JP4007456B2 - 免疫不全組換えポックスウイルス - Google Patents
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Description
本発明は、改変ポックスウイルス(modified poxvirus)およびそれを製造し使用する方法に関する。特に、本発明は、外来遺伝子を挿入し発現させて、免疫不全ウイルスに対して免疫応答を誘起するための安全な免疫化媒体として用いられる改良ベクターに関する。すなわち、本発明は、免疫不全ウイルスの遺伝子産物を発現する組換えポックスウイルス、および、接種された宿主またはインビトロ(例えば、生体外の様式)で、免疫不全ウイルスに対して免疫応答を誘起する免疫原性組成物に関し、さらには、該ポックスウイルスの発現産物であって、それ自身が免疫応答を誘起、例えば抗体を産生するのに有用な生成物に関し、ここで、該抗体は、血清反応陽性または血清反応陰性の個体において免疫不全ウイルス感染に対して有用であり、あるいは、動物またはヒトから単離されることにより、ウイルスまたは感染細胞の検出用の診断キット、試験または分析法を構築するのに有用なものである。
本出願においては、幾つかの刊行物を参照している。これらの参考文献は、本明細書の末尾の特許請求の範囲の前にまとめて引用しているか、あるいは、刊行物について言及している個所においてそれぞれの刊行物を引用している。
発明の背景
外来遺伝子を挿入し発現させるためにはワクシニアウイルス、および最近は、その他のポックスウイルスが用いられている。生きた感染性ポックスウイルス内に外来遺伝子を挿入する基本的な手法は、ドナープラスミド内の外来遺伝子をはさむポックスDNA配列と、レスキューポックスウイルス内に存在する相同配列との間で組換えを起こすことである(Piccini他、1987)。
詳述すれば、組換えポックスウイルスは、当該技術分野で既知であり、また、米国特許第4,769,330号、第4,772,848号、第4,603,112号、第5,100,587号および第5,179,993号に記載されているような方法(これらの特許の開示を参考のために本明細書に引用しておく。)に類似の2つの工程で構築される。
第1の工程として、当該ウイルスに挿入すべきDNA遺伝子配列、特に、非−ポックス源からのオープンリーディングフレームが、ポックスウイルスDNAの一部に相同的なDNAが予め挿入されている大腸菌プラスミド構造体に導入される。これとは別に、挿入されるべきDNA遺伝子配列をプロモータに連結しておく。プラスミド構築物におけるプロモーター−遺伝子連結体の位置は、非必須(nonessential)遺伝子座を含有するポックスDNAの領域をはさむDNA配列に相同的なDNAが、該プロモーター−遺伝子連結体の両端にあるようにしておく。このようにして得られたプラスミド構造体は、次いで、大腸菌内で培養、増幅され(Clewell、1972)、単離される(Clewell他、1969;Maniatis他、1982)。
第2の工程として、挿入されるべきDNA遺伝子配列を含有する単離後のプラスミドは、ポックスウイルスとともに、培養細胞、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞に形質導入(トランスフェクト)される。プラスミド内の相同ポックスDNAと、ウイスルゲノムとの間の組換えにより、ポックスウイルスのゲノムの非必須領域に外来DNA配列が存在する改変ポックスウイルスが得られる。「外来(foreign)」DNA配列という語は、外因性DNA、特に非ポックス源からのDNAであって、該外因性DNAが導入されているゲノムによって通常は産生されない遺伝子産物をコードするDNAを指称する。
遺伝子組換えは、一般に、2つのDNA鎖間の相同DNA部分の交換である。ウイルスによっては、DNAの代わりにRNAとなることもある。核酸の相同部分とは、同じ配列の核酸塩基を有する核酸(DNAまたはRNA)の一部分である。
遺伝子組換えは、本来、感染宿主細胞内で新しいウイルスゲノムが複製または産生される間に起こる。すなわち、2種またはそれ以上の異なるウイルスまたは遺伝子構造体で共感染された(co-infected)宿主細胞内で起こり得る。ウイルス複製サイクル中に、ウイルス遺伝子間の遺伝子組換えが起こる。第1のゲノム由来のDNAの一部を交換させることにより、この第1のウイルスゲノムに相同的なDNAを有する第2の共感染性ウイルスのゲノムの一部を構成する。
しかしながら、組換えは、完全に相補的でない異なるゲノムにおけるDNA部分間でも起こり得る。第1のゲノム由来のそのようなDNAの一部分が別のゲノムの一部分に相同的であるが、その第1のDNA部分に、例えば、遺伝子マーカーや抗原決定基をコードする遺伝子が挿入されて存在されているような場合には、組換えが起こり得、その組換え産物はそのような遺伝子マーカーや組換えウイルスゲノム内の遺伝子により検出されるようになる。最近は、組換えワクシニアウイルスを調製するためにその他の戦略も報告されている。
感染性改変ウイルスにより、挿入されたDNA遺伝子配列の発現を成功させるためには2つの条件が要求される。第1に、ウイルスの非必須領域に挿入を行い、改変ウイルスの生存性が維持されるようにしなければならない。挿入DNAの発現に関する第2の条件は、該挿入DNAに対して至適な関係にあるプロモータが存在しているということである。プロモータの位置は、発現されるべきDNA配列の上流にあるようにしなければならない。
ワクシニアウイルスは天然痘に対する免疫処置に使用されて成功をおさめ、1980年には世界的に天然痘を撲滅させた。その歴史の過程でワクシニアの多くの菌株が出現した。これらの異なる菌株は、種々の免疫原性を示し、また、程度の差はあるが、いろいろな合併症に関連する可能性があるとされ、その最も深刻なものはワクチン接種後の脳炎と全身性ワクシニアである(Behbehani、1993)。
天然痘の撲滅に伴い、ワクシニアの新しい役割、すなわち、外来遺伝子を発現させるための遺伝子工学用ベクターとして役割が重要となった。きわめて多くの異種抗原をコードする遺伝子がワクシニア内で発現され、その結果、対応する病原体の投与に対する防御免疫をもたらしたこともしばしばである(Tartaglia他による総説、1990a)。
ワクシニアウイルスの遺伝学的背景が、発現される外来免疫原の防御効能に影響を与えることが示されている。例えば、ワクシニアウイルスのWyethワクチン株内でエプスタインバーウイルス(EBV)gp340が発現されても、EBVウイルスで引き起こされるリンパ腫に対してコットントップ(cottontop)タマリンを防御しなかったが、ワクシニアウイルスのWR研究室株内で同じ遺伝子を発現させると防御効果があった(Morgan他、1988)。
ワクシニアウイルスベースの組換ワクチンを得ようとする場合には効力と安全性との間に精密なバランスをとることがきわめて重要である。組換えウイルスは、ワクチン接種された動物内で防御能のある免疫応答を誘起するが、実質的に病原性が無いやり方で免疫原を与えなければならない。したがって、ベクター株を弱毒化することが、現在の技術状況では最も望ましいであろう。
多くのワクシニア遺伝子が、組織培養におけるウイルスの成長に非必須であることが確認されており、それらを削除し不活化することにより、いろいろな動物系における毒性が減少される。
ワクシニアウイルス チミジンキナーゼ(TK)をコードする遺伝子についてはマッピングが行われ(Hruby他、1982)、また、配列決定も行われている(Hruby他、1993;Weir他、1993)。チミジキナーゼ遺伝子が不活化または完全に欠失しても、広範な組織培養中でワクシニアウイルスの増殖は妨げられない。また、TK-ワクシニアウイルスは各種の投与法により各種の宿主における接種部位においてインビボ複製する能力を有する。
単純ヘルペスウイルス2型については、TK-ウイルスをモルモットに膣内投与すると、TK+ウイルスの投与の場合よりも脊髄中のウイルス力価がかなり低くなることが示された(Stanberry他、1985)。インビトロでのヘルペスウイルスがコードしているTK活性は、代謝の活発な細胞中ではウイルスの増殖に重要でないが、静止細胞中ではウイルス増殖に必須であることが示された(gamieson他、1974)。
TK-ワクシニアが弱毒化がマウスの脳内投与および腹膜内投与において示された(Buller他、1985)。神経毒性のあるWR実験室株およびWyethワクチン株の双方について弱毒化が認められた。皮内投与されたマウスにおいては、TK-組換えワクシニアが、親株のTK+ワクシニアウイルスと同等の抗ワクシニア中和抗体を産生したが、これは、この試験系では、TK機能の喪失がワクシニアウイルスベクターの免疫原性を有意に減少させないことを示唆している。TK-およびTK+の組換えワクシニアウイルス(WR株)をマウスに鼻内投与すると、他の部位(脳を含む)へのウイルスの伝播が有意に減少したことが見出された(Taylor他、1991a)。
ヌクレオチドの代謝に関連する別の酵素は、リボヌクレオチド還元酵素である。単純ヘルペスウイルス(HSV)内でコードされているリボヌクレオチド還元酵素の活性が、そのラージサブユニットをコードしている遺伝子を欠失させることにより喪失しても、インビトロの分裂細胞中でのウイルス増殖やDNA合成は影響されないが、無血清細胞でのウイルスの増殖能力は極めて損なわれることが示された(Goldstein他、1988)。眼部の急性HSV感染および三叉神経ガングリオンにおける再活性性潜伏感染に関するマウスモデルを用いた場合、リボヌクレオチド還元酵素のラージサブユニットを欠失したHSVについては、野生型HSVに比べて毒性が減少することが示された(Jacobson他、1989)。
ワクシニアウイルスにおいては、リボヌクレオチド還元酵素のスモールサブユニット(Slabaugh他、1988)およびラージサブユニット(Schmidtt他、1988)のいずれも同定されている。ワクシニアウイルスのWR株にリボヌクレオチド還元酵素を挿入によって不活化すると、ウイルスの弱毒化がもたらされ、これはマウスに頭蓋内接種することによって測定される(Child他、1990)。
ワクシニアウイルスの血球凝集素(HA)遺伝子についてはマッピングおよび配列決定が行われている(Shida、1986)。ワクシニアウイルスのHA遺伝子は、組織培養中の増殖にとって非必須なものである(Ichihashi他、1971)。ワクシニアウイルスのHA遺伝子を不活化すると、頭蓋内投与されたウサギにおいては神経毒性化が減少し、また、皮膚内投与部位におけるウサギの外傷は小さくなっていた(Shida他、1988)。HAの遺伝子座を利用して、ワクシニアウイルスのWR株(Shida他、1987)、Lister株の誘導体(Shida他、1988)およびCopenhagen株(Guo他、1989)に外来遺伝子を挿入している。外来遺伝子を発現する組換えHA-ワクシニアウイルスは、免疫原性があり(Guo他、1989;Itamura他、1990;Shida他、1988;Shida他、1987)、また、関連する病原体による投与に対して防御効果を有する(Guo他、1989;Shida他、1987)ことが示された。
牛痘ウイルス(Brighton赤色株)は、鶏卵の漿尿膜上に赤色(出血性)痘瘡を生じさせる。牛痘ゲノム内で自然欠失すると白色痘瘡を生じる突然変異体となる(Pichup他、1984)。出血性機能(u)は、初期遺伝子によってコードされた38kDaのタンパク質によることがマッピングされている(Pickup他、1986)。この遺伝子は、セリンプロテアーゼインヒビターと相同性を有し、牛痘ウイルスに対する宿主の炎症応答を阻害し(Palumbo他、1989)、また、血液凝固のインヒビターである。
このu遺伝子は、ワクシニアウイルスのWR株中に存在する(Kotwal他、1989b)。外来遺伝子を挿入することによりu領域が不活化されているWRワクシニアウイルス組換体を接種されたマウスは、u遺伝子が手つかずのままである類似の組換えワクシニアウイルスを接種されたマウスよりも、該外来遺伝子に対して高い抗体レベルを産生する(Zhou他、1990)。このu領域は、ワクシニアウイルスのCopenhagen株内で欠陥性非機能形態として存在する(Goebel他による報告(1990a,b)においてB13およびB14と称されているオープンリーディングフレーム)。
感染細胞内において牛痘ウイルスは、細胞質A型封入体(ATI)として局在化している(Kato他、1959)。ATIの機能は、動物から動物への伝播に際して牛痘ウイルス粒子を防護することにあると考えられている(Bevgoin他、1971)。牛痘ゲノムのATI領域は160kDaのタンパク質をコードしており、これがATI封入体のマトリックスを形成する(Funahashi他、1988;Patel他、1987)。ワクシニアウイルスは、そのゲノムに相同領域を含有するが、一般にATIを産生しない。ワクシニアのWR株においては、ゲノムのATI領域は94kDaのタンパク質として翻訳される(Patel他、1988)。ワクシニアウイルスのCopenhagen株においては、ATI領域に相応するDNA配列の大部分は欠失されており、該領域の残存する3′末端はATI領域の上流にある配列と融合して、オープンリーディングフレーム(ORF)A26Lを形成する(Goebel他、1990a,b)。
ワクシニアウイルスゲノムの左末端近傍については、各種の自然欠失(Altenburger他、1989;Drillien他、1981;Lai他、1989;Moss他、1981;Paez他、1985;Panicali他、1981)や人為的欠失が報告されている。10kbが自然欠失したワクシニアウイルスのWR株(Moss他、1981;Panicali他、1981)は、マウスに頭蓋内接種した場合に、弱毒化されることが示された(Buller他、1985)。後に、この欠失部は17ヶのORFを含む可能性が示された(Kotwal他、1988b)。該欠失部内にある特別の遺伝子としては、ビロカインN1Lおよび35kDaタンパク質(Goebel他による1990a,bの報告でC3Lと称されたもの)が挙げられる。N1Lを挿入して不活化すると、通常のマウスおよびヌードマウスのいずれについても、頭蓋内接種した場合に、毒性が減少する(Kotwa他、1989a)。上記の35kDaタンパク質は、ワクシニアウイルス感染細胞の培地にN1Lと同様に分泌される。このタンパク質は、補体制御タンパク質群、特に補体4B結合タンパク質(C4bp)に相同的である(Kotwal他、1988a)。細胞性C4bpと同様に、ワクシニアの35kDaタンパク質は補体の第4成分と結合し、古典的補体カスケードを阻害する(Kotwal他、1990)。このように、ワクシニアの35kDaタンパク質は、該ウイルスが宿主の防御機構を回避するのを助けることに関与しているものと考えられる。
ワクシニアゲノムの左末端は、宿主域遺伝子として同定された2つの遺伝子、K1L(Gillard他、1986)およびC7L(Perkus他、1990)を含む。これらの遺伝子の双方が欠失すると、各種のヒト細胞系でワクシニアウイルスの増殖能が減少する(Perkus他、1990)。
上記以外の2つのワクチンベクター系においては、必然的に宿主が制限されているポックスウイルスであるトリポックスウイルスを使用する。ニワトリポックスウイルス(FPV:fowlpoxvirus)およびカナリアポックスウイルス(canary poxvirus)の両者に工夫を施して外来遺伝子産物を発現させてきた。ニワトリポックスウイルス(FPV)は、ポックスウイルス科のトリポックス(Avipox)属の基本ウイルスである。このウイルスは、家禽類に経済的に重要な疾病を引き起こすが、1920年代から弱毒化生ワクチンを使用することにより対策が講じられてきた。トリポックスウイルスの複製は鳥類に限られ(Matthews他、1982)、ヒトを含む非鳥類においてトリポックスウイルスの感染が起こったという文献の報告は存しない。このように宿主が制限されているので、他の種にウイルスが伝染することに対する本質的な安全性が確保され、トリポックスウイルス由来のワクチンベクターは魅力ある手段として動物やヒトへ応用される。
FPVは、家禽類病原体由来の抗原を発現するベクターとして使用されると有利である。毒性トリインフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質がFPV組換体で発現された(Taylor他、1988a)。この組換体をニワトリおよび七面鳥に接種すると、同種または異種の毒性インフルエンザウイルスのいずれの投与に対しても防御能のある免疫応答が誘起された(Taylor他、1988a)。ニューカッスル病ウイルスの表面糖タンパク質を発現するFPV組換体も開発された(Taylor他、1990;Edbauer他、1990)。
宿主制限によりFPVおよびCPVの複製は鳥類系に限られているにも拘わらず、これらのウイルスから誘導された組換体が、非鳥類起源細胞においては外来遺伝子を発現することが見出された。さらに、そのような組換ウイルスは、該外来遺伝子産物に対する免疫学的応答を引き起こし、場合によって、相応する病原体による投与に対する防御能を有することが示された(Tartaglia他、1993a,b;Taylor他、1992;1991b;1988b)。
1983年、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV1)がエイズの原因物質であることが同定された。12年が経過し、多くの世界中の努力にも拘わらず、効果的なHIV1ワクチンは未だ入手できない。しかしながら、最近になって、効果的なHIV1ワクチンを得る可能性のあることが幾つかの報告で示唆されている。例えば、あるワクチン接種法によりサル免疫不全ウイルス(SIV:Simian immunodeficiency virus)投与に対してサル科マカク属のサルが防御されており、このワクチン接種法では、SIVのgp160糖タンパク質を発現するワクシニアウイルス組換体で1次免疫を行い、さらに、精製したSIVgp160糖タンパク質で追加免疫を行っている(Hu他、1992)。さらに、HIV1gp120サブユニットワクチンを用いることによりHIV1の投与に対してチンパンジーが防御された(Berma他、1990)。また、不活化HIV1、gp160および/またはV3ペプチドまたはgp160、p17(Gagタンパクの1種)および/またはV3ペプチドを多回注射するワクチン接種によっても、HIV1投与に対してチンパンジーが防御された(Girard他、1991)。gp160、p17、p24(Gagタンパクの1種)、Vif、Nefおよび/またはV3ペプチドを多回注射する同様のプロトコールによっても、HIV1感染細胞の投与に対してチンパンジーが防御された(Fultz他、1992)。さらに、HIV1 V3に特異的な抗体を注入することにより、チンパンジーは受動免疫防御された(Emini他、1992)。
これらのワクチン接種プロトコールにおいては、HIV1またはSIVのエンベロープ(表面膜)糖タンパク、特に、エンベロープ糖タンパクのV3エピトープに対して免疫応答を誘起することに重点が置かれてきた。不幸なことには、HIV1の菌株が異なると、遺伝子や抗原性、特にエンベロープ糖タンパクにおけるそれらが広範囲に変異する。したがって、効果的なHIV1ワクチンは、単一のHIV1抗原、または単一のHIV1抗原の単一のエピトープだけでなく、それらの多くに対して免疫応答を誘起させることが必要であろう。
B細胞エピトープにおいては配列が広く変異していることが認められるのに対して、T細胞エピトープは比較的保存されている。例えば、HIV1gp160(LAI株)を発現するワクシニアウイルスを接種し精製HIV1 gp160(LAI)を追加免疫したHIV1に血清反応陰性の個体から単離した細胞傷害性リンパ球(CTL)クローンは、HIV1のMNまたはRFエンベロープ糖タンパク質を発現する標的細胞を効率的に溶菌し、HIV1 LAIエンベロープ糖タンパク質を発現する細胞も同様に溶菌する(Hammond他、1992)。したがって、比較的保存されているT細胞エピトープに対して免疫応答を誘起するワクチンは、同種の感染に対して効果的であるのみならず、異種の感染に対しても効果的であるかも知れない。
SIVに対してサル科マカク属のサルをワクチン接種するのに採用した上述の方式に類似する1次免疫−追加免疫プロトコールに従い、HIV1 gp160を発現するALVAC組換体(vCP125)を用いてHIV1に血清反応陰性の個体にワクチン接種した。これらのALVACをベースとしたプロトコールでは、サブユニットを追加免疫すると、vCP125が、HIV1エンベロープに特異的なCD8+CTLを誘起し且つエンベロープに特異的な液性反応を増強する能力を有することが認められた(Pialoux他、1995)。これらの結果は、ALVACに基づく組換えHIV1ワクチンに対する根拠となっている。
1型ヒト免疫不全ウイルス(HIV1)に感染した個体は、当初、HIV1に特異的な中和抗体およびHIV1に特異的なCTLを含む比較的強い抗ウイルス性免疫応答を示す。しかしながら、このような応答にも拘わらず、きわめて多くのHIV1感染者は、HIV1関連疾病により実際には死亡してしまう。多くのHIV1感染者により起こされる免疫応答が防御機能を有しないことを考えると、有効な免疫応答とは、その免疫応答が変化または修正されて、HIV1感染者により通常または多くは認められないようなHIV1エピトープに抗するようになることが必要であるのかも知れない。
HIV1に血清反応陽性の個体にありHIV1感染細胞に結合することのできるHIV1特異性抗体の約40%は、HIV1エンベロープ糖タンパクの第3の可変領域(V3)に特異的である(Spear他、1994)。この結果は、V3ループが1)免疫原性が高く、また、2)感染細胞の表面上に露出されていることを示唆している。V3ループのアミノ酸配列は、HIV1単離源が異なると非常に相違する。すなわち、配列が緩やかに相違してエンベロープ糖タンパクのこの領域の構造や免疫原性を変化させているようではない。V3領域は免疫原性が高く、その構造と免疫原性は、配列変化により大きく影響されないので、エンベロープ糖タンパクのこの領域が、通常は非免疫原性のエピトープまたは異種エピトープを免疫系に提供する免疫原性プラットホームとして有用であるかもしれない。
HIV1に血清反応陽性の個体由来の血清は、実験室で適応化されたHIV1菌株を中和することができる。このような血清は、また、HIV1の初代単離物を中和することもできる(但し、力価を100倍以上高めることが必要である)。逆に、HIV1 gp120でワクチン接種された個体由来の血清は、HIV1の実験室適応化株を中和することができる(但し、血清反応陽性のヒト由来の血清に比べて力価を10倍以上高めることが必要である)が、初代単離物を(分析可能なレベルで)中和することはできない(Hanson、1994)。血清反応陽性の個体およびgp120を接種した個体由来の血清に見出される中和活性の有意部分は、V3ループに特異的なようである(Spear他、1994;Berman他、1994)。V3は高変異性であること、また、この領域に対する抗体は、HIV1の初代単離物や異種株を中和することができないかも知れないことを考えると、V3以外のエピトープ、すなわち、初代単離物を含む広範囲のHIV1菌株を中和することのできるエピトープに対して免疫応答を誘起するワクチンを開発することが必要であろう。
HIV1初代単離物および広範囲の実験室適応化HIV1株を中和する能力を有するモノクローナル抗体が分離された(Conley他、1994;Katinger他、1992)。このモノクローナル抗体によって認識されるエピトープは、HIV1 gp41の662〜667間のアミノ酸にあることがマッピングされ、アミノ酸配列ELDKWAを有する(Buchacher他、1994)。配列情報が誘導されたHIV1のいろいろな菌株(種々のHIV1クレード由来の菌株を含む)の約80%は、このエピトープのコア結合性配列LDKWを発現する(Conley他、1994)。したがって、このエピトープは、V3ループとは異なり、比較的保存性が高いものと考えられる。不幸なことに、このエピトープは、その通常の形態では、免疫原性が大きくない。HIV1に血清反応陽性のヒトの僅か50%が、このエピトープを含有するgp41領域に対して検知可能な抗体応答を有する(Broliden他、1992)。
以上のことから理解されるように、免疫不全ウイルスの組換えポックスウイルス、あるいは、宿主に接種したときに免疫不全ウイルス感染に対して免疫応答を誘起する免疫原性組成物であって、特に、NYVACまたはALVACに基づく組換体のように安全性が高く、HIV1gag(+プロ)(IIIB)、gp120(MN)(+トランスメンブレン)、nef(BRU)CTLエピトープ、pol(IIIB)CTLエピトープ;例えば、HIV1gag(+プロ)(IIIB)、gp120(MN)(+トランスメンブレン)、nefCTL1、nefCTL2、pol1(polCTL1)、pol2(polCTL2),pol3(polCTL3)、ELDKWAまたはLDKWエピトープのいずれかまたは全てを、特に、免疫原性を与えるような形でコードし、または、それらを任意に組み合わせて、例えば、それらの全てを組み合わせたような組成物が得られれば、現在の技術レベルを前進させるきわめて望ましいものとなるであろう。
発明の目的および概要
したがって、本発明の目的は、安全性の向上した改変組換えウイルスを提供し、且つ、そのような組換えウイルスを製造する方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、既知の組換えポックスウイルスワクチンに比べて安全性のレベルが高められた組換えポックスウイルス抗原、ワクチンまたは免疫学的組成物を提供することにある。
本発明のさらに別の目的は、宿主内で遺伝子産物を発現するための改変ベクターであって、該宿主内で弱毒化された毒性を有するように改変されたベクターを提供することにある。
本発明の他の目的は、安全性のレベルが高められた改変組換えウイルスまたは改変ベクターを用いて、インビトロ培養細胞内で遺伝子産物を発現させる方法を提供することにある。
本発明のこれらの目的およびその他の目的ならびに効果は、以下の記述から一層明らかになるであろう。
一つの態様として、本発明は、改変組換えウイルスであって、該ウイルスにコードされている遺伝子機能が不活化されていることにより毒性が弱毒化され安全性が高められた組換えウイルスに関する。その遺伝子機能は、非必須的なものである場合もあれば、毒性に関連している場合もある。ウイルスとしてはポックスウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルス、例えばニワトリポックスウイルスまたはカナリアポックスウイルスである。この改変組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域に、免疫不全性ウイルス由来の抗原もしくはエピトープおよび/またはCTLエピトープ、例えば、HIV1gag(+プロ)(IIIB)、gp120(MN)(+トランスメンブレン)、nef(BRU)CTL、pol(IIIB)CTL、ELDKWA、LDKWエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは、それらの全ての組合せをコードする外来DNA配列を含み得る。
他の態様として、本発明は、接種された宿主動物内に免疫応答を誘起する抗原性、免疫原性、ないしはワクチン組成物または治療用組成物に関し、該ワクチンは、担体と改変組換えウイルスとを含み、該組換えウイルスは、ウイルスにコードされている非必須遺伝子機能が不活化されていることにより毒性が弱毒化され安全性が向上している。本発明に従うこの組成物に用いられるウイルスはポックスウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルス、例えば、ニワトリポックスウイルスまたはカナリアポックスウイルスである。この改変組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域に、抗原性タンパク質、例えば、免疫不全ウイルス由来のものおよび/またはCTL、例えば、HIV1gag(+プロ)(IIIB)、gp120(MN)(+トランスメンブレン)、nef(BRU)CTL、pol(IIIB)CTL、ELDKWA、LDKWエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは、それらの全ての組合せをコードする外来DNA配列を含み得る。
さらに別の態様として、本発明は、改変組換えウイルスを含有する免疫原性組成物に関し、該改変組換えウイルスは、ウイルスにコードされている非必須遺伝子機能が不活化されていることにより毒性が弱毒化され安全性が高められている。この改変組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域に、抗原性タンパク質(例えば、免疫不全ウイルス由来のものおよび/またはCTL、例えば、HIV1gag(+プロ)(IIIB)、gp120(MN)(+トランスメンブレン)、nef(BRU)CTL、pol(IIIB)CTL、ELDKWA、LDKWエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは、それらの全ての組合せ)をコードする外来DNA配列を含み、該組成物は、宿主に接種されると、該抗原に特異的な免疫学的応答を誘起する能力を有する。
別の態様として、本発明は、毒性が弱毒化されているが安全性が高められた改変組換えウイルスを細胞[例えば、末梢血単核細胞(PBMC)またはリンパ節単核細胞(LNMC)]に導入することにより、該細胞内でインビトロに遺伝子産物を発現させる方法に関する。この改変ウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域に、免疫不全性ウイルス由来の抗原もしくはエピトープおよび/またはCTL、例えば、HIV1gag(+プロ)(IIIB)、gp120(MN)(+トランスメンブレン)、nef(BRU)CTL、pol(IIIB)CTL、ELDKWA、LDKWエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは、それらの全ての組合せをコードする外来DNA配列を含み得る。そのような細胞は、その後、個体内に直接再注入されるか、または特異的なCD8+CTL反応活性を上昇させるのに用いられて再注入に供される(半生体外治療)。
別の態様として、本発明は、インビトロ培養される細胞に、毒性が弱毒化され安全性が高められた改変組換えウイルスを導入することにより該細胞内で遺伝子産物を発現させる方法に関する。この改変組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域に、抗原性タンパク質、例えば免疫不全性ウイルス由来のもの例えば、HIV1gag(+プロ)(IIIB)、gp120(MN)(+トランスメンブレン)、nef(BRU)CTL、pol(IIIB)CTL、ELDKWA、LDKWエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは、それらの全ての組合せをコードする外来DNA配列を含み得る。得られた遺伝子産物は、ヒトまた動物に接種されて免疫応答を刺激することができる。産生された抗体は、各個体内で免疫不全ウイルスの予防および治療に有用であり、また、動物由来の抗体は、診断キット、アッセイまたはテストに用いられて、血清のようなサンプル中の免疫不全ウイルスまたはCTL抗原の有無(したがって、免疫応答すなわち抗体を生じたウイルスの有無)を測定するのに用いることができる。
さらに別の態様として、本発明は改変組換えウイルスに関し、該組換えウイルスは、ウイルスにコードされている非必須遺伝子機能が不活化されていることにより毒性が弱毒化されており、さらに、ウイルスゲノムの非必須領域に外因性のDNAを含有している。このDNAは、免疫不全ウイルスおよび/またはCTL抗原、例えば、HIV1gag(+プロ)(IIIB)、gp120(MN)(+トランスメンブレン)、nef(BRU)CTL、pol(IIIB)CTL、ELDKWA、LDKWエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは、それらの全ての組合せをコードすることができるものである。特に、遺伝子機能の不活化は、毒性因子をコードするオープンリーディングフレームを欠失させることにより、または、自然の宿主制限ウイルスを利用することによって行われる。本発明に従って用いるウイルスは、ポックスウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルス、例えばニワトリポックスウイルスまたはカナリアポックスウイルスである。オープンリーディングフレームは、J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、C7L−K1L、およびI4L(Goebel他による1990a,bの報告における用語による)から成る群、ならびにそれらの組合せより選択されるのが好ましい。この点に関し、オープンリーディングフレームは、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、A型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域もしくはリボヌクレオチド還元酵素のラージサブユニット、またはそれらの組合せから成る。NYVACとして同定されたワクシニアウイルスの改変Copenhagen株(Tartaglia他、1992)が使用される。しかしながら、COPAK株も本発明を実施するのに用いることができる。
最も好ましくは、本発明の組換えウイルスにおいて、外来DNAは、HIVgag(+プロ)(IIIB)、gp120(MN)(+トランスメンブレン)、2つのnef(BRU)CTL、および3つのpol(IIIB)CTLエピトープをコードし、または、外来DNAは、ELDKWAまたはLDKWエピトープをコードするものであり、そして、gp120またはgp160の領域で発現されるように挿入され(すなわち、該外来DNAは、V3ループにおいてELDKWAまたはLDKW改変gp120またはgp160、例えばELDKWAもしくはLDKWまたはそれらの一方または両方の繰り返しをコードするものである)、この結果、該エピトープが免疫原性を有する形態で発現される。この最も好ましい態様においても特に好ましいのは、2つのnef(BRU)CTLエピトープと3つのpol(IIIB)CTLエピトープが、CTL1、CTL2、pol1、pol2およびpol3であることである。別の好ましい態様においては、外来DNAがHIV1gp120+TMをコードし、V3ループが改変されて少なくとも1つ、好ましくは2つのELDKWAエピトープを含有する場合である。
別の態様として、本発明は、HIV免疫原および改変gp160またはgp120を包含する。すなわち、本発明は、HIV免疫原、好ましくは、HIVgag(+プロ)(IIIB)、gp120(MN)(+トランスメンブレン)、nef(BRU)CTL、pol(IIIB)CTL、およびELDKWAまたはLDKWエピトープから成る群より選ばれるHIV免疫原を含む。HIV免疫源はgp160またはgp120の一部であってもよい。かくして、例えば、HIV免疫原ELKDKWAまたはLDKWAは、gp120の領域またはgp160の領域の一部、例えば、gp120V3の一部となることができる。したがって、本発明は、gp160に本来は存在していないエピトープを含有するように改変されたgp120またはgp160を包含する。エピトープは、B細胞エピトープであってよい。特に、エピトープは、HIV1gag(+プロ)(IIIB)、gp120(MN)(+トランスメンブレン)、nef(BRU)CTL、pol(IIIB)CTL、およびELDKWAまたはLDKWエピトープの少なくとも1つとすることができる。V3ループ内でgp120を改変することができる。これらの免疫原や改変gp120またはgp160は、任意の適当なベクター、例えば本発明の組換体のようなポックスウイルス;または、Merrifield合成法のような適当な化学合成法により合成することができる。
本発明は、さらに別の態様として、本発明による組換えポックスウイルスの発現産物およびその使用、ならびに、本発明に従う免疫原や改変gp120およびgp160の使用、例えば、治療、予防、診断または試験に用いられる抗原性組成物、免疫原性組成物ないしはワクチン組成物を調製することに関する。さらに、本発明は、本発明の組換体由来のDNAを、サンプル中のHIV DNAの有無を検知するためのプローブとして使用したり、適当な発現プラスミドを用いるDNA免疫法に利用することに関する。
これらの態様およびその他の態様は、以下の詳細な説明に含まれ、それから明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
下記には、本発明を、例を挙げて詳しく説明してあるが、本発明はここで挙げた実施例に限定されるものではない。下記に示した図面を参照することで、本発明の理解が深まるであろう。
図1はチミジンキナーゼ遺伝子を欠失させるためのプラスミドpSD460を構築し、組み換えワクシニアウイルス・vP410を作製する方法を図式化して示したものである。
図2は毒性部位を欠失させるためのプラスミドpSD486を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP553を作製する方法を図式化して示したものである。
図3はATI部位を欠失させるためのプラスミドpMP494△を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP618を作製する方法を図式化して示したものである。
図4は赤血球凝集素遺伝子を欠失させるためのプラスミドpSD467を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP723を作製する方法を図式化して示したものである。
図5は遺伝子クラスタ[C7L-k1L]を欠失させるためのプラスミドpMPCK1△を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP804を作製する方法を図式化して示したものである。
図6はリボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニットを欠失させるためのプラスミドpSD548を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP866を作製する方法を図式化して示したものである。
図7は狂犬病ウイルス糖タンパク質・G遺伝子をTK欠失遺伝子座に挿入させるためのプラスミドpRW842を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP879を作製する方法を図式化して示したものである。
図8はC5オープンリーディングフレーム(ORF)を含むカナリアポックスウイルスPvuII断片のDNA塩基配列(配列番号66)を示したものである。
図9A,9Bは組み換えカナリアポックスウイルスvCP65(ALVAC-RG)を構築する方法を図式化して示したものである。
図10はNYVACを作製するために欠失したORFを図式化して示したものである。
図11はF8のORFを含むTROVAC・DNAの断片のヌクレオチド塩基配列(配列番号67)を示したものである。
図12はF7のORFを含むTROVAC・DNAの2356塩基対断片のDNA塩基配列(配列番号68)を示したものである。
図13A−13Dは同じかまたは別のワクチン(0日目、28日目、180目にワクチンを接種し、接種後0、7、28、35、56、173、187、208日目に抗体価測定)のいずれかで事前に免疫したボランティアにおける狂犬病ウイルス中和抗体価(RFFIT,IU/ml)、HDCおよびvCP65(105.5TCID50)の追加免疫効果をグラフ化したものである。
図14A−14DはpHIV32(配列番号78)に含まれるH6でプロモートされたHIV1・gp120(+トランスメンブレン)遺伝子、I3LでプロモートされたHIVIgag(+pro)遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
図15A−15FはpVQH6CP3L(配列番号79)におけるC3遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
図16はp2-60-HIV.3(配列番号91)におけるI3Lでプロモートされたnef・CTL2エピトープおよびH6でプロモートされたnef・CTL1エピトープのヌクレオチド塩基配列を示したものである。
図17A−17CはpC6L(配列番号92)におけるC6遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
図18A−18BはpC5POLT5A(配列番号105)に含まれるI3Lでプロモートされたpol2エピトープ、H6でプロモートされたpol1エピトープ、42Kでプロモートされたpol3エピトープのヌクレオチド塩基配列を示したものである。
図19A−19CはpNC5L-SP5(配列番号106)におけるC5遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
図20はALVAC,vCP205,またはペプチドCLTB-36による免疫後におけるHIVエンベロープ糖タンパク質に対するウサギ抗体反応を示したものである。
図21はALVAC,vCP205,またはペプチドCLTB-36による免疫後におけるHIV・MN・V3ループに対するウサギ抗体反応を示したものである。
図22はALVAC,vCP205,またはペプチドCLTB-36による免疫後におけるHIVエンベロープ糖タンパク質に対するモルモット抗体反応を示したものである。
図23はALVAC,vCP205,またはペプチドCLTB-36による免疫後におけるHIV・MN・V3ループに対するモルモット抗体反応を示したものである。
図24はHIV血清反応陽性者(患者1)のPBMC・HIV−1特異的CTLのin vitroでの刺激結果を示したものである。
図25患者2における図24の内容を示したものである。
図26a−cはpHIV59およびvCP1307に含まれるH6でプロモートされたHIVI・gp120+TM(ELDKWAエピトープとともに)遺伝子(配列番号124)および発現タンパク質(配列番号125)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
図27はvC1307感染細胞について、FACS分析結果を示したものである(HIV1血清反応陽性者の血清由来のALVAC,vP1286またはvCP1307に感染したHeLa細胞[上のパネル]または、ELDKWAエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体、IMA41-2F5[下のパネル]についてFACS分析を行った)。
図28a−cはpHIV60およびvP1313に含まれるH6でプロモートされたHIVI・gp120+TM(ELDKWAエピトープとともに)遺伝子(配列番号126)および発現タンパク質(配列番号127)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
図29はvP1313感染細胞について、FACS分析結果を示したものである(HIV1血清反応陽性者の血清由来のNYVAC,vP1286またはvP1313に感染したHeLa細胞[上のパネル]、または、ELDKWAエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体、IAM41-2F5[下のパネル]についてFACS分析を行った)。
図30a−cはpHIV61およびvP1319に含まれるH6でプロモートされたHIVI・gp120+TM(ELDKWAエピトープとともに)遺伝子(配列番号128)および発現タンパク質(配列番号128)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
図31はvP1319感染細胞について、FACS分析結果を示したものである(HIV1血清反応陽性者の血清由来のWR,vP1286またはvP1319に感染したHeLa細胞[上のパネル]または、ELDKWAエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体、IMA41-2F5[中段のパネル]、V3ループ、に特異的なマウスモノクローナル抗体50.1についてFACS分析を行った)。
図32、33a,33b,33c,34,35,36,37a,37b,37c,38a,38b,38cはvCP205およびプラセポ(placebo)(図32)を接種したサルにおける体重(図・32)、血球計算(図33a−c)、クレアチニン(図34)、SGOT(図35)、SGPT(図36)、ELISA(Anti-gp160 Mn/BR,-V3MN,-p24,図37a−c、38a−c)の比較を示したものである。上部パネル=サル 1−4、プラセボ;下部パネル=サル 5−8 vCP205;サル:1=白四方形、2=白ひし形、3=白三角形、4=白マル、5=黒四方形、6=黒ひし形、7=黒三角形、8=黒マル;縦軸は体重(wt)、横軸は週(矢印の点で接種実施)。図33a:白血球:左上と底部パネル=サル 1−4,プラセボ;右上と底部=サル5−8、vCP205;上端パネル:各WBC数、小さな黒マルが平均値(m)であることを除いては、図32と同じ;下段パネル示差細胞数、黒四方形=顆粒球、白四方形=リンパ球、黒ひし形=単球。図33b:レイアウトと表示は図33aと同様。上部パネルが赤血球、下部パネルが平均血球数、平均は、黒マルで表示。図33c:レイアウトは図33bと同じ。上部パネルがヘマトクリット、下部パネルがヘモグロビン。図34で、上部棒グラフはサル1−4、プラセボ;下部棒グラフ=サル5−8、vCP205;mg/l対日数、矢印は接種実施日を示す。サル1と5=黒棒、サル2と6=二点描棒(反対方向に斜線)、サル3と7=ドット棒、サル4と8=一点描棒(1つの方向に斜線)、平均は黒マル。図35:図34と表示は同じ。但し、縦軸がIU/l、横軸が日数。図36:図35と表示は同じ。図37a−cと図38a−c:プラセボを接種したサルおよびvCP205を接種したサルでのELISA分析結果、(図38a−c)、縦軸が抗体価(対数)横軸が週。矢印は注射実施を示す。図37aと38a=anti-gp160MN/BRU。図37bと38b=anti-V3MN。図37cと38c=anti-p24;サル1と5=白マル;サル2と6=黒マル;サル3と7=白逆三角形;サル4と8=黒逆三角形。
図39はvCP205接種のサルにおけるanti-HIVI(MN)中和抗体価を示したものである(表示は図38a−cと同じ)。
図40,41a,41b,41c,42,43a,43b,43c,43d,44a,44b,45a,45b,46a,46b,47a,47bは白血球数(図40)、血球計算(赤血球、図41a、ヘマトクリット41b、網状赤血球図41c)、プロトロンビン(図42)、生化学結果(総コレステロール、総タンパク、グルコース、図43a;ナトリウム、カリウム、図43b、クレアチニン、ビリルビン図43c;SGOT、SGPT、アルカリ性ホスファターゼ、図43d)、gp160 MN/BRU ELISA(対照図44a、試験動物図44b)、V3 MN ELISA(対照図46a、試験動物図46b)、vCP300とプラセボを接種したサルにおけるnef ELISA(対照図47a、試験動物図47b)(図40:レイアウトは図33aと同じ。表示は、上部パネルにおいて、平均値がドットマル(左)と白いマル(右)であり、下部パネルでは、パーセントの代わりに小数が使用され、黒四方形が好中球、白ひし形が好酸球、黒三角形が好塩基球である以外は図33aと同じである。図41a:レイアウトは図33bと同じ、表示は、平均がドットマル(左)と白マル(右)である以外は図33aと同じである。図41bは図33cと同じであり、表示は図41aと同じである。図41c:レイアウトも表示も図41bと同様で、上部パネルが網状赤血球、下段パネルが血小板である。図42:上段パネルがプラセボ、下段パネルがvCP300、表示は41cと同様。図43a:最上段がコレステロール、中段がタンパク質、下段がグルコース、白マルがプラセボ、黒マルがvCP300である。図43b:最上段がナトリウム、下段がカリウム、表示は43aである。図43c:最上段がクレアチニン、下段がビリルビン、表示は図43aと同様。図43d:最上段がSGOT、中断がSGPT、下段がアルカリ性ホスファターゼ、表示は図43aと同様。図44a、図44b:gp160 MN/BRU ELISA、対照とvCP300。表示は37aと38aとそれぞれ同じ。図45aと図45b:v3 MN ELISA、対照とvCP300、表示は37bと38bとそれぞれ同じ。図46aと46b:p34,ELISA,対照とvCP300,表示は図37cと38cと同様。図47aと47b:nef ELISA、対照とvCP300,表示は図44a−46bと同様。
発明の詳細な説明
新しいワクシニア・ウイルス・ワクチン株NYVAC(vP866)を開発するために、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン株を、すでに既知であるか、または、潜在的な毒性要素をコードしているゲノムの中の6個の非必須部位を欠失させることで改良を行った。ここで採用した、一連の欠失法について下記に説明する。ワクシニア制限断片のすべての、オープンリーディングフレーム、ヌクレオチドの位置の命名については、Geobelらが報告している(1990a,b)用語に準じている。
欠失遺伝子座を、外来の遺伝子の挿入のための受容遺伝子座となるように操作した。下記リストは、NYVACから欠失させる遺伝子、部位を示したものである。また、この中には、ワクシニア組換体(vP)から欠失する遺伝子、部位を略字で示したもの、欠失部位のオープンリーディングフレーム(Goebelら、1990a,b)が含まれる。
(1)チミジンキナーゼ遺伝子(TK; J2R)、vP410
(2)出血性領域(u;B13R +B14R)vP553
(3)A型細胞封入体(ATI;A26L)vP618
(4)赤血球凝集素遺伝子(HA; A56R)vP723
(5)宿主域遺伝子部位(C7L-K1L)vP804
(6)リボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニット(I4L)vP866(NYVAC)
NYVACは、遺伝子操作技術により、18個の毒性遺伝子をコードしているオープンリーディングフレーム(ORF)と宿主域領域を欠失させることで作製したワクシニアウイルスである。このNYVACは多くの基準によって高度に弱毒化されている。弱毒化させる場合の基準としては、(i)新生マウスの大脳内に接種した後の減少された毒性、(ii)遺伝的(NU+/NU+)免疫不全マウスまたは化学的(シクロホスファミド)免疫不全マウスにも接種可能であること、(iii)免疫不全マウスに接種しても播種感染を引き起こさないものであること、(iv)重大なウサギの皮膚の硬化や腫瘍化を起こさないこと、(v)接種部位から速やかに消失すること、(vi)ヒトを含む組織培養細胞における複製能力が減少されていることがある。このように弱毒化されたものであるにもかかわらず、NYVACをベースにしたベクターは、外来性の免疫原に優れた免疫応答を示し防御免疫を提供している。
TROVACは弱毒化ニワトリポックスウイルスのことで、ニワトリポックスウイルスのFP−1ワクチン株由来のプラーククローン化分離菌であったものであり、1日齢鶏の接種用にその使用が許可されているものである。ALVACは弱毒化カナリアポックスウイルスをベースにしたベクターであり、これはすでに使用許可されているカナリアポックスウイルスであるカナポックス(Kanapox)(Tartagliaら、1992)のプラーククローン化誘導体であったものである。ALVACには、カナポックスの一般特性の一部と類似した特性がある。外来性の免疫原を発現させるALVACをベースにした組み換えウイルスもワクチンベクターとして有効であることはすでに認められていることである(Tartaliaら、1993a,b)。このアビポックスベクターは、生産的な複製のためには、鳥類種に限定して使用される。ヒトの細胞培養では、カナリアポックスウイルス複製が、ウイルス複製サイクルの中の、ウイルスDNA合成の前に、早期に中止してしまう。それにもかかわらず、このウイルスを外来性免疫原が発現するように操作すると、哺乳動物細胞中でin vitroの真正発現とプロセシングが観察され、これを種々の哺乳動物種に接種した場合には、外来免疫原に対する抗体を誘導し細胞性免疫応答を示し、さらに、同種病原体に対する防御作用をするのである(Taylerら、1992;Tayler等、1991)。カナリアポックスウイルス/狂犬病ウイルス糖タンパク質組換体(ALVAC−RG)に関するヨーロッパとアメリカでの最近のフェーズI・臨床試験では、患者はこの実験ワクチンに十分な耐えて、しかも、狂犬病ウイルス中和抗体価がその予防可能レベルにまで達した(Cadozら、1992,Friesら、1992)。さらに、ALVAC−RGの接種者由来の末梢血単核細胞(PBMC)に対して、精製した狂犬病ウイルスで刺激すると、そのリンパ球増殖も有意なレベルに達した(Friesら、1992)。
これらNYVAC、ALVAC、TROVACは、ウイルスやベクターの病原性という観点から、それらの使用上の安全手順ガイドラインやウイルスやベクターなどの遺伝子物質の物理的封じ込めに関するガイドラインを出している米国国立衛生研究所(NIH)と米国組み換えDNA諮問委員会は、これら3つについて、その物理的封じ込めレベルをBSL2レベルからBSL1レベルに緩和したという点で、ポックスウイルスの中では独特なものとして認識されるものである。物理的封じ込めレベルがBSL1であるポックスウイルスは他にない。通常使用されているポックスウイルスであるワクシニアウイルスのコペンハーゲン株でさえ、その物理的封じ込めのレベルはBSL2なのである。従って、これらNYVAC、ALVAC、TROVACは、ほかのどのポックスウイルスよりもその病原性が低いということが技術的にも認知されていることになる。
NYVACをベースにした、およびALVACをベースにした組み換えウイルスは両方とも、ヒトPBMC由来のCD8+CTLにin vitroで特異的に刺激反応を示すことが報告されている(Tartagliaら、1993a)。種々のHIV−1・エンベロープ・糖タンパク質を発現するNYVACまたはALVAC組換体で免疫したマウスでは、第二次接種で復活可能であった一次CTL応答と記憶HIV特異的CTL応答を示している(Tartagliaら、1993a,Coxら、1993)。ALVAC−envおよびNYVAC−envの組換体(ともにHIV−1エンベロープ糖タンパク質を発現)は、HIV−1に感染したヒトの末梢血単核細胞(PBMC)において、強いHIV−特異的CTL応答を高めた(Tartagliaら、1993a;Coxら、1993)。急性感染させた自己由来PBMCを残余PBMCの刺激細胞として使用した。外来性IL−2の不存在下での接種後10日目に、細胞のCTL活性を評価した。ALVAC−envおよびNYVAC−envの組換体がマウスにおける高レベルの抗−HIV活性を刺激した。
本願出願人は、多数のHIV1抗原およびHIV1・T−細胞エピトープを発現するALVAC組換体であるvCP300(ALVAC-MN120TMGNp)を作製した。このvCP300はHIV1(IIIB)gag(および、プロテアーゼ)タンパク質を発現する。(プロテアーゼタンパク質の発現により、gagポリタンパク質が正確にプロセッシングされる)。vCP300は、ある形態のHIV1(MN)エンベロープ糖タンパク質も発現し、gp120がgp41由来のトランスメンブレンアンカー配列に融合される。vCP300は、2個の(2)HIV1(BRU)nef・CTLエピトープと3個の(3)HIVI(IIIB)pol・CTLエピトープも発現する。しかし、vCP300は機能性逆転写酵素活性は示さない。さらに、vCP300は、SIV・サル科マカク属のサル(アカゲザル)モデルでの病原性と関連しHIV1毒性と関連する機能性nef遺伝子産物は発現しない(Millerら、1994;Spinaら、1994)。したがって、vCP300は、gag、env、polおよびnefの免疫的に重要な抗原またはエピトープを発現するが、polおよびnefと関連した有害な酵素または病原性活性は示さないのである。
上記の通り、vCP300は、ある形態のHIV1(MN)エンベロープ糖タンパク質を発現し、そこでは、多数のgp41配列が欠失されている。HIV1(MN)エンベロープ・糖タンパク質と関係がある免疫的に重要なエピトープの殆どが、gp41上よりもむしろgp120上で見られたので、この組換体により発現されるエンベロープ・糖タンパク質の免疫原性が悪影響を受けることはないことが予想される。事実、比較研究では、HIV1・gp120サブユニットワクチンが、チンパンジーをHIV1感染から防御したが、他方、HIV1・gp160サブユニットワクチンではその防御ができなかった(Bermanら、1990)。これら2つのワクチンの効果がなぜ異なるのかについてはまだ分かっていない。しかし、エピトープ・gp41に対する抗体がin vitroでHIV1感染を増進させることが分かっている(Robinsonら、1990)。HIV1の血清反応陽性者において、gp41の推定免疫抑制部位に対する抗体が、AIDSの無発症と関連していることから、この部位が病原性に関してなんらかの役割を果たしていることは知られたことである(Klasseら、1988)。さらに、gp41のC末端部位に対する抗体はHLAクラスII抗原との交差反応し、(Goldingら、1988)、抗原特異的リンパ増殖性反応を阻害することも知られたことである(Goldingら、1989)。
vCP300により発現されたエンベロープ・糖タンパク質の場合には、トランスメンブレン部位と関連した28アミノ酸を除いて、いかなるgp41配列も含んでいないので、これらのgp41と関連した有害な影響は避けられる。さらに、vCP300により発現したエンベロープ・糖タンパク質の場合、gp41上の抗血清により認識される免疫優性エピトープが、HIV1血清陽性者の感染のどの段階においても含まれてない(Shaffermanら、1989)。従って、このエピトープに対する反応を基礎にした診断試験が、ワクチン接種者とHIV1感染者を区別するために使用できる。gp41抗体アッセイにより、vCP300接種者とHIV1感染者を区別できることは重要である。その理由は、vCP300接種者は高レベルのp24抗体を保持していることが予想されるので、大抵の診断キット(HIV1p24抗体の存在をアッセイする)は役にたたなくなるからである。他には、HIV−1感染者では抗−gp41抗体が産生されることが予想されるが、vCP205またはvCP300の接種者にはそれは考えられない。その理由は、vCP205またはvCP300にはgp41が欠失しているからである。
ウサギとモルモットにALVAC組換体(vCP205;ALVAC-MN120TMG)を接種すると、vCP300が発現させたと同様の、細胞表面関連型HIV1・gp120(120TM)およびGag/proを発現した。ウサギとモルモットにvCP205を接種して、さらに、HIV1・T−B・ペプチドで二次免疫させた。ALVACをベースにしたプロトコールによる接種で、HIV1・gp160−抗体およびV3ループ特異的抗体の産生が誘発されたが、このことは、HIV1・gp120細胞表面型を発現するALVAC組換体が、HIV1−特異的免疫応答を誘発することを示している。
vCP300は、HIV1・gp120・エンベロープ・糖タンパク質、細胞表面関連型HIV1・Gag・タンパク質、CTLエピトープを含むHIV1・nefからの2つの部位、CTLエピトープを含むHIV1・polからの3つの部位を発現する。gp41を含まないHIV1・エンベロープ・糖タンパク質が発現されることにより、gp41抗体の検査を使用することで、vCP300の被接種者をHIV1−感染者から区別でき、種々のgp41エピトープと関係する有害な反応を減らすことができる。HIV1・gp160を発現する従来のALVAC組換体が、ヒトにおけるHIV1特異的液性免疫反応および細胞性免疫反応を誘発することが報告されているが(Pialouxら、1995)、さらに、Gag、Pol,Nef、エピトープを追加することにより(および、有害なgp41エピトープを除去することにより)、vCP300により誘発された免疫応答をvCP125と比較してさらに高め範囲を広げる効果があり、これにより、有効なHIV1ワクチンまたは有効な免疫原、抗原物質を提供できることになる。
vCP205またはvCP300で免疫したMacaca Fascicularis(サル科マカク属のサル)において、抗体反応(抗HIV)が観察されており、このことは、これらの組換体が、さらに利用度の高い有効なものであることを示している。
従来のELDKWAやLDKWは、その本来の形状では免疫原性が高くはないために、その免疫原性を高めたものが本発明の組換体であり、gp120のV3ループの中やgp120の別の部位の中、あるいは、gp160エンベロープの一部分の形で、免疫系に効果的に免疫原性を与えることができる。
ALVAC組換体(vCP1307)、NYVAC組換体(vP1313)、COPAK組換体(vP1319)は、HIV1・gp120+TM・遺伝子産物を発現し、そこで、V3ループが、ELDKWA・エピトープの二つのコピを含むように改変される。このgp120+TM・遺伝子産物(ELDKWA・エピトープとともに)は、vCP1307、vP1313,vP1319に感染した細胞の表面に発現する。
このHIV1・gp120+TM(またはgp160)のV3ループは、単に線状HIV1エピトープではない線状エピトープの免疫プラットフォームとして使用できるのである。これらの組換体により産生されたp120+TM・タンパク質を、ポックスウイルスに感染した細胞から分離することができ、それをサブユニットワクチンの形で(何かの構成成分として、あるいは、抗原物質、免疫物質として)ヒトに接種可能である。この組換体から産生したタンパク質およびそれを抗原にして誘発された抗体をHIVの有無の診断に使用できる。従って、本発明は、HIV免疫原および改変したgp120およびgp160を含む。そのようなエンベロープをベースにした免疫原(HIV免疫原または改変gp120またはgp160)は、真核または原核発現ベクターからも誘導でき、サブユニット剤として使用できるし、適当な発現プラスミドを使用することで、DNA免疫により接種が可能である。DNA免疫の技術はすでに公知となっている技術である。このDNA免疫に関する文献には次のようなものがあり、添付してある。「免疫療法および免疫法のための遺伝子直接移転」(Nabel and Felgner, Tibteck, May 1993, 11; 211-215)、「DNAワクチンによるインフルエンザからのイタチ(ferret)の防御」(Webster et al., Vaccine, 1994 12(16), 1495-1498)。組換体であるvCP1307、vP1313、vP1319由来のDNAを、すでに既知であるハイブリダイゼーション法を使用してある特定のサンプルにおけるHIV・DNAの検出プローブとして活用できるし、すでに既知の技術でPCRプライマーを作製することにも利用できる。
外来性免疫原に対して液性免疫と細胞性免疫の両方を誘導する(Tartagliaら,1993a,b; Taylorら、1992; Konishiら、1992)NYVAC、ALVAC、TROVAC・ベクターの弱毒化されたプロフィールにより、これらの組換体には、すでに述べたワクシニアをベースにした組み換えウイルスよりも明らかに優れた長所がある。
本発明にかかる組み換えウイルス、免疫原、改変gp120またはgp160、DNAまたは発現物質を、抗原、ワクチン、治療剤として使用する場合に、非経口(皮内、筋肉内、皮下)の投与が可能である。このような投与法が可能であるので、全身的な免疫応答が期待できる。
より一般的に、本発明の抗原物質、免疫ワクチン物質、免疫治療剤(本発明にかかるポックスウイルス組換体、それからの発現物質、本発明の免疫原、DNA、改変gp120またはgp160を含む)は、製薬業の当業者にはすでに知られた技術により調剤が可能である。本発明の物質を含む、そのような製剤の投与量は、年齢、性、体重、患者の状況、投与経路などを考慮に入れて、医学の当業者にはすでに既知の方法で決定できる。これらの製剤は、単独で投与してもよいし、別の薬剤と併用してもよいし、順番に投与してもよい。また、別の免疫原や抗原やワクチンと一緒に、または一定の順序で投与してもよく、血清反応陽性者に治療薬として投与してもかまわない。さらに、これらの製剤は、単独で投与してもよいし、別の製剤と併用してもよいし、順番に投与してもよい。また、別の免疫原や抗原やワクチンと一緒にまたは一定の順序で投与してもよく、血清反応陰性者に抗原、免疫原、治療薬として投与してもかまわない。その他の製剤には、免疫不全ウイルスから得た精製抗原や、組み換えポックスウイルスやその他のベクター系の抗原による発現物質から精製した抗原も含み、さらに、其の他の免疫不全抗原や生物学的応答改変物質(例:サイトキニン;共働刺激分子)を発現する組み換えポックスウイルスを含むものである。年齢、性、体重、患者状況、投与経路などのすでに知られている要素を考慮に入れて、本発明の物質と他の製剤を併用投与してもかまわない。投与のために、本発明の物質を、例えば口、鼻、肛門、膣等の開口部から投与できるように液体状の製剤にしてもよいし、懸濁液、シロップ、エリキシル剤の形にしてもよい。皮下、皮内、筋肉内、静脈内などの非経口投与用に懸濁液やエマルジョン、注射液の形にしてもよい。さらに、本発明の組み換えポックスウイルス、それからの発現物質、本発明の免疫原、DNA、改変gp120またはgp160を、適当なキャリア、希釈剤、蒸留水、生理食塩水、グルコースなどの添加剤に混ぜて使用してもかまわない。
さらに、本発明の組み換えポックスウイルスが発現する物質は、血清反応陽性または陰性のヒト、または、動物において、免疫応答で促進された用として直接に使用可能である。この発現物質を本発明の物質の代わりに使用してもよいし、本発明の物質に追加して使用してもよい。同様に、本発明の物質を免疫原として使用もできる。
さらに、本発明の組み換えポックスウイルス、それからの発現物質、本発明の免疫原、改変gp120またはgp160は、ヒトおよび動物において、免疫応答、抗体反応を高める。既知の技術を使用して、この抗体からモノクローナル抗体を調製でき、このモノクローナル抗体を、特別な免疫不全ウイルス抗原の有無、従って、そのウイルスの有無、またはウイルスや抗原に対する免疫応答が単に高められたかどうかを決定するための抗体結合アッセイまたは診断キットに利用可能である。これらのモノクローナル抗体は、免疫不全ウイルスまたは本発明の組み換えポックスウイルスの発現物質を発見するための免疫吸着クロマトグラフィーにも適用可能である。
モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞が産生したイムノグロブリンである。モノクローナル抗体は、単一の抗原決定基と反応し、従来の血清由来の抗体よりもより高い特異性を有する。多数のモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより所望する特異性、結合活性、アイソタイプを有する個別の抗体を選択することができる。ハイブリドーマ細胞系が一定で安価な化学的に同一の抗体ソースを提供し、そのような抗体製剤の標準化を容易に行える。モノクローナル抗体の生産法は当業者にはよく知られた技術であり、例えば、米国特許第4,196,265(Koprowski)(1989年4月)に示されており、参考文献として、ここにも添付してある。
モノクローナル抗体の使用法も知られた技術である。診断法での応用がその一つであり、例えば、米国特許第4,376,110(David, G.およびGreene, H.)(1983年3月8日に成立)があり、参考文献として添付してある。モノクローナル抗体は、免疫吸着クロマトグラフィーによる物質の検出にも使用されており、例えば、Scientific American 243:66,70でのMilsten, C. 1980の論文があり、これも参考文献として添付してある。
さらに、本発明の組み換えポックスウイルス、それからの発現物質、本発明の免疫原、改変gp120またはgp160は、患者への後の再注入ために、in vitroまたはex vivo(体外)で、リンパ球またはCTLのような細胞における反応を高めるのに使用できる。患者が血清反応陰性者の場合には、再注入は、能動免疫のような免疫応答、抗原応答の免疫応答を高めるためのものである。血清反応陽性者の場合には、再注入は免疫不全ウイルスに対する免疫系を刺激して増進させるのが目的である。
本発明の組換体によるDNAは、サンプル内のHIV・DNAの有無を検出するプローブとして使用できるし、PCRプライマーの作製に応用でき、すでに既知の技術で適当な発現プラズマを使用してDNA免疫用に使用可能である。(NabelおよびFelgerおよびWebster et al.,前出、を参照されたい)
従って、本発明の組み換えポックスウイルスには、種々の使用法がある。例えば血清陰性者に対して投与する抗原、免疫原、ワクチン組成物として使える。血清陽性者には、治療剤として、免疫不全ウイルスに対する免疫系の強化のために使える。本発明によれば、in vitroで、発明の抗原、免疫原、改変gp120またはgp160を作製可能であり、その場合でも、これらの作製したものは、抗原、免疫原、ワクチン組成物または治療剤として使用可能である。本発明の組み換えポックスウイルスを直接に投与するか、このウイルスの発現物質を投与して得られた抗体は、例えば血清等のサンプル中に抗原があるかないか、例えば、血清中の免疫不全ウイルスまたはCTLの有無、ウイルスや特定の抗原に免疫応答を示したかどうかを探知するための診断キット、試験キットに使用され、さらに、免疫吸着クロマトグラフィに使用される。(本発明にかかる免疫原および改変gp120またはgp160は、利用価値のある抗体を産生させるために使用可能である。)ハイブリダイゼーション・プローブとして使うDNAやPCRプライマーの作製、DNA免疫にも使用(再注入)できる。本発明の組み換えポックスウイルス、それからの発現物質、本発明の免疫原、改変gp120またはgp160は、刺激細胞を作製するのに使用でき、その刺激細胞は免疫応答(抗原反応、免疫反応、能動免疫)を刺激し、あるいは、免疫系を高めて強化(例えば、免疫不全患者あるいは血清反応陽性者の免疫系を強化)するのに使用可能である。本発明の実施例としてまだ他の使用法はある。
本発明について、図面を参照して、下記の例を検討することで、さらに理解が深まり多くの長所を理解できるであろう。
実施例
DNAクローニングと合成 プラスミドを構築し、スクリーニングし、定法に従って増殖させた(Maniatis et al.,1982;Perkus et al.,1985;Piccini et al.,1987)。制限エンドヌクレアーゼは、Bethesda Research Laboratories,Gaithersburg,MD,New England Biolabs,Beverly,MAおよびBoehringer Mannheim Biochemicals,Indianapolis,INより入手した。E.coliポリメラーゼクレノー断片はBoehringer Mannheim Biochemicalsより入手した。BAL−31エキソヌクレアーゼおよびファージT4DNAリガーゼはNew England Biolabsより入手した。試薬は供給者によって特定された方法で用いられた。
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはBiosearch8750またはApplied Biosystem380BDNA合成装置により前述のように調製された(Perkus et al.,1989)。DNAシークエンスはジデオキシ法により(Sanger et al.,1977)Sequenase(Tabor et al.,1987)を用いて前述のとおり行った(Guo et al.,1989)。配列確認のためのDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅(Engelke et al.,1988)を、カスタム合成オリゴヌクレオチドプライマーとGeneAmp DNA増幅試薬キット(Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT)を用いて自動化Perkin Elmer Cetus DNAサーマルサイクラー中で行った。過剰のDNA配列を、制限エンドヌクレアーゼ消化とそれに続くBAL−31エキソヌクレアーゼによる限定切断および合成ヌクレオチドを用いた突然変異(Mandecki,1986)によりプラスミド中から除去した。
細胞、ウイルス、および形質導入 ワクシニアウイルスコペンハーゲン株の起源と培養条件は以前に記述されている(Guo et al.,1989)。組換えによる組換ウイルスの開発、ニトロセルロースフィルターのin situハイブリダイゼーションおよびベータガラクトシダーゼ活性によるスクリーニングは以前に記述された(Piccini et al.,1987)。
ワクシニアウイルスコペンハーゲン株およびNYVACの起源と培養条件は以前に記述されている(Guo et al.,1989;Tartaglia et al.,1992)。組換えによる組換ウイルスの開発、ニトロセルロースフィルターのin situハイブリダイゼーションおよびベータガラクトシダーゼ活性によるスクリーニングは以前に記述された(Panicali et al.,1982;Perkus et al.,1989)。
親カナリアポックスウイルス(Rentschler株)はカナリアのためのワクチン株である。このワクチン株は野生株単離体から得られ、ニワトリ胚繊維芽細胞において200回以上の連続継代を通して弱毒化された。マスターウイルスシードは寒天の下で4回の連続的プラーク精製にかけられ、1つのプラークは5回のさらなる継代により増幅され、そのあとそのストックウイルスが生体外組換えテストにおいて親株として用いられた。プラーク精製されたカナリアポックス単離体はALVACと命名された。
FP−1と命名されたニワトリポックスウイルス(FPV)株は以前に記述された(Taylor et al.,1988a)。それは生後一日のニワトリのワクチン接種に有用な弱毒化されたワクチン株である。親ウイルス株Duvetteはフランスでニワトリからのニワトリポックスかさぶたとして得られた。このウイルスはニワトリ受精卵中で約50回連続継代され続いてニワトリ胚繊維芽細胞において25回継代された。このウイルスは4回の連続的プラーク精製にかけられた。1つのプラーク単離体がさらに初代CEF細胞中で増幅され、TROVACと命名され、ストックウイルスとされた。
NYVAC、ALVACおよびTROVACウイルスベクターおよびその派生体は以前に記述されたように増殖された(Piccini et al.,1987;Taylor et al.,1988a,b)。VERO細胞およびニワトリ胚繊維芽細胞(CEF)は以前に記述されたように増殖された(Taylor et al.,1988a,b)。
実施例1 チミジンキナーゼ遺伝子(J2R)の欠失のためのプラスミドpSD460の構築
今、図1を参照しているが、プラスミドpSD406は、pUC8中にクローン化されたワクシニアHindIII J(位置83359−88377)を含んでいる。pSD406はHindIIIおよびPvuIIで切断され、HindIII Jの左側からの1.7kb断片が、HindIII/SmaIで消化されたpUC8中にクローン化され、pSD447となった。pSD447はJ2R(位置83855−84385)全体の遺伝子を有している。開始コドンはNlaIII部位内部に含まれ、終止コドンはSspI部位内部に含まれている。転写方向は図1中に矢印で示されている。
左側の隣接アーム(flanking arm)を得るため、0.8kbpのHindIII/EcoRI断片をpSD447から単離し、続いてNlaIIIで消化し、0.5kbpのHindIII/NlaII1断片を単離した。アニーリングさせた合成ヌクレオチドMPSYN43/MPSYN44(配列番号1/配列番号2)
を0.5kpHindIII/NlaIII断片とともにHindIII/EcoRIで切断したpUC18中へ連結し、プラスミドpSD449を生成した。
ワクシニア右隣接アームおよびpUCベクター配列を含む制限酵素断片を得るために、pSD447をワクシニア配列内部においてSspIで(部分的に)、そしてHindIIIでpUC/ワクシニア結合部分において消化し、2.9kbpのベクター断片を単離した。このベクター断片を、アニーリングさせた合成ヌクレオチドMPSYN45/MPSYN46(配列番号3/配列番号4)
と連結し、pSD459を創出した。
隣接アームの左側と右側とをひとつのプラスミド中で結合するために、0.5kbpのHindIII/SmaI断片をpSD449から単離し、HindIII/SmaIで消化したpSD459と連結し、プラスミドpSD460を創出した。pSD460を、野生型親ワクシニアウイルスコペンハーゲン株VC−2との組換えのドナープラスミドとして用いた。MPSYN45(配列番号3)をテンプレートとして、および相補的な20merオリゴヌクレオチドMPSYN47(配列番号5)(5’TTAGTTAATTAGGCGGCCGC 3’)をプライマーとして用いたプライマーエクステンション法により、32P標識されたプローブを合成した。組換えウイルスvP410がプラークハイブリダイゼーションにより同定された。
実施例2 出血性領域(B13R+B14R)の欠失のためのプラスミドpSD486の構築
今、図2を参照しているが、プラスミドpSD419は、pUC8中にクローン化されたワクシニアSalI G(位置160744−173351)を有している。pSD422は、右側に近接したワクシニアSalI断片、pUC8中にクローン化されたSalI J(位置173351−182746)を有している。出血性領域、u、B13R−B14R(位置172549−173552)を欠失させたプラスミドを構築するために、pSD419を左側隣接アームの源として、そしてpSD422を右側の隣接アームの源として用いた。領域uの転写方向は図2において矢印で示されている。
所望でない配列をpSD419から取り除くため、NcoI部位(位置172253)の左側の配列は、pSD419をNcoI/SmaIで消化し続いてE.coliポリメラーゼクレノー断片により平滑末端化したのちライゲーションし、プラスミドpSD476を生成した。ワクシニア右隣接アームは、pSD422を、B14Rの終止コドンでHpaIで消化し、そして0.3kbp右側をNruIで消化して得た。この0.3kbp断片を単離し、pSD476から単離した3.4kbpのHincIIベクター断片と連結し、プラスミドpSD477とした。ワクシニアu領域のpSD477の部分的欠失の位置は三角形で示した。残りのプラスミドpSD477中のB13Rをコードしている領域配列を、ClaI/HpaIでの消化により取り除き、その結果生じた断片を、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチドSD22mer/SD20mer(配列番号6/配列番号7)
と連結させ、pSD479とした。pSD479は、BamHI部位が続いている開始コドン(下線)を有している。E.coliベータガラクトシダーゼをB13−B14(u)欠失座中に、uプロモーターのコントロール下で配置するため、3.2kbpのベータガラクトシダーゼ遺伝子(Shapira et al.,1983)を含むBamHI断片を、pSD479のBamHIに挿入し、pSD479BGとした。pSD479BGは、ワクシニアウイルスvP410との組換えのドナープラスミドとして用いた。組換えワクシニアウイルスvP533は、色素基質X−gal存在下でプループラークとして単離された。vP533において、B13R−B14R領域は欠失されベータガラクトシダーゼで置換されていた。
ベータガラクトシダーゼ配列をvP533から取り除くため、pSD477からの派生体でポリリンカー領域は含むが、u欠失結合部分の開始コドンは有さないpSD486を用いた。第1に、前述のpSD477由来ClaI/HpaIベクター断片を、アニーリングさせた合成ヌクレオチドSD42mer/SD40mer(配列番号8/配列番号9)
と連結させ、プラスミドpSD478とした。次にpUC/ワクシニア結合部分のEcoRI部位を、pSD478をEcoRIで消化し続いてE.coliポリメラーゼクレノー断片により平滑化し、ライゲーションすることにより破壊して、プラスミドpSD478E-とした。pSD478E-をBamHIおよびHpaIで消化したのち、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチドHEM5/HEM6(配列番号10/配列番号11)
と連結し、プラスミドpSD486とした。pSD486は、組換えワクシニアウイルスvP533との組換えにドナープラスミドとして用いて、X−gal存在下で透明プラークとして単離されたvP533を創出した。
実施例3 ATI領域(A26L)欠失のためのプラスミドMP494Δの構築
今、図3を参照しているが、pSD414はpUC8中にクローン化されたSalI Bを含んでいる。A26L領域の左側の所望でないDNA配列を取り除くため、pSD414を、XbaIでワクシニア配列の内部(位置137079)で、HindIIIでpUC/ワクシニア結合部分で切断し、続いてE.coliポリメラーゼクレノー断片で平滑化しライゲーションし、プラスミドpSD483とした。A26L領域の右側の所望でないワクシニア配列を取り除くため、pSD483をEcoRIで切断し(位置140665およびpUC/ワクシニア結合部分)、ライゲーションし、プラスミドpSD484とした。A26Lコード領域を除去するため、pSD484はNdeIで(部分的に)A26LORFの僅かに上流を(位置139004)、HpaIでA26LORFの僅かに下流を(位置137889)切断した。5.2kbpのベクター断片を単離し、アニーリングさせた人工合成オリゴヌクレオチドATI3/ATI4(配列番号12/配列番号13)
と連結し、A26L上流領域を再構築し、BglII、EcoRIおよびHpaI制限酵素部位を有する短いポリリンカー領域で、A26LORFを上記のように置換した。構築されたプラスミドをpSD485と命名した。pSD485のポリリンカー領域のBglIIおよびEcoRI部位は固有ではないので、所望でないBglIIおよびEcoRI部位をpSD483(前述)から、BglII(位置140136)、およびEcoRIでpUC/ワクシニア結合部分を消化し、続いてE.coliポリメラーゼクレノー断片で平滑化することにより取り除いた。生成されたプラスミドをpSD489と命名した。pSD489由来のA26LORFを含む1.8kbpのClaI(位置137198)/EcoRV(位置139048)断片を、対応するpSD485由来の0.7kbpポリリンカーを含むClaI/EcoRV断片で置換し、pSD492を生成した。pSD492のポリリンカー領域中のBglIIおよびEcoRI部位は固有である。
E.coliベータガラクトシダーゼ遺伝子(Shapira et al.,1983)をワクシニア11kDaプロモーター(Bertholet et al.,1985;Perkus et al.,1990)の支配下で含む3.3kbpのカセットをpSD492のBglII部位に挿入し、pSD493KBGとした。プラスミドpSD493KBGはレスキューウイルスvP553の組換えにおいて用いられた。組換えワクシニアウイルスvp581は、ベータガラクトシダーゼをA26L欠失領域内に有し、X−gal存在化でブループラークとして単離された。
ベータガラクトシダーゼ遺伝子配列を組換えワクシニアウイルスvP581から除去するためのプラスミドを開発するために、プラスミドpSD492のポリリンカー領域を、合成オリゴヌクレオチドMPSYN177(配列番号14)
を用いた突然変異により欠失させた(Mandecki,1986)。生成されたプラスミド、pMP494Δにおいては、A26L ORFの全体を含む位置[137889−138937]を取り巻くワクシニアウイルスDNAが欠失していた。pMP494Δと、べータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体vP581との間での組換えにより、ワクシニア欠失変異体vP618が、X−gal存在下での透明プラークとして単離され、得られた。
実施例4 血球凝集素遺伝子(A56R)の欠失のためのプラスミドpSD467の構築
今、図4を参照しているが、ワクシニアSalI G制限酵素断片(位置160744−173351)はHindIII A/B結合部分(位置162539)で交差している。pSD419は、pUC8中にクローン化されたワクシニアSalI G断片を有している。血球凝集素(HA)遺伝子の転写方向は図13中に矢印で示されている。HindIII Bから派生したワクシニア配列は、pSD419をHindIIIでワクシニア配列内部とpUC/ワクシニア結合部分を消化し続いてライゲーションすることにより取り除いた。生成されたプラスミド、pSD456は、HA遺伝子A56Rを、左に0.4kbpのワクシニア配列、右に0.4kbpのワクシニア配列と隣接した状態で有している。A56Rコード配列を、pSD456をRsaIで(部分的;位置161090)A56Rコード配列の上流を、またEaqIで(位置162054)遺伝子の末端ちかくを切断することにより除去した。3.6kbpRsaI/EaqIベクター断片を単離し、アニーリングさせた合成ヌクレオチドMPSYN59(配列番号15)、MPSYN62(配列番号16)、MPSYN60(配列番号17)およびMPSYN61(配列番号18)
とライゲーションし、A56R ORFの上流域を再構築し、A56R ORFを上記のポリリンカー領域で置換した。その結果生成されたプラスミドはpSD466である。プラスミドpSD466中のワクシニア欠失は位置[161185−162053]を含んでいる。pSD466中の欠失部位は図4に三角形で示されている。
E.coliベータガラクトシダーゼ遺伝子(Shapira et al.,1983)をワクシニア11kDaプロモーター(Bertholet et al.,1985;Guo et al.,1989)の支配下で含む3.3kbpのカセットをpSD466のBglII部位に挿入し、pSD466KBGとした。プラスミドpSD466KBGはレスキューウイルスvP618の組換えにおいて用いられた。組換えワクシニアウイルスvp708は、ベータガラクトシダーゼをA26L欠失部内に有し、X−gal存在化でブループラークとして単離された。
ベータガラクトシダーゼ配列を、vP708からドナープラスミドpSD467を用いて除去した。pSD467は、pSD466をEcoRI/BamHIで消化した後にE.coliポリメラーゼクレノー断片で平滑化しライゲーションして、EcoRI、SmaIおよびBamHI部位がpUC/ワクシニア結合部分から取り除いてある以外はpSD466と同一である。vP708とpSD467との組換えの結果、組換えワクシニアウイルス欠失変異体、vP723が生成し、X−galの存在下で透明プラークとして単離された。
実施例5 オープンリーディングフレーム[C7L−K1L]の欠失のためのプラスミドpMPCSK1Δの構築
今は、図5を参照しているが、以下のワクシニアクローンがpMCSK1Δの構築のために利用された。pSD420はpUC8中にクローン化されたSalI Hである。pSD435は、pUC18中にクローン化されたKpnI Fである。pSD435はSphIで切断され、再び連結され、pSD451となった。pSD451中では、HindIII M中のSphI部位(位置27416)の左側のDNA配列は取り除かれている(Perkus et al.,1990)。pSD409はpUC8中にクローン化されたHindIII Mである。
ワクシニア由来の[C7L−K1L]遺伝子クラスターの欠失のための基質を供与するために、E.coliベータガラクトシダーゼが最初にワクシニアM2L欠失座に以下のように挿入された(Guo et al.,1990)。pSD409中のBglII部位を除去するために、プラスミドをワクシニア配列中(位置28212)でBglIIで、そしてBamHIでpUCワクシニア結合部分で切断し、続いて連結しpMP409Bとした。pMP409Bを固有のSphI部位(位置27416)で切断した。続いてM2Lコード配列を合成ヌクレオチドを用いた突然変異で除去した(Guo et al.,1990;Mandecki,1986)。
MPSYN82(配列番号19)
その結果生成されたプラスミドpMP409Dは、M2L欠失座に上記のように挿入された固有のBglII部位を含んでいる。E.coliベータガラクトシダーゼ遺伝子(Shapira et al.,1983)をワクシニア11kDaプロモーター(Bertholet et al.,1985)の支配下で含む3.2kbpのBamHI(部分)/BglIIカセットをpMP409DのBglII部位に挿入した。その結果生成されたプラスミドpMP409DBGはレスキューワクシニアウイルスvP723の組換えにおいてドナープラスミドとして用いられた。組換えワクシニアウイルスvp784は、M2L欠失座に挿入されたベータガラクトシダーゼを有し、X−gal存在下でブループラークとして単離された。
ワクシニア遺伝子[C7L−K1L]欠失のためのプラスミドが、SmaI、HindIII、で切断されE.coliポリメラーゼクレノー断片で平滑化されたpUC8中に集められた。ワクシニアHindIII C配列からなる左隣接アームはpSD420をXbaIで消化し(位置18628)続いてE.coliポリメラーゼクレノー断片で平滑化した後BglIIで消化して(位置19706)得た。ワクシニアHindIII K配列からなる右隣接アームはpSD451をBglII(位置29062)およびEcoRV(位置29778)で消化して得た。その結果生成されたプラスミド、pMP581CKは、HindIII C中のBglII部位(位置19706)とHindIII K中のBglII部位(位置29062)との間のワクシニア配列を欠失された。プラスミドpMP581CK中のワクシニア配列の欠失部位は図5において三角形で示されている。
ワクシニア欠失結合部位の過剰のDNAを取り除くため、プラスミドpMP581CKをワクシニア配列内のNcoI部位(位置18811;19655)で切断し、Bal−31エキソヌクレアーゼ処理し、合成オリゴヌクレオチドMPSYN233(配列番号20)
を用いた突然変異にかけた。その結果生成したプラスミド、pMCSK1Δは、12のワクシニアオープンリーディングフレーム[C7L−K1L]を含む位置18805−29108のワクシニア配列を欠失していた。pMCSK1Δと、ベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体vP784との組換えにより、ワクシニア欠失変異体、vP804が生成し、X−gal存在下で透明プラークとして単離された。
実施例6 リボヌクレアーゼ還元酵素ラージサブユニット(I4L)の欠失のためのプラスミドpSD548の構築
今、図6を参照しているが、プラスミドpSD405は、pUC8中にクローン化されたワクシニアHindIII I(位置63875−70367)を有している。pSD405をEcoRVでワクシニア配列内部(位置67933)を、およびSmaIでpUC/ワクシニア結合部分を消化し、連結させ、プラスミドpSD518とした。pSD518はpSD548の構築において用いられた、全てのワクシニア制限断片の供給源として用いられた。
ワクシニアI4L遺伝子は位置67371−65059にわたっている。I4Lの転写方向は図6中で矢印によって示されている。I4Lコード配列部分を欠失させたベクタープラスミド断片を得るため、pSD518をBamHI(位置65381)、およびHpaI(位置67001)で消化し、E.coliポリメラーゼクレノー断片で平滑化した。この4.8kbpのベクター断片は、E.coliベータガラクトシダーゼ遺伝子(Shapira et al.,1983)をワクシニア11kDaプロモーター(Bertholet et al.,1985;Perkus et al.,1990)の支配下で含む3.2kbpのSmaIカセットと連結され、プラスミドpSD524KBGとなった。pSD524KBGを、ワクシニアウイルスvP804との組換えでドナープラスミドとして用いた。組換えワクシニアウイルス、vp855は、べータガラクトシダーゼをI4L遺伝子部分欠失部位中に含み、X−gal存在下でブループラークとして得られた。
ベータガラクトシダーゼとI4L ORFの残りの部分をvP855から欠失させるために、欠失プラスミドpSD548を構築した。左および右ワクシニア隣接アームは別々に、以下に詳細に、および図6中に模式的に示されているようにpUC8中に集められた。
左ワクシニア隣接アームを受け入れるベクタープラスミドを構築するために、pUC8をBamHI/EcoRIで切断し、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチド518A1/518A2(配列番号21/配列番号22)
と連結し、プラスミドpSD531とした。pSD531をRsaI(部分)およびBamHIで切断し、2.7kbpの断片を単離した。pSD518をBglII(位置64459)/RsaI(位置64994)で切断し、0.5kbpの断片を単離した。2つの断片を連結し、I4Lコード配列の左の完全ワクシニア隣接アームを有するプラスミドpSD537とした。
右ワクシニア隣接アームを受け入れるためのベクターを構築するため、pUC8をBamHI/EcoRIで切断し、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチド518B1/518B2(配列番号23/配列番号24)
と連結させ、pSD532とした。pSD532をRsaI(部分的)/EcoRIで切断し、2.7kbpのベクター断片を単離した。pSD518を、RsaIでワクシニア内部(位置67436)を、EcoRIでワクシニア/pUC結合を切断し、0.6kbpの断片を単離した。この2つの断片を連結し、I4Lコード領域の右の完全ワクシニア隣接アームを含むpSD538とした。
右ワクシニア隣接アームは、pSD538由来の0.6kbpEcoRI/BglII断片として単離され、EcoRI/BglIIで切断されたpSD537中へ連結された。その結果生成したプラスミドpSD53gにおいては、I4L ORF(65047−67386)はポリリンカー領域で置換され、ポリリンカー領域は左で0.6kbpのワクシニア配列、右で0.6kbpのワクシニア配列と、すべてpUCのバックグラウンド内部で隣接している。ワクシニア配列内部での欠失部位は、図6で三角形で示されている。組換えワクシニアウイルスvP855中のベータガラクトシダーゼ配列と、pSD539のpUC派生部分のベータガラクトシダーゼとの、起こりうる組換えを避けるために、ワクシニアI4L欠失カセットがpSD539からpRC11へ移動され、pUC派生体からすべてのベータガラクトシダーゼを除去し、ポリリンカー領域で置換した(Colinas et al.,1990)。pSD539をEcoRI/PstIで切断し、1.2kbp断片を単離した。この断片をEcoRI/PstIで切断したpRC11(2.35kbp)中へ挿入し、pSD548とした。pSD548とベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体vP855との組換えの結果、ワクシニア欠失変異体vP866が生成し、X−gal存在下で透明プラークとして単離された。
組換えワクシニアウイルスvP866由来のDNAを、制限酵素消化とそれに続くアガロースゲル上での電気泳動により分析した。制限パターンは期待通りのものであった。vP866をテンプレートとして、上に詳述された6欠失座に隣接するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Engelke et al.,1988)により、期待されたサイズのDNA断片が生産された。PCRにより生産された断片の、欠失結合部位の範囲の周りの配列分析により、結合部位は期待された通りであることが確認された。組換えワクシニアウイルスvP866は、上記の6つの操作された欠失を有し、ワクシニアワクチン株「NYVAC」と命名された。
実施例7 狂犬病糖タンパク質 G遺伝子のNYVACへの挿入
ワクシニアH6プロモーター(Taylor et al.,1988a,b)の支配下で狂犬病糖タンパク質 Gをコードしている遺伝子を、TK欠失プラスミドpSD513中に挿入した。pSD513は、ポリリンカー領域の存在を除いてプラスミドpSD460(図1)と同一である。
今、図7を参照しているが、ポリリンカー領域はpSD460をSmaIで切断し、プラスミドベクターをアニーリングさせた合成ヌクレオチドVQ1A/VQ1B(配列番号25/配列番号26)
と連結することにより挿入され、ベクターpSD513を生成した。pSD513をSmaIで切断し、ワクシニアH6プロモーター(Taylor et al.,1988a,b)支配下の狂犬病糖タンパク質 Gを含むSmaI末端化1.8kbpのカセットと連結した。生成したプラスミドはpRW842と命名された。pRW842はNYVACレスキューウイルス(vP866)との組換えのドナープラスミドとして用いられた。組換えワクシニアウイルスvP879を、狂犬病糖タンパク質 Gに対する32P−標識DNAプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションにより同定した。
本発明の改変組換えウイルスは、組換えワクチンベクターとしての利点を供与する。弱毒化されたベクターの毒性は、ワクチン接種によるワクチン接種された個体内でのランナウェイ感染(runaway infection)を有利に減少させ、ワクチン接種された個体からされていない個体への伝播もしくは環境への汚染を減少もさせる。
改変組換えウイルスはまた、遺伝子産物をコードし細胞内で発現する外来遺伝子を有する改変組換えウイルスを、細胞内に導入することにより、生体外で培養された細胞中での遺伝子発現の方法にもまた有利に用いることができる。
実施例8 ニューカッスル病ウイルスの融合および血球凝集素ノイラミニダーゼ糖タンパク質を発現するTROVAC−NDVの構築
本実施例では、ニワトリポックスウイルスベクターTROVAC、およびTROVAC−NDVと命名されたニワトリポックスニューカッスル病ウイルス組換体の開発、およびその安全性並びに効率を記述する。毒性NDV株テキサスのFおよびHN遺伝子を両方発現するニワトリポックスウイルス(FPV)ベクターを構築した。創出された組換体はTROVAC−NDVと命名された。TROVAC−NDVは実際にプロセシングされたNDV糖タンパク質を、組換えウイルスを感染させた鳥類細胞中で発現し、生後1日のニワトリへの接種により、それに続く毒性NDV投与に対して防御する。
細胞とウイルス NDVテキサス株は短期潜伏性の株である。FおよびHN遺伝子のcDNAの調製は以前に記述された(Taylor et al.,1990;Edbauer et al.,1990)。FPVウイルスのFP−1と命名された株は以前に記述された(Taylor et al.,1988a)。それは生後1日のニワトリのワクチン接種に有用なワクチン株である。親ウイルス株Duvetteはフランスでニワトリからのニワトリポックスのかさぶたとして得られた。ウイルスはふ化鶏卵における約50回の連続継代とそれに続くニワトリ胚繊維芽細胞で25回の継代により弱毒化された。ウイルスは4回の連続プラーク精製にかけられた。1つのプラーク単離体を初代CEF細胞中で増幅し、TROVACと命名されたストックウイルスとした。この生体外組換えテストでTROVAC−NDVを生成するために用いられたストックウイルスは、プラーク単離体から初代CEF中で12回の継代にかけられた。
NDV−Fのカセットの構築 5’末端からの22ヌクレオチドを除く全てのFタンパク質をコードしている配列を含む1.8kbのBamHI断片を、pNDV81(Taylor et al.,1990)から切り出し、pUC18のBamHI部位に挿入し、pCE13とした。以前に記述されたワクシニアウイルスH6プロモーター(Taylor et al.,1988a,b;Guo et al.,1989;Perkus et al.,1989)は、pCE13をSalIで消化し、粘着末端をE.coliポリメラーゼクレノー断片で充填し、そしてHindIIIで消化することにより、pCE13中に挿入した。H6プロモーター配列を含むHindIII−EcoRV断片を、続いてpCE13中に挿入し、pCE38とした。完全5’末端は、pCE38をKpnIおよびNruIで消化し、アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドCE75(配列番号27)およびCE76(配列番号28)を挿入して生成し、pCE47を生成した。
NDV−Fの3’末端非コード領域を取り除くため、pCE13由来のSmaIからPstI断片をpUC18のSmaIおよびPstI部位に挿入し、pCE23とした。非コード領域をpCE23のSacI、BamHI、エキソヌクレアーゼIII、SIヌクレアーゼおよびEcoRIによる連続的消化により除去した。アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドCE42(配列番号29)およびCE43(配列番号30)を続いて挿入しpCE29とした。
NDV−F配列の3’末端を続いて、既にpCE29からのPstI−SacI断片をpCE20のPstI−SacI部位に挿入することによりNDV−Fの5’末端を有しているプラスミドpCE20に挿入しpCE32とした。pCE20の開発は以前にTaylor et al.,1990中で記述された。
H6プロモーターおよびpCE47に含まれているNDV−F5’配列を、pCE32に含まれている3’NDV−F配列とを整列させるために、pCE47のHindIII−PstI断片をpCE32のHindIII−PstI部位へ挿入し、pCE49とした。H6プロモートされたNDV−Fは続いてORFを除いたF8座(以下に記述)へ、pCE49由来のHindIII−NruI断片をpJCA002(以下に記述)のHindIIIおよびSmaI部位へ挿入することにより移し、pCE54とした。pCE54をSacIで、部分的にBamHIで消化し、アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドCE166(配列番号31)およびCE167(配列番号32)を挿入することにより、pCE54へ転写終結シグナルを挿入し、pCE58とした。
NDV−F完全3’末端を、pCE54をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドCE182(配列番号33)およびCE183(配列番号34)をプライマーとしたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により得た。
PCR断片はPvuIIおよびHpaIにより消化させ、HpaIおよび部分的にPvuIIにより消化したpCE58中へクローン化した。その結果生成されたプラスミドはpCE64と命名された。pCE64由来の完全H6プロモーターおよびFコード配列を含むHindIII−HpaI断片を、pRW846のHindIII−HpaI部位にクローン化することにより、翻訳終結シグナルを挿入し、最終NDV−FカセットであるpCE71を生成した。プラスミドpRW846は実質的にpJCA002(以下に記述)と同一ではあるが、H6プロモーターおよび転写並びに翻訳終結シグナルを有している。pRW846をHindIIIおよびHpaIで消化することによって、H6プロモーターは除かれるが停止シグナルは手つかずで残る。
NDV−HNカセットの構築 プラスミドpRW802の構築は以前にEdbauer et al.,1990中で記述された。このプラスミドはワクシニアウイルスH6プロモーターの3’末端に連結したNDV−HN配列をpUC9ベクター中に有している。ワクシニアウイルスH6プロモーターの5’末端を含むHindIII−EcoRV断片をpRW802のHindIIIおよびEcoRV部位に挿入しpRW830とした。アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドCE162(配列番号35)およびCE163(配列番号36)をpRW830に挿入することにより、NDV−HNの完全3’末端を得て、最終NDV−HNカセットであるpCE59を生成した。
FPV挿入ベクターの構築 プラスミドpRW731−15は、ゲノムDNAからクローン化された10kbpのPvuII−PvuII断片をコードしている。3660bpのPvuII−EcoRV断片の両方の鎖に関してヌクレオチド配列が決定され図11に示されている(配列番号67)。ここでF8と名付けられたオープンリーディングフレームの限定が決定された。プラスミドpRW761は2430bpのEcoRV−EcoRV断片を含むpRW731−15のサブクローンである。F8オープンリーディングフレームの全体は、pRW761中のXbaI部位およびSspI部位の間に含まれている。TROVACゲノムDNAとの組換えにおいてF8ORFを取り除く挿入プラスミドを創出するために、以下の工程が行われた。プラスミドpRW761を完全にXbaIで、部分的にSspIで消化した。ゲルから単離された3700bpのXbaI−SspIバンドをアニーリングさせた2本鎖オリゴヌクレオチドJCA017(配列番号37)およびJCA018(配列番号38)と連結した。
このライゲーションの結果生成されたプラスミドはpJCA002と命名された。
NDF FおよびHNの二重挿入ベクターの構築 H6プロモートされたNDV−HN配列を、H6プロモートされたNDV−Fカセット中に、E.coliポリメラーゼクレノー断片で充填したpCE59由来のHindIII断片を、pCE71のHpaI部位へクローン化することにより挿入し、pCE80とした。プラスミドpCE80は完全にNdeIで、部分的にBglIIで部分的に消化し、F8隣接アームに連結し、ともにH6プロモーターによって駆動されているNDV FおよびHN遺伝子を含む4760bp断片を生成した。プラスミドpJCA021は、pRW731−15由来の4900bpのPvuI−HindII断片をpBSSK+のSmaI−HindIIに挿入することにより得られた。プラスミドpJCA021を続いてNdeIおよびBglIIで消化し、pCE80の4760bpのNdeI−BglII断片と連結し、pJCA024とした。プラスミドpJCA024は、それ故、FPV隣接アームの間に3’末端が隣接した逆向きの方向で挿入されたNDV−FおよびHN遺伝子を有している。両方の遺伝子はワクシニアウイルスH6プロモーターに連結されている。NDV−F配列に近い右隣接アームは2350bpのFPV配列からなる。NDV−HN配列に近い左隣接アームは1700bpFPV配列からなる。
TROVAC−NDVの開発 プラスミドpJCA024を、TROVACを感染させた初代CEF細胞中に、以前に記述された(Panicali et al.,1982;Piccini et al.,1987)リン酸カルシウム沈殿法を用いて形質導入した。陽性プラークを、NDV−FおよびHN特異的放射性標識プローブとのハイブリダイゼーションに基づいて選択し、続いて純粋な集団が達成されるまでプラーク精製の連続的過程にかけた。続いて1つの代表プラークを増幅し、その結果得られたTROVAC組換体はTROVAC−NDV(vFP96)と命名された。
免疫蛍光 直接的ではない免疫蛍光を、記述されたように(Taylor et al.,1990)、ポリクローナル抗NDV血清、およびモノ特異的試薬として、NDF−VまたはNDV−HNを発現するワクシニアウイルス組換体に対するウサギ体内で作られた血清を用いて行った。
免疫沈降 免疫沈降反応を、記述されたように(Taylor et al.,1990)SPAFAS Inc.Storrs,CTより得たポリクローナル抗NDV血清を用いて行った。
ストックウイルスを、F8ORFのが欠失されていることを確認するためにin situプラークハイブリダイゼーションにより選別した。TROVACゲノムへのNDV遺伝子の正確な挿入およびF8ORFの欠失は、サザンブロットハイブリダイゼーションによってもまた確認された。
NDV感染細胞中では、F 糖タンパク質は、カルボキシル末端付近の疎水性膜貫通領域によって膜に固定され、プレカーサーF0の、2つのジスルフィド結合したポリペプチドF1およびF2への翻訳後の切断を必要とする。F0の切断は、与えられたNDV株の病原性の決定において重要であり(Homma and Ochiai,1973;Nagai et al.,1976;Nagai et al.,1980)、切断部位のアミノ酸配列は、それ故にウイルスの毒性の決定に重要である。FPV中に挿入され、組換体vFP29を生成したNDV−F配列中の切断部位のアミノ酸は、配列Arg−Arg−Gln−Arg−Arg(配列番号39)(Taylor et al.,1990)を有し、これは毒性NDV株で要求されると判明している配列(Chambers et al.,1986;Espion et al.,1987;Le et al.,1988;McGinnes and Morrison,1986;Toyoda et al.,1987)と一致していた。NDV毒性株に感染した細胞中で合成されるHN糖タンパク質は切断されていない74kDaの糖タンパク質である。例えばUlsterおよびQueenslandのような極端に無毒性の株は、活性化には切断を要求するHN(HN0)をコードしている(Garten et al.,1980)。FおよびHN遺伝子のTROVAC−NDV中での発現を、遺伝子産物が正確にプロセシングされ、提供されているかどうかを確認するために分析した。ポリクローナル抗NDVニワトリ血清を用いた、直接的ではない免疫蛍光により、免疫活性なタンパク質が感染細胞の表面に提供されていることが確認された。両方のタンパク質が原形質膜上に提供されていることを決定するために、FもしくはHN糖タンパク質のいずれかを発現するワクシニア組換体に対するモノ特異的ウサギ血清が生成された。これらの血清を用いた直接的でない免疫蛍光により、両方のタンパク質の表面での提供が確認された。
免疫沈降実験を、親および組換えウイルスに感染させたCEF細胞の(35S)メチオニン標識破砕物を用いて行った。F1およびF2のグリコシル化された状態での見かけの分子量の期待値は、それぞれ54.7および10.3kDaである(Chambers et al.,1986)。ポリクローナル抗NDV血清を用いた免疫沈降実験において、適当なサイズの融合特異的産物がNDV−F単独組換体vFP29(Taylor et al.,1990)およびTROVAC−NDV二重組換体vFP96から検出された。適切なサイズのHN糖タンパク質もまたNDV−NH単独組換体vFP47(Edbauer et al.,1990)およびTROVAC−NDVから検出された。感染させなかった細胞、および親TROVACを感染させたCEF細胞からはNDV特異的産物は検出されなかった。
CEF細胞においてFおよびHN糖タンパク質は、適切に細胞表面上に提供され、そこにおいてそれらはNDV免疫血清によって認識された。免疫沈降分析により、毒性株で要求されるようにF0タンパク質は正確にF1およびF2成分へと切断されることが示された。同じようにHN糖タンパク質は組換体TROVAC−NDVに感染させたCEF細胞中で正確にプロセシングされた。
以前の報告(Taylor et al.,1990;Edbauer et al.,1990;Boursnell et al.,1990a,b,c;Ogawa et al.,1990)では、HNもしくはFのいずれかのみの発現で、NDV投与に対する防御免疫の誘導には十分であると示唆されていた。しかしながら、他のパラミクソウイルスについての研究により、十分な防御免疫には両方のタンパク質に対する抗体要求され得ることが示唆されている。SV5ウイルスはHN糖タンパク質に対する抗体の存在下で組織培養中に拡散できるが、F糖タンパク質に対する抗体の場合はできない。(Merz et al.,1980)。加えて、殺された麻疹ウイルスワクチンでのワクチン失敗は融合成分の不活性化によるものであると提案されている(Norrby et al.,1975)。両方のNDV糖タンパク質はウイルス中和抗体の誘導に反応性である(Avery et al.,1979)、および両方の糖タンパク質は、独立してニワトリポックスベクターで発現された場合にも防御的免疫反応を誘導できることが示されているが、最も効果的なNDVワクチンには両方の糖タンパク質を発現しなくてはならないことが理解されている。
実施例9 狂犬病ウイルス糖タンパク質 Gを発現するALVAC組換体の構築
本実施例では、カナリアポックスウイルスベクター、ALVACおよびALVAC−RG(vCP65)と命名されたカナリアポックス−狂犬病組換体の開発およびその安全性と効率を記述する。
細胞とウイルス 親カナリアポックス(Rentschler株)はカナリアのためのワクチン株である。ワクチン株は野生株単離体から得られ、ニワトリ胚繊維芽細胞上で200回以上の継代を通して弱毒化された。マスターウイルスシードは4回の連続した寒天下プラークハイブリダイゼーションにかけられ、1つのプラーククローンがさらに5回の付加的な継代により増幅され、その後ストックウイルスが親株として生体外組換え試験において用いられた。プラーク精製されたカナリアポックス単離体はALVACと命名された。
カナリアポックス挿入ベクターの構築 880bpのカナリアポックスPvuII断片を、pUC9中のPvuII部位の間にクローン化し、pRW764.5とした。この断片の配列を図8(配列番号66)中の位置1372および2251の間に示す。C5と命名されたオープンリーディングフレームの限定が決定された。オープンリーディングフレームは断片中の位置166から開始され、位置487で終了することが決定された。オープンリーディングフレームに干渉することなくC5の欠失がなされた。位置167から位置455までの塩基は配列(配列番号39)
により置換された。この置換用配列はHindIII、SmaI、およびEcoRI挿入部位および、それに続くワクシニアウイルスRNAポリメラーゼによって認識される翻訳停止および転写終結シグナル(Yuen et al.,1987)を有している。C5 ORF欠失は以下に記述されるように行った。プラスミドpRW764.5を部分的にRsaIで切断し、線状産物を単離した。RsaI線状断片を再びBglIIで切断し、今、位置156から位置462へのRsaIからBglIIへの欠失のあるpRW764.5断片を単離し、以下の合成ヌクレオチドのためのベクターとして用いた:
(配列番号40および41)
オリゴヌクレオチドRW145およびRW146をアニーリングさせ、pRW764.5RsaIおよびBglIIベクターに上記のように挿入した。その結果生成されたプラスミドはpRW831と命名された。
狂犬病G遺伝子を含む挿入ベクターの構築 pRW838の構築を以下に記述する。オリゴヌクレオチドAからEは、H6プロモーターの翻訳開始コドンおよび狂犬病GのATGとオーバーラップしているが、これらをpUC9中にpRW737としてクローン化した。オリゴヌクレオチドAからEはH6プロモーター、NruIでの開始、狂犬病GのHindIIIを通ってそれに続くBglIIを含んでいる。
オリゴヌクレオチドAからE((配列番号42)−(配列番号46))の配列は:
アニーリングさせたオリゴヌクレオチドAからEの配置は以下の通りである:
オリゴヌクレオチドAからEをキナーゼ処理し、アニーリングさせ(95℃、5分間、続いて室温まで冷却)、pUC9のPvuII部位に挿入した。その結果生成されたプラスミドpRW737を、HindIIIおよびBglIIで切断し、ptg155PRO(Kieny et al.,1984)の1.6kbpのHindIII−BglII断片のためのベクターとして用い、pRW739を生成した。ptg155PROのHindIII部位は狂犬病G遺伝子の翻訳開始コドンから86bp下流にある。BglIIはptg155PRO中の狂犬病G遺伝子翻訳終了コドンの下流にある。pRW739を部分的にNruIで切断し、完全にBglIIで切断し、以前に記述された(Taylor et al.,1988a,b;Guo et al.,1989;Perkus et al.,1989)H6プロモーターの3’末端を狂犬病G遺伝子全体を通して含んでいる1.7kbpのNruI−BglII断片を、pRW824のNruIおよびBamHI部位の間に挿入した。その結果生成されたプラスミドはpRW832と命名された。pRW824への挿入によりNruIのH6プロモーター5’を付加した。pRW824の、SmaIが続いているBamHIの配列は(配列番号47):GGATCCCCGGGである。pRW824は、ワクシニアウイルスH6プロモーターに正確に連結した非関連遺伝子を有している。NruIおよびBamHIでの消化によりこの非関連遺伝子を完全に切り出した。1.8kbppRW832のSmaI断片は、H6プロモートされた狂犬病Gを有しており、pRW831のSmaI部位中に挿入され、プラスミドpRW838を生成した。
ALVAC−RGの開発 プラスミドpRW838を、ALVACを感染させた初代CEF細胞に、以前に記述された(Panicali et al.,1982;Piccini et al.,1987)リン酸カルシウム沈殿法により形質導入した。狂犬病G遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な集団が達成させるまで6回の連続したプラーク精製過程にかけた。1つの代表プラークが続いて増幅され、その結果生成されたALVAC組換体はALVAC−RGと命名された(vCP65)(図9Aおよび9Bもまた参照されたい)。狂犬病G遺伝子のALVACゲノムへの、続いて起こる変異なしでの正確な挿入を、配列分析により確認した。
免疫蛍光 成熟狂犬病ウイルス粒子の集合の最後の段階で、糖タンパク質成分はゴルジ体から、細胞質へ伸長しているカルボキシ末端および細胞膜の外側表面上のタンパク質のバルクとともにそれが蓄積する原形質膜へと輸送される。ALVAC−RGで発現された狂犬病糖タンパク質が正確に提供されていることを確認するために、ALVACまたはALVAC−RGに感染させた初代CEF細胞について免疫蛍光を行った。免疫蛍光は以前に記述されたように(Taylor et al.,1990)、狂犬病Gモノクローナル抗体を用いて行った。ALVAC−RGに感染させたCEF細胞では強力な表面蛍光が検出されたが、親ALVACに感染させたものは検出されなかった。
免疫沈降 予め形成された初代CEF単層、Vero(アフリカミドリザル腎臓細胞の系統、ATCC#CCL81)およびMRC−5細胞(ノーマルヒト胎児肺組織から派生した繊維芽様細胞系統、ATCC#CCL171)を、10pfuの親ウイルスALVACおよび組換えウイルスALVAC−RGで放射性標識35S−メチオニンの存在下で接種し、以前に記述されたように処理した(Taylor et al.,1990)。免疫沈降を、狂犬病G特異的モノクローナル抗体を用いて行った。約67kDaの分子量の狂犬病特異的糖タンパク質の効果的な発現が組換体ALVAC−RGに関して検出された。感染させていない細胞もしくは親ALVACウイルスに感染させた細胞においては、狂犬病特異的産物は検出されなかった。
連続継代実験 非鳥類種の範囲でのALVACウイルスの研究においては、拡散的感染も明白な病気も観察されなかった(Taylor et al.,1991b)。しかしながら、親も組換体もどちらも非鳥類種細胞中で増殖可能に適応しないようにするために、連続継代実験を行った。
2つのウイルス、ALVACとALVAC−RGを3種類の細胞系統で10連続盲継代(blind passage)を行った:
(1)11日経過白レグホン胚から調製された初代ニワトリ胚繊維芽(CEF)細胞;
(2)Vero細胞−アフリカミドリザル腎臓細胞の連続系統(ATCC#CCL81);
(3)MRC−5細胞−ヒト胎児肺組織から派生した二倍体細胞系統(ATCC#CCL171)。
最初の接種は0.1pfu/細胞のm.o.iで、一皿あたり2×106の細胞を含む3枚の60mmのディッシュを用いて行った。ひとつのディッシュは、40μg/mlのDNA複製阻害剤シトシンアラビノシド(Ara C)の存在下で接種した。1時間、37℃での吸収期間の後、接種物を取り除き、単層を吸収されなかったウイルスを除去するために洗浄した。このとき、培地を、2つのディッシュ(試料t0からt7)では5mlのEMEM+2% NBCSで、第3のディッシュでは40μg/mlのAra Cを含む5mlのEMEM+2%NBCSで(試料t7A)置換した。残存投入ウイルスの指標を提供するため、試料t0は−70℃で凍結した。試料t7およびt7Aを37℃で7日間保温し、その後で内容物を回収し細胞を非直接的超音波破砕により破砕した。
それぞれの細胞系統のt7試料の1mlを希釈せずに、同じ細胞系統の3枚のディッシュ(試料t0、t7およびt7Aを提供するため)に、そして1枚の初代CEF細胞のディッシュに接種した。試料t0、t7およびt7Aを継代1として扱った。付加的なCEF細胞への接種は、非鳥類種の細胞中に存在するかも知れないウイルスの、より高感度の検出のための増幅工程である。
この工程を10回(CEFおよびMRC−5)または8回(Vero)の連続盲継代について繰り返した。試料は続いて3回凍結、融解させ、初代CEF単層上での滴定によりアッセイした。
それぞれの試料中のウイルス収量を、寒天下のCEF単層上のプラーク滴定により決定した。まとめた実験の結果を表1および2に示す。
結果より、親ALVACおよび組換体ALVAC−RGは両方ともCEF単層上で力価の損失なしに持続した複製が可能であることが示唆された。Vero細胞においては、ALVACは2回の継代で、そしてALVAC−RGは1回の継代で、ウイルスレベルは検出レベル以下に低下した。MRC−5細胞においては、同様の結果が明白となり、1継代の後はウイルスは検出されなかった。表5および6には4継代の結果のみを示したが、この一連の工程はVeroについては8継代、MRC−5については10継代続けたが、いずれのウイルスも非鳥類種細胞中で増殖可能であるような検出可能な適応は無かった。
継代1においては、比較的高いレベルのウイルスが、MRC−5およびVero細胞のt7試料中に存在していた。しかしながら、このウイルスのレベルはt0試料、およびウイルス複製が起こり得ないシトシンアラビノシドの存在下で保温されたt7A試料においてみられたものと同等であった。このことは、非鳥類種細胞で7日に見られたウイルスレベルは、新たに複製されたウイルスではなく残存ウイルスを示していることを表している。
アッセイをより敏感にするため、それぞれの細胞系統からの7日の回収物を許容的CEF単層に接種し、細胞改変効果(CPE)が得られた時点、またCPEが見られなかった場合は7日で回収した。この実験の結果を表3に示す。許容的細胞系統を通した増幅の後ですらも、MRC−5およびVero細胞は付加的な2継代においてのみ検出された。これらの結果は、用いられた条件においては、いずれのウイルスもVeroもしくはMRC−5細胞中での増殖への適応は無かったことを示している。
サル科マカク属のサル(Macaque)への接種 4匹のHIV血清陽性サル科マカク属のサルに、最初にALVAC−RGで表8に記述したように接種した。100日後、これらの動物の追加免疫効果を決定するために再接種し、さらに付加的に7匹の動物をある投与量範囲で接種した。血液を適当な間隔で取り出し、56℃、30分間熱失活させた後、抗狂犬病抗体の存在について、高速蛍光焦点阻害アッセイ(Smith et al.,1973)を用いて血清を分析した。
チンパンジーへの接種 2匹の雄成チンパンジー(50−65kgの体重範囲)を、1×107pfuのvCP65で筋肉内または皮下で接種した。動物は反応を観察し、RFFI試験(Smith et al.,1973)による抗狂犬病抗体の存在分析のために定期的に採血した。動物を、最初の接種から13週間後に同じ投与量で再接種した。
マウスへの接種 マウスの群を50−100μ1の範囲の異なったバッチのvCP65の希釈液で接種した。マウスは足部で接種された。14日目に、15−43マウスLD50の狂犬病ウイルス毒性CVS株を頭蓋内投与で投与した。マウスの生存を観察し、50%防御率(PD50)を、投与後28日に計算した。
イヌおよびネコへの接種 生後5ヶ月の10匹のビーグル犬および生後4ヶ月の10匹のネコに、6.7もしくは7.7log10TCID50のALVAC−RGを皮下で接種した。4匹のイヌおよびネコには接種しなかった。接種の14および28日後に動物から採血し、抗狂犬病抗体をRFFI試験で評価した。6.7log10TCID50のALVAC−RGを接種した動物には接種の29日後に、3.7log10マウスLD50(イヌ)もしくは4.3log10マウスLD50(ネコ)のNYGS狂犬病ウイルス投与株を投与した。
リスザルへの接種 4匹のリスザル(Saimiri sciureus)の3つの群に、3つのウイルス、(a)ALVAC、親カナリアポックスウイルス、(b)ALVAC−RG、狂犬病G遺伝子を発現する組換体、または(c)vCP37、ネコ白血病ウイルスエンベローブ糖タンパク質を発現するカナリアポックス組換体、の1つを接種した。接種は、ケタミン麻酔(ketamine anaesthesia)のもとで行った。各々の動物は同時:(1)20μlを右目の表面に傷付処理なしに点眼;(2)100μlを口内へいくつかの水滴として;(3)100μlを、右腕の外側表面の剃った皮膚上の2つの皮内接種部位それぞれに;(4)100μlを右大腿部前方筋肉内に接種された。
4匹のサルに各々のウイルスを、2匹はトータルで5.0log10pfu、2匹はトータルで7.0log10pfu接種した。動物から規則的な間隔で採血し、血清をRFFI試験(Smith et al.,1973)を用いて抗狂犬病抗体の存在に関して分析した。動物のワクチン接種に対する反応を毎日観察した。最初の接種の6ヶ月後、ALVAC−RGを接種された4匹のサル、最初にvCP37を接種された2匹のサル、最初にALVACを接種された2匹のサルに加えて接種されていないサルに、6.5log10pfuのALVAC−RGを皮下接種した。RFFI試験(Smith et al.,1973)により狂犬病中和抗体の存在について血清を観察した。
ヒト細胞系統へのALVAC−RGの接種 ウイルスが生産的に複製されない非鳥類種細胞中で、外来遺伝子の効率的な発現が得られるか否かを決定するため、5つの細胞型、1つは鳥類種で4つは非鳥類種を、ウイルス収量、外来狂犬病G遺伝子の発現およびウイルス特異的DNA蓄積に関して分析した。接種された細胞は:
(a)Vero、アフリカミドリザル腎臓細胞、ATCC#CCL81;
(b)MRC−5、ヒト胚肺、ATCC#CCL171;
(c)WISH、ヒト羊膜、ATCC#CCL25;
(d)デトロイト−532、ヒト包皮、ダウン症、ATCC#CCL54;および
(e)初代CEF細胞。
11日経過白レグホン胚から調製されたニワトリ胚繊維芽細胞を陽性コントロールとして含んだ。全ての接種は、予め形成された2×106の細胞の単層について以下に記述するように行った。
A DNA分析の方法
3枚のそれぞれの細胞系統のディッシュを5pfu/細胞のウイルスで試験のもとで接種し、別の1つのそれぞれの細胞系統のディッシュを接種しないでおいた。1つのディッシュは40μg/mlのシトシンアラビノシド(Ara C)の存在下で保温した。37℃、60分間の吸収期間の後、接種物を取り除き、単層を吸収されなかったウイルスを除去するために2回洗浄した。培地(Ara Cが存在もしくは不在)は続いて置換された。1つのディッシュ(Ara C無し)からの細胞を、時間0の試料として回収した。残りのディッシュは、37℃で72時間保温し、そのとき細胞を回収しDNA蓄積分析に用いた。2×106の細胞それぞれは、0.5mlの40mMEDTAを含むリン酸緩衝食塩水(PBS)に再懸濁し、37℃で5分間保温した。等量の、42℃で予め保温された120mMのEDTAを含む1.5%アガロースを細胞懸濁液に加え、穏やかに混合した。懸濁液はアガロースプラグ型へ移され少なくとも15分固定化された。アガロースプラグを続いて取り除き、プラグを完全にカバーする量の溶解バッファー(1%サルコシル(sarkosyl)、100μg/mlプロテイナーゼK、10mMトリス塩酸pH7.5、200mMEDTA)中で12−16分間50℃で保温した。溶解バッファーを、続いて5.0mlの滅菌0.5xTBE(44.5mMトリス−ホウ酸、44.5mMホウ酸、0.5mMEDTA)で置換し、4℃で6時間にわたり3回TBEバッファーを交換して平衡化した。プラグ内のウイルスDNAをパルスフィールド電気泳動により細胞RNAおよびDNAと分画した。電気泳動は20時間にわたり180Vで50−90秒のランプで、15℃、0.5xTBE中で行った。DNAはラムダDNA分子量スタンダードとともに泳動した。電気泳動後、ウイルスDNAバンドはエチジウムブロミド染色により可視化した。DNAは続いてニトロセルロース膜に移され、精製ALVACゲノムDNAから調製された放射性標識プローブで探索した。
B.ウイルス収量の評価
投入多重度を0.1pfu/細胞にしたこと以外は、正確に上記のようにディッシュに接種した。感染後72時間で、3回連続の凍結融解サイクルにより破砕した。ウイルス収量はCEF単層上のプラーク滴定により評価した。
C.狂犬病G遺伝子の発現の分析
多重度10pfu/細胞で、組換体もしくは親ウイルスをディッシュに接種し、さらに付加的は1つのディッシュをウイルス感染させていない対照とした。1時間の吸収期間の後、培地を取り除きメチオニンフリーの培地で置換した。30分の期間の後に、この培地を25μCi/mlの35S−メチオニンを含むメチオニンフリー培地で置換した。感染させた細胞を一晩標識し、続いてバッファーA溶解バッファーを添加して溶解させた。免疫沈降を、狂犬病G特異的モノクローナル抗体を用いて、以前に記述されたように(Taylor et al.,1990)行った。
結果:ウイルス収量の評価 0.1pfu/細胞での接種後72時間後の収量の滴定の結果を表5に示す。この結果は、鳥類細胞においては生産的感染がなされうる一方で、4つの非鳥類種細胞システムでは、ウイルス収量の増加はこの方法では検出されなかったことを示唆している。
ウイルスDNAの蓄積の分析 生産的ウイルス複製の防御が、DNA複製の前で行われているかもしくは後でかを決定するために、細胞破砕物由来のDNAを電気泳動により分画し、ニトロセルロース膜に移し、ウイルス特異的DNAの存在を探索した。感染させなかった細胞、ALVAC−RGを感染させた時間0のCEF細胞、ALVAC−RGを感染させた感染後72時間のCEF細胞、および40μg/mlのシトシンアラビノシドの存在下でALVAC−RGを感染させた感染後72時間のCEF細胞由来のDNAは全て、いくらかの、恐らくは放射性標識ALVAC DNAプローブの調製におけるCEF細胞DNAの混入によるバックグラウンド活性を示した。しかしながら、感染後72時間のALVAC−RG感染CEF細胞は、ALVAC特異的ウイルスDNA蓄積を示す約350kbpの領域にある強いバンドを示した。このようなバンドは、培地をDNA合成阻害剤シトシンアラビノシドの存在下で保温した場合には検出されなかった。Vero細胞中で生成された相当する試料では、ALVAC−RGに感染させた時間0のVero細胞において、約350kbpのかすかなバンドが示された。このレベルは残存ウイルスを示す。バンドの強度は、感染後72時間には増幅されており、ウイルスの繁殖の増加とはならないVero細胞において、いくらかのレベルのウイルス特異的DNAの複製が起こっていることが示唆された。MRC−5細胞で生成された相当する試料は、この細胞系統では、これらの条件下ではウイルス特異的DNAの蓄積は検出されないことを示唆していた。この実験を続いて付加的なヒト細胞系統、特にWISHおよびデトロイト532細胞を含むように拡張した。ALVAC感染CEF細胞を陽性コントロールとして用意した。ALVAC−RGで接種した、WISH、デトロイト532細胞のいずれにおいても、ウイルス特異的DNA蓄積は検出されなかった。この方法の検出限界はまだ十分に確認されておらず、この方法の感度より低いレベルで、ウイルスDNA蓄積は起こっているかも知れないことは注意されるべきである。ウイルスDNA複製を3Hチミジンの取り込みによって測定した別の実験は、VeroおよびMRC−5について得られた結果を支持していた。
狂犬病G遺伝子の発現の分析 いずれかの遺伝子、特に挿入した外来遺伝子の発現が、ウイルスDNA複製のないヒト細胞系列中で起こるか否かを決定するため、ALVACおよびALVAC−RGに感染させた、35S−メチオニン標識された鳥類および非鳥類細胞破砕物について免疫沈降実験を行った。狂犬病G遺伝子特異的モノクローナル抗体を用いた免疫沈降の結果は、ALVAC−RGに感染させたCEF、VeroおよびMRC−5、WISHおよびデトロイト細胞中で67kDaの糖タンパク質の免疫沈降を示した。このような特異的狂犬病遺伝子産物は、感染させていないか又は親に感染させた細胞破砕物からは検出されなかった。
この実験の結果は、分析されたヒト細胞系統中では、ALVAC−RG組換体は感染を開始しH6ワクシニアウイルス初期/後期プロモーターの転写制御のもとで外来遺伝子を発現することは可能であるが、DNA複製を通した複製は進行せず、いかなる検出可能なウイルス繁殖の生成も見られなかった。Vero細胞中においては、いくらかのレベルでのALVAC−RG特異的DNA蓄積は見られたが、これらの方法によってはウイルス繁殖は検出されなかった。これらの結果は、分析されたヒト細胞系統中ではウイルス複製の防御はDNA複製の開始に先だって起こるが、その一方Vero細胞中では防御はウイルスDNA複製の開始に続いて起こることを示唆しているであろう。
ALVAC−RGにおいて発現された狂犬病糖タンパク質が免疫原性か否かを決定するため、多くの動物種をこの組換体の接種により試験した。現在の狂犬病ワクチンの効率はマウスモデルシステムで評価されている。それ故、ALVAC−RGを用いた同様の試験を行った。9つの異なったウイルス調製物(シードウイルスを10連続の組織培養継代後に生成されたワクチンバッチ(J)を含む)を、6.7から8.4のlog10TCID50/mlの感染力価の範囲で連続的に希釈し、50から100μlの希釈液を4匹の生後6週間のマウスの足部に接種した。マウスに14日後に頭蓋内経路で、対照マウスグループ中の致死滴定により決定された15から43マウスLD50を含む300μlの狂犬病ウイルスCVS株を接種した。PD50(50%防御量)として表された能力を、接種後14日に計算した。この実験の結果を表6に示す。この結果から、ALVAC−RGは一貫して、3.33から4.56、平均3.73(標準偏差0.48)のPD50値の範囲で狂犬病ウイルス投与に対してマウスを防御可能であることが示された。この研究の拡散として、雄マウスを、6.0log10TCID50のALVACを含む50μlのウイルス、または等量の感染させていない細胞懸濁液で頭蓋内に接種した。マウスを接種後1日、3および6日に犠牲にし、脳を取り除き、固定し、分画した。組織病理学的試験により、マウス中でのALVAC−RGの神経毒性の証拠は無いことが示された。
ALVAC−RGのイヌおよびネコに対する安全性と効率を評価するため、14の生後5ヶ月のビーグル犬の群および14の生後4ヶ月のネコの群を試験した。それぞれの種の4匹の動物はワクチン接種されなかった。5匹の動物は6.7log10TCID50を皮下で接種され、5匹の動物は7.7log10TCID50を同じ経路で接種された。動物は抗狂犬病抗体の分析のために採血された。接種されなかったまたは6.7log10TCID50を接種された動物に、接種後29日目に3.7log10マウスLD50(イヌ、側頭中)または4.3log10マウスLD50(ネコ、首中)のNYGS狂犬病ウイルス投与株を投与した。この実験の結果を表7に示した。
いずれの投与量についても、イヌ、ネコいずれにおいても接種に対する不利な反応は見られなかった。6.7log10TCID50で免疫化された5匹のイヌのうちの4匹は、ワクチン接種後14日で抗体力価を有し、29日には全てのイヌが有していた。全てのイヌは、対照の4匹中3匹を殺した投与に対して保護された。ネコにおいては、6.7log10TCID50を投与された5匹のうち3匹が、14日に特異的抗体力価を有し、29日には全てのネコが陽性であったが平均抗体力価は2.9IUと低かった。全ての対照を殺した投与に対して5匹中3匹が生き残った。7.7log10TCID50で免疫化された全てのネコは14日に抗体力価を有し、29日には、相乗平均力価は8.1国際単位と計算された。
リスザル(Saimiri sciureus)のALVAC、ALVAC−RGおよび関係のないカナリアポックスウイルス組換体の接種に対する免疫反応を調べた。サルのグループを上記のように接種し、狂犬病特異的抗体の存在について血清分析した。皮内経路の接種に対する軽度の典型的な皮膚反応は別にして、不利な反応はいずれのサルにおいても見られなかった。少量の残存ウイルスが皮膚外傷から、皮下接種の後、接種後2日および4日のみに単離された。全ての検体7日およびそれ以降は陰性だった。筋内接種に対する局部反応は無かった。ALVAC−RGで接種された4匹の全てのサルが、RFFI試験で測定された抗狂犬病血清中和抗体を生産した。最初の接種から約6ヶ月後、全てのサルおよび1匹の付加的な接種されていないサルに、6.5log10TCID50のALVAC−RGを、皮下経路で左大腿部の外側表面上に再び接種した。抗狂犬病抗体の存在について血清を分析した。結果を表8に示す。
狂犬病にかかったことのない5匹のサルのうち4匹が、ALVAC−RGの接種後7日までに血清学的反応を生成した。接種後11日までには、5匹のサル全てが検出可能な抗体を有していた。前に狂犬病糖タンパク質にさらした4匹のサルの、全てがワクチン接種後の3日と7日との間に顕著な血清中和力価の上昇を示した。この結果はリスザルのALVAC−RGでのワクチン接種は、不利な副作用を引き起こさず、初期中和抗体反応が誘導されうることを示している。既往反応もまた再ワクチン接種で誘導される。ALVACもしくは無関係の外来遺伝子を発現するカナリアポックス組換体への事前の接種は、再ワクチン接種時の抗狂犬病免疫反応の誘導に影響しなかった。
HIV−2血清陽性のサル科マカク属のサルのALVAC−RG接種に対する免疫的反応を評価した。動物は上記のように接種され、抗狂犬病血清中和抗体の存在をRFFI試験によって評価した。その結果は、表9に示されているが、皮下経路で接種されたHIV−2陽性動物は、抗狂犬病抗体を1回の接種の11日後までに生成した。既往反応が、最初の接種の約3ヶ月後に与えられた追加接種の後で検出された。経口経路で組換体を接種された動物においては反応は検出されなかった。加えて、一連の6匹の動物を、減少させた量のALVAC−RGで筋内または皮下経路のいずれかで接種した。接種された6匹の内の5匹が、接種後14日までに、抗体力価に顕著な差もなく反応した。
HIVに事前にさらされたチンパンジーを、7.0log10pfuのALVAC−RGで皮下もしくは筋内経路で接種した。接種後3ヶ月に、両方の動物を同じ方法で再接種した。結果を表10に示す。
筋内もしくは皮下のいずれの経路でも、不利な反応は見られなかった。両方のチンパンジーは最初の接種後14日までに反応し、再接種に続いて強力な上昇反応が検出された。
実施例10 狂犬病糖タンパク質を発現するカナリアポックスウイルス(ALVAC−RG;vCP65)を用いたヒトの免疫化
ALVAC−RG(vCP65)は実施例9および図9Aおよび9Bで記述されたように開発された。ワクチン製造をスケールアップするために、ALVAC−RG(vCP65)を特定の病原体のない卵から派生した初代CEF細胞中で増殖させた。細胞を多重度0.01で感染させ、37℃で3日間保温した。
ワクチンウイルス懸濁液を、血清フリーの培地中の感染させた細胞の超音波破砕により得た;細胞破片を遠心分離と濾過により取り除いた。その結果得られた清澄化された懸濁液にリンパ形成安定剤(アミノ酸混合物)を加え、1回分の量ごとにバイアルに小分けし、凍結乾燥した。血清フリー培地およびリンパ形成安定剤中のウイルス懸濁液を10倍ごとに連続して希釈することにより、力価が減少してゆく3つのバッチをリンパ形成に先だって調製した。
細胞基質、培地および種ウイルスおよび最終産物の品質制御テストを、実験室齧歯類中での無害性および偶発的な作用物に注意しながら行った。望ましくない特徴は何も発見されなかった。
臨床前データ 生体外での研究により、VeroまたはMRC−5細胞はALVAC−RGの増殖を支持しないことが示された;一連の8(Vero)および10(MRC−5)盲連続継代により、ウイルスのこれらの非鳥類細胞系統中での増殖への検出可能な適応は引き起こされなかった。ALVAC−RG(vCP65)を感染もしくは接種したヒト細胞系統(MRC−5、WISH、デトロイト532、HEL、HNKもしくはEBVを形質転換したリンパ芽球細胞)の分析で、ウイルス特異的DNAの蓄積は見られず、これらの細胞内においてはDNA合成に先だって複製のブロックが起きていることが示唆された。しかしながら、重要なことには、狂犬病ウイルス糖タンパク質遺伝子の発現は、試験された全ての細胞系統において、カナリアポックス複製サイクルの中止段階はウイルスDNA複製に先だって行われることを示している。
ALVAC−RG(vCP65)の安全性および効率は、動物における一連の実験で立証された。カナリア、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、実験室齧歯類(乳児および成マウス)、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコおよびイヌ、リスザル、アカゲザル、およびチンパンジーに、105から108pfuの範囲にある量を接種した。多様な経路が用いられ、もっとも一般的には皮下、筋内および皮内であったが、経口(サルおよびマウス)および頭蓋(マウス)内も用いられた。
カナリアにおいては、ALVAC−RG(vCP65)は乱切部位において「受け入れ」外傷を、病気の兆候または死を伴わずに引き起こした。ウサギへの皮内接種は、拡散せずに7−10日で治る典型的なポックス接種反応を引き起こした。これらの動物実験のいずれにおいても、カナリアポックスによる望ましくない副作用は見られなかった。ALVAC−RG(vCP65)の接種に続いて、齧歯類、イヌ、ネコ、および霊長類において、高速蛍光焦点阻害試験(RFFIT)で測定された抗狂犬病抗体が生産されたことにより、免疫原性が立証された。ALVAC−RGで免疫化されたマウス、イヌ、およびネコにおける狂犬病ウイルス投与実験により、防御が立証された。
ボランティア 25人の健康な、20−45歳の年齢で、以前に狂犬病免疫の経歴のない成人を登録した。彼らの健康状態を完全な医学的経歴、生理的試験、血液学および血液化学分析により評価した。除外基準には、妊娠、アレルギー、あらゆる種類の免疫抑制、慢性衰弱病、ガン、過去3ヶ月以内の免疫グロブリンの注入、およびヒト免疫不全ウイルス(HIV)もしくはB型肝炎表面抗原に対する血清陽性が含まれていた。
研究計画 参加者に無作為に標準ヒト二倍体細胞狂犬病ワクチン(HDC)バッチ番号E0751(Pasteur Merieux Serums & Vaccine、Lyon、France)または研究用ワクチンALVAC−RG(vCP65)を割り当てた。
この試みは量増加研究と命名された。実験用ALVAC−RG(vCP65)ワクチンの3つのバッチは、3つのグループのボランティア(グループA、BおよびC)に順番に、各々の段階の間に2週間の間隔を置いて用いられた。3つのバッチの濃度はそれぞれ、103.5、104.5、105.5組織培養感染量(TCID50)/投与量であった。
それぞれのボランティアは、同じワクチンを4週間の間隔をおいて三角筋領域に皮下で2投与量を接種された。注入されたワクチンの本質は、最初の接種時には参加者には知られていなかったが、調査者には知られていた。
2回目の注入時の、即時ヘルペス感受性の危険を最小化するため、実験ワクチンの中程度の量を割り当てられたグループBのボランティアは、少ない量を1時間前に接種され、大量を割り当てられたグループCは、少量および中程度の量を1時間の間隔をおいて連続的に接種された。
6ヶ月後、最も多い投与量のALVAC−RG(vCP65)(グループC)およびHDCワクチンの被験者に、3回目の量のワクチンを要請した;彼らは無作為に、前回と同じワクチンを接種されるかまたは別のワクチンを接種されるように設定された。その結果、以下の免疫化の手順に相当する4種類のグループが形成された。1.HDC、HDC−HDC;2.HDC、HDC−ALVAC−RG(vCP65);3.ALVAC−RG(vCP65)、ALVAC−RG(vCP65)−HDC;4.ALVAC−RG(vCP65)、ALVAC−RG(vCP65)−ALVAC−RG(vCP65)。
副作用の観察 全ての被験者を注入後1時間観察し、次の5日間毎日再検査した。彼らは局所的および全体的反応を次の3週間記録するよう要請され、1週間に2回問診された。
実験室調査者 登録前およびそれぞれの接種後2、4および6日後の血液見本を得た。分析は、完全血液細胞計数、肝臓酵素およびクレアチンキナーゼアッセイを含んでいた。
抗体アッセイ 最初の注入の7日前および、研究の7、28、35、56、173、187および208日に抗体アッセイを行った。
狂犬病に対する中和抗体のレベルは、高速蛍光焦点阻害試験(RFFIT)(Smith & Yaeger、Laboratory Techniques on Rabis中)を用いて決定した。カナリアポックス抗体は直接ELISAにより測定した。抗原である、Triton X100で破壊した精製カナリアポックスウイルスの懸濁液をマイクロプレートにコートした。固定化された血清の希釈液を室温で2時間反応させ、反応している抗体はペルオキシダーゼで標識化された抗ヒトIgGヤギ血清で明らかとされた。この結果は490nmの光学密度により表されている。
分析 25人の被験者が登録され、研究を実行された。10人の男性と15人の女性で平均年齢は31.9歳であった(21から48まで)。3人を除く全ての被験者が以前に天然痘ワクチンの証拠を有していた;残りの被験者の3人は典型的な傷跡もワクチン接種経歴も有してはいなかった。3人の被験者は少量の実験用ワクチン(103.5、104.5TCID50)の投与量で接種され、9人の被験者は105.5TCID50の投与量で接種され、10人はHDCワクチンを接種された。
安全性(表11) 最初のシリーズの免疫化の間、接種後24時間以内に37.7℃を超える熱が、1人のHDC被験者(37.8℃)および1人のvCP65 105.5TCID50の被験者(38℃)において見られた。ワクチン接種に帰属される他の全体的反応はいずれの被験者においても観察されなかった。
局所的反応は皮下でHDCワクチンを接種された被験者10人中9人で見られ、vCP65の103.5、104.5、105.5TCID50での被験者ではそれぞれ3人中0人、3人中1人および9人中9人であった。
圧痛はもっとも一般的な兆候であったが、つねに穏やかであった。他の局所的兆候には、穏やかで一過性の赤化と硬化が含まれていた。全ての兆候は通常24時間以内に沈静化し、72時間以上は続かなかった。
血液細胞計数、肝臓酵素あるいはクレアチンキナーゼの値に顕著な変化は無かった。
免疫反応;狂犬病に対する中和抗体(表12) 最初の注入から28日後に全てのHDC被験者は防御的力価(0.5IU/ml以上)を有していた。これとは対照的に、ALVAC−RG(vCP65)の被験者は、グループAおよびB(103.5、104.5TCID50)では0人が、グループC(105.5TCID50)では9人中2人のみがこの防御的力価に達していた。
56日目(即ち第2の接種から28日後)には、ALVAC−RG(vCP65)の被験者のうち、グループAでは3人中0人、グループBでは3人中2人、およびグループCでは9人中9人においてこの防御的力価が達成され、10人のHDC被験者の全てにおいても保持されていた。
56日の相乗平均力価は、グループA、B、CおよびHDCそれぞれにおいて0.05、0.47、4.4および11.5IU/mlであった。
180日には、全ての被験者において狂犬病抗体力価は実質的に減少していたが、HDC被験者10人中5人、ALVAC−RG(vCP65)被験者9人中5人において最小防御力価である0.5IU/mlより大きく残存していた;相乗平均力価はグループHDCおよびグループCで、それぞれ0.51および0.45IU/mlであった。
カナリアポックスウイルスに対する抗体(表13) 観察された免疫化前力価は、高い力価を示した被験者が事前のカナリヤに接触していなかったにも拘わらず、力価0.22から1.23O.D.単位で広く変化していた。免疫化前と2回目の免疫化後との間で力価が2倍を越えて上昇した場合を血清変換と定義した場合、グループBでは被験者3人中1人、グループCでは被験者9人中9人で血清変換が得られたが、HDCまたはグループAでは被験者は1人も血清変換されなかった。
追加接種 ワクチンは同様に6ヶ月後の追加接種時にも十分耐性があった:HDC追加免疫を受けた9人中2人で、ALVAC−RG(vCP65)追加免疫を受けた10人中1人で熱がみられた。局所的反応はHDC追加免疫を受けた9人中6人で、ALVAC−RG(vCP65)追加免疫を受けた9人中5人でみられた。
観察 図13A−13Dは、狂犬病中和抗体力価(高速蛍光焦点阻害試験(RFFIT)IU/ml)を示している:同じまたは別のワクチンで予め免疫化されたボランティア体内におけるHDCおよびvCP65(105.5TCID50)の追加免疫効果。ワクチンは0、28および187日および208日に与えられた。0、7、28、35、56、173および180日に抗体力価を測定した。
図13A−13Dに示されるとおり、与えられた追加免疫量は免疫化の方式に拘わらず全ての被験者中で、狂犬病抗体力価のさらなる上昇をもたらした。しかしながら、ALVAC−RG(vCP65)追加免疫は全体的に、HDC追加免疫より低い免疫反応を誘導し、ALVAC−RG(vCP65)、ALVAC−RG(vCP65)−ALVAC−RG(vCP65)グループは他の3つのグループより顕著に低い力価を有していた。同様に、ALVAC−RG(vCP65)追加注入は、HDCワクチンを以前に接種された被験者5人中3人、および以前にALVAC−RG(vCP65)で免疫化された被験者5人すべてにおいて、カナリアポックス抗体力価の上昇をもたらした。
全体として、vCP65の接種による局所的副作用は、ウイルスの局所的増殖を示すものではなかった。特に、ワクチンの注入後にみられる等の皮膚の外傷は無かった。見かけ上のウイルスの複製が無かったにも拘わらず、注入はボランティアにおいて大量のカナリアポックスベクターおよび発現された狂犬病糖タンパク質の両方に対する抗体の生産をもたらした。
狂犬病中和抗体は、マウス中の血清中和試験と相関することが知られている高速蛍光焦点阻害試験(RFFIT)によりアッセイした。105.5TCID50の被験者9人のうち、5人は最初の量の後より少ないレベルの反応を示した。狂犬病抗体の防御的力価が、2回目の接種の後で、試験された多量の被験者の全て、および、中程度の量の被験者においてすら3人中2人において得られた。この研究において、両方のワクチンは、生ワクチンで推奨されているが不活性化HDCにはされていない、皮下経路で接種された。この接種経路は、接種部位を注意深く観察するのに最適であるために選択されたが、これによりHDC被験者における抗体の遅い出現が説明できる:事実、HDC被験者は7日には1人も抗体上昇を有していなかったが、HDCワクチンを筋肉内に接種した殆どの研究においては、かなりの割合の被験者が有している(Klietmann et al.,Int’l Green Cross−Geneva,1981;Kuwert et al.,Int’l Green Cross−Geneva,1981)。しかしながら、本発明は必ずしも皮下経路の接種に限定されない。
狂犬病中和抗体のGMT(相乗平均)は、試験しているワクチンはHDC対照よりも低かったが、しかし防御に要求される最小値よりも十分に上だった。本研究で用いられた3種類の投与量について得られた明白な投与量効果反応は、より多量の投与量はより強力な反応を誘導するかもしれないことを示唆している。この開示から確かに、当業者は、委された患者に対する適切な量を選択できる。
抗体反応を上昇させる能力は、もう一つのこの実施例の重要な結果である;事実、狂犬病抗体力価は、どの免疫化の方法でも、6ヶ月後に全ての被験者において得られ、カナリアポックスベクターまたは狂犬病糖タンパク質によって以前に誘導された免疫性は組換えワクチン候補株または従来のHDC狂犬病ワクチンによる追加免疫にブロック効果を有さないことが示された。このことは、他のワクシニアウイルス組換体に関する、以前から存在する免疫によってヒトにおいて免疫反応はブロックされるという発見と対照をなす(Cooney et al.,Lancet 1991,337:567−72;Etinger et al.,Vaccine 9:470−72,1991)。
このように、この実施例は、非複製的ポックスウイルスが動物もしくは人間において免疫化ベクターとして、複製作用物は免疫反応を与えるという利点があるが、十分に伝播性であるウイルスによって引き起こされる安全性の問題をともなわずに利用可能であることが明白に示された。
実施例11 ALVACおよびNYVACのLD 50 の様々なワクシニアウイルス株との比較
マウス 雄の異系交配されたスイスウェブスターマウス(Swiss Webster mice)を、タコニック ファーム(Taconic Farm,Germantown,NY)より購入し、マウス用食事および水 ad libitumで生後3週間で使用するまで育てた(「通常」マウス)。両方の性の新生異系交配スイスウェブスターマウスを、タコニックファームで行われた続いての定期の妊娠により得た。用いられた全ての新生マウスは2日間の期間内に配達された。
ウイルス ALVACはカナリアポックスウイルス集団のプラーク精製により派生し、初代ニワトリ胚繊維芽細胞(CEF)中で調製された。ショ糖密度勾配遠心分離による精製に続いて、CEF細胞中でプラーク形成単位を数え上げた。ワクシニアウイルスWR(L)変異体は、WRの大プラーク表現型の選択により派生された(Panicali et al.,1981)。ニューヨーク州保健委員会ワクシニアウイルスワクチン株であるWyethは、Parmaceuticals Calf Lymph TypeワクチンDryvax、制御番号302001Bより得た。コペンハーゲン株ワクシニアウイルスVC−2をInstitut Merieux、Franceより得た。ワクシニアウイルス株NYVACはコペンハーゲンVC−2から派生された。Wyeth株を除く全てのワクシニアウイルス株をVeroアフリカミドリザル腎臓細胞中で培養し、ショ糖密度勾配遠心分離により精製しそしてVero細胞上でのプラーク形成単位を数え上げた。Wyeth株はCEF細胞中で増殖させ、CEF細胞中で数え上げた。
接種 10匹の通常マウスに、ストック調製物を滅菌リン酸緩衝生理食塩水で10倍づつ連続的に希釈したいくつかの希釈液の1つを、0.05ml頭蓋内経路(ic)で接種した。いくつかの場合には、希釈しないストックウイルス調製物を接種に用いた。
10匹の、生後1日または2日の新生マウスのグループに、通常マウスと注入量が0.03mlで用いられたこと以外は同じようにicで接種した。
全てのマウスについて、接種後14日(新生マウス)または21日(通常マウス)の期間にわたり、毎日死亡率を観察した。接種の次の朝に死んでいるのが見つかったマウスは、トラウマによる死の可能性があるので除外した。
実験集団の死亡率50%を達成するために要求される致死量(LD50)をReedおよびMuenchの比例法により測定した。
ALVACおよびNYVACの、通常マウスおよび、若異系交配マウスに対するic経路でのLD 50 と、様々なワクシニアウイルス株との比較 若マウス、通常マウスにおけるNYVACおよびALVACの毒性は、他の試験されたワクシニアウイルスよりも数桁のオーダーで低かった(表15)。NYVACおよびALVACは、Wyeth株より通常マウス中で3000倍以上も毒性が低いこと;125000倍以上も親VC−2より毒性が低いこと;および63000000倍もWR(L)派生体よりも毒性が低いことが判明した。これらの結果は、NYVACは他のワクシニア株と比較して高度に弱毒化されていること、および、両方とも極端に大量(3.85×108pfu;ALVAC および3×108pfu;NYVAC)に頭蓋内経路で接種すると、まだ同定されていない機構によってマウスにおいて死を引き起こすが、ALVACは一般的に頭蓋内経路で投与された場合には若マウスにおいて非毒性であること、を示唆しているであろう。
ALVACおよびNYVACの、新生異系交配マウスに対するic経路でのLD 50 と、様々なワクシニアウイルス株との比較 5つのポックスウイルス株の相対毒性を、通常、新生マウスに対して頭蓋内(ic)投与モデルシステムにおいて滴定により試験した(表15)。終了点としての死亡率に関し、LD50値は、ALVACは100000倍以上もワクシニアウイルスWyeth株よりも非毒性であること;ワクシニアウイルスコペンハーゲンVC−2株より200000倍以上も非毒性であること;およびワクシニアウイルスWR−L株より25000000倍以上も非毒性であることが示された。にもかかわらず、試験された最も多量の投与量6.3×107pfuでは、死亡率100%という結果であった。6.3×106pfuでは、33.3%という死亡率であった。死の原因は、実際に決定されてはいないが、最も多量の投与量(約6.3LD50)のグループの平均生存時間(MST)は6.7プラスマイナス1.5日だったので、毒物学的またはトラウマ的本質ではないようであった。5LD50の投与量ではMSTが4.8プラスマイナス0.6日であるWR(L)と比較した場合、ALVACのMSTは顕著に長かった(P=0.001)。
NYVACと比較して、Wyethは15000倍以上も毒性であり;VC−2は35000倍以上も毒性であり;WR(L)は3000000倍以上も毒性であった。ALVACと同様に、最も多量の2つのNYVAC投与量6×108pfuおよび6×107pfuは、100%の死亡率を引き起こした。しかしながら、380LD50に相当する、最も多量に投与されたマウスのMSTはたったの2日であった(9匹が2日に死に、1匹が4日に死んだ)。これと対照的に、最も多量の500LD50に相当するWR−Lを投与された全てのマウスは、4日まで生存した。
実施例12 NYVAC(vP866)およびNYVAC−RG(vP879)の評価
免疫沈降 事前に形成された鳥類もしくは非鳥類細胞の単層に10pfu/細胞の親NYVAC(vP866)もしくはNYVAC−RG(vP879)ウイルスを接種した。接種をメチオニンフリーで2%の透析牛胎児血清を添加したEMEM中で接種を行った。1時間の保温の後で、接種物を除去し、培地を20μCi/mlの35S−メチオニンを含むEMEM(メチオニンフリー)で置換した。一晩、約16時間の保温の後、細胞をバッファーA(1%Nonidet P−40、10mMトリスpH7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、0.01%アジ化ナトリウム、500単位/mlのアプロチニンおよび0.02%フェニルメチルスルフォニルフロリド)の添加により溶解させた。免疫沈降を、C.Trimarchi博士、Griffith研究所、ニューヨーク州保健部、Albany、ニューヨークによって供給された24−3F10と命名された、狂犬病糖タンパク質特異的モノクローナル抗体、およびべーリンガーマンハイム社より得られたラット抗マウス接合体(型番#605−500)を用いて行った。ファルマシアLKBバイオテクノロジー社、Piscataway、ニュージャージーより得られたプロテインAセファロースCL−48を支持マトリクスとして用いた。免疫沈降沈殿物は、Dreyfuss et al.(1984)の方法に従って10%ポリアクリルアミドゲルにより分画した。ゲルを固定化し、間接撮影用に1Mサリチル酸ナトリウムで1時間処理し、免疫沈降されたタンパク質種を視覚化するためにコダックXAR−2フイルムに曝露した。
動物の起源 ニュージーランド白ウサギはHare−Marland(Hewitt、ニュージャージー)より得た。生後3週間の雄のスイスウェブスター異系交配マウス、定期妊娠雌スイスウェブスター異系交配マウス、および生後4週間のスイスウェブスターヌード(nu+nu+)マウスはタコニックファーム社(Germantown、ニューヨーク)より得た。全ての動物はNIHガイドラインに従って維持された。全ての動物プロトコルはIACUC協会で承認されている。必要と思われるときは、明らかに末期的病状のマウスは安楽死させた。
ウサギにおける外傷 2匹のウサギの各々に、皮下で複数の部位に、それぞれ104、105、106、107または108pfuの試験用ウイルスを含むPBSまたはPBSのみを0.1ml接種した。ウサギを4日から外傷が治るまで毎日観察した。硬化および潰瘍化を測定し記録した。
接種部位からのウイルスの回収 1匹のウサギに、皮下で複数の部位に、106、107、108pfuの試験用ウイルスを含むPBSまたはPBSのみを0/1ml接種した。11日後、ウサギを安楽死させ、接種部位それぞれから採取された皮膚生検試料を、機械的破壊および直接的ではない超音波によって無菌的に、ウイルス回収のために調製した。感染可能なウイルスはCEF単層上でのプラーク滴定によりアッセイした。
マウス中での毒性 マウス10匹、またはヌードマウス実験では5匹のグループを、いくつかの0.5mlの滅菌PBS中のウイルス希釈液のうちの1つで、ip接種した。実施例11を参照した。
シクロホスファミド(CY)処理 マウスをip経路で4mg(0.02ml)のCY(SIGMA)で−2日に接種し、続いて0日にウイルスを接種した。感染後に続く日々には、マウスにCYをip接種:1日には4mg;4、7および11日には2mg;14、18、21、25および28日には3mg。免疫抑制を間接的にクールターカウンター(Coulter Counter)により11日に白血球を計数することにより観察した。平均白血球数は処理されていないマウス(n=4)で1μlあたり13500細胞、CY処理対照マウス(n=5)で1μlあたり4220細胞であった。
LD 50 の計算 死亡率50%をなすために必要な致死量(LD50)を、ReedおよびMuenchの比例法(Reed and Muench,1938)により決定した。
NYVAC−RGのマウス中での能力試験 生後4−6週間のマウスに、50から100μlのVV−RG(Kieny et al.,1984)、ALVAC−RG(Taylor et al.,1991b)、またはNYVAC−RGのいずれかの、2.0−8.0 log10組織培養感染量50%(TCID50)を含む希釈液を足部に接種した。各々のグループは8匹のグループからなっていた。接種後14日に、マウスに脳内接種で15LD50の狂犬病ウイルスCVS株を投与した(0.03ml)。28日には、生存したマウスを数え、防御量50%(PD50)を計算した。
NYVAC(vP866)の誘導 ワクシニアウイルスNYVACは、コペンハーゲンワクチン株のプラーククローン単離体であるVC−2から開発された。VC−2からNYVACを開発するために、多くの毒性に関与するウイルス機能を含む18のワクシニアORFを、一連の連続的操作によりこの開示の前の部分で記述したように精密に欠失させた。これらの欠失は、新しい所望でないORFが現れることを防ぐために計画された方式で構築した。図10はNYVACを開発するために欠失されたORFを模式的に示している。図10の上部は、ワクシニアウイルスゲノム(VC−2プラーク単離体、コペンハーゲン株)のHindIII制限地図を示している。拡大部分は、NYVACの開発において連続的に欠失されたVC−2の6つの領域である。この欠失はこの開示の前の部分で記述されている(実施例1から6)。以下に、座からORFが欠失された欠失座を、機能もしくはホモロジーおよびそれらの遺伝子産物の分子量とともに列記する。
NYVACおよびALVACのヒト組織細胞系統上での複製の研究 ヒト起源の細胞中でのワクシニアウイルスNYVAC株(vP866)の複製のレベルを決定するために、6種類の細胞系統に、細胞あたり0.1pfuの投入多重度で液体培地に接種し、72時間保温した。平行して、コペンハーゲン親クローン(VC−2)も接種した。初代ニワトリ胚繊維芽(CEF)細胞(10−11日経過したSPF起源の受精卵から得た、Spafas、Inc.,Storrs、CT)を、全てのウイルスに対する許容的細胞基質を代表するものとして含めた。培養を2つの基準:生産的ウイルス複製の発生および外因性抗原の発現、に基づいて分析した。
多数のヒト派生細胞中でのNYVACの複製能力を図16に示した。VC−2およびNYVACは両方ともCEF細胞中で生産的に複製可能であったが、NYVACは僅かに収量が減少した。VC−2は、試験された6種類のヒト派生細胞系統のうち、EBV形質転換リンパ芽球細胞系統JT−1(エプスタイン−バーウイルスで形質転換されたヒトリンパ芽球細胞系統、Rickinson et al.,1984を参照)を除いて、匹敵する収量で生産的に複製可能であった。これに反し、NYVACは、いずれの試験されたヒト派生細胞系統においてもその生産的複製能力において高度に減衰されていた。残存ウイルスレベル以上の感染可能なウイルスの少量の増加が、NYVACに感染させたMRC−5(ATCC#CCL171、ヒト胚肺起源)、デトロイト532(ATCC#CCL54、ヒト包皮、ダウン症)、HEL299(ATCC#CCL137、ヒト胚肺細胞)およびHNK(ヒト新生児腎臓細胞、Whittiker Bioproducts,Inc.Walkersville、MD、型番#70−151)細胞より得られた。これらの細胞系統における複製は、NYVAC感染CEF細胞から得られた収量、または親VC−2(表16)と比較して、顕著に減少していた。NYVACおよびVC−2のCEF細胞中の24時間での収量は72時間での収量と同等であったことは注目すべきである。ヒト細胞系統培養をさらに48時間(さらに2回のウイルス増殖サイクル)保温することは、従って、得られる相対ウイルス収量を増幅させるかもしれない。
ヒト派生細胞系統MRC−5およびデトロイト532において得られる低レベルのウイルス収量と一致して、検出可能であるが減少したレベルでのNYVAC特異的DNA蓄積がみられた。NYVAC感染CEF細胞でみられたものと関連して、MRC−5およびデトロイト532NYVAC感染細胞系統DNA蓄積レベルの相対ウイルス収量を比較した。NYVAC特異的ウイルスDNA蓄積はいずれの他のヒト派生細胞においても観察されなかった。
同等の実験をアビポックスウイルスALVACを用いて行った。ウイルス複製の結果は表16に示す。カナリアポックスウイルスの鳥類種への宿主制限と一致して、子ウイルスはいずれのヒト細胞系統においても検出されなかった。ALVACがこれらのヒト派生細胞内での生産的複製の欠失は、ALVAC特異的DNA蓄積がいずれのヒト派生細胞系統においても検出されなかったという観察とも一致している。
ヒト細胞中でのNYVAC−RG(vP879)による狂犬病糖タンパク質の発現 効率的な外来遺伝子の発現が、顕著なレベルの生産的ウイルス複製の存在無しに得られるか否かを決定するために、同じ細胞系統を、狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現するNYVAC組換ウイルス(vP879、実施例7)35Sメチオニン存在下で接種した。放射性標識された培養破砕物から、狂犬病糖タンパク質特異的モノクローナル抗体を用いて狂犬病糖タンパク質の免疫沈降を行った。67kDaのタンパク質の免疫沈降が検出され、狂犬病糖タンパク質の完全グリコシル化型と一致していた。血清学的に交叉反応する生産物は、非感染もしくは親NYVAC感染細胞破砕物においては検出されなかった。分析された他の全てのヒト細胞においても同様の結果が得られた。
ウサギ皮膚への接触 皮内(id)接種に続くウサギの外傷の誘導および本質が、ワクシニアウイルスの病原性の尺度として、以前から用いられている(Buller et al.,1988;Child et al.,1990;Fenner,1958;Flexner et al.,1987;Ghend on and Charnos,1964)。故に、ワクシニア株WR(ATCC#VR119、CV−1細胞ATCC#CCL70上でプラーク精製、およびL変異体と命名されたプラーク単離体、ATCC#VR2035 Panicali et al.,1981に記載の通りに選択)、Wyeth(ATCC#VR325、DRYVACとして流通、Wyeth Laboratories、Marietta、PA)、コペンハーゲン(VC−2)、およびNYVACでのid接種と関連した外傷の本質を、2匹のウサギ(A069およびA128)への接種により評価した。2匹のウサギは、ウイルスに対して異なった全体的感受性を示し、ウサギA128はウサギA069よりも深刻ではない反応を示した。ウサギ128Aにおいては、外傷は比較的小さく接種後27日までに治癒した。ウサギA069においては、外傷は強烈で、特にWR接種部位に対してひどく、49日後にようやく治癒した。外傷の強度は、リンパ排出経路に関連して接種部位にもまた依存していた。特に、背脊椎上に位置した部位ではより強烈な外傷を示し、側腹部に位置した外傷を治癒するためにはより長い時間を要した。全ての外傷を、4日から最後の外傷が消失するまで毎日測定し、最大の外傷の大きさと治癒に要した日数の平均を計算した(表17)。対照PBSを接種した部位からは局所反応は観察されなかった。潰瘍化外傷がワクシニアウイルス株WR、VC−2およびWyethを接種した部位で観察された。重要なことには、NYVACを接種した部位では潰瘍化または硬化した外傷は観察されなかった。
感染可能なウイルスの接種部位での持続性 これらのウイルスの接種部位での相対持続性を評価するため、ウサギに対して、皮内経路で複数の部位に、106、107または108pfuのVC−2、WR、WyethまたはNYVACを含む0.1mlのPBSを接種した。各々のウイルスは、107pfu量を背脊椎上に、106および108量を隣接させて位置させた。接種部位を11日間毎日観察した。WRは最も強烈な反応を誘導し、VC−2およびWyethが続いた(表18)。潰瘍化は最初に9日目にWRおよびWyethで、10日目にVC−2で観察された。NYVACまたは対照PBSを接種した部位は潰瘍化も硬化も示さなかった。接種後11日目に、接種部位から皮膚試料を切り出し、機械的に破壊し、ウイルスをCEF細胞で滴定した。この時点で、投与された以上のウイルスが回収された例は無かった。ワクシニア株WRの回収は、投与ウイルス量に関係なく約106pfuであった。ワクシニア株WyethおよびVC−2の回収は投与量に関係なく103から104pfuであった。感染可能なウイルスはNYVAC接種部位から回収されなかった。
遺伝的もしくは化学的免疫欠損マウスの接種 大量のNYVAC(5×108pfu)またはALVAC(109pfu)を腹腔経路でヌードマウスに接種したが、100日間の観察期間にわたって死亡、外傷および明白な病気もみられなかった。これと対照的に、WR(103から104pfu)、Wyeth(5×107または5×108pfu)もしくはVC−2(104から109pfu)を接種したマウスは、伝播した典型的なポックスウイルス外傷を、最初はつま先、次に尾に示し、続いていくつかの動物においては深刻な睾丸炎を示した。WRまたはWyethを感染させたマウスにおいては、伝播した外傷の現れは総じて最後には死へとつながっていたが、VC−2に感染させたマウスは殆どは最後には回復した。計算されたLD50値は表19に示されている。
特に、VC−2を接種されたマウスは、つま先に、1から2日後には尾に外傷(赤い丘疹)を示した。これらの外傷は接種後(pi)11から13日の間に最も高い投与量のマウスにおいて(103、108か、107かおよび106pfu)、pi16日には105pfu投与されたマウス、およびpi21日には104pfu投与されたマウスにおいて起こった。103および102pfuを接種したマウスにおいては、100日の観察期間の間は外傷はみられなかった。pi23日には、109および108pfuを接種したマウスにおいて、7日後には他のグループ(107から104pfu)において睾丸炎がみられた。睾丸炎は特に109および108pfuグループにおいて強烈で、減少してはいたものの、100日間の観察の終わりまで観察された。いくつかの、pi30−35日頃に起じてきた痘様外傷が、2、3のマウスの皮膚上にみられた。殆どの痘外傷は通常はpi60−90日の間に治癒した。109pfuを接種したグループのマウスが1匹だけ死に(pi34日)、108pfuを接種したグループのマウスが1匹だけ死んだ(pi94日)。VC−2を接種されたマウスにおいて他に死亡は観察されなかった。
104pfuのワクシニアWR株を接種したマウスはpi17日で痘外傷を示し始めた。これらの外傷はVC−2を注入されたマウスによって示された(つま先、尾と拡がる)外傷と同様に現れた。103pfuのワクシニアWR株を接種したマウスはpi34日まで外傷を示さなかった。睾丸炎は最も多量のWR(104pfu)を接種したマウスにおいてのみみられた。観察期間の後半の間、外傷は口の周りに現れ、マウスは摂食を停止した。104pfuのワクシニアWR株を接種したマウスは全て、pi21日から31日の間に死ぬか必要と思われたときは安楽死させた。103pfuのワクシニアWR株を接種したマウス5匹のうち4匹はpi35日から57日の間に死ぬか必要と思われるときには安楽死させた。低いWRの投与量(1から100pfu)を接種されたマウスにおいて死亡は観察されなかった。
ワクシニアウイルスWyeth株を多量に(5×107pfuおよび5×108pfu)接種されたマウスはつま先と尾に外傷を示し、睾丸炎を起こし、死んだ。5×106pfuもしくはこれ以下のWyethを注入されたマウスは病気もしくは外傷の兆候を示さなかった。
表19に示されるとおり、CY処理マウスは、ヌードマウスよりも高感度なポックスウイルス毒性アッセイモデルを提供した。ワクシニアウイルス株WR、WyethおよびVC−2に対するLD50値は、このモデルシステムにおいては、ヌードマウスモデルにおけるよりも顕著に低かった。さらに、以下に示すように、Wyeth、WRおよびVC−2ワクシニアウイルスを、それぞれ多量に注入されたマウスで生じた外傷は、より早い外傷の形成という結果となった。ヌードマウスでみられたように、NYVACまたはALVACを注入されたCY処理マウスは、外傷を引き起こさなかった。しかしながら、ヌードマウスとは異なり、NYVACまたはALVACを投与されたCY処理マウスにおいて、投与量に関係なく、いくつかの死亡が観察された。これらのランダムな出来事が死の原因と考えられる。
全てのWyeth投与量(9.5×104から9.5×108pfu)で注入されたマウスは、pi7日と15日の間にそれらの尾および/またはつま先に痘外傷を示した。加えて、尾とつま先は膨張した。尾の外傷の発展は、ポックス外傷に典型的な丘疹、潰瘍化および最終的なかさぶたの形成であった。全てのVC−2投与量(1.65×105から1.65×109pfu)で注入されたマウスもまた、Wyethで接種されたマウスのそれと同様に、それらの尾および/またはつま先に痘外傷を示した。これらの外傷は、接種後7−12日の間に観察された。少量のWRウイルスを注入されたマウスでは外傷は観察されなかったが、これらのグループにおいて死亡は引き起こされた。
NYVAC−RGの能力試験 ワクシニアウイルスコペンハーゲン株の弱毒化が、その結果生じたNYVAC株の有用なベクターとしての能力を顕著に変化させることなく効果を示していることを調べるため、比較能力試験を行った。ウイルスを弱毒化するために行われた連続的遺伝子操作の間のベクターの免疫原的能力を観察するために、狂犬病ウイルス糖タンパク質をレポーター外因性遺伝子として用いた。狂犬病糖タンパク質遺伝子を発現するベクターの防御効果を、狂犬病に対する標準NIHマウス能力試験(seligmann,1973)により評価した。表20は高度弱毒化NYVACベクターから得られたPD50値が、tk座に狂犬病糖タンパク質遺伝子を有するコペンハーゲンをベースとした組換体(Kieny et al.,1984)を用いて得られた値と同一であり、鳥類種に複製が限定されているカナリアポックスベースのベクターであるALVAC−RGについて得られたPD50値に近かったことを示している。
観察 公知の毒性遺伝子を欠失され制限された生体外増殖特性を有するNYVACを、その弱毒化特性を評価するため動物モデルシステム中で分析した。これらの研究は、神経毒性ワクシニアウイルス実験室株、WR、2つのワクシニアウイルス株、Wyeth(ニューヨーク市保健局)およびコペンハーゲン(VC−2)、さらにカナリアポックスウイルス株、ALVAC(実施例11を参照)と比較して行った。これとともに、これらのウイルスは、マウス投与モデルおよびウサギ皮膚モデルにおける、最も毒性株であるWR、立証された特性とともに以前に用いられていた弱毒化ワクチン株を提供しているコペンハーゲン(VC−2)およびWyeth、複製が鳥類種に限られているポックスウイルスの例を提供しているALVACに関し、相対的病原性ポテンシャルのスペクトルを提供した。これらの生体内分析の結果は、ワクシニアウイルス株、WR、Wyethおよびコペンハーゲン(VC−2)と比較して高度に弱毒化されたNYVACの性質を明白に示している(表14−20)。重要なことには、NYVACのLD50値は、鳥類宿主制限アビポックスウイルス、ALVACについて見られた値と匹敵するものであった。NYVACによる死亡は、ALVACと同様に、極端に大量のウイルスが頭蓋内経路で投与された場合にのみ観察された(実施例11、表14、15、19)。これらの死が、多量のタンパク質の接種の非特異性は必然的結果であるか否かはまだ確定はしていない。免疫不全マウスモデル(ヌードマウスおよびCY処理)における分析はまた、WR、Wyethおよびコペンハーゲン株と比較して、NYVACの相対的に高い弱毒化特性を示している(表17および18)。重要なことには、伝播したワクシニア感染あるいはワクシニア性病気の証拠が、NYVACを接種された動物またはALVACを接種させた動物においては、観察期間にわたって観察されなかったことである。NYVAC中の複数の毒性関連遺伝子の欠失は、病原性に関して相乗効果を示した。他のNYVACの無毒性の尺度が、ウサギ皮膚への皮内投与によって提供された(表17および18)。非鳥類種では複製できないウイルスであるALVACについての結果を考えると、ALVACの皮内接種は、投与量に応じたかたちで硬化の範囲を引き起こしたので、接種部位における複製能力は、単に反応性と相関しているのではない。従って、ウイルスの複製能力以外の要素が外傷の形成に寄与していることはあり得る。NYVACの遺伝子の欠失は外傷の現れを防止する。
同じく、実施例11を含む先の実施例およびこの実施例の結果は、WR、および以前にワクシニアウイルスワクチン株として用いられていた、Wyethおよびコペンハーゲンと比較して、高度に弱毒化されたNYVACの性質を示している。事実、試験された動物モデルシステムにおける、NYVACの病原性プロフィールは、鳥類種でのみ生産的に複製することが知られているポックスウイルス、ALVACのそれに近かった。ヒト(表16)およびマウス、ブタ、イヌおよびウマを含む他の種から派生した細胞上での、明らかに制限されたNYVACの生産的複製能力は、ワクチン接種されていない接触体もしくは一般的環境への潜在的伝播を限定もしくは防止するとともに、ワクチン接種された個体内での伝播の、低い可能性をベクターに提供する。
重要なことには、NYVACべースのワクチン候補株は効率的であることが示されている。数多くの病原体由来の外来遺伝子産物を発現するNYVAC組換体は、霊長類を含むいくつかの動物種において外来遺伝子産物に対する免疫反応を誘導する。特に、狂犬病糖タンパク質を発現するNYVACベース組換体は、致死量の狂犬病投与に対してマウスを防御可能であった。NYVACベースの狂犬病糖タンパク質組換体の能力は、tk遺伝子座中に狂犬病糖タンパク質を含むコペンハーゲンベースに対するPD50値に匹敵していた(表20)。NYVACベースの組換体は麻疹ウイルス中和抗体をウサギにおいて誘導し、ブタにおいて仮性狂犬病ウイルスおよび日本脳炎ウイルス投与に対する防御を誘導することが示された。高度に弱毒化されたNYVAC株は、ヒトおよび獣医学の用途に安全性の利点を付与している(Tartaglia et al.,1990)。さらには、NYVACの総合的研究室用発現ベクターシステムとしての利用は、ワクシニアウイルス利用に関する生物的危険を大きく減少させる。
以下の基準によって、この実施例の結果および、実施例11を含む文書中の実施例は、NYVACが高度に弱毒化されていることを示している:a)接種部位での検出可能な硬化あるいは潰瘍化がない(ウサギ皮膚);b)皮内接種部位からの感染可能はウイルスの速やかな消失(ウサギ皮膚);c)睾丸炎がない(ヌードマウス);d)大きく減少された毒性(頭蓋内投与、生後3週間および新生マウス);e)大きく減少された病原性および免疫不全対象物(ヌードおよびシクロホスファミド処理マウス)において拡散性がない;およびf)劇的に減少された、多様なヒト組織培養細胞上での複製能力。しかしながら、高度に弱毒化されているにも拘わらず、NYVACは、ベクターとして、外因性抗原に対して強力な免疫反応を誘導する能力を保持している。
実施例13 トリインフルエンザウイルス血球凝集素糖タンパク質を発現するTROVAC組換体の構築
この実施例はトリインフルエンザウイルスの3つの血清型の血球凝集素遺伝子を発現するニワトリポックスウイルス組換体の開発を記述する。
細胞およびウイルス H4、H5およびH7血球凝集素遺伝子のcDNAクローンを含むプラスミドを、Dr.Robert Webster、St.Jude Children’s Research Hospital、Memphis、Tennesseeより入手した。FP−1と命名されたFPV株は以前に記述されている(Taylor et al.,1988a,b)。これは、生後1日のニワトリのワクチン接種に有用なワクチン株である。親株Duvetteはフランスでニワトリからニワトリポックスのかさぶたとして得られた。親株はふ化鶏卵における約50回の連続継代とそれに続くニワトリ胚繊維芽(CEF)細胞で25回の継代により弱毒化された。このウイルスは1980年にRhone Merieux、Lyon、Franceで得られ、マスターウイルスシードを作り出した。このウイルスは1989年にVirogeneticsに受領され、ウイルスは4回の連続プラーク精製にかけられた。1つのプラーク単離体を初代CEF細胞中で増幅し、TROVACと命名されたストックウイルスとした。この生体外組換えテストでTROVAC−AIH5(vFP89)およびTROVAC−AIH4(vFP92)を生成するために用いられたストックウイルスは、初代CEF中で8回の継代にかけられさらに増幅された。TROVAC−AIH7(vFP100)を生成するために用いられたストックウイルスは、初代CEF中で12回の継代にかけられさらに増幅された。
F8座へのニワトリポックス挿入プラスミドの構築 プラスミドpRW731.15は、TROVACゲノムDNAからクローン化された10kbpのPvuII−PvuII断片を有している。3659bpPvuII−EcoRV断片のヌクレオチド配列が両方の鎖について決定された。この配列を図11に示す(配列番号67)。本研究室でF8と命名されたオープンリーディングフレームの限定が、この配列の内部で決定された。オープンリーディングフレームは、位置495から開始され位置1887で終了する。以下に記述するように、位置779から位置1926までを欠失させた。
プラスミドpRW761は2430bpのEcoRV−EcoRV断片を含むpRW731.15のサブクローンである。プラスミドpRW761をXbaIで完全消化、SspIで部分消化した。3700bpのXbaI−SspIバンドを単離し、アニーリングさせたオリゴヌクレオチドJCA017(配列番号37)およびJCA018(配列番号38)と連結した。
この連結により生じたプラスミドをpJCA002と命名した。プラスミドpJCA004はワクシニアウイルスH6プロモーターに連結した非関連遺伝子をプラスミドpJCA002中に有している。ワクシニアウイルスH6プロモーターの配列は以前に記述された(Taylor et al.,1988a,b;Guo et al.,1989;Perkus et al.,1989)。プラスミドpJCA004をEcoRVとBamHIで消化し、非関連遺伝子とH6プロモーター37末端の一部を欠失させた。アニーリングさせたオリゴヌクレオチドRW178(配列番号48)およびRW179(配列番号49)をEcoRVおよびBamHIで消化し、JCA004のEcoRVおよびBamHI、部位の間に入れ、pRW846を生成した。
それ故、プラスミドpRW846はH6プロモーターの5’EcoRVを、ORF欠失されたF8座に有している。プラスミドpRW846中のH6プロモーターの3’HincII部位に、翻訳終了コドン、ワクシニアウイルス初期プロモーター(Yuen et al.,1987)により認識される転写終結コドンおよびSmaI部位が続いている。
F7座へのニワトリポックス挿入プラスミドの構築 元々のF7ORFが欠失されていない挿入プラスミド、pRW731.13は、5.5kbpのFPゲノムのPvuII断片をpUC9のPvuII部位中に有している。挿入部位はこれらの配列内部の固有のHincIIである。図12に示されているヌクレオチド配列(配列番号68)は、固有のHincII部位を含む2356bpの領域について決定された。この配列の解析により、固有のHincII部位(図12、下線)は90アミノ酸のポリペプチドをコードしているORFの内部に位置していることが明らかとなった。ORFは位置1531のATGにより始まり、位置898で終わる(図12中で矢印で示された位置)。
ORF欠失させた挿入プラスミドのためのアームはpRW731.13をテンプレートとして用いたPCRにより派生した。ORFの上流領域に相当する596bpのアーム(HBと命名)は、オリゴヌクレオチドF73PH2(配列番号50)およびF73PB(配列番号51)により増幅された。
ORFの下流領域に相当する270bpのアーム(EHと命名)は、オリゴヌクレオチドF75PHE(配列番号52)およびF73PH1(配列番号53)により増幅された。
断片EHをEcoRVで消化し、126bpの断片を生成した。EcoRV部位は3’末端にあり、5’末端はHincIIの3’末端を含むようPCRにより形成した。この断片を、HincIIで消化したpBS−SK(Strategene、La Jolla、CA)中に挿入し、プラスミドpF7D1とした。この配列をジデオキシヌクレオチド配列分析により確認した。プラスミドpF7D1をApaIで直線化し、T4 DNAポリメラーゼで平滑化し、596bpのHB断片へ連結した。生成されたプラスミドをpF7D2と命名した。全体の配列と方向をヌクレオチド配列分析により確認した。
プラスミドpF7D2をEcoRVおよびBglIIで消化し、600bpの断片を生成させた。この断片をApaIで消化し、T4DNAポリメラーゼで平滑化し、続いてBamHIで消化したpBS−SKに挿入した。その結果生成されたプラスミドをpF7D3と命名した。このプラスミドは404bpのHBアームと12bpのEHアームを含んでいる。
プラスミドpF7D3を、XhoIで直線化し、E.coliDNAポリメラーゼクレノー断片で2mMのdNTPの存在下で平滑化した。この直線化されたプラスミドはアニーリングさせたオリゴヌクレオチドF7MCSB(配列番号54)およびF7MCSA(配列番号55)と連結させた。
これは、HindIII、PstIおよびSmaI制限部位を含むマルチプルクローニング領域をEHアームとHBアームとの間に挿入するために行った。生成されたプラスミドをpF7DOと命名した。
F8座へのH4血球凝集素挿入プラスミドの構築 A/Ty/Min/833/80から派生したトリインフルエンザH4をコードしているcDNAは、プラスミドpTM4H833中に、Dr.R.Websterより入手した。プラスミドをHindIIIおよびNruIで消化し、E.coliDNAポリメラーゼクレノー断片でdNTPの存在下で平滑化した。H4コード領域を含む平滑化2.5kbpHindIII−NruI断片を、pIBI25(International Biotechnologies、Inc.、New Haven、CT)のHincII部位に挿入した。その結果生成されたプラスミドpRW828を部分的にBanIIで切断し、線状産物を単離しHindIIIで再び切断した。今、100bpのHindIII−BanIIを欠失されたプラスミドpRW828は、合成オリゴヌクレオチドRW152(配列番号56)およびRW153(配列番号57)のベクターとして用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、EcoRV部位からのH6プロモーターの3’部分を表し、H4cDNAのATGをプロモーターのATGと並列させている。
これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、BanIIおよびHindIIIで切断し、上記のHindIII−BanII欠失pRW828ベクター中に挿入した。その結果生成されたプラスミドpRW844をEcoRVおよびDraIで切断し、3’H6プロモートされたH4コード配列を含む1.7kbp断片を、pRW846(以前に記述)のEcoRVおよびHincII部位に挿入し、pRW848とした。プラスミドpRW848は、それ故、ワクシニアウイルスH6プロモーターに連結したH4コード領域を、ニワトリポックスウイルスF8座ORF欠失領域中に有している。
F8座へのH5血球凝集素挿入プラスミドの構築 A/Turkey/Ireland/1378/83から派生したトリインフルエンザH5をコードしているcDNAは、プラスミドpTH29中に、Dr.R.Websterより入手した。合成ヌクレオチドRW10(配列番号58)からRW13(配列番号61)までは、以前に記述されたワクシニアウイルスH6プロモーターの翻訳開始コドンをH5遺伝子のATGとオーバーラップさせるために設計された。配列は、H5遺伝子の5’SalI部位を通して連続しており、H5停止コドンを含む3’H5DraI部位で再び開始する。
オリゴヌクレオチドを、95℃で3分間、続いてゆっくりと室温で冷却しアニーリングさせた。これは以下の、示された末端での二本鎖構造という結果となる。
pRW742のEcoRVとPstI部位との間へのオリゴヌクレオチドのクローン化によりpRW744を生成した。pRW731.15のHincII部位に挿入されたワクシニアウイルスH6プロモーターに連結した非関連遺伝子を有するプラスミドpRW742Bは以前に記述された。PstIおよびEcoRVによる消化で、非関連遺伝子およびH6プロモーターの3’末端を除去した。今、プラスミドpRW744はトリインフルエンザH5のATGとオーバーラップしたH6プロモーターの3’部分を有している。このプラスミドはまた、5’SalI部位を通ったH5配列およびH5停止コドン(DraI部位を含む)からの3’配列を含む。DraI部位の利用によりH5 3’非コード末端を除去する。オリゴヌクレオチドは、初期ワクシニアウイルスRNAポリメラーゼにより認識される転写終結シグナル(Yuen et al.,1987)を付与する。H6プロモートされたH5の構築を完成させるため、H5コード領域を1.6kbpのSalI−DraI断片としてpTH29から単離した。プラスミドpRW744をDraIで部分切断し、線状断片を単離し、SalIで再び消化した、SalIとDraIとの間の8ベースを欠失させたプラスミドを、1.6kbpのpTH29SalI−DraI断片のベクターとして用いた。その結果生成されたプラスミドpRW759をEcoRVおよびDraIで切断した。3’H6プロモーターおよびH5遺伝子を含む1.7kbpのpRW759EcoRV−DraI断片を、pRW846(以前に記述)のEcoRV−HincII部位に挿入した。その結果生成されたプラスミドpRW849は、ORF欠失F8座内にH6プロモートされたトリインフルエンザウイルスH5遺伝子を含んでいた。
F7座へのH7血球凝集素挿入ベクターの構築 A/CK/VIC/1/85由来のH7血球凝集素を含むプラスミドpCVH71は、Dr.R.Websterより入手した。H7遺伝子を含むEcoRI−BamHI断片をE.coliDNAポリメラーゼクレノー断片により平滑末端化し、pIBI25のHincII部位に挿入し、pRW827とした。合成オリゴヌクレオチドRW165(配列番号62)およびRW166(配列番号63)とをアニーリングさせ、HincIIおよびStyIで消化し、pRW827のEcoRVおよびStyI、部位に挿入し、pRW845とした。
オリゴヌクレオチドRW165(配列番号62)およびRW166(配列番号63)はH6プロモーターの3’部分をH7遺伝子に連結している。H7遺伝子の3’非コード末端は、pRW845のApaLI消化の線状産物を単離し、EcoRIで再び切断し、最も大きな断片を単離し、合成ヌクレオチドRW227(配列番号64)およびRW228(配列番号65)とアニーリングさせることにより除去した。その結果生成されたプラスミドはpRW854である。
pRW854のH7の停止コドンにはHpaI部位が続いている。ORF欠失されたF7座中のH6プロモートされたH7構築物中間体を、pRW854のEcoRI−HpaI断片を、EcoRVで切断し、PstI部位を平滑化させたpRW858中に移動させることにより生成した。プラスミドpRW858(以下に記述)は、H6プロモーターをF7ORF欠失中に含む挿入プラスミドである。
プラスミドpRW858は、非関連遺伝子に連結したH6プロモーターを有する850bpのSmaI/HpaI断片を、以前に記述されたpFDOのSmaI部位に挿入することによって構築された。この非関連配列は、pRW858のEcoRV(H6プロモーターの3’末端の24bp上流の部位)およびPstIでの消化により取り除いた。3.5kbpのその結果生じた断片を単離しE.coliDNAポリメラーゼクレノー断片を用いて2mMのdNTP存在下で平滑末端化した。この平滑化された断片を、pRW854(以前に記述)から派出した1700bpのEcoRV/HpaI断片に連結された。このEcoRV/HpaI断片は、VV H6プロモーターの3’部分の24bpの3’側に並列された完全AIV HA(H7)遺伝子を有している。その結果生成されたプラスミドはpRW861と命名された。
126bpEHアーム(以前に定義)は、pRW861中で、TROVAC DNAとの組換え頻度を高めるために伸長された。これを実行するため、575bpのAccI/SnaBI断片をpRW731.13(以前に定義)から派生させた。この断片を単離し、pRW861のAccI部位とNaeI部位との間に挿入した。その結果生成されたプラスミドは、AIV H7遺伝子に隣接している725bpのEHアームおよび404bpのHBアームを有し、pRW869と命名された。プラスミドpRW869は、それ故、5’末端でワクシニアウイルスH6プロモーターに連結されたH7コード配列を有している。左隣接アームは404bpのTROVAC配列からなり右隣接アームは欠失ORFF7座への挿入を目的とした725bpのTROVAC配列からなる。
TROVAC−トリインフルエンザウイルス組換体の開発 トリインフルエンザウイルスHAコード配列を有する挿入プラスミドを、個別に、TROVACを感染させた初代CEF細胞に、以前に記述された(Panicali et al.,1982;Piccini et al.,1987)リン酸カルシウム沈殿法により形質導入した。HA特異的放射性標識プローブとのハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な集団が達成させるまで連続したプラーク精製過程にかけた。1つの代表プラークが続いて増幅されてストックウイルスとされた。プラスミドpRW849は、生体外組換えテストにおいて用いられ、その結果、H5血球凝集素を発現するALVAC−AIH5(vFP89)を生成した。プラスミドpRW848が用いられ、その結果、H4血球凝集素を発現するALVAC−AIH4(vFP92)を生成した。プラスミドpRW869が用いられ、その結果、H7血球凝集素を発現するALVAC−AIH7(vFP100)を生成した。
免疫蛍光 インフルエンザウイルスに感染した細胞においては、HA分子は合成され、プレカーサー分子として粗面小胞体においてグリコシル化される。原形質膜への輸送の間に、最終的にジスルフィド結合したHA1およびHA2サブユニットとなるようなタンパク質切断である翻訳後の拡張的修飾、および成熟ウイルスエンベローブへ取り込まれる場所である宿主細胞膜への挿入を受ける。TROVAC−AIH組換体に感染させた細胞中でHA分子が細胞表面で発現されているかどうかを決定するため、免疫蛍光を行った。直接的でない免疫蛍光は以前に記述されたように(Taylor et al.,1990)行った。TROVAC−AIH4ではH4血球凝集素が、TROVAC−AIH5ではH5血球凝集素が、TROVAC−AIH7ではH7血球凝集素が表面で発現していることが、表面蛍光により確認された。H5血球凝集素の発現は、H5HA特異的モノクローナル抗体のプールを用いて検出された。H4HAの発現はヤギ単独特異的抗H4血清を用いて分析した。H7HAの発現はH7特異的モノクローナル抗体調製物を用いて分析した。
免疫沈降 ウイルス粒子が感染可能であるためには、血球凝集素のポリペプチドの切断が必要であるため、血球凝集素分子の切断部位およびそのの周辺の配列は、ウイルス毒性の決定において重要な役割を果たすことが同定されている。毒性H5およびH7ウイルスは、HA1にカルボキシ末端において1以上の塩基性アミノ酸を有している。これにより、一連の塩基性アミノ酸を認識する細胞内プロテアーゼが血球凝集素を切断することを可能にし、感染可能なウイルスが生体外でも生体内でも拡散することを可能にしていると考えられている。無毒性株のH4血球凝集素分子は組織培養中では、外因性トリプシンが添加されないかぎり切断されない。
TROVAC組換体によって発現された血球凝集素分子が実際にプロセシングされているか否かを決定するため、免疫沈降実験を記述されたように(Taylor et al.,1990)、上記の特異的試薬を用いて行った。
TROVAC−AIH5(vFP89)によって発現されたH5血球凝集素の免疫沈降分析により、糖タンパク質は、それぞれ約44および23kDaの分子量の切断産物HA1およびHA2として明瞭であることを示した。感染させていない細胞もしくは親TROVACウイルスに感染させた細胞においては、このようなタンパク質は沈殿されなかった。同様に、TROVAC−AIH5(vFP100)によって発現されたH5血球凝集素の免疫沈降分析により、切断産物HA2特異的沈殿を示した。HA1切断産物は認識されなかった。感染させていないCEF細胞もしくは親TROVACウイルスに感染させたCEF細胞においては、このようなタンパク質は沈殿されなかった。これと対照的に、TROVAC−AIH4(vFP92)によって発現されたH4血球凝集素の免疫沈降分析においては、プレカーサータンパク質HA0のみの発現を示した。無毒性亜型の血球凝集素の、組織培養中での発現の欠如と一致している。感染させていないもしくは親TROVACウイルスに感染させたCEF細胞においては、H4特異的タンパク質は検出されなかった。組換えによる組換えウイルスの開発、ニトロセルロース膜フィルターによるin situハイブリダイゼーション、およびベータガラクトシダーゼ活性によるスクリーニングは以前に記述された通りである(Panicali et al.,1982;Perkus et al.,1989)。
実施例14−HIV1gag(+プロ)(IIIB)、gp120(MN)(+トランスメンブレン)エピトープを発現するALVAC組換え体の構築
HIV1(IIIB)cDNA配列(Ratner他、1985)を含有するプラスミドpHXB2DをRobert Gallo氏(米国NIH、NCI)から入手した。gag遺伝子の5′末端をコードする配列をワクシニアウイルスtk隣接アームの間にクローニングした。これを行うために、pHXB2Dの1,625bpのBglII断片(gag遺伝子の5′末端を含有する)をpSD542VCVQの4,075bpのBglII断片内にクローニングした。この操作によって得られたプラスミドをpHIVG2と呼ぶ。
次いで、gag遺伝子の3′末端をpGIVG2にクローニングした。これを行うために、280bpのApaI−BamHI PCR断片(gag遺伝子の3′末端を含有する)を、pHIVG2の5,620bpのApaI−BamH断片内にクローニングした。(該PCR断片は、オリゴヌクレオチドプライマーHIVP5(配列番号69)
およびHIVP6(配列番号70)
を用いてプラスミドpHXB2Dから調製した。)この操作によって得られたプラスミドをpHIVG3と呼ぶ。
次いで、gag遺伝子の上流にI3Lプロモーターをクローニングした。これを行うために、ワクシニアウイルスのI3Lプロモーターおよびgag遺伝子の5′末端をコードするオリゴヌクレオチドHIVL17(配列番号71)
およびHIVL18(配列番号72)
を、pGIVG3の5,540bpの部分的BalII−ClaI断片内にクローニングした。この操作によって得られたプラスミドをpHIVG4と呼ぶ。
次に、gag遺伝子のうち、p24、p2、p7およびp6をコードする部分を除去した。これを行うためにオリゴヌクレオチドHIVL19(配列番号73)
およびHIVL20(配列番号74)
を、pHIVG4の4,450bpの部分的PvuII−BamHI断片内にクローニングした。この操作によって得られたプラスミドをpHIVG5と呼ぶ。
次いで、gag遺伝子の残り、ならびにpol遺伝子をp17「遺伝子」の下流にクローニングした。これを行うために、pHXB2Dの4,955bpのClaI−SalI断片(gag遺伝子の大部分、およびpol遺伝子の全部を含有する)を、pHIVG5の4,150bpのClaI−SalI断片内にクローニングした。この操作によって得られたプラスミドをpHIVG6と呼ぶ。
次いで、非関連3′−非コード配列を除去した。これを行うために、360bpのAflII−BamHI PCR断片(pol遺伝子の3′末端を含有する)を、pHIVG6の8,030bpのAflII−BamHI断片内にクローニングした。(該PCR断片は、オリゴヌクレオチドプライマーHIVP7(配列番号75)
およびHIVP8(配列番号76)
を用いてプラスミドpHXB2Dから調製されたものである。)このようにして得られたプラスミドをpHIVG7と呼ぶ。
次いで、I3Lをプロモーターとするgag遺伝子およびpol遺伝子を、カナリアポックスC3の隣接アームの間にクローニングした。これを行うために、pHIVG7の4,360bpの部分的BglII−BamHI断片(I3Lをプロモーターとするgag遺伝子およびpol遺伝子を含有する)を、pVQH6CP3LのBamHI部位にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをpHIVGE14と呼ぶ。
次に、H6をプロモーターとするHIV1gp120(MN)(+トランスメンブブレン)「遺伝子」(Gurgo他、1988)をpHIVGE14内にクローニングした。これを行うために、pC5HIVMN120Tの1,700bpのNruI−SmaI断片(gp120(+トランスメンブレン)「遺伝子」を含有する)を、pHIVGE14の11,400bpのNruI−SmaI断片内にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをpHIVGE14Tと呼ぶ。
次いで、pol遺伝子の大部分を除去した。これを実施するために、540bpのApaI−BamHI PCR断片(HIV1プロテアーゼ「遺伝子」を含有するの3’末端)を、pHIVGE14Tの10,000bpのApaI−BamHI断片にクローニングした。(なお、このPCR断片は、オリゴヌクレオチドプライマーHIVP5およびHIVP37(配列番号77)
を用いてプラスミドpHIVG7から調製されたものである。この操作により、pol遺伝子の大部分が除去されるが、そのプロテアーゼ「遺伝子」はインタクトのままで残っている。この操作により得られたプラスミドをpHIV32という。pHIV32(配列番号78)のDNA配列は図14A〜14Cに示されており、この図は、pHIV32に含まれH6をプロモーターとするHIV1gp120(+トランスメンブレン)遺伝子およびI13LをプロモーターとするHIV1gag(+プロ)遺伝子のヌクレオチド配列を示す。gag(+プロ)およびgp120(+トランスメンブレン)
ALVAC C3隣接アームのDNA配列(配列番号79)は、図15A〜Fに示されている。この図15A〜15Fは、pVQH6CP3LにおけるC3遺伝子座のヌクレオチド配列を示している。
C3遺伝子座、pVQH6CP3L中
pHIV32を用いてALVACをレスキューウイルスとするインビトロ組換えを行いvCP205を得た。
実施例15−HIV1のgag(+プロ)(IIIB)、gp120(MN)(+トランスメンブレン)および2つのnef(BRU)エピトープを発現するALVAC組換体の構築
次に、2つのnef CTLエピトープ、CTL1(アミノ酸66〜147)およびCTL2(アミノ酸182〜206)(Wain-Hobson他、1985;NixonおよびMcMichael、1991)をコードする発現カセットをvCP205に挿入した。nef CTLエピトープを含有する挿入プラスミドp2−60−HIV.3の構築は次のように行った。I13LをプロモーターとするCTLエピトープをpBSH6にクローニングした。これを実施するため、255bpのHindIII−XhoI PCR断片(I3LをプロモーターとするCTL2エピトープを含有する)を、pBSH6の3,100bpのHindIII−XhoI断片にクローニングした。(この255bpのPCRは次にように調製した。すなわち、オリゴヌクレオチドフライマーVQPCRI3(配列番号80)
およびI3PCRCTL(配列番号81)
を用いてプラスミドpMPI3Hから、I3LプロモーターおよびCTL2エピトープの5′末端を有する216bpのPCR断片を調製した。次に、この216bpのPCR断片を鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーVQPCRI3およびCTLPCR(配列番号82)
を用いて第2のPCR反応を行い、I3LをプロモーターとするCTL2エピトープを含有するPCR断片を調製し、これをHindIIIXhoIで酵素分解して、pBSH6にクローニングした。)この操作により得られたプラスミドをp2−60−HIV.1と呼ぶ。
次いで、このp2−60−HIV.1に、H6をプロモーターとするCTL1エピトープをクローニングした。これを行うために、290bpNruI−EcoRI断片(H6をプロモーターとするCTLエピトープを含有)を、p2−60−HIV.1の3,300bpのNruI−EcoRI断片にクローニングした。(なお、290bpのNruI−EcoRI断片の調製は、次のように行った。オリゴヌクレオチドH6PCR1(配列番号83)
およびNCCPCR1(配列番号84)
を用いて、プラスミドpH6T2から、H6プロモーターおよびCTL1エピトープの5′末端を含有する195bpのPCR断片を得た。次に、この195bpのPCR断片およびオリゴヌクレオチドNCC174A(配列番号85)
およびNCC17B(配列番号86)
を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーH6PCRおよびNCCPCR2(配列番号87)
を用いて第2のPCR反応を行った。得られた317bpのPCR断片(H6プロモーターおよび大部分のCTL1エピトープを含有する)ならびにオリゴヌクレオチドNCC291A(配列番号88)
およびNCC291B(配列番号89)
を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーH6PCR1およびNCCPCR3(配列番号90)
を用いて第3のPCR反応を行い、H6をプロモーターとするCTL1エピトープを含有するPCR断片を得て、これをNruIおよびEcoRIで酵素分解し、p2−6−HIV.1にクローニングした。)この操作により得られたプラスミドをp2−60−HIV.2と呼ぶ。
次に、I3LをプロモーターとするCTL2およびH6をプロモーターとするエピトープをカナリアポックスC6隣接アーム間にクローニングした。これを行うために、p2−60−HIV.2の640bpのXhoI断片(2つのnef CTLエピトープを含有する)をpC6LのXhoI部位にクローニングした。この操作で得られたプラスミドをp2−60−HIV.3と呼ぶ。p2−60−HIV.3のDNA配列(配列番号91)は図16に示されている。この図16は、p2−60−HIV.3に含有されているI3Lをプロモーターとするnef CTL2エピトープおよびH6をプロモーターとするnefCTL1エピトープのヌクレオチド配列を示す。
ALVAC C6隣接アームのDNA配列(配列番号92)は、図17A〜Cに示されている。この図17A〜17Cは、pC6LにおけるC6遺伝子座のヌクレオチド配列を示す。
p2−60HIV.3を用いてvCP205をレスキューウイルスとするインビトロ組換えを行いvCP264を得た。
実施例16−HIV1のgag(+プロ)(IIIB)、gp120(MN)(+トランスメンブレン)および2つのnef(BRU)および3つのpol(IIIB)CTLエピトープを含有する領域を発現するALVAC組換体の構築
次に、このvCP264に、3つのpolCTLエピトープ、pol1(アミノ酸172〜219)、pol2(アミノ酸325〜383)およびpol3(アミノ酸461〜519)(Ratner他、1985;NixonおよびMcMichael、1991)をコードする発現カセットを挿入した。3つのpolCTLエピトープを含有する挿入プラスミドpC5POLT5Aの調製は、948bpのXhoI−BamHI断片(H6をプロモーターとするpol1エピトープ、I3Lをプロモーターとするpol2,42Kをプロモーターとするpol3を含有)を、pBSK+の2,940bpのXhoI−BamHI断片にクローニングすることにより行った。(なお、948bpのXhoI−BamHI断片は次のように調製した。プラスミドpHXB2Dから、オリゴヌクレオチドプライマーPlA(配列番号93)
およびP1B(配列番号94)
を用いて、183bpのPCR断片(pol1エピトープを含有)を調製した。プラスミドpHXB2Dから、オリゴヌクレオチドプライマーP2A(配列番号95)
およびP2B(配列番号96)
を用いて、224bpのPCR断片(pol2エピトープを含有)を調製した。プラスミドpHXB2Dから、オリゴヌクレオチドプライマーP3A(配列番号97)
およびP3B(配列番号98)
を用いて、236bpのPCR断片(pol3エピトープを含有)を調製した。プラスミドp2−60−HIV.2からオリゴヌクレオチドプライマーP2IVH(配列番号99)
およびIVHP1(配列番号100)
を用いて、340bpのPCR断片(I13LプロモーターとH6プロモーターを頭部対頭部の関係で含有)を調製した。プラスミドpVQ42KTh4.1から、オリゴヌクレオチドプライマーEPS42K(配列番号101)
および42KP3B(配列番号102)
を用いて、168bpのPCR断片(42Kプロモーターを含有)を調製した。224bpのPCR断片(pol2エピトープを含有)、および340bpのPCR断片(I3LプロモーターおよびH6プロモーターを含有)を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーP2BおよびIVHP1を用いてPCR反応を行い、H6プロモーターおよびI3Lをプロモーターとするpol2エピトープを含有する511bpのPCR断片を調製した。168bpのPCR断片(42Kプロモーターを含有)および236bpのPCR断片(pol3エピトープを含有)を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーIPS42KおよびP3Bを用いて、PCR反応を行い、42Kをプロモーターとするpol3エピトープを含有する347bpのPCR断片を調製した。183bpのPCR断片(pol1エピトープを含有)および347bpのPCR断片(42Kをプロモーターとするpol3エピトープを含有)を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーPIAおよびP3Bを用いてPCR反応を行い、pol1エピトープおよび42Kをプロモーターとするpol3エピトープを含有する506bpのPCR断片を調製した。511bpのPCR断片(H6プロモーターおよびI3Lをプロモーターとするpol2エピトープを含有)および506bpのPCR断片(pol1エピトープおよび42Kをプロモーターとするpol3を含有)を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーP2BおよびP3Bを用いてPCR反応を行い、H6をプロモーターとするpol1エピトープ、I3Lをプロモーターとするpol2および42Kをプロモーターとするpol3エピトープを含有する977bpのPCR断片を調製した。次いで、この977bpのPCR断片をXhoIとBamHIで酵素分解し、pBSK+の2,940bpのXhoI−BamHI断片にクローニングした。)この操作により得られたプラスミドをpBSPOLT5と称する。
このpBSPOLT5のヌクレオチド配列分析を行ったところpol2エピトープに誤りがあることが示された。この誤りを訂正するために、H6をプロモーターとするpol1エピトープ、I3Lをプロモーターとするpol2エピトープおよび42Kをプロモーターとするpol3エピトープを含有する948bpのXhoI−BamHI断片を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーI3PCR1(配列番号103)
およびFIXPOL2(配列番号104)
を用いてPCR反応を行った。得られたPCR断片(I3Lをプロモーターとする訂正pol2エピトープを含有)をHindIIIとXhoIで酵素分解し、pBSPOLT5の3,650bpのHindIII−XhoI断片にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをpBSPOLT5Aと呼ぶ。
次に、H6をプロモーターとするpol1エピトープ、I3Lをプロモーターとするpol2エピトープおよび42Kをプロモーターとするpol3エピトープをカナリアポックスC5隣接アーム間にクローニングした。これを行うために、H6をプロモーターとするpol1エピトープ、I3Lをプロモーターとするpol2エピトープおよび42Kをプロモーターとするpol3エピトープを含有するpBSPOLT5Aの897bpのBamHI−XhoI断片内にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをpC5POLT5Aと呼ぶ。pC5POLT5AのDNA配列(配列番号105)のDNA配列は、図18A〜Bに示されている。この図18A〜図18Bは、pC5POLT5A内のI3Lをプロモーターとするpol2エピトープ、H6をプロモーターとするpol1エピトープおよび42Kをプロモーターとするpol3のヌクレオチド配列を示すものである。
ALVAC C5隣接アームのDNA配列(配列番号106)は図19A〜Cに示されている。この図19A〜19CはpNC5L−SP5におけるC5遺伝子座のヌクレオチド配列を示すものである。
pC5POLT5Aを用いてvCP264をレスキューウイルスとするインビトロ組換えを行いvCP300を得た。
実施例17−制限酵素分析および免疫沈降分析
vCP300内でHIV1配列が正しい遺伝子座に存在していることを確認するために、制限酵素分析を行った。ALVAC、vCP205、vCP264およびvCP300のDNAをHindIII、PstIまたはXhoIで分解し、得られた断片をアガロースゲル上で分画化した。得られた断片の大きさを比較したところ、予期されたように、gag(+プロ)遺伝子およびgp120(+トランスメンブレン)遺伝子はC3遺伝子座に挿入され、nefエピトープはC6遺伝子座に挿入され、また、polエピトープはC5遺伝子座に挿入されていたことが確認された。
vCP300が真正のHIV1gagおよびgp120(+トランスメンブレン)遺伝子産物を発現しているか否かを確認するため免疫沈降分析を行った。HeLa細胞の単層を、10pfu/細胞のm.o.i.でALVACまたはvCP300で疑似感染または感染させた。1時間の吸着期間の後、接種物を吸引して取り出し、細胞の上に2%のウシ胎児血清および[35S]−メチオニン(20μCi/ml)を含有する改変イーグル液(メチオニン無し)2mlをかぶせた。感染後18時間経過した、1mlの3×バッファーA(3%NP−40、30mMのトリス(pH7.4)、3mMのEDTA、0.03%のアジ化ナトリウムおよび0.6mg/mlのPMSF)および50μlのアプロチニンを添加した後、細胞の単層をかきとることにより、細胞を回収した。感染細胞由来の破砕物を分析して、HIV1に血清反応陽性個体由来の血清を用いHIV1gagおよびgp120(+トランスメンブレン)遺伝子の発現をHIV1血清陽性者由来の血清(ニューヨーク州保健部より入手)を用いて調べた。4℃で一晩保存して該血清を保存してプロテインA−セファロースに結合させた。この定温保存後、材料をバッファーAで4回洗浄した。平常なヒト血清およびプロテインA−セファローズで予め調べられた破砕物を、次に、プロテインA−セファロースに結合されたHIV1に血清反応陽性のヒト血清とともに4℃において一晩培養した。一晩の培養の後、サンプルをバッファーAで4回およびLiCL2/尿素バッファーで2回洗浄した。2×Laemmliバッファー(125mMのトリス(pH6.8)、4%SDS、20%グリセロール、10%の2−メルカプトエタノール)を添加し、5分間沸騰させることにより、免疫複合体から沈着タンパク質を解離させた。このタンパク質を10%のDreyfussゲル(Dreyfuss他、1984)上で分画化し、固定化し、且つ、1Mのサリチル酸ナトリウムで処理して間接撮影に供した。この分析により、HIV1gagおよびgp120(+トランスメンブレン)遺伝子産物はvCP300で感染された細胞からは沈降したが、疑似感染細胞またはALVAC感染細胞からは沈降されないことが示された。
vCP300で感染された細胞内でのnefおよびpolエピトープの発現は確認されていないが、これは、該エピトープに特異的な血清試薬が未だ入手できないためである。しかしながら、ヌクレオチド配列分析により、vCP300にクローニングされたnefおよびpolは正しいものであることが確認された。nefおよびpolの発現カセットを含有するPCR断片をvCP300DNAから調製した。これらの断片のヌクレオチド配列の分析により、nefおよびpolの配列が正しいことが示された。
vCP205は、vCP300の場合と同様に細胞表面に結合した形態のHIV1gp120を発現させる。vCP205により発現されたようなこの遺伝子産物の免疫原性を実験用小動物で分析した。
実施例18−免疫原性の検討
2匹のウサギまたはモルモットから成る各グループに、108pfuのALVAC、VCP205、または0.1mgのペプチドCLTB−36(GPKEPFRDYVDRFYKNKRKRIHIGPGRAFYTTKN)(配列番号107)(0.05mgのQS−21をアジュバントとする)を次の表(表21)に示すスケジュールに従って筋肉内接種した。
各ウサギおよびモルモットは、最初の接種の前、また、最初の接種後は2週間毎に14週間にわたり採血した。各血液サンプルから血清を調製し、使用するまで−70℃で保存した。各血清について、動力学的酵素結合免疫吸着アッセイ(KELISA)により、組換えHIV MN/BRUハイブリッドgp160または25−merの合成HIV MNgp120 V3ループ(米国マサチューセッツ州CambridgeのAmerican Bio-technologies社製、製品番号686010)に対する抗体応答を調べた。
vCP205で免疫されたウサギ(グループ2)が最も高いレベルの抗gp160抗体を産生した(図20参照)。ウサギは表21のスケジュールに従って免疫され(図20の矢印)、2週間おきに採血された。各血清を稀釈バッファーで100倍に稀釈し、動力学的ELISA法を用いて精製組換えHIV MN/BRU gp160に対する反応性を調べた。このグループの2匹のウサギはいずれも、単一の接種後にgp160に反応性の抗体を産生し始めた。後の接種により追加しても抗体レベルの上昇は僅かであった。vCP205を2回接種し、その後、QS−21アジュバント中のペプチドCLTB−36で追加免疫したウサギ(グループ3)は、コントロール用ウサギ(グループ1)と比較すると抗gP160抗体を産生していないようであった。QS−21に溶かしたペプチドCLTB−36で3回免疫したウサギのうち、1匹だけが、gp160に特異的な抗体を産生して応答した。その応答のあったウサギ(A353)は、第3回目の免疫後になってようやくgp160抗体を産生し始めた。
ペプチドCLTB−36のみを免疫したウサギは、該ペプチドはエンベロープ(膜)糖タンパク質(V3ループ)の一部のみしか含んでいないので、広範に反応性のあるgp160特異的抗体を産生するとは期待されなかった。したがって、血清を試験して、HIV MN V3ループの25ヶのアミノ酸を含有するペプチドに対する反応性を検討した(図21)。表21のスケジュールに従ってウサギを免疫し(図22の矢印)、2週間毎に採血した。各血清を稀釈バッファーで100倍に稀釈して、HIV MN gp120 V3ループを表す25−merから成る合成ペプチド(CNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGTIC:(配列番号108)米国マサチューセッツ州CambridgeのAmerican Bio-technologies社製、製品番号686010)に対する反応性を動力学的ELISA法を用いて試験した。前と同様に、vCP205を3回接種したウサギの血清中に最も高いV3抗体応答が見出された。vCP205を2回接種した後、QS−21に溶かしたペプチドCLTB−36を接種すると抗V3抗体の応答はあったが、グループ2のように高くはなかった。ここでも前と同様に、QS−21に溶かしたペプチドCLTB−36を3回接種したうち1匹のウサギだけが応答を示した。
全てのグループのモルモット(グループ1の1匹を含む)HIVgP160に反応する抗体を産生した(図22)。表21のスケジュールに従いモルモットを免疫し(図22の矢印)、2週間の間隔をおいて採血した。各血清を稀釈緩衝液で200倍に稀釈し、動力学的ELISA法を用いて精製された組換えHIV MN/BRUgp160に対する反応性を試験した。グループ1においては1匹のみが、QS−21アジュバンド中のペプチドCLTB−36を接種した後で応答を示した。グループ2、3および4における全てのモルモットの血清中の抗体レベルは同程度であった。殆どのモルモットは単一回の接種後にgp160抗体を産生することにより応答した。
KELISA抗原としてHIV MN V3 25−merペプチドを用いた場合にも同様の結果が認められた(図23)。表21のスケジュールに従いモルモットを免疫し(図23の矢印)、2週間毎に採血した。各血清を稀釈バッファーで200倍に稀釈し、HIV MN gp120 V3ループを表す25−merから成る合成ペプチド(CNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGTIC(配列番号109)米国マサチューセッツ州CambridgeのAmerican Bio-Technologies社製、製品番号686010)に対する反応性を動力学的ELISA法を用いて試験した。QS−21中のペプチドCLTB−36を単一回接種するとV3抗体応答が誘起され、第2回および第3回目の接種により追加免疫効果が認められた。V3抗体応答を誘起するにはvCP205の2回接種が必要であったが、vCP205またはQS−21中のCLTB−32を3回目に接種すると追加免疫効果があり、さらに高レベルとなった。
vCP300により発現されたNefおよびpol CTLエピトープの発現性および免疫原性を明らかにするため以下のインビトロアッセイを行った。HIVに血清反応陽性の個体から新鮮なPBMCを入手した。これらの細胞の20%に10m.o.iでvCP300を接種した。接種から2時間後、細胞を洗浄し、自己由来の非接種PBMCと、非接種/接種の比率を10:1として混合した。(接種密度は1.5×106細胞/mlとした。)0日目に、外来源としてIL−7を最終濃度が1000U/mlとなるように添加した。3日目に、外来源として、IL−7およびIL−2を、最終濃度がそれぞれ1000U/mlおよび220U/mlとなるように添加した。培養から12日経過後、ターゲットとしてHIV−1タンパク質を発現するワクシニアウイルス(WR)組換体を感染させた自己由来のエピスタイン−バーウイルス形質転換B細胞を標的として用いる標準的な51Cr遊離アッセイに、上記のインビトロ刺激された細胞群を用いた。エフェクター/ターゲット(E/T)細胞比を20:1とした場合のアッセイの結果を図24および図25に示し、特異的溶解のパーセントとして表している。これらの結果を総合すると、vCP300を感染させたPBMCが、HIV−1、Env−、Gag−、Pol−、およびNef−特異的細胞溶解活性を刺激することが明らかである。さらに、抗CD8モノクローナル抗体により細胞溶解活性が排除されることにより、細胞溶解活性を媒介する細胞の特性は古典的なCD8+CTLであることが明らかである。
以上のことをまとめると、HIV ALVAC組換体カナリアポックスウイルスであるvCP205を接種されたウサギおよびモルモットは、HIVのエンベロープ糖タンパク質、HIV中和に関連するHIVエンベロープ糖タンパク質の1領域(gp120 V3領域)に対する抗体を誘起した。また、vCP300により発現されたEnv、Gag、PolおよびNefをコードする発現産物の発現性と免疫原性は、血清反応陽性の個体由来のCD8+CTLのインビトロ刺激により明らかにされる。かくして、vCP205およびvCP300、ならびに、これらの組換体の前駆体、発現産物およびこれらの組換体由来のDNAは、上記のようにきわめて有用である。
実施例19−vCP1307(gp120 V3ループに挿入された2つのELDKWAエピトープを含むHIV1 gp120+TMを発現するALVAC組換体)の構築
gp120 V3ループ領域に挿入されたHIV1のgp41由来の2つのELDKWAエピトープとともにHIV1 gp120+TMを発現するALVAC組換体であるvCP1307を以下のように作成した。ELDKWA要素およびV3ループの一部をコードする配列をpBSK+(米国カリフォルニア州La JollaのStratagene社製)にクローニングした。これを行うために、EcoRI−SacIで酵素分解した225bpのPCR断片(ELDKWA−V3ループ配列の一部を含有)を、pBSK+の2,900bpのEcoRI−SacI断片にクローニングした。(なお、該PCR断片は、プラスミドpBSHIVMN120Tから、プライマーHIVP72(配列番号110)
およびHIVP74(配列番号111)
から調製した。)この操作により得られたプラスミドをpHIV55と呼ぶ。
また、H6をプロモーターとするHIV1 gp120+TM遺伝子を含有するプラスミドであるpBSHIVMN120Tは、次のように調製されたものである。HIV(MN)env遺伝子のcDNAコピーを含有するプラスミドPMN1.8−9をMarvin Reitz氏(米国NCI、NIH)から入手した。env遺伝子の初期転写終結シグナルT5NTを改変させた。これを行うために、KpnI−EcoRI消化された1,100bpのPcR断片(env遺伝子のT5NT改変5′末端を含有する)を、pBSK+の2,900bpのKpnI−EcoRI断片中にクローニングした。(なお、該PCR断片は、オリゴヌクレオチドHIVMN6(配列番号112)
およびHIV3B2(配列番号113)
を用いて、プラスミドpMN1.8−9から調製した。この操作により得られたプラスミドpBSMIDMNと呼ぶ。
次に、env遺伝子のT5NT改変5′末端をenv遺伝子の残りenv遺伝子の上流にクローニングした。これを行うため、pBSMIDMNの1,025bpのKpnI−EcoRI断片(env遺伝子のT5NT改変5′末端を含有)を、pBS3MNの4,300bpのKpnI−EcoRI断片にクローニングした。(pBS3MNは、EcoRI−SacI酵素分解した430bpのPCR断片(env遺伝子の中央部分を含有)およびSacI−XbaI酵素分解した1,050bpのPCR断片(env遺伝子の3′末端を含有)を、pBSK+の2,900bpのEcoRI−XbaI断片中にクローニングすることにより調製した。ここで、430bpのPCR断片は、プラスミドpMN1.8−9から、オリゴヌクレオチドHIV3B1(配列番号114)
およびHIVMN4(配列番号115)
を用いて調製した。また、1,050bpのPCR断片は、プラスミドpMN1.8−9から、オリヌクレオチドHIVMN5(配列番号116)
およびHIVMN3P(配列番号117)
を用いて調製した。このような操作により得られたプラスミドをpBSMID3MNと呼ぶ。
次に、env遺伝子の上流にH6プロモーター(Perkus他、1989)をクローニングした。これを行うために、pH6IIIBEの320bpのKpnI断片(HIV1(IIIB)env遺伝子の5′末端に結合されたH6プロモーターを含有)およびpBSMID3MNの2,450bpのKpnI−XbaI断片(HIV(MN)env遺伝子の本体を含有)を、pBSK+の2,900bpのKpnI−Xbal断片中にクローニングした。このような操作により得られたプラスミドをpH6HMNEと呼ぶ。
次に、gp41をコードする配列を、HIV1のenvトランスメンブレン(TM)領域をコードする配列と置き換えた。これを実施するため、EcoRI−XbaIで酵素分解した480bpのPCR断片(gp120遺伝子の3′末端およびHIV1のenvトランスメンブレン領域を含有)を、pG6HMNEの4,200bpのEcoRI−XbaI断片にクローニングした。(なお、このPCR断片は、PCR断片(PCR−MN11)ならびにオリゴヌクレオチドHIVTM1(配列番号118)
およびHIVTM2(配列番号119)
から、オリゴヌクレオチドHIV3B1(配列番号114)およびHIVTM3(配列番号120)
を用いて調製した。PCR−MN11は、プラスミドpH6HMNEから、オリゴヌクレオチドHIV3B1(配列番号114)およびHIVMN18(配列番号121)
から調製した。)この操作により得られたプラスミドをpBSHIVMN120Tと呼ぶ。
ELDKWAエピトープおよびV3ループをコードしている配列の別の部分を、続いてpBSKt中にクローン化した。これは、ELDKWA−V3ループ配列の一部を含む300bpのHindIII−SacI消化したPCR断片を、2900bpのHindIII−SacI消化したpBSKt断片中にクローン化することにより行った。(このPCR断片は、プラスミドpBSHIVMN120Tを、プライマーHIVP69(配列番号122;)およびHIVP75(配列番号123)とともに用いて作成した。)
この操作により作成されたプラスミドをpHIV56と称した。
次に、pHIV55およびpHIV56からのELDKWA−V3ループ配列を、H6をプロモーターとするgP120+TM遺伝子にクローニングした。これを行うため、pHIV55の225bpのEcoRI−SacI断片およびpHIV56の300bpのHindIII−SacI断片(ELDKWA−V3ループを含有)を、pBSHIVMN120Tの4,300bpのEcoRI−HindIII断片にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをpHIV57と呼ぶ。
次に、ELDKWAエピトープを含有しているH6をプロモーターとするgp120+TM構築物を、C5隣接アームの間にクローニングした。これを実施するため、pHIV57の1,700bpのNruI−XbaI断片(ELDKWAエピトープを含有し、H6をプロモーターとするgp120+TMを含有する)を、pSIVGC15の4,700bpのNruI−XbaI断片にクローニングした。(pSIVGC15は、C5隣接アーム間にクローニングされたH6をプロモーターとするSIVのenv遺伝子を含有する。)この操作により得られたプラスミドをpGIV59と呼ぶ。H6をプロモーターとするgp120+TM(ELDKWAエピトープも有する)のDNA配列は図26に示されている。
pHIV59を用いて、ALVACをレスキューウイルスとする組換え実験を行いvCP1307を得た。
vCP1307を感染させた細胞上でHIV1のgp120+TM(ELDKWAエピトープも含む)が発現された否かを確認するためFACS分析を行った。S−MEM(Sigma製M-8026Joklik懸濁媒体)に懸濁させた5×106のHeLa−S3細胞に、5pfu/細胞のm.o.i.で、ALVAC、vP1286(HIV1のgp120+TMを発現するWR組換体)、またはvCP1307を感染させた。37℃で60分間の吸着期間の後、該細胞を10mlのS−MEMで洗浄し、1,000RPMで5分間遠心した。次に、それらのサンプルを1mlのS−MEMに再懸濁させ、5mlのSarstadt管に移して37℃の温度下に回転させた。18時間後、200μlのアリコート(細胞数1×106)をポリプロピレンチューブに入れ、3mlのPBS−CMF(0.2%NaN3+0.2%BSAを含む)で洗浄した。次いで、上澄液をデカンテーションで除去し、HIV1に血清反応陽性のヒト由来の血清(米国the New York State Dept. of Healthから入手)を100倍稀釈したもの、または、ELDKWAエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体IAM41−2F5(米国テキサスHoustonのViral Testing Systems社製)を100倍稀釈したもの100μlにペレットを再懸濁させた。それらのサンプルを60分間4℃で定温保存し、PBS−CMF(0.2%NaN3+0.2%BSAを含む)で2回洗浄し、1,000RPMで5分間遠心した。上澄液をデカンテーション除去し、ヤギの抗ヒトFITC(Boehringer Mannheimから入手)の100倍稀釈液にペレットを再懸濁させた。サンプルを30分間、4℃で定温保存し、PBS−CMF(0.2%NaN3+0.2%BSAを含む)で2回洗浄し、Fascan flow細胞計測計(サイトメーター)で分析した。vCP1307感染細胞の表面にはELDKWAエピトープを含有する遺伝子産物が低レベルで発現されていたが、ALVAC感染細胞またはvP1286感染細胞の表面には発現されていなかった(図27の下欄参照)。vP1286感染細胞およびvCP1307感染細胞の表面には、HIV1血清反応陽性の血清に反応性を有する遺伝子産物が発現されていたが、ALVAC感染細胞の表面には発現されていなかった(図27の上欄参照)。このように、vCP1307感染細胞の表面にはHIV1のgp120+TM(ELDKWAエピトープを含む)遺伝子産物であるELDKWAエピトープが発現され、該遺伝子産物のV3ループの一部がELDKWAエピトープで置換された事実を裏付けている。
vCP1307が、免疫原性のあるELDKWAエピトープを含むgp120+TMの一形態を発現するか否かを確認するため、免疫沈降分析を行った。HeLa細胞の単層に、10pfu/細胞のm.o.i.で、ALVAC(親ウイルス)、vP1286(HIV1のgp120+TMを発現するWR組換体)、またはvCP1307を感染させた。1時間の吸着期間の後、接種物を除去し、2%の透析ウシ胎児血清および[35S]−TRANSラベル(30μCi/ml)を含有する改変Eagle液(システインおよびメチオニン欠除)で細胞を覆った。1mlの3×バッファーA(450mMのNaCl、3%のNP−40、30mMのトリス(pH7.4)、3mMのEDTA、0.03%のアジ化ナトリウムおよび0.6mg/mlのPMSF)を添加することにより溶解物を回収し、次のものの発現を分析した。1)ELDKWAエピトープ:ELDKWAエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体IAM41−2F5(米国テキサス州HoustonのViral Testing System社製)を100倍稀釈したものを用いた。2)HIV1の遺伝子産物:HIV1に血清反応陽性のヒト由来の血清(米国のthe New York State Dept. of Healthから入手)を100倍稀釈したものを用いた。平常なヒト血清およびプロテインA−セファローズAで予め清浄化した溶解物をIAM41−2F5/プロテインA−セファローズ複合体またはHIV1血清反応陽性血清/プロテインA−セファローズ複合体とともに、4℃で一晩定温保存した。それらのサンプルをバッファーAで4回、LiCl2/尿素バッファーで2回洗浄した。2倍稀釈のLaenmliバッファー(125mMのトリス(pH=6.8)、4%SDS、20%グリセロール、10%の2−メルカプトエタノール)を添加し、5分間沸騰させることにより沈降したタンパク質を免疫複合体から解離させた。SDS−ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分画化し、固定化し、次に1Mのサリチル酸ナトリウムで処理し、間接撮影に供した。ELDKWAに対するモノクローナル抗体を用いると、vCP1307感染細胞からは適当な大きさのタンパク質が沈降したが、ALVAC感染細胞またはvP1286感染細胞からは沈降しなかった。さらに、HIV1血清反応陽性のヒト血清を用いると、vP1286感染細胞およびvCP1307感染細胞からは適当な大きさのタンパク質が沈殿したが、ALVAC感染細胞からは沈殿しなかった。これらの結果が示すように、vCP1307は、抗原性のあるELDKWAエピトープを含有するgp120+TMの一形態を発現させる。
実施例20−vP1313(gp120 V3ループに挿入された2つのELDKWAエピトープを含むgp120+TMを発現させるNYVAC組換体)の構築
gp120 V3ループに挿入したHIV1 gp41からの2つのELDKWAエピトープを含むHIV1 gp120+TMを発現させるNYVAC組換体であるvP1313を次の方法により作成した。ELDKWAエピトープおよびV3ループの一部をコードする配列をpBSK+にクローニングした。これを行うため、EcoRI−SacIで酵素分解した225bpのPCR断片(ELDKWA−V3ループ配列の一部を含有する)を、pBSK+の2,900bpのEcoRI−SacI断片にクローニングした。(なお、このPCR断片は、プラスミドpBSHIVMN120Tから、プライマーHIVP72(配列番号130)
およびHIVP74(配列番号131)
を用いて調製した。)この操作により得られたプラスミドをpHIV55と呼ぶ。
H6をプロモーターとするHIV1 gp120+TM遺伝子を含有するプラスミドであるpBSHIVMN120Tは次のように調製した。Marvin Reitz氏(米国NCI、NIH)から、HIV1(MN)env遺伝子のcDNAコピーを含有するプラスミドpMN1.8−9を入手した。該env遺伝子の初期転写終結シグナルT5NTを改変させた。これを行うため、KpnI−EcoRI酵素分解された1,100bpのPCR断片(env遺伝子のT5NT改変5′末端を含有)をpBSK+の2,900bpのKpnI−EcoRI断片にクローニングした。(該PCR断片は、プラスミドpMN1.8−9から、オリゴヌクレオチドHIVMN6(配列番号132)
およびHIV3B2(配列番号113)
を用いて調製した。)この操作により得られたプラスミドをpBSMIDMNと呼ぶ。
次に、このenv遺伝子のT5NT改変5′末端をenv遺伝子の残りの上流にクローニングした。これを行うため、pBSMIDMNの1,025bpのKpnI−EcoRI断片(env遺伝子のT5NT改変5′末端を含有する)を、pBS3MNの4,300bpのKpnI−EcoRI断片にクローニングした。(pBS3MNは、EcoRI−SacI酵素分解した430bpのPCR断片(env遺伝子の中央部分を含有する)およびSacI−XbaI酵素分解された1,050bpのPCR断片(env遺伝子の3′末端を含有する)を、pBSK+の2,900bpのEcoRI−XbaI断片にクローニングした。430bpのPCR断片は、プラスミドpMN1.8−9から、オリゴヌクレオチドHIV3B1(配列番号114)
およびHIVMN4(配列番号115)
を用いて調製した。また、1,050bpのPCR断片は、プラスミドpMN1.8−9からオリゴヌクレオチドHIVMN5(配列番号116)
およびHIVMN3P(配列番号117)
を用いて調製した。)この操作により得られたプラスミドをpBSMID3MNと呼ぶ。
次いで、env遺伝子の上流にH6プロモーターをクローニングした。このために、pH6IIIBEの320bpのKpnI断片(HIV1(IIIB)env遺伝子の5′末端に結合したH6プロモーターを含有する)、およびpBSMID3MNの2,450bpのXpnI−XbaI断片(HIV1(MN)env遺伝子の本体を含有する)をpBSK+の2,900bpのXpnI−XbaI断片にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをpH6HMNEと呼ぶ。
次に、gp41をコードする配列を、HIV1 envトランスメンブレン(TM)領域をコードする配列と置き換えた。これを行うため、EcoRI−XbaI酵素分解した480bpのPCR断片(gp120の3′末端およびHIV1 envトランメンブレン領域を含有する)を、pH6HMNEの4,200bpのEcoRI−XbaI断片にクローニングした。(該PCR断片は、PCR断片PCR−MN11ならびにオリゴヌクレオチドHIVTM1(配列番号118)
およびHIVTM2(配列番号114)
から、オリゴヌクレオチドHIV3B1(配列番号120)およびHIVTM3(配列番号114)
を用いて調製した。PCRMN−11は、プラスミドpH6HMNEから、オリゴヌクレオチドHIV3B1(配列番号114)およびHIVMN18(配列番号121)
を用いて調製した。)このようにして得られたプラスミドをpBSHIVMN120Tと呼ぶ。
次に、ELDKWAエピトープとV3ループをコードする他方の部分をpBSK+にクローニングした。これは、HindIII−SacI酵素分解した300bpのPCR断片(ELDKWA−V3ループ配列の一部を含有する)を、pBSK+の2,900bpのHindIII−SacI断片にクローニングすることにより行った。(なお、該PCR断片は、プラスミドpBSHIVMN120TからプライマーHIVP69(配列番号122)
およびHIVP75(配列番号123)
を用いて調製した。)この操作によって得られたプラスミドをpHIV56と呼ぶ。
次に、pHIV55およびpHIV56由来のELDKWA−V3ループ配列を、H6をプロモーターとするgp120+TM遺伝子にクローニングした。これを行うために、pHIV55の225bpのEcoRI−SacI断片およびpHIV56の300bpのHindIII−SacI断片(ELDKWA−V3ループ配列を含有)を、pBSHIVMN120Tの4,300bpのEco−RI−HindIII断片中にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをpHIV57と呼ぶ。
次いで、ELDKWAエピトープを含有しH6をプロモーターとするgp120+TM構築物を、C5隣接アーム間にクローニングした。これを行うために、pHIV57の1,700bpのNruI−XbaI断片(ELDKWAエピトープを含みH6をプロモーターとするgp120+TMを含有する)を、pSIVGC15の4,700bpのNruI−XbaIにクローニングした。(pSIVGC15は、C5隣接アーム間にクローニングされたH6をプロモーターとするSIVのenv遺伝子を含有する。)このような操作によって得られたプラスミドをpHIV59と呼ぶ。
次に、ELDKWAを含みH6をプロモーターとするgp120+TMをI4L隣接アーム間にクローニングした。これは、pHIV59の1,850bpのBamHI−SmaI断片(ELDKWAエピトープを含みH6をプロモーターとするgp120+TM遺伝子を含有する)を、pSD550VCの3,600bpのBamHI−SmaI断片にクローニングすることにより行った。このような操作により得られたプラスミドをpHIV60と呼ぶ。pHIV60内のH6をプロモーターとするTM(ELDKWAエピトープを含む)遺伝子の配列は図28に示されている。
pHIV60を用いてNYVACをレスキューウイルスとするインビトロ組換えを行いvP1313を得た。
vP1313を感染させた細胞の表面に、HIV1 gp120+TM(ELDKWAエピトープを含む)が発現されているか否かを確認するためFACS分析を行った。S−MEM(Sigma M−8028Joklik懸濁媒体)に懸濁させた5×106個のHeLa−S3細胞に、5pfu/細胞のm.o.i.でNYVAC、vP1286(HIV1のgp120+TMを発現するWR組換体)またはvP1313を感染させた。37℃において1時間の吸着期間の後、10mlのS−MEMで細胞を洗浄し、1,000RPMで5分間遠心した。次いで、それらのサンプルを1mlのS−MEMに再懸濁させ、5mlのSarstadt管に移し、37℃の回転装置の上に置いた。18時間後、200μlのアリコート(細胞数1×106)をポリプロピレンチューブに移し、3mlのPBS−CMF(0.2%NaN3+0.2%BSAを含む)で洗浄した。次いで、上澄液をデカンテーション除去し、HIV1に血清反応陽性のヒト由来の血清(米国のthe New York State Dept. of Healthから入手)を100倍稀釈したもの、またはELDKWAエピトープに特異的ヒトモノクローナル抗体IAM41−2F5(米国テキサス州HoustonのViral Testing Systems社製)を100倍稀釈したものの100μlにペレットを再懸濁させた。それらのサンプルを4℃で60分間定温保存し、PBS−CMF(0.2%NaN3+0.2%BSAを含む)で2回洗浄し、1,000RPMで5分間遠心した。上澄液をデカンテーション除去し、ヤギ抗ヒトFITC(Boehringer Mannheimから入手)の100倍稀釈液に再懸濁させた。それらのサンプルを4℃で30分間低温保存した後、PBS−CMF(0.2%NaN3+0.2%BSAを含む)で2回洗浄し、Facscan flow流通式細胞計測計(サイトメーター)で分析した。vP1313感染細胞の表面にはELDKWAエピトープを含む遺伝子産物が発現されていたが、NYVAC感染細胞またはvP1286感染細胞の表面には発現が認められなかった(図29の下欄参照)。また、vP1286感染細胞およびvP1313感染細胞の表面には、HIV1血清反応陽性の血清に反応性の遺伝子産物が発現されたが、NYVAC感染細胞の表面には発現されなかった(図29の上欄参照)。このように、vP1313感染細胞の表面には、HIV1のgp120+TM(ELDKWAエピトープを含む)遺伝子によるELDKWAエピトープが発現されており、この遺伝子産物のV3ループがELDKWAエピトープによって置き換えられたという事実を裏付けている。
vP1313が、免疫原性のあるELDKWAエピトープを含有するgp120+TMの一形態を発現するか否かを確認するため、免疫沈降分析を行った。HeLa細胞の単層に10pfu/細胞のm.o.i.で、NYVAC(親ウイルス)、vP1286(HIV1のgp120+TMを発現するWR組換体)またはvP1313を感染させた。1時間の吸着期間の後、接種物を取り出し、細胞の上に、2%の透析したウシ胎児血清および[35S]−TRANSラベル(30μCi/ml)を含有する改変Eagle液(システインおよびメチオニンが欠除)の2mlをまいた。感染から18時間後、3XバッファーA(450mMのNaCl、3%のNP−40、30mMのトリス(pH=7.4)、3mMのEDTA、0.03%のアジ化ナトリウムおよび0.6mg/mlのPMSF)を添加することにより溶解物(リゼイト)を回収し、次のものの発現を分析した:1)ELDKWAエピトープ[ELDKWAエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体IAM41−2F5(米国テキサス州HoustonのViral Testing Systems社より入手の100倍稀釈液を使用]、および2)HIV1の遺伝子産物[HIV1に血清反応陽性ヒト由来の血清(米国のthe New York State Dept. of Healthから入手)の100倍稀釈液を使用。正常なヒト血清およびプロテインA−セファロース複合体で予め清浄化した溶菌物を、IAM41−2F5/プロテインA−セファロース複合体またはHIV1血清反応陽性血液/プロテインA−セファロース複合体とともに、4℃で一晩定温保存した。それらのサンプルを、バッファーAで4回、LiCl2/尿素バッファーで2回洗浄した。2XのLaemmliバッファー(125mMのトリス(pH=6.8)、4%のSDS、20%のグリセロール、10%の2−メルカプトエタノール)を添加し、5分間沸騰させることにより、免疫複合体から沈降タンパク質を解離させた。ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分画し、固定化し、且つ1Mのサリチル酸ナトリウムで処理し間接撮影(フルオログラフィー)に供した。ELDKWAエピトープに対するモノクローナル抗体を使用すると、vP1313感染細胞から適当な大きさのタンパク質が沈降したが、NYVAC感染細胞またはvP1286感染細胞からは沈降しなかった。さらに、HIV1に血清反応陽性のヒト血清を使用すると、vP1286感染細胞およびvP1313感染細胞からは適当な大きさのタンパク質が沈降したが、NYVAC感染細胞からは沈降しなかった。これらの結果が示すように、vP1313は、免疫原性のあるELDKWAエピトープを含有するgp120+TMの一形態を発現するものである。
実施例21−vP1319(gp120 V3ループに挿入され2つのELDKWAエピトープを含むHIV1 gp120+TMを発現するCOPAK組換体)の構築
gp120 V3ループに挿入されたHIV1のgP41由来の2つのELDKWAを含むHIV1 gp120+TMを発現するCOPAK組換体であるvP1319を次のように作成した。ELDKWAエピトープとV3ループの一部をコードする配列をpBSK+にクローニングした。これは、EcoRI−SacI酵素分解した225bpのPCR断片(ELDKWA−V3ループ配列の一部を含有する)を、pBSK+の2,900bpのEcoRI−SacI断片にクローニングすることにより行った。(なお、該PCR断片は、プラスミドpBSHIVMN120Tから、プライマーHIVP72(配列番号110)
およびHIVP74(配列番号111)
用いて調製した。)このような操作により得られたプラスミドをpHIV55と呼ぶ。
[H6をプロモーターとするHIV1 gp120+TM遺伝子を含有するプラスミドであるpBSHIVMN120Tは以下のように調製した。HIV1[MN]env遺伝子のcDNAコピーを含有するプラスミドであるpMN1.8−9をMarvin Reitz氏(米国NCI、NIH)から入手した。該env遺伝子の初期転写終結シグナル配列T5NTを改変した。これを行うために、KpnI−EcoRIで酵素分解した1,100bPのPCR断片(env遺伝子のT5NT改変5′末端を含有する)を、pBSK+の2,900bpのKpnI−EcoRI断片にクローニングした。(なお、該PCR断片は、プラスミドpMN1.8−9から、オリゴヌクレオチドHIVMN6(配列番号112)
およびHIV3B2(配列番号113)
を用いて調製した。)この操作により得られたプラスミドをpBSMIDMNと呼ぶ。
次に、このenv遺伝子のT5NT改変5′末端を、env遺伝子の残りの上流にクローニングした。これを行うために、pBSMIDMNの1,025bpのKpnI−EcoRI断片(env遺伝子のT5NT改変5′末端を含有する)を、pBS3MNの4,300bpのKpnI−EcoRI断片にクローニングした。(pBS3MNの調製は、EcoRI−SacI酵素分解した430bpのPCR断片(env遺伝子の中央部分を含有する)およびSacI−XbaI酵素分解した1,050bpのPCR断片(env遺伝子の3′末端を含有する)を、pBSK+の2,900bpのEcoRI−XbaI断片にクローニングすることにより行った。(ここで、430bpのPCR断片は、プラスミドpMN1.8−9から、オリゴヌクレオチドHIV3B1(配列番号114)
およびHIVMN4(配列番号115)
を用いて調製した。また、1,050bpのPCR断片は、プラスミドpMN1.8−9から、オリゴヌクレオチドHIVMN5(配列番号116)
およびHIVMN3P(配列番号117)
を用いて調製した。)このような操作により得られたプラスミドをpBSMID3MNと呼ぶ。
次に、env遺伝子の上流にH6プロモーターをクローニングした。これを行うため、pH6IIIBEの320bpのKpnI断片(HIV1(IIIB)env遺伝子の5′末端に結合されたH6プロモーターを含有する)およびpBSMID3MNの2,450bpのXpnI−XbaI断片(HIV1(MN)env遺伝子の本体を含有する)を、pBSK+の2,900bpのKpnI−XbaI断片にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをpH6HMNEと呼ぶ。
次いで、gp41をコードする配列を、HIV1のenvトランスメンブレン(TM)領域をコードする配列と置き換えた。これを行うために、EcoRI−XbaI酵素分解した480bpのPCR断片(gp120遺伝子の3′末端およびHIV1のenvトランスメンブレン領域を含有する)を、pH6HMNEの4,200bpのEcoRI−XbaI断片にクローニングした。(該PCR断片は、PCR断片であるPCR−MN11並びにオリゴヌクレオチドHIVTM1(配列番号118)
およびHIVTM2(配列番号119
から、オリゴヌクレオチドHIV3B1(配列番号114)およびHIVTM3(配列番号120)
を用いて調製した。また、PCRMN11は、プラスミドpH6HMNEから、オリゴヌクレオチドHIV3B1(配列番号114)およびHIVMN18(配列番号121)
を用いて調製した。)このような操作によって得られるプラスミドをpBSHIVMN120Tと呼ぶ。]
次にELDKWAおよびV3ループをコードする他方の部分をpBSK+にクローニングした。これを行うために、HindIII−SacI酵素分解した300bpのPCR断片(ELDKWA−V3ループ配列の一部を含有する)を、pBSK+の2,900bpのHindIII−SacI断片にクローニングした。(なお、該PCR断片は、プラスミドpBSHIVMN120TからプライマーHIVP69(配列番号122)
およびHIVP75(配列番号123)
を用いて調製した。)この操作により得られたプラスミドをpHIV56と呼ぶ。
次に、pHIV55およびpHIV56由来のELDKWA−V3ループ配列を、H6プロモーターとするgp120+TM遺伝子内にクローニングした。これは、pHIV55の225bpのEcoRI−SacIおよびpHIV56の300bpのHindIII−SacI断片(ELDKWA−V3ループ配列を含有)を、pBSHIVMN120Tの4,300bpのEcoRI−HindIII断片にクローニングにすることにより行った。この操作により得られたプラスミドをpHIV57と呼ぶ。
次いで、ELDKWAエピトープを含有し、H6をプロモーターとするgp120+TM構築物を、C5隣接アーム間にクローニングした。これを行うために、pHIV57の1,700bpのNruI−XbaI断片(H6をプロモーターとするgp120+TM(ELDKWAエピトープを含む)遺伝子を含有する)を、pSIVGC15の4,700bpのNruI−XbaI断片にクローニングした。(pSIVGC15は、C5隣接アーム間にクローニングされたH6をプロモーターとするSIVのenv遺伝子を含有する。)この操作により得られたプラスミドをpHIV59と呼ぶ。
次に、H6をプロモーターとするgp120+TM(ELDKWAエピトープを含む)を、COPAK隣接アーム間にクローニングした。これを行うため、pHIV59の1,850bpのBamHI−SmaI断片(H6をプロモーターとするgp120+(ELDKWAエピトープを含む)遺伝子を含有する)を、pSD553VCの4,600bpのBamHI−SmaI断片にクローニングした。この操作によって得られたプラスミドをpHIV61と呼ぶ。このpHIV61における(ELDKWAエピトープを含む)gp120+TM遺伝子のDNA配列は図30に示されている。
pHIV61を用いCOPAKをレスキューウイルスとするインビドロ組換えを行いvP1319を得た。
vP1319が感染された細胞の表面でHIV1gp120+TM(ELDKWAエピトープを含む)が発現されたか否かを確認するためFACS分析を行った。S−MEM(Sigma製M−8028Joklik懸濁媒体)に懸濁させた5×106個のHeLa−S3細胞に、5pfu/細胞のm.o.i.でWR、vP1286(H IV1のgp120+TMを発現するWR組換体)またはvP1319を感染させた。37℃において60分間の吸着期間の後、10mlのS−MEMで細胞を洗浄し、1,000RPMで5分間遠心した。次いで、サンプルを1mlのS−MEMに再懸濁させ、5mlのSarstadt管に移し、37℃の温度下に回転装置上に配置した。18時間後、200μlのアリコート(細胞数1×106)をポリプロピレンチューブにいれ、3mlのPBS−CMF(0.2%NaN3+0.2%BSAを含む)で洗浄した。次いで、上澄液をデカンテーションで除去し、HIV1に血清反応陽性のヒト由来の血清(米国the New York State Dept. of Healthから入手)を100倍稀釈したもの、HIV1(MN)V3ループに特異的なマウスモノクローナル抗体50.1(米国NCI、NIHのM. Robert Guroff氏から入手)を500倍稀釈したもの、または、ELDKWAエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体IAM41−2F5(米国テキサスHoustonのViral Testing Systems社製)を100倍稀釈したもの100μlにペレットを再懸濁させた。それらのサンプルを60分間4℃で定温保存し、PBS−CMF(0.2%NaN3+0.2%BSAを含む)で2回洗浄し、1,000RPMで5分間遠心した。上澄液をデカンテーション除去し、ヤギの抗ヒトFITCまたはヤギの抗マウスFITC(Boehringer Mannheimから入手)の100倍稀釈ペレットを再懸濁させた。サンプルを30分間、4℃で定温保存し、PBS−CMF(0.2%NaN3+0.2%BSAを含む)で2回洗浄し、Facscanflow細胞計測計(サイトメーター)で分析した。vP1319感染細胞の表面にはELDKWAを含有する遺伝子産物が発現されていたが、WR感染細胞またはvP1286感染細胞の表面には発現されていなかった(図31の中欄参照)。vP1286感染細胞の表面にはV3ループを含有する遺伝子産物が発現されていたが、WR感染細胞またはvP1319感染細胞の表面には発現されなかった(図31の下欄参照)。vP1286感染細胞およびvP1319感染細胞の表面には、HIV1に血清反応陽性の血清に反応性の遺伝子産物が発現されていたが、WR感染細胞の表面には発現されていなかった(図31の上欄参照)。この分析が示すように、1)vP1319感染細胞の表面にはHIV1のgp120+TM(ELDKWAエピトープを含む)遺伝子産物であるELDKWAエピトープが発現され、且つ、2)vP1319感染細胞の表面に発現された遺伝子産物は野生型のV3ループを含有せず、該遺伝子産物のV3ループがELDKWAエピトープで置換された事実を裏付けている。
vP1319が、免疫原性のあるELDKWAエピトープを含むgp120+TMの一形態を発現するか否かを確認するため、免疫沈降分析を行った。HeLa細胞の単層に、10pfu/細胞のm.o.i.で、NYVAC(親ウイルス)、vP1286(HIV1のgp120+TMを発現するWR組換体)、またはvP1319を感染させた。1時間の吸着期間の後、接種物を除去し、2%の透析ウシ胎児血清および[35S]−TRANSラベル(30μCi/ml)を含有する改変Eagle液(システインおよびメチオニン欠除)で細胞を覆った。感染から18時間後、1mlの3×バッファーA(450mMのNaCl、3%のNP−40、30mMのトリス(pH7.4)、3mMのEDTA、0.03%のアジ化ナトリウムおよび0.6mg/mlのPMSF)を添加することにより溶解物を回収し、次のものの発現を分析した。1)ELDKWAエピトープ:ELDKWAエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体IAM41−2F5(米国テキサスHoustonのViral Testing Systems社製)を100倍稀釈したものを用いた。2)HIV1の遺伝子産物:HIV1に血清反応陽性のヒト由来の血清(米国the New York State Dept. of Healthから入手)を100倍稀釈したものを用いた。
平常なヒト血清およびプロテインA−セファロースAで予め清浄化した溶解物をIAM41−2F5/プロテインA−セファロース複合体またはHIV1血清反応陽性血清/プロテインA−セファロース複合体とともに、4℃で一晩定温保存した。それらのサンプルをバッファーAで4回、LiCl2/尿素バッファーで2回洗浄した。2XのLaenmliバッファー(125mMのトリス(pH=6.8)、4%SDS、20%グリセロール、10%の2−メルカプトエタノール)を添加し、5分間沸騰させることにより沈降したタンパク質を免疫複合体から解離させた。SDS−ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分画化し、固定化し、次に1Mのサリチル酸ナトリウムで処理し、間接撮影(フルオログラフィー)に供した。ELDKWAに対するモノクローナル抗体を用いると、vP1319感染細胞からは適当な大きさのタンパク質が沈降したが、NYVAC感染細胞またはvP1286感染細胞からは沈降しなかった。さらに、HIV1血清反応陽性のヒト血清を用いると、vP1286感染細胞およびvP1319感染細胞からは適当な大きさのタンパク質が沈殿したが、NYVAC感染細胞からは沈殿しなかった。これらの結果が示すように、vP1319は、抗原性のあるELDKWAエピトープを含有するgp120+TMの一形態を発現させる。
vCP1307、vP1313およびvP1319は、それぞれ、免疫原性のある形態でELDKWAエピトープを発現させるので、前述したように、これらの組換体は、それらの発現産物、それから誘起される抗体、さらには、それらの組換体由来のDNAなどと同様に広範な利用性を有する。
実施例22−vCP205をサル科マカク属のサルに筋肉内投与した場合の接種効果と免疫原性
実験動物:Macaca fascicularis(カニクイザル)(成体、野生捕獲)
数:8匹
性別:オス
捕獲源:モーリシャス島。B型肝炎、フィロウイルスおよび結核症が存在しないと考えられる。
前歴:ポリオの実験に供された。
食事および飲料水:市販のエサと果物;随意に水道水
4匹のオスのカニクイザル(Cynomolgus macaque)に、1ヶ月間隔で5回、ALVAC−HIV(vCP205)(1回投与当たり105.6TCID50を含有)を筋肉内投与した。この注入(注射)によって、何らの症状も外傷も引き起こされなかった。注入によるサルの体重変化はなかった。4匹のコントロール(対照)用サルには、プラセボ(placebo)(DMEM−F12(25%)、ラクトグルタメート(25%)および凍結乾燥用基質(50%))を注入した。一般的な状態を毎日監視し、各接種後、1、2、3、4および7日目に注射部位の観察を行った。体重を週に1回測定した。
血液サンプルを採取して、血液学的分析用にEDTA血液採取用VacutainerRチューブ(フランスMeylandのBecton-Dickinson製)、生化学的分析用にリチウム−ヘパリン マイクロベット CB100 チューブ(ドイツNumbrechtのSarstedt)、および血清学的分析用に血清分離器SST VacutainerRチューブ付きの管に入れた。サンプリングは、0、3、7、14、28、31、35、42、56、59、63、70、84、87、91、98、112、115、119、126および140日目に行った。臨床検査および血液採取に際しては麻酔(ケタミン20mg/kgを筋肉内投与)を行った。
血液学的および生化学的分析は、VET TEST 8008装置を用いて実施した。抗HIV gp160、p24タンパク質およびV3ペプチド抗体の力価をELISA法によって測定した。このため、Maxisorp F96 NUNCプレートを、0.1Mの炭酸塩バッファー(pH9.6)に稀釈した次のいずれかの抗原で37℃において1時間被覆した。
・1ウエル当たり130ngの精製gp160 MN/BRU(組換えワクシニア由来であり、30%の切断gp160を含有するがα2マクログロブリンは含有しない)、
・200ngのV3MNペプチド
・130ngの精製「p24」HIV(大腸菌P25 LAIから単離、バッチ672Cl、Transgene)
インキュベートは、全て、最終体積が100μlになるように行い、その後、リン酸緩衝生理食塩水(pH7.1)/0.1%Tween 20を用いて3回洗浄した。リン酸緩衝生理食塩水(PH7.1)/0.05%Tween 20/5%(w/v)粉状スキムミルク(Gloria)の150μlを用いて37℃で1時間、プレートのブロッキングを行った。
血清をリン酸緩衝生理食塩水0.05%Tween 20/5%(w/v)粉状スキムミルクに溶かし、逐次的に3倍ずつ稀釈(1/50から1/12150の範囲)してウエルに添加し、37℃で90分間保温した。
洗浄後、抗サルIgG/ペルオキシダーゼ複合体(Cappel、ヤギのIgG画分)をリン酸緩衝生理食塩水/0.5%Tween 20/5%(w/v)粉状スキムミルク中に1/3000稀釈したものを添加して、該プレートを37℃において更に90分間保温した。プレートを4回洗浄し、基質であるO−フェニレンジアミン ジハイドロクロリド(Sigmaタブレット)とともに暗中で室温下に30分間保温した。基質は、0.03%の過ホウ酸ナトリウム(Sigmaカプセル)を含有する。0.5Mのリン酸塩・クエン酸塩系緩衝液(pH5.0)に溶かし1.5mg/mlの濃度で用いた。
4NのH2SO4の50μlを用いて反応を停止させた。自動プレートリーダー(Vmax, Molecular Devices)を用い490−650nmにおける光学密度を測定した。抗体力価は次の式に従って計算した。
力価=log(OD490-650×10)/(1/稀釈倍数)
OD値の範囲は0.2から1である。
中和抗体の分析により、10 TCID50のHIV MNで感染された血清のマイクロウエルにおけるシンシチウムの発生を防止する稀釈倍数が決定される。MN株は、F. Barre-Sinoussiから入手し、CEMクローン166細胞中で増殖させた。
血清は補体除去され、RPMI中で血清の逐次的な2倍稀釈液(最初は1/10)を調製した。等体積の血清稀釈液とHIV懸濁液(各500μl)を混合し、37℃において2時間保温した。HIV懸濁液は、1ml当たり102〜102.5のTCID50を含有するように調製しておいたものである。
使用の前に、ポリ−L−リジンがコーティングされたマイクロウエルに指示剤となるCEMss細胞をまき、37℃で1時間保温した。培地を取り除き、ウイルス/血清混合物(100μl/ウエル、各稀釈当たり6ウエル)と置き換えた。37℃で1時間の保温の後、各ウエルに培地を添加し、37℃でプレートを保温した。保温は全て、CO25%のインキュベーター内で行った。
7日後および14日後に、培養物を顕微鏡で調べ、シンシチウムを示すウエルを記録した。中和50%力価をSPEARMANおよびKÅRBERに従って計算し、終点のlog10として表した。確認のために、7日目に培養物を上澄液を採取し、各稀釈液毎にまとめて、RT活性を分析した。各分析は、ウイルス懸濁液の伝染性滴定、参照用血清および陰性コントロールとしての1組の非感染マイクロウエルの抗体滴定を含む。
結果
血液学的および生化学的状態を監視するためのパラメーター(赤血球数、平均血球体積、ヘマトクリット、クレアチニンおよびアラニンアミノトランスフェラーゼなど)の大部分は平常な範囲内で変化した。
ALVAC−HIV(vCP205)による繰り返し免疫に帰することができない幾つかの変化が認められた:i)試験グループおよびコントルールグループの両方における8週および9週目の説明できないリンパ球増加、ii)両グループにおける17および20週目、並びにコントロールグループにおける9週目のヘモグロビンレベルの減少、iii)2匹のコントロール用サルにおけるアスパルテートアミノトランスフェラーゼの異常な高い値、最後に、iv)何匹かについてマイクロ凝集によって引き起こされる異常な血小板値。
vCP205によって誘起される抗HIV免疫応答は、精製gp160MN/BRU(組換体ワクシニア由来)、V3MN合成ペプチドおよびp24(大腸菌由来、LAI単離物)を用いるELISA試験により評価した。すべてのサルがgp160およびV3に対する抗体を、また、4匹のうち2匹がp24に対する抗体を産生した。明確な抗HIV免疫応答は、通常、2回の注射後、あるいは最大限、3回の注射後に現れた。後にvCP205を接種すると、主として抗体レベルが維持され(時には、僅かに上昇)、サル間の応答の均質性が向上した。最大の抗体力価は、通常、各接種の2週間後に認められ、その後、次のブースター(追加免疫)まで減少した。HIV/MNに対する中和抗体は、免疫された全てのサルについて検出可能であった。
臨床観察:接種部位には紅斑も浮腫も認められなかった。コントロール用サルおよびALVAC−HIV(vCP205)感染サルとも体重は安定していた(図32)。
血液学分析:白血球数は、8週および9週目にformula inversionとともにコントロール用サルおよび試験用サルのいずれにおいても大きく向上した(図33a)。この事実は、いずれのグループにおいて認められており、ウイルス注射との相関関係はない。
赤血球数、血球平均体積およびヘマトクリットは平常な範囲内で変化したが、ヘモグロビンは、コントロール用サルでは、9、17および20週目に、また、ALVAC−HIV(vCP205)が接種されたサルでは17および20週目に不一致が認められた(図33bおよび33c参照)。血小板値は、サンプリングの質に応じて変化した(ミクロ凝固)(図33c参照)。
生化学的分析:クレアチニンおよびALAT(SGPTトランスアミナーゼ)は、反復接種後も有意に変化しなかった(図34および図36参照)。AST(SGOTトランスアミナーゼ)は、コントロール用サルの#3および2において、それぞれ、5週目および8〜9週目に特に重要な変化を示した(図35)。
血清学的分析:サル血清の陰性コントロールグループのELISA力価を考慮すると、血清学的応答の陰性検出限界は、gp160、V3およびp24について、log10で表して、それぞれ、1.56±0.24、1.92±0.12および2.18±0.34と考えられた。gp160およびV3に特異的応答は図37a〜37b、図38a〜38bに示す。gp160に対する抗体の動力学的や挙動は、V3に対するそれと類似している。後者の方が僅かに弱い(20週目における平均力価は4.37対8.84である)。
検出可能な免疫応答を誘起するには2回の投与が必要であった。3匹のサルは2回目の投与後に最大の応答を示した;4匹目のサルは、最大の応答を示すのに、3回の投与(gp160について)または4回の投与(V3について)が必要であった。各投与間の4週間の期間中、抗体力価は上昇した後低下し、次の接種によって増強されることになる。当初の投与に対する応答には個体間に有意の相違があるが、実験が進行するに従い応答は平均化した。
p24に特異的な応答(図37cおよび38c):4匹のうちの2匹のサル科マカク属のサル(サル5および7)については、それぞれ、vCP205の2回目の投与後および3回目の投与後に、応答が認められた。これは、モルモットの場合には接種されたどのグループにおいても抗p24抗体が検出されなかったことと対照的である。抗gp160抗体および抗V3抗体の場合と同様に、力価は各投与間に上下動し、個体間の相違は、次第になくなった。gp160およびV3の場合とは異なり、抗p24抗体のプロフィルは一定水準(プラトー)に達することはなかった。
中和抗体:図39に示すように、vCP205が投与された4匹のサルはいずれも、検出可能なレベルの抗HIV(MN)中和抗体を産生した。そのうちの1匹は1回の投与後に陽性となり、2匹は第2回の投与後に、また最後の1匹は5回の投与を必要とした。注目すべきことは、最後の1匹がELISA抗体の動力学挙動が最も遅かったということである。中和抗体のレベルは比較的穏当であり(数学的表現で1/10から1/30)、ELISA測定値と同様に、各投与の間では上下動した。
gp160およびp24による追加免疫効果:4匹のサルに、vCP205の最後の投与から7週間後、200μgのgp160および200μgのp24タンパク質をフロインド(freund's)不完全アジュバント(Montanide ISA51)に溶かしたものを追加投与して超免疫標準血清を産生させた。この結果、抗体力価に著しい上昇(少なくとも10倍)が生じ、ELISA分析において見られたプラトー値が応答限界ではなかったことを示唆していた。
この免疫試験により、gp160 MN/BRUおよびV3 MNペプチドに対する高レベルの結合抗体が誘起され、そして、低いが明確な中和抗体が誘起された。血清学的結果ではALVAC−HIV(vCP125)が接種されたサル科マカク属のサルにおいて観測されたものより高い抗体レベルが示され、また、1回の追加免疫(2回ではない)が良好な既往的応答を得るのに充分であった。この実施例は、vCP205およびその発現産物、それから得られる抗体、ならびにvCP205由来のDNAが前述のように有用であることを示すものである。
実施例23−vCP300をサル科マカク属のサルに投与した場合の接種効果と免疫原性
実験動物:
種:Macaca fascicularis(カニクイザル)
数:8匹
性別:オス
捕獲源:モーリシャス島。B型肝炎、フィロウイルスおよび結核症が存在しないと考えられる。
4匹のカニクイザル(Cynomolgus macaque)に、1ヶ月間隔で5回、ALVAC−HIV(vCP300)(1回投与当たり106.16TCID50を含有)を筋肉内投与した。4匹のコントロール(対照)用サルにはプラセボを注射した。6回目の注射として、すべてのサルにALVAC−HIV(vCP300)を静脈投与した。プログラムは以下のとおりである。
グループ#1
投与薬剤:プラセボ
投与方法:左または右の三角筋に交互に筋肉内投与。
量:1ml
注射回数:5回(0、4、8、12および16週)
グループ#2
投与薬剤:ALVAC−HIV
投与方法:右または右の三角筋に交互に筋肉内投与。
量:1ml
投与量:106.16TCID50
注射回数:5回(0、4、8、12および16週)
グループ#1および#2
20週目。
投与薬剤:ALVAC−HIV(vCP300
投与方法:静脈内投与
量:1ml
投与量:106.16TCID50
注射回数:1回
臨床観察:各接種の後、1、2、3、4および7日目に注射部位の観察を行った。1週間に1度、サルの体重測定を行った。
サンプリング:ケタミン麻酔して、大腿部静脈から血液サンプルを採取した。血液は以下の順にVacutainerチューブ(フランスMeylanのBecton Dickinson):
1)0.129Mクエン酸ナトリウム緩衝チューブ内に1.8ml(プロトロンビン分析用)。
2)5mgのフッ化ナトリウムとシュウ酸カリウムチューブに2ml(グルコース分析用)
3)0.17MのEDTA K3チューブに2ml(血液学的分析用)。
4)不活性保護剤とクロット活性剤を含む血清分離用チューブに2〜3ml(生化学的および血清学的分析用)。
サンプリングは、0、3、7、14、28、31、35、42、56、59、63、70、84、87、91、98、112、119、126、140および143日目に行った。
用量
血液学的分析として、血球数および分化白血球数(differential leucocyte counts)、ヘモグロビン、血小板、プロトロンビン、網状赤血球および沈降率等を測定した。
生化学的分析として、ナトリウム、カリウム、グルコース、アルカリホスファターゼ、コレステロール、全タンパク質および電気泳動、トランスアミナーゼSGOTおよびSGPT等を測定した。
血清学的分析として、抗HIV gp160糖タンパク質、p24タンパク質、V3ペプチドおよびnefタンパク質各抗体を、次のように、ELISA法を改良して滴下した:
Maxisorp F96 NUNCプレートに、0.1Mの炭酸塩緩衝液(pH9.6)で稀釈した以下の抗原の1つを37℃で1時間、次いで4℃で一晩被覆した。
・1ウエル当たり130ngの精製gp160 MN/BRU(組換えワクシニアVVTG5156由来)、
・200ngのV3MNペプチド、
・130ngの精製p24 HIV(大腸菌p25 LAI単離物、バッチ672C1、Transgene製)。
保温は全て、最終体積を100μlとして行い、その後、リン酸緩衝生理食塩水(pH7.1)/0.1%のTween 20で3回洗浄した。リン酸緩衝生理食塩水(pH7.1)/0.1%のTween 20/5%(w/v)の粉状スキムミルク(Gloria)の150μlを用いて37℃で1時間、プレートのブロッキングを行った。リン酸緩衝生理食塩水/0.05%Tween 20/5%(w/v)の粉状スキムミルクに溶かした血清を逐次的に3倍ずつ稀釈した溶液(範囲は1/50から1/12150または1/500から1/121500)をウエルに添加し、37℃で90分間保温した。
洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水/0.05%Tween 20/5%(w/v)の粉状スキムミルク中で3000倍に稀釈した抗サルIgG/ペルオキシダーゼ複合体(Cappel、ヤギのIgG画分)を添加し、37℃においてさらに90分間プレートを保温した。プレートを4回洗浄した後、基質としてO−フェニレンジアミンジハイドロクロリド(Sigmaタブレット)を用いて暗中で30分間、室温下で保温した。基質は、0.03%の過ホウ酸ナトリウム(Sigmaカプセル)を含有する0.05%Mのリン酸クエン酸緩衝液(pH5.0)に溶かした1.5mg/mlの濃度で使用した。50μlの4N H2SO4を用いて反応を停止させた。
自動式プレードリーダー(Vmax, Molecular Devies製)を用いて490−650nmにおける光学密度を測定した。ブランクの値を差し引き、2回の値を平均した。ELISAプレート上に存在させたモルモットの抗gp160および抗p24超免疫標準血清の回帰曲線から、0.2〜1.2の範囲のOD値について抗体力価を計算した。該標準血清の力価は、次式によって予め定められたものである:
力価=log(OD490-650×10)/(1/稀釈倍数)
OD値の範囲は0.2〜1.2である。
サルの抗nef標準血清が入手できなかったので、抗nef抗体の測定は、内部的な陽性コントロールとして、マウスのモノクローナル参照用抗体(抗nef HIV1 AL1、MATG0020、Transgene製)を試験に利用することによって行った。次に、5000倍稀釈した抗マウスIgG/ペルオキシダーゼ複合体(Amersham製)を用い、上述の式に従って血清の力価を計算した。
結果
注入によって何等の症状も外傷も引き起こさなかった。注入によりサルの体重変化はなかった。血液学的パラメーターは有意に変化しておらず、また、生化学的分析によれば、腎臓機能や肝臓機能に変化は認められなかった。
血液学的結果:変化が認められた場合でも、プラセボグループとワクチン化グループにおいてそのパターンや範囲は類似していた。
個々のWBC数は、平常範囲内で変化していた。WBC数較差は、血液サンプリングの3日後にしばしばリンパ球の減少を示した(図40参照)。赤血球数、ヘマトクリットおよびヘモグロビンは、各サンプリング後に一時的に減少したが、これとは対照的に、網状赤血球数は穿刺後、常に増加していた(図41a、41b、41c参照)。平均血球体積は、140日目における増加を除いては、全てのサルにおいて安定していた。血小板数は、幾分変化したが(図41)、プロトロンビンレベルは安定していた(図42)。いずれのグループにも貧血症の徴候は認められなかった。血沈速度は、すべてのサンプルにおいて1時間後1mmであった。
生化学的結果:観測された変化を解釈しやすくするために、標準血清(18のサル血清をプールしたもの)を用い、一連のサンプル測定の開始時(Std a)および終了時(Std p)に分析した。
コレステロール値は、コントロールグループおよび試験グループとも同じように変化した(図43aおよび43b)。
ナトリウムおよびカリウムは全ての注射後で安定していたが、全タンパク質とグルコースに関しては、140日目に大きな上昇が認められた。その日には、静脈内注射に先立ち血液サンプルを麻酔をかけずに抜き出した(その結果、干渉を起こさずに臨床反応を監視することができた);幾つかの生物学的パラメーターに認められた変化は、無麻酔の処置とサンプリングに関連するストレスに因ったものであろう(図43aおよび43b)。電気泳動プロフィール(データを示していない)はすべてのサンプルにおいて酷似していた。クレアチニン、ビリルビン、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼおよびアルカリホスファターゼは平常な範囲内で変化し、常に、コントロールグループおよび試験グループの両方において同じ傾向を示した(図43cおよび43d)。したがって、ALVAC−HIV(vCP300)の接種により腎臓機能および肝臓機能が影響されることはなかった。
血清学的結果:検出可能な抗gp160および抗V3応答を誘起するには、2回の注射(サル#6、7、8)または3回の注射(サル#5)が必要であった(図44a、44b、45a、45b)。2回目の注射の2週間後に、これらの応答はサル間で変化していた(抗gp160力価はlogで2から4.6の間で変動した)。このような応答の不一致は3回目の注射で平滑化された。後続して筋肉内投与を行うと、力価は主として維持されるか上昇し、4回から5回目の注射後には、抗gp160抗体および抗V3抗体に関して、それぞれ、約4.3および3.6に達した。vCP300の筋肉内注射を3回(サル#6、8)から4回(サル#6)、または5回(サル#7)を行った後に、検出可能な抗体が認められた。最も高い抗gp160/V3力価を示したサルが、最も高い抗p24値(1次免疫から18週目において約4.3)を示した。抗nef抗体を産生したサルはなかった(図47a、47b)。
ELISAで抗HIV−1 gp160、V3、p24、nef血清抗体を分析することにより、vCP300により誘起された免疫応答の検討を行った。
全てのサルがgp160、V3およびp24に対する抗体を産生した。2回または多くても3回の筋肉内投与により有意の抗gp160または抗V3応答が得られた。後続の接種はその抗体レベルを維持または上昇させた。抗p24応答は3〜5回の投与後に検出され、vCP300の各接種はそのレベルを上昇させた。いずれのサルにおいても抗nef抗体は検出することができなかった。
抗体力価は、一般に、それぞれの筋肉内注射の2週後に最大となり、次に追加投与が行われるまで減少した。
これらの血清学的結果は、同じタンパク質類を発現させるがCTLエピトープを発現させないALVAC−HIV(vCP205)を用いて得られた結果と非常に似ている。vCP300を用いた本実施例において2つの僅かな違いを指摘することができる。すなわち、抗gp160/V3抗体力価が少し低く(約0.2〜0.5log)、且つ、抗p24応答が高い(すべてのサルにおいて陽性であり、血清力価が高い)ことである。サル間に個体差があるので、これらの相違は有意なものとは考えられない。静脈内接種後に過敏症の徴候は認められなかった。副作用も記録されていない。本プログラムは、gp160、V3およびp24に対する高レベルの結合性抗体を産生させた(gp160についてはvCP205を用いる場合よりも低いが)。本実施例が示すように、vCP300およびその遺伝子産物、それから得られる抗体、ならびにvCP300由来のDNAは、上述したよう鮪用性を有するものである。
以上のように本発明の好ましい態様を詳述したが、添付の請求の範囲により定義された本発明は上述の特定の態様に限定されるものではなく、その精神と意図から逸脱しない多くの変形が可能である。
Claims (13)
- 改変組換体ウイルスであって、ウイルスにコードされている遺伝子機能が不活化されていることにより該ウイルスの毒性が弱毒化されているが効力は保持しており;さらに、該ウイルスの非必須領域に外来DNAを含み、該外来DNAが少なくとも1つの免疫不全症ウイルスエピトープをコードし、前記改変組換体ウィルスが、NYVAC組換体ウィルス、COPAK組換体ウィルスまたはALVAC組換体ウィルスであり、前記外来DNAが、gp120(MN)(+トランスメンブラン)およびELDKWAまたはLDKWエピトープをコードすることを特徴とする組換体ウイルス。
- NYVAC組換体ウィルスであり、前記ELDKWAまたはLDKWエピトープが、gp120の領域の一部として発現されることを特徴とする請求項1記載のウィルス。
- 前記ELDKWAまたはLDKWエピトープが、gp120 V3の一部として発現されることを特徴とする請求項2記載のウィルス。
- ALVAC組換体ウィルスであり、前記ELDKWAまたはLDKWエピトープが、gp120の領域の一部として発現されることを特徴とする請求項1記載のウィルス。
- 前記ELDKWAまたはLDKWエピトープが、gp120 V3の一部として発現されることを特徴とする請求項4記載のウィルス。
- vCP1307であることを特徴とする請求項1記載のウィルス。
- vP1313またはvP1319であることを特徴とする請求項1記載のウィルス。
- 請求項1から7のいずれかに記載のウイルスを適当な担体と混合して含むことを特徴とする免疫応答を誘起するための組成物。
- 生体外培養された細胞内で遺伝子産物を発現させる方法であって、前記細胞に請求項1から7のいずれかに記載のウイルスを導入する工程を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1から7のいずれかに記載のウイルスの生体外発現から調製されることを特徴とする免疫欠損ウイルス抗原。
- gp120(MN)(+トランスメンブラン)およびELDKWAまたはLDKWエピトープに対する抗体であって、請求項1から7のいずれかに記載のウイルス由来の抗原の生体内発現により、または、前記ウイルスの生体外発現由来の免疫欠損ウィルス関連抗原の投与により誘起されることを特徴とする抗体。
- gp120(MN)(+トランスメンブラン)およびELDKWAまたはLDKWエピトープを含み、前記ELDKWAまたはLDKWが、gp120の領域の一部であることを特徴とするHIV免疫原。
- 前記ELDKWAまたはLDKWが、gp120 V3の一部であることを特徴とする請求項12記載のHIV免疫原。
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