라스미드는 pgp50a3-2로서 나타냈다. 490bpEcoRI-EHV-1 gD 3' 말단 제거된 -HpaI은 주형으로서 플라스미드 pJCA 006 및
를 이용하여 PCR-유도되었다. 플라스미드 pgp50a3-2를EcoRI으로 분해시키고HindIII로 부분 분해시켜서 850bpHindIII-H6-EHV-1 gD 5'-EcoRI 단편을 절단하였다. 이 단편을 490bpEcoRI-HpaI 단편과HindIII 및SmaI으로 분해된 벡터 pBS-SK+속에 결합시켜서 플라스미드 pJCA 020을 생성하였다. 플라스미드 pJCA 020은 카세트 H6-EHV-1 gD를 포함한다.
EHV-1 gD 코딩서열의 720bp 5'-대부분 부위는 주형으로 플라스미드 pJCA 020 및 올리고뉴클레오티드 JCA 044 (SEQ ID NO: 233) (5'-CTCTATGACCTCATCCAC-3') 및 JCA 165 (SEQ ID NO: 234)(5'-ATGTCTACCTTCAAGCTTATG-3')을 이용하여 PCR-유도되었다. 이 단편을EcoRI으로 분해하고 키나제 처리하였다. 107bp 42K 프로모터 요소는 주형으로 플라스미드 pAM 12 및 올리고뉴클레오티드 RG286(SEQ ID NO: 235)(5'-TTTATATTGTAATTATA-3') 및 JCA 164( SEQ ID NO: 236)(5'-TTTGGATCCGTTAACTC-AAAAAAATAAATG-3')을 이용하여 PCR-유도되었다. 이 단편을BamHI으로 분해하고, 키나제 처리하고, 720bp ATG-EHV-1 gD 5'-EcoRI 단편과BamHI 및EcoRI으로 분해된 벡터 pBS-SK+속에 결합시켜서 플라스미드 pJCA 035 생성하였다. 42K 프로모터의 서열, 접합부 42K - EHV-1 gD의 서열 및 EHV-1 gD 5' 부분의 서열은 pJCA 035의 직접적인 서열결정에 의해 확인되었다.
플라스미드 pJCA 035를BamHI 및EcoRI으로 분해하여 830bpBamHI -42K-EHV-1 gD 5'부분-EcoRI 단편(F)를 분리하였다. 플라스미드 pJCA 020을EcoRI 및XbaI으로 분해하고 500 bpEcoRI - EHV-1 gD 3' 말단 제거된-XbaI 단편(G)를 분리하였다. 그 다음 단편 F및 G를 함께BamHI 및XbaI으로 분해된 벡터 pBS-SK+속에 결합시켜서 플라스미드 pJCA 038을 생성하였다. 플라스미드 pJCA 038은 벡터 pBS-SK+속에 카세트 42K-EHV-1 gD를 포함하고 있다. 플라스미드 pJCA 038을BamHI 및 HpaI으로 분해하고 1340bpHpaI- 42K-EHV-1 gDBamHI 단편을 분리하였다. 이 단편을BamHI 및SmaI으로 분해된 플라스미드 pSD544(HA 탈 ORF된 유전자좌) 속에 결합시켜서 플라스미드 pJCA 064를 생성하였다. 플라스미드 pJCA 064는 NYVAC HA 탈 ORF된 유전자좌 속으로 카세트 42K-EHV-1 gD를 삽입시키기 위한 도너 플라스미드이다. 플라스미드 pJCA 064는 IVR전에NotI을 이용하여 선형화되었다.
생체외 실험은 도너 플라스미드로서 pJCA 064 및 레스큐바이러스로서 재조합 우두 바이러스 vP956 (NYVAC 백그라운드)를 이용하여 VERO 세포에서 수행되었다. 이것은 표준 방법으로 수행되었다(Piccini등, 1987). ATI-탈-ORF된 유전자좌에 EHV-1 gB 및 gC 유전자 및 HA 탈 ORF된 유전자좌에 EHV-1 gD 유전자를 포함하는 NYVAC-기초 재조합체를 vP 1025로서 나타냈다.
도너 플라스미드 pJCA 043의 생성
220 bpHindIII-EHV-1 gB 3'-대부분 부위는 플라스미드 pJCA 011 및 올리고뉴클레오티드 JCA 159 (SEQ ID NO: 237)(5'-AGGCCAAGCTTGAAGAGGCTC-3') 및 JCA 160 (SEQ ID NO: 238)(5'-AAAGGATCCGTTAACACAAAAATTAAACCATTTTTTCATT-3')을 이용하여 PCR-유도되었다. 이 단편을BamHI 및HindIII로 분해시키고,BamHI 및HindIII로 분해된 벡터 pBS- SK+속에 결합시켜서 플라스미드 pJCA 036을 생성하였다. EHV-1 gB 3'-대부분 부위 PCR 단편의 서열은 pJCA 036의 직접적인 서열 결정에 의해 확인되었다.
플라스미드 pJCA 033을EcoRV 및KpnI으로 분해시키고KpnI-EHV-1 gC 3'-대부분 부위-EcoRV 단편(H)를 분리하였다. 플라스미드 pJCA 038을BamHI 및HpaI으로 분해시키고 1360bpHpaI-42K-EHV-1 gD-BamHI 단편(I)을 분리하였다. 플라스미드 pVHAH6g13을KpnI 및XhoI으로 분해시키고 900bpXhoI-EHV-1 gC 중심부분-KpnI 단편(J)을 분리하였다. 그 다음 단편 H,I 및 J를 함께BamHI 및XhoI으로 분해된 벡터 pBS-SK+속에 결합시켜서 플라스미드 pJCA 041을 생성하였다.
플라스미드 pJCA 034를HindIII 및XhoI으로 분해시켜서 5900bp 선형화된 벡터XhoI-pBS- SK+-I3L- EHV-1 gBHindIII 단편(K)를 분리하였다. 플라스미드 pJCA 036을BamHI 및HindIII로 분해시켜서 220bpHindIII-EHV-1 gB 3 --대부분 부위-BamHI 단편(L)을 분리하였다. 플라스미드 pVHAH6g13을BaℓII 및XhoI으로 분해시켜서 440bpBaℓII-H6-EHV-1gC 5' 부분-XhoI 단편(M)을 분리하였다. 그 다음 단편 K,L 및 M을 함께 결합시켜서 플라스미드 pJCA040을 생성하였다.
플라스미드 pJCA 040를SmaI 및XhoI으로 분해시켜서 3550bpSmaI-I3L-EHV-1gB -- H6-EHV-1 gC 5' 부분-XhoI 단편(N)을 분리하였다. 플라스미드 pJCA 041을BamHI 및XhoI으로 분해시켜서 2460bpXhoI - EHV-1 gC 3'부분 -- 42K-EHV-1 gD-BamHI 단편(O)을 분리하였다. 최종적으로 단편 N 및 O를BgℓII 및SmaI으로 분해된 플라스미드 pSD541VC (NYVAC ATI-탈-ORF 된 유전자좌) 속에 함께 결합시켜서 플라스미드 pJCA 043을 생성하였다. 플라스미드 pJCA 043은 NYVAC ATI-탈-ORF된 유전자좌에 I3L-EHV-1 gB -- H6- EHV-1 gC--42K-EHV-1 gD 삼중 구조체를 삽입하기 위한 도너 플라스미드이다. 플라스미드 pJCA 043은 IVR전에NotI을 이용하여 선형화되었다.
생체외 실험은 도너 플라스미드로서 pJCA 043 및 레스큐 바이러스로서 vP866(NYVAC)를 이용하여 일차 병아리 배 피브로블라스트에서 수행되었다. 생성된 재조합체를 확인하고 정제하는데 표준방법을 이용하였다(Piccini등, 1987). ATI-탈-ORF된 유전자좌에 EHV-1 gB, gC 및 gD 유전자를 포함하는 NYVAC-기초 재조합체를 vP1043으로 나타냈다.
실시예 26
EHV-1 gB, gC 및 gD 당단백질 상동체를 발현하는 ALVAC-기초 재조합체의 제조.
도너 플라스미드 pJCA 049의 생성
플라스미드 pJCA 040을SmaI 및XhoI으로 분해하여 3550bpSmaI-I3L-EHV-1 gB--H6-EHV-1 gC 5' 부분-XhoI 단편(A)을 분리하였다. 플라스미드 pJCA 041을BamHI 및XhoI으로 분해시켜서 2460bpXhoI-EHV-1 gC 3'부분--42K-EHV-1 gD-BamHI 단편(B)을 분리하였다. 단편 A및 B를 함께BamHI 및SmaI으로 분해된 플라스미드 pSPVQC3L 속에 결합시켜서 플라스미드 pJCA 049를 생성하였다. 플라스미드 pJCA 049는 ALVAC C3-탈-ORF된 유전자좌에 I3L-EHV-1 gB-- H6-EHV-1 gC-- 42K-EHV-1 gD 삼중 구조체를 삽입하기 위한 도너 플라스미드이다. 플라스미드 pJCA 049를 IVR 전에NotI을 이용하여 선형화시켰다.
생체외 실험은 도너 플라스미드로서 pJCA 049 및 레스큐 바이러스로서 CPpp(ALVAC)를 이용하여 일차 병아리 배 피브로 블라스트에서 수행되었다. 생성된 재조합체를 확인하고 정제하는데 표준방법을 이용하였다(Piccini등, 1987). C3탈 ORF된 유전자좌에 EHV-1 gB, gC 및 gD 유전자를 포함하는 ALVAC-기초 재조합체를 vCP 132로 나타냈다.
실시예 27
NYVAC- 및 ALVAC- 기초 말(EQUINE) 헤르페스 바이러스 유형1 삼중 재조합체의 발현분석
면역형광검사는 EHV-1 gB(16G5 또는 3F6), EHV-1 gC(14H7) 및 EHV-1 gD(20C4)에 특이적인 모노클로날 항체를 이용하여 이전에 기술한 대로 수행되었다(Taylor 등, 1990). 모든 항-EHV-1 모노클로날 항체는 George Allen (Department of Veterinary Science, University of Kentucky, Lexington, Kentucky, 40546-0076)으로부터 얻었다. 모든 3 EHV-1 특이적인 산물의 발현은 vP1025, vP1043 또는 vCP132로 감염된 세포에서 내부적으로 검출할수 있었다. 단지 EHV-1 gC 당단백질은 감염세포의 표면에서 잘 발현되었다. EHV-1 gB 당단백질에 대한 표면발현은 훨씬 더 약하였고 EHV-1 gD 당단백질의 표면발현은 의심스러웠다.
면역침전은 발현된 EHV-1 gB, gC 및 gD 유전자산물의 확실성을 결정하기 위해 동일한 모노클로날 항체를 이용하여 행하여졌다. EHV-1 gB 당단백질에 대해 특이적인 모노클로날 3F6는 재조합 바이러스 vP956, vP1025, vP1043 또는 vCP132로 감염된 세포에서 유도된 용해물로부터 138 kDa, 70kDa 및 54kDa의 SDS-PAGE 겔 시스템에서의 겉보기 분자량을 갖는 단백질들을 침전시켰다. 미감염된 세포로부터 또는 어버이 바이러스(NYVAC 및 ALVAC) 감염된 세포로부터 유래된 용해물로부터는 어떤 단백질도 침전되지 않았다. EHV-1 gC 당단백질에 대해 특이적인 모노클로날 14H7은 vP956, vP1025 또는 vP1043으로 감염된 세포에서 유도된 용해물로부터 90kDa의 겉보기 분자량을 갖는 당단백질을 침전시켰다. 재조합체 vCP132에 의해 발현된 EHV-1 gC 당단백질은 재조합체 vP956, vP1025 또는 vP1043에 의해 발현된것 보다 다소 작은 (약 2kDa 더 작은) 겉보기 분자량을 가진다. EHV-1 gD 당단백질에 대해 특이적인 모노클로날 항체 20C4는 vP1025, vP1043 또는 vCP132로 감염된 세포로부터 유도된 용해물로부터 55kDa의 겉보기 분자량을 갖는 당단백질을 침전시켰다.
면역침전은 또한 G. Allen으로부터 얻은 토끼의 항-EHV-1 초면역 혈청을 이용하여 행하여졌다. 이 혈청은 vP1025, vP1043 또는 vCP132로 감염된 세포에서 유도된 용해물로부터의 모든 3EHV-1 산물들을 침전시켰다.
실시예 28
햄스터 공격 모델을 이용하여 얻은 보호데이타
공격실험(햄스터 모델)은 폭스바이러스 EHV-1 제조합체 vP956, vP1025 및 vCP132에 의해 유도되는 보호의 상대적인 정도를 평가하기 위하여 Rhone-Merieux (Lyon, France)에서 행하여 졌다. 햄스터를 EHV-1 재조합체의 다양한 희석물로 0일경에 백신접종하고 14일경에 추가 항원 자극하였다. 모든 면역화된 컨트롤 동물을 햄스터-적응된 EHV-1 공격균주로 28일경에 공격하였다. 죽은 동물들의 최종 카운트는 35일경(공격후 7일경)에 행하여졌다. 공격실험의 결과는 표30에서 보여진다.
실시예 29
개에서의 면역연구의 지속
본 연구의 목적은 ALVAC-RG(vCP65)로 단일 접종한후 개에서 보호면역 반응이 얼마동안 유지되는지를 결정하는 것이었다. 항-광견병 항체가 없는 8개월된 41 비글개를 ALVAC-RG의 6.7 log10TCID50의 일 투여량으로 피하경로로 접종하였다. 개를 백신접종 0일 및 백신접종후 1, 2, 3, 6 및 12개월경에 사혈하고 RFFI 테스트를 이용하여 항-광견병 항체의 존재에 대해 혈청을 검사하였다. 백신접종의 부작용에 대해서 모든 동물을 검사하였다.
백신접종후 6개월경에 광견병 바이러스의 병원성 NYGS 균주의 근육내 접종에의하여 5개를 공격하였다. 동물들은 측두근육에서 103.450% 마우스 치사 투여량을 수용하였다. 3 미접종된 컨트롤 동물은 동일한 접종물을 수용하였다. 11 백신접종된 개들 및 3 비-백신접종된 컨트롤 개들의 두번째 그룹이 백신접종후 12개월경에 동일한 방법으로 공격되었다. 6개월 및 12개월경의 혈청학적결과 및 공격결과가 하기의 표 31에서 보여진다.
ALVAC-RG(vCP65)로 백신접종된 개들중 어느것도 백신접종에 반대되는 반응을 나타내지 않았다. ALVAC-RG(vCP65)로 백신접종된 모든 개들이 백신접종후 7일경에 광견병 바이러스 중화 항체의 유도를 나타냈다. 백신접종후 14일과 28일 사이에 최대역가에 도달하였고 그후 역가가 감소하였다. 백신 접종후 6 또는 12개월경의 공격시에는 역가가 낮았고, 어떤 동물에서는 제로에 가까왔다. 낮은 역가에도 불구하고, 백신접종되지 않은 컨트롤 개들이 죽은 치사 광견병 공격에 모든 동물들이 생존하였다. 백신접종후 6개월경의 공격에 생존한 동물의 RFFI 역가는 8개월경(공격후 2개월)에 평가하였다. 이 동물들의 혈청 역가는 7.4, 7.4, 2.3, 1.8 및 7.4 국제단위였다. 광견병 중화항체의 이러한 상승된 그리고 유지된 수준은 동물들이 초기의 단일접종에 의해 효율적으로 준비된다는 것을 나타낸다. 실험이 계속 진행되어 남아있는 동물들은 백신접종후 2 또는 3년경에 공격될 것이다; 그러나 현재까지 실험이 성공적이고 본발명의 유용성을 예시하고 있다.
실시예 30
NYVAC에서의 소 헤르페스 바이러스 유형1 BHV1 유전자의 발현
NYVAC/BHV1 gIV 재조합체의 생성
플라스미드 pBHVgIV는 Rhone Merieux로부터 얻었다. 이 플라스미드는 pBS- SK+의PstI 위치속에 클로닝된, 3.9 kbPstI 단편 상에 암호화된 BHV1 gIV 유전자 (Straub 균주)를 포함한다. 이 플라스미드의 gIV 유전자 (Tikoo등, J.ViroE (1990)64: 5132)는 우두 바이러스 측면부 암사이에 클로닝되었다. 이것은 gIV 유전자를 포함하는 pBHVgIV의 2,000bpPstI -XhoI 단편을 pSD542(실시예32에서 정의됨)의PstI -XhoI 위치속에 클로닝 함으로써 수행되었다. 이러한 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pBHV1이라고 하였다. 그 다음 π프로모터의 3'-말단을 gIV 유전자의 윗쪽에 클로닝하였다. 이것은 π프로모터의 3'-말단과 gIV 유전자의 5'-말단을 암호화하는 올리고뉴클레오티드
를 pBHV1의 5,500bpSstI -XhoI 부분 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이러한 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pBHV3으로 나타냈다.
그다음 외래의 3'-비코딩서열을 제거하였다. 이것은 올리고뉴클레오티드 BHVL5 (SEQ ID NO: 241)(5'-GGGTGACTGCA-3'및 BHVL6(SEQ ID NO:242)(5'-GTCACCC-3')를 pBHV3의 5,200pbSmaI -PstI 부분 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이러한 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pBHV4로 나타냈다.
그 다음 외래의 링커서열을 제거하였다. 이것은 pBHV4의 5,200bpPstI 단편을 결합시켜서 수행되었다. 이러한 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pBHV5로 나타냈다.
그 다음 π프로모터의 5'-말단이 pBHV5속에 클로닝되었다.
이것은 π프로모터의 5'-말단을 포함하는 pPI4의 130bpAf1II-XhoI 단편을 pBHV5의 5,200bpAf1II -XhoI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이러한 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pBHV6로 나타냈다. 레스큐 바이러스로서 vP866(NYVAC)와 생체외 재조합 실험에 pBHV6를 이용하여 vP1051을 생성하였다.
vP1051이 확실한 BHV1 gIV 당단백질을 발현하는지를 결정하기 위해 면역침전 분석을 수행하였다. VERO세포 단일층을 모노감염시키고, 10 PFU/ 세포의 m.o.i.로 vP1051로 감염시키고 또는 NYVAC로 감염시켰다. 1시간 흡착기간후에 접종물을 흡출하고 세포를 2% 태아소 혈청 및 [35S]-메티오닌(20 μCi/mℓ)을 포함하는 변형된 이글 배지(-메티오닌) 2mℓ로 덮었다. 감염 7시간후에 1mℓ의 3 X 완충액A (3% NP-40, 30mM Tris(pH 7.4), 3mM EDTA, 0.03% Na 아지드 및 0.6 mg/mℓ PMSF) 및 50mℓ 아프로티닌을 첨가하고 세포 단일층을 긁어내서 세포를 수거하였다.
그 다음 BHV1 gIV-특이적인 모노클로날 항체 3402 (Dr. Geoffrey Letchworth, U. of Wisconsin,Madison, WI로부터 얻음)를 이용하여 BHV1 gIV 발현에 대해 용해물을 분석하였다. 이것은 하기의 방법에 의해 수행하였다: 마우스(rat) 항-마우스 혈청이 4시간동안 실온에서 단백질-A세파로스에 결합되었다. 이 물질을 1X 완충액A로 5X 세척한후에, 단백질 A-세파로스 결합된 마우스 항-마우스 항체를 gIV-특이적인 모노클로날 항체 3402에 결합시켰다. 그 동안에 용해물은 정상 마우스 혈청 및 단백질 A-세파로스 결합된 마우스 항-마우스 항체를 4℃에서 하룻밤동안 배양함으로써 미리 정화되었다. 이 물질을 1X 완충액A로 5X 세척한후에, BHV1 gIV-특이적인 모노클로날 항체, 마우스 항-마우스, 단백질 A-세파로스 결합체를 용해물에 첨가하고 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 샘플을 1X 완충액A로 4X 그리고 LiCℓ2/요소 완충액으로 2X 세척한후, 침전된 단백질이 2X Laemmli 완충액(125 mM Tris(pH 6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-메트캅토에탄올)의 첨가 및 5분 동안의 비등에 의해 면역 복합체로부터 분리되었다. 그 다음 10% Dreyfuss 겔시스템(Dreyfuss 등, 1984)에서 단백질들이 분리되고, 고정되고 형광사진법을 위해 1M Na-살리실산염으로 처리되었다.
BHV1 gIV-특이적인 모노클로날 항체 3402는 특이적으로 vP1051 감염세포로부터 BHV1 gIV 당단백질을 침전시키지만, NYVAC 또는 모의감염된 세포로부터 BHV1-특이적인 단백질을 침전시키지 않았다.
NYVAC/BHV1 gI 및 gIV 재조합체의 생성
BHV1 gIV 유전자를 포함하는 플라스미드 pBHVgIV는 Rhone Merieux에서 얻어졌다. 이 플라스미드의 gIV 유전자는 우두 바이러스 측면부 암사이에 클로닝되었다. 이것은 gIV 유전자를 포함하는 pBHVgIV의 2,000bpPstI-XhoI 단편을 pSD542의PstI-XhoI 위치속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV1으로 나타냈다.
그 다음 π프로모터의 3'-말단이 gIV 유전자의 윗쪽에 클로닝되었다. 이것은 π프로모터의 3'-말단과 gIV 유전자의 5'-말단을 암호화하는 올리고뉴클레오티드 BHVL7 (SEQ ID NO: 239)및 BHVL8 (SEQ ID NO: 240)을 pBHV1의 5,500bpSstII-XhoI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드를 pBHV3으로 나타냈다.
그 다음 외래의 3'-비코딩 서열을 제거하였다. 이것은 올리고뉴클레오티드 BHVL5(SEQ ID NO: 241) 및 BHVL6 (SEQ ID NO: 242)을 pBHV3을 5,200bpSmaI-PstI 부분단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV4이다.
그 다음 외래의 링커서열이 제거되었다. 이것은 pBHV4의 5,200bpPstI 단편을 결합시켜서 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV5이다.
그 다음 π프로모터의 5'-말단은 pBHV5 속에 클로닝되었다. 이것은 π프로모터의 5'-말단을 포함하는 pP14의 130bpAf1II-XhoI 단편을 pBHV5의 5,200bpAf1II-XhoI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV6이다.
그 다음 BHV1 gI 유전자가 pBHV6속에 클로닝되었다. 이것은 H6-프로모터 구동되는 gI 유전자를 포함하는 pBHV8의 2,900bpBgℓII 단편을 pBHV6의BgℓII 위치속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV9이다.
pBHV8은 하기의 방법에의하여 생성되었다: 플라스미드 PIBRS6는 Rhone Merieux로부터 얻었다. 플라스미드는 BHV1 gI 유전자를 포함하는 6.6 kbSaℓI 단편을 포함한다(Straub 균주). gI 유전자의 5'-말단(Whitbeck 등, J. Virol. (1988)62: 3319)이 H6 프로모터의 아랫쪽에 및 우두 바이러스 HA 측면부 암사이에 클로닝되었다. 이것은 pIBRS6의 540bpSaℓI-PstI 단편을 pGD5의 4,400bpSaℓI-PstI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pIBR2이다.
그 다음 H6 프로모터의 개시코돈이 gI 유전자의 개시코돈과 정렬되었다. 이것은 올리고뉴클레오티드 IBRL1 (SEQ ID
을 pIBR2의 3,800bpNruI-SstII 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성되는 플라스미드는 pIBR4이다.
그 다음에는 앞으로의 조작을 위해 필요한NcoI 위치는 gI 서열로부터 아랫쪽에 생성되었다. 이것은 올리고뉴클레오티드 IBRL3(SEQ ID NO:245) (5'-CCAT-GGTTTAATGCA-3') 및 IBRL4(SEQ ID NO:246) (5'-TTAAACCATGGTGCA-3')을 pIBR4의PstI 위치속으로 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pIBR5이다.
그 다음 추가의 gI 서열이 pIBR5속에 클로닝되었다. 이것은 pIBRS6의 1,740bpTth111I-NcoI 단편을 pIBR5의 3,700bpTth111I-NcoI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pIBR7 이다.
그 다음 앞으로의 조작을 위해 필요한BgℓII 위치는 gI 서열로부터 아랫쪽에 생성되었다. 이것은 올리고뉴클레오티드 IBRL5 (SEQ ID NO:247)(5'-CATGGTTT-AAGATCTC-3') 및 IBRL6 (SEQ ID NO:248)(5'-CATGGAGATCTTAAAC-3')을 pIBR7의NcoI 위치속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pIBR8이다.
그 다음 gI 유전자의 3'-말단이 pIBR8속으로 클로닝되었다. 이것은 pIBRS6의 2,285bpStuI 단편을 pIBR8의 E.coli DNA 중합효소 I (클리나우 단편) 채워진 4,300bpStuI-BgℓII (부분) 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pIBR20이다.
그 다음 H6-프로모터 구동되는 BHV1 g1 유전자를 우두 바이러스 도너 플라스미드로 이동시켰다. 이것은 pIBR20의 E. coli DNA 중합효소 I (클리나우 단편) 채워진 2,900bpBgℓII-NcoI (부분) 단편을 pSD542의SmaI 위치속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이것은 H6-프로모터 구동되는 gI 유전자를 tk 측면부 암 사이에 위치시켰다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pIBR22이다.
그 다음BgℓII 위치가 H6 프로모터로부터 윗쪽에 생성되었다. 이것은 pIBR22의 2,800bpHindIII-EcoRV 단편을 pGD3의 3,500bpHindIII-EcoRV 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다(pGD3은 H6-프로모터 구동되는 헤르페스 심플렉스 바이러스 유형2(HSV2) gD 유전자의 윗쪽에BgℓII 위치를 포함하는 플라스미드이다. 이러한 조작은 HSV2 gD 서열을 BHVIgI 유전자로 대체하고, 이로 인하여 H6-프로모터 구동되는 gI 유전자의 윗쪽에BgℓII 위치를 생성한다). 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV8이다.
레스큐 바이러스로서 vP866(NYVAC)과의 생체외 재조합 실험에서 pBHV9가 이용되어 vP1074가 생성되었다.
vP1074가 확실한 BHV1 gI 및 gIV 당단백질을 발현하는지를 결정하기 위해 면역침전 분석을 수행하였다. VERO세포 단일층을 모의감염시키고, 10 PFU/세포의 m.o.i.로 vP1074로 감염시키고 또는 NYVAC로 감염시켰다. 1시간 흡착기간 후에, 접종물을 흡출하고 세포를 2% 태아소의 혈청 및 [35S]-메티오닌(20 μCi/mℓ)을 포함하는 변형 이글배지(-메티오닌) 2mℓ로 덮었다. 감염 7시간후에 1 mℓ 3X 완충액 A (3% NP-40, 30mM Tris(pH 7.4), 3mM EDTA, 0.03% Na 아지드, 0.6 mg/mℓ(PMSF) 및 50mℓ 아프로티닌을 첨가하고 세포 단일층을 긁어내서 세포를 수거하였다.
BHV1 gI-특이적인 모노클로날 항체 5106 및 gIV-특이적인 모노클로날 항체 3402 (Dr. Geoffrey Letchworth, U. of Wisconsin, Madison, WI로부터 얻어짐)를 이용하여 BHV1 gI 및 gIV 발현에 대해 용해물을 분석하였다. 이것은 하기의 과정에 의해 수행되었다: 마우스(rat) 항-마우스 혈청을 4시간동안 실온에서 단백질-A 세파로스에 결합시켰다. 이 물질을 1X 완충액 A로 5X 세척한 후에, 단백질 A-세파로스 결합된 마우스 항-마우스 항체를 gI-특이적인 모노클로날 항체 및 gIV-특이적인 모노클로날 항체에 결합시켰다. 그 동안에 용해물이 정상 마우스혈청 및 단백질 A-세파로스 결합된 마우스 항-마우스 항체를 4℃에서 하룻밤동안 배양함으로써 미리 정화되었다. 이 물질을 1X 완충액A로 5X 세척한후, gI 또는 gIV-특이적인 모노클로날 항체, 마우스 항-마우스, 단백질A-세파로스 결합체를 용해물에 첨가하고 4℃에서하룻밤동안 배양하였다. 샘플을 1X 완충액 A로 4X 그리고 LiCℓ2/요소 완충액으로 2X 세척한후, 침전된 단백질을 면역 복합체로부터 2X Laemmli 완충액(125 mM Tris (pH 6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-메르캅토에탄올)을 첨가하고 5분동안 비등시켜서 분리시켰다.
그 다음 단백질을 10% Dreyfuss 겔 시스템(Dreyfuss 등, 1984)에서 분리시키고, 고정시키고, 형광사진법을 위하여 1M Na-살리실산염으로 처리하였다.
BHV1 gI 및 gIV-특이적인 모노클로날 항체 5106과 3402는 특이적으로 vP1074 감염된 세포로부터 BHV1 gI 및 gIV 당단백질을 침전시켰지만, 모의 또는 NYVAC 감염된 세포로부터 BHV1-특이적인 단백질을 침전시키지는 않았다.
NYVAC/BHV1 gIII 재조합체의 생성
플라스미드 pBHVgIII은 Phone Merieux로부터 얻어졌다.
이 플라스미드는 pBSK+의BamHI/HindIII 위치속에 클로닝된 3.4kbBamHI/indIII 단편상에 암호화된 BHV1 gIII 유전자(Straub 균주)를 포함한다. 이 플라스미드의 gIII 유전자(Fitzpatrick등, Virology (1989)173: 146)는 우두 바이러스 측면부 암 사이에 클로닝되었다. 이것은 gIII 유전자의 5'-말단을 포함하는 pBHVgIII의 1,000bpNcoI-XhoI 단편, 및 I3L 프로모터를 암호화하는 올리고뉴클레오티드 BHVL1 (SEQ ID NO: 249) (5'-GATCCTGAGAT
을 pSD544의BamHI-XhoI 위치속에 클로닝시킴으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV2이다.
그 다음 gIII 유전자의 3'-말단이 pBHV2 속으로 클로닝되었다. 이것은 gIII 유전자의 3'-말단을 암호화하는 올리고뉴클레오티드,
를 pBHV2의 4,700bpXhoI-Asp718 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV7이다.
그 다음 gIII 유전자의 나머지가 pBHV7 속으로 클로닝되었다. 이것은 gIII 유전자의 안쪽부분을 포함하는 pBHVgIII의 500bpSmaI-XhoI 부분 단편을 pBHV7의 4,750bpSmaI-XhoI 부분 단편속으로 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드가 pBHV10 이다.
레스큐 바이러스로서 vP866 (NYVAC)과의 생체외 재조합 실험에 pBHV10을 이용하여 vP1073이 생성되었다.
vP1073이 확실한 BHV1 gIII 당단백질을 발현하는지를 결정하기 위하여 면역 침전분석을 수행하였다. VERO세포 단일층을 모의감염시키고, 10 PFU/세포의 m.o.i.로 vP1073으로 감염시키고 또는 NYVAC로 감염시켰다. 1시간 흡착기간후에 접종물을 흡출하고 세포를 2% 태아 소혈청 및 [35S]-메티오닌(20 μCi/mℓ)을 포함하는 변형 이글배지(-메티오닌) 2mℓ로 덮었다. 감염 7시간후 1mℓ 3X 완충액 A (3% NP-40, 30mM Tris(pH 7.4), 3mM EDTA, 0.03% Na 아지드 및 0.6 mg/mℓ PMSF) 및 50mℓ 아프로티닌을 첨가하고 세포단일층을 긁어내서 세포를 수거하였다.
그 다음 BHV1 gIII-특이적인 모노클로날 항체 1507 (Dr. Geoffrey Letchworth, U. of Wisconsin,Madison, WI로부터 얻음)를 이용하여 BHV1 gIII 발현에 대해 용해물을 분석하였다. 이것은 하기의 과정에 의하여 수행되었다: 마우스(rat) 항-마우스 혈청을 4시간동안 실온에서 단백질-A 세파로스에 결합시켰다. 이 물질을 1X 완충액 A로 5X 세척한 후에, 단백질 A-세파로스 결합된 마우스 항-마우스 항체를 gIII-특이적인 모노클로날 항체 1507에 결합시켰다. 그 동안에 용해물이 정상 마우스 혈청 및 단백질 A-세파로스 결합된 마우스 항-마우스 항체를 4℃에서 하룻밤동안 배양함으로써 미리 정화되었다. 이 물질을 1X 완충액 A로 5X 세척한후에, gIII-특이적인 모노클로날 항체, 마우스 항-마우스, 단백질A-세파로스 결합체를 용해물에 첨가하고 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 샘플을 1X 완충액 A로 4X 그리고 LiCℓ2/요소 완충액으로 2X 세척한후, 침전된 단백질은 2X Laemmli 완충액 (125 mM Tris(pH 6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-메르캅토에탄올)을 첨가하고 5분간 가열하여 면역 복합체로부터 분리되었다. 그 다음 단백질은 10% Dreyfuss 겔 시스템(Dreyfuss 등, 1984)에서 분리하고, 고정되고 형광사진법을 위해 1M Na-살리실염으로 처리되었다.
BHV1 gIII-특이적인 모노클로날 항체 1507은 특이적으로 vP1073 감염된 세포로부터 BHV1 gIII 당단백질을 침전시켰지만, 모의 또는 NYVAC 감염된 세포로부터 BHV1-특이적인 단백질을 침전시키지는 않았다.
NYVAC/BHV1 gIII 및 gIV 재조합체의 생성
BHV1 gIV 유전자를 포함하는 플라스미드는 Rhone Merieux로부터 얻어졌다. 이 플라스미드의 gIV 유전자는 우두 바이러스 측면부 암 사이에 클로닝되었다. 이것은 gIV 유전자를 포함하는 pBHVgIV의 2,000bp PstI-XhoI 단편을 pSD542의PstI-XhoI 위치속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV1이다.
그 다음 π프로모터의 3'-말단이 gIV 유전자의 윗쪽에 클로닝되었다. 이것은 π프로모터의 3'-말단과 gIV 유전자의 5'-말단을 암호화하는 올리고뉴클레오티드 BHVL7 (SEQ ID NO: 239)및 BHVL8 (SEQ ID NO: 240)을 pBHV1의 5,500bpSstII-XhoI 부분 단편속으로 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV3이다.
그 다음 외래의 3'-비코딩서열을 제거하였다. 이것은 올리고뉴클레오티드 BHVL5 (SEQ ID NO: 241) 및 BHVL6 (SEQ ID NO: 242)를 pBHV3의 5,200bpSmaI-PstI 부분 단편속으로 클로닝함으로써 수행되었다. 이러한 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV4이다.
그 다음 외래의 링커서열을 제거하였다. 이것은 pBHV4의 5,200bpPstI 단편을 결합시켜서 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV5이다.
그 다음 π프로모터의 5'-말단이 pBHV5 속으로 클로닝되었다. 이것은 π프로모터의 5'-말단을 포함하는 pPI4의 130bpAfℓⅡ-XhoI 단편을 pBHV5의 5,200bpAf1II-XhoI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV6이다.
그 다음에는 BHV1 gIII 유전자를 pBHV6속에 클로닝하였다. 이것은 I3L-프로모터 구동되는 gIII 유전자를 포함하는 pBHV10의 1,600bpAsp718-BamHI 단편을 pBHV6의 5,300bpBamHI-Asp718 부분 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV11 이다.
레스큐 바이러스로서 vP866(NYVAC)와의 생체외 재조합 실험에서 pBHV11을 이용하여 vP1083을 생성하였다.
vP1083이 확실한 BHV1 gIII 및 gIV 당단백질을 발현하는지를 결정하기 위하여 면역침전 분석을 행하였다. VERO세포 단일층을 모의감염시키고, 10 PFU/세포의 m.o.i.로 vP1083으로 감염시키고 또는 NYVAC로 감염시켰다. 1시간 흡착기간후 접종물을 흡출하고 세포를 2% 태아 소혈청 및 [35S]-메티오닌(20 μCi/mℓ)을 포함하는 변형된 이글 배지(-메티오닌) 2㎖로 덮었다. 감염 7시간후 1mℓ 3X 완충액A(3% NP-40, 30mM Tris(pH 7.4), 3mM EDTA, 0.03% Na 아지드 및 0.6 mg/mℓ PMSF)및 50mℓ 아프로티닌을 첨가하고 세포 단일층을 긁어내서 세포를 수거하였다.
그 다음 BHV1 gIII-특이적인 모노클로날 항체 1507 및 gIV-특이적인 모노클로날 항체 3402(Dr. Geoffrey Letchworth, U. of Wisconsin,Madison, WI로부터 얻음)를 이용하여 BHV1 gIV 발현에 대해서 용해물을 분석하였다. 이것은 하기의 과정에 의하여 수행되었다: 마우스(rat) 항-마우스 혈청을 4시간동안 실온에서 단백질-A 세파로스에 결합시켰다. 이 물질을 1X 완충액 A로 5X 세척한 후에 단백질 A-세파로스 결합된 마우스 항-마우스 항체를 gIII-특이적인 모노클로날 항체 및 gIV-특이적인 모노클로날 항체에 결합시켰다. 그 동안에 용해물이 정상 마우스 혈청 및 단백질 A-세파로스 결합된 마우스 항-마우스 항체를 4℃에서 하룻밤동안 배양함으로써 미리 정화되었다. 이 물질을 1X 완충액A로 5X 세척한후에 BHV1 gIII 또는 gIV-특이적인 모노클로날 항체, 마우스 항-마우스, 단백질 A-세파로스 결합체를 용해물에 첨가하고 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 샘플을 1X 완충액A로 4X 그리고 LiCℓ2/요소 완충액으로 2X 세척한 후에 침전된 단백질이 2X Laemmli 완충액(125 mM Tris (pH 6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-메르캅토에탄올)을 첨가하고 5분간 가열시켜서 면역복합체로부터 분리되었다. 그 다음 단백질이 10% Dreyfuss 겔 시스템(Dreyfuss 등, 1984)에서 분리되고, 고정되고 형광사진법을 위해 1M Na-살리실산염으로 처리되었다.
BHV1 gIII 및 gIV- 특이적인 모노클로날 항체 1507 및 3402는 특이적으로 vP 1083 감염세포로부터 BHV1 gIII 및 gIV 당단백질을 침전시키지만, 모의 또는 NYVAC 감염세포로부터 BHV1-특이적인 단백질을 침전시키지는 않았다.
NYVAC/BHV1 gI 및 gIII 재조합체의 생성
BHV1 gIII 유전자를 포함하는 플라스미드는 pBHVgIII는 Rhone Merieux로부터 얻어졌다. 이 플라스미드의 gIII 유전자가 우두 바이러스 측면부 암 사이에 클로닝되었다. 이것은 gIII 유전자의 5'-말단을 포함하는 pBHVgIII의 1,000bpNcoI-XhoI 단편 및 I3L 프로모터를 암호화하는 올리고뉴클레오티드 BHVL1 (SEQ ID NO:249) 및 BHVL2 (SEQ ID NO:250)을 pSD544VC의BamHI-XhoI 위치속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV2이다.
그 다음 gIII 유전자의 3'-말단이 pBHV2속으로 클로닝되었다. 이것은 gIII 유전자의 3'-말단을 암호화하는 올리고뉴클레오티드 BHVL15 (SEQ ID NO: 251) 및 BHVL16 (SEQ ID NO: 252)를 pBHV2의 4,700bpXhoI-Asp718 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV7이다.
그 다음 gIII 유전자의 나머지가 pBHV7속으로 클로닝되었다. 이것은 gIII 유전자의 안쪽 부분을 포함하는 pBHVgIII의 500bpSmaI-XhoI 부분 단편을 pBHV7의 4,750bpSmaI-XhoI 부분 단편속으로 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV10 이다.
그 다음 BHV1 gI 유전자가 pBHV10 속에 클로닝되었다. 이것은 H6-프로모터 구동되는 gI 유전자를 포함하는 pBHV8의 2,900bpBgℓII 단편을 pBHV10의BamHI 위치속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV12 이다.
레스큐 바이러스로서 vP866 (NYVAC)와의 생체외 재조합 실험에 pBHV12를 이용하여 vP1087을 생성하였다. vP1087이 확실한 BHV1 gI 및 gIII 당단백질을 발현하는지를 결정하기 위해 면역침전 분석을 행하였다. VERO세포 단일층을 모의감염시키고, 10 PFU/세포의 m.o.i.로 vP1087로 감염시키고 또는 NYVAC로 감염시켰다. 1시간 흡착기간후 접종물을 흡출시키고 세포를 2% 소 태아 혈청 및 [35S]- 메티오닌 (20 μCi/mℓ)을 포함하는 변형된 이글배지(-메티오닌) 2mℓ로 덮었다. 감염 7시간후 1 mℓ 3X 완충액 A(3% NP-40, 30mM Tris (pH 7.4), 3mM EDTA, 0.03% Na 아지드 및 0.6 mg/mℓ PMSF) 및 50mℓ 아프로티닌을 첨가하고 세포 단일층을 긁어내서 세포를 수거하였다. 그 다음 BHV1 gI- 특이적인 모노클로날 항체 5106 및 gIII-특이적인 모노클로날 항체 1507(Dr. Geoffrey Letchworth, U. of Wisconsin,Madison, WI로부터 얻음)를 이용하여 BHV1 gI 및 gIII 발현에 대해 용해물을 분석하였다. 이것은 하기의 과정에 의해 수행되었다: 마우스(rat) 항-마우스 혈청을 4시간동안 실온에서 단백질-A 세파로스에 결합시켰다. 이 물질을 1X 완충액A로 5X 세척한후에, 단백질 A-세파로스 결합된 마우스 항-마우스 항체를 gI-특이적인 모노클로날 항체 및 gIII-특이적인 모노클로날 항체에 결합시켰다. 이 동안에 용해물은 정상 마우스 혈청 및 단백질 A-세파로스 결합된 마우스 항-마우스 항체를 4℃에서 하룻밤동안 배양함으로써 미리 정화되었다. 이 물질을 1X 완충액 A로 5X 세척한 후에, BHV1 gI 또는 gIII-특이적인 모노클로날 항체, 마우스 항-마우스, 단백질 A-세파로스 결합체를 용해물에 첨가하고 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 샘플을 1X 완충액 A로 4X 그리고 LiCℓ2/요소 완충액으로 2X 세척한후, 침전된 단백질은 2X Laemmli 완충액(125 mM Tris(pH 6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-메트캅토에탄올)을 첨가하고 5분간 비등시킴으로써 면역복합체로부터 분리되었다. 그 다음 단백질이 10% Dreyfuss 겔 시스템(Dreyfuss 등, 1984)에서 분리되었고, 고정되고 형광사진법을 위해 1M Na-살리실산염으로 처리되었다.
BHV1 gI 및 gIII-특이적인 모노클로날 항체 5106 및 1507은 특이적으로 vP1087 감염세포로부터 BHV1 gI 및 gIII 당단백질을 침전시켰지만, 모의 또는 NYVAC 감염세포로부터 BHV1-특이적인 단백질을 침전시키지는 않았다.
NYVAC/BHV1 gI, gIII 및 gIV 재조합체의 생성
BHV1 gIV 유전자를 포함하는 플라스미드 pBHVgIV는 Rhone Merieux로부터 얻어졌다. 이 플라스미드의 gIV 유전자는 우두 바이러스 측면부 암 사이에 클로닝하였다. 이것은 gIV 유전자를 포함하는 pBHVgIV의 2,000bpPstI-XhoI 단편을 pSD542VCVQ의PstI-XhoI 위치속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV1이다. 그 다음 π프로모터의 3'-말단이 gIV 유전자의 윗쪽에 클로닝되었다. 이것은 π프로모터의 3'-말단 및 gIV 유전자의 5'- 말단을 암호화하는 올리고뉴클레오티드 BHVL7 및 BHVL8을 pBHV1의 5,500bpSstII-XhoI 부분 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV3이다.
그 다음 외부의 3'-비코딩서열이 제거되었다. 이것은 올리고뉴클레오티드 BHVL5 (SEQ ID NO: 241) 및 BHVL6 (SEQ ID NO: 242)를 pBHV3의 5,200bpSmaI-PstI 부분 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드가 pBHV4이다.
그 다음 외부의 링커 서열이 제거되었다. 이것은 pBHV4의 5,200bpPstI 단편을 결합시켜서 수행되었다. 이 조작에 의하여 생성된 플라스미드는 pBHV5이다.
그 다음에는 π프로모터의 5'-말단이 pBHV5속으로 클로닝되었다. 이것은 π프로모터의 5'-말단을 포함하는 pPI4의 130bpAf1II-XhoI 단편을 pBHV5의 5,200bpAf1II-XhoI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV6이다.
그 다음 BHV1 gIII 유전자가 pBHV6속에 클로닝되었다. 이것은 I3L-프로모터 구동되는 gIII 유전자를 포함하는 pBHV10의 1,600bpAsp718-BamHI 단편을 pBHV6의 5,300bpBamHI-Asp718 부분 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV11이다.
그 다음에는 BHV1 gI 유전자를 pBHV11 속에 클로닝하였다. 이것은 H6-프로모터 구동되는 gI 유전자를 포함하는 pBHV8의 2,900bpBgℓII 단편을 pBHV11의BgℓII 위치에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBHV13이다. 레스큐 바이러스로서 vP866(NYVAC)과의 생체의 재조합 실험에 pBHV13을 이용하여 vP1079를 생성하였다.
vP1079가 확실한 BHV1 gI, gIII 및 gIV 당단백질을 발현하는지를 결정하기 위해 면역침전 분석을 수행하였다. VERO세포 단일층을 모의감염시키고, 10 PFU/세포의 m.o.i.로 vP1079로 감염시키고 또는 NYVAC로 감염시켰다. 1시간 흡착기간후에 접종물을 흡출하고 세포를 2% 태아 소 혈청 및 [35S]-메티오닌(20 μCi/mℓ)을 포함하는 변형 이글배지(-메티오닌) 2mℓ로 덮었다. 감염 7시간후 1 mℓ 3X 완충액A (3% NP-40, 30mM Tris (pH 7.4), 3mM EDTA, 0.03% Na 아지드 및 0.6 mg/mℓ PMSF) 및 50mℓ 아프로티닌을 첨가하고 세포단일층을 긁어내서 세포를 수거했다.
그 다음 BHV1 gI-특이적인 모노클로날 항체 5106 및 gIII-특이적인 모노클로날 항체 1507 및 gIV-특이적인 모노클로날 항체 3402 (Dr. Geoffrey Letchworth, U. of Wisconsin,Madison, WI로부터 얻음)를 이용하여 BHV1 gI, gIII 및 gIV 발현에 대해 용해물을 분석하였다. 이것은 하기의 방법에 의해 수행되었다: 마우스 항-마우스 혈청을 4시간동안 실온에서 단백질 A-세파로스에 결합시켰다. 이 물질을 1X 완충액A로 5X 세척한후, 단백질 A-세파로스 결합된 마우스 항-마우스 항체를 gI, gIII 및 gIV-특이적인 모노클로날 항체에 결합시켰다. 이 동안에 용해물은 정상 마우스 혈청과 단백질 A-세파로스 결합된 마우스 항-마우스 항체를 4℃에서 하룻밤동안 배양함으로써 미리 정화되었다. 이 물질을 1X 완충액A로 5X 세척한후, BHV1 gI,gIII 및 gIV-특이적인 모노클로날 항체, 마우스 항-마우스, 단백질 A-세파로스 결합체를 용해물에 첨가하고 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 샘플을 1X 완충액A로 4X 그리고 LiCℓ2/요소 완충액으로 2X 세척한후, 침전된 단백질은 2X Laemmli 완충액(125 mM Tris(pH 6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-메트캅토에탄올)을 첨가하고 5분간 끓여서 면역복합체로부터 분리되었다. 그 다음 단백질은 10% Dreyfuss 겔 시스템(Dreyfuss 등, 1984)에서 분리되고, 고정되고, 형광사진법을 위해 1M Na-살리실산염으로 처리되었다.
BHV1 gI, gIII 및 gIV-특이적인 모노클로날 항체 5106, 1507 및 3402는 특이적으로 vP1079 감염세포로부터 BHV1 gI, gIII 및 gIV 당단백질을 침전시켰지만, 모의 또는 NYVAC 감염세포로부터 BHV1-특이적인 단백질을 침전시키지 않았다.
실시예 31-NYVAC에서 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전자의 발현 NYVAC/BVDV gE1/gE2 재조합체의 제조
BVDV gE1(gP48/gP25) '유전자'(Osloss균주)가 pIBI25속으로 클로닝되었다.
이것은 pSP65-gE1 (Eurogentec, Liege, Belgium으로부터 얻어짐; Renard등, 유럽특허출원: 86870095)의 1,370bpEcoRI-BamHI 단편을 E. coli DNA 중합효소 I (클리나우 단편)으로 블런트-말단화시키고, 양쪽 말단에XhoI 링커를 결합시키고, 결과적인 단편을 pIBI25의XhoI 위치속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이러한 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBDV1이다.
그 다음 H6 프로모터의 개시코돈이 gE1 '유전자'의 '개시코돈' 과 정렬되었다. 이것은 H6 프로모터의 3'-말단과 gE1 '유전자'의 5'- 말단을 암호화하는 올리고뉴클레오티드 BDVM4 (SEQ ID NO:253) (5'-AGCTTGATATCCGTTAAGTTTGTATCGT-AATGGGCAAACTAGAGAAAGCCCTGT-3') 및 BDVM5 (SEQ ID NO:254) (5'-GGGCTTTCTCTAG-TTTGCCCATTACGATACAAACTTAACGGATATCA-3')을 pBDV1의 4,250bpHindIII-BgℓI(부분) 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBDV6 이다.
다음에는 gE1 '유전자'가 H6 + ATI + HA 삼중 프로모터 (Portetelle등, Vaccine(1991)9:194)의 아랫쪽 그리고 HA 측면부암 사이에 클로닝되었다. 이것은 gE1 '유전자'를 포함하는 pBDV6의 1,380bpEcoRV-PstI(부분) 단편을 pATI25의 3,700bpEcoRV-PstI 단편에 클로닝함으로써 수행되었다. 이러한 조작에 의해 생성된 플라스미드가 pBDV7 이다.
앞으로의 조작을 위해 필요한BamHI 위치는 BVDV 서열의 아랫쪽에 생성되었다. 이것은 올리고뉴클레오티드 BDVM6 (SEQ ID NO:255)(5'-TCGAGGATCC-3')을 pBDV7의XhoI 위치속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생긴 플라스미드는 pBDV8 이다.
다음에는 대략 830bp의 gE2 (gp53)서열 (Osloss균주)이 gE1 서열의 아랫쪽에 클로닝되었다. 이것은 gE2 서열을 포함하는 p7F2 (Eurogentec, Liege, Belgium으로부터 얻음; Renard등, 유럽특허출원:86870095)의 980bpBgℓII-BamHI 단편을 pBDV8의 5,100bpBamHI-BgℓII (부분) 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBDV9이다.
다음에는 H6 프로모터 구동되는 -gE1/gE2 서열이 ATI 측면부암 사이에 클로닝되었다. 이것은 gE1/gE2 서열을 포함하는 pBDV9의 2,200bpNruI-BamHI 단편을 pPGI7의 4,900bpNruI-BamHI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이것은 gE1/gE2 서열을 H6 프로모터의 전사조절하에 그리고 삽입벡터 속에 놓았다. 이 조작에 의해 생긴 플라스미드가 pBDV23이다.
다음에는 대략 270bp의 부가적인 gE2 서열 (Osloss균주)이 현존하는 BVDV서열의 아랫쪽에 클로닝되었다. 이것은 gE2 서열을 포함하는 pSP65E1+E2-1 (Eurogentec, Liege, Belgium으로부터 얻음; Renard등, 유럽특허출원:86870095)의 1,260bpBgℓII-BamHI 단편을 pBDV23의 6,100bp 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다.
이 조작에 의해 생긴 플라스미드가 pBDV24이다.
레스큐바이러스로서 vP866(NYVAC)과의 생체외 재조합실험에 pBDV24를 이용하여 vP972를 생성하였다.
vP972가 확실한 BVDV gE1 및 gE2 당단백질을 발현하는지를 결정하기 위하여 면역침전 분석을 행하였다. VERO세포 단일층이 모의감염되고, 10 PFU/세포의 m.o.i.로 vP972로 감염되고 또는 NYVAC로 감염되었다. 1시간 흡착기간후 접종물을 흡출하고 세포를 2% 태아소 혈청과 [35S]-메티오닌 (20μCi/㎖)을 포함하는 변형이글배지(-메티오닌) 2㎖로 덮었다. 감염 18시간후 1㎖ 3X 완충액 A (3% NP-40, 30mM Tris (pH 7.4), 3mM EDTA, 0,03% Na 아지드 및 0.6mg/㎖ PMSF) 및 50㎖ 아프로티닌을 첨가하고 세포단일층을 긁어내서 세포를 수거하였다.
그 다음 BVDV gp48-특이적인 모노클로날 항체 NYC16 및 NY12B1, BVDV gp53-특이적인 모노클로날 항체 209 D3 (Rhone Merieux, Lyon, 프랑스로부터 얻어짐)을 이용하여 BVDV gE1 및 gE2에 대해서 용해물을 분석하였다. 이것은 하기의 방법에 의해 수행되었다: 마우스 항-마우스 혈청을 4시간동안 실온에서 단백질 A-세파로스에 결합시켰다. 이 물질을 1X 완충액 A로 5X 세척한 후에, 단백질 A-세파로스 결합된 마우스 항-마우스 항체를 gE1-특이적인 모노클로날 항체 NYC16과 NY12B1, 및 gE2-특이적인 모노클로날 항체 209D3에 결합시켰다. 이 동안에 용해물을 정상 마우스 혈청과 단백질 A-세파로스 결합된 마우스 항-마우스 항체를 4℃에서 하룻밤동안 배양함으로써 미리 정화되었다. 이 물질을 1X 완충액 A로 5X 세척한 후 BVDV gE1 또는 gE2-특이적인 모노클로날항체, 마우스 항-마우스, 단백질 A-세파로스 결합체를 용해물에 첨가하고 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 샘플을 1X 완충액 A로 4X 그리고 LiCℓ2/요소 완충액으로 2X 세척한 후, 침전된 단백질을 2X Laemmli 완충액 (125mM Tris (pH 6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-메르캅토에탄올)을 첨가하고 5분동안 끓여서 면역복합체로부터 분리시켰다. 그 다음에 단백질을 10% Dreyfuss겔 시스템 (Dreyfuss등, 1984)에서 분리되었고, 고정되고 형광사진법을 위해 1M Na-살리실산염으로 처리되었다.
BVDV gE1 또는 gE2-특이적인 모노클로날 항체는 vP972 감염세포로부터 BVDV-특이적인 당단백질을 침전시켰지만, NYVAC 또는 모의감염된 세포로부터 BVDV-특이적인 단백질을 침전시키지는 않았다.
NYVAC/BVDV CAPSID/gE1/gE2 재조합체의 제조
BVDV gE1 '유전자'를 pIBI25속에 클로닝하였다. 이것은 gE1 '유전자'를 포함하는 pSP65-gE1의 1,370bpEcoRI-BamHI 단편을 E. coli DNA 중합효소 I (클리나우 단편)으로 블런트-말단화시키고, 양쪽 말단에XhoI 링커를 결합하고, 결과적인 단편을 pIBI25의XhoI 위치속에 클로닝하여 수행되었다. 이 조작에 의해 생긴 플라스미드가 pBDV1이다.
그 다음 gE1 '유전자'를 u 측면부 암 사이에 클로닝하였다. 이것은 gE1 서열을 포함하는 pBDV1의 1,400bpXhoI 단편을 pSD486의XhoI 위치에 클로닝함으로써 수행하였다. 이조작에 의해 생긴 플라스미드가 pBDV11이다.
다음에는 gE1 '유전자'의 '개시코돈'을 u 프로모터의 개시코돈과 정렬시켰다. 이것은 u 프로모터의 3'-말단 및 gE1 서열의 5'-말단을 암호화하는 올리고뉴클레오티드 BDVM7 (SEQ ID NO:256) (5'-CGATTACTATGGGCAAACTAGAGAAAGCCCTGT-3') 및 BDVM8 (SEQ ID NO:257) (5'-GGGCTTTCTCTAGTTTGCCCATAGTAAT-3')을 pBDV11의 4,800bpBgℓI-ClaI 부분단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생긴 플라스미드가 pBDV12이다.
다음에는 BVDV gE2 '유전자' 부분을 gE1 서열의 아랫쪽에 pBDV12속에 클로닝하였다. 이것은 gE2 서열을 포함하는 p7F2의 1,000bpBgℓII-BamHI 단편을 pBDV12의 4,650bpBgℓII-BamHI 단편에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드가 pBDV14이다.
다음에는 gE2 '유전자'의 나머지를 pBDV14속에 클로닝하였다. 이것은 gE2 '유전자'를 포함하는 pSP65E1+E2-1의 1,260bpBgℓII-BamHI 단편을 pBDV14의 4,650bpBgℓII-BamHI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드가 pBDV17이다.
다음에는 캡시드 '유전자' (Osloss 균주)를 gE1 서열의 윗쪽에 pBDV17속에 클로닝하였다. 이것을 2단계로 수행하였다. 제 1단계는 u 프로모터의 개시코돈을 캡시드 '유전자'의 '개시코돈'과 정렬시켰다. 이것은 u 프로모터의 3'-말단 및 캡시드 서열의 5'-말단을 암호화하는 올리고뉴클레오티드 BDVL12 (SEQ ID NO:258) (5'-CGATTACTATGGAGTTGATTACAAATGAACTTTTATACAAAACATACAAACAAAAACCCGCTGGAGTGGAG-GAACCAGTATATACCAAGCAGGTGACCCT-3') 및 BDVL13 (SEQ ID NO:259) (5'-CTAGAG-GGTCACCTGCTTGGTTATATACTGGTTCCTCCACTCCAGCGGGTTTTTGTTTGTATGTTTTGTATAAAAGTTCATTTGTAATCAACTCCATAGTAAT-3')을 pBDV17의 5,200bpClaI-XbaI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생긴 플라스미드가 pBDV25이다. 제 2단계는 캡시드 '유전자'의 나머지를 pBDV25속에 클로닝하였다. 이것은 캡시드 '유전자'를 포함하는 pSP65C-E1-E2 (Eurogentec, Liege, Belgium으로 부터 얻음; Renard등, 유럽특허출원:86870095)의 1,870bpBstEII-BgℓII 단편을 pBDV25의 4,700bpBstEII-BgℓII 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생긴 플라스미드가 pBDV26이다.
다음에는 u-프로모터 구동되는 캡시드/gE1/gE2 서열을 tk 측면부 암 사이에 클로닝하였다. 이것은 u-프로모터 구동되는 캡시드/gE1/gE2 서열을 포함하는 pBDV26의 3,200bpSnaBI-BamHI 단편을 pSD542의 4,000bpSmaI-BamHI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생긴 플라스미드가 pBDV27이다.
레스큐바이러스로서 vP866 (NYVAC)와의 생체외 재조합실험에 pBDV27을 이용하여 vP1017을 생성하였다.
vP1017 감염된 세포와의 면역침전실험을 vP972의 발현에 대하여 상기에서 기술한 대로 수행하였다. 모의 감염된 또는 NYVAC 감염된 VERO세포로부터는 어떤 BVDV-특이적인 단백질도 침전되지 않았다. 그러나 vP1017의 용해물로부터는 BVDV-특이적인 단백질이 침전되었다.
NYVAC/BVDV gE2 재조합체의 제조
BVDV gE1 '유전자'를 pIBI15 속에 클로닝하였다. 이것은 gE1 '유전자'를 포함하는 pSP65-gE1의 1,370bpEcoRI-BamHI 단편을 E.coli DNA 중합효소 I (클리나우 단편)으로 블런트-말단화시키고, 양쪽 말단에XhoI 링커를 결합하고, 결과적인 단편을 pIBI25의XhoI 위치에 클로닝하여 수행하였다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드가 pBDV1 이다.
다음에는 H6 프로모터의 개시코돈을 gE1 '유전자'의 추정되는 '개시코돈'과 정렬시켰다. 이것은 H6 프로모터의 3'-말단 및 gE1 '유전자'의 5'-말단을 암호화하는 올리고뉴클레오티드 BDVM4 (SEQ ID NO:253) 및 BDVM5 (SEQ ID NO:254)를 pBDV1의 4,250bpHindIII-Bgℓ(부분) 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생긴 플라스미드가 pBDV6 이다.
다음에는 gE1 '유전자'를 H6+ATI+HA 삼중 프로모터의 아랫쪽 그리고 HA 측면부암 사이에 클로닝하였다. 이것은 gE1 '유전자'를 포함하는 pBDV6의 1,380bpEcoRV-PstI (부분) 단편을 pATI25의 3,700bpEcoRV-PstI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBDV7이다.
앞으로의 조작에 필요한BamHI 위치는 BVDV 서열의 아랫쪽에 생성되었다. 이것은 올리고뉴클레오티드 BDVM6 (SEQ ID NO:255)를 pBDV7의XhoI 위치속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBDV8이다.
다음에는 대략 830bp의 BVDV gE2 서열을 gE1 '유전자'의 아랫쪽에 클로닝하였다. 이것은 gE2 서열을 포함하는 p7F2의 980bpBgℓII-BamHI 단편을 pBDV8의 5,100bpBamHI-BgℓII (부분) 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생긴 플라스미드는 pBDV9이다.
다음에는 gE1/gE2 서열을 ATI 측면부 암 사이에 클로닝하였다. 이것은 H6- 프로모터 구동되는 gE1/gE2 '유전자'를 포함하는 pBDV9의 2,200bpNruI-BamHI 단편을 pPGI7의 4,900bpNruI-BamHI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBDV23이다.
다음에는 대략 270bp의 부가적인 gE2 서열을 현존하는 BVDV 서열의 아랫쪽에 클로닝하였다. 이것은 부가적인 gE2 서열을 포함하는 pSP65E1+E2-1의 1,260bpBgℓII-BamHI 단편을 pBDV23의 6,100bpBamHI-BgℓII (부분) 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBDV24이다.
그 다음 gE1 서열을 BDV24로부터 삭제하였다. 이것은 H6 프로모터의 3'-말단 및 gE2 '유전자'의 5'-말단을 포함하는 130bpNruI-PstI PCR 단편을 pBDV24의 5,900bpNruI-PstI 단편속에 클로닝함으로써 수행되었다. 이 PCR 단편은 올리고뉴클레오티드 BDVP14 (SEQ ID NO:260) (5'-TTTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAA-TGCTCCCAGTTTGCAAACCC-3') 및 BDVP15 (SEQ ID NO:261) (5'-TCTCCACCTTTACACCACACT-3')와 플라스미드 pBDV17로부터 생성되었다. 이 조작에 의해 생성된 플라스미드는 pBDV28이다.
서열분석은 pBDV28의 H6 프로모터가 2bp 삽입체를 포함한다는 것을 나타냈다. 이 결함을 정정하기 위하여, H6 프로모터의 3'-말단 및 gE2 '유전자'의 5'-말단을 포함하는 pBDV28의 130bpNruI-PstI 단편을 pBDV24의 5,900bpNruI-PstI 단편속에 클로닝하였다. 이러한 조작에 의해 생성된 플라스미드가 pBDV29이다.
레스큐 바이러스로서 vP866 (NYVAC)와의 생체외 재조합실험에 pBDV29를 이용하여 vP1097을 생성하였다. vP1097 감염세포와의 면역침전 실험을 상기에 기술한 대로 수행하여 세포 또는 용해물로부터 BVDV단백질을 생성하였다.
실시예 32-폭스바이러스 벡터에서 인간 시토메갈로바이러스 (HCMV) 당단백질 항원의 클로닝 및 발현
HCMV gB 유전자의 NYVAC 도너플라스미드 pSD542 내로의 클로닝
NCMV DNA의HindIII D 단편의 4800bpHindIII-BamHI 단편을 플라스미드 pIBI24의 2800bpHindIII-BamHI 단편속에 클로닝하였다. 올리고뉴클레오티드 CMVM5 (SEQ ID NO:262) (5'-GCCTCATCGCTGCTGGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGAA-TCCAGGATCTG-3') 및 CMVM3 (SEQ ID NO:263) (5'-GACAGATTGTGATTTTTATAAGCATCGT-AAGCTGTCA-3')를 이용한 생체외 돌연변이 유발 (Kunkel, 1985; Russel등, 1986)에 의하여, gB유전자를 우두 바이러스 H6 프로모터의 조절하에서 발현되도록 변형시켰다 (Taylor등, 1988a,b; Perkus 등, 1989). 변형된 gB를 포함하는 플라스미드를 24CMVgB (5+3)으로 나타냈다.
24CMVgB (5+3)의 2900bpEcoRV-BamHI 단편을 pSP131의 3100bpEcoRV-BamHI 단편속에 클로닝하였다. 이 클로닝 단계는 gB유전자를 H6 프로모터의 조절하에 놓았다. 결과적인 플라스미드를 SP131gB로 표시했다.
SP131gB에서 H6 프로모터 구동되는 gB측면부의 제한위치를 변형시키기 위해 하기의 단계들을 수행하였다. 플라스미드 pMP22BHP는BamHI 위치에 폴리링커 부위에서 HBV sAg 일부를 포함하는 우두 바이러스 (WR균주)HindIII F 단편의 서브클론을 포함한다. pMP22BHP를 폴리링커내에서HindIII로 분해하고 SP131CMVgB의HindIII 단편 (H6 프로모터 구동되는 gB유전자를 포함)에 결합시켜서 플라스미드 sAg22CMVgB를 생성하였다. sAg22CMVgB를BamHI으로 분해하고HindIII로 부분분해하고,BamHI 및HindIII 분해에 의해 pIBI24에서 유도된 폴리링커에 결합시켜서, HBV sAg 없이 H6 프로모터 구동되는 gB유전자를 포함하는 플라스미드 22CMVgB를 생성하였다.
플라스미드 pSD542 (NYVAC TK 유전자좌 도너 플라스미드)는 실시예 7에서 기술한 것처럼 벡터 플라스미드 pSD513을 형성함으로써 플라스미드 pSD460 (Tartaglia 등, 1992)으로부터 유도되었다. pSD513의 폴리링커 부위를PstI/BamHI으로 절단하고 어닐링된 합성 올리고뉴클레오티드 MPSYN288 (SEQ ID NO:264) (5' GGTCGACGGATCCT 3') 및 MPSYN289 (SEQ ID NO:265) (5' GATCAGGATCCGTCGACCTGCA 3')에 결합시켜서 플라스미드 pSD542를 생성함으로써 변형시켰다.
22CMVgB를BamHI 및NsiI으로 분해시켜서 H6 프로모터 및 gB유전자 부분을 포함하는 단편을 생성하고NsiI 및PstI으로 분해시켜서 gB유전자의 나머지를 포함하는 단편을 생성하였다. 이 두 단편을 pSD542에 결합시켰는데, pSD542는 그것의 폴리링커내에서BamHI 및PstI으로 분해되었다. 결과적으로 NYVAC 도너 플라스미드 542CMVgB를 생성하였다.
HCMV gB 크기의 ALVAC 도너 플라스미드 CP3LVQH6로의 클로닝
8.5 kb 카나리아폭스BgℓII 단편을 pBS-SK 플라스미드 벡터의BamHI 위치에 클로닝하여 pWW5를 형성하였다. 뉴클레오티드 서열분석은 C3로 표시된 리딩프레임을 나타냈다. C3 오픈리딩 프레임의 완전삭제와 함께 C3 유전자좌에 외부유전자를 삽입하기 위한 도너 플라스미드를 구성하기 위하여, PCR 프라이머를 이용하여 C3에 상대적으로 5' 및 3'서열을 증폭시켰다. 5'서열에 대한 프라이머는 RG277 (SEQ ID NO:177 및 RG278 (SEQ ID NO:178)이었다.
3'서열에 대한 프라이머는 RG279 (SEQ ID NO:179) 및 RG280 (SEQ ID NO:180)이었다. 프라이머가 우두 바이러스전사 및 번역종결시그날에 의해 측면위치된 다수의 클로닝위치를 포함하도록 고안하였다. 또한 좌측암 및 우측암의 5'-말단 및 3'-말단에는 적당한 제한위치가 포함되어 있어서 (좌측암에는Asp718 및EcoRI 그리고 우측암에는EcoRI 및SacI) 두암이Asp718/SacI 분해된 pBS-SK 플라스미드 벡터속에 결합되게 할 수 있다. 결과적인 플라스미드는 pC3I로 나타냈다.
플라스미드 pWW5를NsiI 및SspI으로 분해시켜서 C3 유전자좌의 윗쪽에 바로 카나리아폭스 DNA의 908bp 단편을 얻었다. 카나리아폭스 DNA의 604bp 단편은 주형으로서 플라스미드 pWW5 및 올리고뉴클레오티드 CP16 (SEQ ID NO:266) (5'-TCCGGTACCGCGGCCGCAGATATTTGTTAGCTTCTGC-3') 및 CP17 (SEQ ID NO:267) (5'-TCGCTCGAGTAGGATACCTACCTACTACCTACG-3')을 이용하여 PCR에 의하여 유도되었다 (Engelke 등, 1988). 604bp 단편을Asp718 및XhoI으로 분해시키고 (각기 올리고뉴클레오티드 CP16 및 CP17의 5'말단에 존재하는 위치)Asp718-XhoI 분해되고 알칼리 포스파타제 처리된 IBI25 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) 속에 클로닝하여 플라스미드 SPC3LA를 생성하였다. SPC3LA를 IBI25 내에서EcoRV로 그리고 카나리아폭스 DNA에서NsiI으로 분해하고 908bpNsiI-SspI 단편에 결합시켜서 C3 유전자좌의 윗쪽에 카나리아폭스 DNA의 1444bp를 포함하는 SPCPLAX를 생성하였다.
카나리아폭스 DNA의 2178bpBgℓII-StyI 단편은 플라스미드 pXX4로부터 분리되었는데 이것은 pBS-SK의PstI 위치속에 클로닝된 카나리아폭스 DNA의 6.5 kbNsiI 단편을 포함한다. 카나리아폭스 DNA의 279bp 단편은 주형으로 플라스미드 pXX4 및 올리고뉴클레오티드 CP19 (SEQ ID NO:268) (5'-TCGCTCGAGCTTTCTTGA-CAATAACATAG-3') 및 CP20 (SEQ ID NO;269) (5'-TAGGAGCTCTTTATACTACTGGGTTACAAC-3')을 이용하여 PCR에 의해 분리되었다 (Engelke 등, 1988). 279bp 단편을XhoI 및SacI (각기 올리고뉴클레오티드 CP19 및 CP20의 5'말단에 존재하는 위치)으로 분해하고,SacI-XhoI 분해되고 알칼리 포스파타제 처리된 IBI25 속에 클로닝하여 플라스미드 SPC3RA를 생성하였다.
폴리링커에 부가적인 특유한 위치를 첨가하기 위하여, pC3I를 폴리링커 부위내에서EcoRI 및ClaI으로 분해시키고, 알칼리포스파타제 처리하고, 키나제 처리되고 어닐링된 올리고뉴클레오티드 CP12 (SEQ ID NO:272) 및 CP13 (SEQ ID NO:273) (EcoRI 접착성 말단,XhoI 위치,BamHI 위치 및ClaI과 양립할 수 있는 접착성 말단을 포함)에 결합시켜서 플라스미드 SPCP3S를 생성하였다.
CP12 (SEQ ID NO:272) 5'-AATTCCTCGAGGGATCC -3'
CP13 (SEQ ID NO:273) 3'- GGAGCTCCCTAGGGC-5'
EcoRIXhoIBamHI
SPCP3S를 C3 유전자좌의 아랫쪽 카나리아폭스 서열내에서StyI 및SacI으로 분해시키고 (pBS-SK), PSC3RA의 261bpBgℓII-SacI 단편 및 pXX4의 2178bpBgℓII-StyI 단편에 결합시켜서 C3 유전자좌의 아랫쪽에 카나리아폭스 DNA의 2572bp를 포함하는 플라스미드 CPRAL을 생성하였다. SPCP3S를 C3 유전자좌의 윗쪽 카나리아폭스 서열내에서Asp718 (pBS-SK에서) 및AccI으로 분해시키고 SPCPLAX의 1436bpAsp718-AccI 단편에 결합시켜서 C3 유전자좌의 윗쪽에 카나리아폭스 DNA의 1457bp를 포함하는 플라스미드 CPLAL을 생성하였다. CPLAL을 C3 유전자좌의 아랫쪽 카나리아폭스 서열내에서StyI 및SacI (pBS-SK에서)으로 분해시키고 CPRAL의 2438bpStyI-SacI 단편에 결합시켜서 플라스미드 CP3L을 생성하였는데, 이것은 C3 유전자좌의 윗쪽에 카나리아폭스 DNA 1457bp, 6 리딩프레임의 종결 코돈, 초기전사종결시그날, 폴리링커부위, 초기전사종결시그날, 6 리딩프레임의 종결코돈, 및 C3 유전자좌의 아랫쪽의 카나리아폭스 DNA 2572bp를 포함한다. 결과적인 플라스미드를 SPCP3L이라고 표시했다.
초기/후기 H6 우두 바이러스 프로모터(Guo등, 1989; Perkus등, 1989)는 주형으로서 pRW838 및 올리고뉴클레오티드
를 이용하여 PCR에 의하여 얻어졌다 (Engelke 등, 1988). PCR 산물을BamHI 및EcoRI (각기 올리고뉴클레오티드 CP21 및 CP22의 5'말단에 존재하는 위치)으로 분해시키고, 폴리링커에서BamHI 및EcoRI으로 분해된 CP3L에 결합시켜서 플라스미드 VQH6CP3L을 생성하였다.
ALVAC 도너플라스미드 VQH6CP3L을 폴리링커에서XhoI으로 그리고 H6 프로모터에서NruI으로 분해시키고,XhoI 및HindⅢ 분해에 의해 pIBI24에서 얻은 폴리링커 및 gB 유전자 및 H6 프로모터 부분을 포함하는 22CMgB의NruI/HindⅢ 단편에 결합시켜서 ALVAC 도너플라스미드 CP3LCMVgB를 생성하였다.
실시예 33-재조합 바이러스: 시토메갈로바이러스의 제조
CMV(시토메갈로바이러스) gB 유전자를 NYVAC의 TK위치 속에 삽입하였다. 재조합 바이러스를 vP1001로 나타냈다. CMV gB 유전자를 ALVAC의 C3 좌 속에 삽입하였다. 재조합체를 vCP139로 나타냈다.
실시예 34-재조합 바이러스 감염세포에서의 CMV GB 단백질의 면역형광
면역형광 연구는 이전에 기술된 대로 (Taylor등, 1990) 기니아피그 폴리클로날 혈청 및 플루오레세인 이소티오시아네이트 염소 항-기니아피그를 이용하여 수행하였다. vP1001로 감염된 세포는 원형질막에서 발현되는 gB를 나타냈다. vCP139로 감염된 세포내에서는 약한 내부의 발현이 검출되었다.
실시예 35-재조합체 감염세포에서 CMV GB의 면역침전
면역침전 실험을 이전에 기술한 대로 수행하였다 (Taylor등, 1990). CMV 감염된 세포에서 생성된 CMV gB 당단백질은 130KDa의 전구체 형태를 가지고 55KDa의 분자량을 갖는다 (Gretch등, 1988). vP1001 및 vCP139로 감염된 세포는 대략 116kDa와 55kDa의 두 CMV gB 암호화된 단백질을 생성한다.
실시예 36-중화항체
CBA 마우스를 vP1001 (NYVAC-HCMV gB)로 면역화시킨 후, 접종한 마우스 혈청의 중화항체역가를 측정하였다 (Gonczol 등, 1986). 인간 시토메갈로바이러스를 중화할 수 있는 항체를 14-21일 후에 (기하학적 평균역가 1:16) 및 면역화 후 28일과 60일 사이에 (gmt = 1:26) 마우스 혈청에서 검출하였다. CBA 마우스를 ALVAC-HCMV gB로 면역화하여 면역화 후 14-21일에는 1:64 gmt, 면역화 후 21-28일에는 1:91 gmt, 면역화 후 28-60일에는 1:111의 HCMV 중화항체 역가를 생성하였다. 그리하여 HCMV gB를 발현하는 카나리아폭스바이러스 또는 우두 바이러스 재조합체로 마우스를 면역화하면 HCMV의 감염성을 중화할 수 있는 항체를 유도하였다.
실시예 37-세포 매개 면역
HCMV 중화항체 역가 뿐만아니라 vCP139도 또한 HCMV gB를 발현하는 재조합 우두 바이러스(우두 바이러스 WR-gB)로 감염된 마우스 L929 세포를 사멸시킬 수 있는 세포독성 T 임파구를 유도할 수 있다. CBA 마우스를 2.5×108pfu의 vCP139로 복막내 면역화시켰다. 16 내지 30일 이후에 마우스의 비장세포 현탁액을 2:1의 비율로 vP1001로 이전에 감염된 동계의 비장세포와 공- 배양함으로써 생체외 재-자극시켰다.
5일 후에 비장세포를 계수하고,51Cr-방출검사(Zinkernagel등, 1984)를 이용하여, 비감염된 L929 세포 또는 아데노바이러스 Ad5dℓE3, HCMV gB를 발현하는 재조합 아데노바이러스(Ad-gB), 우두 바이러스, 및 HCMV gB를 발현하는 재조합 우두 바이러스로 감염된 L929 세포에 대한 세포독성을 평가하였다. 비감염된 표적과 Ad5dℓE3로 감염된 표적에 대해서는 단지 백그라운드 수준의 반응성 만이 측정되었다. 반대로 생체외 자극된 비장세포는 HCMV gB를 발현하는 Ad-gB로 감염된 L929 세포를 바로 사멸시켰다. 우두 바이러스 벡터로 감염된 표적에 대해 일부 용해 반응성이 관찰되었지만, gB를 발현하는 재조합체 우두 바이러스로 감염된 표적에 대해 보다 더 많은 세포용해가 측정되었다. 이것은 명백하게 HCMV gB 내에 위치된에피토프에 특이적인 세포독성 T 임파구가 HCMV gB를 발현하는 재조합체 카나리아폭스바이러스(vCP139)로 접종시켜서 생성된다는 것을 나타냈다.
실시예 38-NYVAC 및 ALVAC 도너플라스미드 제조: 개(CANINE) 파보바이러스(Parvovirus)
개 파보바이러스 vP2 캡시드 유전자를 발현하는 폭스바이러스 재조합체를 생성하기 위하여, vP2 유전자가 CPV-d 분리물(CPV-2 항원유형)의 게놈으로부터 증폭되고 우두 바이러스 H6 프로모터(Perkus 등, 1989)에 결합되고 NYVAC 또는 ALVAC 삽입벡터 속에 삽입된 도너플라스미드가 제조되었다. ALVAC 삽입위치가 탈-ORF된 C3 유전자좌인 반면 NYVAC 삽입위치는 탈-ORF된 AT1 유전자좌이다.
vP2 유전자 서열은 플라스미드 pBI265 (1)으로부터 PCR에 의해 얻어졌다. Dr. Colin R. Parrish, James A. Baker Institute, Cornell University, Ithaca, NY로부터 얻은 이 플라스미드는 CPV-d 분리물(Cornell 790320) (항원유형 CPV-2)의 게놈을 포함한다. 이 분리물의 vP2 유전자 DNA 서열은 공표되었다 (Parrish 등, 1988).
주형으로서 pBI265 (1) 및 프라이머로서 합성 올리고뉴클레오티드
를 이용하여, PCR에 의해 완전한 vP2 오픈 리딩 프레임(ORF)를 증폭하였다. 정제한 DNA 단편을Asp718 및EcoRI으로 절단하고 pBluescript SK+에서Asp718 및EcoRI 위치속에 클로닝하여 pDT4를 생성하였다. vP2 유전자를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
vP2 유전자는 초기전사종결시그날로 작용할 수 있는 ORF 내의 두 TTTTTNT 서열을 포함한다 (Yuen등, 1987). 이 시그날을 제거하기 위해 PCR 위치-지시되는 돌연변이유발을 이용하여 정확한 아미노산 서열을 유지하면서 뉴클레오티드 서열을 변화시켰다. 합성올리고뉴클레오티드
를 이용하여 pBI265 (1)로부터 250bp 단편을 증폭시켰다. 정제한 단편을BgℓⅡ 및AccI으로 분해하고, pDT4에서BgℓⅡ/AccI vP2 단편을 대체하는데 이용하였다. 결과적인 플라스미드 pED3은 TTTTTNT 서열이 TTTCTAT 및 TTCTTCT로 변화된 변형 vP2 유전자를 포함한다.
CPV vP2 캡시드 유전자를 포함하는 NYVAC 도너플라스미드를 하기와 같이 제조하였다. 변형된 vP2 유전자를NruI 및XhoI으로 pED3에서 절단하고,NruI/XhoI으로 절단된 pMPATIH6HSVTK 속에 클로닝하였다. pMPATIH6HSVTK는 H6 프로모터의 조절하에 있는 HSV-1 티미딘 키나제유전자에 대한 코딩서열을 포함하는 발현 카세트가 폴리링커 부위에서HpaI 및XhoI 위치 사이에 삽입된 pSD552 (본 개시내용에서 기술됨)의 유도체이다. 이 플라스미드를NruI 및XhoI으로 절단하면 tk 유전자를 절단하지만 H6 프로모터의 5'말단을 유지한다. 상기에서 기술한 것처럼 이 벡터속에 변형된 vP2 유전자를 삽입하면 pAT1-vP2를 생성한다. 이 NYVAC 도너 플라스미드는 ATI 삽입암에 의해 측면 위치한 H6 프로모터 구동되는 vP2 유전자를 포함한다.
CPV vP2 캡시드 유전자를 포함하는 ALVAC 도너 플라스미드는 하기와 같이 제조하였다. 변형된 vP2 유전자를NruI 및XhoI으로 pED3에서 절단하고, 정제한 단편을NruI 및XhoI으로 절단된 pVQH6CP3L (플라비 바이러스 부분에서 기술된 플라스미드) 속에 클로닝하였다. 결과적인 플라스미드 pC3-vP2는 C3 삽입암에 의해 측면위치된 H6 프로모터 구동되는 vP2 유전자를 포함한다.
실시예 39-NYVAC 및 ALVAC 재조합체의 제조: 개 파보바이러스 (CPV)
레스큐 바이러스로서 NYVAC (vP866) 및 NYVAC-RG (vP879)와의 VERO세포에서의 생체외 재조합 실험에 도너플라스미드 pATI-vP2를 이용하여 각각 vP998 및 vP999를 생성하였다(Tartaglia등, 1992). 재조합체 바이러스를 방사성 표지된 vP2 특이적인 DNA 프로브를 이용한 인시투(in situ) 혼성화 방법에 의해 확인하였다 (Piccini 등, 1987). 재조합체 플라크를 3번의 플라크 정제에 의해 정제하고, 앞으로의 분석을 위해 증폭시켰다.
레스큐 바이러스로서 ALVAC (CPpp) 및 ALVAC-RG (VCP65A)와 CEF 세포에서 생체외 재조합 실험에 도너플라스미드 pC3-vP2를 이용하여 각기 vCP123 및 vCP136을 생성하였다(Taylor 등, 1992), 재조합체 바이러스를 방사성 표지된 vP2 특이적인 프로브 (포지티브시그날) 및 C3 ORF 특이적인 프로브 (네가티브시그날)를 이용한 인시투 혼성화 방법에 의해 확인하였다 (Piccini 등, 1987). 재조합체 플라크를 3번의 플라크 정제에 의해 정제하고, 앞으로의 분석을 위해 증폭시켰다.
실시예 40-NYVAC-및 ALVAC-기초 CPV vP2 재조합체의 발현분석
CPV vP2 유전자를 포함하는 모든 재조합체를 vP2에피토프에 특이적인 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 CPV 개 혈청을 이용하여 이전에 기술한 대로 (Taylor등, 1990) 면역형광법에 의해 발현을 검사하였다. 모든 혈청은 Dr. Colin R, Parrish, James A. Baker Institute, Cornell university, Ithaca, NY로부터 얻었다. ALVAC-기초 재조합체는 CEF 세포에서 검사한 반면 NYVAC-기초 재조합체는 VERO세포에서 검사하였다. 재조합체 vP998, vP999, VCP123, 및 VCP136 모두 핵에서의 국부화와 내부의 형광을 나타냈다. 표면형광은 검출되지 않았다. 부가적으로, 광견병 G 유전자를 포함하는 두 재조합체(vP999 및 VCP136)를 광견병 G에피토프에 특이적인 모노클로날 항체로 스크리닝하였다. 둘다 세포의 표면에서 강한 형광을 나타냈다.
상기의 재조합체에서 확실한 vP2 유전자산물의 발현을 더욱 특정화하기 위하여, 동일한 항혈청을 이용하여 면역침전분석을 하였다 (Taylor등, 1990). ALVAC-기초 재조합체는 CEF 세포에서 검사한 반면 NYVAC-기초 재조합체는 VERO세포에서 검사하였다. 모든 재조합체(vP998, vP999, VCP123, 및 VCP136)에서 항혈청은 65kDa의 단백질을 침전시켰는데, 이것은 본래의 vP2 유전자의 크기와 일치한다. 어버이 바이러스(NYVAC 또는 ALVAC)로부터 또는 세포용해물로부터는 이러한 크기의 어떤 단백질도 검출되지 않았다.
실시예 41-엡스타인 바르바이러스 (EBV) 유전자의 ALVAC로의 삽입
도너플라스미드 EBV 트리플. 2의 제조
플라스미드 EBV 트리플.1 (실시예 11)은 우두 바이러스 TK 유전자좌 삽입 플라스미드 속에 삽입된 EBV 유전자 gH, gB 및 gP340 모두에 대한 발현 카세트를 포함한다. 플라스미드 EBV 트리플. 1을SmaI/BamHI으로 분해하고, 42kDa 엔토모폭스 바이러스 프로모터와 EBV gH 유전자의 5'말단을 포함하는 0.3kb 단편을 분리하였다. 또한 EBV 트리플.1 플라스미드를BamHI으로 분해하고, EBV gH 유전자의 3'말단, EBV gB 발현카세트, 및 EBV gp340 발현카세트를 포함하는 7.3kb 단편을 분리하였다. 그 다음 이 두 단편을SmaI/BamHI으로 절단된 ALVAC C5 유전자좌 삽입 플라스미드 pNVQC5LSP7 (본 명세서에 기술됨, 파상풍균 실시예 참조) 속에 결합시켰다. 결과적인 플라스미드를 EBV 트리플.2로 표시했다.
EBV 유전자의 ALVAC 내로의 삽입
C5 삽입 유전자좌에 3 EBV 유전자 gH, gB 및 gP340에 대한 발현카세트를 포함하는 플라스미드 EBV 트리플.2를 ALVAC 와의 재조합을 위한 도너플라스미드로서 이용하여 ALVAC 재조합체 VCP167을 생성하였다.
vP944 및 VCP157에의한 EBV 단백질의 발현
동일한 3 유전자를 포함하는 NYVAC-기초 재조합체, ALVAC 재조합체 VCP167 및 vP944로 감염된 세포의 대사적으로 표지된 용해물 (실시예 11)을 EBV gB 및 gP340에 대한 마우스 모노클로날 항체 뿐만아니라 EBV에 대한 인간 폴리클로날 혈청을 이용하여 면역 침전시켰다. 침전물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 방사성 사진법에 의하여 분석하였다. NYVAC-기초 재조합체 vP944 및 ALVAC-기초 재조합체 VCP167에 대해서 EBV gB, gH 및 gP340에 대한 정확한 분자량과 특이성을 갖는 단백질이 관찰되었다.
실시예 42-말(EQUINE) 인플루엔자 HA (A1/PRAGUE/56)를 NYVAC 및 ALVAC 속에 삽입하기 위한 발현카세트의 제조
정제된 EIV (A1/Prague/56) 게놈 DNA는 Rhone-Merieux (프랑스 Lyon)에 의해 제공되었다. EIV-특이적인 cDNA는 Gubler 및 Hoffman (1983)에 의해 기술된 것처럼 제조되었다. 올리고뉴클레오티드 EIVSIP (SEQ ID NO:278) (5'-ATCATCCTGC-AGAGCAAAAGCAGG-3')을 이용하여 첫번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 이 올리고뉴클레오티드 (SEQ ID NO:278)는 각 게놈 RNA 절편의 3'-말단에 상보적이다. Gubler 및 Hoffman (1983)에 따라서, cDNA가 dG-테일을 갖게되고,EcoRV으로 분해되고 dC-테일을 갖게 된 pMG5 속에 삽입되었다.
이러한 식으로 pMG5에 cDNA를 삽입하여 플라스미드/cDNA 서열 경계선상에BamHI 위치를 생성하였다.
이러한 EIV cDNA 라이브러리로부터 500 콜로니를 이중으로 암피실린을 포함하는 LB-한천 플레이트 (50μg/㎖)로 옮겼다. 콜로니를 방사성표지된 EIV HA-특이적인 프로브와의 혼성화를 위해 니트로셀룰로스로 옮겼다. 이 프로브는 주형으로 정제한 HA 게놈 RNA 및 올리고뉴클레오티드 EIVSIP (SEQ ID NO:278)로 합성된 방사성표지된 첫번째 가닥 cDNA를 이용함으로써 유도되었다. HA 게놈 단편을 1.2% 저융점 아가로스겔(Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD)로부터 정제하였다. 전체 게놈 RNA를 1 × TBE에서 2볼트/cm로 전개된 이러한 겔 시스템에서 분리시켰다. HA 밴드를 절단하고 75℃에서 아가로스를 용해시킨 다음 페놀추출 2번,에테르추출 1번 그리고 ETOH 침전시켜서 HA RNA를 회수하였다.
표준방법(Maniatis 등, 1991)에 따라 콜로니 혼성화를 행하고 1.4kb HA cDNA 삽입체를 포함하는 cDNA 클론을 확인하였다. 클론은 노던블롯(Northern blot) 분석 대 게놈 RNA 와 뉴클레오티드 서열분석에 의해 HA-특이적이라는 것이 확인되었다. 이 1.4kb 단편을 이용하여 다음 cDNA 라이브러리 스크리닝을 위한 방사성표지된 HA-특이적인 DNA 프로브를 생성하였다.
프로브를 이용하여 다른 HA-특이적인 cDNA 클론을 확인하였다. 가장 큰 것은 1.0kb, 1.2kb, 및 1.4kb 이었고 그것들을 각각 pEIVAIPHA-1, -10, 및 -8로서 표시했다. 일괄하여, 이 클론은 뉴클레오티드 서열분석에 의해 결정된 것처럼 완전한 EIV HA 코딩서열을 포함한다. 이러한 분석으로부터 결정된 EIV HA (A1/Prague/ 56)의 완전한 서열은 도 23에 제공되어 있다 (SEQ ID NO:279).
다음에는 EIV HA의 완전-길이 cDNA 클론을 다른 cDNA 클론으로부터 절편들을 스플라이싱(Splicing) 함으로써 생성하였다. HA 코딩서열의 5'- 대부분 1200bp는 주형으로서 이 플라스미드와 올리고뉴클레오티드 EIVSIP (SEQ ID NO:278) 및 EIVAIP7A (SEQ ID NO:280)(5'-GTTGGTTTTTTCTATTAG-3')을 이용하여 PCR에 의해 pEIVAIPHA-8에서 유도되었다. 이 1200bp 단편을PstI으로 분해하여 5' 및 3' 말단에서PstI 접착성 말단을 생성하였다. HA 코딩서열의 3'-대부분 600bp를 pEIVAIPHA-10으로부터BamHI 및PstI으로 분해시켜서 유도하였다. 이 두 단편을PstI 및BamHI으로 분해된 pBS-SK (Stratagene, La Jolla, CA) 속에 삽입하였다. 전체 EIV HA (A1/Prague/56) 코딩서열을 포함하는 생성플라스미드를 pBSEIVAIPHA로서 나타냈다.
EIV HA 코딩서열(ATG 내지 TAA)은 올리고뉴클레오티드
를 이용하여 pBSEIVAIPHA로부터 PCR에 의해 유도되었다. 올리고뉴클레오티드 EIVAIPHA5P (SEQ ID NO:281)는 우두 바이러스 H6 프로모터(Goebel 등, 1990 a, b)의 3'-대부분 26bp (NruI 위치로 부터)를 제공한다. 1.7kb PCR-유도된 단편을NruI 분해된 pCPCV1 속에 삽입하여 pC3EIVAIPHA를 생성하였다. pCPCV1은 H6 프로모터를 포함하는 삽입 벡터이다. 적당한 방향으로 1.7kb 블런트-말단 단편을 삽입하면 H6 프로모터 3'쪽에 EIV HA를 위치시킨다. 플라스미드 pCPCV1은 하기와 같이 유도되었다. pTP15 (Guo등, 1989)의PstI 위치에 FeLVenv유전자(Guilhot등, 1987) 포함 2.4kb 단편을 포함하고 있는 플라스미드 pFeLV1A를PstI으로 분해하여 FeLV 서열을 절단하고 재결합시켜서 플라스미드 pFeLVF4를 생성하였다. 우두 바이러스 H6 프로모터 요소 및 폴리링커 부위를 pFeLVF4로부터kpnI 및HpaI으로 분해시켜서 방출시켰다. 150bp 단편을 T4 DNA 중합효소를 이용하여 블런트-말단화시키고, 카나리아폭스 DNA의 3.3kbPvuⅡ 게놈 단편을 포함하는 플라스미드 pRW 764.2 속에 삽입시켰다. pRW 764.2를EcoRI으로 선형화시켰는데EcoRI은 카나리아폭스서열내에서 특유한EcoRI 위치를 인식한다. 그리고 E.coli DNA 중합효소의 클리나우 단편을 이용하여 블런트-말단화시켰다. 결과적인 플라스미드를 pCPCV1으로 나타냈다. 이 플라스미드는 카나리아폭스 바이러스 상동성 서열에 의해 측면위치되고 폴리링커 부위가 다음에 오는 우두 바이러스 H6 프로모터를 포함한다.
실시예 43-NYVAC 및 ALVAC 속에 EIV HA (A2/ 퐁텐블로/79)를 삽입하기 위한 발현카세트의 제조
정제한 EIV (A2/퐁텐블로(Fontainebleau)/79) 게놈 RNA는 Rhone-Merieux (프랑스 리용)에 의해 제공되었다. EIV-특이적인 cDNA를 Gubler 및 Hoffman (1983)에 의해 기술되고 EIV (A1/Prague/56) cDNA 제조에 대해 기술된 것처럼 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 EIVSIP (SEQ ID NO:278)을 제 1-가닥 cDNA 합성에 이용하였다.
HA 유전자의 완전-길이 cDNA 클론을 포함하는 세균콜로니를 스크리닝하기 위해, 형질전환된 콜로니의 8 푸울(pool)을 500㎖ 배양물에서 증폭시키고 플라스미드 DNA 제조물을 표준방법에 의해 얻었다 (Sambrook 등, 1989). 올리고뉴클레오티드 EIVSIP (SEQ ID NO:278) 및 EIVS2H (SEQ ID NO:283) (5'-ATCATCAAGCTTAG-TAGAAACAAGG-3')와의 표준 PCR 반응에서 전체 플라스미드 DNA를 주형으로 이용했다. 그러한 반응은 모든 8 EIV 게놈절편의 단지 완전-길이 cDNA 서열을 가능성 있게 증폭시킬 수 있는데, 이것은 이 프라이머가 8 절편의 5' 및 3'말단에 있는 보존되는 서열에 상보적이기 때문이다. 주형으로서 플라스미드 제조물 pPEIVA2F-5은 완전-길이 HA-특이적인 단편의 크기와 일치하는 1.8kb PCR- 유도된 단편을 생성하였다. 이 PCR-유도된 단편을 cDNA 라이브러리의 나머지에 대한 프로브로서 이용하기 위하여 PCR에 의해 재-증폭시켰다. 이 프로브를 이용하여 클론 pEIVA2FHA-7 및 -8을 확인하고 cDNA 삽입체를 통상 합성된 올리고뉴클레오티드를 이용한 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 분석하였다 (Goebel등, 1990a).
뉴클레오티드 서열분석은 클론 #7 및 #8이 EIV (A2/ 퐁텐블로/79) HA 코딩서열의 3'-대부분 1200bp를 나타낸다는 것을 보였다 (도 24) (SEQ ID NO:284).
1200bp EIV 서열은 올리고뉴클레오티드 A2F3P (SEQ ID NO:285) (5'-ATCATCACTAGTATAAAAATCAAATGCAAATGTTGCATCTGATGTTGCC-3') 및 A2FBAM2 (SEQ ID NO:286) (5'-ATCATCGGATCCATCACCCGAGCACAAACAATGAGCAG-3')을 이용하여 PCR에 의해 클론 #7로부터 증폭되었다.BamHI 분해후 이 1200bp 단편의 5'-말단은 제 24 도 (SEQ ID NO:284)에서 완전한 EIV (A2/ 퐁텐블로/79) HA 코딩서열의 뉴클레오티드 617에 해당된다. 이 단편을 올리고 뉴클레오티드 A2F3P (SEQ ID NO:285)를 이용하여 코딩서열 3' 쪽에 고안된SpeI으로 분해시켰다. 이 1200bp 단편을 5'-대부분 616bp를 포함한 단편과 (하기에서 정의됨)SmaI/SpeI 분해된 pBS-SK (Stratagene, La Jolla,CA) 속에 공-삽입하였다. 그러나 가능한 형질전환체의 스크리닝은 단지 1200bp 단편만이 삽입된다는 것을 나타냈다. 뉴클레오티드 서열분석을 위해 수많은 클론을 선택하였다.
수많은 클론의 뉴클레오티드 서열 분석후에 앞으로의 조작을 위해 pBSEIVA2FHA-19를 선택하였다. 이 클론은 뉴클레오티드 617 (도 24) (SEQ ID NO:284) 및 뉴클레오티드 1570 (도 24) (SEQ ID NO:284)에 있는BamHI 위치 가까이에 결함을 포함하였다. 이 결함을 정정하기 위하여 하기의 조작을 행하였다. 플라스미드 pBSEIVA2FHA-19를BamHI 및SphI으로 분해시키고 절단된 900bp 단편을 분리하였다. 이 단편을 HA 코딩서열의 3'-대부분 부위를 둘러싸는 250bpSphI/SpeI 단편과SpeI/BamHI으로 분해된 pBS-SK 속에 공-삽입시켰다. 이 250bp PCR 단편은 주형으로서 클론 #7(상기) 및 올리고뉴클레오티드 A2F3P (SEQ ID NO:285) 및 A2F6 (SEQ ID NO:287) (5'-TTGACTTAACAGATGCAG-3')을 이용하여 유도되었다. 결과적인 플라스미드를 pEIVH33P로서 나타냈다.
EIV HA에 대한 HA 코딩서열의 5'-대부분 616bp를 하기의 방법으로 생성하였다. 먼저 첫번째-가닥 cDNA를 상기와 같이 생성하였다. 그 다음 이 첫번째-가닥 cDNA 제조물을 주형으로 이용하여 올리고 뉴클레오티드 A2F5P (SEQ ID NO:288) (5'-ATGAAGACAACCATTATTTTG-3') 및 A2FBAM1 (SEQ ID NO:289)(5'-TGTTGAGACTGTTAC-TCG-3')를 이용한 PCR에 의해 이 서열을 증폭시켰다. 이 단편을HincII 분해된 pBS-SK (Stratagene, La Jolla, CA)속에 삽입시키고 결과적인 플라스미드를 pEIVH35P로 나타냈다.
우두 바이러스 H6 프로모터 서열 (Goebel등, 1990 a,b) 및 HA 코딩서열의 5'-대부분 부위를 하기의 방법으로 증폭시키고 융합시켰다. H6 서열은 pBSH6IIIBE라 불리우는 H6 프로모터에 정확하게 결합된 HIV-1 (IIIB)env유전자를 포함하는 pBS-기초 플라스미드로부터 유도되었다. 이 서열을 올리고뉴클레오티드 H65PH (SEQ ID NO:164)(5'-ATCATCAAGCTTGAT TCTTTATTCTATAC-3') 및 H63P (SEQ ID NO:291) (5'-TACGATACAAACTTAACGG-3')을 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 올리고뉴클레오티드 H65PH (SEQ ID NO:164) 및 EIV5PACC (SEQ ID NO:292)(5'-GGTTGGGTTTTG-ACTGTAGACCCAATGGGTCAGTAGTATCAAAATAATGGTTGTCTTCATTACGATACAAACTTAACGG-3')와 주형으로 120bp H6 단편을 이용하여 H6 프로모터 및AccI 제한위치까지 HA 코딩서열의 초기 41bp를 포함하는 161bp 단편을 생성하였다. 이 단편을HindIII 및AccI으로 분해하고 pEIVH35P의 550bpAccI/BamHI 단편과HindIII/BamHI 분해된 pBS-SK 속에 공-삽입하였다. 결과적인 플라스미드를 pH6EIVH35P로서 나타냈다.
전체 HA 발현 카세트는 pH6EIVH35P의 710bpHindIII/BamHI 단편 및 pEIVH33P의 1200bpBamHI/SpeI 단편을HindIII와SpeI으로 분해된 pBS-SK 속에 공-삽입시킴으로써 유도되었다. 유도된 플라스미드를 pBSA2FHAB로서 나타냈다.
뉴클레오티드 위치 617에서의BamHI 위치 가까이 상기에서 표시한 염기 변화를 정정하기 위해 만데키 방법 (Mandecki, 1986)을 이용하였다. pBSA2FHAB를BamHI으로 선형화시키고 올리고뉴클레오티드 A2F7 (SEQ ID NO:293)(5'-CAATTTCGA-TAAACTATACATCTGGGGCATCCATCACCCGAGCACAAACAATGAGCAGACAAAATTG-3')을 이용하여 돌연변이 유발방법을 수행하였다. HA의 정정된 형태를 포함하는 플라스미드를 pBSA2FHA로 표시하였다.
실시예 44-각각 vCP128 및 vP961을 생성하는데 이용된 삽입 플라스미드 pEIVC5L 및 pEIVHAVQVV의 제조
플라스미드 pC3EIVAIPHA를NruI 및HindIII로 분해하여 H6 프로모터의 3'-대부분 26bp 및 전체의 EIV (A1/Prague/56) HA 코딩서열을 포함하는 1.7kb 단편을 절단하였다. 클리나우로 블런트-말단화시키고, 이 단편을NruI/EcoRI으로 분해되고 클리나우로 블런트-말단화된 플라스미드 pRW838 속에 삽입시켜서 플라스미드 pC5AIPHA를 제공하였다. 플라스미드 pRW838은 카나리아폭스 삽입 플라스미드 (C5 유전자좌)에서 우두 바이러스 H6 프로모터에 융합된 광견병 G 유전자 (Kieny 등, 1984)를 포함한다.NruI 및EcoRI 분해는 H6 프로모터의 5'-대부분 100bp 및 C5 측면부 암 뒷쪽에 남게되는 광견병 G 유전자를 절단한다.
플라스미드 pC5AIPHA를SmaI 및SacI으로 분해하여 H6 프로모터 및 EIV (A1/Prague/56) 코딩서열의 5'-대부분 645bp를 포함하는 820bp 단편을 절단하였다. HA 코딩서열의 나머지를 포함하는 pC3EIVAIPHA의 1.1kbSacI/HindIII 단편과 함께 이 단편을HindIII 및SmaI으로 분해된 pBS-SK 속에 공-삽입시켰다. 결과적인 플라스미드를 pBSAIPHAVQ로서 나타냈다.
그다음 플라스미드 pBSAIPHAVQ를SpeI 및SmaI으로 선형화시켰다. 이 4.7kb 단편을 pBSA2FHA로부터 유도된 1.8kbSpeI/부분HincII 단편에 결합시켰다. 헤드 대 헤드 배열로 EIV (A1/Prague/56) 및 (A2/ 퐁텐블로/79) HA 유전자를 포함하는 결과적인 pBS-기초 플라스미드를 pBSAIPA2FHAVQ로서 나타냈다.
두 HA 유전자를 포함하는 pBSAIP2FHAVQ에서 유도된NotI/XhoI 단편 (3.5kb)을 분리하고 pSD542 (EIV (A2/Suffolk/89)에 대해 하기에서 기술됨) 및 pC5L 속에 삽입하여 각각 삽입 플라스미드 pEIVHAVQVV 및 pEIVC5L을 제공하였다.
C5L 삽입 플라스미드는 하기와 같이 유도되었다.
코스미드(cosmid) 벡터 pVK102 (Knauf 및 Nester, 1982)를 이용하여, vCP65 (C5 유전자좌에 광견병을 갖는 ALVAC-기초 광견병 G 재조합체)에 대한 게놈 라이브러리를 제조하였다. 이 라이브러리가 pRW764.5(C5 유전자좌) 내에 포함된 0.9kbPvuII 카나리아폭스 바이러스 게놈 단편으로 프로브 조사되었다. 이 카나리아폭스 DNA 서열은 원래의 삽입 유전자좌를 포함한다. 29kb 삽입체를 포함하는 클론을 생장시키고 pHCOS1으로 표시했다. C5 서열을 포함하는 이 코스미드로부터 3.3kbClaI 단편을 서브클로닝하였다. 이ClaI 단편의 서열분석을 이용하여 1-1372로부터 C5 유전자좌의 유전자 지도를 연장시켰다.
C5 삽입벡터 pC5L을 두단계로 제조하였다. 1535bp 좌측암은 올리고뉴클레오티드 C5A (SEQ ID NO:294) (5'-ATCATCGAATTCTGAATGTTAAATGTTATACTTTG) 및 C5B (SEQ ID NO:295) (GGGGGTACCTTTGAGAGTACCACTTCAG-3')를 이용하여 PCR 증폭에 의해 생성되었다. 주형 DNA는 vCP65 게놈 DNA였다. 이 단편을EcoRI/SmaI 분해된 pUC8 속에 클로닝하였다. 서열을 표준 서열결정 프로토콜에의하여 확인하였다. 404bp 우측암은 올리고뉴클레오티드 C5C (SEQ ID NO:296)(5'-ATCATCCTGCAGGTATTCTAAA-CTAGGAATAGATG-3') 및 C5DA (SEQ ID NO:297) (5'-ATCATCCTGCAGGTATTCTAAACT-AGGAATAGATG-3')를 이용하여 PCR 증폭에 의해 생성되었다.
그다음 이 단편을SmaI/PstI으로 분해된 좌측암을 포함하는 이전에 생성된 벡터속에 클로닝하였다. 전체 구조체는 표준 서열 분석에 의해 확인되고 pC5L로 표시되었다. 이 삽입 플라스미드는 외부 유전자를 C5 유전자좌속에 삽입할 수 있게 한다.
실시예 45-인플루엔자 바이러스 (A2/SUFFOLK/89) 헤마글루티닌 유전자를 발현하는 ALVAC- 및 NYVAC-기초 재조합체를 생성하기 위한 삽입 플라스미드의 제조
말 인플루엔자 바이러스 (A2/Suffolk/89)의 헤마글루티닌(HA)유전자를 포함하는 M13클론은 Dr. M. Binns(Animal Health Trust, P.O.Box 5, New market, Suffolk, CB8 7DW,영국)에 의해 제공되었다. 이 클론은HindIII 위치를 통해 M13 벡터속에 삽입된 HA 유전자를 포함하는 완전-길이 1.7kb cDNA 단편을 포함한다.
처음에는 말 인플루엔자 바이러스 (EIV) HA 유전자는 올리고뉴클레오티드 EIVS1 (SEQ ID NO:298)(5'-ATGAAGACAACCATTATTTTG-3') 및 EIVS2 (SEQ IN NO:299) (5'-TCAAATGCAAATGTTGCATCT-3')을 이용하여 PCR에 의해 상기 M13 클론으로부터 증폭되었다. 이 1.7kb 단편을SmaI으로 분해된 pBS-SK (Stratagene, La Jolla, CA) 속에 결합시켰다. 두 포지티브 클론을 얻어서 뉴클레오티드 서열분석(Goebel 등, 1990 a)에 의해 분석하였다. 클론 B가 도 25에서 제공된 서열 (SEQ ID NO:300)과 비교할때 3개의 비-보존 염기변화를 포함하지만 클론 A는 하나의 비-보존 염기변화를 포함하였다. EIVHA 유전자의 완전-길이의 정확한 형태를 생성하기 위해 클론 B를SacI 및MscI으로 분해하여 390bp 단편을 절단하였다. 이 단편을 클론 A에서 유도된 4.3kbMscI/부분SacI 단편속에 결합시켰다. 이것은 정정된 EIVHA를 제공하였고, pBSEIVHS로 표시했다.
EIVHA 코딩서열의 5'-대부분 360bp는 올리고뉴클레오티드 I3L5EIV (SEQ ID NO:301) (5'-GTTTAATCATGAAGACAACCATTATTTTGATAC-3') 및 EIVPVU (SEQ ID NO:302) (5'-AGCAATTGCTGAAAGCGC-3')을 이용한 PCR에 의해 pBSEIVHS로부터 유도되었다. 전체의 I3L 프로모터 부위 (Goebel 등, 1990 a,b)는 올리고뉴클레오티드 I3L5B5 (SEQ ID NO:303) (5'-ATCATCGGATCCCGGGACATCATGCAGTGGTTAAAC-3') 및 EIV5I3L (SEQ ID NO:304)(5'-CAAAATAATGGTTGTCTTCATGATTAAACCTAAATAATTGTAC-3')를 이용하여 PCR에 의해 pMPI3L101로부터 유도되었다. 올리고뉴클레오티드 I3L5B5 (SEQ ID NO:303) 및 EIVPVU (SEQ ID NO:302)와의 PCR에의한 올리고뉴클레오티드 I3L5EIV (SEQ ID NO:301) 및 EIV5I3L (SEQ ID NO:304)의 고안에 의해 제공된 상보성에 기인하여 이러한 단편들을 융합시켜서 480bp 단편을 생성하였다.
플라스미드 pMPI3L101은 I3L 프로모터의 조절하에 광견병 당단백질을 암호화하는 유전자로 구성되는 발현카세트를 포함하는데, 모두 ORF C6L-K1L이 삭제된 우두 바이러스 삽입 플라스미드 속에 삽입되었다 (Goebel등, 1990 a,b). I3L 프로모터는 ORF I3L의 캐시코돈 바로 윗쪽의 101염기 (뉴클레오티드 64, 973-65, 074 Goebel등, 1990 a,b)로 구성된다.
EIVHA 코딩서열의 5' 부위에 정확하게 I3L 프로모터를 연결하는 상기에서 유도된 융합 단편을BamHI (5'-말단) 및AccI (3' 말단)으로 분해시키고 400bp 단편을 분리하였다. 이 단편을 pBSEIVHS에서 유도된 4.6kbBamHI/부분AccI 단편에 결합시키고 결과적인 플라스미드를 pBSEIVHSI3L로 표시했다. EIVHA 발현 카세트를 포함하는 1.8kbSmaI/XhoI 단편은 pBSEIVHSI3L에서 유도되었다. 이 단편을 SmaI/XhoI 분해된 pSD542 (실시예 32에서 기술됨) 삽입벡터 속에 삽입시켜서 pTKEIVHSI3L을 생성하였다.
pBSEIVHEI3L(상기)의 1.8kbSmaI/XhoI 단편을SmaI/XhoI으로 분해된 CPpp (ALVAC) 삽입 플라스미드 VQCP3L 속에 삽입시켰다. 결과적인 플라스미드를 pC3EIVHSI3L로 나타냈다.
삽입 플라스미드 VQCP3L을 하기와 같이 얻었다. VQCPCP3L은 pSPCP3L (실시예 32에서 정의됨)로부터XmaI 분해, 선형화된 플라스미드의 포스파타제 처리, 및 어닐링되고 키나제 처리된 올리고뉴클레오티드 CP23 (SEQ ID NO: 305) (5'-CCGG-TTAATTAATTAGTTATTAGACAAGGTGAAAACGAAACTATTTGTAGCTTAATTAATTAGGTCACC-3') 및 CP24 (SEQ ID NO:306) (5'-CCGGGGTCGACCTAATTAATTAAGCTACAAATAGTTTCGTTTTCACCTTGTCTAA-TAACTAATTAATTAA-3')과의 결합에의하여 유도되었다.
실시예 46-ALVAC-말 인플루엔자 바이러스 재조합체의 개발
플라스미드 pEIVC5L은 말-1, A1/Prague/56(H7)및 말-2, A2/ 퐁텐블로/79(H3)에 대한 헤마글루티닌 코딩서열을 포함한다. 두 유전자가 우두 바이러스 H6 프로모터에 결합되고 탈-ORF된 C5 유전자좌에 삽입되었다. 삽입된 DNA를 방출하기 위해 생체외 재조합에서 레스큐 바이러스로서 ALVAC 바이러스를 이용하였다. H7 및 H3 코딩서열과의 혼성화의 기초하에 포지티브 플라크를 선택하였다. 두 외부 유전자를 포함하는 순수집단에 도달할때까지 재조합체 플라크를 플라크 정제하였다. 이때 재조합체를 vCP128이라고 하고 스톡 바이러스를 확립하였다. H3 헤마글루티닌에 특이적인 모노클로날 항체 및 말의 폴리클로날 항-H7 혈청을 이용하여 면역 형광분석을 수행하였다. 두 시약을 이용하여 vCP 128 감염 VERO세포에서 표면 형광이 검출되었는데, 이것은 감염된 세포표면에서 두 항원이 적당히 제공된다는 것을 나타낸다.
H3 특이적인 모노클로날항체를 이용한 면역 침전분석은 vCP128 감염된 CEF 세포에서의 대략 75kd인 단백질의 존재를 나타냈다. 이것은 가능성 있게 HAo 전구체 당단백질을 나타낸다. 어떤 절단 산물은 검출되지 않았다. H7 특이적인 폴리클로날 혈청을 이용한 면역 침전분석은 대략 75kd인 전구체 당단백질의 존재를 나타냈다. 또한 각기 대략 45 및 35kd의 분자량을 갖는 HA1및 HA2절단 산물도 시각적으로 보였다.
플라스미드 pC3EIVHS13L은 말-2 A2/Suffolk/89 서브 유형의 헤마글루티닌 코딩서열을 포함한다. 이 유전자가 우두 바이러스 I3L 프로모터에 결합되고 탈-ORF된 C3 삽입 위치에서 삽입되었다. 외부 유전자를 방출하기 위하여 생체외 재조합에서 레스큐 바이러스로 ALVAC 바이러스를 이용하였다. H3 특이적인 방사성 표지된 프로브와의 혼성화에 기초하여 재조합체 플라크를 선택하였다. 순수한 재조합체 군집에 도달할때까지 포지티브 플라크를 플라크 정제하였다. 이때 재조합체를 vCP159라 하고 바이러스 스톡을 확립하였다. 병아리의 H3 특이적인 폴리클로날 혈청을 이용한 vCP159 감염 CEF 세포에서의 면역 형광분석은 감염된 세포 표면에서 면역학적으로 인식되는 단백질이 발현되는 것을 나타낸다.
실시예 47-말의 인플루엔자 바이러스 서브유형의 헤마글루티닌 당단백질을 포함하는 NYVAC 재조합체의 개발
플라스미드 pEIVHAVQVV는 말-1, A1/Prague/56(H7) 및 말-2 A2/퐁텐블로/ 79(H3)를 암호화하는 서열을 포함한다. 두 유전자를 우두 바이러스 H6 프로모터에 결합시키고 TK 위치에 삽입시켰다. NYVAC(vP866)을 외부유전자를 방출하기 위한 생체외 재조합에서 레스큐 바이러스로 이용하였다. 방사성 표지된 H3 및 H7 특이적인 단백질과의 혼성화에 기초하여 재조합체 플라크를 선택하였다. 순수한 군집에 도달할때까지 재조합체 자손 바이러스를 플라크 정제하였다. 이때 재조합체를 vP961이라하고 바이러스 스톡을 확립하였다. H3 특이적인 모노클로날항체 및 폴리클로날 항-H7 혈청을 이용한 면역형광분석은 감염된 세포표면에서 두 당단백질이 발현되는 것을 나타냈다. 동일한 시약으로의 면역침전 분석은 H3 당단백질이 대략 75kd의 분자량을 갖는 전구체 당단백질로서 발현된 것을 나타냈다. 어떤 절단 산물도 증거화되지 않았다. H7 당단백질은 각각 대략 45 및 30kd의 분자량을 갖는 HA1및 HA2절단산물과 대략 75kd의 전구체 당단백질로서 명백하였다.
플라스미드 pTKEIVHSI3L은 말-2 A2/Suffolk/89 헤마 글루티닌 당단백질의 코딩서열을 포함한다. 코딩서열을 I3L 프로모터에 결합시키고 TK 위치에서 삽입시켰다. NYVAC (vP866)을 레스큐 바이러스로서 이용하였고 H3 특이적인 방사성 표지된 프로브와의 혼성화를 기초로하여 재조합체 플라크를 선택하였다. 순수 군집에 도달할때까지 재조합체 플라크 자손을 플라크 정제하였다. 이때 재조합체를 vP1063 이라하고 바이러스 스톡을 확립하였다. 병아리의 폴리클로날 항-H3 혈청을 이용한 면역 형광 분석은 감염된 세포 표면에서 면역학적으로 인식되는 단백질이 발현되는 것을 나타냈다.
실시예 48-우두 바이러스/FELV 삽입 플라스미드의 제조
FeLV (Feline Leukemia Virus;고양이 백혈병 바이러스)envDNA 서열은 M13 mp8 벡터(Messing, 1983) 속에 삽입된 2.4kbp FeSV-SM DNA (Guilhot 등, 1987) 단편의 형태로 Dr. F. Galibert (Laboratories d'Hematologie Experimentale Hospital Saint-Luis, 프랑스 파리)에 의해 공급되었다. 전체의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 이러한 2.4kbpPstI/KpnI 단편 (FeLV p70+p13E)을 분리하고 편의를 위해 pUC18속에 삽입시켰다 (Messing, 1983),env서열의 3' 말단의KpnI 위치가PstI 위치로 전환되고, 2.4kbpPstI 단편을 분리하고PstI 분해된 pTp15속에 결합시켰다 (Guo 등, 1989). 결과적인 플라스미드를 pFeLV1A로 표시했다.
생체외 돌연변이유발 (Mandecki, 1986)을 이용하여 pFeLV1A를 pFeLV1B로 전환시켰다. 이것은 올리고뉴클레오티드 SPBGLD (SEQ ID NO:307) (5'-AATAAATCA-CTTTTTATACTAATTCTTTATTCTATACTTAAAAAGT-3')을 이용하여 행해졌다. 이 올리고뉴클레오티드로의 돌연변이 유발은 H6 프로모터와 HA 서열의 경계선에 있는BgℓII 위치의 제거를 가능하게 했다. 이것은 바이러스에서 발견되는 것처럼 이 DNA 절편의 실제 서열을 제공한다. 다음에는 올리고뉴클레오티드 FeLV5P (SEQ ID NO:308)(5'-CGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATGGAAGGTCCAAACGCACCCA-3')로 플라스미드 pFeLV1B를 돌연변이화하여 pFeLV1C를 생성하였다. 생체외 돌연변이 유발은 하기의 변경내용과 Mandecki (1986)에 의해 기술된 대로 행하였다. 유일한SmaI 위치에서 pFeLV1B를 분해하고 나서, DNA를Baℓ31로 분해하였다. 5초, 10초, 20초, 40초, 및 80초 후 분액을 취하고 최종농도 20mM로 EGTA를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 분액을 모아서 돌연변이유발 반응에 이용했다. 결과적인 플라스미드 pFeLV1C는 우두 바이러스 H6 프로모터에 3' 병치된 FeLVenv유전자를 포함하여 ATG의 ATG로의 치환이 존재하였다. 레스큐 바이러스로서 vP425와의 생체외 재조합 테스트에 플라스미드 pFeLV1C를 이용하여 전체 FeLV 엔벨로프 당단백질을 발현하는 재조합체 우두 바이러스(vP453)를 제조하였다.
pFeLV1D를 생성하기 위한 시약으로서 플라스미드 pFeLV1C를 이용하였다. 이 재조합체 플라스미드는 그것이 추정되는 면역 억제 부위가 결핍된 것을 제외하고는 전체 FeLVenv유전자를 포함한다 (Cianciolo 등, 1985; Mathes등, 1978). 면역억제 부위를 암호화하는 서열 (뉴클레오티드 서열 2252-2332, Guihot 등, 1987)은 하기의 방법으로 생체외 돌연변이 유발(Mandecki,1986)에 의해 삭제되었다. 플라스미드 pFeLVIC를BsmI으로 선형화하였다. 선형화된 플라스미드를Baℓ31로 처리하고 1분, 2분, 4분, 및 8분경에 분액을 취하고 돌연변이유발 반응에서 이용하기 위해 모았다. 생체외 돌연변이 유발은 올리고뉴클레오티드 FeLV1SD(SEQ ID NO:309)(5'-ACCTCCCTCTCTGAGGTAGTCTATGCAGATCACACCGGACTCGTCCGAGACAATATGGCTAAATT-AAGAGAAAGACTAAAACAGCGGCAGCAACTGTTTGACTCCCAACAG-3')을 이용하여 행해졌다. VP 456을 생성하기 위한 레스큐 바이러스로서 vP410과의 생체의 재조합 테스트에서 결과적인 플라스미드 pFeLV1D를 이용하였다. 추정 면역억제 부위가 결핍된 전체 엔벨로프 당단백질을 발현하는 우두 바이러스 재조합체가 생성되었다.
실시예 49-아비폭스 바이러스/FeLV 삽입 플라스미드의 제조
FP-1재조합체의 제조를 위하여, pFELV1A (상기에서 기술됨)으로부터 2.4 kbp H6/Felvenv서열이BgℓII로 그리고PstI으로 부분 분해에 의해 삭제되었다.BgℓⅡ위치는 H6프로모터서열의 5' 경계에 있다.PstI위치는 엔벨로프 당단백질 오픈리딩 프레임에 대한 번역종결 시그날로부터 420bp 아랫쪽에 위치되어 있다. 2.4kbp H6/FeLVenv서열을BamH1 및PstI으로 분해된 pCE11속으로 삽입시켰다. FP-1 삽입 벡터 pCE11은 비필수 적인HindⅡ위치 속에 다수의 클로닝위치를 삽입시켜서 pRW 731.13으로부터 유도되었다. 이 삽입 벡터는 FP-1 게놈의 생성을 허용한다. 재조합체 FP-1/FeLV삽입 플라스미드를 pFeLVF1으로 나타냈다. 이 구조체는 정확한 ATG의 ATG로의 치환을 제공하지 않는다.
정확한 ATG:ATG구조체를 이루기 위해서, 우두 바이러스 삽입 벡터 pFeLV1C (여기에 기술됨)로 부터 대략 1.4kbp의NruI/SstⅡ단편을 유도하였다.NruI 위치는 ATG에서 윗쪽으로 포지티브 24bp의 H6 프로모터내에 있다.SstⅡ 위치는 ATG로 부터 아랫쪽 1.4kbp 및 번역종결코돈으로부터 윗쪽1kbp에 위치한다.NruI/SstⅡ단편을 9.9kbp 단편에 결합시켰는데, 이것은 pFeLVF1을SstⅡ 분해 및NruI부분 분해시켜서 생성되었다. 이 9.9kbp 단편은 5.5kbp FP-1측면부암, PUC벡터서열,env유전자의 아랫쪽 부분에 해당되는 FeLV서열 1.4kbp, 및 H6 프로모터의 5'-대부분부분 (대략100bp)을 포함한다. 결과적인 플라스미드를 pFeLVF2로 나타냈다. 정확한 ATG:ATG구조체를 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 확인하였다. 추가의 FP-1 삽입벡터 pFeLVF3는 추정 면역억제부위(상기에서 기술함)에 해당된 FeLVenv서열을 제거함으로써 FeLVF2로부터 유도되었다. 이것은 우두 바이러스 삽입 벡터 pFeLV1D (상기에서 기술함)에서 얻은 대략 1kbp의PstI/SstⅡ 단편을 분리하고, 이 단편을 pFeLVF2의PstI 및SstⅡ분해에 의해 얻은 남아있는 H6/FeLVenv유전자를 포함하는 10.4kbpPstI/SstⅡ단편 속에 삽입하여 수행하였다.
레스큐 바이러스로서 FP-1과의 생체외 재조합 테스트에서 삽입 플라스미드 pFeLVF2 및 pFeLVF3을 이용하였다. 10일된 배를 가진 계란(SPAFAS,Storrs,CT)로부터 얻어진 일차 병아리 배 피브로블라스트(CEF) 단일층에 자손 바이러스를 플레이팅하였고 재조합체 바이러스를 CEF 단일층에서의 플라크 혼성화에 의해 스크리닝하였다. 혼성화 분석에 의해 확인된 재조합체 자손을 선택하여 균질적인 군집에 도달하도록 네번 플라크 정제하다. 전체 FeLVenv유전자를 수용한 FP-1 재조합체를 vFP25라고 하고 포함하는 FP-1재조합체를 vFP32라고 하였다.
cP재조합체를 제조하기 위하여,H6/FeLVenv서열을 포함하는 2.2kbp 단편을 pFeLVF2 및 pFeLVF3에서KpnI 및HpaI 분해에 의해 절단하였다.KpnI 위치는 H6 프로모터서열의 5'경계에 있다.HpaI 위치는 엔벨로프 당단백질 오픈리딩 프레임에 대한 번역 종결시그날로부터 180bp아랫쪽에 위치한다. 이 분리한 단편을 블런트-말단화시켰다. 이 2.2kbp H6/FeLVenv서열을 삽입 플라스미드 pRW 764.2의 비필수적인EcoRI 위치속에 삽입하고EcoRI 위치를 블런트-말단화시켰다. 이 삽입 벡터는 CP 게놈의 C3 유전자좌에서 외부 유전자를 수용한 CP 재조합체의 생성을 가능하게 한다. 재조합체 CP 삽입 플라스미드를 각각 pFeLVCP2 및 pFeLVCP3으로 나타냈다.
레스큐 바이러스로서 CP와 생체외 재조합 테스트에서 삽입 플라스미드 pFeLVCP2 및 pFeLVCP3을 이용하였다. 재조합 자손을 10일된 배를 지닌 계란에서 얻은 일차 CEF 단일층 (SPAFAS,Storrs,CT)에 플레이팅하고, 프로브로서 방사성표지된 FeLV DNA를 이용한 혼성화에 의해 재조합체 바이러스를 선택하였다. 포지티브 혼성화 플라크를 선택하고 균질적인 군집에 도달하도록 네번 플라크 정제하였다. 전체 FeLVenv유전자를 발현하는 재조합체를 VCP35로 나타내고 면역억제 부위가 결핍된 전체env유전자를 발현하는 재조합체를 VCP37로 나타냈다.
실시예 50-FeLV-B env유전자를 포함하는 ALVAC-기초 재조합체의 제조
플라스미드 pFeLV env24는 Rhone-Merieux(프랑스 리용)으로부터 얻었고, FeLV-Benv유전자를 포함한다. 이 플라스미드는 NCE 161 FeLV 균주로부터 얻은 4.2kb cDNA 유도된 단편을 포함한다. 플라스미드 pFeLVenv34는 pBS-SK (Strategene,La Jolla,CA)의SmaI 위치에 4.2kb FeLV-B-특이적인 삽입체를 포함한다. FeLV-Benv유전자의 서열은 도 26(SEQ ID NO:310)에서 제공된다. 이 서열에서 개시코돈(ATG) 및 종결코돈(TGA)은 밑줄친 부분이다.
FeLV-Benv에 대한 발현 카세트를 하기와 같이 제조하였다. 우두 바이러스 H6 프로모터는 올리고뉴클레오티드 H65PH(SEQ ID NO:164) (5'-ATCATCAAGCTTGATTC-TTTATTCTATAC-3') 및 H63PFB(SEQ ID NO:311)(5'-GGGTGCGTTGGACCTTCCATTACGATAGAAA-CTTAACGG-3')를 이용한 PCR에 의해 플라스미드 pI4LH6HIV3B(HIV에 대해 여기에 기술됨)으로부터 유도되었다. 이 서열을 이러한 올리고뉴클레오티드로 증폭시켜서 FeLV-Benv코딩서열의 초기 20bp를 포함하는 3'- 말단 및 5'HindⅢ 위치를 갖는 H6 프로모터를 생성하였다.
FeLV-Benv유전자의 5'-부분은 올리고뉴클레오티드 FB5P (SEQ ID NO:312) (5'-CCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGAAGGTCCAAGCG-3') 및 FB5PA (SEQ ID NO:313)(5'-GGGTAAATTGCAAGATCAAGG-3')를 이용하여 pFeLV-Benv34로부터 PCR에 의해 유도되었다. 이 PCR-유도된 단편은 H6 프로모터의 3'-대부분 23bp와의 상동(5'-말단) 및 위치 546에 유일한ApaI위치를 포함한다. 주형으로 상기에서 정의한 두 PCR 단편과 올리고뉴클레오티드 FB5PA(SEQ ID NO:313) 및 H65PH (SEQ ID NO:164)를 이용한 PCR에 의해 H6 프로모터를 FeLV-Benv유전자의 5'-말단에 융합시켰다. PCR융합 단편을HindⅢ 및ApaI으로 분해시켜서 680bp 단편을 생성하였다.
플라스미드 pFeLV-Benv34를ApaI 및NcoI으로 분해하여env유전자의 중간 부분을 포함하는 740bp 단편을 방출시켰다(도 26). 이 유전자의 3'-말단은 주형으로 pFeLV-benv34와 올리고뉴클레오티드 FBT5D (SEQ ID NO:314) (5'-CCCCAT-GCATTTCCATGGCAGTGCTCAATTGGACCTCTGATTTCTGTGTCTTAATAG-3') 및 FB3PX (SEQ ID NO:315)(5'-ATCATCTCTAGAATAAAAATCATGGTCGGTCCGGATC-3')를 이용한 PCR에 의하여 유도되었다. 이 올리고뉴클레오티드로env유전자의 3' 부분을 PCR증폭시켜서 위치 1326-1332에서 T5NT 요소를 제거하였다. 위치1329에서 T를 C로 치환하여 이 서열을 변화시켰다(도 26). 이러한 변화는env유전자산물의 아미노산 서열을 변화시키지는 않는다. 이 유전자의 3'-말단은XbaI위치와 T5 NT서열을 갖도록 고안되었다. 또한 이 PCR-유도된 단편의 5'-말단은 유일한NcoI 위치를 포함한다(위치 1298의 것에 해당한다; 도 26). 이 단편을NcoI 및XbaI으로 분해하여 707bp 단편을 생성하였다.
740bpNcoI/ApaI 및 707bpNcoI/XbaI 단편을ApaI 및XbaI으로 분해된 pBS-SK 속에 공-삽입시켰다. 결과적인 플라스미드를 pBSFB3P로서 나타냈다. 그 다음 pBSFB3P의 1.5kbApaI/XbaI 단편을 FeLV-Benv유전자(상기)의 H6 프로모터 구동되는 5'-말단을 포함하는 680bp PCR단편과 함께HindⅢ 및XbaI으로 분해된 pBS-SK 속에 공-삽입시켰다. 결과적인 플라스미드를 pB5FEB로 나타냈다.
H6 프로모터 구동되는 FeLV-Benv유전자를 포함하는 pB5FEB의 2.2KbHindⅢ/XbaI단편을 분리하고 클리나우 단편으로 블런트-말단화시켰다. 이 블런트-말단화된 단편을SmaI으로 분해된 pC5L(여기서 HIV에 관한 내용참조) 속에 삽입시켜서 pC5LFEB를 생성하였다. 레스큐 바이러스로서 ALVAC(CPpp)와 표준 생체외 재조합 시험에서 플라스미드 pC5LFEB를 이용하였다. 재조합체 플라크를 FeLV-Benv특이적인 DNA 프로브를 이용하여 확인하였다. 세번의 플라크 정제후 바이러스를 증식시키고 VCP177로 나타냈다.
실시예 51-ALVAC-FeLV-A ENV재조합체 바이러스의 제조
FeLV-Aenv서열이 유도된 플라스미드 pFGA-5는 Dr.J.NeIL(University of Glasgow)에 의해 제공되었고 이전에 기술되었다(Stewart등,1986). 처음에는 뉴클레오티드 1 내지 531에 해당되는 531bpPstI/HindⅢ 단편(Stewart등,1986)을 절단하고PstI 및HindⅢ로 분해된 pCPCV1 속에 결합시키고 pC3FA-1으로 나타냈다. 플라스미드 pCPCV1을 하기와 같이 유도하였다. 플라스미드 pFeLV1A를PstI으로 분해하여 FeLV 서열을 절단하고, 재결합시켜서 플라스미드 pFeLVF4를 생성하였다. 우두 바이러스 H6 프로모터 요소(Taylor 등,1988)와 폴리링커 부위를 pFeLVF4로부터KpnI 및HpaI분해에 의해 방출시켰다. 150bp 단편을 T4 DNA 중합효소를 이용하여 블런트-말단화시키고 카나리아폭스 DNA의 3.3 kbPvuⅡ게놈 단편을 포함하는 플라스미드 pRW764.2 속에 삽입시켰다. pRW764.2를EcoRI으로 선형화시켰는데, 이것은 카나리아폭스 서열내에서 유일한EcoRI 위치를 인식한다. 그리고 E.coli DNA 중합효소의 클리나우 단편을 이용하여 블런트-말단화시켰다. 결과적인 플라스미드를 pCPCV1으로 나타냈다. 이 플라스미드는 폴리링커 부위가 다음에 있고 카나리아 폭스 바이러스 상동 서열에 의해 측면 위치되는 우두 바이러스 H6 프로모터를 포함한다.
플라스미드 pC3FA-1을PstI으로 선형화하고 만데키 방법(1986)을 통한 생체외 반응으로 올리고뉴클레오티드 FENVAH6-1 (SEQ ID NO:316) (5'-CCGTTAAGTTT-GTATCGTAATGGAAAGTCCAACGCAC-3')을 이용하여 돌연변이화하였다. 생체외 돌연변이유발 방법에 의해 외래의 5'-비코딩 서열을 제거하여 우두 H6 프로모터 요소와 FeLV-Aenv서열의 정확한 ATG:ATG 배열이 되었다. 결과적인 플라스미드를 pH6FA-1으로 나타냈다.
FeLV-Aenv유전자의 나머지는 통상 합성된 올리고뉴클레오티드 (Applied Biosystems, San Rafael, CA)를 이용한 표준 PCR에 의해 pFGA-5로부터 유도되었다. 836bp PCR 단편을 주형으로 pFGA-5 및 올리고뉴클레오티드 FENVA-2 (SEQ ID NO:317) (5'-CCATAATTCGATTAAGACACAGAATTCAGAGGTCCAATTGAGCACC-3') 및 FENVAH (SEQ ID NO:318)(5'-CAAGATGGGTTTTGTGCG-3')를 이용하여 얻었다. 이 단편은 FeLV-Aenv유전자의 뉴클레오티드 488 내지 1327에 해당된다 (Stewart 등, 1986). 올리고뉴클레오티드 FENVA-2 (SEQ ID NO:317)의 이용은 위치 1301 내지 1309의 뉴클레오티드 서열을 GAT5GT로부터 GAATTCTGT로 변화시킨다. 이 변화는 폭스바이러스 초기전사 종결시그날로서 인식된다고 알려진 T5NT 서열 모티프를 제거하고 (Yuen 및 Moss, 1987), 이 위치에EcoRI 제한위치를 도입한다. 이 뉴클레오티드 조작은 아미노산 414를 글루탐산에서 보존 아미노산 아스파르트산으로 변화시킨다 (Stewart 등, 1986). 아미노산 415는 이러한 뉴클레오티드 변화에 의해 변경되지 않는다. 이 836bp 단편을HindIII 및EcoRI으로 분해하여 FeLV-Aenv유전자의 뉴클레오티드 532 내지 1302에 해당되는 770bp 단편을 생성하였다.
709bp PCR 단편을 주형으로서 pFGA-5 및 올리고뉴클레오티드 FENVA-3 (SEQ ID NO:319)(5'-GGTGCTCAATTGGACCTCTGAATTCTGTGTCTTAATCGAATTATGG-3') 및 FENVA-4 (SEQ ID NO:320)(5'-ATCATCAAGCTTTCATGGTCGGTCCGG-3')를 이용하여 얻었다. 이 단편은 FeLV-Aenv유전자의 뉴클레오티드 1281 내지 1990에 해당한다 (Stewart 등, 1986). 이 단편을 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오티드 FENVA-3 (SEQ ID NO:319)를 이용하면 836bp PCR 유도된 단편에 대한 상기 내용과 같이 T5NT 요소를 변화시키고EcoRI 위치를 도입시킨다.
709bp 단편을EcoRI/HindIII로 분해시키고, 결과적인 단편을 836bp 단편 (상기)으로부터 얻은 770bpHindIII/EcoRI 단편과 함께HindIII로 분해된 pBS-SK (Stratagene, La, Jolla, CA)속에 공-삽입시켰다. 결과적인 플라스미드를 pF3BS1-B로 나타내고 FeLVenv서열을 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 확인하였다.
우두 바이러스 H6 프로모터에 정확하게 결합된 전체 FeLV-Aenv유전자를 재구성하기 위하여, 1.5kbHindIII 단편을 pF3BS1-B로부터 분리하였다. 이 단편은 FeLV-Aenv의 뉴클레오티드 532 내지 1990에 해당된다 (Stewart 등, 1986). 1.5kbHindIII 단편을HindIII 분해된 pH6FA-1에 결합시켰다. 1.5kbHindIII 단편을 포함하는 플라스미드 구조체가 제한 분석에 의해 적절한 방향에 대해 스크리닝되었고, H6 프로모터에 결합된 전체의 본래 FeLV-Aenv유전자를 포함하는 플라스미드 클론을 pH6FA-3으로 나타냈다.
2.2kb H6/FeLV-Aenv발현카세트는 pH6FA-3으로부터EcoRI 부분 분해와HindIII 부분분해에 의해 절단되었다. 이 단편을HindIII 및EcoRI 분해된 pRW831 속에 삽입시켰다. 결과적인 플라스미드를 pC5FA로서 나타냈다.
pRW831은 외부유전자를 C5 오픈리딩 프레임속에 삽입시키는 것을 가능하게 하는 ALVAC (CPpp) 삽입 플라스미드를 나타낸다. 이 부위내로의 삽입 과정에서, pRW831의 이용은 C5 오픈리딩 프레임 대부분의 삭제를 일으킨다. pRW831을 생성하기 위해 하기의 조작을 행하였다. 카나리아폭스 바이러스 게놈의 880bpPvuII 게놈 단편을 pUC9의PvuII 위치 사이에 삽입시켰다. 결과적인 플라스미드를 pRW764.5 내에 포함된 카나리아 폭스 서열을 뉴클레오티드 서열분석에 의해 분석하고 C5 오픈 리딩 프레임을 밝혔다. 이전에는, C5 ORF내에 위치한 한쌍의BgℓII 위치 사이의 삽입을 이용하여 이 유전자좌에서 재조합체를 고안하였다 (Taylor등, 1992). 전체 부위의 서열은 도 16(SEQ ID NO:220)에 주어져 있다. 뉴클레오티드 서열은PvuII 위치에서 시작된다 (SEQ ID NO:220). C5 ORF는 위치 166에서 개시되고 뉴클레오티드 487에서 종결된다. 이 서열의 정확한 조작은 뉴클레오티드 167 내지 455의 삭제를 가능하게 하였다. 그러한 삭제는 다른 바이러스 유전자의 발현을 방해하지 않도록 행해졌다.
pRW831을 유도하는 방법은 하기와 같다. pRW764.5를RsaI으로 부분 분해하고 선형화된 단편을 분리하였다.RsaI 선형 단편을BgℓIII로 재분해시켰다. 결과적인 2.9kbRsaI/BgℓII 단편 (뉴클레오티드 156 내지 462가 삭제됨)을 분리하고 어닐링된 올리고뉴클레오티드 RW145 (SEQ ID NO:107) 및 RW146 (SEQ ID NO:108)에 결합시켰다. 결과적인 플라스미드를 pRW831로 나타내고, C5 서열 대신에 유일한HindIII,SmaI, 및EcoRI 위치를 갖는 서열을 포함한다.
레스큐 바이러스로서 ALVAC (CPpp)와 재조합 실험에 플라스미드 pC5FA를 이용하였다. 재조합체 바이러스는 방사성 표지된 FeLV-Aenv-특이적인 프로브를 이용한 인시투 플라크 혼성화에 의해 확인하였다. 다음의 혼성화 확인과 함께 세 사이클의 플라크 정제를 한 후, 재조합체를 vCP83으로 표시했다.
실시예 52-p15E의 추정 면역억제 부위가 결핍된 ALVAC-FeLV-A ENV 재조합체 바이러스 제조
추정 면역억제 부위는 FeLV 엔벨로프 당단백질의 p15E 트랜스막 부위내에 위치한다(Cianciolo 등, 1986 ; Mathes 등, 1978). 이 부위를 하기의 방법으로 삭제하였다. 뉴클레오티드 1282 내지 1602의 FeLV-Aenv서열 (Stewart 등, 1986)을 올리고뉴클레오티드 FENVA-3 (SEQ ID NO:320) 및 IS-A (SEQ ID NO:468) (5'-TAAGACTACTTCAGAAAG-3')을 이용하여 pFGA-5로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 뉴클레오티드 1684 내지 1990의env서열(Stewart, 등, 1986)을 올리고뉴클레오티드 FENVA-4 (SEQ ID NO:320) 및 IS-B (SEQ ID NO:323) (5'-GCGGATCACACCGGACTC-3')을 이용하여 pFGA-5로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 전자의 PCR- 유도된 단편을EcoRI으로 분해하고 후자는HindIII로 분해하고 다음에는 ATP 및 T4 키나제로 키나제 처리하였다. 이 단편들을HindIII 및EcoRI으로 분해된 pBS-SK 속에 공-결합시켰다. 결과적인 플라스미드를 뉴클레오티드 서열분석에 의해 확인하고 pBSFAIS-로서 나타냈다. 상기 단편의 결합은 추정 면역억제 부위를 암호화하는 81bp DNA 절편에 서열 5'와 3'을 결합시키고, 따라서 면역억제 펩티드를 암호화하는 서열을 삭제한다.
면역억제 부위를 암호화하는 부위가 결핍된 FeLV-A 서열을 pC5FA로부터SstII/ApaI 분해에 의해 절단하였다. 이 381bp 단편을 pBSFAIS-로부터 300bpSstII/ApaI 단편으로 대체하였다. pC5FA의 4.8kbSstII/ApaI 단편과 상기에서 기술한 300bp 단편을 결합시켰다. 결과적인 플라스미드를 pC5FAISD로 표시했다.
레스큐 바이러스로서 ALVAC (CPpp)와 재조합 실험에서 플라스미드 pC5FAISD를 이용하였다. 재조합체 바이러스를 방사성 표지된 FeLV-Aenv특이적인 프로브를 이용한 인시투 혼성화에 의해 확인하였다. 세 사이클의 플라크 정제후 재조합체를 vCP87로 나타냈다. 이 재조합체는 추정 27 아미노산 면역억제 부위를 암호화하는 부위가 결핍된 FeLV-Aenv유전자를 포함한다. 이 유전자를 C5 유전자좌 속에 삽입하였다.
실시예 53-ALVAC-FeLV-A gag 재조합체 바이러스의 제조
FeLV-Agag/poℓ서열을 플라스미드 pFGA-2gag으로부터 유도하였다. 이 플라스미드는 LTR (651bp)서열 일부, 전체gag유전자, 및poℓ유전자의 1272bp를 포함하는 3.5kbPstI 소단편을 서브클로닝함으로써 FeLV-A 감염성 클론 pFGA-2 (Stewart 등, 1986)로부터 유도하였다. 3.5kb 단편을 PstI 분해된 pUC8 (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD)속에 삽입시켰다. 처음에는, 이 3.5kbPstI FeLV-A DNA 단편을 분리하고 pBS-SK (Stratagene, La Jolla, CA)속에 삽입시켰다. 결과적인 플라스미드를 pBSGAG로서 나타냈다. 전체 3.5kb 삽입체를 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:324) (도 27) 분석하여 개시코돈 위치 (도 27에서 밑줄친 뉴클레오티드 652 내지 654) 및 FeLV-B에 대해 이전에 발표된gag부위의 뉴클레오티드 서열에 정의된 적절한 제한 위치 (Leprevotte 등, 1984)를 확인하였다.
플라스미드 pFGA-2gag을BgℓII 및PstI으로 분해시켜서 2.5kb 단편을 방출시켰다.BgℓII는 뉴클레오티드 위치 1076에 있는 위치를 인식하는 반면 (SEQ ID NO:324),PstI은 FeLV-A 삽입체의 말단에 있는 위치를 인식한다. 2.5kb 단편을 분리하고Hind III 및PstI으로 재분해시켰는데, 이것은 같이 이동되는 플라스미드 서열내의 위치들을 인식한다. 이것은 다음의 결합반응에서 플라스미드 서열이 경쟁할 수 있는 능력을 제거했다.
PCR을 이용하여 FeLV-Agag코딩서열의 5'부분을 유도하였다. 플라스미드 pFGA2gag이 올리고뉴클레오티드 FGAGBGL (SEQ ID NO:325) (5'-GATCTCCATGTAG-TAATG-3') 및 FGAGAGT (SEQ ID NO:326) (5'-CGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTC-TGGAGCCTCTAGTG)와 주형으로 이용되었다. 올리고뉴클레오티드 FGAGATG (SEQ ID NO:326)는 우두 바이러스 H6 프로모터의 3'- 대부분 25 뉴클레오티드를 포함하고 그것의 5'-말단에NruI 위치의 3'-대부분 3bp를 포함한다. 이 H6 서열은 ATG(개시코돈) 및gag코딩서열의 처음 16 뉴클레오티드에 해당되는 뉴클레오티드에 정확하게 연결된다. 올리고뉴클레오티드 FGAGBGL (SEQ ID NO:325)는gag서열의 유일한BgℓII 위치로부터 아랫쪽 59bp 서열의 역 보체에 해당한다 (Leprevotte등, 1984). 이 반응물을 이용한 PCR에 의해 500bp 단편을 생성했고, 이것을 다음에는BgℓII로 분해하여 450bp 단편을 생성하였다.
450bpBgℓII 분해된 PCR-유도 단편을 2.5kbBgℓII/PstI 단편과 함께 공결합시켰는데, 이것은gag유전자의 나머지 및pol유전자 일부, 및NruI과PstI으로 분해된 pCPCV1 (상기의env제조에서 기술함)을 포함한다. pCPCV1 (NruI/PstI)은NruI 인식시그날의 5'- 대부분 3bp를 포함하는 우두 바이러스 H6 프로모터의 5'부분을 포함하고 있다. 결과적인 플라스미드를 pC3FGAG로 나타냈다.
플라스미드 pC3FGAG를PstI으로 선형화하고, 4T DNA 중합효소로 블런트-말단화하고 pSD513 (실시예 7에서 정의함)으로부터 절단된 100bpSspI/SmaI 단편에 결합시켰다. 100bpSspI/SmaI 단편은 FeLV-Agag/pol서열의 3'말단에 종결코돈을 제공한다. 결과적인 플라스미드를 pC3FGAGVQ로서 나타냈다.
FeFV-Agag/pol발현 카세트를 pC3FGAGVQ로부터EcoRI 및HindIII 분해에 의해 절단시켰다. 결과적인 3.4 kb 단편을 분리하고EcoRI 및HindIII 분해된 pC3I (실시예32에서 정의함)과 결합하여 pC3DOFGAGVQ를 생성했다.
레스큐바이러스로서 vCP83 및 vCP87과 생체외 재조합 실험에 플라스미드 pC3DOFGAGVQ를 이용하였다. FeLV-Agag/pol서열 및 전체 FeLV-Aenv유전자를 포함하는 재조합체를 vCP97로 표시한 반면, 동일한gag/pol서열 및 면역억제부위가 결핍된 전체 FeLV-Aenv를 포함하는 재조합체를 vCP93으로 표시하였다.
실시예 54-우두 바이러스 백그라운드속으로 FeLV-A gag의 삽입
삽입플라스미드 pCEN151은 pC3FGAG(상기)의 3.3 kbEcoRI/HindIII 단편을 pSD553의SmaI 위치속에 클로닝함으로써 생성되었다. 이러한 삽입은 단편을 2mM dNTP 존재하에 E. coli DNA 중합효소의 클리나우 단편으로 블런트-말단화시킨후 수행되었다.
플라스미드 pSD553은 COPAK 계열의 우두 삭제/삽입 플라스미드이다. 그것은 ATI 부위 (ORF A25L, A26L; Goebel등, 1990a,b)를 대체하는 측면부 코펜하겐 우두암내에 우두 바이러스 K1L 숙주범위 유전자를 포함한다 (Gillard 등, 1986; Perkus등, 1990). pSD523은 하기와 같이 제조되었다. 플라스미드 pSD541 (실시예10에서 정의함)의 우두 ATI 삭제유전자 좌에 위치한 폴리링커 부위를 하기와 같이 확대하였다. sPD541을BgℓII/XhoI으로 절단하고 어닐링된 상보적인 합성 데옥시올리고뉴클레오티드 MPSYN333 (SEQ ID NO: 329)(5'-GATCTTTTGTTAACAAAAACTAATCAGC-TATCGCGAATCGATTCCCGGGGGATCCGGTACCC-3') 및 MPSYN 334 (SEQ ID NO:330) (5'-TCGAGGGTACCGGATCCCCCGGGAATCGATTCGCGATAGCTGATTAGTTTTTGTTAAC AAAA-3')와 결합시켜서 플라스미드 pSD552를 생성하였다. K1L 숙주범위 유전자를 플라스미드 pSD452 (Perkus등, 1990)로부터 1 kbBgℓII (부분)/HpaI 단편으로 분리하였다. pSD552를BgℓII/HpaI으로 절단하고 K1L 포함단편과 결합하여 pSD553을 생성하였다.
레스큐 바이러스로서 vP866 과 생체외 재조합 실험에서 플라스미드 pCEN151을 이용하여 vP1011을 생성하였다.
실시예 55-ALVAC 재조합체 바이러스에서 FeLV ENV 및 gag 유전자의 면역형광 및 면역침전분석
면역침전.
VERO세포 단일층을 10 pfu/세포에 해당하는 m.o.i.로 어버이 또는 재조합체 바이러스로 감염시켰다. 감염 1시간후에 접종물을 흡출하고, (35S)-메티오닌 (DuPont, Boston, MA; 1000 Ci/mmol), 20μCi/㎖로 보충된 메티오닌- 결핍 배지를 첨가하고 추가로 감염 18시간후까지 배양하였다. 면역침전 및 면역형광분석을 이전에 기술한 대로 (Taylor등, 1990) p27 코어 단백질에 특이적인 모노클로날 항체(Rhone-Merieux, Inc., Athens, GA에 의해 제공됨) 또는 소의 항-FeLV 혈청 (Antibodies, Inc., La Jolla, CA)을 이용하여 수행하였다.
FeLV 바이러스 분리.
첫날에 3x104QN10 세포/웰을 10% FBS, 4μg/㎖ 폴리브렌, 및 둘베코 (Dulbecco) MEM 포함 HEPES 완충액(DFB) 1㎖에서 12-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 배지를 제거하지 않고, 200μℓ의 샘플 (고양이 혈장)을 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서의 2시간 배양후 배지를 1.5㎖의 새로운 DFB로 대체하고 37℃에서 추가로 배양하였다. 5일경에 형질전환에 대해서 플레이트를 조사했다. 음성이면 배지를 1.5㎖의 새로운 DFB로 대체하고 37℃에서 다시 추가배양하였다. 8일경에 형질전환에 대해서 플레이트를 재조사했다. 음성이면 세포를 트립신-EDTA로 두번 세척시켜서 퍼뜨리고 5cm 플레이트에 접촉하기 위해 4㎖ DFB에 놓음으로써 세포를 5cm 플레이트에서 서브배양하였다. 형질전환 조사전에 37℃에서 4일동안 세포를 배양하였다.
면역형광에 의한 FeLV 항원의 검출.
혈액도말을 -20℃에서 MeOH로 5 분간 고정시키고, dH2O로 세척하고 공기건조시켰다. 체적 24μℓ의 토끼 항-FeLV 항체를 다이아몬드 펜으로 도말에 새긴 원내의 혈액도말에 적용했다. PBS로 3번 그리고 dH2O로 1번 세척하기 전에 37℃ 습실에서 1시간동안 항체 존재하에서 도말을 배양하였다. 그 다음 도말을 공기건조시켰다. 체적 25μℓ의 염소 항-고양이 IgG-FITC를 원에 적용하고 일차 항혈청의 상기와 같이 배양하였다. 자외선 광원을 갖는 현미경에서 면역형광을 조사하기 전에 샘플을 일차 항혈청의 상기와 같이 세척하고 건조시켰다.
FeLV 항체 중화분석.
1일경에 5x104QN10 세포/웰을 1㎖ DFB+4μℓ/㎖ 폴리브렌에서 12-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 접종하였다. 혈청희석물을 Leibowitz 배지 50μℓ체적을 이용하여 1:2부터 1:256까지 라운드보텀 96 웰 플레이트에서 제조했다. 1㎖당 4x105포커스형성단위(ffu)로 50μℓ FeLV-A를 첨가했다. 그 웰은 바이러스 컨트롤로서 혈청없는 배지로 포함되었다. 플레이트를 37℃에서 2시간동안 배양하였다. 2시간 흡착기간후 25μℓ의 각 희석물을 QN10 세포의 웰속에 놓았다. QN10 세포상에 25μℓ로 QN10 세포의 접종전에 96-웰 플레이트에서 Leibowitz 배지 50μℓ 체적에서 1:2, 1:4, 1:8, 및 1:16으로 희석함으로써 바이러스 컨트롤을 적정하였다. 플레이트를 3일동안 37℃에서 접종하였다. 날마다 배지를 1㎖의 DFB/웰로 대체하였다. 2일후에 현미경하에서 포커스를 계수했다. 중화항체역가는 바이러스 컨트롤과 비교하여 포커스 카운트의 75% 감소를 나타내는 혈청의 희석도로서 측정되었다.
vCP83 및 vCP87에 의해 발현되는env유전자산물이 감염세포의 원형질막으로 운반되는지를 결정하기 위하여, 면역형광실험을 이전에 기술한 대로 수행하였다 (Taylor등, 1990). 일차 CEF 단일층을 어버이(ALVAC) 또는 재조합체 바이러스 vCP83 및 vCP87로 감염시키고, 소의 항-FeLV 혈청을 이용하여 감염 24시간후에 면역형광법을 수행하였다. 이 결과는 vCP87 또는 어버이 ALVAC 바이러스로 감염된 세포는 어떤 상당한 표면염색을 나타내지 않는 반면, vCP83으로 감염된 세포는 강한 표면형광염색을 보인다는 것을 나타내고 있다.
FeLVenv유전자산물의 발현을 소의 항-FeLV 혈청을 이용한 면역침전분석으로 분석하였다. 비감염 CEF 또는 어버이 ALVAC 바이러스로 감염된 CEF로부터 유도된 용해물에서는 어떤 FeLV-특이적인 단백질종도 침전되지 않았다. vCP83 감염된 세포로부터는 85 kDa, 70 kDa, 및 15 kDa의 겉보기분자량을 갖는 3 FeLV-특이적인 단백질이 침전되었다. 이 결과는 전구체env유전자산물 (85 kDa) 및 완전절단산물 p70과 p15E의 발현과 일치한다. vCP88 감염된 세포에서 유도된 용해물로부터의 면역침전은 83 kDa의 겉보기 분자량을 갖는 단일 FeLV- 특이적인 단백질종을 나타냈다. 이것은 기대치 크기의 비-단백질 분해적으로 프로세싱된env유전자산물의 발현과 다음의 추정면역억제 부위의 삭제와 일치한다. 그리하여 간단히 말하면, 면역억제 부위가 결핍된env의 발현은 명백하게 감염세포 표면으로 적당히 운반되지 않거나 그것이 단백질분해적으로 완전한env특이적인 단백질형태로 절단되지 않았다.
FeLVgag-특이적인 유전자산물의 발현은 소의 항-FeLV 혈청 및 p27 코어단백질(DS) 내의에피토프에 특이적인 모노클로날 항체를 이용한 면역침전에 의해 분석되었다. 비감염 세포 또는 어버이 바이러스로 감염된 세포에서 얻은 용해물로부터는 어떤 FeLV- 특이적인 단백질도 침전되지 않았다. 명백하게 vP1011, vCP93, 및 vCP97 감염세포로부터는 55 kDa의 FeLV 특이적인 단백질종이 D5 및 소의 항-FeLV 혈청과 침전되었다. 이러한 겉보기 분자량의 단백질종은gag-특이적인 전구체형태와 일치한다. 완전한 p27 코어단백질 크기와 일치하는 낮은 정도의 27 kDa 단백질종도 또한 명백하였다.
실시예 56-vCP93 및 vCP97의 생체내 평가
vCP93 및 vCP97의 보호효능은 고양이의 살아있는 FeLV 공격후 재조합체 바이러스의 두번의 접종에 의하여 평가되었다. ALVAC-기초 FeLV 재조합체를 피하내경로로 0일 및 28일경에 108PFU로 투여하였다. 고양이를 7일경에 상동성 FeLV-A 균주 (Glasgow-1)를 구비내 투여한 후 추가항원 자극 접종하여 공격하였다. FeLV 분리, 안티게네미아 (antigenemia) (P27 검출)의 평가, FeLV 분리, 면역형광에 의한 백혈구(WBC) 도말내의 FeLV 항원 존재, FeLV 중화활성의 유도를 위하여 공격 전·후로 혈액샘플을 얻었다.
ALVAC(카나리아폭스 바이러스)-기초 재조합체 바이러스 vCP93 및 vCP97로 백신접종한 후 어떤 불리한 반응도 관찰되지 않았다. 모든 6 비-백신접종한 컨트롤은 FeLV 공격에 굴복하였고 공격노출후 3 주일경에 지속적인 바이러스 혈증 (viremia)을 생기게 했다. 이것은 혈액내의 p27 항원검출, FeLV 분리 및 WBC 도말의 면역 형광분석에 의한 FeLV 항원의 검출에 의해 증거화되었다 (표32). 비-백신 접종된 컨트롤은 연구의 나머지 동안 (공격후 12주일까지) 지속적으로 감염된 상태로 남았다.
공격후 3주일경에는 vCP93으로 백신접종된 6 고양이중 3에서 지속적인 바이러스 혈증이 생겼다. 이때 이 3 고양이로부터의 혈액샘플링은 p27 항원 및/또는 살아 있는 FeLV를 포함하는 것을 보였다(표32). 이 고양이중 하나 (No.2)는 감염후 6주일경에는 이 감염을 삭혔고 공격후 12주일까지 바이러스 혈증이 없는 상태로 남았다. 다른 두 고양이(No.1 및 5)는 3기준, p27 안티게네미아, FeLV분리, 및 WBC에서의 FeLV 항원검출에 의하여 지속적으로 감염된 상태로 남았다. vCP93으로 백신접종된 6 고양이중 셋 (No.3, 4, 및 6)은 공격후 9 주일까지 지속적인 바이러스 혈증이 없었다 (표32). 이 고양이들중 둘(No.3 과 6)은 공격후 12주일까지 순환바이러스가 없는 상태로 남았고, 한 고양이 (No.4)는 12주일경에 갑자기 감염되었다. 그래서 부분보호(6 고양이중 3)가 vCP93으로 백신접종함에 의해 지속적인 바이러스 혈증에 대한 보호를 제공하였다.
가장 인상적으로, vCP93으로 백신접종된 모든 6 고양이는 FeLV-A (Glasgow-1)로의 동원의 공격에 대해 완전보호되었다. 이 고양이들중 단지 하나 (No.12)만이 지속적인 바이러스 혈증에 대한 어떤 암시를 증거화하였다. 이것은 p27 항원이 혈액샘플에서 검출될때 공격후 3 주일경에 일어났다 (표32). 공격후 이 고양이의 혈액으로부터는 어떤 살아있는 FeLV도 분리되지 않았다. 모든 다른 고양이는 p27 안티게네미아가 없었고, 살아있는 FeLV가 없었고, 공격노출후 12주일동안 WBC 도말에서 어떤 FeLV 항원을 나타내지 않았다 (표32).
FeLV 중화 항체의 진화.
FeLV 감염에 대한 보호에서의 중화항체의 가능한 역할 때문에 (Russell 및 Jarrett, 1978; Lutz 등, 1980), 공격전과 후에 그러한 반응의 생성을 측정하였다. vCP93 또는 vCP97로 백신접종된 연구중인 고양이들중 어느것도 FeLV 공격전에는 어떤 중화항체 역가를 나타내지 않았다 (표33). 공격후 지속적인 바이러스혈증이 생긴 고양이들중 어느것도 검출가능한 중화항체역가를 갖지 않았다. 중요하게도 지속적인 감염에 대해 보호된 고양이는 FeLV-특이적인 혈청중화역가를 나타냈다 (표33). 이 역가는 공격후 모든 보호된 고양이에서 크기가 증가하여, 공격 후 12주일경에 연구의 최종시간에 최고수준이 관찰되었다 (표33).
실시예 57-FHV-1 gD 당단백질을 발현하는 ALVAC-기초 재조합체의 생성
고양이 헤르페스 바이러스 유형 1(FHV-1) gD 당단백질의 발현은 우두 바이러스 I3L 프로모터의 조절하에 FHV-1 gD 상동체 유전자를 ALVAC 벡터속에 삽입시켜서 수행되었다. 카세트 I3L-FHV-1 gD를 ALVAC 속에 삽입하는데 필요한 도너 플라스미드를 하기와 같이 생성하였다.
FHV-1 CO 균주 게놈 DNA를EcoRI으로 완전히 분해하고, 아가로스 겔로부터 단편 M(4470bp)을 절단하고,EcoRI으로 분해되고 포스파타제 처리된 벡터 pBS-SK+속에 클로닝하였다. FHV-1EcoRI M 단편을 포함하는 결과적인 플라스미드를 pHFeM2로 표시했다. 변형된 T7 효소서열 (U.S. Biochemical Corp.)을 이용하여 (Tabor 및 Richardson, 1987) 벡터 pBS-SK+속에 삽입된 FHV-1EcoRI M 단편의 여러 서브클론으로부터 두가닥에 대한 FHV-1EcoRI M 단편 완전 뉴클레오티드 서열을 얻었다. 표준 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결반응 (Sanger등, 1977)은 0.4M-NaOH에서 변성된 이중-가닥 주형을 이용하여 수행되었다 (Hattori 및 Sakaki, 1986). M13 순 프라이머 및 역 프라이머를 이용하여 각 클론의 초기서열을 얻었다. 표준화학을 이용함으로써 합성된 통상 프라이머(18mer) (Biosearch 8700 및 Applied Biosystems 380B)를 다음 서열반응을 위해 이용하였다. 연속하는 단편사이의 접합부 서열을 초기클론 pHFeM2 상에서 확인하였다. 모든 서열 데이타 분석에서 PC/GENE (Intelligenetics) 및 IBI 퍼스텔(Pustell) 소프트웨어 패키지를 이용하였다. 상동성 조사는 스위스프롯 방출 (Swissprot release) 18.0 (Intelligenetics)에 대한 FASTP 프로그램 (Lipman 및 Pearson, 1985)으로 행하였다. FHV-1 CO 균주 gD 상동체유전자의 완전서열은 도 28 (SEQ ID NO:290)에서 보여진다.
FHV-1 gD 코딩서열의 185bp 5'-대부분 부위는 주형으로 플라스미드 pHFeM2 및 올리고뉴클레오티드 JCA234 (SEQ ID NO:331) (5'-ATGATGACACGTCTACATTTT-3') 및 JCA235 (SEQ ID NO:332) (5'-TGTTACATAACGTACTTCAGC-3')을 이용하여 얻었고BamHI으로 분해시켰다. 이 185bp 단편은 플라스미드 pMP691 (I3L101RAB) 및 올리고뉴클레오티드 MP287 (SEQ ID NO:226) (5'-GATTAAACCTAAATAATTGT-3') 및 JCA158 (SEQ ID NO:225) (5'-TTTTTCTAGACTGCAG CCCGGGACATCATGCAGTGGTTAAAC-3')을 이용하여 얻어진 I3L 프로모터 요소를 포함하는 120bp PCR-유도된 단편에 융합되고XbaI으로 분해되었다. 185bp 및 120bp 단편을XbaI 및BamHI으로 분해된 벡터 pBS-SK+속에 함께 결합시켜서 플라스미드 pJCA071을 생성하였다. I3L 프로모터의 서열, 접합부 I3L-ATG의 서열 및 FHV-1 gD 5'-대부분 부위의 서열을 pJCA071의 직접적인 서열결정에 의해 확인하였다. 플라스미드 pJCA067은 FHV-1 EcoRI M 단편의 서브클론이다. 그것은 하기와 같이 제조되었다. 플라스미드 pHFeM2를BamHI으로 분해하고 1850bpBamHI-BamHI 단편을 아가로스 겔로부터 절단하고BamHI 분해된 pBS-SK+속에 결합시켰다. 이 클론은 FHV-1 gD의 3'-부위와 아랫쪽 서열을 포함한다. 플라스미드 pJCA067을BamHI 및XhoI으로 분해하여 1270bpBamHI-FHV-1 및 XhoI으로 분해하여 1270bpBamHI-FHV-1 gD 3'-부위-XhoI 단편을 절단하였다. 이 단편을BamHI 및XhoI 분해된 벡터 pBS-SK+속에 결합시켜서 pJCA072를 생성하였다. FHV-1 gD 코딩서열의 3'-대부분 290bp는 주형으로 플라스미드 pHFeM2 및 올리고뉴클레오티드 JCA237 (SEQ ID NO:333) (5'-AATTTTCTCGAGAAGCTTGTTAACAAAAATCATTAAGGATGGTA-GATTGCATG-3') 및 JCA242 (SEQ ID NO:334) (5'-GAGGATTCGAAACGGTCC-3')을 이용하여 PCR에 의해 유도되었다. 이 통상합성된 올리고뉴클레오티드로의 이 단편의 합성은 1) 5' 말단에XbaI 위치와 FHV-1 gD의 3'-대부분 서열을 포함하고, 2) FHV-1 gD 코딩서열의 3'말단에 유일한HpaI,HindIII 및 XhoI 위치와 T5NT 요소를 첨가한다. 이 단편을XbaI 및XhoI으로 분해시키고,XbaI 및XhoI으로 분해된 플라스미드 pJCA072에서 얻은 3575bpXaI-XhoI 단편과 결합하였다. 결과적인 플라스미드를 pJCA073으로 나타냈다.
FHV-1 gD의 290bpXba XhoI 부분의 서열을 pJCA073의 직접적인 서열경쟁에 의해 확인하였다. 플라스미드 pJCA071을SmaI 및BamHI으로 분해하여 305bpSmaI-I3L-FHV-1 gD 5'-대부분 부위-BamHI 단편을 절단하였다. 플라스미드 pJCA073을BamHI 및XhoI으로 분해하여 970bpBamHI-FHV-1 gD 3'부위-XhoI 단편을 절단하였다.SmaI-BamHI 305bp 및BamHI-XhoI 970bp 단편을 최종적으로SmaI 및XhoI으로 분해된 벡터 pCPC6L (C6 탈 ORF 된 유전자좌; pCPC6L의 제조를 위한 다른 ALVAC C6 도너 플라스미드 참조) 속에 함께 재결합시켰다. 이 결합으로부터 얻은 플라스미드를 pJCA084로 표시했다.
레스큐 바이러스로서 CPpp와 일차 병아리 배 피브로블라스트에서 생체외 재조합실험에 플라스미드 pJCA084를 사용하여 vCP162를 생성했다. 재조합체 바이러스는 방사성 표지된 FHV-1 gD 특이적인 프로브를 이용하여 표준방법 (Piccini 등, 1987)에 따른 인시투 혼성화에의하여 확인되었다. 재조합체 플라크는 세번의 플라크 정제에 의해 정제되고 앞으로의 분석을 위해 증폭되었다. 재조합체 바이러스 vCP162는 카나리아폭스 바이러스의 C6 유전자좌에 FHV-1 gD 코딩서열을 포함한다.
실시예 58-vCP162의 발현분석
면역형광분석은 프랑스의 D. Fargeaud, Rhone-Meriuex로부터 얻은 양의 항-FHV-1 gD 폴리클로날 혈청을 이용하여 이전에 기술한 대로 수행되었다 (Taylor등, 1990). 재조합체 vCP162는 강한 내부형광과 표면형광을 나타냈는데, 이것은 감염세포의 표면에서의 FHV-1 gD 당단백질의 발현을 나타낸다.
발현된 FHV-1 gD 산물의 확실성을 결정하기 위하여 동일한 항혈청을 이용하여 면역침전을 행하였다. 이 과정은 이전에 기술한 것에 따라서 행하였다 (Taylor등, 1990). 양의 항-FHV-1 gD 혈청은 재조합체 바이러스 vCP162로 감염된 세포에서 얻은 용해물로부터 60 kDa의 SDS-PAGE 겔 시스템 (Dreyfuss등, 1984) 상에서의 겉보기 분자량을 갖는 산물을 침전시켰다. 비감염세포 또는 어버이 카나리아폭스 바이러스 (CPpp) 감염세포로부터 얻은 용해물로부터는 어떤 단백질도 침전되지 않았다.
실시예 59-한탄 바이러스 (HANTAAN VIRUS) G1 및 G2 당단백질을 발현하는 NYVAC- 및 ALVAC-기초 재조합체의 제조
한탄 바이러스 G1 및 G2 당단백질의 발현은 엔토모폭스바이러스 42 kDa 프로모터의 조절하에서 M 절편을 NYVAC 및 ALVAC 벡터속에 삽입함으로써 수행되었다. 이 바이러스 벡터속에 삽입된 폭스바이러스 발현 카세트는 하기와 같이 제조되었다.
한탄 바이러스 M 절편의 cDNA 클론은 Schmaljohn 등 (1987)에 의해 기술된 대로 유도되었고 플라스미드 벡터 pTZ19R (Pharmacia, Piscataway, NJ)속에 삽입되어 Dr. J. Dalrymple (Virology Division, U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Disease, Frederick, MD)에 의해 제공되었다. M 절편 코딩서열의 326bp 5'-대부분 부위는 주형으로서 M 절편 cDNA를 포함하는 플라스미드 pTZ19R 및 올리고뉴클레오티드 HM59(SEQ ID NO:335) (5'-ATGGGGATATGGAAGTGG-3') 및 HM3P (SEQ ID NO:336) (5'-CATGTTCCTTTCAAGTCAAC -3')을 이용하여 유도되었다. 주형으로서 pAM12 및 올리고뉴클레오티드 RG273(SEW ID NO:142) (5'-AGGCAAGCTTTC-AAAAAAATATAAATGATTC-3') 및 RG274 (SEQ ID NO:143) (5'-TTTATATTGTAATTATAT-ATTTTC-3')을 이용하여 얻은 42kDa 프로모터 요소를 포함하는 107bp PCR-유도 단편에 이 326bp 단편을 융합시켰다. PCR 융합은 올리고뉴클레오티드 RG273 (SEQ ID NO:142) 및 HM3P (SEQ ID NO:336)와 주형으로서 107bp 및 326bp 단편의 동 몰농도의 혼합물을 이용하여 수행되었다. 융합된 단편을HindIII (5' 말단) 및BcℓI (3' 말단)로 분해하여 343bp 단편을 생성하였다.
플라스미드 pAM12는 하기와 같이 유도되었다.Amsacta moorei엔토모폭스바이러스 (AmEPV)로부터 분리한 게놈 DNA를ClaI으로 분해하고 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 이전에 고(highly) 전사되는 AmEPV 유전자를 포함하는 것으로 밝혀진 2.6kb 단편을 겔에서 정제하고 pBS-SK+의ClaI 위치에 클로닝하여 pAM12를 생성했다. 이 단편의 DNA 서열 분석은 42 kDa의 완전한 ORF를 나타냈다. 이 유전자의 5'비번역 서열 (AmEPV 42K 프로모터)은 우두 바이러스와 아비폭스 바이러스에서 강한 초기 프로모터로서 기능하는 것이 다음에 보여졌다.
M 절편 코딩서열의 3'-대부분 748bp는 올리고뉴클레오티드 HMTS-5 (SEQ ID NO:337) (5'-ATCATGAGTCCAAGAGACAAAGGTTTCTTATGCCCTGAG-3') 및 HMTS-3 (SEQ ID NO:338) (5'-ATCATCGAATTCATAAAAACTATGATTTTTTATGCTTCCTTACGGGAC-3') 및 주형으로서 pTZ19R에 포함된 cDNA 클론을 이용한 PCR에 의하여 유도되었다. 이 통상 합성되는 올리고뉴클레오티드로의 이 단편의 합성은 1) 5'말단에EcoRV 위치의 3'대부분 서열을 포함하고, 2) 뉴클레오티드 위치 2687 내지 2693에서 (Schmaljohn등, 1987) T5NT 서열 모티프를 파괴하고(Yuen 및 Moss, 1987), 및 3) 코딩서열의 3'말단에 유일한EcoRI 위치와 T5NT 요소를 첨가한다. 이 단편을EcoRI으로 분해하여 741bpEcoRV/EcoRI 단편을 생성하였다. 741bpEcoRV/EcoRI 단편을 pBS-SK (Stratagene, La Jolla, CA) 속에 삽입하여 플라스미드 pBSHVM39를 생성하였다.
pTZ19R에 M-특이적인 cDNA 클론을 포함하는 플라스미드를 이용하여 GM48(Dam-) 세균세포 (BRL, Gaithersburg, MD)를 형질전환시켰다. 이 세균균주에서 얻은 플라스미드 DNA를BcℓI 및EcoRV로 분해시켜서 2362bp 단편을 제조했다. 이 2362bp 단편을 코딩서열 5'대부분 부위에 융합된 42kDa 프로모터를 포함하는 343bpHindIII/BcℓI 단편과 함께HindIII 및EcoRV로 분해된 pBSHVM3P 속에 공-삽입시켰다. 전체 M 절편 발현 카세트를 포함하는 결과적인 플라스미드를 pBSHVM으로 나타냈다. pBSHVM으로부터 제한 엔도뉴클레아제HindIII 및EcoRI을 이용하여 전체 M 절편 카세트를 절단하였다. 3508bp 유도된 단편을 2mM dNTP 존재하에E.coli의 클리나우 단편을 이용하여 블런트-말단화하였다. 블런트 말단 단편을 pSD550속에 삽입하여 pHVMVC를 제조했다.
플라스미드 pSD550을 하기와 같이 pSD458에서 유도하였다. 플라스미드 pSD548 (Tartaglia 등, 1992)은 14L ORF (Goebel 등, 1990a,b)가BgℓII 및SmaI 위치로 구성되는 클로닝 부위에 의해 대체된 우두 바이러스 벡터 플라스미드이다. 다수의 클로닝부위를 확대하기 위해 pSD548을 BgℓII 및 SmaI으로 절단하고 어닐링된 상보적인 합성올리고뉴클레오티드 539A (SEQ ID NO:339) (5'-AGAAAAATCA-GTTAGCTAAGATCTCCCGGGCTCGAGGGTACCGGATCCTGATTAGTTAATTTTTGT-3') 및 539B (SEQ ID NO:340) (5'-GATCACAAAAATTAACTAATCAGGATCCGGTACCCTCGAGCCCGGGAGATCTTAGCTAACTGA-TTTTTCT-3')와 결합시켰다. 결과적인 플라스미드 pSD550에서 다수 클로닝부위는BgℓII,SmaI,XhoI,KpnI 및BamHI 제한위치를 포함한다.
레스큐 바이러스로서 vP804 VERO 세포에서의 생체외 재조합 실험에 플라스미드 pHVMVC를 이용하여 (Tartaglia 등, 1992) vP882를 얻었다. 재조합체 바이러스는 방사성 표지된 M-특이적인 DNA 프로브를 이용한 표준방법에 따라 (Piccini 등, 1987) 인시투 혼성화에 의해 확인되었다. 재조합체 플라크를 3 번 플라크 정제에 의해 정제하고 앞으로의 분석을 위해 증폭시켰다. 재조합체 바이러스 vP882는 우두 바이러스의 14L 유전자좌에 한탄 M 절편을 포함한다. vP804 백그라운드에서 14L 오픈리딩프레임의 M 절편 카세트로의 대체는 NYVAC-등가 바이러스 백그라운드를 생성한다 (Tartaglia 등, 1992).
M 절편 카세트 (상기)를 포함하는 pBSHVM의 3508bpHindIII/EcoRI 단편을HindIII 및EcoRI으로 분해된 pC4I속에 삽입하였다. 플라스미드 pC4I는 하기와 같이 유도되었다. CPpp의 6.5 kbNsiI 단편을 pBS-SK+의BamHI 위치속에 클로닝하여 pXX-4를 생성했다. DNA 서열 분석은 유전자좌에 C4 삽입체를 포함한 완전한 오픈리딩프레임 (ORF)을 밝혔다. C4 ORF가 삭제된 도너 플라스미드를 제조하기 위하여, 올리고뉴클레오티드 RG287 (SEQ ID NO:341) (5'-CAGTTGGTACCTATGTTAAGGAGG-ACGA-3'), RG293(SEQ ID NO:342) (5'-TATCTGAATTC CTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAA-TTAGTCATATGATATTATCTCTAT-3'), RG289 (SEQ ID NO:343) (5'-TCGATGAATTCGATATCAA-GCTTATCGATTTTTATGATTAACTAGTCAAGTGATTTTATTCAATTACG-3') 및 RG290 (SEQ ID NO:344) (5'-TTATCGAGCTCATTTACATTTCTAAACTC-3')를 프라이머로서 이용하여 pXX4로부터 C3 ORF의 5' 및 3'비번역 부위를 증폭시켰다. 정제한 PCR 단편을KpnI-SacI 위치에서 pBS-SK+속에 클로닝하였다. 결과적인 플라스미드 pC4I는 완전 ORF가 번역 및 우두 바이러스 초기 전사 종결 시그날에 의해 측면위치된 다수의 클로닝위치로 대체된 C4의 5' 및 3'비번역부위 (각각 201 bp)를 포함한다 (Yuen 및 Moss, 1987).
M 절편 카세트를 pC4I 속에 삽입하여 플라스미드 pC4HVM을 생성했다. pSD513 (실시예 7에서 정의함)에서 유도된 100 bpSspI/SmaI 단편의 삽입을 위해 플라스미드 pC4HVM을SmaI으로 선형화하였다. 결과적인 플라스미드를 pC4HVMVQ로서 나타냈다. 플라스미드 pC4HVMVQ를SmaI 분해시키고 다음에는HindIII 부분분해시켜서 M 절편 카세트를 포함하는 3.6kb 단편을 회수하였다. 이 단편을 2mM dNTP존재하에서E.coliDNA 중합효소의 클리나우 단편을 이용하여 블런트-말단화하였다. 이 블런트-말단 단편을SmaI 분해된 pSPCPC3L속에 삽입시켜서 pC3HVMVQ (실시예32에서 정의함)을 제조했다.
레스큐 바이러스로서 CPpp(ALVAC) 그리고 도너 플라스미드로서 pC3HVMVQ를 이용하여 일차 병아리 배 피브로블라스트에서 생체외 조합 실험을 수행하였다. 표준 프로토콜을 이용하여 재조합체 바이러스를 확인하고 정제하였다 (상기와 같음; Piccini 등, 1987). 한탄 바이러스 M절편을 포함하는 ALVAC-기초 재조합체를 vCP114로서 나타냈다.
실시예 60-한탄 바이러스 S 코딩서열을 포함하는 NYVAC- 및 ALVAC-기초 재조합체의 제조
한탄 바이러스 뉴클레오 단백질의 발현은 우두 바이러스 H6 프로모터 (Goebel등, 1990 a,b)의 조절하에서 NYVAC 및 ALVAC 벡터내로 S 절편을 삽입하여 행해졌다. 이 바이러스 벡터속으로 삽입된 폭스바이러스 발현카세트를 하기와 같이 제조하였다.
한탄 바이러스 S 절편의 cDNA 클론은 Schmaljohn 등 (1986)에 의해 기술된 대로 유도되었고 플라스미드 벡터 pGEM-1 (Promega Biotech, Madison, WI) 속에 삽입되어 Dr. Joel Dalrymple (Virology Division, U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Disease, Ft. Detrick, Frederick, MD)에 의해 제공되었다. S 절편의 전체서열은 이전에 기술되었다 (Schmaljohn등, 1986).
H6 프로모터 요소는 주형으로서 플라스미드 pI4LH6HIV3B 및 올리고뉴클레오티드 H65PH (SEQ ID NO:164) (5'-ATCATCAAGCTT-3') 및 HTH63P (SEQ ID NO:346) (5'-CCCTCTGTAATTCCTCCATAGTTGCCATTACGATACAAACTTAACGG-3')을 이용한 PCR에 의하여 증폭되었다. 이 150bp PCR-유도된 단편은 5'말단에HindIII 위치를 포함하고 S 절편 코딩서열의 5'대부분 부위를 포함하는 3'말단에 28 bp 연장부를 가진다.
S 절편 코딩서열의 5'말단은 주형으로서 S-특이적인 cDNA 클론 및 올리고뉴클레오티드HTS5P (SEQ ID NO:347) (5'-CCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCAACTATGGAGG-3') 및 HTS5PNCI (SEQ ID NO: 348) (5'-GGACACGTAAAGATGTTTTGG-3')으로 PCR에 의해 합성되었다. 560bp PCR-유도된 단편을 올리고뉴클레오티드 H65PH (SEQ ID NO:164) 및 HTS5PNC I (SEQ ID NO:348)을 이용하여 PCR에 의해 융합시켰다. PCR-유도된 융합산물을HindIII 및NciI으로 분해하였다.
한탄 바이러스 S 절편의 중앙부위는 올리고뉴클레오티드 T5HT3PPS (SEQ ID NO:349) (5'-GTCCTGCAGGATGGAAAAGAATGCCCCAAGC-3') 및 HTS55PN (SEQ ID NO:350) (5'-GGGGGAGGCAAACTACCAAGG-3')과 주형으로서 S-특이적인 cDNA 클론을 이용한 PCR에 의해 생성되었다. 581 bp 단편은 3'말단에PstI 위치를 포함하고 5'말단은 S 절편의 위치 499의NciI 위치를 포함한다 (Schmaljohn등, 1986). 더욱 올리고뉴클레오티드 T5HT3PPS (SEQ ID NO:349)를 이용하면 아미노산 서열을 변화시키지 않고 위치 1029 내지 1035에서 T5NT 요소를 제거시킨다. 그 다음 이 단편을NciI 및PstI으로 분해시켰다. H6 프로모터에 융합된 코딩서열의 5'말단을 포함하는 PCR 단편 (상기에서HindIII/NicI 분해된 것)을 S 절편의 중앙부위를 포함하는 581bpNciI/PstI 단편과 함께HindIII 및PstI 분해된 pBS-SK속에 결합시켰다. 결과적인 플라스미드를 pBSHTSH65P로 표시했다.
S 절편의 3'대부분 438bp는 주형으로서 S-특이적인 cDNA 클론과 올리고뉴클레오티드HTS3PXBA (SEQ ID NO:351) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAATTAGAGTTTCAAAGGC-3') 및 T5HT5PSP(SEQ ID NO:352) (5'-CGCCAGCATGCAGAAGCAGC-3')을 이용한 PCR에 의하여 유도되었다. 이 단편의 5'말단은 S 절편 코딩서열의 위치 1039에 위치한PstI 위치를 포함하고(Schmaljohn 등, 1986) 3'말단은 T5NT 서열 모티프 및 유일한XbaI 위치를 포함한다. 이 단편을PstI 및XbaI으로 분해하고PstI/XbaI 분해된 pBS-SK속에 삽입하여 pBSHTS3P를 생성하였다.
전체의 S 절편 발현 카세트를 제조하기 위하여, pBSHTSH65P로부터 1122bpPstI/HindIII부분 단편을 얻었다. 이 단편을 pBSHTS3P의 290bpPstI/XbaI 단편과 함께HindII/XbaI 분해된 pBS-SK속에 공-삽입하였다. 결과적인 플라스미드를 pBSHVS로 표시하고,XbaI으로 선형화하고HindIII 부분분해시켰다. 이 단편을 2mM dNTP 존재하에서E.coliDNA 중합효소의 클리나우 단편을 이용하여 블런트-말단화하였다. 그다음 pSD541 (실시예10에서 정의함)의SmaI 위치속에 삽입하여 pATIHVS를 생성하였다.
레스큐 바이러스로서 vP866 (NYVAC) 및 vP882와 VERO 세포에서 생체외 재조합실험에 플라스미드 pATIHVS를 이용하였다. 이것은 표준 프로토콜로 수행되었다 (Piccini 등, 1987). 재조합체 바이러스에서 얻은 플라크를 방사성표지된 S 절편-특이적인 DNA 프로브를 이용하여 이전에 정의한 플라크 혼성화 방법 (Piccini 등, 1987)에 의하여 확인하였다. 레스큐 바이러스 vP866 및 vP882를 이용하여 회수된 바이러스에 대해 각기 제조된 재조합체를 vP950 및 vP951를 나타냈다. 재조합체 바이러스 vP950은 ATI 위치에 S 절편 발현 카세트를 포함하고 vP951은 동일한 유전자좌에 이 카세트를 포함하지만, M 절편 포함 vP882로의 레스큐에 의해 I4L 유전자좌에 M 절편을 포함한다.
플라스미드 pBSHVM을SaℓI으로 선형화하고 2mM dNTP의 존재하에E.coliDNA 중합효소의 클리나우 단편을 이용하여 블런트-말단화시켰다. 이것을 한탄 S 절편 발현카세트를 포함하는 pBSHVS로부터 유도된 1.4kbXbaI/HindIII 부분 (상기와 같이 클리나우로 블런트- 말단화됨) 단편에 결합시켰다. 유도된 플라스미드를 pBSHVMS로서 표시했다. 이 플라스미드는 헤드 대 헤드 배열로 M과 S 카세트를 포함하였다. 플라스미드 pBSHVMS를XhoI으로 선형화하고, 클리나우로 블런트 말단화시키고 (상기와 같이), pSD513(실시예 7에서 정의함)의 100 bpSspI/SmaI 단편에 결합시켜서 pBSHVMSVQ를 생성했다.
플라스미드 pBSHVMSVQ를ClaI/Asp718로 분해시켜서 S 절편 발현 카세트 포함 1.5kb단편을 방출시켰다. 이 단편을 2mM dNTP의 존재하에서E.coliDNA 중합효소의 클리나우 단편을 이용하여 블런트-말단화하였다. 그리고 pSPCP3L(실시예32에서 정의함)의SmaI 위치속에 삽입하여 pC3HVSVQ를 생성하였다.
레스큐 바이러스로서 CPpp (ALVAC)와 일차 병아리 배 피브로블라스트에서의 생체외 재조합 실험에 플라스미드 pC3HVSVQ를 이용하였다. 이것은 플라크 확인, 플라크 정제, 및 바이러스 증폭처럼 표준방법을 이용하여 수행되었다 (Piccini 등, 1987). 제조된 재조합체를 vCP119로서 나타냈다. 이 재조합체는 ALVAC의 C3 유전자좌에 S 절편을 포함한다.
실시예 61-NYVAC- 및 ALVAC-기초 한탄 바이러스 M 및 S 절편 재조합체의 발현분석
G1, G2에 특이적인 모노클로날항체의 푸울 또는 토끼 항-한탄 폴리클로날 혈청을 이용하여 이전에 기술한 대로 면역형광분석을 행하였다 (Taylor등, 1990). 모든 혈청은 Dr. C. Schmaljohn (Virology Division, U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, Ft. Detrick, Frederick, MD)로부터 얻었다. M 절편을 포함하는 재조합체 바이러스 (vP882, 및 vCP114) 또는 S 절편과 조합하여 M 절편을 포함하는 재조합체 바이러스 (vP951)는 상기 항혈청중 어느것을 이용하여 강한 표면형광을 나타내는데, 이것은 감염된 세포의 표면에서의 G1 및 G2 당단백질의 발현을 나타낸다. S 절편만을 포함하는 재조합체 (vP950 및 vCP119)를 이용하면 표면형광이 관찰되지 않았는데, 이것은 감염된 세포의 표면에서 뉴클레오 단백질이 나타나지 않기 때문이다. 그러나 토끼의 항-한탄 혈청을 이용하면 재조합체 vP950 및 vCP119로 강한 형광이 관찰되었다.
발현된 G1, G2 및 S 유전자산물의 확실성을 결정하기 위해 동일한 항-혈청을 이용하여 면역침전이 행해졌다. 이 방법은 이전에 기술된 대로 행하여졌다 (Taylor등, 1990). G1에 특이적인 모노클로날 항체 푸울은 재조합체 바이러스 vP882, vP951, 및 vCP114로 감염된 세포로부터 얻은 용해물로부터 64kDa의 SDS-PAGE 겔 시스템(Dreyfuss 등, 1984)에서의 겉보기 분자량을 갖는 단백질을 침전시켰다. 비감염 세포 또는 어버이 (NYVAC 및 ALVAC) 감염세포 또는 단지 S 절편만을 포함하는 재조합체 바이러스 (vP950 및 vCP119)로 감염된 세포에서 유도된 용해물로부터는 어떤 단백질도 침전되지 않았다. 침전된 폴리펩티드가 대략 550-55kDa의 분자량을 가지는 것을 제외하고는, G2에 특이적인 모노클로날 항체 푸울을 이용하여 동등한 결과를 얻었다. 이러한 크기의 단백질 (64 kDa 및 50-55 kDa)은 각각 G1 및 G2 단백질의 크기와 일치한다 (Schmaljohn등, 1990).
토끼의 항-한탄은 vP951로 감염된 세포에서 얻은 용해물로부터 64kDa, 50-55kDa, 및 48 kDa의 겉보기 분자량을 갖는 3 단백질종을 침전시켰는데 이것은 G1, G2 및 뉴클레오단백질의 발현과 일치한다. 동일한 혈청은 vP950 및 vCP119 감염된 세포용해물로부터는 뉴클레오단백질 (48kDa) 그리고 vP882 및 vCP114로부터는 G1 및 G2 (64kDa, 50-55kDa) 종류를 특이적으로 침전시켰다. 비감염세포 또는 NYVAC 또는 ALVAC 어버이 바이러스로 감염된 세포에서 얻은 용해물로부터는 어떤 그러한 단백질도 침전되지 않았다.
실시예 62-B형 간염 바이러스 (HBV) 유전자의 ALVAC 삽입 플라스미드 내로의 삽입
ALVAC C5 삽입 플라스미드 pNVQH6C5LSP18(실시예44에서 정의함)을BamHI으로 절단하고, 키나제처리되고 어닐링된 합성 올리고뉴클레이티드 MPSYN438/MPSYN439 (SEQ ID NO:353/ 354)와 결합시켰다.
MPSYN438 5' GATCCCCGGGA 3'
MPSYN439 5' GATCTCCCGGG 3'
결과적인 플라스미드 pMPC5Sma는 링커부위에서BamHI 위치 다음에SmaI 위치를 포함한다.
pMP550E31ℓps (여기서 다른 HBV 실시예에서 정의됨)을BgℓII/BamHI (부분)으로 절단하고, EPV 42kDa 프로모터의 조절하에서 HBV 1psAg 유전자를 포함하는 1.2kb 단편을 분리하고BamHI 절단된 pMPC5Sma와 결합시켜서 플라스미드 pMPC5L을 제조했다. pMPC5L을SmaI (부분)으로 절단하고, 단위길이 (4kb) 단편을 분리하였다. 이 단편을 NruI으로 절단하고 가장 큰 밴드(4kb)를 분리하였다.
pGJ/5(실시예13에서 정의함)를SmaI (부분) 및NruI 분해하고, H6 프로모터의 24bp 및 HBV spsAg를 포함하는 0.9kb 단편을 분리하고, pMPC5L의 4kbSmaI/NruI 벡터단편에 결합시켜서 플라스미드 pMPC5LS를 생성하였다.
pMPI3S12C(실시예13에서 정의함)을SmaI으로 절단하고 I3L 프로모터의 조절하에서 S12/코어 융합 유전자를 포함하는 1.2kb 단편을 분리하였다. 이 단편을SmaI 절단된 플라스미드 pMPC5LS 속에 결합하여 플라스미드 pMPC5LSC를 생성하였다.
실시예 63-SPSAG 및 LPSAG를 암호화하는 HBV 유전자의 ALVAC 내로의 삽입
C5 삽입 유전자좌에 HBV 1psAg 및 spsAg를 포함하는 pMPC5LS를 ALVAC와의 재조합을 위한 도너 플라스미드로서 이용하여 ALVAC 재조합체 vCP157을 생성하였다.
vCP157에 의한 HBV 단백질의 발현
ALVAC-HBV 이중 재조합체 vCP157로 감염된 세포의 대사적으로 표지된 용해물을 토끼의 항-S2 혈청을 이용하여 면역침전시키고, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동하고 방사성 사진법에 의해 분석하였다. 1psAg (41KDa, 38KDa 및 spsAg (36KDa,33KDa)에 대한 정확한 크기를 갖는 단백질이 관찰되었다. 이 단백질들은 컨트롤로서 이용된 spsAg 또는 1psAg를 발현하는 NYVAC 단일 HBV 재조합체에 의해 생성된 동일 단백질과 같이 이동되었다.
실시예 64-SPSAG, LPSAG 및 S12/ 코어융합을 암호화하는 HBV 유전자의 ALVAC 내로의 삽입
C5 삽입 유전자좌에 S12/코어 융합을 특정하는 유전자 뿐만 아니라 HBV 1psAg 및 spsAg 유전자를 포함하는 pMPC5LSC를 ALVAC와의 재조합을 위한 도너 플라스미드로서 이용하여 ALVAC 재조합체 vCP169를 제조하였다.
실시예 65-HBV 유전자를 발현하는 NYVAC- 기초 재조합체: 토끼, 마우스 및 기니아 피그의 혈청학적 데이타
토끼, 마우스 및 기니아 피그를 NYVAC-기초 B형 간염 바이러스(HBV) 재조합체 vP856, vP930, vP932 및 vP975 (실시예 13)로 접종하였다. vP856은 표면항원의 중간(M)형태, spsAg를 발현한다. vP930은 표면항원의 큰 (L)형태, 1psAg를 발현한다. vP932는 spsAg 및 1psAg를 둘다 발현한다. vP975는 spsAg, 1psAg 및 코어항원에 융합된 표면항원 프리 S1+프리 S2 부위로 구성된 융합 단백질을 발현한다. AUSAB 테스트 (Abbott)를 이용하여 HBV 표면항원에 대한 항체에 대해서 혈청을 분석하고, CORAB 경쟁적 방사성 면역검사 키트(Abbott)를 이용하여 HBV 코어 항원에 대한 항체에 대해서 혈청을 분석하였다. HBV 프리 S1 및 프리 S2 부위에 대한 항체는 ELISA에 의하여 분석하였다. 표 34-40에 결과들이 주어져 있다.
실시예 66-폭스바이러스에서 세균 유전자의 발현: 폭스바이러스의 파상풍 독소 단편 C(C. TETANI)
C.tetani는 포자형성 혐기균인 속 클로스트리듐의 세균이다; 또한C.botulinum도 이 속에 속한다.C.tetani는 독소인 테타노스파스민 (tetanospasmin; TT)을 생성하는데, 이것은 주로 감염시 관찰되는 마비효과에 관여한다. TT는 세균으로부터 방출시 단일의 150kDa 라이트체인(Light Chain)과 100kDa 헤비체인(heavy chain)이다. 헤비 체인은 약한 단백질 분해처리시 두 단편 B와 C (45kDa와 55kDa)를 생성한다. 본 실시예는 본 발명의 바이러스가C.tetani의 단편 C 같은 면역원성 세균 유전자산물을 발현하는데 이용될 수 있다는 것을 나타낸다.
발현 카세트는 일련의 중합효소 사슬 반응에 의해 제조되었다. 본래의 파상풍 독소 서열에 존재하는 (Eisel 등, 1986; Fairweather 및 Lyness,1986) TTTTTAT 초기 전사 종결 시그날 (Yuen 및 Moss, 1987)을 제거하는데 이 방법이 필요하였다.
H6 프로모터-연결된 단편 C는 프라이머 H6 TETC (SEQ ID NO:355) (5'-ATCATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAAAAATCTGGATTGTTGGG-3') 및 TETFIX2 (SEQ ID NO:356)(5'-GTAATAGTTATGAAAACCC-3')을 이용하여 플라스미드 pSS1261 (Halpern 등, 1990)로부터 PCR에 의해 유도되었다. 이 구조체의 코딩부위 나머지는 프라이머 TETFIX1 (SEQ ID NO:357) (5'-GGGTTTTCATAACTATTAC-3') 및 TETEND (SEQ ID NO:358) (5'-GGATGGACAAATGATTAATTTTTATCTCGAGCCCGGGATGAT-3')을 이용한 플라스미드 pSS1261의 PCR 증폭에 의해 제조되었다. 이 코딩부위의 융합은 프라이머 H6TETC (SEQ ID NO:355) 및 TETEND (SEQ ID NO:358)을 이용하여 553bp 및 881bp PCR-유도된 산물의 PCR 증폭에 의하여 수행되었다. 결과적인 1.4kb PCR-유도된 산물을EcoRV 및XhoI으로 분해시켰다. 1.4kb 단편을 아가로스겔에서 분리하고 유사하게 분해된 pBS-SK+ (Stratagene, La Jolla, CA)에 결합시켰다. 뉴클레오티드 서열 분석을 이용하여 결과적인 플라스미드 pBSTETC에서 삽입체를 증명하였다. 이 플라스미드에서 T의 C로의 휴지상태의 치환이 발견되었는데, 이것은 Eisel등 (1986)의 서열에서 위치 3535에 해당된다. PC5L (실시예 44에서 정의함)을 폴리링커내에서Asp718 및NotI으로 분해시키고, 알칼리포스파타제로 처리하고, 키나제 처리되고 어닐링된 올리고뉴클레오티드 CP26 (SEQ ID NO:359)(5'-GTACGTGACTAATTAGCT-ATAAAAAGGATCCGGTACCCTCGAGTCTAGAATCGATCCCGGGTTTTTATGACTAGTTAATCAC-3') 및 CP27 (SEQ ID NO:360)(5'-GGCCGTGATTAACTAGTCATAAAAACCCGGGATCGATTCTAGACTCGAGGGT-ACCGGATCCTTTTTATAGCTAATTAGTCAC-3')(무력화된 Asp718 위치, 6 리딩 프레임의 번역종결 코돈, 우두 바이러스 초기 전사종결 시그날 (Yuen 및 Moss, 1987),BamHI,KpnI,XhoI,XbaI,ClaI, 및SmaI 제한위치, 우두 바이러스 초기 전사 종결시그날, 6 리딩 프레임의 번역 종결코돈, 및 무력화된NotI 위치를 포함)에 결합시켜서 플라스미드 pC5LSP를 생성하였다. 초기/후기 H6 우두 바이러스 프로모터(Perkus 등, 1989)는 올리고뉴클레오티드 CP30 (SEQ ID NO:361) (5'-TCGGGATCCGGGTT AATTAATTAGTCATCAGGCAGGGCG-3') 및 CP31 (SEQ ID NO:362) (5'-TAGCTCGAGGGT-ACCTACGATACAAACTTAACGG ATATCG-3')을 이용하여 프로모터를 포함하는 플라스미드로부터 PCR에 의해 유도되었다. PCR 산물을BamHI 및XhoI (PCR에 의해 5' 및 3' 터미날에서 생성된 위치)으로 분해하고, 유사하게 분해된 pC5LSP에 결합시켜서 pVQH6C5LSP를 생성하였다. pVQH6C5LSP를EcoRI으로 분해시키고, 알칼리 포스파타제로 처리하고, 자체-어닐링된 올리고뉴클레오티드 CP29 (SEQ ID NO:363)(5'-AATTGCGGCCGC-3')에 결합시키고,NotI 분해시키고 선형 정제하고 자체-결합시켰다. 이 과정에 의해 pVQH6C5LSP에NotI 위치를 도입하여 pNVQH6C5LSP18을 생성하였다. pBSTETC의 1.4kbEcoRV/XhoI 단편을 분리하고 유사하게 분해된 pNVQH6C5LSP/8에 결합시켜서 pC5TETC를 생성하였다.
EcoRV 위치까지의 H6 프로모터는 PCR 및 프라이머 H6PCR1 (SEQ ID NO:364)(5'-ACTACTAAGCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG-3') 및 H6PCR2 (SEQ ID NO:365) (5'-TTAACGGATATCGCGATAATG-3')을 이용하여, 합성 H6 프로모터를 포함하는 플라스미드(perkus 등, 1989)로부터 유도되어 5'HindIII 위치를 생성하였다. 이 122bp PCR-유도된 단편을HindIII 및EcoRV로 분해하고 유사하게 분해된 pBS-SK+(stratagene, La, Jolla, CA)에 결합시켜서 플라스미드 pBSH6를 생성하였다. 삽입체는 뉴클레오티드 서열분석에 의해 확인되었다. pC5TETC의 1.4kbEcoRV/XbaI단편을 절단하고 유사하게 분해된 pBSH6에 결합시켜서 pH6TETC를 생성하였다.
전체 H6-단편 C 카세트를 포함하는 pH6TETC로부터 1.5kbXhoI 단편을 pSD542 (실시예 32에서 정의함)에 결합시켜서 pTKTETC를 생성하였다. ALVAC 및 NYVAC와의 생체외 재조합 실험에 pC5TETC 및 pTKTETC를 이용하여 각각 재조합체 vCP161 및 vP1075를 생성하였다. vCP161 및 vP1075가 확실한 단편 C를 발현하는지를 결정하기 위해 면역침전 분석을 수행하였다. VERO 세포 단일층을 어버이 바이러스 CPpp (ALVAC) 또는 vP866(NYVAC)로 감염시키고, 또는 10pfu/ 세포의 m.o.i.로 vCP1661 또는 vP1075로 감염시켰다. 세포를 감염시키고, [35S]-메티오닌 (20μCi/mℓ)을 포함하는 변형 이글 배지(-메티오닌)에서 배양하고, 용해시키고, 마우스 모노클로날 항체 (클론 49.4, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 및 이차 항체로서 염소의 항-마우스 항혈청을 이용하여 Taylor 등(1990)에 의해 기술된 대로 침전시켰다. 용해물을 정상 마우스 혈청 및 단백질 A-세파로스로 미리 정화시켰다.
모노클로날 항체는 vCP161 및 vP1075 감염세포로부터 대략 47kDa에 해당되는 종류를 특이적으로 침전시켰다. CPpp(ALVAC) 또는 vP866(NYVAC) 감염세포로부터는 어떤 유사한 단백질종도 침전되지 않았다. vCP161 및 vP1075에 의해 암호화된 것과 동일한 E.coli 생성된 재조합 단편 C 뿐만 아니라 본래의 파상풍 독소의 파파인 분해에 의해 생성된 단편 C에 대해서 Makoff 등 (1989)의 관찰과 47kDa 크기는 일치한다.
실시예 67-돼지에서의 NYVAC-기초 가성 광견병 바이러스(Pseudorabies Virus) (PRV)재조합체의 효능
네마리 새끼 돼지의 6 그룹을 NYVAC-기초 gII 재조합체(vP881), gIII 재조합체(vP883), gp50 재조합체(vP900), NYVAC 어버이 바이러스(vP866), 상업적으로 구할 수 있는 불활성화된 가성광견병 바이러스 백신, 또는 모의백신으로서 태아소혈청 포함 이글 MEM으로 접종하였다. 모든 돼지는 근육내 경로로 28일 간격으로 두번 접종물을 수용했다. 어버이 또는 재조합체 NYVAC 바이러스를 수용한 돼지를 접종당 대략 106TCID50으로 접종하였다. 접종후 12일 동안 체온 및 임상적 징후에 대해 모든 돼지들을 측정하였다. 재조합체 또는 어버이 NYVAC 바이러스로의 백신 접종으로 어떤 국부적인 또는 전신적인 유해반응이 관찰되지 않았다.
가성 광견병 바이러스에 대한 혈청 중화 항체 역가를 각 접종후 1, 2 및 4주일동안 측정하였다. 표 41로부터 명백한 것처럼, 단지 불활성화된 백신 제조물만이 단일 접종후 상당한 가성광견병 바이러스 혈청 중화역가를 유도할 수 있었다. 그러나 이차 접종 다음에는 모든 3 NYVAC-기초 재조합체가 관찰 가능한 가성 광견병 바이러스 혈청 중화 역가를 유도할 수 있었다 (표 42). 역가는 가성 광견병 바이러스 gp50 당단백질을 발현하는 NYVAC 재조합체가 가장 컸다. 사실상 gp50 발현 NYVAC 재조합체에 의해 유도된 역가는 상업적으로 구입가능한 불활성화된 백신의 두 접종으로 얻어진 수준에 필적하였다 (표 42).
이차 면역화 후 4주일경에 모든 돼지를 비내의 주입으로 병원성 가성 광견병 바이러스 균주의 대략 105PFU로 공격하였다. 모의 및 어버이 NYVAC 백신화된 컨트롤 모두 가장 심한 임상적 징후를 나타냈고 공격후 14일까지 코의 그리고 구강인후의 표본에서 최고 수준의 가성 광견병 바이러스를 분리하였다. NYVAC-기초 가성광견병 바이러스 재조합체 바이러스는 모두 컨트롤과 비교하여 병원성 가성 광견병 바이러스 공격의 효과 (즉 임상적 징후와 바이러스 분리)를 감소시키는 것을 보였는데, gp50 발현 재조합체 바이러스가 가장 효과가 있었다. 사실상 이 재조합체는 상업적으로 구입가능한 불활성화된 가성광견병 바이러스 백신 만큼 효과적이었다.
다른 헤르페스 바이러스처럼 PRV는 스트레스 또는 코르티 코스테로이드 투여에 의해 재활성화될 수 있는 잠복성 감염을 일으킬 가능성을 갖고 있기 때문에 (Whittmann 및 Rziha, 1989), 그러한 감염에 대한 NYVAC 재조합체의 보호 효능을 평가하기 위한 실험을 두 돼지 그룹에 수행하였다. 이 프로토콜은 하기의 스케줄에서 돼지들에 덱사메타손을 투여하는 것을 포함하였다: 정맥내의 경로로 1.25mg/파운드 및 1일 경에 정맥내의 경로로 0.25mg/파운드. 이 다음에는 4일동안 대략 매 12시간마다 다음 덱사메타손 투여하였다 (0.5mg/파운드). 코의(N) 그리고 인후의(T) 표본을 이용하여 덱사메타손 처리후 0일부터 10 일까지 바이러스 발산을 평가하였다. 이 결과들은 표 43에서 보여진다. 이 결과들은 명백하게 잠복성 PRV 감염의 확립에 대해 보호하는 것에서 NYVAC-기초 PRV 재조합체 바이러스의 효능을 나타낸다. 이 기준에 의하면 NYVAC-gII (vP881)가 참으로 가장 효험이 있었다.
이차 면역화 후 PRV SN 역가
실시예 68-NYVAC.1 (vP954)의 벡터로서의 이용
NYVAC.1 (vP954)(실시예 17)에서는 NYVAC (vP866)의 [C7L-K1L] 삭제가 우측으로 K3L까지 확대되는데, 이 유전자는 삭제되면 인터페론에 대한 증가된 민감도를 제공한다(Beattie 등, 1991). 하기에서 세부화된 대로 광견병 당단백질 유전자에 대한 그리고 홍역 HA 및 F 유전자에 대한 면역화 벡터로서 NYVAC.1을 시험하였다.
vP954 속으로 광견병 당단백질 유전자의 삽입 ;
우두 바이러스 재조합체 vP1006의 제조.
TK 삭제 유전자좌에 삽입된 광견병 당단백질에 대한 발현 카세트를 포함하는 도너 플라스미드 pRW842 (실시예 7)를 vP954 레스큐 바이러스와의 재조합에 이용하였다. 광견병 당단백질 G 코딩서열에 대한32P-표지된 DNA 프로브를 이용한 플라크 혼성화에 의하여 재조합체 우두 바이러스 vP1006을 확인하였다.
홍역 HA, F를 암호화하는 유전자의 vP954 속으로의 삽입 ;
우두 바이러스 재조합체 vP1015의 제조.
TK 삽입 유전자좌에 홍역 F 및 홍역 HA에 대한 발현 카세트를 포함하는 pRW857 (실시예 9)를 vP954 레스큐 바이러스와의 재조합을 위한 도너 플라스미드로서 이용하였다. 홍역 HA 및 홍역 F 코딩서열에 대한32P-표지된 프로브를 이용한 플라크 혼성화에 의하여 재조합체 바이러스 vP1015를 확인하였다.
면역화 매체로서 K3L-MINUS NYVAC.1 기초벡터의 효능 ;
광견병 G 재조합체 vP1006.
4 내지 6주일된 마우스 (바이러스 당 희석당 10)를 vP1006, vP954 (vP1006의 어버이), vP879(NYVAC-기초 광견병 G, 실시예 7)의 미희석물, 10-2, 10-4, 또는 10-6희석물, 또는 우두 바이러스 광견병 187 XP12으로 접종하였다. 풋패드를 통해서 마우스당 50-100μℓ로 접종을 수행하였다. 접종후 14일경에 모든 마우스를 20LD50의 CVS 균주 (0.03mℓ내)로 뇌내의 접종으로 공격하였다. 생존한 마우스를 계수하고 보호 투여량 50% (PD50)을 계산하였다.
표 44에서 보여지는 것처럼, vP1006, vP954의 어버이 바이러스는 최고의 접종물에서 조차 살아있는 광견병 공격으로부터 어떤 마우스를 보호하지 못하였다. 재조합체 바이러스 187 XP12 (Kieny 등, 1984), vP879, 및 vP1006 모두 살아 있는 광견병 공격으로부터 마우스를 보호할 수 있는 능력을 나타냈다. 그러나 이 능력에 있어 이러한 바이러스들의 상대적인 효능이 PD50값에 의해 예시되는 것처럼 변화하였다 (표 44).
홍역 바이러스 재조합체 vP1015.
두 토끼(A168 및 A169)를 0일과 28일경에 피하내 경로로 vP1015의 8.0 log10PFU로 접종하였다. 0 일, 14, 21, 28, 35,42 및 49 일경에 연속 사혈을 취하였다. Albrecht등 (1981)에 의해 기술된 플라크 감소 중화 방법을 이용하여 바이러스 중화항체의 존재에 대해 혈청을 분석하였다.
이 분석의 결과들이 표 45에서 보여진다. 두 동물들은 vP1015의 단일접종후에 접종후 2주일경 보호수준의 항체를 나타내는 동물 A169로 혈청변환되었다. 이차 접종후에는 항체 수준의 상당한 증가가 관찰되었다. 동등한 프로토콜로 두 토끼를 NYVAC-MV (vP913; 실시예 9)로 접종한 결과가 표 45에 포함되었다. 이 결과들은 K2L 및 K3L의 삭제는 바이러스의 효과적인 면역화 매체로서 작용할 수 있는 능력에 영향을 주지 않았다는 것을 나타낸다.
실시예 69-NYVAC.2 (vP938)의 벡터로서의 이용 ;
광견병 당단백질 G 유전자를 포함하는 우두 바이러스 재조합체 vP996의 제조
NYVAC.2 (vP938)(실시예 17)에서는 NYVAC (vP866)의 [C7L-K1L] 삭제가 380RF 전체[C23L- F4L]를 포함하도록 양쪽 방향으로 확대되었다. TK 삭제 유전자좌에 삽입된 광견병 당단백질에 대한 발현 카세트를 포함하는 도너 플라스미드 pRW842 (실시예 7)를 vP938 레스큐 바이러스와의 재조합에 이용하였다. 재조합체 우두 바이러스 vP996을 광견병 당단백질 G 코딩서열에 대한32P-표지된 DNA 프로브를 이용한 플라크 혼성화에 의해 확인하였다.
VERO 및 MRC-5 세포에서 변형 NYVAC 바이러스의 생장
조직 배양에서의 생장에 대한 우두 바이러스의 좌측 [C23L-F4L] 및 우측 [B13R-B29R] 터미널 가까이의 커다란 삭제의 효과를 조사하기 위하여, NYVAC (vP866), vP938, vP996 및 하기의 부가적인 NYVAC-기초 바이러스를 MRC-5 및 VERO 세포에서의 복제에 대해 시험하였다.
vP879(실시예 7)는 NYVAC의 TK 유전자좌 속에 삽입된 광견병 당단백질 유전자를 포함한다.
vP953(실시예 17)은 NYVAC 삭제 및 게놈의 우측 터미널 가까이 부가적인 삭제 [B13R- B29R]를 포함한다.
vP977(실시예 17)은 NYVAC 삭제+ 게놈의 좌측 및 우측 터미널 가까이 부가적인 삭제를 포함한다.
VERO 세포 (아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주, ATCC CCL 81) 및 MRC-5 세포 (인간 태아의 폐, ATCC CCL 171)를 1.5×106으로 60mm 접시에서 감염 2일전에 시드 배양했다. 감염시 모든 세포가 합류하여 접시가 2×106세포를 포함하였다. 세포를 ara C (최종 농도 40μg/ mℓ)가 있는 또는 없는 MEM+2% 새로 태어난 송아지 혈청 (NCS)에서 희석된, 세포당 0.1 pfu 다중도의 바이러스로 감염시켰다 (표 46). 감염된 단일층을 37℃에서 60 분동안 때때로 흔들면서 배양하였다. 1 시간 흡착기간후에, 세포를 MEM+2% NCS로 두번 세척하고, 그다음 ara C 있는 또는 없는 MEM+2% NCS 3mℓ로 덮고, 37℃에서 배양하였다. 감염된 세포를 3사이클의 동결 및 해빙에 의해 감염후 1 또는 72 시간이 지나고 나서 수거하였다. 각 샘플을 VERO 세포에서 이중으로 적정하였다.
표 46에 표시된 것처럼, NYVAC(vP866)은 인간 MRC-5 세포에서 제한된 생장을 할 수 있다. 여기서 시험된 조건 (0.1pfu/ 세포의 moi, 72시간 배양) 하에서 NYVAC는 대략 2 log의 역가 증가를 보였다. 이러한 동일 조건하에서 게놈의 좌측 (vP938) 또는 우측 (vP953) 터미널 가까이 삭제를 포함하는 변형 NYVAC 바이러스는 대략 1 log의 역가증가를 보였다. 양쪽 터미널 가까이 삭제를 포함하는 변형 NYVAC 바이러스 (vP977)의 수율은 투여 바이러스에 상대적으로 감소되었는데, 이것은 MRC-5세포에서 어떤 증식이 없다는 것을 나타낸다. 반대로 이러한 조건하에서 시험한 모든 바이러스가 VERO 세포에서 대략 동일한 정도로 증폭되었다. 표 46에 나타난 것처럼, 다양한 변형 NYVAC 바이러스 삭제 돌연변이체에 대한 VERO 세포에서의 수율에 비교된 MRC-5 세포에서의 우두 바이러스 수율의 백분율은 다음과 같다: vP866 (NYVAC) 3.5%; vP938 (NYVAC.2, 좌측 말단삭제) 1.42%; vP953 (우측 말단삭제) 0.5%; vP977 (좌측 및 우측 말단삭제) 0.06%, MRC-5 세포에서의 NYVAC-기초 광견병 재조합체 vP879 및 NYVAC.2-기초 광견병 재조합체 vP996의 수율은 본질적으로 그것의 각각의 어버이 바이러스에 대한 것과 동일한데, 이것은 외부 유전자의 발현이 조직 배양에서 재조합체 바이러스의 생장에 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 70-볼거리(MUMPS) F 및 HN 유전자의 cDNA 클로닝
볼거리 바이러스의 Urabe AM-9 균주는 유럽과 일본에서 백신으로 이용하는 것이 허가된 살아 있는 약독화된 바이러스이다. 이 바이러스는 프랑스의 Institut Merieux, Marcy l'Etoile로부터 백신 제조물 (Imovax Oreillons)로서 얻어졌다. 바이러스를 VERO 세포에서 증식시키고 (두번의 계대접종 배양) 감염된 세포로부터 전체 RNA를 분리하고 정제하였다 (Chirgwin 등, 1979). 첫번째 가닥 cDNA는 AMV 역전사 효소 및 임의의 프라이머를 이용하여 이 RNA로부터 제조되었다 (Watson 및 Jackson, 1985). RW 볼거리 균주의 공표된 서열을 이용하여 (Waxham등, 1987; Waxham 등, 1988) F 및 HN 유전자의 5' 및 3' 비번역 부위로부터 특이적인 프라이머 세트가 합성되었다. 중합효소 사슬반응(PCR)을 이용하여 첫번째가닥 cDNA로부터 Urabe AM-9 F 및 HN 유전자를 증폭시키는데 이 프라이머를 이용하였다. F 유전자는 합성 올리고뉴클레오티드 RG 503 (SEQ ID NO:366) (5'-TCTGAGCTCGAAAATA GAATTGATCAG-3') 및 RG494 (SEQ ID NO:367) (5'-TCTGGTACCTTTCTGAATGCAGGATG-3')을 이용하여 증폭되었다. HN 유전자는 RG 500 (SEQ ID NO:368) (5'-TCTGAGCTCC-AATACAACACAGAACC-3') 및 RG 501 (SEQ ID NO:369) (5'-TCTGGTACCGCATTCACT-ATTACTCA-3')을 이용하여 증폭되었다. 5' 프라이머 (RG 503 및 RG 500)을SacI 위치를 갖도록 고안하고 3' 프라이머 (RG 494 및 RG 501)을Asp718 위치를 갖도록 고안하였다. 증폭된 F 및 HN 단편을SacI 및Asp718로 분해시키고 다수의 클로닝 위치의SacI 및Asp718 위치에서 pBluescript SK+ 속에 클로닝하였다. 어떤 역전사효소 또는 PCR 결함을 제거하기 위해 6 F 유전자 클론과 5 HN 유전자 클론이 DNA 서열결정되었다. 도 29는 pURF3에 의해 나타내진 컨센서스(consensus) F 서열을 제공하고 (SEQ ID NO:370) 도 30는 pURHN5에 의해 나타내진 컨센서스 HN 서열을 제공한다 (SEQ ID NO:371).
실시예 71-ALVAC 도너 플라스미드 제조:
볼거리 F 및 HN 유전자
볼거리 F 및 HN 유전자를 발현하는 ALVAC 재조합체의 제조를 위한 ALVAC 도너 플라스미드의 전체 디자인은 하기와 같다. 볼거리 F 유전자는 엔토모폭스 42K 프로모터에 결합되었고 (실시예 59에서 기술됨) 볼거리 HN 유전자는 우두 바이러스 H6 프로모터에 결합되었다 (Perkus 등, 1989). 두 프로모터 전사되는 유전자는 5' 대 5' 방향으로 배열되었고 ALVAC C3 유전자좌 삽입 플라스미드 속에 삽입되었다. 제조의 특이한 세부 내용은 하기에서 제공되었다.
pSPCP3L (실시예 32에서 기술됨)의 다수의 클로닝 부위는EcoRV,RsrII,SmaI 및PstI제한 위치를 포함하는 31bp 링커 단편을 첨가함으로써 변화되었다. 링커는 합성 올리고뉴클레오티드 RG 560 (SEQ ID NO:372)(5'-TTAGATATCCGGACCG-CCCGGGCTGCAGAAT-3') 및 RG 561 (SEQ ID NO:373)(5'-ATTCTGCAGCCCGGGCGGT-CCGGATATCTAA-3')을 어닐링시키고, 그 다음EcoRV 및PstI으로 분해시킴으로써 제조되었다. 링커를 pSPCP3L의EcoRV 및PstI 위치속에 클로닝하여 PC3LR을 생성하였다.
H6 프로모터는 합성 올리고뉴클레오티드 RG562 (SEQ ID NO:374) (5'-TATGAATTCCCATGGTTAATTAATTAGTCATC-3') 및 RG563 (SEQ ID NO:375)(5'-TCTCCCGGG-CGGATATCGCGATAATG-3')을 이용하여 pRW823으로부터 PCR에 의해 증폭되었다. pRW823은 Perkus 등, 1989에 의해 기술된 대로 H6 프로모터 서열을 포함한다. 정제한 단편을EcoRI 및SmaI으로 분해하고 pC3LR에서EcoRI 및SmaI 위치속에 결합시켜서 pC3LRVQH6를 생성하였다.
볼거리 F 유전자는 pURF3으로부터HindIII/Asp718 단편 (F 유전자 ORF-N 터미날로부터약 50코돈)으로서 절단되었다. 이 단편의 말단은 클리나우 중합효소를 이용하여 회복되었고,EcoRI 분해되고 클리나우 중합효소로 회복된 pC3LRVQH6 속에 결합되었다. 정확한 방향에 대한 스크리닝은 pC3LRFVQH6를 생성하였다.
42K 프로모터 서열 및 F 유전자의 N-터미날 부분을 포함하는 단편이 합성 올리고 뉴클레오티드 RG 564 (SEQ ID NO:376) (5'-TAACCATGGTTTATTGGGAAGAATATGA-TAATATTTTGGGATTTCAAAATTGAAAATATATAATTACAATATAAAATGAAGGCTTTTTTAGTTAC-3') 및 RG565 (SEQ ID NO:377) (5'-CCACTGCAGGCGTCATAC-3')을 이용하여 pURF3으로부터 PCR에 의해 증폭되었다. 정제한 단편을NcoI 및PstI으로 분해하고NcoI 및PstI 절단된 pC3LRFVQH6 속에 결합시켰다. 결과적인 플라스미드 pC3LRF42KVQH6는 삽입된 단편의 DNA 서열분석에 의해 확인되었다.
볼거리 HN 유전자는 pURHN5로부터 SspI/Asp718 단편 (HN 유전자 ORF-N 터미널로부터 약 35코돈)으로서 절단되었다. 이 단편의 말단은 클리나우 중합효소를 이용하여 회복되었고, SmaI 절단된 pC3LRF42KVQH6 속에 결합시켰다. 정확한 방향에 대한 스크리닝은 pFR2A-30을 생성하였다.
H6 프로모터의 3'부분 및 HN 유전자의 N-터미날 서열을 포함하는 단편이 합성 올리고 뉴클레오티드 RG 566 (SEQ ID NO:378) (5'-TTATCGCGATATCCGTT-AAGTTTGTATCGTAATGGAGCCCTCAAAACTC-3') 및 RG 567 (SEQ ID NO:379) (5'-AAACCTAAGGTCATTAAC-3')을 이용하여 pURHN5로부터 PCR에 의해 증폭되었다. 정제한 단편을NruI 및Bsu36I으로 절단하고NruI 및Bsu36I 절단된 pFR2A-30 속에 결합시켰다. 결과적인 ALVAC 도너 플라스미드 pC3URFHN은 삽입된 단편의 DNA 서열분석에 의해 확인되었다.
실시예 72-ALVAC 재조합체의 제조
도너 플라스미드 pC3URFHN을 ALVAC (CPpp)와의 CEF 세포에서의 생체외 재조합 실험에 이용하여 vCP171을 생성하였다 (Taylor등, 1992). 방사성 표지된 F 및 HN 특이적인 프로브를 이용한 인시투 혼성화 방법 (Piccini 등, 1987)에 의해 재조합체 바이러스를 확인하였다. 세번의 플라크 정제에 의해 재조합체 플라크를 정제하고 발현분석을 위해 증폭시켰다. 발현 분석에 의하여 F와 HN 이 발현되었다.
실시예 73-일본 뇌염 바이러스(JEV) 15aaC, prM, E, NS21, NS2A를 포함하는 삽입벡터의 제조
pRW838의 제조는 상기에서 기술한 것과 같다 (실시예 15 참조). pRW838을 광견병 당단백질 유전자의 3'말단에서EcoRI으로 분해시키고 DNA 중합효소 I의 클리나우 단편으로 채우고 H6 프로모터내에서EcoRV으로 분해시키고, 알칼리 포스파타제로 처리하고, H6 프로모터의 5'103bp, 플라스미드 복제의 오리진 및 C5 측면부암을 포함하는 3202bp 단편을 분리했다. 우두 바이러스 도너 플라스미드에 15 아미노산 C, prM, E, NS1, NS2A를 암호화하는 JEV cDNA를 포함하는 플라스미드 JEVL 14VC (Mason 등, 1991)(뉴클레오티드 337-4125, Konishi 등, 1991)을 H6 프로모터에서EcoRV로 그리고 JEV 서열 (뉴클레오티드 2124)에서SacI으로 분해시키고 1809bp 단편을 분리하였다. JEVL14VC를 T5AT 다음의EagI 위치에서EclXI으로 분해하고, DNA 중합효소 I의 클리나우 단편으로 채우고 JEV 서열 (뉴클레오티드 2124)에서SacI으로 분해하여 2011bp 단편을 생성하였다. 1809bpEcoRV-SacI, 2011bpSacI-채워진EclXI 및 3202bpEcpRV-채워진EcoRI 단편을 결합시켜서 JEVCP1을 생성하였다.
실시예 74-JEV 15aaC, prM, E를 포함하는 C5 삽입벡터의 제조
플라스미드 JEV 36을 H6 프로모터내에서EcoRV로 그리고 JEV 서열내에서SphI으로(뉴클레오티드 2380)분해하여 2065bp 단편을 분리하였다. 플라스미드 VQH6C5LSP (실시예 44에서 정의함)를 H6 프로모터내에서EcoRV로 그리고 폴리링커내에서XbaI으로 분해시키고, 2065bp 단편+ 어닐링된 올리고뉴클레오티드 SP131 (SEQ ID NO:382) 및 SP132(SEQ ID NO:383) (SphI 접착성 말단, E 코딩부위를 완결시키는 T 뉴클레오티드, 번역 종결, 우두 바이러스 초기전사 종결 시그날 (AT5AT; Yuen 및 Moss, 1987), 이차 번역종결, 및XbaI 접착성 말단을 포함)에 결합시켜서 플라스미드 JEVCP5를 생성했는데, 이것은 C5 측면부암 사이에 H6 프로모터의 조절하에 있는 15 아미노산 C, prM 및 E를 암호화 한다.
실시예 75-ALVAC-기초 JEV 재조합체의 제조
JEVCP1을 ALVAC 감염된 일차 CEF 세포속에 트랜스펙션시켜서 15 아미노산 C, prM, E, NS1, NS2A를 암호화하는 카나리아 폭스 재조합체 vCP107을 생성하였다. JEVCP5를 ALVAC 감염된 일차 CEF 세포속에 트랜스펙션시켜서 JEV 15aaC, prM 및 E를 암호화하는 카나리아 폭스 재조합체 vCP140을 생성하였다.
SP131 (SEQ ID NO:382) 5'- C T tga tttttattga T -3'
SP132 (SEQ ID NO:383) 3'-GTACG A ACT AAAAATA ACT AGATC-5'
SphIXbaI
실시예 76-재조합체 감염된 세포에서 JEV 단백질의 면역침전
면역침전 실험을 이전에 기술한 대로 수행하였다 (Konishi 등, 1991). vCP107 및 vCP140 감염세포에서 생성된 E단백질은 JEV-우두 바이러스 재조합체에 의해 생성된 E 단백질과 같이 이동되는데, JEV-우두 바이러스 재조합체는 확실한 E 단백질을 생성하는 것으로 보여졌다 (Konishi 등, 1991). vCP107은 확실한 NS1 단백질을 생성하는 것으로 보여지는 JEV-우두 바이러스 재조합체에 의해 생성되는 NS1단백질과 같이 이동되는 NS1단백질을 생성한다( Konishi 등, 1991).
실시예 77-vCP107로의 마우스의 면역화
3 주일된 스위스 마우스를 107PFU의 vCP107로 복막내 주입에 의해 면역화하고 3주일 후에 선택한 마우스로부터 혈청을 수집하였다. 마우스의 1/2을 vCP107로 재접종하고 3주일 후에 혈청을 수집하였다. 이전에 기술한대로 (Konishi 등, 1991) 중화(Neut) 및 혈구응집억제항체(HAI)에 대해서 혈청을 분석하였다. vCP107로 1번 또는 2번 면역화된 마우스는 높은 역가의 Neut 및 HAI 항체를 발달시켰고, 이차 면역화에 의해 두 역가가 증가되었다. 어버이 ALVAC를 주입한 마우스는 항체 역가를 나타내지 않았다. vCP107 면역화된 마우스에서 얻은 항체 수준은 JEV-우두 바이러스 재조합체로의 면역화에 의해 얻은 것에 필적하였다(Konishi등, 1991).
실시예78
TROVAC-NDV(vFP96)의 효능연구
특이적인 병원체 없는 (SPF) 병아리와 상업적인 브로일러 병아리에서 TROVAC-NDV(vFP96) (실시예8)의 NDV (뉴캐슬병 바이러스)에 대한 보호효능을 결정하기 위한 다수의 연구를 수행하였다.
연구A
1일된 SPF 병아리의 4그룹을 어버이 TROVAC 바이러스 또는 TROVAC-NDV (vFP 96)의 0.3 내지 6.3 ℓog10TCID50의 일정 범위 투여량으로 다리에서 근육내 경로로 접종하였다. 조류를 접종부위에서의 반응에 대해 관찰하고, 항-NDV 혈청중화 항체 및 헤마글루티닌-억제 항체의 존재를 분석하기 위해서 접종후 14일경에 혈청샘플을 수집하였다. 접종후 21 일경에 조류를 벨로겐(Velogen) 성 NDV 균주 텍사스 GB의 5.0 ℓog1050% 알 감염투여량의 근육내 접종에 의하여 공격하였다. 조류는 공격후 14일 동안 유지되었는데 이때 건강한 조류는 보호된 것으로 간주하였다. TROVAC 어버이 바이러스 또는 TROVAC-NDV (vFP 96)의 6.3 또는 2.6 ℓog10TCID50의 근육내 접종은 접종 부위에서 피부손상을 일으켰는데 어떤 경우에는 사멸로 이끌었다.
손상의 심함에 대해 특이적인 투여량 효과가 있었는데, 1.1 내지 1.4 ℓog10TCID50의 투여량에서는 접종 부위에서 사소한 염증반응으로 제한되었다. 모든 경우에 손상은 접종부위로 제한되고 병아리의 다른 부분으로 퍼지지 않았다. 이 효과는 어버이 바이러스로 동일한 효과가 관찰되기 때문에 TROVAC-NDV에서 NDV F 및 HN 유전자의 발현에 기인하지는 않는다. 다른 접종 경로가 이용될때에는 TROVAC 또는 TROVAC 기초 재조합체의 높은 투여량 접종의 유해한 부작용이 관찰되지 않기 때문에 이 반응은 이러한 접종경로에 특이적이다.
혈청학적분석 및 보호효능의 결과는 표47에서 보여진다. TROVAC 어버이 바이러스로 접종한 모든 조류는 치명적인 공격에 굴복하였다. TROVAC-NDV (vFP 96)의 1.1 및 2.6 ℓog10TCID50으로 백신접종한 모든 조류는 공격에 생존하였고 반면에 0.3 ℓog10TCID50을 주입한 조류의 82%가 생존하였다. 이것은 이러한 경로에 의한 이 재조합체에 대한 50% 보호 투여량(PD50)이 0.3 TCID50보다 더 작다는 것을 나타낸다.
a: 조류는 1일 되었을때 근육내 경로에 의해 TROVAC 또는 TROVAC-NDV의 일 접종물을 주입하였다. 투여량은 ℓog10TCID50으로 표현되었다.b: 혈청중화(SN)역가 및 혈구응집-억제(HI) 역가는 시험한 조류의 평균으로 표현되었다. SN 역가는 세포병리학적 효과의 완전 중화를 보여주는 최고 항체희석도의 역수의 ℓog10으로 표현되었다. HI 역가는 응집의 억제를 보여주는 마지막 항체 희석도의 역수의 ℓog10로서 표현되었다.c: 백신접종한 조류수 대 사멸한 조류수의 비율.d: 공격된 조류수 대 사멸한 조류수의 비율, 조류는 NDV 텍사스 균주 GB의 5.0 ℓog2EID50의 근육내 접종에 의하여 공격되었다.ND: 검출할수 없음.NT: 시험하지 않음.
연구 B
상업적인 브로일러 병아리의 두 공급원에서 그리고 SPF 병아리에서 TROVAC-NDV(vFP 96)의 보호효능을 평가하였다. 1 일된 조류의 3그룹을 연구하였다. 그룹 1: 이전에 계두 바이러스로 백신접종한 적이 없었던 부화장에서 얻은 달걀로부터 병아리를 부화시켰다. 그룹 2: 이전에 계두바이러스로 백신접종한 적이 있는 부화장에서 얻은 달걀로부터 병아리를 부화시켰다. 그룹 3: 특이적인 병원체 없는 병아리를 얻었다. 병아리를 TROVAC-NDV의 2.0 또는 4.0 ℓog10EID50으로 피하에 백신 접종하였다. 각 그룹의 병아리를 백신접종하지 않은 접촉 컨트롤로서 유지하였다. 백신접종후 21일 및 28일경에 병아리들을 사혈하였고 NDV HI 항체의 존재를 평가하였다. 또한 한천 겔 침강소 테스트를 이용하여 백신접종후 계두 항체의 존재에 대해 혈청을 분석하였다. 백신접종후 28일경에 각 그룹의 10 병아리와 10 컨트롤을 벨로겐성 NDV 균주텍사스 GB의 4.2 ℓog10EID50의 근육내 접종에 의하여 공격하였고 생존한 것을 평가하였다. 각 그룹의 10 병아리와 10 컨트롤을 또한 계두 바이러스의 NVSL 균주의 날개자상 접종에 의하여 공격하였다. 계두 바이러스 공격으로부터의 보호를 접종부위에서의 손상 또는 선감(善感)의 결핍에 근거하여 평가하였다. 이 실험의 결과는 표48에서 보여진다.
이 결과는 상업적인 브로일러 병아리는 TROVAC-NDV에 의해 발현된 NDV 항원에 대해 검출가능한 면역 반응을 나타내지 않은 반면 SPF 병아리는 면역반응을 보였다는 것을 나타낸다. 상업적인 병아리에서의 특이적인 항-NDV 항체의 결핍에도 불구하고, 벨로겐성 NDV 공격후에 보여지는 보호수준에는 차이가 없었다. 병아리들중 어느것도 한천 겔 침강소 테스트에 의해 검출가능한 계두 백신접종에 대한 면역 반응을 보이지 않았다. 이러한 검출가능한 항- 계두 항체의 결핍에도 불구하고, 모든 백신 접종한 병아리는 계두 공격으로부터 보호되었고, 반면에 비-백신 접종한 병아리는 굴복하였다. 이러한 결과는 암컷을 계두 바이러스에 사전노출시키는 것이 계두 기초 NDV 재조합체로 백신 접종된 병아리에서 NDV 또는 계두에 대한 보호 면역의 유도를 금지하지 않는 것을 나타낸다.
a: 계두 바이러스로 백신접종된 적이 없는 부화장의 병아리들.b: 계두 바이러스로 백신접종된 적이 있는 부화장의 병아리들.c: 특이적인 병원체 없는 병아리들d: HI 항체의 기하학적 평균 역가e: NDV 또는 계두 바이러스 공격후 병아리들의 퍼센트 보호
인간 재조합체 면역결핍 바이러스-NYVAC 또는 -ALVAC 바이러스에 관한 하기의 실시예 79 내지 81의 어떤 재료 및 방법; 세포주
P815 마우스 비만세포종 세포(H-2d)는 American Type Culture Collection으로부터 얻었고, 10% 태아 소혈청(FBS) 및 100 IU/ mℓ 페니실린 및 100μg/ mℓ스트렙토마이신으로 보강된 이글 최소 필수배지에서 보존되었다.
마우스. 암컷 BALB/cJ (H-2d) 마우스는 Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)로부터 구입하였고, 임의로 마우스 먹이와 물로 보존하였다. 모두 6주일과 15주일 사이의 나이를가진 마우스를 이용하였다.
접종. 마우스를 꼬리 측면 정맥을 통해서 인산-완충된 식염수 0.1 mℓ의 5×107플라크 형성 단위(pfu)로 정맥내 접종하였다.
혈청. 마우스를에테르로 약하게 마취시키고 후안와총으로부터 혈액을 모았다. 하나의 실험그룹을 이루는 마우스의 혈액을 울혈하고 응고시켰다. 혈청을 모아서 사용할때까지 -70℃에서 보존하였다.
세포독성 T 임파구 및 세포독성 T 임파구의 메모리 전구체의 생체외 자극의 분석.
6 주일된 암컷 BALB/c 마우스를 5×107pfu의 우두 바이러스(NYVAC), HIV-1 (IIIB)env발현 재조합체 우두 바이러스(vP 911), 카나리아 폭스 바이러스 (ALVAC), 또는 HIV-1 (IIIB)env발현 재조합체 카나리아 폭스바이러스(vCP112)로 정맥내 접종하였다. 7일후에 HIV-1 (IIIB) gp120의 초변이성 V3 루프 부위에 해당하는 펩티드와 하룻밤동안 배양된 P815 세포 또는 미변형 P815 세포에 대한 일차 CTL 활성에 대해서 비장 세포를 검사하였다. 초기 면역화후 22일 경에 실험마우스의 비장세포를 폭스 바이러스 감염된 자극제 비장세포와 함께 배양하고 전처럼 펩티드 펄스 표적에 대한 메모리 CTL 활성에 대해 검사하였다. 이차 CTL 활성을 결정하기 위하여 일차 면역화후 29일경 마우스에 일차의 경우와 동일한 투여량 및 내용물의 이차 접종물을 주입하였다. 5일후에 비장세포를 펩티드 펄스표적에 대한 세포용해 활성에 대해 검사하였다. 세포독성분석을 위하여 H-2dP815 마우스 비만세포종 세포를 20μg/mℓ V3 펩티드 (CNTRKRIRIQRGPGRAFVTGK, American Bio-Technologies, Inc.) (SEQ ID NO: 457)가 있는 또는 없는 배지(10% 태아 소혈청, 2mM L-글루타민, 100U/mℓ 페니실린, 및 100μg/mℓ 스트렙토마이신으로 보강되고 Earle 염을 포함하는 최소 필수 배지)에서 하룻밤동안 배양하였다. 다음날 아침, P815 세포를 원심분리에 의해 세척하고 2×106세포 당 100μCi의 Na2 51ＣrO4에서 37℃로 1시간동안 표지화시켰다. 원래의 비장을 안락사시킨 마우스로부터 무균적으로 제거하고, 얼음 냉각된 Hank 균형염 용액에 담그고, Stomacher 교반기를 이용하여 단일세포 현탁액으로 파열시켰다. 비장세포 현탁액을 저속 원심분리에 의해 여러번 세척하고 검사배지(10% 태아소혈청, 20mM HEPES, 2mM L-글루타민, 5 × 10-5M 2-메르캅토에탄올, 100U/mℓ 페니실린, 및 100 μg/mℓ 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640)에 재현탁시켰다. 메모리 CTL 활성을 위하여, 면역화된 마우스의 비장세포를 자극 배지(10% 태아 소혈청, 2mM L-글루타민, 10-4M 2-메르캅토에탄올, 100U/mℓ 페니실린, 및 100μg/ mℓ 스트렙토마이신을 포함하며, Earle 염이 있는 최소필수배지)에 재현탁시키고, 폭스바이러스 또는 폭스바이러스 재조합체중 하나로 감염된 새로운 동계의 자극제 비장세포를 가진 직립형 25cm2조직배양 플라스크에서 생체외 자극시켰다. 37℃에서 5일후에 세포를 세척하고, 계수하고, 검사배지에 재현탁시켰다.51크롬 표지된 표적세포를 4시간51Cr 방출검사를 위하여 96-웰 마이크로 타이터 플레이트에서 적정된 효과인자 세포에 첨가했다. 세가지 검사에 대해 보여진 효과인자 대 표적 세포비율(E:T)는 100:1 (일차), 20:1(메모리), 및 50:1 (이차) 였다. 퍼센트 세포독성은(실험적51Cr 방출- 자연적51Cr 방출)/(최대51Cr 방출- 자연적51Cr 방출)×100으로 계산되었다. 최대 방출은 표적세포에 5% 황산 도데실 나트륨을 첨가하여 결정되었고 반면에 자연적 방출은 효과인자세포의 부재하에 표적세포를 배양함으로써 결정되었다. 주어진 실험중 어느것에서도 표적세포로부터의51Cr의 자연적 방출이 최대51Cr방출의 20%를 초과하지 않았다. 에러바(error bar)는 평균으로 부터 1표준편차를 나타낸다. (*) P ＜ 0.05, 스튜던트 t-테스트는 적당한 우두 바이러스 또는 카나리아 폭스 바이러스 면역화된 마우스와 비교되었다.
세포독성 효과인자 세포의 세포표면 표현형
방법은 본질적으로 HIV IIIB env를 발현하는 우두 바이러스 또는 카나리아폭스 바이러스재조합체 (vP911, vCP112)로, 또는 우두 바이러스 또는 카나리아폭스 바이러스 벡터(NYVAC, ALVAC)로 면역화된 마우스 비장세포였다. 이차 접종은 일차접종 30 일후에 투여하였다. V3 펩티드 펄스 표적에 첨가하기 전에 비장세포를 2- 단계 프로토콜로 마우스 T-임파구 표면항원에 대한 동종항혈청 또는 모노클로날 항체로 처리하였다. 간단하게 동종항-Thy 1.2 (Cedarlane), 모노클로날 항-CD4 (172.4, K.J.Weinhold, Duke University Medical Center에서 얻음), 또는 모노클로날 항-Lyt 2.2 (Cedarlane)을 첨가한 세포독성배지(0.2% BSA 및 5mM HEPES 포함 RPMI 1640) 1mℓ 당 107살아있는 세포로 비장세포를 재현탁시켰다. 5℃에서 30분후에 세포를 세척하고, 원래부피의 세포독성배지에 재현탁시키고, 보체(토끼 Lo-Tox M, Cedarlane) 있는 또는 없는 두 동등 부분으로 나누고, 45분간 37℃에서 배양하였다. 세포를 검사 배지에서 세척하고, 처리-전 세포밀도에 근거하여 5시간51Cr 방출검사에 첨가전에 100:1 (일차), 10:1 ( 메모리), 또는 80:1 ( 이차)의 효과인자 대 표적세포 비율에 가까운 검사배지 체적에 재현탁시켰다. 에러 바는 평균으로부터 1표준 편차를 나타낸다.
HIV IIIB gp120의 V3 루프부위의 CTL 항원리셉터 인식의 특이성
세포독성 T임파구 및 세포독성 T임파구의 메모리 전구체는 상기에서 기술한 대로 마우스를 vCP112로 접종함으로써 생성되었다. 세포독성 T임파구의 검사는 P815 표적세포가 HIV-1 IIIB
로부터의 V3 펩티드로 하룻밤 동안 펄스화된 것을 제외하고는 상기에서 기술한대로 수행되었다. 효과인자 대 표적세포 비율은 100:1 (일차), 20:1 (메모리), 및 50:1 (이차)이었다.
HIV-1(IIIB) gp120에 대한 항체 반응
ELISA 플레이트(Immulon II)의 웰을 pH 9.6의 탄산완충액중의 부분 정제한 HIV-1(IIIB) gp120 (Dr. G. Franchini, NCI-NIH) 0.5 μg으로 4℃에서 하룻밤동안 코팅시켰다. 그 다음 플레이트를 0.05% Tween20을 포함하는 인산- 완충된 함염물(PBST)로 세척하였다. 그 다음 플레이트를 1% 소혈청 알부민(BSA)을 포함하는 PBST로 37℃에서 2시간동안 차단시켰다. PBST로 세척한후에, 혈청을 처음에는 0.1% BSA를 포함하는 PBST(희석 완충액)로 1:20 희석하였다. 혈청을 ELISA 플레이트의 웰에서 더욱 2배 연속하여 희석하였다. 플레이트를 2시간동안 37℃에서 배양하고 PBST로 세척하였다. 호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제 결합된 토끼 항-마우스 면역글로불린(DAKO)을 희석완충액으로 1:2000 희석하고 ELISA 플레이트의 웰에 첨가하고 1시간동안 37℃에서 배양하였다. PBST로 세척한후에 기질 완충액중의 OPD(o- 페닐렌디아민 디히드로 클로라이드)를 첨가하고 약 20 분동안 주위 온도에서 발색시켰다. 2.5 M H2SO4의 첨가에 의하여 반응을 종결시켰다. 490nm에서의 흡광도는 Bio-Tek EL-309 ELISA 리딩기로 결정되었다. 혈청 종결점은 0.4의 흡광도값을 주는 희석도의 역수로서 정의되었다.
실시예 79
HIV env를 발현하는 재조합체 카나리아폭스 바이러스는 HIV-특이적인 세포독성 T 임파구 활성을 유도한다.
HIV 카나리아 폭스 바이러스 재조합체(vCP112; 실시예18에서 정의함)로 처음 접종한후 7일경에, HIV V3 펩티드 펄스 표적세포에 대한 비장세포의 세포독성 반응은 동일한 HIVenv유전자를 발현하는 우두 바이러스 재조합체(vP911) (실시예18)의 동일한 투여량 5×107pfu에 의해 유도된 세포독성반응과 거의 동등하였다( 도 31). 적당한 생체외 자극 또는 이차 접종후, 카나리아폭스 바이러스 재조합체를 주입한 마우스의 비장세포의 세포독성 수준이 증가하였고, 유사하게 우두 바이러스 재조합체를 투여한 마우스의 비장세포에 필적하였다. 비-재조합체 우두 바이러스 또는 카나리아 폭스 바이러스 벡터 NYVAC 및 ALVAC로 접종한 마우스 비장세포로부터는 그러한 세포독성 반응이 검출되지 않았는데, 이것은 HIVenv유전자를 발현하는 폭스바이러스 재조합체 면역화에 대한 필요조건을 확인시킨다. 더욱, 접종 방법에는 관계없이 어떤 마우스 비장세포의 비변형 P815 세포에 대해서는 어떤 세포독성 반응성도 검출되지 않았다. 그리하여 HIV-1의env코딩서열을 발현하는 재조합체 우두 바이러스 또는 더욱 중요하게는 재조합체 카나리아폭스 바이러스로 접종된 마우스만이 V3-특이적인 세포독성 반응을 나타냈다.
실시예80
세포독성 효과인자 세포의 특정화
HIV-1 V3 펩티드 펄스 표적세포의 용해와 연관된 비장세포의 정체를 결정하기 위하여 마우스를 vCP112로 면역화시켰다. 일차 접종 21일후 각 면역화 또는 생체외 자극후, 2-단계 방혈과정을 수행하고, V3펩티드 펄스 P815 세포에 대한 세포독성에 대하여 비장세포를 평가하였다. 카나리아 폭스벡터 ALVAC로 접종한 마우스는 펩티드 펄스표적을 사멸시킬수 있는 비장세포를 생성하지 않았고 보여지지 않는다. 단일 면역화후 vCP112는 V3 펩티드 펄스표적을 사멸시킬수 있는 비장세포를 유도했다. 용해성 효과인자 세포는 항-마우스 Thy 1.2 또는 Lyt 2.2 + 보체 처리에 민감하였고 도 32에서 보여지는 것처럼 항-CD4에 저항성이 있었다. 도 32는 세포독성 T임파구 세포표면 항원 Thy 1.2 및 Lyt 2.2의 항체에 대한 vCP112로 면역화된 비장세포의 세포독성효과 인자세포의 민감성을 나타낸다. 보체 또는 모노클로날 항체중 어느것 또는 동종 항혈청 어느것도 이 세포의 세포용해 작용에 영향을 주지 않았다. 30일경에 투여된 이차 면역화 5일후에 유사한 결과가 얻어졌다. 단일접종후 21일경에 vCP112 감염된 동종 비장세포로의 생체외 자극은 항-Thy 1.2에 단지 부분적으로 민감하지만 항-Lyt 2.2에는 완전히 민감하고 항-CD4에는 저항성이 있는 용해성 효과인자 세포로 만들었다. 이러한 Thy 1.2-, CD4-, Lyt 2.2 + 효과인자 세포는 vCP112 접종된 마우스 비장세포의 vP911로의 생체외 자극후에는 보여지지 않았다. 그럼에도 불구하고 HIV V3 루프 특이적인 세포독성은 Thy 1.2 및 Lyt 2.2를 발현하지만 CD4는 발현하지 않는 T임파구 집단에 의하여 매개되는 것이 명백하다. 이 세포표면 표현형은 고전적인 새포독성 T임파구에 특유하다.
실시예81
HIV gp 120의 V3 루프부위의 CTL 항원 리셉터 인식의 특이성
T 임파구 항원 리셉터는에피토프 단편의 일차 아미노산 서열의 작은 변형에 대단히 민감하다. HIV gp120의 V3 루프부위는 초변이성이며 HIV 분리물 사이에서 면역학적으로 다르다. 초변이성은 단지 몇몇 아미노산의 치환과 첨가에 놓여있다. HIV 카나리아폭스 바이러스 재조합체에 의해 생성된 세포독성 세포의 특이성을 조사하기 위해 HIV 분리물 IIIB, MN, 또는 SF2의 gp120의 V3 루프부위에 해당하는 펩티드로 펄스화된 P815 표적세포중에서 CTL 활성에 대한 민감성을 비교하였다. HIV 특이적인 일차 CTL 활성은 도 33에서 보여지듯이, HIV 분리물 IIIB의 V3 루프에 해당하는 펩티드로 펄스화된 P815 표적세포에는 제한되었지만, HIV 분리물 MN 또는 SF2의 gp120의 V3 루프부위에 해당하는 펩티드로 펄스화된 표적세포에는 그렇지 않았다. 도 33는 gp120의 HIV IIIB 초변이성 V3 루프에 대한 그러나 HIV MN 또는 SF2의 V3 루프에 대해서는 아닌 세포독성 T임파구 항원 리셉터의 특이성을 나타낸다. 카나리아 폭스 바이러스 재조합체 vCP112로 면역화시켜서 유도된 생체외 자극된 HIV 특이적인 메모리 CTL 활성 및 이차 CTL 활성으로도 유사한 결과가 얻어졌다. 그리하여 HIV 분리물 IIIB의env유전자를 발현하는 재조합체 카나리아 폭스 바이러스에 의해 유도된 HIV 특이적인 CTL은 동일한 항원 분리물로부터 유래한 표적 에피토프만을 인식한다. 이러한 결과는 명백하게 HIV 카나리아 폭스 바이러스 재조합체로의 면역화에 의해 생성된 임파구 효과인자세포의 정교한 특이성을 나타내며 자연 킬러(NK) 세포 활성같은 비특이적인 효과인자 기작을 제거시킨다. 이러한 결과는 HIV-V3 특이적인 마우스 세포독성 T 임파구에 의한 에피토프 인식의 정밀성을 특정화하는 다른 발표들과 완전히 일치한다.
실시예 82
NYVAC- 또는 ALVAC- 기초 HIV 재조합체를 접종한 마우스의 항체반응
HIV에의 체액성 반응을 평가하기 위해 마우스를 0일째에 우두 바이러스 HIV 재조합체 또는 카나리아 폭스 바이러스 재조합체로 면역시키고 4주째에 2차 면역을 받게하였다. 마우스를 초기면역후 20주 내내 여러 간격으로 출혈시켰다. 각 처리군으로부터 수집된 혈청을 항원으로서 정제된 gp 120을 사용하여 ELISA에 의해 HIV에 대한 항체를 분석하였고 결과를 도 34에 나타내었는데 이것은 HIV-1 env를 발현하는 벡터(NYVAC, ALVAC)로 면역되거나 또는 우두 바이러스 재조합체 vP911 또는 카나리아 폭스 재조합체(vCP112)로 면역된 마우스의 HIV IIIB gp120에 대한 항체반응을 제공하며, 여기서 역삼각형은 2차 접종 투여시기를 가리킨다. 1차 항체 반응은 일반적으로 간소하나 검출가능하였다. 2차 면역에 이어서, vP911 및 vCP112 둘다로 면역된 마우스의 항체 역가는 증가하였고 제6주에서의 피이크는 10,000 이상의 역가를 가졌다. 이들 항체 역가는 연구의 지속기간내내 대략 같은 수준으로 남아있었다. 따라서, 카나리아 폭스 바이러스 HIV재조합체, vCP112는 상당한 항체반응을 유발할수 있었다.
HIV-1의 env 유전자를 발현하는 카나리아 폭스 바이러스로 마우스에의 접종은 세포독성 T 임파구의 특징을 갖는 비장세포 반응성, 즉, 면역을 위한 요건, 세포표면 표현형, 기억, 및 세련된 에피토프 특이성을 유도한다. 더나아가서, HIV-1 gp120에 대한 항체 반응은 이 재조합체 카나리아 폭스 바이러스로 접종에 의해 유발된다.
실시예 83
ALVAC 및 NYVAC에 의한 HIV-1 (MN)env의 NYVAC-및 ALVAC- 기초 HIV-1재조합체 발현의 유도
HIV-1(MN)env서열은 각각 HIV-1(MN)의 게놈 cDNA 클론으로부터의 1774bp 및 1803bp 소단편을 함유하는 플라스미드 pMN 1.8-9 및 pMN 1.8-10으로부터 유도되었다. 이들 플라스미드는 닥터 갈로(Dr. R.C.Gallo)(NCI-NIH)의 실험실에 의해 제공되었다. 1,026bp KpnI/EcoRI 단편은 올리고뉴클레오티드 HIVMN6 (SEQ ID NO: 387)(5'-GGGTTATTAATGATCTGTAG-3') 및 HIV 3B2(SEQ ID NO: 151)를 사용하여 PCR에 의해 pMN1.8-9로부터의 이들 서열을 증폭시키고 이어서KpnI/EcoRI로 분해시킴으로써 유도되었다. 이 단편은KpnI 및EcoRI로 분해시킨 pBS-SK에 삽입되어 pBSMIDMN을 얻었다.
1,028bpSaℓI/XbaI 단편은 올리고뉴클레오티드 HIVMN5 (SEQ ID NO: 388)(5'-ATCATCGAGCTCTGTTCCTTGGGTTCTTAG-3') 및 HIVMN3P (SEQ ID NO : 389) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAATTATAGCAAAGCCCTTTCCAAGCC-3')를 사용하여 PCR에 의해 pMN1.8-10으로부터 유도되고 이어서SacI 및XbaI으로 분해시켰다. 이 단편은 404bpEcoRI/SacI 단편을 가진EcoRI및XbaI으로 분해된 pBS-SK에 공-결합시켰다. 404bp 단편은 주형으로서의 pMN1.8-9와 올리고뉴클레오티드 HIV3B1 (SEQ ID NO: 144) 및 HIVMN4 (SEQ ID NO: 390) (5'-ATCATCGAGCTCCT ATCGCTGCTC-3')로 PCR에 의해 유도되었다. 결과된 플라스미드는 pBS3MN으로 지칭하였다.
pBSMIDMN으로부터의 1,026bpEcoRI/KpnI 단편은EcoRI/KpnI로 분해된 4,315bp pBS3MN에 삽입시켜 pBSMID3MN을 발생시켰다. 이 플라스미드는 5'-대부분 영역을 제외하고는 대부분의env유전자를 함유한다. 우두 바이러스 H6 프로모터 (Goebel et al., 1990 a,b) 및env유전자의 5'-대부분 영역은 318bpKpnI 단편을 pH6HIIIBE (실시예18에 정의됨)로부터 분리함으로써 얻어졌다. 이 단편은 pBSMID3MN으로부터의 2.9 bpKpnI/XbaI 단편과 함께KpnI/XbaI 분해된 pBS-SK에 결합시켰다. 결과된 플라스미드는 pH6HMNE로 지칭되었다.
H6프로모터의 3'-대부분의 26 bp에 3'을 병치시킨 전체 HIV-1(MN)env유전자를 함유하는 pH6HMNE로부터의 2.7 kbNruI/XbaI 단편은 블런트 말단으로 하였고NruI/SmaI 분해된 pSPHAH6에 삽입시켰다. 이것은 플라스미드 pHAHIVMNE를 발생시켰다. 플라스미드 pSPHAH6는 다음과 같이 유도되었다.
플라스미드 pMP2VCL(K1L 숙주 범위 유전자의 상류에 우두 서열내에 폴리링커 영역을 함유함)을HindIII 및XhoI로 폴리링커내에서 분해시키고 어닐링된 올리고 뉴클레오티드 SPHPRHA A 내지 D
에 결합시켜HindIII 부위, H6 프로모터 -124 내지 -1(Perkus et al., 1989) 그리고XhoI,KpnI,SmaI,SacI 및EcoRI 부위를 함유하는 pSP126을 발생시켰다.
플라스미드 pSD544(6 개의 리딩프레임에서 폴리링커 영역과 번역종결 코돈으로 치환된 HA 유전자의 부위를 둘러싸는 우두서열을 함유함)를 폴리링커 내에서XhoI로 분해시키고 DNA 폴리머라제1의 클리나우 단편으로 채우고 알칼리성 포스파타제로 처리하였다. SP126을HindIII로 분해시키고 클리나우로 처리하고 H6 프로모터를SmaI으로 분해에 의해 분리하였다. H6 프로모터 단편의 pSD544에 결합은 폴리링커영역에(HA 전사의 방향으로) H6 프로모터를 함유한 pSPHAH6를 발생시켰다. 이 삽입 플라스미드는 우두 HA 유전자(A56; Goebel et al., 1990 a,b)의 외래 유전자물질로의 치환을 가능하게 한다.
pH6HMNE로부터의 2.8kbXbaI/부분KpnI 단편을 분리하고XbaI 및KpnI으로 분해시킨 pC5L(실시예44에서 정의됨)에 삽입시켰다. 결과된 플라스미드는 pC5HIVMNE로 지칭하였다.
플라스미드 pHAHIVMNE 및 pC5HIVMNE는 레스큐 바이러스로서 각각 NYVAC (vP866) 및 ALVAC(CPpp)와의 생체외(in vitro) 재조합 실험에서 사용하였다. 이것들은 표준과정(Piccini et al., 1987)에 의해 행해졌다. 재조합 바이러스로부터 유도된 플라크는 방사성 표지된env특이적 DNA 프로브(Piccini et al., 1987)를 사용하여 플라크 혼성화에 의해 확인되었다. 3 라운드의 플라크 정제후, 재조합 바이러스를 증폭하였다. NYVAC-기초 HIV-1(MN)env재조합체는 vP1008이라 칭하였고 ALVAC-기초 재조합체는 vCP125라 칭하였다.
재조합체 바이러스, vCP125 및 vP1008은 앞서 보고된 과정들(Taylor et al., 1990)을 사용하여 면역 형광법 및 면역침전법에 의해 HIV-1(MN)env유전자의 발현에 대해 분석하였다. HIV-혈청양성 개인들로부터 수집된 사람 혈청(Dr. K. Steimer, Chiron Corp., Emeryville,CA로부터 얻음)을 이들 분석에서 사용하였다. 면역형광법으로부터의 결과는 vCP125 아니면 vP1008로 감염된 세포들이 그것들의 표면에서 HIV-1(MN) 유전자 생성물을 발현함을 나타내었다. vP1008 및 vCP125 감염된 세포들로부터 제조된 용해물로부터의 면역침전은 각각 160kDa, 120kDa, 및 41kDa의 겉보기 분자질량을 갖는 세가지 지배적인 HIV-1- 특이적 단백질의 존재를 증명하였다. 이것들은 전구체 외피 당단백질(160 KDa)과 단백질분해 유도된 성숙한 형태(120kDa 및 41kDa)와 일치한다.
실시예 84
ALVAC 및 NYVAC에 의한 HIV-1 (MN) gp120의 발현
391bpEcoRI/XbaI 단편은 올리고뉴클레오티드 T7(SEQ ID NO: 395)(5'-AATACGACTCACTATAG-3')와 HIVMN120 (SEQ ID NO: 396) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAA-TTATCTTTTTTCTCTCTGCACCACTC-3')을 사용하여 pBS3MN으로부터 증폭시키고 이어서EcoRI 및XbaI으로 분해시켰다. 이 단편을 pH6HMNE(실시예83에 정의됨)로부터 유도된 4.2kbEcoRI/XbaI 단편에 결합시켰다. 결과된 플라스미드는 PBS-SK에서 HIV-1(MN) gp120에 대한 폭스바이러스 발현카세트를 함유하며 pBSHIVMN120으로 칭하였다.
1.7 kbXbaI/부분KpnI 단편을 분리하고KpnI/XbaI로 분해시킨 pC5L에 삽입시켰다. 결과된 플라스미드는 pC5HIVMN120으로 칭하였다. HIV-1(MN) gp120 유전자를 NYVAC에 일체화시키기 위한 삽입 플라스미드는 먼저 1.6kbNruI/SmaI 단편을 pBSHIVMN120으로부터 분리함으로써 얻었다. 이 단편은NruI 및SmaI로 분해시킨 pSPHAH6에 삽입하여 pHAHIVMN120을 제공하였다. 삽입플라스미드 pC5HIVMN120 및 pHAHIVMN120은 레스큐 바이러스로서 ALVAC (CPpp) 및 NYVAC(vP866)와의 재조합 실험에서 사용되었다. 이들 분석 및 플라크 확인 및 정제는 표준 과정에 의해 수행되었다(Piccini et al., 1987). 혼성화 분석들은 방사성 표지된 HIV-1(MN) gp120-특이적 프로브로 수행되었다. 정제된 재조합체를 증폭시켰다. ALVAC-기초 HIV-1(MN) gp120 재조합체는 vCP124로서 지칭되었고 NYVAC-기초 HIV-1(MN) gp120 재조합체는 vP1004로서 지칭되었다.
vCP124및 vP1004로 감염된 세포들은 면역형광법 및 면역침전법에 의해 재조합체 발현된 HIV-1(MN) gp120의 존재에 대해 분석되었다. 이들 분석은 HIV-혈청양성 개인들로부터 수집된 사람 혈청을 사용하여(K. Steimer, Chiron Corporation, Emeryville, CA로부터 얻음) 앞서 기술된 대로(Taylor et al., 1990)수행하였다. 이들 연구로부터의 결과들은 vCP124 나 vP1004로 감염된 세포들이 HIV-1(MN) gp120을 함유한 반면, gp120은 미감염 세포들 및 어버이 바이러스, ALVAC 및 NYVAC로 감염된 세포들에서 관찰되지 않았음을 분명히 가르쳐 주었다.
실시예 85
ALVAC 및 NYVAC에 의한 절단 불가형태의 HIV-1 gp160의 발현
절단 불가형태의 HIV-1(IIIB) gp160을 발현하기 위해 알기닌 대 트레오닌 돌연변이를 구오 외(Guo et al., (1990))에 의해 증명된 바와같이 아미노산 511 (Ratner et al., 1985)에서 조작처리하였다. 이들 변형은 감염된 세포의 표면으로부터 gp120의 탈피를 감소하도록 행해졌다. 이들 조작은 다음과 같이 수행되었다. 376bpPstI/XbaI 단편은 올리고뉴클레오티드 HIV3B2A (SEQ ID NO: 397) (5'-GAAATAATAAAACAATAATC-3')및 HIVECB (SEQ ID NO: 398) (5'-GCTCCTATTCCC-ACTGCAGTTTTTTCTCTCTGCAC-3')를 사용하여 pH6HIIIBE로부터 서열을 먼저 증폭시키고 이어서PstI 및XbaI로 분해에 의해 얻어졌다. 이 단편은 pH6HIIIBE로부터의 1,061bpPstI/XbaI 단편 및 4.5 kbEcoRI/XbaI 단편과 결합시켜 pBSHIV3BEEC를 얻었다.
gp160 카세트에 결합된 H6 프로모터의 3'-대부분 26bp를 함유하는 pBSHIV3BEEC로부터의 2.6kbNruI/XbaI 단편을 분리하고 pBSHVS(실시예 60에서 정의됨)의 3.0kbNruI/XbaI 단편에 결합시켜 pBSHIV3BEECM을 얻었다.NruI 및XbaI으로 분해는 H6 프로모터의 3'-대부분 26bp와 한탄(Hantaan) 바이러스 S서열을 잘라낸다. 3.0kbNruI/XbaI 단편은 pBS-SK 플라스미드에서 H6 프로모터의 5'-대부분의 100bp를 함유한다.
pBSHIV3BEECM으로부터의 2.8kbXbaI/부분KpnI 단편은XbaI/KpnI 분해된 pC5L에 결합시켜 pC5HIV3BEEC를 얻었다. pBSHIV3BEECM으로부터의 2.7kbNruI/XbaI 단편은E. coliDNA 폴리머라제의 클리나우 단편으로 블런트 말단화하고NruI/SmaI 분해된 pSPHAH6에 삽입하여 pHAHIV3BEEC를 얻었다. 삽입 플라스미드, pC5HIV3BEEC 및 pHAHIV3BEEC는 레스큐 바이러스로서 각각 ALVAC(CPpp) 및 NYVAC(vP866)를 사용하여 표준과정(Piccini et al., 1987)에 의해 시험관내 재조합 실험에서 사용하였다. 재조합체 플라크는 HIV-1env유전자에 특이적인 방사성 표지된 프로브를 사용하여 표준 플라크 혼성화 분석(Piccini et al., 1987)에 의해 확인되었다. 재조합체 바이러스는 3라운드의 정제에 이어서 증폭시켰다. ALVAC-기초 HIV-1(IIIB) gP160(절단불가)은 vCP126으로 칭하였고 NYVAC-기초 동등물은 vP1020으로 칭하였다.
HIV-혈청양성 개인들로부터 수집된 사람 혈청(K. Steimer, Chiron Corp. Emeryville, CA로부터 얻음)을 사용하여 vP1020 및 vCP126 감염된 세포들에 대해 앞서 기술된 과정들(Taylor et al., 1990)에 의해 면역형광 및 면역침전 분석을 수행하였다. 면역형광 결과는 vCP126이나 아니면 vP1020으로 감염된 세포들의 표면에서 HIV-1(IIIB)gp160 (절단 불가 형태)의 표면발현을 명백히 증명하였다. 더 나아가서, 면역침전 결과는 성숙한 gp120 및 gp41 프로임으로 단백질 분해절단되지 않은 이들 감염된 세포들에서 HIV-1(IIIB) gp160의 존재를 증명하였다.
절단 불가형태의 HIV-1(MN) gp160도 또한 속행하여 재조합 바이러스를 다음과 같이 얻었다.
PstI/XbaI 단편은 올리고뉴클레오티드 HIVMN3P(SEQ ID NO: 389) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAATTATAGGAAAGCCCTTTCCAAGCC-3')와 HIVECA(SEQ ID NO: 399) (5'-GTGCAGAGAAAAAACTGCAGTGGGAATAGGAGC-3')를 사용하여 pH6HMNE로부터 PCR증폭과 이어서PstI/XbaI로 분해에 의해얻어졌다. 이 1061bp 단편은 pBSHIVMNT(이하)로부터의 391bpEcoRI/PstI와 pH6HMNE( 실시예83에 정의됨)로부터의 4.2kbEcoRI/XbaI 단편과 결합되었다. 결과된 플라스미드는 pBSHIVMNEEC1으로 지칭되었다. HIVenv삽입물의 서열분석은 단일 뉴클레오티드가 없어졌음을 증명하였다. 이것을 정정하기 위해 다음의 조작을 수행하였다. pH6HMNE로부터의 4.6kbSacI/XbaI는 pBSHIVMNEEC의 형성을 가져왔다.
pBSHIVMNEEC로부터의 2.6NruI/XbaI 단편을 분리하고 클리나우로 블런트 말단화하고NruI/SmaI 분해된 pSPHAH6( 실시예83에 정의됨)에 삽입하였다. 결과된 플라스미드를 pHAHIVMNEEC라 칭하였다. pBSHIVMNEEC로부터의 2.6kbNruI/XbaI 단편도 또한NruI/XbaI 분해된 pVQH6C5LSP6(이하)에 삽입하여 pC5HIVMNEEC를 얻었다.
삽입 플라스미드, pHAHIVMNEEC 및 pC5HIVMNEEC는 레스큐 바이러스로서 각각 NYVAC (vP866) 및 ALVAC(CPpp)와의 표준 재조합실험(Piccini et al., 1987)에서 사용되었다. 재조합 바이러스는 확인되었고 플라크는 방사성 표지된 HIVenv-특이적 DNA 프로브를 사용하여 표준플라크 혼성화(Piccini et al., 1987)에 의해 정제되었다. 그 다음 정제된 재조합체 바이러스를 증폭시켰다. HIV-1(MN) 절단불가 gp160을 함유하는 NYVAC-기초 재조합체는 vP1078로 칭하였고 ALVAC 동등물은 vCP144라 칭하였다.
vCP126과 vP1078의 발현분석은 상기한 바와같이 수행되었다. 이들 결과는 발현이 HIV-1(IIIB) 대응물, vP1020 및 vCP126에 정량적으로 동등함을 증명하였다.
실시예 86
ALVAC 및 NYVAC에 의한 HIV-1 env의 절단불가의 숨겨진 형태의 발현
유전자 생성물의 카르복시말단 근처의 막투과 서열의 제거에 의해 단백질 분해 절단되지 않으며 숨겨지는 HIV-1(MN)env를 발현하는 ALVAC- 및 NYVAC-기초 재조합체 바이러스를 발생시켰다. 502bpPstI/XbaI 단편은 올리고뉴클레오티드 HIVECA (SEQ ID NO: 399) 및 HIVMNT1 (SEQ ID NO: 400) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAA-TTACAAACTTGCCCATTTATCCAATTCC-3')를 사용하여 pH6HMNE(실시예 83에 정의됨)로부터 이들 서열을 먼저 증폭하고 이어서 PstI (5' 말단) 및XbaI (3'말단)으로 분해시켜 얻어졌다. 이 단편은 뉴클레오티드 7219 내지 7808에 해당한다(Ratner et al., 1985). 이 단편은env발현카세트의 3'말단으로서 제공될 것이다. 그대로 env 유전자 생성물은 막투과 영역을 결핍할 것이며, 올리고뉴클레오티드 HIVMNT1 (SEQ ID NO: 400)에 의해 제공된 종결코돈에 의해 종결될 것이며 올리고뉴클레오티드 HIVECA (SEQ ID NO: 399)를 사용하여 제공된 511(상기)에서 아미노 변화로 인해 절단되지 않을 것이다. 이 502bp단편은 올리고뉴클레오티드 HIV3B1 (SEQ ID NO: 144) 및 HIVECB (SEQ ID NO: 398)을 사용하여 pH6HMNE로부터 PCR에 의해 유도된 391bpEcoRI/PstI 단편에 결합되었고 4.2 kbEcoRI/XbaI 단편은 pH6MNE에 결합되었다. 결과된 플라스미드는 pBSHIVMNT라 칭하였다.
pBSHIVMNT로부터의 2.2kbXbaI/부분KpnI 단편을 분리하고XbaI 및KpnI로 분해된 pC5L에 삽입하였다. 결과된 플라스미드를 pC5HIVMNT라 칭하였다. NYVAC 삽입 플라스미드는 pBSHIVMNT로부터 2.1 kbNruI/XbaI 단편을 분리함으로써 유도되었다. 이 단편을 그 다음 2mM dNTPs의 존재하에E. coliDNA 폴리머라제의 클리나우단편으로 블런트 말단으로 하고NruI 및SmaI로 분해시킨 pSPHAH6에 삽입하여 pHAHIVMNT를 얻었다.
삽입 플라스미드, pC5HIVMNT 및 pHAHIVMNT는 레스큐 바이러스로서 각각 ALVAC(CPpp) NYVAC(vP866)와의 표준 재조합실험(Piccini et al., 1987)에서 사용되었다. 재조합 바이러스는 방사성 표지된 HIVenv-특이적 프로브를 사용하여 표준 플라크 혼성화 분석(Piccini et al., 1987)에 의해 확인되었다. 재조합 바이러스는 증폭에 앞서 3회의 정제시켰다. ALVAC-기초 HIV-1(MN)env(절단불가; 숨겨짐)를 vCP120으로 칭하였고 NYVAC 동등물을 vP994로 칭하였다.
면역침전분석을 HIV-혈청양성 개인들로부터 수집된 사람혈청을 사용하여 vCP120 및 vP994 감염된 세포에 대해 앞서 기술된 바와같이(Taylor et al,, 1990) 수행하였다. vCP120 및 vP994는 둘다 절단불가의 절두형 유전자 생성물과 일치한 분자량을 갖는 HIV-1(MN)env-특이적 유전자 생성물을 발현하였다. 더나아가서는, vCP120 및 vP994 감염된 세포 배양액으로부터 세포없는 배지의 면역침전은 이 env 유전자 생성물의 분비를 가리켰다.
유사한 제조를 HIV-1(IIIB)env에 대해 조작처리하였다. 이것을 달성하기 위해 다음의 조작들을 수행하였다. 487 bpPstI/XbaI 단편은 올리고뉴클레오티드 HIVECA(SEQ ID NO: 399) 및 HIV3BT (SEQ ID NO: 401) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAA-TTACAAACTTGCCCATTTATCTAATT CC-3')를 사용하여 pH6HIIIBE(실시예18에 정의됨)로부터의 이들 서열을 먼저 증폭시키고 이어서PstI/XbaI으로 분해함으로써 얻어졌다. 397bpEcoRI/PstI 단편을 pBSHIV3BEEC로부터 분리하고 4.2 kbEcoRI/XbaI 단편을 pH6HIII BEM으로부터 분리하였다. 이들 세 단편들을 함께 결합시켜 pBSHIV3BT1을 얻었다.
pBSHIV3BEECM의HindIII/XbaI 분해에 의해 유도된 2.1kb 및 2.9kb 단편을 pBSHIV3BT1으로부터의 105bpHindIII/XbaI 단편에 결합시켜 pBSHIV3BT를 얻었다. 이 플라스미드를NruI 및XbaI으로 분해시켜 2.1 kb 단편을 절단하였다. 이 단편을 블런트 말단으로 하고NruI 및SmaI으로 분해된 pSPHAH6에 삽입하여 pHAHIV3BT를 발생시켰다.
플라스미드 pHAHIV3BT는 레스큐 바이러스로서 NYVAC(vP866)와, 상기와 같이, 재조합 실험에서 사용되었다. 재조합 바이러스를 상기와 같이 확인 및 정제하고 결과된 재조합체를 vP1036으로 칭하였다. 이 재조합체는 vCP120 및 vP994에 대해 상기한 발현특징들을 모두 가졌다.
실시예 87
NYVAC 및 ALVAC에 의해 막투과 서열로 고정된 HIV-1(MN) gp120의 발현
소수성 막투과 서열을 코드화하는 영역에 gp120을 코드화하는env영역을 융합하기 위해, 다음의 조작들을 수행하였다. gp120 코드서열의 3'-대부분 영역에 해당하는 200bp 단편은 올리고뉴클레오티드 HIV3B1(SEQ ID NO: 144) 및 HIVMN18 (SEQ ID NO:402) (5'-GCCTCCT ACTATCATTATGAATAATCTTTTTCTCTCTG-3')를 사용하여 pH6HMNE (실시예 83에 정의됨)로부터 PCR에 의해 유도되었다. 이 단편을 올리고뉴클레오티드 HIV3B1 (SEQ ID NO: 144) 및 HIVTM3 (SEQ ID NO:405) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAATTATCCCTGCCTAACTCTATTCAC-3')을 사용하여 어닐링된 올리고뉴클레오티드 HIVTM1 (SEQ ID NO: 403) (5'-TTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTT-AAGAATAGTTTTTGCTGTACTCTCTGTAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATAA-3') 및 HIVTM2 (SEQ ID NO: 404) (5'-TTATCCCTGCCTAACTCTATTCACTACAGAGAGTACAGCAAAAACTATTCTTAAACCTACC-AAGCCTCCTACTA TCATTATGAATAA-3')에 PCR에 의해 융합하였다. 올리고뉴클레오티드 HIVTM1 (SEQ ID NO: 403) 및 HIVTM2 (SEQ ID NO:404)는 뉴클레오티드 7850 및 7934 (Ratner et al., 1985)에 해당하며 HIVenv소수성 앵코르서열을 코드화하는 영역을 나타낸다. HIVTM3(SEQ ID NO: 405)와의 융합은 궁극적인 카세트의 3'말단을 종결코돈 및 3'XbaI 부위와 조작처리한다. 유도된 단편은EcoRI/XbaI로 분해하고EcoRI 및XbaI로 분해된 pH6HMNE에 결합시켜 pBSHIVMN120T를 얻었다. H6프로모터의 3'-대부분 26bp와 전체 HIV-1 카세트를 함유하는 pBSHIVMN120T로부터의 1.7bkNruI/XbaI 단편을 분리하고 pVQH6C5LSP6로부터의 5.1kbNruI/XbaI 단편에 삽입하여 pC5HIVMN120T를 유도하였다. 플라스미드 pVQH6C5LSP6은 다음과 같이 유도되었다.
pC5LSP (실시예 66에 정의됨)를BamHI로 분해하고 어닐링된 올리고뉴클레오티드 CP32 (SEQ ID NO: 406) (5'-GATCTTAATTAATTAGTCATCAGGCAGGGCGAGAACGAGACT-ATCTGCTCGTTAATTAATTAGGTCGACG-3') 및 CP33 (SEQ ID NO: 407) (5'-GATCCGTCGACCT-AATTAATTAACGAGCACATAGTCTCGTTCTCGCCCTGCCTGATGACTAATTAATTAA-3')에 결합하여 pVQC 5LSP6를 발생시켰다.
pBSHIVMN120T로부터의 1.7kb NruI/XbaI 단편을 또한 블런트 말단화하고NruI 및SmaI으로 분해된 pSPHAH6에 삽입하였다. 결과된 플라스미드는 pHAHIVMN120T로 칭하였다.
삽입 플라스미드, pC5HIVMN120T 및 pHAHIVMN120T는 레스큐 바이러스로서 각각 ALVAC 및 NYVAC와의 표준 재조합 실험(Piccini et al., 1987)에 사용되었다. 재조합체 바이러스를 방사성 표지된 HIV-1 gp120-특이적 DNA 프로브를 사용하여 표준 플라크 혼성화(Piccini et al., 1987)에 의해 확인 및 정제하였다. 순수한 집단을 증폭시키고 ALVAC-기초 고정된 HIV-1(MN) gp120 재조합체를 vCP138로 칭하였다. NYVAC-기초 동등물은 vP1035 라 칭하였다.
면역 형광 및 면역침전분석을 표준과정(Taylor et al., 1990)에 의해 수행하여 vP138 및 vP1035 감염된 세포들에서 HIV-1(MN) 고정된 gp120의 발현을 평가하였다. HIV-혈청양성 개인으로부터 수집된 사람혈청(Dr. K. Steimer, Chiron Corp. Emeryville CA로부터 얻음)으로부터 수집된 사람 혈청을 사용하여 분석을 수행하였다.
표면 면역형광의 연구는 vCP138 및 vP1035 감염된 세포들이 플라스마막에서 HIV-1(MN) gp120을 함유함을 가리켰다. 중요하게도, vCP138및 vP1035 감염된 세포들의 표면오염은 gp160을 발현하는 재조합 바이러스(즉, vCP125, vCP124, vP1004, 및 vP1008) 또는 비-고정 gp120으로 감염된 세포들과 비교하여 크게 향상되었다. 면역침전 분석에 대한 결과로 vCP138 및 vP1035 감염된 세포들에서 gp120의 발현이 확인되었고 발현된 생성물은 예상한 분자질량의 것으로 확인되었다.
실시예 88
NYVAC/HIV-1 gag (프로테아제 - ) 재조합체의 발생
사람 면역결핍 바이러스 타입1 (HIV-1) cDNA 서열을 함유하는 플라스미드, pHXB2D를 Dr. R.C. Gallo (NCI-NIH) (NCI-NIH)로부터 얻었다.gag유전자의 5'-말단을 코드화하는 서열을 우두 바이러스 tk 측면부 암 사이에서 클로닝시켰다. 이것은 pSD542 (실시예32에 정의됨)의 4,075bpBgℓII 단편에 gag 유전자의 5'말단을 함유하는 pHXB2D의 1,625bpBgℓII 단편을 클로닝함으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pHIVG2라 부른다.
그 다음gag유전자의 3'말단을gag유전자의 나머지로부터 하류에 클로닝시켰다. 이것은 pHIVG2의 5,620bpApaI-BamHI 단편에 gag 유전자의 3'말단을 함유하는 280bpApaI-BamHI PCR 단편을 클로닝함으로써 달성되었다. 이 PCR단편은 올리고뉴클레오티드, HIVP5(SEQ ID NO: 408) (5'-TGTGGCAAAGAAGGGC-3') 및 HIVP6 (SEQ ID NO: 409) (5'-TTGGATCCTTATTGTGACGAGGGGTC-3')와의 플라스미드, pHXB2D로부터 발생되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pHIVG3라 부른다.
그 다음 I3L 프로모터는gag유전자의 상류에 클로닝시켰다. 이것은 pHIVG3의 5,540bp 부분BgℓII-CℓaI 단편에 우두 바이러스 I3L 프로모터와gag유전자의 5'-말단을 코드화하는 올리고뉴클레오티드, HIVL 17 (SEQ ID NO: 410)(5'-GATCTTGAGATAAAGTGAAAATATATATCATTATATTACAAAGTACAATTATTTAGGTTTAATCATGG-GTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGAT-3')및 HIVL18 (SEQ ID NO: 411) (5'-CGATCTAATTCTCCCCCGCTTAATACTGACGCTCTCGCACCCATGATTAAACCTAAATAATTGTACTTTGTAATATAATGATATATATTTTCACTTTATCTCAA-3')을 클로닝함으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pHIVG4라 부른다. pHIVG4는 레스큐 바이러스로서의 vP866 (NYVAC)와의 재조합 실험에서 사용하여 vP969를 얻었다.
면역 침전 분석을 수행하여 vP969가 진정한 HIV-1gag전구체 단백질을 발현하는지를 결정하였다. VERO 세포 단일층들을 모의 감염시키거나, 어버이 바이러스를 감염시키거나 아니면 10PFU/세포의 m.o.i에서 vP969로 감염시킨다. 1 시간 흡착기간에 이어서, 접종물을 흡인시키고 세포를 2% 소 태아 혈청과 [35S]-메티오닌 (20 μCi/mℓ)을 함유하는 변형된 이글 배지(마이너스 메티오닌) 2mℓ를 위에 놓았다. 세포는 1mℓ 3×완충액 A (3% NP-40, 30mM Tris (pH 7.4), 3mM EDTA, 0.03% Na 아지드 및 0.6 mg/mℓ PMSF)의 첨가와 이어서 세포단일층의 후속 스크레이핑에 의해 감염후 18시간에 수집하였다. 감염된 세포로부터의 용해물을 HIV-1 혈청 양성 개인으로부터의 수집된 혈청 (Chiron,Emeryville, CA로부터 얻음)을 사용하여 HIV-1gag전구체 발현에 대해 분석하였다. 혈청을 vP866 감염된 VERO 세포들로 재흡착시켰다. 재흡착된 혈청을 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 단백질 A-세파로오스에 결합시켰다. 이 인큐베이션 기간에 이어서, 그 물질을 1×완충액A로 4회 세척하였다. 정상의 사람 혈청 및 단백질 A-세파로오스로 사전 정화시킨 용해물을 그 다음 단백질 A-세파로오스에 결합된 HIV-1 혈청 양성 사람 혈청으로 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 밤새 인큐베이션 기간후, 샘플을 1×완충액A로 4회, LiCℓ2/ 요소완충액으로 2회 세척하였다. 침전된 단백질들은 2×램리(Laemmli) 완충액(125 mM Tris(pH6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-메르캅토 에탄올)의 첨가와 5분간 비등시킴으로써 면역복합체로부터 해리되었다. 단백질들을 10% 드레이퍼스 (Dreyfuss) 겔 시스템 (Dreyfuss et al., 1984) 상에서 분별하고 고정시키고 플루오로그래피를 위해 1M Na-살리실레이트를 처리하였다.
HIV-1 혈청 양성 개인으로 부터의 사람혈청은 vP969 감염된 세포들로 부터의 HIV-1gag전구체 단백질을 특이적으로 침전시켰다. 모의 감염되거나 NYVAC 감염된 세포들로부터의 HIV-1 특이적 단백질은 침전시키지 않았다.
실시예89
NYVAC/HIV-1 gag/poℓ 재조합체의 발생
gag유전자의 5'말단을 코드화하는 서열을 우두 바이러스 tk 측면부 암 사이에서 클로닝 시켰다. 이것은gag유전자의 5'말단을 함유하는 pHXB2D의 1,625bpBgℓII 단편을 pSD542(실시예32에 정의됨)의 4,075 bp BgℓII 단편에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드를 pHIVG2라 부른다.
gag유전자의 3'말단을 그 다음 pHIVG2에 클로닝시켰다. 이것은gag유전자의 3'말단을 함유하는 280bpApaI-BamHI PCR 단편을 pHIVG2의 5,620bpApaI-BamHI 단편에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 PCR 단편은 올리고뉴클레오티드, HIVP5 (SEQ ID NO: 408) 및 HIVP6 (SEQ ID NO: 409)와 함께 플라스미드, pHXB2D로부터 발생시켰다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pHIVG3라고 부른다.
그 다음 I3L 프로모터를gag유전자의 상류에 클로닝시켰다. 이것은 우두 바이러스 I3L 프로모터와 gag 유전자의 5'말단을 코드하는 올리고뉴클레오티드, HIVL17 (SEQ ID NO: 410) 및 HIVL18 (SEQ ID NO: 411)을 pHIVG3의 부분BaℓII-CℓaI 단편에 클로닝함으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pHIVG4라고 부른다.
그 다음 p24, p2, p7및 p6를 코드하는gag유전자의 부분을 제거하였다. 이것은 올리고뉴클레오티드, HIVL 19 (SEQ ID NO: 412) (5'- CTGACACAGGACACAGCAA-TCAGGTCAGCCAAAATTACTAATTTTTATCTCGAGGTCGACAGGACCCG-3') 및 HIVL20 (SEQ ID NO: 413) (5'-GATCCGGGTCCTGTCGACCTCGAGATAAAAATTAGTAATTTTGGCTGACCTGATTGCTGTGTCC-TGTGTCAG-3')를 pHIVG4의 4,450bp 부분PvuII-BamHI 단편에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pHIVG5라 부른다.
그 다음poℓ유전자 뿐만아니라gag유전자의 나머지를 p17 '유전자'의 하류에 클로닝시켰다. 이것은 대부분의gag유전자와 모든poℓ유전자를 함유하는 pHXB2D의 4,955bpCℓaI-SaℓI 단편을 pHIVG5의 4,150bpCℓaI-SaℓI 단편에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pHIVG6라 부른다.
그 다음 외래의 3'-비코드화 서열을 제거하였다. 이것은poℓ유전자의 3'말단을 함유하는 360bpAfℓII-BamHI PCR 단편을 pHIVG6의 8,030bpAfℓII-BamHI 단편에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 PCR 단편은 올리고뉴클레오티드, HIVP7 (SEQ ID NO: 414) (5'-AAGAAAATTATAGGAC-3')와 HIVP8(SEQ ID NO: 415) (5'-TTGG-ATCCCTAATCCTCATCCTGT-3')와 함께 플라스미드, pHXB2D로부터 발생시켰다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pHIVG7이라 부른다.
pHIVG7은 레스큐 바이러스로서 vP866(NYVAC)와의 재조합 실험에서 사용하여 vP989를 얻었다. vP989 감염된 세포들로 면역침전실험을 HIV-1gag전구체 단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행하였다. HIV-1 특이적 종이 모의 감염된 또는 NYVAC 감염된 VERO 세포로부터 침전되지 않았다.
그러나gag전구체 단백질, 또한 여러중간체 및 성숙한 gag 절단생성물들에 해당하는 단백질종이 vP989 감염된 세포들의 용해물로부터 침전되었다.
실시예90
NYVAC/HIV-1 gag/poℓ 및 env (gp120) 재조합체의 발생
gag유전자의 5'말단을 코드하는 서열을 우두 바이러스 tk 측면부 암 사이에 클로닝시켰다. 이것은 상기한 바와같이 (실시예89 참조) 플라스미드 pHIVG7을 초기에 제조함으로써 달성되었다.
pHIVG7을 레스큐 바이러스로서 vP921과의 재조합 실험에서 사용하여 vP991을 얻었다.
vP991 감염된 세포로 면역침전실험을 HIVgag전구체 단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행하였다. 모의 감염된 VERO 세포로부터 HIV-특이적 종은 침전되지 않았다. 그러나 env 및gag전구체 단백질, 또한 여러 중간체 및 성숙한gag절단생성물에 해당하는 단백질 종은 vP991 감염된 세포들의 용해물로부터 침전되었다.
실시예91
NYVAC/HIV-1 gag/poℓ 및 env (gp160) 재조합체의 발생
gag유전자의 5'말단을 코드화하는 서열을 우두 바이러스 tk 측면부 암 사이에 클로닝시켰다. 이것은 상기한 바와같이 (실시예89 참조) 플라스미드 pHIVG7을 초기에 제조함으로써 달성되었다.
pHIVG7을 레스큐 바이러스로서 vP911(상기)와의 재조합 실험에서 사용하여 vP990을 얻었다.
vP990 감염된 세포들과의 면역침전 실험을 HIV-1gag전구체 단백질의 발현에 대해 상기한 바와 같이 수행하였다. 모의 감염된 VERO 세포로부터 HIV-1 특이적 종은 침전되지 않았다. 그러나env및gag전구체 단백질, 또한 여러 중간체 및 성숙한gag절단생성물에 해당하는 단백질종이 vP990 감염된 세포들의 용해물로부터 침전되었다.
실시예92
NYVAC/HIV-1 p17, p24 재조합체의 발생
HIV-1 cDNA 서열을 함유하는 플라스미드 pHXB2D를 닥터 갈로(Dr. R.C. Gallo)(NCI-NIH)로부터 얻었다.
gag유전자의 5'말단을 코드화하는 서열을 우두 바이러스 tk 측면부 암 사이에 클로닝시켰다. 이것은 상기한 바와같이 (실시예89 참조) pHIVG5를 초기에 제조함으로써 달성되었다.
p24 '유전자'의 3'말단을 그 다음 pHIVG5에 클로닝시켰다. 이것은 p24 '유전자'의 3'말단을 함유하는 660bpSaℓI-BamHI PCR 단편을 pHIVG5의 4,450bpSaℓI-BamHI 단편에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 PCR 단편은 올리고뉴클레오티드, HIVP25 (SEQ ID NO: 416) (5'-AAAGTCGACCCATATCACCTAGAAC-3') 및 HIVP26 (SEQ ID NO: 417) (5'-TTTGGATCCTTACAAAACTCTTGCCTTAT-3')와 함께 플라스미드, pHXB2D로부터 발생되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pHIVG8이라 부른다.
엔토모폭스 42kd 프로모터를 그 다음 p24 '유전자'의 상류에 클로닝시켰다. 이것은 엔토모폭스 42kd 프로모터와 p24 '유전자'의 5'말단을 코드하는 올리고뉴클레오티드, HIVL21 (SEQ ID NO: 418) (5'-TCGAGCAAAATTGAAAATATATAATTACAATATAAAA-TGCCTATAGTGCAGAACATCCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCA-3') 및 HIVL22 (SEQ ID NO: 419) (5'-TTTAAAGTTCTAGGTGATATGGCCTGATGTACCATTTGCCCCTGGA-TGTTCTGCACTATAGGCATTTTATATTGTAATTATATATTTTCAATTTTGC-3')를 pHIVG8의 5,070bpXhoI-NsiI 단편에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pHIVG9라 부른다.
pHIVG9는 레스큐 바이러스로서 vP866(NYVAC)와의 재조합 실험에서 사용되어 vP970을 얻었다.
vP970 감염된 세포들로 면역 침전실험은 HIV-1 gag 전구체 단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행되었다. 모의 감염되거나 NYVAC 감염된 VERO 세포들로부터 HIV-1-특이적 종은 침전되지 않았다. 그러나 p24에 해당하는 단백질종이 vP970 감염된 세포들의 용해물로부터 침전되었다.
실시예93
NYVAC/HIV-1 p17, p24 및 env(gp120) 재조합체의 발생
HIV-1 cDNA 서열을 함유하는 플라스미드 pHXB2D는 닥터 갈로(Dr. R.C. Gallo)(NCI-NIH)로 부터 얻었다.
gag유전자의 5'말단을 코드하는 서열을 우두 바이러스 tk 측면부 암 사이에서 클로닝시켰다. 이것은 상기한 바와같이 (실시예92 참조) 플라스미드 pHIVG9을 초기에 제조함으로써 달성되었다.
pHIVG9을 레스큐 바이러스로서 vP921과의 재조합실험에서 사용하여 vP973을 얻었다.
vP973 감염된 세포와의 면역침전 실험을 HIV-1 gag 전구체 단백질의 발현에 대해 상기와 같이 수행하였다. 모의 감염된 VERO 세포로부터 HIV-1 특이적종은 침전되지 않았다. 그러나 env 및 p24에 해당하는 단백질종은 vP973 감염된 세포들의 세포용해물로부터 침전되었다.
실시예94
NYVAC/HIV-1 p17, p24 및 env(gp160) 재조합체의 발생
HIV-1 cDNA 서열을 함유하는 플라스미드, pHXB2D를 닥터 갈로(Dr. R.C. Gallo)(NCI-NIH)로부터 얻었다.
gag유전자의 5'말단을 코드하는 서열을 우두 바이러스 tk 측면부 암 사이에서 클로닝시켰다. 이것은 상기한 바와같이 (실시예92 참조) 플라스미드 pHIVG9을 초기에 제조함으로써 달성되었다.
pHIVG9을 레스큐 바이러스로서 vP911과의 재조합실험에서 사용하여 vP971을 얻었다.
vP971 감염된 세포와의 면역침전 실험을 HIV-1gag전구체 단백질의 발현에 대해 상기와 같이 수행하였다. HIV-1-특이적 종은 모의 감염된 VERO 세포로부터 침전되지 않았다. 그러나 env 및 p24에 해당하는 단백질종은 vP971 감염된 세포들의 세포 용해물로부터 침전되었다.
실시예95
NYVAC/HIV-1 gag(프로테아제~) 및 env( 절두형) 재조합체의 발생
HIV-1 cDNA 서열을 함유하는 플라스미드, pHXB2D를 닥터 갈로(Dr. R.C. Gallo)(NCI-NIH)로 부터 얻었다.
gag유전자의 5'말단을 코드하는 서열은 우두 바이러스 tk 측면부 암 사이에서 클로닝되었다. 이것은 상기한 바와같이 (실시예89 참조) 플라스미드 pHIVG-9을 초기에 제조함으로써 달성되었다.
H6-프로모터 구동되는 절두형 HIV-1 외피유전자를 그다음 pHIVG4에 삽입하였다. 이것은 H6-프로모터 구동되는 절두형 HIV-1 외피 유전자를 함유하는 pHIVE10의E.coliDNA 폴리머라제I (클리나우단편)이 들어있는 1,600bpXhoI-NotI 단편을 pHIVG4의 들어있는BamHI 부위에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pHIVGE11이라 부른다.
플라스미드 pHIVE10은 pBSHIV3BCDT1으로 부터의SacI/부분KpnI 단편을 pIBI25(IBI, New Haven, CT)의 다수 클로닝 영역에 삽입함으로써 유도되었다. 플라스미드 pBSHIV3BCDT1은 엄격한 절두형의 HIV-1(IIIB)외피( 아미노산 1내지 447; Ratner et al., 1985)를 발현하는 H6 프로모터 구동되는 카세트를 함유한다. 이 카세트의 발현은 V3 루프 영역과 T1 에피토프를 보유하면서 CD4 결합을 제거하는 것으로 평가되었다.
pBSHIV3BCDT1을 제조하기 위해 다음의 조작들이 수행되었다. 200bp의 PCR 유도된 단편은 올리고뉴클레오티드 HIV3B2A (SEQ ID NO: 397) 및 HIVCD4A (SEQ ID NO: 420) (5'-GCCTCCTACTATCATTATGAATAAACTGATGGGAGGGGCATAC-3')를 사용하여 pH6HIIIBE (실시예 18에 정의됨)로부터 증폭되었다. 이 단편은 올리고뉴클레오티드 HIV3B2A (SEQ ID NO: 397) 및 HIVTM3 (SEQ ID NO: 405)를 사용하여 어닐링된 올리고뉴클레오티드 HIVTM1(SEQ ID NO: 403) 및 HIVTM2 (SEQ ID NO: 404)에 PCR에 의해 융합되었다. 이들 조작은 HIV-1env막투과 앵코르(아미노산 691 내지 718; Ratner et al., 1985), 번역종결코돈(TAA), 및 3'XbaI 부위를 코드하는 서열을 놓음으로써 절두형env카세트의 3'말단을 만든다. 이 PCR-융합생성물은EcoRI 및XbaI으로 분해시켜 243bp 단편을 얻었다. 이 단편을 pH6HIIIBE의 4.5bpEcoRI/XbaI 단편에 결합시켜 pBSHIV3BCDT1을 발생시켰다.
pHIVGE11을 레스큐 바이러스로서 vP866 (NYVAC)와의 재조합실험에 사용하여 vP979를 얻었다.
vP979 감염된 세포들로 면역침전실험은 HIV-1gag전구체 단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행되었다. HIV-1-특이적 종은 모의 감염된 또는 NYVAC 감염된 VERO 세포로부터 침전되지 않았다. 그러나 env 및gag전구체 단백질에 해당하는 단백질종은 vP 979 감염된 세포의 용해물로부터 침전되었다.
실시예96
NYVAC/HIV-1 gag/poℓ 및 env( 절두형) 재조합체의 발생
gag 유전자의 5'말단을 코드하는 서열을 우두 바이러스 tk 측면부 암 사이에서 클로닝시켰다. 이것은 상기한 바와같이(실시예 89 참조) 플라스미드 pHIVG7을 초기에 제조함으로써 달성되었다.
H6-프로모터 구동되는 절두형 HIV-1 외피유전자는 그 다음 pHIVG7에 삽입되었다. 이것은 H6-프로모터 구동되는 절두형 HIV-1 외피유전자를 함유하는E. coliDNA 폴리머라제I(클리나우 단편)이 들어있는 1,600bpXhoI-NotI 단편을 pHIVG7의 들어있는BamHI 부위에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pHIVGE12라고 부른다.
pHIVGE12를 레스큐 바이러스로서 vP866 (NYVAC)와의 제조합 실험에서 사용하여 vP978을 얻었다.
vp978 감염된 세포로 면역침전실험은 HIV-1gag전구체 단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행되었다. HIV-1-특이적 종은 모의 감염되거나 NYVAC 감염된 VERO 세포들로 부터 침전되지 않았다. 그러나 env 및gag전구체 단백질 또한 여러 중간체 및 성숙한gag절단 생성물에 해당하는 단백질종은 vP978 감염된 세포들의 용해물로부터 침전되었다.
실시예97
NYVAC/HIV-1 gag/poℓ 및 env(gp120) 재조합체의 발생
gag유전자를 코드하는 서열을 우두 바이러스 tk 측면부 암 사이에서 클로닝시켰다. 이것은 상기한 바와같이( 실시예 89 참조) 플라스미드 pHIVG7을 초기에 제조함으로써 달성되었다. 그 다음 I3L-프로모터 구동되는gag및poℓ유전자를 카나리아 폭스삽입 벡터에 삽입시켰다. 이것은 I3L-프로모터 구동되는gag및poℓ유전자를 함유하는 pHIVG7의 4,360bp 부분BgℓII-BamHI 단편을 pVQH6CP3L의BamHI 부위에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생한 플라스미드는 pHIVGE14라고 부른다.
H6-프로모터 구동되는 HIV-1(MN) 외피(gp120) 유전자를 그 다음 pHIVGE14에 삽입시켰다. 이것은 H6-프로모터 구동되는 gp120 유전자를 함유하는 올리고뉴클레오티드, HIVL29 (SEQ ID NO: 421) (5'-GGCCGCAAC-3') 및 HIVL 30 (SEQ ID NO: 422) (5'-TCGAGTTGC-3') 그리고 pBSHIVMN 120의 1,600bpNruI-NotI 단편을 pHIVGE14의 11,500bpNruI-XhoI 단편에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생한 플라스미드는 pHIVGE15라고 한다.
H6-프로모터 구동되는 외피(gp120) 유전자와 I3L- 프로모터 구동되는gag및poℓ유전자를 그 다음 우두 바이러스 삽입벡터에 삽입시켰다. 이것은 H6-프로모터 구동되는 gp120 유전자와 I3L-프로모터 구동되는gag및poℓ유전자를 함유하는 pHIVGE15의 6,400bpNotI-BamHI 단편을 pSD542VCVQ의 4,000bp NotI-BgℓII 단편에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드를 pHIVGE16이라 부른다.
pHIVGE16을 레스큐 바이러스로서 vP866 (NYVAC)와의 생체외 재조합 실험에서 사용하여 vP988을 얻었다.
vP988 감염된 세포들로 면역침전실험을 HIV-1 gag 전구체 단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행하였다. HIV-1-특이적 종은 모의 감염되거나 또는 NYVAC 감염된 VERO 세포로 부터 침전되지 않았다. 그러나, env 및gag전구체 단백질, 또한 여러 중간체 및 성숙한gag절단생성물에 해당하는 단백질 종은 vP988 감염된 세포들의 용해물로부터 침전되었다.
실시예98
NYVAC/HIV-1 gag/poℓ 및 env(gp160) 재조합체의 발생
gag유전자의 5'말단을 코드하는 서열을 우두 바이러스 tk 측면부 암 사이에서 클로닝시켰다. 이것은 상기한 바와같이 (실시예 97 참조) 플라스미드 pHIVGE16을 초기에 제조함으로써 달성되었다.
그 다음 gp120 유전자를 gp160 유전자로 대치시켰다. 이것은 전체 HIV-1(MN) 외피(gp160) 유전자를 함유하는 pH6HMNE의 2,600bpNruI-NotI 단편을 pHIVGE16의 8,000bp 부분 NruI-NotI 단편에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pHIVGE19 라 부른다.
pHIVGE19를 레스큐 바이러스로서 vP866 (NYVAC)와의 체외 재조합 실험에서 사용하여 vP1009를 얻었다.
vP1009 감염된 세포로 면역침전실험을 HIV-1gag전구체 단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행하였다. HIV-1-특이적 종은 모의 감염되거나 또는 NYVAC 감염된 VERO 세포로부터 침전되지 않았다. 그러나 env 및gag전구체 단백질, 여러 중간체 및 성숙한gag절단 생성물에 해당하는 단백질 종은 vP1009 감염된 세포들의 용해물로부터 침전되었다.
실시예 99
ALVAC/HIV-1 gag/poℓ 및 env(gp120) 재조합체의 발생
gag유전자의 5'말단을 코드하는 서열을 우두 바이러스 tk 측면부 암 사이에서 클로닝시켰다. 이것은 상기한 바와같이 (실시예 97 참조) 플라스미드 pHIVGE15을 초기에 제조함으로써 달성되었다.
pHIVGE15를 레스큐 바이러스로서 CPpp(ALVAC)와의 재조합 실험에서 사용하여 vCP117을 얻었다.
vCP117이 진정한 HIV-1gag및 env 유전자 생성물을 발현하는지를 결정하기 위해 면역침전분석을 수행하였다. CEF 세포 단일층은 모의 감염되거나, 어버이 바이러스 감염되거나 아니면 10PFU/세포의 m.o.i.에서 vCP117로 감염시켰다. 1시간의 흡착기간에 이어서, 접종물을 흡인시키고 세포를 2% 소 태아 혈청 및 [35S]- 메티오닌(20 μCi/mℓ)을 함유하는 변형된 이글배지(마이너스 메티오닌) 2mℓ위에 놓았다. 세포를 1 mℓ 3×완충액 A (3% NP-40, 30mM Tris (pH7.4), 3mM EDTA, 0.03% Na 아지드 및 0.6 mg/mℓ PMSF)의 첨가와 이어서 세포단일층의 후속 스크레이핑에 의해 감염후 18 시간에 수확하였다.
감염된 세포로부터의 용해물을 HIV-1 혈청양성 개인으로부터의 혈청(New York State Department of Health로부터 얻음)을 사용하여 HIVgag및 env 유전자 발현에 대해 분석하였다. 혈청을 CPpp 감염된 CEF 세포들로 사전 흡착시켰다. 사전 흡착된 혈청을 4℃에서 밤새 인큐베이션하에 단백질 A-세파로오스에 결합시켰다. 이 인큐베이션 기간에 이어서, 물질을 1×완충액 A로 4회 세척하였다. 정상의 사람 혈청 및 단백질 A-세파로오스로 사전 정화된 용해물을 단백질 A-세파로오스에 결합된 HIV-1 혈청양성 사람 혈청과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 밤새 인큐베이션 기간후, 샘플을 1×완충액A로 4회, LiCℓ2/요소완충액으로 2회 세척하였다. 침전된 단백질을 2×램리 완충액(125 mM Tris (pH6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-메르캅토에탄올)의 첨가와 5분간 비등에 의해 면역복합체로부터 해리시켰다. 단백질을 10% 드레이퍼스 겔 시스템(Dreyfuss et al., (1984) 상에서 분별하고 고정시키고 플루오로그래피를 위해 1M Na-살리실레이트로 처리하였다.
HIV-1 혈청양성 개인으로부터의 사람 혈청은 vCP117 감염된 세포들로부터 HIV-1gag및 env 단백질을 특이적으로 침전시켰으나 모의 감염되거나 또는 CPpp 감염된 세포들로부터 HIV-1-특이적 단백질을 침전시키지 않았다.
실시예100
ALVAC/HIV-1 gag/poℓ 및 env(gp160) 재조합체의 발생
gag유전자의 5'말단을 코드하는 서열을 우두 바이러스 tk 측면부 암 사이에서 클로닝시켰다. 이것은 상기한 바와같이 (실시예 97 참조) 플라스미드 pHIVGE15을 초기에 제조함으로써 달성되었다.
그 다음 gp120 유전자를 gp 160 유전자로 대치하였다. 이것은 전체 HIV-1(MN) 외피(gp160) 유전자를 함유하는 pH6HMNE의 2,600bpNruI-NotI 단편을 pHIVGE15의 9,800bpNruI-NotI 단편에 클로닝 시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드를 pHIVGE 18이라고 부른다.
앞의 단계에서 삭제된 카나리아폭스 측면부암을 그 다음 pHIVGE18에 클로닝시켰다. 이것은 C3 측면부암을 함유하는 pHIVGE15의 1,500bpNotI 단편을 pHIVGE18의 12,400bpNotI 단편에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드를 pHIVGE 20 이라 부른다.
pHIVGE20을 레스큐 바이러스로서 CPpp(ALVAC)와의 재조합 실험에서 사용하여 vCP130을 얻었다.
vCP130이 진정한 HIV-1gag및 env 유전자 생성물을 발현하는지를 결정하기 위해 면역침전 분석을 수행하였다. CEF 세포 단일층을 모의 감염시키거나 어버이 바이러스로 감염시키거나 10PFU/ 세포의 m.o.i.에서 vCP130으로 감염시켰다. 1 시간 흡착시간에 이어서, 접종물을 흡인시키고 세포를 2% 소 태아 혈청과 [35S] -메티오닌(20 μCi/mℓ)를 함유하는 변형된 이글배지(마이너스 메티오닌) 2mℓ위에 놓았다. 세포들을 1mℓ 3×완충액 A (3% NP-40, 30mM Tris(pH7.4), 3mM EDTA, 0.03% Na 아지드 및 0.6 mg/mℓ PMSF)의 첨가와 이어서 세포 단일층의 후속 스크레이핑에 의해 감염후 18 시간에 수확하였다.
감염된 세포로부터의 용해물을 HIV-1 혈청양성 개인으로부터의 수집된 혈청(Chiron, Emeryville, CA로부터 얻음)을 사용하여 HIV-1 gag 및 env 유전자 발현에 대해 분석하였다. 혈청을 CPpp 감염된 CEF 세포로 사전흡착시켰다. 사전흡착된 혈청을 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 단백질A-세파로오스에 결합시켰다. 이 인큐베이션 기간에 이어서, 이 물질을 1×완충액A로 4회 세척하였다. 정상의 사람혈청과 단백질 A-세파로오스로 사전 정화된 용해물을 그 다음 단백질 A-세파로오스에 결합된 HIV-1 혈청 양상 사람혈청과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 밤새 인큐베이션 기간후, 샘플을 1×완충액 A로 4회, LiCℓ2/요소 완충액으로 2회 세척하였다. 침전된 단백질을 2×램리 완충액(125mM Tris (pH6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-메르캅토에탄올)의 첨가와 5분간 비등에 의해 면역복합체로부터 해리시켰다. 단백질들을 10% 드레이퍼스 겔 시스템(Dreyfuss et al., 1984) 상에서 분별하고 고정시키고 플루오로그라피를 위해 1M Na-살리실레이트로 처리하였다. HIV-1 혈청 양성 개인으로부터 사람 혈청은 vCP130 감염된 세포로부터 HIV-1gag및 env 단백질을 특이적으로 침전시켰으나, 모의 감염되거나 또는 CPpp 감염된 세포들로부터 HIV-1- 특이적 단백질을 침전시키지 않았다.
실시예101
ALVAC/HIV-1 gag/poℓ 재조합체의 발생
HIV-1 cDNA 서열을 함유하는 플라스미드, pHXB2D를 닥터 갈로(Dr. R.C. Gallo)(NCI-NIH)로부터 얻었다.gag유전자의 5'-말단을 코드하는 서열을 우두 바이러스 tk 측면부암 사이에서 클로닝시켰다. 이것은 상기한 바와같이 (실시예 89 참조) 플라스미드 pHIVG7을 초기에 제조함으로써 달성되었다.
gag및poℓ유전자를 그 다음 카나리아 폭스 측면부 암 사이에서 클로닝시켰다. 이것은 I3L-프로모터 구동되는gag및poℓ유전자를 함유하는 pHIVG7의 4,400bpSmaI-NotI 단편과 올리고뉴클레오티드 HIV2L6 (SEQ ID NO: 423) (5'-GGCCAAAC-3') 및 HIV2L7 (SEQ ID NO: 424)(5'-TCGAGTTT-3')를 pSPCP3L의 SmaI- XhoI 그 부위에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드를 pHIVG24라 부른다.
pHIVG24를 레스큐 바이러스로서 CPpp(ALVAC)와의 재조합 실험에서 사용하여 vCP152를 얻었다.
vCP152 감염된 세포들로 면역침전 실험을 HIV-1 env 및gag단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행하였다. HIV-1-특이적 종은 모의 감염되거나 ALVAC 감염된 세포에서 침전되지 않았다. 그러나gag전구체 단백질 또한 여러 중간체 및 성숙한gag절단 생성물에 해당하는 단백질종들은 vCP152 감염된 세포들의 용해물로부터 침전되었다.
실시예102
ALVAC/HIV-1 gag/poℓ 및 env(절두형) 재조합체의 발생
HIV-1 cDNA 서열을 함유하는 플라스미드, pHXB2D를 닥터 갈로(Dr. R.C. Gallo)(NCI-NIH)로부터 얻었다.
gag유전자의 5'-말단을 코드하는 서열을 우두 바이러스 tk 측면부 암 사이에서 클로닝시켰다. 이것은 상기한 바와같이 (실시예101 참조) 플라스미드 pHIVG24를 초기에 제조함으로써 달성되었다.
pHIVG24를 레스큐 바이러스로서 vCP120과의 재조합 실험에서 사용하여 vCP155를 얻었다.
vCP155 감염된 세포들로 면역침전실험을 HIV-1 env 및gag단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행하였다. HIV-1-특이적 종은 모의 감염된 세포들로부터 침전되지 않았다. 그러나 env 및gag전구체 단백질 또한 여러 중간체 및 성숙한gag절단 생성물에 해당하는 단백질종들은 vCP155 감염된 세포들의 용해물로부터 침전되었다.
실시예103
ALVAC/HIV-1 gag/poℓ 및 env(막투과 앵코르를 가진 gp120) 재조합체의 발생
HIV-1 cDNA 서열을 함유하는 플라스미드, pHXB2D를 닥터 갈로(Dr. R.C. Gallo)(NCI-NIH)로부터 얻었다.
gag유전자의 5'-말단을 코드하는 서열을 우두 바이러스 tk 측면부 암 사이에서 클로닝시켰다. 이것은 상기한 바와같이 (실시예101 참조) 플라스미드 pHIVG24를 초기에 제조함으로써 달성되었다.
pHIVG24를 레스큐 바이러스로서 vCP138과의 재조합 실험에서 사용하여 vCP156을 얻었다.
vCP156 감염된 세포들로 면역침전 실험을 HIV-1 env 및gag단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행하였다. HIV-1-특이종은 모의 감염된 세포들로부터 침전되지 않았다. 그러나 env 및gag전구체 단백질, 또한 여러 중간체 및 성숙한 절단 생성물에 해당하는 단백질종들은 vCP156 감염된 세포들의 용해물로부터 침전되었다.
HIV-1gag-특이적 유전자 생성물 단독으로, 아니면 우두 바이러스에 의한env와 조합한 발현은 비감염 바이러스 유사입자의 생성을 가져오는 것으로 나타났다(Haffar et al., 1990; Hu et al., 1990). 이런 배경으로 본발명자들은 HIV-1gag-poℓ및env유전자를 발현하는 ALVAC-기초 재조합체로 감염된 세포들도 이러한 입자들을 생성하는지를 연구하였다. 더나아가서는, 만일 이들 ALVAC-기초 재조합체가 비-조류 세포들(즉 VERO, MRC-5 등)을 감염시키기 위해 사용된다면, 그때 HIV-1 바이러스 유사입자는 어떤 폭스바이러스 비리온 오염물질이 없이 정제될수 있다.
vCP156으로 감염된 VERO 세포들을 사용하는 입자형성을 평가하기 위해 다음의 실험을 수행하였다. VERO 세포들을 대략 5pfu/세포의 m.o.i.에서 감염시켰다. 24시간 감염기간후, 상징액을 수확하고 2000 rpm에서 10 분간 원심분리에 의해 정화하였다. 그 다음 상징액을 30,000kDa의 분자량을 차단하는 필터를 통해 분리시켰다. 따라서, 그 보다 작은 분자들은 이들 필터를 통과할 것이다. 그 다음 필터에 의해 보유된 물질들을 HIV-혈청 양성 개인으로부터 수집된 사람혈청(Dr. J. Conroy, New York State Department of Health로부터 얻음)을 사용하여 표준 웨스턴 블롯분석(Maniatis et al., 1990)에 의해 분석하였다. 웨스턴 블롯 분석으로부터의 결과는 필터에 의해 보유된 물질에서 주 핵 단백질 p24와 HIV-1(MN) 고정된 gp120의 존재를 증명하였다. 상기한 크기 배제로, p24는 그것이 더 큰 구조적 배치(즉, 바이러스 유사입자)로 있지 않다면 통과했을 것이다. 그러므로, 이들 결과는 gp120 외피성분을 함유하는 HIV-1 바이러스 유사입자가 vCP156 감염된 세포에서 생성됨을 강하게 제안한다.
실시예104
ALVAC 및 NYVAC에서 HIV-1 env 유전자의 T1, T2, 및 TH4.1에피토프의 발현
개개 펩티드로서 HIV-1env(Hosmalin et al., 1991)의 T1, T2 및 TH4.1에피토프를 발현하는 재조합 폭스 바이러스 vP1062 및 vCP146을 발생시켰다.
플라스미드 p731T1의 제조.
플라스미드 pMPI3H는 pUC8 백그라운드에서 우두 I3L 초기/ 중간체 프로모터 요소(Schmitt and Stunnenberg, 1988)을 함유한다. 프로모터 요소는 주형으로서 우두HindIII I의 서브클론인 pMPVC1을 사용하고 프라이머로서 합성 올리고뉴클레오티드 MPSYN 283 (SEQ ID NO: 425)(5'-CCCCCCAAGCTTACATCATGCAGTGGTTAAAC-3') 및 MPSYN287 (SEQ ID NO: 426) (5'- GATTAAACCTAAATAATTGT-3')를 사용하여 폴리머라제 사슬반응(PCR)에 의해 합성되었다. 이 반응으로부터의 DNA는HindIII 및RsaI로 절단하였고 프로모터 요소를 함유하는 0.1 kb 단편을 정제하였다. 링커영역은 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드 MPSYN398(SEQ ID NO: 427) (5'-ACAATTA-TTTAGGTTAACTGCA-3') 및 MPSYN399 (SEQ ID NO: 428)(5'-GTTAACCTAAATAATTGT-3')를 어닐링함으로써 조립되었다. PCR-유도된 프로모터 요소와 폴리링커 영역을HindIII 및RstI로 절단한 벡터 플라스미드 pUC8과 결합시켰다. 결과된 플라스미드, pMPI3H는 개시 코돈에 관하여 위치 -100 내지 -6의 I3L 프로모터 영역, 이어서HpaI,PstI,SalI,BamHI,SmaI 및 EcoRI 부위를 함유하는 폴리링커 영역을 함유한다.
HpaI으로의 절단은 프로모터에서 위치-6에서 선형화된 블런트 말단화된 DNA를 생성한다.
우두 I3L 프로모터 구동되는 T1 펩티드를 함유하는 카세트는 상보적 올리고뉴클레오티드 T1C (SEQ ID NO: 429) (5'-TAATCATGAAACAAATTATTAATATGTGGCAAGAAG-AGGAAAAGCTATGTACGCTTGACTAGTTAATCACTCGAG-3') 및 T1N (SEQ ID NO: 430) (5'-GATCCTCGAGTGATTAACTAGTCAAGCGTACATAGCTTTTCCTACTTCTTGCCACATATTAATAATTTGTTTCATGATTA-3')을HpaI 및BamHI로 분해된 플라스미드 pMPI3H에 결합함으로써 발생시켰다. 이 결합은 프로모터의 마지막 5 염기쌍들로 재구성되고 T1 펩티드의 완전한 코드화 서열을 제공하며 종결코돈과BamHI 부위 사이에XhoI 부위를 만든다. 이것은 플라스미드 p731T1이다. 단편의 서열은 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 확인되었다.
플라스미드 pH6T2의 제조.
우두 H6 프로모터 구동되는 T2 펩티드를 함유하는 카세트는 두 단계로 발생되었다. 즉,EcoRV 부위를 통해 H6 프로모터는 PCR 및 프라이머 H6PCR1 (SEQ ID NO: 364) 및 H6PCR2(SEQ ID NO : 365)를 사용하여 합성 H6 프로모터(Perkus et al., 1989)를 함유하는 플라스미드로부터 유도되어 5' HindIII 부위를 만들었다. 이 122bp PCR-유도된 단편은HindIII 및EcoRV로 분해되고 이어서 마찬가지로 분해된 pBS-SK+(Stratagene, La Jolla, CA)에 결합되어 플라스미드 pBSH6를 발생시킨다.
EcoRV 부위로부터 H6 프로모터의 3' 말단을 완결하고 T2 펩티드를 코드하며 유전자의 3'말단에서BamHI 부위를 만드는 상보적 올리고뉴클레오티드 T2C (SEQ ID
를 어닐링시킨 다음EcoRV 및BamHI로 분해시킨 pBSH6에 결합시켰다. 이 플라스미드를 pH6T2라 칭하고 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 단편을 확인하였다.
플라스미드 pVQ42KTH4.1의 제조
AmEPV42K 프로모터 구동되는 TH4.1 펩티드를 함유하는 카세트는 연속 PCR 반응에 의해 발생시켰다. 즉, 5'PstI 및SmaI 부위를 가진 107bp 42K 프로모터를 프라이머 42KVQ1 (SEQ ID NO: 433) (5'- AATTAATTAGCTGCAGCCCCGGGTC-AAAAAAATATAAATG-3') 및 42KVQ2 (SEQ ID NO: 434) (5'- CCTTGTACTACTTCAATT-ACTCTATCCATTTTATATTGTAATTATATATTTTC)를 사용하여 42K 프로모터의 조절하에 광견병 당단백질에 대한 유전자를 함유하는 플라스미드인 플라스미드 p42KRABI로부터 PCR에 의해 유도되었다. 이 PCR-유도된 단편의 107bp 프로모터 영역의 서열은 (SEQ ID NO: 435) 5'-TCAAAAAAATATAAATGATTCACCATCTGATAGAAAAAAAATTTATTGGGAAGA-ATATGATAATATTTTGGGATTTCAAAATTGAAAATATATAATTACAATATAAA-3'이다. 159bp PCR-유도된 단편을 이 단편과 TH4.1 펩티드 TH41C (SEQ ID NO: 436) (5'-ATGGATAGAGTAA TTGAAGTAGTACAAGGAGCTTATAGAGCTATTAGATGACTAGTTAATCACTCGAGGATCC-3')와 TH41N (SEQ ID NO: 437) (5'-GGATCCTCGAGTGATTAACTAGTCATCTAATAGCTCTATAAGCTCCTTGTACTACTT-CAATTACTCTATCCAT-3')를 코드하는 합성 올리고뉴클레오티드를 주형으로 사용하고 프라이머 42KTH41 (SEQ ID NO: 438) (5'-ATCATCGGATCCTCGAGTGATTAAACTAG-TCATCTAATAGCTC-3') 및 42KVQ1 (SEQ ID NO: 433)을 사용하여 제2 PCR로 TH4.1의 코드화 서열에 융합시켰다. 이 210bp PCR-유도된 단편은 프라이머 42KTH41 (SEQ ID NO: 438) 및 BAMVQ (SEQ ID NO: 441) (5'-TTAATCAGGATCCTTAATTAATTAGTTATTAGAC-3')를 사용하여 제3 PCR에 대한 주형으로서 그 단편과 합성 올리고뉴클레오티드 VQC (SEQ ID NO: 439) (5'-TTAATCAGGATCCTTAATTAATTAGTTATTAGACAAGGTGAAAACGAAACT-ATTTGTAGCTTAATTAATTAGCTGCAGCCCGGG-3') 및 VQN (SEQ ID NO: 440) (5'- CCCGGGC-TGCAGCTAATTAATTAAGCTACAAATAGTTTCGTTTTCACCTTGTCTAATAACTAATTAATTAAGGATCCTGATTAA -3')를 사용하여 5' 말단에서BamHI 부위를 포함시키면서 5' 방향으로 연장되었다. 후속 뉴클레오티드 서열분석은 42KTH41에 대한 상기 서열에서 밑줄로 표시한 바와같이 여분의 염기(A)가 위치24 뒤에 삽입되도록 하는 올리고뉴클레오티드 42KTH41 (SEQ ID NO: 438)의 서열에서 착오가 나타났다. 이것은 프라이머 BAMVQ (SEQ ID NO : 441) 및 42KTH41A (SEQ ID NO: 442) (5'-ATCATCGGATCCTCGAGTGATTAACTAGTCA-TCTAATAGCTC-3')로 주형으로서 제3 PCR로부터 유도된 272bp 단편을 사용하여 최종 PCR로 교정되었다. 최종 PCR후, 카세트는XhoI 및BamHI 부위 3'를 가진 42K- TH4.1에BamHI,PstI 및SmaI 부위 5'를 함유하는 것이었다. 이 271bp PCR-유도된 단편은BamHI로 분해되고 pBS-SK+(Stratagene, La Jolla, CA)의BamHI 부위에 클로닝시켜 플라스미드 pVQ42KTH4.1을 발생시켰다. 이 플라스미드의 뉴클레오티드 서열 분석은 프로모터와 코드영역의 서열이 정확하였음을 확인하였다. 그러나, 3bp 삭제가 나타나 3'BamHI 부위의 손실을 가져왔다.
플라스미드 pT1T2TH4.1의 제조.
이들 세 카세트를 단일 플라스미드 pT1T2TH4.1에 조합하되 다음 방법으로 즉 170bpHindIII/XhoI 단편을 p731T1으로부터 분리시키고 마찬가지로 분해된 pH6T2에 결합시켜 pT1T2를 발생시키므로, I3L-T1을 다른 두 유전자에 마주하는 배향이 되도록 하였다. pVQ42KTH4.1로부터 290bpBamHI/SacI 단편을 마찬가지로 분해된 pT1T2에 결합시켜 pT1T2TH4.1을 만들었다. 삽입물의 서열은 뉴클레오티드 서열분석에 의해 확인되었다.
pC5LSP(실시예 66에 정의됨)을EcoRI로 분해하고 알칼리성 포스파타제로 처리하고,NotI로 분해되고 선형 정제되고 이어서 자체 결합된 자체 어닐링된 올리고뉴클레오티드 CP29 (SEQ ID NO: 363) (5'-AATTGCGGCCGC-3')에 결합시켰다. 이 과정은NotI 부위를 pC5LSP에 도입하였고 pNC5LSP5를 발생시켰다. 각각의 프로모터들에 의해 구동되는 에피토프에 대한 유전자를 함유하는 pT1T2TH4.1로부터의 602bpXhoI 단편을 그들의XhoI 부위에서 공여체 플라스미드 pNC5LSP5 및 pSD550(실시예 59에서 정의됨)에 클로닝시켰다. 뉴클레오티드 서열 분석을 사용하여 삽입물의 서열과 배향을 확인하였다. 결과된 플라스미드 pC5T1T2TH4.1 및 pI4T1T2TH4.1을 ALVAC 및 NYVAC와의 체외 재조합실험에서 사용하여 각각 재조합 바이러스 vCP146 및 vP1062를 발생시켰다. 이들 재조합 바이러스는 특이적 DNA 프로브의 바이러스 플라크에의 혼성화에 의해 원하는 유전자를 함유하는 것으로 증명되었다.
실시예 105
HIV-1 env로부터 막투과 앵코르(anchor)영역을 가진것과 가지지 않은 HIV-1 env의 T1, T2, 및 TH4.1 에피토프를 함유하는 두가지 융합 펩티드의 발현
절단가능 링커 영역에 의해 HIV-1env의 T1, T2 및 TH4.1에피토프에 해당하는 서열에 결합된 HIV-1env로부터의 신호서열로 구성되는 융합 펩티드를 발현하는 재조합 폭스 바이러스 vP1060, vP1061, vCP154 및 vCP148을 만들었다. vP1060 및 vCP154는 vP1061 및 vCP148과 전자의 재조합 바이러스가 HIV-1env의 막투과 영역에 해당하는 서열과 함께 융합 펩티드를 발현하는 점에서 다르다.
두 융합펩티드는 Ratner et al. (1985)를 기초로 HIV-1 (IIIB)env, 잔기 1-50(더하기 개시 Met)의 51 아미노산 N-말단 부분을 포함한다. 이 신호영역(SEQ ID NO: 443)의 아미노산 서열은 MKEQKTVAMRVKEKYQHLWRWGWRWGTMLLGMLMICSATEKLWVTV-YYGVP이다. 이것에 서로 신호로부터 분리된 T1,T2 및 TH4.1에피토프(Hosmalin et al., 1991)와 절단가능 링커영역에 의해 5개 아미노산 길이까지 존재하는 앵코르 서열이 이어진다. 펩티드(SEQ ID NO: 444)의 이 영역의 아미노산 서열은 [신호]-PFR-KQIINMWQEVGKAMYA-PPFRK-HEDIISLWDQSLK-PPFRK-DRVIEVVQGAYRAIR-[PPFRK-앵코르]이다. 앵코르영역은 HIV-1(III B)env, 잔기 691-718의 28 아미노산 막투과 영역이다. 이 영역(SEQ ID NO: 445)의 아미노 서열은 LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSVVNRVRQG-[중지]이다.
융합 펩티드의 두가지 변형에 대해, H6 프로모터와 HIV-1env신호서열을 프라이머 H6PCR1 (SEQ ID NO: 364)와 PCRSIGT1 (SEQ ID NO: 446) (5'-CATATTAA-TTTGTTTTCTAAAAGGAGGTACCCCATAATAGACTGTG-3')을 사용하여 플라스미드 pH6HIIIBEM (실시예 18에 정의됨)으로부터 PCR에 의해 유도되었다. 이 314bp PCR-유도된 단편은 5'HindIII 부위에 이어서 신호, 링커 그리고 T1 펩티드의 처음 6개 아미노산에 대한 H6 프로모터 및 코드화 서열로 구성된다.
막투과 영역없는 구조체에 대한 코드화 영역의 나머지는 프라이머 PCRT1T2 (SEQ ID NO: 449) (5'-AAACAAATTATTAATATGTGGCAAGAAGTAGGAAAAGCTATGTACGCTCCTCC-TTTTAGAAAACACGAAG-3')및 PCRT4END (SEQ ID NO: 450) (5'-ACTACTTCTAGATTATCTAAT-AGCTCTATAAGCTCCTTGTACTACTTCAA TTACTC -3')을 사용하여 올리고뉴클레오티드 T2T4A (SEQ ID NO: 447) (5'-GCTCCTCCTTTTAGAAAACACGAAGATATTATTTCTTTGTGGGATCAATCTTT-AAAACCTCCTTTTAGAAAAGATAGAGTAATTGAAGTAGTAC-3') 및 T2T4B (SEQ ID NO: 448) (5'-GTACTACTTCAATTACTCTATCTTTTCTAAAAGGAGGTTTTAAAGATTGATCCCACAAAGAAATAATATCTTCGTGTTTTCTAAAAGGAGGAGC-3')의 PCR 증폭에 의해 발생시켰다. 이 177bp PCR-유도된 단편은 T1 펩티드, 링커영역, T2 펩티드, 또다른 링커영역, 및 TH4.1 펩티드, 이어서 3'XbaI 부위를 코드화한다. 이 단편을 프라이머 H6PCR1 (SEQ ID NO: 364) 및 PCRT4END (SEQ ID NO: 450)로 PCR에 의해 프로모터 및 신호서열을 함유하는 314bp PCR-유도된 단편으로 융합시켰다.
HindIII 및XbaI으로 이 473bp PCR-유도된 단편의 분해에 이어서, 455bp의 단편을 아가로오스 겔로부터 분리시키고 마찬가지로 분해된 pBS-SK에 결합시키고 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 삽입물의 서열을 입증하였다. 결과된 플라스미드는 pBST1T2TH4.1로 칭하였다.
막 투과 앵코르를 가진 변형의 코드화 영역의 나머지는 프라이머 PCRT1T2 (SEQ ID NO: 449) 및 PCRT4TM (SEQ ID NO: 451) (5'-TACTATCATTATGAATAATTTTCT-AAAAGGAGGTCTAATAGCTCTATAAGCTCCTTGTACTACTTCAATTACTC-3')를 사용하여 올리고뉴클레오티드, T2T4A (SEQ ID NO: 447) 및 T2T4B (SEQ ID NO: 448)의 PCR 증폭에 의해 발생시켜 막투과 영역을 수용하도록 3' 말단을 변경시켰다. 이 195bp PCR-유도된 단편을 프라이머 PCRT1T2(SEQ ID NO: 449) 및 PCRTMEND (SEQ ID NO: 450)을 사용하여 앵코르, HIVTM1(SEQ ID NO: 403) 및 HIVTM2 (SEQ ID NO: 404)로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 PCR에 의해 융합하였다. 이 276bp PCR 유도된 단편을 프라이머 H6PCR1 (SEQ ID NO: 364) 및 PCRTMEND (SEQ ID NO: 450)로 PCR에 의해 프로모터 및 신호서열을 함유하는 314bp PCR-유도된 단편과 융합시켰다. 이 572 bp PCR-유도된 단편의HindIII 및XbaI으로 분해에 이어서 554bp의 단편을 아가로오스 겔로부터 분리하고 마찬가지로 분해된 pBS에 결합시키고 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 삽입물의 서열을 입증하였다. 결과된 플라스미드는 pBST1T2TH4.1A라 칭하였다.
pC5LSP (실시예 66에 정의됨)를BamHI로 분해하고 어닐링된 올리고뉴클레오티드CP32(SEQ ID NO: 406) 및 CP33 (SEQ ID NO: 407)에 결합시켜 pVQC5LSP6를 발생시켰다. pVQC5LSP6를EcoRI로 분해하고 알칼리성 포스파타제로 처리하고,NotI으로 분해되고 선형 정제되고 이어서 자체 결합된 자체 어닐링된 올리고뉴클레오티드 CP29(SEQ ID NO: 363)에 결합시켰다. 이 과정은NotI 부위를 pVQC5LSP6에 도입하여 pNVQC5LSP7을 발생시켰다.
두 카세트는 삽입플라스미드 pNVQC5LSP7의XhoI 및XbaI 부위 사이에 개별적으로 놓였다. 이들 플라스미드 pC5ST1T1TH4.1 및 pC5ST1T2TH4.1A를 C5 좌, 각각 vCP148 및 vCP154에서 카나리아폭스 바이러스 재조합체를 발생시키기 위해 사용하였다.BamHI-SmaI 단편을 pC5ST1T1TH4.1 및 pC5ST1T2TH4.1A로부터 잘라내고 마찬가지로 분해된 pSD550 (실시예 59에 정의됨)에 결합시켜 각각 플라스미드 pI4ST1T2TH4.1과 pI4ST1T1TH4.1A를 발생시켰다. 이들 플라스미드를 NYVAC의 I4 좌와의 IVR에서 사용하여 각각 재조합체 vP1061 및 vP1060을 가져왔다. 이들 재조합체 바이러스는 특이적 DNA 프로브의 바이러스 플라크에의 혼성화에 의해 원하는 유전자를 함유함이 증명되었다.
실시예106
ALVAC, TROVAC 및 NYVAC에서 HIV-1 nef 유전자의 발현
HIV-1nef(MN)을 발현하는 재조합체 폭스바이러스 vP1084, vFP174, 및 vCP168은 다음과 같이 발생시켰다.
I3L 프로모터는 프라이머 I3PCR1 (SEQ ID NO: 452) (5'-ATCATCGGATCCAA-GCTTACATCATGCAGTGG-3') 및 PI3NEF2 (SEQ ID NO: 453) (5'-CGTTTTGACCATTTGCCA-CCCATGTTAAACCTAAATAATTGTACTTTG-3')를 사용하여 플라스미드 pMPI3H로부터 PCR에 의해 유도되었다.nef의 코드화 영역은 프라이머 PI3NEF1 (SEQ ID NO: 454) (5'- AGTACAATTATTTAGGTTTAATCATGGGTGGCAAATGGTCAAAACG -3') 및 PNEFBAM (SEQ ID NO: 455) (5'-ATCATCGGATCCTAACACTTCTCTCTCCGG -3')를 사용하여 pMN 1.8-10(7792 및 9595에서SstI 부위 사이에 MN 게놈의 그 부분의 클론)의 PCR 증폭에 의해 발생되었다. 코드화 영역의 프로모터와의 융합은 프라이머 I3PCR1 (SEQ ID NO: 452) 및 PNEFBAM (SEQ ID NO: 455)를 사용하여 앞의 PCR 생성물의 증폭에 의해 달성되었다.BamHI로 이 생성물의 분해에 이어서 0.7 kb의 단편을 아가로오스 겔로부터 분리하고 마찬가지로 분해된 pBS-SK+(Stratagene La Jolla, CA)에 결합시켜 플라스미드 pI3NEF를 발생시켰다. 서열 이탈이 처음 관찰된 것은 이 시점에서였다. 카세트의 서열은 플라스미드 pMN 1.8-10에서 이탈로 인해 공개된 서열 (Gurgo et al., 1988, Genbank Accession Number M17449)과 다른것으로 결정되었다. 이들 차이를 공개된 서열과 비교하여 이하 요약한다.
카세트에서 두 무변화(Silent) 돌연변이(위치 8834 및 9127에서)는 명백히 PCR에서 착오였다. 코드화된 단백질에 대한 효과가 없기 때문에 이것들은 존속하도록 두었다. 9930에서 프레임 이동은 길어진 오픈 리딩 프레임을 가져와 다른 HIV-1 분리물과 더 밀접하게 유사해진다. MN 분리물로부터nef의 공개된 크기와 조화되어 이 카세트는 코드화 영역의 절두형 3' 말단을 발생시키기 위해 제4 PCR을 요하였다.
위치 9930에서 여분의 염기의 제거는 프라이머 I3PCR1 (SEQ ID NO: 452) 및 PNEFFIX1 (SEQ ID NO: 456) (5'-ATCATCGGATCCTAACACTTCTCTCTCCGGTCATCCATCCATGCT-GGCTCATAG-3)로pI3NEF에서 삽입물의 PCR 증폭에 의해 달성되었다.
BamHI로 이 678bp PCR-유도된 단편의 분해에 이어서 660bp의 단편을 아가로오스 겔로부터 분리하고 마찬가지로 분해된 pBS에 결합시켜 플라스미드 pBSI3NEF를 발생시켰다. 삽입물을 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 입증하였다.
nef유전자를 함유하는 pBSI3NEF로부터의 660bpBamHI 단편은 삽입 플라스미드pNVQC5LSP7 (실시예 105에 정의됨)의BamHI 부위에 놓였다. 결과된 플라스미드 pC5I3NEF는 ALVAC의 C5 위치로 IVR에서 사용되어 재조합체 vCP168을 발생시켰다. 같은 660bpBamHI 단편을 또한 삽입 플라스미드 pSD550VC(실시예 59에 정의됨)의BamHI 부위에 놓아 플라스미드 pI4I3NEF를 만들었다. NYVAC로 이 플라스미드와의 IVR은 재조합체 vP1084를 발생시켰다.
TROVAC의 F16 위치에 대한 삽입 플라스미드는 다음 방법으로 유도되었다. 7.3kbNaeI/NdeI 단편을 Tartaglia et al (1990)에 의해 기술된 조류 폭스 바이러스의 10.5kbHindIII 단편을 함유하는 플라스미드로부터 분리하고 마찬가지로 분해된 pUC9에 결합시켜 플라스미드 pRW866을 만들었다.
pUC9는PvuII로 분해되고EcoRI 링커는PvuII 부위사이에 결합되어 플라스미드 pRW715를 만들었다. 조류 폭스서열에 의한 측면부로된 클로닝 부위는 프라이머 RW264 (SEQ ID NO: 457) (5'-AATTAACCCGGGATCCAAGCTTCTAGCTAGCTAATTTTTATA-GCGGCCGCTATAATCGTTAACTTATTAG-3') 및 RW267 (SEQ ID NO; 458) (5'-GCTAGAAA-TCTCTTAGTTTTTATAGTTG-3')로 10.5kb 단편의 일부의 PCR 증폭에 의해 발생되었다. 인접영역은 또한 프라이머 RW266 (SEQ ID NO: 459) (5'-GTTACATATGTACAGAAT-CTGATCATAG-3') 및 RW265 (SEQ ID NO: 460) (5'- CTAGCTAGAAGCTTGGATCCCGGGTTAA-TTAATTAATAAAAAGCGGCCGCGTTAAAGTAGAAAAATG-3')를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 이들 RCR-유도된 단편으로 프라이머 RW266 (SEQ ID NO: 459) 및 RW267 (SEQ ID NO: 458)을 사용하여 제3PCR에 의해 융합되었다. 결과된 PCR-유도된 단편은 5'-EcoRI 부위와 3'NdeI 부위에 의한 측면부로된 조류 폭스서열로 구성되었다. 단편의 중심에는NotI 부위에 의한 측면부로된SmaI,BamHI 및HindIII 부위를 함유하는 폴리클로닝 영역과 6개 리딩프레임에 번역종결코돈이 있다. 초기 전사종결신호(Yuen and Moss, 1987)는 3'NotI 부위에 인접해 있다.EcoRI 및NdeI로 분해된 이 PCR-유도된 단편은 마찬가지로 분해된 pRW715에 결합되어 플라스미드 pRW864를 만든다. 11K 프로모터 구동되는 ℓacZ 유전자를 일부BamHI, 전체PstI 분해에 의해 pAM1으로부터 잘라내었다. 이 단편은 클리나우 폴리머라제로 블런트 말단화하고SmaI 분해된 pRW864에 결합되어 pRW867A를 만들었다. pRW867A로부터의NotI 단편은FspI 부위에 결합시켰을때NotI 부위가 재생되도록dNTP의 존재하에 클리나우 폴리머라제로 블런트 말단으로 만들고 Tartaglia et al., (1990)에 의해 기술된 위치 1955에 해당하는 삽입이 행해지도록FspI로 부분적으로 분해된 pRW866에 결합시켰다. 그 다음 결과된 플라스미드, pRW868을 NotI으로 분해하여ℓacZ 카세트를 제거하고NotI 분해에 의해 잘라낸 pRW864로부터 66bp 폴리링커에 결합시켰다. 결과된 플라스미드는 pRW673이라 칭하였다. 81 bpSmaI 단편을 pVQ42KTH4.1 (실시예 104에 정의됨)로부터 유도하였고SmaI 분해된 pRW873에 삽입하여 플라스미드 pVQ873을 발생시켰다.
nef카세트는 pVQ873으로 삽입을 위해 684bpHindIII 단편으로서 pBSI3NEF로부터 잘라내었고 이어서 TROVAC의 F16 위치로 IVR에 사용되어 vFP174를 발생시켰다.
실시예 107
NYVAC에서 HIV-2 유전자의 발현
NYVAC/HIV-2 gag/poℓ재조합체의 발생.
사람 면역결핍 바이러스 타입2 (HIV2)gag및poℓ유전자를 함유하는 플라스미드, pISSYEGP를 닥터 프란치니(Dr. G. Franchini)(NCI- NIH)로부터 얻었다. 이 플라스미드로부터의 gag 및poℓ유전자를 우두 바이러스 tk 측면부암 사이에서 I3L 프로모터의 하류에 클로닝시켰다. 이것은 HIV2gag및poℓ유전자를 함유하는 pISSYEGP의 4,400bpBstUI-BgℓII 단편과, I3L 프로모터를 함유하는 올리고뉴클레오티드, SIVL1 (SEQ ID NO: 181) 및 HIV2L1 (SEQ ID NO: 461) (5'-CGCCC-ATGATTAAACCTAAATAATTGTACTTTGTAATATAATGATATATATTTTCACTTTATCTCAC-3')를 pSD542의 4,070bpXhoI-BgℓII 단편에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드를 pHIV21이라 부른다.
그 다음 외래의 3'-비코드화 서열을 제거하였다. 이것은poℓ유전자의 3'-말단을 함유하는 280bpBcℓI-SmaI PCR 단편을 pHIV21의 8,100bp BcℓI-SmaI 단편에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 PCR 단편은 올리고뉴클레오티드, HIV2P2 (SEQ ID NO: 462) (5'-ATGGCAGTTCATTGCAT -3')와 HIV2P3 (SEQ ID NO: 463) (5'-TTCCCGGGAGATCTCTATGCCATTTCTCCAT-3')와 플라스미드, pISSYEGP로부터 발생되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드를 pHIV22 라 부른다.
pHIV22를 레스큐 바이러스로서 vP866 (NYVAC)와의 재조합 실험에서 사용하여 vP1045을 얻었다.
면역침전분석을 수행하여 vP1045가 진정한 HIV2gag유전자 생성물을 발현하는지 결정하였다. VERO 세포 단일층을 모의 감염시키거나, 어버이 바이러스로 감염시키거나 10 PFU/세포의 m.o.i에서 vP1045로 감염시켰다. 1 시간 흡착기간에 이어서, 접종물을 흡인하고 세포를 2% 소 태아 혈청과 [35S]- 메티오닌(20 μCi/mℓ)를 함유하는 변형된 이글배지(마이너스 메티오닌) 2mℓ위에 놓았다. 세포를 1 mℓ 3X 완충액 A(3% NP-40, 30mM Tris (pH7.4), 3mM EDTA, 0.03% Na 아지드 및 0.6 mg/mℓ PMSF)의 첨가와 세포단일층의 후속 스크레이핑에 의해 감염후 18 시간에 수확하였다.
감염된 세포로부터 용해물을 HIV2 혈청양성 개인으로부터 수집된 혈청(Dr. G. Franchini (NCI-NIH), NCI-NIH, Bethesda, MD)을 사용하여 HIV2gag발현에 대해 분석하였다. 혈청을 vP866 감염된 VERO 세포와 사전흡착시켰다. 사전흡착된 혈청을 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 단백질 A-세파로오스에 결합시켰다. 이 인큐베이션 기간에 이어서, 이 물질을 1X 완충액A로 4회 세척하였다. 정상의 사람혈청과 단백질 A-세파로오스로 사전 정화된 용해물을 그 다음 단백질 A-세파로오스에 결합된 HIV2 혈청 양성 사람혈청으로 4℃에서　밤새　인큐베이션시켰다. 밤새 인큐베이션기간후, 샘플을 1X 완충액 A로 4회, LiCℓ2/요소 완충액으로 2회 세척하였다. 침전된 단백질을 2X 램리 완충액(125 mM Tris (pH6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-메르캅토 에탄올)의 첨가와 5분간 비등에 의해 면역복합체로부터 해리시켰다. 단백질을 10% 드레이퍼스 겔 시스템(Dreyfuss et al., 1984) 상에서 분별하고 고정하고 플루오로그라피를 위해 1M Na 살리실레이트로 처리하였다. HIV2 혈청양성 개인으로부터의 사람혈청은 vP1045 감염된 세포들로부터 HIV2gag전구체 단백질, 또한 여러중간체 및 성숙한 절단 단백질 생성물을 특이적으로 침전하나 모의 감염되거나 NYVAC 감염된 세포들로 부터 HIV2-특이적 단백질을 침전하지 않았다.
실시예 108
NYVAC/HIV-2 gag/poℓ 및 env(gp 160) 재조합체의 발생
HIV-2gag및poℓ유전자를 함유하는 플라스미드 pISSYEGP를 닥터 프란치니 (Dr. G. Franchini)(NCI-NIH)로부터 얻었다. 이 플라스미드로부터의gag및poℓ유전자는 I3L 프로모터의 하류에 우두 바이러스 tk 측면부암 사이에서 클로닝되었다. 이것은 상기한 바와같이 (실시예 107 참조) 플라스미드 pHIV 22를 초기에 제조함으로써 달성되었다.
pHIV22는 레스큐 바이러스로서 vP920과의 재조합실험에서 사용하여 vP1047을 얻었다.
vP1047 감염된 세포와의 면역침전실험을 HIV2gag단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행되었다. HIV2-특이적 종은 모의 감염된 세포로부터 침전하지 않았다. 그러나 HIV2 및gag전구체 단백질, 또한 여러중간체 및 성숙한gag절단생성물에 해당하는 단백질종이 vP1047 감염된 세포의 용해물로부터 침전되었다.
실시예 109
NYVAC/HIV-2 gag/poℓ 및 env(gp 120) 재조합체의 발생
HIV-2gag및poℓ유전자를 함유하는 플라스미드 pISSYEGP를 닥터 프란치니 (Dr. G. Franchini)(NCI-NIH)로부터 얻었다. 이 플라스미드로부터의gag및poℓ유전자를 I3L 프로모터의 하류에 우두 바이러스 tk 측면부암 사이에서 클로닝시켰다. 이것은 상기한 바와같이 (실시예 107 참조) 플라스미드 pHIV 22를 초기에 제조함으로써 달성되었다.
pHIV22는 레스큐 바이러스로서 vP922와의 재조합실험에서 사용하여 vP1044을 얻었다.
vP1044 감염된 세포와의 면역침전 실험을 HIV2gag단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행되었다. HIV2-특이적 종은 모의 감염된 세포로부터 침전되지 않았다. 그러나 HIV2 env 및gag전구체 단백질, 또한 여러중간체 및 성숙한gag절단생성물에 해당하는 단백질종은 vP1044 감염된 세포의 용해물로부터 침전되었다.
실시예 110
ALVAC에서 HIV2 유전자의 발현
ALVAC/HIV-2 gag/poℓ 및 env(gp 160) 재조합체의 발생.
플라스미드, pBSH6HIV2ENV는 H6-프로모터 구동되는 HIV2 env (gp160) 유전자를 함유한다. 이 플라스미드로부터의 H6 프로모터 구동되는 env 유전자를 카나리아 폭스측면부 암사이에서 클로닝시켰다. 이것은 H6-프로모터 구동되는 env 유전자를 함유하는 pBSH6HIV2ENV의 2,700bpXhoI-SacII 단편과 올리고 뉴클레오티드, HIV2L4 (SEQ ID NO: 464) (5'-GGTTG-3') 및 HIV2L5 (SEQ ID NO: 465) (5'- AATTCAACCGC-3')를 pC6L의XhoI-EcoRI 부위에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pHIV23이라 부른다.
그다음 HIV2gag및poℓ유전자를 pHIV23에 클로닝시켰다. 이것은 I3L-프로모터 구동되는 HIV2gag및poℓ유전자를 함유하는 pHIV22의 4,450bpXmaI-NotI 단편과 올리고뉴클레오티드, HIV2L6(SEQ ID NO: 423) 및 HIV2L7 (SEQ ID NO: 424)를 pHIV23의 7,000 bpXmaI-XhoI 단편에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드를 pHIV25라 부른다.
pHIV25를 레스큐 바이러스로서 CPpp(ALVAC)와의 재조합 실험에서 사용하여 vCP153을 얻었다.
면역침전 분석을 수행하여 vCP153이 진정한 HIV2gag및 env 유전자 생성물을 발현하는지 결정하였다. CEF 세포 단일층을 모의 감염시키거나 어버이 바이러스로 감염시키거나 10PFU/ 세포의 m.o.i.에서 vCP153으로 감염시켰다. 1 시간 흡착기간에 이어서 접종물을 흡인하고 세포를 2% 소 태아 혈청과 [35S]-메티오닌( 20μCi/mℓ)를 함유하는 변형된 이글배지( 마이너스 메티오닌) 2mℓ위에 놓았다. 세포를 1mℓ 3X 완충액A (3% NP-40, 30mM Tris (pH7.4), 3mM EDTA, 0.03% Na 아지드 및 0.6 mg/mℓ PMSF)의 첨가와 이어서 세포단일층의 후속 스크레이핑에 의해 감염후 18 시간에 수확하였다.
감염된 세포들로부터의 용해물을 HIV2 혈청 양성 개인으로부터의 수집된 혈청(Dr. G. Franchini (NCI-NIH), NCI-NIH, Bethesda, MD로부터 얻음)을 사용하여 HIV2gag및 env 유전자 발현에 대해 분석하였다. 혈청을 CPpp 감염된 CEF 세포로 사전흡착시켰다. 사전흡착된 혈청을 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하여 단백질 A-세파로오스에 결합시켰다. 이 인큐베이션 기간에 이어서, 이 물질을 1X 완충액A로 4회 세척하였다. 정상의 사람혈청과 단백질 A-세파로오스로 사전정화된 용해물을 그 다음 단백질 A-세파로오스에 결합된 HIV2 혈청양성 사람혈청과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 밤새인큐베이션 기간후, 샘플을 1X 완충액A로 4회, LiCℓ2/ 요소 완충액으로 2회 세척하였다. 침전된 단백질을 2X 램리 완충액(125 mM Tris (pH6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-메르캅토에탄올)의 첨가와 5분간 비등에 의해 면역복합체로부터 분리시켰다. 단백질들을 10% 드레이퍼스겔 시스템(Dreyfuss et al., 1984) 상에서 분별하고 고정시키고 플루오로그라피를 위해 1M Na-살리실레이트로 처리하였다.
HIV2 혈청 양성 개인으로부터의 사람 혈청은 vCP153 감염된 세포들로부터 HIV2 env 및gag전구체 단백질, 또한 여러중간체 및 성숙한 gag 절단 생성물을 특이적으로 침전시켰으나, 모의 감염되거나 CPpp 감염된 세포들로부터 HIV 2-특이적 단백질을 침전시키지 않았다.
실시예111
NYVAC/SIV env (gp120-gp28) 및 gag (프로타아제 - ) 재조합체의 NYVAC 발생에서 SIV 유전자의 발현
면역침전분석을 수행하여 vP948 (실시예21에 정의됨) 이 진정한 SIV env 및gag전구체 단백질을 발현하는지 결정하였다. VERO 세포 단일층을 모의 감염시키거나, 어버이 바이러스로 감염시키거나, 10 PFU/ 세포의 m.o.i.에서 vP948로 감염시켰다. 1 시간 흡착기간에 이어서, 접종을 흡인하고 세포를 2% 소 태아 혈청과 [35S]-메티오닌(20 μCi/mℓ)를 함유하는 변형된 이글배지(마이너스 메티오닌) 2mℓ위에 놓았다. 세포들을 1 mℓ 3X 완충액A (3% NP-40, 30mM Tris (pH7.4). 3mM EDTA, 0.03% Na Azide 및 0.6 mg/mℓ PMSF)의 첨가와 세포단일층의 후속 스크레이핑에 의해 감염후 18 시간에 수확하였다.
감염된 세포들로부터의 용해물을 SIV 혈청양성 짧은꼬리 원숭이(macagues)로부터의 혈청(Dr. G. Franchini (NCI-NIH), NCI-NIH, Bethesda, MD로부터 얻음)을 사용하여 SIV env 및gag전구체 발현에 대해 분석하였다. 혈청을 vP866 (NYVAC) 감염된 VERO 세포로 사전흡착시켰다. 사전흡착된 혈청을 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 단백질 A-세파로오스에 결합시켰다. 이 인큐베이션 기간에 이어서, 이 물질을 1X 완충액A로 4회 세척하였다. 정상의 짧은 꼬리원숭이 혈청과 단백질 A-세파로오스로 사전 정화된 용해물을 단백질 A-세파로오스에 결합된 SIV 혈청 양성 짧은꼬리 원숭이 혈청과 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 밤새 인큐베이션기간후, 샘플을 1X 완충액A로 4회, LiCℓ2/요소 완충액으로 2회 세척하였다. 침전된 단백질을 2X 램리완충액(125 mM Tris (pH6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-메르캅토에탄올)의 첨가와 5분간 비등에 의해 면역복합체로부터 분리시켰다. 단백질을 10% 드레이퍼스겔 시스템(Dreyfuss et al., 1984) 상에서 분별하고 고정시키고 플루오로그라피를 위해 1M Na-살리실레이트로 처리하였다.
SIV 혈청 양성 개인으로부터의 짧은꼬리 원숭이 혈청은 SIVgag전구체 단백질과 외피 당단백질을 vP948 감염된 세포로부터 특이적으로 침전시켰으나 모의 감염된 세포들로부터 SIV 특이적 단백질은 침전시키지 않았다.
실시예 112
NYVAC/SIV gag/poℓ 재조합체의 발생
SIVMAC142cDNA 서열을 함유하는 플라스미드, pSIVGAGSS11G를 닥터 프란치니 (Dr. G. Franchini)(NCI-NIH)로부터 얻었다. 이 플라스미드로부터gag및poℓ유전자들을 I3L 프로모터의 하류에 및 우두 바이러스 tk 측면부 암 사이에서 클로닝시켰다. 이것은 상기한 바와같이(실시예 21 참조) 플라스미드 pSIVG5를 제조함으로써 달성되었다.
그 다음 외래 3'-비코드화 서열을 제거하였다. 이것은poℓ유전자의 3'-말단을 함유하는 1,000bpBamH1-HpaI PCR 단편을 pSIVG1의 7,400bp 부분BamH1-HpaI 단편에 클로닝함으로써 달성되었다. 이 PCR 단편은 올리고뉴클레오티드, SIVP5 (SEQ ID NO: 183) 및 SIVP6 (SEQ ID NO: 184)와, 플라스미드 pSIVGAGSSIIG로부터 발생되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pSIVG4라 부른다.
서열분석은 pSIVG4가poℓ유전자내에 단일의 염기쌍 삭제를 함유함을 나타내었다. 이 오차를 교정하기 위해, pSIVG1의 2,320bpBgℓII-StuI 단편을 pSIVG4의 6,100bp 부분BgℓII-StuI 단편에 클로닝시켰다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pSIVG5라 부른다.
pSIVG5는 레스큐 바이러스로서 vP866 (NYVAC)와의 재조합 실험에서 사용하여 vP1042를 얻었다.
vP1042 감염된 세포와의 면역침전 실험을 SIV env 및gag전구체 단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행하였다. SIV-특이적 종은 모의 감염되거나 NYVAC 감염된 VERO 세포로부터 침전되지 않았다. 그러나gag전구체 단백질, 또한 여러중간체 및 성숙한gag절단 생성물에 해당하는 단백질종은 vP1042 감염된 세포의 용해물로부터 침전되었다.
실시예 113
NYVAC/SIV gag/poℓ 및 env (gp120-gp41) 재조합체의 발생
pSIVG5 (실시예21)을 레스큐 바이러스로서 vP1050과의 재조합 실험에서 사용하여 vP1071을 얻었다.
vP1071 감염된 세포와의 면역침전 실험은 SIV 유전자의 발현을 나타낸다.
실시예114
NYVAC/SIV gag/poℓ 및 env (gp120-gp28) 재조합체의 발생
pSIVG5 (실시예21)을 레스큐바이러스로서 vP874와의 재조합 실험에서 사용하여 vP943을 얻었다.
vP943 감염된 세포와의 면역침전 실험은 SIV env 및 gag 전구체 단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행하였다. SIV-특이적 종은 모의 감염된 VERO 세포로부터 침전되지 않았다. 그러나 env 및gag전구체 단백질, 또한 여러 중간체 및 성숙한gag절단생성물에 해당하는 단백질 종이 vP943 감염된 세포의 용해물로부터 침전되었다.
실시예 115
NYVAC/SIV p16, p28 재조합체의 발생
vP942 (실시예21) 감염된 세포들로 면역침전 실험을 SIV env 및gag전구체 단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행하였다. SIV-특이적 종은 모의 감염된 VERO 세포로부터 침전되지 않았다. 그러나 p16 및 p28에 해당하는 단백질 종은 vP942 감염된 세포의 용해물로부터 침전되었다.
실시예116
NYVAC/SIV p16, p28 및 env (gp120-gp28) 재조합체의 발생
vP952(실시예21) 감염된 세포들로 면역침전실험을 SIV env 및gag전구체 단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행하였다. SIV-특이적 종은 모의 감염된 VERO 세포로부터 침전되지 않았다. 그러나 env 및 p16 및 p28에 해당하는 단백질 종은 vP952 감염된 세포의 용해물로부터 침전되었다.
실시예 117
NYVAC/SIV env (gp120-gp41) 재조합체의 발생
플라스미드 pSIVEMVC는 H6-프로모터 전사되는 SIVMAC142외피유전자(시험관내 선별된 절두형 변형)를 함유한다. 미리 성숙한 종결코돈을 함유하는 외피유전자의 영역을 pBSK+에 클로닝시켰다. 이것은 pSIVEMVC의 1,120bpCℓaI-BamHI 단편을 pBSK+의CℓaI-BamHI 부위에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pSIV10이라 부른다.
그 다음 상류 종결코돈, TAG를 원래의 CAG 코돈으로 변화시켰다. 이것은 올리고뉴클레오티드, SIVL20 (SEQ ID NO: 466)(5'- CTAGCTAAGTTAAGGCAGGGGTATA-GGCCAGTGTTCTCTTCCCCACCCTCTTATTTCCAGCAGACTCATACCCAACAG -3') 및 SIVL 21 (SEQ ID NO: 467)(5'-GTCCTGTTGGGTATGAGTCTGCTGGAAATAAGAGGGTGGGGAAGAGAACACTGGCCTATACCCC-TGCCTTAACTTAG-3')를 pSIV10의 4,000bpNheI-PpuMI 단편에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pSIV11이라 부른다.
그 다음 변형된 코돈을 함유하는 영역을 pSIVEMVC에 되클리닝시켰다. 이것은 변형된 코돈을 함유하는 pSIV11의 380bp BgℓII-NheI 단편을 pSIVEMVC의 5,600bp 부분 BgℓII-NheI 단편에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드를 pSIV12라 부른다.
pSIV12를 레스큐 바이러스로서 vP866(NYVAC)와의 시험관내 재조합 실험에서 사용하여vP1050을 얻었다.
vP1050 감염된 세포들로 면역침전 실험을 SIV env 및gag전구체 단백질의 발현에 대해 상기한 바와같이 수행하였다. SIV-특이적 종은 모의 감염되거나 NYVAC 감염된 VERO 세포로부터 침전되지 않았다. 그러나 env에 해당하는 단백질종은 vP1050 감염된 세포들의 용해물로부터 침전되었다.
실시예 118
ALVAC에서 SIV 유전자의 발현
ALVAC/SIV gag/poℓ재조합체의 발생.
SIVMAC142cDNA 서열을 함유하는 플라스미드, pSIVGAGSSIIG를 닥터 프란치니 (Dr. G. Franchini)(NCI-NIH)로부터 얻었다. 이 플라스미드로부터gag및poℓ유전자를 I3L 프로모터의 하류에 및 우두 바이러스 측면부 암 사이에서 클로닝시켰다. 이것은 상기한 바와같이 (실시예 21 참조) 플라스미드 pSIVG5를 초기에 제조함으로써 달성되었다.
그 다음gag/poℓ유전자를 카나리아폭스 측면부 암 사이에서 클로닝시켰다. 이것은 I3L-프로모터 구동되는gag/poℓ유전자를 함유하는 pSIVG5의 4,500bpSmaI-NotI 단편을 pC5L (실시예44에 정의됨)의SmaI-NotI 부위에 클로닝시킴으로써 달성되었다. 이 조작에 의해 발생된 플라스미드는 pSIVGC13이라 부른다.
pSIVGC13을 레스큐 바이러스로서 CPpp (ALVAC)와의 재조합 실험에서 사용하여 vCP172를 얻었다.
vCP172 감염된 세포와의 면역침전실험은 SIV 유전자의 발현을 나타내었다.
실시예 119
광견병 당단백질(ALVAC-RG(vCP65)을 발현하는 카나리아폭스를 사용하는 사람의 면역화
ALVAC-RG (vCP65)를 실시예15 및 도 17에 기술된 것과 같이 제조하였다. 스케일 업 및 백신제조를 위해, ALVAC-RG (vCP65)를 명시된 병원균 없는 계란으로부터 1차 CEF에서 성장시켰다. 세포들을 0.01의 증식도로 감염시키고 37 ℃에서 3 일간 인큐베이션시켰다.
백신 바이러스 현탁액은 감염된 세포의 혈청없는 배지에서 초음파 붕괴에 의해 얻었으며, 그 다음 세포 부스러기를 원심분리 및 여과에 의해 제거하였다. 결과된 정화된 현탁액을 동결건조 안정제(아미노산의 혼합물)를 보충하고, 1 회 투여량 바이알에 조제하고 동결 건조시켰다. 동결건조에 앞서 혈청없는 배지와 동결건조 안정제의 혼합물중의 바이러스 현탁액의 10배 일련의 희석액에 의해 감소하는 역가의 3개의 배치를 제조하였다. 우발적 병원체 및 실험동물에의 무해성에 대한 조사를 주안점으로하여 세포기질, 배지 및 바이러스 종자 그리고 최종생성물에 품질관리 시험을 적용하였다. 원하는 특성은 발견되지 않았다.
임상전 데이타
생체외에서의 연구는 VERO 또는 MRC-5 세포가 ALVAC-RG(vCP65)의 성장을 지지하지 않으며, 일련의 8(VERO) 및 10(MRC) 블라인드 연속 계대배양은 이들 비조류 세포주에서 성장하기 위한 바이러스의 검출할만한 순응을 일으키지 않았다. 사람 세포주의 분석(MRC-5, WISH Detroit 532, HEL, HNK 또는 EBC 형질전환된 임파아구 ALVAC-RG (vCP65))은 이들 세포에서 DNA 합성에 앞서 복제에 차단이 일어남을 제안하는 바이러스 특이적 DNA의 축적을 나타내지 않았다. 그러나, 중대하게 모든 세포주에서 광견병 바이러스 당단백질 유전자의 발현을 시험한바 카나리아폭스 복제사이클에서 발육부전 단계가 바이러스 DNA 복제에 앞서 일어남을가리켰다.
ALVAC-RG (vCP65)의 안전성과 효율은 동물에서 일련의 실험에서 증명되었다. 카나리아, 닭, 오리, 거위, 실험동물(새끼 및 성숙한 마우스), 햄스터, 기니아피그, 고양이와 개, 다람쥐 원숭이, 리서스 짧은꼬리 원숭이 및 침팬지를 포함하는 많은 종들에 105내지 108pfu 범위의 투여량으로 접종하였다. 다양한 경로를 사용하였으나, 가장 통상적으로 피하, 근육내 및 경피 뿐만아니라 경구(원숭이 및 마우스) 및 뇌내(마우스) 경로를 사용하였다.
카나리아에서 ALVAC-RG(vCP65)는 질병 또는 사망의 징후없이 난자 부위에서 '선감(take)' 손상을 일으켰다. 토끼의 경피접종은 퍼지지않고 7일 내지 10 일에 치유되는 전형적인 폭스바이러스 접종반응을 가져왔다. 어떤 동물시험에서도 카나리아 폭스로 인한 불리한 부작용은 없었다. 면역원성은 신속한 형광 초점 억제시험(RFFIT)에 의해 측정한 바 설치동물, 개, 고양이 및 영장류에서 ALVAC-RG(vCP65)의 접종에 이은 항 광견병 항체의 개발에 의해 증명되었다. ALVAC-RG(vCP65)로 면역된 마우스, 개 및 고양이에서 광견병 바이러스 공격(challenge) 실험에 의해 보호도 또한 증명되었다.
지원자
광견병 면역의 사전 병력이 없는 20-45세의 건강한 성인 25 명을 등록하였다. 그들의 건강한 상태를 완벽한 진료기록, 신체검사, 혈액학적 및 혈액화학분석에 의해 평가하였다. 제외 평가기준은 임신, 알레르기, 모든 종류의 면역 저하, 만성쇠약질환, 암, 최근 3개월내의 면역글로빈의 주사, 및 사람 면역결핍 바이러스 (HIV)에 또는 B형 간염 바이러스 표면항원에의 혈청 양성을 포함하였다.
연구계획
참여인들을 무작위 배분하여 표준 사람 이배체 세포 광견병 백신(HDC) 배치 E0751(Pasteur Merieux Serums & Vaccine,Lyon, France)나 아니면 연구용 백신 ALVAC-RG(vCP65)를 받게하였다.
이 시도를 투여량 단계적 상승연구라 칭하였다. 실험용 ALVAC-RG(vCP65)백신의 3개의 배치를 세그룹의 지원자(A, B 및 C 그룹)에게 연속해서 각 단계 사이에 2주 간격으로 사용하였다. 3 개의 배치의 농도는 각각 103.5, 104.5, 105.5조직배양 감염성 투여량(Tissue Culture Infectious Dose)(TCID50)/투여량이었다.
각 지원자는 4주의 간격으로 삼각근 영역에 피하에 2투여량의 같은 백신을 받았다. 주사된 백신의 성질은 첫번 주사시기에 참여인들이 알지 못했으나 조사자에 의해 알게 되었다.
두번째 주사시에 즉각적인 과민반응의 위험을 최소화하기 위해, 중간투여량의 실험용 백신에 분배된 B그룹의 지원자들에게 더 낮은 투여량으로 1시간 앞서 주사하고 더 높은 투여량에 할당된 사람들(C 그룹)에게 1시간 간격으로 계속해서 낮은 투여량과 중간 투여량을 받게 하였다.
6 개월후, 가장 높은 투여량의 ALVAC-RG (vCP65)(C 그룹) 및 HDC 백신 받은 사람에게 세번째 투여량의 백신을 제공하였고 그다음 무작위적으로 앞서와 같은 백신이나 아니면 교체 백신을 받게하였다. 그 결과, 다음의 면역체계에 해당하는 4개의 그룹이 형성되었다:
1. HDC, HDC-HDC;
2. HDC, HDC-ALVAC-RG (vCP65);
3. ALVAC-RG(vCP65), ALVAC-RG(vCP65)-HDC;
4. ALVAC-RG(vCP65), ALVAC-RG(vCP65), ALVAC-RG(vCP65).
부작용의 감시
모든 환자들을 주사후 1시간동안 감시하고 그 다음 5일간 매일 재진찰하였다. 그들에게 물어서 다음 3주간의 국소 및 전신 반응을 기록하고 1주에 두번씩 전화로 물었다.
실험실 조사자
혈액견본을 등록전과 각 주사 2일후, 4 일후 및 6일후 얻었다. 분석은 전체 혈세포계수, 간 효소 및 크레아틴 키나제 분석을 포함하였다.
항체분석
항체분석은 첫번주사에 7일 앞서 수행하고 연구 7일째, 28일째, 35일째, 56일째, 173일째, 187 일째 및 208일째에 수행하였다.
광견병에 대한 중화항체의 수준을 신속 형광 초점 억제시험(RFFIT)(Smith & Yaeger,InLaboratory Techniques on Rabies)를 사용하여 결정하였다. 카나리아폭스 항체를 직접 ELISA에 의해 측정하였다. 항원, 즉 0.1% Triton×100으로 붕괴시킨 정제된 카나리아폭스 바이러스의 현탁액을 마이크로 플레이트에 발랐다. 고정된 항체 희석액을 실온에서 2시간동안 반응시켰고 퍼옥시다제 표지된 항-사람 IgG 염소 혈청으로 반응하는 항체가 나타났다. 결과는 490nm에서 광학 밀도로서 나타낸다.
분석
25명의 환자를 등록하고 연구를 완결하였다. 남자 10명 여자 15명이었고 평균연령이 31.9세(21 내지 48세)이었다. 단지 3명의 환자가 이전에 마마 백신접종의 증거가 있었고 3명의 나머지 환자들은 대표적인 우두자국이나 백신접종역사를가지고 있지 않았다. 세명의 환자에 낮은 투여량의 실험용 백신(103.5및 104.5TCID50)을 각각 받게하였고, 9 명의 환자는 105.5TCID50을 받았고 10명은 HDC 백신을 받았다.
안전성 (표 49)
1 차 시리즈의 면역화의 동안에 한명의 HDC를 받은 환자 (37.8℃)와 한명의 vCP65 105.5TCID50을 받은 환자 (38℃)에서 주사후 24시간내에 37.7℃가 넘는 열병이 관찰되었다. 백신접종에 기인한 다른 전신반응은 어떤 참여자에서도 관찰되지 않았다.
국소반응은 피하주사받은 HDC 백신을 받은 환자 9/10명과 vCP65 103.5, 104.5, 105.5TCID50을 받은 환자 0/3, 1/3 및 9/9 명에서 각각 관찰되었다.
신경과민이 가장 공통된 증상이었으나 항상 경증이었다. 다른 국소증상은 발적 및 경변을 포함하였으나 이것 또한 가볍고 일시적이었다. 모든 증상은 보통 24시간 내에 가라앉았고 결코 72시간 이상 지속되지 않았다.
혈세포수, 간 효소 또는 크레아틴 키나제 값에는 상당한 변화는 없었다.
면역반응: 광견병에 중화하는 항체 (표 50)
첫번 주사 28일후 모든 HDC를 받은 환자는 보호역가(≥ 0.5 IU/㎖)를 가졌다. 반대로 A 및 B 그룹 (103.5및 104.5TCID50)에서는 아무것도, C 그룹 (105.5TCID50) ALVAC-RG(vCP65)를 받은 환자에서 단지 2/9명만이 이 보호역가에 이르렀다.
56일째에 (즉 두번째 주사 28일후) 보호역가는 AVLAC-RG(vCP65) 백신을 받은 환자 A 그룹의 0/3, B 그룹의 2/3 및 C 그룹의 9/9에서 달성되었고 모든 10명의 HDC를 받은 환자에서 지속되었다.
56일째에 기하평균역가는 각각 A, B, C 및 HDC 그룹에서 0.05, 0.47, 4.4 및 11.5 IU/㎖이었다.
180일째에 광견병 항체역가는 모든 환자에서 실질적으로 감소하였으나 5/10 HCD를 받은 환자에서와 5/9 ALVAC-RG(vCP65) 받은 환자에서 0.5 IU/㎖의 최소 보호역가 위로 남아있었고 기하평균 역가는 각각 HCD 및 C 그룹에서 0.51 및 0.45 IU/㎖이었다.
카나리아폭스 바이러스에 대한 항체 (표 51)
관찰된 면역역가는 최고 역가를 가진 이들 환자에서 카나리아 새와 어떤 사전 접촉이 없음에도 불구하고 0.22 내지 1.23 O.D.단위로 다양한 역가로 크게 다양해졌다. 사전면역과 두번째 주사후 역가간에 두배이상 증가로 정의했을 때, 혈청전환은 B 그룹에서 1/3 환자들과 9/9 환자들에서 얻어진 반면, A 그룹 또는 HDC 그룹에서는 혈청전환된 환자가 없었다.
추가접종(booster) 주사
백신은 마찬가지로 추가접종 시기인 6개월후까지 항균성이 있었으며, 2/9 HDC 추가접종 받은 환자들과 1/10 ALVAC-RG(vCP65) 추가접종 받은 환자에서 열병이 관찰되었다. 국소반응이 HDC 추가접종 받은 환자 5/9와 ALVAC-RG(vCP65) 추가접종받은 환자 6/10에서 존재하였다.
관찰
도 35는 광견병 중화항체역가의 그래프 (신속형광초점억제시험 또는 RFFIT, IU/㎖): 즉, 같은 백신 또는 교체백신으로 이전에 면역화된 지원자들에서의 HDC 및 vCP65(105.5TCID50)의 추가접종 효과를 나타낸다. 백신은 0일째, 28일째 및 180일째에 주어졌다. 항체역가는 0, 7, 28, 35, 56, 173, 및 187과 208일째에 측정하였다.
도 35에 나타낸 바와 같이, 주어진 추가접종 투여량은 면역체계마다 모든 환자에서 광견병 항체역가에 있어서 더 증가를 가져왔다. 그러나, 세계적으로 HDC 추가접종 및 ALVAC-RG (vCP65), ALVAC-RG(vCP65)-ALVAC-RG(vCP65) 그룹보다 더 낮은 면역반응을 유도하는 ALVAC-RG(VCP65) 추가접종은 세 다른 그룹보다 상당히 더 낮은 역가를 가졌다. 마찬가지로, ALVAC-RG(vCP65) 추가접종 주사는 HDC 백신을 사전에 받은 3/5 환자들에서와 ALVAC-RG (vCP65)로 사전면역된 모든 다섯 환자들에서 카나리아폭스 항체역가의 증가를 가져왔다.
일반적으로, vCP65의 투여로부터의 국소적 부작용의 어느것도 바이러스의 국소적 복제를 나타내지 않았다. 특히, 백신의 주사후 관찰된 것들과 같은 피부의 손상이 없었다. 바이러스의 복제가 명백히 없었음에도 불구하고 주사는 카나리아폭스 벡터와 발현된 광견병 당단백질 둘다에 대한 상당량의 항체를 발생시키는 지원자들을 가져왔다.
광견병 중화항체는 마우스에서 혈청중화시험과 잘 상관되는 것으로 알려진 신속형광 초점억제시험(RFFIT)으로 분석하였다. 105.5TCID50을 받은 9명의 환자중 5명은 첫번 투여량후 낮은 수준의 반응을 나타냈다. 광견병 항체의 보호역가는 시험한 최고 투여량을 받은 모든 환자들에서와 중간 투여량을 받은 3명중 2명의 환자에서도 두번째 주사후 얻어졌다. 이 연구에서, 두 백신은 5개 백신에 대해 보통 권장되나, 불활성화된 HDC 백신에 대해서는 권장되지 않는 바와 같이 피하에 주어졌다. 이 주사경로는 주사 부위의 주의깊은 조사를 가장 잘 허용하기 때문에 선택되었으나, 이것은 HDC 받은 환자에서 항체의 더딘 출현을 설명할 수 있으며, 참으로, HDC 받은 환자중 아무도 7일째에 항체증가를 갖지 못하였고, 한편 HDC 백신이 근육내에 주어진 대부분의 연구에서는 상당한 비율의 환자가 갖는다(Klietmann et al., Int'l Green Cross-Geneva, 1981; Kuwert et al., Int'l Green Cross-Geneva, 1981).그러나, 이 발명은 반드시 피하투여경로로 제한하지 않는다.
광견병 중화항체의 GMT (기하평균역가)는 HDC 조절백신으로보다는 조사용 백신으로 더 낮았으나, 여전히 보호에 요구되는 최소역가 보다는 위였다. 본 연구에서 사용된 세 투여량으로 얻은 분명한 투여량 효과반응은 더 높은 투여량이 더 강한 반응을 유도함을 제안한다. 본 명세서로부터 확실히 당업자는 주어진 환자에 대한 적당한 투여량을 선택할 수 있다.
항체반응을 추가접종하는 능력은 이 실시예의 또다른 중요한 결과이며, 참으로, 광견병 항체역가의 증가가 면역체계가 어떻든지 6개월 투여량후 모든 환자에서 얻어졌으며, 카나리아폭스 벡터나 아니면 광견병 당단백질에 의해 유도된 사전존재하는 면역성은 재조합 백신후보 또는 종래의 HDC 광견병 백신으로 추가접종에 대한 차단효과가 없음을 나타내었다. 이것은 면역반응이 사전존재하는 면역성에 의해 차단될 수도 있다는 사람에서 우두 재조합체로한 다른 발명자들의 발견과는 반대된다(Cooney et al, Lancet 1991, 337:567-72; Etlinger et al, Vaccine 1991, 9:470-72).
따라서, 이 실시예는 비복제 폭스바이러스가 사람에서 면역 벡터로서 제공될 수 있으며 복제제가 면역 반응을 초래하나, 충분히 허용된 바이러스에 의해 조장되는 안전성 문제없이 모든 이점들을가지고 있다.
백신접종이래 5일내의 반응
광견병 중화항체(REFIT; IU/㎖) 개인별 역가 및 기하평균역가(GMT)
카나리아폭스 항체: ELISA 기하평균역가*
실시예 120-NYVAC-JEV 재조합체(vP908, vP923)에 의한 일본뇌염 바이러스에 대한 보호
NYVAC-JEV 재조합체를 사용하여, 일본뇌염 바이러스에 대한 보호를 제공하였다. NYVAC vP866, NYVAC 재조합체 vP908 및 vP923, 그리고 우두 재조합체 vP555 및 vP829가 여기 기술한대로 제조되었다.
마우스 보호실험
마우스 보호실험을 앞서 기술한 대로 (Mason et al., 1991) 수행하였다. 간단히, 10 내지 12마리의 4주생 이계교배된 스위스 마우스 그룹을 vP829, vP866, vP908 또는 vP923의 10?? PFU로 복강내(i.p.) 주사에 의해 면역시키고 3주후 혈청을 수집하였다. 마우스를 JEV의 베이징(Beijing) P3 균주로 복강내 주사에 의해 공격하였다. 공격에 이어서 마우스를 1일 간격으로 실험이 3주후 결론이 날 때까지 관찰하였다. 실험동물의 한 배 새끼들을 사용하여 치사량 적정을 수행하였다.
돼지 보호실험
약 25kg 체중의 랜드레이스(Landrace) 이종교배 거세된 돼지를 사용하였다. 5 마리 돼지를 인산염 완충식염수(PBS), 또는 PBS 2㎖에서 희석된 vP866, vP908 또는 vP923의 1 x 108PFU로 피하(s.c.) 주사에 의해 면역시켰다. 접종 28일후, 돼지를 상기한 바와 같은 방법으로 추가접종 주사하였고 첫번 접종 56일후 그것들을 JEV의 B-2358/84 균주의 2 x 105PFU로 피하주사에 의해 공격하였다. 혈청을 0(면역전), 7, 14, 21, 28 (추가접종 주사전), 31, 35, 42, 56(공격전), 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 및 76일째 (공격후)에 모든 그룹에서 동물들로부터 혈청을 수집하였다.
면역반응의 평가
돼지혈청을 Bonishi et al. (1991)에 기술된 바와 같이 하되, 항―돼지 면역 글로불린(Ig) G (DAKO Corp., Carpinteria, California)로 피복된 고정된Staphylococcus aureus박테리아를 사용하여 [35S]Met-표지된 JEV 감염된 세포들로부터 얻은 세제처리된 세포 용해물 또는 배양액으로부터 JEV 단백질을 침전시키는 능력에 대해 시험하였다. 돼지 및 마우스 사전 공격혈청에 대한 HAI 시험을 클라크 및 카살스(Clarke and Casals)(1958)의 방법의 변형에 의해 수행하였다. NEUT 시험을 메이슨 외(Mason et al.)(1991)의 방법에 의해 기술된 바와 같이 하되, 돼지혈청을 시험하기 위해 새로 녹인 사람혈청을 사용하지 않았다.
바이러스 혈증
JEV 공격후 8일동안 수집된 새로 녹인 알리근의 돼지혈청을 6-웰 마이크로플레이트에서VERO 단일층 세포상의 감염성 JEV에 대해 플라크 적정시켰다. 바이러스 흡착에 이어서, 세포 단일층을 1% 카르복시메틸셀룰로오스를 함유하는 배지위에 놓고 플라크를 감염후 5일에 20%에탄올에 용해된 0.1% 결정 바이올렛으로 염색하여 시각화하였다. 셋 또는 그 이하의 플라크가 혈청 300μℓ와 배양된 웰에서 관찰된다면, 역가는 ＜10 PFU/㎖로 기록되었다.
재조합체 우두 바이러스의 구조
이 연구에서 제조된 우두 재조합체에 함유된 JEV cDNA 서열을 도 36에 나타내었다. 이 재조합 바이러스에서 JEV cDNA의 혈청 스트랜드를 초기/나중 H6 프로모터 뒤에 위치시켰다. 재조합 vP908(및 vP555; Mason et al., 1991)은 prM의 N-말단에 선행하는 추정상의 15개 아미노산 신호서열, prM, E, NS1 및 NS2A를 포함한다. 재조합체 vP923 (및 vP828; Konishi et al., 1991)은 prM의 추정상의 신호서열, prM, 및 E를 코드화한다.
재조합체 우두 바이러스에 의한 E 및 NSI의 합성
E 또는 NS1 유전자의 면역침전을 E 또는 NS1에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 수행하였다. E MAb와 반응성인 단백질들은 vP555, vP908 및 vP923으로 감염된 세포들에서 합성되었고 NS1 MAb와 반응성인 단백질들은 vP555 및 vP908로 감염된 세포에서 합성되었으나 vP923으로 감염된 세포에서는 합성되지 않았다. vP555 감염된 세포들은 세포의 안 및 밖에 정확한 형태의 E 및 NS1을 생성하였다. vP908 및 vP923에 의해 생성된 단백질들은 vP555에 의해 생성된 것들과 크기가 동일하였다. E 및 NS1 둘다에 대해, 세포로부터의 방출에 바로 선행하는 N-결합된 글리칸의 성숙과 일치하여 SDS-PAGE에서 세포내 형태보다 더 느리게 이동하였다. 게다가, vP908 감염된 세포들은 고분자량 형태의 NS1, NS1'를 생성하였는데, 이것은 JEV 게놈(Mason et al., 1987)의 NS2A 영역에 의해 코드화된 서열의 또다른 처리과정에 의해 유도된다. M(및 prM)에 특이적인 MAb를 사용하여 방사성 표지된 우두 재조합체 감염된 세포들로부터 제조된 면역침전물은 prM이 vP908 및 vP923으로 감염된 세포들에서 합성되었음을 나타내었다.
vP908 또는 vP923 감염된 HeLa 세포들의 세포외 액은 vP866 감염된 세포의 배양액에서 검출불가능한 HA 활성을 나타내었다. 데이타는 vP829가 vP555(Konishi et al., 1991) 보다 대략 8배 더 세포외 헤마글루티닌의 합성을 유도하였음을 가리켰다. 이 차이와 병행하여, vP923으로 감염된 세포들은 vP908로 감염된 세포들보다 대략 8배 더 HA 활성을 생성하였다. 이들 결과는 vP980과 vP923에 의해 생성된 JEV 단백질의 재조합체 형태는 각각 vP555와 vP829에 의해 생성된 것들과 동등함을 가리켰다.
마우스의 면역화 및 공격
보호 면역성을 유발하는 NYVAC 기초 재조합체 바이러스의 능력을 마우스에서 조사하였다. 공격 전혈청에 대한 NEUT 및 HAI 데이타는 vP908과 vP923이 vP829와 같은 수준의 항체를 생성하였음을 가리켰다 (표 52) (Konishi et al, 1991). 이들 혈청학 데이타와 일치하여, vP908과 vP923은 JEV의 병원균 P3 균주에 의해 치사 JEV 감염으로부터의 보호를 가진 마우스를 제공할 수 있었다 (표 52). 보호의 수준은 vP829와의 면역에 의해 달성된 것과 유사하였다. 이들 연구는 두 NYVAC 기초 재조합체인 vP908과 vP923이 앞서 기술된 것들(Konishi et al., 1991)과 유사한 수준으로 마우스에서 면역원성이 있었음을 확인하였다.
재조합체 우두 바이러스에 의한 돼지에 JEV 항원에 대한 면역반응의 도입
매 7일마다 수집된 각 그룹에서의 모든 돼지로부터 수집된 사전 공격 혈청을 항 JEV NEUT 및 HAI 활성에 대해 시험하였다. 도 37에서 나타낸 바와 같이, NEUT 및 HAI 둘다의 활성이 vP908 및 vP923으로 면역된 돼지에서 관찰되었으나, pBS 또는 vP866으로 접종된 돼지에서 관찰되지 않았다. 비교적 높은 수준의 NEUT 항체는 vP908과 vP923 둘다 면역된 돼지에서 첫번 및 두 번째 접종 7일후 관찰되었고 21일후 검출하기 힘든 수준으로 감소되었다. 1 차 접종과 추가접종 둘다에 대해, HAI는 NEUT 항체보다 더 느리게 감소하였다 (도 37). vP908은 vP923 보다 약간 더 높은 수준의 HAI 및 NEUT 항체를 제공하였다. 두 재조합체들과의 HAI 역가는 1회 접종후 달성된 것보다 2회 접종후 더 컸다. vP923은 1회 접종시보다 2회 접종후 더 높은 NEUT 역가를 제공한 반면, vP908은 1회 또는 2회 접종후 동등한 NEUT 역가를 유발하였다.
돼지를 0일째 및 28일째에 면역시키고 PBS 또는 vP866으로 면역된 돼지로부터 56일째에 그리고 vP908 또는 vP923으로 면역된 돼지로부터 0, 7, 28, 35 및 56일째에 혈청을 수집하였다. 5 마리의 각 그룹에서 모든 동물들로부터 수집된 혈청들을 JEV-감염된 세포들의 배양액으로부터 수확된 방사성 표지된 단백질들을 면역침전시키는 능력에 대해 시험하였다.
E에 대한 면역반응은 NEUT 및 HAI 시험의 결과와 잘 상관되었다. 35일째에 vP923으로 면역된 돼지에 관찰된 E에 대한 RIP 반응은 vP908로 면역된 돼지에서 관찰된 E에 대한 RIP 반응은 vP908로 면역된 돼지에서 E에 대한 RIP 반응보다 더 높은반면, 35일째에 HIA 역가는 두 그룹에서 동등하였다. 그러나, 35일째에 NEUT 역가는 vP908로 면역된 돼지에서 보다 vP923으로 면역된 돼지에서 더 높았다. NEUT 또는 HAI에 수반된 것들 이외의 항체들이 유도될 수도 있으나 RIP 분석의 정량적 관점은 더이상 유효하지 않았다. 비교적 높은 NEUT 항체역가에도 불구하고 7일째에 E에 대한 항체의 약한 RIP 반응은 면역후 초기에 IgM 항체에 의해 설명될 수 있다. JEV-특이적 IgM의 수준은 더이상 분석되지 않았다. 수집된 혈청의 어떤 것도 NS1에 대한 면역반응을 나타내지 않았다.
재조합체 우두 바이러스로 면역된 돼지에서의 바이러스 혈증
10 PFU/㎖의 JE 바이러스 역가가 대조 돼지 [PBS(4/5) 또는 vP866(5/5)]로부터의 공격후 혈청에서 검출된 한편, vP923으로 접종된 5마리 돼지중 단지 2마리가 >10 PFU/㎖의 바이러스 혈증을 나타내었다 (도 38). 중대하게도, vP908로 면역된 5마리 돼지중 어느것도 >10 PFU/㎖의 측정할만한 바이러스 혈증을 갖지 않았다. PBS와 vP866(1.2 x 103PFU/㎖)으로 면역된 그룹들에서 개개 돼지에서의 최대 바이러스 역가의 기하평균은 vP908과 vP923으로 면역된 그룹에서의 평균 (1.9 x 101PFU/㎖; P＜0.001 스튜던트 t-테스트; ＜10 PFU/㎖의 바이러스 혈증을 가진 모든 돼지에 대해 10 PFU/㎖의 역가를 가정함) 보다 상당히 더 높았다. 더욱이, 바이러스 ㎖당 >10 PFU를 나타내는 돼지에 대한 바이러스 혈증의 평균기간은 PBS 및 vP866에 대해 2.7일, >10 PFU/㎖의 역가를 가진 두 vP923 면역된 돼지에 대해 2.0 일이었다. 이들 결과는 vP908 및 vP923의 면역이 공격후 JEV 바이러스 혈증을 상당히 감소시켰음을 가리킨다.
JEV 공격에 대한 면역반응을 평가하기 위해, 본 발명자들은 JEV에 대한 항체에 대한 공격후 20일에 수집된 개개혈청들을 시험하였다. vP908 또는 vP923으로 백신접종한 돼지는 PBS 또는 vP866으로 접종한것들 보다 E에 대해 더 높은 반응을 가졌고 공격전에 존재한 E에 대한 항체반응이 JEV 주사에 의해 추가접종 접종되었음을 가리킨다. 재조합체 우두에서 발현되지 않은 JEV 단백질들인 NS3 및 NS5에 대한 반응은 모든 공격후 혈청들에서 검출되어, ＜10 PFU/㎖의 바이러스 혈증을 가진 돼지들에서도 약간의 수준의 JEV 복제가 일어났음을 제안한다. 따라서, NS3에 대한 공격후 혈청의 반응성과 혈청 JEV 역가에 의해 측정한 바 감염없음 간의 예상된 역비례관계가 관찰되지 않았다. 이것은 공격후 NS3에 대한 수집된 마우스 혈청의 반응성의 결핍이 보호와 상관되는 (Konishi et al., 1991) 마우스로 얻은 이전 데이타와 반대이다.
보호실험의 동안에, 어버이 우두(vP866) 그룹에서 1마리의 돼지가 공격 12일후 죽였다. 이 동물은 공격후 기간동안에 어떤 다른 돼지보다 더 높은 체온을 나타내었고 3일동안 >1,000 PFU의 JEV 혈청역가를 가진 유일한 동물이었다 (도 38). 시체 해부시 샘플취한 뇌견본으로부터 JEV가 검출되지 않았으나, 동물은 JEV 감염으로 인한 질병으로 죽었을 것이다.
관찰
실시예는 NYVAC-JEV가 JEV 바이러스 혈증에 대한 효과적인 보호를 제공하며 따라서 NYVAC-JEV는가축병 치료이용분야에 유용하고 안전하다.
마우스에서의 면역화 및 JEV 공격
a4-주된 마우스 그룹을 면역화하는데 사용한 우두 재조합 바이러스b플라크 수의 90% 감소를 일으키는 혈청 희석( Mason 등, 1991)c혈청 희석d생존수/ 공격받은 수 (생존 %).
면역화 3주후에 Beijing P3 균주로 각 그룹의 마우스를 공격하였다.
마우스의 리터-메이트를 이용한 치사량 역가측정으로 결정한 결과 공격량은 3.8 x 105LD50이었다.
실시예 121-NYVAC (vP866) 및 NYVAC-RG (vP879)의 평가 면역침전
미리형성된 조류 또는 비-조류세포의 단층에 어버이 NYVAC (vP866) 또는 NYVAC-RG (vP879) 바이러스를 세포당 10pfu로 접종하였다. 접종은 메티오닌이 없고 2%의 투석된 소 태아 혈청이 첨가된 EMEM에서 수행하였다. 1시간동안 배양한 후, 접종액을 제거하고, 배지를35S-메티오닌 20μCi/㎖을 함유하는 EMEM (메티오닌 없음)으로 대체하였다. 대략 16시간동안 밤새 배양한 후, 완충액 A(1% Nonidet P-40, 10mM Tris pH 7.4, 150mM NaCℓ, 1mM EDTA, 0.01% 소디움 아지드, ㎖당 500 단위의 아프로티닌, 및 0.02% 페닐메틸 술포닐 플루오라이드)를 첨가하여 세포를 용해시켰다. Dr. C. Trinarchi, Griffith Laboratories, New York State Department of Health, Albany, New York에서 구입한, 24-3F10으로 명명된 광견병 당단백질 특이성 모노클로날 항체 및 Boehringer Mannheim Corporation (Cat. #605-500)에서 구입한 마우스 항―마우스 콘주게이트를 이용하여 면역침전을 수행하였다. 단백질 A 세파로스 CL-48을 Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, New Jersey에서 구입하여 지지물 매트릭스로 사용하였다. Dreyfuss 등 (1984)의 방법에 따라 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 면역침전물을 분획하였다. 겔을 고정시킨 후, 형광사진법을 위해 1M Na-살리실레이트로 1시간동안 처리하고, 이어서 면역침전된 단백질 종이 보이도록 Kodak XAR-2 필름에 노출시켰다.
동물의 공급원
뉴질랜드 흰토끼는 Hare-Marland(Hewitt, New Jersey)에서 구입하였다. 3주된 수컷 스위스 웹스터 이계교배 마우스, 시간이 정해진 수태중의 암컷 스위스 웹스터 이계교배 마우스, 및 4주된 스위스 웹스터 누드 (nu+nu+) 마우스는 Taconic Farms, Inc. (Germantown, New York)에서 구입하였다. 모든 동물을 NIH 지침에 따라 유지하였다. 모든 동물의 실험계획안은 IACUC 협회에 의해 증명되었다. 필요하다고 생각되는 경우, 분명히 병의 말기에 있는 마우스는 안락사시켰다.
토끼의 병변 평가
각각의 두마리 토끼에 104, 105, 106, 107또는 108pfu의 각 테스트 바이러스를 함유하는 PBS 0.1㎖ 또는 PBS만을 여러부위에 내피접종하였다. 4 일째부터 병변이 없어질 때까지 매일 토끼를 관찰하였다. 경결(Indurations) 및 궤양을 관찰하고 기록하였다.
접종부위로부터 바이러스의 회수
한 마리의 토끼에 각 테스트 바이러스의 106, 107또는 108pfu를 포함하는 PBS 0/1 ㎖ 또는 PBS 만으로 여러부위에 피하접종하였다. 11일 경과 후, 토끼를 안락사시키고 기계적 파괴에 의해 무균적으로 피부생검표본을 준비한 후 간접적으로 초음파분쇄를 하여 바이러스를 회수하였다. CEF 단층에서 플라크의 역가측정으로 감염성 바이러스를 분석하였다.
마우스에서의 독성
누드 마우스 실험에서 열마리 또는 다섯마리의 그룹을 멸균된 PBS 0.5㎖중의 수개의 바이러스 희석액중 하나로 복강내에 접종하였다. 실시예 24와도 관련된다.
시클로포스파미드(CY) 처리
2 일전에 CY(SIGMA) 4mg(0.02㎖)을 마우스에 복강내로 투여하고, 0일째에 바이러스에 주사하였다. 감염후 다음날에 CY를 마우스의 복강내에 투여하였다: 1일째에 4mg; 4,7 및 11일째에 2mg; 14, 18, 21, 25 및 28일째에 3mg. 11일째되는 날에 콜터 계수기로 백혈구를 측정하므로서 면역억제를 간접적으로 조사하였다. 평균 백혈구 수는 처리되지 않은 마우스(n=4)에 대해 13,500세포/μℓ이고 CY-처리의 대조표준 마우스(n=5)에 대해서는 4,220세포/μℓ였다.
LD 50 의 계산
50% 사망율 (LD50)을 일으키는데 요구되는 치사량을 Reed 및 Muench(Reed 및 Muench 1938)의 비례방법으로 결정하였다.
마우스에서 NYVAC-RG의 잠재성 시험
4 내지 5주된 마우스를 풋패드(footpad)에서 각 VV-RG(Kieny 등, 1984), ALVAC-RG(Taylor등, 1991b), 또는 NYVAC-RG의 50 내지 100μℓ 범위의 희석액 (2.0-8.0 ℓog10조직 배양 감염량 50% (TCID50))으로 접종하였다. 백신접종후 14일째에 15 LD50의 광견병 바이러스 CVS 균주로 두개내에 접종하여 마우스를 공격하였다. 28일째에 생존 마우스를 세고 보호량 50%(PD50)를 계산하였다.
NYVAC(vP866)의 유도
우두 바이러스의 NYVAC 균주를 VC-2, COPENHAGEN 백신 균주의 플라크 클론 분리체로부터 만들었다. VC-2로부터 NYVAC을 만들기 위해, 독성과 관련된 많은 바이러스의 기능부위를 포함하여 18개의 우두 ORF를 본 명세서의 앞에 기재한 바와 같이 일련의 연속조작으로 정확하게 제거하였다. 이들 제거는 새로운 종류의 불필요한 오픈 리딩 프레임의 출현을 방지하도록 고안된 방법으로 수행하였다. 도 39는 NYVAC을 만들기 위해 제거한 ORF를 개략적으로 나타낸다. 도 39의 상단에는 우두 바이러스 게놈(VC-2 플라크 분리체, COPENHAGEN 균주)의 Hind Ⅲ 제한 지도가 나타나 있다. NYVAC의 제조시에 연속적으로 제거된 VC-2의 여섯 부분이 확대되어 있다. 제거는 본 명세서의 앞부분에 기재되어 있다 (실시예 1 내지 6). 유전자좌로부터 제거되는 ORF가 그들 유전자 산물의 기능 또는 동질성 및 분자량과 함께 제거되는 유전자좌의 밑에 열거되어 있다.
사람 조직 세포주에서 NYVAC 및 ALVAC의 복제 연구
사람 기원의 세포에서 우두 바이러스 NYVAC 균주(vP866)의 복제수준을 결정하기 위해 액체 배양하에 세포당 0.1pfu의 다수를 접종한 후 72시간동안 배양하였다. COPENHAGEN 어버이 클론(VC-2)을 동일하게 접종하였다. 모든 바이러스에 대해 허용되는 세포 기질을 제공하기 위해 일차 병아리 배 피브로블라스트(CEF)(10 내지 11일된 SPF 기원의 배를 지닌 알로부터 얻음, Spafas, Inc., Storrs, CT)를 포함시켰다. 두가지 기준에 근거하여 배양물을 분석하였다: 증식적인 바이러스 복제의 존재 및 외부 항원의 발현.
많은 사람유도 세포에서 NYVAC의 복제능력을 표 53에 나타냈다. VC-2 및 NYVAC은 둘다 CEF 세포에서 증식적인 복제를 할 수 있으나, NYVAC은 약간 감소된 산출량을 나타냈다. 또한 VC-2는 테스트한 여섯가지의 사람 유도 세포주에서 EBV 형질전환의 림포블라스토이드(lymphoblastoid) 세포주 JT-1(엡스타인―바르 바이러스로 형질전환된 사람 림프블라스토이드 세포주, Rickinson 등, 1984 참조)을 제외하고 필적할만한 수량으로 증식적인 복제를 할 수 있었다. 대조적으로 NYVAC은 시험한 사람 유도 세포주에서 증식적으로 복제할 수 있는 능력이 매우 약독화되었다. 잔여 바이러스 수준외에 감염성 바이러스의 적은 증가가 NYVAC-감염된 MRC-5(ATCC #CCL171, 사람 배의 폐 기원), DETROIT 532(ATCC #CCL54, 사람 표피, 다운스 신드롬), HEL 299(ATCC #CCL137, 사람 배의 폐 세포) 및 NHK(사람 신생아의 신장세포, Whittiker Bioproducts, Inc. Walkersville, MD, Cat #70-151) 세포에서 달성되었다. 이들 세포주에 대한 복제는 NYVAC-감염된 CEF 세포 또는 어버이 VC-2에서 얻은 바이러스 산출량과 비교할 경우 현저히 감소하였다 (표 53). 24시간후 NYVAC 및 VC-2 둘다에 대한 CEF 세포에서의 산출량은 72-시간 산출량과 동일함에 주의해야 한다. 사람 세포주를 추가로 48시간 (다른 두 바이러스 증식 사이클) 배양하면, 얻어지는 관련된 바이러스 산출량이 증폭되었을 것이다.
저수준의 바이러스 산출량이 사람―유도 세포주, MRC-5 및 DETROIT 532에서 얻어진 것과일치하여, 검출가능하나 감소된 수준의 NYVAC-특이적 DNA 축적이 관찰되었다. MRC-5 및 DETROIT 532 NYVAC-감염된 세포주에서의 DNA 축적 수준은 NYVAC-감염된 CEF 세포에서 관찰되는 것과 관련하여 관련 바이러스 산출량에 필적하였다. NYVAC-특이성 바이러스의 DNA 축적은 다른 어떠한 사람―유도 세포에서도 관찰되지 않았다.
또한 아비폭스 바이러스, ALVAC을 이용하여 동일한 실험을 수행하였다. 바이러스 복제의 결과를 또한 표 53에 나타냈다. 카나리폭스 바이러스 내지 조류 종의 숙주 범위 제한과 일치하여 어떠한 사람 세포주에서도 후손 바이러스가 검출되지 않았다. 또한 ALVAC-특이성 DNA 축적이 어떠한 사람―유도 세포주에서도 검출되지 않았다는 관찰은 이들 사람―유도 세포에서 ALVAC의 증식적 복제가 일어나지 않는 것과 일치한다.
사람세포에서 NYVAC-RG(vP879)에 의한 광견병 당단백질의 발현
외부 유전자의 효과적 발현이 증식적 바이러스의 복제가 현저한 수준으로 일어나지 않는 경우에 달성되는지 여부를 결정하기 위해, 동일한 세포주에 광견병 바이러스 당단백질을 발현하는 NYVAC 재조합체(vP879, 실시예 7)를35S-메티오닌의 존재하에 접종하였다. 광견병 당단백질에 특이한 모노클로날 항체를 이용하여 방사능 표지의 배양 용해물로 광견병 당단백질의 면역침전을 수행하였다. 67kDa 단백질의 면역침전이 관찰된 바, 광견병 당단백질의 완전히 글리코실화된 형태와 일치하였다. 혈청학적인 교차반응이 일어나지 않은 생성물이 미감염된 또는 어버이 NYVAC으로 감염된 세포 용해물에서 검출되었다. 분석한 다른 모든 사람 세포에서도 동일한 결과를 얻었다.
토끼 피부의 접종
내피(id) 접종후, 토끼의 피부병변유발 및 특성은 우두 바이러스 균주의 병원성의 척도로 이전부터 이용되어 왔다(Buller 등, 1988; Child 등, 1990; Fenner, 1958, Flexner 등, 1987; Ghendon 및 Chernos 1964). 그러므로, 우두 균주 WR(CV-1 세포에서 정제한 ATCC #VR119 플라크, ATCC #CCL70, 및 L 변형체라 명명된 플라크 분리체, 선별된 ATCC #VR2035, Panicali 등, 1981에 기재되어 있음), WYETH(ATCC #VR325, Wyeth Laboratories, Marietta, PA에 의해 DRYVAC으로 시판됨), COPENHAGEN (VC-2), 및 NYVAC의 id 접종과 관련된 병변 특성을 두마리 토끼(A069 및 A128)의 접종을 통해 평가하였다. 두마리 토끼는 바이러스에 대한 다른 전체적인 민감도를 나타내었으며, 토끼 A12B는 토끼 A069 보다 덜 심각한 반응을 나타냈다. 토끼 A069에 있어서, 병변은 WR 접종 부위에 특이하게 강했으며, 단지 48시간후에 해소되었다. 또한 병변강도는 림프 배액 망상구조와 관련하여 접종부위의 위치에의존하였다. 특히, 척추위에 위치한 모든 부위는 보다 강한 병변을 나타냈으며, 대퇴부 바깥쪽에 위치한 병변을 회복하는데는 보다 긴 시간이 요구되었다. 모든 병변은 4일부터 마지막 병변이 사라질 때까지 매일 측정하였으며, 최대 병변 크기의 평균 및 회복시까지의 일수를 계산하였다 (표 54). 대조표준 PBS로 주사한 부위에서는 국부적 반응이 관찰되지 않았다.궤양성 병변은 WR, VC-2 및 WYETH 우두 바이러스 균주를 접종한 부위에서 관찰되었다. 중요하게도, 경결 및 궤양성 병변은 NYVAC으로 접종한 부위에서는 관찰되지 않았다.
접종부위에서 전염성 바이러스의 지속성
접종부위에서 이들 바이러스의 상대적인 지속성을 평가하기 위해 다수부위에 106, 107또는 108pfu의 VC-2, WR, WYETH 또는 NYVAC을 함유하는 PBS 0.1㎖을 토끼의 내피에 접종하였다. 각 바이러스에 대해, 107pfu 접종량을 척추위에 접종하고, 106및 108접종량을 측면에 접종하였다. 접종 부위를 11일동안 매일 관찰하였다 WR은 가장 강한 반응을 일으켰고, VC-2 및 WYETH가 이어졌다 (표 55). 궤양은 WR 및 WYETH에 대해 9일째에 처음으로 관찰되었고, VC-2에 대해서는 10일째에 관찰되었다. NYVAC 또는 대조표준 PBS를 접종한 부위는 경결 및 궤양을 나타내지 않았다. 접종후 11일에, 접종 부위에서 피부 샘플을 잘라내, 기계적으로 파괴하고, CEF 세포에서 바이러스를 적정하였다. 결과를 표 55에 나타냈다. 이 시점에서 회수한 바이러스가 투여한 바이러스 보다 많은 경우는 없었다. 우두 균주, WR의 회수는 투여한 바이러스의 양에 관계없이 각 부위에서 약 106pfu였다. 우두 균주 WYETH 및 VC-2의 회수는 접종량에 관계없이 103내지 104pfu였다. 전염성 바이러스는 NYVAC으로 접종한 부위에서는 회수되지 않았다.
유전적으로 또는 화학적으로 면역결핍인 마우스의 접종
높은 접종량의 NYVAC(5 x 108pfu) 또는 ALVAC(109pfu)의 누드 마우스에의 복강내 접종은 100일간의 관찰기간을 통해 치사, 병변, 및 분명한 질환을 나타내지 않았다. 대조적으로, WR (103내지 104pfu), WYETH (5 x 107또는 5 x 108pfu) 또는 VC-2(104내지 109pfu)로 접종된 마우스는 맨처음 발가락에 폭스바이러스의 전형적인 잔재성 병변을 나타냈고, 이어서 꼬리에 나타났으며, 일부 동물에서는 심각한 고환염이 뒤따랐다. WR 또는 WYETH로 감염된 마우스에서, 잔재성 병변의 출현은 일반적으로 실제적인 치사를 일으켰으며, 반면에 VC-2로 감염된 대부분의 마우스는 실제적으로 회복되었다. 계산한 LD50값을 표 56에 나타냈다.
특히, VC-2로 접종된 마우스는 발가락에 병변 (붉은 구진)이 나타나기 시작하고 1 내지 2일 후에는 꼬리에도 나타났다. 이들 병변은 가장 높은 접종량 (109, 108, 107및 106pfu) 이 주어진 마우스에서는 접종(pi)한 후 11 내지 13일 사이에, 105pfu가 주어진 마우스에서는 투여후 16일째에, 및 104pfu가 주어진 마우스에서는 투여후 21일째에 나타났다. 103및 102pfu로 접종된 마우스에서는 100일동안의 관찰기간에 병변이 관찰되지 않았다. 고환염은 109및 108pfu가 주어진 마우스에서는 투여후 23일째에, 다른 그룹(107내지 104pfu)에서는 투여후 대략 7일째에 관찰되었다. 고환염은 109및 108pfu 그룹에서 특히 심하였고, 계속 진행하여 100일 관찰기간의 끝까지 관찰되었다. 일부 폭스―유사 병변이 접종후 30 내지 35일째에 몇마리 마우스의 피부에서 관찰되었다. 대부분의 폭스 병변은 정상적으로 접종후 60 내지 90일 사이에 치유되었다. 109pfu로 접종한 그룹에서 단지 한마리의 마우스가 죽었고 (접종후 34일째), 108pfu로 접종한 그룹에서도 한마리의 마우스가 죽었다 (접종후 94일째). VC-2로 접종된 마우스에서의 치사는 관찰되지 않았다.
우두의 WR 균주 104pfu로 접종된 마우스는 접종후 17일째에 폭스 병변을 나타내기 시작하였다. 이들 병변은 VC-2가 주사된 마우스 (부풀은 발가락, 꼬리)에서 나타난 병변과 동일하게 나타났다. WR 균주 105pfu로 접종된 마우스는 접종후 30일까지 병변을 나타내지 않았다. 고환염은 높은 접종량의 WR(104pfu)로 접종한 마우스에서만 관찰되었다. 관찰기간의 후기 단계에서, 병변은 입에서 나타났고 마우스는 식사를 중지하였다. WR 104pfu로 접종된 모든 마우스는 죽었거나, 또는 필요에 따라 접종후 21일 내지 31일 사이에 안락사시켰다. WR 103pfu를 주사한 5마리의 마우스중 4마리가 죽었고, 필요에 따라 접종후 35일 내지 57일 사이에 안락사시켰다. 낮은 접종량의 WR(1 내지 100pfu)로 접종된 마우스에서는 치사가 관찰되지 않았다.
우두 바이러스의 WYETH 균주가 높은 접종량 (5 x 107및 5 x 108pfu)으로 접종된 마우스는 발가락과 꼬리에 병변을 나타내고, 고환염(orchitis)이 발생하여 죽었다. 5 x 106pfu 또는 그 이하의 WYETH를 주사한 마우스는 질환 또는 병변의 징후를 나타내지 않았다.
표 56에 나타낸 바와 같이, CY-처리된 마우스는 누드 마우스에서 보다 민감한 폭스바이러스 독성 분석에 대한 모델을 제공하였다. WR, WYETH, 및 VC-2 우두 바이러스 균주에 대한 LD50값은 누드 마우스 모델에서보 다 이 모델 시스템에서 현저히 낮았다. 부가적으로, 병변을 하기된 바와 같이 보다 빠른 병변형성을 일으키는 각 바이러스의 높은 접종량으로 WYETH, WR 및 VC-2 우두 바이러스를 주사한 마우스에서 발생하였다. 누드 마우스에서 나타난 바와 같이, NYVAC 또는 ALVAC을 주사한 CY-처리된 마우스에서는 병변이 발생하지 않았다. 그러나, 누드 마우스와 달리, 일부 치사가 접종량과 관계없이 NYVAC 또는 ALVAC으로 공격당한 CY-처리된 마우스에서 관찰되었다. 이들 무작위 발병은 치사를 야기시키는 것으로 여겨진다.
총 접종량의 WYETH(9.5 x 104내지 9.5 x 108pfu)를 주사한 마우스는 접종후 7 내지 15일 사이에 그들의 꼬리 및/또는 그들의 발가락에 폭스 병변을 나타냈다. 게다가 꼬리 및 발가락은 부풀었다. 꼬리에서의 병변 발생은 구진, 궤양의 형성 및 최종적으로 딱지를 형성하는 전형적인 폭스 병변이었다. 또한 총 접종량의 VC-2 (1.65 x 105내지 1.65 x 109)로 접종된 마우스는 그들의 꼬리 및/또는 그들의 발가락에 WYETH 주사의 마우스 것과 유사한 폭스 병변을 발생하였다. 이들 병변은 접종후 7 내지 12일 사이에 관찰되었다. 낮은 접종량의 WR 바이러스가 주사된 마우스에서는 병변이 관찰되지 않았으며, 이들 그룹에서 치사가 있어왔다.
NYVAC-RG의 효능 시험
유용한 벡터로서 얻어진 NYVAC 균주의 능력이 현저히 변화하지 않고 우두 바이러스의 COPENHAGEN 균주의 약독화가 영향을 받는지를 결정하기 위해, 비교효능시험을 수행하였다.바이러스를 약독화시키기 위해 수행하는 연속적인 유전자 조작시에 벡터의 면역유발 가능성을 조사하기 위해, 광견병 바이러스 당단백질을 리포터 외부 항원으로 사용하였다. 광견병 당단백질 유전자를 발현하는 벡터의 보호 효력을 광견병에 대한 표준 NIH 마우스 효능 시험으로 평가하였다(Seligmann, 1973). 표 57은 매우 약독화된 NYVAC 벡터로 얻은 PD50값이tk유전자좌(Kieny 등, 1984)에 광견병 당단백질을 포함하는 COPENHAGEN―기초의 재조합체를 이용하여 얻은 것과 동일하고 복제가 조류종에 제한된 카나리폭스에의거한 벡터, ALVAC-RG로 얻은 PD50값과 유사함을 실증한다.
관찰
알려진 독성 유전자가 제거되고 제한된 생체외 증식 특성을 갖는 NYVAC을 동물 모델 시스템에서 분석하여 약독화 특성을 평가하였다. 이들 연구는 비교를 위해 신경독성 우두 바이러스 실험실 균주, WR, 두 우두 바이러스백신 균주, WYETH(New York City Board of Health) 및 COPENHAGEN(VC-2), 뿐만 아니라 카나리폭스 바이러스 균주, ALVAC(실시예 24 참조)으로 수행하였다. 동시에, 이들 바이러스는 가장 독성이 강한 균주인 WR, 입증된 특성을 지니며 이전에 이용한 약독화된 백신 균주를 제공하는 COPENHAGEN(VC-2) 및 WYETH, 및 복제가 조류종에 제한되는 폭스바이러스의 예를 제공하는 ALVAC와 함께 마우스 공격 모델 및 토끼 피부 모델에서 상대적인 병원성 잠재력의 스펙트럼을 제공하였다. 이들 생체에서의 분석에서 얻은 결과는 우두 바이러스 균주, WR, WYETH 및 COPENHAGE(VC-2)에 대한 NYVAC의 매우 약독화된 특성을 명백하게 실증하였다 (표 28 내지 29, 53 내지 57). 분명하게, NYVAC에 대한 LD50값은 조류 숙주 제한 아비폭스 바이러스, ALVAC에서 관찰된 것에 필적할만하였다. ALVAC 뿐만 아니라 NYVAC에 의한 치사는 극도로 높은 접종량의 바이러스가 두 개내의 경로를 통해 투여되었을 때만 관찰되었다 (실시예 24, 표 28, 29, 56). 이들 치사가 고단백질양의 비특이적 접종결과에 의한 것인지 여부는 아직 확립되지 않았다. 또한 면역손상 마우스 모델 (누드 및 CY-처리된)에서의 분석결과는 WR, WYETH 및 COPENHAGEN 균주 (표 54 및 55)에 비해 NYVAC의 상대적으로 높은 약독화 특성을 실증한다 (표 54 및 55). 분명하게, 분산된 우두 감염 또는 우두 질환의 증거는 관찰기간동안 NYVAC-접종된 동물, ALVAC-접종된 동물에서 관찰하지 못했다. NYVAC에서 다수의 독성―연관된 유전자의 제거는 병원성에 대해 상승작용 효과를 나타냈다. NYVAC의 다른 무해성의 측정은 토끼 피부에 대한 내피 투여를 통해 제공하였다 (표 54 및 55). 비조류종에서 복제할 수 없는 바이러스인 ALVAC으로 얻는 결과를 비교해 볼 때, 접종부위에서의 복제능력은 반응성과의 유일한 상관관계는 아니다. 왜냐하면 ALVAC의 내피 투여는 접종량의존 방법에서 경결 부위를 야기시켰다(미공개 관찰). 그러므로, 바이러스의 복제능력 이이의 인자가 병변의 형성에 관여할 것이다. NYVAC에서의 유전자 제거는 병변의 출현을 방지한다.
동시에, 실시예 24를 포함하여, 이 실시예 및 이전 실시예의 결과는 WR 및 이전에 이용한 우두 바이러스 백신 균주, WYETH 및 COPENHAGEN에 대한 NYVAC의 매우 약독화된 특성을 실증한다. 실제로, 시험한 동물 모델 시스템에서 NYVAC의 병원성 프로필은 조류 종에서만 증식적으로 복제하는 것으로 알려진 폭스바이러스인 ALVAC의 것과 유사하다. 마우스, 돼지, 개 및 말을 포함하여, 사람 (표 53) 및 다른 종에서 유도된 세포에서 증식적으로 복제하는 NYVAC의 분명히 제한된 능력은 백신접종된 개체에서의 감소된 산재가능성을 지닌 벡터를 제공하는 것에 더하여 비백신화 접촉 또는 일반적인 환경에 대한가능한 전파를 제한 또는 방해하는 충분한 장벽을 제공한다.
중요하게도, NYVAC-기초 백신 후보물이 효과가 있는 것으로 알려져 왔다. 많은 병원체로부터 외부 유전자 산물을 발현하는 NYVAC 재조합체는 영장류를 포함하여 몇가지 동물 종에서 외부 유전자 산물에 대해 면역반응을 유발하였다. 특히, 광견병 당단백질을 발현하는 NYVAC-기초 재조합체는 치사의 광견병 공격으로부터 마우스를 보호하였다. NYVAC-기초 광견병 당단백질 재조합체의 효능은 tk 유전자좌에 광견병 당단백질을 포함하는 COPENHAGEN-기초 재조합체의 PD50값에 필적하였다 (표 57). NYVAC-기초 재조합체는 또한 토끼의 홍역 바이러스 중화 항체를 유발하고 돼지의 가성광견병(Pseudorabies) 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스 공격으로부터 보호한다는 것이 알려져 왔다. 매우 약독화된 NYVAC 균주는 사람 및 가축에 적용함에 있어 안전성의 잇점을 부여한다(Tartaglia 등, 1990). 더욱이, 일반적인 실험실 발현 벡터 시스템으로서 NYVAC의 이용은 우두 바이러스의 이용과 관련된 생물학적 위험을 크게 감소시킬 것이다.
하기 평가기준에 의해, 실시예 24를 포함하여 이 실시예 및 이전의 실시예는 매우 약독화된 NYVAC을 보여준다: a) 접종부위 (토끼 피부)에서 경결 및 궤양이 탐지되지 않았음; b) 내피의 접종부위 (토끼 피부)로부터 감염성 바이러스의 신속한 제거; c) 고환 염증이 없음 (누드 마우스); d) 크게 감소한 독성 (두개내 공격, 3주된 마우스 및 신생 마우스 둘다); e) 크게 감소한 병원성 및 면역결합된 대상 (누드 마우스 및 시클로포스파미드로 처리된 마우스)에서의 전염 실패; 및 f) 각종 사람 조직 배양 세포에서의 크게 감소한 복제 능력. 크게 약독화되었음에도 불구하고 아직 벡터로서의 NYVAC은 외부항원에 대해 강한 면역 반응을 유발하는 능력을 보유한다.
본 발명의 바람직한 구체예들을 세부적으로 기술하였지만, 본 발명의 정신 또는 영역으로부터 벗어나지 않으면서 본발명의 많은 명백한 변형이 가능하기 때문에 첨부된 청구범위에 의해 한정된 본발명이 상기 상세한 설명에서 기술된 특별한 세부내용으로 제한되지는 않는다는 것이 이해되어져야 한다.
본 발명은 증가된 안정성을 가지는 변형된 재조합체 카나리아폭스 바이러스를 제공하고 그러한 재조합체 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 알려진 재조합체 카나리아폭스 바이러스 백신과 비교할때 증가된 안정성 수준을 갖는 재조합체 카나리아폭스 바이러스 백신을 제공한다.
또한, 본 발명은 벡터가 숙주에서 약화된 병독성을 갖도록 벡터가 변형된 숙주내에서 유전자 산물을 발현하기 위한 변형벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 증가된 안정성 수준울 갖는 변형된 벡터 또는 변형된 재조합체 바이러스를 이용하여 생체외에서 배양된 세포에서 유전자 산물을 발현하기 위한 방법을 제공한다.
참고문헌

Claims (27)

  1. ALVAC 카나리아폭스 바이러스의 모든 확인되는(identifying) 특성들을 갖는 약독화된 바이러스.
  2. ALVAC 바이러스.
  3. 제 1 항의 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. 제 2 항의 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 바이러스 게놈의 비필수 부위내에 비-폭스 바이러스 공급원으로부터의 외인성 DNA를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 외인성 DNA가 광견병 바이러스, B형 간염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 뎅그열 바이러스, 홍역 바이러스, 가성 광견병 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스, 말 헤르페스 바이러스, 소 헤르페스 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 인간 시토메갈로바이러스, 개 파보바이러스, 말 인플루엔자 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 헤르페스 바이러스, 한탄 바이러스,C. tetani, 조류 인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스 및 뉴캐슬병 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이러스.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스가 카나리아폭스 바이러스이고, 비-폭스 바이러스 공급원이 광견병 바이러스이고, 카나리아폭스 바이러스는 vCP65 또는 vCP136인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스가 카나리아폭스 바이러스이고, 비-폭스 바이러스 공급원이 인간 면역결핍 바이러스이고, 카나리아폭스 바이러스는 vCP95, vCP112, vCP60, vCP61, vCP125, vCP124, vCP126, vCP144, vCP120, vCP138, vCP117, vCP130, vCP152, vCP155, vCP156, vCP146, vCP148, vCP154, vCP168 또는 vCP153인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  9. 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스는 카나리아폭스 바이러스이고, 비-폭스 바이러스 공급원은 말 헤르페스 바이러스이고, 카나리아폭스 바이러스는 vCP132인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  10. 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스는 카나리아폭스 바이러스이고, 비-폭스 바이러스 공급원은 인간 시토메갈로바이러스이고, 카나리아폭스 바이러스는 vCP139인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  11. 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스는 카나리아폭스 바이러스이고, 비-폭스 바이러스 공급원은 개 파보바이러스이고, 카나리아폭스 바이러스는 vCP123 또는 vCP136인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  12. 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스는 카나리아폭스 바이러스이고, 비-폭스 바이러스 공급원은 엡스타인-바르 바이러스이고, 카나리아폭스 바이러스는 vCP167인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  13. 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스는 카나리아폭스 바이러스이고, 비-폭스 바이러스 공급원은 말 인플루엔자 바이러스이고, 카나리아폭스 바이러스는 vCP128 또는 vCP159인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  14. 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스는 카나리아폭스 바이러스이고, 비-폭스 바이러스 공급원은 고양이 백혈병 바이러스이고, 카나리아폭스 바이러스는 vCP177, vCP83, vCP35, vCP37, vCP87, vCP93 또는 vCP97인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  15. 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스는 카나리아폭스 바이러스이고, 비-폭스 바이러스 공급원은 고양이 헤르페스 바이러스이고, 카나리아폭스 바이러스는 vCP162인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  16. 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스는 카나리아폭스 바이러스이고, 비-폭스 바이러스 공급원은 한탄 바이러스이고, 카나리아폭스 바이러스는 vCP114 또는 vCP119인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  17. 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스는 카나리아폭스 바이러스이고, 비-폭스 바이러스 공급원은 B형 간염 바이러스이고, 카나리아폭스 바이러스는 vCP169 또는 cVP157인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  18. 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스는 카나리아폭스 바이러스이고, 비-폭스 바이러스 공급원은C. tetani이고, 카나리아폭스 바이러스는 vCP161인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  19. 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스는 카나리아폭스 바이러스이고, 비-폭스 바이러스 공급원은 볼거리 바이러스이고, 카나리아폭스 바이러스는 vCP171인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  20. 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스는 카나리아폭스 바이러스이고, 비-폭스 바이러스 공급원은 일본 뇌염 바이러스이고, 카나리아폭스 바이러스는 vCP107 또는 vCP140인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  21. 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스는 카나리아폭스 바이러스이고, 비-폭스 바이러스 공급원은 원숭이 면역결핍 바이러스이고, 카나리아폭스 바이러스는 vCP172인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  22. 제 6 항에 있어서, vCP65인 광견병 바이러스 재조합체 카나리아폭스 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  23. 제 6 항에 있어서, vCP95, vCP112, vCP60 또는 vCP61인 인간 면역결핍 바이러스 재조합체 카나리아폭스 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  24. 제 1 항에 있어서, 상기 바이러스 게놈의 비필수 부위내에 비-폭스 바이러스 공급원으로부터의 외인성 DNA를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스.
  25. 접종돠는 숙주 동물에서 광견병, 간염, 뇌염, 황열, 홍역, 만성 피로 증후군, 포진, AIDS, 바이러스성 설사, 인플루엔자, 백혈병, 파상풍, 볼거리, 댕그/댕그 출혈열, 아우제스키(Aujeszky) 병, 뉴캐슬 병, 신장 징후를 갖는 출혈열, 한탄바이러스 폐 증후군, 및 SIV, 시토메갈로바이러스 및 개 파보바이러스에 의한 질환에 대한 면역학적 반응을 유도하기 위한 면역학적 조성물로, 상기 조성물은 제1항, 제2항 및 제5항 내지 제24항중의 어느 한 항의 바이러스, 또는 제3항 또는 제4항의 벡터와 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역학적 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서, 백신인 것을 특징으로 하는 면역학적 조성물.
  27. 생체외 배양된 병아리 배 피브로블라스트, MRC-5 세포,VERO 세포, WISH 세포, DETROIT 532 세포, HEL 세포, HNK 세포 및 EBC 형질전환된 림포블라스토이드 세포로 이루어진 군에서 선택되는 세포에서 단백질을 발현하는 방법으로, 상기 방법은 제1항, 제2항 및 제5항 내지 제24항중의 어느 한 항의 바이러스, 또는 제3항 또는 제4항의 벡터를 세포속으로 도입하고, 상기 발현벡터로 세포를 형질전환하고, 재조합체 폭스바이러스의 발현을 허용하는 조건하에서 형질전환된 세포를 배양하고, 그리고 단백질을 더 정제하는 것으로 이루어지는 방법.
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