JP2003529559A - 新規用途 - Google Patents
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Abstract
Description
ク質の新規使用に関する。特に、本発明は、HIV TatおよびHIV gp120タンパク質
の組合せの使用に関する。さらに、本発明は、HIV NefおよびHIV gp120タンパク
質の組合せの使用に関する。
免疫不全症候群(AIDS)の根本的な原因である。ワクチンを生成するために世界中
で大規模な研究が行われてきたが、そのような努力はこれまでのところ成果がな
い。
ウイルスタンパク質である。この付着は、CD4および2つのケモカイン受容体で
あるCCR-4またはCXCR-5の1つとして知られるヘルパーT細胞およびマクロファ
ージの2つの表面分子への結合により仲介される。gp120タンパク質は、まずよ
り大きい前駆体分子(gp160)として発現され、次いでこれが翻訳後切断されて、g
p120およびgp41となる。gp120タンパク質は、gp41分子へ連結することによりビ
リオンの表面上に保持されて、ウイルス膜に挿入される。
ク質の中で最も免疫原性のある領域(V3ループ)は該タンパク質の中で最も可変す
る部分でもある。従って、gp120(またはその前駆体gp160)をワクチン抗原として
使用して、中和抗体を誘導することは、広く防御的なワクチンのためには使用が
限定されると考えられている。gp120タンパク質は、また、細胞毒性Tリンパ球(
CTL)により認識されるエピトープを含む。これらのエフェクター細胞は、ウイル
ス感染細胞を消失させることができ、従って、二番目に主要な抗ウイルス免疫機
構を構成する。中和抗体の標的領域とは対照的に、一部のCTLエピトープは、異
なるHIV株間で比較的保護されているように思われる。このために、gp120および
gp160は、細胞媒介性免疫応答(特にCTL)を引き出すことを目的としたワクチンに
おいて有用な抗原成分であると考えられている。
伝子の生成物などの内部構造タンパク質、ならびにRev、Nef、VifおよびTatなど
の他の非構造タンパク質を含む(Greeneら, New England J. Med, 324, 5, 308以
下(1991)、およびBryantら (Pizzo編), Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390
以下 (1992))。
染の初期に、構造タンパク質の不在下で発現される。
9.6PD infection in rhesus macaques, 12th Cent Gardes meeting, Marnes-La-
Coquette, 26.10.1999)において、アカゲザル(rhesus macaques)をTatトキソイ
ドを単独、またはエンベロープ糖タンパク質gp160ワクチン組合せ(1用量の組換
えワクシニアウイルスおよび1用量の組換えタンパク質)との組合せで免疫した
実験が説明された。しかし、観察された結果は、エンベロープ糖タンパク質の存
在によって、Tatのみで行った実験よりも有利になることはなかったことを示し
た。
ンパク質)が、gp120と相乗的に作用して、キメラヒト-サル免疫不全ウイルス(SH
IV)での病原性誘発(pathogenic challenge)からアカゲザルを防御することを見
出した。今日、アカゲザルのSHIV感染は、ヒトAIDSと最も関係の深い動物モデル
であると考えられている。従って、本発明者らは、この前臨床モデルを使用して
、gp120抗原、ならびにNefおよびTat含有抗原を単独でまたはそれらの組合せを
含むワクチンの防御効力を評価した。ウイルス感染および病原性の2つのマーカ
ーの分析、末梢血液中のCD4陽性細胞のパーセンテージ、およびサルの血漿中の
遊離SHIV RNAゲノムの濃度から、2つの抗原が相乗的に作用することが示された
。gp120またはNefTat+SIV Nefのいずれかのみでの免疫は、アジュバントのみで
の免疫と比べて違いを生じなかった。対照的に、gp120およびNefTat+SIV Nef抗
原の組合せの投与は、特定の実験グループの動物全てにおいて上記2つのパラメ
ーターの顕著な改善を生じた。
ワクチン製造における、HIV gp120と共に用いるHIV Tatおよび/またはNefタンパ
ク質の新規の使用を提供する。
ク質は一緒にされると、NefTat+SIV Nef、またはgp120のいずれかが単独で使用
された場合に観察される応答よりも増強された応答を生じる。この増強された応
答、または相乗効果は、これらの組み合わせられたタンパク質でのワクチン接種
の結果であるウイルス負荷の減少に見とめられる。あるいはまた、またはさらに
、増強された応答は、HIV NefTat、SIV NefおよびHIV gp120でのワクチン接種を
行わなかった時に見とめられるレベルを上回るCD4+レベルが維持されることにも
はっきりと表れている。該相乗効果は、gp120とTat、gp120とNef、またはgp120
とNefおよびTatの両方との組合せによるものである。
れる相乗効果をさらに増強し得る。これらの他のタンパク質はまた、元の完全な
抗原の組合せを必要とせずに、gp120、Tatおよび/またはNef含有ワクチンの個々
の成分と相乗的に作用し得る。追加のタンパク質は、Rev、Vif、VpuおよびVprな
どのHIVの調節タンパク質であり得る。これらはまた、HIV gagまたはpol遺伝子
に由来する構造タンパク質であってもよい。
体タンパク質p55をコードする。次いで、前駆体は、タンパク質分解により、主
要な構造タンパク質p24(キャプシド)およびp18(マトリックス)、ならびにいくつ
かの小さいタンパク質に切断される。前駆体タンパク質p55、ならびにその主要
誘導体p24およびp18はどちらも、適切なワクチン抗原として考えられ、これらは
gp120と、Tatおよび/またはNefとの間に見とめられる相乗効果をさらに増強し得
る。前駆体p55およびキャプシドタンパク質p24はVLPまたは単量体タンパク質と
して使用してもよい。
IV Nefタンパク質に場合により連結され得る。
ンパク質は、好ましくは5〜10のヒスチジン残基を含むC末端ヒスチジンテイル
を有し得る。ヒスチジン(または「His」)テイルの存在は精製を助ける。
基を含むヒスチジン尾部と共に発現される。これらは、精製を助けるために有利
である。酵母(サッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae))にお
ける、Nef(Macreadie I.G.ら, 1993, Yeast 9 (6) 565-573)およびTat(Braddock
Mら, 1989, Cell 58 (2) 269-79)の個別の発現が報告されている。Nefタンパク
質およびGagタンパク質p55およびp18はミリスチル化される。ピキア(Pichia)発
現系におけるNefおよびTat(Nef-HisおよびTat-His構築物)の別々の発現、ならび
に融合構築物Nef-Tat-Hisの発現は先にWO99/16884に記載されている。
びにNef-Tat-His融合タンパク質(配列番号12および13)のDNAおよびアミノ酸配列
を、図1に示す。
よいし、またはより好ましくはワクチン使用のために改変されてもよい。これら
の改変は、精製法に関係する技術的理由のために必要とされるか、TatまたはNef
タンパク質の1つまたは複数の機能的特性を生物学的に不活化させるために使用
され得る。従って、本発明は、例えば変異型タンパク質であってよいHIVタンパ
ク質の誘導体を包含する。「変異型」という用語は、本明細書中では、部位特異的
突然変異誘発のための周知技術または他の任意の従来法を用いて1つまたは複数
のアミノ酸の欠失、付加または置換が行われた分子を意味するのに用いる。
維持したまま生物学的に不活化され得る。D.Clements(Tulane University)によ
り構築された1つの可能性のある変異型tat遺伝子(BH10分子クローンに由来)は
、活性部位領域(Lys41→Ala)、ならびにRGDモチーフ(Arg78→LysおよびAsp80→G
lu)において突然変異を担持する(Virology 235:48-64, 1997)。
と共に図1に示す。
化学的方法で改変して、タンパク質を安定化かつ単量体化できる。TatまたはNef
などのタンパク質の酸化凝集を予防するための1つの方法として、タンパク質の
チオール基の化学的修飾の使用がある。第1のステップでは、DTT、βメルカプ
トエタノールまたはグルタチオンなどの還元剤での処理によりジスルフィド架橋
を還元する。第2のステップでは、得られたチオールを、アルキル化剤との反応
により保護する(例えば、タンパク質は、ヨードアセトアミドを用いてカルボキ
シアミダート化(carboxyamidated)/カルバミドメチレート化(carbamidomethylat
ed)できる)。このような化学修飾は、細胞結合アッセイ、およびヒト末梢血液単
核細胞のリンパ球増殖の阻害により評価した場合のTatまたはNefの機能的性質を
改変しない。
する方法により精製できる。
、またはNefTatおよびgp120抗原を含み、従来技術により調製され得る。
niversity Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978に概して記載されて
いる。リポソーム中への内包化は、例えば、Fullerton(US 4,235,877)に記載さ
れている。タンパク質の巨大分子への結合(conjugation)は、例えば、Likhite(U
S 4,372,945)およびArmorら(US 4,474,757)に記載されている。
な副作用のない免疫防御的応答を誘導する量として選択される。このような量は
、どの具体的な免疫原が採用されるかに依存して異なる。一般的に、各用量は、
各タンパク質を1〜1000μg、好ましくはTatまたはNefまたはNefTatを2〜200μg
、最も好ましくは4〜40μg、そして好ましくはgp120を1〜150μg、最も好ましく
は2〜25μg含むことが期待される。特定のワクチンの最適量は、被験体における
抗体力価および他の応答の観察を含む標準的な研究により確認できる。特定のワ
クチン用量の一例は、20μgのNefTat、および5または20μgのgp120を含む。初回
ワクチンに続いて、被検体は、約4週間以内に追加免疫を受けて、その後2回目
の追加免疫処置を受けてもよい。
ことが好ましい。アジュバントは、Vaccine Design-the Subunit and Adjuvant
Approach, PowellおよびNewman編, Plenum Press, New York, 1995に概して記載
されている。
ン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩が挙げられるが、カルシウム、鉄もしく
は亜鉛の塩、またはアシル化チロシン、アシル化糖、陽イオンもしくは陰イオン
誘導型(derivatised)多糖、もしくはポリホスファゼンの不溶性懸濁液であって
もよい。
とが好ましい。しかし、他の体液性応答を含む他の応答が排除されるわけではな
いことが理解されるであろう。
。得られる免疫応答は、体液性免疫応答または細胞媒介性免疫応答 (従来から、
それぞれ抗体および細胞性エフェクター防御メカニズムにより特徴づけられてい
る)という、2つの極端なカテゴリーに大別される。これらの応答カテゴリーは
、Th1型応答(細胞媒介性応答)、およびTh2型免疫応答(体液性応答)と称されてい
る。
およびナチュラルキラー細胞応答の生成により特徴付けられ得る。Th1型応答は
、マウスではIgG2aサブタイプの抗体の生成により特徴付けられることが多く、
ヒトではこれらはIgG1型抗体に対応する。Th2型免疫応答は、マウスではIgG1、I
gAおよびIgMを含む幅広い免疫グロブリンイソタイプの生成により特徴付けられ
る。
て、最終的な免疫応答をTh1またはTh2応答のいずれかに導く多くの同定されたタ
ンパク質メッセンジャーであるサイトカインであると考えられる。従って、高レ
ベルのTh1型サイトカインは、所与の抗原に対して細胞媒介性免疫応答の誘導を
助ける傾向があり、高レベルのTh2型サイトカインは、抗原に対して体液性免疫
応答の誘導を助ける傾向がある。
が重要である。現実には、個体は、優勢的にTh1または優勢的にTh2であると表現
される免疫応答を支持する。しかし、サイトカインのファミリーは、マウスCD4+
veT細胞クローンについてMosmannおよびCoffman (Mosmann, T.R.およびCoffman
, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secret
ion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology
, 7, p145-173)が記載するファミリーに基づいて考えることが都合がいい場合が
多い。慣習的に、Th1型応答は、Tリンパ球によるINF-γおよびIL-2サイトカイ
ンの生成を伴う。Th1型免疫応答の誘導を直接伴うことが多い他のサイトカイン
は、IL-12などのT細胞により生成されない。対照的に、Th2型応答は、IL-4、IL
-5、IL-6、IL-10および腫瘍壊死因子β(TNF-β)の分泌を伴う。
刺激に特に適していることが知られている。従来から、ワクチンまたは感染後の
免疫応答のTh1:Th2バランスの最良の指標としては、抗原での再刺激後のTリン
パ球によるTh1もしくはTh2サイトカインのin vitro生成の直接測定、および/ま
たは抗原特異的抗体応答のIgG1:IgG2a比の測定が含まれる。
刺激された際に高レベルのTh1型サイトカインを生成するように刺激して、Th1型
イソタイプを伴う抗原特異的免疫グロブリン応答を誘発するものである。
いTh1型免疫刺激薬としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されな
い。
A(3D-MPL)は、本発明において使用するのに好ましいTh1型免疫刺激薬である。3
D-MPLは、Ribi Immunochem(Montana)製の周知のアジュバントである。化学的
に、4、5または6のアシル化鎖を有する3-デ-O-アシル化モノホスホリル脂質
Aの混合物として提供されることが多い。これは、GB2122204B(本参考文献は、
ジホスホリル脂質A、およびその3-O-デアシル化誘導体の調製も開示している)
に教示されている方法により精製および調製できる。他の精製および合成リポ多
糖も記載されている(US 6,005,099およびEP 0 729 473 B1;Hilgersら, 1986, I
nt. Arch. Allergy. Immunol., 79(4):392-6;Hilgersら, 1987, Immunology, 6
0(1):141-6;およびEP 0 549 074 B1)。3D-MPLの好ましい形態は、微粒子サイズ
が直径0.2μm未満である微粒子剤形の形態であり、その製造方法はEP 0 689 454
に開示されている。
周知のアジュバントであり、Lacaille-Dubois, MおよびWagner H.(1996. A revi
ew of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytome
dicine vol 2 pp 363-386)に教示されている。例えば、Quil A(南アメリカの木
であるシャボンノキ(Quillaja Saponaria Molina)の樹皮に由来)、およびその画
分は、US 5,057,540、および”Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C.R
., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55;およびEP 0 362
279 B1に記載されている。溶血性サポニンQS21およびQS17(Quil AのHPLC精製画
分)は、強力な全身性アジュバントとして記載されており、それらの製造方法はU
S 5,057,540およびEP 0 362 279 B1に開示されている。これらの参考文献にはま
た、全身性ワクチンの強力なアジュバントとして作用するQS7(Quil-Aの非溶血性
画分)の使用も記載されている。QS21の使用はさらに、Kensilら(1991.J.Immunol
ogy vol 146, 431-437)に記載されている。QS21とポリソルベートまたはシクロ
デキストリンとの組み合わせも知られている(WO 99/10008)。QS21およびQS7など
のQuil Aの画分を含む微粒子アジュバント系は、WO 96/33739およびWO 96/11711
に記載されている。
刺激オリゴヌクレオチドである。CpGは、DNAに存在するシトシン-グアノシン・ジ
ヌクレオチドモチーフの略である。CpGは、当該分野において、全身および粘膜
経路の両方により投与された場合にアジュバントとなることが知られている(WO
96/02555、EP 468520、Davisら, J.Immunol, 1998, 160(2):870-876;McCluskie
およびDavis, J.Immunol., 1998, 161(9):4463-6)。歴史的には、BCGのDNA画分
は、抗腫瘍効果を発揮できることが観察されていた。さらなる研究では、BCG遺
伝子配列から誘導した合成オリゴヌクレオチドが、免疫刺激効果を(in vitroお
よびin vivoの両方で)誘導可能であることが示された。これらの研究の著者は、
中央CGモチーフを含む特定のパリンドローム配列がこの活性を担持すると結論づ
けた。免疫刺激におけるCGモチーフの中心的役割は、後に、Krieg, Nature 374,
p546 1995による発表において明白にされた。詳細な分析により、CGモチーフが
特定の配列関係になければならず、このような配列は細菌DNAにおいては一般的
であるが、脊椎動物DNAでは稀であることが示された。免疫刺激性配列は、CGモ
チーフがメチル化されていないプリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジ
ンであることが多い。しかし、他の非メチル化CpG配列は免疫刺激性であること
が知られており、本発明において使用してもよい。
。これらのモチーフのいくつかは、1つのモチーフの繰返しまたは異なるモチー
フの組合せのいずれかとして、同じオリゴヌクレオチドに存在し得る。オリゴヌ
クレオチドを含むこれらの免疫刺激性配列が1つ以上存在することにより、(イ
ンターフェロンγを産生し、細胞溶解活性を有する)ナチュラルキラー細胞およ
びマクロファージを含む様々な免疫サブセットが活性化され得る(Wooldrigeら V
ol 89 (no. 8), 1977)。このコンセンサス配列を持たない配列を含む他の非メチ
ル化CpGも、免疫調節性であることが示されている。
solution)に入れられて投与されるか(WO 96/02555;McCluskieおよびDavis、前
掲)、または抗原に共有結合されるか(WO 98/16247)、または水酸化アルミニウム
などの担体と共に処方される((肝炎表面抗原)Davisら、前掲;Brazolot-Millan
ら, Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8)。
、およびアルミニウム塩(水酸化アルミニウムなど)を含む金属塩などの担体と共
に処方され得る。例えば、3D-MPLは、水酸化アルミニウム(EP 0 689 454)、また
は水中油型エマルジョン(WO 95/17210)と処方でき;QS21は、コレステロール含
有リポソーム(WO 96/33739)、水中油型エマルジョン(WO 95/17210)、またはミョ
ウバン(WO 98/15287)と有利に処方でき;CpGは、ミョウバン(Davisら、前掲;Br
azolot-Millan、前掲)または他の陽イオン担体と処方され得る。
導体の組合せ(WO 94/00153;WO 95/17210;WO 96/33739;WO 98/56414;WO 99/1
2565;WO 99/11241)、なかでもQS21および3D-MPLの組合せ(WO 94/00153に開示)
が好ましい。あるいはまた、CpGおよびサポニン(QS21など)の組合せもまた、本
発明において使用するための強力なアジュバントを形成する。
ホリル脂質A、好ましくは3D-MPLの組合せを含む。増強された系は、モノホスホ
リル脂質Aおよびサポニン誘導体の組合せ、特にWO 94/00153に開示されるよう
なQS21および3D-MPLの組合せ、またはWO96/33739に開示されるようなコレステロ
ール含有リポソーム(DQ)中でQS21が弱められた反応原性が低い組成物を含む。
に強力なアジュバント剤形は、WO 95/17210に記載されており、本発明において
使用される別の好適な剤形である。
塩と共に含む。
つ以上コードするDNAを含んで、ポリペプチドがin situで生成されるようにでき
る。DNAは、プラスミドDNAなどの核酸発現系、細菌およびウイルス発現系を含む
当業者に知られている様々な送達系のいずれの中に存在してもよい。Rolland, C
rit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998および該文献に引用さ
れる参考文献に記載されるものなど、多数の遺伝子送達技術が当該分野において
周知である。適切な核酸発現系は、患者内での発現のために必要なDNA配列(例え
ば、適切なプロモーターおよび停止シグナルなど)を含む。発現系が、ウイルス
または細菌などの組換え生(live)微生物である場合、目的の遺伝子を、生組換え
ウイルスまたは細菌のゲノムに挿入できる。この生ベクターでの接種およびin v
ivo感染により、抗原のin vivo発現および免疫応答の誘導が生じる。この目的の
ために使用されるウイルスおよび細菌は、例えば:ポックスウイルス(例えば、
ワクシニア、鶏痘、カナリア痘、改変型ポックスウイルス(例えば、改変型ウイ
ルスアンカラ(Modified Virus Ankara)(MVA))、アルファウイルス(シンドビスウ
イルス、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス)、フラビウイ
ルス(黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス)、アデノウイルス
、アデノ随伴ウイルス、ピコルナウイルス(ポリオウイルス、ライノウイルス)、
ヘルペスウイルス(水痘帯状疱疹ヘルペスウイルス等)、リステリア、サルモネラ
、赤痢菌、ナイセリア、BCGである。これらのウイルスおよび細菌は、有毒であ
ってもよいし、または生ワクチンを得るために様々な方法により弱毒化されても
よい。このような生ワクチンも、本発明の一部を形成する。
タンパク質をコードするポリヌクレオチドの形態で提供され得る。
れてもよい。初回-追加免疫は、幅広い免疫応答を誘導するために有効であると
考えられている。アジュバント化されたタンパク質ワクチンは主に抗体およびT
ヘルパー免疫応答を誘導し、プラスミドまたは生ベクターとしてのDNAの送達は
強力な細胞毒性Tリンパ球(CTL)応答を誘導する。従って、タンパク質およびDNA
ワクチン接種の組合せは、幅広い免疫応答を提供する。これは、特にHIVの関係
において関連する。なぜなら、中和抗体およびCTLの両方が、HIVに対する免疫防
御のための重要であると考えられるからである。
種のためのスケジュールは、タンパク質抗原および上記タンパク質をコードする
DNAの連続的(”初回-追加免疫”)投与または同時投与を含み得る。DNAは、プラ
スミドDNAとして、または組換え生ベクターの形態(例えばポックスウイルスベク
ターまたは本明細書に記載している任意の他の適切な生ベクター)で送達され得
る。タンパク質抗原を1回以上注射してから1回以上のDNA投与を行うか、また
はDNAをまず1回以上の投与に使用してから1回以上のタンパク質による免疫を
行ってもよい。
例えば改変型ウイルスアンカラ(MVA))またはアルファウイルス(例えば、ベネズ
エラウマ脳炎ウイルス)などの組換え生ベクターの形態のDNAでの初回免疫を行
い、その後にタンパク質(好ましくはアジュバント化されたタンパク質)での追加
免疫を行うことを含む。
1つがgp120と共にNefおよび/またはTatおよび/またはNef-Tatを含むという条件
下で: a)製薬上許容可能な賦形剤と共に、gp120、NefおよびTatタンパク質を1つ
以上含む組成物;ならびに b)製薬上許容可能な賦形剤と共に、gp120、NefおよびTatコードポリヌクレ
オチドを1つ以上含む組成物 を含む製薬キットをさらに提供する。
に投与されてもよい。a)は、gp120、NefおよびTatタンパク質の3つを全て含
むことが好ましい。b)は、gp120、NefおよびTat DNAの3つを全て含むことが
好ましい。NefおよびTatは、NefTat融合タンパク質の形態であることが最も好ま
しい。
を含む、本明細書に記載するワクチン剤形の製造方法が提供される。タンパク質
組成物は、適切なアジュバント、および場合により担体と混合され得る。
体の組合せは以下の通りである。
築物のために選択した。なぜなら、この遺伝子は、コンセンサスNefに最も密接
に関係するものの1つであるからである。
ローニングされた1170bpのDNA断片であった(pcDNA3/Nef)。
cience, 229, p69-73, 1985に記載されるHTLV III cDNAクローンとして得た。
質、Tatタンパク質、および融合体Nef-Tatをメチロトローフ酵母ピキア・パスト
リス中で発現させた。
VITROGEN)を使用した。このベクターを、異種タンパク質の発現がAOX1遺伝子の
天然型ATGコドンの直後に開始し、1つのグリシンおよび6つのヒスチジン残基
のテイルを有する組換えタンパク質を産生するように改変した。このPHIL-D2-MO
Dベクターは、オリゴヌクレオチドリンカーを、PHIL-D2ベクターの隣接するAsuI
I部位とEcoRI部位との間でクローニングすることにより構築した(図2を参照)。
Hisテイルに加えて、このリンカーはNcoI、SpeIおよびXbal制限部位を担持し、
その間にnef、tatおよびnef-tat融合体を挿入した。
より増幅した。
で制限消化し、アガロースゲル上で精製し、ライゲートして組込みプラスミドpR
IT14597を作成した(図2を参照)。
により増幅した:
3’末端に導入した。得られたPCR断片およびPHIL-D2-MODベクターを両方ともNco
IおよびSpeIで制限消化し、アガロースゲル上で精製し、ライゲートして、組込
みプラスミドpRIT14598を作成した。
片を、PHIL-D2-MODベクターの平滑化EcoRI (T4ポリメラーゼ)部位とNcoI部位と
の間にライゲートした。nef-tat-Hisコード断片は、pRIT14596の平滑化XbaI (T4
ポリメラーゼ)切断およびNcoI切断により得た。
株を得るために、それぞれの発現カセット、および宿主ゲノム中のhis4に相補的
になるためのHIS4遺伝子を担持する直線状NotI断片でGS115株を形質転換した。N
otI-直線状断片でのGS115の形質転換は、AOXI座での組換えに有利である。
組込み、挿入(Mut+表現型)、または置換(transplacement)(MutS表現型)の種類を
決定した。
選択した: 組換えNef-Hisタンパク質を生成するY1738株(Mut+表現型)では、以下からなる
ミリスチル化215アミノ酸タンパク質: ・ミリスチン酸 ・PHIL-D2-MODベクターのNcoIクローニング部位の使用により作成されるメチオ
ニン ・Nefタンパク質の205アミノ酸(アミノ酸2から始まりアミノ酸206まで) ・クローニング処置(PHIL-D2-MODベクターのSpeI部位におけるクローニング)に
より作成されるトレオニンおよびセリン ・1つのグリシンおよび6つのヒスチジン。
ノ酸タンパク質: ・NcoIクローニング部位の使用により作成されるメチオニン ・Tatタンパク質の85アミノ酸(アミノ酸2から始まりアミノ酸86まで) ・クローニング処置により導入されるトレオニンおよびセリン ・1つのグリシンおよび6つのヒスチジン 組換えNef-Tat-His融合タンパク質を生成するY1737株(MutS表現型)では、以下
からなるミリスチル化302アミノ酸タンパク質: ・ミリスチン酸 ・NcoIクローニング部位の使用により作成されるメチオニン ・Nefタンパク質の205アミノ酸(アミノ酸2から始まりアミノ酸206まで) ・クローニング処置により作成されるトレオニンおよびセリン ・Tatタンパク質の85アミノ酸(アミノ酸2から始まりアミノ酸86まで) ・クローニング処置により導入されるトレオニンおよびセリン ・1つのグリシンおよび6つのヒスチジン実施例2.酵母(ピキア・パストリス)おけるHIV-1 Tat-変異体の発現 変異型組換えTatタンパク質も発現させた。変異型Tatタンパク質は、免疫原エ
ピトープは維持したままで、生物学的に不活性でなければならない。
子をこれらの構築物のために選択した。
らびにRGDモチーフ(Arg78→Lys、およびAsp80→Glu)において突然変異を担持す
る(Virology 235: 48-64, 1997)。
サブクローニングされたcDNA断片として受け入れた(pCMVLys41/KGE)。
からPCRにより増幅した(1.1節のpRIT14598の構築を参照)。
3’末端に導入した。得られたPCR断片およびPHIL-D2-MODベクターを両方とも、N
coIおよびSpeIで制限消化し、アガロースゲル上で精製し、ライゲートして、組
込みプラスミドpRIT14912を作成した。
子をpCMVLys41/KGEプラスミドからPCRにより増幅した。
方とも、SpeI制限酵素で切断し、アガロースゲル上で精製し、ライゲートして組
込みプラスミドpRIT14913を作成した。
異体-Hisタンパク質および融合体Nef-Tat変異体-Hisを発現しているピキア・パ
ストリス株を得た。
換え株を選択した:すなわち、Y1775(Mut+表現型)およびY1776(MutS表現型) Nef-Tat変異体-His融合タンパク質、すなわち302アミノ酸タンパク質を発現する
1つの組換え株を選択した:Y1774(Mut+表現型)。
用培地を供給)、および誘導期(メタノールおよび塩/微量元素溶液を供給)を含む
。発酵の間、成長の後にサンプルを回収し、それらの吸光度を620 nmで測定する
。誘導期の間、メタノールをポンプを介して添加し、(培養サンプルについての)
ガスクロマトグラフィー、および質量分析計でのオンラインガス分析によりその
濃度を観察した。発酵後、30分間の2〜8℃における5020gでの遠心分離により
細胞を回収し、細胞ペーストを -20℃ にて保存した。さらなる作業のためには
、細胞ペーストを解凍し、緩衝液(Na2HPO4 (pH 7) 50 mM, PMSF 5%、イソプロパ
ノール4mM)中に150のOD(620 nm)にて再懸濁し、DynoMill中に4回通して破壊す
る(室温(room)、0.6L、3000rpm、6L/H、ビーズ直径0.40〜0.70 mm)。
ウェスタンブロットにより分析した。クーマシーブルー染色SDS-ゲル上で、組換
えTat-hisが、72〜96時間の誘導後の最大強度を表す強いバンドとしてはっきり
と識別された。
mill)ホモジネートOD55 2Lから開始される。クロマトグラフィーステップは、室
温で実施する。ステップ間は、Nef-Tat陽性画分を低温室(+4℃)で一晩維持する
。より長時間の場合には、サンプルを-20℃で凍結する。
および図4にクマシーブルーG250によるものを示す。 Superdex200ステップ後: >95% 透析および滅菌濾過ステップ後: >95%
ネートOD55 2L)から精製される。
ネートOD50 1Lから開始される。クロマトグラフィーステップは、室温で実施す
る。ステップ間は、Nef-Tat陽性画分を低温室(+4℃)で一晩維持する。より長時
間の場合には、サンプルを-20℃で凍結する。
) 酸化Nef-Tat-Hisタンパク質2.8mgが、組換え体酵母細胞73g(含水重量)または
ダイノーミルホモジネートOD50 1Lから精製される。
ネートOD66 2Lから開始される。クロマトグラフィーステップは、室温で実施す
る。ステップ間は、Tat陽性画分を低温室(+4℃)で一晩維持する。より長時間の
場合には、サンプルを-20℃で凍結する。
すようにSDS-PAGEによって評価した純度レベル: 透析および滅菌濾過ステップ後: >95%
ノーミルホモジネートOD66 2Lから精製される。
ネートOD60 1Lから開始される。クロマトグラフィーステップは、室温で実施す
る。ステップ間は、Tat陽性画分を低温室(+4℃)で一晩維持する。より長時間の
場合には、サンプルを-20℃で凍結する。
すようにSDS-PAGEによって評価した純度レベル: 透析および滅菌濾過ステップ後: >95%
ーミルホモジネートOD60 1Lから精製される。
ネートOD100 4Lから開始される。クロマトグラフィーステップは、室温で実施す
る。ステップ間は、Nef陽性画分を低温室(+4℃)で一晩維持する。より長時間の
場合には、サンプルを-20℃で凍結する。
すようにSDS-PAGEによって評価した純度レベル: 透析および滅菌濾過ステップ後: >95%
イノーミルホモジネートOD100 4Lから精製される。
ネートOD50 3Lから開始される。クロマトグラフィーステップは、室温で実施す
る。ステップ間は、Nef陽性画分を低温室(+4℃)で一晩維持する。より長時間の
場合には、サンプルを-20℃で凍結する。
示すようにSDS-PAGEによって評価した純度レベル: 透析および滅菌濾過ステップ後: >95%
イノーミルホモジネートOD50 3Lから精製される。
カークザル(macaque)においてサル免疫不全ウイルス(SIV)のNefタンパク質
であるSIVmac239を発現させた(Aids Reserch and Human Retroviruses, 6:1221
-1231, 1990)。Nefコード領域において、SIV mac 239は92アミノ酸の後のフレ
ーム内に終止コドンを持ち、これはわずか10kDのみの末端切断型産物であること
が予測される。Nefリーディングフレームの残りはオープンリーディングフレー
ムであり、そしてそのオープンな枠全体で263アミノ酸(30kD)のタンパク質を
コードしていると予測されるであろう。
片を出発材料としてとし、これをLX5Nプラスミド(Dr R. C. Desrosiers, South
borough, MA, USAから譲与された)にクローニングした。該SIV nef遺伝子は、
全長のSIVmac239Nefタンパク質を発現するように前駆体の終止コドンにおいて変
異を有しており(9353位のヌクレオチドGが本来のTヌクレオチドに置換されてい
る)。
述にてHIV-1 nefおよびtat配列の発現に用いた)を用いた。この組換えタンパク
質を誘導性アルコールオキシダーゼ(AOX1)プロモーターの制御下で発現させ、
そしてタンパク質のC末端に精製を容易にするヒスチジン親和性末端を伸長させ
た。
プライマーSNEF1およびSNEF2を用いてPCRによって増幅させた。
ある(Acid Reserch and Human Retroviruses, 6:1221-1231, 1990)。
る一方、SpeI部位を3’末端に導入した。該PCR断片を得、そして融合したPHIL-D
2-MODベクターをNcoIおよびSpeIの両方によって切断した。NcoI制限部位がSIV n
ef増幅配列に1カ所存在するため(9286位)、各々+200bpおよび+600bpの2つの
断片が得られ、アガロースゲルで精製し、PHIL-D2-MODベクターに連結した。こ
の結果得られた組換えプラスミドは、自動配列決定によるnef増幅領域の確認の
後に、pRIT 14908を得た。
びHIS4遺伝子のみを有する直鎖状NotI断片によって形質転換した(図11)。該
直鎖状NotI DNA断片はAOX1内在性P. pastoris遺伝子と両末端に相同性を有し、A
OX1座位において組換えを起こす。多重複製融合クローンを定量的ドットブロッ
ト解析によって選択した。組換えタンパク質の最良の生産水準を示す1つの形質
転換体を選択し、そしてY1772組織体を得た。
ク質であり、以下のものから構成され得る: ・ミリスチン酸 ・PHIL-D2-MODベクターのNcoIクローニング部位を用いて作出されたメチオニン
Nefタンパク質の262アミノ酸(aa)(aa2から開始してaa263まで伸長、図12参
照) ・クローニング手順により作出されたスレオニンおよびセリン(PHIL-D2-MODベ
クターのSpeI部位にクローニング(図11)) ・1つのグリシンおよび6つのヒスチジン。
タンパク質の生成量は全タンパク質の10%と推定した図13、レーン3-4)。
細胞沈殿物を破砕バッファー中に再懸濁し、0.5mmガラスビーズで破砕しそして
細胞抽出物を遠心分離した。不溶性沈殿物(P)および可溶性上清(S)に含まれ
る該タンパク質をクーマシーブルー染色SDS-PAGE10%上で比較した。図13に示
すように、Y1772株由来の組換えタンパク質の多く(レーン3-4)は不溶性画分に
含まれている。
産出および精製に用いる。
換えgP120糖タンパク質は、HIV-1分離株W61DのgP120エンベロープタンパク質の
組換え末端切断型である。該タンパク質は細胞培養液中に放出され、ここから最
終的に精製される。
離株W61DのエンベロープDNAコード配列(tatおよびrevの5’エキソンを含む)を
得た(Dr. Tersmette, CCB, Amsterdam)。プラスミドはpRIT13965と命名した。
131)およびPCR技術を用いてpRIT13965内のgp160コード配列のアミノ酸Glu 515
のコドンに終止コドンを挿入する必要があった。プライマーDIR 131は3つの終
止コドン(全てオープンリーディングフレーム内)およびSalI制限部位を含む。
aI断片(170 bp)およびpRIT13965からPCRによって作製したDraI-SalI断片(510
bp)から完全なgp120エンベロープ配列を再構築した。両断片はゲル精製および
大腸菌プラスミドpUC18内に一緒に連結され、初めにSalIで(klenow処理)、そ
して次にBamHIで切断した。ここで得られたものがプラスミドpRIT13967である。
gp120コードカセットを含むXmaI-SalI断片(1580 bp)の遺伝子配列を配列決定
し、そして予測された配列との同一性を見出した。初めにBclI(klenow処理)そ
して次にXmaIで切断することでプラスミドRIT13967をCHO GS発現ベクターpEE14
(Celltech Ltd., UK)に連結した。この結果得られたプラスミドはpRIT13968と
命名した。
よってCHO細胞内にトランスフェクトした。2日後、CHOK1細胞を選択増殖培地(
GMEM+メチオニンスルフォキシミン(MSX)25μM+グルタミン酸+アスパラギン+10
%ウシ胎児血清)に曝露した。 3つの選択したトランスフェクトクローンをさら
に175m2フラスコ内で増殖させ、そして細胞バイアル瓶のいくつかを-80℃で保存
した。C-env 23,9をさらに増殖するために選択した。
びMCBの調製のために細胞を7.5%ウシ胎児血清および50μMのMSXを含むGMEM培地
で増殖させた。これらの細胞培養物を無菌性およびマイコプラズマについて試験
し、陰性であることを立証した。
ンク由来の細胞を用いて調製した。要するに、プレマスター保存物の2つのアン
プルを7.5%透析済みウシ胎児血清を加えた培地中に播種した。該細胞を4つの培
養フラスコに分配し、37℃で培養した。細胞吸着の後、培養液を50μMのMSXを補
った新しい培地で交換した。コンフルエントになったら、細胞をトリプシン消化
によって回収しそしてTフラスコ−ローラーボトル−細胞ファクトリーユニット
に8倍希釈でサブカルチャーを行った。細胞をトリプシン消化および遠心分離に
よって細胞ファクトリーユニットから回収した。細胞ペレットを低温保存のため
にDMSOを補った培地に再懸濁した。アンプルは、前もってラベルおよびオートク
レーブしておき、熱密封を行った(250バイアル)。これらを漏れがないか確か
めて、液体窒素中で保存する前に一晩-70℃で保存した。
7.5%透析済み子ウシ血清(FBS)を補った適切な培養液の入った2つのTフラスコ
にプールして播種する。コンフルエントになった時(継代13代目)、細胞をト
リプシン消化によって回収して集めて、上記のとおり10個のTフラスコ内に拡大
培養する。コンフルエントの細胞(継代14代目)をトリプシン処理し、続いて
2つの細胞ファクトリーユニット(各々6000 cm2、15節)に拡大培養し、次に
10個のファクトリーユニット(継代16代目)に拡大培養する。増殖培養液に
は、7.5%透析済み子ウシ血清(FBS)および1% MSXを加える。細胞がコンフルエ
ントに達すると、増殖培養液を捨て、1%透析済み子ウシ血清のみを含みMSXを含
まない「生産培地」と交換する。上清を2日ごと(48時間間隔)に32日まで回収
する。回収した培養液は、直ちに1.2-0.22μm濾過装置を通して不純物を除去し
、そして精製するまで-20℃で保存する。
調整し、そして0.2μmフィルター上で濾過する。これらの発熱物質含有量を調べ
る(LALアッセイ)。280nmにおける光学濃度、pHおよびカラム溶出の溶出速度を
継続的に測定する。
.0)を最終濃度30mMとなるように加える。CCFを精製するまで-20℃で保存する。
30mMトリスバッファー(pH8.0)、1M硫酸アンモニウムで平衡化したTSK/TOYOPEA
RL-BUTYL 650M(TOSOHAAS)カラムに1晩かけて通す。これらの条件下で抗原が
ゲル基質に吸着する。該カラムを硫酸アンモニウムの段階的に減少する濃度勾配
により洗浄する。抗原は30mMトリスバッファー(pH8.0)、0.25M硫酸アンモニウ
ムで溶出する。
ッファー(pH8.0)で平衡化したQ-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)カラムに
ロードする。該カラムをネガティブモードに作用する(すなわち、gP120が該ゲ
ルに吸着しないが一方で不純物の多くを保持する)。
メンブレン「Omega Screen Channel」にロードする。濃縮が終わると、CaCl2 0.
3mMを含む5mMリン酸バッファー(pH7.0)で透析濾過によりバッファー交換する
。さらなる工程を直ちに実施しない場合は、gP120プールを-20℃で凍結して保存
する。解凍した後、不溶性物質を除去するために該溶液を0.2μMメンブレンで濾
過する。
したmacro-Prep Ceramic Hydroxyapatite, type II(Biorad)カラムにロードす
る。該カラムを同じバッファーで洗浄する。抗原はカラムを通過し、そして不純
物がカラムに吸着する。
S(TOYOHAAS)カラムにロードする。該カラムを同じバッファーで洗浄し、次に
酢酸20mM(pH5.0)、NaCl 10mMで洗浄する。次に抗原を80mM NaClを含む同じバ
ッファーで溶出する。
外濾過ステップを実施する。gP120プールをカットオフ値150kDaのFILTRONメンブ
レン「Omega Screen Channel」にロードして限外濾過にかける。このポアサイズ
のメンブレンは抗原を保持しない。この過程の後、希釈した抗原をカットオフ値
50kDaの同じタイプのメンブレン(Filtron)で濃縮する。
ー交換し、かつ残存した混入物を溶出させる。該カラムをリン酸緩衝食塩水(PB
S)で溶出する。
菌濾過の後、精製バルクは処理するまで-20℃で保存する。精製のスキームは以
下のフローシートに要約する。
現産物を含む。さらに、該調製物は、油/水エマルジョン中の3 de-O-アシル化
モノホスホリル脂質A 3D-MPLおよびQS21または非メチル化CpGジヌクレオチドモ
チーフを含むおよび水酸化アルミニウムを担体として含むの混合物を含む。
ポ多糖(LPS)を化学的に無毒化したものである。
合した3D-MPLが体液性免疫および細胞性免疫のT H1型の双方を強く増幅するもの
と結合することが示してきた。
から精製したサポニンであり、強いアジュバンド活性を有する。つまり、抗原特
異的リンパ球増殖およびいくつかの抗原に対するCTLsの双方を誘導する。Smith
Kline Beecham Biologicalsで実施された実験は、体液性およびT H1型細胞性免
疫反応の双方の誘導における3D-MPLおよびQS21の組み合わせの明らかな相乗効果
を立証してきた。
Tween 80を乳化剤として含むPBSから構成される。該エマルジョンは5%スクアレ
ン、5%トコフェロール、2% Tween 80を含み、かつ平均粒径は180nmである(WO95
/17210を参照)。
ョンを3D-MPL/QS21に添加すると免疫刺激特性がさらに増加することが立証され
た。
100mlの2倍濃縮エマルジョンを供するために、5gのDLα-トコフェロールおよび
5mlのスクアレンをボルテックスにかけて完全に混合する。90mlのPBS/Tween溶液
を加えて完全に混合する。得られたエマルジョンを次にシリンジに通し、最終的
にM110S Microfluidics装置を用いることで微小流動物にする。生じた油滴のサ
イズはおよそ180nmである。
物として)を10倍濃縮PBS pH6.8とH2Oで希釈し、水中油エマルジョン、3D-MPL(
50μg)、QS21(50μg)および保存剤として1μg/mlチメロサールを5分間隔で続
けて加える。該エマルジョン体積は総量の50%に等しい(500μlの投与量に対し
て250μl)。
ル化オリゴヌクレオチドである。CpGは、水中油製剤に比べてTH1型免疫の非常に
強い誘導剤であり、主に混合型TH1/T H2応答を誘導する。CpGは水中油製剤より
低レベルの抗体を誘導し、かつ良好な細胞性免疫応答を誘導する。CpGは低い局
所的な反応性を誘導することが予想される。
水溶液を得る。
の吸着を阻害するリン酸イオンを除去する。H2Oで希釈した抗原(100μg gp120
、20μg Nef Tatおよび20μg SIV Nef)をCpG水溶液(500μg CpG)と共に30分
間インキュベートしAl(OH)3上に吸着させてNef TatおよびNef抗原のHisテールと
オリゴヌクレオチドとの間の潜在的な相互作用を助長させた(結合すると、遊離
のCpGに比べてCpGのより強い免疫刺激効果が得られる)。次に5分間隔で続けてA
l(OH)3(500μg)、10倍濃縮NaClおよび保存剤として1μg/mlチメロサールを加
えた。
注射して免疫化を行った: 第1群 アジュバンド2 +gp120 第2群 アジュバンド2 +gp120 +Nef Tat +SIV Nef 第3群 アジュバンド2 +Nef Tat* +SIV Nef 第4群 アジュバンド6 +gp120 +Nef Tat +SIV Nef 第5群 アジュバンド2 +Nef Tat +SIV Nef 第6群 アジュバンド2 アジュバンド2はスクアレン/トコフェロール/Tween 80/3D-MPL/QS21を含
み、そしてアジュバンド6はミョウバンおよびCpGを含む。
びAsp80→Gluとなっている(Virology 235: 48-64, 1997)。
チャレンジをかける。チャレンジした週(wk16)から血液サンプルを指示した時
点で定期的に採取して、FACS解析によって末梢血液単核細胞中のCD4-陽性細胞の
%(図14)およびbDNAアッセイによってプラズマ中のRNAウイルスゲノムの濃度
を調べる(図15)。
第1、3、5および6群の全ての動物においてチャレンジ後に減少する。第2群
の全ての動物はCD4-陽性細胞のわずかな減少を示し、時間と共に基準レベルに回
復する。同様の傾向が第4群の動物にも観察された(図14)。
2群の動物の4匹中3匹(およびCD4-陽性細胞を維持する1つの対照動物)で、検
出レベルより低下し、かつ4匹目の動物は下限に近いウイルス負荷のみを示す。
他の動物のほとんどは高いあるいは中程度のウイルス負荷を維持する(図15)
。
過程を通して第3群(変異型Tatを有する)において第5群(非変異型Tatを有す
るものと同等の群)より2から3倍高かった。
の全ての動物はなお生存しており、一方で他の群の動物のほとんどはAIDS様症状
のために安楽死せざるを得なかった。群毎の生存動物は、 第1群 2/4 第2群 4/4 第3群 0/4 第4群 4/4 第5群 0/4 第6群 1/4結論 gp120およびNefTat(SIV Nefの存在下において)を組み合わせることは、CD4-
陽性細胞の減少を防ぎ、病原性SHIV89.6pに感染した動物におけるウイルス負荷
を減少させ、かつAIDS様病症状の進行を遅延あるいは防ぎ、一方でgp120あるい
はNefTat/SIV Nef単独であるとSHIV誘発の病的結果を防御しない。
QS21と共に含む水中の油エマルジョンであり、本研究の終了点においてミョウバ
ン/CpGアジュバンドより強い効果を有するようである。
アジュバンドの効力を確認するため、および異なるTatに基づく抗原を比較する
ために行った。本研究は異なる研究室で行われた。
い、および16週間目に病原性SHIV89.6pの標準投与によって誘発をかけた。
率および斃死率を調べた。
。
を除く全ての動物において誘発後に顕著に減少する。第1群の1匹のみがCD4-陽
性細胞の著しい減少を示す。第1の研究における動物と異なり、第2の実験にお
けるサルは、ウイルスチャレンジ後1ヶ月には異なるレベルでのCD4-陽性細胞の
安定化が見られる(図16)。この安定化は一般的にCD4-陽性細胞の初期の%よ
り低いが、しかし該細胞の完全な消失を引き起こすことはない。このことは第2
の研究に用いたサル個体群におけるSHIV誘導性疾患に対する低い感受性を示すの
かも知れない。それにも関わらず、gp120/NefTat/SIV Nefワクチンおよび2つの
gp120/Tatワクチンの有益な効果は明白である。CD4-陽性細胞が20%以上である動
物の数はワクチン接種動物で5匹であるが、一方アジュバンド群の対照動物は1
匹もこのレベルを越えて維持しない。
するものである(図17)。6匹の対照の動物のうち2匹のみが高いウイルス負
荷を維持し、他の動物ではウイルスがプラズマから消失する。このように、ワク
チン効果をウイルス負荷パラメーターにおいて説明するのは困難である。
における)がほとんどのワクチン接種した動物においてCD4-陽性細胞の減少を防
ぐことを示す。このことは最初のSHIV研究で得た結果の確証である。本研究の動
物の感受性の欠乏のため、ウイルス負荷パラメーターはワクチン効果を説明する
ために用いることが出来ないであろう。したがって、SHIVモデルに明示されるよ
うに、gp120ならびにTatおよびNef HIV抗原を組み合わせることがHIV感染の病理
的結果に対する防御を供する。
の防御を提供する。この効果はgp120/NefTat/SIV Nef抗原の組み合わせによるも
のほど大きくないが、しかしgp120およびTatがSHIV誘導性疾患発症に対していく
つかの防御的効力を仲介しうることを示す。
アカゲザルで実施した。両者のパラメーター、CD4-陽性細胞の%およびプラズマ
ウイルス負荷は第2の研究の動物がSHIV誘導性疾患に対して感受性が低いこと、
および動物間で相当大きな変動性があることが示唆される。それにも関わらず、
gp120/NefTat/SIV NefワクチンのCD4-陽性細胞の維持における有益な効果がgp12
0/NefTatおよびSIV Nefを含む実験ワクチンで見られた。このことは該ワクチン
の効果が別々の研究で再現されるだけでなく、血縁関係にないサル個体群におい
ても説明される。
およびアミノ酸配列を示す。
。
ノ酸配列を示す。
ーで染色したSDS-PAGEの結果を示す。
におけるPBMC中のCD4陽性細胞の分析結果を示す。
けるSHIVの血漿中のウイルス負荷の分析結果を示す。
におけるPBMC中のCD4陽性細胞の分析結果を示す。
けるSHIVの血漿中のウイルス負荷の分析結果を示す。
Claims (19)
- 【請求項1】 HIVに対するヒトの予防的または治療的免疫化のためのワク
チンの製造における、 a)HIV Tatタンパク質もしくはポリヌクレオチド;または b)HIV Nefタンパク質もしくはポリヌクレオチド;または c)HIV Nefタンパク質もしくはポリヌクレオチドに連結したHIV Tatタンパク質
またはポリヌクレオチド(Nef-Tat); と、HIV gp120タンパク質もしくはポリヌクレオチドとの使用。 - 【請求項2】 HIVの治療または予防において、Tat、Nef、またはNef-Tatが
gp120と相乗的に作用することを特徴とする、請求項1に記載の使用。 - 【請求項3】 上記使用におけるワクチンが、HIV感染者のHIVウイルス負荷
が低減させるものであることを特徴とする、請求項1または2記載の使用。 - 【請求項4】 上記使用におけるワクチンが、CD4+レベルを、HIV Tat、Nef
、またはNef-TatとHIV gp120とを用いたワクチン接種をしない場合に認められる
レベルより高く維持するものであることを特徴とする、請求項1または2記載の
使用。 - 【請求項5】 ワクチンが、gag、rev、vif、vpr、vpuからなる群より選択さ
れる抗原をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の使
用。 - 【請求項6】 Tatタンパク質が、突然変異タンパク質であることを特徴と
する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の使用。 - 【請求項7】 Tat、Nef、またはNef-Tatタンパク質が還元されていること
を特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用。 - 【請求項8】 Tat、Nef、またはNef-Tatタンパク質がカルバミドメチル化
されていることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の使用。 - 【請求項9】 Tat、Nef、またはNef-Tatタンパク質が酸化されていること
を特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用。 - 【請求項10】 アジュバントをさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項
に記載の使用。 - 【請求項11】 アジュバントが、TH1誘導性アジュバントであることを特
徴とする、請求項10記載の使用。 - 【請求項12】 アジュバントが、モノホスホリル脂質A、または3-デ-O-ア
シル化モノホスホリル脂質Aを含むモノホスホリル脂質Aの誘導体を含むものであ
ることを特徴とする、請求項10または11に記載の使用。 - 【請求項13】 サポニンアジュバントをさらに含む、請求項10〜12の
いずれか1項に記載の使用。 - 【請求項14】 水中油型エマルジョンをさらに含む、請求項10〜13の
いずれか1項に記載の使用。 - 【請求項15】 アジュバントがCpGモチーフ含有オリゴヌクレオチドを含
むことを特徴とする、請求項10または11に記載の使用。 - 【請求項16】 アルミニウム塩をさらに含む、請求項15記載の使用。
- 【請求項17】 HIVに対するヒトの予防的または治療的免疫化のための
初回免疫送達用ワクチンの製造における、 a)HIV Tatタンパク質もしくはポリヌクレオチド;または b)HIV Nefタンパク質もしくはポリヌクレオチド;または c)HIV Nefタンパク質もしくはポリヌクレオチドに連結したHIV Tatタンパク質
またはポリヌクレオチド; と、HIV gp120タンパク質もしくはポリヌクレオチドとの使用。 - 【請求項18】 HIV Tat、HIV Nef、またはHIV Nef-TatをHIV gp120タンパ
ク質もしくはそれらをコードするポリヌクレオチドと共に含むワクチンをヒトに
投与することによりヒトをHIVに対して免疫化する方法。 - 【請求項19】 HIV Tat、HIV Nef、またはHIV Nef-TatをHIV gp120タンパ
ク質もしくはそれらをコードするポリヌクレオチドと共に含む、ヒトに使用する
ためのワクチン組成物。
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