SK11122002A3

SK11122002A3 - Použitie HIV Tat proteínu a/alebo HIV Nef proteínu spolu s HIV gp120 proteínom a vakcína obsahujúca tieto proteíny

Info

Publication number: SK11122002A3
Application number: SK1112-2002A
Authority: SK
Inventors: Gerald Voss
Original assignee: Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date: 2000-01-31
Filing date: 2001-01-29
Publication date: 2003-01-09
Also published as: US20050266025A1; HK1051317A1; CN1419456A; HUP0204250A3; IL150756A0; DZ3286A1; US20090104229A1; WO2001054719A2; PL357210A1; KR20070073987A; KR20020073569A; AU783005B2; WO2001054719A3; NZ520327A; PL211762B1; KR100808348B1; EP1251870A2; BR0107972A; CZ20022643A3; OA12168A

Description

Predložený vynález sa týka nových použití HIV proteínov v medicínskych a vakcínových prostriedkoch obsahujúcich takéto HIV proteíny. Konkrétne sa vynález týka použitia HIV Tat a HIV gp120 proteínov v kombinácii. Okrem toho sa vynález týka použitia HIV Nef a HIV gp120 proteínov v kombinácii.

Doterajší stav techniky

HIV-1 je primárnou príčinou syndrómu získanej imunitnej nedostatočnosti (AIDS),'ktorý je považovaný za jeden z najväčších zdravotných problémov na svete. Hoci sa uskutočňuje extenzívny výskum po celom svete, aby sa vyrobila vakcína, doteraz neboli takéto pokusy úspešné.

HIV obalový glykoproteín gp120 je vírusový proteín, ktorý je používaný na pripojenie na hostiteľskú bunku. Toto pripojenie je sprostredkované viazaním dvoch povrchových molekúl pomocných T buniek a makrofágov, známych ako CD4, a jedného z dvoch chemokínových receptorov CCR-4 alebo CXCR-5. Gp120 proteín sa najprv exprimuje ako veľká prekurzorová molekula (gp160), ktorá sa potom posttranslačne štiepi, čím vzniká gp120 a gp41. Gp120 proteín je zachytený na povrchu viriónu prostredníctvom väzby na gp41 molekulu, ktorá je začlenená vo vírusovej membráne.

Gp120 proteín je principiálnym cieľom neutralizačných protilátok, ale nanešťastie je väčšina imunogénnych oblastí proteínov (V3 slučka) zároveň najvariabilnejšími časťami proteínu. Preto sa použitie gp120 (alebo jeho prekurzora gp160) ako vakcínového antigénu na vyvolanie neutralizačných protilátok považuje za obmedzené čo sa týka vakcíny so širokým ochranným rozsahom. Gp120 proteín tiež obsahuje epitopy, ktoré sú rozoznávané cytotoxickými T lymfocytami (CTL). Tieto efektorové bunky sú schopné eliminovať vírusom infikované bunky a preto predstavujú druhý hlavný protivírusový imunitný mechanizmus. Na rozdiel od

-2cieľových oblastí neutralizačných protilátok sa niektoré CTL epitopy javia ako relatívne konzervované medzi rozličnými HIV kmeňmi. Z tohto dôvodu sú gp120 a gp160 považované za užitočné antigénne zložky vakcín, ktorých cieľom je vyvolanie bunkovo sprostredkovaných imunitných odpovedí (konkrétne CTL).

Neobalové proteíny HIV-1 boli opísané a zahŕňajú napríklad vnútorné štrukturálne proteíny, ako napríklad produkty génov gag a pol, a iné neštrukturálne proteíny, ako napríklad Rev, Nef, Vif a Tat (Greeene a ďalší, New England J. Med., 324, 5, 308 a ďalšie (1991) a Bryant a ďalší (vyd. Pizzo), Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390 a ďalšie (1992).

HIV Tat a Nef proteíny sú skoré proteíny, teda sa exprimujú v skorom štádiu infekcie a v neprítomnosti štrukturálneho proteínu.

Pri prezentácii na konferencii (C. Dávid Pauza, Immunization with Tat toxoid attenuates SHIV89.6PD infection in rhesus macaques, 12. Cent Gardes meeting, Marnes-La-Xoquette, 26.10.1999) boli opísané experimenty, pri ktorých sa makaky rhesus imunizovali s Tat toxoidom, samostatne alebo v kombinácii s vakcínovou kombináciou obsahujúcou obalový glykoproteín gp160 (jedna dávka rekombinantného vakcínia vírusu a jedna dávka rekombinantného proteínu). Avšak pozorované výsledky ukázali, že prítomnosť obalového glykoproteínu nie je žiadnou výhodou v porovnaní s experimentmi uskutočňovanými len s Tat.

Zistilo sa však, že Tat- a/alebo Nef-obsahujúci imunogén (najmä Nef-Tat fúzovaný protein) účinkujú synergicky s gp120 pri ochrane makakov pred patogénnou infekciou chimérnym humánno-opičím vírusom imunitnej nedostatočnosti (SHIV). Doteraz je SHIV infekcia makakov rhesus považovaná za najrelevantnejší zvierací model humánneho AIDS. Preto sa použil tento predklinický model na zhodnotenie ochrannej účinnosti vakcín obsahujúcich gp120 antigén a Nef- a Tat-obsahujúci antigén, buď samostatne, alebo v kombinácii. Analýzy dvoch markerov vírusovej infekcie a patogénnosti, percenta CD4-pozitívnych buniek v periférnej krvi a koncentrácie voľných SHIV RNA genómov v plazme opíc, indikovali, že tieto dva antigény účinkujú synergicky. Výsledkom imunizácie buď s gp120, alebo s Nef-Tat + SIV Nef samostatne, nebol žiadny rozdiel v porovnaní s imunizáciou so samotným adjuvans. Na rozdiel od toho, podanie kombinácie gp120 a Nef-Tat + SIV Nef antigénov viedlo k značnému zlepšeniu dvoch vyššie

-3uvedených parametrov u všetkých zvierat v tejto konkrétnej experimentálnej skupine.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použitie HIV Tat a/alebo Nef proteinu spolu s HIV gp120 na výrobu vakcíny na profylaktickú alebo terapeutickú imunizáciu ľudí proti HIV.

Ako je opísané vyššie, NefTat proteín, SIV Nef proteín a gp120 proteín spolu poskytujú zosilnenú odpoveď v porovnaní s odpoveďou, ktorá sa pozoruje, keď sa buď NefTat + SIV Nef, alebo gp120, použijú samostatne. Túto zosilnenú odpoveď alebo synergiu je možné vidieť v poklese množstva vírusu, čo je výsledok očkovania s týmito kombinovanými proteínmi. Alternatívne, alebo okrem toho, sa zosilnená odpoveď manifestuje udržiavaním hladín CD4+ nad hladinami zistenými pri neprítomnosti vakcinácie s HIV NefTat, SIV Nef a HIV gp120. Synergický účinok je prisudzovaný kombinácii gp120 a Tat, alebo gp120 a Nef alebo gp120 a Nef aj Tat.

Pridanie iných HIV proteinov môže synergický účinok, ktorý bol pozorovaný medzi gp120 a Tat a/alebo Nef, ešte zosilniť. Tieto iné proteíny tiež môžu účinkovať synergický z jednotlivými zložkami vakcíny obsahujúcej gp120, Tat a/alebo Nef, pričom nie je potrebná prítomnosť kompletnej originálnej antigénovej kombinácie. Ďalšími proteínmi môžu byť regulačné proteíny HIV, ako napríklad Rev, Vif, Vpu a Vpr. Môžu nimi byť aj štrukturálne proteíny odvodené od HIV génov gag alebo pol.

HIV gag gén kóduje prekurzorový proteín p55, ktorý sa môže spontánne zostavovať do nezrelých častíc podobných vírusu (VLPs). Prekurzor sa potom proteolyticky štiepi na hlavné štrukturálne proteíny, p24 (kapsid) a p18 (matrix), a na niekoľko menších proteinov. Tak prekurzorový proteín p55, ako aj jeho hlavné deriváty p24 a p18, môžu byť považované za vhodné vakcínové antigény, ktoré môžu ešte zosilňovať synergický účinok pozorovaný medzi gp120 a Tat a/alebo Nef. Prekurzor p55 a kapsidový proteín p24 môžu byť použité ako VLPs alebo ako monomérne proteíny.

HIV Tat proteín môže byť vo vakcíne podľa predloženého vynálezu voliteľne spojený s HIV Nef proteínom, napríklad ako fúzovaný proteín.

-4HIV Tat proteín, HIV Nef proteín alebo NefTat fúzovaný proteín podľa predloženého vynálezu môžu mať C koncový histidínový chvost, ktorý výhodne obsahuje 5 až 10 histidínových zvyškov. Prítomnosť histidínového (alebo His) chvosta napomáha purifikácii.

Vo výhodnom uskutočnení sa proteiny exprimujú s histidínovým chvostom obsahujúcim 5 až 10 a výhodne šesť histidínových zvyškov. Tieto sú výhodné, pretože napomáhajú purifikácii. Bola publikovaná samostatná expresia Nef (Macreadie I.G. a ďalší, 1993, Yeast 9 (6) 565-573) a Tat (Braddock M a ďalší, 1989, Celí 58 (2) 269-79) v kvasinkách (Saccharomyces cerevisiae). Nef proteín a Gag proteiny p55 a p18 sú myristylované. Vo WO 99/16884 už boli opísané separátne expresie Nef a Tat v Pichia expresnom systéme (Nef-His a Tat-His konštrukty) a expresia fúzovaného konštruktu Nef-Tat-His.

DNA a aminokyselinové sekvencie reprezentatívneho Nef-His proteínu (sekv. č. 8 a 9), Tat-His proteínu (sekv. č. 10 a 11) a Nef-Tat-His fúzovaného proteínu (sekv. č. 12 a 13) sú uvedené na obrázku 1.

HIV proteiny podľa predloženého vynálezu môžu byť použité v natívnej konformácii, alebo výhodne môžu byť na vakcínové použitie modifikované. Tieto modifikácie môžu byť buď potrebné z technických dôvodov týkajúcich sa spôsobu purifikácie, alebo môžu byť použité na biologickú inaktiváciu jednej alebo niekoľkých funkčných vlastností Tat alebo Nef proteínu. Takže vynález zahŕňa deriváty HIV proteinov, ktorými môžu byť napríklad mutované proteiny. Výraz mutovaný je tu používaný vo význame molekuly, v ktorej je deletovaná, pridaná alebo substituovaná jedna alebo viacero aminokyselín použitím dobre známych techník miestne špecifickej mutagenézy alebo akejkoľvek inej obvyklej metódy.

Napríklad mutantný Tat protein môže byť mutovaný tak, aby bol biologicky neaktívny, a aby si pritom stále zachovával imunogénne epitopy. Jeden možný mutovaný tat gén, skonštruovaný D. Clementsom (Tulane University) (pochádzajúci z BH10 molekulového klonu) nesie mutácie v oblasti aktívneho miesta (Lys 41 ->

Ala) a v RGD motíve (Arg 78 -> Lys a Asp 80 -> Glu) (Virology 235: 48-64, 1997).

Mutovaný Tat je ilustrovaný na obrázku 1 (sekv. č. 22 a 23) a v Nef-Tat mutant-His (sekv. č. 24 a 25).

-5HIV Tat alebo Nef proteíny vo vakcíne podľa predloženého vynálezu môžu byť modifikované chemickými metódami v priebehu purifikačného procesu, aby sa proteíny stali stabilnými a monomérnymi. Jedným spôsobom na predchádzanie oxidatívnej agregácii proteínu, ako napríklad Tat alebo Nef, je použitie chemických modifikácii proteínových tiolových skupín. V prvom kroku sa redukujú disulfidové mostíky pôsobením redukčného činidla, ako napríklad DTT, beta-merkaptoetanolu alebo glutatiónu. V druhom kroku sa výsledné tioly blokujú reakciou s alkylačným činidlom (napríklad proteín môže byť karboxyamidovaný/karbamidometylovaný použitím jódacetamidu). Takáto chemická modifikácia nemodifikuje funkčné vlastnosti Tat alebo Nef, čo sa zistilo prostredníctvom bunkových väzobných testov a inhibíciou lymfoproliferácie ľudských periférnych krvných mononukleárnych buniek.

HIV Tat proteín a HIV gp120 proteín sa môžu purifikovať spôsobmi načrtnutými v pripojených príkladoch.

Vakcína podľa predloženého vynálezu bude obsahovať imunoprotektívne alebo imunoterapeutické množstvo tat a/alebo nef alebo NefTat a gp120 antigénov a môže byť pripravená obvyklými technikami.

Príprava vakcín je vo všeobecnosti opísaná v New Trends and Developments in Vaccines, vyd. Voliér a ďalší, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Enkapsulácia vo vnútri lipozómov je opísaná napríklad v Fullerton, US. patent č. 4235877. Konjugácia proteínov s makromolekulami je opísaná napríklad v Likhite, US patent 4372945 a v Armor a ďalší, US patent 4474757.

Množstvo proteínu vo vakcínovej dávke je vybrané ako množstvo ktoré indukuje imunoprotektívnu ochranu bez významných negatívnych vedľajších účinkov v typických vakcínach. Takéto množstvo sa bude meniť v závislosti na tom, ktorý konkrétny imunogén sa využije. Vo všeobecnosti sa očakáva, že každá dávka bude obsahovať 1 až 1000 pg každého proteínu, výhodne 2 až 200 pg, najvýhodnejšie 4 až 40 pg Tat alebo Nef alebo NefTat a výhodne 1 až 150 pg, najvýhodnejšie 2 až 25 pg gp120. Optimálne množstvo pre konkrétnu vakcínu sa môže upresňovať štandardnými štúdiami zahŕňajúcimi pozorovanie protilátkových titrov a iných odpovedí u subjektov. Jeden konkrétny príklad vakcínovej dávky bude obsahovať 20 pg NefTat a 5 alebo 20 pg gp120. Po počiatočnej vakcinácii môžu

-6subjekty obdržať druhú dávku po približne 4 týždňoch a následne ďalšiu revakcinačnú imunizáciu.

K proteínom podľa predloženého vynálezu sa výhodne pridáva vo vakcínovej formulácii podľa vynálezu adjuvans. Adjuvans sú vo všeobecnosti opísané vo Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach, vyd. Powell and Newman, Plénum Press, New York, 1995.

Vhodné adjuvans zahŕňajú hliníkovú soľ, ako napríklad gél hydroxidu hlinitého (kamenec) alebo fosforečnan hlinitý, ale môžu to byť aj soli vápnika, železa alebo zinku alebo to môže byť nerozpustná suspenzia acylovaného tyrozínu alebo acylovaných sacharidov, katiónových alebo aniónových derivátov polysacharidov alebo polyfosfazény.

Je výhodné, aby vo formulácii podľa vynálezu adjuvantný prostriedok indukoval preferenčnú Th1 odpoveď. Avšak musí byť zrejmé, že iné odpovede, vrátane iných humorálnych odpovedí, nie sú vylúčené.

Imunitná odpoveď je generovaná proti antigénu prostredníctvom interakcie antigénu s bunkami imunitného systému. Výsledná imunitná odpoveď môže byť veľmi všeobecne rozdelená do dvoch extrémnych kategórií, humorálnej imunitnej odpovede a bunkovo sprostredkovanej imunitnej odpovede (tradične sú charakterizované protilátkovým, respektíve bunkovým efektorovým mechanizmom ochrany). Tieto kategórie odpovede boli označené ako Th1-typ odpovedí (bunkovo sprostredkovaná odpoveď) a Th2-typ iminutných odpovedí (humorálna odpoveď).

Extrémny Th1-typ imunitných odpovedí môže byť charakterizovaný generovaním odpovede antigénovo špecifických haplotypom definovaných cytotoxických T lymfocytov a prirodzených zabíjačských buniek. U myší sa Th1-typ odpovede často charakterizuje generovaním protilátok lgG2a subtypu, zatiaľ čo u ľudí tieto zodpovedajú lgG1 typu protilátok. Th2-typ imunitných odpovedí je charakteristický generovaním širokého rozsahu imunoglobulínových izotypov zahŕňajúcich myšie lgG1, IgA a IgM.

Za hnaciu silu vývoja týchto dvoch typov imunitných odpovedí je možné brať cytokíny, množstvo identifikovaných proteínových poslov, ktorý pomáhajú bunkám imunitného systému a nasmerúvajú eventuálnu imunitnú odpoveď buď na Th1, alebo na Th2 odpoveď. Takže vysoké hladiny cytokínov Th1-typu majú tendenciu

-7 uprednostňovať indukciu bunkami sprostredkovaných imunitných odpovedí na daný antigén, zatiaľ čo vysoké hladiny cytokínov Th2-typu majú tendenciu uprednostňovať indukciu humorálnych imunitných odpovedí na antigén.

Je dôležité pamätať na to, že rozlišovanie Th1 a Th2-typu imunitných odpovedí nie je absolútne. V skutočnosti jednotlivec bude podporovať imunitnú odpoveď, ktorá sa opisuje ako predominantne Th1 alebo predominantne Th2. Avšak často je vhodné uvažovať s rodinami cytokínov v termínoch ako sú opísané pre hlodavčie CD4+ve T bunkové klony Mosmannom a Coffmanom (Mosmann, T.R a Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 ceils: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, str. 145-173). Tradične sú odpovede Th1-typu spojené s produkciou INF-γ a IL-2 cytokínov T-lmyfocytmi. Iné cytokíny, ktoré sú často priamo spojené s indukciou imunitných odpovedí Th1-typu, nie sú produkované T-bunkami, ako napríklad 11-12. Na rozdiel od toho sú odpovede Th2-typu spojené s vylučovaním IL-4, IL-5, IL-6, IL10 a nádorového nekrotického faktora-β (TNF-β)

Je známe, že určité vakcínové adjuvans sú výnimočne vhodné na stimuláciu buď Th1, alebo Th2-typu cytokínových odpovedí. Najlepšie indikátory Th1:Th2 rovnováhy imunitnej odpovede po vakcinácii alebo infekcii tradične zahŕňajú priame meranie produkcie Th1 alebo Th2 cytokínov T lymfocytami in vitro po opätovnej stimulácii s antigénom a/alebo meranie lgG1:lgG2a pomeru antigénovo špecifických protilátkových odpovedí.

Takže adjuvans Th1-typu je adjuvans, ktoré stimuluje izolované T-bunkové populácie k produkcii vysokých hladín Th1-typu cytokínov, keď sa opätovne stimulujú s antigénom in vitro, a indukuje antigénovo špecifické imunoglobulínové odpovede asociované z izotypom Th1-typu.

Výhodné imunostimulanty Th1-typu, ktoré môžu byť formulované na produkciu adjuvans vhodného na použitie v predloženom vynáleze, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na nasledovné.

Monofosforyllipid A, najmä 3-de-O-acylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL) je výhodným imunostimulantom Th1-typu na použitie vo vynáleze. 3D-MPL je dobre známe adjuvans vyrábané firmou Ribi Immunochem, Montana. Chemicky sa často dodáva ako zmes 3-de-O-acylovaného monofosforyllipidu A so 4, 5 alebo 6

-8acylovanými reťazcami. Môže sa purifikovať a pripraviť spôsobmi opísanými v GB 2122204B, ktorý opisuje aj prípravu difosforyllipidu A a jeho 3-O-deacylovaných variantov. Iné purifikované a syntetické lipopolysacharidy boli opísané v US 6005099 a EP 0729473B1; Hilgers a ďalší, 1986, Int. Árch. Allergy. Immunol., 79(4):392-6; Hilgers a ďalší, 1987, Immunology, 60(1):141-6; a EP 0549074 B1. Výhodnou formou 3D-MPL je forma časticovej formulácie s veľkosťou malých častíc menšou ako 0,2 gm v priemere, a spôsob jej výroby je opísaný v EP 0689454.

Výhodnými Th1 imunostimulantami podľa vynálezu sú aj saponíny. Saponíny sú dobre známe adjuvans a sú opísané v: Lacaille-Dubois, M a Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine zv. 2, str. 363-386). Napríklad Quil A (vyrobený z kôry juhoamerického stromu Quillaja Saponaria Molina) a jeho frakcie sú opísané v US 5057540 a v Saponins as vaccine adjuvants, Kensil, C.R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55; a EP 0362279 B1. Hemolytické saponíny QS21 a QS17 (HPLC purifikované frakcie Quil A) boli opísané ako účinné systémové adjuvans a spôsob ich výroby je opísaný v US patente č. 5057540 a v EP 0362279B1. V týchto publikáciách je opísané aj použitie QS7 (nehemolytická frakcia Quil-A), ktorý funguje ako účinné adjuvans pre systémové vakcíny. Použitie QS21 je podrobnejšie opísané v Kensil a ďalší (1991. J. Immunology zv. 146, 431-437). Dobre sú známe aj kombinácie QS21 a polysorbátu alebo cyklodextrínu (WO 99/10008). Časticové adjuvans systémy obsahujúce frakcie QuilA, ako napríklad QS21 a QS7, sú opísané vo WO 96/33739 a WO 96/11711.

Iným výhodným imunostimulantom je imunostimulačný oligonukleotid obsahujúci nemetylované CpG dinukleotidy (CpG). CpG je skratka cytozínguanozínových dinukleotidových motívov nachádzajúcich sa v DNA. CpG je v oblasti známy ako adjuvans, keď sa podáva tak systémovým, ako aj mukóznym podaním (WO 96/02555, EP 468520, Davis a ďalší, J. Immunol., 1998, 160(2): 870876; McCIuskie a Davis, J. Immunol., 1998, 161(9): 4463-6). Vývoj v čase: Pozorovalo sa, že DNA frakcia BCG môže vykazovať protinádorový účinok. V ďalších štúdiách sa ukázalo, že syntetické oligonukleotidy odvodené od BCG génových sekvencii sú schopné indukovať imunostimulačné účinky (tak in vitro, ako aj in vivo). Autori týchto štúdií dospeli k názoru, že túto aktivitu nesú určité

-9palindromatické sekvencie vrátane centrálneho CG motívu. Centrálna úloha CG motívu v imunostimulácii bola neskôr objasnená v publikácii Krieg, Náture 374, str. 546, 1995. Podrobná analýza ukázala, že CG motív musí byť v určitom sekvenčnom kontexte, a že takéto sekvencie sú bežné v bakteriálnej DNA, ale sú zriedkavé v DNA stavovcov. Imunostimulačnou sekvenciou je často: purín, purín, C, G, pyrimidín, pyrimidín; pričom CG motív nie je metylovaný, ale aj o iných CpG sekvenciách je známe, že sú imunostimulačné a môžu byť použité v predloženom vynáleze.

V určitých kombináciách šiestich nukleotidov sa môže nachádzať palindromatická sekvencia. V rovnakom oligonukleotide sa môže nachádzať niekoľko týchto motívov, buď ako opakovania jedného motívu, alebo ako kombinácie rôznych motívov. Prítomnosť jednej alebo viacerých z týchto oligonukleotidov obsahujúcich imunostimulačné sekvencie môže aktivovať rôzne imunitné podsady, vrátane prirodzených zabíjačských buniek (ktoré produkujú interferón γ a majú cytolytickú aktivitu) a makrofágov (Wooldrige a ďalší, zv. 89 (č. 8), 1977). V súčasnosti sa ukázalo, že aj iné sekvencie obsahujúce nemetylovaný CpG, ktoré nemajú túto konsenzus sekvenciu, sú imunomodulačné.

CpG, keď je formulovaný vo vakcínach, sa vo všeobecnosti podáva vo voľnom roztoku spolu s voľným antigénom (WO 96/02555); McCIuskie a Davis, vyššie), alebo kovalentne konjugovaný s antigénom (WO 98/16247), alebo formulovaný s nosičom, ako napríklad hydroxidom hlinitým ((hepatitídový povrchový antigén) Davis a ďalší, vyššie; Brazolot-Millan a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998,95(26),15553-8).

Také imunostimulanty, ako sú opísané vyššie, môžu byť formulované spolu s nosičmi, ako napríklad lipozómami, emulziami olej vo vode, a/alebo so soľami kovov vrátane solí hliníka (ako napríklad s hydroxidom hlinitým). Napríklad, 3D-MPL môže byť formulovaný s hydroxidom hlinitým (EP 0689454) alebo v emulziách olej vo vode (WO 95/17210); QS21 môže byť výhodne formulované s lipozómami obsahujúcimi cholesterol (WO 96/33739), v emulziách olej vo vode (WO 95/17210) alebo s kamencom (WO 98/15287); CpG môže byť formulovaný s kamencom (Davis a ďalší, vyššie; Brazolot-Millan, vyššie) alebo s inými katiónovými nosičmi.

-10Výhodné sú aj kombinácie imunostimulantov, najmä kombinácia monofosforyllipidu A a saponínového derivátu (WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241), konkrétnejšie kombinácia QS21 a 3D-MPL, ako je opísaná vo WO 94/00153. Alternatívne aj kombinácia CpG plus saponín, ako napríklad QS21, tvorí účinné adjuvans na použitie v predloženom vynáleze.

Takže vhodné adjuvans systémy zahŕňajú napríklad kombináciu monofosforyllipidu A, výhodne 3D-MPL, spolu so soľou hliníka. Zosilnený systém zahŕňa kombináciu monofosforyllipidu A a saponínového derivátu, konkrétne kombináciu QS21 a 3D-MPL, ako je opísaná vo WO 94/00153, alebo menej reaktogénny prostriedok, kde QS21 je utlmený v lipozómoch obsahujúcich cholesterol (DQ), ako je opísané vo WO 96/33739.

Výnimočne účinná adjuvans formulácia zahŕňajúca QS21, 3D-MPL & tokoferol v emulzii olej vo vode je opísaná vo WO 95/17210 a je ďalšou výhodnou formuláciou na použitie podľa vynálezu.

Iná výhodná formulácia obsahuje CpG oligonukleotid, samotný alebo s hlinitou soľou.

V inom predmete vynálezu môže vakcína obsahovať DNA kódujúcu jeden alebo viacero z Tat, Nef a gp120 polypeptidov, tak, aby sa polypeptid generoval in situ. DNA sa môže nachádzať v ktoromkoľvek z rôznych dodávacích systémov známych pre priemerného odborníka v oblasti zahŕňajúc nukleokyselinové expresné systémy, ako napríklad plazmidové DNA, bakteriálne a vírusové expresné systémy. V oblasti je dobre známych množstvo techník na dodávanie génu, ako napríklad techniky opísané v Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198, 1998 a v tam uvedených citáciách. Príslušné nukleotikyselinové expresné systémy obsahujú DNA sekvencie nevyhnutné na expresiu u pacienta (ako napríklad vhodný promótor a terminačný signál). Ak je expresným systémom rekombinantný živý mikroorganizmus, ako napríklad vírus alebo baktéria, gén, o ktorý je záujem, sa môže začleniť do genómu živého rekombinantného vírusu alebo baktérie. Inokulácia a in vivo infekcia s týmto živým vektorom bude viesť k in vivo expresii antigénu a k indukcii imunitnej odpovede. Vírusmi a baktériami používanými na tento účel sú napríklad: osýpkové vírusy (napr. vakcinia, vírus osýpok hydiny, vírus

-11 osýpok kanárikov, modifikované osýpkové vírusy, napr. modifikovaný vírus Ankara (MVA)), alfavírusy (Sindbis vírus, Semliki Forest vírus, vírus venezuelskej konskej encefalitídy), flavivirusy (vírus žltej horúčky, Dengue vírus, vírus japonskej encefalitídy), adenovírusy, adeno-asociované vírusy, pikornavírusy (poliovírus, vírus chrípky), herpesvírusy (vírus varicella zoster, atď.), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Tieto vírusy a baktérie môžu byť virulentné alebo oslabené za účelom získania živých vakcín. Aj takéto živé vakcíny tvoria časť vynálezu.

Takže Nef, Tat a gp120 zložky výhodnej vakcíny podľa vynálezu môžu byť poskytnuté vo forme polynukleotidov kódujúcich požadované proteiny.

Okrem toho sa imunizácie podľa vynálezu môžu uskutočňovať kombináciou formulácií založených na proteíne a na DNA. Imunizácie prvou a následne druhou revakcinačnou dávkou sú považované za účinné na indukciu širokých imunitných odpovedí. Proteínové vakcíny s adjuvans indukujú najmä protilátky a imunitné odpovede T pomocnými bunkami, zatiaľ čo dodanie DNA vo forme' plazmidu alebo živého vektora silno indukuje cytotoxické T lymfocytové (CTL) odpovede. Takže kombinácia proteínovej a DNA vakcinácie bude poskytovať veľmi rôzne imunitné odpovede. To je relevantné najmä v kontexte HIV, keďže za dôležité v imunitnej obrane proti HIV sa považujú tak neutralizačné protilátky, ako aj CTL.

Podľa vynálezu môže režim očkovania s gp120, Nef a Tat, samostatne alebo v kombinácii, zahŕňať postupné (prvá dávka - revakcinácia, prime-boost) alebo súčasné podávanie proteínových antigénov a DNA kódujúcej vyššie uvedené proteiny. DNA sa môže dodávať vo forme plazmidovej DNA alebo vo forme rekombinantného živého vektora, napr. poxvírusového vektora alebo akéhokoľvek iného vhodného živého vektora, ako napríklad tu opísaných vektorov. Proteínové antigény sa môžu injektovať raz alebo niekoľko krát a potom môže nasledovať jedno alebo viacero DNA podaní, alebo sa môže DNA použiť prvá na jedno alebo viacero podaní a potom môže nasledovať jedna alebo viacero proteínových imunizácií.

Konkrétny príklad prime-boost (prvé očkovanie + revakcinácia) imunizácie podľa vynálezu zahŕňa prvé očkovanie s DNA vo forme rekombinantného živého vektora, ako napríklad modifikovaného poxvírusového vektora, napríklad modifikovaného vírusu Ankara (MVA), alebo alfavirusu, napríklad vírusu venezuelskej konskej encefalitídy, a potom nasleduje revakcinácia s proteínom, výhodne proteínom spolu s adjuvans.

Takže vynález ďalej poskytuje farmaceutický kit, ktorý obsahuje:

a) prostriedok zahŕňajúci jeden alebo viacero z gp120, Nef a Tat proteínov spolu s farmaceutický prijateľným excipientom; a

b) prostriedok obsahujúci jeden alebo viacero z polynukleotidov kódujúcich gp120, Nef a Tat spolu s farmaceutický prijateľným excipientom;

s podmienkou, že aspoň jeden z a) alebo b) obsahuje gp120 s Nef a/alebo Tat a/alebo Nef-Tat.

Prostriedky a) a b) sa môžu podávať oddelene, v ľubovoľnom poradí, alebo spolu. Výhodne a) obsahuje všetky tri proteiny gp120, Nef a Tat. Výhodne b) obsahuje všetky tri DNA gp120, Nef a Tat. Najvýhodnejšie sú Nef a Tat vo forme NefTat fúzovaného proteínu.

Ďalší predmet predloženého vynálezu poskytuje spôsob výroby očkovacej formulácie, ako je tu opísaná, pričom zahŕňa miešanie kombinácie proteínov podľa vynálezu. Proteínový prostriedok sa môže miešať s vhodným adjuvans a, voliteľne, s nosičom.

Výnimočne výhodné adjuvans a/alebo nosičové kombinácie na použitie vo formuláciách podľa vynálezu sú nasledovné:

i) 3D-MPL + QS21 v DQ ii) kamenec + 3D-MPL iii) kamenec + QS21 v DQ + 3D-MPL iv) kamenec + CpG

v) 3D-MPL + QS21 v DQ + emulzia olej vo vode , vi) CpG

Vynález je ilustrovaný v nasledujúcich príkladoch a na obrázkoch.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 sú znázornené DNA a aminokyselinové sekvencie Nef-H; Tat-H;

Nef-Tat-His fúzie a mutovaného Tat.

Na obr. 2 je znázornená mapa integrativneho vektora pRIT14597.

- 13Na obr. 3 je znázornená úroveň čistoty Nef-Tat-His fúzového proteinu určená prostredníctvom SDS-PAGE Daiichi strieborným sfarbením.

Na obr. 4 je znázornená úroveň čistoty Nef-Tat-His fúzového proteinu určená prostredníctvom SDS-PAGE Coomassie blue G250 farbením.

Na obr. 6 je znázornená úroveň čistoty Nef-Tat-His fúzového proteinu odhadnutá prostredníctvom SDS-PAGE (Daiichi strieborné farbenie, Coomassie blue G250 farbenie, Western blotting).

Na obr. 7 je znázornená úroveň čistoty Nef-Tat-His fúzového proteinu odhadnutá prostredníctvom SDS-PAGE (Coomassie blue G250 farbenie, Western blotting).

Na obr. 8 je znázornená úroveň čistoty Nef-Tat-His fúzového proteinu odhadnutá prostredníctvom SDS-PAGE (Coomassie blue G250 farbenie, Western blotting).

Na obr. 9 je znázornená úroveň čistoty Nef-Tat-His fúzového proteinu odhadnutá prostredníctvom SDS-PAGE (Coomassie blue G250 farbenie, Daiichi strieborné farbenie).

Na obr. 10 je znázornená úroveň čistoty Nef-Tat-His fúzového proteinu odhadnutá prostredníctvom SDS-PAGE (Daiichi strieborné farbenie, Coomassie blue G250 farbenie, Western blotting).

Na obr. 11 je znázornená mapa integratívneho vektora pRIT14908.

Na obr. 12 sú znázornené sekvencie SIV-NEF-His proteinu exprimované v Pichia.

Na obr. 13 je znázornená SDS-PAGE analýza farbená s Coomassie blue rekombinantných kmeňov Pichia pastoris exprimujúcich SIV/NEF.

Na obr. 14 je znázornená štúdia na opiciach 1 - analýza CD4-pozitívnych buniek medzi PBMCs pred a po infekcii s SHIV.

Na obr. 15 je znázornená štúdia na opiciach 1 - analýza množstva SHIV plazmatického vírusu po infikovaní s SHIV.

Na obr. 16 je znázornená štúdia na opiciach 2 - analýza CD4-pozitívnych buniek medzi PBMCs pred a po infekcii s SHIV.

Na obr. 17 je znázornená štúdia na opiciach 2 - analýza množstva SHIV plazmatického vírusu po infikovaní s SHIV.

-14Príklady uskutočnenia vynálezu

Všeobecná časť

Pre konštrukty v týchto experimentoch bol vybraný Λ/ef gén z Bru/Lai izolátu (Celí 40: 9-17, 1985), pretože tento gén patrí medzi gény najbližšie ku konsenzus Nef.

Východiskovým materiálom pre Bru/Lai Nef gén bol 1170bp DNA fragment klonovaný v cicavčom expresnom vektore pcDNA3 (pcDNA3/Nef).

Tat gén pochádza z BH10 molekulového klonu. Tento gén sme obdržali vo forme HTLV III cDNA klonu označeného pCV1 a opísaného v Science, 229, str. 6973, 1985.

Nef a Tat gény sa mohli exprimovať v Pichia alebo v akomkoľvek inom hostiteľovi.

Príklad 1

Expresia HIV-1 nef a tat sekvencii v Pichia pastoris

Nef protein, Tat protein a fúzia Nef-Tat sa exprimovali v metylotrofickej kvasinke Pichia pastoris pod kontrolou inducibilného promótora alkohol oxidázy (AOX1).

Na expresiu týchto HIV-1 génov sa použila modifikovaná verzia integratívneho vektora PHIL-D2 (INVITROGEN). Tento vektor sa modifikoval takým spôsobom, aby sa expresia heterológneho proteínu začala hneď za natívnym ATG kodónom AOX1 génu, a aby sa produkoval rekombinantný protein s chvostom obsahujúcim jeden glycínový a šesť histidínových zvyškov. Tento PHIL-D2-MOD vektor sa skonštruoval klonovaním oligonukleotidového spojovníka medzi susediace Asull a EcoRI miesta PHIL-D2 vektora (pozri obrázok 2). Okrem His chvosta nesie tento spojovník aj Ncol, Spel a Xbal reštrikčné miesta medzi ktoré sa začlenil nef, tat a nef-tat fúzia.

1.1 Konštrukcia integratívnych vektorov pRIT14597 (kóduje Nef-His protein), pRIT14598 (kóduje Tat-His protein) a pRIT14599 (kóduje fúziu Nef-Tat-His)

Nef gén sa amplifikoval prostredníctvom PCR z pcDNA3/Nef plazmidu s primermi 01 a 02.

Ncol

PrimerOl (sekv. č. 1): 5’ atcgtccatg.ggt.ggc . aag.tgg.τ 3’

Spel

Primer 02 (sekv. č. 2): 5’ cggctactagtgcagttcttgaa 3’

Tak získaný PCR fragment, ako aj integratívny PHIL-D2-MOD vektor sa poštiepili s Ncol a Spel, purifikovali sa na agarózovom géli a ligovali sa, čím vznikol integratívny plazmid pRIT14597 (pozri obrázok 2).

Tat gén sa amplifikoval prostredníctvom PCR z derivátu pCV1 plazmidu s primermi 05 a 04:

Spel

Primer 04 (sekv. č. 4): 5’ cggctactagtttccttcgggcct 3’

Ncol

Primer 05 (sekv. č. 5): 5' atcgtccatggagccagtagatc 3’

Ncol reštrikčné miesto sa začlenilo na 5’ koniec PCR fragmentu, zatiaľ čo Spel miesto sa začlenilo na 3’ koniec s primerom 04. Získaný PCR fragment, ako aj PHIL-D2-MOD vektor sa poštiepili s Ncol a Spel, purifikovali sa na agarózovom géli a ligovali sa, čím sa vytvoril integratívny plazmid pRIT14598.

Aby sa skonštruoval pRIT14599, ligoval sa 910bp DNA fragment zodpovedajúci nef-ŕaŕ-His kódujúcej sekvencii medzi EcoRI miesto zatupené T4 polymerázou a Nco miesto PHIL-D2-MOD vektora. Fragment kódujúci nef-taf-His sa získal štiepením plazmidu pRIT14596 s Xbal (koniec zatupený T4 polymerázou) a s Ncol.

1.2 Transformácia kmeňa Pichia pastoris GS115(his4)

Aby sa získali kmene Pichia pastoris exprimujúce Nef-His, Tat-His a fúziu Nef-Tat-His, transformoval sa kmeň GS115 s lineárnymi Notl fragmentárni nesúcimi

-16zodpovedajúce expresné kazety a HIS4 gén na komplementáciu his4 v hostiteľskom genóme. Transformácia GS115 s A/oŕ/-lineárnymi fragmentárni zvýhodňovala rekombináciu v AOX1 lokuse.

Multikópiové integratívne klony sa selektovali kvantitatívnou dot blot analýzou a stanovoval sa typ integrácie, a to inzercia (Mut⁺ fenotyp) alebo trans-umiestnenie (Mut^s fenotyp).

Z každej transformácie sa vybral jeden transformant vykazujúci vysokú produkčnú hladinu rekombinantného proteínu:

Kmeň Y1738 (Mut⁺ fenotyp) produkujúci rekombinantný Nef-His protein, myristylovaný protein s 215 aminokyselinami, ktorý sa skladá z:

- kyseliny myristylovej,

- metionínu vytvoreného použitím Ncol klonovacieho miesta PHIL-D2-M0D vektora, -205 aminokyselín Nef proteínu (začínajúc od aminokyseliny 2 a pokračujúc po aminokyselinu 206),

- treonínu a serínu, ktoré boli vytvorené klonovacím postupom (klonovanie v Spel mieste PHIL-D2-MOD vektora),

-jedného glycínu a šiestich histidínov.

Kmeň Y1739 (Mut⁺ fenotyp) produkujúci Tat-His protein, protein s 95 aminokyselinami, ktorý sa skladá z:

- metionínu vytvoreného použitím Ncol klonovacieho miesta,

-85 aminokyselín Tat proteínu (začínajúc od aminokyseliny 2 a pokračujúc po aminokyselinu 86),

- treonínu a serínu, ktoré boli začlenené klonovacím postupom,

-jedného glycínu a šiestich histidínov.

Kmeň Y1737 (Mut^s fenotyp) produkujúci rekombinantný Nef-Tat-His fúzovaný protein, myristylovaný protein s 302 aminokyselinami, ktorý sa skladá z:

- kyseliny myristylovej,

- metionínu vytvoreného použitím Ncol klonovacieho miesta,

- 205 aminokyselín Nef proteínu (začínajúc od aminokyseliny 2 a pokračujúc po aminokyselinu 206),

- treonínu a serínu, ktoré boli vytvorené klonovacím postupom,

- 85 aminokyselín Tat proteínu (začínajúc od aminokyseliny 2 a pokračujúc po aminokyselinu 86),

- treonínu a serínu, ktoré boli začlenené klonovacím postupom, -jedného glycínu a šiestich histidínov.

' I

Príklad 2

Expresia HIV-1 Tat-mutantu v Pichia pastoris

Exprimovaný bol a mutantný rekombinantný Tat proteín. Mutantný Tat proteín musí byť biologický inaktívny, pričom si musí zachovávať imunogénne epitopy.

Pre tieto konštrukty sa vybral dvojmo mutovaný tat gén skonštruovaný D. Clementsom (Tulane University).

Tento tat gén (pochádza z BH10 molekulového klonu) nesie mutácie v oblasti aktívneho miesta (Lys 41 -> Ala) a v RGD motíve (Arg 78 -> Lys a Asp 80 -> Glu) (Virology 235: 48-64,1997).

Mutantný tat gén sme obdržali vo forme cDNA fragmentu subklonovaného medzi EcoRI a Hindlll miesta vo vnútri CMV expresného plazmidu (pCMVLys41/KGE).

2.1 Konštrukcia integratívnych vektorov pRIT14912 (kóduje Tat mutant-His proteín) a pRIT14913 (kóduje fúzovaný Nef-Tat mutant-His)

Tat mutantný gén sa amplifikoval prostredníctvom PCR z pCMVLys41/KGE plazmidu s primermi 05 a 04 (pozri časť 1.1, konštrukcia pRIT14598).

Ncol reštrikčné miesto sa začlenilo na 5’ koniec PCR fragmentu, zatiaľ čo Spel miesto sa začlenilo na 3’ koniec s primerom 04. Získaný PCR fragment, ako aj PHIL-D2-MOD vektor sa poštiepili s Ncol a Spel, purifikovali sa na agarózovom géli a ligovali sa, čím vznikol integratívny plazmid pRIT 14912.

Na konštrukciu pRIT14913 sa tat mutantný gén amplifikoval prostredníctvom PCR z pCMVLys41/KGE plazmidu s primermi 03 a 04.

Spel

Primer03 (sekv. č. 3): 5’ atcgtactagt.gag.cca.gta.gat.c 3’

-18Spel

Primer 04 (sekv. č. 4): 5’ cggctactagtttccttcgggcct 3’

Získaný PCR fragment, ako aj plazmid pRIT14597 (exprimujúci Nef-His proteín) sa poštiepili s Spel reštrikčným enzýmom, purifikovali sa na agarózovom géli a ligovali sa, čím vznikol integratívny plazmid pRIT14913.

2.2 Transformácia kmeňa Pichia pastoris GS115

Kmene Pichia pastoris exprimujúce Tat mutant-His proteín a fúzovaný NefTat mutant-His sa získali amplifikovaním integračných a rekombinantných kmeňových selekčných stratégií opísaných vyššie, v časti 1.2.

Vyselektovali sa dva rekombinantné kmene produkujúce Tat mutant-His proteín, proteín s dĺžkou 95 aminokyselín: Y1775 (Mut⁺ fenotyp) a Y1776 (Mut^sfenotyp).

Vyselektoval sa jeden rekombinantný kmeň exprimujúci Nef-Tat mutant-His fúzovaný proteín, proteín s dĺžkou 302 aminokyselín: Y1774 (Mut⁺ fenotyp).

Príklad 3

Fermentácia Pichia pastoris produkujúcej rekombinantný Tat-His

Typický proces je opísaný v nižšie uvedenej tabuľke.

Fermentácia zahŕňa rastovú fázu (výživa s médiom založeným na glycerole podľa príslušnej krivky), vedúcu ku kultúre s vysokou hustotou buniek, a indukčnú fázu (výživa s metanolom a roztokom solí a mikroelementov). Počas fermentácie sa rast sleduje odoberaním vzoriek a meraním ich absorbancie pri 620 nm. Počas indukčnej fázy sa pridával metanol prostredníctvom pumpy a jeho koncentrácia sa monitorovala plynovou chromatografíou (na kultivačných vzorkách) a on-line plynovou analýzou s hmotnostným spektrometrom. Po fermentácii sa bunky izolovali centrifugáciou pri 5020 ot./min. v priebehu 30’ pri 2 až 8 °C a bunky sa uskladnili vo forme pasty pri -20 °C. Na ďalšie spracovanie sa bunková pasta rozmrazila, resuspendovala sa na OD 150 (pri 620 nm) v tlmivom roztoku

- 19(Na2HPO₄, pH 7, 50mM; PMSF 5%, izopropanol 4 mM) a rozrušili sa 4 pasážami v Dyno mlyne (objem 0,6 I, 3000 ot./min., 6L/H, priemer guľôčok 0,40 až 0,70 mm).

Na zhodnotenie sa v priebehu indukcie odobrali vzorky expresie, rozrušili sa a analyzovali sa prostredníctvom SDS-PAGE alebo Western blotu. Na Coomassie blue farbených SDS-géloch bol jasne identifikovaný rekombinantný Tat-his vo forme intenzívneho pásu s maximálnou intenzitou po približne 72 až 96 hodinovej indukcii.

Roztopenie skúmavky s pracovným inokulom
i
Proces v tuhej fáze 30 °C, 14 až 16 hodín	Syntetické médium: YNB + glukóza + agar
i
Kvapalná predkultivácia v dvoch 2I Erlenmeyerových bankách 30 °C, 200 ot./min.	Syntetické médium: 2x400 ml YNB + glycerol zastavenie, keď OD > 1 (pri 620 nm)
4
Inokulácia do 20I fermentora	5 I počiatočného média (FSC006AA) 3 ml protipenivého činidla SAG471 (od Witco) Nastavenia: teplota: 30 °C tlak: 0,03 MPa (0,3 bar) prúdenie vzduchu: 20 Nl/min rozpustený O₂: regulovaný > 40% pH: regulované s NH4OH na 5
i
Výživová fermentačná dávka: rastová fáza trvanie približne 40 hodín	Výživa s médiom FFB005AA založeným na glycerole. Konečné OD medzi 200 a 500 (620 nm).
Výživová fermentačná dávka: indukčná fáza trvanie do 97 hodín	Výživa s metanolom a roztokom solí a mikroelementov (FSE021AB)
i
centrifugácia	5020 g / 30 minút / 2 až 8 °C
i
Izolácia bunkovej pasty a uskladnenie pri -20 °C
i

Rozmrazenie buniek a resuspendovanie na OD 150 (620 nm) v tlmivom roztoku	Tlmivý roztok: Na₂HPO₄, pH 7, 50 mM; PMSF 5 %, izopropanol 4 mM

Rozrušenie buniek v Dyno mlyne 4 pasáže	Dyno mlyn: objem 0,6 1, 3000 ot./min., 61/hod, priemer guľôčok 0,40 až 0,70 mm
Φ
Transfer na extrakciu/purifikáciu

Média používané na fermentáciu:

Tuhá predkultivácia: (YNB + glukóza + aqar)

Glukóza:	10 g/l	Na₂MoO₄.2H₂O:	0,0002 g/l	Kyselina listová:	0,000064 g/l
KH₂PO₄:	1 g/l	MnSO₄.H₂O:	0,0004 g/l	Inozitol:	0,064 g/l
MgSO₄.7H₂O:	0,5 g/l	H3BO3:	0,0005 g/l	Pyridoxín:	0,008 g/l
CaCI₂.2H₂O:	0,1 g/l	Kl:	0,0001 g/l	Tiamín:	0,008 g/l
NaCI:	0,1 g/l	CoCI₂.6H₂O:	0,00009 g/l	Niacín:	0,000032 g/l
FeCI₃.6H₂O:	0,0002 g/l	Riboflavin:	0,000016 g/l	Pantotenát vápenatý:	0,008 g/l
CuSO₄.5H₂O	0,00004 g/l	Biotín:	0,000064 g/l	Kyselina paraaminobenzoová	0,000016 g/l
ZnSO₄.7H₂O	0,0004 g/l	(NH₄)₂SO₄:	5 g/l	Agar:	18 g/l

Kvapalná predkultivácia: (YNB + glycerol)

Glycerol:	2 % (obj.)	Na₂Mo0₄.2H₂0:	0,0002 g/l	Kyselina listová:	0,000064 g/l
KH₂PO₄:	1 g/1	MnSO₄.H₂O:	0,0004 g/l	Inozitol:	0,064 g/l
MgSO₄.7H₂O:	0,5 g/l	H3BO3:	0,0005 g/l	’ Pyridoxín:	0,008 g/l
CaCI₂.2H₂O:	0,1 g/l	Kl:	0,0001 g/l	Tiamín:	0,008 g/l
NaCI:	0,1 g/l	CoCI₂.6H₂0:	0,00009 g/l	Niacín:	0,000032 g/l
FeCI₃.6H₂O:	0,0002 g/l	Riboflavin:	0,000016 g/l	Pantotenát	0,008 g/l
				vápenatý:
CuSO₄.5H_zO	0,00004 g/l	Biotín:	0,000064 g/l	Kyselina paraaminobenzoová	0,000016 g/l
ZnSO₄.7H₂O	0,0004 g/l	(NH₄)₂SO₄:	5 g/l

-21 Počiatočná fermentačná náplň: (FSC006AA)

(NH₄)₂SO₄:	6,4 g/l	Na₂MoO₄.2H₂O:	2,04 mg/l
KH₂PO₄:	9 g/l	MnSO₄.H₂O:	4,08 mg/l
MgSO₄.7H₂O:	4,7 g/l	H3BP3:	5,1 mg/l
CaCI₂.2H₂O:	0,94 g/l	Kl:	1,022 mg/l
FeCI₃.6H₂O:	10 mg/l	CoCI₂.6H₂O:	0,91 mg/l
HCI:	1,67 ml/l	NaCI:	0,66 g/l
CuSO₄.5H₂O:	0,408 mg/l	Biotín:	0,534 mg/l
ZnSO₄.7H₂O:	4,08 mg/l

Výživový roztok používaný v rastovej fáze (FFB005AA)

Glycerol:	38,7 % (obj.)	Na₂MoO₄.2H₂O:	5,7 mg/l
MgSO₄.7H₂O:	13 g/l	CuSO₄.5H₂O:	1,13 mg/l
CaCI₂.2H₂O:	2,6 g/l	CoCI₂.6H₂O:	2,5 mg/l
FeCI₃.6H₂O:	27,8 mg/l	H3BP3:	14,2 mg/l
ZnSO₄.7H₂O:	11,3 mg/l	Biotín:	1,5 mg/l
MnSO₄.H₂O:	11,3 mg/l	Kl:	2,84 mg/l
KH₂PO₄:	24,93 g/l	NaCI:	0,167 g/l

Výživový roztok solí a mikroelementov používaný v priebehu indukcie (FSE021 AB)

KH₂PO₄:	45 g/l	Na₂Mo0₄.2H₂0:	10,2 mg/l
MgSO₄.7H₂O:	23,5 g/l	MnSO₄.H₂O:	20,4 mg/l
CaCI₂.2H₂O:	4,70 g/l	H3BP3:	25,5 mg/l
NaCI:	0,3 g/l	Kl:	5,11 mg/l
HCI:	8,3 ml/l	CoCI₂.6H₂0:	4,55 mg/l
CuSO₄.5H₂O:	2,04 mg/l	FeCI₃.6H₂O:	50,0 g/l
ZnSO₄.7H₂O:	20,4 mg/l	Biotín:	2,70 mg/l

Príklad 4

Purifikácia Nef-Tat-His fúzovaného proteínu (Pichia pastoris)

-22Purifikačná schéma vychádza zo 146 g rekombinantných Pichia pastoris buniek (hmotnosť za mokra) alebo 2 I Dyno mlynového homogenátu s OD 55. Chromatografické kroky sa uskutočňujú pri laboratórnej teplote. Medzi jednotlivými krokmi sa Nef-Tat pozitívne frakcie udržiavajú cez noc v chladiacej miestnosti (+4 °C); na dlhší čas sa vzorky zmrazujú na -20 °C.

146 g buniek Pichia pastoris

Homogenizácia

Φ

Rozrušenie v Dyno mlyne (4 pasáže)

Φ

Centrifugácia

Φ

Pelet z Dyno mlyna

Φ

Premývanie (1 hodina - 4 °C)

Centrifugácia i

Pelet

T

Solubilizácia (O/N - 4 °C)

Redukcia (4 hodiny pri laboratórnej teplote v tme)

Tlmivý roztok: 2 I 50mM PO₄, pH 7,0 finálne OD: 50

JA10 rotor/ 9500 ot./min./30 min./ laboratórna teplota

Tlmivý roztok: +2 110mM PO₄, pH 7,5 150 mM - NaCI, 0,5 % empigen

JA10 rotor/ 9500 ot./min./30 min./ laboratórna teplota

Tlmivý roztok: +660 ml 10mM PO₄, pH

7,5 - 150mM NaCI - 4,0M GuHCI + 0,2M kyseliny 2-merkaptoetánsulfónovej, sodná soľ (práškový prídavok)/

23Φ karbamidometylácia (1/2 hod. pri laboratórnej teplote v tme)

Φ

Imobilizovaná kovová iónová afinitná chromatografia na Ni⁺⁺-NTA-agaróze (Qiagen - 30 ml živice)

Φ

Riedenie , Φ . ·.

Katiónová výmenná chromatografia na

SP Sepharose FF (Pharmacia -30 ml živice) nastavenie pH na 7,5 (s 0,5M NaOH roztokom) pred inkubovaním + 0,25M jódacetamid (práškový prídavok)/ nastavenie pH na 7,5 (s 0,5M NaOH roztokom) pred inkubovaním

Ekvilibračný tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI 4,0M GuHCI

Premývací tlmivý roztok:

1) Ekvilibračný tlmivý roztok

2) 10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI 6M močovina

3) 10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI 6M močovina - 25 mM imidazol

Elučný tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI - 6M močovina - 0,5M imidazol na iónovú silu 18 ms/cm²

Riediaci tlmivý roztok:

10mM PO4, pH 7,5 - 6M močovina

Ekvilibračný tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI - 6M močovina

Premývací tlmivý roztok:

1) Ekvilibračný tlmivý roztok

2) 10mM PO4, pH 7,5 - 250mM NaCI 6M močovina

Koncentrácia

Gólová filtračná chromatografia na Superdex200 XK 16/60 (Pharmacia -120 ml živice)

Dialýza (O/N - 4 °C)

Sterilizácia filtráciou

Elučný tlmivý roztok: 10mM borát, pH

9,0 - 2M NaCI - 6M močovina do 5 mg/ml

10kDa Omega membrána (Filtron)

Elučný tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI - 6M močovina ml vzorky na injekciu -> 5 injekcií

Tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 6,8 - 150mM NaCI 0,5M Arginín*

Millex GV 0,22 pm *pomer: 0,5 M arginínu na proteínovú koncentráciu 1600 pg/ml.

Čistota:

Úroveň čistoty ako bola odhadnutá prostredníctvom SDS-PAGE znázornenej na obrázku 3 Daiichi strieborným farbením a na obrázku 4 Coomassie blue G250 farbením.

Po Superdex200 kroku: > 95 %

Po dialyzačnom kroku a po sterilizácii filtráciou:> 95 %

Izolácia

Zo 146 g rekombinantných Pichia pastoris buniek (= 2 I Dyno mlynového homogenátu OD 55) sa purifikuje 51 mg Nef-Tat-his proteínu.

-25Príklad 5

Purifikácia oxidovaného Nef-Tat-His fúzovaného proteínu v Pichia pastoris

Purifikačná schéma vychádza zo 73 g rekombinantných Pichia pastoris buniek (hmotnosť za mokra) alebo 1 I Dyno mlynového homogenátu s OD 55. Chromatografické kroky sa uskutočňujú pri laboratórnej teplote. Medzi jednotlivými krokmi sa Nef-Tat pozitívne frakcie udržiavajú cez noc v chladiacej miestnosti (+4 °C); na dlhší čas sa vzorky zmrazujú na -20 °C.

g buniek Pichia pastoris

Homogenizácia

Φ

Rozrušenie v Dyno mlyne (4 pasáže)

Centrifugácia ;

Pelet z Dyno mlyna

Φ

Premývanie (2 hodiny - 4°C)

Φ

Centrifugácia ;

Pelet

Tlmivý roztok: 1 I 50mM PO4, pH 7,0 Pefabloc 5 mM finálne OD: 50

JA10 rotor/ 9500 ot./min./30 min./ laboratórna teplota

Tlmivý roztok: +1 110mM PO₄, pH 7,5 150 mM - NaCl, 0,5 % empigen

JA10 rotor/ 9500 ot./min./30 min./ laboratórna teplota

-26Solubilizácia (O/N - 4 °C) Φ

Imobilizovaná kovová iónová afinitná chromatografia na Ni⁺⁺-NTA-agaróze (Qiagen -15 ml živice)

Riedenie

Katiónová výmenná chromatografia na

SP Sepharose FF (Pharmacia -7 ml živice)

Tlmivý roztok: +330 ml 10mM PO4, pH

7,5 - 150mM NaCI - 4,0M GuHCI

Ekvilibračný tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI 4,0M GuHCI

Premývací tlmivý roztok:

1) Ekvilibračný tlmivý roztok

2) 10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI -

6M močovina

3) 10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI -

6M močovina - 25 mM imidazol

Elučný tlmivý roztok:

Riediaci tlmivý roztok:

10mM PO4, pH 7,5 - 6M močovina

Ekvilibračný tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI - 6M močovina

Premývací tlmivý roztok:

1) Ekvilibračný tlmivý roztok

2) 10mM PO₄, pH 7,5 - 250mM NaCI -

6M močovina

Elučný tlmivý roztok: 10mM borát, pH

9,0 - 2M NaCI - 6M močovina

-27Koncentrácia až na 0,8 mg/ml

10kDa Omega membrána (Filtron)

Dialýza (O/N - 4 °C)

Tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 6,8 - 150mM NaCI 0,5M Arginín*

Sterilizácia filtráciou

Millex GV 0,22 pm

Úroveň čistoty ako bola odhadnutá prostredníctvom SDS-PAGE znázornenej na obrázku 6 (Daiichi strieborné farbenie, Coomassie blue G250 farbenie, Western blotting):

Po dialyzačnom kroku a po sterilizácii filtráciou:> 95 %

Výťažok (hodnotenie prostredníctvom kolorimetrického proteínového testu: DOC TCA BCA)

Zo 73 g rekombinantných Pichia pastoris buniek (hmotnosť za mokra) alebo z 1 I Dyno mlynového homogenátu OD 50 sa purifikuje 2,8 mg ox.idovaného NefTat-his proteínu.

Príklad 6

Purifikácia redukovaného Tat-His proteínu (Pichia pastoris)

Purifikačná schéma vychádza zo 160 g rekombinantných Pichia pastoris buniek (hmotnosť za mokra) alebo 2 I Dyno mlynového homogenátu s OD 66. Chromatografické kroky sa uskutočňujú pri laboratórnej teplote. Medzi jednotlivými krokmi sa Tat pozitívne frakcie udržiavajú cez noc v chladiacej miestnosti (+4 °C); na dlhší čas sa vzorky zmrazujú na -20 °C.

-28Tlmivý roztok: +2 I 50mM ΡΟ₄, pH 7,0 4 mM PMSF finálne OD: 50

160 g buniek Pichia pastoris

Homogenizácia ;

Rozrušenie v Dyno mlyne (4 pasáže)

Φ

Centrifugácia

Φ

Pelet z Dyno mlyna

Ψ

Premývanie (1 hodina - 4°C)

Φ

Centrifugácia

Φ

Pelet

Φ

Solubilizácia (O/N - 4 °C)

Centrifugácia ;

Redukcia (4 hodiny pri laboratórnej teplote v tme)

JA10 rotor/ 9500 ot./min./30 min./ laboratórna teplota

Tlmivý roztok: +2 I 10mM PO₄, pH 7,5 150 mM - NaCI, 1% empigen

JA10 rotor/ 9500 ot./min. / 30 min. / laboratórna teplota

Tlmivý roztok: +660 ml 10mM PO₄, pH

7,5 - 150mM NaCI - 4,0M GuHCI

JA10 rotor/ 9500 ot./min. / 30 min. / laboratórna teplota + 0,2M kyseliny 2-merkaptoetánsulfónovej, sodná soľ (práškový prídavok)/ nastavenie pH na 7,5 (s 1M NaOH roztokom) pred inkubovaním

-29karbamidometylácia (1/2 hod. pri laboratórnej teplote v tme)

Imobilizovaná kovová iónová afinitná chromatografia na Ni⁺⁺-NTA-agaróze (Qiagen - 60 ml živice)

Riedenie

Γ

Katiónová výmenná chromatografia na

SP Sepharose FF (Pharmacia -30 ml živice) + 0,25M jódacetamid (práškový prídavok)/ nastavenie pH na 7,5 (s 1M NaOH roztokom) pred inkubovaním

Ekvilibračný tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI 4,0M GuHCI

Premývací tlmivý roztok:

1) Ekvilibračný tlmivý rožok

2) 10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI 6M močovina

3) 10mM PO₄, pH 7,5- 150mM NaCI- . 6M močovina - 35mM imidazol

Elučný tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI - 6M močovina - 0,5M imidazol na iónovú silu 12 ms/cm²

Riediaci tlmivý roztok:

20mM borát, pH 8,5 - 6M močovina

Ekvilibračný tlmivý roztok:

20mM borát, pH 8,5 - 150mM NaCI - 6M močovina

Premývací tlmivý roztok:

Ekvilibračný tlmivý roztok

Elučný tlmivý roztok: 20mM borát, pH

8,5 - 400mM NaCI - 6M močovina

Koncentrácia až na 1,5 mg/ml

10kDa Omega membrána (Filtron)

Dialýza (O/N - 4 °C)

Tlmivý roztok:

10mM PO4, pH 6,8 - 150mM NaCI 0,5M Arginin

Sterilizácia filtráciou

Millex GV 0,22 pm

Úroveň čistoty ako bola odhadnutá prostredníctvom SDS-PAGE znázornenej na obrázku 7 (Daiichi strieborné farbenie, Coomassie blue G250 farbenie, Western blotting):

Po dialyzačnom kroku a po sterilizácii filtráciou:> 95 %

Zo 160 g rekombinantných Pichia pastoris buniek (hmotnosť za mokra) alebo z 2 I Dyno mlynového homogenátu OD 66 sa purifikuje 48 mg redukovaného Tat-his proteínu.

Príklad 7

Purifikácia oxidovaného Tat-His proteínu (Pichia pastoris)

Purifikačná schéma vychádza zo 74 g rekombinantných Pichia pastoris buniek (hmotnosť za mokra) alebo 1 I Dyno mlynového homogenátu s OD 60. Chromatografické kroky sa uskutočňujú pri laboratórnej teplote. Medzi jednotlivými krokmi sa Tat pozitívne frakcie udržiavajú cez noc v chladiacej miestnosti (+4 °C); na dlhší čas sa vzorky zmrazujú na -20 °C.

-31 Tlmivý roztok: +1 I 50mM PO₄, pH 7,0 Pefabloc 5 mM finálne OD: 60 g buniek Pichia pastoris i

Homogenizácia

Rozrušenie v Dyno mlyne (4 pasáže)

Centrifugácia ;

Pelet z Dyno mlyna Φ

Premývanie (2 hodiny - 4°C) Φ

Centrifugácia

Pelet Φ

Solubilizácia (O/N - 4 °C)

Centrifugácia

JA10 rotor/ 9500 ot./min./30 min./ laboratórna teplota

Tlmivý roztok: +1 110mM PO₄, pH 7,5 150 mM - NaCI, 0,5 % empigen

JA10 rotor/ 9500 ot./min./30 min./ laboratórna teplota

Tlmivý roztok: +330 ml 10mM PO₄, pH

7,5 - 150mM NaCI - 4,0M GuHCI

I

JA10 rotor/ 9500 ot./min./30 min./ laboratórna teplota

Ekvilibračný tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI 4,0M GuHCI

Premývaci tlmivý roztok:

-32Φ

Riedenie

Katiónová výmenná chromatografia na

SP Sepharose FF (Pharmacia -15 ml živice)

Koncentrácia

Dialýza (O/N - 4 °C)

Φ

Sterilizácia filtráciou

1) Ekvilibračný tlmivý roztok

2) 10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI -

6M močovina

3) 10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI -

6M močovina - 35mM imidazol

Elučný tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI - 6M močovina - 0,5M imidazol o

na iónovú silu 12 ms/cm

Riediaci tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 7,5 - 6M močovina

Ekvilibračný tlmivý roztok:

20mM borát, pH 8,5 - 150mM NaCI - 6M močovina

Premývaci tlmivý roztok:

1) Ekvilibračný tlmivý roztok

2) 20mM borát, pH 8,5 - 400mM NaCI -

6M močovina

Elučný tlmivý roztok: 20mM piperazín, pH 11,0 - 2M NaCI - 6M močovina až na 15 mg/ml

10kDa Omega membrána (Filtron)

Tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 6,8 - 150mM NaCI 0,5M Arginín

Millex GV 0,22 gm

-33Úroveň čistoty ako bola odhadnutá prostredníctvom SDS-PAGE znázornenej na obrázku 8 (Daiichi strieborné farbenie, Coomassie blue G250 farbenie, Westem blotting):

Po dialyzačnom kroku a po sterilizácii filtráciou:> 95 %

Zo 74 g rekombinantných Pichia pastoris buniek (hmotnosť za mokra) alebo z 1 I Dyno mlynového homogenátu OD 60 sa purifikuje 19 mg oxidovaného Tat-his proteínu.

Príklad 8

Purifikácia redukovaného SIV Nef-His proteínu (Pichia pastoris)

Purifikačná schéma vychádza z 340 g rekombinantných Pichia pastoris buniek (hmotnosť za mokra) alebo 4 I Dyno mlynového homogenátu s OD 100. Chromatografické kroky sa uskutočňujú pri laboratórnej teplote. Medzi jednotlivými krokmi sa Nef pozitívne frakcie udržiavajú cez noc v chladiacej miestnosti (+4 °C); na dlhší čas sa vzorky zmrazujú na -20 °C.

340 g buniek Pichia pastoris

Ψ

Homogenizácia. Tlmivý roztok: 4 I 50mM PO₄, pH 7,0 - 4 mM PMSF finálne OD: 100

Φ

Rozrušenie v Dyno mlyne (4 pasáže)

Φ

Centrifugácia JA10 rotor/ 9500 ot./min. / 60 min. / laboratórna teplota

34Pelet z Dyno mlyna Ψ Solubilizácia (O/N - 4 °C) Centrifugácia

Redukcia (4 hodiny pri laboratórnej teplote v tme) ⁴

Karbamidometylácia (1/2 hod. pri laboratórnej teplote v tme) Imobilizovaná kovová iónová afinitná chromatografia na Ni⁺⁺-NTA-agaróze (Qiagen - 40 ml živice)

Koncentrácia

Tlmivý roztok: + 2,6 I 10mM PO4, pH 7,5

- 150mM NaCI-4,0M GuHCI

JA10 rotor/ 9500 ot./min. / 30 min. / laboratórna teplota + 0,2M kyseliny 2-merkaptoetánsulfónovej, sodná soľ (práškový prídavok)/ nastavenie pH na 7,5 (s 1M NaOH roztokom) pred inkubovaním + 0,25M jódacetamid (práškový prídavok)/ nastavenie pH na 7,5 (s 1M NaOH roztokom) pred inkubovaním

Ekvilibračný tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI 4,0M GuHCI

Premývací tlmivý roztok:

1) Ekvilibračný tlmivý roztok

2) 10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI 6M močovina - 25mM imidazol

Elučný tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI - 6M močovina - 0,5M imidazol až na 3 mg/ml

10kDa Omega membrána (Filtron)

-35Gélová filtračná chromatografia na Superdex 200 (Pharmacia -120 ml živice)

Koncentrácia i

Dialýza (O/N - 4 °C)

Φ

Sterilizácia filtráciou

Elučný tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI - 6M močovina až na 1,5 mg/ml

10kDa Omega membrána (Filtron)

Tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 6,8 - 150mM NaCI 0,3% empigen

Millex GV 0,22 pm

Úroveň čistoty ako bola odhadnutá prostredníctvom SDS-PAGE znázornenej na obrázku 9 (Daiichi strieborné farbenie, Coomassie blue G250 farbenie, Western blotting):

Po dialyzačnom kroku a po sterilizácii filtráciou:> 95 %

Výťažok (hodnotenie prostredníctvom kolorimetrického proteínového testu: DOC TCA BOA)

Z 340 g rekombinantných Pichia pastorís buniek (hmotnosť za mokra) alebo zo 4 I Dyno mlynového homogenátu OD 100 sa purifikuje 20 mg redukovaného SIV Nef-his proteínu.

Príklad 9

Purifikácia redukovaného HIV Nef-His proteínu (Pichia pastorís)

Purifikačná schéma vychádza zo 160 g rekombinantných Pichia pastorís buniek (hmotnosť za mokra) alebo 3 I Dyno mlynového homogenátu s OD 50.

Chromatografické kroky sa uskutočňujú pri laboratórnej teplote. Medzi jednotlivými

-36krokmi sa Nef pozitívne frakcie udržiavajú cez noc v chladiacej miestnosti (+4 °C); na dlhší čas sa vzorky zmrazujú na -20 °C.

160 g buniek Pichia pastoris i

Homogenizácia

Rozrušenie v Dyno mlyne (4 pasáže)

Zmrazenie/roztopenie

Centrifugácia

I

Pelet z Dyno mlyna

Φ

Solubilizácia (O/N - 4 °C) Centrifugácia i Redukcia (3 hodiny pri laboratórnej teplote v tme)

Karbamidometylácia (1/2 hod. pri laboratórnej teplote v tme)

Tlmivý roztok: 3 I 50mM PO4, pH 7,0 5mM Pefabloc finálne OD: 50

JA10 rotor/ 9500 ot./min. / 60 min. / laboratórna teplota

Tlmivý roztok: + 1 110mM PO₄, pH 7,5 150mM NaCI-4,0M GuHCI

JA10 rotor/ 9500 ot./min. / 60 min. / laboratórna teplota + 0,2M kyseliny 2-merkaptoetánsulfó- . novej, sodná soľ (práškový prídavok)/ nastavenie pH na 7,5 (s 1M NaOH roztokom) pred inkubovaním + 0,15M jódacetamid (práškový prídavok)/ nastavenie pH na 7,5 (s 1M NaOH roztokom) pred inkubovaním

-37Φ

Imobilizovaná kovová iónová afinitná chromatografia na Ni⁺⁺-NTA-agaróze (Qiagen -10 ml živice)

Koncentrácia

Φ

Gélová filtračná chromatografia na Superdex 200 (Pharmacia -120 ml živice) I

Dialýza (O/N - 4 °C)

Sterilizácia filtráciou

Ekvilibračný tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI 4,0M GuHCI

Premývací tlmivý roztok:

1) Ekvilibračný tlmivý roztok

2) 10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI -

6M močovina

3) 10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI -

6M močovina - 25mM imidazol

Elučný tlmivý roztok:

10mM citrát, pH 6,0 - 150mM NaCI - 6M močovina - 0,5M imidazol až na 3 mg/ml

10kDa Omega membrána (Filtron)

Elučný tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 7,5 - 150mM NaCI - 6M močovina

Tlmivý roztok:

10mM PO₄, pH 6,8 - 150mM NaCI 0,5Marginín , t

Millex GV 0,22 pm

Úroveň čistoty ako bola odhadnutá prostredníctvom SDS-PAGE znázornenej na obrázku 10 (Daiichi strieborné farbenie, Coomassie blue G250 farbenie,

Western blotting):

Po dialyzačnom kroku a po sterilizácii filtráciou:> 95 %

-38Výťažok (hodnotenie prostredníctvom kolorimetrického proteínového testu: DOC TCA BCA)

Zo 160 g rekombinantných Pichia pastoris buniek (hmotnosť za mokra) alebo z 3 I Dyno mlynového homogenátu OD 50 sa purifikuje 20 mg redukovaného HIV Nef-his proteínu.

Príklad 10

Expresia SIV nef sekvencie v Pichia pastoris

Aby sa zhodnotili Nef a Tat antigény v patogénnom SHIV imunizačnom modeli, exprimovali sme Nef proteín opičieho vírusu imunitnej nedostatočnosti (SIV) makakov, SIVmac239 (Aids Research and Human Retroviruses, 6:1221-1231, 1990). V Nef kódujúcej oblasti má SIVmac239 stop kodón v čítacom rámci za aminokyselinou 92, na základe čoho je pravdepodobný skrátený produkt s hmotnosťou len 10 kD. Zvyšok Nef čítacieho rámca je otvorený a vo. svojej úplne otvorenej forme by mal kódovať proteín obsahujúci 263 aminokyselín (30 kD).

Naším východiskovým materiálom pre SIVmac239 nef gén bol DNA fragment zodpovedajúci kompletnej kódujúcej sekvencii, klonovaný v LX5N plazmide (obdržaný od Dr. R.C. Desrosiers, Southborough, MA, USA). Tento SIV nef gén je mutovaný v predčasnom stop kodóne (nukleotid G v polohe 9353 je nahradený pôvodným T nukleotidom), aby sa exprimoval SIVmac239 Nef proteín s úplnou dĺžkou.

Na expresiu tohto SIV nef génu v Pichia pastoris sa použil vektor PHIL-D2MOD (predtým použitý na expresiu HIV-1 nef a tat sekvencii). Rekombinantný proteín sa exprimuje pod kontrolou inducibilného promótora alkohol oxidázy (AOX1) a C-koniec proteínu je predĺžený histidínovým afinitným chvostom, ktorý bude uľahčovať purifikáciu.

10.1 Konštrukcia integratívneho vektora pRIT14908

Na konštrukciu pRIT14908 sa SIV nef gén amplifikoval prostredníctvom PCR z pLX5N/SIV-NEF plazmidu s primermi SNEF1 a SNEF2.

-39primer SNEF1: 5’ ATCGTCCATG.GGTGGAGCTATTTT 3’

Ncol primer SNEF2: 5’ CGGCTACTAGTGCGAGTTTCCTT 3’

Spel

Amplifikovaná SIV nef DNA oblasť začína na nukleotide 9077 a končí na nukleotide 9865 (Aids Research and Human Retroviruses, 6: 1221-1231,1990).

Ncol reštrikčné miesto (ktoré nesie ATG kodón nef génu) sa začlenilo na 5’ koniec PCR fragmentu, zatiaľ čo Spel miesto sa začlenilo na 3’ koniec. Získaný PCR fragment, ako aj integratívny PHIL-D2-MOD vektor sa poštiepili s Ncol a Spel. Keďže jedno Ncol reštrikčné miesto sa nachádza v SIV nef amplifikovanej sekvencii (v polohe 9286), získali sa dva fragmenty s veľkosťou ± 200 bp, respektíve ± 600 bp, tie sa purifikovali na agarózovom géli a ligovali sa s PHIL-D2-MOD vektorom. Výsledný rekombinantný plazmid obdržal po overení nef amplifikovanej oblasti automatickým sekvenovaním, označenie pRIT14908.

10.2 Transformácia kmeňa Pichia pastorís GS115(his4)

Aby sa získal kmeň Pichia pastorís exprimujúci SIV nef-His, transformoval sa kmeň GS115 s lineárnym Notl fragmentom nesúcim len expresnú kazetu a HIS4 gén (obrázok 11). Tento lineárny Notl DNA fragment, ktorý má na oboch koncoch homológie s AOX1 rezidentným P. pastorís génom, zvýhodňuje rekombináciu v AOX1 lokuse. Multikópiové integratívne klony sa selektovali prostredníctvom kvantitatívnej dot blot analýzy. Vyselektoval sa jeden transformant vykazujúci najlepšiu produkčnú hladinu rekombinantného proteínu ä označil sa ako Y1772.

Kmeň Y1772 produkuje rekombinantný SIV Nef-His proteín, proteín obsahujúci 272 aminokyselín, ktorý je zložený z:

- kyseliny myristylovej,

- metionínu vytvoreného použitím Ncol klonovacieho miesta PHIL-D2-MOD vektora,

- 262 aminokyselín (aa) Nef proteínu (od aminokyseliny 2 a pokračujúc po aminokyselinu 263, pozri obrázok 12),

- treonínu a serínu vytvorených procesom klonovania (klonovanie v Spel mieste PHIL-D2-MOD vektora (obrázok 11)),

-jedného glycínu a šiestich histidínov.

Nukleová a proteínová sekvencia sú uvedené na obrázku 12.

10.3 Charakterizácia produktu exprimovaného kmeňom Y1772

Úroveň expresie

Po 16 hodinách indukcie v médiu obsahujúcom 1% metanol ako zdroj uhlíka bol rekombinantný Nef-His proteín prevládajúcim, pričom sa odhadlo, že predstavuje 10 % celkových proteínov (obrázok 13, dráhy 3 a 4).

Rozpustnosť

Indukované kultúry rekombinantného kmeňa Y1772 produkujúceho Nef-His proteín sa scentrifugovali. Bunkové pelety sa resuspendovali v rozrušovacom tlmivom roztoku, rozrušili sa s 0,5mm sklenenými guľôčkami a bunkové extrakty sa centrifugovali. Proteíny obsiahnuté v nerozpustnom pelete (P) a v rozpustnom supernatante (S) sa porovnali na SDS-PAGE 10% farbenej s Coomassie Blue. Ako je znázornené na obrázku 13, väčšina rekombinantného proteínu z kmeňa Y1772 (dráhy 3 a 4) je spojená s nerozpustnou frakciou.

Kmeň Y1772 majúci uspokojivú hladinu expresie rekombinantného proteínu sa použil na produkciu a purifikáciu SIV Nef-His proteínu.

Príklad 11

Expresia gp120 v CHO '

Zaviedla sa stabilná CHO-K1 bunková línia, ktorá produkuje rekombinantný gp120 glykoproteín. Rekombinantným gp120 glykoproteínom je rekombinantná skrátená forma gp120 obalového proteínu HIV-1 izolátu W61D. Proteín sa vylučuje do bunkového kultivačného média, z ktorého sa následne purifikuje.

-41 Konštrukcia gp120 transfekčného plazmidu pRIT13968

Obalová DNA kódujúca sekvencia (vrátane 5’ exónu tat a rev) HIV-1 izolátu W61D sa získala (Dr. Tersmette, CCB, Amsterdam) vo forme plazmidu W61D (Ncol-Xhol) obsahujúceho genomickú gp160 obalovú sekvenciu. Plazmid bol označený ako pRIT13965.

Aby sa skonštruovala gp120 expresná kazeta musel sa začleniť stop kodón do kodónu aminokyseliny glu 515 sekvencie kódujúcej gp160 v pRIT13965 použitím primerovej oligonukleotidovej sekvencie (DIR 131) a PCR technológie. Primer DIR 131 obsahuje tri stop kodóny (vo všetkých otvorených čítacích rámcoch) a Sali reštrikčné miesto.

Kompletná gp120 obalová sekvencia sa potom rekonštituovala z N-koncového BamHl-Dral fragmentu (170 bp) pg160 plazmidového subklonu pW61d env (pRIT13966) odvodeného od pRIT13965, a z Dral-Sall fragmentu (510 bp) generovaného prostredníctvom PCR z pRIT13966. Oba fragmenty sa gélovo purifikovali a ligovali spolu s E. coli plazmidom pUC18, ktorý sa najprv poštiepil so Sali (ošetrený s Klenowom), a potom s BamHI. Výsledkom bol plazmid pRIT13967. Génová sekvencia Xmal-Sall fragmentu (1580 bp) obsahujúceho gp120 kódujúcu kazetu sa sekvenovala a zistilo sa, že je zhodná s predpokladanou sekvenciou. Plazmid RIT13967 sa ligoval do CHO GS-expresného vektora pEE14 (Celltech Ltd., UK) tak, že sa najprv poštiepil s Beli (ošetrený s Klenowom) a potom s Xmal. Výsledný plazmid sa označil ako pRIT13968.

Príprava Master bunkovej banky

Gp120-konštrukt (pRIT13968) sa transfekoval do CHO buniek klasickým postupom CaPO4-precipitácia/glycerolový šok. O dva dni neskôr sa CHOK1 bunky umiestnili do selektívneho rastového média (GMEM + 25 μΜ metionín sulfoximín (MSX) + glutamát + asparagín + 10% fetálne teľacie sérum). Tri vybrané transfektantové klony sa ďalej amplifikovali v 175cm² fľašiach a niekoľko bunkových skúmaviek sa uskladnilo pri -80 °C. Na ďalšiu expanziu sa vybral C-env 23.9.

Pripravila sa malá predbežná banka a zmrazilo sa 20 ampúl. Na prípravu predbežnej banky a MCB sa bunky pestovali v GMEM kultivačnom médiu doplnenom s 7,5% fetálnym teľacím sérom, ktoré obsahovalo 50 μΜ MSX. Tieto

-42bunkové kultúry sa testovali z hľadiska sterility a mykoplazmy a dokázalo sa, že sú negatívne.

Master bunková banka CHOK1 enf 23.9 (v pasáži 12) sa pripravila použitím buniek odvodených z predmasterovej bunkovej banky. V stručnosti: dve ampulky predmasterového inokula sa naočkovali do média doplneného s 7,5% dialyzovaným fetálnym hovädzím sérom. Bunky sa rozdistribuovali do štyroch kultivačných fľaši a kultivovali sa pri 37 °C. Po prichytení buniek sa kultivačné médium vymenilo za čerstvé médium doplnené s 50 μΜ MSX. Keď bunky vytvorili súvislú vrstvu, izolovali sa trypsinizáciou a rozdelili sa na subkultúry s rozdeľovacím pomerom 1/8 do T-fľaší s okrúhlym dnom - do bunkových výrobných jednotiek. Bunky sa izolovali z bunkových výrobných jednotiek trypsinizáciou a centrifugáciou. Bunkový pelet sa resuspendoval v kultivačnom médiu doplnenom s DMSO ako kryogénnym konzervačným činidlom. Ampulky sa preznačili, autoklávovali sa a tepelne sa utesnili (250 nádobiek). Skontrolovalo sa, či neprepúšťajú a uskladnili sa cez noc pri -70 °C, pred uskladnením v kvapalnom dusíku.

Bunková kultivácia a produkcia surového výťažku

Dve nádobky z master bunkovej banky sa rýchlo roztopili. Bunky sa spojili a inokulovali sa do dvoch T-fliaš pri 37 °C° ± 1 °C s príslušným kultivačným médiom doplneným so 7,5% dialyzovaným fetálnym hovädzím (FBS) sérom. Keď bunky dosiahli súvislú vrstvu (pasáž 13), izolovali sa trypsinizáciou, spojili sa a expandovali sa do 10 T-fliaš, ako bolo uvedené vyššie. Bunky v súvislej vrstve (pasáž 14) sa trypsinizovali a sériovo sa expandovali do 2 bunkových výrobných jednotiek (každá 6000 cm²; pasáž 15), potom do 10 bunkových výrobných jednotiek (pasáž 16). Rastové kultivačné médium sa doplnilo so 7,5% dialyzovaným fetálnym hovädzím (FBS) sérom a 1% MSX. Keď bunky dosiahli súvislú vrstvu, odstránilo sa rastové médium a nahradilo sa produkčným médiom obsahujúcim len 1% dialyzované fetálne hovädzie sérum a žiadne MSX. Každé dva dni sa izoloval supernatant (48 hodinový interval), celkovo 32 dní. Izolované kultivačné tekutiny sa okamžite prečírili cez 1,2-0,22pm filtračnú jednotku a pred purifikáciou sa udržiavali na -20 °C.

-43Príklad 12

Purifikácia HIV gp120 (W61D CHO) z bunkovej kultivačnej tekutiny

Všetky purifikačné kroky sa uskutočňujú v chladiacej miestnosti pri 2 až 8 °C. pH tlmivých roztokov sa nastavuje pri tejto teplote a tlmivé roztoky sa prefiltrujú cez 0,2pm filter. Testujú sa z hľadiska obsahu pyrogénu (LAL test). Kontinuálne sa monitoruje optická hustota pri 280 nm, pH a vodivosť kolónových eluátov.

(i) Prečistená kultivačná tekutina

Zozbieraná prečistená bunková kultivačná tekutina (CCF) sa vysterilizuje filtráciou a pridá sa Tris tlmivý roztok, pH 8,0, do konečnej koncentrácie 30 mM. CCF sa uskladňuje zmrazený na -20 °C až do purifikácie.

(ii) Hydrofóbna interakčná chromatografia

Po rozmrazení sa do prečistenej kultivačnej tekutiny pridá síran amónny až do 1 M. Roztok cez noc prechádza TSK/TOYOPEARL-BUTYL 650 m (TOSOHAAS) kolónou, ekvilibrovanou v 30mM Tris tlmivom roztoku - pH 8,0 - 1 M síran amónny. V týchto podmienkach sa antigén naviaže na gélovú matricu. Kolóna sa premyje s postupne klesajúcim gradientom síranu amónneho. Antigén sa eluuje pri 30 mM Tris tlmivom roztoku - pH 8,0 - 0,25 M síran amónny.

(iii) Aniónová výmenná chromatografia

Po znížení vodivosti roztoku na 5 až 6 mS/cm sa gP120 spojené frakcie nanesú na Q-sepharose Fast Flow (Pharmacia) kolónu, ekvilibrovanú v tlmivom roztoku obsahujúcom Tris a fyziologický roztok, pH 8,0. Kolóna pracuje negatívnym spôsobom, tzn. gP120 sa neviaže na gél, zatiaľ čo väčšina nečistôt sa zachytáva.

(iv) Koncentrácia a diafiltrácia prostredníctvom ultrafiltrácie

Aby sa zvýšila koncentrácia proteínu, nanesie sa gP120 zásoba na FILTRON membránu Omega Screen Channel s hraničnou hodnotou 50 kDa. Na konci zakoncentrovávania sa tlmivý roztok vymení diafiltráciou s 5mM fosfátovým tlmivým roztokom obsahujúcim 0,3 mM CaCh, pH 7,0. Ak sa okamžite neuskutočňuje ďalšie spracovávanie, gP120 zásoba sa uskladňuje zmrazená pri -20 °C. Po rozmrazení sa roztok prefiltruje cez 0,2pm membránu, aby sa odstránil nerozpustný materiál.

(v) Chromatografia na hydroxyapatite gP120 UF zásoba sa nanesie na macro-Prep keramickú hydroxyapatitovú kolónu typu II (Biorad) ekvilibrovanú v 5mM fosfátovom tlmivom roztoku + 0,3 mM CaCh, pH 7,0. Kolóna sa premyje s rovnakým tlmivým roztokom. Antigén prechádza cez kolónu a nečistoty sa naviažu na kolónu.

(vi) Katiónová výmenná chromatografia gP120 zásoba sa nanesie na CM/TOYOPEARL-650 S (TOSOHAAS) kolónu, ekvilibrovanú v 20mM acetátovom tlmivom roztoku, pH 5,0. Kolóna sa premyje s rovnakým tlmivým roztokom, potom s 20mM acetátom, pH 5,0 a 10mM NaCI. Antigén sa potom eluuje rovnakým tlmivým roztokom obsahujúcim 80 mM NaCI.

(vii) Ultrafiltrácia

Aby sa zvýšila schopnosť purifikačného procesu odstraňovať vírus, uskutočňuje sa ďalší ultrafiltračný krok. gP120 zásoba sa podrobí ultrafiltrácii na FILTRON membráne Omega Screen Channel, hraničná hodnota 150 kDa. Membrána s takouto veľkosťou pórov nezachytáva antigén. Po tomto procese sa nariedený antigén zakoncentruje na rovnakom type membrány (Filtron), ale s hraničnou hodnotou 50 kDa.

(viii) Gélová chromatografia vylučujúca na základe veľkosti gPl20 zásoba sa aplikuje na SUPERDEX 200 (Pharmacia) kolónu, aby sa vymenil tlmivý roztok, a aby sa eliminovali zvyškové kontaminanty. Kolóna sa eluuje s fosfátovým tlmivým fyziologickým roztokom (PBS).

(ix) Sterilizácia filtráciou a uskladnenie

Frakcie sa sterilizujú filtráciou na 0,2pm PVDF membráne (Millipore). Po sterilizácii filtráciou sa purifikovaná celková zásoba uskladní pri -20 °C až do prípravy formulácií.

-45Purifikačná schéma je zhrnutá nižšie.

- Úroveň čistoty purifikovanej celkovej zásoby odhadnutá prostredníctvom SDS-PAGE analýzy (farbenie striebrom/Coomassie Blue/Western Blotting) je > 95 %.

- Produkčný výťažok je približne 2,5 mg/l CCF (podľa Lowryho testu). Celkový purifikačný výťažok je približne 25 % (podľa ELISA testu).

- Purifikovaný materiál je stabilný 1 týždeň pri 37 °C (podľa WB analýzy).

PURIFIKÁCIA gp120 Z KULTIVAČNEJ TEKUTINY Znak Ý označuje kroky, ktoré sú dôležité pre odstránenie vírusu.

PREČISTENIE KULTIVAČNEJ TEKUTINY

Φ

HYDROFÓBNA INTERAKČNÁ CHROMATOGRAFIA (BUTYL-TOYOPEARL 650 M)

Φ

ANIÓNOVÁ VÝMENNÁ CHROMATOGRAFIA Ý (NEGATÍVNY SPÔSOB) (Q-SEPHAROSE) I

50KDA ULTRAFILTRÁCIA (ZAKONCENTROVANIE A VÝMENA TLMIVÉHO ROZTOKU) (USKLADNENIE-20 °C)

HYDROXYAPATITOVÄ CHROMATOGRAFIA (NEGATÍVNY SPÔSOB) (MAKROPREP KERAMICKÝ HYDROXYAPATIT II) ;

KATIÓNOVÁ VÝMENNÁ CHROMATOGRAFIA (CM-TOYOPEARL 650 S)

-464150KD ULTRAFILTRÁCIA 'J (OMEGA MEMBRÁNY/FILTRON)

I

50KD ULTRAFILTRÁCIA (ZAKONCENTROVANIE)

Φ

VEĽKOSTNÁ VYLUČOVACIA CHROMATOGRAFIA V (SUPERDEX 200) , FILTRÁCIA STERILIZÁCIOU

Φ

PURIFIKOVANÁ CELKOVÁ ZÁSOBA

USKLADNENIE -20 °C

Príklad 13

Príprava vakcíny

Vakcína pripravená podľa vynálezu obsahuje produkty expresie jednej alebo viacerých rekombinantných DNA kódujúcich antigén. Okrem toho formulácie obsahujúc zmes 3-de-O-acylovaného monofosforyllipidu A (3D-MPL) a QS21 v emulzii olej/voda alebo oligonukleotid obsahujúci nemetylované CpG dinukleotidové motívy a hydroxid hlinitý ako nosič.

3D-MPL je chemicky detoxifikovaná forma lipopolysacharidu (LPS) Gramnegatívnej baktérie Salmonella minnesota..

Experimenty uskutočňované firmou Smith Kline Beecham Biologicals ukázali, že 3D-MPL kombinovaný s rôznymi vehikulami veľmi zosilňuje tak humorálnu imunitu, ako aj Tm typ bunkovej imunity.

QS21 je saponín purifikovaný zo surového extraktu kôry stromu Quillaja

Saponaria Molina, ktorý má silný adjuvantný účinok. Indukuje tak antigénovo špecifickú lymfoproliferáciu, ako aj CTLs voči niekoľkým antigénom. Experimenty uskutočňované firmou Smith Kline Beecham Biologicals demonštrovali jasný

-47synergický účinok kombinácií 3D-MPL a QS21 na indukciu tak humorálnej imunitnej odpovede, ako aj Tm typ bunkovej imunitnej odpovede.

Emulzia olej/voda sa skladá z 2 olejov (tokoferolu a skvalénu) a z PBS obsahujúceho Tween 80 ako emulzifikátor. Emulzia obsahuje 5 % skvalénu, 5 % tokoferolu, 2 % Tween 80 a má priemernú veľkosť častíc 180 nm (pozri WO 95/17210).

Experimenty uskutočňované firmou Smith Kline Beecham Biologicals dokázali, že spojenie tejto Q/W emulzie s 3D-MPL/QS21 ešte viac zvyšuje ich imunostimulačné vlastnosti.

Príprava emulzie olej/voda (2 násobný koncentrát)

Tween 80 sa rozpustí vo fosfátovom tlmivom fyziologickom roztoku (PBS), aby vznikol 2% roztok v PBS. Na poskytnutie 100 ml dvojnásobne koncentrovanej emulzie sa 5 g DL alfa tokoferolu a 5 ml skvalénu vortexuje, aby sa dôkladne zmiešali. Pridá sa 90 ml PBS/Tween roztoku a dôkladne sa zmieša. Výsledná emulzia sa potom pretlačí cez striekačku a nakoniec sa mikrofluidizuje použitím M110S Microfluidics zariadenia. Výsledné olejové kvapky majú veľkosť približne 180 nm.

Príprava formulácie olej vo vode

Antigény (100 pg gp120, 20 pg NefTat a 20 pg SIV Nef, samostatne alebo v kombinácii) sa nariedeli 10 násobne koncentrovaným PBS, pH 6,8, a H₂O pred za sebou idúcim pridávaním emulzie oleja vo vode, 3D-MPL (50 pg), QS21 (50 pg) a 1 pg/l tiomerzalu ako konzervačného činidla v 5 minútovom intervale. Objem emulzie sa rovná 50 % celkového objemu (250 pl pre 50Ópl dávku).

Všetky inkubácie sa uskutočňovali pri laboratórnej teplote s pretrepávaním.

CpG oligonukleotid (CpG) je syntetický nemetylovaný oligonukleotid obsahujúci jeden alebo niekoľko CpG sekvenčných motívov. CpG je veľmi účinný induktor T_Hi typu imunity v porovnaní s formuláciou olej vo vode, ktorá indukuje najmä zmiešanú Thi/T_H2 odpoveď. CpG indukuje nižšiu hladinu protilátok ako formulácia olej vo vode a dobrú bunkami sprostredkovanú imunitnú odpoveď.

Očakáva sa, že CpG indukuje nižšiu lokálnu reaktivitu.

-48Príprava CpG oligonukleotidového roztoku: CpG suchý prášok sa rozpustí v H2O, aby vznikol roztok 5 mg/ml CpG.

Príprava CpG formulácie

I antigény sa dialyzovali oproti 150mM NaCI, aby sa eliminovali fosforečné ióny, ktoré inhibujú adsorpciu gp120 na hydroxid hlinitý. Antigény nariedené v H₂O (100 pg gp120, 20 pg NefTat a 20 pg SIV Nef) sa inkubovali s CpG roztokom (500 pg CpG) 30 minút pred adsorpciou na AI(OH)₃, aby sa zvýhodnila potenciálna interakcia medzi His chvostom NefTat a Nef antigénov a oligonukleotidom (je opísaný silnejší imunostimulačný účinok CpG, keď je naviazaný na antigén, v porovnaní s voľným CpG). Potom sa postupne v 5 minútových interfaloch pridával ΑΙ(ΟΗ)₃, (500 pg), 10 násobne koncentrovaný NaCI a 1 pg/ml tiomerzalu ako konzervačné činidlo.

Príklad 14

Imunizácia a SHIV imunostimulačný experiment na makakoch rhesus

Prvá štúdia

Skupiny obsahujúce po 4 makaky rhesus sa intramuskulárne imunizovali v mesiacoch 0,1 a 3 nasledujúcimi vakcinačnými prostriedkami:

skupina 1	adjuvans 2	+ gp120
skupina 2	adjuvans 2	+ gp120	+Neffat	+ SIV Nef
skupina 3	adjuvans 2		+NefTat*	+ SIV Nef
skupina 4	adjuvans 2	+ gpi20	+NefTat	+ SIV Nef
skupina 5	adjuvans 2		+NefTat	+ SIV Nef
skupina 6	adjuvans 2

Adjuvans 2 obsahuje skvalén/tokoferol/Tween 80/3D-MPL/QS21 a adjuvans obsahuje kamenec a CpG.

-49Tat* predstavuje mutovaný Tat, v ktorom Lys 41 -> Ala a v RGD motíve Arg 78 -> Lys a Asp 80 -> Glu (Virology 235: 48-64, 1997).

Mesiac po poslednej imunizácii sa všetky zvieratá infikovali s patogénnym SHIV (kmeň 89.6p). Počnúc týždňom, v ktorom sa uskutočnila infekcia (t16) sa periodicky odoberali vzorky krvi v uvedených časových bodoch, aby sa stanovilo % CD4-pozitívnych buniek medzi periférnymi krvnými mononukleárnymi bunkami FACS analýzou (obrázok 14) a koncentrácia RNA vírusových genómov v plazme bDNA testom (obrázok 15).

Výsledky

Po infikovaní so SHIV₈9.6_P sa všetky zvieratá nakazili.

CD4-pozitívne bunky klesajú po infikovaní u všetkých zvierat v skupinách 1, 3, 5 a 6 s výnimkou jedného zvieraťa v každej zo skupín 1 a 6 (kontrolná skupina). Všetky zvieratá v skupine 2 vykazujú mierny pokles CD4-pozitívnych buniek a v priebehu času sa znova dosiahnu základné hladiny. Podobný trend sa pozoruje u zvierat v skupine 4 (obrázok 14).

Údaje o množstve vírusu sú poväčšine nepriamo úmerné k CD4 údajom. Množstvo vírusu klesá pod hladinu detegovateľnosti u 3/4 zvierat skupiny 2 (a u jedného kontrolného zvieraťa, ktoré si udržiava svoje CD4-pozitívne bunky) a štyri zvieratá vykazujú len marginálne množstvo vírusu. Väčšina ostatných zvierat si udržiava veľké alebo stredné množstvo vírusu (obrázok 15).

Prekvapujúco boli anti-Tat a anti-Nef protilátkové titre merané ELISA testom dvoj až trojnásobne vyššie v skupine 3 (s mutovaným Tat) ako v skupine 5 (rovnaká skupina s nemutovaným Tat), v priebehu trvania štúdie.

Na 68. týždeň (56. týždeň po infikovaní) bôli všetky zvieratá zo skupín, ktoré obdržali kompletnú antigénovú kombináciu (skupiny 2 a 4), životaschopné, zatiaľ čo zvieratá z iných skupín museli byť usmrtené kvôli symptómom podobným AIDS. Prežívanie zvierat na skupinu bolo: skupina 1: 2/4 skupina 2:4/4 skupina 3:0/4 skupina 4:4/4

-50skupina 5: 0/4 skupina 6: 1/4

Závery:

Kombinácia gp120 a NefTat (v prítomnosti SIV Nef) predchádzala strate CD4-pozitívnych buniek, redukovala množstvo vírusu u zvierat infikovaných s patogénnym SHIVeg.ôp a odďaľovala alebo zabraňovala vývoju symptómov ochorenia podobného AIDS, zatiaľ čo gp120 alebo NefTat/SIV Nef samostatne nechránili pred patologickými následkami SHIV infekcie.

Zdá sa, že adjuvans 2, ktorý je emulziou olej vo vode obsahujúcou skvalén, tokoferol a Tween 80 spolu s 3D-MPL a QS21, má silnejší účinok na študované koncové výstupy ako adjuvans kamenec/CpG.

Druhá štúdia

Druhá SHIV infekčná štúdia na makakoch rhesus sa uskutočňovala na to, aby sa potvrdila účinnosť kandidátskej vakcíny gp120/NefTat + adjuvans, a aby sa porovnali antigény založené na rozličných Tat. Štúdia sa uskutočňovala v odlišnom laboratóriu.

Projekt štúdie bol nasledovný:

Skupiny 6 makakov rhesus sa imunizovali na 0., 4. a 12. týždeň i.m. injekciami a na 16. týždeň sa infikovali štandardnou dávkou patogénneho SHIV89.6p.

Skupina 1 je opakovaním skupiny 2 z prvej štúdie.

skupina 1: ' _l	adjuvans 2	+gp120	+NefTat
skupina 2:	adjuvans 2	+gp120	+Tat (oxidovaný)
skupina 3:	adjuvans 2	+gp120	+Tat (redukovaný)
skupina 4:	adjuvans 2

Sledovanými koncovými výstupmi boli znova % CD4-pozitívnych buniek, množstvo vírusu prostredníctvom RT-PCR, morbidita a mortalita.

-51 Výsledky

Všetky zvieratá okrem jedného v skupine 2 sa nakazili po infikovaní s SHIV₈₉.₆.

CD4-pozitívne bunky významne klesajú po infikovaní u všetkých zvierat kontrolnej skupiny 4 a skupiny 3, a s výnimkou jedného u všetkých zvierat skupiny 2. Len jedno zviera v skupine 1 vykazuje značný pokles CD4-pozitívnych buniek. Na rozdiel od zvierat z prvej štúdie, opice v druhom experimente vykazujú stabilizáciu CD4-pozitívnych buniek na rozličných úrovniach jeden mesiac po infekcii vírusom (obrázok 16). Stabilizácia je vo všeobecnosti nižšia ako počiatočné % CD4pozitívnych buniek, ale nikdy nebude viesť ku kompletnej strate buniek. Z toho môže vyplývať nižšia náchylnosť na SHIV-indukované ochorenie v populácii opíc, ktoré boli použité na druhú štúdiu. Bez ohľadu na to je demonštrovateľný užitočný účinok gp120/NefTat/SIV Nef vakcíny a dvoch gp120/Tat vakcín. Počet zvierat s % CD4-pozitívnych buniek vyšším ako 20 je 5 pre očkované zvieratá, zatiaľ čo žiadne z kontrolných zvierat z adjuvans skupiny sa neudrží nad uvedenou hladinou.

Analýza RNA plazmatických vírusových množstiev potvrdila relatívne nízku náchylnosť študovaných zvierat (obrázok 17). Len 2 zo 6 kontrolných zvierat si udržiavali veľké množstvo vírusu, zatiaľ čo vírus sa u ostatných zvierat vytratil z plazmy. Takže je ťažko demonštrovať účinok vakcíny z hľadiska parametra množstva vírusu.

Závery

Z analýzy CD4-pozitívnych buniek vyplýva, že vakcína gp120/NefTat + adjuvans (v prítomnosti SIV Nef) predchádza poklesu CD4-pozitívnych buniek u väčšiny'očkovaných zvierat. Toto je potvrdením výsledku získaného v prvej SHIV štúdii. Kvôli chýbajúcej náchylnosti študovaných zvierat nemohol byť parameter množstva vírusu použitý na demonštrovanie účinku vakcíny. Možno zhrnúť, že kombinácia gp120 a Tat a Nef HIV antigénov poskytuje ochranu proti patologickým následkom HIV infekcie, čoho dôkazom je SHIV model.

Aj samostatné Tat antigény v kombinácii s gp120 poskytujú určitú ochranu pred poklesom CD4-pozitívnych buniek. Účinok je menej výrazný ako pri gp120/Nefľat/SIV Nef antigénovej kombinácii, ale demonštruje, že gp120 a Tat sú

-52schopné sprostredkovať určitý ochranný účinok proti manifestáciám SHIVindukovaného ochorenia.

Druhá SHIV infekčná štúdia sa uskutočňovala s makakmi rhesus zo zdroja, ktorý bol úplne nepribuzný so zdrojom zvierat z prvej štúdie. Oba parametre, tak %

I

CD4-pozitívnych buniek, ako aj plazmatické množstvo vírusu, naznačujú, že zvieratá v druhej štúdii boli menej, náchylné na SHIV-indukované ochorenie, a že existovala značne vyššia variabilita medzi zvieratami. Bez ohľadu na to bolo vidieť užitočný vplyv gp120/NefTat/SIV Nef vakcíny na udržiavanie CD4-pozitívnych buniek s experimentálnou vakcínou obsahujúcou gp120/Nefľat a SIV Nef. Z toho vyplýva, že účinok vakcíny nebol len opakovaním v oddelenej štúdii, ale navyše bol aj demonštrovaný na nepríbuznej populácii opíc.

-53Zoznam sekvencii <110> SmithKline Beecham Biologicals S.A.

<120> Nové použitie <130> B45209 <160> 31 <170> FastSEQ pre Windows verziu 3.0 <210> 1 <211 >28 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> primer <400> 1 atcgtccatg nggtnggcna agntggnt <210>2 <211 >23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> primer

-54<400>2 cggctactag tgcagttctt gaa 23 <210>3 <211>29 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> primer <400> 3 atcgtactag tngagnccan gtangatnc <210>4 <211 >24 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> primer

<400> 4
cggctactag tttccttcgg gcct <210>5 <211 >23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia	24

<220>

<223> primer

-55<400> 5 atcgtccatg gagccagtag atc <210>6 <211>24 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> primer

<400>6 atcgtccatg ggtggagcta tttt	24
<210>7 <211 >23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia
<220> <223> primer

<400> 7
cggctactag tgcgagtttc ctt	23
<210>8
<211 >648
<212> DNA
<213> ľudská

<400>8 atgggtggca agtggtcaaa aagtagtgtg gttggatggc ctactgtaag ggaaagaatg 60

agacgagctg	agccagcagc	agatggggtg	ggagcagcat	ctcgagacct	ggaaaaacat	120
ggagcaatca	caagtagcaa	tacagcagct	accaatgctg	cttgtgcctg	gctagaagca	180
caagaggagg	aggaggtggg	ttttccagtc	acacctcagg	tacctttaag	accaatgact	240
tacaaggcag	ctgtagatct	tagccacttt	ttaaaagaaa	aggggggact	ggaagggcta	300
attcactccc	aacgaagaca	agatatcctt	gatctgtgga	tctaccacac	acaaggctac	360
ttccctgatt	ggcagaacta	cacaccaggg	ccaggggtca	gatatccact	gacctttgga	4 20
tggtgctaca	agctagtacc	agttgagcca	gataaggtag	aagaggccaa	taaaggagag	480
aacaccagct	tgttacaccc	tgtgagcctg	catggaatgg	atgaccctga	gagagaagtg	540
ttagagtgga	ggtttgacag	ccgcctagca	tttcatcacg	tggcccgaga	gctgcatccg	600
gagtacttca	agaactgcac	tagtggccac	catcaccatc	accattaa		648
<210>9
<211> 215
<212> PRT
<213> ľudský

<400> 9

Met

Gly

Lys

Trp

Ser

Lys

Ser

Val

Gly

Trp

Pro

Thr

Val

1

5

10

15

Arg

Glu

Arg

Met

Arg

Ala

Glu

Pro

Ala

Asp

Gly

Val

Gly

Ala

20

25

30

Ala

Ser

Arg

Asp

Leu

Glu

Lys

His

Gly

Ala

íle

Thr

Ser

Asn

Thr

35

40

45

Ala

Thr

Asn

Ala

Cys

Ala

Trp

Leu

Glu

Ala

Gin

Glu

50

55

60

Glu

Val

Gly

Phe

Pro

Val

Thr

Pro

Gin

Val

Pro

Leu

Arg

Pro

Met

Thr

65

70

75

80

Tyr

Lys

Ala

Val

Asp

Leu

Ser

His

Phe

Leu

Lys

Glu

Lys

Gly

85

90

95

Leu

Glu

Gly

Leu

íle

His

Ser

Gin

•Arg

Arg

Gin

Asp

íle.Leu

Ašp

Leu

100

105

110

Trp

íle

Tyr

His

Thr

Gin

Gly

Tyr

Phe

Pro

Asp

Trp

Gin

Asn

Tyr

Thr

115

120

125

Pro

Gly

Pro

Gly

Val

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Trp

Cys

Tyr

Lys

13 0

135

140

Leu

Val

Pro

Val

Glu

Pro

Asp

Lys

Val

Glu

Ala

Asn

Lys

Gly

Glu

145

150

155

160

Asn

Thr

Ser

Leu

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Gly

Met

Asp

Pro

165

170

175

Glu

Arg

Glu

Val

Leu

Glu

Trp

Arg

Phe

Asp

Ser

Arg

Leu

Ala

Phe

His

180

185

190

His

Val

Ala

Arg

Glu

Leu

His

Pro

Glu

Tyr

Phe

Lys

Asn

Cys

Thr

Ser

195

200

Gly His His His His His His

205

210

215 <210> 10 <211 >288 <212>DNA <213> ľudská <400>10 atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact60 gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca120 aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa180 ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcaaccca cctcccaatc ccgaggggac240 ccgacaggcc cgaaggaaac tagtggccac catcaccatc accattaa288 <210> 11 <211 >95 <212> PRT <213> ľudský <400> 11

Met

Glu

Pro

Val

Asp

Pro

Arg

Leu

Glu

Pro

Trp

Lys

His

Pro

Gly

Ser

1

5

10

15

Gin

Pro

Lys

Thr

Ala

Cys

Thr

Asn

Cys

Týp

Cys

Lys

Cys

Phe

20

25

30

His

Cys

Gin

Val

Cys

Phe

íle

Thr

Lys

Ala

Leu

Gly

íle

Ser

Tyr

Gly

35

40

45

Arg

Lys

Arg

Gin

Arg

Pro

Gin

Gly

Ser

Gin

Thr

50

55

60

His

Gin

Val

Ser

Leu

Ser

Lys

Gin

Pro

Thr

Ser

Gin

Ser

Arg

Gly

Asp

65

70

75

80

Pro

Thr

Gly

Pro

Lys

Glu

Thr

Ser

Gly

His

90

-58<210> 12 <211> 909 <212> DNA <213> ľudská <400> 12

atgggtggca	agtggtcaaa	aagtagtgtg	gttggatggc	ctactgtaag	ggaaagaatg	60
agacgagctg	agccagcagc	agatggggtg	ggagcagcat	ctcgagacct	ggaaaaacat	120
ggagcaatca	caagtagcaa	tacagcagct	accaatgctg	cttgtgcctg	gctagaagca	180
caagaggagg	aggaggtggg	ttttccagtc	acacctcagg	tacctttaag	accaatgact	240
tacaaggcag	ctgtagatct	tagccacttt	ttaaaagaaa	aggggggact	ggaagggcta	300
attcactccc	aacgaagaca	agatatcctt	gatctgtgga	tctaccacac	acaaggctac	360
ttccctgatt	ggcagaacta	cacaccaggg	ccaggggtca	gatatccact	gacctttgga	420
tggtgctaca	agctagtacc	agttgagcca	gataaggtag	aagaggccaa	taaaggagag	480
aacaccagct	tgttacaccc	tgtgagcctg	catggaatgg	atgaccctga	gagagaagtg	540
ttagagtgga	ggtttgacag	ccgcctagca	tttcatcacg	tggcccgaga	gctgcatccg	600
gagtacttca	agaactgcac	tagtgagcca	gtagatccta	gactagagcc	ctggaagcat	660
ccaggaagtc	agcctaaaac	tgcttgtacc	aattgctatt	gtaaaaagtg	ttgctttcat	720
tgccaagttt	gtttcataac	aaaagcctta	ggcatctcct	atggcaggaa	gaagcggaga	780
cagcgacgaa	gacctcctca	aggcagtcag	actcatcaag	tttctctatc	aaagcaaccc	840
acctcccaat	cccgagggga	cccgacaggc	ccgaaggaaa	ctagtggcca	ccatcaccat	900
caccattaa						909

<210> 13 <211 >302 <212> PRT <213>ľudský

I <400> 13

Met	Gly	Gly	Lys	Trp	Ser	Lys	Ser
1				5
Arg	Glu	Arg	Met	Arg	Arg	Ala	Glu
			20
Ala	Ser	Arg	Asp	Leu	Glu	Lys	His
		35					40
Ala	Ala	Thr	Asn	Ala	Ala	Cys	Ala
	50					55

Ser	Val 10	Val	Gly	Trp	Pro	Thr Val 15
Pro	Ala	Ala	Asp	Gly	Val	Gly	Ala
25					30
Gly	Ala	íle	Thr	Ser	Ser	Asn	Thr
				45
Trp	Leu	Glu	Ala	Gin	Glu	Glu	Glu

Glu

Val

Gly

Phe

Pro

Val

Thr

Pro

Gin

Val

Pro

Leu

Arg

Pro

Met

Thr

65

70

75

80

Tyr

Lys

Ala

Val

Asp

Leu

Ser

His

Phe

Leu

Lys

Glu

Lys

Gly

85

90

95

Leu

Glu

Gly

Leu

íle

His

Ser

Gin

Arg

Gin

Asp

íle

Leu

Asp

Leu

100

105

110

Trp

íle

Tyr

His

Thr

Gin

Gly

Tyr

Phe

Pro

Asp

Trp

Gin

Asn

Tyr

Thr

115

120

125

Pro

Gly

Pro

Gly

Val

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Trp

Cys

Tyr

Lys

130

135

140

Leu

Val

Pro

Val

Glu

Pro

Asp

Lys

Val

Glu

Ala

Asn

Lys

Gly

Glu

145

150

155

160

Asn

Thr

Ser

Leu

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Gly

Met

Asp

Pro

165

170

175

Glu

Arg

Glu

Val

Leu

Glu

Trp

Arg

Phe

Asp

Ser

Arg

Leu

Ala

Phe

His

180

185

190

His

Val

Ala

Arg

Glu

Leu

His

Pro

Glu

Tyr

Phe

Lys

Asn

Cys

Thr

Ser

195

200

205

Glu

Pro

Val

Asp

Pro

Arg

Leu

Glu

Pro

Trp

Lys

His

Pro

Gly

Ser

Gin

210

215

220

Pro

Lys

Thr

Ala

Cys

Thr

Asn

Cys

Tyr

Cys

Lys

Cys

Phe

His

225

230

235

240

Cys

Gin

Val

Cys

Phe

íle

Thr

Lys

Ala

Leu

Gly

íle

Ser

Tyr

Gly

Arg

245

250

255

Lys

Arg

Gin

Arg

Pro

Gin

Gly

Ser

Gin

Thr

His

260

265

270

Gin

Val

Ser

Leu

Ser

Lys

Gin

Pro

Thr

SEr

Gin

Ser

Arg

Gly

Asp

Pro

275

280

285

Thr

Gly

Pro

Lys

Glu

Thr

Ser

Gly

His

290

295

300

<210> 14 ,.

<211> 1029 <212> DNA <213> ľudská <400> 14 atggatccaa aaactttagc cctttcttta ttagcagctg gcgtactagc aggttgtagc 60 agccattcat caaatatggc gaatacccaa atgaaatcag acaaaatcat tattgctcac 120

cgtggtgcta	gcggttattt	accagagcat	acgttagaat	ctaaagcact	tgcttttgca	180
caacaggctg	attatttaga	gcaagattta	gcaatgacta	aggatggtcg	tttagtggtt	240
attcacgatc	actttttaga	tggcttgact	gatgttgcga	aaaaattccc	acatcgtcat	300
cgtaaagatg	gccgttacta	tgtcatcgac	tttaccttaa	aagaaattca	aagtttagaa	360
atgacagaaa	actttgaaac	catgggtggc	aagtggtcaa	aaagtagtgt	ggttggatgg	420
cctactgtaa	gggaaagaat	gagacgagct	gag.ccagcag	cagatggggt	gggagcagca	480
tctcgagacc	tggaaaaaca	tggagcaatc	acaagtagca	atacagcagc	taccaatgct	540
gcttgtgcct	ggctagaagc	acaagaggag	gaggaggtgg	gttttccagt	cacacctcag	600
gtacctttaa	gaccaatgac	ttacaaggca	gctgtagatc	ttagccactt	tttaaaagaa	660
aaggggggac	tggaagggct	aattcactcc	caacgaagac	aagatatcct	tgatctgtgg	720
atctaccaca	cacaaggcta	cttccctgat	tggcagaact	acacaccagg	gccaggggtc	780
agatatccac	tgacctttgg	atggtgctac	aagctagtac	cagttgagcc	agataaggta	840
gaagaggcca	ataaaggaga	gaacaccagc	ttgttacacc	ctgtgagcct	gcatggaatg	900
gatgaccctg	agagagaagt	gttagagtgg	aggtttgaca	gccgcctagc	atttcatcac	960
gtggcccgag	agctgcatcc	ggagtacttc	aagaactgca	ctagtggcca	ccatcaccat	1020
caccattaa						1029

<210> 15 <211> 324 <212> PRT <213> ľudský <400> 15

Cys 1

Ser

Ser His

Ser 5

Ser

Asn

Met

Ala Asn Thr 10

Gin

Met

Lys

Ser .15

Asp

Lys

íle

Ala

His

Arg

Gly

Ala

Ser

Gly

Tyr

Leu

Pro

Glu

His

20

25

30

Thr

Leu

Glu

Ser

Lys

Ala

Leu

Ala

Phe

Ala

Gin

Ala

Asp

Tyr

Leu

35

40

45

Glu’ Gin

Asp

Leu

Ala

Met

Thr

Lys

Asp

Gly

Arg

Leu

Val

íle

His

50

55

60

Asp

His

Phe

Leu

Asp

Gly

Leu

Thr

Asp

Val

Ala

Lys

Phe

Pro

His

65

70

75

80

Arg

His

Arg

Lys

Asp

Gly

Arg

Tyr

Val

íle

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

85

90

95

Glu

íle

Gin

Ser

Leu

Glu

Met

Thr

Glu

Asn

Phe

Glu

Thr

Met

Gly

100

105

110

Lys

Trp

Ser

Lys

Ser

Val

Gly

Trp

Pro

Thr

Val

Arg

Glu

Arg

115

120

125

Met Arg 130

Arg

Ala

Glu

Pro Ala Ala Asp Gly 135

Val

Gly 140

Ala

Ser

Arg

Asp

Leu

Glu

Lys

His

Gly

Ala

íle

Thr

Ser

Asn

Thr

Ala

Thr

145

150

155

160

Asn

Ala

Cys

Ala

Trp

Leu

Glu

Ala

Gin

Glu

Val

Gly

165

170

175

Phe

Pro

Val

Thr

Pro

Gin

Val

Pro

Leu

Arg

Pro

Met

Thr

Tyr

Lys

Ala

180

185

190

Ala

Val

Asp

Leu

Ser

His

Phe

Leu

Lys

Glu

Lys

Gly

Leu

Glu

Gly

195

200

205

Leu

íle

His

Ser

Gin

ARg

Arg

Gin

Asp

íle

Leu

Asp

Leu

Trp

íle

Tyr

210

215

220

His

Thr

Gin

Gly

Tyr

Phe

Pro

Asp

Trp

Gin

Asn

Tyr

Thr

Pro

Gly

Pro

225

230

235

240

'Gly

Val

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Trp

Cys

Tyr

Lys

Leu

Val

Pro

245

250

255

Val

Glu

Pro

Asp

Lys

Val

Glu

Ala

Asn

Lys

Gly

Glu

Asn

Thr

Ser

260

265

270

Leu

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Gly

Met

Asp

Pro

Glu

Arg

Glu

275

280

285

Val

Leu

Glu

Trp

Arg

Phe

Asp

Ser

Arg

Leu

Ala

Phe

His

Val

Ala

290

295

300

Arg

Glu

Leu

His

Pro

Glu

Tyr

Phe

Lys

Asn

Cys

Thr

Ser

Gly

His

305

310

315

320

His His His His <210> 16 <211> 1290 <212> DNA <213> ľudská <400> 16 cctttcttta gaatacccaa accagagcat gcaagattta tggcttgact atggatccaa agccattcat cgtggtgcta caacaggctg attcacgatc cgtaaagatg atgacagaaa aaactttagc caaatatggc gcggttattt attatttaga actttttaga gccgttacta actttgaaac ttagcagctg gcgtactagc aggttgtagc 60 atgaaatčag acaaaatcat tattgctcac 120 acgttagaat ctaaagcact tgcttttgca 180 gcaatgacta aggatggtcg tttagtggtt 240 gatgttgcga aaaaattccc acatcgtcat 300 aagtttagaa 360 ggttggatgg 420 tgtcatcgac .tttaccttaa aagaaattca catgggtggc aagtggtcaa aaagtagtgt

cctactgtaa	gggaaagaat	gagacgagct	gagccagcag	cagatggggt	gggagcagca	480
tctcgagacc	tggaaaaaca	tggagcaatc	acaagtagca	atacagcagc	taccaatgct	540
gcttgtgcct	ggctagaagc	acaagaggag	gaggaggtgg	gttttccagt	cacacctcag	600
gtacctttaa	gaccaatgac	ttacaaggca	gctgtagatc	ttagccactt	tttaaaagaa	660
aaggggggac	tggaagggct	aattcactcc	caacgaagac	aagatatcct.	tgatctgtgg	720
atctaccaca	cacaaggcta	cttccctgat	tggcagaact	acacaccagg	gccaggggtc	780
agatatccac	tgacctttgg	atggtgctac	aagctagtac	cagttgagcc	agataaggta	840
gaagaggcca	ataaaggaga	gaacaccagc	ttgttacacc	ctgtgagcct	gcatggaatg	900
gatgaccctg	agagagaagt	gttagagtgg	aggtttgaca	gccgcctagc	atttcatcac	960
gtggcccgag	agctgcatcc	ggagtacttc	aagaactgca	ctagtgagcc	agtagatcct	1020
agactagagc	cctggaagca	tccaggaagt	cagcctaaaa	ctgcttgtac	caattgctat	1080
tgtaaaaagt	gttgctttca	ttgccaagtt	tgtttcataa	caaaagcctt	aggcatctcc	1140
tatggcagga	agaagcggag	acagcgacga	agacctcctc	aaggcagtca	gactcatcaa	1200
gtttctctat	caaagcaacc	cacctcccaa	tcccgagggg	acccgacagg	cccgaaggaa	1260
.actagtggcc	accatcacca	tcaccattaa				1290
<210> 17
<211> 411
<212> PRT
<213> ľudský

<400> 17

Cys 1

Ser

Ser His

Ser 5

Ser Asn Met

Ala Asn 10

Thr

Gin

Met

Lys

Ser 15

Asp

Lys

íle

Ala

His

Arg

Gly

Ala

Ser

Gly

Tyr

Leu

Pro

Glu

His

20

25

30

Thr

Leu

Glu

Ser

Lys

Ala

Leu

Ala

Phe

Ala

Gin

Ala

Asp

Tyr

Leu

35

40

45

Glu

Gin

Asp

Leu

Ala

Met

Thr

Lys

Asp

Gly

Arg

Leu

Val

íle

His

50

55

60

Asp

His

Phe

Leu

Asp

Gly

Leu

Thr

Asp

Val

Ala

Lys

Phe

Pro

His

65

70

75

80

Arg

His

Arg

Lys

Asp

Gly

Arg

Tyr

Val

íle

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

85

90

95

Glu

íle

Glri

Ser

Leu

Glu

Met

Thr

Glu

Asn

Phe

Glu

Thr

Met

Gly

100

105

110

Lys

Trp

Ser

Lys

Ser

Val

Gly

Trp

Pro

Thr

Val

Arg

Glu

Arg

115

120

125

Met Arg Arg 130

Ala Glu

Pro Ala Ala Asp 135

Gly

Val

Gly 140

Ala

Ser

Arg

Asp

Leu

Glu

Lys

His

Gly

Ala

íle

Thr

Ser

Asn

Thr

Ala

Thr

145

150

155

160

Asn

Ala

Cys

Ala

Trp

Leu

Glu

Ala

Gin

Glu

Val

Gly

165

170

1

175

Phe

Pro

Val

Thr

Pro

Gin

Val

Pro

Leu

Arg

Pro

Met

Thr

Tyr

Lys

Ala

180

185

190

Ala

Val

Asp

Leu

Ser

His

Phe

Leu

Lys

Glu

Lys

Gly

Leu

Glu

Gly

195

200

205

Leu

íle

His

Ser

Gin

ARg

Arg

Gin

Asp

íle

Leu

Asp

Leu

Trp

íle

Tyr

210

215

220

His

Thr

Gin

Gly

Tyr

Phe

Pro

Asp

Trp

Gin

Asn

Tyr

Thr

Pro

Gly

Pro

225

230

235

240

Gly

Val

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Trp

Cys

Tyr

Lys

Leu

Val

Pro

245

250

255

Val

Glu

Pro

Asp

Lys

Val

Glu

Ala

Asn

Lys

Gly

Glu

Asn

Thr

Ser

260

265

270

Leu

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Gly

Met

Asp

Pro

Glu

Arg

Glu

275

280

285

Val

Leu

Glu

Trp

Arg

Phe

Asp

Ser

Arg

Leu

Ala

Phe

His

Val

Ala

290

295

300

Arg

G1U

Leu

His

Pro

Glu

Tyr

Phe

Lys

Asn

Cys

Thr

Ser

Glu

Pro

Val

305

310

315

320

Asp

Pro

Arg

Leu

Glu

Pro

Trp

Lys

His

Pro

Gly

Ser

Gin

Pro

Lys

Thr

325

330

335

Ala

Cys

Thr

Asn

Cys

Tyr

Cys

Lys

Cys

Phe

His

Cys

Gin

Val

340

345

350

Cys

Phe

íle

Thr

Lys

Ala

Leu

Gly

íle

Ser

Tyr

Gly

Arg

Lys

Arg

355

360

365

Arg

Gin

Arg

Pro

Gin

Gly

Ser

Gin

Thr

His

Gin

Val

Ser

370

375

380

Leu

Ser

Lys

Gin

Pro

Thr

Ser

Gin

Ser

Arg

Gly

Asp

Pro

Thr

Gly

Pro

385

390

395

400

Lys

Glu

Thr

Ser

Gly

His

405

410

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie a) HIV Tat proteínu alebo polynukleotidu; alebo , b) HIV Nef proteínu alebo polynukleotidu; alebo

c) HIV Tat proteínu alebo polynukleotidu spojeného s HIV Nef proteínom alebo polynukleotidom -Nef-Tat;

a HIV gp120 proteínu alebo polynukleotidu na výrobu vakcíny na profylaktickú alebo terapeutickú imunizáciu ľudí proti HIV, pričom Tat, Nef alebo Nef-Tat pôsobia synergicky s gp120 pri liečbe alebo prevencii HIV.
2. Použitie podľa nároku 1, kde používaná vakcína redukuje množstvo HIV vírusu u HIV infikovaných ľudí.
3. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde výsledkom použitej vakcíny je udržanie CD4+ hladín nad hladinami zistenými pri absencii vakcinácie s HIV Tat, Nef alebo Nef-Tat a s HIV gp120.
4. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, kde vakcína ďalej obsahuje antigén vybraný zo skupiny pozostávajúcej z: gag, rev, vif, vpr, vpu.
5. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde Tat proteín je mutovaný proteín.
6. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, kde Tat, Nef alebo Nef-Tat proteín je redukovaný.
7. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, kde Tat, Nef alebo Nef-Tat proteín je karbamidometylovaný.
8. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, kde Tat, Nef alebo Nef-Tat proteín je oxidovaný.
9. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, ktoré ďalej zahŕňa adjuvans.
10. Použitie podľa nároku 9, kde adjuvans je Thi indukujúci adjuvans.
11. Použitie podľa nároku 9 alebo 10, kde adjuvans zahŕňa monofosforyllipid A alebo jeho derivát, ako napríklad 3-de-O-acylovaný monofosforyllipid A.
12. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 11, ktoré ďalej zahŕňa saponínový adjuvans.
13. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 12, ktoré ďalej zahŕňa emulziu olej vo vode.
14. Použitie podľa nároku 9 alebo 10, kde adjuvans zahŕňa oligonukleotidy obsahujúce CpG motív.
15. Použitie podľa nároku 14, ktoré ďalej zahŕňa hliníkovú soľ.
16. Použitie a) HIV Tat proteínu alebo polynukleotidu; alebo

b) HIV Nef proteínu alebo polynukleotidu; alebo

c) HIV Tat proteínu alebo polynukleotidu spojeného s HIV Nef proteínom alebo polynukleotidom;

a HIV gp120 proteínu alebo polynukleotidu na výrobu vakcíny vhodnej na dodávanie prostredníctvom primárneho podania a následnou revakcináciou (primeboost) na profylaktickú alebo terapeutickú imunizáciu ľudí proti HIV.
17. Spôsob imunizácie človeka proti HIV, vyz n a č u j ú c i sa tým, že zahŕňa podávanie vakcíny obsahujúcej HIV Tat alebo HIV Nef alebo HIV NefTat proteíny alebo polynukleotidy, ktoré ich kódujú, v kombinácii s HIV gp120 proteínom alebo polynukleotidom, ktorý ich kóduje.
18. Vakcínový prostriedok na humánne použitie, vyznačujúci sa tým, že obsahuje HIV Tat alebo HIV Nef alebo HIV Nef-Tat proteíny alebo polynukleotidy, ktoré ich kódujú, v kombinácii s HIV gp120 proteínom alebo polynukleotidom, ktorý ho kóduje.
19. Režim očkovania s gp120, nef a tat, v y zn a č u j ú c i sa tým, že zahŕňa postupné podávanie proteínových antigénov a DNA kódujúcej gp120, nef a tat.
20. Režim očkovania podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že proteínové antigény sa injekčné podávajú raz alebo niekoľkokrát a potom nasleduje jedno alebo viacero podaní DNA.
21. Režim podávania podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že najprv sa použije DNA na jedno alebo viacero podaní a potom nasleduje jedno alebo viacero podaní proteínu.
22. Použitie

a) prostriedku obsahujúceho gp120 Nef, Tat a gp120 proteíny; a

b) prostriedku obsahujúceho gp120, Nef a Tat DNA na výrobu lieku na liečenie HIV, pričom a) a b) sa môžu použiť oddelene v akomkoľvek poradí, alebo spolu.
23. Použitie gp120, nef a tat proteínových antigénov na výrobu lieku na liečenie HIV u jedinca, ktorému bola podaná DNA kódujúca gp120, nef a tat proteínové antigény.
24. Použitie DNA kódujúcej gp120, nef a tat proteínové antigény na výrobu lieku na liečenie HIV u jedinca, ktorému boli podané gp120, nef a tat proteínové antigény.