BG106964A - Ваксина за профилактична или терапевтична имунизация против hiv - Google Patents

Ваксина за профилактична или терапевтична имунизация против hiv Download PDF

Info

Publication number
BG106964A
BG106964A BG106964A BG10696402A BG106964A BG 106964 A BG106964 A BG 106964A BG 106964 A BG106964 A BG 106964A BG 10696402 A BG10696402 A BG 10696402A BG 106964 A BG106964 A BG 106964A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
nef
tat
hiv
protein
gpl20
Prior art date
Application number
BG106964A
Other languages
English (en)
Inventor
Gerald Voss
Original Assignee
Smithkline Beecham Biologicals S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0002200A external-priority patent/GB0002200D0/en
Priority claimed from GB0009336A external-priority patent/GB0009336D0/en
Priority claimed from GB0013806A external-priority patent/GB0013806D0/en
Priority claimed from PCT/EP2000/005998 external-priority patent/WO2001000232A2/en
Application filed by Smithkline Beecham Biologicals S.A. filed Critical Smithkline Beecham Biologicals S.A.
Publication of BG106964A publication Critical patent/BG106964A/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Област на техниката
Изобретението се отнася до ново използване на HIV протеини и до състави на ваксини, съдържащи такива HIV протеини. Поспециално изобретението се отнася до използване на HIV Tat и HIV gpl 20 протеини в комбинация. Освен това, изобретението се отнася до използването на HIV Nef и HIV gp 120 протеини в комбинация. Предшестващо състояние на техниката
HIV-1 е първопричината за придобиване на синдрома на имунна недостатъчност / AIDS/, който се счита като един от най-главните световни здравни проблеми . Въпреки разширеното проучване в целия свят насочено към получаване на ваксина, тези усилия далеч не са били успешни.
HIV обвивката гликопротеинът gpl20 е вирусният протеин, който се използва за закрепване към клетката-приемник. Това закрепване се осъществява посредством свързването към две повърхностни w молекули на помощни Т клетки и макрофаги, известни като CD4 и един от двата хемокинови рецептора CCR-4 или CXCR-5. gpl 20 протеинът е експресиран първо като по-голяма прекурсорна молекула / gpl 60 /, която след това е разцепена пост-транслационно до получаването на gpl20 и gp 41. gpl20 протеинът е задържан върху повърхността на вириона посредством свързване към gp 41 молекулата, която е включена във вирусната мембрана.
gp 120 протеинът е основната мишена на неутрализиращи антитела, но за съжаление най-имуногенните области на протеините /V3 контура/ са най-променливите части на протеина. Затова, използването на gp 120 протеина / или неговия прекурсор gp 160 / като ваксинен антиген , предизвикващ създаването на неутрализиращи антитела, се счита че е с ограничено приложение за общо защитна ваксина, gp 120 протеинът също съдържа епитопи, които са разпознати чрез цитотоксични Т лимфоцити /CTL/. Тези ефекторни клетки са способни да елиминират инфектираните с вирус клетки, и затова съставляват втори главен антивирусен имунен механизъм. Обратно на целевите области на неутрализиращи антитела някои CTL епитопи изглежда да са относително запазени сред различни HIV видове. По тази причина gp 120 и gp 160 са считани за полезни антигенни компоненти във ваксини, които целят предизвикването на предавани посредством клетка имунни реакции / особено CTL/.
He-обвити протеини на HIV-1 са описани и включват например вътрешни структурни протеини, такива като продуктите на gag и pol гените и други не-структурни протеини, такива като Rev, Nef, Vif и Tat / Greene et al., New England J. Med, 324,5, 308 et seq /1991/ и Bryant et al., /Ed. Pizzo/, Pediatr. Infect. Dis, J., 11, 5, 390 et seq /1992/.
HIV Tat и Nef са начални протеини, т.е.. те се експресират в началото на инфекция и в отсъствието на структурен протеин.
При представяне на Конференция / С. David Pauza, Immunization with Tat toxoid attenuates SHIV89.6PD infection in macaques, 12 Cent Gardes meeting, Marnes-La-Coquette, 26.10.1999/, са описани опити, при които резус макаци са имунизирани с Tat токсоид самостоятелно или в комбинация с обвит гликопротеин gp 160 ваксинна комбинация / една доза рекомбинантен ваксинен вирус и една доза рекомбинантен протеин /.Обаче, наблюдаваните резултати показват, че наличието на обвития гликопротеин не дава предимство спрямо опитите, осъществени с Tat самостоятелно.
Същност на изобретението
Ние установихме ,обаче, че Tat- и/или Nef-съдържащ имуноген /особено Nef-Tat съединен протеин/ действа синергистично с gp 120 при защитата на резус маймуни от патогенна заплаха с химерен вирус на човешка-маймунска имунна недостатъчност /SHIV/. До днес SHIV инфекцията на резус макаци се счита за най -релевантния животински модел за AIDS у човека. Затова, ние използвахме този предклиничен модел за оценка на защитната ефикасност на ваксини, съдържащи gp 120 антиген и Nef- и Tat-съдържащ антиген било самостоятелно, било в комбинация. Анализът на два маркера на вирусна инфекция и патогенеза, процентът на СО4-позитивни клетки в периферната кръв и концентрацията на свободни SHIV RNA геноми в плазмата на маймуните, показва че двата антигена действат синергистично. Имунизацията било с gpl20 или с NefTat+SIV Nef самостоятелно не води до никакви различия в резултатите , сравнени с имунизацията само с помощно средство. Обратно, въвеждането в организма на комбинацията gpl20 и NefTat+SIV Nef, антигени води в резултат до забележимо подобрение на двата, споменати по-горе параметъра при всички животни на тази специална опитна група.
Така, съгласно изобретението, се осигурява ново използване на HIV Tat и/или Nef протеина заедно с HIV gp 120 за производството на ваксина за профилактична и лечебна имунизация на хора срещу HIV.
Както бе споменато по-горе, NefTat протеинът, SIV Nef протеинът и gp 120 протеинът заедно дават повишена ответна реакция спрямо тази, която се наблюдава когато NefTat+SIV Nef или gp 120 са използвани самостоятелно. Тази повишена ответна реакция или синергизмът може да бъде видян в понижаването на вирусното натоварване като резултат от ваксинацията с тези комбинирани протеини.
Съответно или допълнително повишената ответна реакция се проявява посредством поддържане на СО4+нивата спрямо онези нива, намерени в отсъствието на ваксинация с HIV NefTat, SIV Nef и HIV gp 120. Синергистичният ефект се отдава на комбинацията на gp 120 и Tat, или gp 120 и Nef, или gp 120 и двата протеина- Nef и Tat.
Прибавянето на други HIV протеини може допълнително да повиши синергистичния ефект, който се наблюдава между gp 120 и Tat и/или Nef . Тези други протеини също могат да действат синергистично с отделните компоненти на gp 120 и Tat и/или Nefсъдържащата ваксина, без да е необходимо присъствието на цялата оригинална антигенна комбинация. Допълнителните протеини могат да бъдат регулаторни протеини на HIV, такива като Rev, Vif, Vpu, и Vpr. Те могат също да бъдат структурни протеини, произхождащи от HIV gag или pol гени.
w HIV gag генът кодира прекурсорен протеин р55, който може спонтанно да се събере в незрели вирусоподобни частици /VLPs/. След това прекурсорът протеолитично се разцепва на основните структурни протеини р24 /капсид/ и р18 /матрица/, и на няколко по-малки протеина. Както прекурсорният протеин р55 така и неговите основни производни р24 и р18 могат да бъдат считани като подходящи ваксинни антигени , които могат допълнително да повишат синергистичния ефект , наблюдаван между gpl20 и Tat и/или Nef. Прекурсорът р55 и капсидният протеин р24 могат да се използват като VLPs или като мономерни протеини.
HIV Tat протеинът във ваксината ,съгласно изобретението, може по желание да бъде свързан към HIV Nef протеина, например като слят протеин.
HIV Tat протеинът, HIV Nef протеинът или NefTat слетият протеин, съгласно изобретението, могат да имат С крайна Хистидинова опашка, която за предпочитане съдържа между 5-10 Хистидинови остатъци. Присъствието на хистидиновата / nnH“His”/ опашка подпомага пречистването.
При предпочитано изпълнение на изобретението, протеините са експресирани с Хистидинова опашка, съдържаща между 5 и 10 и за предпочитане шест Хистидинови остатъка. Те са предимство при помощното пречистване. Отделна експресия , в мая /Saccharomyces cerevisiae/ на Nef /Macreadie I.G. et al., 1993, Yeast 9 /6/ 565-573/ и на Tat /Braddock M. et al., 1989, Cell 58 /2/ 269-79/ е описана. Nef протеинът и Gag протеини p55 и pl8 са миристилирани. Експресията на Nef и Tat поотделно в експресионна система Pichia /Nef-His и Tat-His конструкции/и експресията на слятата конструкция Nef-Tat-His е описана предварително във WO 99/16884.
DNA и амино киселинните последователности на представителните Nef-His /Seq. ID. No.s 8 и 9/, Tat-His I Seq., ID. No.s 10 и 11 / и на Nef-Tat-His слятия протеин /Seq. ID. No.s 12 и 13/ са посочени на Фигура 1.
HIV протеините, съгласно изобретението, могат да бъдат използвани в тяхния естествен строеж или за предпочитане, могат да бъдат модифицирани за използването им във ваксината. Тези модификации могат да бъдат необходими или по технически причини, свързани е метода на пречистване, или могат да бъдат използвани за биологично дезактивиране на една или няколко функционални характеристики на Tat или Nef протеина.Така изобретението обхваща производни на HIV протеини, които могат да бъдат, например мутирали протеини. Терминът “ мутирал” се използва тук за да означи молекула, която е претърпяла заличаване, добавяне или заместване на една или повече амино киселини, при използване на добре познати методики за насочена към място мутагенеза или по какъвто и да е друг обичаен метод.
Например, мутантен Tat протеин може да бъде мутиран така, че да е биологически неактивен, макар, че все още да поддържа неговите имуногенни епитопи. Един възможен мутирал tat ген, създаден от D.Clements /Tulane University/, /произхождащ от ВН10 молекуларен клон/ носи мутации в областта на активното място /Lys41->Ala/ и в RGD мотива / Arg 78—>Lys и Asp 80—>Glu/ / Virology 235 :48-64,1997/.
Мутиран Tat е илюстриран на Фигура 1 /Seq.ID. No.s 22 и 23 / , както и Nef-Tat Mutant-His /Seq. ID. No.s 24 r 25/.
HIV Tat или Nef протеините във ваксината, съгласно изобретението, могат да бъдат модифицирани посредством химически методи по време на процеса на пречистването до получаването на стабилни и мономерни протеини. Един метод за предотвратяване на окислителната агрегация на протеин, такъв като Tat или Nef е използването на химически модификации на тиолните протеинови групи. В първия етап дисулфидните мостове се редуцират посредством обработка с редуциращо средство, такова като DTT, бета-меркаптоетанол или глутатион. Във втория етап получените в резултат тиоли се блокират посредством взаимодействието с алкилиращо средство / например, протеинът може да бъде карбоксиамидиран / карбамидометилиран при използване на йодоацетамид/. Такива химически модификации не променят функционалните свойства на Tat и Nef, което се оценява посредством клетъчния свързващ анализ и инхибирането на лимфопролиферацията на мононуклеарни клетки от човешка периферна кръв.
HIV Tat протеинът и HIV gp 120 протеините могат да бъдат пречистени по методи, посочени в приложените примери.
Ваксината, съгласно изобретението, ще съдържа имунозащитно или имунолечебно количество от Tat и/или Nef или NefTat и gp 120 антигени и може да бъде приготвена по обичайните методики. Приготвянето на ваксини е общо описано в New Trends and Developments in Vaccines, издадена от Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. Капсулирането c липозоми e описано, например от Fullerton, U.S. патент 4,235,877.Конюгирането на протеини до макромолекули е описано, например, от Likhite,
U.S. патент 4, 372. 945 и от Armor et al., U.S. патент 4,474,757.
Количеството на протеина в доза от ваксината е подбрано като количество, което предизвиква имунозащитна реакция без значителни неблагоприятни странични ефекти при типични ваксини. Това количество ще варира в зависимост от това кой специфичен имунитет се използва.
Общо, очаква се, че всяка доза ще включва 1-1000 pg от всеки протеин, за предпочитане от 2-200 pg, по-специално от 4-40 pg Tat или Nef или NefTat и за предпочитане 1-150 pg, най-вечее 2-25 pg от gp 120. Оптималното количество за дадена ваксина може да бъде установено посредством обичайните проучвания, включващи наблюдаване на тигрите на антитела и други обекти на ответните реакции. Един специален пример на доза ваксина ще включва 20 pg NefTat и 5 или 20 pg от gp 120. След първоначалната ваксинация, субектите могат да получат усилване в период от около 4 седмици и последваща втора подпомагаща имунизация.
Протеините, съгласно изобретението за предпочитане са с помощни добавки в състава на ваксината, съгласно изобретението. Помощните добавки са описани общо във Vaccine Design-the Subunit and Adjuvant Appoach, издадена от Powell and Newman, Plenum Press, New York ,1995.
Подходящите помощни добавки включват алуминиева сол , такава като алуминиев хидроксид гел /alum/ или алуминиев фосфат, но може също да бъде сол на калция, желязото или цинка или може да бъде неразтворима суспензия на ацетилиран тирозин или ацетилирани захари, катийонни или анйонни производни на полизахариди или полифосфазени.
В състава, съгласно изобретението, за предпочитане е съставът на помощните добавки да индуцира преференциална Thl ответна реакция. Обаче, трябва да бъде разбрано, че други ответни реакции, включително други хуморални реакции, не са изключени.
Имунна ответна реакция се генерира към антиген посредством взаимодействие на антигена с клетките на имунната система.Получената в резултат имунна реакция може да бъде ясно разграничена в две екстремни категории, бидейки хуморална или предавана посредством клетка имунни реакции / охарактеризирани традиционно чрез ефекторен механизъм на защита посредством антитяло и клетъчен ефекторен механизъм на защита, съответно/. Тези категории на ответна реакция са обозначени като Thl-тип реакции / реакция предавана посредством клетка / , и ТЬ2-тип имунни реакции / хуморална реакция /.
Екстремният Thl-тип имунни реакции могат да се охарактеризират посредством генериране на специфичен антиген, хаплотип рестриктирани цитотоксични Т лимфоцити и реакция на естествен убиец на клетката. При мишки Th 1-тип реакциите често се характеризират посредством генериране на антитела на IgG2a подтипа, докато при хората те съответстват на IgGl типа антитела. Th2- типът имунни реакции се характеризират посредством генериране на голям обхват имуноглобулинови изотипи, включващи при мишка IgGl, IgA, и IgM.
Може да се счита, че движещата сила зад развитието на тези два типа имунни реакции са цитокините, редица идентифицирани протеинови пратеници, които служат да подпомагат клетките на имунната система и насочват евентуалната имунна реакция или към Thl- или към Т112-типа реакция. Така високите нива на Thl-тип цитокини има тенденция да благоприятства индуцирането на предавани посредством клетката имунни реакции, докато високите нива на Th2- тип цитокини има тенденция да благоприятства индуцирането на хуморалните имунни реакции към антигена.
Важно е да се запомни, че разграничаването на Thl- и Т112-тип имунни реакции не е абсолютно. В действителност един индивид ще поддържа имунна реакция, която се описва, че е преобладаващо Thl w - или преобладаващо Th2. Често, обаче е удобно фамилиите цитокини да се разглеждат от гледна точка на това, описано в миши CD4+ve Т-клетъчни клони от Mosmann and Coffman /Mosmann, T.R. and Coffmann, R.L. /1989/ TH1 и TH2 клетки : различни модели на лимфокинова секреция водят до различни функционални свойства. Annual Review of Immunology, 7 p. 145-173/. Традиционно, Thl-тип ответни реакции са свързани с продукцията на INF- γ и IL-2 цитокини от Т- лимфоцити. Други цитокини често директно свързани с индукцията на ТН1- тип имунни реакции не се продуцират от Т-клетки, такива като IL-12. Обратно, Т112-тип #(”-·=
Известно е, че някои ваксинни помощни добавки са особено подходящи за стимулиране било на Thl-тип или ТИ2-тип цитокинови реакции. Традиционно най-добрите индикатори на Thl: Th2 баланса на имунната реакция след ваксинация или инфекция включват дирекно измерване на продукцията на Thl или Th2 цитокини от Т лимфоцити in vitro след рестимулация с антиген, и/или измерването на IgGl :IgG2a отношението на антиген специфично антитяло реакции.
Така, Thl-тип помощна добавка е тази, която стимулира изолирани Т-клетъчни популации да продуцират високи нива на Thl-тип цитокини, когато са рестимулирани с антиген in Vitro, и индуцира антиген специфични имуноглобулинови реакции, свързани с Thlтип изотип.
Предпочитани Thl-тип имуностимуланти, които могат да продуцират помощни добавки, подходящи за използване, съгласно изобретението, включват, но не се ограничават, до следното.
Монофосфорил липид А, по-специално З-де-О-ацилиран монофосфорил липид A /3D-MPL/, е предпочитан Thl-тип имуностимулант за използване, съгласно изобретението. 3D-MPL е добре позната помощна добавка, произведена от Ribi Immunochem, Montana. Химически често се доставя като смес на З-де-О-ацилиран монофосфорил липид А било с 4, 5 или 6 ацилирани вериги. Може да бъде пречистен и получен по методи, описани в GB 2122204 В, който също описва получаването на дифосфорил липид А, и негови
З-О-деацилирани варианти. Други пречистени и синтетични липополизахариди са описани b/US 6,005,099 и ЕР 0 729 473 В1; Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79/4/:392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60/l/:141-6; EP 0 549 074 В1/. Предпочитана форма но 3D-MPL е във вид на състав от частички, с малки частички с размер по-малък от 0.2цт в диаметър като метод за приготовляването му е описан в ЕР 0 689 454.
Сапонините също са предпочитани Thl имуностимуланти, съгласно изобретението. Сапонините са добре познати помощни добавки и са описани в : Lacaille-Dubois, М и Wagner Н. /1996/ A review of the biological and pharmacological activities of saponins.Phytomedicine vol 2 pp 363-386/. Например, Quil A / произхождащ от кората на Южно Американското дърво Quillaja Saponaria Molina/,и негови фракции са описани в US 5,057,540 , в “Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 /1-2/: 1-55; и в EP 0 362 279 Bl. Хемолитичните сапонини QS21 и QS17 /пречистени с високоефективна течна хроматография, фракции на Quil А / са били описани като потенциални системни помощни добавки и методът за тяхното получаване е описан в US No. 5,057,540 и в ЕР 0 362 279 В1.В тези източници също е описано и използването на QS7 / нехемолитична фракция на Quil-А/ , който действа като потенциална помощна добавка за системни ваксини. Използването на QS21 понататък е описано от Kensil et al. в /1991. J. Immunology vol. 146, 431-437/. Комбинации на QS21 и полисорбат или циклодекстрин също са известни /WO 99/10008/. Раздробени системи на помощни добавки, включващи фракции на QuilA, такива като QS21 и QS7 са описани във WO 96/33739 и WO 96/11711.
Друг предпочитан имуностимулант е имуностимулаторния олигонуклеотид , съдържащ неметилирани CpG динуклеотиди /”CpG”/. CpG е съкращение за цитозин-гуанозин динуклеотидни мотиви, присъстващи в DNA. CpG е известен в тази област на техниката като помощна добавка, когато се внася в организма както по системен, така и по мукозен път. /WO 96/02555, ЕР 468520, Davis et al., J. Immunol, 1998, 160/2/: 870-876; McCluskie and Davis et al., J.
Immunol, 1998, 161/9/: 4463-6 /.Исторически е наблюдавано, че DNA фракцията на BCG може да прояви анти-туморен ефект. При понататъшни изследвания, синтетични олигонуклеотиди, произхождащи от BCG генни последователности, са сочени като способни да индуцират имуностимулаторни ефекти / както in vitro така и in vivo/.Авторите на тези изследвания заключават, че някои палиндромични последователности, включващи централен CG мотив, носят тази активност. Централната роля на CG мотива при имуностимулирането е изяснена по-късно от Krieg, Nature 374, p.546 ,1995. Подробният анализ е показал, че CG мотивът трябва да бъде в някоя последователност контекст, и че такива последователности са обичайни в бактериалната DNA , но са рядкост в DNA на гръбначните. Имуностимулаторната последователност е често : Пурин, Пурин, C,G, пиримидин, пиримидин; където CG мотивът не е метилиран, но други неметилирани CpG последователности са известни като имуностимулатори и могат да бъдат използвани , съгласно изобретението.
При някои комбинации на шест нуклеотида присъства палиндромична последователност. Някои от тези мотиви, при които Ч или се повтаря един мотив или са комбинация от различни мотиви, може да присъства в същия олигонуклеотид. Присъствието на една или повече от тези имуностимулиращи последователности, съдържащи олигонуклеотиди, могат да активират различни имунни подмножества, включително естествения убиец на клетки / който продуцира γ интерферон и притежава цитолитична активност/ и макрофаги /Wooldrige et al. Vol 89 /по.8/,1977/. Други неметилирани CpG, съдържащи последователности, които не притежават тази консенсусна последователност, също са показали, че са имуномодулатори.
CpG , когато е смесен във ваксини, обикновено се внася в организма в свободен разтвор заедно със свободен антиген /WO 96/02555; McCluskie and Davis, supra/ или ковалентно конюгиран към антиген /WO 98/16247/, или във вид на състав е носител, такъв като алуминиев хидроксид //Hepatitis surface antigen/ Davis et al., supra; Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 1998, 95/26/, 155538/.
Такива имуностимуланти, както са описани по-горе, могат да бъдат приготвени заедно е носители, такива като например липозоми, емулсии масло във вода, и или метални соли, включително алуминиеви соли / такива като алуминиев хидроксид/. Например, 3D-MPL може да бъде смесен е алуминиев хидроксид /ЕР 0 689 454 / или приготвен във вид на емулсии масло във вода /WO 95/17210/; QS21 може за предпочитане да бъде смесен с холестерол съдържащи липозоми /WO 96/33739/, да бъде във вид на водни емулсии /WO 95/17210/ или стипца /WO 98/15287/; CpG може да бъде смесен със стипца /Davis et al. supra; Brazolot-Millan, supra/ или е други катийонни носители.
Комбинации на имуностимуланти също са предпочитани, поспециално комбинация на монофосфорил липид А и на сапониново производно /WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241/, най-вече комбинацията на QS21 и 3D-MPL, както е описана във WO 94/00153.Алтернативно, комбинация на CpG плюс сапонин, такъв като QS21 също формира мощна помощна добавка за прилагане, съгласно изобретението.
Така, подходящите системи от помощни добавки включват, например, комбинация на монофосфорил липид А , за предпочитане
3D-MPL, заедно с алуминиева сол. Подобрена система включва комбинацията на монофосфорил липид А и сапониново производно, по-специално комбинацията на QS21 и 3D-MPL, както е описана във WO 94/00153, или по-малко реактогенна комбинация, където QS21 е уловен в холестерол съдържащи липозоми /DQ/както е разкрито в / WO 96/33739/.
Съставът на особено мощна помощна добавка, включваща QS21 , 3D-MPL & токоферол, под формата на емулсия масло във вода е описан във WO 95/17210 и е друг предпочитан състав за приложение, съгласно изобретението.
Друг предпочитан състав съдържа CpG олигонуклеотид самостоятелно или заедно с алуминиева сол.
При друг аспект на изобретението, ваксината може да съдържа DNA , кодираща един или повече Tat,Nef и gpl20 полипептиди, така че полипептидът е образуван in situ. DNA може да присъства във всяка една от множеството доставящи системи, известни на специалиста в дадената област на техниката, включващи експресионни системи на нуклеинова киселина, такива като плазмид DNA , бактериални и вирусни експресионни системи. В тази област на техниката са известни множество методики за доставяне на ген, такива като онези, описани от Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15 :143-198, 1998 и цитираните там източници.
Подходящите експресионни системи на нуклеинова киселина съдържат необходимите DNA последователности за експресия в пациента / такива като подходящ промотор и завършващ сигнал/. Когато експресионната система е рекомбинантен жив организъм, такъв като вирус или бактерия, представляващият интерес ген може да бъде въведен в генома на живия рекомбинантен вирус или бактерия. Инокулирането и in vivo инфекцията с този жив вектор ще доведат до in vivo експресия на антигена и индуциране на имунни реакции. Вирусите и бактериите, използвани за тази цел са например поксвирусите /например vaccinia, fowlpox, canarypox, модифицирани поксвируси, например Modified Virus Ankara / MV А/ /, алфавирусите / Sindbis virus, Semliki Forest Virus, Venezuelian Equine Encephalitis Virus/ , флавивирусите /вируса на жълта треска, Dengue virus, Japanese encephalitis virus /, аденовирусите, аденосвързаните вируси, пикорнавирусите / полио вирус , риновирус/, херпесвирусите / варицела зостер вирус и др./, Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. . Тези вируси и бактерии могат да бъдат вирулентни или отслабени по различен начин, за да се получат живи ваксини. Такива живи ваксини съща са част от изобретението.
Така, Nef, Tat и gpl20 компонентите на предпочитана ваксина, съгласно изобретението, могат да бъдат осигурени под формата на полинуклеотиди, кодиращи желаните протеини.
Нещо повече, имунизациите, съгласно изобретението, могат да бъдат осъществени с комбинация на състави на база протеин и DNA . Първоначалните-усилващи имунизации се считат за ефективни при индуциране на обширни имунни реакции. Протеиновите ваксини с помощни добавки индуцират основно антитела и Т помощни имунни реакции, докато доставянето на DNA като плазмид или жив вектор индуцира силни цитотоксични Т лимфоцитни /CTL/ реакции. Така, комбинацията на протеин и DNA ваксинация ще осигури голямо разнообразие от имунни реакции. Това особено се отнася в контекста на HIV, тъй като както неутрализиращите антитела така и CTL се смята, че са от значение за имунната защита срещу HIV. Съгласно изобретението схемата за ваксинация с gp 120, Nef nTat, самостоятелно или в комбинация, може да включва последователната / “първична-усилваща”/ или едновременното въвеждане в организма на протеин антигени и DNA, кодираща споменатите по-горе ,протеини. DNA може да бъде доставена като плазмид DNA или под формата на рекомбинантен жив вектор, например поксвирусен вектор или всякакъв друг подходящ жив вектор, такъв като онези, описани тук. Протеиновите антигени могат да бъдат инжектирани еднократно или няколко пъти, последвани от еднократно или няколкократно въвеждане на DNA, или DNA може да бъде използвана първо за еднократно или няколкократно въвеждане в организма, последвани от една или повече протеинови имунизации.
Специален пример на първична-усилваща имунизация, съгласно ...... изобретението, включва зареждане е DNA, под формата на w· рекомбинантен жив вирус, такъв като модифициран поксвирусен вектор, например Modified Virus Ankara /MVА/ или алфавирус, например Venezuelan Equine Encephalitis Virus, последвано от усилване с протеин, за предпочитане протеин е помощна добавка. Така изобретението понататък осигурява фармацевтичен комплект, съдържащ :
а/ състав, съдържащ един или повече gpl20, Nef и Tat протеини заедно с фармацевтично приемлив инертен носител; и б/ състав, съдържащ един или повече gpl20 , Nef nTat -кодиращи Ч* протеини заедно с фармацевтично приемлив инертен носител;
при условие, че поне един от съставите /а/ или /б/ съдържа gp 120 е Nef и/или Tat и/или Nef -Tat.
Съставите а/ и б/ могат да бъдат въвеждани поотделно, във всякакъв ред, или заедно. За предпочитане а/ съдържа всичките три gpl20, Nef и Tat протеини. За предпочитане б/ съдържа всичките три gpl20, Nef nTat DNA. Най-вече е за предпочитане Nef и Tat да са под формата на NefTat слят протеин.
В понататъшен аспект изобретението осигурява метод за получаване на ваксинния състав, както е описан тук, при което методът включва смесване на комбинация от протеини, съгласно изобретението. Протеиновият състав може да бъде смесен с подходяща помощна добавка и, по желание, с носител.
Особено предпочитани комбинации от помощни добавки и/или носител, за използване в съставите, съгласно изобретението, са следните:
1/3D-MPL+QS21 в DQ
2/ стипца +3D-MPL
3/ стипца +QS21 DQ + 3D-MPL
4/ стипца +CpG
5/ 3D-MPL + QS21 DQ +емулсия масло във вода
6/ CpG
Изобретението е илюстрирано с придружаващите примери и Фигури
ПРИМЕРИ
Общ
Nef генът от Bru/Lai изолат /Cell 40 : 9-17,1985/ е селектиран за конструкциите на тези опити, тъй като този ген е сред онези, които са най-близко свързани към консенсусния Nef. Изходният материал за Bru/Lai Nef гена е 1170 bp DNA фрагмент, клониран върху експресионен вектор на бозайник pcDNA3 /pcDNA3/Nef/.
Tat генът произхожда от ВН10 молекулярен клон. Този ген е получен като HTLV III cDNA клон, наречен pCVl и описан в Science, 229, р 69-73, 1985.
Експресията на Nef и Tat гените може да бъде в Pichia или всеки друг приемник.
Пример 1. ЕКСПРЕСИЯ НА HIV-lnef и Tat ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИ В PICHIA PASTORIS.
Nef протеинът, Tat протеинът и слетият Nef-Tat се експресират в метилотрофните дрожди Pichia pastoris под контрола на индуцируемия алкохол оксидазен /АОХ1/ промотор.
За да се експресират тези HIV-1 гени се използва модифицирана версия на интегративния вектор PHIL-D2 /INVITROGEN/. Този вектор е модифициран по такъв начин, че експресията на хетероложни протеини започва веднага след нативния ATG кодон на АОХ1 гена и продуцира рекомбинантен протеин с край на един глицин и шест хистидинови остатъка. Този PHIL-D2-MOD вектор е конструиран чрез клониране на олигонуклеотиден линкер между съседните Asull и EcoRI места на PHIL-D2 вектора / виж Фигура 2/. В допълнение на His края, този линкер носи Ncol, Spel и Xbal рестрикционни места между които са въведени nef, tat и слетия neftat.
1.1 ИЗГРАЖДАНЕ НА ИНТЕГРАТИВНИТЕ ВЕКТОРИ pRIT1497 / кодиращ Nef-His протеин/, pRIT14598 /кодиращ Tat-His протеин/ и pRIT14599 /кодиращ слят Nef-Tat-His/
Nef генът се увеличава чрез PCR от pcDNA3/Nef плазмида с праймерите 01 и 02.
Ncol
IIPAftMEPOl/SeqIDNOl/: 5ATCGTCCATGGGT.GGCAAG.TGGT3·
Spel
IIPABMEP02/Seq ID NO 2/: 5’ CGGCTACTAGTGCAGTTCTTGAA3 ’ Полученият PCR фрагмент и интегративният PHIL-D2-MOD вектор се рестриктират и двата с Ncol и Spel, пречистват се върху агарозен гел и се лигатират за да създадат интегративния плазмид pRIT14597 /виж фигура 2 /.
tat генът се увеличава с PCR от производно на pCVl плазмида с праймери 05 и 04:
Spel nPAHMEP04/SeqIDNO4/: 5’CGGCTACTAGTTTCCTTCGGGCCT3’ Ncol nPAMVEP05/SeqIDNO5/: 5’ATCGTCCATGGAGCCAGTAGATC3’ Едно Ncol рестрикционно място се въвежда при 5’ края на PCR фрагмента докато Spel място се въвежда при 3’ края с праймер 04. Полученият PCR фрагмент и PHIL-D2-MOD вектора се рестриктират и двата с Ncol и Spel, пречистват се върху агарозен гел и се лигатират за да създадат интегративния плазмид pRIT14598.
За създаването на pRIT14599, 910 bp DNA фрагмент, съответстващ на nef-tat-His, кодираща последователност се лигатира между EcoRI притъпено /Т4 полимераза/ и Ncol места на PHIL-D2-MOD вектора. nef-tat-His кодиращият фрагмент се получава чрез Xbal притъпено /Т4 полимераза/ и Ncol усвояване на pRIT 14596.
1.2 ТРАНСФОРМАЦИЯ НА PICHIA PASTORIS ВИДА GS115/his4/.
За получаване на Pichia pastoris видове, експресиращи Nef-His, TatHis и Nef-Tat-His, видът GS115 се трансформира с линейни Notl фрагменти, носещи съответните експресионни касети плюс HIS4 гена до запълване на his4 в приемния геном. Трансформацията на GS115 с Notl-линейни фрагменти благоприятства рекомбинацията при AOXI мястото.
Многокопийни интегрантни клони се селектират чрез количествен дот блот анализ и се определят типа на интеграция, въвеждане /Mut+ фенотип/ или трансполагане /Muts фенотип/.
От всяка трансформация,се избира един трансформант,показващ високо ниво на продукция за рекомбинантния протеин:
Вид Y1738 /МиГфенотип/, продуциращ рекомбинантния Nef-His протеин, миристилиран протеин с 215 амино киселини, който е съставен от :
• миристинова киселина • метионин, създаден чрез използването на Ncol клониращо място на PHIL-D2-MOD вектора • 205 а.к. на Nef протеина / започващ при а.к.2 и разпростиращ се до а.к. 206 / • Треонин и серин, създадени чрез клонираща методика /клониране при Spel място на PHIL-D2-MOD вектора/.
• Един глицин и шест хистидина.
Вид Y1739 /МиРфенотип/, продуциращ Tat-His протеин, протеин с
а.к., който е съставен от :
• Метионин, създаден чрез използването на Ncol клониращо място • 85 а.к. на Tat протеина / започващ при а.к. 2 и разпростиращ се до а.к.86/ • Треонин и серин, въведен чрез клонираща методика • Глицин и шест хистидина
Вид Y1737/Mut* фенотип/ продуциращ рекомбинантния Nef-TatHis слят протеин, миристилиран протеин с 302 амино киселини, който е съставен от:
• Миристинова киселина • Метионин, създаден чрез използването на Ncol клониращо място • 205 а.к. на Nef протеина / започващ при а.к. 2 и разпростиращ се до а.к. 206/ • Треонин и серин, създадени чрез клонираща методика • 85 а.к. на Tat протеина / започващ при а.к.2 и разпростиращ се до а.к. 86/ • Треонин и серин, въведени чрез методика на клониране • Един глицин и шест хистидина
Пример 2. ЕКСПРЕСИЯ НА HIV-1 Tat -МУТАНТ В PICHIA PASTQRIS
Експресиран е също мутантен рекомбинантен Tat протеин. Мутантният Tat протеин трябва да бъде биологично неактивен докато поддържа имуногенните си епитопи.
За тези конструкции се селектира двоен мутантен tat ген, създаден от D.Clements /Tulane University/.
Този tat ген / произхождащ от ВН10 молекулярен клон/ носи мутации в областта на активното място /Lys41-> Ala/ и в RGD мотива /Arg78 -+Lys и Asp80-> Glu/ /Virology 235: 48-64, 1997/.
Мутантният tat ген е получен като cDNA фрагмент субклониран между EcoRI и Hindlll местата с CMV експресионен плазмид /pCMVLys41/KGE/.
2.1 КОНСТРУКЦИЯ НА ИНТЕГРАТИВНИ ВЕКТОРИ pRIT14912 /кодиращ Tat мутантен- His протеин/ и pRIT14913 /кодиращ слят Nef-Tat мутантен- His/
Tat мутантният ген се увеличава чрез PCR от pCMVLys41/KGE плазмид с праймери 05 и 04 / виж секция 1.1 конструкция на PRIT14598/.
Въвежда се едно Исо1рестрикционно място при 5’ края на PCR фрагмента докато Spel място се въвежда при 3’ края с праймер 04. Полученият PCR фрагмент и PHIL-D2-MOD векторът и двата се рестриктират посредством Ncol и Spel, пречистват се върху агарозен гел и се лигатират за създаване на интегративния плазмид PRIT14912.
За конструирането на pRIT14913 tat мутантният ген се увеличава чрез PCR от pCMVLys41/KGE плазмид с праймери 03 и 04.
Spel ripafiMep03/SeqIDNO3/: 5’ATCGTACTAGT.GAG.CCA.GTA.GAT.C3’
Spel
IlpaHMepOd/SeqlDNO 4/: 5’ CGGCTACTAGTTTCCTTCGGGCCT3 ’ Полученият PCR фрагмент и плазмидът pRIT14597 /експресиращ Nef-His протеин / и двата се усвояват посредством Spel рестрикционен ензим, пречистват се върху агарозен гел и се лигатират до създаването на интегративния плазмид pRIT14913.
2.2 ТРАНСФОРМАЦИЯ НА PICHIA PASTORIS BHZJGSl 15 Pichia pastoris видовете, експресиращи Tat мутантен -His протеин и слят Nef-Tat мутантен -His, се получават посредством прилагане на интеграционни и рекомбинантни методики на видова селекция, описани по-горе в секция 1.2.
Избрани са два рекомбинантни вида, продуциращи Tat мутантенHis протеин, протеин с 95 а.к.: Y1775/Mut+ фенотип / и ¥1776/МиТфенотип /.
Избран е един рекомбинантен вид, експресиращ Nef-Tat мутантен His слят протеин, протеин с 302 a.K.:Y1774/Mut+ фенотип /.
Пример 3: ФЕРМЕНТАЦИЯ НА PICHIA PASTORIS ПРОДУЦИРАЩ РЕКОМБИНАНТ TAT-HIS
Типичен процес е описан в таблицата, поместена тук по-долу.
Ферментацията включва растежна фаза / хранене със среда на база глицерол съгласно подходяща крива/ водеща до клетъчна култура с висока плътност и индукционна фаза / хранене с метанол и разтвор на соли/микро-елементи/. По време на ферментацията растежът се следи посредством вземане на проби и измерване на абсорбцията им при 620 пт.По време на индукционната фаза метанолът се добавя с помощта на помпа и неговата концентрация се наблюдава с помощта на газ хроматография / върху проби от културата / и с помощта на
Затопляне на посявката
Ф
Твърда пре дв. култура
30°С, 14-16Н
Ф
Течна предв. култура в 2 л ерленмайер 30°С,200об/мин г
Инокулиране на 20л ферментатор он-лайн газов анализ с мас спектрометър. След ферментацията клетките се събират чрез центрофугиране при 5020 г в продължение на 30’ при 2-8°С и клетъчната паста се съхранява при - 20°С. За понататъшна работа клетъчната паста се затопля, суспендира се отново при OD /при 620 пт/на 150 в буфер /Na2HPO4pH7 50 mM,PMSF 5%, изопропанол 4 тМ/ и се раздробява посредством четирикратно преминане през DynoMill / отделение 0.6L, 3000 об/мин., 6L/H, топчета с диаметър 0.40-0.70 тш/.
За оценяване на експресията се вземат проби по време на индукцията, раздробяват се и се анализират чрез SDS-Page или Western блот. Върху оцветени с Coomassie блу SDS-гелове рекомбинантът Tat-his ясно се идентифицира като интензивна ивица, с максимален интензитет след около 72-96Н индукция.
Синтетична среда: YNB+глюкоза+агар
Синтетична среда:2 х 400 мл YNB+глицерол спира,когато OD>1 / 620шп/
5л първ. среда /FSC006AA/
Змл антипенител SAG471 /от Witco/
Температура: 3 0°С Свръх налягане: 0.3 barg Въздушен поток:20 Nl/min г
Ферментация :растежна фаза продължителност около 40Н
Ферментация:индукционна фаза, продължителност до97Н
Центрофугиране
Ф
Извличане на клетъчната паста и съхранение при-20°С
Ф
Затопляне на клетките и повт. суспендиране при OD 150/620пт/ в буфер
Ф
Раздробяване на клетките eDynomill 4 пасажа
Разтворен О2: регулиран >40% pH: регулиран на 5 е NH4OH
Хранене със среда на база глицерол FFB005AA крайна OD 200-500 OD/620nm/
Хранене е метанол и р-р на соли/микроелементи/Р8Е021АВ/
5020г/30мин/2-8°С
Буфер:Иа2НРО4 рН7 50шМ,
PMSF 5%, изопропанол 4 шМ
Dyno-mill/отделениеО. 6L,
ЗОООоб/мин, 6L/H, топчета с диам.0.40-0.70тт/
Ф
Прехвърляне за екстракция/ пречистване
Среда,използвана за ферментация:
Твърда предв.култураУУЛВ +глюкоза +агар/
Глюкоза 10 г/л Na2MoO4 0.0002г/л Фолиева 0.000064
.2Н2О к-на г/л
КН2РО4: 1г/л MnSO4.H 0.0004 г/л инозитол: 0.064 г/л
20:
MgSO4. 0.5 г/л НЗВОЗ: 0.0005 г/л пиридокс 0.008 г/л
7Н2О ин:
СаС12. 0.1 г/л KI: 0.0001 г/л тиамин: 0.008 г/л
2Н2О
NaCl: 0.1 г/л СоС12.6Н 0.00009 ниацин: 0.000032
20: г/л г/л
FeC13. 0.0002 г/л Рибофлав 0.000016 Пантотен 0.008 г/л
6Н2О: ин: г/л ат Са:
CuSO4. 0.00004 биотин: 0.000064 Пара- 0.000016
5Н2О: г/л г/л аминобен г/л
зоена к-
на
ZnSO4. 0.0004 г/л /NH4/2SO 5 г/л агар 18 г/л
7H2O: 4:
Течна предв. култура, / YNB + глицерол/
глицерол: 2%/обем/ обем/ Na2MoO4 .2Н2О: 0.0002 г/л Фолиева к-на 0.000064 г/л
КН2РО4: 1 г/л MnSO4. 0.0004 г/л инозитол: 0.064 г/л
Н2О:
MgSO4. 0.5 г/л НЗВОЗ: 0.0005 г/л пиридокс 0.008 г/л
7Н2О: ин:
СаС12. 0.1 г/л KI: 0.0001 г/л тиамин: 0.008 г/л
2Н2О:
NaCl: 0.1 г/л СоС12.6Н 0.00009 ниацин: 0.000032
20: г/л г/л
FeC13. 0.0002 г/л рибофлав 0.000016 пантотен 0.008 г/л
6Н2О ин: г/л ат Са:
CuSO4. 0.00004 биотин: 0.000064 пара- 0.000016
5Н2О: г/л г/л аминобен г/л
зоена к-
на
ZnSO4. 0.0004 г/л /NH4/2SO 5 г/л
7Н2О: 4:
Първоначално зареждане на ферментатора:/ FSC006AA/
/NH4/2SO4: 6.4 г/л
КН2РО4: 9 г/л Na2MoO4. 2Н2О 2.04 мг/л
MgSO4.7H2O 4.7 г/л MnSO4.H2O: 4.08 мг/л
СаС12.2Н2О: 0.94 г/л НЗВОЗ: 5.1 мг/л
FeC13.6H2O: 10 мг/л KI: 1.022 мг/л
НС1: 1.67 мл/л СоС12.6Н2О: 0.91 мг/л
CuSO4.5H2O: 0.408 мг/л NaCl: 0.06 г/л
ZnSO4.7H2O: 4.08 мг/л биотин 0.534 мг/л
Хранителен разтвор, използван за растежната фаза ZFFB005AA/
глицерол 38.7% обем/обем Na2MoO4. 2Н2О: 5.7 мг/л
MgSO4.7H2O: 13 г/л CuSO4.5H2O: 1.13 мг/л
СаС12.2Н2О: 2.6 г/л СоС12.6Н2О: 2.5 мг/л
FeC13.6H2O: 27.8 мг/л НЗВОЗ: 14.2 мг/л
ZnSO4.7H2O: 11.3 мг/л биотин 1.5 мг/л
MnSO4.H2O: 11.3 мг/л KI: 2.84 мг/л
КН2РО4: 24.93 г/л NaCl: 0.167 г/л
Хранителен разтвор на соли и микро-елементи, използван по време на индукцията / FSE021АВ/:
КН2РО4: 45 г/л Na2MoO4. 2Н2О: 10.2 мг/л
MgSO4.7H2O: 23.5 г/л MnSO4.H2O: 20.4 мг/л
СаС12.2Н2О: 4.70 г/л НЗВОЗ: 25.5 мг/л
NaCI: 0.3 г/л KI: 5.11 мг/л
НС1: 8.3 мл/л СоС12.6Н2О: 4.55 мг/л
CuSO4.5H2O: 2.04 мг/л FeC13.6H2O: 50.0 мг/л
ZnSO4.7H2O: 20.4 мг/л биотин 2.70 мг/л
Пример 4: ПРЕЧИСТВАНЕ НА Nef-Tat-His СЛЯТ ПРОТЕИН / PICHIA PASTORIS /
Схемата на пречистване е развита от 146 г рекомбинантни PICHIA PASTORIS клетки (мокро тегло) или 2 л Dyno-iil хомогенат OD 55.Хроматографските етапи са развити при стайна температура. Между етапите, Nef-Tat позитивните фракции се държат цяла нощ в студената стая / + 4°С/; за по дълго време пробите се замразяват при -20°С.
146 г PICHIA PASTORIS клетки
Ф
Хомогенизиране Буфер:2л 50mM РО4 pH 7.0 крайна OD : 50
Ф
Dyno-mill раздробяване /4 пасажа/
Ф центрофугиране
JA10 ротор/9500об/мин/30 мин/стайна температура
φ
Dyno-mill /пелети/
Φ промиване /1 час-4°С/
Φ центрофугиране
Φ пелети
Φ солюбилизиране
Φ редукция /4ч-стайна температура- на тъмно/ ф
карбамидометилиране /1/2ч-стайна температура-на тъмно/
Ф
Буфер: + 2л 10 mM РО4 pH 7.5150 тМ-NaCI 0.5% емпиген
JA10 ротор/9500об/мин/30 мин/стайна температура
Буфер :+660 мл 10 mM РО4 pH
7.5-150 мМ NaCl-4.0M GuHCl +0.2М 2-меркаптоетан сулфонова киселина,натриева сол /прибавяне пудра/ pH нагласено на 7.5 / с 0.5 М р-р на
NaOH/преди инкубиране +0,25М йодоацетамид / прибавяне пудра/ pH нагласено на 7.5 / с 0.5 М р-р на
NaOH/преди инкубиране афинитетна хроматография РО4 pH 7.5-150 mM NaCl-4.0M имобилизиране метални йони Еквилибрационен буфер: 10 тМ върху Ni '-NTA-агароза /Quagen- GuHCl
30 мл смола/ Промиващбуфер: 1/еквилибрационен буфер 2/ 10 тМ РО4 pH 7.5-150 тМ NaCl-6 М карбамид 3/ 10 мМ РО4 pH 7.5-150 тМ NaCl-6 М карбамид-25 тМ имидазол Елуиращ буфер: 10 тМ РОд pH 7.5-150 тМ NaCl-6 М карбамид -0.5 М имидазол
разреждане Надолу към йонна концентрация 18 MS/cm2 Разреждащ буфер: 10 тМ РОд pH 7.5-6.0 М карбамид
Катйон обменна хроматография Еквилибрационен буфер: 10 мМ върху SP Сефароза FF РО4 pH 7.5-150 mM NaCl-6.0M /Pharmacia-ЗО мл смола / карбамид
Промиващбуфер:
1/еквилибрационен буфер
2/ 10 мМ РО4 pH 7.5-250 мМ
NaCl-6 М карбамид
Елуиращ буфер: 10 тМ борат pH
9.0- 2М NaCl-6 М карбамид
концентриране
Ф
Г елфилтрационна хроматография върху Superdex 200 ХК 16/60 /Pharmacia-120 мл смола/ г
диализа /O/N-4°C/ г
до 5 мг/мл kDa Omega мембрана /Filtron/
Елуиращ буфер: ЮмМ РО4 pH
7.5-150мМ NaCl-б.М карбамид 5 мл проба/ инжекция—>5 инжекции
Буфер: ЮмМ РО4 pH 6.8-150 мМ NaCl-0.5M Аргинин*
Millex GV 0,22 pm стерилно филтруване * отношение: 0,5М аргинин за протеин концентрация 1600 pg/ml.
Чистота
Степента на чистота, оценена с помощта на SDS-PAGE, е показана на фигура 3 посредством Daiichi Silver Staining и на Фигура 4 посредством Coomassie blue G250.
След Superdex200 етапа: >95%
След етапа на диализа и стерилно филтруване: >95%
Извличане мг Nef-Tat-his протеин са пречистени от 146г рекомбинантни Pichia pastoris клетки /влажно тегло /=2л Dyno-mill хомогенат OD 55/.
Пример 5: ПРЕЧИСТВАНЕ НА ОКИСЛЕН NEF-TAT-HIS СЛЯТ ПРОТЕИН В PICHIA PASTORIS
Схемата на пречистване е развита от 73 г рекомбинантни Pichia pastoris клетки / влажно тегло/ или 1 л Dyno-mill хомогенат OD 50.Хроматографските етапи се осъществяват при стайна температура. Между етапите, Nef-Tat позитивните фракции се съхраняват в студена стая / + 4°С /; за по-дълъг период от време, пробите се замразяват при -20°С.
г Pichia pastoris клетки
Чи»·'
Ф хомогенизиране
Ф
Dyno-mill раздробяване / 4 пасажа/
Ф центрофугиране ф
Dyno-mill пелети ф
Промиване /2ч-4°С/ ф
центрофугиране
Ф
Буфер: 1л 50 mM РО4 pH 7.0Pefabloc 5тМ крайна OD : 50
JA10 ротор /9500об/мин/30 мин/стайна температура
Буфер: +1л 10 mM РО4 pH 7.5150 тМ NaCl-0.5% Empigen
JA10 ротор /9500об/мин/30 мин/стайна температура пелети солюбилизиране /O/N-4°C/
Φ имобилизиране метални йони афинитетна хроматография върху Nf -NTA-агароза /Quagen15 мл смола/ разреждане
Буфер: 330 мл 10 mM РО4 pH 7.5150 тМ NaCl-4.0MGuHCl
Еквилибрационен буфер: 10 тМ РО4 pH 7.5-150 тМ NaCM.OM GuHCl
Промиващбуфер:
1/еквилибрационен буфер
2/ 10 тМ РО4 pH 7.5-150 тМ
NaCl-6 М карбамид
3/ 10 тМ РО4 pH 7.5-150 тМ NaCl-6 М карбамид-25 тМ имидазол
Елуиращ буфер: 10 тМ РО4 pH
7.5-150 тМ NaCl-6 М карбамид -0.5 М имидазол надолу към йонна концентрация 18MS/cm2
Разреждащ буфер: 10 тМ РО4 pH
7.5-6.0 М карбамид
Катйон обменна хроматография Еквилибрационен буфер: 10 тМ върху SP Сефароза FF РО4 pH 7.5-150 мМ NaCl-6.0M /Pharmacia-7 мл смола / карбамид
Промиващбуфер:
1/еквилибрационен буфер
2/ 10 mM РО4 pH 7.5-250 тМ
NaCl-6 М карбамид
Елуиращ буфер: 10 тМ борат pH
9.0- 2М NaCl-6 М карбамид
концентриране до 0.8мг/мл диализа kDa Omega мембрана /Filtron/
Буфер: ЮмМ РО4 pH 6.8-150 тМ /O/N-4°C/
NaCl-0.5M Аргинин
стерилно филтруване
Millex GV 0,22pm
-^•Степента на чистота, оценена с помощта на SDS-PAGE, е показана на фигура 6 / Daiichi Silver Staining , Coomassie blue G250, Western blotting/:
След етапа на диализа и стерилно филтруване: >95% —>Извличане /оценено чрез колориметричен анализ на протеини: DOC ТСА ВСА/
2.8 мг окислен Nef-Tat-his протеин са пречистени от 73г рекомбинантни Pichia pastoris клетки/влажно тегло/ или 1 л Dynomill хомогенат OD 50.
Пример 6: ПРЕЧИСТВАНЕ НА РЕДУЦИРАН TAT-HIS
ПРОТЕИН /PICHIA PASTORIS/
Схемата на пречистване е развита от 160 г рекомбинантни Pichia pastoris клетки / влажно тегло/ или 2 л Dyno-mill хомогенат OD бб.Хроматографските етапи се осъществяват при стайна температура. Между етапите, Tat позитивните фракции се съхраняват в студена стая / + 4°С /; за по-дълъг период от време, пробите се замразяват при -20°С.
160 г Pichia pastoris клетки
Ф хомогенизиране
Ф
Dyno-mill раздробяване / 4 пасажа/
Ф центрофугиране г
Dyno-mill пелети
Ф
Промиване /1ч-4°С/
Ф центрофугиране г
пелети
Ф солюбилизиране
Буфер: 2л 50 мМ РО4 pH 7.04тМ PMSF крайна OD : 66
JA10 ротор /9500об/мин/30 мин/стайна температура
Буфер: +2л 10 mM РО4 pH 7.5150 mM NaCl-1% Empigen
JA10 ротор /9500об/мин/30 мин/стайна температура
Буфер:+ 660 мл 10 mM РО4 pH /0/N-4°C/
Φ центрофугиране
7.5-150 mM NaCl-4.0MguHCl
JA10 ротор /9500об/мин/30 мин/стайна температура редукция +0.2М 2-меркаптоетан сулфонова /4ч-стайна температура- на тъмно/
Ф кисена,натриева сол /прибавяне пудра/ pH нагласено на 7.5 / с 1 М р-р на NaOH/преди инкубиране карбамидометилиране +0,25М йодоацетамид / /1/2ч-стайна температура-на прибавяне пудра/ pH нагласено тъмно/ на 7.5 / с 1 М р-р на NaOH/преди инкубиране имобилизиране метални йони афинитетна хроматография върху Ni~-NTA-arapo3a /QuagenЕквилибрационен буфер: 10 тМ
РО4 pH 7.5-150 тМ NaCM.OM
GuHCl мл смола/
Промиващбуфер:
1/еквилибрационен буфер
2/ 10 тМ РО4 pH 7.5-150 тМ
NaCl-6 М карбамид
3/ 10 тМ РО4 pH 7.5-150 тМ
NaCl-6 М карбамид-25 тМ имидазол
Елуиращ буфер: 10 тМ РО4 pH
7.5-150 mM NaCl-6 M карбамид
-0.5 M имидазол разреждане надолу към йонна концентрация
MS/cm2 разреждащ буфер: 20 тМ борат pH 8.5-6.0 М карбамид
Катйон обменна хроматография Еквилибрационен буфер: 10 тМ върху SP Сефароза /Pharmacia-ЗО мл смола /
FF борат pH 8.5-150 mM NaCl-6.0M карбамид
Промиващб уфер: еквилибрационен буфер
Елуиращ буфер: 20 тМ борат pH
8.5- 400тМ NaCl-6.0 М карбамид
концентриране до 1.5 мг/мл kDa Omega мембрана /Filtron/
диализа /O/N-4°C/ Буфер: ЮмМ РОд цН 6.8-150 тМ NaCl-0.5M Аргинин
стерилно филтруване Millex GV 0,22pm
->Степента на чистота, оценена е помощта на SDS-PAGE, е показана на Фигура 7/ Daiichi Silver Staining , Coomassie blue G250, Western blotting/:
След етапа на диализа и стерилно филтруване: >95%
-^Извличане /оценено чрез колориметричен анализ на протеини: DOC ТСА ВСА/ мг Tat-his протеин са пречистени от 160 г рекомбинантни Pichia pastoris клетки/влажно тегло/ или 2 л Dyno-mill хомогенат OD 66.
Пример 7: ПРЕЧИСТВАНЕ НА ОКИСЛЕН TAT-HIS ПРОТЕИН /PICHIA PASTORIS/
Схемата на пречистване е развита от 74 г рекомбинантни Pichia pastoris клетки / влажно тегло/ или 1 л Dyno-mill хомогенат OD бО.Хроматографските етапи се осъществяват при стайна температура. Между етапите, Tat позитивните фракции се съхраняват в студена стая / + 4°С /; за по-дълъг период от време, пробите се замразяват при -20°С.
г Pichia pastoris клетки
Ф хомогенизиране Буфер: 1л 50 mM РО4 pH 7.0-5 mM Pefabloc 5 крайна OD : 60
Ф
Dyno-mill раздробяване / 4 пасажа/
Ф центрофугиране JA10 ротор /9500об/мин/30 мин/стайна температура
Ф
Dyno-mill пелети
Φ
Промиване /1ч-4°С/
Φ центрофугиране
Φ пелети г солюбилизиране /O/N-4°C/ г центрофугиране
Ф имобилизиране метални йони афинитетна хроматография върху Ni -NTA-агароза /Quagen30 мл смола/
Буфер: +1л 10 mM РО4 pH 7.5150 mM NaCl-1% Empigen
JA10 ротор /9500об/мин/30 мин/стайна температура
Буфер: 330 мл 10 мМ РО4 pH 7.5150 mM NaCM.OMGuHCl
JA10 ротор /9500об/мин/30 мин/стайна температура
Еквилибрационен буфер: 10 тМ РО4 pH 7.5-150 тМ NaCM.OM GuHCl
Промиващбуфер:
1/еквилибрационен буфер
2/ 10 тМ РО4 pH 7.5-150 тМ
NaCl-6 М карбамид
3/ 10 мМ РО4 pH 7.5-150 мМ NaCl- 6 М карбамид-35 тМ имидазол
Елуиращ буфер: 10 тМ РО4 pH
7.5-150 mMNaCl-6 М карбамид
-0.5 М имидазол
разреждане надолу към йонна концентрация 12 mS/cm Разреждащ буфер: 20тМ борат pH 8.5-6 М карбамид
Катийон обменна хроматография върху SP Сефароза FF /Pharmacia-15 мл смола /
Еквилибрационен буфер: 20 тМ борат pH 8.5-150 mM NaCl-6.0M карбамид
Промиващбуфер:
1/еквилибрационен буфер
2/ 10 тМ борат pH 8.5-400 тМ
NaCl-60 М карбамид
Елуиращ буфер: 20 тМ пиперазин pH 11- 2М NaCl-6 М карбамид
концентриране диализа /O/N-4°C/ до 1.5 мг/мл kDa Omega мембрана /Filtron/
Буфер: ЮтМ РО4 pH 6.8-150 mM
NaCl-0.5M Аргинин стерилно филтруване Millex GV 0,22pm —>Степента на чистота, оценена с помощта на SDS-PAGE, е показана на фигура 8 / Daiichi Silver Staining , Coomassie blue G250, Western blotting/:
След етапа на диализа и стерилно филтруване: >95%
-^Извличане /оценено чрез колориметричен анализ на протеини: DOC ТСА ВСА/ мг окислен Tat-his протеин са пречистени от 74г рекомбинантни Pichia pastoris клетки/влажно тегло/ или 1 л Dyno-mill хомогенат OD w 60.
Пример 8: ПРЕЧИСТВАНЕ НА SIV РЕДУЦИРАН NEF-HIS ПРОТЕИН /PICHIA PASTORIS/
Схемата на пречистване е развита от 340 г рекомбинантни Pichia pastoris клетки / влажно тегло/ или 4 л Dyno-mill хомогенат OD 100. Хроматографските етапи се осъществяват при стайна температура. Между етапите, Nef позитивните фракции се съхраняват в студена стая / + 4°С /; за по-дълъг период от време, пробите се замразяват при -20°С.
340 г Pichia pastoris клетки ф
хомогенизиране Буфер: 4л 50 шМ РО4 pH 7.0PMSF 4шМ крайна OD : 100
Ф
Dyno-mill раздробяване / 4 пасажа/ г
центрофугиране
JA10 ротор /9500об/мин/60 мин/стайна температура
Ф
Dyno-mill пелети
Ф солюбилизиране /O/N-4°C/
Ф центрофугиране
Ф
Буфер:+ 2,6л 10 mM РО4 pH 7.5150 тМ NaCl-4.0MGuHCl
JA10 ротор /9500об/мин/30 мин/стайна температура редукция +0.2М 2-меркаптоетан сулфонова /4ч-стайна температура- на тъмно/ кисена,натриева сол /прибавяне пудра/ pH нагласено на 7.5 / с 1 М р-р на NaOH/преди инкубиране карбамидометилиране +0,25М йодоацетамид / /1/2ч-стайна температура-на прибавяне пудра/ pH нагласено тъмно/ на 7.5 / с 1 М р-р на NaOH/преди инкубиране
Ф имобилизирани афинитетна метални йони хроматография върху Ni++-NTA-arapo3a /QiagenЕквилибрационен буфер: 10 тМ
РО4 pH 7.5-150 тМ NaCl-4.0M
GuHCl мл смола/
Промиващбуфер:
1/еквилибрационен буфер
2/ 10 тМ РО4 pH 7.5-150 тМ
NaCl-6 М карбамид-25 тМ имидазол
Елуиращ буфер: 10 шМ РОд pH
7.5-150 mM NaCl-6 М карбамид
-0.5 М имидазол концентриране
Гелфилтрационна хроматография върху Superdex 200 /Pharmacia120 мл смола/
Ф концентриране
Ф диализа /O/N-4°C/
Ф стерилно филтруване до 3 мг/мл
10kDa Omega мембрана /Filtron/
Елуиращ буфер: 10 тМ РОд pH
7.5-150 тМ NaCl-6 М карбамид до 1,5 мг/мл
10kDa Omega мембрана /Filtron/
Буфер: 10 тМ РО4 pH 6.8-150 тМ NaCl-0.3% Empigen
Millex GV 0,22цт
-^Степента на чистота, оценена с помощта на SDS-PAGE, е показана на фигура 9 / Daiichi Silver Staining , Coomassie blue G250, Western blotting/:
След етапа на диализа и стерилно филтруване: >95%
-^Извличане /оценено чрез колориметричен анализ на протеини:
DOC ТСА ВСА/ мг SIV редуциран Nef -his протеин са пречистени от 340г рекомбинантни Pichia pastoris клетки/влажно тегло/ или 4 л Dynomill хомогенат OD 100.
Пример 9: ПРЕЧИСТВАНЕ НА НПУ РЕДУЦИРАН NEF-HIS
ПРОТЕИН /PICHIA PASTORIS/
Схемата на пречистване е развита от 160 г рекомбинантни Pichia pastoris клетки / влажно тегло/ или 3 л Dyno-mill хомогенат OD 50. Хроматографските етапи се осъществяват при стайна температура. Между етапите, Nef позитивните фракции се съхраняват в студена стая / + 4°С /; за по-дълъг период от време, пробите се замразяват при -20°С.
160 г Pichia pastoris клетки хомогенизиране
Буфер: Зл 50 mM РО4 pH 7.0Pefabloc 5тМ крайна OD : 50
Dyno-mill раздробяване пасажа/ замразяване/размразяване
Ф центрофугиране
JA10 ротор /9500об/мин/60 мин/стайна температура
Dyno-mill пелети
Ф солюбилизиране /O/N-4°C/
Буфер:+ 1 л 10 mM РО4 pH 7.5150 mM NaCl-4.0MGuHCl ф
центрофугиране
JA10 ротор /9500об/мин/60 мин/стайна температура
редукция /Зч-стайна температура- на тъмно/
Ф карбамидометилиране +0.1 М 2-меркаптоетан сулфонова кисена,натриева сол /прибавяне пудра/ pH нагласено на 7.5 / с 1 М р-р на NaOH/преди инкубиране +0,15М йодоацетамид / /1/2ч-стайна температура-на прибавяне пудра/ pH нагласено тъмно/ на 7.5 / с 1 М р-р на NaOH/преди инкубиране
Чй**' имобилизиранг метални йони афинитетна хроматография върху Ni ^-NTA-агароза /QuagenЕквилибрационен буфер: 10 тМ
РО4 pH 7.5-150 тМ NaCl-4.0M
GuHCl мл смола/
Промиващбуфер:
1/еквилибрационен буфер
2/ 10 тМ РО4 pH 7.5-150 тМ
NaCl-6 М карбамид
3/ 10 тМ РО4 pH 7.5-150 тМ
NaCl-6 М карбамид-25 тМ имидазол
Елуиращ буфер: 10 тМ цитрат pH 6 .0-150 mM NaCl-6M карбамид
-0.5 М имидазол
Φ концентриране до 3 мг/мл
10kDa Omega мембрана /Filtron/
Φ
Гелфилтрационна хроматография Елуиращ буфер: ЮтМ РО4 pH върху Superdex 200 /Pharmacia- 7.5-150тМ NaCl-6M карбамид
120 мл смола/
Ф
диализа Буфер: ЮшМ РОа pH 6.8-150 тМ
/O/N-4°C/ NaCl-0.5 М аргинин
Ф
стерилно филтруване Millex GV 0,22цт
-^Степента на чистота, оценена с помощта на SDS-PAGE, е показана на фигура 10 / Daiichi Silver Staining , Coomassie blue G250, Western blotting/:
След етапа на диализа и стерилно филтруване: >95%
-^Извличане /оценено чрез колориметричен анализ на протеини: DOC ТСА ВСА/ мг HIV редуциран Nef -his протеин са пречистени от 160г рекомбинантни Pichia pastoris клетки/влажно тегло/ или 3 л Dynomill хомогенат OD 50.
Пример10:ЕКСПРЕСИЯ НА SIVnef ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ В /PICHIA PASTORIS/
За да се оценят Nef и Tat антигените в предизвикан патогенен SHIV модел, бе експресиран Nef протеин на маймунски вирус на имунна недостатъчност / SIV / на макаци, SIV mac239 /Aids Reasearch and Human Retroviruses, 6 : 1221-1231, 1990/. B Nef кодиращата област, SIV mac 239 има в-рамка стоп кодон след 92 а.к. предпологащ съкратен продукт на само 10 kD . Остатъкът на Nef четящата рамка е отворен и може да се предполага, че ще кодира протеин с 263 а.к. /30 kD/ в неговата напълно отворена форма.
Нашият изходен материал за SIV mac 239 nef гена е DNA фрагмент, съответстващ на пълната кодираща последователност, клонирана върху LX5N плазмида /получен от Dr R.C. Desrosiers, Southborough, МА,US А/.
Този SIV nef ген е мутиран при прематурния стоп кодон / нуклеотид G в положение 9353 замества оригиналния Т нуклеотид /по такъв начин, че да експресира пълната дължина на SIV mac 239 Nef протеина.
За да експресира този SIV nef ген в Pichia pastoris се използва PHILD2-MOD векторът / предварително използван за експресия на HIV-1 nef и tat последователности/. Рекомбинантният протеин се експресира под контрола на предизвикващия алкохол оксидаза /АОХ1/ промотор и с-края на протеина се удължава с Хистидин афинитетен край, който ще улесни пречистването.
10,1 КОНСТРУКЦИЯ НА ИНТЕГРАТИВНИЯ ВЕКТОР pRIT 14908
За да се конструира pRIT 14908, SIV nef генът се увеличава чрез PCR от pLX5N/SIV-NEF плазмида с праймери SNEF1 и SNEF2. праймер SNEF1 :5’ ATCGTCCATG.GGTGGAGCTATTTT3’
Ncol праймер SNEF2: 5’ CGGCTACTAGTGCGAGTTTCCTT3 ’
Spel
Увеличението на SIV nef DNA областта, започва при нуклеотид 9077и завършва при нуклеотид 9865 /Aids Research and Human Retroviruses, 6 : 1221-1231, 1990/,
Едно Ncol рестрикционно място /което носи ATG кодона на nef гена/ се въвежда при 5’ края и PCR фрагмент докато Spel място се въвежда при 3’ края. Полученият PCR фрагмент и интегративният PHIL-D2-MOD вектор и двата се рестриктират чрез Ncol и Spel. Тъй като едно Ncol рестрикционно място приссътва върху SIV nef увеличената последователност / при положение 9286/, получават се два фрагмента, съответно ±200 Ьр и ±600 Ьр, пречистват се върху агарозен гел и се лигатират към PHIL-D2-MOD вектора. В резултат се получава рекомбинантния плазмид, след верификация на nef увеличената област е помощта на автоматично броене на последователности, pRIT 14908 е деноминиран.
10,2 ТРАНСФОРМАЦИЯ НА PICHIA PASTORIS ВИД GS115/his4/,
За да се получи вида Pichia pastoris. експресиращ SIV nef-His, видът GS115 се трансформира е линеен Notl фрагмент, носещ само експресионната касета и HIS4 гена / фиг.11/.
Линейният Notl DNA фрагмент, с хомологии при двата края с АОХ1 присъщ Р. pastoris ген, благоприятства рекомбинацията при АОХ1 положението.
Многокопийни интегрантни клони се селектират с помощта на количествен дот-блот анализ.
Един трансформант, който показва най-доброто продукционно ниво за рекомбинантния протеин, се избира и получава означението Y1772.
Видът Y1772 продуцира рекомбинантния SIV Nef-His протеин, протеин с 272 а.к., който е съставен от :
• Миристинова киселина • Метионин, създаден чрез използването на Ncol клониращото място на PHIL-D2-MOD вектора.
• 262 амино киселини / ак/ на Nef протеина / започващ при 2 а.к. и разпростиращ се до 263 а.к., виж Фигура 12/ • Треонин и серин, създадени чрез клонираща процедура / клониране при Spel мястото на PHIL-D2-MOD вектора / Фигура 11/.
• Един глицин и шест хистидина.
• Нуклеинови и протеинови последователности са показани на фигура 12.
10.3 ОХАРАКТЕРИЗИРАНЕ НА ЕКСПРЕСИРАНИЯ ПРОДУКТ НА ВИДА Y1772,
Ниво на експресия
След 16 часа индукция в среда, съдържаща 1% метанол като източник на въглерод, добивът на рекомбинантния Nef-His протеин се оценява на 10% от общия протеин / фигура 13, линии 3-4/.
Разтворимост
Индуцираните култури на рекомбинантния вид Y1772, продуциращ Nef-His протеин се центрофугират. Клетъчните пелети се суспендират отново в раздробяващ буфер, раздробяват се с 0.5 мм стъклени топчета и клетъчните екстракти се центрофугират. Протеините, съдържащи се в неразтворимите пелети /Р/ и в разтворимата супернатанта /S/ се сравняват върху оцветен с Coomassie Blue SDS-PAGE 10%.
Както е показано на фигура 13, преобладаващата част от рекомбинантния протеин от вида Y1772 / линии 3-4/ е свързана с неразтворимата фракция.
Видът Y1772, който показва задоволително ниво на експресия на рекомбинатен протеин, се използва за получаване и пречистване на SIV Nef-His протеин.
Пример 11: ЕКСПРЕСИЯ НА GP120 В СНО
Установена е устойчива СНО-К1 клетъчна линия, която продуцира рекомбинантен gP120 гликопротеин. Рекомбинантният gP120 гликопротеин е рекомбинантна съкратена форма на gP120 обвития протеин на HIV-1 изолата W61D. Протеинът се екскретира в клетъчната културална среда , от която впоследствие се пречиства.
Конструкция на gp!20 трансфекционен плазмид pRIT13968 Получена е обвитата DNA кодираща последователност / включваща 5’ ексон на tat и rev/на HIV-1 изолат W61D, /Dr. Tersmette, ССВ, Amsterdam/, като геномна gpl60 обвивка, съдъроаща W61D /NcoI-XhoI/.Плазмидът е обозначен pRIT13965.
За да се конструира gpl20 експресионна касета стоп кодон трябва да се въведе при амино киселина glu 515 кодон на gp 160 кодиращата последователност в pRIT13965 при използване на праймер олигонуклеотидна последователност /DIR 131/ и PCR технология.Праймерът DIR 131 съдържа три стоп кодона / при всички отворени четящи рамки/ и Sall рестрикционно място.
Пълната gpl20 последователност след това се възстановява от Nтерминалния BamHl-Dral фрагмент на /170 bp/ gpl60 плазмид субклон pW61d env /pRIT13966/, произхождащ от pRIT13965,H Dral-Sall фрагмента /510Ьр/, създаден е помощта на PCR от pRIT13965. Двата фрагмента се подлагат на гелно пречистване и се лигатират заедно в E.coli плазмида pUC18, срязан първо чрез Sall /klenow третиране/, и след това чрез BamHl. Това води до плазмид pRIT 13967. Генната последователност на Xmal-Sall фрагмента/1580 Ьр/, съдържащ gpl20 кодираща касета се подлага на изследване и се установява, че е идентична на очакваната последователност. Плазмидът RIT13967 се лигатира в СНО GS-експресионния вектор рЕЕ14 /Celltech Ltd.,UK/ посредством срязване първо с Bell /klenow третиране /и след това чрез Xmal. Полученият в резултат плазмид е обозначен pRIT 13968.
Сг Получаване на Master Cell Bank gpl20-KOHCipyKijHaTa /pRIT13968/ce трансфектира в СНО клетки с помощта на класическатаСаРОд-утаяване/ глицерол шокова процедура.Два дни по-късно СНОК1 клетките се подлагат на селективна растежна среда /GMEM+метионин сулфоксимин /MSX/ 25 μΜ+ глутамат+ аспарагин+10% телешки ембрионален серум /.Три избрани трансфектантни клони понататък нарастват в 175 м колби и няколко ампули с клетки се съхраняват при -80°С. C-env 23,9 е избрана за понататъшна експанзия.
Приготовлява се малка предварителна банка на клетки и 20 ампули се замразяват.За приготовляването на предварителната банка и на МСВ, клетките растат в GMEM културална среда, допълнена с 7.5 % телешки ембрионален серум, съдържащ 50 μΜ MSX. Тези клетични култури се тестват за стерилност и микоплазма и за негативност.
Master Cell Bank СНОК1 env 23.9 / при пасаж 12/ се приготовлява при използване на клетки, произхождащи от предварителната клетъчна банка. Накратко, две ампули от премастера се посяват в среда, допълнена с 7.5 % диализиран телешки ембрионален серум.Клетките се разпределят в четири културални колби и се култивират при 37°С. След прикрепване на клетките културалната среда се сменя с пресна среда, допълнена с 50 μΜ MSX . При сливане, клетките се събират чрез трипсинизиране и субкултивиране с 1/8 разцепващо отношение в Т-колби-ролер ботъл-клетъчни фабрични единици. Клетките се събират от клетъчните фабрични единици посредством трипсинизиране и центрофугиране. Клетъчните пелети се суспендират отново в културална среда, допълнена с DMSO като нискотемпературен ппредпазител. Ампулите предварително се бележат, обработват се в автоклав и се запечатват на топло / 250 ампули/. Те се проверяват за течове и се
Чесъхраняват една нощ при -70°С преди съхраняване в течен азот. Клетъчна култура и продукция на сурова реколта
Две ампули от мастер клетъчната банка се размразяват бързо. Клетките се изливат и се инокулират в две- Т-колби с подходяща културална среда, допълнена с 7.5% диализиран телешки ембрионален серум /FBS/ при 37°±1°С. Когато се достигне сливане / пасаж 13/, клетките се събират чрез трипсинизиране, изливат се и се експандират в 10 Т- колби, както по-горе.Слетите клетки / пасаж 14 / са трипсинизирани и се експандират серийно в 2 клетъчни промишлени единици / всяка 6000 см2; пасаж 15 /, след това в 10 клетъчни фактории / пасаж 16 /. Растежната културална среда се допълва с 7.5 % диализиран телешки ембрионален серум /FBS/и 1% MSX .Когато клетките достигнат сливане, растежната културална среда се изхвърля и се замества с “продукционна среда “, съдържаща само 1% диализиран телешки ембрионален серум и не съдържаща MSX. Супернатантата се събира на всеки два дни / 48-часов интервал/ до 32-рия ден. Събраните културални флуиди се избистрят веднага през 1.2-0.22 pm филтър и се съхраняват при -20°С преди пречистването.
Пример 12: ПРЕЧИСТВАНЕ НА HIV GP 120/W61D СНО/ ОТ КЛЕТЪЧНИЯ КУЛТУРАЛЕН ФЛУИД
Всички етапи на пречистване се осъществяват в студена стая при 28°С.рН на буферите се нагласяват при тази температура и се филтруват върху 0.2 pm филтър. Те се тестват за пирогенно съдържание /LAL анализ /. Непрекъснато се наблюдават оптическата плътност при 280 nm, pH и проводимостта на елуатите от колоната.
/1/ Избистряне на културалния флуид
Събраните избистрени клетъчни флуиди /ССР/ се стерилизират чрез филтруване и се прибавя Tris- буфер, рН=8.0, до крайна концентрация 30 mM. CCF се съхраняват замразени при -20°С до пречистването.
/2/ Хидрофобна интерактивна хроматография
След размразяване, към избистрения културален флуид се прибавя амониев сулфат до 1 М. Разтворът се прекарва през нощта през TSK7TOYOPEARL-BUTYL 650М /TOSOHAAS/ колона, еквилибрирана в ЗОтМ Tris-буфер-рН 8.0-1 М амониев сулфат. При тези условия, антигенът се свързва към гелната матрица. Колоната се промива с понижаващ се стъпалообразно градиент на амониев сулфат. Антигенът се елуира при 30 тМ Tris-буфер-рН 8.0-0.25 М амониев сулфат.
/3/ Анийон-обменна хроматографияя
След понижаване на проводимостта на разтвора между 5 и 6 mS/cm, фракциите с gP120 се зареждат върху Q- sepharose Fast Flow /Pharmacia/ колона, еквилибрирана в Tris- буферен солев разтвор-рН 8.0.Колоната работи по негативен начин, т.е. gP120 не се свързва към гела, докато по-голямата част от онечистванията се задържат. /4/Концентриране и диафилтруване посредством ултрафилтруване
За да се повиши концентрацията на протеина, gP120 фракциите се зареждат върху FILTRON мембрана “Omega Screen Channel”, с 50 kDa изключване. В края на концентрирането, буферът се заменя чрез диафилтруване с 5 тМ фосфатен буфер, съдържащ СаС12 0.3 тМ, pH 7.0. Ако следващата обработка не се осъществява веднага, то gP120 се съхранява при -20°С. След размразяване разтворът се филтрува върху 0.2 μΜ мембрана, за да се отстрани неразтворимия материал.
/5/Хроматография върху хидроксиапатит gP120 UF пулът се зарежда върху macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite, тип II/Biorad/колона ,еквилибрирана в 5 тМ фосфатен буфер + СаС12 0.3 mM, pH 7.0. Колоната се промива със същия буфер.Антигенът преминава през колоната и онечистванията се задържат в нея.
/6/ Катйон-обменна хроматография gP120 пулът се зарежда върху CM/TOYOPEARL-650S /TOSOHAAS/ колона, еквилибрирана в ацетатен буфер 20 mM, pH 5.0. Колоната се промива със същия буфер, след това с ацетат 20mM, pH 5.0 и NaCI 10 тМ.Антигенът след това се елуира със същия буфер, съдържащ 80 mM NaCI.
/7/Ултрафилтруване
За да се повиши капацитета на вирусното изчистване на процеса на пречистване се осъществява допълнителен етап на ултрафилтруване. gP120 пулът се подлага на ултрафилтруване върху FILTRON мембрана“ Omega Screen Chanel” с изключване 150 kDa. Мембраната с тази големина на порите не задържа антигена. След процеса, разреденият антиген се концентрира върху същия тип мембрана /Filtron/, но с изключване 50 kDa.
/8/Големина изключваща гел хроматография gPP120 пулът се прилага към SUPERDEX 200 /PHARMACIA/ колона , за да се обмени буфера и да се отстранят остатъчните онечиствания. Колоната се елуира със солев фосфатен буфер /PBS/. /9/ Стерилно филтруване и съхранение
Фракциите се стерилизират посредством филтруване върху 0.2 μΜ PVDF мембрана /Millipore/. След стерилното филтруване, пречистената маса се съхранява замразена при -20°С до крайната обработка. Процесът на пречистване е сумиран на схемата по-долу. -»Степента на чистота на пречистената маса, оценена с помощта на w SDS-PAGE анализ /Silver staining/Coomassie Blue/Westwm Blotting/ е > 95 %
-^•Добивът от процеса на получаване е около 2.5 мг/L CCF /съгласно Lowry анализа/-Общият добив от пречистването е около 25% / съгласно Elisa анализа /
-^Пречистеният материал е стабилен една седмица при 37°С / съгласно WB анализа/
Пречистване на gpl 20 от културалния флуид
Знакът а/ обозначава етапите, които са критични за извличане на вируса.
ИЗБИСТРЯНЕ НА КУЛТУРАЛНИЯ ФЛУИД
Ф
ХИДРОФОБНА ИНТЕРАКТИВНА ХРОМАТОГРАФИЯ /БУТИЛ-TOYOPEARL 650М/
Ф
АНИЙОН ОБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ а/ / НЕГАТИВЕН НАЧИН/ /Q-SEPHAROSE /
Ф
KD УЛТРАФИЛТРУВАНЕ /КОНЦЕНТРИРАНЕ И СМЯНА НА БУФЕРА /
Ф / СЪХРАНЯВАНЕ -20° С /
Ф
ХИДРОКСИАПАТИТНА ХРОМАТОГРАФИЯ /НЕГАТИВЕН НАЧИН / /MACROPREP CERAMIC HYDROXYAPATITE II/
Ф
КАТЙОНОБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ /CM-TOYOPEARL 650 S/
Ф
150 KD УЛТРАФИЛТРУВАНЕ V /ОМЕГА МЕМБРАНИ/FILTRON/
Ф
KD УЛТРАФИЛТРУВАНЕ / КОНЦЕНТРИРАНЕ/
Ф
ИЗКЛЮЧВАЩА ГОЛЕМИНА ХРОМАТОГРАФИЯ л/ /SUPERDEX 200/
СТЕРИЛНО ФИЛТРУВАНЕ
Ф
ПРЕЧИСТЕНА МАСА СЪХРАНЕНИЕ -20° С
Пример 13: ПРИГОТВЯНЕ НА ВАКСИНА
Ваксината, получена съгласно изобретението, съдържа експресионните продукти на една или повече рекомбинантни DNA, кодиращи антиген. Нещо повече, съставите съдържат смес от 3 де-О ацилиран монофосфорил липид A 3D-MPL и QS21 в масло/вода емулсия или олигонуклеотид, съдържащ неметилирани CpG динуклеотидни мотиви и алуминиев хидроксид като носител.
3D-MPL: е химически детоксифицирана форма на липополизахарида /LPS/на Грам-негативната бактерия Salmonella minnesota.
Опитите, осъществени от Smith Kline Beecham Biologicals са показали, че 3D-MPL , комбиниран с различни носители повишава както хуморалния имунитет така и Тщ типа на клетъчния имунитет. QS21: е сапонин, пречистен от суров екстракт от кората на дървото iQ Quillaja Saponaria Molina, който има силна активност като помощна добавка: то индуцира както антиген-специфичната лимфопролиферация така и CTLS към няколко антигена.
Опитите на Smith Kline Beecham Biologicals са показали ясен синергистичен ефект на комбинациите на 3D-MPL и QS21 при индуцирането на двете хуморалната и Thi типа клетъчна имунни реакции.
Емулсията масло/вода е съставена от 2 масла / токоферол и сквален/ и на PBS, съдържащ Tween 80 като емулгатор. Емулсията съдържа 5% сквален, 5% токоферол, 2% Tween 80 и има средна големина на частиците от 180 nm / WO 95/17210/.
Опитите на Smith Kline Beecham Biologicals доказват, че свързването на тази масло/вода емулсия към 3D-MPL/QS21 допълнително повишава техните имуностимулиращи свойства.
Приготвяване на емулсия масло/вода / 2-кратен концентрат/
Tween 80 се разтваря в буфериран с фосфат солев разтвор /PBS/ до получаване на 2%-ен разтвор в PBS. За да се осигурят 100 мл двукратно концентрирана емулсия 5 г DL алфа токоферол и 5 мл сквален се завихрят за внимателно смесване. 90 мл разтвор на PBS/Tween се прибавят и се смесват внимателно. Получената в
резултат емулсия след това се прекарва през помпа и накрая се микрофлуидизира при използване на Mil OS Microfluidics апарат. Получените в резултат маслени капчици имат големина приблизително 180 nm.
Приготвяне на състав масло във вода
Антигени /100 pg gp 120, 20pg NefTat и 20pg SIV Nef, самостоятелно или в комбинация/ се разреждат в 10 кратно концентриран PBS pH
6.8 и Н2О преди последващото прибавяне във водната емулсия на маслото, 3D-MPL /50pg/, QS21 /50 pg/ и lpg/ml тиомерзал като презерватив на петминутен интервал. Обемът на емулсията е равен на 50% от общия обем /250 pl за доза от 500р1 /.
Всяко инкубиране се осъществява при стайна температура и разбъркване.
CpG олигонуклеотидът /CpG/ е синтетичен неметилиран олигонуклеотид, съдържащ един или няколко CpG мотива. CpG е много мощен подбудител на Тщ типа имунитет, сравнен със състава масло във вода, който индуцира главно смесена Тш/Тнг ответна реакция. CpG индуцира по-ниско ниво на антитела отколкото състава масло във вода и добра имунна реакция, предавана посредством клетката. Очаква се CpG да предизвиква по-ниска локална реактогенност.
Приготвяне на CpG олигонуклеотиден разтвор : сух прахообразен CpG се разтваря във вода до получаването на разтвор, съдържащ 5 мг/мл CpG.
Приготвяне на CpG състав
Трите антигена се диализират срещу 150 мМ разтвор на натриев хлорид за елиминиране на фосфатните йони, които инхибират адсорбцията на gp 120 върху алуминиевия хидроксид.
Антигените разредени във вода /100 pg gpl20, 20pg NefTat и 20pg SIV Nef/ се инкубират c разтвора на CpG / 500 pg CpG / в продължение на 30 минути преди адсорбцията върху алуминиев трихидроксид за благоприятстване на потенциалното взаимодействие между His края на NefTat и Nef антигените и олигонуклеотида / описан е по-силен имуностимулиращ ефект на CpG , когато е свързан към антигена в сравнение със свободния CpG /. След това последователно се прибавят на пет минутен интервал /500 pg / алуминиев трихидроксид, 10 кратно концентриран натриев хлорид и lpg/ml тиомерзал като презерватив.
Всяко инкубиране се осъществява при стайна температура при разбъркване.
Пример 14: ИМУНИЗАЦИЯ И ПРЕДИЗВИКАН SHIV У РЕЗУС МАЙМУНИ
Първо изследване
Четири групи маймуни резус се имунизират мускулно на 0, 1 и 3-тия месец със следните ваксинни състави:
Група 1: Помощна добавка 2 + gpl20
Група 2: Помощна добавка 2 + gp 120+ NefTat+SIV Nef ГрупаЗ: Помощна добавка 2 + NefTat*+SIV Nef
Група 4:Помощна добавка 6 + gpl20+ NefTat+SIV Nef Група 5:Помощна добавка 2 + NefTat+SIV Nef
Група 6:Помощна добавка 2
Помощната добавка 2 съдържа сквален/токоферол/ Tween 80/3DMPL/QS21 и
Помощна добавка 6 съдържа стипца и CpG .
ТаЦозначава мутирал Tat, при който Lys41—>А1а и в RGD мотива Arg78—>Lys и Asp80-»Glu /Virology 235: 48-64, 1997/.
Един месец след последната имунизация всички животни са заразени с патогенния SHIV /вид 89.6р/.От седмицата на заразяването /wkl6/ се вземат периодично кръвни проби в определени моменти от време за определяне % на CD4позитивните клетки сред мононуклеарните клетки на периферната кръв е помощта на FACS анализ / Фигура 14 / и на концентрацията на RNA вирусните геноми в плазмата е помощта на bDNA анализ / Фигура 15 /.
Резултати
Всички животни са инфектирани след заразяването е SHIV89 6р СО4-позитивните клетки намаляват след заразяването при всички животни от групи 1, 3, 5 и 6 с изключение на едно животно във всяка от групите 1 и 6 / контролна група/.Всички животни в група 2 показват леко понижаване в СО4-позитивните клетки и след време възстановяват нивата от основната линия. Подобно се наблюдава и при животните от група 4 / Фигура 14/.
Данните за натоварване е вируса са почти обратни на CD4 данните. Натоварването с вируса намалява под нивото на откриване при 3/4 от животните в група 2 / и при контролното животно, което поддържа неговите С04-позитивни клетки/, и четвъртото животно показва само маргинално вирусно натоварване.Преобладаващата част от другите животни поддържат високо или междинно вирусно натоварване./ Фигура 15/.
Изненадващо, титрите на анти-Tat и анти-Nef антитела, измерени е помощта на ELISA са 2 до 3- пъти по-високи в Група 3 / е мутиран Tat/ отколкото в Група 5 / еквивалентната група с не-мутиран Tat /през целия курс на изследването.
На 68-мата седмица / 56 седмици след заразяването/ всички животни от групите, които са получили пълната антигенна комбинация / групи 2 и 4 / остават още живи, докато повечето животни в другите групи трябваше да бъдат подложени на ефтаназия поради подобни на AIDS симптоми. Преживелите животни за група са :
Група 1: 2/4
Група 2: 4/4
Група 3: 0/4
Група 4: 4/4
Група 5: 0/4
Група6:1/4
Заключения
Комбинацията от gpl20 и NefTat /в присъствието на SIV Nef/предотвратява загубата на С04-позитивни клетки, понижава вирусното натоварване при животни, инфектирани с патогенния SHIV89.6p, и забавя или предотвратява развитието на AIDS -подобни болестни симптоми, докато gpl20 или NefTat/SIV Nef самостоятелно не защитава от патогенните последствия от заразяването със SHIV.
Помощната добавка 2, която е емулсия масло във вода, съдържаща сквален, токоферол и Tween 80, заедно с 3D-MPL и QS21 изглежда, че има по-силен ефект в крайните точки на изследването отколкото помощната добавка от стипца /CpG.
Второ изследване
Второ изследване на заразени със SHIV резус маймуни се провежда ,за да се потвърди ефикасността на кандидат ваксината gpl20/NefTat+noMoniHa добавка и да се сравни с различни Tatбазирани антигени. Изследването се провежда от различна лаборатория.
Начинът на проучването е следния.
Групи от по 6 резус маймуни се имунизират на 0, 4 и 12-тата седмица с мускулни инжекции, и се заразяват на 16-тата седмица със стандартна доза патогенен SHIV89.6p·
Група 1 е повторение на Група 2 от първото изследване. Група 1: Помощна добавка 2 + gp 120+ NefTat+SIV Nef Група2: Помощна добавка 2 + gpl20 + Tat /окислен/ Група 3:Помощна добавка 2 + gpl 20 + Tat /редуциран/ Група 4 .Помощна добавка 2
Пътят и крайните точки пак са % СО4-позитивни клетки, вирусно натоварване с RT-PCR, заболеваемост и смъртност.
Резултати
Всички животни с изключение на едно в група 2 са инфектирани след заразяването с SHIV89.6pCD4 -позитивните клетки намаляват значително при всички животни от контролна група 4 и група 3, и при всички с изключение на едно в група 2. Само едно животно от група 1 показва забележимо намаляване в СО4-позитивните клетки. За разлика от животните от първото изследване, маймуните при втория опит показват стабилизация на С04-позитивните клетки при различни нива един месец след заразяването с вируса / Фигура 16 /. Стабилизацията е общо по-ниска от първоначалния % на СО4-позитивни ге клетки, но никога не води до пълна загуба на клетките. Това може да е показател за по-ниската податливост спрямо SHIV- индуцираното заболяване при маймунската популация, използвана за второто изследване. Въпреки това, благоприятният ефект на gpl20/NefTat/SIV Nef ваксината и на двете gpl20/Tat ваксини може да бъде демонстриран. Броят на животните с % на CD4 -позитивните клетки над 20 е 5 за ваксинираните животни, докато нито при едно животно от контролната група само с помощна добавка, не остава над това ниво.
Анализът на RNA плазменото вирусно натоварване потвърждава относително ниската податливост на изследваните животни /Фигура 17/. Само 2 от шестте контролни животни поддържат високо вирусно натоварване, докато вирусът изчезва от плазмата на другите животни. Така, ефектът на ваксината е трудно да се демонстрира при параметъра вирусно натоварване.
Заключения
Анализът на СО4-позитивните клетки показва, че ваксината gpl20/NefTat+ помощна добавка/в присъствието на SIV Nef / предотвратява спада на СО4-позитивните клетки при повечето ваксинирани животни. Това е потвърждение на резултата, получен при първото SHIV изследване.Поради липсата на податливост на изследваните животни, параметърът вирусно натоварване не би могъл да бъде използван за демонстрация на ефекта от ваксината. Взети заедно, комбинацията от gpl20 nTat и NefHIV антигените осигуряват защита срещу патологичните последствия на HIV инфекцията, както е очевидно при SHIV модела.
Самостоятелно Tat антигените в комбинация с gpl20 също осигуряват известна защита от понижаване на С04-позитивните клетки. Ефектът е по-малко изразителен отколкото с gpl20/NefTat/SIV Nef антигенната комбинация, но показва, че gpl20 и'1'at също са способни да предават известна защитна ефикасност срещу проявите на SHIV-индуцирано заболяване.
Второто изследване със заразяване със SHIV е осъществено с маймуни резус от източник, напълно несвързан с източника на животни от първото изследване. Двата параметра, % на CD4позитивни клетки и плазмено вирусно натоварване, подсказват, че животните във второто изследване са по-малко податливи на SHIVиндуцирано заболяване, и че има значително по-голяма променчивост сред животните. Въпреки това, благоприятният ефект върху поддържането на СО4-позитивните клетки на gpl20/NefTat/SIV Nef ваксината е виден с опитната ваксина, съдържаща gpl20/NefTat/SIV Nef. Това показва, че ефектът от ваксината не само е повторен при отделно изследване, но нещо повече, демонстриран е и при несвързана популация от маймуни.

Claims (24)

1. Използване на а/ HIV Tat протеин или полинуклеотид; или б/ HIV Nef протеин или полинуклеотид; или в/ HIV Tat протеин или полинуклеотид, свързан към един HIV Nef протеин или полинуклеотид /Nef-Tat/;
и един HIV gpl20 протеин или полинуклеотид при производството на ваксина за профилактична или терапевтична имунизация на хора срещу HIV, където Tat, Nef или Nef -Tat действат синергистично с gpl 20 при лечението или профилактиката на HIV.
2. Използване, съгласно претенция 1, при което използваната ваксината понижава HIV вирусното натоварване при инфектирани с HIV хора.
3. Използване, съгласно претенция 1 или 2, при което използваната ваксина води до поддържане на СО4+нивата над онези, установени при отсъствието на ваксинация с HIV Tat, Nef или Nef-Tat и HIV gpl20.
4. Използване, съгласно която и да е претенция от 1 до 3, при което ваксината понататък включва антиген, избран от групата, състояща се от: gag,rev, vif,vpr,vpu.
5. Използване, съгласно която и да е претенция от 1 до 4, при което Tat протеинът е мутиран протеин.
6. Използване, съгласно която и да е претенция от 1 до 5, при което Tat, Nef или Nef-Tat протеинът е редуциран.
7. Използване, съгласно която и да е претенция от 1 до 6, при което Tat, Nef или Nef-Tat протеинът е карбамидометилиран.
8. Използване, съгласно която и да е претенция от 1 до 5, при което Tat, Nef или Nef-Tat протеинът е окислен.
9. Използване, съгласно която и да е претенция от 1 до 8, при което допълнително включва помощна добавка.
10. Използване, съгласно претенция 9, при което помощната добавка е индуцираща ТН1 помощна добавка.
11. Използване, съгласно претенция 9 или 10„ при което помощната добавка съдържа монофосфорил липид А или негово производно, такова като 3-де- О-ацилиран монофосфорил липид А .
12. Използване, съгласно която и да е претенция от 9 до 11, включващо допълнително сапонинова помощна добавка.
13. Използване, съгласно която и да е претенция от 9 до 12, включващо допълнително емулсия масло във вода.
14. Използване, съгласно претенция 9 или претенция 10, при което помощната добавка включва олигонуклеотиди, съдържащи CpG мотив.
15. Използване, съгласно претенция 14, включващо допълнително алуминиева сол.
16. Използване на а/ HIV Tat протеин или полинуклеотид; или б/ HIV Nef протеин или полинуклеотид; или в/ HIV Tat протеин или полинуклеотид, свързан към един HIV Nef протеин или полинуклеотид;
и един HIV gpl20 протеин или полинуклеотид при производството на ваксина, подходяща за основно-усилващо доставяне за профилактична или терапевтична имунизация на хора срещу HIV.
17. Метод за имунизиране на хора срещу HIV, характеризиращ се с това, че в човека се въвежда ваксина, съдържаща HIV Tat или HIV Nef или HIV NefTat в комбинация с HIV gpl20 протеини или кодиращи ги полинуклеотиди.
18. Ваксинен състав за използване прли хора, характеризиращ се с това, че включва HIV Tat или HIV Nef или HIV NefTat в комбинация с HIV gpl20 протеини или кодиращи ги полинуклеотиди.
19. Режим за ваксинация с gp 120,nef и tat, характеризиращ се с това че включва последователно въвеждане на протеинови антигени и DNA, кодираща gp 120,nef и tat.
20. Режим, съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че протеиновите антигени се инжектират веднъж или няколко пъти последвани от едно или неколкократно въвеждане на DNA.
21. Режим, съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че първо се използва DNA за еднократно или неколкократно въвеждане, последвана от еднократно или неколкократно въвеждане на протеин.
22. Използване на а/състав, съдържащ gpl20 Nef, Tat и gpl20 протеини ;и б/ състав, съдържащ gpl20,Nef е Tat DNA при производството на препарат за лечение на HIV, при което /а/ и/б/ могат да бъдат използвани поотделно във всякакъв ред или заедно.
23. Използване на gpl20, nef и tat протеин антигени при приготвяне на препарат за лечението HIV на индивид, на когото е въведена DNA,кодираща gpl20,nef и tat протеин антигени.
24. Използване на DNA, кодираща gpl20,nef и tat протеин антигени при приготвяне на препарат за лечението на HIV на индивид, на когото са въведени gpl20, nef и tat протеин антигени.
BG106964A 2000-01-31 2002-07-30 Ваксина за профилактична или терапевтична имунизация против hiv BG106964A (bg)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0002200A GB0002200D0 (en) 2000-01-31 2000-01-31 Novel use
GB0009336A GB0009336D0 (en) 2000-04-14 2000-04-14 Novel use
GB0013806A GB0013806D0 (en) 2000-06-06 2000-06-06 Novel use
PCT/EP2000/005998 WO2001000232A2 (en) 1999-06-29 2000-06-28 Use of cpg as an adjuvant for hiv vaccine
PCT/EP2001/000944 WO2001054719A2 (en) 2000-01-31 2001-01-29 Vaccine for the prophylactic or therapeutic immunization against hiv

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG106964A true BG106964A (bg) 2004-01-30

Family

ID=27255504

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG106964A BG106964A (bg) 2000-01-31 2002-07-30 Ваксина за профилактична или терапевтична имунизация против hiv

Country Status (23)

Country Link
US (3) US20030158134A1 (bg)
EP (1) EP1251870A2 (bg)
JP (1) JP2003529559A (bg)
KR (2) KR20070073987A (bg)
CN (1) CN1326873C (bg)
AP (1) AP2002002592A0 (bg)
AU (1) AU783005B2 (bg)
BG (1) BG106964A (bg)
BR (1) BR0107972A (bg)
CA (1) CA2398611A1 (bg)
CZ (1) CZ20022643A3 (bg)
DZ (1) DZ3286A1 (bg)
EA (1) EA200200724A1 (bg)
HK (1) HK1051317A1 (bg)
HU (1) HUP0204250A3 (bg)
IL (1) IL150756A0 (bg)
MX (1) MXPA02007413A (bg)
NO (1) NO20023616L (bg)
NZ (1) NZ520327A (bg)
OA (1) OA12168A (bg)
PL (1) PL211762B1 (bg)
SK (1) SK11122002A3 (bg)
WO (1) WO2001054719A2 (bg)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
IT1297090B1 (it) * 1997-12-01 1999-08-03 Barbara Ensoli Tat di hiv-1 o suoi derivati, da soli od in combinazione, a scopo vaccinale, profilattico e terapeutico, contro l'aids i tumori e le
PT1077722E (pt) 1998-05-22 2006-12-29 Coley Pharm Group Inc Produtos e composições para utilização na indução da imunidade mucosal
AU2487300A (en) 1998-12-31 2000-07-31 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
US20050226890A1 (en) * 1999-08-12 2005-10-13 Cohen David I Tat-based vaccine compositions and methods of making and using same
JP2004503205A (ja) 2000-02-04 2004-02-05 デューク・ユニバーシティー ヒト免疫不全ウイルスワクチン
WO2005090392A1 (en) * 2004-03-16 2005-09-29 Inist Inc. Tat-based tolerogen compositions and methods of making and using same
WO2003004620A2 (en) 2001-07-05 2003-01-16 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP1279404A1 (en) 2001-07-26 2003-01-29 Istituto Superiore di Sanità Use of HIV-1 tat, fragments or derivatives thereof, to target or to activate antigen-presenting cells, to deliver cargo molecules for vaccination or to treat other diseases
GB0118367D0 (en) * 2001-07-27 2001-09-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel use
FR2828404B1 (fr) * 2001-08-10 2005-07-15 Neovacs Superimmunogene composite a usage vaccinal bifonctionnel pour le traitement des maladies associees a un desordre tissulaire stromal
NZ532383A (en) 2001-11-21 2007-03-30 Univ Pennsylvania Pan-7 simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
EP1944043A1 (en) 2001-11-21 2008-07-16 The Trustees of the University of Pennsylvania Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
GB0206359D0 (en) 2002-03-18 2002-05-01 Glaxosmithkline Biolog Sa Viral antigens
GB0206360D0 (en) 2002-03-18 2002-05-01 Glaxosmithkline Biolog Sa Viral antigens
WO2003080112A2 (en) * 2002-03-19 2003-10-02 Powdermed Limited Imidazoquinolineamines as adjuvants in hiv dna vaccination
GB0210682D0 (en) * 2002-05-09 2002-06-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel use
CA2483640A1 (en) 2002-05-16 2003-11-27 Bavarian Nordic A/S Fusion protein of hiv regulatory/accessory proteins
JP2005533855A (ja) 2002-07-24 2005-11-10 インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト 病原性ウイルスからの別のリーディングフレームによりコードされる抗原
CA2484339A1 (en) 2002-09-13 2004-03-25 Intercell Ag Method for isolating hepatitis c virus peptides
ZA200503511B (en) 2002-10-29 2006-10-25 Coley Pharmaceutical Group Ltd Use of CPG oligonucleotides in the treatment of hepatitis C virus infection
GB0225788D0 (en) * 2002-11-05 2002-12-11 Glaxo Group Ltd Vaccine
GB0225786D0 (en) * 2002-11-05 2002-12-11 Glaxo Group Ltd Vaccine
CA2502015A1 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5' cpg nucleic acids and methods of use
CN100355453C (zh) * 2003-03-24 2007-12-19 英特塞尔股份公司 改进的疫苗
WO2004084938A1 (en) 2003-03-24 2004-10-07 Intercell Ag Improved vaccines
WO2005070041A2 (en) * 2004-01-09 2005-08-04 Morehouse School Of Medicine Modulating vaccine against hiv nef protein-induced lymphocyte depletion
GB0405480D0 (en) * 2004-03-11 2004-04-21 Istituto Superiore Di Sanito Novel tat complexes,and vaccines comprising them
WO2005090968A1 (en) * 2004-03-16 2005-09-29 Inist Inc. Tat-based immunomodulatory compositions and methods of their discovery and use
FR2868318B1 (fr) * 2004-04-01 2012-11-16 Commissariat Energie Atomique Antigene tat stabilise et ses applications pour la vaccination anti-vih
CA2601022C (en) 2005-03-23 2023-03-07 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Use of an influenza virus an oil-in-water emulsion adjuvant to induce cd4 t-cell and/or improved b-memory cell response
JP5639760B2 (ja) 2006-07-17 2014-12-10 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム インフルエンザワクチン
US8926993B2 (en) * 2006-07-17 2015-01-06 Aduro Biotech Methods and compositions using Listeria for enhancing immunogenicity by prime boost
EP2094296A4 (en) * 2006-11-17 2011-09-14 Univ Duke VACCINE WITH MULTIPLE COMPONENTS
US9717788B2 (en) 2007-03-02 2017-08-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Method of inducing an immune response against HIV employing HIV immunogens, adenoviral vectors encoding said immunogens, and adjuvant
EA021391B1 (ru) * 2007-03-02 2015-06-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Способ индукции иммунного ответа, вакцинная композиция, ее применение и набор
TW200908994A (en) 2007-04-20 2009-03-01 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP2463362B1 (en) 2007-11-28 2017-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian subfamily c adenovirus SAdv-31 and uses thereof
CN101883858B (zh) 2007-11-28 2015-07-22 宾夕法尼亚大学托管会 猿猴亚家族E腺病毒SAdV-39、-25.2、-26、-30、-37和-38及其应用
EP2325298B1 (en) 2008-03-04 2016-10-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania SIMIAN ADENOVIRUSES SAdV-36, -42.1, -42.2, AND -44 AND USES THEREOF
DK2350269T3 (en) 2008-10-31 2015-12-07 Univ Pennsylvania ABE ADENOVIRUS WITH SADV-46 HEXONCAPSIDE PROTEINS AND APPLICATIONS THEREOF
CN102405057B (zh) 2009-03-23 2016-05-25 那尼尔科斯治疗公司 用免疫刺激性Hiv Tat衍生物多肽治疗癌症
EP2435559A1 (en) 2009-05-29 2012-04-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus 41 and uses thereof
AU2011332025B2 (en) 2010-11-23 2015-06-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Subfamily E simian adenoviruses A1321, A1325, A1295, A1309 and A1322 and uses thereof
CN105473723A (zh) 2012-05-18 2016-04-06 宾夕法尼亚大学托管会 亚家族e猿腺病毒a1302、a1320、a1331和a1337及其用途
RU2695653C2 (ru) 2013-10-04 2019-07-25 Пин Фарма, Инк. Иммуностимулирующие полипептидные производные тат вич для применения в лечении рака
DK3142750T3 (da) 2014-05-13 2020-09-14 Univ Pennsylvania Sammensætninger omfattende aav, som udtrykker dobbelt-antistofkonstrukter og anvendelser deraf
CN104001155B (zh) * 2014-06-12 2016-04-13 中山大学 一种Tat蛋白及其制备方法和应用
US10188749B2 (en) 2016-04-14 2019-01-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods to program therapeutic cells using targeted nucleic acid nanocarriers
EP3565535A4 (en) 2017-01-05 2020-12-30 Fred Hutchinson Cancer Research Center SYSTEMS AND METHODS FOR IMPROVING THE EFFECTIVENESS OF A VACCINE
AU2021229710A1 (en) 2020-03-01 2022-10-06 Dynavax Technologies Corporation CPG-adjuvanted SARS-CoV-2 virus vaccine
WO2022232289A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing therapeutic antibodies and uses thereof
AU2023235112A1 (en) 2022-03-14 2024-10-17 Generation Bio Co. Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5863542A (en) * 1991-03-07 1999-01-26 Virogenetics Corporation Recombinant attenuated ALVAC canaryopox virus containing heterologous HIV or SIV inserts
NZ253137A (en) * 1992-06-25 1996-08-27 Smithkline Beecham Biolog Vaccine comprising antigen and/or antigenic composition, qs21 (quillaja saponaria molina extract) and 3 de-o-acylated monophosphoryl lipid a.
EP0814834B2 (fr) * 1995-03-08 2009-03-18 Neovacs Immunogenes denues de toxicite derivant d'une proteine de regulation retrovirale, anticorps diriges contre ces immunogenes, procede pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les renfermant
GB9720585D0 (en) * 1997-09-26 1997-11-26 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US20050033022A1 (en) * 1997-09-26 2005-02-10 Smithkline Beecham Biologicals Sa Fusion proteins comprising HIV-1 Tat and/or Nef proteins
FR2773156B1 (fr) * 1997-12-26 2000-03-31 Biovacs Inc Nouveaux immunogenes anti-retroviraux (toxoides), nouveaux procedes de preparation et application a la prevention et au traitement du sida

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003529559A (ja) 2003-10-07
CZ20022643A3 (cs) 2003-02-12
AP2002002592A0 (en) 2002-09-30
NZ520327A (en) 2004-06-25
KR100808348B1 (ko) 2008-02-27
AU5791001A (en) 2001-08-07
WO2001054719A3 (en) 2001-12-20
US20030158134A1 (en) 2003-08-21
AU783005B2 (en) 2005-09-15
HK1051317A1 (zh) 2003-08-01
EA200200724A1 (ru) 2003-02-27
OA12168A (en) 2006-05-08
BR0107972A (pt) 2002-11-05
WO2001054719A2 (en) 2001-08-02
KR20070073987A (ko) 2007-07-10
CN1419456A (zh) 2003-05-21
PL357210A1 (en) 2004-07-26
MXPA02007413A (es) 2004-07-30
PL211762B1 (pl) 2012-06-29
NO20023616L (no) 2002-09-17
HUP0204250A3 (en) 2005-06-28
US20050266025A1 (en) 2005-12-01
NO20023616D0 (no) 2002-07-30
SK11122002A3 (sk) 2003-01-09
US20090104229A1 (en) 2009-04-23
CN1326873C (zh) 2007-07-18
IL150756A0 (en) 2003-02-12
EP1251870A2 (en) 2002-10-30
KR20020073569A (ko) 2002-09-27
DZ3286A1 (fr) 2001-08-02
HUP0204250A1 (hu) 2003-03-28
CA2398611A1 (en) 2001-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG106964A (bg) Ваксина за профилактична или терапевтична имунизация против hiv
EP2130921B1 (en) Vaccine for prevention and treatment of HIV-infection
US20080102085A1 (en) Vaccine comprising gp120 and nef and/or tat for the immunization against hiv
US20140193481A1 (en) Stabilised vaccine composition
SK71397A3 (en) Pharmaceutical compositions inducting cytotoxic t-lymphocyte response
ZA200205968B (en) Vaccine for the prophylactic or therapeutic immunization against HIV.