KR20020073569A - Ｈｉｖ에 대한 예방 또는 치료용 면역화를 위한 백신 - Google Patents

Ｈｉｖ에 대한 예방 또는 치료용 면역화를 위한 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 a) HIV Tat 단백질 또는 폴리뉴클레오티드; b) HIV Nef 단백질 또는 폴리뉴클레오티드; 또는 c) HIV Nef 단백질 또는 폴피뉴클레오티드 (Nef-Tat)와 연결된 HIV Tat 단백질 또는 폴리뉴클레오티드; 및 HIV gp120 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 HIV에 대한 인간의 예방 또는 치료용 면역화 백신의 제조용 용도를 제공한다.

Description

ＨＩＶ에 대한 예방 또는 치료용 면역화를 위한 백신 {VACCINE FOR THE PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC IMMUNIZATION AGAINST HIV}
HIV-1은 세계의 주요한 건강상 문제 중의 하나로 여겨지는 후천성 면역 결핍증 (AIDS)의 주요한 원인이다. 백신을 생산하기 위하여 전 세계가 집중적인 연구를 하는데도 불구하고, 이러한 노력은 아직 성공적이지 않다.
HIV 엔벨로프 당단백질 gp120은 바이러스 단백질로서 숙주 세포에 부착할 때 사용된다. 상기 부착은 CD4 및 두 개의 케모킨 수용체 CCR-4 또는 CXCR-5 중 하나로서 알려진 헬퍼 T 세포 및 마크로파아지의 두 개의 표면 분자에 결합하여 매개된다. gp120 단백질은 처음에 보다 큰 전구체 분자 (gp160)로서 발현되고, 다음에 번역후 과정에서 절단되어 gp120 및 gp41이 된다. gp120 단백질은 gp41에 의해 연결되어 비리온의 표면에 보유되고, 이는 바이러스 막으로 삽입된다.
gp120 단백질은 항체를 중화시키는 주요한 표적이나, 공교롭게도 단백질의가장 면역원성이 큰 부위 (V3 루프)가 또한 단백질의 가장 변하기 쉬운 부위이다. 따라서, gp120 (또는 이의 전구체인 gp160)의 항체의 중화를 유도하는 백신 항원으로서의 용도는 광범위한 예방용 백신으로서 제한적이라고 생각된다. gp120 단백질은 또한 세포독성 T 림프구 (CTL)에 의해 인지되는 에피토프를 함유한다. 상기 효과기 세포 (effector cell)는 바이러스-감염 세포를 제거하여서, 2차 주요 항바이러스 면역 메카니즘을 구성한다. 항체를 중화시키는 표적 부위와 달리, 일부 CTL 에피토프는 다른 HIV 균주간에 비교적 보존되는 것이 분명하다. 이러한 이유로, gp120 및 gp160은 세포-매개 면역 반응 (특히 CTL)을 유도하는 목적의 백신의 유용한 항원 구성요소라고 생각된다.
HIV-1의 비-엔벨로프 단백질이 기술된 바 있는데, 예를 들어, gag 및 pol 유전자의 생산물과 같은 내부 구조 단백질 및 Rev, Nef, Vif 및 Tat와 같은 다른 비구조 단백질을 포함한다 (참고문헌: Green et al., New England J. Med, 324, 5, 308 et seq, 1991, 및 Bryant et al., (Ed Pizzo), Pediatr. Infect, Dis. J., 11, 5, 390 et esq, 1992).
HIV Tat 및 Nef 단백질은 초기 단백질인데, 즉 이들은 감염 초기에 구조 단백질이 없을 때에 발현된다.
컨퍼런스 발표 (C. David Pauza, Immunization with Tat toxoid attenuates SHIV89.6PD infection in rhesus macaques, 12thCent Gardes meeting, Marnes-La-Coqueete, 1999.10.26)에서, 레서스 (rhesus) 짧은꼬리원숭이를 Tat 톡소이드 단독으로 또는 엔벨로프 당단백질 gp160 백신 배합물과 혼합하여 면역화한 실험 (재조합 백시니아 바이러스 1 용량 및 재조합 단백질 1 용량)을 기술하였다. 그러나, 실험결과는 엔벨로프 당단백질의 첨가가 Tat 단독으로 수행된 실험에 비해 이점이 없음을 보여주었다.
본 발명은 HIV 단백질을 함유하는 약제 및 백신 조성물 중의 HIV 단백질의 신규 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 배합물 중의 HIV Tat 및 HIV gp120 단백질의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 배합물 중의 HIV Nef 및 HIV gp120 단백질의 용도에 관한 것이다.
그러나, 본 발명자들은 Tat- 및/또는 Nef-함유 면역원 (특히, Nef-Tat 융합 단백질)이 인간-유인원 키메라 면역결핍 바이러스 (SHIV)의 병원성 접종으로부터 레서스 원숭이를 보호하는데 gp120과 상승적으로 작용한다는 사실을 발견하였다. 레서스 짧은꼬리원숭이의 SHIV 감염은 인간 AIDS를 위한 가장 적절한 동물 모델로서 간주된다. 따라서, gp120 항원 및 Nef- 및 Tat-함유 항원을 단독으로 또는 혼합하여 함유하는 백신의 보호 효능을 평가하기 위하여 상기 전임상 모델을 사용하였다. 바이러스 감염 및 병원성의 두 개의 표지, 말초혈 내의 CD4-양성 세포의 비율 및 원숭이 혈장의 유리 SHIV RNA 게놈의 농도의 분석은 두 개의 항원이 상승적으로 작용함을 보여준다. gp120 또는 NefTat+SIV Nef 단독으로 면역화하는 것은 애쥬번트 단독으로 면역화하는 것과 비교하여 차이가 없다. 대조적으로, gp120 및 NefTat+SIV Nef 항원의 배합물의 투여는 상기 특정 실험 군의 모든 동물에서 상기 언급된 두 개의 파라미터가 현저하게 개선된 결과를 보였다.
따라서, 본 발명은 HIV gp120과 혼합된 HIV Tat 및/또는 Nef 단백질의 HIV에 대한 인간의 예방 또는 치료를 위한 면역화를 위한 백신의 제조용 신규 용도를 제공한다.
상기 기술한 바와 같이, NefTat 단백질, SIV Nef 단백질 및 gp120 단백질은 함께 NefTat+SIV Nef 또는 gp120가 단독으로 사용되는 경우에 관찰되는 반응에 비하여 향상된 반응을 보인다. 이러한 향상된 반응, 또는 상승효과는 이들 배합된 단백질의 백신접종 후의 바이러스 로드의 감소로 나타난다. 선택적으로 또는 추가적으로, 향상된 반응은 HIV NefTat, SIV Nef 및 HIV gp120으로 백신 접종 하지 않은 경우에 비해 그 자체로 CD4+ 수준이 유지됨을 증명하는 것이다. 상승 효과는 gp120 및 Tat, gp120 및 Nef, 또는 gp120 및 Nef 및 Tat 둘 모두의 배합물로 인한 것이다.
다른 HIV 단백질의 첨가 또한 상승 효과를 향상시키는데, 이는 gp120 및 Tat 및/또는 Nef 사이에서 관찰된다. 또한, 이들 다른 단백질은 gp120, Tat 및/또는 Nef-함유 백신의 개개 구성요소와 상승적으로 작용하고, 원래의 항원 배합물 전체를 필요로 하지 않는다. 추가의 단백질은 HIV의 조절 단백질, 예를 들어 Rev, Vif, Vpu, 및 Vpr이다. 또한, 이들은 HIVgag또는pol유전자로부터 유래된 구조 단백질이다.
HIV gag 유전자는 전구체 단백질 p55를 코딩하고, 이는 자발적으로 비성숙 바이러스-유사 입자 (VLPs)로 집합한다. 다음, 전구체는 단백질분해효소에 의해 주요 구조단백질 p24 (캡시드) 및 p18 (기질), 및 몇 개의 보다 더 작은 단백질로 절단된다. 전구체 단백질 p55 및 이의 주요 유도체 p24 및 p18은 모두 gp120 및 Tat 및/또는 Nef사이에 관찰되는 상승 효과를 향상시키는 적절한 백신 항원으로서 간주된다. 전구에 p55 및 캡시드 단백질 p24는 VLP 또는 단량체 단백질로서 사용된다.
본 발명의 백신의 HIV Tat 단백질은 선택적으로 예를 들어 융합단백질로서 HIV Nef 단백질과 연결되어 있다.
본 발명의 HIV Tat 단백질, HIV Nef 단백질 또는 NefTat 융합단백질은 c-말단 히스티딘 꼬리를 가지고, 이는 바람직하게는 5-10 히스티딘 잔기를 포함한다. 히스티딘 (또는 "His") 꼬리의 존재는 정제를 용이하게 한다.
바람직한 구체예에서, 단백질은 5 내지 10, 바람직하게는 6 히스티딘 잔기를 포함하는 히스티딘 꼬리와 함께 발현된다. 이들은 정제를 용이하게 하여 유리하다. 효모 (Saccharomyces cerevisias)에서 Nef (참고문헌: Macreadie I. G. et al., 1993, Yeast 9(6): 565-573) 및 Tat (참고문헌: Braddock M et al., 1989, Cell 58(2):269-79)의 분리된 발현이 보고된 바 있다. Nef 단백질 및 Gag 단백질 p55 및 p18은 미리스틸화되어 있다 (myristilate). 피치아 (Pichia) 발현 시스템에서 Nef 및 Tat의 분리된 발현 (Nef-His 및 Tat-His 구성물) 및 융합 구조물 Nef-Tat-His의 발현이 문헌(WO 99/16884)에서 기술된 바 있다.
대표적인 Nef-His (Seq. ID. No.s 8 및 9), Tat-His (Seq. ID. No.s 10 및 11) 및 Nef-Tat-His 융합단백질 (Seq. ID. No.s 12 및 13)의 DNA 및 아미노산 서열을 도 1에 도시한다.
본 발명의 HIV 단백질은 이들의 천연 입체구조로 사용되거나, 보다 바람직하게는 백신 용도로 수식된다. 이들 수식은 정제 방법과 관련한 기술적 이유로 인한 것이고, 또는 Tat 또는 Nef 단백질의 하나 또는 몇몇 기능적 특성을 불활성화하기위하여 사용되었다. 이와 같이, 본 발명은 HIV 단백질의 유도체, 예를 들어, 변이된 단백질을 포함한다. "변이된"이란 용어는 본원에서 특정위치돌연변이 또는 임의의 다른 통상적인 방법과 같은 널리 알려진 기술을 사용하여 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가 및 치환된 분자를 의미한다.
예를 들어, 변이체 Tat 단백질은 변이되어 생물학적으로 불활성화되었지만 면역학적 에피토프를 유지하고 있다. 클리먼트 (D.Clement, Tulane University)에 의해 제조된 하나의 가능한 변이된 tat 유전자는 (BH10 분자 클론으로부터 유래) 활성 위치 부위에서의 변이 (Lys41→Ala) 및 RGD 모티프에서의 변이 (motif) (Arg78→Lys 및 Asp80→Glu)를 포함한다 (참고문헌: Virology 235:48-64, 1997).
변이된 Tat는 도 1 (Seq. ID. No.s 22 및 23)에 Nef-Tat 변이체-His (Seq. ID. No.s 24 및 25)로서 도시된다.
본 발명의 백신의 HIV Tat 또는 Nef 단백질을 화학적 방법에 의하여 수식하여 정제과정에서 단백질을 안정화하고 단량체가 되도록 한다. Tat 또는 Nef와 같은 단백질의 산화적 응집을 방지하는 방법은 단백질의 티올 기를 화학적으로 수식하여 사용하는 것이다. 제 1 단계에서 이황화물 가교가 DTT, 베타멀켑토에탄올 또는 글루타티온과 같은 환원제로 처리함에 의하여 환원된다. 제 2 단계에서, 생성된 티올을 알킬화 제제와의 반응에 의하여 차단한다 (예를 들어, 단백질은 요오드아세트아미드를 사용하여 카르복시아미드화/카르바미도메틸화될 수 있다). 상기 화학적 수식은 세포결합분석에 의해 분석된 Tat 또는 Nef의 기능적 특성 및 인간 말초혈 단핵 세포의 림프구 증식의 억제를 수식하지 않는다.
HIV Tat 단백질 및 HIV gp120 단백질은 하기의 실시예에 의해 약술된 방법에 의해 정제되었다.
본 발명의 백신은 Tat 및/또는 Nef 또는 NefTat 및 gp120 항원의 면역보호 또는 면역치료 양을 함유하고, 통상적인 방법에 의하여 제조된다.
백신 제조는 일반적으로 문헌 (New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al 발행, University Park Press, Balitimore, Maryland, U.S.A., 1978)에 기술되어 있다. 예를 들어, 리포솜내로의 피막화는 문헌(Fullerton, 미국 특허 제 4,325,877)에 기술되어 있다. 예를 들어, 단백질과 고분자의 결합은 문헌(Likhite, 미국특허 제 4,372,945) 및 문헌(Armor et al., 미국특허 제 4,474,757호)에 공개되어 있다.
백신 용량내의 단백질 양은 통상적인 백신에서 심각한 부작용 없이 면역 보호 반응을 유발할 수 있는 양으로서 선택된다. 상기 양은 어떤 특이 항원이 적용되는지에 따라 다르다. 일반적으로 각 용량은 각 단백질 1-1000㎍, 바람직하게는 Tat 또는 Nef 또는 NefTat 2-200㎍, 가장 바람직하게는 4-40㎍ 및 바람직하게는 gp120 1- 150㎍, 가장 바람직하게는 2-25㎍을 포함한다. 특정 백신을 위한 최적의 양은 항체 역가 및 피검체의 다른 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인한다. 백신 용량의 특정 예는 NefTat 20㎍ 및 gp120의 5 또는 20㎍을 포함한다. 최초 백신 접종후에, 피검체는 약 4주가 지나서 추가 접종을 받고, 후속하는 제 2 차 추가 접종을 받는다.
본 발명의 단백질은 바람직하게는 본 발명의 백신제형에 애쥬번트로서 첨가된다. 애쥬번트는 일반적으로 문헌(Vaccin Design-the Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman 발행, Pleum Press, New York, 1995)에 기술되어 있다.
적절한 애쥬번트로서 알루미늄 염, 예를 들어, 수산화 알루미늄 겔 (alum) 또는 인산 알루미늄을 포함하고, 칼슘, 철 또는 아연의 염이거나, 아실화된 티로신 또는 아실화된 당, 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도된 폴리사카라이드 또는 포리포스파진의 불용성 현탁액이다.
본 발명의 제형에서, 애쥬번트 조성물은 우선적으로 Th1 반응을 유도하는 것이 바람직하다. 그러나, 다른 체액성 반응을 포함하는 다른 반응을 배제하지 않는 것으로 이해된다.
면역 반응은 면역 시스템의 세포와 항원의 상호작용을 통해 항원에 유발된다. 유발된 면역 반응은 크게 두 개의 카테고리, 체액성 면역 반응 또는 세포 매개 면역 반응(각각 통상적으로 항체 및 효과기 세포의 보호 메카니즘을 특징으로 함)으로 나누어진다. 반응의 상기 카테고리를 Th1-유형 반응 (세포매개 반응) 및 Th2-유형 면역 반응 (체액성 반응)이라고 부른다.
Th1-유형 면역 반응은 항원 특이적, 주조직적합항원염색체 면역제한 (haplotype restriction) 세포독성 T 림프구 및 자연 살상 세포 반응의 유도를 특징으로 한다. 마우스에서 Th1-유형 면역 반응은 종종 IgG2a 서브타입의 항체의 생산을 특징으로 하고, 사람에서 이들은 IgG1 타입 항체의 생산을 특징으로 한다. Th2-유형 면역 반응은 광범위한 마우스 IgG1, IgA, 및 IgM을 포함하는 면역글로불린 이소타입의 생산을 특징으로 한다.
상기 두 가지 유형의 면역 반응의 구동력은 많은 단백질 메신저인 사이토카인이고, 이는 면역 시스템의 세포를 돕고 결과로서 일어나는 면역반응을 Th1 또는 Th2 반응으로 결정하는 역활을 한다. 이와 같이, 높은 수준의 Th1-유형 사이토카인은 해당 항원에 대한 세포 매개 면역 반응을 유도하고, 반면에 높은 수준의 Th2-유형 사이토카인은 항원에 대한 체액성 면역 반응을 유도한다.
Th1 및 Th2-유형 면역 반응의 구별은 절대적인 것이 아니라는 사실을 기억하는 것이 중요하다. 사실, 각각이 Th1 또는 Th2가 우세한 것으로 설명되는 면역 반응을 의미하는 것이다. 그러나, 이는 종종 모스만 (Mosmann) 및 코프만 (Coffman)에 의한 쥐과의 CD4+ve T 세포 클론에 기술된 식으로 사이토카인 군을 고려하는 것이 편리하다 (참고문헌: Mosmann, T.R. and Coffman, R.L., TH1 and Th2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties, Annual Review of Immunology, 7:145-173, 1989). 통상적으로, Th1-유형 반응은 INF-γ및 T-림프구에 의한 IL-2 사이토카인의 생산과 관련된다. Th1-유형 면역 반응의 유도와 직접 관련된 다른 사이토카인, 예를 들어 IL-12는 T-세포에 의해 생산되지 않는다. 대조적으로, Th2-반응은 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 종양 괴사 인자-β(TNF-β)의 분비와 관련된다.
특정 백신 애쥬번트가 특히 Th1 또는 Th2-유형 사이토카인 반응의 자극에 적절하다고 알려져 있다. 통상적으로 백신접종 또는 감염후의 면역 반응의 Th1:Th2 발란스는 항원의 재자극후의 시험관내 T 림프구에 의한 Th1 또는 Th2 사이토카인의생산의 직접적인 측정 및/또는 항원 특이적 항체 반응의 IgG1:IgG2a 비율로 가장 잘 알 수 있다.
이와 같이, Th1-유형 애쥬번트는 분리된 T-세포를 자극하여 시험관내에서 항원으로 재자극한 경우에 높은 수준의 Th1-유형 사이토카인을 생산하고, Th1-유형 이소타입과 관련된 항원 특이적 면역글로불린 반응을 유도하는 것이다.
본 발명의 사용에 적절한 애쥬번트를 생산하기 위하여 제형된 바람직한 Th1-유형 면역자극제가 하기에 포함되고 이에 제한되지 않는다.
모노포스포릴 리피드 A, 특히, 3-디-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A (3D-MPL)은 본 발명의 바람직한 Th1-유형 면역자극제이다. 3D-MPL은 리비 이뮤노켐 (Ribi Immunochem, Montana)에 의하여 제조된 널리 알려진 애쥬번트이다. 화학적으로 이는 종종 4,5,또는 6-아실화된 고리를 가진 3-디-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A의 혼합물로서 제공된다. 이는 문헌(GB 2122204B)에 기술된 방법에 의해 정제되고 제조되며, 이는 또한 디포스포릴 리피드 A 및 이들의 3-O-디아실화된 유도체의 제조물을 기술한다. 다른 정제되고 합성된 리포폴리사카라이드가 기술되어 있다 (참고문헌: 미국 특허 제 6,005,099호 및 EP 0 729 473 B1; Hilgers et al., Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4):392-6, 1986; Immunology 60(1):141-6, 1987; 및 EP 0 549 074 B1). 3D-MPL의 바람직한 형태는 지름 0.2㎍ 미만의 작은 입자 크기를 가지는 특정 제형이고, 이의 제조 방법이 문헌(EP 0 689 454)에 기술되어 있다.
또한, 사포닌은 본 발명에 따른 바람직한 Th1 면역자극제이다. 사포닌은 잘알려진 애쥬번트이고 문헌(Lacaille-Dubois, M 및 Wagner H., A review of the biological and pharmacological activities of saponons, Phytomedicine vol 2: 363-386, 1996)에 기술되어 있다. 예를 들어, 퀼 A (Quil A, 남아프리카 나무 퀴라자 사포나리아 모리나의 나무 껍질에서 유래됨) 및 이들의 분획이 미국 특허 제 5,057,540호 및 문헌("Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 12(1-2):1-55, 1996) 및 EP 0 362 279 B1에 기술되어 있다. 용혈성 사포닌 QS21 및 QS17 (퀼 A의 HPLC에 의해 정제된 분획)은 효능있는 전신적 애쥬번트로서 기술되어 있고, 이들의 생산방법은 미국 특허 제 5,057,540호 및 EP 0 362 279 B1에 기술되어 있다. 또한, 이들 참고 문헌에는 Q27 (퀼 A의 비용혈성 분획)의 전신적인 백신의 효능 있는 애쥬번트로서 작용하는 용도가 기술되어 있다. QS21의 용도는 또한 문헌(Kensil et al., J. Immunology 146: 431-437, 1991)에 기술되어 있다. 또한, QS21 및 폴리소르베이트 또는 시클로덱스트린의 배합물이 널리 알려져 있다 (참고문헌: WO 99/10008). 퀼 A의 분획, 예를 들어 QS21 및 QS7을 포함하는 특정 애쥬번트 시스템은 문헌(WO 96/33739 및 WO 96/11711)에 기술되어 있다.
또 다른 바람직한 면역자극제는 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드 ("CpG")를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드이다. CpG는 DNA에 존재하는 시토신-구아노신 디뉴클레오티드 모티브의 약자이다. CpG는 전신 및 점막 경로에 의해 투여되는 경우에 애쥬번트로서 당기술분야에 알려져 있다 (참고문헌: WO 96/02555, EP 468520, Davis et al., J. Immonol, 1998, 160(2):870-876;McCluskie 및 Davis, J. Immunol., 1998, 161:(9):4463-6). 역사적으로 BCG의 합성 분획은 항-종양 효능을 가진다고 알려져 있다. 추가의 연구에서, BCG로부터 유도된 합성 뉴크레오티드는 면역자극성 효능 (시험관내 또는 체내)을 야기할 수 있음이 알려졌다. 이들 연구의 저자는 중앙에 CG 모티브를 포함하는 특정 앞뒤상동 서열이 상기 활성을 보인다고 결론내렸다. 면역 자극의 CG 모티브의 주요 역활은 후에 크리그에 의해서 밝혀졌다 (참고문헌: Krieg, Nature 374:546, 1995). CG 모티브가 특정 서열 환경에 있어야 하고, 이러한 서열이 박테리아 DNA에서는 공통적이지만 척추동물 DNA에서는 드물다는 상세한 분석이 행해졌다. 면역자극성 서열은 종종, 퓨린, 퓨린, C, G, 피리미딘, 피리미딘이고, 여기서 CG 모티브는 메틸화되지 않고, 다른 메틸화되지 않은 CpG 서열은 면역자극성을 가지는 것으로 알려져 있고 본 발명에서 사용된다.
6개의 뉴클레오티드의 특정 조합에서, 앞뒤상동 서열이 존재한다. 이들 모티브의 몇몇은 하나의 모티브의 반복 또는 다른 모티브의 조합으로서 동일한 올리고뉴클레오티드에 존재한다. 올리고뉴클레오티드를 함유하는 하나 이상의 이들 면역자극성 서열의 존재는, 자연 살상 세포 (인터페론 γ을 생산하고 세포용해 활성을 가짐) 및 마크로파지 (참고문헌: Wooldrige et al., vol 89 (no. 8), 1977)를 포함하는 다양한 면역 서브셋을 활성화한다. 또한, 서열을 함유하나 이의 공통 서열 (consensus sequence)을 가지지 않는 다른 메틸화되지 않은 CpG는 면역조절제로서 알려져 있다.
백신에 제형되는 경우에, CpG는 일반적으로 유리 항원과 함께 유리 용액으로투여되거나 (참고문헌: WO 96/02555, McCluskie 및 Davis, supra) 공유결합에 의해 항원에 결합되어 투여되거나 (참고문헌: WO 98/16247), 또는 수산화 알루미늄 같은 운반체와 함께 제형된다 (참고문헌: (Hepatitis surface antigen) Davis et al. supra; Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acd. Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8).
상기에 기술된 면역자극제는 운반체, 예를 들어 리포솜, 수중유 (oil in water) 에멀젼, 및/또는 알루미늄 염 (예를 들어 수산화 알루미늄)을 포함하는 금속염과 함께 제형된다. 예를 들어, 3D-MPL은 알루미늄 하이드록사이드 (참고문헌: EP 0 689 454) 또는 수중유 (oil in water) 에멀젼 (참고문헌: WO 95/17210)과 함께 제형되고; QS21은 리포솜을 함유하는 콜레스테롤 (참고문헌: WO 96/33739), 수중유 (oil in water) 에멀젼 (참고문헌: WO 95/17210), 또는 백반 (참고문헌: WO 98/15287)과 함께 제형되는 것이 유리하고; CpG는 백반 (참고문헌: Davis et al., supra; Brazolot-Millan supra) 또는 다른 양이온 운반체로 제형된다.
또한, 면역자극제의 조합, 특히, 모노포스포릴 리피드 A 및 사포닌 유도체의 조합 (참고문헌: WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 99/12565; WO 99/11241), 보다 더 상세하게는 문헌(WO 94/00153)에 공개된 QS21 및 3D-MPL의 조합이 바람직하다. 선택적으로, CpG 및 QS21과 같은 사포닌의 조합 또한 본 발명의 효능있는 애쥬번트를 형성한다.
이와 같이, 적절한 애쥬번트 시스템은 예를 들어, 알루미늄 염과 함께 모노포스포릴 리피드 A, 바람직하게는 3D-MPL의 조합을 포함한다. 향상된 시스템은 모노포스포릴 리피드 A 및 사포닌 유도체의 조합, 특히 문헌(WO 94/00153)에서 공개된 QS21 및 3D-MPL의 조합, 또는 문헌(WO 96/33739)에 공개된 납와 같이 리포솜을 함유하는 콜레스테롤내에 갇힌 QS21의 보다 적은 반응원성을 가지는 조성물을 포함한다.
QS21, 3D-MPL 및 수중유 (oil in water) 에멀젼중의 토코페롤을 포함하는 특히 효능있는 애쥬번트 제형은 문헌(WO 95/17210)에 기술되어 있고, 본 발명의 사용을 위한 다른 바람직한 제형이다.
또 다른 바람직한 제형은 CpG 올리고뉴클레오티드를 단독으로 또는 알루미늄 염과 함께 포함한다.
본 발명의 또 다른 면에서, 백신은 하나 이상의 Tat, Nef 및 gp120 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하여, 폴리펩티드는 그 자리에서 생산된다. DNA는 당업자에 알려진 다양한 임의의 운반시스템 내에 존재하고, 이는 플라스미드 DNA, 박테리아 및 바이러스 발현 시스템과 같은 핵산을 포함한다. 많은 유전자 전달 기술은 당업자에게 잘 알려져 있고, 이들은 문헌 (Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier System 15: 143-198, 1998) 및 본원에서 인용된 문헌에 기술되어 있다. 적절한 핵산 발현 시스템은 환자내에서 발현을 위해 필요한 DNA 서열 (적절한 프로모터 및 종결 신호)을 함유한다. 발현 시스템은 살아있는 재조합 미생물, 예를 들어, 바이러스 또는 박테리아인 경우에, 대상 유전자는 살아있는 재조합 바이러스 또는 박테리아에 삽입된다. 상기 살아 있는 벡터의 접종 및 생체내 감염은 항원의 생체내 발현 및 면역 반응의 유도를 유발한다. 이러한 목적으로 사용되는 바이러스 및 박테리아는 하기의 예와 같다: 폭스바이러스 [예: 백시니아, 조류폭스바이러스, 카나리폭스, 수식된 폭스바이러스 예를 들어, 수식된 바이러스 안카라(ankara) (MVA)], 알파바이러스 [신디비스 바이러스, 세밀키 포레스트 바이러스 (Semilki Forest Virus), 베네수엘라 에퀸 뇌염 바이러스 (Venezuelian Equine Encephalitis virus)], 플라비바이러스 (황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스), 아데노 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 피코르나바이러스 (폴리오 바이러스, 리노바이러스), 헤르페스바이러스 (수두 대상 포진 바이러스 등), 리스테리아, 살모넬라, 시겔라, 네이세리아, BCG. 상기 바이러스 및 박테리아는 독성이 있거나, 살아있는 백신을 얻기 위하여 다양한 방법으로 약독화되었다. 또한, 상기 살아있는 백신은 본 발명의 부분을 형성한다.
이와 같이, 본 발명에 따른 바람직한 백신의 Nef, Tat 및 gp120 구성요소는 필요한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 형태로 제공된다.
또한, 본 발명에 따른 면역화는 단백질 및 DNA-기초한 제형의 배합물로 수행된다. 감작-추가 접종 (prime-boost) 면역화는 광범위한 면역 반응을 유도하는데 효과적이다. 애쥬번트가 첨가된 단백질 백신은 주요하게 항체 및 T 헬퍼 면역 반응을 유도하고, 반면에 플라스미드 또는 살아 있는 벡터로서 DNA의 운반은 강한 세포독성 림프구 (CTL) 반응을 유도한다. 이와 같이, 단백질 및 DNA 백신의 배합은 다양한 면역 반응을 제공한다. 특히 HIV의 환경에 적절한데, 이는 항체 및 CTL 둘 모두의 중화는 HIV에 대한 면역 방어에 중요하다고 생각되기 때문이다.
본 발명에 따르면, gp120, Nef 및 Tat 단독으로 또는 혼합하여 백신접종하는계획은 단백질 항원 및 상기 언급된 단백질을 코딩하는 DNA의 연쇄적인 ("감작 추가 접종") 또는 동시 접종을 포함한다. DNA는 플라스미드 DNA 또는 살아있는 재조합 벡터의 형태, 예를 들어 폭스바이러스 벡터 또는 본원에서 기술된 임의의 다른 살아있는 벡터의 형태로 운반된다. 단백질 항원이 1회 또는 수회 접종된 후에 1회 이상의 DNA 투여되거나, DNA가 먼저 1회 이상 투여되고 그 후에 1회 이상의 단백질 면역화가 수행된다.
본 발명에 따른 감작 추가 접종 면역화의 특정 예는 살아있는 재조합 벡터, 예를 들어 수식된 폭스바이러스벡터, 예를 들어 수식된 바이러스 안카라 (MVA), 또는 알파바이러스, 예를 들어 베네수엘라 에퀸 뇌염 바이러스의 형태로 DNA를 감작하고, 다음에 단백질, 바람직하게는 애쥬번트가 첨가된 단백질로 추가접종되는 것을 포함한다.
이와 같이, 본 발명은 하기의 약제학적 키트를 추가로 제공하고:
a) 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 하나 이상의 gp120, Nef 및 Tat 단백질을 포함하는 조성물; 및
b) 약제학적으로 허용되는 부형재와 함께 하나 이상의 gp120, Nef 및 Tat-인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물;
이 경우에, 하나 이상의 (a) 또는 (b)는 Nef 및/또는 Tat 및/또는 Nef-Tat와 함께 gp120을 포함한다. 조성물 a) 및 b)는 임의의 순서로, 별도로 또는 함께 투여된다. 바람직하게는 a)는 gp120, Nef 및 Tat 단백질의 세개 모두를 포함한다. 바람직하게는 b)는 gp120, Nef 및 Tat DNA 세 개 모두를 포함한다. 가장 바람직하게는 Nef 및 Tat는 NefTat 융합 단백질의 형태이다.
본 발명의 추가의 면에서, 본원에 기술된 백신 제형의 제조방법을 제공하고, 여기서 제조방법은 본 발명에 따른 단백질의 조합을 혼합하는 것을 포함한다. 단백질 조성물은 적절한 애쥬번트와 혼합되고, 선택적으로 운반체와 혼합된다.
본 발명에 따른 제형의 사용을 위한 특히 바람직한 애쥬번트 및/또는 운반체 조합은 하기와 같다:
ⅰ) 3D-MPL + DQ중의 QS21
ⅱ) 백반 + 3D-MPL
ⅲ) 백반 + DQ중의 QS21 +3D-MPL
ⅳ) 백반 + CpG
ⅴ) 3D-MPL + DQ중의 QS21 + 수중유 (oil in water) 에멀젼
ⅵ) CpG
본 발명은 하기의 실시예 및 도면에서 설명된다:
일반
Bru/Lai 분리주의 Nef 유전자 (참고문헌: Cell 40: 9-17, 1985)는 실험 설계를 위해 선택되었는데, 이는 이 유전자가 공통 Nef과 밀접하게 관련되어 있는 것 중 하나이기 때문이다.
Bru/Lai Nef 유전자를 위한 출발 물질은 동물 발현 벡터 pcDNA3 (pcDNA3/Nef)에서 클론된 1170bp DNA 단편이다.
Tat 유전자는 BH 분자 클론으로부터 유래되었다. 상기 유전자는 pCV1이라고 명명된 HTLV Ⅲ cDNA 클론으로서 제공받았고, 이는 문헌(Science 229:69-73,1985)에 기술되어 있다.
Nef 및 Tat 유전자의 발현은 피치아 또는 임의의 다른 숙주에서 행해졌다.
실시예 1:피치아 파스토리스에서의 HIV-1 Nef 및 Tat 서열의 발현
Nef 단백질, Tat 단백질 및 융합 Nef-Tat는 알코올 옥시다제 (AOX1) 유도 프로모터의 조절하에 호메틸성 (methylotrophic) 효모피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현되었다. 이들 HIV-1 유전자를 발현하기 위하여 삽입 벡터 (integrative vector) PHIL-D2의 수식된 버젼 (INVITROGEN)이 사용되었다. 이들 벡터는, AOX1 유전자의 천연 ATG 코돈 바로 뒤에 이형 단백질의 발현이 시작되는 방식으로 수식되었고, 이들은 1개의 글리신 및 6개의 히스티딘 잔기의 꼬리를 가지는 재조합 단백질을 생산한다. 이들 PHIL-D2-MOD 벡터는 PHIL-D2 벡터의 인접한 AsuⅡ 및 EcoRI 위치 사이에 올리고뉴클레오티드 연결자를 클로닝하여 제조된다 (도 2 참조). His 꼬리에 더하여, 이들 연결자는 NcoI, SpeI 및 XbaI 절단 부위를 가지고, 이 사이에 Nef, Tat 및 Nef-Tat 융합단백질이 삽입된다.
1.1 삽입 벡터 pRIT14597 (Nef-His 단백질을 코딩), pRIT14598 (Tat-His 단백질을 코딩) 및 pRIT14599 (융합 Nef-Tat-His를 코딩)의 제조
Nef 유전자를 프라이머 01 및 02로 pcDNA3/Nef 플라스미드로부터 PCR에 의해 증폭하였다.
획득된 PCR 단편 및 삽입 PHIL-D2-MOD 벡터를 둘다 NcoI 및 SpeI에 의해 제한효소로 절단하고, 아가로스젤에서 정제하고, 연결 (ligation)하여 삽입 플라스미드 pRIT14597을 생성하였다 (도 2 참조).
Tat 유전자를 프라이머 05 및 04로 pCV1 플라스미드의 유도체로부터 PCR에 의해 증폭하였다.
NcoI 절단 부위는 PCR 단편의 5'말단에 도입되었고, SpeI 부위는 프라이머 04를 가진 3'말단에 도입되었다. 획득된 PCR 단편 및 PHIL-D2-MOD 벡터를 둘다 NcoI 및 SpeI에 의해 절단하고, 아가로스 젤에서 정제하고 연결시켜 삽입 벡터 pRIT14598을 생성하였다.
pRIT14599를 제조하기 위하여, Nef-Tat-His 코딩 서열에 해당하는 910bp DNA 단편을 EcoRI 비점착성 말단 및 PHIL-D2-MOD 벡터 사이를 연결시켰다 (T4 폴리머레이즈). Nef-Tat-His 코딩 단편을 Xbal 비점착성 말단 (T4 폴리머레이즈) 및 pRIT14596의 NcoI 소화에 의하여 획득하였다.
1.2 피치아 파스토리스 균주 GS115(His4)의 형질전환
Nef-His, Tat-His 및 융합 Nef-Tat-His를 발현하는피치아 파스토리스균주를 얻기 위하여, 균주 GS115를 개별 발현 카세트 및 HIS4 유전자를 가지는 선형 NotI 단편으로 형질전환시켜 숙주 게놈에 His4를 보완하였다. NotI-선형 단편 을 이용한 GS115의 형질전환은 AOXI 유전자좌에서 재조합을 용이하게 한다.
멀티카피 삽입 클론을 정량 점적 분석에 의하여 선택하고, 인테그레이션 (integration), 삽입 (insertion) (Mut+형질) 또는 이식 (Muts형질)의 유형을 결정하였다.
각 형질전환체로부터, 재조합 단백질의 고생산 수준을 보이는 하나의 형질전환체를 선택하였다:
재조합 Nef-His 단백질, 하기로 구성된 미리스틸화된 215 아미노산 단백질을 생산하는 균주 Y1738 (Mut+형질):
ㆍ 미리스틴산
ㆍ 메티오닌, PHIL-D2-MOD 벡터의 NcoI 클로닝 부위를 사용하여 생성.
ㆍ Nef 단백질의 205 a.a. (a.a.2로 시작하여 a.a.206으로 연장)
ㆍ 클로닝 방법에 의해 생성된 트레오닌 및 세린 (PHIL-D2-MOD 벡터의 SpeI부위에서 클로닝)
ㆍ 1개의 글리신 및 6개의 히스티딘
Tat-His 단백질, 하기로 구성된 95 아미노산 단백질을 생산하는 균주 Y1739(Mut+형질):
ㆍ NcoI 클로닝 부위를 사용하여 생성된 메티오닌
ㆍ Tat 단백질의 85 a.a. (a.a. 2로부터 출발하여 a.a. 86으로 연장)
ㆍ 클로닝 방법에 의하여 도입된 트레오닌 및 세린
ㆍ 1개의 글리신 및 6개의 히스티딘
재조합 Nef-Tat-His 융합 단백질, 하기로 구성된 미리스틸화된 302 아미노산 단백질을 생산하는 균주 Y1737 (Muts형질):
ㆍ 미리스틴산
ㆍ NcoI 클로닝 부위를 사용하여 생성된 메티오닌
ㆍ Nef 단백질의 205 a.a. (a.a. 2로부터 출발하여 a.a. 206으로 연장)
ㆍ 클로닝 방법에 의하여 생성된 트레오닌 및 세린
ㆍ Tat 단백질의 85 a.a. (a.a. 2로부터 출발하여 a.a. 86으로 연장)
ㆍ 클로닝 방법에 의하여 도입된 트레오닌 및 세린
ㆍ 1개의 글리신 및 6개의 히스티딘
실시예 2: 피치아 파스토리스에서 HIV-1 Tat-변이체의 발현
변이체 재조합 Tat 단백질을 또한 발현시켰다. 변이체 Tat 단백질은 면역원성 에피토프를 유지하면서 생물학적으로 불활성해야 한다.
D. 클리먼트 (Tulane University)에 의해서 제조된 이중 변이체 Tat 유전자는 이들 구성물을 위하여 선택했다.
상기 tat 유전자 (BH10 분자 클론으로부터 유래됨)는 활성 부위 영역 (Lys41→Ala) 및 RGD 모티브 (Arg→Lys 및 Asp80→Glu)에서 변이되었다 (참고문헌: Virology 235: 48-64, 1997).
변이체 tat 유전자를 CMV 발현 벡터 플라스미드 (pCMVLys41/KGE)내에서 EcoRI 및 HindⅢ 부위사이에 서브클론된 cDNA 단편으로서 결합시켰다.
2.1 삽입 벡터의 제조
pRIT14912 (Tat 변이체-His 단백질을 코딩) 및 pRIT14913 (융합 Nef-Tat 변이체-His를 코딩)
tat 변이체 유전자를 프라이머 05 및 04로 pCMVLys41/KGE 플라스미드로부터 PCR에 의해 증폭시켰다 (1.1 pRIT14598의 제조를 참조).
NcoI 절단 부위를 PCR 단편의 5'말단에 도입하였고, SpeI 부위를 프라이머 04를 가진 3'말단에 도입하였다. 획득된 PCR 단편 및 PHIL-D2-MOD 벡터를 둘다 NcoI 및 SpeI로 절단하여, 아가로스젤에서 정제하고, 연결하여 삽입 플라스미드 pRIT14912를 생성하였다.
pRIT14912를 제조하기 위하여, tat 유전자를 프라이머 03 및 04로 pCMVLys41/KGE플라스미드로부터 PCR에 의해서 증폭하였다.
획득된 PCR 단편 및 플라스미드 pRIT14597 (Nef-His 단백질을 발현)를 SpeI 제한효소에 의해 소화시키고, 아가로스젤에서 정제하고, 연결하여 삽입 플라스미드 pRIT14913를 생성하였다.
2.2 피치아 파스토리스 균주 GS115의 형질전환
Tat 변이체-His 단백질 및 융합 Nef-Tat 변이체-His를 발현하는피치아 파스토리스균주를 1.2에서 기술된 인테그레이션 및 재조합 균주 선택 방법을 적용하여 획득하였다.
95 아미노산 단백질인 Tat-변이체-His 단백질을 생산하는 두개의 재조합 균주를 선택하였다: Y1775 (Mut+형질) 및 Y1776 (Muts형질).
302 아미노산 단백질인 Nef-Tat 융합 단백질을 발현하는 재조합 균주를 선택하였다: Y1774 (Mut+형질).
실시예 3:재조합 Tat-His를 생산하는 피치아 파스토리스의 발효
통상적인 방법은 하기의 표에 기술된다.
발효는 고밀도 세포 배양에 이르는 증식 단계 (적절한 곡선에 따른 글리세롤-기초 배지 공급) 및 유도 (induction) 단계 (메탄올 및 염/미량성분 용액을 공급)를 포함한다. 발효기간동안, 시료를 취하여 620nm에서 흡광도를 측정하여 증식을 관찰하였다. 유도 단계에서, 메탄올을 펌프에 의하여 첨가하고 이의 농도를 가스 크로마토그래피 (배양 시료에 대한) 및 질량 분광계가 장착된 온-라인 가스 분석에 의하여 모니터링하였다. 발효 후에, 세포를 2-8℃에서 30분동안 5020g로 원심분리하여 회수하여 세포 페이스트를 -20℃에 저장하였다. 추가적인 작업을 위하여 세포 페이스트를 해동하고 완충액 (Na2HPO4 pH7 50mM, PMSF 5%, 이소프로파놀 4mM)중에 150 OD (620nm)로 재현탁하여, DynoMill에서 4패시지 (passage)에서 파쇄하였다 (룸 0.6L, 3000rpm, 6L/H, 비드 지름 0.40-0.70mm).
발현여부를 평가하기 위하여, 유도단계동안 시료를 제거하고, 파쇄하여 SDS-Page 또는 웨스턴 블랏에 의하여 분석하였다. SDS-겔을 염색한 코마시 블루로, 재조합 Tat-His를 약 72-96H 유도 후에 최대 강도를 나타내는 짙은 밴드로서 명확하게 동정하였다.
작업 시드(seed) 바이얼의 해동
↓
고체 전배양30℃, 14-16H 합성 배지: YBN + 글루코오스 + 한천
↓
두개의 2L 삼각플라스크에서의 액체 전배양30℃, 200rpm 합성 배지: 2×400㎖ YBN + 글리세롤OD>1 (620nm에서)일때 멈춤
↓
20L 배양기로의 접종 5L 초기 배지 (FSC006AA)3㎖ 소포제 SAG471 (Witco에서 구입)설정 값:온도 30℃초과압력 0.3barg공기 흐름 20NI/min용해 O2>40%으로 조절pH NH4OH에 의해 5로 조절
↓
유가 (fed bach) 배양 : 증식단계기간: 약 40H 글리세롤-기초 배지 FFB005AA를 공급200 내지 500 OD (620nm)로 최종 OD
유가 배양 : 유도 단계기간: 97H 이하 메탄올 및 염/미량원소 용액을 공급 (FSE021AB)
↓
원심분리 5020g/30분/2-8℃
↓
세포페이스트를 회수하여 -20℃에서 저장
↓
세포를 해동시키고 완충액중에 OD 150 (620nm)로 재현탁 완충액: Na2HPO4 pH7 50mM, PMSF 5%이소프로파놀 4mM
↓
Dyno-mill에서 세포 파쇄4 패시지 Dyno-mill: (룸 0.6L, 3000rpm, 6L/H, 비드 지름 0.04-0.70mm)
↓
추출/정제 단계로 이전
발효에 사용된 배지:
고체 전배양: (YNB + 글루코오스 + 한천)
글루코오스 10 g/l Na2MoO4.2H2O 0.0002g/l 엽산 0.000064g/l
KH2PO4 1g/l MnSO4.H2O 0.0004g/l 이노시톨 0.064g/l
MgSO4.7H2O 0.5g/l H3BO3 0.0005g/l 피리독신 0.008g/l
CaCl2.2H2O 0.1g/l KI 0.0001g/l 티아민 0.008g/l
NaCl 0.1g/l CoCl2.6H2O 0.00009g/l 니아신 0.000032g/l
FeCl3.6H2O 0.0002g/l 리보플라빈 0.000016g/l 판토테네이트 Ca 0.008g/l
CuSO4.5H2O 0.00004g/l 바이오틴 0.000064g/l 파라-아미노벤조산 0.000016g/l
ZnSO4.7H2O 0.0004g/l (NH4)2SO4 5g/l 한천 18g/l
액체 전배양 (YNB + 글리세롤)
글루코오스 2% (v/v) Na2MoO4.2H2O 0.0002g/l 엽산 0.000064g/l
KH2PO4 1g/l MnSO4.H2O 0.0004g/l 이노시톨 0.064g/l
MgSO4.7H2O 0.5g/l H3BO3 0.0005g/l 피리독신 0.008g/l
CaCl2.2H2O 0.1g/l KI 0.0001g/l 티아민 0.008g/l
NaCl 0.1g/l CoCl2.6H2O 0.00009g/l 니아신 0.000032g/l
FeCl3.6H2O 0.0002g/l 리보플라빈 0.000016g/l 판토테네이트 Ca 0.008g/l
CuSO4.5H2O 0.00004g/l 바이오틴 0.000064g/l 파라-아미노벤조산 0.000016g/l
ZnSO4.7H2O 0.0004g/l (NH4)2SO4 5g/l
초기 배양 충전: (FSC006AA)
(NH4)2SO4 6.4g/l Na2MoO4.2H2O 2.04㎎/l
KH2PO4 9g/l MnSO4.H2O 4.08㎎/l
MgSO4.7H2O 4.7g/l H3BO3 5.1㎎/l
CaCl2.2H2O 0.94g/l KI 1.022㎎/l
FeCl3.6H2O 10㎎/l CoCl2.6H2O 0.91㎎/l
HCl 1.67㎎/l NaCl 0.06g/l
CuSO4.5H2O 0.408㎎/l 바이오틴 0.534㎎/l
ZnSO4.7H2O 4.08㎎/l
증식단계에 사용된 공급 용액 (FFB005AA)
글리세롤 38.7% (v/v) Na2MoO4.2H2O 5.7㎎/l
MgSO4.7H2O 13g/l CuSO4.5H2O 1.13㎎/l
CaCl2.2H2O 2.6g/l CoCl2.6H2O 2.5㎎/l
FeCl3.6H2O 27.8㎎/l H3BO3 14.2㎎/l
ZnSO4.7H2O 11.3㎎/l 바이오틴 1.5㎎/l
MnSO4.H2O 11.3㎎/l KI 2.84㎎/l
KH2PO4 24.93g/l NaCl 0.167g/l
유도단계동안 사용된 염 및 미량원소 공급 용액 (FSE021AB)
KH2PO4 45g/l Na2MoO4.2H2O 10.2㎎/l
MgSO4.7H2O 23.5g/l MnSO4.H2O 20.4㎎/l
CaCl2.2H2O 4.70g/l H3BO3 25.5㎎/l
NaCl 0.3g/l KI 5.11㎎/l
HCl 8.3㎖/l CoCl2.6H2O 4.55㎎/l
CuSO4.5H2O 2.04㎎/l FeCl3.6H2O 50.0㎎/l
ZnSO4.7H2O 20.04㎎/l 바이오틴 2.70㎎/l
실시예 4:Nef-Tat-His 융합단백질의 정제 (피치아 파스토리스)
정제 단계를 재조합피치아 파스토리스세포 146g (습윤 중량) 또는 2L Dyno-mill 파쇄액 OD 55로부터 시작하였다. 크로마토그래피 단계를 실온에서 수행하였다. 단계 사이에, Nef-Tat 양성 분획을 저온실 (+4℃)에서 밤새 보관하였다; 더 긴 시간동안 시료를 -20℃에서 냉동시켰다.
피치아 파스토리스 세포146g
↓
파쇄 (homogenization): 완충액: 2L 50mM PO4pH 7.0; 최종 OD: 50
↓
Dyno-mill 파쇄(4 패시지)
↓
원심분리: JA10로터/9500rpm/30분/실온
↓
Dyno-mill 펠릿 (pellet)
↓
세척 (1h-4℃):완충액: +2L 100mM PO4pH7.5-150mM-NaCl 0.5% 엠피젠
↓
원심분리: JA10로터/9500rpm/30분/실온
↓
펠릿
↓
용해 (O/N-4℃): 완충액: +660㎖ 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-4.0M GuHCl
↓
환원 (4H-실온-암실에서):
+0.2M 2-메르캅토에탄설폰산, 나트륨염 (분말 첨가)/인큐베이션 전에 pH를 7.5로 조절 (0.5 NaOH 용액)
↓
카르바미도메틸레이션 (1/2h-실온-암실에서):
+0.25 요오드아세트아미드 (분말 첨가)/인큐베이션 전에 pH를 7.5로 조절 (0.5 NaOH 용액)
↓
Ni ++ -NTA-아가로스상의 고정화 금속이온 흡착 크로마토그래피 (키아젠(Qiagen)-수지 30㎖):
평형 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-4.0M GuHCl
세척 완충액:
1) 평형 완충액
2) 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아
3) 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아-25mM 이미다졸
용출 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아-0.5M 이미다졸
↓
희석: 18mS/cm2의 이온강도로 희석; 희석 완충액: 10mM PO4pH 7.5-6.0M 유레아
↓
SP 세파로오스 FF상의 양이온 교환 크로마토그래피 (파마시아-수지 30㎖):
평형 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아
세척 완충액:
1) 평형 완충액
2) 10mM PO4pH 7.5-250mM NaCl-6M 유레아
용출 완충액: 10mM 보레이트 pH 9.0-2M NaCl-6M 유레아
↓
농축: 5㎎/㎖로 농축; 10kDa 오메가 멤브레인 (필트론)
↓
수퍼덱스200 XK 16/60상의 겔 여과 크로마토그래피 (파마시아-수지 120㎖)
용출 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아
5㎖ 시료/주입→5회 주입
↓
투석 (O/N-4℃): 완충액: 10mM PO4pH 6.8-150mM NaCl-0.5M 아르기닌*
↓
멸균 여과: Millex GV 0.22㎛
*비: 1600㎍/㎖의 단백질 농도당 0.5M 아르기닌
순도
SDS-PAGE에 의해 측정되는 순도의 수준은 다이치 (Daiichi) 은 염색에 의해 도 3에 도시되고, 코마시 블루 G250에 의해 도 4에 도시된다.
수퍼덱스200 단계 후 > 95%
투석 및 멸균 여과 단계 후 > 95%
회수
Nef-Tat-His 단백질의 51㎎이 재조합 피치아 파스토리스 세포 146g로부터 정제되었다 (=2L Dyno-mill 파쇄물 OD 55).
실시예 5:피치아 파스토리스의 산화된 Nef-Tat-His 융합 단백질의 정제
정제 단계를 재조합피치아 파스토리스세포의 73g (습윤 중량) 또는 1LDyno-mill 파쇄물 OD 50로부터 시작하였다. 크로마토그래피 단계를 실온에서 수행하였다. 단계 사이에, Nef-Tat 양성 분획을 저온(+4℃)에서 밤새 보관하고; 더 긴 시간동안 시료를 -20℃에서 냉동시켰다.
피치아 파스토리스 73g
↓
파쇄 (homogenization): 완충액: 1L 50mM PO4pH 7.0-페화블록(Pefabloc); 최종 OD: 50
↓
Dyno-mill 파쇄(4 패시지)
↓
원심분리: JA10로터/9500rpm/30분/실온
↓
Dyno-mill 펠릿
↓
세척 (2h-4℃): 완충액: +1L 10mM PO4pH7.5-150mM NaCl-0.5% 엠피젠
↓
원심분리: JA10로터/9500rpm/30분/실온
↓
펠릿
↓
용해 (O/N-4℃): 완충액: +330㎖ 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-4.0M GuHCl
↓
Ni ++ -NTA-아가로스상의 고정화 금속이온 흡착 크로마토그래피 (키아젠-수지 15㎖):
평형 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-4.0M GuHCl
세척 완충액:
1) 평형 완충액
2) 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아
3) 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아-25mM 이미다졸
용출 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아-0.5M 이미다졸
↓
희석: 18mS/cm2의 이온강도로 희석; 희석 완충액: 10mM PO4pH 7.5-6M 유레아
↓
SP 세파로오스 FF상의 양이온 교환 크로마토그래피 (파마시아-수지 7㎖):
평형 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6.0M 유레아
세척 완충액:
1) 평형 완충액
2) 10mM PO4pH 7.5-250mM NaCl-6M 유레아
용출 완충액: 10mM 보레이트 pH 9.0-2M NaCl-6M 유레아
↓
농축: 0.8㎎/㎖로 농축; 10kDa 오메가 멤브레인 (필트론)
↓
투석 (O/N-4℃): 완충액: 10mM PO4pH 6.8-150mM NaCl-0.5M 아르기닌
↓
멸균 여과: Millex GV 0.22㎛
→SDS-PAGE에 의해 측정되는 순도의 수준은 도 5에 도시된다 (다이치 은 염색, 코마시 블루 G250, 웨스턴 블랏팅):
투석 및 멸균 여과 단계 후 > 95%
→회수 (단백질 비색측정법에 의해 측정: DOC TCA BAC)
산화된 Nef-Tat-His 단백질 2.8㎎를 재조합 피치아 파스토리스 세포 73g(습윤 중량) 또는 Dyno-mill 파쇄물 OD 50 1L로부터 정제하였다.
실시예 6: 환원된Tat-His 단백질 (피치아 파스토리스)의 정제
정제 단계를 재조합 피치아 파스토리스 세포 (습윤 중량) 160g 또는 2L Dyno-mill 파쇄물 OD 66으로부터 시작하였다. 크로마토그래피 단계를 실온에서 수행하였다. 단계 사이에, Tat 양성 분획을 저온실 (+4℃)에서 밤새 보관하고; 더긴 시간동안 시료를 -20℃에서 냉각시켰다.
피치아 파스토리스 160g
↓
파쇄 (homogenization): 완충액: +2L 50mM PO4pH 7.0-4mM PMSF; 최종 OD: 66
↓
Dyno-mill 파쇄(4 패시지)
↓
원심분리: JA10로터/9500rpm/30분/실온
↓
Dyno-mill 펠릿
↓
세척 (1h-4℃): 완충액: +2L 10mM PO4pH7.5-150mM NaCl-1% 엠피젠
↓
원심분리: JA10로터/9500rpm/30분/실온
↓
펠릿
↓
용해 (O/N-4℃): 완충액: +660㎖ 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-4.0M GuHCl
↓
원심분리: JA10로터/9500rpm/30분/실온
↓
환원 (4H-실온-암실에서):
+0.2M 2-메르캅토에탄설폰산, 나트륨염 (분말 첨가)/인큐베이션 전에 pH를 7.5로 조절 (1M NaOH 용액)
↓
카르바미도메틸레이션 (1/2h-실온-암실에서):
+0.25 요오드아세트아미드 (분말 첨가)/인큐베이션 전에 pH를 7.5로 조절 (1M NaOH 용액)
↓
Ni ++ -NTA-아가로스상의 고정화 금속이온 흡착 크로마토그래피 (키아젠(Qiagen)-수지 60㎖):
평형 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-4.0M GuHCl
세척 완충액:
1) 평형 완충액
2) 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아
3) 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아-35mM 이미다졸
용출 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아-0.5M 이미다졸
↓
희석: 12mS/cm의 이온강도로 희석; 희석 완충액: 20mM 보레이트 pH 8.5-6M 유레아
↓
SP 세파로오스 FF상의 양이온 교환 크로마토그래피 (파마시아-수지 30㎖):
평형 완충액: 20mM 보레이트 pH 8.5-150mM NaCl-6.0M 유레아
세척 완충액: 평형 완충액
용출 완충액: 20mM 보레이트 pH 8.5-400mM NaCl-6.0M 유레아
↓
농축: 1.5㎎/㎖로 농축; 10kDa 오메가 멤브레인 (필트론)
↓
투석 (O/N-4℃): 완충액: 10mM PO4pH 6.8-150mM NaCl-0.5M 아르기닌*
↓
멸균 여과: Millex GV 0.22㎛
→SDS-PAGE에 의해 측정되는 순도의 수준은 도 6에 도시된다 (다이치 은 염색, 코마시 블루 G250, 웨스턴 블랏팅):
투석 및 멸균 여과 단계 후 > 95%
→회수 (단백질 비색측정법에 의해 측정: DOC TCA BAC)
산화된 Tat-His 단백질 48㎎를 재조합 피치아 파스토리스 세포 (습윤 중량) 160g 또는 Dyno-mill 파쇄물 OD 50 2L로부터 정제하였다.
실시예 7:산화된 Tat-His 단백질 (피치아 파스토리스)의 정제
정제 단계를 재조합 피치아 파스토리스 세포 (습윤 중량) 74g 또는 1L Dyno-mill 파쇄물 OD 60으로부터 시작하였다. 크로마토그래피 단계는 실온에서 수행된다. 단계 사이에, Tat 양성 분획을 저온실 (+4℃)에서 밤새 보관하고; 더 긴 시간동안 시료를 -20℃에서 냉각시켰다.
피치아 파스토리스 74g
↓
파쇄 (homogenization): 완충액: +1L 50mM PO4pH 7.0-5mM 페화블록; 최종 OD: 60
↓
Dyno-mill 파쇄(4 패시지)
↓
원심분리: JA10로터/9500rpm/30분/실온
↓
Dyno-mill 펠릿
↓
세척 (1h-4℃): 완충액: +1L 10mM PO4pH7.5-150mM NaCl-1% 엠피젠
↓
원심분리: JA10로터/9500rpm/30분/실온
↓
펠릿
↓
용해 (O/N-4℃): 완충액: +330㎖ 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-4.0M GuHCl
↓
원심분리: JA10로터/9500rpm/30분/실온
↓
Ni ++ -NTA-아가로스상의 고정화 금속이온 흡착 크로마토그래피 (키아젠-수지 30㎖):
평형 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-4.0M GuHCl
세척 완충액:
1) 평형 완충액
2) 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아
3) 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아-35mM 이미다졸
용출 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아-0.5M 이미다졸
↓
희석: 12mS/cm2의 이온강도로 희석; 희석 완충액: 20mM 보레이트 pH 8.5-6M 유레아
↓
SP 세파로오스 FF상의 양이온 교환 크로마토그래피 (파마시아-수지 15㎖):
평형 완충액: 20mM 보레이트 pH 8.5-150mM NaCl-6.0M 유레아
세척 완충액:
1) 평형 완충액
2) 20mM 보레이트 pH 8.5-400mM NaCl-6.0M 유레아
용출 완충액: 20mM 피페라진 pH 11.0-2M NaCl-6M 유레아
↓
농축: 1.5㎎/㎖로 농축; 10kDa 오메가 멤브레인 (필트론)
↓
투석 (O/N-4℃): 완충액: 10mM PO4pH 6.8-150mM NaCl-0.5M 아르기닌
↓
멸균 여과: Millex GV 0.22㎛
→SDS-PAGE에 의해 측정되는 순도의 수준은 도 7에 도시된다 (다이치 은 염색, 코마시 블루 G250, 웨스턴 블랏팅):
투석 및 멸균 여과 단계 후 > 95%
→회수 (단백질 비색측정법에 의해 측정: DOC TCA BAC)
산화된 Tat-His 단백질 19㎎를 재조합 피치아 파스토리스 세포 (습윤 중량) 74g 또는 Dyno-mill 파쇄물 OD 60 1L로부터 정제하였다.
실시예 8:SIV 환원된 Nef-His 단백질 (피치아 파스토리스)의 정제
정제 단계를 재조합 피치아 파스토리스 세포 (습윤 중량) 340g 또는 4L Dyno-mill 파쇄물 OD 100으로부터 시작하였다. 크로마토그래피 단계는 실온에서 수행하였다. 단계 사이에, Tat 양성 분획을 저온실 (+4℃)에서 밤새 보관하고; 더 긴 시간동안 시료를 -20℃에서 냉각시켰다.
피치아 파스토리스 340g
↓
파쇄 (homogenization): 완충액: +4L 50mM PO4pH 7.0-4mM PMSF; 최종 OD: 100
↓
Dyno-mill 파쇄(4 패시지)
↓
원심분리: JA10로터/9500rpm/60분/실온
↓
Dyno-mill 펠릿
↓
용해 (O/N-4℃): 완충액: +2.6L 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-4.0M GuHCl
↓
원심분리: JA10로터/9500rpm/30분/실온
↓
환원 (4H-실온-암실에서):
+0.2M 2-메르캅토에탄설폰산, 나트륨염 (분말 첨가)/인큐베이션 전에 pH를 7.5로 조절 (1M NaOH 용액)
↓
카르바미도메틸레이션 (1/2h-실온-암실에서):
+0.25 요오드아세트아미드 (분말 첨가)/인큐베이션 전에 pH를 7.5로 조절 (1M NaOH 용액)
↓
Ni ++ -NTA-아가로스상의 고정화 금속이온 흡착 크로마토그래피 (키아젠-수지 40㎖):
평형 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-4.0M GuHCl
세척 완충액:
1) 평형 완충액
2) 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아-25mM 이미다졸
용출 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아-0.5M 이미다졸
↓
농축(1.5㎎/㎖ 이하, 10kDa 오메가 멤브레인 (필트론)
↓
수퍼덱스200 상의 겔 여과 크로마토그래피 (파마시아-수지 120㎖)
용출 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아
↓
농축: 1.5㎎/㎖로 농축; 10kDa 오메가 멤브레인 (필트론)
↓
투석 (O/N-4℃): 완충액: 10mM PO4pH 6.8-150mM NaCl-0.3% 엠피젠
↓
멸균 여과: Millex GV 0.22㎛
→SDS-PAGE에 의해 측정되는 순도의 수준은 도 8에 도시된다 (다이치 은 염색, 코마시 블루 G250, 웨스턴 블랏팅):
투석 및 멸균 여과 단계 후 > 95%
→회수 (단백질 비색측정법에 의해 측정: DOC TCA BAC)
SIV 산화된 Tat-His 단백질 20㎎를 재조합 피치아 파스토리스 세포 (습윤 중량) 340g 또는 Dyno-mill 파쇄물 OD 100 4L로부터 정제하였다.
실시예 9:HIV 환원된 Nef-His 단백질 (피치아 파스토리스)의 정제
정제 단계를 재조합 피치아 파스토리스 세포 (습윤 중량) 160g 또는 3L Dyno-mill 파쇄물 OD 50으로부터 시작하였다. 크로마토그래피 단계를 실온에서 수행하였다. 단계 사이에, Tat 양성 분획을 저온실 (+4℃)에서 밤새 보관하고; 더 긴 시간동안 시료를 -20℃에서 냉각시켰다.
피치아 파스토리스 160g
↓
파쇄 (homogenization): 완충액: +3L 50mM PO4pH 7.0-5mM 페화블록; 최종 OD: 50
↓
Dyno-mill 파쇄(4 패시지)
↓
냉동/해동
↓
원심분리: JA10로터/9500rpm/60분/실온
↓
Dyno-mill 펠릿
↓
용해 (O/N-4℃): 완충액: +1L 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-4.0M GuHCl
↓
원심분리: JA10로터/9500rpm/60분/실온
↓
환원 (3H-실온-암실에서):
+0.1M 2-메르캅토에탄설폰산, 나트륨염 (분말 첨가)/인큐베이션 전에 pH를 7.5로 조절 (1M NaOH 용액)
↓
카르바미도메틸레이션 (1/2h-실온-암실에서):
+0.15 요오드아세트아미드 (분말 첨가)/인큐베이션 전에 pH를 7.5로 조절 (1M NaOH 용액)
↓
Ni ++ -NTA-아가로스상의 고정화 금속이온 흡착 크로마토그래피 (키아젠-수지10㎖):
평형 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-4.0M GuHCl
세척 완충액:
1) 평형 완충액
2) 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아
3) 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아-25mM 이미다졸
용출 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아-0.5M 이미다졸
↓
농축: 3㎎/㎖로 농축; 10kDa 오메가 멤브레인 (필트론)
↓
수퍼덱스200 상의 겔 여과 크로마토그래피 (파마시아-수지 120㎖)
용출 완충액: 10mM PO4pH 7.5-150mM NaCl-6M 유레아
↓
투석 (O/N-4℃): 완충액: 10mM PO4pH 6.8-150mM NaCl-0.5M 아르기닌
↓
멸균 여과: Millex GV 0.22㎛
→SDS-PAGE에 의해 측정되는 순도의 수준은 도 9에 도시된다 (다이치 은 염색, 코마시 블루 G250, 웨스턴 블랏팅):
투석 및 멸균 여과 단계 후 > 95%
→회수 (단백질 비색측정법에 의해 측정: DOC TCA BAC)
SIV 산화된 Tat-His 단백질 20㎎를 재조합 피치아 파스토리스 세포 (습윤 중량) 160g 또는 Dyno-mill 파쇄물 OD 50 3L로부터 정제하였다.
실시예 10:피치아 파스토리스의 SIV Nef서열의 발현
병원성 SHIV 감염 모델에서 Nef 및 Tat 항원을 평가하기 위하여, 짧은 꼬리 원숭이의 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV)의 Nef 단백질, SIVmac239을 발현시켰다 (참고문헌: Aids Research and Human Retroviruses 6:1221-1231, 1990). Nef 코딩영역에서, SIVmac239는 단지 10kD의 해독종결된 (truncated) 생산물을 예상하는 92aa 뒤에 인-프레임 (in-frame) 종결 코돈을 가진다. Nef 오픈 리딩 프레임의 나머지는 개방되어 있고, 완전하게 개방된 형태로 263aa (30kD)의 단백질을 인코딩하는 것으로 예상된다.
본 발명자들의 SIVmac239 Nef 유전자를 위한 출발 물질은 Lx5N 플라스미드 (R.C. Desrosiers, Southborough, MA, USA가 제공)에서 클론된, 완전한 코딩 서열에 해당하는 DNA 단편이었다. 상기 SIV Nef 유전자는 완전한-길이의 SIVmac239 Nef 단백질을 발현하기 위하여 조발성 종결 코돈에서 변이되었다 (9353 위치의 뉴클레오티드 G가 본래의 T 뉴클레오티드를 대신함).
피치아 파스토리스의 상기 SIV Nef 유전자를 발현하기 의하여, PHIL-D2-MOD 벡터 (상기에서 HIV-1 Nef 및 Tat 서열에 사용됨)를 사용하였다. 재조합 단백질을 유발성 알코올 옥시다제 (AOXI)의 조절하에 발현시켰고, 정제를 용이하게 하는 히스티딘 흡착 꼬리에 의해 단백질의 C-터미날을 신장시켰다.
10.1 삽입 벡터 pRIT 14908의 제조
pRIT 14908을 제조하기 위하여, SIV Nef 유전자를 프라이머 SNEF1 및 SNEF2로 pLX5N/SIV-NEF 플라스미드로부터 PCR에 의해 증폭시켰다.
증폭된 SIV NefDNA 영역은 뉴클레오티드 9077에서 시작되고 뉴클레오티드9865에서 종결된다 (참고문헌: Aids Research and Human Retrovirus, 6:1221-1231, 1990).
NcoI 절단 부위 (Nef 유전자의 ATG 코돈을 가짐)를 PCR 단편의 5' 말단에 도입하고, SpeI 영역을 3' 말단에 도입하였다. 획득된 PCR 단편 및 삽입 PHIL-D2-MOD 벡터를 둘다 NcoI 및 SpeI에 의해 절단하였다. NcoI 절단 부위는 SIV Nef 증폭된 서열 (위치 9286)에 존재하기 때문에, 각각 ±200bp 및 ±600bp의 두개의 단편을 획득하였고, 이를 아가로스젤에서 정제하여 PHIL-D2-MOD 벡터에 연결하였다. 자동화 서열 분석에 의하여 Nef 증폭된 영역을 검증한 후에 생성된 재조합 플라스미드가 제공되었다.
10.2 피치아 파스토리스 균주 GS115(His4)의 형질전환
SIV Nef-His를 발현하는 피치아 파스토리스 균주를 얻기 위하여, 균주 GS115를 발현 카세트 및 HIS4 유전자만을 가지는 선형 NotI 단편으로 형질전환하였다 (도 10). AOXI 내재하는 피치아 파스토리스 유전자와 양 말단에서 상동성을 가지는 상기 선형 NotI DNA 단편은, AOXI 유전자좌에서 재조합되기 쉽다. 멀티카피 삽입 클론을 정량 점적 분석법에 의하여 선택하였다.
재조합 단백질의 최대 생산량을 보이는 형질전환체 하나를 선택하여 Y1772라고 명명하였다. 균주 Y1772는 재조합 SIV Nef-His 단백질, 하기로 구성되는 272 아미노산을 생산한다:
ㆍ 미리스틴산
ㆍ 메티오닌, PHIL-D2-MOD 벡터의 NcoI 클로닝 위치를 사용하여 생성.
ㆍ Nef 단백질의 262 aa (aa2로 시작하여 aa263으로 연장)
ㆍ 클로닝 방법에 의해 생성된 트레오닌 및 세린 (PHIL-D2-MOD 벡터의 SpeI 부위에서 클로닝) (도 11)
ㆍ 1개의 글리신 및 6개의 히스티딘
핵산 및 단백질 서열은 도 11에 도시된다.
10.3 균주 Y1772의 발현 생산물의 특성분석
발현 수준
1% 메탄올을 탄소공급원으로서 함유하는 배지에서 16시간 유도 후에, 재조합 Nef-His 단백질의 양이 전체 단백질의 10%로 측정되었다 (도 12, 3-4줄)
용해도
Nef-His 단백질을 생산하는 재조합 균주 Y1772의 유도된 배양을 원심분리하였다. 세포 펠릿을 브레이킹 (breaking) 완충액에서 재현탁하고 0.5mm 유리구슬로 파쇄한 후에 세포 추출물을 원심분리하였다. 불용해성 펠릿 (P) 및 용해성 상등액 (S)에 함유된 단백질을 코마시 블루로 염색하여 SDS-PAGE 10%에서 비교하였다. 도 13에서 도시된 바와 같이, Y1772 (3-4줄)의 재조합 단백질의 대부분은 불용해성 분획에 포함되어 있었다.
충분한 재조합 단백질 발현 수준을 보이는 균주 Y1772를 SIV Nef-His 단백질의 생산 및 정제를 위하여 사용하였다.
실시예 11:CHO에서 GP120의 발현
재조합 gP120 당단백질을 생산하는 안정한 CHO-K1 세포주를 확립하였다. 재조합 gP120 당단백질은 HIV-1 분리주 W61D의 gP120 엔벨로프 단백질의 재조합 해독종결된 형태이다. 단백질을 세포 배양 배지로부터 추출하여, 후속적으로 이로부터 정제하였다.
gp120 형질 도입 플라스미드 pRIT13968의 제조
HIV-1 분리주 W61D의 엔벨로프 DNA 코딩 서열 (tat 및 rev의 5'엑손을 포함)을 플라스미드 W61D (Nco-XhoI)를 함유하는 게놈 gp160 엔벨로프로서 획득하였다. 이 플라스미드를 pRIT13965라고 명명하였다.
gp120 발현 카세트를 제조하기 위하여, 프라이머 올리고뉴클레오티드 서열 (DIR 131)을 사용하여, 종결 코돈을 pRIT13965의 gp160 인코딩 서열의 아미노산 glu 515 코돈에 삽입하였다. 프라이머 DIR 131은 세개의 종결 코돈 (모두 개방형 오픈 리딩 프레임로) 및 SalI 절단 부위를 가진다.
다음, 완전한 gp120 엔벨로프 서열을 pRIT13965로부터 유도된 gp160 플라스미드 서브클론 pW61d env (pRIT13966)의 BamH1-DraI 단편 (170bp) 및 pRIT13965로부터 PCR에 의해 생성된 DraI-SalI 단편 (510bp)로부터 재제조하였다. 두개의 단편을 겔로 정제하고, 대장균 플라스미드 pUC18로 연결하여, 먼저 SalI (클레노우 처리)로 절단하고, BamH1으로 절단하였다. 이는 플라스미드 pRIT13967이다. gp120 코딩 카세트를 함유하는 XmaI-SalI 단편 (1580bp)의 유전자 서열을 서열분석하여 예상되는 서열과 동일함을 확인하였다. 플라스미드 RIT13967을 먼저 BclI (클레노우 처리)로 절단하고 다음 XmaI으로 절단하여 CHO GS-발현 벡터 pEE14 (Celltech Ltd., UK)로 연결하였다. 생성되는 플라스미드를 pRIT13968이라고 칭하였다.
마스터 세포 은행의 준비
gp120-구성물 (pRIT13968)을 통상적인 CaPO4-침전/글리세롤 충격 방법에 의하여 CHO 세포에 형질도입하였다. 2일 후에, CHOK1 세포를 선택 증식 배지 (GMEM + 메티오닌 설폭시민 (MSX) 25μM + 글루타메이트 + 아스파라긴 + 10% 우태아혈청)에 취하였다. 세개의 선택된 형질도입 클론을 175m2플라스크에서 추가로 증폭시키고, 세포 바이얼을 -80℃에서 저장하였다. C-env 23, 9를 추가의 확장을 위해 선택하였다.
세포의 작은 전단계 은행를 준비하고 20 앰플을 냉동하였다. 전단계 은행 및 MCB의 준비를 위해 세포를 7.5% 우태아혈청 (fetal calf serum)이 보충되고 50μM MSX를 함유한 GMEM 배양 배지에서 증식시켰다. 상기 세포 배양에 대해서 멸균성 및 마이코플라즈마를 시험하여, 음성임을 확인하였다.
마스터 세포 은행 CHOK1 env23.9 (12패시지에서)를 프리마스터 세포은행으로부터 유래된 세포를 사용하여 준비하였다. 간략하게, 프리마스터 시드 (seed)의 2개의 엠플을 7.5% 투석된 우태아혈청 (fetal bovine serum)으로 보충된 배지에 접종하였다. 세포를 4개의 배양 플라스크에 분배하고 37℃에서 배양하였다. 세포 부착후에, 배양 배지를 50μM MSX로 보충된 신선한 배지로 교환하였다. 컨플루언스 (confluence)시에, 세포를 트립신처리에 의해 수집하고, T 플라스크-롤러 바틀-세포 제조 단위에서 1/8 비율로 계대배양하였다. 세포를 트립신처리 및 원심분리에 의해서 세포 제조 단위로부터 수집하였다. 세포 펠릿을 극저온 보존제로서 DMSO가 보충된 배양 배지에 재현탁하였다. 앰플을 프리라벨링하고, 고압멸균한 후에 열로 봉하였다 (250 바이얼). 이들에 대해 새는지 여부를 검사한 뒤, 액체 질소에서 보관하기 전에, -70℃에서 밤새 보관하였다.
세포 배양 및 미정제 회수물의 생산
마스터 세포은행의 2개의 바이얼을 빠르게 해동시켰다. 세포를 7.5% 투석된 우태아혈청 (FBS)가 보충된 적절한 배양 배지로 37℃±1℃에서 2개의 T 플라스크에 혼합하여 접종하였다. 컨플루언스에 도달하였을 때 (패시지 13), 세포를 트립신처리에 의하여 수집하고, 혼합하여 상기와 같이 10 T 플라스크에서 증식시켰다. 컨플루언스의 세포 (패시지 14)를 트립신으로 처리하여 연속적으로 2 세포 제조 단위에서 증식시키고 (각각 6000㎤; 패시지 15), 다음 10 세포 제조 단위에서 증식시켰다 (패시지 16). 증식 배양 배지를 7.5% 투석된 우태아혈청 (FBS) 및 1% MSX로 보충하였다. 세포가 컨플루언스에 도달하였을 때, 증식 배양 배지를 제거하고, MSX를 함유하지 않고 1% 투석된 우태아혈청만을 함유한 "생산 배지"로 교환하였다. 32일동안 이틀마다 (48시간의 간격을 두고) 상등액을 수집하였다. 회수된 배양액을 바로 1.2-0.22㎛ 필터로 여과하고 정제후에 -20℃에서 보관하였다.
실시예 12:세포 배양액으로부터 HIV GP 120 (W61D CHO)의 정제
모든 정제 단계를 2-8℃의 저온실에서 수행하였다. 완충액의 pH를 상기 온도에서 제조하고 0.2㎛ 필터에서 여과하였다. 이들을 발열물질 (pyrogen) 양을 분석하였다 (LAL 분석). 칼럼 용출액의 280nm에서의 광학 농도, pH 및 전도율을 계속적으로 모니터링하였다.
(ⅰ) 여과 배양액
회수된 여과 배양액 (CCF)을 여과 멸균하고 Tris 완충액 (pH 8.0)을 30mM 최종 농도가 되도록 첨가하였다. CCF를 정제시까지 -20℃에서 냉동하여 보관하였다.
(ⅱ) 소수성 상호작용 크로마토그래피
해동후에, 황산 암모늄을 1M이 될 때까지 여과된 배양액에 첨가하였다. 용액을 30mM Tris 완충액-pH8.0-1M 황산암모늄으로 평형된 TSK/TOYOPEAL-BUTYL 650M (TOSOHAAS) 칼럼에 밤새 통과시켰다. 상기 상태에서, 항원을 겔 매트릭스에 결합시켰다. 칼럼을 황산암모늄을 단계적으로 감소시켜 세척하였다. 항원을 30mM Tris 완충액-pH 8.0-0.25 황산 암모늄에서 용출하였다.
(ⅲ) 음이온-교환 크로마토그래피
용액의 전도율을 5 및 6 mS/㎝로 감소시킨 후에, 분획의 gP120 풀(pool)을 Tris-완충식염수-pH 8.0으로 평형된 Q-세파로스 페스트 플로우 (fast flow) (파마시아) 칼럼에 로딩하였다. 칼럼을 음성 방식, 즉, gP120은 겔에 부착되지 않고, 불순물의 대부분이 겔내에 보유되는 방식으로 수행하였다.
(ⅳ) 한외여과에 의한 농축 및 투석여과
단백질 농도를 증가시키기 위하여, gP120 풀을 50kDa 컷 오프의 FILTRON 막 "오메가 스크린 채널"에 로딩하였다. 농축이 끝난 후, 완충액를 CaCl20.3mM을 함유하는 5mM 인산염 완충액, pH 7.0로 투석여과시켜 교환하였다. 바로 추가의 작업이 수행되지 않는 경우에, gP120 풀을 -20℃에서 냉동시켜 저장하였다. 해동한 후에, 불용성 물질을 제거하기 위하여 0.2μM 막에서 여과하였다.
(ⅴ) 수산화인회석 (hydroxyapatite)에서의 크로마토그래피
gP120 UF 풀을 5mM 인산염 완충액 + CaCl20.3mM, pH 7.0으로 평형된 마크로-프렙 세라믹 하이드록시아파티테, 유형Ⅱ (바이오래드)에 로딩하였다. 칼럼을 동일한 완충액로 세척하였다. 항원은 칼럼을 통과하고, 불순물은 칼럼에 부착된다.
(ⅵ) 양이온 교환 크로마토그래피
gP120 풀을 아세테이트 완충액 20mM, pH 5.0에서 평형된 CM/TOYOPEARL-650S (TOSOHAAS) 칼럼에 로딩하였다. 칼럼을 동일한 완충액로 세척하고, 다음에 아세테이트 20mM, pH 5.0 및 NaCl 10mM을 세척하였다. 다음, 항원을 80mM NaCl을 함유하는 동일한 완충액로 용출하였다.
(ⅶ) 한외여과
정제과정의 바이러스 제거 능력을 증가시키기 위하여, 추가적인 한외여과 단계를 수행하였다. gP120풀을 필트론 막 "오메가 스크린 채널", 컷-오프 150kDa로 한외여과하였다. 상기 막공 크기의 막은 항원을 여과하지 않는다. 처리후에, 흐석된 항원을 컷-오프가 50kDa인 동일한 유형의 막 (필트론)으로 농축하였다.
(ⅷ) 크기별 배재 겔 크로마토그래피
gP120 UF 풀을 수퍼덱스 200 (파마시아) 칼럼에 적용하여 완충액를 교환하고잔여 불순물을 제거하였다. 칼럼을 인산완충식염수 (PBS)로 용출하였다.
(ⅸ) 멸균 여과 및 저장
분획을 0.2 μM PVDF 막 (밀리포어)으로 여과하여 멸균하였다. 멸균여과 후에, 정제된 원액을 제형전까지 -20℃에 냉동시켜 저장하였다. 정제 과정을 하기의 흐름도로 요약하였다.
⇒ SDS-PAGE 분석 (은 염색법/코마시 블루/웨스턴 블랏팅)에 의하여 측정된 정제 원액의 순도는 ≥95%이다.
⇒ 생산 수율은 약 2.5㎎/L CCF (로우리 (Lowry) 분석에 의함)이다-전체적인 정제 수율은 약 25% (엘리자 (ELISA) 분석에 의함)이다.
⇒ 정제된 물질은 37℃에서 1주간 안정하다 (웨스턴 블랏팅에 의함).
배양액의 gp120의 정제
ν표시는 바이러스 제거에 중요한 단계이다.
여과한 배양액
↓
소수성 상호작용 크로마토그래피 (부틸-토요펄 650M: BUTYL TOYOPEARL 650M)
↓
음이온 교환 크로마토그래피 (음성 방식) ν
(Q-세파로스)
↓
50kD 한외여과 (농축 및 완충액 교환)
↓
(보관 -20℃)
↓
수산화인회석 크로마토그래피 (음성 모드)
(마크로프렙 세라믹 히드록시아마티테 Ⅱ)
↓
양이온 교환 크로마토그래피 (CM-토요펄 650S)
↓
150kD 한외여과 (오메가 멤브레인/필트론) ν
↓
50KD 한외여과 (농축)
↓
크기별 배제 크로마토그래피 (수퍼덱스 200) ν
멸균여과
↓
정제 원액
(-20℃에서 저장)
실시예 13:백신 제조
본 발명에 따라 제조된 백신은 항원을 코딩하는 하나 이상의 재조합 DNA의 발현 생산물을 포함한다. 또한, 제형은 오일/물 에멀젼중의 3 디-O-아실화 모노포스포릴 리피드 A 3D-MPL 및 QS21, 또는 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드 모티브 및 수산화 알루미늄을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 운반체로서 함유한다.
3D-MPL: 그람-음성 박테리아 살모넬라 미네소타의 리포폴리사카라이드 (LPS)의 화학적으로 독성이 제거된 형태이다.
스미스 클라인 비이참 바이오로지칼스에서 수행된 실험은 다양한 부형제가 배합된 3D-MPL는 체액성 면역 및 TH1유형 세포성 면역을 강력하게 상승시킴을 보였다.
QS21: 퀼리자 사포나리아 몰리나 나무의 껍질의 추출원액으로부터 정제된 사포닌이고, 이는 강력한 애쥬번트 활성을 가진다: 이는 몇몇 항원에 대한 항원-특이성 림프구증식 및 CTLs를 유도한다. 스미스 클라인 비이참 바이오로지칼스에서 수행된 실험은 체액성 및 TH1유형 세포성 면역의 유도에 대한 3D-MPL 및 QS21의 조합의 명백한 상승효과를 증명하였다.
오일/물 에멀젼은 2 오일 (토코페롤 및 스쿠알렌) 및 트윈 80을 유화제로서 포함한다. 에멀젼은 5% 스쿠알렌, 5% 토코페롤, 2% 트윈 80을 포함하고, 180nm의 평균 입자 크기를 가진다 (참고문헌: WO 95/17210).
스미스 클라인 비이참 바이오로지칼스에서 수행된 실험은 3D-MPL/QS21에 상기 O/W 에멀젼을 첨가하는 것이 이들의 면역 자극 특성을 추가로 증가시킴을 증명하였다.
오일/물 에멀젼의 제조 (2배 농축)
트위 80을 인산완충식염수 (PBS)에 용해시켜, PBS에 2% 용액을 제공하였다. 두배 농축 에멀젼 100㎖을 제공하기 위하여 DL 알파 토코페롤 5g 및 스쿠알렌 5㎖을 볼텍싱하여 완전히 혼합하였다. PBS/트윈 용액 90㎖을 첨가하여 완전히 혼합하였다. 생성된 에멀젼을 주사기를 통과시켜 최종적으로 M110S 마이크로플루이딕스 머쉰 (Microfluiducs machine)을 이용하여 미세유체화하였다. 생성된 오일 소적은 약 180nm의 크기를 가진다.
오일/물 제형의 준비
항원을 (gp120 100㎍, NefTat 20㎍ 및 SIV Nef 20㎍을 단독으로 또는 혼합하여) 10배 농축된 PBS pH6.8 및 H2O로 희석한 후에, 오일/물 에멀젼에 3D-MPL (50㎍), QS21 (50㎍) 및 티오멀살 (thiomersal) 1㎍/㎖을 보존제로서 5분 간격으로 첨가하였다. 에멀젼 부피는 전체 부피의 50%와 동일하다 (500㎕의 용량 중 250㎕).
모든 인큐베이션은 교반하면서 실온에서 수행되었다.
CpG 올리고뉴클레오티드 (CpG)는 하나 또는 수개의 CpG 서열 모티브를 함유하는 메틸화되지 합성 올리고뉴클레오티드이다. CpG는 주로 혼합된 TH1/TH2반응을 유도하는 오일/물 제형과는 다르게 TH1유형 면역반응의 매우 효능있는 유도물질이다. CpG는 오일/물 제형보다 더 낮은 수준의 항체 및 우수한 세포 매개 면역 반응을 유도한다. CpG는 보다 낮은 국소적인 반응원성을 유도하는 것으로 기대된다.
CpG 뉴클레오티드 용액의 준비: CpG 건조 분발을 H2O에 용해하여 5㎎/㎖ CpG 용액을 제조하였다.
CpG 제형의 준비
3 항원을 NaCl 150mM로 투석하여 수산화 알루미늄에 gp120이 흡착하는 것을 저해하는 인산 이온을 제거하였다.
Al(OH)3에 흡착시키기 전에, H2O에 희석된 항원 (gp120 100㎍, NefTat 20㎍ 및 SIV Nef 20㎍)을 CpG 용액(CpG 500㎍)으로 30분간 인큐베이션하여, NefTat 및 Nef 항원의 His 꼬리와 올리고뉴클레오티드사이에 상호작용을 가능하게 하였다. 다음, 연속적으로 5분 간격을 두고, Al(OH)3(500㎍), 10배 농축 NaCl 및 티오멀살 1㎍/㎖을 보존제로 첨가하였다.
모든 인큐베이션은 교반하면서 실온에서 수행되었다.
실시예 14:레서스 원숭이에서의 면역화 및 SHIV 접종실험
1차 연구
4 군의 레서스 원숭이를 0, 1, 3 달에 하기의 백신 조성물을 근내로 투여하여 면역화하였다:
1 군: 애쥬번트2 + gp120
2 군: 애쥬번트2 + gp120 + NefTat + SIV nef
3 군: 애쥬번트2 + NefTat*+ SIV nef
4 군: 애쥬번트6 + gp120 + NefTat + SIV nef
5 군: 애쥬번트2 + gp120 + NefTat + SIV nef
6 군: 애쥬번트2
애쥬번트 2는 스쿠알렌/토코페롤/트윈 80/3D-MPL/QS21을 포함하고, 애쥬번트 6은 백반 및 CpG를 포함한다.
Tat*는 변이된 Tat를 나타내며, Lys41 →Ala, 및 RGD 모티브에서 Arg78 →Lys 및 Asp80 →Glu로 변이되었다 (참고문헌: Virology 235:48-64, 1997).
마지막 면역화 후 1달 후에, 모든 동물을 병원성 SHIV (균주 89.6p)로 감염시켰다. 감염시킨 주로부터 (wk 16) 혈액 시료를 지정된 시간에 주기적으로 취하여 말초혈 단핵 세포중의 CD4-양성 세포의 %를 FACS 분석법에 의하여 결정하고 (도 13), 혈장내의 RNA 바이러스 게놈의 농도를 bDNA 분석법에 의해서 결정하였다 (도 14).
결과
모든 동물을 SHIV89.6p접종후에 감염시켰다.
CD4-양성 세포는 1군 및 6군의 동물 (대조군)을 제외한 1, 3, 5 및 6군의 모든 동물에서 접종후에 감소하였다. 2군의 모든 동물은 CD4-양성 세포에서 약간의 감소를 보였고 시간이 경과하면서 기본량으로 회복되었다. 4군의 동물에서 유사한 경향을 관찰하였다 (도 14).
바이러스 로드 결과는 CD4 결과와 거의 반대를 보였다. 바이러스 로드는 2군 동물의 3/4에서 검출 수준 이하로 감소하였다 (그리고 한 개의 대조 동물에서는CD4-양성 세포를 유지하였다). 다른 동물의 대부분은 높거나 중간의 바이러스 로드를 유지하였다 (도 15).
놀랍게도, ELISA에 의하여 측정된 항-Tat 및 항-Nef 항체 역가는 연구과정내내 5군보다 3군에서 2 내지 3배 높았다.
68주 (접종후 56주)에, 완전한 항원 배합물을 투여받은 군의 모든 동물 (2 및 4군)은 아직 살아 있고, 다른 군의 동물의 대부분을 AIDS-유사 증상으로 인하여 안락사시켜야 했다. 군당 생존한 동물은 하기와 같다:
1 군: 2/4
2 군: 4/4
3 군: 0/4
4 군: 4/4
5 군: 0/4
6 군: 1/4
결론
gp120 및 NefTat의 배합물 (SIV Nef 첨가)은 CD4-양성 세포의 손실을 막아 병원성 SHIV89.6p로 감염된 동물의 바이러스 로드를 감소시켰고, ADIS-유사 증상을 지연시키거나 막았고, 반면에 gp120 또는 NefTat/SIV은 단독으로 SHIV 접종시 병리적 결과를 예방하지 못했다.
3D-MPL 및 QS21과 함께 스쿠알렌, 토코페롤 및 트윈 80을 포함하는 오일/물에멀젼인 애쥬번트 2는 백반/CpG 애쥬번트보다 연구 종점에 있어서 더 강한 효과를 가지는 것으로 보인다.
2차 연구
2차 레서스 원숭이 SHIV 접종 연구는 후보 백신인 gp120/NefTat + 애쥬번트의 효능을 확인하고 다른 Tat-기초한 항원과 비교하기 위하여 수행되었다. 연구는 다른 실험실에서 행해졌다.
본 연구의 설계는 하기와 같다.
6 레서스 원숭이의 군을 0,4 및 12주에 접종하여 면역화시켰고 병원성 SHIV89.6p의 표준 용량으로 16주에 접종하였다.
1군은 1차 연구의 2군과 같은 방법으로 수행하였다.
1 군: 애쥬번트2 + gp120 + NefTat + SIV nef
2 군: 애쥬번트2 + gp120 + Tat (산화됨)
3 군: 애쥬번트2 + gp120 + Tat (환원됨)
4 군: 애쥬번트2
추적/종점은 % CD4-양성 세포, PCR에 의한 바이러스 로드, 병적상태, 치사율이었다.
결과
2 군의 한 마리만을 제외하고 모든 동물을 SHIV89.6p로 접종하여 감염시켰다.
CD4-양성 세포는 2군의 한 마리만을 제외하고 대조군인 4군, 3군, 2군의 모든 동물에서 접종후에 상당히 감소하였다. 1군의 단지 한 마리만이 CD4-양성 세포에서 현저한 감소를 보였다. 1차 연구의 동물과는 달리, 2차 실험의 원숭이는 바이러스 접종 1달후에 다른 수준을 CD4-양성 세포의 안정화를 보였다 (도 15). 안정화는 일반적으로 CD4-양성 세포의 초기 %보다 낮았으나, 세포의 완전한 손실에 이르지는 않았다. 이는 2차 연구에서 사용된 원숭이 집단에서 SHIV-유도 질환에 대한 민감도가 감소하였음을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, gp120/NefTat/SIV Nef 백신 및 2개의 gp120/Tat 백신의 이로운 효과는 명백하다. CD4-양성 세포의 %가 20이상인 동물의 수는 백신접종된 동물 중 5마리이고, 애쥬번트 군의 대조 동물은 어느 것도 상기 수준이상을 보이지 못했다.
RNA 혈장 바이러스 로드의 분석을 통하여 연구 동물의 비교적 낮은 민감도를 확인하였다 (도 16). 6 대조 동물의 2 마리만이 높은 바이러스 로드를 유지하였고, 다른 동물에서는 혈청에서 바이러스가 검출되지 않았다. 따라서, 백신 효과는 바이러스 로드 파라미터로 증명하기 어려웠다.
결론
CD4-양성 세포의 분석은 백신 gp120/NefTat + 애쥬번트 (SIV Nef 첨가)가 대부분의 백신접종된 동물의 CD4-양성 세포의 감소를 방지함을 의미한다. 이는 1차 SHIV 연구에서 얻은 결과를 확인하는 것이다. 연구 동물의 민감도의 부족으로 인하여, 바이러스 로드 파라미터는 백신 효능을 증명하는 데 사용되지 않았다. SHIV 모델에서 증명된 바와 같이, 함께 취하여진 gp120 및 Tat 및 NefHIV 항원의 배합물은 HIV 감염의 병리적 결과를 예방한다.
또한, gp120와 혼합된 Tat 단독 항원은 CD4-양성 세포의 감소를 예방한다. 그 효능은 gp120/NefTat/SIV Nef 항원 배합물과 비교하여 보다 덜 확실하나, gp120 및 Tat는 SHIV-유도 질환 징후에 대하여 예방적 효능을 매개할 수 있음을 증명하였다.
2차 SHIV 접종 연구는 1차 연구의 동물 공급원과 완전히 무관한 공급원의 레서스 원숭이에 대하여 수행되었다. CD4-양성 세포 및 혈장 바이러스 로드, 두 개의 파라미터는 2차 연구의 동물이 SHIV-유도 동물에 보다 덜 민감하고, 동물들간에 상당히 큰 편차가 있음을 보인다. 그럼에도 불구하고, gp120/NefTat/SIV Nef 백신의 CD4-양성 세포를 유지하는 이로운 효능이 gp120/NefTat 및 SIV Nef를 함유하는 시험 백신에서 나타났다. 이는 백신 효능이 분리된 연구에서 반복될 뿐만 아니라 관련되지 않은 원숭이 집단에서 증명되었음을 의미한다.

Claims (19)

  1. a) HIV Tat 단백질 또는 폴리뉴클레오티드; b) HIV Nef 단백질 또는 폴리뉴클레오티드; 또는 c) HIV Nef 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 (Nef-Tat)와 연결된 HIV Tat 단백질 또는 폴리뉴클레오티드; 및 HIV gp120 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 HIV에 대한 인간의 예방 또는 치료용 면역화 백신의 제조용 용도.
  2. 제 1항에 있어서, Tat, Nef 또는 Nef-Tat가 HIV의 치료 또는 예방에 있어 gp120과 상승적으로 작용함을 특징으로 하는 용도.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 사용된 백신이 HIV 감염된 인간의 HIV 바이러스 로드를 감소시킴을 특징으로 하는 용도.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 사용된 백신이 HIV Tat, Nef 또는 Nef-Tat 및 HIV gp120으로 백신접종하지 않은 경우에 나타나는 수준을 초과하여 CD4+ 수준을 유지함을 특징으로 하는 용도.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 백신이 gag, rev, vif, vpr 및 vpu로 구성된 군으로부터 선택된 항원을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, Tat 단백질이 변이된 단백질임을 특징으로 하는 용도.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, Tat, Nef 또는 Nef-Tat 단백질이 환원됨을 특징으로 하는 용도.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, Tat, Nef 또는 Nef-Tat 단백질이 카르바미도메틸화됨을 특징으로 하는 용도.
  9. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, Tat, Nef 또는 Nef-Tat 단백질이 산화됨을 특징으로 하는 용도.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 애쥬번트를 추가적으로 포함함을 특징으로 하는 용도.
  11. 제 10항에 있어서, 애쥬번트가 TH1 유도 애쥬번트임을 특징으로 하는 용도.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 애쥬번트가 모노포스포릴 리피드A 또는 3-디-O-아실레이티드 모노포스포릴 리피드A와 같은 이들의 유도체를 포함함을 특징으로 하는 용도.
  13. 제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 사포닌 애쥬번트를 추가로 포함함을 특징으로 하는 용도.
  14. 제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 수중유 (oil in water) 에멀젼을 추가로 포함함을 특징으로 하는 용도.
  15. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 애쥬번트가 CpG 모티브-함유 올리고뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 용도.
  16. 제 15항에 있어서, 알루미늄염을 추가로 포함함을 특징으로 하는 용도.
  17. a) HIV Tat 단백질 또는 폴리뉴클레오티드; b) HIV Nef 단백질 또는 폴리뉴클레오티드; 또는 c) HIV Nef 단백질 또는 폴리뉴클레오티드와 연결된 HIV Tat 단백질 또는 폴리뉴클레오티드; 및 HIV gp120 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 HIV에 대한 인간의 예방 또는 치료용 면역화를 위한 감작-추가접종 운반에 적절한 백신의 제조용 용도.
  18. HIV Tat 또는 HIV Nef 또는 HIV NefTat를 포함하는 백신을 이들을 코딩하는 HIV gp120 또는 폴리뉴클레오티드와 혼합하여 인간에게 투여함에 의해 인간을 HIV에 대해 면역화하는 방법.
  19. HIV Tat 또는 HIV Nef 또는 HIV NefTat를 이들을 코딩하는 HIV gp120 또는 폴리뉴클레오티드와 혼합하여 포함하는, 인간에게 사용하는 백신 조성물.
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