JPH09511649A - 免疫不全症組換えポックスウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 免疫不全症ウイルスおよび／またはＣＴＬ抗原をコードするＤＮＡを含有する弱毒化された組換体ウイルス、該ウイルスを使用する方法と組成物、それから得られる発現産物、該ウイルスまたは発現産物から産生される抗体が開示され、特許請求されている。組換休ウイルスはＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ組換体ウイルスでもよい。ＤＮＡは、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、ＥＬＤＫＷＡエピトープまたはＬＤＫＷエピトープ、好ましくは、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、２つのｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬエピトープと３つのｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬエピトープ、または、ｇｐ１２０ Ｖ３ループもしくはその他の領域またはｇｐ１６０中の２つのＥＬＤＫＷＡの少なくとも１つをコードしているものであってもよい。２つのｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬエピトープと３つのｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬエピトープは、好ましくは、ＣＴＬ１、ＣＴＬ２、ｐｏｌ１、ｐｏｌ２およびｐｏｌ３である。この組換体ウイルス、それから得られる遺伝子産物、該ウイルスおよび遺伝子産物によって産生される抗体は、幾つかの子防、治療および診断上の用途を有する。この組換体ウイルス由来のＤＮＡは、プローブとして、またはＰＣＲプライマーを調製したり、免疫化するのに有用である。さらに、ＨＩＶ免疫原および改変ｇｐ１６０とｇｐ１２０についても開示し特許請求している。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫不全症組換えポックスウイル 発明の属する技術分野 本発明は、改変ポックスウイルス(modified poxvirus)およびそれを製造し使 用する方法に関する。特に、本発明は、外来遺伝子を挿入し発現させて、免疫不 全症ウイルスに対して免疫応答を誘起するための安全な免疫化媒体として用いら れる改良ベクターに関する。すなわち、本発明は、免疫不全症ウイルスの遺伝子 産物を発現する組換えポックスウイルス、および、投与された宿主またはインビ トロ（例えば、生体外の様式）で、免疫不全症ウイルスに対して免疫応答を誘起 する免疫原性組成物に関し、さらには、該ポックスウイルスの発現産物であって 、それ自身が免疫応答を誘起、例えば抗体を産生するのに有用な生成物に関し、 ここで、該抗体は、血清反応陽性または血清反応陰性の個体において免疫不全症 ウイルス感染に対して有用であり、あるいは、動物またはヒトから単離されるこ とにより、ウイルスまたは感染細胞の検出用の診断キット、試験または分析法を 構築するのに有用なものである。 本出願においては、幾つかの刊行物を参照している。これらの参考文献は、本 明細書の末尾の特許請求の範囲の前にまとめて引用しているか、あるいは、刊行 物について言及している個所においてそれぞれの刊行物を引用している。 発明の背景 外来遺伝子を挿入し発現させるためにはワクシニアウイルス、および最近は、 その他のポックスウイルスが用いられている。生きた感染性ポックスウイルス内 に外来遺伝子を挿入する基本的な手法は、ドナープラスミド内の外来遺伝子をは さむポックスＤＮＡ配列と、レスキューポックスウイルス内に存在する相同配列 との間で組換えを起こすことである（Piccini他、1987）。 詳述すれば、組換えポックスウイルスは、当該技術分野で既知であり、また、 米国特許第４，７６９，３３０号、第４，７７２，８４８号、第４，６０３，１ １２号、第５，１００，５８７号および第５，１７９，９９３号に記載されてい るような方法（これらの特許の開示を参考のために本明細書に引用しておく。） に類似の２つの工程で構築される。 第１の工程として、当該ウイルスに挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列、特に、非− ポックス源からのオープンリーディングフレームが、ポックスウイルスＤＮＡの 一部に相同性なＤＮＡが予め挿入されている大腸菌プラスミド構造体に導入され る。これとは別に、挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列をプロモータに連結してお く。プラスミド構築物におけるプロモーター−遺伝子連結体の位置は、可欠（no nessential）遺伝子座を含有するポックスＤＮＡの領域をはさむＤＮＡ配列に相 同性なＤＮＡが、該プロモーター−遺伝子連結体の両端にあるようにしておく。 このようにして得られたプラスミド構造体は、次いで、大腸菌内で培養、増幅さ れ（Clewell、1972）、単離される(Clewell 他、1969;Maniatis他、1982)。 第２の工程として、挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離後のプラ スミドは、ポックスウイルスとともに、培養細胞、例えば、ニワトリ胚線維芽細 胞に形質導入（トランスフェクト）される。プラスミド内の相同性ポックスＤＮ Ａと、ウイスルゲノムとの間の組換えにより、ポックスウイルスのゲノムの可欠 領域に外来ＤＮＡ配列が存在する改変ポックスウイルスが得られる。「外来(for eign)」ＤＮＡ配列という語は、外因性ＤＮＡ、特に非ポックス源からのＤＮＡ であって、該外因性ＤＮＡが導入されているゲノムによって通常は産生されない 遺伝子産物をコードするＤＮＡを指称する。 遺伝子組換えは、一般に、２つのＤＮＡ鎖間の相同性ＤＮＡ部分の交換である 。ウイルスによっては、ＤＮＡの代わりにＲＮＡとなることもある。核酸の相同 性部分とは、同じ配列の核酸塩基を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の一部分 である。 遺伝子組換えは、本来、感染宿主細胞内で新しいウイルスゲノムが複製または 産生される間に起こる。すなわち、２種またはそれ以上の異なるウイルスまたは 遺伝子構造体で共感染された(co-infected)宿主細胞内で起こり得る。ウイルス 複製サイクル中に、ウイルス遺伝子間の遺伝子組換えが起こる。第１のゲノム由 来のＤＮＡの一部を交換させることにより、この第１のウイルスゲノムに相同性 なＤＮＡを有する第２の共感染性ウイルスのゲノムの一部を構成する。 しかしながら、組換えは、完全に相補的でない異なるゲノムにおけるＤＮＡ部 分間でも起こり得る。第１のゲノム由来のそのようなＤＮＡの一部分が別のゲノ ムの一部分に相同性であるが、その第１のＤＮＡ部分に、例えば、遺伝子マーカ ーや抗原決定基をコードする遺伝子が挿入されて存在されているような場合には 、組換えが起こり得、その組換え産物はそのような遺伝子マーカーや組換えウイ ルスゲノム内の遺伝子により検出されるようになる。最近は、組換えワクシニア ウイルスを調製するためにその他の戦略も報告されている。 感染性改変ウイルスにより、挿入されたＤＮＡ遺伝子配列の発現を成功させる ためには２つの条件が要求される。第１に、ウイルスの可欠領域に挿入を行い、 改変ウイルスの生存性が維持されるようにしなければならない。挿入ＤＮＡの発 現に関する第２の条件は、該挿入ＤＮＡに対して至適な関係にあるプロモータが 存在しているということである。プロモータの位置は、発現されるべきＤＮＡ配 列の上流にあるようにしなければならない。 ワクシニアウイルスは天然痘に対する免疫処置に使用されて成功をおさめ、１ ９８０年には世界的に天然痘を撲滅させた。その歴史の過程でワクシニアの多く の菌株が出現した。これらの異なる菌株は、種々の免疫原性を示し、また、程度 の差はあるが、いろいろな合併症に関連する可能性があるとされ、その最も深刻 なものはワクチン接種後の脳炎と全身性ワクシニアである（Behbehani、1993） 。 天然痘の撲滅に伴い、ワクシニアの新しい役割、すなわち、外来遺伝子を発現 させるための遺伝子工学用ベクターとして役割が重要となった。きわめて多くの 異種抗原をコードする遺伝子がワクシニア内で発現され、その結果、対応する病 原体の投与に対する防御免疫をもたらしたこともしばしばである(Tartaglia他に よる総説、1990a)。 ワクシニアウイルスの遺伝学的背景が、発現される外来免疫原の防御効能に影 響を与えることが示されている。例えば、ワクシニアウイルスのWyeth ワクチン 株内でエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０が発現されても、ＥＢＶ ウイルスで引き起こされるリンパ腫に対してコットントップ（cottontop）タマ リンを防御しなかったが、ワクシニアウイルスのＷＲ研究室株内で同じ遺伝子を 発現させると防御効果があった（Morgan他、1988）。 ワクシニアウイルスベースの組換体ワクチンを得ようとする場合には効力と安 全性との間に精密なバランスをとることがきわめて重要である。組換えウイルス は、ワクチン投与された動物内で防御能のある免疫応答を誘起するが、実質的に 病原性が無いやり方で免疫原を与えなければならない。したがって、ベクター株 を弱毒化することが、現在の技術状況では最も望ましいであろう。 多くのワクシニア遺伝子が、組織培養におけるウイルスの成長に可欠であるこ とが確認されており、それらを削除し不活化することにより、いろいろな動物系 における毒性が減少される。 ワクシニアウイルス チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子について はマッピングが行われ（Hruby 他、1982）、また、配列決定も行われている（Hr uby 他、1993；Weir他、1993）。チミジキナーゼ遺伝子が不活化または完全に欠 失しても、広範な組織培養中でワクシニアウイルスの増殖は妨げられない。また 、ＴＫ- ワクシニアウイルスは各種の投与法により各種の宿主における接種部位 においてインビボ複製する能力を有する。 単純ヘルペスウイルス２型については、ＴＫ- ウイルスをモルモットに膣内投 与すると、ＴＫ+ ウイルスの投与の場合よりも脊髄中のウイルス力価がかなり低 くなることが示された（Stanberry 他、1985）。インビトロでのヘルペスウイル スがコードしているＴＫ活性は、代謝の活発な細胞中ではウイルスの増殖に重要 でないが、静止細胞中ではウイルス増殖に必須であることが示された(gamieson 他、1974)。 ＴＫ- ワクシニアが弱毒化がマウスの脳内投与および腹膜内投与において示さ れた（Buller他、1985）。神経毒性のあるＷＲ実験室株およびWyeth ワクチン株 の双方について弱毒化が認められた。皮内投与されたマウスにおいては、ＴＫ- 組換えワクシニアが、親株のＴＫ+ ワクシニアウイルスと同等の抗ワクシニア中 和抗体を産生したが、これは、この試験系では、ＴＫ機能の喪失がワクシニアウ イルスベクターの免疫原性を有意に減少させないことを示唆している。ＴＫ- お よびＴＫ+ の組換えワクシニアウイルス（ＷＲ株）をマウスに鼻内接種すると、 他の部位（脳を含む）へのウイルスの伝播が有意に減少したことが見出された(T aylor他、1991a)。 ヌクレオチドの代謝に関連する別の酵素は、リボヌクレオチド還元酵素である 。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）内でコードされているリボヌクレオチド還元 酵素の活性が、そのラージサブユニットをコードしている遺伝子を欠失させるこ とにより喪失しても、インビトロの分裂細胞中でのウイルス増殖やＤＮＡ合成は 影響されないが、無血清細胞でのウイルスの増殖能力は極めて損なわれることが 示された（Goldstein 他、1988）。眼部の急性ＨＳＶ感染および三叉神経ガング リオンにおける再活性性潜伏感染に関するマウスモデルを用いた場合、リボヌク レオチド還元酵素のラージサブユニットを欠失したＨＳＶについては、野生型Ｈ ＳＶに比べて毒性が減少することが示された（Jacobson他、1989）。 ワクシニアウイルスにおいては、リボヌクレオチド還元酵素のスモールサブユ ニット（Slabaugh他、1988）およびラージサブユニット（Schmidtt他、1988）の いずれも同定されている。ワクシニアウイルスのＷＲ株にリボヌクレオチド還元 酵素を挿入によって不活化すると、ウイルスの弱毒化がもたらされ、これはマウ スに頭蓋内接種することによって測定される（Child他、1990）。 ワクシニアウイルスの血球凝集素（ＨＡ）遺伝子についてはマッピングおよび 配列決定が行われている（Shida、1986）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子は 、組織培養中の増殖にとって可欠なものである（Ichihashi 他、1971）。ワクシ ニアウイルスのＨＡ遺伝子を不活化すると、頭蓋内投与されたラビットにおいて は神経毒性化が減少し、また、皮膚内投与部位におけるラビットの外傷は小さく なっていた（Shida 他、1988）。ＨＡの遺伝子座を利用して、ワクシニアウイル スのＷＲ株（Shida 他、1987）、Lister株の誘導体（Shida 他、1988）およびCo penhagen株（Guo 他、1989）に外来遺伝子を挿入している。外来遺伝子を発現す る組換えＨＡ- ワクシニアウイルスは、免疫原性があり（Guo 他、1989；Itamur a 他、1990；Shida 他、1988；Shida 他、1987）、また、関連する病原体による 投与に対して防御効果を有する（Guo他、1989；Shida他、1987）ことが示された 。 牛痘ウイルス（Brighton赤色株）は、鶏卵の漿尿膜上に赤色（出血性）痘瘡を 生じさせる。牛痘ゲノム内で自然欠失すると白色痘瘡を生じる突然変異体となる （Pichup他、1984）。出血性機能（ｕ）は、初期遺伝子によってコードされた３ ８ｋＤａのタンパク質によることがマッピングされている（Pickup他、1986）。 この遺伝子は、セリンプロテアーゼインヒビターと相同性を有し、牛痘ウイルス に対する宿主の炎症応答を阻害し（Palumbo 他、1989）、また、血液凝固のイン ヒビターである。 このｕ遺伝子は、ワクシニアウイルスのＷＲ株中に存在する(Kotwal他、1989b )。外来遺伝子を挿入することによりｕ領域が不活化されているＷＲワクシニア ウイルス組換体が接種されたマウスは、ｕ遺伝子が手つかずのままである類似の 組換えワクシニアウイルスが接種されたマウスよりも、該外来遺伝子に対して高 い抗体レベルを産生する（Zhou他、1990）。このｕ領域は、ワクシニアウイルス のCopenhagen株内で欠陥性非機能形態として存在する（Goebel他による報告(199 0a,b)においてＢ１３およびＢ１４と称されているオープンリーディングフレー ム）。 感染細胞内において牛痘ウイルスは、細胞質Ａ型封入体（ＡＴＩ）として局在 化している（Kato他、1959）。ＡＴＩの機能は、動物から動物への伝播に際して 牛痘ウイルス粒子を防護することにあると考えられている（Bevgoin 他、1971） 。牛痘ゲノムのＡＴＩ領域は１６０ｋＤａのタンパク質をコードしており、これ がＡＴＩ封入体のマトリックスを形成する（Funahashi 他、1988;Patel 他、198 7）。ワクシニアウイルスは、そのゲノムに相同領域を含有するが、一般にＡＴ Ｉを産生しない。ワクシニアのＷＲ株においては、ゲノムのＡＴＩ領域は９４ｋ Ｄａのタンパク質として翻訳される（Patel 他、1988）。ワクシニアウイルスの Copenhagen株においては、ＡＴＩ領域に相応するＤＮＡ配列の大部分は欠失され ており、該領域の残存する３´末端はＡＴＩ領域の上流にある配列と融合して、 オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）Ａ２６Ｌを形成する(Goebel他、1990a ,b)。 ワクシニアウイルスゲノムの左末端近傍については、各種の自然欠失（Altenb urger 他、1989；Drillien他、1981；Lai他、1989；Moss他、1981；Paez他、198 5；Panicali他、1981）や人為的欠失が報告されている。１０ｋｂが自然欠失し たワクシニアウイルスのＷＲ株（Moss他、1981；Panicali他、1981）は、マウス に頭蓋内接種することにより弱毒化されることが示された（Buller他、1985）。 後に、この欠失部は１７ケのＯＲＦを含む可能性が示された(Kotwal他、1988b) 。該欠失部内にある特別の遺伝子としては、ビロカインＮ１Ｌおよび３５ｋＤａ タ ンパク質（Goebel他による1990a,b の報告でＣ３Ｌと称されたもの）が挙げられ る。Ｎ１Ｌを挿入して不活化すると、通常のマウスおよびヌードマウスのいずれ についても、頭蓋内接種により毒性が減少する(Kotwa他、1989a)。上記の３５ｋ Ｄａタンパク質は、ワクシニアウイルス感染細胞の培地にＮ１Ｌと同様に分泌さ れる。このタンパク質は、補体コントロールタンパク質群、特に補体４Ｂ結合タ ンパク質（Ｃ４ｂｐ）に相同性である(Kotwal他、1988a)。細胞性Ｃ４ｂｐと同 様に、ワクシニアの３５ｋＤａタンパク質は補体の第４成分と結合し、古典的補 体カスケードを阻害する（Kotwal他、1990）。このように、ワクシニアの３５ｋ Ｄａタンパク質は、該ウイルスが宿主の防御機構を回避するのを助けることに関 与しているものと考えられる。 ワクシニアゲノムの左末端は、宿主域遺伝子として同定された２つの遺伝子、 Ｋ１Ｌ（Gillard他、1986）およびＣ７Ｌ（Perkus他、1990）を含む。これらの 遺伝子の双方が欠失すると、各種のヒト細胞系でワクシニアウイルスの増殖能が 減少する（Perkus他、1990）。 上記以外の２つのワクチンベクター系においては、必然的に宿主が制限されて いるポックスウイルスであるトリポックスウイルスを使用する。ニワトリポック スウイルス（ＦＰＶ：fowlpoxvirus）およびカナリアポックスウイルス（canary poxvirus）の両者に工夫を施して外来遺伝子産物を発現させてきた。ニワトリポ ックスウイルス（ＦＰＶ）は、ポックスウイルス科のトリポックス(Avipox)属の 基本ウイルスである。このウイルスは、家禽類に経済的に重要な疾病を引き起こ すが、１９２０年代から弱毒化生ワクチンを使用することにより対策が講じられ てきた。トリポックスウイルスの複製は鳥類に限られ（Matthews他、1982）、ヒ トを含む非鳥類においてトリポックスウイルスの感染が起こったという文献の報 告は存しない。このように宿主が制限されているので、他の種にウイルスが伝染 することに対する本質的な安全性が確保され、トリポックスウイルス由来のワク チンベクターは魅力ある手段として動物やヒトへ応用される。 ＦＰＶは、家禽類病原体由来の抗原を発現するベクターとして使用されると有 利である。毒性トリインフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質がＦＰＶ組 換体で発現された(Taylor他、1988a)。この組換体をニワトリおよび七面鳥に接 種すると、同種または異種の毒性インフルエンザウイルスのいずれの投与に対し ても防御能のある免疫応答が誘起された(Taylor他、1988a)。ニューカッスル病 ウイルスの表面糖タンパク質を発現するＦＰＶ組換体も開発された（Taylor他、 1990；Edbauer他、1990）。 宿主制限によりＦＰＶおよびＣＰＶの複製は鳥類系に限られているにも拘わら ず、これらのウイルスから誘導された組換体が、非鳥類起源細胞においては外来 遺伝子を発現することが見出された。さらに、そのような組換体ウイルスは、該 外来遺伝子産物に対する免疫学的応答を引き起こし、場合によって、相応する病 原体による投与に対する防御能を有することが示された(Tartaglia他、1993a,b ；Taylor他、1992；1991b；1988b)。 １９８３年、ヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ１）がエイズの原因物質で あることが同定された。１２年が経過し、多くの世界中の努力にも拘わらず、効 果的なＨＩＶ１ワクチンは未だ入手できない。しかしながら、最近になって、効 果的なＨＩＶ１ワクチンを得る可能性のあることが幾つかの報告で示唆されてい る。例えば、あるワクチン接種法によりサル免疫不全症ウイルス(ＳＩＶ：Simia n immunodeficiency virus)投与に対してマカクが防御されており、このワクチ ン接種法では、ＳＩＶのｇｐ１６０糖タンパク質を発現するワクシニアウイルス 組換体で１次免疫を行い、さらに、精製しなＳＩＶｇｐ１６０糖タンパク質でブ ースター免疫を行っている（Hu他、1992）。さらに、ＨＩＶ１ｇｐ１２０サブユ ニットワクチンを用いることによりＨＩＶ１の投与に対してチンパンジーが防御 された（Berma他、1990）。また、不活化ＨＩＶ１、ｇｐ１６０および／または Ｖ３ペプチドまたはｇｐ１６０、ｐ１７（Gagタンパクの１種）および／または Ｖ３ペプチドを多回注射するワクチン接種によっても、ＨＩＶ１投与に対してチ ンパンジーが防御された（Girard他、1991）。ｇｐ１６０、ｐ１７、ｐ２４（Ga gタンパクの１種）、Ｖｉｆ、Ｎｅｆおよび／またはＶ３ペプチドを多回注射す る同様のプロトコールによっても、ＨＩＶ１感染細胞の投与に対してチンパンジ ーが防御された（Fultz他、1992）。さらに、ＨＩＶ１ Ｖ３に特異的な抗体を 注入することにより、チンパンジーは受動免疫防御された（Emini他、1992）。 これらのワクチン接種プロトコールにおいては、ＨＩＶ１またはＳＴＶのエン ベロープ（表面膜）糖タンパク、特に、エンベロープ糖タンパクのＶ３エピトー プに対して免疫応答を誘起することに重点が置かれてきた。不幸なことには、Ｈ ＩＶ１の菌株が異なると、遺伝子や抗原性、特にエンベロープ糖タンパクにおけ るそれらが広範囲に変異する。したがって、効果的なＨＩＶ１ワクチンは、単一 のＨＩＶ１抗原、または単一のＨＩＶ１抗原の単一のエピトープだけでなく、そ れらの多くに対して免疫応答を誘起させることが必要であろう。 Ｂ細胞エピトープにおいては配列が広く変異していることが認められるのに対 して、Ｔ細胞エピトープは比較的保存されている。例えば、ＨＩＶ１ｇｐ１６０ （ＬＡＩ株）を発現するワクシニアウイルスを接種し精製ＨＩＶ１ ｇｐ１６０ （ＬＡＩ）を追加免疫したＨＩＶ１に血清反応陰性の個体から単離した細胞毒性 リンパ球（ＣＴＬ）クローンは、ＨＩＶ１のＭＮまたはＲＦエンベロープ糖タン パク質を発現する標的細胞を効率的に溶菌し、ＨＩＶ１ ＬＡＩエンベロープ糖 タンパク質を発現する細胞も同様に溶菌する（Hammond他、1992）。したがって 、比較的保存されているＴ細胞エピトープに対して免疫応答を誘起するワクチン は、同種の感染に対して効果的であるのみならず、異種の感染に対しても効果的 であるかも知れない。 ＳＩＶに対してマカクをワクチン接種するのに採用した上述の方式に類似する １次免疫−ブースター免疫プロトコールに従い、ＨＩＶ１ ｇｐ１６０を発現す るＡＬＶＡＣ組換体（ｖＣＰ１２５）を用いてＨＩＶ１に血清反応陰性の個体に ワクチン接種した。これらのＡＬＶＡＣをベースとしたプロトコールでは、サブ ユニットをブースター免疫すると、ｖＣＰ１２５が、ＨＩＶ１エンベロープに特 異的なＣＤ８+ ＣＴＬを誘起し且つエンベロープに特異的な体液応答を増強する 能力を有することが認められた（Pialoux他、1995）。これらの結果は、ＡＬＶ ＡＣに基づく組換えＨＩＶ１ワクチンに対する根拠となっている。 ヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ１）に感染した個体は、当初、ＨＴＶ１ に特異的な中和抗体およびＨＩＶ１に特異的なＣＴＬを含む比較的強い抗ウイル ス性免疫応答を示す。しかしながら、このような応答にも拘わらず、きわめて多 くのＨＩＶ１感染者は、ＨＩＶ１関連疾病により実際には死亡してしまう。多く のＨＩＶ１感染者により起こされる免疫応答が防御機能を有しないことを考える と、有効な免疫応答とは、その免疫応答が変化または修正して、ＨＩＶ１感染者 により通常または多くは認められないようなＨＩＶ１エピトープに抗するように なることが必要であるのかも知れない。 ＨＩＶ１に血清反応陽性の個体にありＨＩＶ１感染細胞に結合することのでき るＨＩＶ１特異性抗体の約４０％は、ＨＩＶ１エンベロープ糖タンパクの第３の 可変領域（Ｖ３）に特異的である（Spear他、1994）。この結果は、Ｖ３ループ が1)免疫原性が高く、また、2)感染細胞の表面上に露出されていることを示唆し ている。Ｖ３ループのアミノ酸配列は、ＨＩＶ１単離源が異なると非常に相違す る。すなわち、配列が緩やかに相違してエンベロープ糖タンパクのこの領域の構 造や免疫原性を変化させているようではない。Ｖ３領域は免疫原性が高く、その 構造と免疫原性は、配列変化により大きく影響されないので、エンベロープ糖タ ンパクのこの領域が、通常は非免疫原性のエピトープまたは異種エピトープを免 疫系に提供する免疫原性プラットホームとして有用であるかもしれない。 ＨＩＶ１に血清反応陽性の個体由来の血清は、実験室で適応化されたＨＩＶ１ 菌株を中和することができる。このような血清は、また、ＨＩＶ１の初代単離物 を中和することもできる（但し、力価を１００倍以上高めることが必要である） 。逆に、ＨＩＶ１ ｇｐ１２０でワクチン接種された個体由来の血清は、ＨＩＶ １の実験室適応化株を中和することができる（但し、血清反応陽性のヒト由来の 血清に比べて力価を１０倍以上高めることが必要である）が、初代単離物を（分 析可能なレベルで）中和することはできない（Hanson、1994）。血清反応陽性の 個体およびｇｐ１２０を接種した個体由来の血清に見出される中和活性の有意部 分は、Ｖ３ループに特異的なようである（Spear 他、1994；Berman他、1994）。 Ｖ３は高変異性であること、また、この領域に対する抗体は、ＨＩＶ１の初代単 離物や異種株を中和することができないかも知れないことを考えると、Ｖ３以外 のエピトープ、すなわち、初代単離物を含む広範囲のＨＩＶ１菌株を中和するこ とのできるエピトープに対して免疫応答を誘起するワクチンを開発することが必 要であろう。 ＨＩＶ１初代単離物および広範囲の実験室適応化ＨＩＶ１株を中和する能力を 有するモノクローナル抗体が分離された（Conley他、1994；Katinger他、1992） 。 このモノクローナル抗体によって認識されるエピトープは、ＨＩＶ１ ｇｐ４１ の６６２〜６６７間のアミノ酸にあることがマッピングされ、アミノ酸配列ＥＬ ＤＫＷＡを有する（Buchacher他、1994）。配列情報が誘導されたＨＩＶ１のい ろいろな菌株（種々のＨＩＶ１クレード由来の菌株を含む）の約８０％は、この エピトープのコア結合性配列ＬＤＫＷを発現する（Conley他、1994）。したがっ て、このエピトープは、Ｖ３ループとは異なり、比較的保存性が高いものと考え られる。不幸なことに、このエピトープは、その通常の形態では、免疫原性が大 きくない。ＨＩＶ１に血清反応陽性のヒトの僅か５０％が、このエピトープを含 有するｇｐ４１領域に対して検知可能な抗体応答を有する（Broliden他、1992） 。 以上のことから理解されるように、免疫不全症ウイルスの組換えポックスウイ ルス、あるいは、宿主に投与したときに免疫不全症ウイルス感染に対して免疫応 答を誘起する免疫原性組成物であって、特に、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣに基 づく組換体のように安全性が高く、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇ ｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬエピトー プ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬエピトープ；例えば、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ） （ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆＣＴＬ１ 、ｎｅｆＣＴＬ２、ｐｏｌ１（ｐｏｌＣＴＬ１）、ｐｏｌ２（ｐｏｌＣＴＬ２） ，ｐｏｌ３（ｐｏｌＣＴＬ３）、ＥＬＤＫＷＡまたはＬＤＫＷエピトープのいず れかまたは全てを、特に、免疫原性を与えるような形でコードし、または、それ らを任意に組み合わせて、例えば、それらの全てを組み合わせたような組成物が 得られれば、現在の技術レベルを前進させるきわめて望ましいものとなるであろ う。 発明の目的および概要 したがって、本発明の目的は、安全性の向上した改変組換えウイルスを提供し 、且つ、そのような組換えウイルスを製造する方法を提供することにある。 本発明の別の目的は、既知の組換えポックスウイルスワクチンに比べて安全性 のレベルが高くなった組換えポックスウイルス抗原、ワクチンまたは免疫学的組 成物を提供することにある。 本発明のさらに別の目的は、宿主内で遺伝子産物を発現するための改変ベクタ ーであって、該宿主内で弱毒化された毒性を有するように改変されたベクターを 提供することにある。 本発明の他の目的は、安全性のレベルが高くなった改変組換えウイルスまたは 改変ベクターを用いて、インビトロ培養細胞内で遺伝子産物を発現させる方法を 提供することにある。 本発明のこれらの目的およびその他の目的ならびに効果は、以下の記述から一 層明らかになるであろう。 一つの態様として、本発明は、改変組換えウイルスであって、該ウイルスにコ ードされている遺伝子機能が不活化されていることにより毒性が弱毒化され安全 性が高められた組換えウイルスに関する。その遺伝子機能は、可欠的なものであ る場合もあれば、毒性に関連している場合もある。ウイルスとしてはポックスウ イルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルス、例 えばニワトリポックスウイルスまたはカナリアポックスウイルスである。この改 変組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの可欠領域に、免疫不全性ウイルス由 来の抗原もしくはエピトープおよび／またはＣＴＬエピトープ、例えば、ＨＩＶ １ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン ）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、ＥＬＤＫＷＡ、ＬＤ ＫＷエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは、それらの全ての組 合せをコードする外来ＤＮＡ配列を含み得る。 他の態様として、本発明は、接種された宿主動物内に免疫応答を誘起する抗原 性、免疫原性、ないしはワクチン組成物または治療用組成物に関し、該ワクチン は、担体と改変組換えウイルスとを含み、該組換えウイルスは、ウイルスにコー ドされている可欠遺伝子機能が不活化されていることにより毒性が弱毒化され安 全性が向上している。本発明に従うこの組成物に用いられるウイルスはポックス ウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルス、 例えば、ニワトリポックスウイルスまたはカナリアポックスウイルスである。こ の改変組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの可欠領域に、抗原性タンパク質 、例えば、免疫不全症ウイルス由来のものおよび／またはＣＴＬ、例えば、ＨＩ Ｖ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレ ン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、ＥＬＤＫＷＡ、Ｌ ＤＫＷ エピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは、それらの全ての組合せ をコードする外来ＤＮＡ配列を含み得る。 さらに別の態様として、本発明は、改変組換えウイルスを含有する免疫原性組 成物に関し、該改変組換えウイルスは、ウイルスにコードされている可欠遺伝子 機能が不活化されていることにより毒性が弱毒化され安全性が高められている。 この改変組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの可欠領域に、抗原性タンパク 質（例えば、免疫不全症ウイルス由来のものおよび／またはＣＴＬ、例えば、Ｈ ＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブ レン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、ＥＬＤＫＷＡ、 ＬＤＫＷエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは、それらの全て の組合せ）をコードする外来ＤＮＡ配列を含み、該組成物は、宿主に投与される と、該抗原に特異的な免疫学的応答を誘起する能力を有する。 別の態様として、本発明は、毒性が弱毒化されているが安全性が高められた改 変組換えウイルスを細胞［例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ節 単核細胞（ＬＮＭＣ）］に導入することにより、該細胞内でインビトロに遺伝子 産物を発現させる方法に関する。この改変ウイルスは、そのウイルスゲノムの可 欠領域に、免疫不全性ウイルス由来の抗原もしくはエピトープおよび／またはＣ ＴＬ、例えば、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（ ＋トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ 、ＥＬＤＫＷＡ、ＬＤＫＷエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましく は、それらの全ての組合せをコードする外来ＤＮＡ配列を含み得る。そのような 細胞は、その後、個体内に直接再注入されるか、または特異的なＣＤ８+ ＣＴＬ 反応活性を増加させるのに用いられて再注入に供される（半生体外治療）。 別の態様として、本発明は、インビトロ培養される細胞に、毒性が弱毒化され 安全性が高められた改変組換えウイルスを導入することにより該細胞内で遺伝子 産物を発現させる方法に関する。この改変組換えウイルスは、そのウイルスゲノ ムの可欠領域に、抗原性タンパク質、例えば免疫不全性ウイルス由来のもの例え ば、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランス メンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、ＥＬＤＫ ＷＡ、ＬＤＫＷエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは、それら の全ての組合せをコードする外来ＤＮＡ配列を含み得る。得られた遺伝子産物は 、ヒトまた動物に投与されて免疫応答を刺激することができる。産生された抗体 は、各個体内で免疫不全症ウイルスの予防および治療に有用であり、また、動物 由来の抗体は、診断キット、アッセイまたはテストに用いられて、血清のような サンプル中の免疫不全症ウイルスまたはＣＴＬ抗原の有無（したがって、免疫応 答すなわち抗体を生じたウイルスの有無）を測定するのに用いることができる。 さらに別の態様として、本発明は改変組換えウイルスに関し、該組換えウイル スは、ウイルスにコードされている可欠遺伝子機能が不活化されていることによ り毒性が弱毒化されており、さらに、ウイルスゲノムの可欠領域に外因性のＤＮ Ａを含有している。このＤＮＡは、免疫不全症ウイルスおよび／またはＣＴＬ抗 原、例えば、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋ トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、 ＥＬＤＫＷＡ、ＬＤＫＷエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは 、それらの全ての組合せをコードすることができるものである。特に、遺伝子機 能の不活化は、毒性因子をコードするオープンリーディングフレームを欠失させ ることにより、または、自然の宿主制限ウイルスを利用することによって行われ る。本発明に従って用いるウイルスは、ポックスウイルスが有利であり、特にワ クシニアウイルスまたはアビポックスウイルス、例えばニワトリポックスウイル スまたはカナリアポックスウイルスである。オープンリーディングフレームは、 Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、およびＩ ４Ｌ（Goebel他による1990a,bの報告における用語による）から成る群、ならび にそれらの組合せより選択されるのが好ましい。この点に関し、オープンリーデ ィングフレームは、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血 球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域もしくはリボヌクレオチド還元酵素のラージ サブユニット、またはそれらの組合せから成る。ＮＹＶＡＣとして同定されたワ クシニアウイルスの改変Copenhagen株（Tartaglia他、1992）が使用される。し かしながら、ＣＯＰＡＫ株も本発明を実施するのに用いることができる。 最も好ましくは、本発明の組換えウイルスにおいて、外来ＤＮＡは、ＨＩＶｇ ａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、 ２つのｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、および３つのｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬエピト ープをコードし、または、外来ＤＮＡは、ＥＬＤＫＷＡまたはＬＤＫＷエピトー プをコードするものであり、そして、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０の領域で発現 されるように挿入され（すなわち、該外来ＤＮＡは、Ｖ３ループにおいてＥＬＤ ＫＷＡまたはＬＤＫＷ改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０、例えばＥＬＤＫＷＡも しくはＬＤＫＷまたはそれらの一方または両方の繰り返しをコードするものであ る）、この結果、該エピトープが免疫原性を有する形態で発現される。この最も 好ましい態様においても特に好ましいのは、２つのｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬエピ トープと３つのｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬエピトープが、ＣＴＬ１、ＣＴＬ２、 ｐｏｌ１、ｐｏｌ２およびｐｏｌ３であることである。別の好ましい態様におい ては、外来ＤＮＡがＨＩＶ１ｇｐ１２０＋ＴＭをコードし、Ｖ３ループが改変さ れて少なくとも１つ、好ましくは２つのＥＬＤＫＷＡエピトープを含有する場合 である。 別の態様として、本発明は、ＨＩＶ免疫原および改変ｇｐ１６０またはｇｐ１ ２０を包含する。すなわち、本発明は、ＨＩＶ免疫原、好ましくは、ＨＩＶｇａ ｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎ ｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、およびＥＬＤＫＷＡまたは ＬＤＫＷエピトープから成る群より選ばれるＨＩＶ免疫原を含む。ＨＩＶ免疫源 はｇｐ１６０またはｇｐ１２０の一部であってもよい。かくして、例えば、ＨＩ Ｖ免疫原ＥＬＫＤＫＷＡまたはＬＤＫＷＡは、ｇｐ１２０の領域またはｇｐ１６ ０の領域の一部、例えば、ｇｐ１２０Ｖ３の一部となることができる。したがっ て、本発明は、ｇｐ１６０に本来は存在していないエピトープを含有するように 改変されたｇｐ１２０またはｇｐ１６０を包含する。エピトープは、Ｂ細胞エピ トープであってよい。特に、エピトープは、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩ Ｂ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ 、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、およびＥＬＤＫＷＡまたはＬＤＫＷエピトープの 少なくとも１つとすることができる。Ｖ３ループ内でｇｐ１２０を改変すること ができる。これらの免疫原や改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０は、任意の適当な ベ クター、例えば本発明の組換体のようなポックスウイルス；または、Merrifield 合成法のような適当な化学合成法により合成することができる。 本発明は、さらに別の態様として、本発明による組換えポックスウイルスの発 現産物およびその使用、ならびに、本発明に従う免疫原や改変ｇｐ１２０および ｇｐ１６０の使用、例えば、治療、予防、診断または試験に用いられる抗原性組 成物、免疫原性組成物ないしはワクチン組成物を調製することに関する。さらに 、本発明は、本発明の組換体由来のＤＮＡを、サンプル中のＨＩＶ ＤＮＡの有 無を検知するためのプロープとして使用したり、適当な発現プラスミドを用いる ＤＮＡ免疫法に利用することに関する。 これらの態様およびその他の態様は、以下の詳細な説明に含まれ、それから明 らかであろう。 図面の簡単な説明 下記には、本発明を、例を挙げて詳しく説明してあるが、本発明はここで挙げ た実施例に限定されるものではない。下記に示した図面を参照することで、本発 明の理解が深まるであろう。 図１はチミジンキナーゼ遺伝子を欠失させるためのプラスミドpSD460を構築し 、組み換えワクシニアウイルス・vP410を作製する方法を図式化して示したもの である。 図２は毒性部位を欠失させるためのプラスミドpSD486を構築し、組み換えワク シニアウイルスvP553を作製する方法を図式化して示したものである。 図３はＡＴＩ部位を欠失させるためのプラスミドpMP494△を構築し、組み換え ワクシニアウイルスvP618を作製する方法を図式化して示したものである。 図４は赤血球凝集素遺伝子を欠失させるためのプラスミドpSD467を構築し、組 み換えワクシニアウイルスvP723を作製する方法を図式化して示したものである 。 図５は遺伝子クラスタ[C71-k1l]を欠失させるためのプラスミドpMPCK1△を構 築し、組み換えワクシニアウイルスvP804を作製する方法を図式化して示したも のである。 図６はリボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニットを欠失させるためのプラ スミドpSD548を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP866を作製する方法を図 式 化して示したものである。 図７は狂犬病ウイルス糖タンパク質・Ｇ遺伝子をＴＫ欠失遺伝子座に挿入させ るためのプラスミドpRW842を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP879を作製 する方法を図式化して示したものである。 図８はＣ５オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むカナリアポックス ウイルスPvuII断片のＤＮＡ塩基配列(配列番号66)を示したものである。 図９Ａ，９Ｂは組み換えカナリアポックスウイルスvCP65(ALVAC-RG)を構築す る方法を図式化して示したものである。 図１０はＮＹＶＡＣを作製するために欠失したＯＲＦを図式化して示したもの である。 図１１はＦ８のＯＲＦを含むＴＲＯＶＡＣ・ＤＮＡの断片のヌクレオチド塩基 配列(配列番号67)を示したものである。 図１２はＦ７のＯＲＦを含むＴＲＯＶＡＣ・ＤＮＡの2356塩基対断片のＤＮＡ 塩基配列(配列番号68)を示したものである。 図１３Ａ−１３Ｄは同じかまたは別のワクチン（０日目、２８日目、１８０目 にワクチンを投与し、投与後０、７、２８、３５、５６、１７３、１８７、２０ ８日目に抗体価測定）のいずれかで事前に免疫したボランティアにおける狂犬病 ウイルス中和抗体価(RFFIT，IU/ml)、ＨＤＣおよびｖＣＰ６５(10^5.5TCID₅₀)の 追加免疫効果をグラフ化したものである。 図１４Ａ−１４ＤはpHIV32(配列番号78)に含まれるＨ６でプロモートされたＨ ＩＶＩ・ｇｐ１２０（+トランスメンブレン）遺伝子、Ｉ３Ｌでプロモートされ たＨＩＶＩgag(+pro)遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したものである。 図１５Ａ−１５ＦはpVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオ チド塩基配列を示したものである。 図１６はp2-60-HIV.3(配列番号91)におけるＩ３Ｌでプロモートされたｎｅｆ ・ＣＴＬ２エピトープおよびＨ６でプロモートされたｎｅｆ・ＣＴＬ１エピトー プのヌクレオチド塩基配列を示したものである。 図１７Ａ−１７ＣはpC6L(配列番号92)におけるＣ６遺伝子座のヌクレオチド塩 基配列を示したものである。 図１８Ａ−１８ＢはpC5POLT5A(配列番号105)に含まれるＩ３Ｌでプロモートさ れたpol2エピトープ、Ｈ６でプロモートされたpol1エピトープ、４２Ｋでプロモ ートされたpol3エピトープのヌクレオチド塩基配列を示したものである。 図１９Ａ−１９ＣはpNC5L-SP5(配列番号 106)におけるＣ５遺伝子座のヌクレ オチド塩基配列を示したものである。 図２０はALVAC,vCP205,またはペプチドCLTB-36による免疫後におけるＨＩＶエ ンベロープ糖タンパク質に対するウサギ抗体反応を示したものである。 図２１はALVAC,vCP205,またはペプチドCLTB-36による免疫後におけるＨＩＶ・ ＭＮ・Ｖ３ループに対するウサギ抗体反応を示したものである。 図２２はALVAC,vCP205,またはペプチドCLTB-36による免疫後におけるＨＩＶエ ンベロープ糖タンパク質に対するモルモット抗体反応を示したものである。 図２３はALVAC,vCP205,またはペプチドCLTB-36による免疫後におけるＨＩＶ・ ＭＮ・Ｖ３ループに対するモルモット抗体反応を示したものである。 図２４はＨＩＶ血清反応陽性者（患者１）のＰＢＭＣ・ＨＩＶー１特異的ＣＴ Ｌのin vitroでの刺激結果を示したものである。 図２５患者２における図２４の内容を示したものである。 図２６ａ−ｃはpHIV59およびvCP1307に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩ ＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに)遺伝子(配列番号 124) および発現タンパク質(配列番号125)のヌクレオチド塩基配列を示したものであ る。 図２７はvC1307感染細胞について、ＦＡＣＳ分析結果を示したものである（Ｈ ＩＶ１血清反応陽性者の血清由来のALVAC，vP1286またはvCP1307に感染したＨｅ Ｌａ細胞[上のパネル]または、ＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的なヒトモノクロ ーナル抗体、IMA41-2F5[下のパネル]についてＦＡＣＳ分析を行った）。 図２８ａ−ｃはpHIV60およびvP1313に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶ Ｉ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに)遺伝子(配列番号 126)お よび発現タンパク質(配列番号127)のヌクレオチド塩基配列を示したものである 。 図２９はvP1313感染細胞について、ＦＡＣＳ分析結果を示したものである（Ｈ ＩＶ１血清反応陽性者の血清由来のNYVAC，vP1286またはvP1313に感染したＨｅ Ｌａ細胞[上のパネル]、または、ＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的なヒトモノク ロ ーナル抗体、IAM41-2F5[下のパネル]についてＦＡＣＳ分析を行った）。 図３０ａ−ｃはpHIV61およびvP1319に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶ Ｉ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに)遺伝子(配列番号 128)お よび発現タンパク質(配列番号128)のヌクレオチド塩基配列を示したものである 。 図３１はvP1319感染細胞について、ＦＡＣＳ分析結果を示したものである（Ｈ ＩＶ１血清反応陽性者の血清由来のWR，vP1286またはvP1319に感染したＨｅＬａ 細胞[上のパネル]または、ＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的なヒトモノクローナ ル抗体、IMA41-2F5[中段のパネル]、Ｖ３ループ、に特異的なマウスモノクロー ナル抗体50.1についてＦＡＣＳ分析を行った）。 図３２、３３ａ，３３ｂ，３３ｃ，３４，３５，３６，３７ａ，３７ｂ，３７ ｃ，３８ａ，３８ｂ，３８ｃはvCP205およびプラセボ（placebo）（図３２）を 接種したサルにおける体重（図・３２）、血球計算（図３３ａ−ｃ）、クレアチ ニン（図３４）、ＳＧＯＴ（図３５）、ＳＧＰＴ（図３６）、ＥＬＴＳＡ（Anti -gp160 Mn/BR，-V3MN，-p24，図３７ａ−ｃ、３８ａ−ｃ）の比較を示したもの である。上部パネル＝サル １ー４、プラセボ；下部パネル＝サル ５ー８ vCP 205；サル：１＝白四方形、２＝白ひし形、３＝白三角形、４＝白マル、５＝黒 四方形、６＝黒ひし形、７＝黒三角形、８＝黒マル；縦軸は体重（ｗｔ）、横軸 は週（矢印の点で接種実施）。図３３ａ：白血球：左上と底部パネル＝サル １ ー４，プラセボ；右上と底部＝サル５ー８、vCP205；上端パネル：各ＷＢＣ数、 小さな黒マルが平均値（ｍ）であることを除いては、図３２と同じ；下段パネル 示差細胞数、黒四方形＝顆粒球、白四方形＝リンパ球、黒ひし形＝単球。図３３ ｂ：レイアウトと表示は図３３ａと同様。上部パネルが赤血球、下部パネルが平 均血球数、平均は、黒マルで表示。図３３ｃ：レイアウトは図３３ｂと同じ。上 部パネルがヘマトクリット、下部パネルがヘモグロビン。図３４で、上部棒グラ フはサル１−４、プラセボ；下部棒グラフ＝サル５−８、vCP205；mg/1対日数、 矢印は接種実施日を示す。サル１と５＝黒棒、サル２と６＝二点描棒（反対方向 に斜線）、サル３と７＝ドット棒、サル４と８＝一点描棒（１つの方向に斜線） 、平均は黒マル。図３５：図３４と表示は同じ。但し、縦軸がIU/l、横軸が日数 。図３６：図３５と表示は同じ。図３７ａ−ｃと図３８ａ−ｃ：プラセボを投与 し たサルおよびvCP205を投与したサルでのＥＬＩＳＡ分析結果、（図３８ａ−ｃ） 、縦軸が抗体価（対数）横軸が週。矢印は注射実施を示す。図３７ａと３８ａ＝ anti-gp160MN/BRU。図３７ｂと３８ｂ＝anti-V3MN。図３７ｃと３８ｃ＝anti-p2 4；サル１と５＝白マル；サル２と６＝黒マル；サル３と７＝白逆三角形；サル ４と８＝黒逆三角形。 図３９はvCP205接種のサルにおけるanti-HIVI(MN)中性化抗体価を示したもの である（表示は図３８ａ−ｃと同じ）。 図４０，４１ａ，４１ｂ，４１ｃ，４２，４３ａ，４３ｂ，４３ｃ，４３ｄ， ４４ａ，４４ｂ，４５ａ，４５ｂ，４６ａ，４６ｂ，４７ａ，４７ｂは白血球数 （図４０）、血球計算（赤血球、図４１ａ、ヘマトクリット４１ｂ、網状赤血球 図４１ｃ）、プロトロンビン（図４２）、生化学結果（総コレステロール、総タ ンパク、グルコース、図４３ａ；ナトリウム、カリウム、図４３ｂ、クレアチニ ン、ビリルビン図４３ｃ；ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、アルカリ性ホスファターゼ、図 ４３ｄ）、gp160 MN/BRU ELISA（対照図４４ａ、試験動物図４４ｂ）、V3 MN EL ISA（対照図４６ａ、試験動物図４６ｂ）、ｖＣＰ３００とプラセボを接種した サルにおけるnef ELISA（対照図４７ａ、試験動物図４７ｂ）（図４０：レイア ウトは図３３Ａと同じ。表示は、上部パネルにおいて、平均値がドットマル（左 ）と白いマル（右）であり、下部パネルでは、パーセントの代わりに小数が使用 され、黒四方形が好中球、白ひし形が好酸球、黒三角形が好塩基球である以外は 図３３ａと同じである。図４１ａ：レイアウトは図３３ｂと同じ、表示は、平均 がドットマル（左）と白マル（右）である以外は図３３ａと同じである。図４１ ｂは図３３ｃと同じであり、表示は図４１ａと同じである。図４１ｃ：レイアウ トも表示も図４１ｂと同様で、上部パネルが網状赤血球、下段パネルが血小板で ある。図４２：上段パネルがプラセボ、下段パネルがｖＣＰ３００、表示は４１ ｃと同様。図４３ａ：最上段がコレステロール、中段がタンパク質、下段がグル コース、白マルがプラセボ、黒マルがｖＣＰ３００である。図４３ｂ：最上段が ナトリウム、下段がカリウム、表示は４３ａである。図４３ｃ：最上段がクレア チニン、下段がビリルビン、表示は図４３ａと同様。図４３ｄ：最上段がＳＧＯ Ｔ、中断がＳＧＰＴ、下段がアルカリ性ホスファターゼ、表示は図４３ａと同様 。図４４ ａ、図４４ｂ：gp160 MN/BRU ELISA、対照とｖＣＰ３００。表示は３７ａと３８ ａとそれぞれ同じ。図４５ａと図４５ｂ：v3 MN ELISA、対照とｖＣＰ３００、 表示は３７ｂと３８ｂとそれぞれ同じ。図４６ａと４６ｂ：p34，ELISA，対照と ｖＣＰ３００，表示は図３７ｃと３８ｃと同様。図４７ａと４７ｂ：nef ELISA 、対照とｖＣＰ３００，表示は図４４ａー４６ｂと同様。 発明の詳細な説明 新しいワクシニア・ウイルス・ワクチン株ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を開発す るために、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン株を、すでに既知であ るか、または、潜在的な毒性要素をコードしているゲノムの中の６個の非必須部 位を欠失させることで改良を行った。ここで採用した、一連の欠失法について下 記に説明する。ワクシニア制限断片のすべての、オープンリーディングフレーム 、ヌクレオチドの位置の命名については、Geobelらが報告している(1990a,b)用 語に準じている。 欠失遺伝子座を、外来の遺伝子の挿入のための受容遺伝子座となるように操作 した。下記リストは、ＮＹＶＡＣから欠失させる遺伝子、部位を示したものであ る。また、この中には、ワクシニア組換体(vP)から欠失する遺伝子、部位を略字 で示したもの、欠失部位のオープンリーディングフレーム(Goebelら、1990a,b) が含まれる。 （１）チミジンキナーゼ遺伝子(TK; J2R)、vP410 （２）毒性部位（u;B13R +B14R）vP553 （３）Ａタイプ細胞封入体(ATI;A26L)vP618 （４）赤血球凝集素遺伝子(HA; A56R)vP723 （５）宿主範囲域遺伝子部位(C7L-KIL)vP804 （６）リボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニット(I4L)vP866（ＮＹＶＡＣ） ＮＹＶＡＣは、遺伝子操作技術により、１８個の毒性遺伝子をコードしている オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と宿主範囲を欠失させることで作製し たワクシニアウイルスである。このＮＹＶＡＣは多くの基準によって高度に弱毒 化されている。弱毒化させる場合の基準としては、（ｉ）新生マウスの大脳内に 接種した後の減少された毒性、（ｉｉ）遺伝的(NU+/NU+)免疫不全マウスまたは 化 学的（シクロホスファミド）免疫不全マウスにも接種可能であること、（ｉｉｉ ）免疫不全マウスに接種しても播種感染を引き起こさないものであること、（ｉ ｖ）重大なウサギの皮膚の硬化や腫瘍化を起こさないこと、（ｖ）接種部位から 速やかに消失すること、（ｖｉ）ヒトを含む組織培養細胞における複製能力が減 少されていることがある。このように弱毒化されたものであるにもかかわらず、 ＮＹＶＡＣをベースにしたベクターは、外来性の免疫原に優れた免疫応答を示し 防御免疫を提供している。 ＴＲＯＶＡＣは弱毒化ニワトリポックスウイルスのことで、ニワトリポックス ウイルスのＦＰ−１ワクチン株由来のプラーククローン化分離菌であったもので あり、１日齢鶏の接種用にその使用が許可されているものである。ＡＬＶＡＣは 弱毒化カナリアポックスウイルスをベースにしたベクターであり、これはすでに 使用許可されているカナリアポックスウイルスであるカナポックス(Kanapox)(Ta rtagliaら、1992)のプラーククローン化誘導体であったものである。ＡＬＶＡＣ には、カナポックスの一般特性の一部と類似した特性がある。外来性の免疫原を 発現させるＡＬＶＡＣをベースにした組み換えウイルスもワクチンベクターとし て有効であることはすでに認められていることである(Tartaliaら、1993 a,b)。 このアビポックスベクターは、生産的な複製のためには、鳥類種に限定して使用 される。ヒトの細胞培養では、カナリアポックスウイルス複製が、ウイルス複製 サイクルの中の、ウイルスＤＮＡ合成の前に、早期に中止してしまう。それにも かかわらず、このウイルスを外来性免疫原が発現するように操作すると、哺乳動 物細胞中でin vitroの真正発現とプロセシングが観察され、これを種々の哺乳動 物種に接種した場合には、外来免疫原に対する抗体を誘導し細胞免疫応答を示し 、さらに、同種病原体に対する防御作用をするのである(Tayler ら、1992;Tayle r等、1991)。カナリアポックスウイルス／狂犬病ウイルス糖タンパク質組換体（ ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）に関するヨーロッパとアメリカでの最近のフェーズＩ・臨床 試験では、患者はこの実験ワクチンに十分な耐えて、しかも、狂犬病ウイルス中 和抗体価がその予防可能レベルにまで達した(Cadozら、1992,Friesら、1992)。 さらに、ＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種者由来の末梢血管単核細胞(PBMC)に対して、精 製した狂犬病ウイルスで刺激すると、そのリンパ球増殖も有意なレベルに達した (Friesら、 1992)。 これらＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣは、ウイルスやベクターの病原 性という観点から、それらの使用上の安全手順ガイドラインやウイルスやベクタ ーなどの遺伝子物質の物理的封じ込めに関するガイドラインを出している米国国 立衛生研究所（ＮＩＨ）と米国組み換えＤＮＡ諮問委員会は、これら３つについ て、その物理的封じ込めレベルをＢＳＬ２レベルからＢＳＬ１レベルに緩和した という点で、ポックスウイルスの中では独特なものとして認識されるものである 。物理的封じ込めレベルがＢＳＬ１であるポックスウイルスは他にない。通常使 用されているポックスウイルスであるワクシニアウイルスのコペンハーゲン株で さえ、その物理的封じ込めのレベルはＢＳＬ２なのである。従って、これらＮＹ ＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣは、ほかのどのポックスウイルスよりもその 病原性が低いということが技術的にも認知されていることになる。 ＮＹＶＡＣをベースにした、およびＡＬＶＡＣをベースにした組み換えウイル スは両方とも、ヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８₊ ＣＴＬにin vitroで特異的に刺激 反応を示すことが報告されている(Tartagliaら、1993a)。種々のＨＩＶー１・エ ンベロープ・糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ組換体で免疫 したマウスでは、第二次接種で復活可能であった一次ＣＴＬ応答と記憶ＨＩＶ特 異的ＣＴＬ応答を示している(Tartagliaら、1993a，Coxら、1993)。ＡＬＶＡＣ −ｅｎｖおよびＮＹＶＡＣ−ｅｎｖの組換体（ともにＨＩＶー１エンベロープ糖 タンパク質を発現）は、ＨＩＶー１に感染したヒトの末梢血管単核細胞（ＰＢＭ Ｃ）において、強いＨＩＶー特異的ＣＴＬ応答を高めた(Tartagliaら、1993a；C oxら、1993)。急性感染させた自己由来ＰＢＭＣを残余ＰＢＭＣの刺激細胞とし て使用した。外来性ＩＬー２の不存在下での接種後１０日目に、細胞のＣＴＬ活 性を評価した。ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖおよびＮＹＶＡＣ−ｅｎｖの組換体がマウス における高レベルの抗−ＨＩＶ活性を刺激した。 本願出願人は、多数のＨＩＶ１抗原およびＨＩＶ１・Ｔー細胞エピトープを発 現するＡＬＶＡＣ組換体であるｖＣＰ３００(ALVAC-MN120TMGNp)を作製した。こ のｖＣＰ３００はＨＩＶ１（ＩＩＩＢ）ｇａｇ（および、プロテアーゼ）タンパ ク質を発現する。（プロテアーゼタンパク質の発現により、ｇａｇポリタンパク 質が正確にプロセッシングされる）。ｖＣＰ３００は、ある形態のＨＩＶ１（Ｍ Ｎ）エンベロープ糖タンパク質も発現し、ｇｐ１２０がｇｐ４１由来のトランス メンブレンアンカー配列に融合される。ｖＣＰ３００は、２個の（２）ＨＩＶ１ （ＢＲＵ）ｎｅｆ・ＣＴＬエピトープと３個の（３）ＨＩＶＩ（ＩＩＩＢ）ｐｏ ｌ・ＣＴＬエピトープも発現する。しかし、ｖＣＰ３００は機能性逆転写酵素活 性は示さない。さらに、ｖＣＰ３００は、ＳＩＶ・マカク（アカゲザル）モデル での病原性と関連しＨＩＶ１毒性と関連する機能性ｎｅｆ遺伝子産物は発現しな い(Millerら、1994; Spinaら、1994)。したがって、ｖＣＰ３００は、ｇａｇ、 ｅｎｖ、ｐｏｌおよびｎｅｆの免疫的に重要な抗原またはエピトープを発現する が、ｐｏｌおよびｎｅｆと関連した有害な酵素または病原性活性は示さないので ある。 上記の通り、ｖＣＰ３００は、ある形態のＨＩＶ１（ＭＮ）エンベロープ糖タ ンパク質を発現し、そこでは、多数のｇｐ４１配列が欠失されている。ＨＩＶ１ （ＭＮ）エンベロープ・糖タンパク質と関係がある免疫的に重要なエピトープの 殆どが、ｇｐ４１上よりもむしろｇｐ１２０上で見られたので、この組換体によ り発現されるエンベロープ・糖タンパク質の免疫原性が悪影響されることはない ことが予想される。事実、比較研究では、ＨＩＶ１・ｇｐ１２０サブユニットワ クチンが、チンパンジーをＨＩＶ１感染から防御したが、他方、ＨＩＶ１・ｇｐ １６０サブユニットワクチンではその防御ができなかった(Bermanら、1990)。こ れら２つのワクチンの効果がなぜ異なるのかについてはまだ分かっていない。し かし、エピトープ・ｇｐ４１に対する抗体がin vitroでＨＩＶ１感染を増進させ ることが分かっている(Robinsonら、1990)。ＨＩＶ１の血清反応陽性者において 、ｇｐ４１の推定免疫抑制部位に対する抗体が、ＡＩＤの無発症と関連している ことから、この部位が病原性に関してなんらかの役割を果たしていることは知ら れたことである(Klasseら、1988)。さらに、ｇｐ４１のＣ末端部位に対する抗体 はＨＬＡクラスＩＩ抗原との交差反応し、(Goldingら、1988)、抗原特異的リン パ増殖性反応を阻害することも知られたことである(Goldingら、1989)。 ｖＣＰ３００により発現されたエンベロープ・糖タンパク質の場合には、トラン スメンブレン部位と関連した２８アミノ酸を除いて、いかなるｇｐ４１配列も含 んでいないので、これらのｇｐ４１と関連した有害な影響は避けられる。さらに 、 ｖＣＰ３００により発現したエンベロープ・糖タンパク質の場合、ｇｐ４１上の 抗血清により認識される免疫優性エピトープが、ＨＩＶ１血清陽性者の感染のど の段階においても含まれてない(Shaffermanら、1989)。従って、このエピトープ に対する反応を基礎にした診断試験が、ワクチン接種者とＨＩＶ１感染者を区別 するために使用できる。ｇｐ４１抗体アッセイにより、ｖＣＰ３００接種者とＨ ＩＶ１感染者を区別できることは重要である。その理由は、ｖＣＰ３００接種者 は高レベルのｐ２４抗体を保持していることが予想されるので、大抵の診断キッ ト（ＨＩＶ１ｐ２４抗体の存在をアッセイする）は役にたたなくなるからである 。他には、ＨＩＶー１感染者ではは抗ーｇｐ４１抗体が産生されることが予想さ れるが、ｖＣＰ２０５またはｖＣＰ３００の接種者にはそれは考えられない。そ の理由は、ｖＣＰ２０５またはｖＣＰ３００にはｇｐ４１が欠失しているからで ある。 ウサギとモルモットにＡＬＶＡＣ組換体(vCP205;ALVAC-MN120TMG)を接種する と、ｖＣＰ３００が発現させたと同様の、細胞表面関連型ＨＩＶ１・ｇｐ１２０ （１２０ＴＭ）およびｇａｇ／ｐｒｏを発現した。ウサギとモルモットにｖＣＰ ２０５を接種して、さらに、ＨＩＶ１・Ｔ−Ｂ・ペプチドで二次免疫させた。Ａ ＬＶＡＣをベースにしたプロトコールによる接種で、ＨＩＶ１・ｇｐ１６０ー抗 体およびＶ３ループ特異的抗体の産生が誘発されたが、このことは、ＨＩＶ１・ ｇｐ１２０細胞表面型を発現するＡＬＶＡＣ組換体が、ＨＩＶ１−特異的免疫応 答を誘発することを示している。 ｖＣＰ３００は、ＨＩＶ１・ｇｐ１２０・エンベロープ・糖タンパク質、細胞 表面関連型ＨＩＶ１・Ｇａｇ・タンパク質、ＣＴＬエピトープを含むＨＩＶ１・ ｎｅｆからの２つの部位、ＣＴＬエピトープを含むＨＩＶ１・ＰＯＬからの３つ の部位を発現する。ｇｐ４１を含まないＨＩＶ１・エンベロープ・糖タンパク質 が発現されることにより、ｇｐ４１抗体の検査を使用することで、ｖＣＰ３００ の被接種者をＨＩＶ１−感染者から区別でき、種々のｇｐ４１エピトープと関係 する有害な反応を減らすことができる。ＨＩＶ１・ｇｐ１６０を発現する従来の ＡＬＶＡＣ組換体が、ヒトにおけるＨＩＶ１特異的体液性免疫反応および細胞性 免疫反応を誘発することが報告されているが(Pialouxら、1995)、さらに、Ｇａ ｇ、 Ｐｏｌ，Ｎｅｆ、エピトープを追加することにより（および、有害なｇｐ４１エ ピトープを除去することにより）、ｖＣＰ３００により誘発された免疫応答をｖ ＣＰ１２５と比較してさらに高め範囲を広げる効果があり、これにより、有効な ＨＩＶ１ワクチンまたは有効な免疫原、抗原物質を提供できることになる。 ｖＣＰ２０５またはｖＣＰ３００で免疫したMacaca Fascicularis（マカク属 サル）において、抗体反応（抗ＨＩＶ）が観察されており、このことは、これら の組換体が、さらに利用度の高い有効なものであることを示している。 従来のＥＬＤＫＷＡやＬＤＫＷは、その本来の形状では免疫原性が高くはない ために、その免疫原性を高めたものが本発明の組換体であり、ｇｐ１２０のＶ３ ループの中やｇｐ１２０の別の部位の中、あるいは、ｇｐ１６０エンベロープの 一部分の形で、免疫系に効果的に免疫原性を与えることができる。 ＡＬＶＡＣ組換体（ｖＣＰ１３０７）、ＮＹＶＡＣ組換体（ｖＰ１３１３）、 ＣＯＰＡＫ組換体（ｖＰ１３１９）は、ＨＩＶ１・ｇｐ１２０＋ＴＭ・遺伝子産 物を発現し、そこで、Ｖ３ループが、ＥＬＤＫＷＡ・エピトープの二つのコピを 含むように改変される。このｇｐ１２０＋ＴＭ・遺伝子産物（ＥＬＤＫＷＡ・エ ピトープとともに）は、ｖＣＰ１３０７、ｖＰ１３１３，ｖＰ１３１９に感染し た細胞の表面に発現する。 このＨＩＶ１・ｇｐ１２０＋ＴＭ（またはｇｐ１６０）のＶ３ループは、単に 線形ＨＩＶ１エピトープではない線形エピトープの免疫プラットフォームとして 使用できるのである。これらの組換体により産生されたｇｐ１２０＋ＴＭ・タン パク質を、ポックスウイルスに感染した細胞から分離することができ、それをサ ブユニットワクチンの形で（何かの構成成分として、あるいは、抗原物質、免疫 物質として）ヒトに接種可能である。この組換体から産生したタンパク質および それを抗原にして誘発された抗体をＨＩＶの有無の診断に使用できる。従って、 本発明は、ＨＩＶ免疫原および改変したｇｐ１２０およびｇｐ１６０を含む。そ のようなエンベロープをベースにした免疫原（ＨＩＶ免疫原または改変ｇｐ１２ ０またはｇｐ１６０）は、真核または原核発現ベクターからも誘導でき、サブユ ニット剤として使用できるし、適当な発現プラスミドを使用することで、ＤＮＡ 免疫により投与が可能である。ＤＮＡ免疫の技術はすでに公知となっている技術 である。このＤＮＡ免疫に関する文献には次のようなものがあり、添付してある 。「免疫療法および免疫法のための遺伝子直接移転」(Nabel and Felgner，Tibt eck，May 1993，11; 211-215)、「ＤＮＡワクチンによるインフルエンザからの イタチ（ferret）の防御」(Webster et al.，Vaccine，1994 12(16)，1495-1498 )。組換体であるｖＣＰ１３０７、ｖＰ１３１３、ｖＰ１３１９由来のＤＮＡを 、すでに既知であるハイブリダイゼーション法を使用してある特定のサンプルに おけるＨＩＶ・ＤＮＡの検出プローブとして活用できるし、すでに既知の技術で ＰＣＲプライマーを作製することにも利用できる。 外来性免疫原に対して体液性免疫と細胞性免疫の両方を誘導する(Tartagliaら ，1993a,b; Taylorら、1992; Konishiら、1992)ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲ ＯＶＡＣ・ベクターの弱毒化されたプロフィールにより、これらの組換体には、 すでに述べたワクシニアをベースにした組み換えウイルスよりも明らかに優れた 長所がある。 本発明にかかる組み換えウイルス、免疫原、改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０ 、ＤＮＡまたは発現物質を、抗原、ワクチン、治療剤として使用する場合に、非 経口（皮内、筋肉内、皮下）の投与が可能である。このような投与法が可能であ るので、全身的な免疫応答が期待できる。 より一般的に、本発明の抗原物質、免疫ワクチン物質、免疫治療剤（本発明に かかるポックスウイルス組換体、それからの発現物質、本発明の免疫原、ＤＮＡ 、改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０を含む）は、製薬業の当業者にはすでに知ら れた技術により調剤が可能である。本発明の物質を含む、そのような製剤の投与 量は、年齢、性、体重、患者の状況、投与経路などを考慮に入れて、医学の当業 者にはすでに既知の方法で決定できる。これらの製剤は、単独で投与してもよい し、別の薬剤と併用してもよいし、順番に投与してもよい。また、別の免疫原や 抗原やワクチンと一緒に、または一定の順序で投与してもよく、血清反応陽性者 に治療薬として投与してもかまわない。さらに、これらの製剤は、単独で投与し てもよいし、別の製剤と併用してもよいし、順番に投与してもよい。また、別の 免疫原や抗原やワクチンと一緒にまたは一定の順序で投与してもよく、血清反応 陰性者に抗原、免疫原、治療薬として投与してもかまわない。その他の製剤には 、免 疫不全ウイルスから得た精製抗原や、組み換えポックスウイルスやその他のベク ター系の抗原による発現物質から精製した抗原も含み、さらに、其の他の免疫不 全抗原や生物学的応答改変物質（例：サイトキニン；共働刺激分子）を発現する 組み換えポックスウイルスを含むものである。年齢、性、体重、患者状況、投与 経路などのすでに知られている要素を考慮に入れて、本発明の物質と他の製剤を 併用投与してもかまわない。投与のために、本発明の物質を、例えば口、鼻、肛 門、膣等の開口部から投与できるように液体状の製剤にしてもよいし、懸濁液、 シロップ、エリキシル剤の形にしてもよい。皮下、皮内、筋肉内、静脈内などの 非経口投与用に懸濁液やエマルジョン、注射液の形にしてもよい。さらに、本発 明の組み換えポックスウイルス、それからの発現物質、本発明の免疫原、ＤＮＡ 、改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０を、適当なキャリア、希釈剤、蒸留水、生理 食塩水、グルコースなどの添加剤に混ぜて使用してもかまわない。 さらに、本発明の組み換えポックスウイルスが発現する物質は、血清反応陽性 または陰性のヒト、または、動物において、免疫応答で促進された用として直接 に使用可能である。この発現物質を本発明の物質の代わりに使用してもよいし、 本発明の物質に追加して使用してもよい。同様に、本発明の物質を免疫原として 使用もできる。 さらに、本発明の組み換えポックスウイルス、それからの発現物質、本発明の 免疫原、改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０は、ヒトおよび動物において、免疫応 答、抗体反応でプロモートする。既知の技術を使用して、この抗体からモノクロ ーナル抗体を調整でき、このモノクローナル抗体を、特別な免疫不全ウイルス抗 原の有無、従って、そのウイルスの有無、またはウイルスや抗原に対する免疫応 答が単にプロモートされたのかどうかを決定するための抗体結合アッセイまたは 診断キットに利用可能である。これらのモノクローナル抗体は、免疫不全ウイル スまたは本発明の組み換えポックスウイルスの発現物質を発見するための免疫吸 着クロマトグラフィーにも適用可能である。 モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞が産生したイムノグロブリンである 。モノクローナル抗体は、単一の抗原決定基と反応し、従来の血清由来の抗体よ りもより高い特異性を有する。多数のモノクローナル抗体をスクリーニングする こ とにより所望する特異性、結合活性、アイソタイプを有する個別の抗体を選択す ることができる。ハイブリドーマ細胞系が一定で安価な化学的に同一の抗体ソー スを提供し、そのような抗体製剤の標準化を容易に行える。モノクローナル抗体 の生産法は当業者にはよく知られた技術であり、例えば、米国特許第４、１９６ 、２６５(Koprowski)（１９８９年４月）に示されており、参考文献として、こ こにも添付してある。 モノクローナル抗体の使用法も知られた技術である。診断法での応用がその一 つであり、例えば、米国特許第４、３７６、１１０(David，G．およびGreene，H ．)（１９８３年３月８日に成立）があり、参考文献として添付してある。モン クローナル抗体は、免疫吸着クロマトグラフィーによる物質の検出にも使用され ており、例えば、Scientific American 243:66,70でのMilsten，C．1980 の論文 があり、これも参考文献として添付してある。 さらに、本発明の組み換えポックスウイルス、それからの発現物質、本発明の 免疫原、改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０は、in vitroまたはexvivo（体外）で 、リンパ球またはＣＴＬのような細胞中の、患者への続いての再注入ための反応 をプロモートさせるのに使用できる。患者が血清反応陰性者の場合には、再注入 は、能動免疫のような免疫応答、抗原応答の免疫応答をプロモートさせるための ものである。血清反応陽性者の場合には、再注入は免疫不全ウイルスに対する免 疫システムをプロモートさせ増加させるのが目的である。 本発明の組換体によるＤＮＡは、サンプル内のＨＩＶ・ＤＮＡの有無を検出す るプローブとして使用できるし、ＰＣＲプライマーの作製し応用でき、すでに既 知の技術で適当な発現プラズマを使用してＤＮＡ免疫用に使用可能である。（Na belおよびFelgerおよびWebster etal.，前出、を参照されたい） 従って、本発明の組み換えポックスウイルスには、種々の使用法がある。例え ば血清陰性者に対して投与する抗原、免疫原、ワクチン組成物として使える。血 清陽性者には、治療剤として、免疫不全ウイルスに対する免疫システムの強化の ために使える。本発明によれば、in vitroで、発明の抗原、免疫原、改変ｇｐ１ ２０またはｇｐ１６０を作製可能であり、その場合でも、これらの作製したもの は、抗原、免疫原、ワクチン組成物または治療剤として使用可能である。本発明 の組み換えポックスウイルスを直接に投与するか、このウイルスの発現物質を投 与して得られた抗体は、例えば血清等のサンプル中に抗原があるかないか、例え ば、血清中の免疫不全ウイルスまたはＣＴＬの有無、ウイルスや特定の抗原に免 疫応答を示したかどうかを探知するための診断キット、試験キットに使用され、 さらに、免疫吸着クロマトグラフィに使用される。（本発明にかかる免疫原およ び改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０は、利用価値のある抗体を産生させるために 使用可能である。）ハイブリダイゼーション・プローブとして使うＤＮＡやＰＣ Ｒプライマーの作製、ＤＮＡ免疫にも使用（再注入）できる。本発明の組み換え ポックスウイルス、それからの発現物質、本発明の免疫原、改変ｇｐ１２０また はｇｐ１６０は、刺激細胞を作製するのに使用でき、その刺激細胞は免疫応答（ 抗原反応、免疫反応、能動免疫）でプロモートさせ、あるいは、免疫システムを 高め強化（例えば、免疫不全患者あるいは血清反応陽性者の免疫システム強化） するのに使用可能である。本発明の実施例としてまだ他の使用法はある。 本発 明について、図面を参照して、下記の例を検討することで、さらに理解が深まり 多くの長所を理解できるであろう。実施例 ＤＮＡクローニングと合成 プラスミドを構築し、スクリーニングし、定法に 従って増殖させた（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。制限 エンドヌクレアーゼは、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ ｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡおよびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮより入手し た。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより入手した。ＢＡＬ−３１エキソヌクレ アーゼおよびファージＴ４ＤＮＡリガーゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ ａｂｓより入手した。試薬は供給者によって特定された方法で用いられた。 合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはＢｉｏｓｅａｒｃｈ８７５０またはＡ ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ３８０ＢＤＮＡ合成装置により前述のように 調製された（Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。ＤＮＡシークエンスは ジデオキシチェーン終結法により（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７）Ｓ ｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７）を用いて前述のとお り行った（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。配列確認のためのＤＮＡの複製 連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅（Ｅｎｇｅｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８）を 、カスタム合成オリゴヌクレオチドプライマーとＧｅｎｅＡｍｐ ＤＮＡ増幅試 薬キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を 用いて自動化Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡサーマルサイクラ ー中で行った。過剰のＤＮＡ配列を、制限エンドヌクレアーゼ消化とそれに続く ＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼによる限定分解および合成ヌクレオチドを用い た突然変異（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，１９８６）によりプラスミド中から除去した。 細胞、ウイルス、および形質導入 ワクシニアウイルスコペンハーゲン株の起 源と培養条件は以前に記述されている（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。組 換えによる組換体ウイルスの開発、ニトロセルロースフィルターのインサイチュ ハイブリダイゼーションおよびベータガラクトシダーゼ活性によるスクリーニン グは以前に記述された（Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。 ワクシニアウイルスコペンハーゲン株およびＮＹＶＡＣの起源と培養条件は以 前に記述されている（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。組換えによる組換体ウイルスの開発、ニトロセル ロースフィルターのインサイチュハイブリダイゼーションおよびベータガラクト シダーゼ活性によるスクリーニングは以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅ ｔ ａｌ．，１９８２；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。 親カナリアポックスウイルス（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株）はカナリアのための ワクチン株である。このワクチン株は野生株単離体から得られ、ニワトリ胚繊維 芽細胞において２００回以上の連続継代を通して弱毒化された。マスターウイル スシードは寒天の下で４回の連続的プラーク精製にかけられ、１つのプラークは ５回のさらなる継代により増幅され、そのあとそのストックウイルスが生体外組 換えテストにおいて親株として用いられた。プラーク精製されたカナリアポック ス単離体はＡＬＶＡＣと命名された。 ＦＰ−１と命名されたニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ）株は以前に記述さ れた（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ）。それは生後一日のニワトリ のワクチン接種に有用な弱毒化されたワクチン株である。親ウイルス株Ｄｕｖｅ ｔｔｅはフランスでニワトリからのニワトリポックスかさぶたとして得られた。 このウイルスはニワトリ受精卵中で約５０回連続継代され続いてニワトリ胚繊維 芽細胞において２５回継代された。このウイルスは４回の連続的プラーク精製に かけられた。１つのプラーク単離体がさらに初期ＣＥＦ細胞中で増幅され、ＴＲ ＯＶＡＣと命名され、ストックウイルスとされた。 ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣウイルスベクターおよびその派生 体は以前に記述されたように増殖された（Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９ ８７；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）。ＶＥＲＯ細胞およびニ ワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）は以前に記述されたように増殖された（Ｔａｙｌ ｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）。実施例１ チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）の欠失のための プラスミドｐＳＤ４６０の構築 今、図１を参照しているが、プラスミドｐＳＤ４０６は、ｐＵＣ８中にクロー ン化されたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｊ（位置８３３５９−８８３７７）を含 んでいる。ｐＳＤ４０６はＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｖｕＩＩで切断され、Ｈｉｎ ｄＩＩＩ Ｊの左側からの１．７ｋｂ断片が、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで消化 されたｐＵＣ８中にクローン化され、ｐＳＤ４４７となった。ｐＳＤ４４７はＪ ２Ｒ（位置８３８５５−８４３８５）全体の遺伝子を有している。開始コドンは ＮｌａＩＩＩサイト内部に含まれ、終止コドンはＳｓｐＩサイト内部に含まれて いる。転写方向は図１中に矢印で示されている。 左側の隣接アーム（ｆｌａｎｋｉｎｇ ａｒｍ）を得るため、０．８ｋｂｐの ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＳＤ４４７から単離し、続いてＮｌａＩＩ Ｉで消化し、０．５ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片を単離した。ア ニーリングさせた合成ヌクレオチドＭＰＳＹＮ４３／ＭＰＳＹＮ４４（配列番号 １／配列番号２） を０．５ｋｐＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片とともにＨｉｎｄＩＩＩ／Ｅｃ ｏＲＩで切断したｐＵＣ１８中へ連結し、プラスミドｐＳＤ４４９を生成した。 ワクシニア右隣接アームおよびｐＵＣベクター配列を含む制限酵素断片を得る ために、ｐＳＤ４４７をワクシニア配列内部においてＳｓｐＩで（部分的に）、 そしてＨｉｎｄＩＩＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分において消化し、２．９ｋ ｂｐのベクター断片を単離した。このベクター断片を、アニーリングさせた合成 ヌクレオチドＭＰＳＹＮ４５／ＭＰＳＹＮ４６（配列番号３／配列番号４） と連結し、ｐＳＤ４５９を創出した。 隣接アームの左側と右側とをひとつのプラスミド中で結合するために、０．５ ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ断片をｐＳＤ４４９から単離し、ＨｉｎｄＩ ＩＩ／ＳｍａＩで消化したｐＳＤ４５９と連結し、プラスミドｐＳＤ４６０を創 出した。ｐＳＤ４６０を、野生型親ワクシニアウイルスコペンハーゲン株ＶＣ− ２との組換えのドナープラスミドとして用いた。ＭＰＳＹＮ４５（配列番号３） をテンプレートとして、および相補的な２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドＭＰＳＹ Ｎ４７（配列番号５）（５’ ＴＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣ ３ ’）をプライマーとして用いたプライマーエクステンション法により、³²Ｐ標識 されたプローブを合成した。組換えウイルスｖＰ４１０がプラークハイブリダイ ゼーションにより同定された。実施例２ 出血性領域（Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）の欠失のための プラスミドｐＳＤ４８６の構築 今、図２を参照しているが、プラスミドｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８中にクロー ン化されたワクシニアＳａｌＩ Ｇ（位置１６０７４４−１７３３５１）を有し ている。ｐＳＤ４２２は、右側に近接したワクシニアＳａｌＩ断片、ｐＵＣ８中 にクローン化されたＳａｌＩ Ｊ（位置１７３３５１−１８２７４６）を有して いる。出血性領域、ｕ、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ（位置１７２５４９−１７３５５２ ）を欠失させたプラスミドを構築するために、ｐＳＤ４１９を左側隣接アームの 源として、そしてｐＳＤ４２２を右側の隣接アームの源として用いた。領域ｕの 転写方向は図２において矢印で示されている。 所望でない配列をｐＳＤ４１９から取り除くため、ＮｃｏＩサイト（位置１７ ２２５３）の左側の配列は、ｐＳＤ４１９をＮｃｏＩ／ＳｍａＩで消化し続いて Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片により平滑末端化したのちライゲーショ ンし、プラスミドｐＳＤ４７６を生成した。ワクシニア右隣接アームは、ｐＳＤ ４２２を、Ｂ１４Ｒの終止コドンでＨｐａＩで消化し、そして０．３ｋｂｐ右側 をＮｒｕＩで消化して得た。この０．３ｋｂｐ断片を単離し、ｐＳＤ４７６から 単離した３．４ｋｂｐのＨｉｎｃＩＩベクター断片と連結し、プラスミドｐＳＤ ４７７とした。ワクシニアｕ領域のｐＳＤ４７７の部分的欠失の位置は三角形で 示した。残りのプラスミドｐＳＤ４７７中のＢ１３Ｒをコードしている領域配列 を、ＣｌａＩ／ＨｐａＩでの消化により取り除き、その結果生じた断片を、アニ ーリングさせた合成オリゴヌクレオチドＳＤ２２ｍｅｒ／ＳＤ２０ｍｅｒ（配列 番号６／配列番号７） と連結させ、ｐＳＤ４７９とした。ｐＳＤ４７９は、ＢａｍＨＩサイトが続いて いる開始コドン（下線）を有している。Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼを Ｂ１３−Ｂ１４（ｕ）欠失座中に、ｕプロモーターのコントロール下で配置する ため、３．２ｋｂｐのベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８３）を含むＢａｍＨＩ断片を、ｐＳＤ４７９のＢａｍＨＩに挿入 し、ｐＳＤ４７９ＢＧとした。ｐＳＤ４７９ＢＧは、ワクシニアウイルスｖＰ４ １０との組換えのドナープラスミドとして用いた。組換えワクシニアウイルスｖ Ｐ５３３は、色素基質Ｘ−ｇａｌ存在下でプループラークとして単離された。ｖ Ｐ５３３において、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ領域は欠失されベータガラクトシダーゼ で置換されていた。 ベータガラクトシダーゼ配列をｖＰ５３３から取り除くため、ｐＳＤ４７７か らの派生体でポリリンカー領域は含むが、ｕ欠失結合部分の開始コドンは有さな いｐＳＤ４８６を用いた。第１に、前述のｐＳＤ４７７由来ＣｌａＩ／ＨｐａＩ ベクター断片を、アニーリングさせた合成ヌクレオチドＳＤ４２ｍｅｒ／ＳＤ４ ０ｍｅｒ（配列番号８／配列番号９） と連結させ、プラスミドｐＳＤ４７８とした。次にｐＵＣ／ワクシニア結合部分 のＥｃｏＲＩサイトを、ｐＳＤ４７８をＥｃｏＲＩで消化し続いてＥ．ｃｏｌｉ ポリメラーゼクレノー断片により平滑化し、ライゲーションすることにより破壊 して、プラスミドｐＳＤ４７８Ｅ^-とした。ｐＳＤ４７８Ｅ^-をＢａｍＨＩおよび ＨｐａＩで消化したのち、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５ ／ＨＥＭ６（配列番号１０／配列番号１１） と連結し、プラスミドｐＳＤ４８６とした。ｐＳＤ４８６は、組換えワクシニア ウイルスｖＰ５３３との組換えにドナープラスミドとして用いて、Ｘ−ｇａｌ存 在下で透明プラークとして単離されたｖＰ５３３を創出した。実施例３ ＡＴＩ領域（Ａ２６Ｌ）欠失のための プラスミドｐＭＰ４９４Δの構築 今、図３を参照しているが、ｐＳＤ４１４はｐＵＣ８中にクローン化されたＳ ａｌＩ Ｂを含んでいる。Ａ２６Ｌ領域の左側の所望でないＤＮＡ配列を取り除 くため、ｐＳＤ４１４を、ＸｂａＩでワクシニア配列の内部（位置１３７０７９ ）で、ＨｉｎｄＩＩＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分で切断し、続いてＥ．ｃｏ ｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化しライゲーションし、プラスミドｐＳＤ ４８３とした。Ａ２６Ｌ領域の右側の所望でないワクシニア配列を取り除くため 、ｐＳＤ４８３をＥｃｏＲＩで切断し（位置１４０６６５およびｐＵＣ／ワクシ ニア結合部分）、ライゲーションし、プラスミドｐＳＤ４８４とした。Ａ２６Ｌ コード領域を除去するため、ｐＳＤ４８４はＮｄｅＩで（部分的に）Ａ２６ＬＯ ＲＦの僅かに上流を（位置１３９００４）、ＨｐａＩでＡ２６ＬＯＲＦの僅かに 下流を（位置１３７８８９）切断した。５．２ｋｂｐのベクター断片を単離し、 アニーリングさせた人工合成オリゴヌクレオチドＡＴＩ３／ＡＴＩ４（配列番号 １２／配列番号１３） と連結し、Ａ２６Ｌ上流領域を再構築し、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａ Ｉ制限酵素サイトを有する短いポリリンカー領域で、Ａ２６ＬＯＲＦを上記のよ うに置換した。構築されたプラスミドをｐＳＤ４８５と命名した。ｐＳＤ４８５ のポリリンカー領域のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩサイトは固有ではないので、 所望でないＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩサイトをｐＳＤ４８３（前述）から、Ｂ ｇｌＩＩ（位置１４０１３６）、およびＥｃｏＲＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部 分を消化し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化することに より取り除いた。生成されたプラスミドをｐＳＤ４８９と命名した。ｐＳＤ４８ ９由来のＡ２６ＬＯＲＦを含む１．８ｋｂｐのＣｌａＩ（位置１３７１９８）／ ＥｃｏＲＶ（位置１３９０４８）断片を、対応するｐＳＤ４８５由来の０．７ｋ ｂｐポリリンカーを含むＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶ断片で置換し、ｐＳＤ４９２を生 成した。ｐＳＤ４９２のポリリンカー領域中のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩサイ トは固有である。 Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ． ，１９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０）の支配下で含む ３．３ｋｂｐのカセットをｐＳＤ４９２のＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＳＤ４ ９３ＫＢＧとした。プラスミドｐＳＤ４９３ＫＢＧはレスキューウイルスｖＰ５ ５３の組換えにおいて用いられた。組換えワクシニアウイルスｖｐ５８１は、ベ ータガラクトシダーゼをＡ２６Ｌ欠失領域内に有し、Ｘ−ｇａｌ存在化でブルー プラークとして単離された。 ベータガラクトシダーゼ遺伝子配列を組換えワクシニアウイルスｖＰ５８１か ら除去するためのプラスミドを開発するために、プラスミドｐＳＤ４９２のポリ リンカー領域を、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７（配列番号１４） を用いた突然変異により欠失させた（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，１９８６）。生成され たプラスミド、ｐＭＰ４９４Δにおいては、Ａ２６Ｌ ＯＲＦの全体を含む位置 ［１３７８８９−１３８９３７］を取り巻くワクシニアウイルスＤＮＡが欠失し ていた。ｐＭＰ４９４Δと、ベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体ｖ Ｐ５８１との間での組換えにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ６１８が、Ｘ−ｇ ａｌ存在下での透明プラークとして単離され、得られた。実施例４ 血球凝集素遺伝子（Ａ５６Ｒ）の欠失のための プラスミドｖＳＤ４６７の構築 今、図４を参照しているが、ワクシニアＳａｌＩ Ｇ制限酵素断片（位置１６ ０７４４−１７３３５１）はＨｉｎｄＩＩＩ Ａ／Ｂ結合部分（位置１６２５３ ９）で交差している。ｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８中にクローン化されたワクシニ アＳａｌＩ Ｇ断片を有している。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向は図１ ３中に矢印で示されている。ＨｉｎｄＩＩＩ Ｂから派生したワクシニア配列は ｐＳＤ４１９をＨｉｎｄＩＩＩでワクシニア配列内部とｐＵＣ／ワクシニア結合 部分を消化し続いてライゲーションすることにより取り除いた。生成されたプラ スミド、ｐＳＤ４５６は、ＨＡ遺伝子Ａ５６Ｒを、左に０．４ｋｂｐのワクシニ ア配列、右に０．４ｋｂｐのワクシニア配列と隣接した状態で有している。Ａ５ ６Ｒコード配列を、ｐＳＤ４５６をＲｓａＩで（部分的；位置１６１０９０）Ａ ５６Ｒコード配列の上流を、またＥａｑＩで（位置１６２０５４）遺伝子の末端 ちかくを切断することにより除去した。３．６ｋｂｐＲｓａＩ／ＥａｑＩベクタ ー断片を単離し、アニーリングさせた合成ヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９（配列番 号１５）ＭＰＳＹＮ６２（配列番号１６）、ＭＰＳＹＮ６０（配列番号１７）お よびＭＰＳＹＮ６１（配列番号１８） とライゲーションし、Ａ５６Ｒ ＯＲＦの上流域を再構築し、Ａ５６Ｒ ＯＲＦ を上記のポリリンカー領域で置換した。そ９結果生成されたプラスミドはｐＳＤ ４６６である。プラスミドｐＳＤ４６６中のワクシニア欠失は位置［１６１１８ ５−１６２０５３］を含んでいる。ｐＳＤ４６６中の欠失サイトは図４に三角形 で示されている。 Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ． ，１９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９）の支配下で含む３．３ ｋｂｐのカセットをｐＳＤ４６６のＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＳＤ４６６Ｋ ＢＧとした。プラスミドｐＳＤ４６６ＫＢＧはレスキューウイルスｖＰ６１８の 組換えにおいて用いられた。組換えワクシニアウイルスｖｐ７０８は、ベータガ ラクトシダーゼをＡ２６Ｌ欠失部内に有し、Ｘ−ｇａｌ存在化でブループラーク として単離された。 ベータガラクトシダーゼ配列を、ｖＰ７０８からドナープラスミドｐＳＤ４６ ７を用いて除去した。ｐＳＤ４６７は、ｐＳＤ４６６をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ で消化した後にＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化しライゲーショ ンして、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩサイトがｐＵＣ／ワクシニア結 合部分から取り除いてある以外はｐＳＤ４６６と同一である。ｖＰ７０８とｐＳ Ｄ４６７との組換えの結果、組換えワクシニアウイルス欠失変異体、ｖＰ７２３ が生成し、Ｘ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離された。実施例５ オープンリーディングフレーム［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］の 欠失のためのプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構築 今は、図５を参照しているが、以下のワクシニアクローンがｐＭＣＳＫ１Δの 構築のために利用された。ｐＳＤ４２０はｐＵＣ８中にクローン化されたＳａｌ Ｉ Ｈである。ｐＳＤ４３５は、ｐＵＣ１８中にクローン化されたＫｐｎＩ Ｆ である。ｐＳＤ４３５はＳｐｈＩで切断され、再び連結され、ｐＳＤ４５１とな った。ｐＳＤ４５１中では、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ中のＳｐｈＩサイト（位置２７ ４１６）の左側のＤＮＡ配列は取り除かれている（Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ． ，１９９０）。ｐＳＤ４０９はｐＵＣ８中にクローン化されたＨｉｎｄＩＩＩ Ｍである。 ワクシニア由来の［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］遺伝子クラスターの欠失のための基質を 供与するために、Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼが最初にワクシニアＭ２ Ｌ欠失座に以下のように挿入された（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ｐＳ Ｄ４０９中のＢｇｌＩＩサイトを除去するために、プラスミドをワクシニア配列 中（位置２８２１２）でＢｇｌＩＩで、そしてＢａｍＨＩでｐＵＣワクシニア結 合部分で切断し、続いて連結しｐＭＰ４０９Ｂとした。ｐＭＰ４０９Ｂを固有の ＳｐｈＩサイト（位置２７４１６）で切断した。続いてＭ２Ｌコード配列を合成 ヌクレオチドを用いた突然変異で除去した（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０； Ｍａｎｄｅｃｋｉ，１９８６）。 ＭＰＳＹＮ８２（配列番号１９） その結果生成されたプラスミドｐＭＰ４０９Ｄは、Ｍ２Ｌ欠失座に上記のように 挿入された固有のＢｇｌＩＩサイトを含んでいる。Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクト シダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８３）をワクシニア１１ ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５）の支配下 で含む３．２ｋｂｐのＢａｍＨＩ（部分）／ＢｇｌＩＩカセットをｐＭＰ４０９ ＤのＢｇｌＩＩサイトに挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＭＰ４０９ ＤＢＧはレスキューワクシニアウイルスｖＰ７２３の組換えにおいてドナープラ スミドとして用いられた。組換えワクシニアウイルスｖｐ７８４は、Ｍ２Ｌ欠失 座に挿入されたベータガラクトシダーゼを有し、Ｘ−ｇａｌ存在下でブループラ ークとして単離された。 ワクシニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠失のためのプラスミドが、ＳｍａＩ、 ＨｉｎｄＩＩＩ、で切断されＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化さ れたｐＵＣ８中に集められた。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｃ配列からなる左隣 接アームはｐＳＤ４２０をＸｂａＩで消化し（位置１８６２８）続いてＥ．ｃｏ ｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化した後ＢｇｌＩＩで消化して（位置１９ ７０６）得た。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ配列からなる右隣接アームはｐＳ Ｄ４５１をＢｇｌＩＩ（位置２９０６２）およびＥｃｏＲＶ（位置２９７７８） で消化して得た。その結果生成されたプラスミド、ｐＭＰ５８１ＣＫは、Ｈｉｎ ｄＩＩＩ Ｃ中のＢｇｌＩＩサイト（位置１９７０６）とＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ中 のＢｇｌＩＩサイト（位置２９０６２）との間のワクシニア配列を欠失された。 プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫ中のワクシニア配列の欠失サイトは図５において三 角形で示されている。 ワクシニア欠失結合部位の過剰のＤＮＡを取り除くため、プラスミドｐＭＰ５ ８１ＣＫをワクシニア配列内のＮｃｏＩサイト（位置１８８１１；１９６５５） で切断し、Ｂａｌ−３１エキソヌクレアーゼ処理し、合成オリゴヌクレオチドＭ ＰＳＹＮ２３３（配列番号２０） を用いた突然変異にかけた。その結果生成したプラスミド、ｐＭＣＳＫ１Δは、 １２のワクシニアオープンリーディングフレーム［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を含む位置 １８８０５−２９１０８のワクシニア配列を欠失していた。ｐＭＣＳＫ１Δと、 ベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体ｖＰ７８４との組換えにより、 ワクシニア欠失変異体、ｖＰ８０４が生成し、Ｘ−ｇａｌ存在下で透明プラーク として単離された。実施例６ リボヌクレアーゼ還元酵素ラージサブユニット（Ｉ４Ｌ）の 欠失のためのプラスミドｐＳＤ５４８の構築 今、図６を参照しているが、プラスミドｐＳＤ４０５は、ｐＵＣ８中にクロー ン化されたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｉ（位置６３８７５−７０３６７）を有 している。ｐＳＤ４０５をＥｃｏＲＶでワクシニア配列内部（位置６７９３３） を、およびＳｍａＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分を消化し、連結させ、プラス ミドｐＳＤ５１８とした。ｐＳＤ５１８はｐＳＤ５４８の構築において用いられ た、全てのワクシニア制限断片の供給源として用いられた。 ワクシニアＩ４Ｌ遺伝子は位置６７３７１−６５０５９にわたっている。１４ Ｌの転写方向は図６中で矢印によって示されている。Ｉ４Ｌコード配列部分を欠 失させたベクタープラスミド断片を得るため、ｐＳＤ５１８をＢａｍＨＩ（位置 ６５３８１）、およびＨｐａＩ（位置６７００１）で消化し、Ｅ．ｃｏｌｉポリ メラーゼクレノー断片で平滑化した。この４．８ｋｂｐのベクター断片は、Ｅ． ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９ ８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ ．，１９８５；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０）の支配下で含む３．２ ｋｂｐのＳｍａＩカセットと連結され、プラスミドｐＳＤ５２４ＫＢＧとなった 。ｐＳＤ５２４ＫＢＧを、ワクシニアウイルスｖＰ８０４との組換えでドナープ ラスミドとして用いた。組換えワクシニアウイルス、ｖｐ８５５は、ベータガラ クトシダーゼをＩ４Ｌ遺伝子部分欠失部位中に含み、Ｘ−ｇａｌ存在下でブルー プラークとして得られた。 ベータガラクトシダーゼとＩ４Ｌ ＯＲＦの残りの部分をｖＰ８５５から欠失 させるために、欠失プラスミドｐＳＤ５４８を構築した。左および右ワクシニア 隣接アームは別々に、以下に詳細に、および図６中に模式的に示されているよう にｐＵＣ８中に集められた。 左ワクシニア隣接アームを受け入れるベクタープラスミドを構築するために、 ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニーリングさせた合成オリゴヌ クレオチド５１８Ａ１／５１８Ａ２（配列番号２１／配列番号２２） と連結し、プラスミドｐＳＤ５３１とした。ｐＳＤ５３１をＲｓａＩ（部分）お よびＢａｍＨＩで切断し、２．７ｋｂｐの断片を単離した。ｐＳＤ５１８をＢｇ ｌＩＩ（位置６４４５９）／ＲｓａＩ（位置６４９９４）で切断し、０．５ｋｂ ｐの断片を単離した。２つの断片を連結し、Ｉ４Ｌコード配列の左の完全ワクシ ニア隣接アームを有するプラスミドｐＳＤ５３７とした。 右ワクシニア隣接アームを受け入れるためのベクターを構築するため、ｐＵＣ ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオ チド５１８Ｂ１／５１８Ｂ２（配列番号２３／配列番号２４） と連結させ、ｐＳＤ５３２とした。ｐＳＤ５３２をＲｓａＩ（部分的）／Ｅｃｏ ＲＩで切断し、２．７ｋｂｐのベクター断片を単離した。ｐＳＤ５１８を、Ｒｓ ａＩでワクシニア内部（位置６７４３６）を、ＥｃｏＲＩでワクシニア／ｐＵＣ 結合を切断し、０．６ｋｂｐの断片を単離した。この２つの断片を連結し、Ｉ４ Ｌコード領域の右の完全ワクシニア隣接アームを含むｐＳＤ５３８とした。 右ワクシニア隣接アームは、ｐＳＤ５３８由来の０．６ｋｂｐＥｃｏＲＩ／Ｂ ｇｌＩＩ断片として単離され、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで切断されたｐＳＤ５３ ７中へ連結された。その結果生成したプラスミドｐＳＤ５３９においては、Ｉ４ Ｌ ＯＲＦ（６５０４７−６７３８６）はポリリンカー領域で置換され、ポリリ ンカー領域は左で０．６ｋｂｐのワクシニア配列、右で０．６ｋｂｐのワクシニ ア配列と、すべてｐＵＣのバックグラウンド内部で隣接している。ワクシニア配 列内部での欠失部位は、図６で三角形で示されている。組換えワクシニアウイル スｖＰ８５５中のベータガラクトシダーゼ配列と、ｐＳＤ５３９のｐＵＣ派生部 分のベータガラクトシダーゼとの、起こりうる組換えを避けるために、ワクシニ アＩ４Ｌ欠失カセットがｐＳＤ５３９からｐＲＣ１１へ移動され、ｐＵＣ派生体 からすべてのベータガラクトシダーゼを除去し、ポリリンカー領域で置換した（ Ｃｏｌｉｎａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ｐＳＤ５３９をＥｃｏＲＩ／Ｐｓ ｔＩで切断し、１．２ｋｂｐ断片を単離した。この断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ で切断したｐＲＣ１１（２．３５ｋｂｐ）中へ挿入し、ｐＳＤ５４８とした。ｐ ＳＤ５４８とベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体ｖＰ８５５との組 換えの結果、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８６６が生成し、Ｘ−ｇａｌ存在下で透 明プラークとして単離された。 組換えワクシニアウィルスｖＰ８６６由来のＤＮＡを、制限酵素消化とそれに 続くアガロースゲル上での電気泳動により分析した。制限パターンは期待通りの ものであった。ｖＰ８６６をテンプレートとして、上に詳述された６欠失座に隣 接するプライマーを用いた複製連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｅｎｇｅｌｋｅ ｅｔ ａ ｌ．，１９８８）により、期待されたサイズのＤＮＡ断片が生産された。ＰＣＲ により生産された断片の、欠失結合部位の範囲の周りの配列分析により、結合部 位は期待された通りであることが確認された。組換えワクシニアウイルスｖＰ８ ６６は、上記の６つの操作された欠失を有し、ワクシニアワクチン株「ＮＹＶＡ Ｃ」と命名された。実施例７ 狂犬病糖タンパク質 Ｇ遺伝子のＮＹＶＡＣへの挿入 ワクシニアＨ６プロモーター（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ ）の支配下で狂犬病糖タンパク質 Ｇをコードしている遺伝子を、ＴＫ欠失プラ ス ミドｐＳＤ５１３中に挿入した。ｐＳＤ５１３は、ポリリンカー領域の存在を除 いてプラスミドｐＳＤ４６０（図１）と同一である。 今、図７を参照しているが、ポリリンカー領域はｐＳＤ４６０をＳｍａＩで切 断し、プラスミドベクターをアニーリングさせた合成ヌクレオチドＶＱ１Ａ／Ｖ Ｑ１Ｂ（配列番号２５／配列番号２６） と連結することにより挿入され、ベクターｐＳＤ５１３を生成した。ｐＳＤ５１ ３をＳｍａＩで切断し、ワクシニアＨ６プロモーター（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａ ｌ．，１９８８ａ，ｂ）支配下の狂犬病糖タンパク質 Ｇを含むＳｍａＩ末端化 １．８ｋｂｐのカセットと連結した。生成したプラスミドはｐＲＷ８４２と命名 された。ｐＲＷ８４２はＮＹＶＡＣレスキューウイルス（ｖＰ８６６）との組換 えのドナープラスミドとして用いられた。組換えワクシニアウイルスｖＰ８７９ を、狂犬病糖タンパク質 Ｇに対する³²Ｐ−標識ＤＮＡプローブを用いたプラー クハイブリダイゼーションにより同定した。 本発明の改変組換えウイルスは、組換えワクチンベクターとしての利点を供与 する。弱毒化されたベクターの毒性は、ワクチン接種によるワクチン接種された 個体内でのランナウエイ感染（ｒｕｎａｗａｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を有利に 減少させ、ワクチン接種された個体からされていない個体への伝播もしくは環境 への汚染を減少もさせる。 改変組換えウイルスはまた、遺伝子産物をコードし細胞内で発現する外来遺伝 子を有する改変組換えウイルスを、細胞内に導入することにより、生体外で培養 された細胞中での遺伝子発現の方法にもまた有利に用いることができる。実施例８ ニューカッスル病ウイルスの 融合および血球凝集素ノイラミニダーゼ糖タンパク質を発現する ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶの構築 本実施例では、ニワトリポックスウイルスベクターＴＲＯＶＡＣ、およびＴＲ ＯＶＡＣ−ＮＤＶと命名されたニワトリポックスニューカッスル病ウイルス組換 体の開発、およびその安全性並びに効率を記述する。毒性ＮＤＶ株テキサスのＦ およびＨＮ遺伝子を両方発現するニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ）ベクター を構築した。創出された組換体はＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶと命名された。ＴＲＯＶ ＡＣ−ＮＤＶは実際にプロセシングされたＮＤＶ糖タンパク質を、組換えウイル スを感染させた鳥類細胞中で発現し、生後１日のニワトリへの接種により、それ に続く毒性ＮＤＶ投与に対して防御する。 細胞とウイルス ＮＤＶテキサス株は短期潜伏性の株である。ＦおよびＨＮ遺 伝子のｃＤＮＡの調製は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９ ９０；Ｅｄｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ＦＰＶウイルスのＦＰ−１ と命名された株は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ ）。それは生後１日のニワトリのワクチン接種に有用なワクチン株である。親ウ イルス株Ｄｕｖｅｔｔｅはフランスでニワトリからのニワトリポックスのかさぶ たとして得られた。ウイルスはふ化鶏卵における約５０回の連続継代とそれに続 くニワトリ胚繊維芽細胞で２５回の継代により弱毒化された。ウイルスは４回の 連続プラーク精製にかけられた。１つのプラーク単離体を初期ＣＥＦ細胞中で増 幅し、ＴＲＯＶＡＣと命名されたストックウイルスとした。この生体外組換えテ ストでＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶを生成するために用いられたストックウイルスは、 プラーク単離体から初期ＣＥＦ中で１２回の継代にかけられた。 ＮＤＶ−Ｆのカセットの構築 ５’末端からの２２ヌクレオチドを除く全ての Ｆタンパク質をコードしている配列を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ断片を、ｐＮ ＤＶ８１（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）から切り出し、ｐＵＣ１８ のＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｐＣＥ１３とした。以前に記述されたワクシニア ウイルスＨ６プロモーター（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ；Ｇ ｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）は、 ｐＣＥ１３をＳａｌＩで消化し、粘着末端をＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー 断片で充填し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより、ｐＣＥ１３中に挿 入した。Ｈ６プロモーター配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、続い てｐＣＥ１３中に挿入し、ｐＣＥ３８とした。完全５’末端は、ｐＣＥ３８をＫ ｐｎＩおよびＮｒｕＩで消化し、アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌク レオチドＣＥ７５（配列番号２７）およびＣＥ７６（配列番号２８）を挿入して 生成し、ｐＣＥ４７を生成した。 ＮＤＶ−Ｆの３’末端非コード領域を取り除くため、ｐＣＥ１３由来のＳｍａＩ からｐｓｔＩ断片をｐＵＣ１８のＳｍａＩおよびＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐＣ Ｅ２３とした。非コード領域をｐＣＥ２３のＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、エキソヌク レアーゼＩＩＩ、ＳＩヌクレアーゼおよびＥｃｏＲＩによる連続的消化により除 去した。アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドＣＥ４２（配列 番号２９）およびＣＥ４３（配列番号３０）を続いて挿入しｐＣＥ２９とした。 ＮＤＶ−Ｆ配列の３’末端を続いて、既にｐＣＥ２９からのＰｓｔＩ−ＳａｃＩ 断片をｐＣＥ２０のＰｓｔＩ−ＳａｃＩサイトに挿入することによりＮＤＶ−Ｆ の５’末端を有しているプラスミドｐＣＥ２０に挿入しｐＣＥ３２とした。ｐＣ Ｅ２０の開発は以前にＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０中で記述された。 Ｈ６プロモーターおよびｐＣＥ４７に含まれているＮＤＶ−Ｆ５’配列を、ｐ ＣＥ３２に含まれている３’ＮＤＶ−Ｆ配列とを整列させるために、ｐＣＥ４７ のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＣＥ３２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩサイ トへ挿入し、ｐＣＥ４９とした。Ｈ６プロモートされたＮＤＶ−Ｆは続いてＯＲ Ｆを除いたＦ８座（以下に記述）へ、ｐＣＥ４９由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｎｒｕ Ｉ断片をｐＪＣＡ００２（以下に記述）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩサイト へ挿入することにより移し、ｐＣＥ５４とした。ｐＣＥ５４をＳａｃＩで、部分 的にＢａｍＨＩで消化し、アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチ ドＣＥ１６６（配列番号３１）およびＣＥ１６７（配列番号３２）を挿入するこ とにより、ｐＣＥ５４へ転写終結シグナルを挿入し、ｐＣＥ５８とした。 ＮＤＶ−Ｆ完全３’末端を、ｐＣＥ５４をテンプレートとして、オリゴヌクレオ チドＣＥ１８２（配列番号３３）およびＣＥ１８３（配列番号３４）をプライマ ーとした複製連鎖反応（ＰＣＲ）により得た。 ＰＣＲ断片はＰｖｕＩＩおよびＨｐａＩにより消化させ、ＨｐａＩおよび部分的 にＰｖｕＩＩにより消化したｐＣＥ５８中へクローン化した。その結果生成され たプラスミドはｐＣＥ６４と命名された。ｐＣＥ６４由来の完全Ｈ６プロモータ ーおよびＦコード配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ−Ｈｐａｉ断片を、ｐＲＷ８４６の ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩサイトにクローン化することにより、翻訳終結シグナ ルを挿入し、最終ＮＤＶ−ＦカセットであるｐＣＥ７１を生成した。プラスミド ｐＲＷ８４６は実質的にｐＪＣＡ００２（以下に記述）と同一ではあるが、Ｈ６ プロモーターおよび転写並びに翻訳終結シグナルを有している。ｐＲＷ８４６を ＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｐａＩで消化することによって、Ｈ６プロモーターは除 かれるが停止シグナルは手つかずで残る。 ＮＤＶ−ＨＮカセットの構築 プラスミドｐＲＷ８０２の構築は以前にＥｄｂ ａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０中で記述された。このプラスミドはワクシニ アウイルスＨ６プロモーターの３’末端に連結したＮＤＶ−ＨＮ配列をｐＵＣ９ ベクター中に有している。ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの５’末端を含 むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＲＷ８０２のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃ ｏＲＶサイトに挿入しｐＲＷ８３０とした。アニーリングさせキナーゼ処理した オリゴヌクレオチドＣＥ１６２（配列番号３５）およびＣＥ１６３（配列番号３ ６）をｐＲＷ８３０に挿入することにより、ＮＤＶ−ＨＮの完全３’末端を得て 、最終ＮＤＶ−ＨＮカセットであるｐＣＥ５９を生成した。 ＦＰＶ挿入ベクターの構築 プラスミドｐＲＷ７３１−１５は、ゲノムＤＮＡ からクローン化された１０ｋｂｐのＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片をコードしてい る。３６６０ｂｐのＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片の両方の鎖に関してヌクレオチ ド配列が決定され図１１に示されている（配列番号６７）。ここでＦ８と名付け られたオープンリーディングフレームの限定が決定された。プラスミドｐＲＷ７ ６１は２４３０ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶ断片を含むｐＲＷ７３１−１５の サブクローンである。Ｆ８オープンリーディングフレームの全体は、ｐＲＷ７６ １中のＸｂａＩサイトおよびＳｓｐＩサイトの間に含まれている。ＴＲＯＶＡＣ ゲノムＤＮＡとの組換えにおいてＦ８ＯＲＦを取り除く挿入プラスミドを創出す るために、以下の工程が行われた。プラスミドｐＲＷ７６１を完全にＸｂａＩで 、部分的にＳｓｐＩで消化した。ゲルから単離された３７００ｂｐのＸｂａＩ− ＳｓｐＩバンドをアニーリングさせた２本鎖オリゴヌクレオチドＪＣＡ０１７（ 配列番号３７）およびＪＣＡ０１８（配列番号３８）と連結した。 このライゲーションの結果生成されたプラスミドはｐＪＣＡ００２と命名された 。 ＮＤＦ ＦおよびＨＮの二重挿入ベクターの構築 Ｈ６プロモートされたＮＤ Ｖ−ＨＮ配列を、Ｈ６プロモートされたＮＤＶ−Ｆカセット中に、Ｅ．ｃｏｌｉ ポリメラーゼクレノー断片で充填したｐＣＥ５９由来のＨｉｎｄＩＩＩ断片を、 ｐＣＥ７１のＨｐａＩサイトへクローン化することにより挿入し、ｐＣＥ８０と した。プラスミドｐＣＥ８０は完全にＮｄｅＩで、部分的にＢｇｌＩＩで部分的 に消化し、Ｆ８隣接アームに連結し、ともにＨ６プロモーターによって駆動され ているＮＤＶ ＦおよびＨＮ遺伝子を含む４７６０ｂｐ断片を生成した。プラス ミドｐＪＣＡ０２１は、ｐＲＷ７３１−１５由来の４９００ｂｐのＰｖｕＩ−Ｈ ｉｎｄＩＩ断片をｐＢＳＳＫ⁺のＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩに挿入することにより 得られた。プラスミドｐＪＣＡ０２１を続いてＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化 し、ｐＣＥ８０の４７６０ｂｐのＮｄｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片と連結し、ｐＪＣＡ ０２４とした。プラスミドｐＪＣＡ０２４は、それ故、ＦＰＶ隣接アームの間に ３’末端が隣接した逆向きの方向で挿入されたＮＤＶ−ＦおよびＨＮ遺伝子を有 している。両方の遺伝子はワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結されてい る。ＮＤＶ−Ｆ配列に近い右隣接アームは２３５０ｂｐのＦＰＶ配列からなる。 ＮＤＶ−ＨＮ配列に近い左隣接アームは１７００ｂｐＦＰＶ配列からなる。 ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶの開発 プラスミドｐＪＣＡ０２４を、ＴＲＯＶＡＣを 感染させた初期ＣＥＦ細胞中に、以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）リン酸カルシウ ム沈殿法を用いて形質導入した。陽性プラークを、ＮＤＶ−ＦおよびＨＮ特異的 放射性標識プローブとのハイブリダイゼーションに基づいて選択し、続いて純粋 な集団が達成されるまでプラーク精製の連続的過程にかけた。続いて１つの代表 プラークを増幅し、その結果得られたＴＲＯＶＡＣ組換体はＴＲＯＶＡＣ−ＮＤ Ｖ（ｖＦＰ９６）と命名された。 免疫蛍光 直接的ではない免疫蛍光を、記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ ｅ ｔ ａｌ．，１９９０）、ポリクローナル抗ＮＤＶ血清、およびモノ特異的試薬 として、ＮＤＦ−ＶまたはＮＤＶ−ＨＮを発現するワクシニアウイルス組換体に 対するウサギ体内で作られた血清を用いて行った。 イムノプレシピテーション イムノプレシピテーション反応を、記述されたよ うに（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）ＳＰＡＦＡＳ Ｉｎｃ．Ｓｔｏ ｒｒｓ，ＣＴより得たポリクローナル抗ＮＤＶ血清を用いて行った。 ストックウイルスを、Ｆ８０ＲＦのが欠失されていることを確認するためにイ ンサイチュ プラークハイブリダイゼーションにより選別した。ＴＲＯＶＡＣゲ ノムへのＮＤＶ遺伝子の正確な挿入およびＦ８０ＲＦの欠失は、サザンブロット ハイブリダイゼーションによってもまた確認された。 ＮＤＶ感染細胞中では、Ｆ 糖タンパク質は、カルボキシル末端付近の疎水性 膜内外領域によって膜に固定され、プレカーサーＦ₀の、２つのジスルフィド結 合したポリペプチドＦ₁およびＦ₂への翻訳後の分解を必要とする。Ｆ₀の分解は 、与えられたＮＤＶ株の病原性の決定において重要であり（Ｈｏｍｍａ ａｎｄ Ｏｃｈｉａｉ，１９７３；Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，１９７６；Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，１９８０）、分解サイトのアミノ酸配列は、それ故にウイルス の毒性の決定に重要である。ＦＰＶ中に挿入され、組換体ｖＦＰ２９を生成した ＮＤＶ−Ｆ配列中の分解サイトのアミノ酸は、配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａ ｒｇ−Ａｒｇ（配列番号３９）（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）を有 し、これは毒性ＮＤＶ株で要求されると判明している配列（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｅｓｐｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８；ＭｃＧｉｎｎｅｓ．ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８６ ；Ｔｏｙｏｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８７）と一致していた。ＮＤＶ毒性株に感 染した細胞中で合成されるＨＮ糖タンパク質は分解されていない７４ｋＤａの糖 タンパク質である。例えばＵｌｓｔｅｒおよびＱｕｅｅｎｓｌａｎｄのような極 端に無毒性の株は、活性化には分解を要求するＨＮ（ＨＮ₀）をコードしている （Ｇａｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０）。ＦおよびＨＮ遺伝子のＴＲＯＶＡ Ｃ−ＮＤＶ中での発現を、遺伝子産物が正確にプロセシングされ、提供されてい るかどうかを確認するために分析した。ポリクローナル抗ＮＤＶニワトリ血清を 用いた、直接的ではない免疫蛍光により、免疫活性なタンパク質が感染細胞の表 面に提供されていることが確認された。両方のタンパク質が原形質膜上に提供さ れていることを決定するために、ＦもしくはＨＮ糖タンパク質のいずれかを発現 するワクシニア組換体に対するモノ特異的ウサギ血清が生成された。これらの 血清を用いた直接的でない免疫蛍光により、両方のタンパク質の表面での提供が 確認された。 イムノプレシピテーション実験を、親および組換えウイルスに感染させたＣＥ Ｆ細胞の（³⁵Ｓ）メチオニン標識破砕物を用いて行った。Ｆ₁およびＦ₂のグリコ シル化された状態での見かけの分子量の期待値は、それぞれ５４．７および１０ ．３ｋＤａである（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。ポリクロー ナル抗ＮＤＶ血清を用いたイムノプレシピテーション実験において、適当なサイ ズの融合特異的産物がＮＤＶ−Ｆ単独組換体ｖＦＰ２９（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ二重組換体ｖＦＰ９６から検出 された。適切なサイズのＨＮ糖タンパク質もまたＮＤＶ−ＮＨ単独組換体ｖＦＰ ４７（Ｅｄｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ から検出された。感染させなかった細胞、および親ＴＲＯＶＡＣを感染させたＣ ＥＦ細胞からはＮＤＶ特異的産物は検出されなかった。 ＣＥＦ細胞においてＦおよびＨＮ糖タンパク質は、適切に細胞表面上に提供さ れ、そこにおいてそれらはＮＤＶ免疫血清によって認識された。イムノプレシピ テーション分析により、毒性株で要求されるようにＦ₀タンパク質は正確にＦ₁お よびＦ₂成分へと分解されることが示された。同じようにＨＮ糖タンパク質は組 換体ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶに感染させたＣＥＦ細胞中で正確にプロセシングされ た。 以前の報告（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｅｄｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ａ，ｂ，ｃ ；Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）では、ＨＮもしくはＦのいずれかのみ の発現で、ＮＤＶ投与に対する防御免疫の誘導には十分であると示唆されていた 。しかしながら、他のパラミクソウイルスについての研究により、十分な防御免 疫には両方のタンパク質に対する抗体要求され得ることが示唆されている。ＳＶ ５ウイルスはＨＮ糖タンパク質に対する抗体の存在下で組織培養中に拡散できる が、Ｆ糖タンパク質に対する抗体の場合はできない。（Ｍｅｒｚ ｅｔ ａｌ． ，１９８０）。加えて、殺された麻疹ウイルスワクチンでのワクチン失敗は融合 成分の不活性化によるものであると提案されている（Ｎｏｒｒｂｙ ｅｔ ａｌ ．， １９７５）。両方のＮＤＶ糖タンパク質はウイルス中性化抗体の誘導に反応性で ある（Ａｖｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９７９）、および両方の糖タンパク質は、 独立してニワトリポックスベクターで発現された場合にも防御的免疫反応を誘導 できることが示されているが、最も効果的なＮＤＶワクチンには両方の糖タンパ ク質を発現しなくてはならないことが理解されている。実施例９ 狂犬病ウイルス糖タンパク質 Ｇを発現する ＡＬＶＡＣ組換体の構築 本実施例では、カナリアポックスウイルスベクター、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶ ＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）と命名されたカナリアポックス−狂犬病組換体の開発 およびその安全性と効率を記述する。 細胞とウイルス 親カナリアポックス（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株）はカナリア のためのワクチン株である。ワクチン株は野生株単離体から得られ、ニワトリ胚 繊維芽細胞上で２００回以上の継代を通して弱毒化された。マスターウイルスシ ードは４回の連続した寒天下プラークハイブリダイゼーションにかけられ、１つ のプラーククローンがさらに５回の付加的な継代により増幅され、その後ストッ クウイルスが親株として生体外組換え試験において用いられた。プラーク精製さ れたカナリアポックス単離体はＡＬＶＡＣと命名された。 カナリアポックス挿入ベクターの構築 ８８０ｂｐのカナリアポックスＰｖｕ ＩＩ断片を、ｐＵＣ９中のＰｖｕＩＩサイトの間にクローン化し、ｐＲＷ７６４ ．５とした。この断片の配列を図８（配列番号６６）中の位置１３７２および２ ２５１の間に示す。Ｃ５と命名されたオープンリーディングフレームの限定が決 定された。オープンリーディングフレームは断片中の位置１６６から開始され、 位置４８７で終了することが決定された。オープンリーディングフレームに干渉 することなくＣ５の欠失がなされた。位置１６７から位置４５５までの塩基は配 列（配列番号３９） により置換された。この置換用配列はＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、およびＥｃｏ ＲＩ挿入サイトおよび、それに続くワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼによ って認識される翻訳停止および転写終結シグナル（Ｙｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，１ ９８７）を有している。Ｃ５ ＯＲＦ欠失は以下に記述されるように行った。プ ラスミドｐＲＷ７６４．５を部分的にＲｓａＩで切断し、直線状産物を単離した 。ＲｓａＩ直線状断片を再びＢｇｌＩＩで切断し、今、位置１５６から位置４６ ２へのＲｓａＩからＢｇｌＩＩへの欠失のあるｐＲＷ７６４．５断片を単離し、 以下の合成ヌクレオチドのためのベクターとして用いた： （配列番号４０および４１） オリゴヌクレオチドＲＷ１４５およびＲＷ１４６をアニーリングさせ、ｐＲＷ７ ６４．５ＲｓａＩおよびＢｇｌＩＩベクターに上記のように挿入した。その結果 生成されたプラスミドはｐＲＷ８３１と命名された。 狂犬病Ｇ遺伝子を含む挿入ベクターの構築 ｐＲＷ８３８の構築を以下に記述 する。オリゴヌクレオチドＡからＥは、Ｈ６プロモーターの翻訳開始コドンおよ び狂犬病ＧのＡＴＧとオーバーラップしているが、これらをｐＵＣ９中にｐＲＷ ７３７としてクローン化した。オリゴヌクレオチドＡからＥはＨ６プロモーター 、ＮｒｕＩでの開始、狂犬病ＧのＨｉｎｄＩＩＩを通ってそれに続くＢｇｌＩＩ を含んでいる。 オリゴヌクレオチドからＥ（（配列番号４２）−（配列番号４６））の配列は： アニーリングさせたオリゴヌクレオチドＡからＥの配置は以下の通りである： オリゴヌクレオチドＡからＥをキナーゼ処理し、アニーリングさせ（９５℃、 ５分間、続いて室温まで冷却）、ｐＵＣ９のＰｖｕＩＩサイトに挿入した。その 結果生成されたプラスミドｐＲＷ７３７を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで 切断し、ｐｔｇ１５５ＰＲＯ（Ｋｉｅｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４）の１．６ ｋｂＰのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片のためのベクターとして用い、ｐＲＷ ７３９を生成した。ｐｔｇ１５５ＰＲＯのＨｉｎｄＩＩＩサイトは狂犬病Ｇ遺伝 子の翻訳開始コドンから８６ｂｐ下流にある。ＢｇｌＩＩはｐｔｇ１５５ＰＲＯ 中の狂犬病Ｇ遺伝子翻訳終了コドンの下流にある。ｐＲＷ７３９を部分的にＮｒ ｕＩで切断し、完全にＢｇｌＩＩで切断し、以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕ ｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｈ６プロモーターの３’末端を狂犬病Ｇ遺伝子全 体を通して含んでいる１．７ｋｂｐのＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ｐＲＷ８２ ４のＮｒｕ工およびＢａｍＨＩサイトの間に挿入した。その結果生成されたプラ スミドはｐＲＷ８３２と命名された。ｐＲＷ８２４への挿入によりＮｒｕＩのＨ ６プロモーター５’を付加した。ｐＲＷ８２４の、ＳｍａＩが続いているＢａｍ ＨＩの配列は（配列番号４７）：ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧである。ｐＲＷ８２４ は、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターに正確に連結した非関連遺伝子を有し ている。ＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩでの消化によりこの非関連遺伝子を完全に切 り出した。１．８ｋｂｐｐＲＷ８３２のＳｍａＩ断片は、Ｈ６プロモートされた 狂犬病Ｇを有しており、ｐＲＷ８３１のＳｍａＩサイト中に挿入され、プラスミ ドｐＲＷ８３８を生成した。 ＡＬＶＡＣ−ＲＧの開発 プラスミドｐＲＷ８３８を、ＡＬＶＡＣを感染させ た初期ＣＥＦ細胞に、以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１ ９８２；Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）リン酸カルシウム沈殿法に より形質導入した。狂犬病Ｇ遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーション に基づいて陽性プラークを選択し、純粋な集団が達成させるまで６回の連続した プラーク精製過程にかけた。１つの代表プラークが続いて増幅され、その結果生 成されたＡＬＶＡＣ組換体はＡＬＶＡＣ−ＲＧと命名された（ｖＣＰ６５）（図 ９Ａおよび９Ｂもまた参照されたい）。狂犬病Ｇ遺伝子のＡＬＶＡＣゲノムへの 、続いて起こる変異なしでの正確な挿入を、配列分析により確認した。 免疫蛍光 成熟狂犬病ウイルス粒子の集合の最後の段階で、糖タンパク質成分 はゴルジ体から、細胞質へ伸長しているカルボキシ末端および細胞膜の外側表面 上のタンパク質のバルクとともにそれが蓄積する原形質膜へと輸送される。ＡＬ ＶＡＣ−ＲＧで発現された狂犬病糖タンパク質が正確に提供されていることを確 認するために、ＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させた初期ＣＥＦ細胞 について免疫蛍光を行った。免疫蛍光は以前に記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、狂犬病Ｇモノクローナル抗体を用いて行った。Ａ ＬＶＡＣ−ＲＧに感染させたＣＥＦ細胞では強力な表面蛍光が検出されたが、親 ＡＬＶＡＣに感染させたものは検出されなかった。 イムノプレシピテーション 予め形成された初期ＣＥＦ単層、Ｖｅｒｏ（アフ リカグリーンモンキー腎臓細胞の系統、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１）およびＭＲＣ− ５細胞（ノーマルヒト胎児肺組織から派生した繊維芽様細胞系統、ＡＴＣＣ＃Ｃ ＣＬ１７１）を、１０ｐｆｕの親ウイルスＡＬＶＡＣおよび組換えウイルスＡＬ ＶＡＣ−ＲＧで放射性標識³⁵Ｓ−メチオニンの存在下で接種し、以前に記述され たように処理した（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。イムノプレシピ テーションを、狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いて行った。約６７ｋＤ ａの分子量の狂犬病特異的糖タンパク質の効果的な発現が組換体ＡＬＶＡＣ−Ｒ Ｇに関して検出された。感染させていない細胞もしくは親ＡＬＶＡＣウイルスに 感染させた細胞においては、狂犬病特異的産物は検出されなかった。 連続継代実験 非鳥類種の範囲でのＡＬＶＡＣウイルスの研究においては、拡 散的感染も明白な病気も観察されなかった（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９ ９１ｂ）。しかしながら、親も組換体もどちらも非鳥類種細胞中で増殖可能に適 応しないようにするために、連続継代実験を行った。 ２つのウイルス、ＡＬＶＡＣとＡＬＶＡＣ−ＲＧを３種類の細胞系統で１０連 続盲継代（ｂｌｉｎｄ ｐａｓｓａｇｅ）を行った： （１）１１日経過白レグホン胚から調製された初期ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ ）細胞； （２）Ｖｅｒｏ細胞−アフリカグリーンモンキー腎臓細胞の連続系統（ＡＴＣ Ｃ＃ＣＣＬ８１）； （３）ＭＲＣ−５細胞−ヒト胎児肺組織から派生した二倍体細胞系統（ＡＴＣ Ｃ＃ＣＣＬ１７１）。 最初の接種は０．１ｐｆｕ／細胞のｍ．ｏ．ｉで、一皿あたり２×１０⁶の細胞 を含む３枚の６０ｍｍのディッシュを用いて行った。ひとつのディッシュは、４ ０μｇ／ｍｌのＤＮＡ複製阻害剤シトシンアラビノシド（Ａｒａ Ｃ）の存在下 で接種した。１時間、３７℃での吸収期間の後、接種物を取り除き、単層を吸収 されなかったウイルスを除去するために洗浄した。このとき、培地を、２つのデ ィッシュ（試料ｔ０からｔ７）では５ｍｌのＥＭＥＭ＋２％ ＮＢＣＳで、第３ のディッシュでは４０μｇ／ｍｌのＡｒａ Ｃを含む５ｍｌのＥＭＥＭ＋２％Ｎ ＢＣＳで（試料ｔ７Ａ）置換した。残存投入ウイルスの指標を提供するため、試 料ｔ０は−７０℃で凍結した。試料ｔ７およびｔ７Ａを３７℃で７日間保温し、 その後で内容物を回収し細胞を非直接的超音波破砕により破砕した。 それぞれの細胞系統のｔ７試料の１ｍｌを希釈せずに、同じ細胞系統の３枚の ディッシュ（試料ｔ０、ｔ７およびｔ７Ａを提供するため）に、そして１枚の初 期ＣＥＦ細胞のディッシュに接種した。試料ｔ０、ｔ７およびｔ７Ａを継代１と して扱った。付加的なＣＥＦ細胞への接種は、非鳥類種の細胞中に存在するかも 知れないウイルスの、より高感度の検出のための増幅工程である。 この工程を１０回（ＣＥＦおよびＭＲＣ−５）または８回（Ｖｅｒｏ）の連続 盲継代について繰り返した。試料は続いて３回凍結、融解させ、初期ＣＥＦ単層 上での滴定によりアッセイした。 それぞれの試料中のウイルス収量を、寒天下のＣＥＦ単層上のプラーク滴定に より決定した。まとめた実験の結果を表１および２に示す。 結果より、親ＡＬＶＡＣおよび組換体ＡＬＶＡＣ−ＲＧは両方ともＣＥＦ単層 上で力価の損失なしに持続した複製が可能であることが示唆された。Ｖｅｒｏ細 胞においては、ＡＬＶＡＣは２回の継代で、そしてＡＬＶＡＣ−ＲＧは１回の継 代で、ウイルスレベルは検出レベル以下に低下した。ＭＲＣ−５細胞においては 、同様の結果が明白となり、１継代の後はウイルスは検出されなかった。表５お よび６には４継代の結果のみを示したが、この一連の工程はＶｅｒｏについては ８継代、ＭＲＣ−５については１０継代続けたが、いずれのウイルスも非鳥類種 細胞中で増殖可能であるような検出可能な適応は無かった。 継代１においては、比較的高いレベルのウイルスが、ＭＲＣ−５およびＶｅｒ ｏ細胞のｔ７試料中に存在していた。しかしながら、このウイルスのレベルはｔ ０試料、およびウイルス複製が起こり得ないシトシンアラビノシドの存在下で保 温されたｔ７Ａ試料においてみられたものと同等であった。このことは、非鳥類 種細胞で７日に見られたウイルスレベルは、新たに複製されたウイルスではなく 残存ウイルスを示していることを表している。 アッセイをより敏感にするため、それぞれの細胞系統からの７日の回収物を許 容的ＣＥＦ単層に接種し、細胞改変効果（ＣＰＥ）が得られた時点、またＣＰＥ が見られなかった場合は７日で回収した。この実験の結果を表３に示す。許容的 細胞系統を通した増幅の後ですらも、ＭＲＣ−５およびＶｅｒｏ細胞は付加的な ２継代においてのみ検出された。これらの結果は、用いられた条件においては、 いずれのウイルスもＶｅｒｏもしくはＭＲＣ−５細胞中での増殖への適応は無か ったことを示している。 マカク（Ｍａｃａｑｕｅ）への接種 ４匹のＨＩＶ血清陽性マカクを最初にＡ ＬＶＡＣ−ＲＧで表８に記述したように接種した。１００日後、これらの動物を ブースター効果を決定するために再接種し、さらに付加的に７匹の動物をある投 与量範囲で接種した。血液を適当な間隔で取り出し、５６℃、３０分間熱失活さ せた後、抗狂犬病抗体の存在について、高速蛍光焦点阻害アッセイ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９７３）を用いて血清を分析した。 チンパンジーへの接種 ２匹の雄成チンパンジー（５０−６５ｋｇの体重範囲 ）を、１×１０⁷ｐｆｕのｖＣＰ６５で筋肉内または皮下で接種した。動物は反 応を観察し、ＲＦＦＩ試験（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９７３）による抗狂 犬 病抗体の存在分析のために定期的に採血した。動物を、最初の接種から１３週間 後に同じ投与量で再接種した。 マウスへの接種 マウスの群を５０−１００μｌの範囲の異なったバッチのｖ ＣＰ６５の希釈液で接種した。マウスは足部で接種された。１４日目に、１５− ４３マウスＬＤ５０の狂犬病ウイルス毒性ＣＶＳ株を頭蓋内接種で投与した。マ ウスの生存を観察し、５０％防御率（ＰＤ₅₀）を、接種後２８日に計算した。 イヌおよびネコへの接種 生後５ケ月の１０匹のビーグル犬および生後４ケ月 の１０匹のネコに、６．７もしくは７．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀のＡＬＶＡＣ−Ｒ Ｇを皮下で接種した。４匹のイヌおよびネコには接種しなかった。動物から接種 後１４および２８日に採血し、抗狂犬病抗体をＲＦＦＩ試験で評価した。６．７ ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀のＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した動物には接種後２９日に、３ ．７ｌｏｇ₁₀マウスＬＤ₅₀（イヌ）もしくは４．３ｌｏｇ₁₀マウスＬＤ₅₀（ネコ ）のＮＹＧＳ狂犬病ウイルス投与株を投与した。 リスザルへの接種 ４匹のリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）の ３つの群に、３つのウイルス、（ａ）ＡＬＶＡＣ、親カナリアポックスウイルス 、（ｂ）ＡＬＶＡＣ−ＲＧ、狂犬病Ｇ遺伝子を発現する組換体、または（ｃ）ｖ ＣＰ３７、ネコ白血病ウイルスエンベローブ糖タンパク質を発現するカナリアポ ックス組換体、の１つを接種した。接種は、ケタミン麻酔（ｋｅｔａｍｉｎｅ ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ）のもとで行った。各々の動物は同時：（１）２０μｌ を右目の表面に傷付処理なしに点眼；（２）１００μｌを口内へいくつかの水滴 として；（３）１００μｌを、右腕の外側表面の剃った皮膚上の２つの皮内接種 部位それぞれに；（４）１００μｌを右大腿部前方筋肉中に受け取った。 ４匹の猿に各々のウイルスを、２匹はトータルで５．０ｌｏｇ₁₀ｐｆｕ、２匹 はトータルで７．０ｌｏｇ₁₀ｐｆｕ接種した。動物から規則的な間隔で採血し、 血清をＲＦＦＩ試験（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９７３）を用いて抗狂犬病 抗体の存在に関して分析した。動物のワクチン接種に対する反応を毎日観察した 。最初の接種の６ケ月後、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを受け取った４匹の猿、最初にｖＣ Ｐ３７を受け取った２匹の猿、最初にＡＬＶＡＣを受け取った２匹の猿に加えて 接種されていない猿に、６．５ｌｏｇ₁₀ｐｆｕのＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下接種し た。 ＲＦＦＩ試験（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９７３）により狂犬病中和抗体の 存在について血清を観察した。 ヒト細胞系統へのＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種 ウイルスが生産的に複製されない 非鳥類種細胞中で、外来遺伝子の効率的な発現が得られるか否かを決定するため 、５つの細胞型、１つは鳥類種で４つは非鳥類種を、ウイルス収量、外来狂犬病 Ｇ遺伝子の発現およびウイルス特異的ＤＮＡ蓄積に関して分析した。接種された 細胞は： （ａ）Ｖｅｒｏ、アフリカグリーンモンキー腎臓細胞、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１ ； （ｂ）ＭＲＣ−５、ヒト胚肺、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１； （ｃ）ＷＩＳＨ、ヒト羊膜、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２５； （ｄ）デトロイト−５３２、ヒト包皮、ダウン症、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ５４；お よび （ｅ）初期ＣＥＦ細胞。 １１日経過白レグホン胚から調製されたニワトリ胚繊維芽細胞を陽性コントロ ールとして含んだ。全ての接種は、予め形成された２×１０⁶の細胞の単層につ いて以下に記述するように行った。 Ａ ＤＮＡ分析の方法 ３枚のそれぞれの細胞系統のディッシュを５ｐｆｕ／細胞のウイルスで試験の もとで接種し、別の１つのそれぞれの細胞系統のディッシュを接種しないでおい た。１つのディッシュは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（Ａｒａ Ｃ） の存在下で保温した。３７℃、６０分間の吸収期間の後、接種物を取り除き、単 層を吸収されなかったウイルスを除去するために２回洗浄した。培地（Ａｒａ Ｃが存在もしくは不在）は続いて置換された。１つのディッシュ（Ａｒａ Ｃ無 し）からの細胞を、時間０の試料として回収した。残りのディッシュは、３７℃ で７２時間保温し、そのとき細胞を回収しＤＮＡ蓄積分析に用いた。２×１０⁶ の細胞それぞれは、０．５ｍｌの４０ｍＭＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水（Ｐ ＢＳ）に再懸濁し、３７℃で５分間保温した。等量の、４２℃で予め保温された １２０ｍＭのＥＤＴＡを含む１．５％アガロースを細胞懸濁液に加え、穏やかに 混合した。懸濁液はアガロースプラグ型へ移され少なくとも１５分固定化された 。アガロースプラグを続いて取り除き、プラグを完全にカバーする量の溶解バッ ファー（１％サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）、１００μｇ／ｍｌプロテイナー ゼＫ、１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５、２００ｍＭＥＤＴＡ）中で１２−１６分 間５０℃で保温した。溶解バッファーを、続いて５．０ｍｌの滅菌０．５ｘＴＢ Ｅ（４４．５ｍＭトリス−ホウ酸、４４．５ｍＭホウ酸、、０．５ｍＭＥＤＴＡ ）で置換し、４℃で６時間にわたり３回ＴＢＥバッファーを交換して平衡化した 。プラグ内のウイルスＤＮＡをパルスフィールド電気泳動により細胞ＲＮＡおよ びＤＮＡと分画した。電気泳動は２０時間にわたり１８０Ｖで５０−９０秒のラ ンプで、１５℃、０．５ｘＴＢＥ中で行った。ＤＮＡはラムダＤＮＡ分子量スタ ンダードとともに泳動した。電気泳動後、ウイルスＤＮＡバンドはエチジウムブ ロミド染色により可視化した。ＤＮＡは続いてニトロセルロース膜に移され、精 製ＡＬＶＡＣゲノムＤＮＡから調製された放射性標識プローブで探索した。 Ｂ．ウイルス収量の評価 投入多重度を０．１ｐｆｕ／細胞にしたこと以外は、正確に上記のようにディ ッシュに接種した。感染後７２時間で、３回連続の凍結融解サイクルにより破砕 した。ウイルス収量はＣＥＦ単層上のプラーク滴定により評価した。 Ｃ．狂犬病Ｇ遺伝子の発現の分析 多重度１０ｐｆｕ／細胞で、組換体もしくは親ウイルスをディッシュに接種し 、さらに付加的は１つのディッシュをウイルス感染させていない対照とした。１ 時間の吸収期間の後、培地を取り除きメチオニンフリーの培地で置換した。３０ 分の期間の後に、この培地を２５μＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓ−メチオニンを含むメチオ ニンフリー培地で置換した。感染させた細胞を一晩標識し、続いてバッファーＡ 溶解バッファーを添加して溶解させた。イムノプレシピテーションを、狂犬病Ｇ 特異的モノクローナル抗体を用いて、以前に記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）行った。 結果：ウイルス収量の評価 ０．１ｐｆｕ／細胞での接種後７２時間後の収量 の滴定の結果を表５に示す。この結果は、鳥類細胞においては生産的感染がなさ れうる一方で、４つの非鳥類種細胞システムでは、ウイルス収量の増加はこの方 法では検出されなかったことを示唆している。 ウイルスＤＮＡの蓄積の分析 生産的ウイルス複製の防御が、ＤＮＡ複製の前 で行われているかもしくは後でかを決定するために、細胞破砕物由来のＤＮＡを 電気泳動により分画し、ニトロセルロース膜に移し、ウイルス特異的ＤＮＡの存 在を探索した。感染させなかった細胞、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させた時間０の ＣＥＦ細胞、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させた感染後７２時間のＣＥＦ細胞、およ び４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシドの存在下でＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染さ せた感染後７２時間のＣＥＦ細胞由来のＤＮＡは全て、いくらかの、恐らくは放 射性標識ＡＬＶＡＣ ＤＮＡプローブの調製におけるＣＥＦ細胞ＤＮＡの混入に よるバックグラウンド活性を示した。しかしながら、感染後７２時間のＡＬＶＡ Ｃ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞は、ＡＬＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ蓄積を示す約３５ ０ｋｂｐの領域にある強いバンドを示した。このようなバンドは、培地をＤＮＡ 合成阻害剤シトシンアラビノシドの存在下で保温した場合には検出されなかった 。Ｖｅｒｏ細胞中で生成された相当する試料では、ＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させ た時間０のＶｅｒｏ細胞において、約３５０ｋｂｐのかすかなバンドが示された 。このレベルは残存ウイルスを示す。バンドの強度は、感染後７２時間には増幅 されており、ウイルスの繁殖の増加とはならないＶｅｒｏ細胞において、いくら かのレベルのウイルス特異的ＤＮＡの複製が起こっていることが示唆された。Ｍ ＲＣ−５細胞で生成された相当する試料は、この細胞系統では、これらの条件下 ではウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は検出されないことを示唆していた。この実験 を続いて付加的なヒト細胞系統、特にＷＩＳＨおよびデトロイト５３２細胞を含 むように拡張した。ＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞を陽性コントロールとして用意し た。ＡＬＶＡＣ−ＲＧで接種した、ＷＩＳＨ、デトロイト５３２細胞のいずれに おいても、ウイルス特異的ＤＮＡ蓄積は検出されなかった。この方法の検出限界 はまだ十分に確認されておらず、この方法の感度より低いレベルで、ウイルスＤ ＮＡ蓄積は起こっているかも知れないことは注意されるべきである。ウイルスＤ ＮＡ複製を³Ｈチミジンの取り込みによって測定した別の実験は、Ｖｅｒｏおよ びＭＲＣ−５について得られた結果を支持していた。 狂犬病Ｇ遺伝子の発現の分析 いずれかの遺伝子、特に挿入した外来遺伝子の 発現が、ウイルスＤＮＡ複製のないヒト細胞系列中で起こるか否かを決定するた め、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させた、³⁵Ｓ−メチオニン標識さ れた鳥類および非鳥類細胞破砕物についてイムノプレシピテーション実験を行っ た。狂犬病Ｇ遺伝子特異的モノクローナル抗体を用いたイムノプレシピテーショ ンの結果は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させたＣＥＦ、ＶｅｒｏおよびＭＲＣ−５ ＷＩＳＨおよびデトロイト細胞中で６７ｋＤａの糖タンパク質のイムノプレシピ テーションを示した。このような特異的狂犬病遺伝子産物は、感染させていない か又は親に感染させた細胞破砕物からは検出されなかった。 この実験の結果は、分析されたヒト細胞系統中では、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ組換体 は感染を開始しＨ６ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターの転写制御のも とで外来遺伝子を発現することは可能であるが、ＤＮＡ複製を通した複製は進行 せず、いかなる検出可能なウイルス繁殖の生成も見られなかった。Ｖｅｒｏ細胞 中においては、いくらかのレベルでのＡＬＶＡＣ−ＲＧ特異的ＤＮＡ蓄積は見ら れたが、これらの方法によってはウイルス繁殖は検出されなかった。これらの結 果は、分析されたヒト細胞系統中ではウイルス複製の防御はＤＮＡ複製の開始に 先だって起こるが、その一方Ｖｅｒｏ細胞中では防御はウイルスＤＮＡ複製の開 始に続いて起こることを示唆しているであろう。 ＡＬＶＡＣ−ＲＧにおいて発現された狂犬病糖タンパク質が免疫原性か否かを 決定するため、多くの動物種をこの組換体の接種により試験した。現在の狂犬病 ワクチンの効率はマウスモデルシステムで評価されている。それ故、ＡＬＶＡＣ −ＲＧを用いた同様の試験を行った。９つの異なったウイルス調製物（シードウ イルスを１０連続の組織培養継代後に生成されたワクチンバッチ（Ｊ）を含む） を、６．７から８．４のｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌの感染力価の範囲で連続的に 希釈し、５０から１００μｌの希釈液を４匹の生後６週間のマウスの足部に接種 した。マウスに１４日後に頭蓋内経路で、対照マウスグループ中の致死滴定によ り決定された１５から４３マウスＬＤ₅₀を含む３００μｌの狂犬病ウイルスＣＶ Ｓ株を投与した。ＰＤ₅₀（５０％防御量）として表された能力を、投与後１４日 に計算した。この実験の結果を表６に示す。この結果から、ＡＬＶＡＣ−ＲＧは 一貫して、３．３３から４．５６、平均３．７３（標準偏差０．４８）のＰＤ₅₀ 値の範囲で狂犬病ウイルス投与に対してマウスを防御可能であることが示された 。この研究の拡散として、雄マウスを、６．０ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀のＡＬＶＡＣ を含む５０μｌのウイルス、または等量の感染させていない細胞懸濁液で頭蓋内 に接種した。マウスを接種後１日、３および６日に犠牲にし、脳を取り除き、固 定し、分画した。組織病理学的試験により、マウス中でのＡＬＶＡＣ−ＲＧの神 経毒性の証拠は無いことが示された。 ＡＬＶＡＣ−ＲＧのイヌおよびネコに対する安全性と効率を評価するため、１ ４の生後５ケ月のビーグル犬の群および１４の生後４ケ月のネコの群を試験した 。それぞれの種の４匹の動物はワクチン接種されなかった。５匹の動物は６．７ １ｏｇ₁₀ＣＩＤ₅₀を皮下で受け取り、５匹の動物は７．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀を 同じ経路で受け取った。動物は抗狂犬病抗体の分析のために採血された。接種さ れなかったまたは６．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀を受け取った動物に、接種後２９日 目に３．７ｌｏｇ₁₀マウスＬＤ₅₀（イヌ、側頭中）または４．３ｌｏｇ₁₀マウス ＬＤ₅₀（ネコ、首中）のＮＹＧＳ狂犬病ウイルス投与株を投与した。この実験の 結果を表７に示した。 いずれの投与量についても、イヌ、ネコいずれにおいても接種に対する不利な 反応は見られなかった。６．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀で免疫化された５匹のイヌの うちの４匹は、ワクチン接種後１４日で抗体力価を有し、２９日には全てのイヌ が有していた。全てのイヌは、対照の４匹中３匹を殺した投与に対して保護され た。ネコにおいては、６．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀を受け取った５匹のうち３匹が 、１４日に特異的抗体力価を有し、２９日には全てのネコが陽性であったが平均 抗体力価は２．９ＩＵと低かった。全ての対照を殺した投与に対して５匹中３匹 が生き残った。７．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀で免疫化された全てのネコは１４日に 抗体力価を有し、２９日には、相乗平均力価は８．１国際単位と計算された。 リスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ− ＲＧおよび関係のないカナリアポックスウイルス組換体の接種に対する免疫反応 を調べた。猿のグループを上記のように接種し、狂犬病特異的抗体の存在につい て血清分析した。皮内経路の接種に対する軽度の典型的な皮膚反応は別にして、 不利な反応はいずれの猿においても見られなかった。少量の残存ウイルスが皮膚 外傷から、皮下接種の後、接種後２日および４日のみに単離された。全ての検体 ７日およびそれ以降は陰性だった。筋内接種に対する局部反応は無かった。ＡＬ ＶＡＣ−ＲＧで接種された４匹の全ての猿が、ＲＦＦＩ試験で測定された抗狂犬 病血清中性化抗体を生産した。最初の接種から約６ケ月後、全ての猿および１匹 の付加的な接種されていない猿に、６．５ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀のＡＬＶＡＣ−Ｒ Ｇを、皮下経路で左大腿部の外側表面上に再び接種した。抗狂犬病抗体の存在に ついて血清を分析した。結果を表８に示す。 狂犬病にかかったことのない５匹の猿のうち４匹が、ＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種 後７日までに血清学的反応を生成した。接種後１１日までには、５匹の猿全てが 検出可能な抗体を有していた。前に狂犬病糖タンパク質にさらした４匹の猿の、 全てがワクチン接種後の３日と７日との間に顕著な血清中性化力価の増加を示し た。この結果はリスザルのＡＬＶＡＣ−ＲＧでのワクチン接種は、不利な副作用 を引き起こさず、初期中性化抗体反応が誘導されうることを示している。アムナ ネスティック（ａｍｎａｎｅｓｔｉｃ）反応もまた再ワクチン接種で誘導される 。ＡＬＶＡＣもしくは無関係の外来遺伝子を発現するカナリアポックス組換体へ の事前の接種は、再ワクチン接種時の抗狂犬病免疫反応の誘導に影響しなかった 。 ＨＩＶ−２血清陽性マカクのＡＬＶＡＣ−ＲＧ接種に対する免疫的反応を評価 した。動物は上記のように接種され、抗狂犬病血清中性化抗体の存在をＲＦＦＩ 試験によって評価した。その結果は、表９に示されているが、皮下経路で接種さ れたＨＩＶ−２陽性動物は、抗狂犬病抗体を１回の接種の１１日後までに生成し た。アムナネスティック反応が、最初の接種の約３ケ月後に与えられたブースタ ー接種の後で検出された。経口経路で組換体を受け取った動物においては反応は 検出されなかった。加えて、一連の６匹の動物を、減少させた量のＡＬＶＡＣ− ＲＧで筋内または皮下経路のいずれかで接種した。接種された６匹の内の５匹が 、接種後１４日までに、抗体力価に顕著な差もなく反応した。ＨＩＶに事前にさ らされたチンパンジーを、７．０ｌｏｇ₁₀ｐｆｕのＡＬＶＡＣ−ＲＧで皮下もし くは筋内経路で接種した。接種後３ケ月に、両方の動物を同じ方法で再接種した 。結果を表１０に示す。 筋内もしくは皮下のいずれの経路でも、不利な反応は見られなかった。両方の チンパンジーは最初の接種に１４日までに反応し、再接種に続いて強力な上昇反 応が検出された。 実施例１０ 狂犬病糖タンパク質を発現する カナリアポックスウイルス（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ；ｖＣＰ６５） を用いたヒトの免疫化 ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）は実施例９および図９Ａおよび９Ｂで記述さ れたように開発された。ワクチン製造をスケールアップするために、ＡＬＶＡＣ −ＲＧ（ｖＣＰ６５）を特定の病原体のない卵から派生した初期ＣＥＦ細胞中で 増殖させた。細胞を多重度０．０１で感染させ、３７℃で３日間保温した。 ワクチンウイルス懸濁液を、血清フリーの培地中の感染させた細胞の超音波破 砕により得た；細胞破片を遠心分離と濾過により取り除いた。その結果得られた 清澄化された懸濁液にリンパ形成安定剤（アミノ酸混合物）を加え、１回分の量 ごとにバイアルに小分けし、凍結乾燥した。血清フリー培地およびリンパ形成安 定剤中のウイルス懸濁液を１０倍ごとに連続して希釈することにより、力価が減 少してゆく３つのバッチをリンパ形成に先だって調製した。 細胞基質、培地およびウイルスシードおよび最終産物の品質制御テストを、実 験室齧歯類中での無害性および偶発的な作用物に注意しながら行った。望ましく ない特徴は何も発見されなかった。 臨床前データ 生体外での研究により、ＶｅｒｏまたはＭＲＣ−５細胞はＡＬ ＶＡＣ−ＲＧの増殖を支持しないことが示された；一連の８（Ｖｅｒｏ）および １０（ＭＲＣ−５）盲連続継代により、ウイルスのこれらの非鳥類細胞系統中で の増殖への検出可能な適応は引き起こされなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ ６５）を感染もしくは接種したヒト細胞系統（ＭＲＣ−５、ＷＩＳＨ、デトロイ ト５３２、ＨＥＬ、ＨＮＫもしくはＥＢＶを形質転換したリンパ芽球細胞）の分 析で、ウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は見られず、これらの細胞内においてはＤＮ Ａ合成に先だって複製のブロックが起きていることが示唆された。しかしながら 、重要なことには、狂犬病ウイルス糖タンパク質遺伝子の発現は、試験された全 ての細胞系統において、カナリアポックス複製サイクルの中止段階はウイルスＤ ＮＡ複製に先だって行われることを示している。 ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の安全性および効率は、動物における一連の 実験で立証された。カナリア、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、実験室齧歯類（乳 児および成マウス）、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコおよびイヌ、リス ザル、アカゲザルマカク、およびチンパンジーに、１０⁵から１０⁸ｐｆｕの範囲 にある量を接種した。多様な経路が用いられ、もっとも一般的には皮下、筋内お よび皮内であったが、経口（サルおよびマウス）および頭蓋（マウス）内も用い られた。 カナリアにおいては、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）は乱切部位において「 受け入れ」外傷を、病気の兆候または死を伴わずに引き起こした。ウサギへの皮 内接種は、拡散せずに７−１０日で治る典型的なポックス接種反応を引き起こし た。これらの動物実験のいずれにおいても、カナリアポックスによる望ましくな い副作用は見られなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の接種に続いて、 齧歯類、イヌ、ネコ、および霊長類において、高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩ Ｔ）で測定された抗狂犬病抗体が生産されたことにより、免疫原性が立証された 。ＡＬＶＡＣ−ＲＧで免疫化されたマウス、イヌ、およびネコにおける狂犬病ウ イルス投与実験により、防御が立証された。 ボランティア ２５人の健康な、２０−４５歳の年齢で、以前に狂犬病免疫の 経歴のない成人を登録した。彼らの健康状態を完全な医学的経歴、生理的試験、 血液学および血液化学分析により評価した。除外基準には、妊娠、アレルギー、 あらゆる種類の免疫抑制、慢性衰弱病、ガン、過去３ケ月以内の免疫グロブリン の注入、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＢ型肝炎表面抗原に対 する血清陽性が含まれていた。 研究計画 参加者に無作為に標準ヒト二倍体細胞狂犬病ワクチン（ＨＤＣ）バ ッチ番号Ｅ０７５１（Ｐａｓｔｅｕｒ Ｍｅｒｉｅｕｘ Ｓｅｒｕｍｓ ＆ Ｖ ａｃｃｉｎｅ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）または研究用ワクチンＡＬＶＡＣ−Ｒ Ｇ（ｖＣＰ６５）を割り当てた。 この試みは量増加研究と命名された。実験用ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５） ワクチンの３つのバッチは、３つのグループのボランティア（グループＡＮＢお よびＣ）に順番に、各々の段階の間に２週間の間隔を置いて用いられた。３つの バッチの濃度はそれぞれ、１０^3.5、１０^4.5、１０^5.5組織培養感染量（ＴＣＩ Ｄ₅₀）／投与量であった。 それぞれのボランティアは、同じワクチンを４週間の間隔をおいて三角筋領域 に皮下で２投与量受け取った。注入されたワクチンの本質は、最初の接種時には 参加者には知られていなかったが、調査者には知られていた。 ２回目の注入時の、即時ヘルペス感受性の危険を最小化するため、実験ワクチ ンの中程度の量を割り当てられたグループＢのボランティアは、少ない量を１時 間前に接種され、大量を割り当てられたグループＣは、少量および中程度の量を １時間の間隔をおいて連続的に受け取った。 ６ケ月後、最も多い投与量のＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）（グループＣ） およびＨＤＣワクチンの受取人に、３回目の量のワクチンを要請した；彼らは無 作為に、前回と同じワクチンを受け取るかまたは別のワクチンを受け取るように された。その結果、以下の免疫化の手順に相当する４種類のグループが形成され た。１．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＨＤＣ；２．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖ ＣＰ６５）；３．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ ６５）−ＨＤＣ；４．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖ ＣＰ６５）−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）。 副作用の観察 全ての対象を注入後１時間観察し、次の５日間毎日再検査した 。彼らは局所的および全体的反応を次の３週間記録するよう要請され、１週間に ２回問診された。 実験室調査者 登録前およびそれぞれの接種後２、４および６日後の血液見本 を得た。分析は、完全血液細胞計数、肝臓酵素およびクレアチンキナーゼアッセ イを含んでいた。 抗体アッセイ 最初の注入の７日前および、研究の７、２８、３５、５６、１ ７３、１８７および２０８日に抗体アッセイを行った。 狂犬病に対する中性化抗体のレベルは、高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ） （Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｙａｅｇｅｒ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓ ｏｎ Ｒａｂｉｓ中）を用いて決定した。カナリアポックス抗体は直接ＥＬ ＩＳＡにより測定した。抗原である、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００で破壊した精製カ ナリアポックスウイルスの懸濁液をマイクロプレートにコートした。固定化され た血清の希釈液を室温で２時間反応させ、反応している抗体はペルオキシダーゼ で標識化された抗ヒトＩｇＧヤギ血清で明らかとされた。この結果は４９０ｎｍ の光学密度により表されている。 分析 ２５人の対象が登録され、研究を実行された。１０人の男性と１５人の 女性で平均年齢は３１．９歳であった（２１から４８まで）。３人を除く全ての 対象が以前に天然痘ワクチンの証拠を有していた；残りの対象の３人は典型的な 傷跡もワクチン接種経歴も有してはいなかった。３人の対象は少量の実験用ワク チン（１０^3.5、１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀）の投与量で受け取り、９人の対象は１０^{5. 5} ＴＣＩＤ₅₀の投与量で受け取り、１０人はＨＤＣワクチンを受け取った。 安全性（表１１） 最初のシリーズの免疫化の間、接種後２４時間以内に３７ ．７℃を超える熱が、１人のＨＤＣ受取人（３７．８℃）および１人のｖＣＰ６ ５ １０^5.5ＴＣＩＤ₅₀の受取人（３８℃）において見られた。ワクチン接種に 帰 属される他の全体的反応はいずれの受取人においても観察されなかった。 局所的反応は皮下でＨＤＣワクチンを接種された受取人１０人中９人で見られ 、ｖＣＰ６５の１０^3.5、１０^4.5、１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀での受取人ではそれぞれ ３人中０人、３人中１人および９人中９人であった。 圧痛はもっとも一般的な兆候であったが、つねに穏やかであった。他の局所的 兆候には、穏やかで一過性の赤化と硬化が含まれていた。全ての兆候は通常２４ 時間以内に沈静化し、７２時間以上は続かなかった。 血液細胞計数、肝臓酵素あるいはクレアチンキナーゼの値に顕著な変化は無か った。 免疫反応；狂犬病に対する中性化抗体（表１２） 最初の注入から２８日後に 全てのＨＤＣ受取人は防御的力価（０．５ＩＵ／ｍｌ以上）を有していた。これ とは対照的に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の受取人は、グループＡおよび Ｂ（１０^3.5、１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀）では０人が、グループＣ（１０^5.5ＴＣＩＤ_{5 0} ）では９人中２人のみがこの防御的力価に達していた。 ５６日目（即ち第２の接種から２８日後）には、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６ ５）の受取人のうち、グループＡでは３人中０人、グループＢでは３人中２人、 およびグループＣでは９人中９人においてこの防御的力価が達成され、１０人の ＨＤＣ受取人の全てにおいても保持されていた。 ５６日の相乗平均力価は、グループＡ、Ｂ、ＣおよびＨＤＣそれぞれにおいて ０．０５、０．４７、４．４および１１．５ＩＵ／ｍｌであった。 １８０日には、全ての対象において狂犬病抗体力価は実質的に減少していたが 、ＨＤＣ受取人１０人中５人、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）受取人９人中５ 人において最小防御力価である０．５ＩＵ／ｍｌより大きく残存していた；相乗 平均力価はグループＨＤＣおよびグループＣで、それぞれ０．５１および０．４ ５ＩＵ／ｍｌであった。 カナリアポックスウイルスに対する抗体（表１３） 観察された免疫化前力価 は、高い力価を示した対象が事前のカナリヤに接触していなかったにも拘わらず 、力価０．２２から１．２３Ｏ．Ｄ．単位で広く変化していた。免疫化前と２回 目の免疫化後の力価との間での２倍より大きい増加と定義した場合、血清変換は グ ループＢでは対象３人中１人、グループＣでは対象９人中９人で得られたが、Ｈ ＤＣまたはグループＡでは対象は１人も血清変換されなかった。 ブースター注入 ワクチンは同様に６ケ月後のブースター接種時にも十分耐性 があった：ＨＤＣブースター受取人９人中２人で、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６ ５）ブースター受取人１０人中１人で熱がみられた。局所的反応はＨＤＣブース ター受取人９人中６人で、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ブースター受取人９ 人中５人でみられた。 観察 図１３Ａ−１３Ｄは、狂犬病中性化抗体力価（高速蛍光焦点阻害試験（ ＲＦＦＩＴ）ＩＵ／ｍｌ）を示している：同じまたは別のワクチンで予め免疫化 されたボランティア体内におけるＨＤＣおよびｖＣＰ６５（１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀ ）のブースター効果。ワクチンは０、２８および１８７日および２０８日に与え られた。０、７、２８、３５、５６、１７３および１８０日に抗体力価を測定し た。 図１３Ａ−１３Ｄに示されるとおり、与えられたブースター量は免疫化の方式 に拘わらず全ての対象中で、狂犬病抗体力価のさらなる増加をもたらした。しか しながら、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ブースターは全体的に、ＨＤＣブー スターより低い免疫反応を誘導し、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡ Ｃ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）グループは他の３つ のグループより顕著に低い力価を有していた。同様に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣ Ｐ６５）ブースター注入は、ＨＤＣワクチンを以前に受け取った対象５人中３人 、および以前にＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫化された対象５人すべて において、カナリアポックス抗体力価の増加をもたらした。 全体として、ｖＣＰ６５の投与による局所的副作用は、ウイルスの局所的増殖 を示すものではなかった。特に、ワクチンの注入後にみられる等の皮膚の外傷は 無かった。見かけ上のウイルスの複製が無かったにも拘わらず、注入はボランテ ィアにおいて大量のカナリアポックスベクターおよび発現された狂犬病糖タンパ ク質の両方に対する抗体の生産をもたらした。 狂犬病中性化抗体は、マウス中の血清中性化試験と相関することが知られてい る高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）によりアッセイした。１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀ の受取人９人のうち、５人は最初の量の後より少ないレベルの反応を示した。 狂犬病抗体の防御的力価が、２回目の接種の後で、試験された多量の受取人の全 て、および、中程度の量の受取人においてすら３人中２人において得られた。こ の研究において、両方のワクチンは、生ワクチンで推奨されているが不活性化Ｈ ＤＣにはされていない、皮下経路で投与された。この接種経路は、接種部位を注 意深く観察するのに最適であるために選択されたが、これによりＨＤＣ受取人に おける抗体の遅い出現が説明できる：事実、ＨＤＣ受取人は７日には１人も抗体 増加を有していなかったが、ＨＤＣワクチンが筋内で投与された殆どの研究にお いては、かなりの割合の対象が有している（Ｋｌｉｅｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． ，Ｉｎｔ’ｌ Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ−Ｇｅｎｅｖａ，１９８１；Ｋｕｗｅｒ ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ−Ｇｅｎｅｖａ，１９ ８１）。しかしながら、本発明は必ずしも皮下経路の投与に限定されない。 狂犬病中性化抗体のＧＭＴ（相乗平均）は、試験しているワクチンはＨＤＣ対 照よりも低かったが、しかし防御に要求される最小値よりも十分に上だった。本 研究で用いられた３種類の投与量について得られた明白な投与量効果反応は、よ り多量の投与量はより強力な反応を誘導するかもしれないことを示唆している。 この開示から確かに、当業者は、委された患者に対する適切な量を選択できる。 抗体反応を上昇させる能力は、もう一つのこの実施例の重要な結果である；事 実、狂犬病抗体力価は量、どの免疫化の方式でも、６ケ月後に全ての対象におい て得られ、カナリアポックスベクターまたは狂犬病糖タンパク質によって以前に 誘導された免疫性は組換えワクチン候補株または従来のＨＤＣ狂犬病ワクチンに よるブースターにブロック効果を有さないことが示された。このことは、他のワ クシニアウイルス組換体に関する、以前から存在する免疫によってヒトにおいて 免疫反応はブロックされるという発見と対照をなす（Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ ．，Ｌａｎｃｅｔ １９９１，３３７：５６７−７２；Ｅｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ９：４７０−７２，１９９１）。 このように、この実施例は、非複製的ポックスウイルスが動物もしくは人間に おいて免疫化ベクターとして、複製作用物は免疫反応を与えるという利点がある が、十分に伝播性であるウイルスによって引き起こされる安全性の問題をともな わずに利用可能であることが明白に示された。 実施例１１ ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣのＬＤ₅₀の 様々なワクシニアウイルス株との比較 マウス 雄の異系交配されたスイスウェブスターマウス（Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂ ｓｔｅｒ ｍｉｃｅ）を、タコニック ファーム（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍ， Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）より購入し、マウス用食事および水 ａｄ ｌｉ ｂｉｔｕｍで生後３週間で使用するまで育てた（「通常」マウス）。両方の性の 新生異系交配スイスウェブスターマウスを、タコニックファームで行われた続い ての定期の妊娠により得た。用いられた全ての新生マウスは２日間の期間内に配 達された。 ウイルス ＡＬＶＡＣはカナリアポックスウイルス集団のプラーク精製により 派生し、初期ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）中で調製された。ショ糖密度勾配 遠心分離による精製に続いて、ＣＥＦ細胞中でプラーク形成単位を数え上げた。 ワクシニアウイルスＷＲ（Ｌ）変異体は、ＷＲの大プラーク表現型の選択により 派生された（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８１）。ニューヨーク州保 健委員会ワクシニアウイルスワクチン株であるＷｙｅｔｈは、Ｐａｒｍａｃｅｕ ｔｉｃａｌｓ Ｃａｌｆ Ｌｙｍｐｈ ＴｙｐｅワクチンＤｒｙｖａｘ、制御番 号３０２００１Ｂより得た。コペンハーゲン株ワクシニアウイルスＶＣ−２をＩ ｎｓｔｉｔｕｔ Ｍｅｒｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅより得た。ワクシニアウイルス 株ＮＹＶＡＣはコペンハーゲンＶＣ−２から派生された。Ｗｙｅｔｈ株を除く全 てのワクシニアウイルス株をＶｅｒｏアフリカグリーンモンキー腎臓細胞中で培 養し、ショ糖密度勾配遠心分離により精製しそしてＶｅｒｏ細胞上でのプラーク 形成単位を数え上げた。Ｗｙｅｔｈ株はＣＥＦ細胞中で増殖させ、ＣＥＦ細胞中 で数え上げた。 接種 １０匹の通常マウスに、ストック調整物を滅菌リン酸緩衝生理食塩水で １０倍づつ連続的に希釈したいくつかの希釈液の１つを、０．０５ｍｌ頭蓋内経 路（ｉｃ）で接種した。いくつかの場合には、希釈しないストックウイルス調製 物を接種に用いた。 １０匹の、生後１日または２日の新生マウスのグループに、通常マウスと注入 量が０．０３ｍｌで用いられたこと以外は同じようにｉｃで接種した。 全てのマウスについて、接種後１４日（新生マウス）または２１日（通常マウ ス）の期間にわたり、毎日死亡率を観察した。接種の次の朝に死んでいるのが見 つかったマウスは、トラウマによる死の可能性があるので除外した。 実験集団の死亡率５０％を達成するために要求される致死量（ＬＤ₅₀）をＲｅ ｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの比例法により測定した。 ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣの、通常マウスおよび、若異系交配マウスに対す るｉｃ経路でのＬＤ₅₀と、様々なワクシニアウイルス株との比較 若マウス、通 常マウスにおけるＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの毒性は、他の試験されたワクシ ニアウイルスよりも数桁のオーダーで低かった（表１５）。ＮＹＶＡＣおよびＡ ＬＶＡＣは、Ｗｙｅｔｈ株より通常マウス中で３０００倍以上も毒性が低いこと ；１２５０００以上も親ＶＣ−２より毒性が低いこと；および６３００００００ 倍もＷＲ（Ｌ）派生体よりも毒性が低いことが判明した。これらの結果は、ＮＹ ＶＡＣは他のワクシニア株と比較して高度に弱毒化されていること、および、両 方とも極端に大量（３．８５×１０⁸ｐｆｕ；ＡＬＶＡＣ および３×１０⁸ｐｆ ｕ；ＮＹＶＡＣ）に頭蓋内経路で接種すると、まだ同定されていない機構によっ てマウスにおいて死を引き起こすが、ＡＬＶＡＣは一般的に頭蓋内経路で投与さ れた場合には若マウスにおいて非毒性であること、を示唆しているであろう。 ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣの、新生異系交配マウスに対するｉｃ経路でのＬ Ｄ₅₀と、様々なワクシニアウイルス株との比較 ５つのポックスウイルス株の相 対毒性を、通常、新生マウスに対して頭蓋内（ｉｃ）投与モデルシステムにおい て滴定により試験した（表１５）。終了点としての死亡率に関し、ＬＤ₅₀値は、 ＡＬＶＡＣは１０００００倍以上もワクシニアウイルスＷｙｅｔｈ株よりも非毒 性であること；ワクシニアウイルスコペンハーゲンＶＣ−２株より２０００００ 倍以上も非毒性であること；およびワクシニアウイルスＷＲ−Ｌ株より２５００ ００００倍以上も非毒性であることが示された。にもかかわらず、試験された最 も多量の投与量６．３×１０⁷ｐｆｕでは、死亡率１００％という結果であった 。６．３×１０⁶ｐｆｕでは、３３．３％という死亡率であった。死の原因は、 実際に決定されてはいないが、最も多量の投与量（約６．３ＬＤ₅₀）のグループ の平均生存時間（ＭＳＴ）は６．７プラスマイナス１．５日だったので、毒物学 的またはトラウマ的本質ではないようであった。５ＬＤ₅₀の投与量ではＭＳＴが ４．８プラスマイナス０．６日であるＷＲ（Ｌ）と比較した場合、ＡＬＶＡＣの ＭＳＴは顕著に長かった（Ｐ＝０．００１）。 ＮＹＶＡＣと比較して、Ｗｙｅｔｈは１５０００倍以上も毒性であり；ＶＣ− ２は３５０００倍以上も毒性であり；ＷＲ（Ｌ）は３００００００倍以上も毒性 であった。ＡＬＶＡＣと同様に、最も多量の２つのＮＹＶＡＣ投与量６×１０⁸ ｐｆｕおよび６×１０⁷ｐｆｕは、１００％の死亡率を引き起こした。しかしな がら、３８０ＬＤ₅₀に相当する、最も多量に投与されたマウスのＭＳＴはたった の２日であった（９匹が２日に死に、１匹が４日に死んだ）。これと対照的に、 最も多量の５００ＬＤ₅₀に相当するＷＲ−Ｌを投与された全てのマウスは、４日 まで生存した。 実施例１２ ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）および ＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）の評価 イムノプレシピテーション 事前に形成された鳥類もしくは非鳥類細胞の単層 に１０ｐｆｕ／細胞の親ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）もしくはＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ ｖＰ８７９）ウイルスを接種した。接種をメチオニンフリーで２％の透析牛胎児 血清を添加したＥＭＥＭ中で接種を行った。１時間の保温の後で、接種物を除去 し、培地を２０μＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓ−メチオニンを含むＥＭＥＭ（メチオニンフ リー）で置換した。一晩、約１６時間の保温の後、細胞をバッファーＡ（１％Ｎ ｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１０ｍＭトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％アジ化ナトリウム、５００単位／ｍｌのアプロチ ニンおよび０．０２％フェニルメチルスルフオニルフロリド）の添加により溶解 させた。イムノプレシピテーションを、Ｃ．Ｔｒｉｍａｒｃｈｉ博士、Ｇｒｉｆ ｆｉｔｈ研究所、ニューヨーク州保健部、Ａｌｂａｎｙ、ニューヨークによって 供給された２４−３Ｆ１０と命名された、狂犬病糖タンパク質特異的モノクロー ナル抗体、およびベーリンガーマンハイム社より得られたラット抗マウス接合体 （型番＃６０５−５００）を用いて行った。ファルマシアＬＫＢバイオテクノロ ジー社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージーより得られたプロテインＡセ ファロースＣＬ−４８を支持マトリクスとして用いた。イムノプレシピテーショ ン沈殿物は、Ｄｒｅｙｆｕｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４）の方法に従って１０ ％ポリアクリルアミドゲルにより分画した。ケルを固定化し、間接撮影用に１Ｍ サリチル酸ナトリウムで１時間処理し、イムノプレシピテーションされたタンパ ク質種を視覚化するためにコダックＸＡＲ−２フイルムに曝露した。 動物の起源 ニュージーランド白ウサギはＨａｒｅ−Ｍａｒｌａｎｄ（Ｈｅｗ ｉｔｔ、ニュージャージー）より得た。生後３週間の雄のスイスウェブスター異 系交配マウス、定期妊娠雌スイスウェブスター異系交配マウス、および生後４週 問のスイスウェブスターヌード（ｎｕ⁺ｎｕ⁺）マウスはタコニックファーム社（ Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ニューヨーク）より得た。全ての動物はＮＩＨガイドラ インに従って維持された。全ての動物プロトコルはＩＡＣＵＣ協会で承認されて いる。必要と思われるときは、明らかに末期的病状のマウスは安楽死させた。 ウサギにおける外傷 ２匹のウサギの各々に、皮下で複数の部位に、それぞれ １０⁴、１０⁵、１０⁶、１０⁷または１０⁸ｐｆｕの試験用ウイルスを含むＰＢＳ またはＰＢＳのみを０．１ｍｌ接種した。ウサギを４日から外傷が治るまで毎日 観察した。硬化および潰瘍化を測定し記録した。 接種部位からのウイルスの回収 １匹のウサギに、皮下で複数の部位に、１０⁶ 、１０⁷、１０⁸ｐｆｕの試験用ウイルスを含むＰＢＳまたはＰＢＳのみを０／ １ｍｌ接種した。１１日後、ウサギを安楽死させ、接種部位それぞれから採取さ れた皮膚生検試料を、機械的破壊および直接的ではない超音波によって無菌的に 、ウイルス回収のために調製した。感染可能なウイルスはＣＥＦ単層上でのプラ ーク滴定によりアッセイした。 マウス中での毒性 マウス１０匹、またはヌードマウス実験では５匹のグルー プを、いくつかの０．５ｍｌの滅菌ＰＢＳ中のウイルス希釈液のうちの１つで、 ｉｐ接種した。実施例１１を参照した。 シクロホスファミド（ＣＹ）処理 マウスをｉｐ経路で４ｍｇ（０．０２ｍｌ ）のＣＹ（ＳＩＧＭＡ）で−２日に接種し、続いて０日にウイルスを接種した。 感染後に続く日々には、マウスにＣＹをｉｐ接種：１日には４ｍｇ；４、７およ び１１日には２ｍｇ；１４、１８、２１、２５および２８日には３ｍｇ。免疫抑 制を間接的にクルターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ）により１ １日に白血球を計数することにより観察した。平均白血球数は処理されていない マウス（ｎ＝４）で１μｌあたり１３５００細胞、ＣＹ処理対照マウス（ｎ＝５ ）で１μｌあたり４２２０細胞であった。 ＬＤ₅₀の計算 死亡率５０％をなすために必要な致死量（ＬＤ₅₀）を、Ｒｅｅ ｄおよびＭｕｅｎｃｈの比例法（Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ，１９３８） により決定した。 ＮＹＶＡＣ−ＲＧのマウス中での能力試験 生後４−６週間のマウスに、５０ から１００μｌのＶＶ−ＲＧ（Ｋｉｅｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、ＡＬＶ ＡＣ−ＲＧ（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１ｂ）、またはＮＹＶＡＣ− ＲＧのいずれかの、２．０−８．０ ｌｏｇ₁₀組織培養感染量５０％（ＴＣＩＤ₅₀ ）を含む希釈液を足部に接種した。各々のグループは８匹のグループからな っていた。接種後１４日に、マウスに脳内接種で１５ＬＤ₅₀の狂犬病ウイルスＣ ＶＳ株を投与した（０．０３ｍｌ）。２８日には、生存したマウスを数え、防御 量５０％（ＰＤ₅₀）を計算した。 ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）の誘導 ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣは、コペン ハーゲンワクチン株のプラーククローン単離体であるＶＣ−２から開発された。 ＶＣ−２からＮＹＶＡＣを開発するために、多くの毒性に関与するウイルス機能 を含む１８のワクシニアＯＲＦを、一連の連続的操作によりこの開示の前の部分 で記述したように精密に欠失させた。これらの欠失は、新しい所望でないＯＲＦ が現れることを防ぐために計画された方式で構築した。図１０はＮＹＶＡＣを開 発するために欠失されたＯＲＦを模式的に示している。図１０の上部は、ワクシ ニアウイルスゲノム（ＶＣ−２プラーク単離体、コペンハーゲン株）のＨｉｎｄ ＩＩＩ制限地図を示している。拡大部分は、ＮＹＶＡＣの開発において連続的に 欠失されたＶＣ−２の６つの領域である。この欠失はこの開示の前の部分で記述 されている（実施例１から６）。以下に、座からＯＲＦが欠失された欠失座を、 機能もしくはホモロジーおよびそれらの遺伝子産物の分子量とともに列記する。 ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣのヒト組織細胞系統上での複製の研究 ヒト起源 の細胞中でのワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ株（ｖＰ８６６）の複製のレベルを 決定するために、６種類の細胞系統に、細胞あたり０．１ｐｆｕの投入多重度で 液体培地で接種し、７２時間保温した。平行して、コペンハーゲン親クローン（ ＶＣ−２）も接種した。初期ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞（１０−１１日経 過したＳＰＦ起源の受精卵から得た、Ｓｐａｆａｓ、Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｒｒｓ、 ＣＴ）を、全てのウイルスに対する許容的細胞基質を代表させて含めた。培養を ２つの基準：生産的ウイルス複製の発生および外因性抗原の発現、に基づいて分 析した。 多数のヒト派生細胞中でのＮＹＶＡＣの複製能力を図１６に示した。ＶＣ−２ およびＮＹＶＡＣは両方ともＣＥＦ細胞中で生産的に複製可能であったが、ＮＹ ＶＡＣは僅かに収量が減少した。ＶＣ−２は、試験された６種類のヒト派生細胞 系統のうち、ＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞系統ＪＴ−１（エプスタイン−バー ウイルスで形質転換されたヒトリンパ芽球細胞系統、Ｒｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４を参照）を除いて、匹敵する収量で生産的に複製可能であっ た。これに反し、ＮＹＶＡＣは、いずれの試験されたヒト派生細胞系統において もその生産的複製能力において高度に減衰されていた。残存ウイルスレベル以上 の感染可能なウイルスの少量の増加が、ＮＹＶＡＣに感染させたＭＲＣ−５（Ａ ＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１、ヒト胚肺起源）、デトロイト５３２（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ ５４、ヒト包皮、ダウン症）、ＨＥＬ２９９（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１３７、ヒト胚 肺細胞）およびＨＮＫ（ヒト新生児腎臓細胞、Ｗｈｉｔｔｉｋｅｒ Ｂｉｏｐｒ ｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、型番＃７０−１５１ ）細胞より得られた。これらの細胞系統における複製は、ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ 細胞から得られた収量、または親ＶＣ−２（表１６）と比較して、顕著に減少し ていた。ＮＹＶＡＣおよびＶＣ−２のＣＥＦ細胞中の２４時間での収量は７２時 間での収量と同等であったことは注目すべきである。ヒト細胞系統培養をさらに ４８時間（さらに２回のウイルス増殖サイクル）保温することは、従って、得ら れる相対ウイルス収量を増幅させるかもしれない。 ヒト派生細胞系統ＭＲＣ−５およびデトロイト５３２において得られる低レベ ルのウイルス収量と一致して、検出可能であるが減少したレベルでのＮＹＶＡＣ 特異的ＤＮＡ蓄積がみられた。ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞でみられたものと関連 して、ＭＲＣ−５およびデトロイト５３２ＮＹＶＡＣ感染細胞系統ＤＮＡ蓄積レ ベルの相対ウイルス収量を比較した。ＮＹＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ蓄積はい ずれの他のヒト派生細胞においても観察されなかった。 同等の実験をアビポックスウイルスＡＬＶＡＣを用いて行った。ウイルス複製 の結果は表１６に示す。カナリアポックスウイルスの鳥類種への宿主制限と一致 して、子ウイルスはいずれのヒト細胞系統においても検出されなかった。ＡＬＶ ＡＣがこれらのヒト派生細胞内で生産的複製をの欠失は、ＡＬＶＡＣ特異的ＤＮ Ａ蓄積がいずれのヒト派生細胞系統においても検出されなかったという観察とも 一致している。 ヒト細胞中でのＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）による狂犬病糖タンパク質の 発現 効率的な外来遺伝子の発現が、顕著なレベルの生産的ウイルス複製の存在 無しに得られるか否かを決定するために、同じ細胞系統を、狂犬病ウイルス糖タ ンパク質を発現するＮＹＶＡＣ組換体ウイルス（ｖＰ８７９、実施例７）³⁵Ｓメ チオニン存在下でで接種した。放射性標識された培養破砕物から、狂犬病糖タン パク質特異的モノクローナル抗体を用いて狂犬病糖タンパク質のイムノプレシピ テーションを行った。６７ｋＤａのタンパク質のイムノプレシピテーションが検 出され、狂犬病糖タンパク質の完全グリコシル化型と一致していた。血清学的に 交叉反応する生産物は、非感染もしくは親ＮＹＶＡＣ感染細胞破砕物においては 検出されなかった。分析された他の全てのヒト細胞においても同様の結果が得ら れた。 ウサギ皮膚への接種 皮内（ｉｄ）接種に続いくウサギの外傷の誘導および本 質が、ワクシニアウイルスの病原性の尺度として、以前から用いられている（Ｂ ｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｃｈｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０； Ｆｅｎｎｅｒ，１９５８；Ｆｌｅｘｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｇｈｅｎ ｄｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒｎｏｓ，１９６４）。故に、ワクシニア株ＷＲ（ＡＴ ＣＣ＃ＶＲ１１９、ＣＶ−１細胞ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ７０上でプラーク精製、およ びＬ変異体と命名されたプラーク単離体、ＡＴＣＣ＃ＶＲ２０３５ Ｐａｎｉｃ ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８１に記載の通りに選択）、Ｗｙｅｔｈ（ＡＴＣＣ ＃ＶＲ３２５、ＤＲＹＶＡＣとして流通、Ｗｙｅｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ、Ｍａｒｉｅｔｔａ、ＰＡ）、コペンハーゲン（ＶＣ−２）、およびＮＹＶＡ Ｃでのｉｄ接種と関連した外傷の本質を、２匹のウサギ（Ａ０６９およびＡ１２ ８）への接種により評価した。２匹のウサギは、ウイルスに対して異なった全体 的感受性を示し、ウサギＡ１２８はウサギＡ０６９よりも深刻ではない反応を示 した。ウサギ１２８Ａにおいては、外傷は比較的小さく接種後２７日までに治癒 した。ウサギＡ０６９においては、外傷は強烈で、特にＷＲ接種部位に対してひ どく、４９日後にようやく治癒した。外傷の強度は、リンパ排出経路に関連して 接種部位にもまた依存していた。特に、背脊椎上に位置した部位ではより強烈な 外傷を示し、側腹部に位置した外傷を治癒するためにはより長い時間を要した。 全ての外傷を、４日から最後の外傷が消失するまで毎日測定し、最大の外傷の大 きさと治癒に要した日数の平均を計算した（表１７）。対照ＰＢＳを接種した部 位からは局所反応は観察されなかった。潰瘍化外傷がワクシニアウイルス株ＷＲ 、 ＶＣ−２およびＷｙｅｔｈを接種した部位で観察された。重要なことには、ＮＹ ＶＡＣを接種した部位では潰瘍化または硬化した外傷は観察されなかった。 感染可能なウイルスの接種部位での持続性 これらのウイルスの接種部位での 相対持続性を評価するため、ウサギに対して、皮内経路で複数の部位に、１０⁶ 、１０⁷または１０⁸ｐｆｕのＶＣ−２、ＷＲ、ＷｙｅｔｈまたはＮＹＶＡＣを含 む０．１ｍｌのＰＢＳを接種した。各々のウイルスは、１０⁷ｐｆｕ量を背脊椎 上に、１０⁶および１０⁸量を隣接させて位置させた。接種部位を１１日間毎日観 察した。ＷＲは最も強烈な反応を誘導し、ＶＣ−２およびＷｙｅｔｈが続いた（ 表１８）。潰瘍化は最初に９日目にＷＲおよびＷｙｅｔｈで、１０日目にＶＣ− ２で観察された。ＮＹＶＡＣまたは対照ＰＢＳを接種した部位は潰瘍化も硬化も 示さなかった。接種後１１日目に、接種部位から皮膚試料を切り出し、機械的に 破壊し、ウイルスをＣＥＦ細胞で滴定した。結果を表２２に示す。この時点で、 投与された以上のウイルスが回収された例は無かった。ワクシニア株ＷＲの回収 は、投与ウイルス量に関係なく約１０⁶ｐｆｕであった。ワクシニア株Ｗｙｅｔ ｈおよびＶＣ−２の回収は投与量に関係なく１０³から１０⁴ｐｆｕであった。感 染可能なウイルスはＮＹＶＡＣ接種部位から回収されなかった。 遺伝的もしくは化学的免疫欠損マウスの接種 大量のＮＹＶＡＣ（５×１０⁸ ｐｆｕ）またはＡＬＶＡＣ（１０⁹ｐｆｕ）を腹腔経路でヌードマウスに接種し たが、１００日間の観察期間にわたって死亡、外傷および明白な病気もみられな かった。これと対照的に、ＷＲ（１０³から１０⁴ｐｆｕ）、Ｗｙｅｔｈ（５×１ ０⁷または５×１０⁸ｐｆｕ）もしくはＶＣ−２（１０⁴から１０⁹ｐｆｕ）を接種 したマウスは、伝播した典型的なポックスウイルス外傷を、最初はつま先、次に 尾に示し、続いていくつかの動物においては深刻な睾丸炎を示した。ＷＲまたは Ｗｙｅｔｈを感染させたマウスにおいては、伝播した外傷の現れは総じて最後に は死へとつながっていたが、ＶＣ−２に感染させたマウスは殆どは最後には回復 した。計算されたＬＤ₅₀値は表１９に示されている。 特に、ＶＣ−２を接種されたマウスは、つま先に、１から２日後には尾に外傷 （赤い丘疹）を示した。これらの外傷は接種後（ｐｉ）１１から１３日の間に最 も高い投与量のマウスにおいて（１０³、１０⁸か、１０⁷かおよび１０⁶ｐｆ ｕ）、ｐｉ１６日には１０⁵ｐｆｕ投与されたマウス、およびｐｉ２１日には１ ０⁴ｐｆｕ投与されたマウスにおいて起こった。１０³および１０²ｐｆｕを接種 したマウスにおいては、１００日の観察期間の間は外傷はみられなかった。ｐｉ ２３日には、１０⁹および１０⁸ｐｆｕを接種したマウスにおいて、７日後には他 のグループ（１０⁷から１０⁴ｐｆｕ）において睾丸炎がみられた。睾丸炎は特に １０⁹および１０⁸ｐｆｕグループにおいて強烈で、減少してはいたものの、１０ ０日間の観察の終わりまで観察された。いくつかの、ｐｉ３０−３５日頃に起じ てきた痘様外傷が、２、３のマウスの皮膚上にみられた。殆どの痘外傷は通常は ｐｉ６０−９０日の間に治癒した。１０⁹ｐｆｕを接種したグループのマウスが １匹だけ死に（ｐｉ３４日）、１０⁸ｐｆｕを接種したグループのマウスが１匹 だけ死んだ（ｐｉ９４日）。ＶＣ−２を接種されたマウスにおいて他に死亡は観 察されなかった。 １０⁴ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種したマウスはｐｉ１７日で痘外傷を示 し始めた。これらの外傷はＶＣ−２を注入されたマウスによって示された（つま 先、尾と拡がる）外傷と同様に現れた。１０³ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種 したマウスはｐｉ３４日まで外傷を示さなかった。睾丸炎は最も多量のＷＲ（１ ０⁴ｐｆｕ）を接種したマウスにおいてのみみられた。観察期間の後半の間、外 傷は口の周りに現れ、マウスは摂食を停止した。１０⁴ｐｆｕのワクシニアＷＲ 株を接種したマウスは全て、ｐｉ２１日から３１日の間に死ぬか必要と思われた ときは安楽死された。１０³ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種したマウス５匹の うち４匹はｐｉ３５日から５７日の間に死ぬか必要と思われるときには安楽死さ れた。低いＷＲの投与量（１から１００ｐｆｕ）を接種されたマウスにおいて死 亡は観察されなかった。 ワクシニアウイルスＷｙｅｔｈ株を多量に（５×１０⁷ｐｆｕおよび５×１０⁸ ｐｆｕ）接種されたマウスはつま先と尾に外傷を示し、睾丸炎を起こし、死んだ 。５×１０⁶ｐｆｕもしくはこれ以下のＷｙｅｔｈを注入されたマウスは病気も しくは外傷の兆候を示さなかった。 表１９に示されるとおり、ＣＹ処理マウスは、ヌードマウスよりも高感度なポ ッタスウイルス毒性アッセイモデルを提供した。ワクシニアウイルス株ＷＲ、Ｗ ｙｅｔｈおよびＶＣ−２に対するＬＤ₅₀値は、このモデルシステムにおいては、 ヌードマウスモデルにおけるよりも顕著に低かった。さらに、以下に示すように 、Ｗｙｅｔｈ、ＷＲおよびＶＣ−２ワクシニアウイルスを、それぞれ多量に注入 されたマウスで生じた外傷は、より早い外傷の形成という結果となった。ヌード マウスでみられたように、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを注入されたＣＹ処理マ ウスは、外傷を引き起こさなかった。しかしながら、ヌードマウスとは異なり、 ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを投与されたＣＹ処理マウスにおいて、投与量に関 係なく、いくつかの死亡が観察された。これらのランダムな出来事が死の原因と 考えられる。 全てのＷｙｅｔｈ投与量（９．５×１０⁴から９．５×１０⁸ｐｆｕ）で注入さ れたマウスは、ｐｉ７日と１５日の間にそれらの尾および／またはつま先に痘外 傷を示した。加えて、尾とつま先は膨張した。尾の外傷の発展は、ポックス外傷 に典型的な丘疹、潰瘍化および最終的なかさぶたの形成であった。全てのＶＣ− ２投与量（１．６５×１０⁵から１．６５×１０⁹ｐｆｕ）で注入されたマウスも また、Ｗｙｅｔｈで接種されたマウスのそれと同様に、それらの尾および／また はつま先に痘外傷を示した。これらの外傷は、接種後７−１２日の間に観察され た。少量のＷＲウイルスを注入されたマウスでは外傷は観察されなかったが、こ れらのグループにおいて死亡は引き起こされた。 ＮＹＶＡＣ−ＲＧの能力試験 ワクシニアウイルスコペンハーゲン株の弱毒化 が、その結果生じたＮＹＶＡＣ株の有用なベクターとしての能力を顕著に変化さ せることなく効果を示していることを調べるため、比較能力試験を行った。ウイ ルスを弱毒化するために行われた連続的遺伝子操作の間のベクターの免疫原的能 力を観察するために、狂犬病ウイルス糖タンパク質をレポーター外因性遺伝子と して用いた。狂犬病糖タンパク質遺伝子を発現するベクターの防御効果を、狂犬 病に対する標準ＮＩＨマウス能力試験（ｓｅｌｉｇｍａｎｎ，１９７３）により 評価した。表２０は高度弱毒化ＮＹＶＡＣベクターから得られたＰＤ₅₀値は、ｔ ｋ 座に狂犬病糖タンパク質遺伝子を有するコペンハーゲンをベースとした組換体 （Ｋｉｅｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４）を用いて得られた値と同一であり、鳥 類種に複製が限定されているカナリアポックスベースのベクターであるＡＬＶＡ Ｃ−ＲＧについて得られたＰＤ₅₀値に近かったことを示している。 観察 公知の毒性遺伝子を欠失され制限された生体外増殖特性を有するＮＹＶ ＡＣを、その弱毒化特性を評価するため動物モデルシステム中で分析した。これ らの研究は、神経毒性ワクシニアウイルス実験室株、ＷＲ、２つのワクシニアウ イルス株、Ｗｙｅｔｈ（ニューヨーク市保健局）およびコペンハーゲン（ＶＣ− ２）、さらにカナリアポックスウイルス株、ＡＬＶＡＣ（実施例１１を参照）と 比較して行った。これとともに、これらのウイルスは、マウス投与モデルおよび ウサギ皮膚モデルにおける、最も毒性株であるＷＲ、立証された特性とともに以 前に用いられていた弱毒化ワクチン株を提供しているコペンハーゲン（ＶＣ−２ ）およびＷｙｅｔｈ、複製が鳥類種に限られているポックスウイルスの例を提供 しているＡＬＶＡＣに関し、相対的病原性ポテンシャルのスペクトルを提供した 。これらの生体内分析の結果は、ワクシニアウイルス株、ＷＲ、Ｗｙｅｔｈおよ びコペンハーゲン（ＶＣ−２）と比較して高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣの性質 を明白に示している（表１４−２０）。重要なことには、ＮＹＶＡＣのＬＤ₅₀値 は、鳥類宿主制限アビポックスウイルス、ＡＬＶＡＣについて見られた値と匹敵 するものであった。ＮＹＶＡＣによる死亡は、ＡＬＶＡＣと同様に、極端に大量 のウイルスが頭蓋内経路で投与された場合にのみ観察された（実施例１１、表１ ４、１５、１９）。これらの死が、多量のタンパク質の接種の非特異的は必然的 結果であるか否かはまだ確定はしていない。免疫不全マウスモデル（ヌードマウ スおよびＣＹ処理）における分析はまた、ＷＲ、Ｗｙｅｔｈおよびコペンハーゲ ン株と比較して、ＮＹＶＡＣの相対的に高い弱毒化特性を示している（表１７お よび１８）。重要なことには、伝播したワクシニア感染あるいはワクシニア性病 気の証拠が、ＮＹＶＡＣを接種された動物またはＡＬＶＡＣを接種させた動物に おいては、観察期間にわたって観察されなかったことである。ＮＹＶＡＣ中の複 数の毒性関連遺伝子の欠失は、病原性に関して相乗効果を示した。他のＮＹＶＡ Ｃの無毒性の尺度が、ウサギ皮膚への皮内投与によって提供された（表１７およ び１８）。非鳥類種では複製できないウイルスであるＡＬＶＡＣについての結果 を考えると、ＡＬＶＡＣの皮内接種は、投与量に応じたかたちで硬化の範囲を引 き起こしたので、接種部位における複製能力は、単に反応性と相関しているので はな い。従って、ウイルスの複製能力以外の要素が外傷の形成に寄与していることは あり得る。ＮＹＶＡＣの遺伝子の欠失は外傷の現れを防止する。 同じく、実施例１１を含む先の実施例およびこの実施例の結果は、ＷＲ、およ び以前にワクシニアウイルスワクチン株として用いられていた、Ｗｙｅｔｈおよ びコペンハーゲンと比較して、高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣの性質を示してい る。事実、試験された動物モデルシステムにおける、ＮＹＶＡＣの病原性プロフ ィールは、鳥類種でのみ生産的に複製することが知られているポックスウイルス 、ＡＬＶＡＣのそれに近かった。ヒト（表１６）およびマウス、ブタ、イヌおよ びウマを含む他の種から派生した細胞上での、明らかに制限されたＮＹＶＡＣの 生産的複製能力は、ワクチン接種されていない接触体もしくは一般的環境への潜 在的伝播を限定もしくは防止するとともに、ワクチン接種された個体内での伝播 の、低い可能性をベクターに提供する。 重要なことには、ＮＹＶＡＣベースのワクチン候補株は効率的であることが示 されている。数多くの病原体由来の外来遺伝子産物を発現するＮＹＶＡＣ組換体 は、霊長類を含むいくつかの動物種において外来遺伝子産物に対する免疫反応を 誘導する。特に、狂犬病糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣベース組換体は、致 死量の狂犬病投与に対してマウスを防御可能であった。ＮＹＶＡＣベースの狂犬 病糖タンパク質組換体の能力は、ｔｋ遺伝子座中に狂犬病糖タンパク質を含むコ ペンハーゲンベースに対するＰＤ₅₀値に匹敵していた（表２０）。ＮＹＶＡＣベ ースの組換体は麻疹ウイルス中性化抗体をウサギにおいて誘導し、ブタにおいて 仮性狂犬病ウイルスおよび日本脳炎ウイルス投与に対する防御を誘導することが 示された。高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣ株は、ヒトおよび獣医学の用途に安全 性の利点を付与している（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。さ らには、ＮＹＶＡＣの総合的研究室用発現ベクターシステムとしての利用は、ワ クシニアウイルス利用に関する生物的危険を大きく減少させる。 以下の基準によって、この実施例の結果および、実施例１１を含む文書中の実 施例は、ＮＹＶＡＣが高度に弱毒化されていることを示している：ａ）接種部位 での検出可能な硬化あるいは潰瘍化がない（ウサギ皮膚）；ｂ）皮内接種部位か らの感染可能はウイルスの速やかな消失（ウサギ皮膚）；ｃ）睾丸炎がない（ヌ ードマウス）；ｄ）大きく減少された毒性（頭蓋内投与、生後３週間および新生 マウス）；ｅ）大きく減少された病原性および免疫不全対象物（ヌードおよびシ クロホスファミド処理マウス）において拡散性がない；およびｆ）劇的に減少さ れた、多様なヒト組織培養細胞上での複製能力。しかしながら、高度に弱毒化さ れているにも拘わらず、ＮＹＶＡＣは、ベクターとして、外因性抗原に対して強 力な免疫反応を誘導する能力を保持している。 実施例１３ トリインフルエンザウイルス 血球凝集素糖タンパク質を発現する ＴＲＯＶＡＣ組換体の構築 この実施例はトリインフルエンザウイルスの３つの血清型の血球凝集素遺伝子 を発現するニワトリポックスウイルス組換体の開発を記述する。 細胞およびウイルス Ｈ４、Ｈ５およびＨ７血球凝集素遺伝子のｃＤＮＡクロ ーンを含むプラスミドを、Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｓｔ．Ｊｕｄ ｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｍｅｍｐｈ ｉｓ、Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅより入手した。ＦＰ−１と命名されたＦＰＶ株は以前 に記述されている（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）。これは、 生後１日のニワトリのワクチン接種に有用なワクチン株である。親株Ｄｕｖｅｔ ｔｅはフランスでニワトリからニワトリポックスのかさぶたとして得られた。親 株はふ化鶏卵における約５０回の連続継代とそれに続くニワトリ胚繊維芽（ＣＥ Ｆ）細胞で２５回の継代により弱毒化された。このウイルスは１９８０年にＲｈ ｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅで得られ、マスターウイルス シードを作り出した。このウイルスは１９８９年にＶｉｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓに 受領され、ウイルスは４回の連続プラーク精製にかけられた。１つのプラーク単 離体を初期ＣＥＦ細胞中で増幅し、ＴＲＯＶＡＣと命名されたストックウイルス とした。この生体外組換えテストでＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）およ びＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）を生成するために用いられたストック ウイルスは、初期ＣＥＦ中で８回の継代にかけられさらに増幅された。ＴＲＯＶ ＡＣ−ＡＩＨ７（ｖＦＰ１００）を生成するために用いられたストックウイルス は、初期ＣＥＦ中で１２回の継代にかけられさらに増幅された。 Ｆ８座へのニワトリポックス挿入プラスミドの構築 プラスミドｐＲＷ７３１ ．１５は、ＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡからクローン化された１０ｋｂｐのＰｖｕ ＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片を有している。３６５９ｂｐＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片 のヌクレオチド配列が両方の鎖について決定された。この配列を図１１に示す（ 配列番号６７）。本研究室でＦ８と命名されたオープンリーディングフレームの 限定が、この配列の内部で決定された。オープンリーディングフレームは、位置 ４ ９５から開始され位置１８８７で終了する。以下に記述するように、位置７７９ から位置１９２６までを欠失させた。 プラスミドｐＲＷ７６１は２４３０ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶ断片を含む ｐＲＷ７３１．１５のサブクローンである。プラスミドｐＲＷ７６１をＸｂａＩ で完全消化、ＳｓｐＩで部分消化した。３７００ｂｐのＸｂａＩ−ＳｓｐＩバン ドを単離し、アニーリングさせたオリゴヌクレオチドＪＣＡ０１７（配列番号３ ７）およびＪＣＡ０１８（配列番号３８）と連結した。 この連結により生じたプラスミドをｐＪＣＡ００２と命名した。プラスミドｐ ＪＣＡ００４はワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結した非関連遺伝子を プラスミドｐＪＣＡ００２中に有している。ワクシニアウイルスＨ６プロモータ ーの配列は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ； Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。 プラスミドｐＪＣＡ００４をＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化し、非関連遺伝子と Ｈ６プロモーター３７末端の一部を欠失させた。アニーリングさせたオリゴヌク レオチドＲＷ１７８（配列番号４８）およびＲＷ１７９（配列番号４９）をＥｃ ｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、ＪＣＡ００４のＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩ サイトの間に入れ、ｐＲＷ８４６を生成した。 それ故、プラスミドｐＲＷ８４６はＨ６プロモーターの５’ＥｃｏＲＶを、ＯＲ Ｆ欠失されたＦ８座に有している。プラスミドｐＲＷ８４６中のＨ６プロモータ ーの３’ＨｉｎｃＩＩサイトに、翻訳終了コドン、ワクシニアウイルス初期プロ モーター（Ｙｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）により認識される転写終結コド ンおよびＳｍａＩサイトが続いている。 Ｆ７座へのニワトリポックス挿入プラスミドの構築 元々のＦ７ＯＲＦが欠失 されていない挿入プラスミド、ｐＲＷ７３１．１３は、５．５ｋｂｐのＦＰゲノ ムのＰｖｕＩＩ断片をｐＵＣ９のＰｖｕＩＩサイト中に有している。挿入サイト はこれらの配列内部の固有のＨｉｎｃＩＩである。図１２に示されているヌクレ オチド配列（配列番号６８）は、固有のＨｉｎｃＩＩサイトを含む２３５６ｂｐ の領域について決定された。この配列の解析により、固有のＨｉｎｃＩＩサイト （図１２、下線）は９０アミノ酸のポリペプチドをコードしているＯＲＦの内部 に位置していることが明らかとなった。ＯＲＦは位置１５３１のＡＴＧにより始 まり、位置８９８で終わる（図１２中で矢印で示された位置）。 ＯＲＦ欠失させた挿入プラスミドのためのアームはｐＲＷ７３１．１３をテン プレートとして用いたＰＣＲにより派生した。ＯＲＦの上流領域に相当する５９ ６ｂｐのアーム（ＨＢと命名）は、オリゴヌクレオチドＦ７３ＰＨ２（配列番号 ５０）およびＦ７３ＰＢ（配列番号５１）により増幅された。 ＯＲＦの下流領域に相当する２７０ｂｐのアーム（ＥＨと命名）は、オリゴヌク レオチドＦ７５ＰＨＥ（配列番号５２）およびＦ７３ＰＨ１（配列番号５３）に より増幅された。 断片ＥＨをＥｃｏＲＶで消化し、１２６ｂｐの断片を生成した。ＥｃｏＲＶサ イトは３’末端にあり、５’末端はＨｉｎｃＩＩの３’末端を含むようＰＣＲに より形成した。この断片を、ＨｉｎｃＩＩで消化したｐＢＳ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔ ｅｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中に挿入し、プラスミドｐＦ７Ｄ１とし た。この配列をジデオキシヌクレオチド配列分析により確認した。プラスミドｐ Ｆ７Ｄ１をＡｐａＩで直線化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、５９６ ｂｐのＨＢ断片へ連結した。生成されたプラスミドをｐＦ７Ｄ２と命名した。全 体の配列と方向をヌクレオチド配列分析により確認した。 プラスミドｐＦ７Ｄ２をＥｃｏＲＶおよびＢｇＩＩＩで消化し、６００ｂｐの 断片を生成させた。この断片をＡｐａＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平 滑化し、続いてＢａｍＨＩで消化したｐＢＳ−ＳＫに挿入した。その結果生成さ れたプラスミドをｐＦ７Ｄ３と命名した。このプラスミドは４０４ｂｐのＨＢア ームと１２ｂｂｐのＥＨアームを含んでいる。 プラスミドｐＦ７Ｄ３を、ＸｈｏＩで直線化し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラ ーゼクレノー断片で２ｍＭのｄＮＴＰの存在下で平滑化した。この直線化された プラスミドはアニーリングさせたオリゴヌクレオチドＦ７ＭＣＳＢ（配列番号５ ４）およびＦ７ＭＣＳＡ（配列番号５５）と連結させた。 これは、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩ制限サイトを含むマルチプル クローニング領域をＥＨアームとＨＢアームとの間に挿入するために行った。生 成されたプラスミドをｐＦ７ＤＯと命名した。 Ｆ８座へのＨ４血球凝集素挿入プラスミドの構築 Ａ／Ｔｙ／Ｍｉｎ／８３３ ／８０から派生したトリインフルエンザＨ４をコードしているｃＤＮＡは、プラ スミドｐＴＭ４Ｈ８３３中に、Ｄｒ．Ｒ．Ｗｅｂｓｔｅｒより入手した。プラス ミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｒｕＩで消化し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラー ゼクレノー断片でｄＮＴＰの存在下で平滑化した。Ｈ４コード領域を含む平滑化 ２．５ｋｂｐＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｒｕＩ断片を、ｐＩＢＩ２５（Ｉｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｈａｖｅ ｎ、ＣＴ）のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入した。その結果生成されたプラスミドｐ ＲＷ８２８を部分的にＢａｎＩＩで切断し、直線状の産物を単離しＨｉｎｄＩＩ Ｉで再び切断した。今、１００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｎＩＩを欠失された プラスミドｐＲＷ８２８は、合成オリゴヌクレオチドＲＷ１５２（配列番号５６ ）およびＲＷ１５３（配列番号５７）のベクターとして用いた。これらのオリゴ ヌクレオチドは、ＥｃｏＲＶサイトからのＨ６プロモーターの３’部分を表し、 Ｈ４ｃＤＮＡのＡＴＧをプロモーターのＡＴＧと並列させている。 これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、ＢａｎＩＩおよびＨｉｎｄＩ ＩＩで切断し、上記のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｎＩＩ欠失ｐＲＷ８２８ベクター中 に挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ８４４をＥｃｏＲＶおよびＤ ｒａＩで切断し、３’Ｈ６プロモートされたＨ４コード配列を含む１．７ｋｂｐ 断片を、ｐＲＷ８４６（以前に記述）のＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｃＩＩサイトに 挿入し、ｐＲＷ８４８とした。プラスミドｐＲＷ８４８は、それ故、ワクシニア ウイルスＨ６プロモーターに連結したＨ４コード領域を、ニワトリポックスウイ ルスＦ８座ＯＲＦ欠失領域中に有している。 Ｆ８座へのＨ５血球凝集素挿入プラスミドの構築 Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｒｅ ｌａｎｄ／１３７８／８３から派生したトリインフルエンザＨ５をコードしてい るｃＤＮＡは、プラスミドｐＴＨ２９中に、Ｄｒ．Ｒ．Ｗｅｂｓｔｅｒより入手 した。合成ヌクレオチドＲＷ１０（配列番号５８）からＲＷ１３（配列番号６１ ）までは、以前に記述されたワクシニアウイルスＨ６プロモーターの翻訳開始コ ドンをＨ５遺伝子のＡＴＧとオーバーラップさせるために設計された。配列は、 Ｈ ５遺伝子の５’ＳａｌＩサイトを通して連続しており、Ｈ５停止コドンを含む３ ’Ｈ５ＤｒａＩサイトで再び開始する。 オリゴヌクレオチドを、９５℃で３分間、続いてゆっくりと室温で冷却しアニ ーリングさせた。これは以下の、示された末端での二本鎖構造という結果となる 。 ｐＲＷ７４２のＥｃｏＲＶとＰｓｔＩサイトとの間へのオリゴヌクレオチドの クローン化によりｐＲＷ７４４を生成した。ｐＲＷ７３１．１５のＨｉｎｃＩＩ サイトに挿入されたワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結した非関連遺伝 子を有するプラスミドｐＲＷ７４２Ｂは以前に記述された。ＰＳｔＩおよびＥｃ ｏＲＶによる消化で、非関連遺伝子およびＨ６プロモーターの３’末端を除去し た。今、プラスミドｐＲＷ７４４はトリインフルエンザＨ５のＡＴＧとオーバー ラップしたＨ６プロモーターの３’部分を有している。このプラスミドはまた、 ５’ＳａｌＩサイトを通ったＨ５配列およびＨ５停止コドン（ＤｒａＩサイトを 含む）からの３’配列を含む。ＤｒａＩサイトの利用によりＨ５ ３’非コード 末端を除去する。オリゴヌクレオチドは、初期ワクシニアウイルスＲＮＡポリメ ラーゼにより認識される転写終結シグナル（Ｙｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ ）を付与する。Ｈ６プロモートされたＨ５の構築を完成させるため、Ｈ５コード 領 域を１．６ｋｂｐのＳａｌＩ−ＤｒａＩ断片としてｐＴＨ２９から単離した。プ ラスミドｐＲＷ７４４をＤｒａＩで部分分解し、直線状断片を単離し、ＳａｌＩ で再び消化した、ＳａｌＩとＤｒａＩとの間の８ベースを欠失させたプラスミド を、１．６ｋｂｐのｐＴＨ２９ＳａｌＩ−ＤｒａＩ断片のベクターとして用いた 。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ７５９をＥｃｏＲＶおよびＤｒａＩで切 断した。３’Ｈ６プロモーターおよびＨ５遺伝子を含む１．７ｋｂｐのｐＲＷ７ ５９ＥｃｏＲＶ−ＤｒａＩ断片を、ｐＲＷ８４６（以前に記述）のＥｃｏＲＶ− ＨｉｎｃＩＩサイトに挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ８４９は 、ＯＲＦ欠失Ｆ８座内にＨ６プロモートされたトリインフルエンザウイルスＨ５ 遺伝子を含んでいた。 Ｆ７座へのＨ７血球凝集素挿入ベクターの構築 Ａ／ＣＫ／ＶＩＣ／１／８５ 由来のＨ７血球凝集素を含むプラスミドｐＣＶＨ７１は、Ｄｒ．Ｒ．Ｗｅｂｓｔ ｅｒより入手した。Ｈ７遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＥ．ｃｏｌ ｉＤＮＡポリメラーゼクレノー断片により平滑末端化し、ｐＩＢＩ２５のＨｉｎ ｃＩＩサイトに挿入し、ｐＲＷ８２７とした。合成オリゴヌクレオチドＲＷ１６ ５（配列番号６２）およびＲＷ１６６（配列番号６３）とをアニーリングさせ、 ＨｉｎｃＩＩおよびＳｔｙＩで消化し、ｐＲＷ８２７のＥｃｏＲＶおよびｓｔｙ Ｉサイトに挿入し、ｐＲＷ８４５とした。 オリゴヌクレオチドＲＷ１６５（配列番号６２）およびＲＷ１６６（配列番号 ６３）はＨ６プロモーターの３’部分をＨ７遺伝子に連結している。Ｈ７遺伝子 の３’非コード末端は、ｐＲＷ８４５のＡｐａＬＩ消化の直線状産物を単離し、 ＥｃｏＲＩで再び切断し、最も大きな断片を単離し、合成ヌクレオチドＲＷ２２ ７（配列番号６４）およびＲＷ２２８（配列番号６５）とアニーリングさせるこ とにより除去した。その結果生成されたプラスミドはｐＲＷ８５４である。 ｐＲＷ８５４のＨ７の停止コドンにはＨｐａＩサイトが続いている。ＯＲＦ欠失 されたＦ７座中のＨ６プロモートされたＨ７構築物中間体を、ｐＲＷ８５４のＥ ｃｏＲＩ−ＨｐａＩ断片を、ＥｃｏＲＶで切断し、ＰｓｔＩサイトを平滑化させ たｐＲＷ８５８中に移動させることにより生成した。プラスミドｐＲＷ８５８（ 以下に記述）は、Ｈ６プロモーターをＦ７ＯＲＦ欠失中に含む挿入プラスミドで ある。 プラスミドｐＲＷ８５８は、非関連遺伝子に連結したＨ６プロモーターを有す る８５０ｂｐのＳｍａＩ／ＨｐａＩ断片を、以前に記述されたｐＦＤＯのＳｍａ Ｉサイトに挿入することによって構築された。この非関連配列は、ｐＲＷ８５８ のＥｃｏＲＶ（Ｈ６プロモーターの３’末端の２４ｂｐ上流のサイト）およびＰ ＳｔＩでの消化により取り除いた。３．５ｋｂｐのその結果生じた断片を単離し Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼクレノー断片を用いて２ｍＭのｄＮＴＰ存在下 で平滑末端化した。この平滑化された断片を、ｐＲＷ８５４（以前に記述）から 派出した１７００ｂｐのＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ断片に連結された。このＥｃｏＲ Ｖ／ＨｐａＩ断片は、ＶＶ Ｈ６プロモーターの最３’２４ｂｐの３’に並列さ れた完全ＡＩＶ ＨＡ（Ｈ７）遺伝子を有している。その結果生成されたプラス ミドはｐＲＷ８６１と命名された。 １２６ｂｐＥＨアーム（以前に定義）は、ｐＲＷ８６１中で、ＴＲＯＶＡＣ ＤＮＡとの組換え頻度を増加させるために伸長された。これを実行するため、５ ７５ｂｐのＡｃｃＩ／ＳｎａＢＩ断片をｐＲＷ７３１．１３（以前に定義）から 派生させた。この断片を単離し、ｐＲＷ８６１のＡｃｃＩサイトとＮａｅＩサイ トとの間に挿入した。その結果生成されたプラスミドは、ＡＩＶ Ｈ７遺伝子に 隣接している７２５ｂｐのＥＨアームおよび４０４ｂｐのＨＢアームを有し、ｐ ＲＷ８６９と命名された。プラスミドｐＲＷ８６９は、それ故、５’末端でワク シニアウイルスＨ６プロモーターに連結されたＨ７コード配列を有している。左 隣接アームは４０４ｂｐのＴＲＯＶＡＣ配列からなり右隣接アームは欠失ＯＲＦ Ｆ７座への挿入を目的とした７２５ｂｐのＴＲＯＶＡＣ配列からなる。 ＴＲＯＶＡＣ−トリインフルエンザウイルス組換体の開発 トリインフルエン ザウイルスＨＡコード配列を有する挿入プラスミドを、個別に、ＴＲＯＶＡＣを 感染させた初期ＣＥＦ細胞に、以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａ ｌ．，１９８２；Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）リン酸カルシウム 沈殿法により形質導入した。ＨＡ特異的放射性標識プローブとのハイブリダイゼ ーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な集団が達成させるまで連続し たプラーク精製過程にかけた。１つの代表プラークが続いて増幅されてストック ウイルスとされた。プラスミドｐＲＷ８４９は、生体外組換えテストにおいて用 いられ、その結果、Ｈ５血球凝集素を発現するＡＬＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８ ９）を生成した。プラスミドｐＲＷ８４８が用いられ、その結果、Ｈ４血球凝集 素を発現するＡＬＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）を生成した。プラスミドｐＲ Ｗ８６９が用いられ、その結果、Ｈ７血球凝集素を発現するＡＬＶＡＣ−ＡＩＨ ７（ｖＦＰ１００）を生成した。 免疫蛍光 インフルエンザウイルスに感染した細胞においては、ＨＡ分子は合 成され、プレカーサー分子として粗面小胞体においてグリコシル化される。原形 質膜への輸送の間に、最終的にジスルフィド結合したＨＡ₁および ＨＡ₂サブユ ニットとなるタンパク質分解である翻訳後の拡張的修飾、および成熟ウイルスエ ンベローブへ取り込まれる場所である宿主細胞膜への挿入を受ける。ＴＲＯＶＡ Ｃ−ＡＩＨ組換体に感染させた細胞中でＨＡ分子が細胞表面で発現されているか どうかを決定するため、免疫蛍光を行った。直接的でない免疫蛍光は以前に記述 されたように（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）行った。ＴＲＯＶＡＣ −ＡＩＨ４ではＨ４血球凝集素が、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５ではＨ５血球凝集 素が、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７ではＨ７血球凝集素が表面で発現していることが 、表面蛍光により確認された。Ｈ５血球凝集素の発現は、Ｈ５ＨＡ特異的モノク ローナル抗体のプールを用いて検出された。Ｈ４ＨＡの発現はヤギ単独特異的抗 Ｈ４血清を用いて分析した。Ｈ７ＨＡの発現はＨ７特異的モノクローナル抗体調 製物を用いて分析した。 イムノプレシピテーション ウイルス粒子が感染可能であるためには、血球凝 集素のポリペプチドの分解が必要であるため、血球凝集素分子の分解サイトおよ びそのの周辺の配列は、ウイルス毒性の決定において重要な役割を果たすことが 同定されている。毒性Ｈ５およびＨ７ウイルスは、ＨＡ₁にカルボキシ末端にお いて１以上の塩基性アミノ酸を有している。これにより、一連の塩基性アミノ酸 を認識する細胞内プロテアーゼに血球凝集素を分解することを可能にし、感染可 能なウイルスが生体外でも生体内でも拡散することを可能にしていると考えられ ている。無毒性株のＨ４血球凝集素分子は組織培養中では、外因性トリプシンが 添加されないかぎり分解されない。 ＴＲＯＶＡＣ組換体によって発現された血球凝集素分子が実際にプロセシング されているか否かを決定するため、イムノプレシピテーション実験を記述された ように（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、上記の特異的試薬を用いて 行った。 ＴＲＯＶＡＣ−ＡＴＨ５（ｖＦＰ８９）によって発現されたＨ５血球凝集素の イムノプレシピテーション分析により、糖タンパク質は、それぞれ約４４および ２３ｋＤａの分子量の分解産物ＨＡ₁およびＨＡ₂として明瞭であることを示した 。感染させていない細胞もしくは親ＴＲＯＶＡＣウイルスに感染させた細胞にお いては、このようなタンパク質は沈殿されなかった。同様に、ＴＲＯＶＡＣ−Ａ ＩＨ５（ｖＦＰ１００）によって発現されたＨ５血球凝集素のイムノプレシピテ ーション分析により、分解産物ＨＡ₂特異的沈殿を示した。ＨＡ₁分解産物は認識 されなかった。感染させていないＣＥＦ細胞もしくは親ＴＲＯＶＡＣウイルスに 感染させたＣＥＦ細胞においては、このようなタンパク質は沈殿されなかった。 これと対照的に、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）によって発現されたＨ ４血球凝集素のイムノプレシピテーション分析においては、プレカーサータ ンパク質ＨＡ₀のみの発現を示した。無毒性亜型の血球凝集素の、組織培養中で の発現の欠如と一致している。感染させていないもしくは親ＴＲＯＶＡＣウイル スに感染させたＣＥＦ細胞においては、Ｈ４特異的タンパク質は検出されなかっ た。組換えによる組換えウイルスの開発、ニトロセルロース膜フィルターによる インサイチュハイブリダイゼーション、およびベータガラクトシダーゼ活性によ るスクリーニングは以前に記述された通りである（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａ ｌ．，１９８２；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。実施例１４ −ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ） （＋トランスメンブレン）エピトープを発現するＡＬＶＡＣ組 換えの構築 ＨＩＶ１（ＩＩＩＢ）ｃＤＮＡ配列（Ratner他、1985）を含有するプラスミド ｐＨＸＢ２ＤをRobert Gallo氏（米国ＮＩＨ、ＮＣＩ）から入手した。ｇａｇ遺 伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋ隣接アームの間にク ローニングした。これを行うために、ｐＨＸＢ２Ｄの１，６２５ｂｐのＢｇｌＩ Ｉ断片（ｇａｇ遺伝子の５′末端を含有する）をｐＳＤ５４２ＶＣＶＱの４，０ ７５ｂｐのＢｇｌＩＩ断片内にクローニングした。この操作によって得られたプ ラスミドをｐＨＩＶＧ２と呼ぶ。 次いで、ｇａｇ遺伝子の３′末端をｐＧＩＶＧ２にクローニングした。これを 行うために、２８０ｂｐのＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ ＰＣＲ断片（ｇａｇ遺伝子の ３′末端を含有する）を、ｐＨＩＶＧ２の５，６２０ｂｐのＡｐａＩ−ＢａｍＨ 断片内にクローニングした。（該ＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチドプライマー ＨＩＶＰ５（配列番号６９： およびＨＩＶＰ６（配列番号７０： を用いてプラスミドｐＨＸＢ２Ｄから調製した。）この操作によって得られたプ ラスミドをｐＨＩＶＧ３と呼ぶ。 次いで、ｇａｇ遺伝子の上流にＩ３Ｌプロモーターをクローニングした。これ を行うために、ワクシニアウイルスのＩ３Ｌプロモーターおよびｇａｇ遺伝子の ５′末端をコードするオリゴヌクレオチドＨＩＶＬ１７（配列番号７１： およびＨＩＶＬ１８（配列番号７２： を、ｐＧＩＶＧ３の５，５４０ｂｐの部分的ＢａｌＩＩ−ＣｌａＩ断片内にクロ ーニングした。この操作によって得られたプラスミドをｐＨＩＶＧ４と呼ぶ。 次に、ｇａｇ遺伝子のうち、ｐ２４、ｐ２、ｐ７およびｐ６をコードする部分 を除去した。これを行うためにオリゴヌクレオチドＨＩＶＬ１９（配列番号７３ ： およびＨＩＶＬ２０（配列番号７４： を、ｐＨＩＶＧ４の４，４５０ｂｐの部分的ＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ断片内にク ローニングした。この操作によって得られたプラスミドをｐＨＩＶＧ５と呼ぶ。 次いで、ｇａｇ遺伝子の残り、ならびにｐｏｌ遺伝子をｐ１７「遺伝子」の下 流にクローニングした。これを行うために、ｐＨＸＢ２Ｄの４，９５５ｂｐのＣ ｌａＩ−ＳａｌＩ断片（ｇａｇ遺伝子の大部分、およびｐｏｌ遺伝子の全部を含 有する）を、ｐＨＩＶＧ５の４，１５０ｂｐのＣｌａＩ−ＳａｌＩ断片内にクロ ーニングした。この操作によって得られたプラスミドをｐＨＩＶＧ６と呼ぶ。 次いで、非関連３′−非コーディング配列を除去した。これを行うために、３ ６０ｂｐのＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩ ＰＣＲ断片（ｐｏｌ遺伝子の３′末端を含 有する）を、ｐＨＩＶＧ６の８，０３０ｂｐのＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片内に クローニングした。（該ＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチドプライマーＨＩＶＰ ７（配列番号７５： およびＨＩＶＰ８（配列番号７６： を用いてプラスミドｐＨＸＢ２Ｄから調製されたものである。）このようにして 得られたプラスミドをｐＨＩＶＧ７と呼ぶ。 次いで、Ｉ３Ｌをプロモーターとするｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子を、カ ナリアポックスＣ３の隣接アームの間にクローニングした。これを行うために、 ｐＨＩＶＧ７の４，３６０ｂｐの部分的ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（Ｉ３Ｌを プロモーターとするｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子を含有する）を、ｐＶＱＨ ６ＣＰ３ＬのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。この操作により得られたプラ スミドをｐＨＩＶＧＥ１４と呼ぶ。 次に、Ｈ６をプロモーターとするＨＩＶ１ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスブ レン）「遺伝子」（Gurgo他、1988）をｐＨＩＶＧＥ１４内にクローニングした 。これを行うために、ｐＣ５ＨＩＶＭＮ１２０Ｔの１，７００ｂｐのＮｒｕＩ− ＳｍａＩ断片（ｇｐ１２０（＋トランスメンブレン）「遺伝子」を含有する）を 、ｐＨＩＶＧＥ１４の１１，４００ｂｐのＮｒｕＩ−ＳｍａＩ断片内にクローニ ングした。この操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１４Ｔと呼ぶ。 次いで、ｐｏｌ遺伝子の大部分を除去した。これを実施するために、５４０ｂ ｐのＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ ＰＣＲ断片（ＨＩＶ１プロテアーゼ「遺伝子」を含 有するの３’末端）を、ｐＨＩＶＧＥ１４Ｔの１０，０００ｂｐのＡｐａＩ−Ｂ ａｍＨＩ断片にクローニングした。（なお、このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオ チドプライマーＨＩＶＰ５およびＨＩＶＰ３７（配列番号７７： を用いてプラスミドｐＨＩＶＧ７から調製されたものである。この操作により、 ｐｏｌ遺伝子の大部分が除去されるが、そのプロテアーゼ「遺伝子」はインタク トのままで残っている。この操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶ３２とい う。ｐＨＩＶ３２（配列番号７８）のＤＮＡ配列は図１４Ａ〜１４Ｃに示されて おり、この図は、ｐＨＩＶ３２に含まれＨ６をプロモーターとするＨＩＶ１ｇｐ １２０（＋トランスメンブレン）遺伝子およびＩ１３ＬをプロモーターとするＨ ＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）遺伝子のヌクレオチド配列を示す。ｇａｇ（＋プロ）お よびｇｐ１２０（＋トランスメンブレン） ＡＬＶＡＣ Ｃ３隣接アームのＤＮＡ配列（配列番号７９）は、図１５Ａ〜Ｆ に示されている。この図１５Ａ〜１５Ｆは、ｐＶＱＨ６ＣＰ３ＬにおけるＣ３遺 伝子座のヌクレオチド配列を示している。 Ｃ３遺伝子座、ｐＶＱＨ６ＣＰ３Ｌ中 ｐＨＩＶ３２を用いてＡＬＶＡＣをレスキューウイルスとするインビトロ組換 えを行いｖＣＰ２０５を得た。実施例１５ −ＨＩＶ１のｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ ）（＋トランスメンブレン）および２つのｎｅｆ（ＢＲＵ）エ ピトープを発現するＡＬＶＡＣ組換体の構築 次に、２つのｎｅｆ ＣＴＬエピトープ、ＣＴＬ１（アミノ酸６６〜１４７） およびＣＴＬ２（アミノ酸１８２〜２０６）（Wain-Hobson他、1985；Nixonおよ びMcMichael、1991）をコードする発現カセットをｖＣＰ２０５に挿入した。ｎ ｅｆ ＣＴＬエピトープを含有する挿入プラスミドｐ２−６０−ＨＩＶ．３の構 築は次のように行った。Ｉ１３ＬをプロモーターとするＣＴＬエピトープをｐＢ ＳＨ６にクローニングした。これを実施するため、２５５ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ −ＸｈｏＩ ＰＣＲ断片（Ｉ３ＬをプロモーターとするＣＴＬ２エピトープを含 有する）を、ｐＢＳＨ６の３，１００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片にク ローニングした。（この２５５ｂｐのＰＣＲは次にように調製した。すなわち、 オリゴヌクレオチドフライマーＶＱＰＣＲＩ３（配列番号８０： およびＩ３ＰＣＲＣＴＬ（配列番号８１： を用いてプラスミドｐＭＰＩ３Ｈから、Ｉ３ＬプロモーターおよびＣＴＬ２エピ トープの５′末端を有する２１６ｂｐのＰＣＲ断片を調製した。次に、この２１ ６ｂｐのＰＣＲ断片を鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーＶＱＰＣＲＩ ３およびＣＴＬＰＣＲ（配列番号８２： を用いて第２のＰＣＲ反応を行い、Ｉ３ＬをプロモーターとするＣＴＬ２エピト ープを含有するＰＣＲ断片を調製し、これをＨｉｎｄＩＩＩＸｈｏＩで酵素分解 して、ｐＢＳＨ６にクローニングした。）この操作により得られたプラスミドを ｐ２−６０−ＨＩＶ．１と呼ぶ。 次いで、このｐ２−６０−ＨＩＶ．１に、Ｈ６をプロモーターとするＣＴＬ１ エピトープをクローニングした。これを行うために、２９０ｂｐＮｒｕＩ−Ｅｃ ｏＲＩ断片（Ｈ６をプロモーターとするＣＴＬエピトープを含有）を、ｐ２−６ ０−ＨＩＶ．１の３，３００ｂｐのＮｒｕＩ−ＥｃｏＲＩ断片にクローニングし た。（なお、２９０ｂｐのＮｒｕＩ−ＥｃｏＲＩ断片の調製は、次のように行っ た。オリゴヌクレオチドＨ６ＰＣＲ１（配列番号８３： およびＮＣＣＰＣＲ１（配列番号８４： を用いて、プラスミドｐＨ６Ｔ２から、Ｈ６プロモーターおよびＣＴＬ１エピト ープの５′末端を含有する１９５ｂｐのＰＣＲ断片を得た。次に、この１９５ｂ ｐのＰＣＲ断片およびオリゴヌクレオチドＮＣＣ１７４Ａ（配列番号８５： およびＮＣＣ１７Ｂ（配列番号８６： を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーＨ６ＰＣＲおよびＮＣＣＰＣＲ２（ 配列番号８７： を用いて第２のＰＣＲ反応を行った。得られた３１７ｂｐのＰＣＲ断片（Ｈ６プ ロモーターおよび大部分のＣＴＬ１エピトープを含有する）ならびにオリゴヌク レオチドＮＣＣ２９１Ａ（配列番号８８： およびＮＣＣ２９１Ｂ（配列番号８９： を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーＨ６ＰＣＲ１およびＮＣＣＰＣＲ３ （配列番号９０： を用いて第３のＰＣＲ反応を行い、Ｈ６をプロモーターとするＣＴＬ１エピトー プを含有するＰＣＲ断片を得て、これをＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＩで酵素分解し 、ｐ２−６−ＨＩＶ．１にクローニングした。）この操作により得られたプラス ミドをｐ２−６０−ＨＩＶ．２と呼ぶ。 次に、Ｉ３ＬをプロモーターとするＣＴＬ２およびＨ６をプロモーターとする エピトープをカナリアポックスＣ６隣接アーム間にクローニングした。これを行 うために、ｐ２−６０−ＨＩＶ．２の６４０ｂｐのＸｈｏＩ断片（２つのｎｅｆ ＣＴＬエピトープを含有する）をｐＣ６ＬのＸｈｏＩ部位にクローニングした 。この操作で得られたプラスミドをｐ２−６０−ＨＩＶ．３と呼ぶ。ｐ２−６０ −ＨＩＶ．３のＤＮＡ配列（配列番号９１）は図１６に示されている。この図１ ６は、ｐ２−６０−ＨＩＶ．３に含有されているＩ３Ｌをプロモーターとするｎ ｅｆ ＣＴＬ２エピトープおよびＨ６をプロモーターとするｎｅｆＣＴＬ１エピ トープのヌクレオチド配列を示す。 ｎｅｆ ＣＴＬエピトープ ＡＬＶＡＣ Ｃ６隣接アームのＤＮＡ配列（配列番号９２）は、図１７Ａ〜Ｃ に示されている。この図１７Ａ〜１７Ｃは、ｐＣ６ＬにおけるＣ６遺伝子座のヌ クレオチド配列を示す。 Ｃ６遺伝子座、ｐＣ６Ｌ中 ｐ２−６０ＨＩＶ．３を用いてｖＣＰ２０５をレスキューウイルスとするイン ビトロ組換えを行いｖＣＰ２６４を得た。実施例１６ −ＨＩＶ１のｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ ）（＋トランスメンブレン）および２つのｎｅｆ（ＢＲＵ）お よび３つのｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬエピトープを含有する領 域を発現するＡＬＶＡＣ組換えの構築 次に、このｖＣＰ２６４に、３つのｐｏｌＣＴＬエピトープ、ｐｏｌ１（アミ ノ酸１７２〜２１９）、ｐｏｌ２（アミノ酸３２５〜３８３）およびｐｏｌ３（ アミノ酸４６１〜５１９）（Ratner他、1985；NixonおよびMcMichael、1991）を コードする発現カセットを挿入した。３つのｐｏｌＣＴＬエピトープを含有する 挿入プラスミドｐＣ５ＰＯＬＴ５Ａの調製は、９４８ｂｐのＸｈｏＩ−ＢａｍＨ Ｉ断片（Ｈ６をプロモーターとするｐｏｌ１エピトープ、Ｉ３Ｌをプロモーター とするｐｏ１２，４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３を含有）を、ｐＢＳＫ+ の２，９４０ｂｐのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行 った。（なお、９４８ｂｐのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片は次のように調製した。 プラスミドｐＨＸＢ２Ｄから、オリゴヌクレオチドプライマーＰｌＡ（配列番号 ９３： およびＰ１Ｂ（配列番号９４： を用いて、１８３ｂｐのＰＣＲ断片（ｐｏｌ１エピトープを含有）を調製した。 プラスミドｐＨＸＢ２Ｄから、オリゴヌクレオチドプライマーＰ２Ａ（配列番号 ９５： およびＰ２Ｂ（配列番号９６： を用いて、２２４ｂｐのＰＣＲ断片（ｐｏｌ２エピトープを含有）を調製した。 プラスミドｐＨＸＢ２Ｄから、オリゴヌクレオチドプライマーＰ３Ａ（配列番号 ９７： およびＰ３Ｂ（配列番号９８： を用いて、２３６ｂｐのＰＣＲ断片（ｐｏｌ３エピトープを含有）を調製した。 プラスミドｐ２−６０−ＨＩＶ．２からオリゴヌクレオチドプライマーＰ２ＩＶ Ｈ（配列番号９９： およびＩＶＨＰＩ（配列番号１００： を用いて、３４０ｂｐのＰＣＲ断片（Ｉ１３ＬプロモーターとＨ６プロモーター を頭部対頭部の関係で含有）を調製した。プラスミドｐＶＱ４２ＫＴｈ４．１か ら、オリゴヌクレオチドプライマーＥＰＳ４２Ｋ（配列番号１０１： および４２ＫＰ３Ｂ（配列番号１０２： を用いて、１６８ｂｐのＰＣＲ断片（４２Ｋプロモーターを含有）を調製した。 ２２４ｂｐのＰＣＲ断片（ｐｏｌ２エピトープを含有）、および３４０ｂｐのＰ ＣＲ断片（Ｉ３ＬプロモーターおよびＨ６プロモーターを含有）を鋳型とし、オ リゴヌクレオチドプライマーＰ２ＢおよびＩＶＨＰ１を用いてＰＣＲ反応を行い 、Ｈ６プロモーターおよびＩ３Ｌをプロモーターとするｐｏｌ２エピトープを含 有する５１１ｂｐのＰＣＲ断片を調製した。１６８ｂｐのＰＣＲ断片（４２Ｋプ ロモーターを含有）および２３６ｂｐのＰＣＲ断片（ｐｏｌ３エピトープを含有 ）を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーＩＰＳ４２ＫおよびＰ３Ｂを用い て、ＰＣＲ反応を行い、４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３エピトープを含有 する３４７ｂｐのＰＣＲ断片を調製した。１８３ｂｐのＰＣＲ断片（ｐｏｌ１エ ピトープを含有）および３４７ｂｐのＰＣＲ断片（４２Ｋをプロモーターとする ｐｏｌ３エピトープを含有）を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーＰＩＡ およびＰ３Ｂを用いてＰＣＲ反応を行い、ｐｏｌ１エピトープおよび４２Ｋをプ ロモーターとするｐｏｌ３エピトープを含有する５０６ｂｐのＰＣＲ断片を調製 した。５１１ｂｐのＰＣＲ断片（Ｈ６プロモーターおよびＩ３Ｌをプロモーター とするｐｏｌ２エピトープを含有）および５０６ｂｐのＰＣＲ断片（ｐｏｌ１エ ピトープおよび４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３を含有）を鋳型とし、オリ ゴヌクレオチドプライマーＰ２ＢおよびＰ３Ｂを用いてＰＣＲ反応を行い、Ｈ６ をプロモーターとするｐｏｌ１エピトープ、Ｉ３Ｌをプロモーターとするｐｏｌ ２および４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３エピトープを含有する９７７ｂｐ のＰＣＲ断片を調製した。次いで、この９７７ｂｐのＰＣＲ断片をＸｈｏＩとＢ ａｍＨ Ｉで酵素分解し、ｐＢＳＫ+の２，９４０ｂｐのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片にク ローニングした。）この操作により得られたプラスミドをｐＢＳＰＯＬＴ５と称 する。 このｐＢＳＰＯＬＴ５のヌクレオチド配列分析を行ったところｐｏｌ２エピト ープに誤りがあることが示された。この誤りを訂正するために、Ｈ６をプロモー ターとするｐｏｌ１エピトープ、Ｉ３Ｌをプロモーターとするｐｏｌ２エピトー プおよび４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３エピトープを含有する９４８ｂｐ のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーＩ３Ｐ ＣＲＩ（配列番号１０３： およびＦＩＸＰＯＬ２（配列番号１０４： を用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ断片（Ｉ３Ｌをプロモーターとす る訂正ｐｏｌ２エピトープを含有）をＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで酵素分解し、 ｐＢＳＰＯＬＴ５の３，６５０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニ ングした。この操作により得られたプラスミドをｐＢＳＰＯＬＴ５Ａと呼ぶ。 次に、Ｈ６をプロモーターとするｐｏｌ１エピトープ、Ｉ３Ｌをプロモーター とするｐｏｌ２エピトープおよび４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３エピトー プをカナリアポックスＣ５隣接アーム間にクローニングした。これを行うために 、Ｈ６をプロモーターとするｐｏｌ１エピトープ、Ｉ３Ｌをプロモーターとする ｐｏｌ２エピトープおよび４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３エピトープを含 有するｐＢＳＰＯＬＴ５Ａの８９７ｂｐのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片内にクロー ニングした。この操作により得られたプラスミドをｐＣ５ＰＯＬＴ５Ａと呼ぶ。 ｐＣ５ＰＯＬＴ５ＡのＤＮＡ配列（配列番号１０５）のＤＮＡ配列は、図１８Ａ 〜Ｂに示されている。この図１８Ａ〜図１８Ｂは、ｐＣ５ＰＯＬＴ５Ａ内のＩ３ Ｌをプロモーターとするｐｏｌ２エピトープ、Ｈ６をプロモーターとするｐｏｌ １エピトープおよび４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３のヌクレオチド配列を 示 すものである。 ＰＯＬ ＣＴＬエピトープ ＡＬＶＡＣ Ｃ５隣接アームのＤＮＡ配列（配列番号１０６）は図１９Ａ〜Ｃ に示されている。この図１９Ａ〜１９ＣはｐＮＣ５Ｌ−ＳＰ５におけるＣ５遺伝 子座のヌクレオチド配列を示すものである。 Ｃ５遺伝子座（ｐＮＣ５Ｌ−ＳＰ５中） ｐＣ５ＰＯＬＴ５Ａを用いてｖＣＰ２６４をレスキューウイルスとするインビ トロ組換えを行いｖＣＰ３００を得た。実施例１７ −制限酵素分析および免疫沈降分析 ｖＣＰ３００内でＨＩＶ１配列が正しい遺伝子座に存在していることを確認す るために、制限酵素分析を行った。ＡＬＶＡＣ、ｖＣＰ２０５、ｖＣＰ２６４お よびｖＣＰ３００のＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩまたはＸｈｏＩで分解し 、得られた断片をアガロースゲル上で分画化した。得られた断片の大きさを比較 したところ、予期されたように、ｇａｇ（＋プロ）遺伝子およびｇｐ１２０（＋ トランスメンブレン）遺伝子はＣ３遺伝子座に挿入され、ｎｅｆエピトープはＣ ６ 遺伝子座に挿入され、また、ｐｏｌエピトープはＣ５遺伝子座に挿入されていた ことが確認された。ｖＣＰ３００が真正のＨＩＶ１ｇａｇおよびｇｐ１２０（＋ トランスメンブレン）遺伝子産物を発現しているか否かを確認するため免疫沈降 分析を行った。ＨｅＬａ細胞の単層を、１０ｐｆｕ／細胞のm.o.i.でＡＬＶＡＣ またはｖＣＰ３００で疑似感染または感染させた。１時間の吸着期間の後、接種 物を吸引して取り出し、細胞の上に２％のウシ胎児血清および［³⁵Ｓ］−メチオ ニン（２０μＣｉ／ｍ／ｌ）を含有する改変イーグル液（メチオニン無し）２ｍ ｌをかぶせた。感染後１８時間経過した、１ｍｌの３×バッファーＡ（３％ＮＰ −４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のア ジ化ナトリウムおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）および５０μｌのアプロチ ニンを添加した後、細胞の単層をかきとることにより、細胞を回収した。感染細 胞由来の破砕物を分析して、ＨＩＶ１に血清反応陽性個体由来の血清を用いＨＩ Ｖ１ｇａｇおよびｇｐ１２０（＋トランスメンブレン）遺伝子の発現をＨＩＶ１ 血清陽性者由来の血清（ニューヨーク州保健部より入手）を用いて調べた。４℃ で一晩保存して該血清を保存してプロテインＡ−セファロースに結合させた。こ の定温保存後、材料をバッファーＡで４回洗浄した。平常なヒト血清およびプロ テインＡ−セファローズで予め調べられた破砕物を、次に、プロテインＡ−セフ ァロースに結合されたＨＩＶ１に血清反応陽性のヒト血清とともに４℃において 一晩培養した。一晩の培養の後、サンプルをバッファーＡで４回およびＬｉＣＬ 2／尿素バッファーで２回洗浄した。２×Laemmliバッファー（１２５ｍＭのトリ ス（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％の２−メルカプト エタノール）を添加し、５分間沸騰させることにより、免疫複合体から沈着タン パク質を解離させた。このタンパク質を１０％のDreyfussゲル（Dreyfuss他、19 84）上で分画化し、固定化し、且つ、１Ｍのサリチル酸ナトリウムで処理して間 接撮影に供した。この分析により、ＨＩＶ１ｇａｇおよびｇｐ１２０（＋トラン スメンブレン）遺伝子産物はｖＣＰ３００で感染された細胞からは沈降したが、 疑似感染細胞またはＡＬＶＡＣ感染細胞からは沈降されないことが示された。 ｖＣＰ３００で感染された細胞内でのｎｅｆおよびｐｏｌエピトープの発現は 確認されていないが、これは、該エピトープに特異的な血清試薬が未だ入手でき ないためである。しかしながら、ヌクレオチド配列分析により、ｖＣＰ３００に クローニングされたｎｅｆおよびｐｏｌは正しいものであることが確認された。 ｎｅｆおよびｐｏｌの発現カセットを含有するＰＣＲ断片をｖＣＰ３００ＤＮＡ から調製した。これらの断片のヌクレオチド配列の分析により、ｎｅｆおよびｐ ｏｌの配列が正しいことが示された。 ｖＣＰ２０５は、ｖＣＰ３００の場合と同様に細胞表面に結合した形態のＨＩ Ｖ１ｇｐ１２０を発現させる。ｖＣＰ２０５により発現されたようなこの遺伝子 産物の免疫原性を実験用小動物で分析した。実施例１８ −免疫原性の検討 ２匹のウサギまたはモルモットから成る各グループに、１０８ｐｆｕのＡＬＶ ＡＣ、ＶＣＰ２０５、または０．１ｍｇのペプチドＣＬＴＢ−３６（GPKEPFRDYV DRFYKNKRKRIHIGPGRAFYTTKN）（配列番号１０７）（０．０５ｍｇのＱＳ−２１を アジュバントとする）を次の表（表２１）に示すスケジュールに従って筋肉内接 種した。 各ウサギおよびモルモットは、最初の接種の前、また、最初の接種後は２週間 毎に１４週間にわたり採血した。各血液サンプルから血清を調製し、使用するま で−７０℃で保存した。各血清について、動力学的酵素結合免疫吸着アッセイ（ ＫＥＬＩＳＡ）により、組換えＨＩＶ ＭＮ／ＢＲＵハイブリッドｇｐ１６０ま たは２５−ｍｅｒの合成ＨＩＶ ＭＮｇｐ１２０ Ｖ３ループ（米国マサチュ ーセッツ州CambridgeのAmerican Bio-technologies社製、製品番号６８６０１０ ）に対する抗体応答を調べた。 ｖＣＰ２０５で免疫されたウサギ（グループ２）が最も高いレベルの抗ｇｐ１ ６０抗体を産生した（図２０参照）。ウサギは表２１のスケジュールに従って免 疫され（図２０の矢印）、２週間おきに採血された。各血清を稀釈バッファーで １００倍に稀釈し、動力学的ＥＬＩＳＡ法を用いて精製組換えＨＩＶ ＭＮ／Ｂ ＲＵ ｇｐ１６０に対する反応性を調べた。このグループの２匹のウサギはいず れも、単一の接種後にｇｐ１６０に反応性の抗体を産生し始めた。後の接種によ り追加しても抗体レベルの増加は僅かであった。ｖＣＰ２０５を２回接種し、そ の後、ＱＳ−２１アジュバント中のペプチドＣＬＴＢ−３６で追加免疫したウサ ギ（グループ３）は、コントロール用ウサギ（グループ１）と比較すると抗ｇＰ １６０抗体を産生していないようであった。ＱＳ−２１に溶かしたペプチドＣＬ ＴＢ−３６で３回免疫したウサギのうち、１匹だけが、ｇｐ１６０に特異的な抗 体を産生して応答した。その応答のあったウサギ（Ａ３５３）は、第３回目の免 疫後になってようやくｇｐ１６０抗体を産生し始めた。 ペプチドＣＬＴＢ−３６のみを免疫したウサギは、該ペプチドはエンベロープ （膜）糖タンパク質（Ｖ３ループ）の一部のみしか含んでいないので、広範に反 応性のあるｇｐ１６０特異的抗体を産生するとは期待されなかった。したがって 、血清を試験して、ＨＩＶ ＭＮ Ｖ３ループの２５ケのアミノ酸を含有するペ プチドに対する反応性を検討した（図２１）。表２１のスケジュールに従ってウ サギを免疫し（図２２の矢印）、２週間毎に採血した。各血清を稀釈バッファー で１００倍に稀釈して、ＨＩＶ ＭＮ ｇｐ１２０ Ｖ３ループを表す２５−ｍ ｅｒから成る合成ペプチド（CNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGTIC：（配列番号１０８） 米国マサチューセッツ州CambridgeのAmerican Bio-technologies社製、製品番号 686010）に対する反応性を動力学的ＥＬＩＳＡ法を用いて試験した。前と同様に 、ｖＣＰ２０５を３回接種したウサギの血清中に最も高いＶ３抗体応答が見出さ れた。ｖＣＰ２０５を２回接種した後、ＱＳ−２１に溶かしたペプチドＣＬＴＢ −３６を接種すると抗Ｖ３抗体の応答はあったが、グループ２のように高くはな かった。ここでも前と同様に、ＱＳ−２１に溶かしたペプチドＣＬＴＢ−３６を ３ 回接種したうち１匹のウサギだけが応答を示した。 全てのグループのモルモット（グループ１の１匹を含む）ＨＩＶｇｐ１６０に 反応する抗体を産生した（図２２）。表２１のスケジュールに従いモルモットを 免疫し（図２２の矢印）、２週間の間隔をおいて採血した。各血清を稀釈緩衝液 で２００倍に稀釈し、動力学的ＥＬＩＳＡ法を用いて精製された組換えＨＩＶ ＭＮ／ＢＲＵｇｐ１６０に対する反応性を試験した。グループ１においては１匹 のみが、ＱＳ−２１アジュバンド中のペプチドＣＬＴＢ−３６を接種した後で応 答を示した。グループ２、３および４における全てのモルモットの血清中の抗体 レベルは同程度であった。殆どのモルモットは単一回の接種後にｇｐ１６０抗体 を産生することにより応答した。 ＫＥＬＩＳＡ抗原としてＨＩＶ ＭＮ Ｖ３ ２５−ｍｅｒペプチドを用いた 場合にも同様の結果が認められた（図２３）。表２１のスケジュールに従いモル モットを免疫し（図２３の矢印）、２週間毎に採血した。各血清を稀釈バッファ ーで２００倍に稀釈し、ＨＩＶ ＭＮ ｇｐ１２０ Ｖ３ループを表す２５−ｍ ｅｒから成る合成ペプチド（CNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGTIC（配列番号１０９）米 国マサチューセッツ州CambridgeのAmerican Bio-Technologies社製、製品番号68 6010）に対する反応性を動力学的ＥＬＩＳＡ法を用いて試験した。ＱＳ−２１中 のペプチドＣＬＴＢ−３６を単一回接種するとＶ３抗体応答が誘起され、第２回 および第３回目の接種によりブースター効果が認められた。Ｖ３抗体応答を誘起 するにはｖＣＰ２０５の２回接種が必要であったが、ｖＣＰ２０５またはＱＳ− ２１中のＣＬＴＢ−３２を３回目に接種するとブースター効果があり、さらに高 レベルとなった。 ｖＣＰ３００により発現されたＮｅｆおよびｐｏｌ ＣＴＬエピトープの発現 性および免疫原性を明らかにするため以下のインビトロアッセイを行った。ＨＩ Ｖに血清反応陽性の個体から新鮮なＰＢＭＣを入手した。これらの細胞の２０％ に１０m.o.iでｖＣＰ３００を接種した。接種から２時間後、細胞を洗浄し、自 己由来の非接種ＰＢＭＣと、非接種／接種の比率を１０：１として混合した。（ 接種密度は１．５×１０⁶細胞／ｍｌとした。）０日目に、外来源としてＩＬ− ７を最終濃度が１０００Ｕ／ｍｌとなるように添加した。３日目に、外来源とし て、 ＩＬ−７およびＩＬ−２を、最終濃度がそれぞれ１０００Ｕ／ｍｌおよび２２０ Ｕ／ｍｌとなるように添加した。培養から１２日経過後、ターゲットとしてＨＩ Ｖ−１タンパク質を発現するワクシニアウイルス（ＷＲ）組換体を感染させた自 己由来のエピスタイン−バーウイルス形質転換Ｂ細胞を標的として用いる標準的 な51Ｃｒ遊離アッセイに、上記のインビトロ刺激された細胞群を用いた。エフェ クター／ターゲット（Ｅ／Ｔ）細胞比を２０：１とした場合のアッセイの結果を 図２４および図２５に示し、特異的溶解のパーセントとして表している。これら の結果を総合すると、ｖＣＰ３００を感染させたＰＢＭＣが、ＨＩＶ−１、Ｅｎ ｖ−、Ｇａｇ−、Ｐｏｌ−、およびＮｅｆ−特異的細胞溶解活性を刺激すること が明らかである。さらに、抗ＣＤ８モノクローナル抗体により細胞溶解活性が排 除されることにより、細胞溶解活性を媒介する細胞の特性は古典的なＣＤ８+Ｃ ＴＬであることが明らかである。 以上のことをまとめると、ＨＩＶ ＡＬＶＡＣ組換体カナリアポックスウイル スであるｖＣＰ２０５を接種されたウサギおよびモルモットは、ＨＩＶのエンベ ロープ糖タンパク質、ＨＩＶ中性化に関連するＨＩＶエンベロープ糖タンパク質 の１領域（ｇｐ１２０ Ｖ３領域）に対する抗体を誘起した。また、ｖＣＰ３０ ０により発現されたＥｎｖ、Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＮｅｆをコードする発現産物 の発現性と免疫原性は、血清反応陽性の個体由来のＣＤ８+ＣＴＬのインビトロ 刺激により明らかにされる。かくして、ｖＣＰ２０５およびｖＣＰ３００、なら びに、これらの組換体の前駆体、発現産物およびこれらの組換体由来のＤＮＡは 、上記のようにきわめて有用である。実施例１９ −ｖＣＰ１３０７（ｇｐ１２０ Ｖ３ループに挿入された２つの ＥＬＤＫＷＡエピトープを含むＨＩＶ１ ｇｐ１２０＋ＴＭを 発現するＡＬＶＡＣ組換体）の構築 ｇｐ１２０ Ｖ３ループ領域に挿入されたＨＩＶ１のｇｐ４１由来の２つのＥ ＬＤＫＷＡエピトープとともにＨＩＶ１ ｇｐ１２０＋ＴＭを発現するＡＬＶＡ Ｃ組換体であるｖＣＰ１３０７を以下のように作成した。ＥＬＤＫＷＡ要素およ びＶ３ループの一部をコードする配列をｐＢＳＫ＋（米国カリフォルニア州La J ollaのStratagene社製）にクローニングした。これを行うために、ＥｃｏＲＩ− ＳａｃＩで酵素分解した２２５ｂｐのＰＣＲ断片（ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配 列の一部を含有）を、ｐＢＳＫ＋の２，９００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片 にクローニングした。（なお、該ＰＣＲ断片は、プラスミドｐＢＳＨＩＶＭＮ１ ２０Ｔから、プライマーＨＩＶＰ７２（配列番号１１０： およびＨＩＶＰ７４（配列番号１１１： から調製した。）この操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶ５５と呼ぶ。 また、Ｈ６をプロモーターとするＨＩＶ１ ｇｐ１２０＋ＴＭ遺伝子を含有す るプラスミドであるｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔは、次のように調製されたもので ある。ＨＩＶ（ＭＮ）ｅｎｖ遺伝子のｃＤＮＡコピーを含有するプラスミドＰＭ Ｎ１．８−９をMarvin Reitz氏（米国ＮＣＩ、ＮＩＨ）から入手した。ｅｎｖ遺 伝子の初期転写終結シグナルＴ5ＮＴを改変させた。これを行うために、Ｋｐｎ Ｉ−ＥｃｏＲＩ消化された１，１００ｂｐのＰＣＲ断片（ｅｎｖ遺伝子のＴ5Ｎ Ｔ改変５′末端を含有する）を、ｐＢＳＫ＋の２，９００ｂｐのＫｐｎＩ−Ｅｃ ｏＲＩ断片中にクローニングした。（なお、該ＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチ ドＨＩＶＭＮ６（配列番号１１２： およびＨＩＶ３Ｂ２（配列番号１１３： を用いて、プラスミドｐＭＮ１．８−９から調製した。この操作により得られた プラスミドｐＢＳＭＩＤＭＮと呼ぶ。 次に、ｅｎｖ遺伝子のＴ5ＮＴ改変５′末端をｅｎｖ遺伝子の残りｅｎｖ遺伝 子の上流にクローニングした。これを行うため、ｐＢＳＭＩＤＭＮの１，０２５ ｂ ｐのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片（ｅｎｖ遺伝子のＴ5ＮＴ改変５′末端を含有） を、ｐＢＳ３ＭＮの４，３００ｂｐのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片にクローニング した。（ｐＢＳ３ＭＮは、ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ酵素分解した４３０ｂｐのＰＣ Ｒ断片（ｅｎｖ遺伝子の中央部分を含有）およびＳａｃＩ−ＸｂａＩ酵素分解し た１，０５０ｂｐのＰＣＲ断片（ｅｎｖ遺伝子の３′末端を含有）を、ｐＢＳＫ ＋の２，９００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片中にクローニングすることによ り調製した。ここで、４３０ｂｐのＰＣＲ断片は、プラスミドｐＭＮ１．８−９ から、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１１４： およびＨＩＶＭＮ４（配列番号１１５： を用いて調製した。また、１，０５０ｂｐのＰＣＲ断片は、プラスミドｐＭＮ１ ．８−９から、オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ５（配列番号１１６： およびＨＩＶＭＮ３Ｐ（配列番号１１７： を用いて調製した。このような操作により得られたプラスミドをｐＢＳＭＩＤ３ ＭＮと呼ぶ。 次に、ｅｎｖ遺伝子の上流にＨ６プロモーター（Perkus他、1989）をクローニ ングした。これを行うために、ｐＨ６ＩＩＩＢＥの３２０ｂｐのＫｐｎＩ断片（ ＨＩＶ１（ＩＩＴＢ）ｅｎｖ遺伝子の５′末端に結合されたＨ６プロモーターを 含有）およびｐＢＳＭＩＤ３ＭＮの２，４５０ｂｐのＫｐｎＩ−ＸｂａＩ断片（ ＨＩＶ（ＭＮ）ｅｎｖ遺伝子の本体を含有）を、ｐＢＳＫ＋の２，９００ｂｐの ＫｐｎＩ−ＸｂａＩ断片中にクローニングした。このような操作により得られた プラスミドをｐＨ６ＨＭＮＥと呼ぶ。 次に、ｇｐ４１をコードする配列を、ＨＩＶ１のｅｎｖトランスメンブレン（ ＴＭ）領域をコードする配列と置き換えた。これを実施するため、ＥｃｏＲＩ− ＸｂａＩで酵素分解した４８０ｂｐのＰＣＲ断片（ｇｐ１２０遺伝子の３′末端 およびＨＩＶ１のｅｎｖトランスメンブレン領域を含有）を、ｐＧ６ＨＭＮＥの ４，２００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片にクローニングした。（なお、この ＰＣＲ断片は、ＰＣＲ断片（ＰＣＲ−ＭＮ１１）ならびにオリゴヌクレオチドＨ ＩＶＴＭ１（配列番号１１８： およびＨＩＶＴＭ２（配列番号１１９： から、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１１４）およびＨＩＶＴＭ３ （配列番号１２０： を用いて調製した。ＰＣＲ−ＭＮ１１は、プラスミドｐＨ６ＨＭＮＥから、オリ ゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１１４）およびＨＩＶＭＮ１８（配列番 号１２１： から調製した。）この操作により得られたプラスミドをｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０ Ｔと呼ぶ。 ＥＬＤＫＷＡエピトープおよびＶ３ループをコードしている配列の別の部分を 、続いてｐＢＳＫｔ中にクローン化した。これは、ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配 列の一部を含む３００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ消化したＰＣＲ断片を、 ２９００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ消化したｐＢＳＫｔ断片中にクローン 化 することにより行った。（このＰＣＲ断片は、プラスミドｐＢＳＨＴＶＭＮ１２ ０Ｔを、プライマーＨＩＶＰ６９（配列番号１２２；）およびＨＩＶＰ７５（配 列番号１２３）とともに用いて作成した。） この操作により作成されたプラスミドをｐＨＩＶ５６と称した。 次に、ｐＨＩＶ５５およびｐＨＩＶ５６からのＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列 を、Ｈ６をプロモーターとするｇＰ１２０＋ＴＭ遺伝子にクローニングした。こ れを行うため、ｐＨＩＶ５５の２２５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片およびｐ ＨＩＶ５６の３００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片（ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ ループを含有）を、ｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔの４，３００ｂｐのＥｃｏＲＩ− ＨｉｎｄＩＩＩ断片にクローニングした。この操作により得られたプラスミドを ｐＨＩＶ５７と呼ぶ。 次に、ＥＬＤＫＷＡエピトープを含有しているＨ６をプロモーターとするｇｐ １２０＋ＴＭ構築物を、Ｃ５隣接アームの間にクローニングした。これを実施す るため、ｐＨＩＶ５７の１，７００ｂｐのＮｒｕＩ−ＸｂａＩ断片（ＥＬＤＫＷ Ａエピトープを含有し、Ｈ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭを含有する ）を、ｐＳＩＶＧＣ１５の４，７００ｂｐのＮｒｕＩ−ＸｂａＩ断片にクローニ ングした。（ｐＳＩＶＧＣ１５は、Ｃ５隣接アーム間にクローニングされたＨ６ をプロモーターとするＳＩＶのｅｎｖ遺伝子を含有する。）この操作により得ら れたプラスミドをｐＧＩＶ５９と呼ぶ。Ｈ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ ＴＭ（ＥＬＤＫＷＡエピトープも有する）のＤＮＡ配列は図２６に示されている 。 ｐＨＩＶ５９を用いて、ＡＬＶＡＣをレスキューウイルスとする組換え実験を 行いｖＣＰ１３０７を得た。 ｖＣＰ１３０７を感染させた細胞上でＨＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭ（ＥＬＤＫ ＷＡエピトープも含む）が発現された否かを確認するためＦＡＣＳ分析を行った 。Ｓ−ＭＥＭ（Sigma製M-8026Joklik懸濁媒体）に懸濁させた５×１０⁶のＨｅＬ ａ −Ｓ３細胞に、５ｐｆｕ／細胞のm.o.i.で、ＡＬＶＡＣ、ｖＰ１２８６（ＨＩＶ １のｇｐ１２０＋ＴＭを発現するＷＲ組換体）、またはｖＣＰ１３０７を感染さ せた。３７℃で６０分間の吸着期間の後、該細胞を１０ｍｌのＳ−ＭＥＭで洗浄 し、１，０００ＲＰＭで５分間遠心した。次に、それらのサンプルを１ｍｌのＳ −ＭＥＭに再懸濁させ、５ｍｌのSarstadt管に移して３７℃の温度下に回転させ た。１８時問後、２００μｌのアリコート（細胞数１×１０⁶）をポリプロピレ ンチューブに入れ、３ｍｌのＰＢＳ−ＣＭＦ（０．２％ＮａＮ₃＋０．２％ＢＳ Ａを含む）で洗浄した。次いで、上澄液をデカンテーションで除去し、ＨＩＶ１ に血清反応陽性のヒト由来の血清（米国the New York State Dept．of Healthか ら入手）を１００倍稀釈したもの、または、ＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的な ヒトモノクローナル抗体ＩＡＭ４１−２Ｆ５（米国テキサスHoustonのViral Tes ting Systems社製）を１００倍稀釈したもの１００μｌにペレットを再懸濁させ た。それらのサンプルを６０分間４℃で定温保存し、ＰＢＳ−ＣＭＦ（０．２％ ＮａＮ₃＋０．２％ＢＳＡを含む）で２回洗浄し、１，０００ＲＰＭで５分間遠 心した。上澄液をデカンテーション除去し、ヤギの抗ヒトＦＩＴＣ（Boehringer Mannheimから入手）の１００倍稀釈液にペレットを再懸濁させた。サンプルを ３０分間、４℃で定温保存し、ＰＢＳ−ＣＭＦ（０．２％ＮａＮ₃＋０．２％Ｂ ＳＡを含む）で２回洗浄し、Fascan flow 細胞計測計（サイトメーター）で分析 した。ｖＣＰ１３０７感染細胞の表面にはＥＬＤＫＷＡエピトープを含有する遺 伝子産物が低レベルで発現されていたが、ＡＬＶＡＣ感染細胞またはｖＰ１２８ ６感染細胞の表面には発現されていなかった（図２７の下欄参照）。ｖＰ１２８ ６感染細胞およびｖＣＰ１３０７感染細胞の表面には、ＨＩＶ１血清反応陽性の 血清に反応性を有する遺伝子産物が発現されていたが、ＡＬＶＡＣ感染細胞の表 面には発現されていなかった（図２７の上欄参照）。このように、ｖＣＰ１３０ ７感染細胞の表面にはＨＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭ（ＥＬＤＫＷＡエピトープを 含む）遺伝子産物であるＥＬＤＫＷＡエピトープが発現され、該遺伝子産物のＶ ３ループの一部がＥＬＤＫＷＡエピトープで置換された事実を裏付けている。 ｖＣＰ１３０７が、免疫原性のあるＥＬＤＫＷＡエピトープを含むｇｐ１２０ ＋ＴＭの一形態を発現するか否かを確認するため、免疫沈降分析を行った。Ｈｅ Ｌａ細胞の単層に、１０ｐｆｕ／細胞のm.o.i.で、ＡＬＶＡＣ（親ウイルス）、 ｖＰ１２８６（ＨＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭを発現するＷＲ組換体）、またはｖ ＣＰ１３０７を感染させた。１時間の吸着期間の後、接種物を除去し、２％の透 析ウシ胎児血清および［³⁵Ｓ］−ＴＲＡＮＳラベル（３０μＣｉ／ｍｌ）を含有 する改変Ｅａｇｌｅ液（システインおよびメチオニン欠除）で細胞を覆った。１ ｍｌの３×バッファーＡ（４５０ｍＭのＮａＣｌ、３％のＮＰ−４０、３０ｍＭ のトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のアジ化ナトリウムお よび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）を添加することにより溶解物を回収し、次の ものの発現を分析した。１）ＥＬＤＫＷＡエピトープ：ＥＬＤＫＷＡエピトープ に特異的なヒトモノクローナル抗体ＩＡＭ４１−２Ｆ５（米国テキサス州Housto nのViral Testing System社製）を１００倍稀釈したものを用いた。２）ＨＩＶ １の遺伝子産物：ＨＩＶ１に血清反応陽性のヒト由来の血清（米国のthe New Yo rk State Dept．of Healthから入手）を１００倍稀釈したものを用いた。平常な ヒト血清およびプロテインＡ−セファローズＡで予め清浄化した溶解物をＩＡＭ ４１−２Ｆ５／プロテインＡ−セファローズ複合体またはＨＩＶ１血清反応陽性 血清／プロテインＡ−セファローズ複合体とともに、４℃で一晩定温保存した。 それらのサンプルをバッファーＡで４回、ＬｉＣｌ2／尿素バッファーで２回洗 浄した。２倍稀釈のLaenmliバッファー（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ＝６．８） 、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添 加し、５分間沸騰させることにより沈降したタンパク質を免疫複合体から解離さ せた。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分画化し、固定化し、 次に１Ｍのサリチル酸ナトリウムで処理し、間接撮影に供した。ＥＬＤＫＷＡに 対するモノクローナル抗体を用いると、ｖＣＰ１３０７感染細胞からは適当な大 きさのタンパク質が沈降したが、ＡＬＶＡＣ感染細胞またはｖＰ１２８６感染細 胞からは沈降しなかった。さらに、ＨＩＶ１血清反応陽性のヒト血清を用いると 、ｖＰ１２８６感染細胞およびｖＣＰ１３０７感染細胞からは適当な大きさのタ ンパク質が沈殿したが、ＡＬＶＡＣ感染細胞からは沈殿しなかった。これらの結 果が示すように、ｖＣＰ１３０７は、抗原性のあるＥＬＤＫＷＡエピトープを含 有するｇｐ１２０＋ＴＭの一形態を発現させる。実施例２０ −ｖＰ１３１３（ｇｐ１２０ Ｖ３ループに挿入された２つのＥ ＬＤＫＷＡエピトープを含むｇｐ１２０＋ＴＭを発現させるＮ ＹＶＡＣ組換体）の構築 ｇｐ１２０ Ｖ３ループに挿入したＨＩＶ１ ｇｐ４１からの２つのＥＬＤＫ ＷＡエピトープを含むＨＩＶ１ ｇｐ１２０＋ＴＭを発現させるＮＹＶＡＣ組換 体であるｖＰ１３１３を次の方法により作成した。ＥＬＤＫＷＡエピトープおよ びＶ３ループの一部をコードする配列をｐＢＳＫ+にクローニングした。これを 行うため、ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩで酵素分解した２２５ｂｐのＰＣＲ断片（ＥＬ ＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列の一部を含有する）を、ｐＢＳＫ＋の２，９００ｂｐ のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片にクローニングした。（なお、このＰＣＲ断片は、 プラスミドｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔから、プライマーＨＩＶＰ７２（配列番号 １３０： およびＨＩＶＰ７４（配列番号１３１： を用いて調製した。）この操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶ５５と呼ぶ 。 Ｈ６をプロモーターとするＨＩＶ１ ｇｐ１２０＋ＴＭ遺伝子を含有するプラ スミドであるｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔは次のように調製した。Marvin Reitz氏 （米国ＮＣＩ、ＮＩＨ）から、ＨＩＶ１（ＭＮ）ｅｎｖ遺伝子のｃＤＮＡコピー を含有するプラスミドｐＭＮ１．８−９を入手した。該ｅｎｖ遺伝子の初期転写 終結シグナルＴ5ＮＴを改変させた。これを行うため、ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ酵 素分解された１，１００ｂｐのＰＣＲ断片（ｅｎｖ遺伝子のＴ5ＮＴ改変５′末 端を含有）をｐＢＳＫ+の２，９００ｂｐのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片にクロー ニングした。（該ＰＣＲ断片は、プラスミドｐＭＮ１．８−９から、オリゴヌク レオチドＨＩＶＭＮ６（配列番号１３２： およびＨＩＶ３Ｂ２（配列番号１１３： を用いて調製した。）この操作により得られたプラスミドをｐＢＳＭＩＤＭＮと 呼ぶ。 次に、このｅｎｖ遺伝子のＴ5ＮＴ改変５′末端をｅｎｖ遺伝子の残りの上流 にクローニングした。これを行うため、ｐＢＳＭＩＤＭＮの１，０２５ｂｐのＫ ｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片（ｅｎｖ遺伝子のＴ5ＮＴ改変５′末端を含有する）を 、ｐＢＳ３ＭＮの４，３００ｂｐのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片にクローニングし た。（ｐＢＳ３ＭＮは、ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ酵素分解した４３０ｂｐのＰＣＲ 断片（ｅｎｖ遺伝子の中央部分を含有する）およびＳａｃＩ−ＸｂａＩ酵素分解 された１，０５０ｂｐのＰＣＲ断片（ｅｎｖ遺伝子の３′末端を含有する）を、 ｐＢＳＫ+の２，９００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片にクローニングした。 ４３０ｂｐのＰＣＲ断片は、プラスミドｐＭＮ１．８−９から、オリゴヌクレオ チドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１１４： およびＨＩＶＭＮ４（配列番号１１５： を用いて調製した。また、１，０５０ｂｐのＰＣＲ断片は、プラスミドｐＭＮ１ ．８−９からオリゴヌクレオチドＨＴＶＭＮ５（配列番号１１６： およびＨＩＶＭＮ３Ｐ（配列番号１１７： を用いて調製した。）この操作により得られたプラスミドをｐＢＳＭＩＤ３ＭＮ と呼ぶ。 次いで、ｅｎｖ遺伝子の上流にＨ６プロモーターをクローニングした。このた めに、ｐＨ６ＩＩＩＢＥの３２０ｂｐのＫｐｎＩ断片（ＨＩＶ１（III Ｂ）ｅｎ ｖ遺伝子の５′末端に結合したＨ６プロモーターを含有する）、およびｐＢＳＭ ＩＤ３ＭＮの２，４５０ｂｐのＸｐｎＩ−ＸｂａＩ断片（ＨＩＶ１（ＭＮ）ｅｎ ｖ遺伝子の本体を含有する）をｐＢＳＫ+の２，９００ｂｐのＸｐｎＩ−Ｘｂａ Ｉ断片にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをｐＨ６ＨＭＮ Ｅと呼ぶ。 次に、ｇｐ４１をコードする配列を、ＨＩＶ１ ｅｎｖトランスメンブレン（ ＴＭ）領域をコードする配列と置き換えた。これを行うため、ＥｃｏＲＩ−Ｘｂ ａＩ酵素分解した４８０ｂｐのＰＣＲ断片（ｇｐ１２０の３′末端およびＨＩＶ １ ｅｎｖトランメンブレン領域を含有する）を、ｐＨ６ＨＭＮＥの４，２００ ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片にクローニングした。（該ＰＣＲ断片は、ＰＣ Ｒ断片ＰＣＲ−ＭＮ１１ならびにオリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭ１（配列番号１ １８： およびＨＩＶＴＭ２（配列番号１１４： から、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１２０）およびＨＩＶＴＭ３ （配列番号１１４： を用いて調製した。ＰＣＲＭＮ−１１は、プラスミドｐＨ６ＨＭＮＥから、オリ ゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１１４）およびＨＩＶＭＮ１８（配列番 号１２１： を用いて調製した。）このようにして得られたプラスミドをｐＢＳＨＩＶＭＮ１ ２０Ｔと呼ぶ。 次に、ＥＬＤＫＷＡエピトープとＶ３ループをコードする他方の部分をｐＢＳ Ｋ+にクローニングした。これは、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ酵素分解した３０ ０ｂｐのＰＣＲ断片（ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列の一部を含有する）を、ｐ ＢＳＫ+の２，９００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片にクローニングする ことにより行った。（なお、該ＰＣＲ断片は、プラスミドｐＢＳＨＩＶＭＮ１２ ０Ｔから、プライマーＨＩＶＰ６９（配列番号１２２： およびＨＩＶＰ７５（配列番号１２３： を用いて調製した。）この操作によって得られたプラスミドをｐＨＩＶ５６と呼 ぶ。 次に、ｐＨＩＶ５５およびｐＨＩＶ５６由来のＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列 を、Ｈ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭ遺伝子にクローニングした。こ れを行うために、ｐＨＩＶ５５の２２５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片および ｐＨＩＶ５６の３００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片（ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ ３ループ配列を含有）を、ｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔの４，３００ｂｐのＥｃｏ −ＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片中にクローニングした。この操作により得られたプ ラスミドをｐＨＩＶ５７と呼ぶ。 次いで、ＥＬＤＫＷＡエピトープを含有しＨ６をプロモーターとするｇｐ１２ ０＋ＴＭ構築物を、Ｃ５隣接アーム間にクローニングした。これを行うために、 ｐＨＩＶ５７の１，７００ｂｐのＮｒｕＩ−ＸｂａＩ断片（ＥＬＤＫＷＡエピト ープを含みＨ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭを含有する）を、ｐＳＩ ＶＧＣ１５の４，７００ｂｐのＮｒｕＩ−ＸｂａＩにクローニングした。（ｐＳ ＩＶＧＣ１５は、Ｃ５隣接アーム間にクローニングされたＨ６をプロモーターと するＳＩＶのｅｎｖ遺伝子を含有する。）このような操作によって得られたプラ スミドをｐＨＩＶ５９と呼ぶ。 次に、ＥＬＤＫＷＡを含みＨ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭを１４ Ｌ隣接アーム間にクローニングした。これは、ｐＨＩＶ５９の１，８５０ｂｐの ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含みＨ６をプロモーター とするｇｐ１２０＋ＴＭ遺伝子を含有する）を、ｐＳＤ５５０ＶＣの３，６００ ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片にクローニングすることにより行った。このよ うな操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶ６０と呼ぶ。ｐＨＩＶ６０内のＨ ６をプロモーターとするＴＭ（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含む）遺伝子の配列は 図２８に示されている。 ｐＨＩＶ６０を用いてＮＹＶＡＣをレスキューウイルスとするインビトロ組換 えを行いｖＰ１３１３を得た。 ｖＰ１３１３を感染させた細胞の表面に、ＨＩＶ１ ｇｐ１２０＋ＴＭ（ＥＬ ＤＫＷＡエピトープを含む）が発現されているか否かを確認するためＦＡＣＳ分 析を行った。Ｓ−ＭＥＭ（Sigma Ｍ−８０２８Joklik懸濁媒体）に懸濁させた５ ×１０⁶個のＨｅＬａ−Ｓ３細胞に、５ｐｆｕ／細胞のm.o.i.でＮＹＶＡＣ、ｖ Ｐ１２８６（ＨＴＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭを発現するＷＲ組換体）またはｖＰ１ ３１３を感染させた。３７℃において１時間の吸着期間の後、１０ｍｌのＳ−Ｍ ＥＮで細胞を洗浄し、１，０００ＲＰＭで５分間遠心した。次いで、それらのサ ンプルを１ｍｌのＳ−ＭＥＭに再懸濁させ、５ｍｌのSarstadt管に移し、３７℃ の回転装置の上に置いた。１８時間後、２００μｌのアリコート（細胞数１×１ ０⁶）をポリプロピレンチューブに移し、３ｍｌのＰＢＳ−ＣＭＦ（０．２％Ｎ ａＮ₃＋０．２％ＢＳＡを含む）で洗浄した。次いで、上澄液をデカンテーショ ン除去し、ＨＩＶ１に血清反応陽性のヒト由来の血清（米国のthe New York Sta te Dept．of Healthから入手）を１００倍稀釈したもの、またはＥＬＤＫＷＡエ ピトープに特異的ヒトモノクローナル抗体ＩＡＭ４１−２Ｆ５（米国テキサス州 HoustonのViral Testing Systems社製）を１００倍稀釈したものの１００μｌに ペレットを再懸濁させた。それらのサンプルを４℃で６０分間定温保存し、ＰＢ Ｓ−ＣＭＦ（０．２％ＮａＮ₃＋０．２％ＢＳＡを含む）で２回洗浄し、１，０ ００ＲＰＭで５分間遠心した。上澄液をデカンテーション除去し、ヤギ抗ヒトＦ ＩＴＣ（Boehringer Mannheimから入手）の１００倍稀釈液に再懸濁させた。そ れらのサンプルを４℃で３０分間低温保存した後、ＰＢＳ−ＣＭＦ（０．２％Ｎ ａＮ₃＋０．２％ＢＳＡを含む）で２回洗浄し、Facscan flow 流通式細胞計測計 （サイトメーター）で分析した。ｖＰ１３１３感染細胞の表面にはＥＬＤＫＷＡ エピトープを含む遺伝子産物が発現されていたが、ＮＹＶＡＣ感染細胞またはｖ Ｐ１２８６感染細胞の表面には発現が認められなかった（図２９の下欄参照）。 また、ｖＰ１２８６感染細胞およびｖＰ１３１３感染細胞の表面には、ＨＩＶ１ 血清反応陽性の血清に反応性の遺伝子産物が発現されたが、ＮＹＶＡＣ感染細胞 の表面には発現されなかった（図２９の上欄参照）。このように、ｖＰ１３１３ 感染細胞の表面には、ＨＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭ（ＥＬＤＫＷＡエピトープを 含む）遺伝子によるＥＬＤＫＷＡエピトープが発現されており、この遺伝子産物 のＶ３ループがＥＬＤＫＷＡエピトープによって置き換えられたという事実を裏 付けている。 ｖＰ１３１３が、免疫原性のあるＥＬＤＫＷＡエピトープを含有するｇｐ１２ ０＋ＴＭの一形態を発現するか否かを確認するため、免疫沈降分析を行った。Ｈ ｅＬａ細胞の単層に１０ｐｆｕ／細胞のm.o.i.で、ＮＹＶＡＣ（親ウイルス）、 ｖＰ１２８６（ＨＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭを発現するＷＲ組換体）またはｖＰ １３１３を感染させた。１時間の吸着期間の後、接種物を取り出し、細胞の上に 、２％の透析したウシ胎児血清および［³⁵Ｓ］−ＴＲＡＮＳラベル（３０μＣｉ ／ｍｌ）を含有する改変Ｅａｇｌｅ液（システインおよびメチオニンが欠除）の ２ｍｌをまいた。感染から１８時間後、３ＸバッファーＡ（４５０ｍＭのＮａＣ ｌ、３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ＝７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ 、０．０３％のアジ化ナトリウムおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）を添加す ることにより溶解物（リゼイト）を回収し、次のものの発現を分析した：１）Ｅ ＬＤＫＷＡエピトープ［ＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的なヒトモノクローナル 抗体ＩＡＭ４１−２Ｆ５（米国テキサス州HoustonのViral Testing Systems社よ り入手の１００倍稀釈液を使用］、および２）ＨＩＶ１の遺伝子産物［ＨＩＶ１ に血清 反応陽性ヒト由来の血清（米国のthe New York State Dept．of Healthから入手 ）の１００倍稀釈液を使用。正常なヒト血清およびプロテインＡ−セファロース 複合体で予め清浄化した溶菌物を、ＩＡＭ４１−２Ｆ５／プロテインＡ−セファ ロース複合体またはＨＩＶ１血清反応陽性血液／プロテインＡ−セファロース複 合体とともに、４℃で一晩定温保存した。それらのサンプルを、バッファーＡで ４回、ＬｉＣｌ2／尿素バッファーで２回洗浄した。２ＸのLaemmliバッファー（ １２５ｍＭのトリス（ｐＨ＝６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、 １０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間沸騰させることにより、 免疫複合体から沈降タンパク質を解離させた。ポリアクリルアミドゲル上でタン パク質を分画し、固定化し、且つ１Ｍのサリチル酸ナトリウムで処理し間接撮影 （フルオログラフィー）に供した。ＥＬＤＫＷＡエピトープに対するモノクロー ナル抗体を使用すると、ｖＰ１３１３感染細胞から適当な大きさのタンパク質が 沈降したが、ＮＹＶＡＣ感染細胞またはｖＰ１２８６感染細胞からは沈降しなか った。さらに、ＨＩＶ１に血清反応陽性のヒト血清を使用すると、ｖＰ１２８６ 感染細胞およびｖＰ１３１３感染細胞からは適当な大きさのタンパク質が沈降し たが、ＮＹＶＡＣ感染細胞からは沈降しなかった。これらの結果が示すように、 ｖＰ１３１３は、免疫原性のあるＥＬＤＫＷＡエピトープを含有するｇｐ１２０ ＋ＴＭの一形態を発現するものである。実施例２１ −ｖＰ１３１９（ｇｐ１２０ Ｖ３ループに挿入され２つのＥＬＤ ＫＷＡエピトープを含むＨＩＶ１ ｇｐ１２０＋ＴＭを発現す るＣＯＰＡＫ組換体）の構築 ｇｐ１２０ Ｖ３ループに挿入されたＨＩＶ１のｇＰ４１由来の２つのＥＬＤ ＫＷＡを含むＨＩＶ１ ｇｐ１２０＋ＴＭを発現するＣＯＰＡＫ組換体であるｖ Ｐ１３１９を次のように作成した。ＥＬＤＫＷＡエピトープとＶ３ループの一部 をコードする配列をｐＢＳＫ＋にクローニングした。これは、ＥｃｏＲＩ−Ｓａ ｃＩ酵素分解した２２５ｂｐのＰＣＲ断片（ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列の一 部を含有する）を、ｐＢＳＫ＋の２，９００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片に クローニングすることにより行った。（なお、該ＰＣＲ断片は、プラスミドｐＢ ＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔから、プライマーＨＩＶＰ７２（配列番号１１０： およびＨＩＶＰ７４（配列番号１１１： を用いて調製した。）このような操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶ５５ と呼ぶ。 ［Ｈ６をプロモーターとするＨＩＶ１ ｇｐ１２０＋ＴＭ遺伝子を含有するプ ラスミドであるｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔは以下のように調製した。ＨＩＶ１［ ＭＮ］ｅｎｖ遺伝子のｃＤＮＡコピーを含有するプラスミドであるｐＭＮ１．８ −９をMarvin Reitz氏（米国ＮＣＩ、ＮＩＨ）から入手した。該ｅｎｖ遺伝子の 初期転写終結シグナル配列Ｔ5 ＮＴを改変した。これを行うために、ＫｐｎＩ− ＥｃｏＲＩで酵素分解した１，１００ｂＰのＰＣＲ断片（ｅｎｖ遺伝子のＴ5 Ｎ Ｔ改変５′末端を含有する）を、ｐＢＳＫ+の２，９００ｂｐのＫｐｎＩ−Ｅｃ ｏＲＩ断片にクローニングした。（なお、該ＰＣＲ断片は、プラスミドｐＭＮ１ ．８−９から、オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ６（配列番号１１２： およびＨＩＶ３Ｂ２（配列番号１１３： を用いて調製した。）この操作により得られたプラスミドをｐＢＳＭＩＤＭＮと 呼ぶ。 次に、このｅｎｖ遺伝子のＴ５ＮＴ改変５′末端を、ｅｎｖ遺伝子の残りの上 流にクローニングした。これを行うために、ｐＢＳＭＩＤＭＮの１，０２５ｂｐ のＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片（ｅｎｖ遺伝子のＴ5 ＮＴ改変５′末端を含有する ）を、ｐＢＳ３ＭＮの４，３００ｂｐのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片にクローニン グした。（ｐＢＳ３ＭＮの調製は、ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ酵素分解した４３０ｂ ｐ のＰＣＲ断片（ｅｎｖ遺伝子の中央部分を含有する）およびＳａｃＩ−ＸｂａＩ 酵素分解した１，０５０ｂｐのＰＣＲ断片（ｅｎｖ遺伝子の３′末端を含有する ）を、ｐＢＳＫ＋の２，９００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片にクローニング することにより行った。（ここで、４３０ｂｐのＰＣＲ断片は、プラスミドｐＭ Ｎ１．８−９から、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１１４： およびＨＩＶＭＮ４（配列番号１１５： を用いて調製した。また、１，０５０ｂｐのＰＣＲ断片は、プラスミドｐＭＮ１ ．８−９から、オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ５（配列番号１１６： およびＨＩＶＭＮ３Ｐ（配列番号１１７： を用いて調製した。）このような操作により得られたプラスミドをｐＢＳＭＩＤ ３ＭＮと呼ぶ。 次に、ｅｎｖ遺伝子の上流にＨ６プロモーターをクローニングした。これを行 うため、ｐＨ６ＩＩＩＢＥの３２０ｂｐのＫｐｎＩ断片（ＨＩＶ１（ＩＩＩＢ） ｅｎｖ遺伝子の５′末端に結合されたＨ６プロモーターを含有する）およびｐＢ ＳＭＩＤ３ＭＮの２，４５０ｂｐのＸｐｎＩ−ＸｂａＩ断片（ＨＩＶ１（ＭＮ） ｅｎｖ遺伝子の本体を含有する）を、ｐＢＳＫ＋の２，９００ｂｐのＫｐｎＩ− ＸｂａＩ断片にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをｐＨ６ ＨＭＮＥと呼ぶ。 次いで、ｇｐ４１をコードする配列を、ＨＩＶ１のｅｎｖトランスメンブレン （ＴＭ）領域をコードする配列と置き換えた。これを行うために、ＥｃｏＲＩ− ＸｂａＩ酵素分解した４８０ｂｐのＰＣＲ断片（ｇｐ１２０遺伝子の３′末端お よびＨＩＶ１のｅｎｖトランスメンブレン領域を含有する）を、ｐＨ６ＨＭＮＥ の４，２００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片にクローニングした。（該ＰＣＲ 断片は、ＰＣＲ断片であるＰＣＲ−ＭＮ１１並びにオリゴヌクレオチドＨＩＶＴ Ｍ１（配列番号１１８： およびＨＩＶＴＭ２（配列番号１１９： から、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１１４）およびＨＩＶＴＭ３ （配列番号１２０： を用いて調製した。また、ＰＣＲＭＮ１１は、プラスミドｐＨ６ＨＭＮＥから、 オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１１４）およびＨＩＶＭＮ１８（配 列番号１２１： を用いて調製した。）このような操作によって得られるプラスミドをｐＢＳＨＩ ＶＭＮ１２０Ｔと呼ぶ。］ 次にＥＬＤＫＷＡおよびＶ３ループをコードする他方の部分をｐＢＳＫ+にク ローニングした。これを行うために、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ酵素分解した３ ００ｂｐのＰＣＲ断片（ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列の一部を含有する）を、 ｐＢＳＫ+の２，９００ｂｐのＨｉｎｄＩＩ−ＳａｃＩ断片にクローニングした 。（なお、該ＰＣＲ断片は、プラスミドｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔからプライマ ーＨＩＶＰ６９（配列番号１２２： およびＨＩＶＰ７５（配列番号１２３： を用いて調製した。）この操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶ５６と呼ぶ 。 次に、ｐＨＩＶ５５およびｐＨＩＶ５６由来のＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列 を、Ｈ６プロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭ遺伝子内にクローニングした。こ れは、ｐＨＩＶ５５の２２５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩおよびｐＨＩＶ５６の ３００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片（ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列を 含有）を、ｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔの４，３００ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片にクローニングにすることにより行った。この操作により得られたプ ラスミドをｐＨＩＶ５７と呼ぶ。 次いで、ＥＬＤＫＷＡエピトープを含有し、Ｈ６をプロモーターとするｇｐ１ ２０＋ＴＭ構築物を、Ｃ５隣接アーム間にクローニングした。これを行うために 、ｐＨＩＶ５７の１，７００ｂｐのＮｒｕＩ−ＸｂａＩ断片（Ｈ６をプロモータ ーとするｇｐ１２０＋ＴＭ（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含む）遺伝子を含有する ）を、ｐＳＩＶＧＣ１５の４，７００ｂｐのＮｒｕＩ−ＸｂａＩ断片にクローニ ングした。（ｐＳＩＶＧＣ１５は、Ｃ５隣接アーム間にクローニングされたＨ６ をプロモーターとするＳＩＶのｅｎｖ遺伝子を含有する。）この操作により得ら れたプラスミドをｐＨＩＶ５９と呼ぶ。 次に、Ｈ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭ（ＥＬＤＫＷＡエピトープ を含む）を、ＣＯＰＡＫ隣接アーム間にクローニングした。これを行うため、ｐ ＨＩＶ５９の１，８５０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片（Ｈ６をプロモーター とするｇｐ１２０＋（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含む）遺伝子を含有する）を、 ｐＳＤ５５３ＶＣの４，６００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片にクローニング した。この操作によって得られたプラスミドをｐＨＩＶ６１と呼ぶ。このｐＨＩ Ｖ６１における（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含む）ｇｐ１２０＋ＴＭ遺伝子のＤ ＮＡ配列は図３０に示されている。 ｐＨＩＶ６１を用いＣＯＰＡＫをレスキューウイルスとするインビドロ組換え を行いｖＰ１３１９を得た。 ｖＰ１３１９が感染された細胞の表面でＨＩＶ１ｇｐ１２０＋ＴＭ（ＥＬＤＫ ＷＡエピトープを含む）が発現されたか否かを確認するためＦＡＣＳ分析を行っ た。Ｓ−ＭＥＭ（Sigma製Ｍ−８０２８Joklik 懸濁媒体）に懸濁させた５×１０⁶ 個のＨｅＬａ−Ｓ３細胞に、５ｐｆｕ／細胞のm.o.i.でＷＲ、ｖＰ１２８６（ Ｈ ＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭを発現するＷＲ組換体）またはｖＰ１３１９を感 染させた。３７℃において６０分間の吸着期間の後、１０ｍｌのＳ−ＭＥＭで細 胞を洗浄し、１，０００ＲＰＭで５分間遠心した。次いで、サンプルを１ｍｌの Ｓ−ＭＥＭに再懸濁させ、５ｍｌのSarstadt管に移し、３７℃の温度下に回転装 置上に配置した。１８時間後、２００μｌのアリコート（細胞数１×１０⁶）を ポリプロピレンチューブにいれ、３ｍｌのＰＢＳ−ＣＭＦ（０．２％ＮａＮ₃＋ ０．２％ＢＳＡを含む）で洗浄した。次いで、上澄液をデカンテーションで除去 し、ＨＩＶ１に血清反応陽性のヒト由来の血清（米国the New York State Dept. of Healthから入手）を１００倍稀釈したもの、ＨＩＶ１（ＭＮ）Ｖ３ループに 特異的なマウスモノクローナル抗体５０．１（米国ＮＣＩ、ＮＩＨのM．Robert Guroff氏から入手）を５００倍稀釈したもの、または、ＥＬＤＫＷＡエピトープ に特異的なヒトモノクローナル抗体ＩＡＭ４１−２Ｆ５（米国テキサスHouston のViral Testing Systems 社製）を１００倍稀釈したもの１００μｌにペレット を再懸濁させた。それらのサンプルを６０分間４℃で定温保存し、ＰＢＳ−ＣＭ Ｆ（０．２％ＮａＮ₃＋０．２％ＢＳＡを含む）で２回洗浄し、１，０００ＲＰ Ｍで５分間遠心した。上澄液をデカンテーション除去し、ヤギの抗ヒトＦＩＴＣ またはヤギの抗マウスＦＩＴＣ（Boehringer Mannheim から入手）の１００倍稀 釈ペレットを再懸濁させた。サンプルを３０分間、４℃で定温保存し、ＰＢＳ− ＣＭＦ（０．２％ＮａＮ₃＋０．２％ＢＳＡを含む）で２回洗浄し、Fascanflow 細胞計測計（サイトメーター）で分析した。ｖＰ１３１９感染細胞の表面にはＥ ＬＤＫＷＡを含有する遺伝子産物が発現されていたが、ＷＲ感染細胞またはｖＰ １２８６感染細胞の表面には発現されていなかった（図３１の中欄参照）。ｖＰ １２８６感染細胞の表面にはＶ３ループを含有する遺伝子産物が発現されていた が、ＷＲ感染細胞またはｖＰ１３１９感染細胞の表面には発現されなかった（図 ３１の下欄参照）。ｖＰ１２８６感染細胞およびｖＰ１３１９感染細胞の表面に は、ＨＩＶ１に血清反応陽性の血清に反応性の遺伝子産物が発現されていたが、 ＷＲ感染細胞の表面には発現されていなかった（図３１の上欄参照）。この分析 が示すように、１）ｖＰ１３１９感染細胞の表面にはＨＩＶ１のｇｐ１２０＋Ｔ Ｍ（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含む）遺伝子産物であるＥＬＤＫＷＡエピトープ が発現され、且つ、２）ｖＰ１３１９感染細胞の表面に発現された遺伝子産物は 野生型のＶ３ループを含有せず、該遺伝子産物のＶ３ループがＥＬＤＫＷＡエピ トープで置換された事実を裏付けている。 ｖＰ１３１９が、免疫原性のあるＥＬＤＫＷＡエピトープを含むｇｐ１２０＋ ＴＭの一形態を発現するか否かを確認するため、免疫沈降分析を行った。ＨｅＬ ａ細胞の単層に、１０ｐｆｕ／細胞のm.o.i.で、ＮＹＶＡＣ（親ウイルス）、ｖ Ｐ１２８６（ＨＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭを発現するＷＲ組換体）、またはｖＰ １３１９を感染させた。１時間の吸着期間の後、接種物を除去し、２％の透析ウ シ胎児血清および［³⁵Ｓ］−ＴＲＡＮＳラベル（３０μＣｉ／ｍｌ）を含有する 改変Ｅａｇｌｅ液（システインおよびメチオニン欠除）で細胞を覆った。感染か ら１８時間後、１ｍｌの３×バッファーＡ（４５０ｍＭのＮａＣｌ、３％のＮＰ −４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のア ジ化ナトリウムおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）を添加することにより溶解 物を回収し、次のものの発現を分析した。１）ＥＬＤＫＷＡエピトープ：ＥＬＤ ＫＷＡエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体ＩＡＭ４１−２Ｆ５（米国 テキサスHouston のViral Testing Systems 社製）を１００倍稀釈したものを用 いた。２）ＨＩＶ１の遺伝子産物：ＨＩＶ１に血清反応陽性のヒト由来の血清（ 米国the New York State Dept．of Healthから入手）を１００倍稀釈したものを 用いた。 平常なヒト血清およびプロテインＡ−セファロースＡで予め清浄化した溶解物 をＩＡＭ４１−２Ｆ５／プロテインＡ−セファロース複合体またはＨＩＶ１血清 反応陽性血清／プロテインＡ−セファロース複合体とともに、４℃で一晩定温保 存した。それらのサンプルをバッファーＡで４回、ＬｉＣｌ２／尿素バッファー で２回洗浄した。２ＸのLaenmli バッファー（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ＝６． ８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール） を添加し、５分間沸騰させることにより沈降したタンパク質を免疫複合体から解 離させた。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分画化し、固定化 し、次に１Ｍのサリチル酸ナトリウムで処理し、間接撮影（フルオログラフィー ）に供した。ＥＬＤＫＷＡに対するモノクローナル抗体を用いると、ｖＰ１３１ ９感染細胞からは適当な大きさのタンパク質が沈降したが、ＮＹＶＡＣ感染細胞 またはｖＰ１２８６感染細胞からは沈降しなかった。さらに、ＨＩＶ１血清反応 陽性のヒト血清を用いると、ｖＰ１２８６感染細胞およびｖＰ１３１９感染細胞 からは適当な大きさのタンパク質が沈殿したが、ＮＹＶＡＣ感染細胞からは沈殿 しなかった。これらの結果が示すように、ｖＰ１３１９は、抗原性のあるＥＬＤ ＫＷＡエピトープを含有するｇｐ１２０＋ＴＭの一形態を発現させる。 ｖＣＰ１３０７、ｖＰ１３１３およびｖＰ１３１９は、それぞれ、免疫原性の ある形態でＥＬＤＫＷＡエピトープを発現させるので、前述したように、これら の組換体は、それらの発現産物、それから誘起される抗体、さらには、それらの 組換体由来のＤＮＡなどと同様に広範な利用性を有する。実施例２２ −ｖＣＰ２０５をマカクに筋肉内投与した場合の接種効果と免疫 原性 実験動物：Macaca fascicularis（カニクイザル）（成体、野生捕獲） 数：８匹 性別：オス 捕獲源：モーリシャス島。Ｂ型肝炎、フィロウイルスおよび結核症が存在しない と考えられる。 前歴：ポリオの実験に供された。 食事および飲料水：市販のエサと果物；随意に水道水 ４匹のオスのカニクイザル（Cynomolgus macaque）に、１ケ月間隔で５回、Ａ ＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ２０５）（１回投与当たり１０^5.6ＴＣＩＤ₅₀を含有 ）を筋肉内投与した。この注入（注射）によって、何らの症状も外傷も引き起こ されなかった。注入によるサルの体重変化はなかった。４匹のコントロール（対 照） 用サルには、プラセボ（placebo）（ＤＭＥＭ−Ｆ１２（２５％）、ラクトグル タメート（２５％）および凍結乾燥用基質（５０％））を注入した。一般的な状 態を毎日監視し、各接種後、１、２、３、４および７日目に注射部位の観察を行 った。体重を週に１回測定した。 血液サンプルを採取して、血液学的分析用にＥＤＴＡ血液採取用Vacutainer^R チューブ（フランスMeyland のBecton-Dickinson製）、生化学的分析用にリチウ ム−ヘパリン マイクロベット ＣＢ１００ チューブ（ドイツNumbrecht のSa rstedt）、および血清学的分析用に血清分離器SST Vacutainer^Rチューブ付きの 管に入れた。サンプリングは、０、３、７、１４、２８、３１、３５、４２、５ ６、５９、６３、７０、８４、８７、９１、９８、１１２、１１５、１１９、１ ２６および１４０日目に行った。臨床検査および血液採取に際しては麻酔（ケタ ミン２０ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与）を行った。 血液学的および生化学的分析は、ＶＥＴ ＴＥＳＴ ８００８装置を用いて実 施した。抗ＨＩＶ ｇｐ１６０、ｐ２４タンパク質およびＶ３ペプチド抗体の力 価をＥＬＩＳＡ法によって測定した。このため、Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６ Ｎ ＵＮＣプレートを、０．１Ｍの炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）に稀釈した次の いずれかの抗原で３７℃において１時間被覆した。 ・１ウエル当たり１３０ｎｇの精製ｇｐ１６０ ＭＮ／ＢＲＵ（組換えワクシ ニア由来であり、３０％の切断ｇｐ１６０を含有するがα2 マクログロブリンは 含有しない）、 ・２００ｎｇのＶ３ＭＮペプチド ・１３０ｎｇの精製「ｐ２４」ＨＩＶ（大腸菌Ｐ２５ ＬＡＩから単離、バッ チ６７２Ｃ１、Transgene） インキュベートは、全て、最終体積が１００μｌになるように行い、その後、 リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．１）／０．１％Tween ２０を用いて３回洗浄し た。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．１）／０．０５％Tween ２０／５％(ｗ／ ｖ)粉状スキムミルク（Gloria）の１５０μｌを用いて３７℃で１時間、プレー トのブロッキングを行った。 血清をリン酸緩衝生理食塩水０．０５％Tween ２０／５％（ｗ／ｖ）粉状スキ ムミルクに溶かし、逐次的に３倍ずつ稀釈（１／５０から１／１２１５０の範囲 ）してウエルに添加し、３７℃で９０分間保温した。 洗浄後、抗サルＩｇＧ／ペルオキシダーゼ複合体（Cappel、ヤギのＩｇＧ画分 ）をリン酸緩衝生理食塩水／０．５％Tween ２０／５％（ｗ／ｖ）粉状スキムミ ルク中に１／３０００稀釈したものを添加して、該プレートを３７℃において更 に９０分間保温した。プレートを４回洗浄し、基質であるＯ−フェニレンジアミ ン ジハイドロクロリド（Sigma タブレット）とともに暗中で室温下に３０分間 保温した。基質は、０．０３％の過ホウ酸ナトリウム（Sigma カプセル）を含有 する０．０５Ｍのリン酸塩・クエン酸塩系緩衝液（ｐＨ５．０）に溶かし１．５ ｍｇ／ｍｌの濃度で用いた。４ＮのＨ2 ＳＯ4 の５０μｌを用いて反応を停止さ せた。自動プレートリーダー(Vmax，Molecular Devices)を用い４９０−６５０ ｎｍにおける光学密度を測定した。抗体力価は次の式に従って計算した。 力価＝ｌｏｇ（ＯＤ_490-650×１０）／（１／稀釈倍数） ＯＤ値の範囲は０．２から１である。 中性化抗体の分析により、１０ ＴＣＩＤ₅₀のＨＩＶ ＭＮで感染された血清 のマイクロウエルにおけるシンシチウムの発生を防止する稀釈倍数が決定される 。ＭＮ株は、F．Barre-Sinoussi から入手し、ＣＥＭクローン１６６細胞中で増 殖させた。 血清は補体除去され、ＲＰＭＩ中で血清の逐次的な２倍稀釈液（最初は１／１ ０）を調製した。等体積の血清稀釈液とＨＩＶ懸濁液（各５００μｌ）を混合し 、３７℃において２時間保温した。ＨＩＶ懸濁液は、１ｍｌ当たり１０²〜１０^{2 .5} のＴＣＩＤ⁵⁰を含有するように調製しておいたものである。 使用の前に、ポリ−Ｌ−リジンがコーティングされたマイクロウエルに指示剤 となるＣＥＭｓｓ細胞をまき、３７℃で１時間保温した。培地を取り除き、ウイ ルス／血清混合物（１００μｌ／ウエル、各稀釈当たり６ウエル）と置き換えた 。３７℃で１時間の保温の後、各ウエルに培地を添加し、３７℃でプレートを保 温した。保温は全て、ＣＯ₂５％のインキュベーター内で行った。 ７日後および１４日後に、培養物を顕微鏡で調べ、シンシチウムを示すウエル を記録した。中性化５０％力価をＳＰＥＡＲＭＡＮおよびＫÅＲＢＥＲに従って 計算し、終点のｌｏｇ₁₀として表した。確認のために、７日目に培養物を上澄液 を採取し、各稀釈液毎にまとめて、ＲＴ活性を分析した。各分析は、ウイルス懸 濁液の伝染性滴定、参照用血清および陰性コントロールとしての１組の非感染マ イクロウエルの抗体滴定を含む。 結果 血液学的および生化学的状態を監視するためのパラメーター（赤血球数、平均 血球体積、ヘマトクリット、クレアチニンおよびアラニンアミノトランスフェラ ーゼなど）の大部分は平常な範囲内で変化した。 ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ２０５）による繰り返し免疫に帰することができ ない幾つかの変化が認められた：ｉ）試験グループおよびコントルールグループ の両方における８週および９週目の説明できないリンパ球増加、ii）両グループ における１７および２０週目、並びにコントロールグループにおける９週目のヘ モグロビンレベルの減少、iii)２匹のコントロール用サルにおけるアスパルテー トアミノトランスフェラーゼの異常な高い値、最後に、iv）何匹かについてマイ クロ凝集によって引き起こされる異常な血小板値。 ｖＣＰ２０５によって誘起される抗ＨＩＶ免疫応答は、精製ｇｐ１６０ＭＮ／ ＢＲＵ（組換体ワクシニア由来）、Ｖ３ＭＮ合成ペプチドおよびｐ２４（大腸菌 由来、ＬＡＩ単離物）を用いるＥＬＩＳＡ試験により評価した。すべてのサルが ｇｐ１６０およびＶ３に対する抗体を、また、４匹のうち２匹がｐ２４に対する 抗体を産生した。明確な抗ＨＩＶ免疫応答は、通常、２回の注射後、あるいは最 大限、３回の注射後に現れた。後にｖＣＰ２０５を接種すると、主として抗体レ ベルが維持され（時には、僅かに増加）、マカク間の応答の均質性が向上した。 最大の抗体力価は、通常、各接種の２週間後に認められ、その後、次のブースタ ー（追加免疫）まで減少した。ＨＩＶ／ＭＮに対する中和抗体は、免疫された全 てのサルについて検出可能であった。 臨床観察：接種部位には紅斑も浮腫も認められなかった。コントロール用サル およびＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ２０５）感染サルとも体重は安定していた（ 図３２）。 血液学分析：白血球数は、８週および９週目にformula inversion とともにコ ントロール用サルおよび試験用サルのいずれにおいても大きく向上した（図３３ ａ）。この事実は、いずれのグループにおいて認められており、ウイルス注射と の相関関係はない。 赤血球数、血球平均体積およびヘマトクリットは平常な範囲内で変化したが、 ヘモグロビンは、コントロール用サルでは、９、１７および２０週目に、また、 ＡＬＶＡＣ−ＨＴＶ（ｖＣＰ２０５）が接種されたサルでは１７および２０週目 に不一致が認められた（図３３ｂおよび３３ｃ参照）。血小板値は、サンプリン グの質に応じて変化した（ミクロ凝固）（図３３ｃ参照）。 生化学的分析：クレアチニンおよびＡＬＡＴ（ＳＧＰＴトランスアミナーゼ） は、反復接種後も有意に変化しなかった（図３４および図３６参照）。ＡＳＴ（ ＳＧＯＴトランスアミナーゼ）は、コントロール用サルの＃３および２において 、それぞれ、５週目および８〜９週目に特に重要な変化を示した（図３５）。 血清学的分析：マカク血清の陰性コントロールグループのＥＬＩＳＡ力価を考 慮すると、血清学的応答の陰性検出限界は、ｇｐ１６０、Ｖ３およびｐ２４につ いて、ｌｏｇ₁₀で表して、それぞれ、１．５６±０．２４、１．９２±０．１２ および２．１８±０．３４と考えられた。ｇｐ１６０およびＶ３に特異的応答は 図３７ａ〜３７ｂ、図３８ａ〜３８ｂに示す。ｇｐ１６０に対する抗体の動力学 的挙動は、Ｖ３に対するそれと類似している。後者の方が僅かに弱い（２０週目 における平均力価は４．３７対８．８４である）。 検出可能な免疫応答を誘起するには２回の投与が必要であった。３匹のサルは ２回目の投与後に最大の応答を示した；４匹目のサルは、最大の応答を示すのに 、３回の投与（ｇｐ１６０について）または４回の投与（Ｖ３について）が必要 であった。各投与間の４週間の期間中、抗体力価は上昇した後低下し、次の接種 によって増強されることになる。当初の投与に対する応答には個体間に有意の相 違があるが、実験が進行するに従い応答は平均化した。 ｐ２４に特異的な応答（図３７ｃおよび３８ｃ）：４匹のうちの２匹のマカク （マカク５および７）については、それぞれ、ｖＣＰ２０５の２回目の投与後お よび３回目の投与後に、応答が認められた。これは、モルモットの場合には接種 されたどのグループにおいても抗ｐ２４抗体が検出されなかったことと対照的で ある。抗ｇｐ１６０抗体および抗Ｖ３抗体の場合と同様に、力価は各投与間に上 下動し、個体間の相違は、次第になくなった。ｇｐ１６０およびＶ３の場合とは 異なり、抗ｐ２４抗体のプロフィルは一定水準（プラトー）に達することはなか った。 中和抗体：図３９に示すように、ｖＣＰ２０５が投与された４匹のサルはいず れも、検出可能なレベルの抗ＨＩＶ（ＭＮ）中和抗体を産生した。そのうちの１ 匹は１回の投与後に陽性となり、２匹は第２回の投与後に、また最後の１匹は５ 回の投与を必要とした。注目すべきことは、最後の１匹がＥＬＩＳＡ抗体の動力 学挙動が最も遅かったということである。中和抗体のレベルは比較的穏当であり （算術表現で１／１０から１／３０）、ＥＬＩＳＡ測定値と同様に、各投与の間 では上下動した。 ｇｐ１６０およびｐ２４による追加免疫効果：４匹のサルに、ｖＣＰ２０５の 最後の投与から７週間後、２００μｇのｇｐ１６０および２００μｇのｐ２４タ ンパク質をフロインド（freund's）不完全アジュバント（Montanide ＩＳＡ５１ ）に溶かしたものをブースター投与して超免疫標準血清を産生させた。この結果 、抗体力価に著しい増加（少なくとも１０倍）が生じ、ＥＬＩＳＡ分析において 見られたプラトー値が応答限界ではなかったことを示唆していた。 この免疫試験により、ｇｐ１６０ ＭＮ／ＢＲＵおよびＶ３ ＭＮペプチドに 対する高レベルの結合抗体が誘起され、そして、低いが明確な中和抗体が誘起さ れた。血清学的結果ではＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ１２５）が接種されたマカ クにおいて観測されたものより高い抗体レベルが示され、また、１回のブースタ ー（２回ではない）が良好な既往的応答を得るのに充分であった。この実施例は 、ｖＣＰ２０５およびその発現産物、それから得られる抗体、ならびにｖＣＰ２ ０５由来のＤＮＡが前述のように有用であることを示すものである。実施例２３ −ｖＣＰ３００をマカクを投与した場合の接種効果と免疫原性 実験動物： 種：Macaca fascicularis（カニクイザル） 数：８匹 性別：オス 捕獲源：モーリシャス島。Ｂ型肝炎、フィロウイルスおよび結核症が存在しない と考えられる。 ４匹のカニクイザル（Cynomolgus macaque）に、１ケ月間隔で５回、ＡＬＶＡ Ｃ−ＨＩＶ（ｖＣＰ３００）（１回投与当たり１０6.16ＴＣＩＤ50を含有）を筋 肉内投与した。４匹のコントロール（対照）用サルにはプラセボを注射した。６ 回目の注射として、すべてのサルにＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ３００）を静脈 投与した。プログラムは以下のとおりである。 グループ＃１ 投与薬剤：プラセボ 投与方法：左または右の三角筋に交互に筋肉内投与。 量：１ｍｌ 注射回数：５回（０、４、８、１２および１６週） グループ＃２ 投与薬剤：ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ 投与方法：右または右の三角筋に交互に筋肉内投与。 量：１ｍｌ 投与量：１０^6.16ＴＣＩＤ₅₀ 注射回数：５回（０、４、８、１２および１６週） グループ＃１および＃２ ２０週目。 投与薬剤：ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ３００ 投与方法：静脈内投与 量：１ｍｌ 投与量：１０^6.16ＴＣＩＤ₅₀ 注射回数：１回 臨床観察：各接種の後、１、２、３、４および７日目に注射部位の観察を行っ た。１週間に１度、サルの体重測定を行った。 サンプリング：ケタミン麻酔して、大腿部静脈から血液サンプルを採取した。 血液は以下の順にVacutainerチューブ（フランスMeylanのBecton Dickinson）： １）０．１２９Ｍクエン酸ナトリウム緩衝チューブ内に１．８ｍｌ（プロトロン ビン分析用）。 ２）５ｍｇのフッ化ナトリウムとシュウ酸カリウムチューブに２ｍｌ（グルコー ス分析用） ３）０．１７ＭのＥＤＴＡ Ｋ3に２ｍｌ（血液学的分析用）。 ４）不活性保護剤とクロット活性剤を含む血清分離用チューブに２〜３ｍｌ（生 化学的および血清学的分析用）。 サンプリングは、０、３、７、１４、２８、３１、３５、４２、５６、５９、 ６３、７０、８４、８７、９１、９８、１１２、１１９、１２６、１４０および １４３日目に行った。 用量 血液学的分析として、血球数および変化白血球数（differential leucocyte c ounts）、ヘモグロビン、血小板、プロトロンビン、網状赤血球および沈降率等 を測定した。 生化学的分析として、ナトリウム、カリウム、グルコース、アルカリホスファ ターゼ、コレステロール、全タンパク質および電気泳動、トランスアミナーゼＳ ＧＯＴおよびＳＧＰＴ等を測定した。 血清学的分析として、抗ＨＩＶ ｇｐ１６０糖タンパク質、ｐ２４タンパク質 、Ｖ３ペプチドおよびｎｅｆタンパク質各抗体を、次のように、ＥＬＩＳＡ法を 改良して滴下した： Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６ ＮＵＮＣプレートに、０．１Ｍの炭酸塩緩衝液（ ｐＨ９．６）で稀釈した以下の抗原の１つを３７℃で１時間、次いで４℃で一晩 被覆した。 ・１ウエル当たり１３０ｎｇの精製ｇｐ１６０ ＭＮ／ＢＲＵ（組換えワクシニ アＶＶＴＧ５１５６由来）、 ・２００ｎｇのＶ３ＭＮペプチド、 ・１３０ｎｇの精製ｐ２４ ＨＩＶ（大腸菌ｐ２５ ＬＡＩ単離物、バッチ６７ ２Ｃ１、Transgene製）。 保温は全て、最終体積を１００μｌとして行い、その後、リン酸緩衝生理食塩 水（ｐＨ７．１）／０．１％のTween ２０で３回洗浄した。リン酸緩衝生理食塩 水（ｐＨ７．１）／０．１％のTween ２０／５％（ｗ／ｖ）の粉状スキムミルク （Gloria）の１５０μｌを用いて３７℃で１時間、プレートのブロッキングを行 った。リン酸緩衝生理食塩水／０．０５％Tween ２０／５％（ｗ／ｖ）の粉状ス キムミルクに溶かした血清を逐次的に３倍ずつ稀釈した溶液（範囲は１／５０か ら１／１２１５０または１／５００から１／１２１５００）をウエルに添加し、 ３７℃で９０分間保温した。 洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水／０．０５％Tween ２０／５％（ｗ／ｖ）の粉 状スキムミルク中で３０００倍に稀釈した抗サルＩｇＧ／ペルオキシダーゼ複合 体（Cappel、ヤギのＩｇＧ画分）を添加し、３７℃においてさらに９０分間プレ ートを保温した。プレートを４回洗浄した後、基質としてＯ−フェニレンジアミ ンジハイドロクロリド（Sigma タブレット）を用いて暗中で３０分間、室温下で 保温した。基質は、０．０３％の過ホウ酸ナトリウム(Sigmaカプセル)を含有す る０．０５％Ｍのリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶かした１．５ｍｇ／ ｍｌの濃度で使用した。５０μｌの４Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄を用いて反応を停止させた。 自動式プレードリーダー（Vmax，Molecular Devies製）を用いて４９０−６５ ０ｎｍにおける光学密度を測定した。ブランクの値を差し引き、２回の値を平均 した。ＥＬＩＳＡプレート上に存在させたモルモットの抗ｇｐ１６０および抗ｐ ２４超免疫標準血清の回帰曲線から、０．２〜１．２の範囲のＯＤ値について抗 体力価を計算した。該標準血清の力価は、次式によって予め定められたものであ る： 力価＝ｌｏｇ（ＯＤ_490-650×１０）／（１／稀釈倍数） ＯＤ値の範囲は０．２〜１．２である。 サルの抗ｎｅｆ標準血清が入手できなかったので、抗ｎｅｆ抗体の測定は、内 部的な陽性コントロールとして、マウスのモノクローナル参照用抗体（抗ｎｅｆ ＨＩＶ１ ＡＬ１、ＭＡＴＧ００２０、Transgene 製）を試験に利用すること によって行った。次に、５０００倍稀釈した抗マウスＩｇＧ／ペルオキシダーゼ 複合体（Amersham製）を用い、上述の式に従って血清の力価を計算した。 結果 注入によって何等の症状も外傷も引き起こさなかった。注入によりサルの体重 変化はなかった。血液学的パラメーターは有意に変化しておらず、また、生化学 的分析によれば、腎臓機能や肝臓機能に変化は認められなかった。 血液学的結果：変化が認められた場合でも、プラセボグループとワクチン化グ ループにおいてそのパターンや範囲は類似していた。 個々のＷＢＣ数は、平常範囲内で変化していた。ＷＢＣ数較差は、血液サンプ リングの３日後にしばしばリンパ球の減少を示した（図４０参照）。赤血球数、 ヘマトクリットおよびヘモグロビンは、各サンプリング後に一時的に減少したが 、これとは対照的に、網状赤血球数は穿刺後、常に増加していた（図４１ａ、４ １ｂ、４１ｃ参照）。平均血球体積は、１４０日目における増加を除いては、全 てのサルにおいて安定していた。血小板数は、幾分変化したが（図４１）、プロ トロンビンレベルは安定していた（図４２）。いずれのグループにも貧血症の徴 候は認められなかった。枕降速度は、すべてのサンプルにおいて１時間後１ｍｍ であった。 生化学的結果：観測された変化を解釈しやすくするために、標準血清（１８の マカク血清をプールしたもの）を用い、一連のサンプル測定の開始時（Std ａ） および終了時（std ｐ）に分析した。 コレステロール値は、コントロールグループおよび試験グループとも同じよう に変化した（図４３ａおよび４３ｂ）。 ナトリウムおよびカリウムは全ての注射後で安定していたが、全タンパク質と グルコースに関しては、１４０日目に大きな上昇が認められた。その日には、静 脈内注射に先立ち血液サンプルを麻酔をかけずに抜き出した（その結果、干渉を 起こさずに臨床反応を監視することができた）；幾つかの生物学的パラメーター に認められた変化は、無麻酔の処置とサンプリングに関連するストレスに因った ものであろう（図４３ａおよび４３ｂ）。電気泳動プロフィール（データを示し ていない）はすべてのサンプルにおいて酷似していた。クレアチニン、ビリルビ ン、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸ピルビン酸ト ランスアミナーゼおよびアルカリホスファターゼは平常な範囲内で変化し、常に 、 コントロールグループおよび試験グループの両方において同じ傾向を示した（図 ４３ｃおよび４３ｄ）。したがって、ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ３００）の接 種により腎臓機能および肝臓機能が影響されることはなかった。 血清学的結果：検出可能な抗ｇｐ１６０および抗Ｖ３応答を誘起するには、２ 回の注射（マカク＃６、７、８）または３回の注射（マカク＃５）が必要であっ た（図４４ａ、４４ｂ、４５ａ、４５ｂ）。２回目の注射の２週間後に、これら の応答はサル間で変化していた（抗ｇｐ１６０力価はｌｏｇで２から４．６の間 で変動した）。このような応答の不一致は３回目の注射で平滑化された。後続し て筋肉内投与を行うと、力価は主として維持されるか増加され、４回から５回目 の注射後には、抗ｇｐ１６０抗体および抗Ｖ３抗体に関して、それぞれ、約４． ３および３．６に達した。ｖＣＰ３００の筋肉内注射を３回（マカク＃６、８） から４回（マカク＃６）、または５回（マカク＃７）を行った後に、検出可能な 抗体が認められた。最も高い抗ｇｐ１６０／Ｖ３力価を示したサルが、最も高い 抗ｐ２４値（１次免疫から１８週目において約４．３）を示した。抗ｎｅｆ抗体 を産生したサルはなかった（図４７ａ、４７ｂ）。 ＥＬＩＳＡで抗ＨＩＶー１ ｇｐ１６０、Ｖ３、ｐ２４、ｎｅｆ血清抗体を分 析することにより、ｖＣＰ３００により誘起された免疫応答の検討を行った。 全てのサルがｇｐ１６０、Ｖ３およびｐ２４に対する抗体を産生した。２回ま たは多くても３回の筋肉内投与により有意の抗ｇｐ１６０または抗Ｖ３応答が得 られた。後続の接種はその抗体レベルを維持または増加させた。抗ｐ２４応答は ３〜５回の投与後に検出され、ｖＣＰ３００の各接種はそのレベルを上昇させた 。いずれのサルにおいても抗ｎｅｆ抗体は検出することができなかった。 抗体力価は、一般に、それそれの筋肉内注射の２週後に最大となり、次にブー スター投与が行われるまで減少した。 これらの血清学的結果は、同じタンパク質類を発現させるがＣＴＬエピトープ を発現させないＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ２０５）を用いて得られた結果と非 常に似ている。ｖＣＰ３００を用いた本実施例において２つの僅かな違いを指摘 することができる。すなわち、抗ｇｐ１６０／Ｖ３抗体力価が少し低く（約０． ２〜０．５ｌｏｇ）、且つ、抗ｐ２４応答が高い（すべてのマカクにおいて陽性 であり、血清力価が高い）ことである。サル間に個体差があるので、これらの相 違は有意なものとは考えられない。静脈内接種後に過敏症の徴候は認められなか った。副作用も記録されていない。本プログラムは、ｇｐ１６０、Ｖ３およびｐ ２４に対する高レベルの結合性抗体を産生させた（ｇｐ１６０についてはｖＣＰ ２０５を用いる場合よりも低いが）。本実施例が示すように、ｖＣＰ３００およ びその遺伝子産物、それから得られる抗体、ならびにｖＣＰ３００由来のＤＮＡ は、上述したような有用性を有するものである。 以上のように本発明の好ましい態様を詳述したが、添付の請求の範囲により定 義された本発明は上述の特定の態様に限定されるものではなく、その精神と意図 から逸脱しない多くの変形が可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 タータグリア，ジェイムズ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 12303 スケネクタディ クリスティーナ ドラ イヴ ７ (72)発明者 コックス，ウィリアム アイ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 12180 トロイ パインウッズ アヴェニュー 519

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．改変組換体ウイルスであって、ウイルスにコードされている遺伝子機能が不 活化されていることにより該ウイルスの毒性が弱毒化されているが効力は保持し ており；さらに、該ウイルスの可欠領域に外来ＤＮＡを含み、該外来ＤＮＡが少 なくとも１つの免疫不全症ウイルスエピトープをコードしていることを特徴とす る組換体ウイルス。 ２．前記ウイルスがポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項 記載のウイルス。 ３．前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求の 範囲第２項記載のウイルス。 ４．少なくとも１つのオープンリーディングフレームを欠失させることにより遺 伝子機能が不活化されていることを特徴とする請求の範囲第３項記載のウイルス 。 ５．欠失された遺伝子機能が、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌオープンリーディングフレーム、 または宿主範囲域領域を含むことを特徴とする請求の範囲第４項記載のウイルス 。 ６．少なくとも１つの追加のオープンリーディングフレームが欠失されており、 該追加のオープンリーディングフレームが、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２ ６Ｌ、Ａ５６Ｒ、およびＩ４Ｌから成る群より選ばれることを特徴とする請求の 範囲第５項記載のウイルス。 ７．少なくとも１つの追加のオープンリーディングフレームが欠失されており、 該追加のオープンリーディングフレームが、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領 域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、およびリボヌクレオチド還元酵素のラ ージサブユニットから成る群より選ばれることを特徴とする請求の範囲第５項記 載のウイルス。 ８．Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｒ、Ａ ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌおよ びＩ４Ｌがウイルスから欠失されていることを特徴とする請求の範囲第６項記載 のウイルス。 ９．チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子 、宿主領域およびリボヌクレオチド還元酵素のラージサブユニットがウイルスか ら欠失されていることを特徴とする請求の範囲第７項記載のウイルス。 10．ＮＹＶＡＣ組換体ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第８項記載の ウイルス。 11．ＮＹＶＡＣ組換体ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第９項記載の ウイルス。 12．前記外来ＤＮＡが、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ ）ＣＴＬエピトープ、およびＥＬＤＫＷＡエピトープまたはＬＤＫＷエピトープ のうちの少なくとも１つをコードすることを特徴とする請求の範囲第１１項記載 のウイルス。 13．前記外来ＤＮＡが、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、２つのｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬエピトープと ３つのｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬエピトープ、または２つのＥＬＤＫＷＡエピト ープをコードすることを特徴とする請求の範囲第１２項記載のウイルス。 14．前記２つのｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬエピトープと前記３つのｐｏｌ（ＩＩＩ Ｂ）ＣＴＬエピトープが、ＣＴＬ１、ＣＴＬ２、ｐｏｌ１、ｐｏｌ２およびｐｏ ｌ３であることを特徴とする請求の範囲第１３項記載のウイルス。 15．前記ＥＬＤＫＷＡエピトープまたは前記ＬＤＫＷＡエピトープがｇｐ１２０ の１領域またはｇｐ１６０の１領域の一部として発現されることを特徴とする請 求の範囲第１２項記載のウイルス。 16．前記ＥＬＤＫＷＡエピトープまたは前記ＬＤＫＷＡエピトープがｇｐ１２０ Ｖ３の一部として発現されることを特徴とする請求の範囲第１５項記載のウイル ス。 17．改変組換体アビポックスウイルスであって、改変により宿主内における毒性 が弱毒化されており、さらに、ウイルスゲノムの可欠領域に外来ＤＮＡを含有し 、該外来ＤＮＡが少なくとも１つの免疫不全症ウイルスエピトープをコードする ものであることを特徴とする組換体アビポックスウイルス。 18．前記ウイルスがカナリアポックスウイルスであることを特徴とする請求の範 囲第１７項記載のウイルス。 19．前記カナリアポックスウイルスが、Rentschlerワクチン株の１つであって、 ニワトリ胚線維芽細胞による２００回以上の継代接種により弱毒化され、そのマ スター種株が寒天培地下の４回の連続的なプラーク精製に供された後、それ由来 のプラーククローンが５回の追加の継代接種により増幅されたものであることを 特徴とする請求の範囲第１８項記載のウイルス。 20．ＡＬＶＡＣ組換体ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１８項記載 のウイルス。 21．前記外来ＤＮＡが、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ ）ＣＴＬエピトープ、およびＥＬＤＫＷＡエピトープまたはＬＤＫＷエピトープ のうちの少なくとも１つをコードすることを特徴とする請求の範囲第１８項記載 のウイルス。 22．前記外来ＤＮＡが、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、２つのｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬエピトープと ３つのｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬエピトープ、または２つのＥＬＤＫＷＡエピト ープのうちの少なくとも１つをコードすることを特徴とする請求の範囲第１８項 記載のウイルス。 23．前記ＥＬＤＫＷＡエピトープまたは前記ＬＤＫＷＡエピトープがｇｐ１２０ の１領域またはｇｐ１６０の１領域の一部として発現されることを特徴とする請 求の範囲第２１項記載のウイルス。 24．前記ＥＬＤＫＷＡエピトープまたは前記ＬＤＫＷＡエピトープがｇｐ１２０ Ｖ３の一部として発現されることを特徴とする請求の範囲第２３項記載のウイル ス。 25．前記２つのｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬエピトープと前記３つのｐｏｌ（ＩＩＩ Ｂ）ＣＴＬエピトープが、ＣＴＬ１、ＣＴＬ２、ｐｏｌ１、ｐｏｌ２およびｐｏ ｌ３であることを特徴とする請求の範囲第２２項記載のウイルス。 26．ｖＣＰ２０５（ＡＬＶＡＣ−ＭＮ１２０ＴＭＧ）、ｖＣＰ２６４（ＡＬＶＡ Ｃ−ＭＮ１２０ＴＭＧＮ）、ｖＣＰ３００（ＡＬＶＡＣ−ＭＮ１２０ＴＭＧＮＰ ）、またはｖＣＰ１３０７であることを特徴とする請求の範囲第２１項記載のウ イルス。 27．ｖＰ１３１３またはｖＰ１３１９。 28．免疫学的治療の必要性のある患者を治療しまたは個人の体内に免疫応答を誘 起する方法であって、該患者または個人に、適当な担体と混合して、請求の範囲 第１、１２、１４、２１、２６または２７項のいずれかに記載のウイルスを含む 組成物を投与することを特徴とする方法。 29．請求の範囲第１、１２、１４、２１、２６または２７項のいずれかに記載の ウイルスを適当な担体と混合して含むことを特徴とする免疫応答を誘起するため の組成物。 30．インビトロ培養される細胞内で遺伝子産物を発現させる方法であって、該細 胞に請求の範囲第１、１２、１４、２１、２６または２７項のいずれかに記載の ウイルスを導入することを特徴とする方法。 31．請求の範囲第１、１２、１４、１９、２２または２３項のいずれかに記載の ウイルスのインビトロ発現から調製されることを特徴とする免疫不全症ウイルス 抗原。 32．請求の範囲第１、１２、１４、１９、２２または２３項のいずれかに記載の ウイルス由来の抗原のインビボ発現により、または、該ウイルスのインビトロ発 現由来の免疫不全症関連抗原の投与により誘起されることを特徴とする抗体。 33．ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランス メンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、およびＥ ＬＤＫＷＡエピトープまたはＬＤＫＷエピトープから成る群より選ばれることを 特徴とするＨＩＶ免疫原。 34．前記ＥＬＤＫＷＡまたは前記ＬＤＫＷＡが、ｇｐ１２０の１領域またはｇｐ １６０の１領域の一部分であることを特徴とする請求の範囲第３３項記載のＨＩ Ｖ免疫原。 35．前記ＥＬＤＫＷＡまたは前記ＬＤＫＷＡが、ｇｐ１２０ Ｖ３の一部である ことを特徴とする請求の範囲第３４項記載のＨＩＶ免疫原。 36．ｇｐ１２０またはｇｐ１６０中に自然に存在しないエピトープを含有するよ うに改変されたことを特徴とするｇｐ１２０またはｇｐ１６０。 37．ｇｐ１２０またはｇｐ１６０中に自然に存在しないＢ細胞エピトープを含有 するように改変されたことを特徴とする請求の範囲第３６項記載のｇｐ１２０ま たはｇｐ１６０。 38．ｇｐ１２０Ｖ３ループ中に自然に存在しないエピトープを含有するようにＶ ３ループ中で改変されたことを特徴とする請求の範囲第３６項記載のｇｐ１２０ またはｇｐ１６０。 39．前記エピトープがＢ細胞エピトープであることを特徴とする請求の範囲第３ ８項記載のｇｐ１６０またはｇｐ１２０。 40．前記エピトープがＥＬＤＫＷＡまたはＬＤＫＷＡであることを特徴とする請 求の範囲第３８項記載のｇｐ１６０またはｇｐ１２０。 41．ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランス メンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、およびＥ ＬＤＫＷＡエピトープまたはＬＤＫＷエピトープのうちの少なくとも１つを含む ように改変されたｇｐ１２０であることを特徴とする請求の範囲第３６項記載の ｇｐ１６０またはｇｐ１２０。 42．前記ｇｐ１２０がＶ３ループ内でエピトープを含有するように改変されるこ とを特徴とする請求の範囲第４１項記載のｇｐ１６０またはｇｐ１２０。