BRPI0808553A2 - Métodos para elevar uma resposta imune contra um patógeno, para estimar a produção de células t cd4+ e/ou cd8+ e/ou anticorpos específicos de patógeno em mamíferos e para estimular uma resposta imune em um mamífero, composição de vacina, uso da mesma, e, kit - Google Patents

Métodos para elevar uma resposta imune contra um patógeno, para estimar a produção de células t cd4+ e/ou cd8+ e/ou anticorpos específicos de patógeno em mamíferos e para estimular uma resposta imune em um mamífero, composição de vacina, uso da mesma, e, kit Download PDF

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Description

“MÉTODOS PARA ELEVAR UMA RESPOSTA IMUNE CONTRA UM PATÓGENO, PARA ESTIMULAR A PRODUÇÃO DE CÉLULAS T CD4+ E/OU CD8+ E/OU ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE PATÓGENO EM MAMÍFEROS E PARA ESTIMULAR UMA RESPOSTA IMUNE EM UM MAMÍFERO, COMPOSIÇÃO DE VACINA, USO DA MESMA, E, KIT” Campo da invenção
Esta invenção diz respeito a novas composições de vacina e seu uso no estímulo de respostas imunes em mamíferos, especialmente seres humanos, e em particular para a prevenção e tratamento de infecção pelos patógenos. Em particular a mesma diz respeito às composições capazes de induzir respostas de célula T CD4+ e CD8+ assim como respostas de anticorpo em pacientes sem recorrer aos programas de preparador-reforço complexos.
Fundamentos para a invenção
Os organismos integrais inativados foram usados em vacinação com êxito desde os idos do século dezenove. Em tempos mais recentes, vacinas envolvendo a administração de extratos, subunidades, toxóides e polissacarídeos capsulares foram utilizados. Desde que as técnicas de engenharia genética têm estado disponíveis, o uso de proteínas recombinantes tem sido uma estratégia favorecida, removendo muitos dos riscos associados com o uso de proteínas purificadas a partir de fontes naturais.
Os métodos de vacina no princípio foram fundamentados na administração de proteínas que estimularam alguns aspecto da resposta imune in vivo. Subsequentemente foi avaliado que as respostas imunes também poderia ser incitadas pela administração de DNA que seria transcrito e traduzido pelo hospedeiro em uma proteína imunogênica.
A resposta imune de mamífero tem dois componentes chave: a resposta humoral e a resposta mediada por célula. A resposta humoral envolve a geração de anticorpos circulantes que ligar-se-ão ao antígeno para o qual são específicos, neutralizando deste modo o antígeno e favorecendo a sua depuração subsequente por um processo envolvendo outras células que são citotóxicas ou fagocíticas. As células B são responsáveis pela geração de 5 anticorpos (células B plasmáticas), assim como pela posse de memória humoral imunológica (células B de memória), isto é, a capacidade para reconhecer um antígeno alguns anos depois da primeira exposição ao mesmo por exemplo, através da vacinação. A resposta mediada por célula envolve a interação de numerosos tipos diferentes de células, entre as quais estão as 10 células T. as células T são divididas em vários subconjuntos diferentes, principalmente as Células T CD4+ e CD8+.
As células que apresentam antígeno (APC) tais como macrófagos e células dendrítica atuam como sentinelas do sistema imune, triando o corpo quanto aos antígenos estranhos. Quando antígenos estranhos 15 extracelulares são detectados pelo APC, estes antígenos são fagocitados (engolfados) dentro do APC onde eles serão processados em peptídeos menores. Estes peptídeos são subsequentemente apresentados nas moléculas do complexo da histocompatibilidade principal classe II (MHC II) na superfície do APC onde eles podem ser reconhecido pelos linfócitos T 20 específicos de antígeno que expressam as moléculas de superfície CD4 (células T CD4+). Quando as células T CD4+ reconhecem o antígeno para o qual elas são específicas nas moléculas MHCII na presença de sinais coestimulatórios adicionais adequados, elas se tomam ativadas e secretam uma série de citocinas que subsequentemente ativam os outros ramos do sistema 25 imune. No geral, as células T CD4+ são classificadas nos subconjuntos auxiliar T I (Thl) ou auxiliar T 2 (Th2) dependendo do tipo de resposta que eles geram a seguir do reconhecimento de antígeno. No reconhecimento de um complexo de peptídeo-MHC II, as células T CD4+ Thl secretam interleucinas e citocinas tais como interferon gama ativando deste modo macrófagos para liberar produtos químicos tóxicos tais como óxido nítrico e espécies de oxigênio/nitrogênio reativas. IL-2 e TNF-alfa também são habitualmente categorizadas como citocinas Thl. Ao contrário, as células T CD4+ Th2 no geral secretam interleucinas tais como IL-4, IL-5 ou IL-13.
5 Outras funções das células T CD4+ auxiliares T incluem
fornecer ajuda para ativar as células B para produzir e liberar anticorpos, elas também podem participar da ativação de células T CD8+ específicas de antígeno, o outro subconjunto de célula T principal além das células T CD4+.
As células T CD8+ reconhecem o peptídeo para o qual eles são específicos quando o mesmo é apresentado na superfície de uma célula hospedeira pelas moléculas de histocompatibilidade principal da classe I (MHC I) na presença de sinais co-estimulatórios apropriados. De modo a ser apresentado nas moléculas MHC I, um antígeno estranho precisa ter acesso diretamente à parte de dentro da célula (o citossol ou núcleo) tal como é o caso quando um vírus ou bactérias intracelulares diretamente penetram uma célula hospedeira ou depois da vacinação com DNA. Dentro da célula, o antígeno é processado em peptídeos pequenos que serão carregados sobre as moléculas MHC I que são redirecionadas para a superfície da célula. Na ativação as células T CD 8+ secretam uma série de citocinas tais como interferon gama que ativa macrófagos e outras células. Em particular, um subconjunto destas células T CD8+ secreta moléculas líticas e citotóxicas (por exemplo, granzima, perforina) na ativação. Tais células T CD8+ são aludidas como células T citotóxicas.
Mais recentemente, um caminho alternativo de apresentação de antígeno envolvendo a carga de antígenos extracelulares ou fragmentos destes nos complexos MHCI foram descritos e chamados de “apresentação cruzada”.
A natureza da resposta de célula T também é influenciada pela composição do adjuvante usado em uma vacina. Por exemplo, adjuvantes contendo MPL & QS21 mostraram ativar células T CD4+ Thl para secretar IFN-gama (Stewart et al. Vaccine, 2006, 24 (42-43): 6483-92).
Considerando que os adjuvantes são bem conhecidos por terem valor no realce de respostas imunes aos antígenos de proteína, eles no 5 geral não foram usados em conjunção com vacinação com DNA ou vetor com base em DNA. Existem várias hipóteses a cerca do porquê os adjuvantes não foram usados em conjunção com as vacinas com base em vetor de DNA. Na verdade, interferências entre o adjuvante e o vetor podem ter um impacto sobre a sua estabilidade. Além disso, poder-se-ia esperar que a adição de um 10 adjuvante a um vetor atenuado aumentaria a reatogenicidade induzida por tal produto. Finalmente, aumentar a imunogenicidade de uma vacina com base no vetor de DNA pode levar a uma resposta imune neutralizadora realçada contra o próprio vetor, impedindo desse modo qualquer efeito reforçador de injeções subsequentes da mesma vacina com base em vetor. De fato, em um 15 protocolo de vacinação direcionado para a proteção contra a infecção por P. falciparum, Jones et al (2001, J Infect Diseases 183, 303-312) têm relatado um resultado adverso depois de combinar DNA, proteína recombinante e adjuvante como uma composição reforçadora a seguir de uma preparadora pelo DNA. Na verdade, os níveis de parasitemia foram significantemente 20 mais baixos em um grupo em que a composição reforçadora continha apenas proteína e adjuvante. Foi concluído que o uso da combinação de DNA, proteína recombinante e adjuvante neste protocolo afetou adversamente o resultado na parasitemia assim como respostas de anticorpo.
Por outro lado, tem havido um relato de realce da eficácia de 25 um vacina de vetor com base em DNA com adjuvante (Ganne et al. Vaccine (1994) 12(13) 1190-1196). Em particular, a eficácia realçada de uma vacina de vetor de adenovírus defeituoso em replicação pela adição de adjuvantes oleosos foi correlacionada com níveis de anticorpo mais altos mas o impacto sobre as respostas de célula T CD4 e CD8 não foi relatado. O uso de um vírus não patogênico como um adjuvante foi divulgado na W02007/016715. Não foi mencionado que o dito vírus poderia conter qualquer polinucleotídeo heterólogo.
r
E no geral considerado que a estimulação tanto das células 5 CD4+ quanto das CD8+ são necessárias para a imunidade protetora ótima, especialmente em certas doenças tais como infecção pelo HIV/AIDS. De modo a induzir uma resposta imune ótima profilática ou terapeuticamente, a estimulação tanto de células CD4+ quanto de CD8+ é desejável. Isto é uma das metas principais das estratégias de vacinação de “preparação-reforço” em 10 que a administração alternada de vacinas com base em proteína (induzindo principalmente as células T CD4+) com vacinas com base em vetor de DNA, isto é, DNA nú, vetores virais ou vetores bacterianos intracelulares tais como listeria, (induzindo principalmente células T CD8+) ou vice versa mais provavelmente ativam respostas tanto de célula T CD4+ quanto CD8+.
Entretanto, embora as estratégias de vacina de preparação
reforço no geral possam dar origem a uma resposta maior ou mais balanceada, a exigência de vacinar em mais do que uma ocasião e certamente em mais do que duas ocasiões pode ser oneroso ou mesmo inviável, especialmente nos programas de imunização em massa para o mundo em desenvolvimento.
Além disso,, como já mencionado acima, frequentemente não
é possível reforçar o componente de vetor viral por causa da imunidade que pode ter sido incitada contra o próprio vetor.
Assim os objetivos da invenção incluem um ou mais dos seguintes: (a) fornecer um protocolo de vacinação completo e uma 25 composição de vacina que estimule a produção de Células CD4+ e/ou CD8+ e/ou anticorpos e em particular que remova ou alivie a necessidade quanto a imunizações repetidas; (b) fornecer um protocolo de vacinação e uma composição de vacina que melhor estimule a produção de células CD4+ e/ou células CD8+ e/ou anticorpos em relação às composições de vacina contendo um polipeptídeo imunogênico sozinho ou um polinucleotídeo sozinho ou em relação a um protocolo preparação-reforço convencional envolvendo a administração separada de polipeptídeo imunogênico e polinucleotídeo; (c) fornecer uma composição de vacina que estimule ou melhor estimule 5 respostas Thl; (d) fornecer uma composição de vacina e protocolo de vacinação em que as doses requeridas de componentes, especialmente vetores virais, são minimizadas; e (e) mais no geral fornecer uma composição de vacina e protocolo de vacinação úteis para o tratamento ou prevenção de doenças causadas pelos patógenos. Por “estimula melhor” é intencionado que 10 a intensidade e/ou persistência da resposta é realçada.
Sumário da invenção
Assim de acordo com a invenção é fornecido um método para elevar uma resposta imune contra um patógeno que compreende administrar (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários derivados do dito 15 patógeno; (ii) um ou mais vetores adenovirais que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários derivados do dito patógeno; e (iii) um adjuvante; em que o um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários, o um ou mais vetores adenovirais e o adjuvante são administrados concomitantemente.
De acordo com um aspecto específico da invenção é fornecida
uma composição de vacina que compreende (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários derivados de um patógeno; (ii) um ou mais vetores adenovirais que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários derivados do dito patógeno; e (iii) um adjuvante.
Também é fornecido uma composição imunogênica que compreende (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários derivados de um patógeno; (ii) um ou mais vetores adenovirais que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários derivados do dito patógeno; e (iii) um adjuvante.
As ditas vacinas e composições imunogênicas adequadamente estimulem a produção de células T CD4+ e/ou células T CD8+ e/ou anticorpos específicos de patógeno.
Por “células T CD4+ e/ou células T CD8+ e/ou anticorpos específicos de patógeno” é intencionado células T CD4+ e/ou células T CD8+ e/ou anticorpos que especificamente reconhecem o patógeno inteiro ou uma parte (por exemplo, uma subunidade imunogênica) deste. Por “reconhecem especificamente” é intencionado que as células T CD4+ e/ou células T CD8+ e/ou anticorpos reconheçam em uma maneira imunoespecífica ao invés de uma não específica o dito patógeno (ou parte deste).
Também é fornecido um método para estimular uma resposta imune em um mamífero que compreende administrar a um paciente uma quantidade imunologicamente eficaz de uma tal composição.
Também é fornecido o uso de uma tal composição na fabricação de um medicamento para estimular uma resposta imune em um mamífero.
Também é fornecido uma tal composição para o uso na estimulação de uma resposta imune em um mamífero.
Também é fornecido um método para estimular a produção de células T CD4+ e/ou células T CD8+ e/ou anticorpos específicos de patógeno em mamíferos que compreende administrar ao dito mamífero (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários derivados de um patógeno; (ii) um ou mais vetores adenovirais que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários derivados do dito patógeno; e (iii) um adjuvante; em que o um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários, o um ou mais vetores adenovirais e o adjuvante são administrados concomitantemente, por exemplo pela administração de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição supracitada.
Também é fornecido o uso das composições supracitadas na fabricação de um medicamento para estimular a produção de células CD4+ e/ou CD8+ e/ou anticorpos específicos de patógeno em mamíferos.
Por exemplo, a produção de células T CD4+ ou células T CD8+ ou anticorpos é estimulada. Adequadamente a produção de 2 e especialmente 3 das células T CD4+ e/ou células T CD8+ e/ou anticorpos é estimulada.
Adequadamente a produção de células T CD8+ é estimulada.
Adequadamente a produção de células T CD4+ e CD8+ é estimulada. Adequadamente a produção de células T CD4+ e CD8+ e anticorpos é estimulada.
De modo adequadamente alternativo a produção de células T CD4+ é estimulada. Adequadamente a produção de CD4+ e anticorpos é estimulada.
De modo adequadamente alternativo a produção de anticorpos
é estimulada.
O métodos da invenção são adequadamente intencionados a 20 fornecer as etapas adequadas para um método completo para incitar uma resposta imune (embora o método, se desejado, possa ser repetido). Portanto adequadamente os métodos não envolvem o uso de uma dose de preparação de nenhum polipeptídeo ou polinucleotídeo imunogênicos (por exemplo, na forma de um vetor tal como um vetor adenoviral) que codifica qualquer 25 polipeptídeo imunogênico.
Por exemplo é fornecido um método para elevar uma resposta imune contra um patógeno que consiste de (a) administrar (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários derivados do dito patógeno; (ii) um ou mais vetores adenovirais que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários derivados do dito patógeno; e (iii) um adjuvante; em que o um ou mais polipeptídeos imunogênicos, o um ou mais vetor adenoviral e o adjuvante são administrados concomitantemente; e (b) opcionalmente repetir as etapas de (a).
As etapas do método podem ser repetidas (por exemplo, repetidas uma vez) se uma repetição dá origem a uma resposta imune melhorada. Uma resposta adequada, pelo menos na medida em que uma resposta de célula T é participante, pode ser obtida sem qualquer necessidade para repetição.
Também é fornecido um método para elevar uma resposta imune contra um patógeno que compreende (a) administrar (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários derivados do dito patógeno; (ii) um ou mais vetores adenovirais que compreendem um ou mais polinucleotídeos 15 heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários derivados do dito patógeno; e (iii) um adjuvante; em que o um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários, o um ou mais vetores adenovirais e o adjuvante são administrados concomitantemente; e em que o método não envolve administrar nenhuma dose preparadora de polipeptídeo imunogênico 20 ou polinucleotídeo que codifica polipeptídeo imunogênico.
Também é fornecido um kit que compreende (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários derivados de um patógeno; (ii) um ou mais vetores adenovirais que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos 25 secundários derivados do dito patógeno; e (iii) um adjuvante; e em particular que compreende (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários derivados de um patógeno e um adjuvante; e (ii) um ou mais vetores adenovirais secundários que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos derivados do dito patógeno; para o uso em um método de acordo com a invenção.
As composições e métodos da invenção podem ser úteis para a prevenção de infecção pelos patógenos em pacientes ingênuos, ou prevenção de re-infecção em pacientes que foram anteriormente infectados pelo patógeno ou tratamento de pacientes que foram infectados pelo patógeno. Descrição resumida das figuras
A Figura 1 mostra uma representação gráfica da construção de plasmídeo p73i-Tgm
As Figuras 2 a 8 mostram os resultados de experimentos debatidos no Exemplo 1, especificamente:
As Figuras 2a, 2b, 3a, 3b: respostas de célula T CD4+ e CD8+ em resposta à re-estimulação pelos grupos de peptídeos derivados de p24, RT, Nef e pl7 a seguir de vários protocolos de imunização e em pontos de tempo diferentes;
Figura 4: respostas de anticorpo contra F4;
As Figuras 5 a 8 respostas de anticorpo contra componentes de F4, p24, RT, pl7 e Nef respectivamente;
A Figura 9 mostra os resultados de experimentos debatidos no Exemplo 2, especificamente:
Respostas de célula T CD4+ em resposta à re-estimulação
pelos grupos de peptídeos derivados de p24 e RT a seguir de vários protocolos de imunização;
As Figuras 10-12 mostram os resultados de experimentos debatidos no Exemplo 3, especificamente:
A Figura 10 mostra a resposta linfoproliferativa de PBMC de
coelho contra grupos de peptídeo que abrangem a seqüência F4;
A Figura 11 mostra o curso de tempo de respostas de anticorpo
contra F4;
As Figuras 12a e 12b mostram respostas de anticorpo (no dia 77) contra os componentes de F4, p24 e RT respectivamente;
A Figura 13 mostra a quantificação de Células T CD4 específicas do HIV-I;
A Figura 14 mostra a distribuição da frequência de Células T CD4 específicas de F4 7 dias depois das duas imunizações;
A Figura 15 mostra a produção de citocina das células T CD4 específicas de F4 7 dias depois das duas imunizações;
A Figura 16 mostra a quantificação de Células T CD8 específicas do HIV-1;
A Figura 17 mostra a produção de citocina de células T CD8
específicas de F4 7 dias depois das duas imunizações;
A Figura 18 mostra a quantificação de células T CD4 específicas de CSP;
A Figura 19 mostra a quantificação de células T CD8 específicas de CSP;
A Figura 20 mostra a quantificação de células T CD4 específicas de CSP(terminal N);
A Figura 21 mostra a quantificação de células T CD4 específicas de CSP(terminal C);
A Figura 22 mostra a quantificação de células T CD8
específicas de CSP(terminal N);
A Figura 23 mostra a quantificação de células T CD8 específicas de CSP(terminal C);
A Figura 24 mostra a quantificação de títulos de anticorpo específicos de CSP.
Sumário das listagens de seqüência
Descrição de aminoácido ou polinucleotídeo Identificador de Seqüência (SEQ ID No) HIV Gag-RT-Nef (“GRN”) (Ciado B) (cDNA) 1 HIV Gag-RT-Nef (“GRN”) (Ciado B) (aminoácido) 2 HIV Gag-RT-integrase-Nef (“GRIN”) (Ciado A) (cDNA) 3 HIV Gag-RT-integrase-Nef (“GRIN”) (Ciado A) (aminoácido) 4 HIV gp 140 (Ciado A) (cDNA) 5 HIV gpl40 (Ciado A) (aminoácido) 6 HIV rp 120 (Ciado B) (cDNA) 7 HIV gpl20 (Ciado B) (aminoácido) 8 Proteína de fusão de antígenos TB M72 (cDNA) 9 Proteína de fusão de antígenos M72 (aminoácido) 10 Antígeno derivado da proteína CS de P. falciparum (cDNA) 11 Antígeno derivado da proteína CS de P. falciparum (aminoácido) 12 Proteína de fusão derivada da proteína CS de P. falciparum “RTS” (cDNA) 13 Proteína de fusão derivada da proteína CS de P. falciparum “RTS” (aminoácido) 14 HIV p24-RT-Nef-p 17 (cDNA) 15 HIV p24-RT-Nef-pl7 (aminoácido) 16 As seqüências indicadas acima podem ser utilizadas como
polipeptídeos ou polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de uso em aspectos exemplares da invenção. Os ditos polipeptídeos podem consistir de ou compreender as seqüências mencionadas acima. Os resíduos Met iniciais 5 são opcionais. Os resíduos His de terminal N (incluindo os resíduos His imediatamente a seguir de um Met inicial, como na SEQ ID No 9) são opcionais ou um rótulo His de terminal N de um comprimento diferente pode ser utilizado (por exemplo, tipicamente até 6 resíduos de His podem ser utilizados para facilitar a isolação da proteína). As proteínas análogas que têm 10 identidade de seqüência significante por exemplo, maior do que 80 %, por exemplo maior do que 90 %, por exemplo maior do que 95 %, por exemplo maior do que 99 % de identidade de seqüência em relação ao comprimento inteiro da seqüência de referência podem ser utilizadas, especialmente quando a proteína análoga tem uma função similar e particularmente quando a 15 proteína análoga é similarmente imunogênica. Por exemplo até 20, por exemplo até 10 por exemplo, 1 a 5 substituições (por exemplo, substituições conservativas) podem ser toleradas. Os ácidos nucléicos que diferem daqueles indicados acima que codificam as mesmas proteínas, ou as proteínas análogas anteriormente mencionadas, podem ser utilizadas. A identidade de seqüência 20 pode ser determinada por meios convencionais por exemplo, usando BLAST. Em uma variante específica da SEQ ID No 16 que pode ser mencionada, reside 398 é Ser e não Cys.
Descrição detalhada da invenção Como aqui usado o teimo “concomitantemente” significa em que o um ou mais polipeptídeos imunogênicos, o um ou mais vetores adenovirais e o adjuvante são administrados dentro de um período de não mais do que 12 horas por exemplo, dentro de um período de não mais do que 5 1 hora, tipicamente em uma ocasião por exemplo, no curso da mesma visita ao profissional de saúde, por exemplo o um ou mais polipeptídeos imunogênicos, o um ou mais vetores adenovirais e o adjuvante são administrados seqüencial ou simultaneamente.
Como aqui usado, o termo “epítopo” refere-se a uma seqüência de aminoácido imunogênica. Um epítopo pode se referir a uma seqüência de um mínimo de aminoácidos de tipicamente 6 a 8 aminoácidos, seqüência mínima esta que é imunogênica quando removida do seu contexto natural, por exemplo quando transplantada em um polipeptídeo heterólogo. Um epítopo também pode se referir àquela porção de uma proteína que é imunogênica, onde o polipeptídeo contendo o epítopo é aludido como o antígeno (ou algumas vezes “antígeno de polipeptídeo”). Um polipeptídeo ou antígeno podem conter um ou mais (por exemplo, 2 ou 3 ou mais) epítopos distintos. O termo “epítopo” abrange os epítopos de célula B e célula T. O termo “epítopo de célula T” abrange epítopos de célula T CD4+ e epítopos de célula T CD8+ (algumas vezes também aludidos como epítopos de CTL).
O termo “polipeptídeo imunogênico” refere-se a um polipeptídeo que é imunogênico, isto quer dizer que o mesmo é capaz de evocar uma resposta imune em um mamífero, e portanto contém um ou mais epítopos (por exemplo, epítopos de célula T e/ou célula B). Os polipeptídeos 25 imunogênicos podem conter um ou mais antígenos de polipeptídeo por exemplo, em um arranjo não natural tal como em uma proteína de fusão.
Os polipeptídeos imunogênicos tipicamente serão proteínas recombinantes produzidas por exemplo, pela expressão em um hospedeiro heterólogo tal como um hospedeiro bacteriano, em levedura ou em células de mamífero cultivadas.
O termo “polipeptídeo derivado de um patógeno” significa um polipeptídeo que parcial ou totalmente contém seqüências (isto é, antígenos) que ocorrem naturalmente em patógenos ou carregam um alto grau de 5 identidade de seqüência para este (por exemplo, mais do que 95 % de identidade em relação a um trecho de pelo menos 10, por exemplo pelo menos 20 aminoácidos).
Os polipeptídeos imunogênicos podem conter um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) antígenos de polipeptídeo.
A menos que de outro modo especificado, uma “resposta
imune” pode ser uma resposta celular e/ou uma humoral.
Em uma forma de realização da invenção um ou mais dos ditos um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários são substancialmente os mesmos como um ou mais dos ditos um ou mais polipeptídeos imunogênicos 15 secundários. Por exemplo um do pelo menos um polipeptídeo imunogênico primário e um do pelo menos um polipeptídeo imunogênico secundário podem ter uma identidade de seqüência global de 90 % ou mais, por exemplo 95 % ou mais, por exemplo 98 % ou 99 % ou mais em relação ao comprimento de um ou outro polipeptídeo imunogênico.
Em uma outra forma de realização da invenção um ou mais
dos ditos um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários contêm pelo menos um antígeno que é substancialmente o mesmo como um antígeno contido em um ou mais dos ditos um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários. Por exemplo um do pelo menos um polipeptídeo imunogênico 25 primário e um do pelo menos um polipeptídeo imunogênico secundário pode ter uma identidade de seqüência global de 90 % ou mais, por exemplo 95 % ou mais, por exemplo 98 % ou 99 % ou mais em relação a um trecho de 20 aminoácidos ou mais, por exemplo 40 aminoácidos ou mais, por exemplo 60 aminoácidos ou mais. Adequadamente um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários compreendem pelo menos um epítopo de célula T.
Adequadamente um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários compreendem pelo menos um epítopo de célula T.
Adequadamente o um ou mais polipeptídeos imunogênicos
primários compreendem pelo menos um epítopo de célula B.
Adequadamente o um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários compreendem pelo menos um epítopo de célula B.
Em uma outra forma de realização da invenção um ou mais 10 dos ditos um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários e um ou mais dos ditos um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários compartilham um ou mais epítopos de célula B e/ou célula T idênticos. Adequadamente eles compartilham uma ou mais seqüências de aminoácido idênticas de 10 aminoácidos de comprimento ou mais, por exemplo 15 aminoácidos ou mais, 15 por exemplo 25 aminoácidos ou mais.
Em uma outra forma de realização da invenção, nenhum do um ou mais dos ditos um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários é substancialmente o mesmo ou contém qualquer antígeno em comum com um ou mais dos ditos um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários, por 20 exemplo eles podem ter uma identidade de seqüência global de menos do que 90 % em relação a um trecho de 20 aminoácidos ou mais, por exemplo 40 aminoácidos ou mais, por exemplo 60 aminoácidos ou mais.
Assim, eles não podem compartilhar qualquer epítopo de célula B ou célula T. Por exemplo, eles não podem compartilhar qualquer seqüência de aminoácido idêntica de 10 aminoácidos de comprimento ou mais, por exemplo em 15 aminoácidos ou mais, por exemplo 25 aminoácidos ou mais.
Em uma forma de realização específica da invenção um polipeptídeo imunogênico primário e um polipeptídeo imunogênico secundário contêm os mesmos antígenos no mesmo arranjo ou em um arranjo diferente (por exemplo, em um arranjo diferente). Por “arranjo diferente” é intencionado que eles possam ser arranjados em uma ordem diferente e/ou eles podem ser divididos. Em uma outra forma de realização específica da 5 invenção um polipeptídeo imunogênico primário e um polipeptídeo imunogênico secundário são os mesmos.
A composição de acordo com a invenção pode conter um polipeptídeo imunogênico primário como o único polipeptídeo imunogênico na composição. Alternativamente a composição de acordo com a invenção IO pode conter mais do que um polipeptídeo imunogênico primário por exemplo, 2 ou 3 ou 4 ou mais polipeptídeos imunogênicos.
A composição de acordo com a invenção pode compreender um vetor adenoviral. Alternativamente a mesma pode compreender mais do que um vetor adenoviral por exemplo, 2 vetores adenovirais.
Nas composições de acordo com a invenção um vetor
adenoviral pode compreender um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo imunogênico secundário ou pode compreender mais do que um polinucleotídeo heterólogo que juntos codificam mais do que um polipeptídeo imunogênico secundário sob o controle de mais do que um promotor.
Assim como para a vacinação profilática, as composições da
invenção também podem ser usadas em indivíduos que já são infectados com patógeno, e resultam no controle imunológico melhorado da infecção estabelecida. Isto é de interesse particular quando o patógeno é o HIY. No caso do HIV, acredita-se que este controle seja obtido pelas células T 25 positivas em CD8 que especificamente reconhecem as células infectadas pelo HIV. Tal resposta de célula T positiva em CD8 é mantida pela presença de células T auxiliares positivas em CD4 específicas do HIV. Portanto, a indução de ambos os tipos de resposta imune é particularmente útil, e pode ser obtida combinando-se composições de vacina diferentes. Uma combinação de uma proteína adjuvantada e um adenovírus recombinante é de interesse particular. Os pacientes infectados com HIV que irão se beneficiar da vacinação descrita acima estão na fase de infecção primária, de latência ou terminal da infecção pelo HTV no momento da vacinação. Os pacientes podem passar ou não por 5 outras intervenções de tratamento terapêutico contra o patógeno (no caso do HIV - por exemplo terapia anti-retroviral altamente ativa) no momento da vacinação.
Antígenos
Os antígenos de uso de acordo com a invenção são derivados de patógenos. Os patógenos incluem vírus, bactérias, protozoários e outros organismos parasíticos nocivos para os mamíferos incluindo o ser humano.
Os antígenos adequados de polipeptídeo a serem administrados como polipeptídeo ou polinucleotídeo que codifica polipeptídeo de acordo com a invenção incluem antígenos derivados do HIV (por exemplo, HIV-1), 15 vírus do herpes humano (tal como gH, gL, gM, gB, gC, gK, gE ou gD ou derivados destes ou proteína Inicial Imediata tal como ICP27, ICP 47, ICP4, ICP36 do HSVl ou HSV2), citomegalovírus, especialmente Humano, (tal como gB ou derivados deste), vírus de Epstein Barr (tal como gp350 ou derivados deste), Vírus Zoster da Varicela (tal como gpl, II, III e IE63), ou de 20 um vírus da hepatite tal como vírus da hepatite B (por exemplo antígeno de superfície da Hepatite B, PreS 1, PreS2 e proteínas env de superfície, antígeno de núcleo da Hepatite B ou pol), vírus da hepatite C (por exemplo, Núcleo, El, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e B) e antígeno do vírus da hepatite E, ou de outros patógenos virais, tais como paramixovírus: Vírus Sincicial 25 Respiratório (tal como proteínas F e G ou derivados destas), ou antígenos do vírus da parainfluenza, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus do papiloma humano (por exemplo HPV6, 11, 16, 18, por exemplo, LI, L2, El, E2, E3, E4, E5, E6, E7), flavivírus (por exemplo, Vírus da febre Amarela, Vírus da Dengue, vírus da encefalite transportada por carrapatos, Vírus da Encefalite Japonesa) ou vírus da Influenza (tal como hemaglutina, nucleoproteína, proteínas NA ou M, ou combinações destas), ou antígenos derivados de patógenos bacterianos tais como Neisseria spp, incluindo N. gonorrhea e N. meningitidis, por exemplo, proteínas de ligação de 5 transferrina, proteínas de ligação de lactoferrina, PiIC, adesinas); S. pyogenes (por exemplo proteínas M ou fragmentos destas, C5A protease, S. agalactiae,
S. mutans; H. ducreyv, Moraxella spp, incluindo M catarrhalis, também conhecida como Branhamella catarrhalis (por exemplo adesinas e invasinas de peso molecular alto e baixo); Bordetella spp, incluindo B. pertussis (por 10 exemplo pertactina, toxina pertussis ou derivados desta, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclase, fimbriae), B. parapertussis e B. bronchiseptica\ Mycobacterium spp., incluindo M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, incluindo L. pneumophila; Escherichia spp, incluindo E. coli enterotóxica (por exemplo 15 fatores de colonização, toxina instável ao calor ou derivados deste, toxina estável ao calor ou derivados deste), E. coli entero-hemorrágica, E. coli enteropatogênica (por exemplo toxina equivalente à toxina shiga ou derivados desta); Vibrio spp, incluindo V cholera (por exemplo toxina da cholera ou derivados desta); Shigella spp, incluindo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; 20 Yersinia spp, incluindo Y. enterocolitica (por exemplo uma proteína Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campilobacter spp, incluindo C. jejuni (por exemplo toxinas, adesinas e invasinas) e E. coli; Salmonella spp, incluindo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., incluindo L. monocytogenes; Helicobacter spp, incluindo H. pilori (por exemplo urease, 25 catalase, toxina vacuolante); Pseudomonas spp, incluindo P. aeruginosa; Staphilococcus spp., incluindo S. aureus, S. epidermidis; Enteroeoecus spp., incluindo E. faecalis, E. faecium\ Clostridium spp., incluindo C. tetani (por exemplo toxina do tétano e derivado deste), C. botulinum (por exemplo toxina botulínica e derivados desta), C. difficile (por exemplo toxinas de clostridium A ou B e derivados desta); Bacillus spp., incluindo B. anthracis (por exemplo toxina botulínica e derivados desta); Corynebacterium spp., incluindo C. diphtheriae (por exemplo toxina da difteria e derivados desta); Borrelia spp., incluindo B. burgdorferi (por exemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por exemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por exemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por exemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., incluindo E. equi e o agente da Erlichiose Granulocítica Humana; Rickettsia spp, incluindo R. riekettsii; Chlamydia spp., incluindo C. traehomatis, C. pneumoniae, C. psittaei; Leptospira spp., incluindo L. interrogans', Treponema spp., incluindo T. pallidum (por exemplo as proteínas de membrana externa rara), T. dentieola, T. hyodysenteriae; ou derivados de parasitas tais como Plasmodium spp., incluindo P. falciparum e P. vivax; Toxoplasma spp., incluindo T. gondii (por exemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluindo E. histolytica; Babesia spp., incluindo B. microti; Trypanosoma spp., incluindo T. eruzi; Giardia spp., incluindo G. Iamblia; leishmania spp., incluindo L. major, Pneumoeystis spp., incluindo P. carinii; Trichomonas spp., incluindo T. vaginalis; Schisostoma spp., incluindo S. mansoni, ou derivados de levedura tais como Candida spp., incluindo C. albieans; Cryptoeoecus spp., incluindo C. neoformans.
Outros antígenos bacterianos incluem antígenos derivados de Streptoeoceus spp, incluindo S. pneumoniae (PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de ligação de colina) e o antígeno de proteína Pneumolysin (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial 25 Patogenesis, 25, 337-342), e derivados destoxificados mutantes destes (WO 90/06951; WO 99/03884). Outros antígenos bacterianos incluem antígenos derivados de Haemophilus spp., incluindo H. influenzae tipo B (por exemplo PRP e conjugados destes), H. influenzae não tipável, por exemplo OMP26, adesinas de alto peso molecular, P5, P6, proteína D e lipoproteína D, e fimbrina e peptídeos derivados de fimbrina (US 5.843.464) ou variantes de cópia múltipla ou proteínas de fusão destas.
Em particular, os métodos ou composições da presente invenção podem ser usados para proteger contra ou tratar distúrbios virais tais 5 como aqueles causados pelo vírus da Hepatite B, vírus da Hepatite C, vírus do papiloma humano, vírus da imunodeficiência humana (HIV), ou vírus simples do herpes; doenças bacterianas tais como aquelas causadas pelo Mycobacterium tubereulosis (TB) ou Chlamydia sp; e infecções protozoáricas tais como a malária.
Deve ser reconhecido que estes estados de doença, patógenos e
antígenos específicos têm sido aludidos apenas por via de exemplo, e não são intencionados a serem limitantes do escopo da presente invenção.
Antígenos TB
O patógeno, por exemplo, pode ser Mycobaeterium
tubereulosis.
Os antígenos exemplares derivados de M. tubereulosis são por exemplo alfa-cristalina (HspX), HBHA, Rvl753, Rv2386, Rv2707, Rv2557, Rv2558, RPFs: Rv0837c, Rvl884c, Rv2389c, Rv2450, Rvl009, aceA (Rv0467), ESAT6, Tb38-1, Ag85A, -B ou -C, MPT 44, MPT59, MPT45, 20 HSP10, HSP65, HSP70, HSP 75, HSP90, PPD 19kDa [Rv3763], PPD, 38kDa [Rv0934]), PstS 1, (Rv0932), SodA (Rv3846), Rv2031c, 16kDa, Ral2, TbH9, Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, DPPD, mTCCl, mTCC2, hTCCl (WO 99/51748) e hTCC2, e especialmente Mtb32a, Ra35, Ral2, DPV, MSL, MTI, Tb38-1, mTCCl, TbH9 (Mtb39a), hTCCl, mTCC2 e DPPD. Os 25 antígenos derivados de M. tubereulosis também incluem proteínas de fusão e variantes destas onde pelo menos dois, ou por exemplo, três polipeptídeos de M. tubereulosis são fundidos em uma proteína maior, tais fusões podem compreender ou consistir de Ral2-TbH9-Ra35, Erdl4-DPV-MTI, DPV-MTIMSL, Erd 14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erdl4-DPV-MTI-MSL, DPV-MTIMSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748), Ral2-Tbh9-Ra35-Ag85B e Ral2-Tbh9-Ra35-mTCC2. Uma seqüência particular Ral2-Tbh9-Ra35 que pode ser mencionada é definida pela SEQ ID No 6 da W02006/117240 junto com variantes em que Ser 704 desta seqüência é mutado para outro que não 5 serina, por exemplo, para Ala, e derivados desta que incorporam um rótulo His de terminal N de um comprimento apropriado (por exemplo, SEQ ID No 2 ou 4 da W02006/117240). Ver também a SEQ ID No 10 que é uma seqüência contendo um M de partida opcional e um rótulo His-His de terminal N opcional (posições 2 e 3) e em que o Ala mutado em relação ao 10 Ser do tipo selvagem está na posição 706.
Antígenos de Chlamvdia
O patógeno, por exemplo, pode ser um Chlamydia sp. por exemplo, C trachomatis.
Os antígenos exemplares derivados de Chlamydia sp por 15 exemplo, C trachomatis são selecionados de CT858, CT089, CT875, MONIP, CT622, PmpD, PmpG e fragmentos deste, SWIB e fragmentos imunogênicos de qualquer um destes (tais como PmpDpd e PmpGpd) e combinações destes. As combinações preferidas de antígenos incluem CT858, CT089 e CT875. As seqüências específicas e combinações que podem ser utilizadas são descritas 20 na W02006/104890.
Antígenos de Plasmodium
O patógeno, por exemplo pode ser um parasita que cause a malária tal como um Plasmodium sp. por exemplo, P falciparum ou P vivax.
Por exemplo, os antígenos derivados de P falciparum incluem 25 a proteína circunsporozoíta (proteína CS), PfEMP-1, antígeno Pfs 16, MSP-1, MSP-3, LSA-1, LSA-3, AMA-I e TRAP. Um antígeno híbrido particular que pode ser mencionado é RTS. RTS é uma proteína híbrida que compreende substancialmente toda a porção de terminal C da proteína circunsporozoíta (CS) de P. falciparum ligada por intermédio de quatro aminoácidos da porção preS2 do antígeno de superfície da Hepatite B ao antígeno de superfície (S) do vírus da hepatite B. Quando expressado em levedura RTS é produzido como uma partícula de lipoproteína, e quando é co-expressado com o antígeno S do HBV produz uma partícula mista conhecida como RTS.S. A 5 estrutura ou RTS e RTS.S são divulgados na WO 93/10152. Antígenos TRAP são descritos na WO 90/01496. Outros antígenos de Plasmodium incluem P. falciparum EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrina, Pf332, STARP, SALSA, PfEXPl5 Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230 e seus análogos em outro Plasmodium spp. Uma forma de realização da presente invenção é 10 uma composição que compreende RTS.S ou proteína CS ou um fragmento deste tal como a porção CS de RTS.S em combinação com um ou mais outros antígenos maláricos que podem ser selecionados por exemplo do grupo que consiste de MSP-1, MSP-3, AMA-1, Pfs 16, LSA-I ou LSA-3. Os antígenos possíveis de P vivax incluem a proteína circunsporozoíta (CS proteína) e a 15 proteína de ligação de antígeno Duffy e fragmentos imunogênicos destas, tais como PvRII (ver por exemplo, a W002/12292).
Assim em uma forma de realização adequada da invenção, os polipeptídeos imunogênicos primários e secundários são selecionados de antígenos derivados de Plasmodium falciparum e/ou Plasmodium vivax.
Por exemplo, os polipeptídeos imunogênicos primários e/ou
secundários são selecionados de antígenos derivados de Plasmodium falciparum e/ou Plasmodium vivax são selecionados de RTS (por exemplo, como RTS.S), proteína circunsporozoíta (CS), MSP-1, MSP-3, AMA-1, LSA
1, LSA-3 e derivados imunogênicos destes ou fragmentos imunogênicos destes.
Um derivado específico que pode ser mencionado é a proteína híbrida conhecida como RTS, especialmente quando apresentada na forma de uma partícula mista conhecida como RTS.S.
Uma seqüência RTS exemplar é mostrada na SEQID No 14. Um antígeno derivado de CS da proteína P. falciparum exemplar é mostrado na SEQ ID No 12. Esta seqüência particular corresponde à seqüência CSP de P. falciparum (cepa 3D7), que também contém uma inserção de 19 aminoácidos que vem da cepa 7G8 (81-100).
Em uma forma de realização específica da invenção, um
polipeptídeo imunogênico primário é RTS.S e um polipeptídeo imunogênico secundário é a proteína CS de Plasmodium falciparum ou um fragmento imunogênico deste.
Antígenos de HPV
O patógeno, por exemplo, pode ser um Vírus do Papiloma
Humano.
Assim os antígenos de uso na presente invenção, por exemplo, pode ser derivado do Vírus do Papiloma Humano (HPV) considerado ser responsável pelas verrugas genitais (HPV 6 ou HPV 11 e outros), e/ou os 15 vírus do HPV responsáveis pelo câncer cervical (HPV 16, HPVl 8, HPV33, HPV51, HPV56, HPV31, HPV45, HPV58, HPV52 e outros). Em uma forma de realização as formas das composições profiláticas, ou terapêuticas, para as verrugas genitais compreendem partículas Ll ou capsômeros, e proteínas de fusão que compreendem um ou mais antígenos selecionados das proteínas do 20 HPV El, E2, E5 E6, E7, Ll e L2. Em uma forma de realização as formas de proteína de fusão são: L2E7 como divulgada na W096/26277, e proteína D (l/3)-E7 divulgada na PCT/EP98/05285.
Uma composição de profilaxia ou terapêutica para a infecção cervical do HPV ou câncer preferida, pode compreender 16 ou 18 antígenos 25 do HPV. Por exemplo, os monômeros de antígeno Ll ou L2, ou antígenos Ll ou L2 apresentados juntos como uma partícula equivalente a vírus (VLP) ou a proteína Ll sozinha apresentada sozinha em uma estrutura de VLP ou capsômero. Tais antígenos, partículas equivalentes a vírus e capsômero são por si conhecidos. Ver por exemplo W094/00152, W094/20137, W094/05792 e W093/02184. As proteínas iniciais adicionais podem ser incluídas sozinhas ou como proteínas de fusão tais como E7, E2 ou preferivelmente E5 por exemplo; particularmente formas de realização preferidas destas incluem um VLP que compreende proteínas de fusão Ll E7 (WO 96/11272). Em uma forma de realização os antígenos de HPV 16 compreendem as proteínas iniciais E6 ou E7 em fusão com um carregador da proteína D para formar as proteínas de fusão D - E6 ou E7 de HPV 16, ou combinações destas; ou combinações de E6 ou E7 com L2 (WO 96/26277). Alternativamente as proteínas iniciais do HPV 16 ou 18 E6 e E7, podem ser IO apresentados em uma única molécula, preferivelmente uma proteína de fusão D- E6/E7. Uma tal composição pode opcionalmente fornecer cada uma ou ambas as proteínas E6 e E7 de HPV 18, preferivelmente na forma de uma proteína de fusão da proteína D - E6 ou proteína D - E7 ou proteína de fusão D E6/E7. Adicionalmente os antígenos de outras cepas do HPV, preferivelmente das cepas HPV 31 ou 33 podem ser utilizados.
Antígenos do HIV
O patógeno, por exemplo, pode ser HIV por exemplo, HIV-1. Assim, os antígenos podem ser selecionados de antígenos derivados do HIV, particularmente antígenos derivados de HIV-1.
As proteínas Tat e Nef do HTV são proteínas iniciais, isto é,
elas são expressadas no início na infecção e na ausência de proteína estrutural.
O gene Nef codifica uma proteína do HIV inicial acessória que foi mostrada possuir diversas atividades. Por exemplo, a proteína Nef é conhecida causar a remoção de CD4, o receptor de HTV, a partir da superfície 25 da célula, embora a importância biológica desta função seja debatida. Adicionalmente Nef interage com o caminho de sinal de células T e induz um estado ativo, que por sua vez pode promover a expressão de gene mais eficiente. Alguns isolados do HIV têm mutações ou deleções nesta região, que fazem com que elas não codifiquem a proteína funcional e são severamente comprometidas na sua replicação e patogênese in vivo.
O gene Gag é traduzido a partir do RNA de tamanho natural para produzir uma poliproteína precursora que é subsequentemente clivado em 3 a 5 proteínas capsídicas; a proteína de matriz pl7, proteína capsídica 5 p24 e proteína de ligação de ácido nucléico (Fundamental Virology, Fields BN, Knipe DM e Howley M 1996 2. Fields Virology vol 2 1996).
O gene Gag dá origem à proteína precursora Gag de 55 quilodalton (Kd), também chamado de p55, que é expressada a partir do mRNA viral não dividido. Durante a tradução, o terminal N de p55 é 10 miristoilado, deflagrando a sua associação com o aspecto citoplásmico de membranas celulares. A poliproteína de Gag associada à membrana recruta duas cópias do RNA genômico viral junto com outras proteínas virais e celulares que deflagram a germinação da partícula viral a partir da superfície de uma célula infectada. Depois da germinação, p55 é clivada pela protease 15 viralmente codificada (um produto do gene Pol) durante o processo de maturação viral em quatro proteínas menores designadas MA (matriz [pl7]), CA (capsídeo [p24]), NC (nucleocapsídeo [p9]), e p6.(4).
Além das 3 proteínas Gag principais (pl7, p24 e p9), todos os precursores de Gag contêm diversas outras regiões, que são clivadas e 20 permanecem no virion como peptídeos de vários tamanhos. Estas proteínas têm papéis diferentes por exemplo, a proteína p2 tem um papel proposto na atividade reguladora da protease e contribui para a regulagem de tempo correta do processamento proteolítico.
O polipeptídeo de MA é derivado da extremidade miristoilada 25 do terminal N de p55. A maioria das moléculas MA permanecem ligadas à superfície interna da bicamada lipídica do virion, estabilizando a partícula. Um subconjunto de MA é recrutado dentro das camadas mais profundas do virion onde ele se toma parte do complexo que acompanha o DNA viral para o núcleo. Estas moléculas MA facilitam o transporte nuclear do genoma viral porque um sinal cariofílico no MA é reconhecido pelo mecanismo de importação nuclear celular. Este fenômeno permite que o HIV infecte as células que não se dividem, uma propriedade inusitada para um retro vírus.
A proteína p24 (CA) forma o núcleo cônico de partículas 5 virais. A ciclofilina A foi demonstrada interagir com a região p24 de p55 levando às sua incorporação em partículas do HIV. A interação entre Gag e ciclofilina A é essencial por causa do rompimento desta interação pela ciclosporina inibe a replicação viral.
A região NC de Gag é responsável pelo reconhecimento 10 específico do chamado sinal de empacotamento do HIV. O sinal de empacotamento consiste de estruturas de quatro alças de haste localizadas próximas à extremidade 5’ do RNA viral, e é suficiente para mediar a incorporação de um RNA heterólogo em virions do HIV-1. NC liga-se ao sinal de empacotamento através das interações mediadas pelos dois motivos 15 de dedo de zinco. NC também facilita a transcrição reversa.
A região de polipeptídeo p6 medeia as interações entre Gag p55 e a proteína acessória Vpr5 levando à incorporação de Vpr em virions de montagem. A região p6 também contém um chamado domínio final que é requerido para a liberação eficiente de virions de germinação de uma célula infectada.
O gene Pol codifica três proteínas tendo as atividades necessárias pelo vírus na infecção inicial, transcriptase reversa RT, protease, e a proteína integrase necessária para a integração de DNA viral no DNA celular. O produto primário de Pol é clivado pela protease do virion para 25 produzir o peptídeo RT de terminal amino que contém as atividades necessárias para a síntese de DNA (DNA polimerase direcionada ao RNA e DNA, ribonuclease H) e proteína integrase de terminal carbóxi. A RT do HIV é um heterodímero de RT de tamanho natural (p66) e um produto de clivagem (p51) que carece do domínio de RNase H de terminal carbóxi. RT é uma das proteínas mais altamente conservadas codificadas pelo genoma retroviral. Duas atividades principais de RT são o DNA Pol e a ribonuclease H. A atividade de DNA Pol de RT usa RNA e DNA como padrões intercambiavelmente e como todas as DNA polimerases 5 conhecidas é incapaz de iniciar a síntese de DNA de novo, mas requer uma molécula pré existente para servir como um preparador (RNA).
A atividade de RNase H inerente em todas as proteínas RT desempenha o papel essencial mais cedo na replicação de remover o genoma de RNA conforme a síntese de DNA se processa. Ela seletivamente degrada o 10 RNA de todas as moléculas híbridas de RNA - DNA. Estruturalmente a polimerase e ribo H ocupam domínios separados, que não se sobrepõem dentro da Pol que abrange os dois terços de amino da Pol.
A subunidade catalítica p66 é dobrada em 5 subdomínios distintos. O terminal amino 23 destes têm a porção com atividade RT. O terminal carbóxi para estes é o domínio RNase H.
Depois da infecção da célula hospedeira, o genoma do RNA retroviral é copiado no DNA de filamento duplo linear pela transcriptase reversa que está presente na partícula infectante. A integrase (revisada em Skalka AM '99 Adv in Virus Res 52 271-273) reconhece as extremidades do 20 DNA viral, as aparam e acompanha o DNA viral a um sítio cromossômico hospedeiro para catalisar a integração. Muitos sítios no DNA hospedeiro podem ser alvos para a integração. Embora a integrase seja suficiente para catalisar a integração in vitro, ela não é a única proteína associada com o DNA viral in vivo - a proteína grande - o complexo de DNA viral isolado das 25 células infectadas foi denotado o complexo de pré integração. Isto facilita a aquisição dos genes da célula hospedeira pelos genomas virais da progênie.
A integrase é composta de 3 domínios distintos, o domínio de terminal N, o núcleo catalítico e o domínio de terminal C. O domínio de núcleo catalítico contém todas as exigências quanto a química de transferência de polinucleotidila.
Os antígenos derivados de HIV-I para nós na invenção pode assim por exemplo ser selecionado de Gag (por exemplo Gag de tamanho natural), pl7 (uma porção de Gag), p24 (uma outra porção de Gag), p41, p40, 5 Pol (por exemplo Pol de tamanho natural), RT (uma porção de Pol), p51 (uma porção de RT), integrase (uma porção de Pol), protease (uma porção de Pol), Env, gpl20, gpl40 ou gpl60, gp41, Nef, Vif, Vpr, Vpu, Rev, Tat e derivados imunogênicos destes e fragmentos imunogênicos destes, particularmente Env, Gag, Nef e Pol e derivados imunogênicos destes e fragmentos imunogênicos 10 destes incluindo pl7, p24, RT e integrase. As vacinas do HIV podem compreender polipeptídeos e/ou polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que correspondem aos antígenos do HIV diferentes múltiplos por exemplo 2 ou 3 ou 4 ou mais antígenos do HIV que podem ser selecionados da lista acima. Vários antígenos diferentes, por exemplo, podem ser compreendidos 15 em uma única proteína de fusão. Mais do que um polipeptídeo imunogênico primário e/ou mais do que um polipeptídeo imunogênico secundário cada um dos quais é um antígeno do HIV ou uma fusão de mais do que um antígeno pode ser utilizada.
Por exemplo um antígeno pode compreender Gag ou um 20 derivado imunogênico ou fragmento imunogênico deste, fundido a RT ou um derivado imunogênico ou fragmento imunogênico deste, fundido a Nef ou um derivado imunogênico ou fragmento imunogênico deste em que a porção Gag da proteína de fusão está presente na extremidade do terminal 5’ do polipeptídeo.
Uma seqüência Gag de uso de acordo com a invenção pode
excluir a seqüência que codifica o polipeptídeo Gag p6. Um exemplo particular de uma seqüência Gag para o uso na invenção compreende seqüências que codificam pl 7 e/ou p24.
Uma seqüência RT pode conter uma mutação para inativar substancialmente qualquer atividade de transcriptase reversa (ver a W003/025003).
O gene RT é um componente do gene pol maior no genoma do HIV. Será entendido que a seqüência RT utilizada de acordo com a invenção 5 pode estar presente no contexto de Pol, ou um fragmento de Pol que corresponde pelo menos ao RT. Tais fragmentos de Pol retêm epítopos CTL principais de Pol. Em um exemplo específico, RT é incluída apenas como o fragmento p51 ou apenas o p66 de RT.
O componente de RT da proteína de fusão ou composição de acordo com a invenção opcionalmente compreende uma mutação para remover um sítio que serve como um sítio de início interno em sistemas de expressão procarióticos.
Opcionalmente a seqüência Nef para o uso na invenção é truncado para remover a seqüência que codifica a região de terminal N isto é, 15 a remoção de 30 a 85 aminoácidos, por exemplo de 60 a 85 aminoácidos, particularmente o terminal N de 65 aminoácidos (a última truncagem é aqui aludida como trNef). Alternativa ou adicionalmente o Nef pode ser modificado para remover o sítio de miristilação. Por exemplo o sítio de miristilação Gly 2 pode ser removido pela deleção ou substituição. 20 Alternativa ou adicionalmente o Nef pode ser modificado para alterar o motivo de dileucina de Leu 174 e Leu 175 pela deleção ou substituição de uma ou ambas as leucinas. A importância do motivo de dileucina na infraregulagem de CD4 é descrita por exemplo, em Bresnahan P. A. et al (1998) Current Biology, 8(22): 1235-8.
O antígeno Env pode estar presente no seu tamanho natural
como gpl60 ou truncado como gpl40 ou mais curto (opcionalmente com uma mutação adequada para destruir o motivo do sítio de clivagem entre gpl20 e gp41). O antígeno de Env também pode estar presente na sua forma processada que ocorre naturalmente como gpl20 e gp41. Estes dois derivados de gplóO podem ser usados individualmente ou juntos como uma combinação. Os antígenos Env anteriormente mencionados podem exibir ainda as deleções (em particular de alças variáveis) e truncagens. Os fragmentos de Env também podem ser usados.
Uma seqüência gpl20 exemplar é mostrada na SEQ ID No 8. Uma seqüência gpl40 exemplar é mostrada na SEQ ID No 6.
Os polipeptídeos imunogênicos de acordo com a invenção podem compreender Gag, Pol, Env e Nef em que pelo menos 75 %, ou pelo menos 90 % ou pelo menos 95 %, por exemplo, 96 % dos epítopos de CTL destes antígenos nativos estão presentes.
Nos polipeptídeos imunogênicos de acordo com a invenção que compreendem pl7/p24 Gag, p66 RT, e Nef truncado como definido acima, 96 % dos epítopos CTL dos antígenos Gag, Pol e Nef nativos estão adequadamente presentes.
Uma forma de realização da invenção fornece um polipeptídeo imunogênico contendo pl7, p24 Gag, p66 RT, Nef truncado (destituído de nucleotídeos que codificam aminoácidos de terminal 1-85 - “trNef”) na ordem Gag, RT, Nef. Nos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos imunogênicos da invenção, adequadamente ο P24 Gag e P66 RT são códons otimizados.
As construções de polinucleotídeo específicas e antígenos de polipeptídeo correspondentes de acordo com a invenção incluem:
1. p 17, p24 (otimizado no códon) Gag - p66 RT (otimizado no códon) - Nef truncado;
2. Nef truncado - p66 RT (otimizado no códon) - pl7, p24 (otimizado no códon) Gag;
3. Nef truncado - pl7, p24 (otimizado no códon) Gag - p66 RT (otimizado no códon);
4. p66 RT (otimizado no códon) - pl7, p24 (otimizado no códon) Gag - Nef truncado;
5. p66 RT (otimizado no códon) - Nef truncado - pl7, p24 (otimizado no códon) Gag;
6. pl7, p24 (otimizado no códon) Gag - Nef truncado - p66 RT (otimizado no códon).
Uma fusão exemplar é uma fusão de Gag, RT e Nef particularmente na ordem Gag-RT-Nef (ver por exemplo, SEQ ID No 2). Uma outra fusão exemplar é uma fusão de pl7, p24, RT e Nef particularmente na ordem p24-RT-Nef-pl7 (ver por exemplo, SEQ ID No 16, aludido em outro lugar aqui como “F4”).
Em uma outra forma de realização um polipeptídeo imunogênico contém Gag, RT, integrase e Nef, especialmente na ordem GagRT-integrase-Nef (ver por exemplo, a SEQ ID No 4).
Em outras formas de realização o antígeno de HIV pode ser 15 um polipeptídeo de fusão que compreende Nef ou um derivado imunogênico deste ou um fragmento imunogênico deste, e pl7 Gag e/ou p24 Gag ou derivados imunogênicos destes ou fragmentos imunogênicos destes, em que quando Gag tanto pl7 quanto p24 estão presentes existe pelo menos um antígeno do HIV ou fragmento imunogênico entre eles.
Por exemplo, Nef é adequadamente Nef de tamanho natural.
Por exemplo pl7 Gag e p24 Gag são adequadamente pl7 e p24 de tamanho natural, respectivamente.
Em uma forma de realização um polipeptídeo imunogênico compreende Gag tanto pl7 quanto p24 ou fragmentos imunogênicos destes. 25 Em uma tal construção o componente p24 Gag e componente pl7 Gag são separados por pelo menos um outro antígeno de HIV ou fragmento imunogênico, tal como Nef e/ou RT ou derivados imunogênicos destes ou fragmentos imunogênicos destes. Ver a W02006/013106 para mais detalhes.
Nas proteínas de fusão que compreendem p24 e RT, pode ser preferível que o p24 preceda a RT na construção porque quando os antígenos são expressados sozinhos na E. coli melhor expressão de p24 do que de RT é observada.
Algumas construções de acordo com a invenção incluem os
seguintes:
1. p24-RT-Nef-pl7 2. p24-RT* -Nef-pl7 3. p24-p51RT-Nef-p 17 4. p24-p51RT* -Nef-p 17 5. p 17-p5 IRT-Nef 6. pl7 - p51 RT* -Nef 7. Nef-pl7 8. Nef - pl7 com ligador 9. pl7 - Nef 10. pl7 - Nef com ligador * representa a mutação Inetionina592 RT para lisina Em um outro aspecto a presente invenção fornece uma proteína de fusão de antígenos HIV que compreendem pelo menos quatro antígenos do HIV ou fragmentos imunogênicos, em que os quatro antígenos 20 ou fragmentos são ou são derivados de Nef5 Pol e Gag. Preferivelmente Gag está presente como dois componentes separados que são separados por pelo menos um outro antígeno na fusão. Preferivelmente o Nef é Nef de tamanho natural. Preferivelmente o Pol é p66 ou p51 RT. Preferivelmente o Gag é pl7 e p24 Gag. Outras características preferidas e propriedades dos componentes 25 de antígeno da fusão neste aspecto da invenção são como aqui descrito.
As formas de realização preferidas deste aspecto da invenção são as quatro fusões componentes como já listadas acima:
1. p24-RT-Nef-p 17
2. p24-RT*-Nef-p 17 3. p24-p5lRT-Nef-pl7
4. ρ24-ρ51RT*-Nef-p17
Os polipeptídeos imunogênicos da presente invenção podem ter seqüências ligadoras presentes entre as seqüências que correspondem aos 5 antígenos particulares tais como Gag, RT e Nef. Tais seqüências ligadoras podem ter, por exemplo até 20 aminoácidos no comprimento. Em um exemplo particular elas podem ser de 1 a 10 aminoácidos, ou de 1 a 6 aminoácidos, por exemplo 4 a 6 aminoácidos.
Outra descrição de tais antígenos HIV adequados podem ser encontrados na W003/025003.
Os antígenos do HTV da presente invenção podem ser derivados de qualquer Clado do HIV, por exemplo Clado A, Clado B ou Clado C. Por exemplo os antígenos do HTV podem ser derivados do Clado A ou B, especialmente B.
Em uma forma de realização específica da invenção, um
polipeptídeo imunogênico primário é um polipeptídeo que compreende Gag e/ou Pol e/ou Nef ou um fragmento ou derivado de qualquer um deles (por exemplo, p24-RT-Nef-pl7). Em uma forma de realização específica da invenção um polipeptídeo imunogênico secundário é um polipeptídeo que 20 compreende Gap e/ou Pol e/ou Nef ou um fragmento ou derivado de qualquer um deles (por exemplo, Gag-RT-Nef ou Gag-RT-integrase-Nef).
Assim em uma forma de realização específica, um polipeptídeo que compreende Gap e/ou Pol e/ou Nef ou um fragmento ou derivado de qualquer um deles (por exemplo, p24-RT-Nef-pl7) é um 25 polipeptídeo imunogênico primário e um polipeptídeo que compreende Gap e/ou Pol e/ou Nef ou um fragmento ou derivado de qualquer um deles (por exemplo, Gag-RT-Nef ou Gag-RT-integrase-Nef) é um polipeptídeo imunogênico secundário.
Em uma outra forma de realização específica da invenção, um polipeptídeo imunogênico primário é Env ou um fragmento ou derivado deste por exemplo, gpl20, gpl40 ou gplóO (especialmente gpl20). Em uma forma de realização específica da invenção um polipeptídeo imunogênico secundário é um polipeptídeo que compreende Gag e/ou Pol e/ou Nef ou um fragmento ou derivado de qualquer um deles (por exemplo, p24-RTNef-pl7).
Assim em uma forma de realização específica, Env ou um fragmento ou derivado deste por exemplo, gpl20, gpl40 ou gpl60 (especialmente gpl20) é um polipeptídeo imunogênico primário e um polipeptídeo que compreende Gag e/ou Pol e/ou Nef ou um fragmento ou 10 derivado de qualquer um deles (por exemplo, p24-RTNef-pl7) é um polipeptídeo imunogênico secundário.
Em uma outra forma de realização específica da invenção, um polipeptídeo imunogênico primário é um polipeptídeo que compreende Gag e/ou Pol e/ou Nef ou um fragmento ou derivado de qualquer um deles (por 15 exemplo, p24-RT-Nef-pl7). Em uma forma de realização específica da invenção um polipeptídeo imunogênico secundário é Env ou um fragmento ou derivado deste por exemplo, gpl20, gpl40 ou gplóO (especialmente gpl20).
Assim em um forma de realização específica, um polipeptídeo que compreende Gag e/ou Pol e/ou Nef ou um fragmento ou derivado de 20 qualquer um deles (por exemplo, p24-RT-Nef-pl7) é um polipeptídeo imunogênico primário e Env ou um fragmento ou derivado deste por exemplo, gpl20, gpl40 ou gplóO (especialmente gpl20) é um polipeptídeo imunogênico secundário.
Derivados imunogênicos e fragmentos imunogênicos de antígenos Os antígenos anteriormente mencionados podem ser utilizados
na forma de derivados imunogênicos ou fragmentos imunogênicos destes ao invés do antígeno inteiro.
Como aqui usado o termo “derivado imunogênico” em relação a um antígeno de origem nativa refere-se a um antígeno que foi modificado em um modo limitado em relação às suas contrapartes nativas. Por exemplo isto pode incluir uma mutação pontual que pode mudar as propriedades da proteína por exemplo, pela melhora da expressão em sistemas procarióticos ou pela remoção da atividade indesejável, por exemplo, atividade enzimática.
Os derivados imunogênicos entretanto serão suficientemente similares aos antígenos nativos tal que eles retenham as suas propriedades antigênicas e permanecem capazes de elevar uma resposta imune contra o antígeno nativo. Se um dado derivado incita ou não uma tal resposta imune pode ser medido por um ensaio adequadamente imunológico tal como um ELISA (para as 10 respostas de anticorpo) ou citometria de fluxo usando tingimento adequado para os marcadores celulares (para respostas celulares).
Fragmentos imunogênicos são fragmentos que codificam pelo menos um epítopo, por exemplo um epítopo CTL, tipicamente um peptídeo de pelo menos 8 aminoácidos. Fragmentos de pelo menos 8, por exemplo 8 a 15 10 aminoácidos ou até 20, 50, 60, 70, 100, 150 ou 200 aminoácidos no comprimento são considerados cair dentro do escopo da invenção contanto que o polipeptídeo demonstre antigenicidade, isto quer dizer que os epítopos principais (por exemplo, epítopos de CTL) são retidos pelo polipeptídeo. Adenovírus
Os vetores adenovirais da presente invenção compreendem um
ou mais polinucleotídeos heterólogos (DNA) que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos.
Os vetores adenovirais de uso na presente invenção podem ser derivados de uma faixa de hospedeiros mamíferos.
Os adenovírus (aqui aludidos como “Ad” ou “Adv”) têm uma
morfologia característica com um capsídeo icosaédrico consistindo de três proteínas principais, hexon (II), penton base (III) e uma fibra nodosa (IV), junto com várias outras proteínas menores, VI, VIII, IX, IIIa e IVa2 (Russell W. C. 2000, Gen Viriol, 81: 2573-2604). O genoma viral é um DNA linear, de filamento duplo com uma proteína de terminal ligada covalentemente ao término 5’, que têm repetições de terminal invertida (ITRs). O DNA viral está intimamente associado com a proteína VII altamente básica e um peptídeo pequeno chamado de mu. Uma outra proteína, V, é empacotada com este 5 complexo de proteína de DNA e fornece uma ligação estrutural ao capsídeo por intermédio da proteína VI. O vírus também contém uma protease codificada por vírus, que é necessária para o processamento de algumas das proteínas estruturais para produzir vírus infecciosos maduros.
Mais de 100 sorotipos distintos de adenovírus foram isolados 10 que infectam várias espécies de mamífero, 51 dos quais são de origem humana. Assim um ou mais dos vetores adenovirais podem ser derivados de um adenovírus humano. Os exemplos de tais adenovírus derivados de ser humano são Adi, Ad2, Ad4, Ad5, Ad6, AdlI, Ad 24, Ad34, Ad35, particularmente Ad5, Adll e Ad35. Os sorotipos humanos foram 15 categorizados em seis subgêneros (A-F) com base em vários critérios biológicos, químicos, imunológicos e estruturais.
Embora vetores com base em Ad5 tenham sido usados extensivamente em vários testes de terapia de gene, pode haver limitações sobre o uso de Ad5 e outros vetores adenovirais do grupo C devido à 20 imunidade pré existente na população geral devido à infecção natural. Ad5 e outros membros do grupo C tendem a estar entre os sorotipos mais soroprevalecente. A imunidade aos vetores existentes pode se desenvolver como um resultado da exposição ao vetor durante o tratamento. Estes tipos de imunidade pré existente ou desenvolvida aos vetores soroprevalecentes pode 25 limitar a eficácia da terapia de gene ou esforços de vacinação. Os sorotipos de adenovírus alternativos, assim constituem alvos muito importantes na busca de sistemas de liberação de gene capazes de evitar a resposta imune do hospedeiro.
Uma tal área de sorotipos alternativos são aqueles derivados de primatas não humanos, especialmente adenovírus de chimpanzé. Ver a Patente US 6.083.716 que descreve o genoma de dois adenovírus de chimpanzé.
Foi mostrado que os vetores adenovirais de chimpanzé (“Pan” ou “C”) induzem respostas imunes fortes aos produtos de transgene tão eficientemente quanto os vetores adenovirais humanos (Fitzgerald et al. J. Immunol. 170: 1416).
Os adenovírus de primata não humano podem ser isolados dos linfonodos mesentéricos de chimpanzé. Os adenovírus de chimpanzé são 10 suficientemente similares ao adenovírus humano subtipo C para permitir a replicação de vírus El deletado em células HEK 293. Contudo os adenovírus de chimpanzé são filogeneticamente distintos dos sorotipos humanos mais comuns (Ad2 e Ad5). Pan 6 é menos intimamente relacionado e é sorologicamente distinto dos Pans 5, 7 e 9.
Assim um ou mais dos vetores adenovirais podem ser
derivados de um adenovírus de primata não humano por exemplo, um adenovírus de chimpanzé tal como um selecionado dos sorotipos Pan5, Pan6, Pan7 e Pan9.
Os vetores adenovirais também podem ser derivados de mais 20 do que um sorotipo de adenovírus, e cada sorotipo pode ser da mesma fonte ou diferente. Por exemplo eles podem ser derivados de mais do que um sorotipo humano e/ou mais do que um sorotipo de primata não humano. Os métodos para construir vetores adenovirais quiméricos são divulgados na W02005/001103.
Existem certas restrições de tamanho associadas com a
inserção de DNA heterólogo no adenovírus. Adenovírus humanos têm a capacidade de empacotar até 105 % do comprimento do genoma do tipo selvagem (Bett et al 1993, J Virol 67 (10), 5911-21). O limite de empacotamento mais baixo para adenovírus humanos foi mostrado ser de 75 % do comprimento do genoma do tipo selvagem (Parks et al 1995, J Virol 71(4), 3293-8).
Um exemplo de adenovírus de uso na presente invenção são adenovírus que são distintos dos sorotipos que ocorrem naturalmente 5 prevalecente na população humana tal como Ad2 e Ad5. Isto evita a indução de respostas imunes potentes contra o vetor que limita a eficácia de administrações subsequentes do mesmo sorotipo pelo bloqueio da captação do vetor através do anticorpo de neutralização e toxicidade influenciadora.
Assim, o adenovírus pode ser um adenovírus que não é um 10 sorotipo de vírus humano que ocorre naturalmente prevalecente. O adenovírus isolado de animais têm capsídeo, hexon, penton e componentes de fibra imunologicamente distintos mas são de modo filogenético intimamente relacionados. Especificamente, o vírus pode ser um adenovírus não humano, tal como um adenovírus símio e em particular um adenovírus de chimpanzé 15 tal como Pan 5, 6, 7 ou 9. Os exemplos de tais cepas são descritos na W003/000283 e são disponíveis da American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, e outras fontes. As cepas de adenovírus de chimpanzé desejáveis são Pan 5 [ATCC VR-591], Pan 6 [ATCC VR-592], e Pan 7 [ATCC VR-593].
O uso de adenovírus de chimpanzé é considerado ser vantajoso
em relação ao uso de sorotipos de adenovírus humanos por causa da falta de imunidade pré existente, em particular a falta de anticorpos de neutralização cruzada, para o adenovírus na população alvo. A reação cruzada do adenovírus de chimpanzé com respostas de anticorpo de neutralização pré25 existentes está apenas presente em 2 % da população alvo comparada com 35 % no caso de certos vetores de adenovírus humano candidatos. Os adenovírus de chimpanzé são distintos dos subtipos humanos mais comuns Ad2 e Ad5, mas são mais intimamente relacionados ao Ad4 humano do subgrupo E, que não é um subtipo prevalecente. Pan 6 é menos intimamente relacionado com Pan 5, 7 e 9.
O adenovírus da invenção pode ser defeituoso em replicação. Isto significa que o mesmo tem uma capacidade reduzida para replicar em células não complementares, comparado com o vírus do tipo selvagem. Isto 5 pode ser realizado pela mutação do vírus por exemplo, pela deleção de um gene envolvido na replicação, por exemplo deleção do gene Ela, Elb, E3 ou E4.
Os vetores adenovirais de acordo com a presente invenção pode ser derivado de adenovírus defeituoso em replicação que compreende uma deleção de El funcional. Assim os vetores adenovirais de acordo com a invenção podem ser defeituosos em replicação devido à ausência da capacidade para expressar Ela e Elb adenovirais, isto é, são funcionalmente deletados emElaeElb. O adenovírus recombinante também pode carregar deleções funcionais em outros genes [ver a WO 03/000283] por exemplo, deleções nos genes E3 ou E4. O gene E3 inicial demorado do adenovírus pode ser eliminado da seqüência de adenovírus que forma parte do vírus recombinante. A função de E3 não é necessária para a produção da partícula de adenovírus recombinante. Assim, é desnecessário substituir a função deste produto de gene de modo a empacotar um adenovírus recombinante útil na invenção. Em uma forma de realização particular o adenovírus recombinante tem os genes El e E3 funcionalmente deletados. A construção de tais vetores é descrita em Roy et al., Human Gene Therapy 15: 519-530, 2004.
O adenovírus recombinante também pode ser construído tendo uma deleção funcional do gene E4, embora possa ser desejável reter a função 25 E4 ORF6. Os vetores de adenovírus de acordo com a invenção também podem conter uma deleção no gene inicial demorado E2a. As deleções também podem ser feitas em qualquer um dos últimos genes de Ll a L5 do genoma do adenovírus. Similarmente as deleções nos genes intermediários IX e IVa podem ser úteis. Outras deleções podem ser feitas nos outros genes de adenovírus estruturais ou não estruturais. As deleções acima podem ser usadas individualmente, isto é, uma seqüência de adenovírus para o uso na presente invenção pode conter deleções apenas de El. Alternativamente, as 5 deleções de genes inteiros ou porções destes eficazes para destruir a sua atividade biológica podem ser usadas em qualquer combinação. Por exemplo em um vetor exemplar, as seqüências de adenovírus podem ter deleções dos genes El e do gene E4, ou dos genes El, E2a e E3, ou dos genes El e E3 (tais como as deleções funcionais em Ela e Elb, e uma deleção de pelo menos 10 parte de E3), ou dos genes El, E2a e E4, com ou sem deleção de E3 e assim por diante. Tais deleções podem ser parciais ou deleções completas destes genes e podem ser usadas em combinação com outras mutações, tais como mutações sensíveis à temperatura para se obter um resultado desejado.
Os vetores adenovirais podem ser produzidos em qualquer linhagem de célula adequada em que o vírus é capaz de replicação. Em particular, linhagens de célula de complementação que fornecem os fatores perdidos do vetor viral que resulta nas suas características de replicação prejudicada (tal como El e/ou E4) podem ser usadas. Sem limitação, uma tal linhagem de célula pode ser de células HeLa [Acesso ATCC Ns CCL 2], A549 [Acesso ATCC No. CCL 185], HEK 293, KB [CCL 17], Detroit [por exemplo, Detroit 510, CCL 72] e WI-38 [CCL 75], entre outras. Estas linhagens de célula são todas disponíveis da American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209. Outras linhagens de célula precursoras adequadas podem ser obtidas de outras fontes, tais como células PER.C6©, como representadas pelas células depositadas sob ECACC no. 96022940 na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) no Centre for Applied Microbiology and Research (CAMR, UK) ou células Her 96 (Crucell).
As seqüências de polinucleotídeo que codificam polipeptídeos imunogênicos podem ser otimizadas no códon para as células de mamífero. Tal otimização no códon é descrita em detalhes na W005/025614. A otimização de códon para certas seqüências do HIV é descrita ainda na WO 03/025003.
5 Em uma forma de realização da presente invenção as
construções de polinucleotídeo compreendem uma seqüência líder de terminal N. A seqüência de sinal, domínio de transmembrana e domínio citoplásmico são individualmente todos opcionalmente presentes ou deletados. Em uma forma de realização da presente invenção todas estas regiões estão presentes mas modificadas.
Um promotor para o uso no vetor adenoviral de acordo com a invenção pode ser o promotor do gene IE de HCMV, por exemplo em que a região não traduzida 5’ do gene IE de HCMV que compreende o exon 1 é incluída e o intron A é completa ou parcialmente excluída como descrito na WO 02/36792.
Quando vários antígenos são fundidos em uma proteína de fusão, tal proteína seria codificada por um polinucleotídeo sob o controle de um único promotor.
Em uma forma de realização alternativa da invenção, vários 20 antígenos podem ser expressados separadamente através de promotores individuais, cada um dos ditos promotores pode ser o mesmo ou diferente. Já em uma outra forma de realização da invenção alguns dos antígenos podem formar uma fusão, ligado a um primeiro promotor e outro(s) antígeno(s) pode(m) estar ligado(s) a um segundo promotor, que pode ser o mesmo ou 25 diferente do primeiro promotor.
Assim, o vetor adenoviral pode compreender um ou mais cassetes de expressão cada um dos quais codificam um antígeno sob o controle de um promotor. Alternativa ou adicionalmente o mesmo pode compreender um ou mais cassetes de expressão cada um dos quais codificam mais do que um antígeno sob o controle de um promotor, antígenos estes que são desse modo expressados como uma fusão. Cada cassete de expressão pode estar presente em mais do que um local no vetor adenoviral.
O polinucleotídeo ou polinucleotídeos que codificam polipeptídeos imunogênicos a serem expressados podem ser inseridos em qualquer uma das regiões deletadas no adenovírus, por exemplo na região deletada El.
Embora dois ou mais polinucleotídeos que codificam polipeptídeos imunogênicos possam ser ligados como uma fusão, a proteína 10 resultante pode ser expressada como uma proteína de fusão, ou a mesma pode ser expressada como produtos de proteína separadas, ou a mesma pode ser expressada como uma proteína de fusão e depois subsequentemente quebrada em subunidades menores.
Adiuvante
Os adjuvantes são descritos no geral em Vaccine Design - the
Subunit and Adjuvant Approach eg Powell and Newman, Plenum Press, Nova Iorque, 1995.
Os adjuvantes adequados incluem um sal de alumínio tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, mas também podem ser um sal de cálcio, ferro ou zinco, ou podem ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada, ou açúcares acilados, polissacarídeos, ou polifosfazenos catiônica ou anionicamente derivados.
Na formulação da invenção é preferido que a composição de adjuvante preferencialmente induza uma resposta Thl. Entretanto será entendido que outras respostas, incluindo outras respostas humorais, não sejam excluídas.
É conhecido que certos adjuvantes de vacina são particularmente apropriados para a estimulação de Thl ou Th2 - respostas tipo citocina. Tradicionalmente os melhores indicadores do equilíbrio Thl:Th2 da resposta imune depois de uma vacinação ou infecção inclui a medição direta da produção das citocinas Thl ou Th2 pelos linfócitos T in vitro depois da re-estimulação com antígeno, e/ou a medição da razão de IgGl :IgG2a de respostas de anticorpo específicas de antígeno.
Assim, um adjuvante tipo Thl é um que estimula populações
de célula T isoladas para produzir altos níveis de citocinas tipo Thl in vivo (como medido no soro) ou ex vivo (citocinas que são medidas quando as células são re-estimuladas com antígeno in vitro), e induz respostas de imunoglobulina específicas de antígeno associadas com isotipo tipo Thl.
Os imunoestimulantes tipo Thl preferidos que podem ser
formulados para produzir adjuvantes adequados para o uso na presente invenção incluem e não são restritos aos seguintes:
O ligando 4 do receptor equivalente a Toll (TLR), especialmente um agonista tal como um derivado de lipídeo A particularmente monofosforil lipídeo A ou mais particularmente monofosforil lipídeo A 3 Desacilado (3 D - MPL).
3 D-MPL é vendido sob a marca MPL® pela GlaxoSmithKline e primariamente promove as respostas de célula T CD4+ caracterizadas pela produção de IFN-g (células Thl isto é, células auxiliares T 20 CD4 com um fenótipo tipo I). O mesmo pode ser produzido de acordo com os métodos divulgados na GB 2 220 211 A. Quimicamente o mesmo é uma mistura de monofosforil lipídeo A 3-desacilado com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Preferivelmente nas composições da presente invenção 3 D-MPL de partícula pequena é usado. O 3 D-MPL de partícula pequena tem um tamanho 25 de partícula tal que o mesmo possa ser filtrado estéril através de um filtro de
0,22 μηι. Tais preparações são descritas no Pedido de Patente Internacional N2 W094/21292. Os derivados sintéticos de lipídeo A são conhecidos e considerados ser agonistas de TLR 4 incluindo, mas não limitados a:
OM174 (2-desóxi-6-o-[2-desóxi-2-[(R)-3-dodecanoilóxitetradecanoilamino]-4-o-fosfono-P-D-glicopiranosil]-2-[(R)-3-hidróxitetradecanoilammo]-a-D-glicopiranosildiidrogenofosfato), (WO 95/14026)
OM294 DP (3S, 9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10- 5 diol, 1,10-bis(diidrogenofosfato) (W099/64301 e W000/0462)
OM197 MP-Ac DP (3S, 9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino] decan-1,10- diol,l-diidrogenofosfato 10-(6-amino-hexanoato) (WO 01/46127)
Outros ligandos de TLR4 que podem ser usados são alquil 10 glicosaminida fosfatos (AGPs) tais como aqueles divulgados na W09850399 ou US6303347 (processos para a preparação de AGPs também são divulgados), ou sais farmaceuticamente aceitáveis de AGPs como divulgado na US6764840. Alguns AGPs são agonistas de TLR4, e alguns são antagonistas de TLR4. Ambos são considerados ser úteis como adjuvantes.
As saponinas também são imunoestimulantes de Thl
preferidos de acordo com a invenção. As saponinas são adjuvantes bem conhecidos e são divulgados em: Lacaille-Dubois, M e Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386). Por exemplo, Quil A (derivado da casca da 20 árvore sul americana Quillaja Saponaria Molina), e frações desta, são descritas na US 5.057.540 e “Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55; e EP 0 362 279 BI. As saponinas hemolíticas QS21 e QS17 (as frações purificadas na HPLC de Quil A) foram descritas como adjuvantes sistêmicos potentes, e o método de sua 25 produção é divulgado na Patente US N2 5.057.540 e EP 0 362 279 BI. Também descrito nestas referências está o uso de QS7 (uma fração não hemolítica de Quil-A) que atua como um adjuvante potente para as vacinas sistêmicas. O uso de QS21 é descrito ainda em Kensil et al. (1991. J. Immunology vol 146, 431-437). As combinações de QS21 e polissorbato ou ciclodextrina também são conhecidas (WO 99/10008). Os sistemas de adjuvante particulado que compreendem frações de QuilA, tais como QS21 e QS7 são descritos na WO 96/33739 e WO 96/11711. Um tal sistema é conhecido como um Iscom e pode conter uma ou mais saponinas.
5 O adjuvante da presente invenção em particular pode
compreender um ligando 4 de receptor equivalente a Toll (TLR)5 especialmente 3D-MPL, em combinação com uma saponina.
Outros adjuvantes adequados incluem ligandos TLR 9 (agonistas). Assim um outro imunoestimulante preferido é um 10 oligonucleotídeo imunoestimulador contendo dinucleotídeos CpG não metilados (“CpG”). CpG é uma abreviação para os motivos de dinucleotídeo citosina-guanosina presentes no DNA. CpG é conhecido na técnica como sendo um adjuvante quando administrado tanto pela via sistêmica quanto mucósica (WO 96/02555, EP 468520, Davis et al., J. Immunol, 1998, 160(2): 15 870-876; McCluskie e Davis, J. Immunol., 1998, 161(9): 4463-6). Historicamente, foi observado que a fração de DNA de BCG exerceria um efeito antitumor. Em estudos adicionais, oligonucleotídeos sintéticos derivados de seqüências do gene BCG foram mostrados serem capazes de induzir efeitos imunoestimulatórios (tanto in vitro quanto in vivo). Os autores 20 destes estudos concluíram que certas seqüências palindrômicas, incluindo um motivo CG central, conteve esta atividade. O papel central do motivo CG na imunoestimulação foi mais tarde elucidado em uma publicação por Krieg, Nature 374, p546 1995. A análise detalhada tem mostrado que o motivo CG tem que estar em um certo contexto de seqüência, e que tais seqüências são 25 comuns no DNA bacteriano mas são raros em DNA de vertebrado. A seqüência imunoestimulatória é frequentemente: Purina, Purina, C, G, pirimidina, pirimidina; em que o motivo CG não é metilado, mas outras seqüências CpG não metiladas são conhecidas ser imunoestimulatórias e podem ser usadas na presente invenção. Em certas combinações dos seis nucleotídeos uma seqüência palindrômica está presente. Diversos destes motivos, como repetições de um motivo ou uma combinação de motivos diferentes, podem estar presentes no mesmo oligonucleotídeo. A presença de uma ou mais destas seqüências 5 imunoestimulatórias contendo oligonucleotídeos pode ativar vários subconjuntos imunes, incluindo células matadoras naturais (que produzem interferon γ e têm atividade citolítica) e macrófagos (Wooldrige et al Vol 89 (no. 8), 1977). Outras seqüências contendo CpG não metilado não tendo esta seqüência de consenso também foram agora mostrados ser 10 imunomodulatórias.
CpG quando formulado em vacinas, é no geral administrado em solução livre junto com antígeno livre (WO 96/02555; McCluskie e Davis, supra) ou covalentemente conjugado a um antígeno (WO 98/16247), ou formulado com um carregador tal como hidróxido de alumínio ((antígeno de 15 superfície da Hepatite) Davis et al. supra; Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8).
Outros agonistas de TLR9 de interesse potencial incluem motivo CpR imunoestimulatório contendo oligonucleotídeos e oligonucleotídeos contendo motivo YpG (Idera).
Tais imunoestimulantes como descrito acima podem ser
formulados juntos com carregadores, tais como por exemplo lipossomas, emulsões de óleo em água e ou sais metálicos, incluindo sais de alumínio (tais como hidróxido de alumínio). Por exemplo, 3D-MPL pode ser formulado com hidróxido de alumínio (EP 0 689 454) ou emulsões de óleo em água (WO 25 95/17210); QS21 pode ser vantajosamente formulado com lipossomas contendo colesterol (WO 96/33739), emulsões de óleo em água (WO 95/17210) ou alume (WO 98/15287); CpG podem ser formulados com alume (Davis et al, supra; Brazolot-Millan supra) ou com outros carregadores catiônicos. As combinações de imunoestimulantes também são preferidos, em particular uma combinação de um monofosforil lipídeo A e um derivado de saponina (WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241), mais particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL como divulgada na WO 94/00153. Alternativamente, uma combinação de CpG mais uma saponina tal como QS21 também forma um adjuvante potente para o uso na presente invenção. Alternativamente a saponina pode ser formulada em um lipossoma ou em um Iscom e combinado com um oligonucleotídeo imunoestimulatório.
Assim, os sistemas de adjuvante adequados incluem, por exemplo, uma combinação de monofosforil lipídeo A, preferivelmente 3DMPL, junto com um sal de alumínio (por exemplo, como descrito na WO00/23105).
Um sistema realçado envolve a combinação de um monofosforil lipídeo A e um derivado de saponina particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL como divulgado na WO 94/00153, ou uma composição menos reatogênica onde o QS21 é extinto em lipossomas contendo colesterol (DQ) como divulgado na WO 96/33739. Esta combinação pode adicionalmente compreender um oligonucleotídeo imunoestimulatório.
Assim um adjuvante de exemplo compreende QS21 e/ou MPL
e/ou CpG.
Uma formulação de adjuvante particularmente potente envolvendo QS21, 3D-MPL & tocoferol em uma emulsão de óleo em água é descrita na WO 95/17210 e é uma outra formulação preferida para o uso na invenção.
Uma outra formulação preferida compreende um oligonucleotídeo de CpG sozinho ou junto com um sal de alumínio.
Em um outro aspecto da presente invenção é fornecido um método de fabricação de uma formulação de vacina como aqui descrita, em que o método compreende misturar um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários de acordo com a invenção com um adjuvante adequado.
Os adjuvantes particularmente preferidos para o uso nas formulações de acordo com a invenção são como segue:
i) 3D-MPL + QS21 em um lipossoma (ver por exemplo, Adjuvante B abaixo)
ii) Alume + 3D-MPL
iii) Alume + QS21 em um lipossoma + 3D-MPL
iv) Alume + CpG
v) 3D-MPL + QS21 + emulsão de óleo em água
vi) CpG
vii) 3D-MPL + QS21 (por exemplo, em um lipossoma) + CpG
viii) QS21+ CpG.
Preferivelmente, o adjuvante é apresentado na forma de um lipossoma, ISCOM ou uma emulsão de óleo em água. Em uma forma de realização de exemplo da invenção o adjuvante compreende uma emulsão de óleo em água. em uma outra forma de realização de exemplo da invenção o adjuvante compreende lipossomas.
Adequadamente o componente de adjuvante não contêm nenhum vírus. Assim adequadamente, as composições para o uso de acordo com a invenção não contém nenhum vírus outro que não o um ou mais vetores adenovirais que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários derivados de um patógeno.
Composições, dosagem e administração
Nos métodos da invenção, o(s) polipeptídeo(s) imunogênico(s), o(s) vetor(es) adenoviral(is) e o adjuvante são administrados concomitantemente.
Tipicamente o adjuvante será co-formulado com um polipeptídeo imunogênico. Adequadamente o adjuvante também será coformulado com qualquer outro polipeptídeo imunogênico a ser administrado.
Assim em uma forma de realização da invenção é fornecido um método para elevar uma resposta imune que compreende administrar (i) 5 um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários co-formulados com um adjuvante; e (ii) um ou mais vetores adenovirais que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários; em que um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários e adjuvante e um ou mais vetores adenovirais são administrados IO concomitantemente.
Por “co-formulados” é intencionado que os polipeptídeos imunogênicos primários e o adjuvante estejam contidos dentro da mesma composição por exemplo, uma composição farmacêutica.
Tipicamente o vetor adenoviral está contido em uma composição por exemplo, uma composição farmacêutica.
Alternativamente, o um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários, o um ou mais vetores adenovirais e um adjuvante são coformulados.
Assim, são fornecidas composições de acordo com a invenção que compreendem um ou mais polipeptídeos imunogênicos, um ou mais vetores adenovirais e um adjuvante.
As composições e métodos de acordo com a invenção podem envolver o uso de mais do que um polipeptídeo imunogênico e/ou mais do que um vetor adenoviral. O uso de antígenos múltiplos é especialmente 25 vantajoso em incitar respostas imunes protetoras para certos patógenos, tais como o HIV, M. tuberculosis e Plasmodium sp. As composições de acordo com a invenção podem compreender mais do que um adjuvante.
As composições e métodos utilizados de acordo com a invenção tipicamente podem compreender um carregador por exemplo, um carregador tamponado aquoso. Os componentes protetores tais como açúcares podem ser incluídos.
As composições devem ser administradas em quantidades suficientes para transduzir as células alvo e fornecer níveis suficientes de 5 transferência e expressão de gene e para permitir que respostas imunes específicas de patógeno se desenvolvam para desse modo fornecer um benefício profilático ou terapêutico sem efeitos fisiológicos adversos indevidos ou com efeitos fisiológicos medicamente aceitáveis, que podem ser determinados por aqueles habilitados nas técnicas médicas. As vias 10 convencionais e farmaceuticamente aceitáveis de administração incluem, mas não são limitadas à liberação direta à retina e outros métodos de liberação intraocular, liberação direta ao fígado, inalação, intranasal, intravenosa, intramuscular, intratraqueal, subcutânea, intradérmica, epidérmica, retal, oral e outras vias parenterais de administração. As vias de administração podem 15 ser combinadas, se desejado, ou ajustadas dependendo do produto de gene ou da condição. A via de administração primariamente dependerá da natureza da condição a ser tratada. Mais adequadamente a via é intramuscular, intradérmica ou epidérmica.
Os tecidos preferidos para alvejar são músculo, pele e membranas mucósicas. A pele e as membranas mucósicas são os sítios fisiológicos onde a maioria dos antígenos infecciosos são normalmente encontrados.
Quando os polipeptídeos imunogênicos primários, adjuvante e vetor adenoviral não são co-formulados, as formulações diferentes (por exemplo, as formulações de polipeptídeo/adjuvante e vetor adenoviral) podem ser administradas pela mesma via de administração ou pelas vias diferentes de administração.
As dosagens de composições nos métodos dependerão primariamente de fatores tais como a condição que é tratada, a idade, peso e saúde do paciente e pode assim variar entre os pacientes. Por exemplo, uma dosagem humana ou veterinária adulta terapeuticamente eficaz está no geral na faixa de cerca de 100 μΐ a cerca de 100 ml de um carregador contendo concentrações de cerca de 1 x IO6 a cerca de 1 x IO15 partículas, de cerca de 1 5 x IO11 a 1 x IO13 partículas, ou de cerca de 1 x IO9 a Ix IO12 partículas de vírus junto com em tomo de 1 a 1000 μg, ou cerca de 2 a 100 μg por exemplo, em tomo de 4 a 40 μg de polipeptídeo imunogênico. As dosagens variarão dependendo do tamanho do animal e da via de administração. Por exemplo, uma dosagem humana ou veterinária adequada (para um animal de cerca de
80 kg) para a injeção intramuscular está na faixa de cerca de 1 x IO9 a cerca 12
de 5 x 10 partículas virais e 4 a 40 μg de proteína por ml, para um único local. Uma pessoa de habilidade na técnica pode ajustar estas doses, dependendo da via de administração e a aplicação terapêutica ou vacinai para a qual a composição é utilizada.
A quantidade de adjuvante dependerá da natureza do adjuvante
e do polipeptídeo imunogênico, da condição que é tratada e da idade, peso e saúde do paciente. Tipicamente para a administração humana uma quantidade de adjuvante de 1 a 100 μg por exemplo, 10 a 50 μg por dose podem ser adequados.
Adequadamente uma resposta imune adequada é obtida por
uma administração única concomitante da composição ou composições da invenção nos métodos da invenção. Entretanto se a resposta imune é ainda realçada pela administração de uma outra dose de polipeptídeos imunogênicos primários, adjuvante e vetor adenoviral em uma segunda ocasião ou
subsequente (por exemplo depois de um mês ou dois meses) então um tal protocolo é abrangido pela invenção.
Foi verificado que boas respostas de célula T CD4+ e/ou CD8+ específicas de patógeno podem ser tipicamente incitadas depois de uma única administração concomitante da composição ou composições da invenção nos métodos da invenção. Entretanto foi verificado que boas respostas de anticorpo específicas de patógeno podem requerer uma segunda administração ou adicional concomitante da composição ou composições da invenção.
Os componentes da invenção podem ser combinados ou
formulados com qualquer excipiente farmacêutico adequado tal como água, tampões e outros.
Exemplos
Preparações Adjuvantes I) A preparação de emulsão de óleo em água seguiu o protocolo como apresentado na WO 95/17210.
A emulsão contém: 42,72 mg/ml de esqualeno, 47,44 mg/ml de tocoferol, 19,4 mg/ml de Tween 80. As gotícuias de óleo resultantes têm um tamanho de aproximadamente 180 nm Tween 80 foi dissolvido em solução salina tamponada com
fosfato (PBS) para dar uma solução a 2 % no PB S. Fornecendo 100 ml duas vezes concentrado, emulsão 5 g de DL alfa tocoferol e 5 ml de esqualeno foram turbilhonados até completamente misturados. 90 ml de solução de PBS/Tween foram adicionados e completamente misturados, a emulsão 20 resultante foi depois passada através de uma seringa e finalmente microfluidizada pelo uso de uma máquina Ml 10S microfluidics. As gotículas de óleo resultantes têm um tamanho de aproximadamente 180 nm
2) Preparação de emulsão de óleo em água com QS21 e MPL
A emulsão volumosa estéril foi adicionada ao PBS para atingir 25 uma concentração final de 500 μΐ de emulsão por ml (v/v). 3 D-MPL foi depois adicionado. QS21 foi depois adicionado entre cada adição de componente, o produto intermediário foi agitado por 5 minutos. Quinze minutos mais tarde, o pH foi checado e ajustado se necessário a 6,8 +/- 0,1 com NaOH ou HCl. A concentração final de 3D-MPL e QS21 foi 100 μg por ml para cada um.
3) Preparação de MPL lipossômico
Uma mistura de lipídeo (tal como fosfatidilcolina da gema do ovo ou sintética) e colesterol e 3 D-MPL em solvente orgânico, foi secada sob 5 vácuo (ou alternativamente sob uma corrente de gás inerte). Uma solução aquosa (tal como solução salina tamponada com fosfato) foi depois adicionada e o vaso agitado até que todos os lipídeo estivessem em suspensão. Esta suspensão foi depois microfluidizada até que o tamanho do lipossoma fosse reduzido a cerca de 100 nm e depois filtrado estéril através de um filtro 10 de 0,2 μηι. A extrusão ou sonificação poderia substituir esta etapa.
Tipicamente a razão de colesterol:fosfatidilcolina foi de 1:4 (p/p) e a solução aquosa foi adicionada para dar uma concentração de colesterol final de 10 mg/ml.
A concentração final de MPL é de 2 mg/ml.
Os lipossomas têm um tamanho de aproximadamente 100 nm
e são aludidos como SUV (para vesículas unilamelares pequenas). Os lipossomas por si só são estáveis com o tempo e não têm nenhuma capacidade fusogênica.
4. Preparação de Adjuvante B (“adj B”)
O volume estéril de SUV foi adicionado a PB S. A composição
em PBS foi Na2HPO4: 9 mM; KH2PO4: 48 mM; NaCl: 100 mM pH 6,1. QS21 em solução aquosa foi adicionado a SUV. A concentração final de 3D-MPL e QS21 foi de 100 μg por ml para cada um. Esta mistura é aludida como Adjuvante B. Entre cada adição de componente, o produto intermediário foi 25 agitado por 5 minutos. O pH foi checado e ajustado se necessário a 6,1 +/- 0,1 com NaOH ou HCl.
Preparação da proteína p24-RT-Nef-P17 f“F4”)
F4 foi preparada como descrito na W02006/013106 Exemplo
1, método otimizado em códon. Preparação de adenovírus de Chimpanzé Pan7 contendo o transgene Gag-RTNeff“Pan7GRN”)
Construção de plasmídeos Gag, RT, Nef.
Plasmídeo p73i-Tgm
A seqüência completa do inserto de plasmídeo Tgm é dado na SEQ ID No Iea construção de plasmídeo mostrada graficamente na Fig 1. Esta contém pl7 p24 (otimizado no códon) Gag, p66 RT (otimizado no códon e inativado) e Nef truncado.
O plasmídeo P73i-Tgm foi preparado como descrito na W003/025003 Exemplos 1 a 13.
Construção do Adenovírus Pan 7 deletado em E1/E3
O Adenovírus Pan 7 deletado em E1/E3 foi preparado como descrito na W02006/120034 Exemplo 1.
Outros sorotipos de vetores podem ser construídos em um modo similar. Uma descrição completa da construção das deleções El, E3 e E4 neste e outros sorotipos de Adenovírus Pan é dada na W003/0046124. Informação adicional também está disponível em Human Gene Therapy 15: 519-530.
Inserção de seqüências Gag, RT, Nef no Adenovírus
Usando o plasmídeo P73i-Tgm, o cassete de expressão GRN foi inserido no adenovírus Pan 7 deletado em E1/E3 para produzir C7-GRNc como descrito na W02006/120034 Exemplo 3. C7-GRNc é o componente de adenovírus Pan7GRN usado nos exemplos aqui apresentados.
Exemplo 1
Estudo de imunogenicidade em camundongos imunizados com componente de adenovírus (Pan7GRN) e componente de proteína (F4/adiuvante B) separadamente ou tanto com o componente de adenovírus quanto de proteína co-formulados juntos
A cepa de camundongo usada foi a CB6F1 e 3 camundongos foram usados por ponto de tempo. Para a imunização com F4/adjuvante B (P),
1/10 da dose humana foi injetada isto é, 9 μg de proteína F4 em 50 μΐ de
* 8
adjuvante B. Para imunização com Pan7GRN (a), 10 x 10 partículas virais
em 50 μΐ de solução salina (solução em água para injeção a 0,9 % de NaCl) foi usado. O adenovírus de chimpanzé Pan7GRN carrega os genes que codificam Gag (G), RT (R) e Nef (N).
O programa de vacinação foi como segue:
Grupo Dia 0 Dia 21 Dia 42 Dia 63 1 - - F4/adj B F4/adi B 2 Pan7GRN Pan7GRN 3 F4/ adj B F4/adj B Pan7GRN Pan7GRN 4 Pan7GRN Pan7GRN F4/adj B F4/adj B 5 - - - F4/adj B/ Pan7GRN 6 - - F4/adj B/ F4/adj B/ Pan7GRN Pan7GRN 7 - - adi B adj B 8 - - - Assim pode ser observado que nos grupos 1 e 2, os
camundongos foram imunizados com 2 injeções de proteína (PP) ou 10 adenovírus (AA), respectivamente. Os camundongos dos grupos 3 e 4, receberam um programa de preparação-reforço convencional: proteína depois adenovírus (PPAA) ou o outro caminho mais longo (AAPP) considerando que nos grupos 5 e 6, os camundongos receberam uma ou duas injeções de uma combinação (combo) de proteína e adenovírus juntos de acordo com a 15 invenção. Os camundongos do grupo 7 apenas receberam controle de adjuvante considerando que os camundongos do grupo 6 foram ingênuos.
As seguintes leituras foram realizadas:
As respostas de anticorpo (ELISA realizado nos soros de cada um dos animais individuais de cada grupo):
- resposta de anticorpo contra F4 (Figura 4)
- resposta de anticorpo contra componentes F4 p24, RT, Nef e p 17 (Figura 5 a 8)
Respostas celulares (Figuras 2 a 3): - medidas pela citometria de fluxo a seguir do tingimento de superfície e citocina intracelular depois da re-estimulação durante a noite de células do baço com grupos de peptídeos de p24, RT, Nef ou pl7. As células do baço de 3 camundongos por ponto no tempo e por grupo foram reunidos para a análise.
Para os grupos 1 e 2, as amostras foram coletadas para medição 21 dias depois da imunização final correspondente. Para os grupos remanescentes, as medições foram coletadas 21 dias, 56 dias e 112 dias depois da imunização final correspondente.
Resultados:
Os resultados são mostrados nas Figuras 2 a 8.
Os rótulos do eixo X correspondem como segue:
PP - Grupo 1 animais a seguir da segunda imunização AA - Grupo 2 animais a seguir da segunda imunização PPAA - Grupo 3 animais a seguir da quarta imunização
AAPP - Grupo 4 animais a seguir da quarta imunização Combo - Grupo 5 animais a seguir da imunização Combo x 2 - Grupo 6 animais a seguir da segunda imunização Os pontos de tempo de medição (21, 56 ou 112 dias após a última imunização) são indicados em parênteses.
Respostas Celulares (Figura 2-3):
Nos pontos de tempo analisados, os dados mostram que as respostas de célula T CD4+ foram observadas principalmente contra p24, RT e Nef.
Como mostrado nas Figuras 2a e 2b (painéis esquerdos), 21
dias após a última imunização, as respostas de célula T CD4+ mais altas são observadas com duas imunizações de adenovírus seguida por duas imunizações de proteína/adjuvante (animais do Grupo 4). Uma injeção da combinação de adenovírus/proteína/adjuvante induz níveis de célula T CD4+ mais altos do que as duas injeções de proteína/ adjuvante a seguir da reestimulação com peptídeos p24, RT ou Nef.
Para a re-estimulação por RT e Nef, duas imunizações com a combinação de adenovírus/proteína/adjuvante induz uma resposta de célula T 5 CD4+ levemente mais alta do que com uma imunização com a combinação, considerando que as respostas com uma ou duas imunizações foram idênticas para p24.
Nos pontos de tempo analisados, as respostas de célula T CD8+ são principalmente observadas contra os peptídeos p24 e RT e nenhum 10 número significante de células T CD8+ específicas para Nef ou pl7 foi detectado. Como mostrado nas Figuras 2a e 2b (painéis da direita), 21 dias após a última imunização respostas de célula T CD8+ foram similares depois de uma ou duas imunizações com a combinação de adenovírus/proteína/ adjuvante. A resposta de CD8 contra p24 observada nos grupos imunizados 15 (i) duas vezes com adenovírus ou (ii) duas vezes com adenovírus seguidas por duas vezes com proteína ou (iii) uma vez ou duas com a combinação de adenovírus/proteína/adjuvante foram comparáveis entre si e levemente mais baixa do que a uma do grupo imunizado duas vezes com a proteína seguidas por duas vezes com adenovírus. A resposta de CD8 contra RT observada nos 20 grupos imunizados uma vez ou duas vezes com a combinação de adenovírus/proteína/adjuvante foram comparáveis e levemente mais baixas do que uma dos grupos imunizados (i) duas vezes com adenovírus ou (ii) duas vezes com adenovírus seguidas por duas vezes com proteína ou (iii) duas vezes com proteína seguida por duas vezes com adenovírus.
As respostas de célula T CD4 e CD8 foram também analisadas
nos últimos pontos de tempo (56 e 112 dias após a última imunização), quando a persistência das respostas podem ser determinadas (Figuras 3a e 3b). As respostas CD4 (Fig 3a e 3b, painéis da esquerda) são principalmente observadas contra p24, RT e Nef. Nestes pontos de tempo, as respostas CD4 mais altas são observadas nos animais imunizados duas vezes com adenovírus seguidas por duas vezes com proteína. A resposta CD4 em camundongos imunizados uma vez ou duas vezes com a combinação de adenovírus/proteína/ adjuvante foram comparáveis entre si e no geral mais 5 altas do que a resposta observada nos grupos imunizados duas vezes com a proteína seguidas por duas vezes com adenovírus.
Nos últimos pontos de tempo, a resposta CD8 contra p24 é a mais alta no grupo imunizado uma vez com a combinação de adenovírus/proteína/adjuvante (Fig 3b, painel direito). É comparável com 10 aquele dos animais imunizados duas vezes com proteína seguidas por duas vezes com adenovírus e levemente mais altas do que aquela dos animais imunizados (i) duas vezes com a combinação de adenovírus/proteína/ adjuvante ou (ii) duas vezes com adenovírus seguidas por duas vezes com proteína. Os últimos dois são comparáveis entre si. A resposta CD8 contra RT 15 é a mais alta e similar nos grupos imunizados (i) duas vezes com a combinação de adenovírus/ proteína/adjuvante ou (ii) duas vezes com adenovírus seguido por duas vezes com proteína. A resposta CD8 contra RT de grupos imunizados (i) duas vezes com a combinação de adenovírus/proteína/adjuvante ou (ii) duas vezes com proteína seguida por
duas vezes com adenovírus foi levemente mais baixa mas comparáveis entre si (Figura 3). Como mostrado na figura 3a (painel direito), nenhum número significante de células T CD8+ específicas para Nef ou pl7 foram detectadas. Respostas de anticorpo:
Como mostrado nas Figuras 4 a 8, as respostas de anticorpo detectadas são principalmente direcionadas contra p24 (Fig 5), RT (Fig 6) e Nef (Fig 8). A resposta anti-F4 (Fig 4) no geral imita a resposta observada contra cada um dos componentes p24, RT ou Nef e pode ser caracterizada como segue:
- Baixa para nenhuma resposta de anticorpo é detectada nos grupos imunizados (i) duas vezes com adenovírus ou (ii) uma vez com a combinação de adenovírus/proteína/adjuvante;
- As respostas de anticorpo mais altas usualmente detectadas no grupo imunizado duas vezes com a proteína em 21 dias após a imunização.
Entretanto, também é neste grupo que a variabilidade mais alta entre indivíduos é observada. Além disso, para a sorologia anti-Nef, o grupo imunizado duas vezes com adenovírus seguido por duas vezes com proteína parece demonstrar a resposta mais alta, quando comparada aos outros grupos;
- A resposta observada nos grupos imunizados (i) duas vezes com a combinação de adenovírus/proteína/adjuvante ou (ii) duas vezes com
proteína seguidas por duas vezes com adenovírus ou (iii) duas vezes com adenovírus seguidas por duas vezes com a proteína são comparáveis, pico em
21 dias após a última imunização e depois levemente diminuído com o tempo.
As respostas de anticorpo contra pl7 (Fig 7) foram muito baixas a indetectáveis em todos os grupos.
Conclusão:
Globalmente, a resposta imune mediada por célula específica de antígeno mais alta é observada no grupo de tratamento AAPP depois de 4 imunizações. Entretanto, quando da comparação de grupos depois de 2 20 imunizações (isto é, os grupos AA, PP e 2xcombo), a indução de respostas de célula T tanto de CD4 quanto de CD8 específicas de antígeno é observada apenas no grupo imunizado duas vezes com a combinação de proteína/adenovírus/adjuvante. Além disso, níveis similares de respostas de célula T CD4 e CD8 podem ser atingidos depois de uma única injeção da 25 combinação de proteína/ adenovírus/adjuvante. além disso, em termos de persistência, as respostas de célula T específicas de antígeno observadas 112 dias depois da 2a imunização com a combinação de proteína/adenovírus/ adjuvante são comparáveis àquelas observadas 112 dias depois da 4a imunização no grupo de tratamento com AAPP. Finalmente, parece que 2 imunizações com a combinação de proteína/adenovírus/ adjuvante são necessárias para se obter uma resposta de anticorpo comparável com aquela obtida no grupo imunizado duas vezes com a proteína adjuvantada, grupo que forneceu as respostas de anticorpo mais altas no geral.
Exemplo 2
Estudo de imunogenicidade em camundongos imunizados com adenovírus Pan7GRN e proteína F4/adiuvante B co-formulados juntos
A cepa de camundongo usada foi CB6F1 com 9 camundongos por grupo. Os camundongos foram imunizados uma vez com uma coformulação da proteína F4 (1/10 da dose humana foi injetada isto é, 9 μg)
Q
junto com 10x10 partículas virais de Pan7GRN, em 50 μΐ de adjuvante B ou uma diluição do último (1/2, 1/4 ou 1/10). As respostas celulares CD4 e CD8 contra um grupo de peptídeos Nef, pl7, p24 ou RT foram determinadas 21 dias após a imunização (3 grupos de 3 baços para cada grupo).
A leitura a seguir foi realizada:
Respostas celulares (Figura 9):
- medida pela citometria de fluxo a seguir do tingimento de superfície e citocina intracelular depois da re-estimulação durante a noite de células do baço com grupos de peptídeos de p24, RT, Nef ou pl7. As células do baço foram agrupadas (3 agrupamentos de 3 baços por grupo) para a análise.
Resultados:
Os resultados mostrados na Figura 9 representam as respostas celulares observadas depois da re-estimulação com um grupo de peptídeos p24 ou RT.
Os rótulos do eixo dos X correspondem como segue:
Adj B - Camundongos imunizados com 9 μg de F4/ 108vpPan7GRN/ adjuvante B não diluído
1/2 Adj B- Camundongos imunizados com 9 μg de F4/108vpPan7 GRN/ adjuvante B diluído
1/2 1/4 Adj B - Camundongos imunizados com 9 μg de F4/ 108vpPan7 GRN/ adjuvante B diluído
1/4 1/10 Adj B - Camundongos imunizado com 9 μg de F4/ 5 108vpPan7GRN/ adjuvante B diluído
1/10 Ingênuo - camundongos ingênuos (nenhuma imunização) Os resultados indicam que as respostas CD4 (Figura 9, painel esquerdo) e CD8 (Figura 9, painel direito) são principalmente observadas contra p24 e RT, com a resposta de célula T CD8 específica para RT sendo mais baixa do que a específica para p24. Além disso, os resultados indicam que as respostas CD4 contra p24 e RT em 21 dias após as imunizações nos grupos imunizados com o adjuvante B não diluído ou uma diluição 1/2 deste são similares. Estas respostas CD4 tendem a diminuir quando o adjuvante é diluído 1/4. Quando o adjuvante B é diluído em 1/10, as respostas CD4 observadas são similares àquelas de grupos imunizados com a diluição 1/4 do adjuvante B. As respostas anti-CD8 contra p24 são comparáveis se o adjuvante é diluído 1/2 ou não. Entretanto, a resposta diminui quando o adjuvante B é diluído 1/4 e ainda mais se o mesmo é diluído 1/10. Ao contrário, tais tendências não são observadas para as respostas CD8 anti-RT onde não há um efeito de faixa de dose real da dose de adjuvante usada. Conclusão:
As células CD4+ e células CD8+ contra componentes F4 foram induzidas por uma única administração de uma composição contendo um polipeptídeo imunogênico, um vetor adenoviral contendo um 25 polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo imunogênico e um adjuvante, ainda quando o último foi diluído. O impacto da diluição de adjuvante diferiu dependendo das respostas de CD4 ou CD8 específicas de antígeno de interesse. Em particular as respostas observadas foram contra p24 e o CD4 anti-p24 e as respostas de célula T CD8 mostram um efeito de faixa de dose que se correlaciona com a dose de adjuvante usada na vacina de combinação. Embora o mesmo efeito possa ser observado para a resposta de célula T CD4 anti-RT, o efeito de faixa de dose da dose de adjuvante usada no combo é menos evidente para as resposta de célula T CD8 anti-RT.
Finalmente, se forem consideradas as respostas de célula T CD4 e CD8 específica e a soma das respostas contra os 4 antígenos, uma faixa de dose pode ser observada.
Exemplo 3:
Estudo de imunogenicidade em coelhos brancos New Zealand imunizados com Pan7GRN ou F4/adjuvante B seqüencialmente ou componentes tanto de adenovírus quanto de proteína co-formulados juntos
Para a imunização com F4/adjuvante B, a dose humana foi injetada isto é, 90 μg de proteína F4 em 500 μΐ de adjuvante B. Para a imunização com Pan7GRN, 10 x IO10 ou 10 x IO12 partículas virais em 500 μΐ 15 de solução salina foram usadas. Para a imunização com os componentes tanto de adenovírus quanto de proteína co-formulados juntos, 90 μg de proteína F4, 10 x IO11 partículas virais de Pan7 GRN em 500 μΐ de adjuvante B foram usados.
O programa de vacinação foi como segue:
Grupo Dia 0 Dia 14 Dia 126 1 F4/ adj B F4/ adj B F4/adj B 2 Pan7GRN 10Λ10 Pan7GRN 10A10 3 Pan7GRN 10A12 Pan7GRN 10A12 4 F4/adj B/ F4/adj B/ F4/adj B/ Pan7GRN 10Λ11 Pan7GRN 10Λ11 Pan7GRN 10*11 Haviam 3 coelhos por grupo exceto para o grupo 1 que incluiu
apenas 2 coelhos.
As leituras a seguir foram realizadas:
As respostas de anticorpo (ELISA realizada nos soros de cada animal individual de cada grupo):
- resposta de anticorpo contra F4
- resposta de anticorpo contra os componentes de F4 p24, RT, Nefe ρ17
Respostas linfoproliferativas:
A linfoproliferação foi determinada pela captação de timidina tritiada pelas células mononucleares de sangue periférico (isoladas do sangue integral depois de um gradiente de densidade) reestimuladas in vitro com grupos de peptídeos Nef, pl7, p24 e/ou RT por 88 horas na presença de timidina tritiada durante as últimas 16 horas da incubação.
Resultados:
Resposta linfoproliferativa:
Como mostrado na Figura 10, as respostas linfoproliferativas
mais altas são observadas no grupo imunizado duas vezes com proteína. A resposta linfoproliferativa de animais imunizados duas vezes com a combinação de adenovírus/proteína/ adjuvante foi observada em todos os coelhos do grupo. Esta realmente deu pico depois de uma injeção e pôde ser 15 ainda evocados (em níveis similares do que depois da Ia injeção) a seguir de uma terceira injeção da combinação de adenovírus/proteína/adjuvante, sugerindo que as primeiras duas injeções não induzem uma resposta de neutralização que inibiria qualquer resposta a uma outra injeção similar. Nesta intensidade, a resposta proliferativa observada em coelhos imunizados com a 20 combinação de adenovírus/proteína/adjuvante foi comparável àquela
I O
observada em animais imunizados uma vez ou duas vezes com 10 partículas virais de adenovírus e pareceram mais altas do que aquela de animais imunizados uma vez ou duas vezes com IO10 partículas virais de adenovírus. De modo geral, isto sugere que usar a combinação de 25 adenovírus/proteína/adjuvante poderia diminuir a dose de adenovírus a ser usada. Finalmente, depois de uma terceira injeção da combinação de adenovírus/proteína/adjuvante, a resposta observada no grupo 4 foi similar àquela de animais imunizados 3 vezes com a proteína (grupo 1).
Sorologia: Como mostrado na Figura 11, a cinética da resposta de anticorpo anti-F4 observada nos animais imunizados duas vezes com a combinação de adenovírus/proteína/adjuvante é similar àquela de animais imunizados duas vezes com a proteína: a mesma já é detectada em 7 dias após 5 a 2a injeção e depois diminui com o tempo. Entretanto, em termos de intensidade, a resposta anti-F4 de animais imunizados duas vezes com a combinação de adenovírus/proteína/ adjuvante permanece mais alta nos últimos pontos de tempo (21 e 63 dias após a 2a imunização) quando comparada com a resposta anti-F4 de animais imunizados duas vezes com a 10 proteína. Nenhuma resposta de anticorpo anti-F4 é observada em coelhos imunizados uma vez com IO10 partículas virais de adenovírus. Em coelhos
1 λ
imunizados uma vez com 10 partículas virais de adenovírus, uma resposta anti-F4 é detectada apenas em 21 e 63 dias após a imunização. Neste grupo, a alta variabilidade da resposta observada no ponto de tempo de 63 dias após a 15 imunização (d77) resulta de um único animal (dos 3) que demonstra títulos mais altos contra os diferentes componentes F4, especialmente p24 e RT como mostrado nas Figuras 12a e 12b respectivamente. A resposta de anticorpo anti-F4 é principalmente composta de anticorpos que alvejam p24 e RT e em um grau muito maior Nef e pl7.
Conclusão:
As respostas linfoproliferativas e de anticorpo poderiam ser induzidas em coelho depois de duas injeções de uma composição contendo um polipeptídeo imunogênico, um vetor adenoviral contendo um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo imunogênico e um 25 adjuvante. Além disso, se tem evidência de que uma resposta linfoproliferativa pode ser evocada depois de uma terceira injeção de tal composição. Finalmente, a melhor resposta de anticorpo (em intensidade e persistência) é observada com a combinação de adenovírus/proteína/ adj uvante. Exemplo 4 Imunogenicidade de F4 (otimizada em códonVadiuvante B e C7-GRN quando administrados como uma combinação em camundongos CB6F1.
Planejamento Experimental
Os camundongos CB6F1 foram imunizados duas vezes (dias O e 21) com as combinações diferentes listadas abaixo. F4co/ adjuvante B foi usada a 9 μg de F4co/animal em 50 μΐ de Adjuvante B (1/10 da dose humana) e o vírus C7-GRN a IO8 partículas virais/ animal. F4co no Exemplo 4 é F4 preparado como descrito na W02006/013106 Exemplo 1, método otimizado no códon.
Combinações
C7-GRN
C7-GRN/ adjuvante B C7-GRN/F4co
C7-GRN/F4co/ adjuvante B F4co F4co/ adjuvante B adjuvante B C7 vazio
C7vazio/ adjuvante B C7vazio/F4co C7vazio/F4col adjuvante B Programa de imunizações e análise de resposta imune
As imunizações foram realizadas no dia 0 e dia 21. O tingimento de citocina intracelular (ICS) foi realizado a 21 dias, 28 dias (7 dias após a imunização 2), 42 dias (21 dias após a imunização 2) e 77 dias (56 dias após a imunização 2).
Resultados
Respostas de célula T CD4 específica de HIV
Os resultados são mostrados nas seguintes figuras: Figura 13. Quantificação de Células T CD4 específicas do HIV-1. A % de células T CD3 CD4 que secretam IFN-γ e/ou IL-2 é representada para cada protocolo de imunização em quatro pontos de tempo. Os linfócitos de sangue periférico (PBLs) foram estimulados ex vivo (2 horas antes da adição da Brefeldin depois durante a noite) com uma reunião de peptídeos que abrangem a seqüência F4 e a produção de citocina foi medida por ICS. Cada valor é a média geométrica de 5 grupos de 3 camundongos. Figura 14. Distribuição da frequência de Células T CD4 específicas de F4 7 dias depois das duas imunizações.
A frequência de células T CD4 circulantes específicas de F4 em 7 dias depois das duas imunizações é representada para cada protocolo. Cada ponto representa o valor obtido para um grupo de 3 camundongos.
Figura 15. Produção de citocina de células T CD4 específicas de F4 7 dias depois das duas imunizações.
A % de células T CD4 específicas de F4 que secretam IL-2 e/ou IFN-γ é representada para 5 grupos de 3 camundongos. Os resultados para a imunização com F4co/ adjuvante B (a), F4co/ adjuvante B /C7 vazio (B) e F4co/ adjuvante B /C7-GRN (C) são apresentados.
A frequência de células T CD4 circulantes específicas de F4 atinge 2,82 % 21 dias depois das duas imunizações com a combinação de F4co/ adjuvante B e declina para 0,91 % 56 dias após a imunização (Figura 13). Duas doses do vírus C7-GRN sozinho resulta em 0,52 % das células T CD4 circulantes específicas de F4 21 dias após a última imunização e a presença do adjuvante B não altera esta resposta.
A presença do vetor Cl vazio ou do vírus C7-GRN recombinante além da mistura F4co/ adjuvante B não aumenta nem interfere com a frequência da resposta de célula T CD4 específica de F4 (3,58 % e 2,82 % respectivamente, 21 dias após a última imunização). Mesmo se nenhuma análise estatística foi realizada, a distribuição da população sugere que a intensidade das respostas de célula T CD4 específicas de F4 não é diferente entre os três protocolos F4co/ adjuvante B, F4co/ adjuvante B /C7 vazio e F4co/ adjuvante B /C7-GRN (Figura 14).
Como esperado, a administração do F4co sem adjuvante B não induz células T CD4 específicas de F4 significantes.
O perfil da produção de citocina mostra que depois da imunização com F4co/ adjuvante B, as células T CD4 específicas de F4 secretam tanto IFN-γ quanto IL-2. A adição de C7 vazio ou C7-GRN no protocolo de imunização não altera este perfil.
Como um resultado, estes dados sugerem que a maior resposta
de célula T CD4 específica de F4 é obtida depois da imunização com a combinação de F4co/ adjuvante B e que a presença do vírus C7-GRN não melhora nem altera esta resposta.
Respostas de célula T CD8 específica de antígeno Os resultados são mostrados nas seguintes figuras
Figura 16. Quantificação de Células T CD8 específicas do HIV-1.
A % de células T CD8 CD3 que secretam IFN-γ e/ou IL-2 é reapresentada para cada protocolo de imunização em quatro pontos de tempo. Os linfócitos de sangue periférico (PBLs) foram estimulados ex vivo (2 horas 20 antes da adição de Brefeldin depois durante a noite) com um grupo de peptídeos que abrangem F4 e a produção de citocina foi medida pelo ICS. Cada valor é a média geométrica de 5 grupos de 3 camundongos.
Figura 17. Produção de citocina de células T CD8 específicas de F4 7 dias depois das duas imunizações.
A % de células T CD8 específicas de F4 que secretam IL-2
e/ou IFN-γ é representada por 5 grupos de 3 camundongos. Os resultados para a imunização com C7-GRN (a), C7-GRN/ adjuvante B (B) e C7-GRN+F4co/ adjuvante B (C) são apresentados.
Depois de uma injeção, o vetor recombinante C7-GRN induz uma alta frequência de células T CD8 circulantes específicas de F4 (9,70 % de células T CD8 totais, 21 dias após a imunização) (Figura 4). Uma segunda injeção não reforça a resposta de célula T CD8 específica de F4. A combinação de F4co/ adjuvante B induz células T CD8 específicas de F4 5 baixas a indetectáveis e adicionar esta combinação ao C7-GRN não melhora ou prejudica a resposta de célula T CD8 específico de F4.
A resposta de célula T CD8 específica de F4 é retardada quando o adjuvante B é adicionado ao C7-GRN, mas atinge o mesmo nível como com o C7-GRN sozinho ou a combinação C7-GRN/F4co/ adjuvante B em 21 dias após a segunda imunização.
As células T CD8 específicas de F4 principalmente secretam IFN-γ se o vetor C7-GRN é injetado sozinho ou em combinação com F4co/ adjuvante B (Figura 17).
De maneira interessante, a resposta de célula T CD8 específica de F4 persiste até 56 dias após a última imunização sem declinar, sugerindo que o vetor C7 evoca células T CD8 alta e persistente.
Conclusão
A vacina de F4co/adjuvante B induz uma alta frequência de células T CD4 específicas de HtV poli-funcional mas nenhuma célula T CD8 20 específica do HIV em camundongos CB6F1. No mesmo modelo de animal, o adenovírus recombinante C7 que expressa Gag, RT e Nef (Ad C7-GRN) induz uma resposta de célula T CD8 específica de antígeno alta e células T CD4 específica de antígeno baixa a indetectável. Uma combinação de F4/ adjuvante B e Ad C7-GRN evoca célula T tanto de CD4 quanto de CD8 25 específico de antígeno ao mesmo tempo. Uma combinação de três componentes, F4co, adjuvante B e C7-GRN evoca os níveis mais altos de células T tanto de CD4 quanto de CD8 específico de antígeno ao mesmo tempo. A combinação de F4/ adjuvante B e Ad C7-GRN tem um efeito aditivo concernente à intensidade de ambos os ramos da resposta imune celular. O efeito da resposta de célula T CD4 específica de antígeno sobre a funcionalidade da resposta de célula T CD8 específica de antígeno permanece para ser determinada neste modelo.
Exemplo 5
Imunogenicidade do chimpadenovírus Cl que expressam a construção CS2 da proteína CSP de Plasmodium falciparum (C1-CS2) quando administrado sozinho
Planejamento Experimental:
Camundongos CB6F1 foram imunizados uma vez 10 intramuscularmente com uma faixa de dose (IO10, IO9 & IO8 partículas virais) do chimpadenovírus Cl que expressam o antígeno da malária CSP e as respostas de célula T CD4 e CD8 (terminal C e terminal N) específicas de CSP foram determinadas 21, 28 e 35 dias após a injeção pelo ICS (Tingimento de Citocina Intra-Celular).
Respostas de célula T CD4 específicas de CSP
Os resultados são mostrados nas figuras a seguir:
Figura 18. Quantificação de células T CD4 específicas de CSP.
A % de células T CD4 que secreta IFN-γ e/ou IL-2 é representada para cada protocolo de imunização em três pontos de tempo. Os 20 linfócitos de sangue periférico (PBLs) foram estimulados ex vivo (2 horas antes da adição do Brefeldin depois durante a noite) com um grupo de peptídeos que abrangem as seqüências de terminal N de CSP ou de terminal C de CSP e a produção de citocina foi medida por ICS. As respostas para os grupos de peptídeo de o terminal C e terminal N foram adicionados e cada 25 valor é a média de 5 grupos de 4 camundongos.
Figura 19. Quantificação de células T CD8 específicas de CSP.
A % de células T CD8 que secretam IFN-γ e/ou IL-2 é representada para cada protocolo de imunização em três pontos de tempo. Os linfócitos de sangue periférico (PBLs) foram estimulados ex vivo (2 horas antes da adição do Brefeldin depois durante a noite) com um grupo de peptídeos que abrangem as seqüências de terminal N de CSP ou terminal C de CSP e a produção de citocina foi medida por ICS. As respostas para os grupos de peptídeo de terminal C e de terminal N foram adicionados e cada valor é a média de 5 grupos de 4 camundongos.
Estes resultados indicam que tanto a dose de IO10 quanto a de IO9 de C7-CS2 evocou níveis similares de respostas de célula T CD4 específicas de CSP (pico 0,5 %) e níveis similares de respostas de célula T CD8 específicas de CSP (pico 8 %). A dose de IO10 de C7-CS2 foi escolhida 10 em experimentos subsequentes onde a imunogenicidade de C7-CS2 em combinação com RTS.S foi testada (ver abaixo).
Exemplo 6
Imunogenicidade de C7-CS2 e RTS,S quando administrados como uma combinação em camundongos CB6F1 Planejamento Experimental:
Os camundongos CB6F1 foram imunizados três vezes intramuscularmente (dia 0, 14 & 28) com uma combinação do candidato à vacina contra a malária RTS,S (5 μg) em 50 μΐ de Adjuvante B (aludido como P-PP nas figuras abaixo) ou uma combinação de RTS5S (5 μg) e C7-CS2 (1010 20 partículas virais) em 50 μΐ de Adjuvante B (aludido como C-C-C nas figuras abaixo). As respostas de célula T CD4 e CD8 (terminal C e terminal N) específicas de CSP foram determinadas nos seguintes pontos de tempo:
- 7 dias após 2 imunizações
- 7, 21, 35 e 49 dias após 3 imunizações
As respostas de célula T específicas de CSP foram
determinadas pelo ICS (Tingimento de Citocina Intracelular).
As respostas de anticorpo específicas de CSP nos soros de animais imunizados também foram determinadas pelo ELISA em 14 e 42 dias após a 3a imunização. Respostas de célula T CD4 específicas de CSP Os resultados são mostrados nas figuras a seguir:
Figura 20. Quantificação de células T CD4 específicas de CSP fterminal N).
A % de células T CD4 que secretam IFN-γ e/ou TL-2 é representada para cada protocolo de imunização em cinco pontos de tempo. Linfócitos de sangue periférico (PBLs) foram estimulados ex vivo (2 horas antes da adição do Brefeldin depois durante a noite) com um grupo de peptídeos que abrangem a seqüência de terminal N de CSP e a produção de citocina (IFNg e/ou IL-2) foi medida pelo ICS. Cada valor é a média de 4 grupos de 7 camundongos.
Figura 21. Quantificação de células T CD4 específicas de CSP (terminal Q.
A % de células T CD4 que secretam IFN-γ e/ou IL-2 é representada para cada protocolo de imunização em cinco pontos de tempo. Linfócitos de sangue periférico (PBLs) foram estimulados ex vivo (2 horas antes da adição do Brefeldin depois durante a noite) com um grupo de peptídeos que abrangem a seqüência de terminal C de CSP e a produção de citocina (IFNg e/ou IL-2) foi medida pelo ICS. Cada valor é a média de 4 grupos de 7 camundongos.
Estes resultados indicam que camundongos imunizados com 3 injeções da combinação [RTS5S + C7-CS2 IO10 + Adjuvante B] demonstram respostas de célula T CD4 específicas de antígeno mais altas (tanto contra a parte do terminal C quanto do terminal N de CSP) do que os camundongos imunizados com 3 injeções de RTS5S + Adjuvante B.
Respostas de célula T CD8 específicas de CSP
Os resultados são mostrados nas figuras a seguir:
Figura 22. Quantificação de células T CD8 específicas de CSP (terminal N).
A % de células T CD8 que secretam IFN-γ e/ou IL-2 é representada para cada protocolo de imunização em cinco pontos de tempo. Linfócitos de sangue periférico (PBLs) foram estimulados ex vivo (2 horas antes da adição do Brefeldin depois durante a noite) com um grupo de peptídeos que abrangem a seqüência do terminal N de CSP e a produção de citocina (IFNg e/ou IL-2) foi medida pelo ICS. Cada valor é a média de 4 grupos de 7 camundongos.
Figura 23. Quantificação de células T CD8 específicas de CSP (terminal C).
A % de células T CD8 que secretam IFN-7 e/ou IL-2 é representada para cada protocolo de imunização em cinco pontos de tempo. Linfócitos de sangue periférico (PBLs) foram estimulados ex vivo (2 horas antes da adição do Brefeldin depois durante a noite) com um grupo de 10 peptídeos que abrangem a seqüência de terminal C de CSP e a produção de citocina (IFNg e/ou IL-2) foi medida pelo ICS. Cada valor é a média de 4 grupos de 7 camundongos.
Estes resultados indicam que camundongos imunizados com 3 injeções da combinação [RTS5S + C7-CS2 IO10 + Adjuvante B ] demonstram respostas de célula T CD8 específicas de antígeno mais altas (tanto contra a parte de terminal C quanto a de terminal N de CSP) do que os camundongos imunizados com 3 injeções de RTS5S + Adjuvante B.
Respostas de anticorpo específicas de CSP
Os resultados são mostrados na figura a seguir:
Figura 24. Quantificação de títulos de anticorpo específicos de CSP.
Os soros dos camundongos foram coletados em 14 e 42 dias após a 3a imunização. Os títulos de anticorpo anti-CSP foram medidos em cada um destes soros individuais pelo ELISA. Os dados mostrados são os títulos de anticorpo médios geométricos + 95 % de intervalo de confidência. Estes resultados indicam que camundongos imunizados com 3
injeções da combinação [RTS5S + C7-CS2 IO10 + Adjuvante B ] demonstram títulos de anticorpo específicos de CSP similar do que os camundongos imunizados com 3 injeções de RTS5S + Adjuvante B. Conclusões
A vacina de RTS,S/adjuvante B induz uma alta frequência de células T CD4 específicas de terminal C CSP mas nenhuma célula T CD4 específica de terminal N de CSP. Além disso, a vacina de RTS,S/adjuvante B induz células T CD8 específico de terminal C&N de CSP baixo a indetectável. No mesmo modelo de animal, o adenovírus recombinante C7 que expressa CSP induz respostas de célula T CD8 específicas de (terminal C e terminal N) de CSP altas e respostas de célula T CD4 específicas (terminal C e terminal N) de CSP mais baixas. Uma combinação de RTS5S/ adjuvante B e Ad C7-CS2 evoca níveis altos de célula T tanto CD4 quanto CD8 específicos de (terminal C e terminal N) de CSP ao mesmo tempo. A combinação de RTS5S/ adjuvante B e Ad C7-CS2 tem um efeito aditivo concernente à intensidade de ambos os ramos da resposta de célula T. Finalmente, a combinação de RTS5S/ adjuvante B e Ad C7-CS2 evoca altos níveis de respostas de anticorpo específicas de CSP que são comparáveis àqueles induzidos pelo RTS,S/adjuvante B. SEQUENCIAS
SEQ ID I
51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601 651 701 751 801 851 901 951 1001 1051 1101 1151 1201 1251 1301 1351 1401 1451 1501 1551 1601 1651 1701 1751 1801 1851 1901 1951 2001 2051 2101 2151 2201 2251 2301 2351 2401 2451 2501 2551 2601 2651 2701 2751 2801 2851 2901
No I: atgggtgccc gaaaattagg tcgtgtgggc ctggaaacat cctccagacc ccctctactg ttggacaaaa ggcagctgct ttgtccaaaa acgctcaatg ggttatcccc tcaatacaat ttgaaggaga cgtccacgct ctgacattgc accaacaatc cctgggcctg acattagaca tataagaccc gacggagaca tgaaggcact cagggagtag cagtcccatc ccaaggtcaa gagatctgca ggagaaccca ccaagtggcg gatttctggg gaagaagagc ctctggacga aacaacgaga ctggaagggc agccgtttcg gacctgtacg tgaggagctg agaagcatca cccgacaagt gaccgtgaac agatctatcc accaaggccc gctggctgag atgacccctc cagtggacat caagtacgcc ccgaggccgt acacccaagt gaccgaatat cacctcctct ggcgcggaga cgggaaggcc tgaccgacac ctccaggact gctgggcatt accagattat gtcccggccc gagtgcgggg aggtaccttt tttttaaaag acaagatatc
gagcttcggt
ctgcgcccgg
ctcgagggag
ctgagggatg
gggagtgaag
cgtacaccag
ttgaggagga
gacactgggc
cattcagggc
cctgggtgaa
atgttctccg
gcttaatacc
ctatcaacga
ggcccaatcg
cggcaccacc
ctcccatccc
aacaagatcg
gggacccaaa
tgcgagcaga
ctcctggtac
aggcccggct
gcggacccgg
gagaccgtgc
gcagtggcca
ccgagatgga
tacaacaccc
caagctggtg
aggtccagct
gtgaccgtgc
ggactttaga
cccctggcat
tctcccgcca
gaagcagaac
tgggctctga
aggcagcatc
gaaggagccg
ggaccgtgca
gacatccaga
cgggatcaag
tgaccgaggt
aaccgggaga
caaggacctg
accagattta
cgcatgaggg
ccagaagatc
tcaagctgcc
tggcaggcca
ggtgaagctg
cattctacgt
gggtacgtca
caccaaccag
ccggcctgga
attcaggccc
cgagcagctg
ataagggcat
attagaaagg
aagaccaatg
aaaagggggg
cttgatctgt
actgtctggt
gaggcaaaaa
cttgaacggt
tcgccagatc
agctgaggtc
aggatcgaga
gcaaaacaag
atagcaacca
cagatggttc
ggttgtcgaa
ctttgagtga
gtgggcggcc
ggaggcagcc
cgcccggaca
tctacactgc
agttggagaa
tgcgcatgta
gagcctttta
gcaggcctct
agaacgctaa
gccaccctgg
acacaaagcc
cggtgaagct
ctcaccgagg
gaaagagggc
ccgtgtttgc
gatttccggg
gggcatcccc
tggacgtggg
aagtacaccg
cagatatcag
ttttccagag
cccgatatcg
cctggaaatc
tgctgagatg
ccattcctga
gcctatcgtc
agctggtggg
gtgcgccagc
gattcccctc
tcctgaagga
atcgccgaaa
ccaggagcct
gcgcccacac
acgaccgagt
tatccagaag
cctggattcc
tggtaccagc
ggacggcgcg
ccaaccgggg
aagacggagc
ggtgaacatc
agccggacca
atcaagaaag
tggcggcaac
tgctgatggt
acttacaagg
actggaaggg
ggatctacca
ggagagctgg
gaaatacaag
ttgccgtgaa
ctggggcaat
cttgtataac
ttaaggatac
agcaagaaga
ggtatcacag
atcaggccat
gagaaggcct
gggggccact
atcaggccgc
gagtgggaca
gatgcgggag
aagagcaaat
atctataaac
ctctccgaca
gggattacgt
caggaggtca
ccccgactgc
aagagatgat
agagtgttga
gaaacccggg
agaagatcaa
aagatcagca
catcaagaag
agctgaataa
catccggccg
cgacgcttac
cctttaccat
tacaacgtcc
ctccatgacc
tcatctacca
gggcagcatc
gggcctgacc
agatgggcta
ctccccgaga
caagctcaac
tctgcaagct
acggaggaag
gcccgtgcac
tccagaagca
ttcaagaacc
caacgatgtc
ccatcgtgat
gagacctggg
cgagtgggag
tcgagaagga
gccaaccgcg
ccgccagaag
tgcaggccat
gtgacggaca
gtccgagagc
agaaggtcta
gagcaggtcg
gggttttcca
cagctgtaga
ctaattcact
cacacaaggc
acagatggga
ctcaagcata
cccaggcctg
tgcagccatc
acagtggcta
caaggaggcc
aggcccagca
aactatccta
cagcccccgg
tttctcctga
cctcaggacc
catgcaaatg
gagtgcatcc
cctcgcggct
cggatggatg
ggtggatcat
tccatccttg
cgaccggttt
aaaactggat
aaaacaatct
gaccgcctgt
tgggccccat
atggacggcc
ggccctggtg
agatcgggcc
aaggacagca
gcggacccag
gcctgaagaa
ttcagcgtcc
cccatctatc
tcccccaggg
aagatcctgg
gtacatggac
gcacgaagat
actccggaca
cgagctccat
aggacagctg
tgggctagcc
gctgcgcggc
ccgagctcga
ggcgtgtact
gggccagggg
tcaagaccgg
aagcagctga
ctgggggaag
agacgtggtg
ttcgtgaata
gcccatcgtg
aaacaaagct
gtcgtcaccc
ctatctcgct
gccagtacgc
gaactggtga
cctcgcctgg
acaagctggt
gtcacacctc
tcttagccac
cccaaagaag
tacttccctg 2951 attggcagaa ctacacacca gggccagggg tcagatatcc actgaccttt
3001 ggatggtgct acaagctagt accagttgag ccagataagg tagaagaggc
3051 caataaagga gagaacacca gcttgttaca ccctgtgagc ctgcatggga
3101 tggatgaccc ggagagagaa gtgttagagt ggaggtttga cagccgccta
3151 gcatttcatc acgtggcccg agagctgcat ccggagtact tcaagaactg
3201 ctga SEQ ID No 2:
I MGARASVLSG GELDRWEKIR LRPGGKKKYK LKHIVWASRE LERFAVNPGL
51 LETSEGCRQI LGQLQPSLQT GSEELRSLYN TVATLYCVHQ RIEIKDTKEA
101 LDKIEEEQNK SKKKAQQAAA DTGHSNQVSQ NYPIVQNIQG QMVHQAISPR
151 TLNAWVKWE EKAFSPEVIP MFSALSEGAT PQDLNTMLNT VGGHQAAMQM
201 LKETINEEAA EWDRVHPVHA GPIAPGQMRE PRGSDIAGTT STLQEQIGWM
251 TNNPPIPVGE IYKRWIILGL NKIVRMYSPT SILDIRQGPK EPFRDYVDRF
301 YKTLRAEQAS QEVKNWMTET LLVQNANPDC KTILKALGPA ATLEEMMTAC
351 QGVGGPGHKA RVLMGPISPI ETVPVKLKPG MDGPKVKQWP LTEEKIKA.LV
4 01 ΕΙΟΤξΜΕΚξσ KISKIGPENP YNTPVFAIKK KDSTKWRKLV DFRELNKRTQ
4 51 DFWEVQLGIP HPAGLKKKKS VTVLDVGDAY FSVPLDEDFR KYTAFTIPSI
501 NNETPGIRYQ YNVLPQGWKG SPAIFQSSMT KILEPFRKQN PDIVIYQYMD
551 DLYVGSDLEI GQHRTKIEEL RQHLLRWGLT TPDKKHQKEP PFLKMGYELH
601 PDKWTVQPIV LPEKDSWTVN DIQKLVGKLN WASQIYPGIK VRQLCKLLRG
651 TKALTEVIPL TξEAELELAE NREILKEPVH GVYYDPSKDL IAEIQKQGQG
701 QWTYQIYQξP FKNLKTGKYA RMRGAHTNDV KQLTEAVQKI TTESIVIWGK
751 TPKFKLPIQK ETWETWWTEY WQATW^WE FVNTPPLVKL WYQLEKEPIV
8 01 GAETFYVDGA ANRETKLGKA GYVTNRGRQK WTLTDTTNQ KTELQAIYLA
851 LQDSGLEVNI VTDSQYALGI IQAQPDQSES ELVNQIIEQL IKKEKVYLAW
901 VPAHKGIGGN EQVDKLVSAG IRKVLMVGFP VTPQVPLRPM TYKAAVDLSH
951 FLKEKGGLξG LIHSQRRQDI LDLWIYHTQG YFPDWQNYTP GPGVRYPLTF
1001 GWCYKLVPVE PDKVEEANKG ENTSLLHPVS LHGMDDPERE VLEWRFDSRL
1051 AFHHVARELH PEYFKNC SEQ ID No 3:
1 atggccgcca gagccagcat cctgagcggg ggcaagctgg acgcctggga
51 gaagatcaga ctgaggcctg gcggcaagaa gaagtaccgg ctgaagcacc
101 tggtgtgggc cagcagagag ctggatcgct tcgccctgaa tcctagcctg
151 ctggagacca ccgagggctg ccagcagatc atgaaccagc tgcagcccgc
201 cgtgaaaacc ggcaccgagg agatcaagag cctgttcaac accgtggcca
251 ccctgtactg cgtgcaccag cggatcgacg tgaaggatac caaggaggcc
301 ctggacaaga tcgaggagat ccagaacaag agcaagcaga aaacccagca
351 ggccgctgcc gacaccggcg acagcagcaa agtgagccag aactacccca
401 tcatccagaa tgcccagggc cagatgatcc accagaacct gagccccaga
451 accctgaatg cctgggtgaa agtgatcgag gaaaaggcct tcagccccga
501 agtgatccct atgttcagcg ccctgagcga gggcgccacc ccccaggacc
551 tgaacgtgat gctgaacatt gtgggcggac accaggccgc catgcagatg
601 ctgaaggaca ccatcaatga ggaggccgcc gagtgggaca gactgcaccc
651 cgtgcaggcc ggacccatcc cccctggcca gatcagagag cccagaggca
7 01 gcgacatcgc cggcaccacc tccacccctc aagaacagct gcagtggatg
751 accggcaacc ctcccatccc tgtgggcaac atctacaagc ggtggatcat
801 cctgggcctg aacaagattg tgcggatgta cagccccgtg tccatcctgg
851 atatcaagca gggccccaag gagcccttca gagactacgt ggaccggttc
901 ttcaaggccc tgagagccga gcaggccacc caggacgtga agggctggat
951 gaccgagacc ctgctggtgc agaacgccaa ccccgactgc aagagcatcc
1001 tgaaggccct gggcagcggc gccacactgg aggagatgat gaccgcctgc
1051 cagggagtgg gcggacccgg ccacaaggcc agagtgctgg ccgaggccat
1101 gagccaggcc cagcagacca acatcatgat gcagcggggc aacttcagag
1151 gccagaagcg gatcaagtgc ttcaactgcg gcaaggaggg ccacctggcc
1201 agaaactgca gagcccccag gaagaagggc tgctggaagt gtggcaagga
1251 agggcaccag atgaaggact gcaccgagag gcaggccaat ttcctgggca
1301 agatttggcc tagcagcaag ggcagacccg gcaatttccc ccagagcaga
1351 cccgagccca ccgcccctcc cgccgagctg ttcggcatgg gcgagggcat
14 01 cgccagcctg cccaagcagg agcagaagga cagagagcag gtgccccccc
1451 tggtgtccct gaagtccctg ttcggcaacg atcctctgag ccagggatcc
1501 cccatcagcc ccatcgagac cgtgcccgtg accctgaagc ccggcatgga
1551 tggccccaaa gtgaaacagt ggcccctgac cgaggagaag attaaggccc
1601 tgaccgaaat ctgtaccgag atggagaagg agggcaagat cagcaagatc 1651 1701 1751 1801 1851 1901 1951 2001 2051 2101 2151 2201 2251 2301 2351 2401 2451 2501 2551 2601 2651 2701 2751 2801 2851 2901 2951 3001 3051 3101 3151 3201 3251 3301 3351 3401 3451 3501 3551 3601 3651 3701 3751 3801 3851 3901 3951 4001 4051 4101 4151 4201 4251 4301 4351 4401 4451 4501 4551 4601 4 651 SEQID
ggccccgaga cagcaccaag cccaggactt aagaagaaga cgtgcccctg gcaccaacaa cagggctgga cctggagccc tggccgccct aagatcgaag cgataagaag tgcaccccga agctggaccg cagccaaatc gaggcgccaa ctggagctgg gtactacgac aggaccagtg accgggaagt gctggccgaa gcaagacccc tggtggatgg gaacaccccc tcctgggcgc aagctgggca gtctctgacc tggccctgca tacgccctgg ggtgaaccag gctgggtgcc ctggtgtcca ggcccaggag gcgacttcaa gataagtgtc ccctggcatc tggtggccgt gccgagaccg atggcccgtg ccgccgtgaa atcccctaca gctgaagaag cagccgtgca attggcggct tatccagacc gagtgtacta ctgctgtgga caaagtggtg agatggccgg atgggcggca ggagagaatg ctcaggatct cccagctgtg tgtgagaccc acctgagcca agccggaagc ctacttcccc ccctgacctt gtggagaagg ccagcacggc acagcaggct tacaaggact No 4 :
MAARASILSG
acccctacaa tggcggaaac ctgggaagtg agtccgtgac gacgagaact cgagaccccc agggcagccc ttccggagca gtatgtgggc agctgagggc caccagaagg taagtggacc tgaacgacat tacgccggca agccctgaca ccgagaacag cccagcaagg gacctaccaa acgccaggaa gtggtgcaga caagttcaag actactggca cctctggtga cgagaccttc aggccggcta gagacaacca ggacagcggc gcatcattca atcatcgaga cgcccacaag gcggcatccg gaccacgaga cctgcctccc agctgaaggg tggcagctgg gcacgtggcc gccaggagac aaagtggtgc ggccgcctgt accctcagag atcatcggcc gatggccgtg acagcgccgg aaggaactgc ccgggacagc agggcgaagg ccccggagga cgatgactgc agtggtccaa agaagagccc ggataagcac tgtggctgga caggtgcccc cttcctgaag ggcaggagat gactggcaga cggctggtgc ccacagaggg atggacgatg ggccctgaag gctga
cacccccatc
tggtggactt
cagctgggca
agtgctggat
tcaggaagta
ggagtgagat
cgccatcttc
agaaccccga
agcgatctgg
ccacctgctg
agcccccttt
gtgcagccca
ccagaaactg
ttaaagtgaa
gacatcgtga
ggagatcctg
acctggtggc
atctaccagg
gagaagcgcc
aagtggctat
ctgcccatcc
ggccacctgg
agctgtggta
tacgtggacg
cgtgaccgac
accagaaaac
agcgaagtga
ggcccagccc
agctgatcgg
ggcatcggcg
gaaagtgctg
gataccacag
atcgtggcca
cgaggccatg
cctgcaccca
agcggctaca
cgcctacttc
acaccgccaa
tggtgggcca
ccagggcgtg
aggtgaggga
ttcatccaca
agagcggatc
agaagcagat
agggacccca
cgccgtggtg
aggccaagat
gtggccggca
gggcagcatt
ctgccgccgc
ggcgccatca
ggcccaggaa
tgagacccat
gagaagggcg
cctggatctg
attacacccc
ttcaagctgg
cgagaacaac
aggagcggga
cacagagccc
ttcgccatca
ccgggagctg
tcccccaccc
gtgggcgacg
caccgccttc
accagtacaa
cagagcagca
gatcatcatc
agatcggcca
agctggggct
cctgtggatg
tcatgctgcc
gtgggcaagc
gcagctgtgc
cactgacaga
aaggaccccg
cgagattcag
agcctttcaa
cacaccaacg
ggagagcatc
agaaggagac
attcctgagt
tcagctggag
gagccgccaa
agaggcagac
cgagctgcac
acatcgtgac
gatagaagcg
caaggacaaa
gcaacgagca
tttctggacg
caactggcgg
aggagatcgt
cacggccagg
cctggagggc
tcgaggccga
ctgctgaagc
cggcagcaac
atatccagca
gtggccagca
ccaggccgag
acttcaagcg
atcgacatca
caccaagatt
tctggaaggg
atccaggaca
tctgcgggac
ggcaggatga
gtgggctggc
tcctggagtg
ccagcagcaa
gaggaggaag
gacctacaag
gcctggacgg
tgggtgtacc
tggccctgga
tgcctatgga
agcctgctgc
agtgctgatc
aggaactgca
agaagaagga aacaagagga tgccggcctg cctacttcag accatcccca cgtgctgcct tgaccaagat taccagtaca gcacaggacc tcaccacccc ggctacgagc cgataaggag tgaattgggc aggctgctga ggaggccgag tgcacggcgt aagcagggcc gaacctgaaa atgtgaggca gtgatctggg ctgggaaacc gggagttcgt aaggacccca tagagagacc agaaagtggt gccatcctgc cgactcccag agagcgagct atctacctga ggtggacaag gcatcgacaa acaatggcca ggccagctgc tggactgcag aaagtgattc agtgattccc tggccggcag ttcacctctg ggagttcggc tgaacaagga cacctgaaaa gaagggcggc tcgccaccga cagaacttca ccctgccaag acagcgacat tacggcaaac ggacagatct ccgagatccg ggcgccgtgt catcaacaac tgggcttccc ggcgccttcg cctgatctac acacccaggg gtgcggtatc gcccgacgaa accctatctg tggaagttcg cccagagttc
GKLDAWEKIR LRPGGKKKYR LKHLVWASRE LDRFALNPSL 51 LETTEGCQQI MNQLQPAVKT GTEEIKSLFN TVATLYCVHQ RIDVKDTKEA
101 LDKIEEIQNK SKQKTQQAAA DTGDSSKVSQ NYPIIQNAQG QMIHQNLSPR
151 TLNAWVKVIE EKAFSPEVIP MFSALSEGAT PQDLNVMLNI VGGHQAAMQM
201 LKDTINEEAA EWDRLHPVQA GPIPPGQIRE PRGSDIAGTT STPQEQLQWM
251 TGNPPIPVGN IYKRWIILGL NKIVRMYSPV SILDIKQGPK EPFRDYVDRF
301 FKALRAEQAT QDVKGWMTET LLVQNANPDC KSILKALGSG ATLEEMMTAC
351 QGVGGPGHKA RVLAEAMSQA QQTNIMMQRG NFRGQKRIKC FNCGKEGHLA
4 01 RNCRAPRKKG CWKCGKEGHQ MKDCTERQAN FLGKIWPSSK GRPGNFPQSR
4 51 PEPTAPPAEL FGMGEGIASL PKQEQKDREQ VPPLVSLKSL FGNDPLSQGS
501 PISPIETVPV TLKPGMDGPK VKQWPLTEEK IKALTEICTE MEKEGKISKI
551 GPENPYNTPI FAIKKKDSTK WRKLVDFREL NKRTQDFWEV QLGIPHPAGL
601 KKKKSVTVLD VGDAYFSVPL DENFRKYTAF TIPSTNNETP GVRYQYNVLP
651 QGWKGSPAIF QSSMTKILEP FRSKNPEIII YQYMAALYVG SDLEIGQHRT
7 01 KIEELRAHLL SWGFTTPDKK HQKEPPFLWM GYELHPDKWT VQPIMLPDKE
7 51 SWTVNDIQKL VGKLNWASQI YAGIKVKQLC RLLRGAKALT DIVTLTEEAE
8 01 LELAENREIL KDPVHGVYYD PSKDLVAEIQ KQGQDQWTYQ IYQEPFKNLK 851 TGKYARKRSA HTNDVRQLAE WQKVAMESI VIWGKTPKFK LPIQKETWET 901 WWMDYWQATW IPEWEFVNTP PLVKLWYQLE KDPILGAETF YVDGAANRET 951 KLGKAGYVTD RGRQKWSLT ETTNQKTELH AILLALQDSG SEVNIVTDSQ 1001 YALGIIQAQP DRSESELVNQ IIEKLIGKDK IYLSWVPAHK GIGGNEQVDK 1051 LVSSGIRKVL FLDGIDKAQE DHERYHSNWR TMASDFNLPP IVAKEIVASC 1101 DKCQLKGEAM HGQVDCSPGI WQLACTHLEG KVILVAVHVA SGYIEAEVIP 1151 AETGQETAYF LLKLAGRWPV KWHTANGSN FTSAAVKAAC WWANIQQEFG 1201 IPYNPQSQGV VASMNKELKK IIGQVRDQAE HLKTAVQMAV FIHNFKRKGG 1251 IGGYSAGERI IDIIATDIQT KELQKQITKI QNFRVYYRDξ RDPIWKGPAK 1301 LLWKGEGAW IQDNSDIKW PRRKAKILRD YGKQMAGDDC VAGRQDEDRS 1351 MGGKWSKGSI VGWPEIRERM RRAPAAAPGV GAVSQDLDKH GAITSSNINN 14 01 PSCVWLEAQE EEEVGFPVRP QVPLRPMTYK GAFDLSHFLK EKGGLDGLIY 1451 SRKRQEILDL WVYHTQGYFP DWQNYTPGPG VRYPLTFGWC FKLVPMEPDE 1501 VEKATEGENN SLLHPICQHG MDDEEREVLI WKFDSRLALK HRAQELHPEF 1551 YKDC
SEQID No 5:
1 atgagggtga tggagatcca gcggaactgc cagcacctgc tgagatgggg
51 catcatgatc ctgggcatga ttatcatctg cagcaccgcc gacaacctgt
101 gggtgaccgt gtactacggc gtgcctgtgt ggagagatgc cgagaccacc
151 ctgttctgcg ccagcgacgc caaggcctac agcaccgaga agcacaatgt
201 gtgggccacc cacgcctgcg tgcctaccga tcccaaccct caggagatcc
251 ccctggacaa cgtgaccgag gagttcaaca tgtggaagaa caacatggtg
301 gaccagatgc acgaggacat catcagcctg tgggaccaga gcctgaagcc
351 ctgcgtgcag ctgacccccc tgtgcgtgac cctgaactgc agcaacgcca
4 01 gagtgaacgc caccttcaac tccaccgagg acagggaggg catgaagaac
451 tgcagcttca acatgaccac cgagctgcgg gataagaagc agcaggtgta
501 cagcctgttc taccggctgg acatcgagaa gatcaacagc agcaacaaca
551 acagcgagta ccggctggtg aactgcaata ccagcgccat cacccaggcc
601 tgccctaagg tgaccttcga gcccatcccc atccactact gcgcccctgc
651 cggcttcgcc atcctgaagt gcaacgacac cgagttcaat ggcaccggcc
7 01 cctgcaagaa tgtgagcacc gtgcagtgca cccacggcat caagcccgtg
7 51 gtgtccaccc agctgctgct gaacggcagc ctggccgaga gagaagtgcg
801 gatcaggagc gagaacatcg ccaacaacgc caagaacatc atcgtgcagt
851 tcgccagccc cgtgaagatc aactgcatcc ggcccaacaa caatacccgg
901 aagagctaca gaatcggccc tggccagacc ttctacgcca ccgacattgt
951 gggcgacatc agacaggccc actgcaacgt gtccaggacc gactggaaca
1001 acaccctgag actggtggcc aaccagctgc ggaagtactt cagcaacaag
1051 accatcatct tcaccaacag cagcggcgga gacctggaga tcaccaccca
1101 cagcttcaat tgtggcggcg agttcttcta ctgcaacacc tccggcctgt
1151 tcaatagcac ctggaccacc aacaacatgc aggagtccaa cgacaccagc
1201 aacggcacca tcaccctgcc ctgccggatc aagcagatca tccggatgtg
1251 gcagcgcgtg ggccaggcca tgtacgcccc tcccatcgag ggcgtgattc
1301 gctgcgagag caacatcacc ggcctgatcc tgaccagaga tggcggcaac
1351 aacaattccg ccaacgagac cttcagacct ggcggcggag atatccggga
1401 caactggcgg agcgagctgt acaagtacaa ggtggtgaag atcgagcccc
1451 tgggcgtggc ccccaccaga gccaagagaa gagtggtgga gcgggagaag
1501 agagccgtgg gcatcggcgc cgtgtttctg ggcttcctgg gagccgccgg 1551 atctacaatg ggagccgcca gcatcaccct gaccgtgcag gccagacagc
1601 tgctgagcgg catcgtgcag cagcagagca atctgctgag agccatcgag
1651 gcccagcagc agctgctgaa gctgacagtg tggggcatca agcagctgca
17 01 ggccagggtg ctggccgtgg agagatacct gagggaccag cagctcctgg
1751 gcatctgggg ctgcagcggc aagctgatct gcaccaccaa cgtgccctgg
1801 aatagcagct ggagcaacaa gagctacgac gacatctggc agaacatgac
1851 ctggctgcag tgggacaagg agatcagcaa ctacaccgac atcatctaca
1901 gcctgatcga ggagagccag aaccagcagg agaagaacga gcaggatctg
1951 ctggccctgg acaagtgggc caacctgtgg aactggttcg acatcagcaa
2001 gtggctgtgg tacatcagat cttga
SEQID No 6:
I
51
101
151
201
251
301
351
401
451
501
551
601
651
MRVMEIQRNC QHLLRWGIMI LGMIIICSTA DNLWVTVYYG VPVWRDAETT LFCASDAKAY STEKHNVWAT HACVPTDPNP QEIPLDNVTE EFNMWKNNMV DQMHEDIISL WDQSLKPCVQ LTPLCVTLNC SNARVNATFN STEDREGMKN CSFNMTTELR DKKQQVYSLF YRLDIEKINS SNNNSEYRLV NCNTSAITQA CPKVTFEPIP IHYCAPAGFA ILKCNDTEFN GTGPCKNVST VQCTHGIKPV VSTQLLLNGS LAEREVRIRS ξΝΙΑΝΝΑΚΝΙ IVQFASPVKI NCIRPNNNTR KSYRIGPGQT FYATDIVGDI RQAHCNVSRT DWNNTLRLVA NQLRKYFSNK TIIFTNSSGG DLEITTHSFN CGGEFFYCNT SGLFNSTWTT NNMQESNDTS NGTITLPCRI KQIIRMWQRV GQAMYAPPIE GVIRCESNIT GLILTRDGGN NNSANETFRP GGGDIRDNWR SELYKYKWK IEPLGVAPTR AKRRWEREK RAVGIGAVFL GFLGAAGSTM GAASITLTVQ ARQLLSGIVQ QQSNLLRAIE AQQQLLKLTV WGIKQLQARV LAVERYLRDQ QLLGIWGCSG KLICTTNVPW NSSWSNKSYD DIWQNMTWLQ WDKEISNYTD IIYSLIEESQ NQQEKNEQDL LALDKWANLW NWFDISKWLW YIRS SEQ ID No 7:
atgaaagtga aggagaccag gaagaattat cagcacttgt ggagatgggg 50 caccatgctc cttgggatgt tgatgatctg tagtgctgca gaacaattgt 100 gggtcacagt ctattatggg gtacctgtgt ggaaagaagc aactaccact 150 ctattctgtg catcagatgc taaagcatat gatacagagg tacataatgt 200 ttgggccaca catgcctgtg tacccacaga ccccaaccca caagaagtag 250 tattgggaaa tgtgacagaa tattttaaca tgtggaaaaa taacatggta 300 gaccagatgc atgaggatat aatcagttta tgggatcaaa gcttgaagcc 350 atgtgtaaaa ttaaccccac tctgtgttac tttagattgc gatgatgtga 400 ataccactaa tagtactact accactagta atggttggac aggagaaata 450 aggaaaggag aaataaaaaa ctgctctttt aatatcacca caagcataag 500 agataaggtt caaaaagaat atgcactttt ttataacctt gatgtagtac 550 caatagatga tgataatgct actaccaaaa ataaaactac tagaaacttt aggttgatac attgtaactc ctcagtcatg acacaggcct gtccaaaggt atcatttgaa ccaattccca tacattattg tgccccggct ggttttgcga 700 ttctgaagtg taacaataag acgtttgatg gaaaaggact atgtacaaat 750 gtcagcacag tacaatgtac acatggaatt aggccagtag tgtcaactca 800 actgctgtta aatggcagtc tagcagaaga agaggtagta attagatctg 850 acaatttcat ggacaatact aaaaccataa tagtacagct gaatgaatct
600
650
900
gtagcaatta attgtacaag acccaacaac aatacaagaa aaggtataca 950 tataggacca gggagagcct tttatgcagc aagaaaaata ataggagata 1000 taagacaagc acattgtaac cttagtagag cacaatggaa taacacttta 1050 aaacagatag ttataaaatt aagagaacac tttgggaata aaacaataaa 1100 atttaatcaa tcctcaggag gggacccaga aattgtaagg catagtttta 1150 attgtggagg ggaatttttc tactgtgata caacacaact gtttaatagt 1200 acttggaatg gtactgaagg aaataacact gaaggaaata gcacaatcac 1250 actcccatgt agaataaaac aaattataaa catgtggcag gaagtaggaa 1300 aagcaatgta tgcccctccc atcggaggac aaattagatg ttcatcaaat 1350 attacagggc tgctattaac aagagatggt ggtaccgaag ggaatgggac 1400 agagaatgag acagagatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca 1450 attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaagt tgaaccacta 1500 ggagtagcac ccaccagggc aaagagaaga gtggtgcaga gataa 1545 SEQ ID No 8:
MKVKETRKNY QHLWRWGTML LGMLMICSAA EQLWVTVYYG VPVWKEATTT 50 LFCASDAKAY DTEVHNVWAT HACVPTDPNP QEWLGNVTE YFNMWKNNMV 100 DQMHEDIISL WDQSLKPCVK LTPLCVTLDC DDVNTTNSTT TTSNGWTGEI 150 RKGEIKNCSF NITTSIRDKV QKEYALFYNL DWPIDDDNA TTKNKTTRNF 200 RLIHCNS ξΥΜ TQACPKVSFE PIPIHYCAPA GFAILKCNNK TFDGKGLCTN 250 VSTVQCTHGI RPWSTQLLL NGSLAEEEW IRSDNFMDNT KTIIVQLNES 300 VAINCTRPNN NTRKGIHIGP GRAFYAARKI IGDIRQAHCN LSRAQWNNTL 350 KQIVIKLREH FGNKTIKFNQ SSGGDPEIVR HSFNCGGEFF YCDTTQLFNS 400 TWNGTEGNNT EGNSTITLPC RIKQIINMWQ EVGfCAMYAPP IGGQIRCSSN 450 ITGLLLTRDG GTEGNGTENE TEIFRPGGGD MRDNWRSELY KYKWKVEPL 500 GVAPTRAKRR WQR 514 SEQ ID No 9:
atgcatcaca cggccgcgtc cgataacttc cagctgtccc agggtgggca gggattcgcc 60 attccgatcg ggcaggcgat ggcgatcgcg ggccagatcc gatcgggtgg ggggtcaccc 120 accgttcata tcgggcctac cgccttcctc ggcttgggtg ttgtcgacaa caacggcaac 180 ggcgcacgag tccaacgcgt ggtcgggagc gctccggcgg caagtctcgg catctccacc 240 ggcgacgtga tcaccgcggt cgacggcgct ccgatcaact cggccaccgc gatggcggac 300 gcgcttaacg ggcatcatcc cggtgacgtc atctcggtga cctggcaaac caagtcgggc 360 ggcacgcgta cagggaacgt gacattggcc gagggacccc cggccgaatt catggtggat 420 ttcggggcgt taccaccgga gatcaactcc gcgaggatgt acgccggccc gggttcggcc 480 tcgctggtgg ccgcggctca gatgtgggac agcgtggcga gtgacctgtt ttcggccgcg 540 tcggcgtttc agtcggtggt ctggggtctg acggtggggt cgtggatagg ttcgtcggcg 600 ggtctgatgg tggcggcggc ctcgccgtat gtggcgtgga tgagcgtcac cgcggggcag 660 gccgagctga ccgccgccca ggtccgggtt gctgcggcgg cctacgagac ggcgtatggg 720 ctgacggtgc ccccgccggt gatcgccgag aaccgtgctg aactgatgat tctgatagcg 780 accaacctct tggggcaaaa caccccggcg atcgcggtca acgaggccga atacggcgag 840 atgtgggccc aagacgccgc cgcgatgttt ggctacgccg cggcgacggc gacggcgacg 900 gcgacgttgc tgccgttcga ggaggcgccg gagatgacca gcgcgggtgg gctcctcgag 960 caggccgccg cggtcgagga ggcctccgac accgccgcgg cgaaccagtt gatgaacaat 1020 gtgccccagg cgctgcaaca gctggcccag cccacgcagg gcaccacgcc ttcttccaag 1080 ctgggtggcc tgtggaagac ggtctcgccg catcggtcgc cgatcagcaa catggtgtcg 1140 atggccaaca accacatgtc gatgaccaac tcgggtgtgt cgatgaccaa caccttgagc 1200 tcgatgttga agggctttgc tccggcggcg gccgcccagg ccgtgcaaac cgcggcgcaa 1260 aacggggtcc gggcgatgag ctcgctgggc agctcgctgg gttcttcggg tctgggcggt 1320 ggggtggccg ccaacttggg tcgggcggcc tcggtcggtt cgttgtcggt gccgcaggcc 1380 tgggccgcgg ccaaccaggc agtcaccccg gcggcgcggg cgctgccgct gaccagcctg 1440 accagcgccg cggaaagagg gcccgggcag atgctgggcg ggctgccggt ggggcagatg 1500 ggcgccaggg ccggtggtgg gctcagtggt gtgctgcgtg ttccgccgcg accctatgtg 1560 atgccgcatt ctccggcagc cggcgatatc gccccgccgg ccttgtcgca ggaccggttc 1620 gccgacttcc ccgcgctgcc cctcgacccg tccgcgatgg tcgcccaagt ggggccacag 1680 gtggtcaaca tcaacaccaa actgggctac aacaacgccg tgggcgccgg gaccggcatc 1740 gtcatcgatc ccaacggtgt cgtgctgacc aacaaccacg tgatcgcggg cgccaccgac 1800 atcaatgcgt tcagcgtcgg ctccggccaa acctacggcg tcgatgtggt cgggtatgac 1860 cgcacccagg atgtcgcggt gctgcagctg cgcggtgccg gtggcctgcc gtcggcggcg 1920 atcggtggcg gcgtcgcggt tggtgagccc gtcgtcgcga tgggcaacag cggtgggcag 1980 ggcggaacgc cccgtgcggt gcctggcagg gtggtcgcgc tcggccaaac cgtgcaggcg 2040 tcggattcgc tgaccggtgc cgaagagaca ttgaacgggt tgatccagtt cgatgccgcg 2100 atccagcccg gtgatgcggg cgggcccgtc gtcaacggcc taggacaggt ggtcggtatg 2160 aacacggccg cgtcctag 2178 SEQ ID No 10:
MHHTAASDNF QLSQGGQGFA IPIGQAMAIA GQIRSGGGSP TVHIGPTAFL GLGWDNNGN 60 GARVQRWGS APAASLGIST GDVITAVDGA PINSATAMAD ALNGHHPGDV ISVTWQTKSG 120 GTRTGNVTLA EGPPAEFMVD FGALPPEINS ARMYAGPGSA SLVAAAQMWD SVASDLFSAA 180 SAFQSWWGL TVGSWIGSSA GLMVAAASPY VAWMSVTAGQ AELTAAQVRV AAAAYETAYG 240 LTVPPPVIAE NRAELMILIA TNLLGQNTPA IAVNEAEYGE MWAQDAAAMF GYAAATATAT 300 ATLLPFEEAP EMTSAGGLLE QAAAVEEASD TAAANQLMNN VPQALQQLAQ PTQGTTPSSK 360 LGGLWKTVSP HRSPISNMVS MANNHMSMTN SGVSMTNTLS SMLKGFAPAA AAQAVQTAAQ 420 NGVRAMSSLG SSLGSSGLGG GVAANLGRAA SVGSLSVPQA WAAANQAVTP AARALPLTSL 4 80 TSAAERGPGQ MLGGLPVGQM GARAGGGLSG VLRVPPRPYV MPHSPAAGDI APPALSQDRF 540 ADFPALPLDP SAMVAQVGPQ WNINTKLGY NNAVGAGTGI VIDPNGWLT NNHVIAGATD 600 INAFSVGSGQ TYGVDWGYD RTQDVAVLQL RGAGGLPSAA IGGGVAVGEP WAMGNSGGQ 660 GGTPRAVPGR WALGQTVQA SDSLTGAEET LNGLIQFDAA IQPGDAGGPV VNGLGQWGM 720 NTAAS 72 5 SEQ ID No 11:
atgatgagaa aacttgccat cctcagcgtc agctctttcc tgttcgtgga 50 ggccctcttc caggagtatc agtgctacgg aagcagcagc aatacaaggg 100 tcctgaacga gctcaactat gacaacgctg gaacgaacct gtataacgag 150 ctggagatga actactatgg caagcaggag aactggtata gcctgaagaa 200 gaacagccgg tccctgggcg agaacgacga cggcaacaac aacaacggcg
acaacggcag ggagggcaaa gatgaggaca agagggacgg gaacaacgag
gataacgaga agctgcggaa gcccaagcac aagaaactca agcagcccgc
cgacgggaac ccggacccca atgcaaatcc caacgtcgac ccaaacgcaa
accctaacgt ggaccccaac gccaatccca acgtcgatcc taatgccaat
ccaaatgcca accctaacgc aaatcctaat gcaaacccca acgccaatcc
taacgccaac ccaaatgcca acccaaacgc taaccccaac gctaacccaa
atgcaaatcc caatgctaac ccaaacgtgg accctaacgc taaccccaac
gcaaacccta acgccaatcc taacgcaaac cccaatgcaa acccaaacgc
aaatcccaac gctaacccta acgcaaaccc caacgccaac cctaatgcca
accccaatgc taaccccaac gccaatccaa acgcaaatcc aaacgccaac
ccaaatgcaa accccaacgc taatcccaac gccaacccaa acgccaatcc
taacaagaac aatcagggca acgggcaggg
ctaatcggaa tgtggacgag aacgccaacg
aacaacaacg aggagccctc cgacaagcac atcaaggaat
gatccagaac agtctgagca ccgagtggtc cccctgctcc
gcaacggcat ccaggtgagg atcaagcccg gctccgccaa
gacgagctgg actacgccaa cgacatcgag aagaagatct gaaatgcagct ctgtgttcaac gtcgtgaa ctccgccatc SEQ ID No 12:
MMRKLAILSV SSFLFVEALF QEYQCYGSSS NTRVLNELNY
ccataacatg ccgaacgacc ccaacagcgc cgtgaagaac acctgaacaa gtgacctgcg caagcccaag gcaagatgga
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
1050
1100
ggcctgtga 1149
LEMNYYGKQE NWYSLKKNSR SLGENDDGNN NNGDNGREGK
DNAGTNLYNE
DEDKRDGNNE
aatccaaatg
tccaaatgca
ccaatgcaaa
DNEKLRKPKH KKLKQPADGN PDPNANPNVD PNANPNVDPN ANPNVDPNAN PNANPNANPN ANPNANPNAN PNANPNANPN ANPNANPNAN PNVDPNANPN ANPNANPNAN PNANPNANPN ANPNANPNAN PNANPNANPN ANPNANPNAN PNANPNANPN ANPNANPNKN NQGNGQGHNM PNDPNRNVDE NANANSAVKN NNNEEPSDKH IKEYLNKIQN SLSTEWSPCS VTCGNGIQVR IKPGSANKPK DELDYANDIE KKICKMEKCS SVFNWNSAI GL 382 SEQ ID No 13: atgatggctc ccgatcctaa ccccaatgca aatcctaatg ctaatgccaa tccaaatgca aatgcaaatc ctaatgccaa tgcaaaccca aatgcaaacc gtaatggaca aggtcacaat gaaaatgcta aagtgataag caactgaatg agaataaagc aaatgatatt ttaatgtcgt aacatcacat tttcttgttg ggacttctct tcgcagtccc tcctggttat tcctgctgct atgttgcccg accatgcaaa catgttgctg ccatcgtcct
50
100
150
200
250
300
350
atgccaacag tgctgtaaaa cacataaaag aatatttaaa gtccccatgt agtgtaactt ctggctctgc taataaacct gaaaaaaaaa tttgtaaaat aaatagttca ataggattag caggattcct aggacccctg acaagaatcc tcacaatacc caattttcta gggggatcac caacctccaa tcactcacca cgctggatgt gtctgcggcg atgcctcatc ttcttattgg tttgtcctct acctgcacga tacaaaacct gggctttcgc
tttctcttgg ctcagtttac tttcccccac tgtttggctt
aattccagga
ctcctgctca
acggatggaa
aaaataccta
tagtgccatt
tcagctatat
aatgcaaacc caaacgcaaa 50 tgcaaatcct aatgcaaatc 100 caaacccaaa cgcaaacccc 150 aatccaaatg caaacccaaa 200 tcctaataaa aacaatcaag 250 acccaaaccg aaatgtagat 300 aataataata acgaagaacc 350 caaaatacaa aattctcttt 400 gtggaaatgg tattcaagtt 450 aaagacgaat tagattatgc 500 ggaaaaatgt tccagtgtgt 550 ggcctgtgac gaacatggag 600 ctcgtgttac aggcggggtt 650 gcagagtcta gactcgtggt 700 ccgtgtgtct tggccaaaat 750 acctcctgtc ctccaatttg 800 ttttatcata ttcctcttca 850 ttcttctgga ttatcaaggt 900 tcaacaacaa ccaatacggg 950 aggcaactct atgtttccct 1000 attgcacctg tattcccatc 1050 tgggagtggg cctcagtccg 1100 tgttcagtgg ttcgtagggc 1150 ggatgatgtg gtattggggg 1200 ataccgctgt taccaatttt 1250 ccaagtctgt acagcatcgt gagtcccttt cttttgtctc tgggtataca tttaa 1275 SEQ ID No 14:
MMAPDPNANP NANPNANPNA NPNANPNANP NANPNANPNA NPNANPNANP NANPNANPNK NNQGNGQGHN MPNDPNRNVD ENANANSAVK NNNNEEPÇDK HIKEYLNKIQ NSLSTEWSPC SVTCGNGIQV
EKKICKMEKC TRILTIPQSL
RIKPGSANKP KDELDYANDI
NITSGFLGPL LVLQAGFFLL
SQSPTSNHSP TSCPPICPGY RWMCLRRFII
MLPVCPLIPG STTTNTGPCK TCTTPAQGNS
NANPNANPNA NPNANPNANP 50
100 150
SSVFNWNSS IGLGPVTNME 200 DSWWTSLNFL GGSPVCLGQN 2 50 FLFILLLCLI FLLVLLDYQG 3 00 MFPSCCCTKP TDGNCTCIPI 350 PSSWAFAKYL
PSLYSIVSPF
SEQ ID No
atggtcattg
tccgcgaact
ccccggaggt
caagacctta
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MVIVQNIQGQ MVHQAISPRT LNAWVKWEE KAFSPEVIPM FSALSEGATP 50 QDLNTMLNTV GGHQAAMQML KETINEEAAE WDRVHPVHAG PIAPGQMREP 100 RGSDIAGTTS TLQEQIGWMT NNPPIPVGEI YKRWIILGLN KIVRMYSPTS 150 ILDIRQGPKE PFRDYVDRFY KTLRAEQASQ EVKNWMTETL LVQNANPDCK 200 TILKALGPAA TLEEMMTACQ GVGGPGHKAR VLHMGPISPI ETVSVKLKPG 250 MDGPKVKQWP LTEEKIKALV EICTEMEKEG KISKIGPENP YNTPVFAIKK 300 KDSTKWRKLV DFRELNKRTQ DFWEVQLGIP HPAGLKKKKS VTVLDVGDAY 350 FSVPLDEDFR KYTAFTIPSI NNETPGIRYQ YNVLPQGWKG SPAIFQSCMT 400 KILEPFRKQN PDIVIYQYMD DLYVGSDLEI GQHRTKIEEL RQHLLRWGLT 450 TPDKKHQKEP PFLKMGYELH PDKWTVQPIV LPEKDSWTVN DIQKLVGKLN 500 WASQIYPGIK VRQLCKLLRG TKALTEVIPL TEEAELELAE NREILKEPVH 550 GVYYDPSKDL IAEIQKQGQG QWTYQIYQEP FKNLKTGKYA RMRGAHTNDV 600 KQLTEAVQKI TTESIVIWGK TPKFKLPIQK ETWETWWTEY WQATWIPEWE 650 FVNTPPLVKL WYQLEKEPIV GAETFYVDGA ANRETKLGKA GYVTNRGRQK 7 00 WTLTDTTNQ KTELQAIYLA LQDSGLEVNI VTDSQYALGI IQAQPDQSES 7 50 ELVNQIIEQL IKKEKVYLAW VPAHKGIGGN EQVDKLVSAG IRKVLAMGGK 800 WSKSSWGWP TVRERMRRAE PAADGVGAAS RDLEKHGAIT SSNTAATNAA 8 50 CAWLEAQEEE EVGFPVTPQV PLRPMTYKAA VDLSHFLKEK GGLEGLIHSQ 90 0 RRQDILDLWI YHTQGYFPDW QNYTPGPGVR YPLTFGWCYK LVPVEPDKVE 95 0 EANKGENTSL LHPVSLHGMD DPEREVLEWR FDSRLAFHHV ARELHPEYFK 1000 NCRPMGARAS VLSGGELDRW EKIRLRPGGK KKYKLKHIVW ASRELERFAV 1050 NPGLLETSEG CRQILGQLQP SLQTGSEELR SLYNTVATLY CVHQRIEIKD 1100 TKEALDKIEE EQNKSKKKAQ QAAADTGHSN QVSQNY 1136 Todas as referências aludidas neste pedido, incluindo patentes e pedidos de patente, são aqui incorporados por referência ao grau mais completo possível.
Por todo este relatório descritivo e as reivindicações que seguem, a menos que o contexto requeira de outro modo, a palavra ‘compreendem’ e variações tais como ‘compreende’ e ‘que compreende’, serão entendidos implicar a inclusão de um número inteiro, etapa, grupo de números inteiros ou grupo de etapas estabelecidos mas não à exclusão de nenhum outro número inteiro, etapa, grupo de números inteiros ou grupo de etapas.
O pedido do qual esta descrição e reivindicações formam parte pode ser usado como uma base para a prioridade em respeito a qualquer aplicação subsequente. As reivindicações de tal pedido subsequente podem ser direcionadas a qualquer característica ou combinação de características aqui descritas. Elas podem tomar a forma de produto, composição, processo ou reivindicações de uso e podem incluir, por via de exemplo e sem limitação, as reivindicações a seguir:

Claims (40)

1. Método para elevar uma resposta imune contra um patógeno, caracterizado pelo fato de que compreende administrar (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários derivados do dito patógeno; (ii) um ou mais vetores adenovirais que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários derivados do dito patógeno; e (iii) um adjuvante; em que o um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários, o um ou mais vetores adenovirais e o adjuvante são administrados concomitantemente.
2. Método para elevar uma resposta imune contra um patógeno, caracterizado pelo fato de que compreende administrar (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários derivados do dito patógeno coformulados com um adjuvante; e (ii) um ou mais vetores adenovirais que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários derivados do dito patógeno; em que um ou mais polipeptídeos imunogênicos e o adjuvante, e um ou mais vetores adenovirais são administrados concomitantemente.
3. Método para estimular a produção de células T CD4+ e/ou CD8+ e/ou anticorpos específicos de patógeno em mamíferos, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao dito mamífero (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários derivados de um patógeno; (ii) um ou mais vetores adenovirais que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários derivados do dito patógeno; e (iii) um adjuvante; em que o um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários, o um ou mais vetores adenovirais e o adjuvante são administrados concomitantemente, por exemplo pela administração de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição supracitada.
4. Método para elevar uma resposta imune contra um patógeno, caracterizado pelo fato de que consiste em (a) administrar (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários derivados do dito patógeno; (ii) um ou mais vetores adenovirais que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários derivados do dito patógeno; e (iii) um adjuvante; em que o um ou mais polipeptídeos imunogênicos, o um ou mais vetor adenoviral e o adjuvante são administrados concomitantemente; e (b) opcionalmente repetir as etapas de (a).
5. Método para elevar uma resposta imune contra um patógeno, caracterizado pelo fato de que compreende administrar (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários derivados do dito patógeno; (ii) um ou mais vetores adenovirais que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários derivados do dito patógeno; e (iii) um adjuvante; em que o um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários, o um ou mais vetores adenovirais e o adjuvante são administrados concomitantemente; e em que o método não envolve administrar nenhuma dose preparadora de polipeptídeo imunogênico ou polinucleotídeo que codifica polipeptídeo imunogênico.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que um ou mais polipeptídeos imunogênicos, um ou mais vetores adenovirais e um adjuvante são co-formulados.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a produção de células T CD4+ e células T CD8+ e anticorpos específicos de patógeno é estimulada.
8. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários derivados de um patógeno; (ii) um ou mais vetores adenovirais que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários derivados do dito patógeno; e (iii) um adjuvante.
9. Método ou composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizadofa) pelo fato de que um ou mais dos ditos um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários são substancialmente os mesmos como um ou mais dos ditos um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários.
10. Método ou composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizadofa) pelo fato de que um ou mais dos ditos um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários contêm pelo menos um antígeno que é substancialmente o mesmo como um antígeno contido em um ou mais dos ditos um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários.
11. Método ou composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizadofa) pelo fato de que um ou mais dos polipeptídeos imunogênicos primários compreendem pelo menos um epítopo de célula T.
12. Método ou composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de I a 11, caracterizado(a) pelo fato de que o um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários compreendem pelo menos um epítopo de célula B.
13. Método ou composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizadofa) pelo fato de que um ou mais dos ditos um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários e um ou mais dos ditos um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários compartilham um ou mais epítopos de célula B e/ou célula T idênticos.
14. Método ou composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado(a) pelo fato de que nenhum do um ou mais dos ditos um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários são substancialmente os mesmos ou não contêm nenhum antígeno em comum com um ou mais dos ditos um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários.
15. Método ou composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado(a) pelo fato de que um ou mais dos vetores adenovirais são derivados de um adenovírus humano.
16. Método ou composição de vacina de acordo com a reivindicação 15, caracterizadofa) pelo fato de que o sorotipo do adenovírus humano é selecionado de Adi, Ad2, Ad4, Ad5, Ad6, AdlI, Ad 24, Ad34 e Ad35.
17. Método ou composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado(a) pelo fato de que um ou mais dos vetores adenovirais é derivado de um adenovírus de primata não humano.
18. Método ou composição de vacina de acordo com a reivindicação 17, caracterizadofa) pelo fato de que o sorotipo de adenovírus de primata não humano é selecionado dos sorotipos de adenovírus de chimpanzé Pan5, Pan6, Pan7 e Pan9.
19. Método ou composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, caracterizadofa) pelo fato de que o patógeno é o HIV.
20. Método ou composição de vacina de acordo com a reivindicação 19, caracterizado(a) pelo fato de que os polipeptídeos imunogênicos contêm antígenos derivados do HIV que são selecionados de Env, Nef, Gag, e Pol e derivados imunogênicos destes e fragmentos imunogênicos destes.
21. Método ou composição de vacina de acordo com a reivindicação 20, caracterizado(a) pelo fato de que um polipeptídeo imunogênico primário é o p24-RT-Nef-pl7.
22. Método ou composição de vacina de acordo com a reivindicação 20 ou reivindicação 21, caracterizadofa) pelo fato de que um polipeptídeo imunogênico secundário é o Gag-RT-Nef.
23. Método ou composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, caracterizadofa) pelo fato de que o patógeno é o Plasmodium falciparum e/ou Plasmodium vivax.
24. Método ou composição de vacina de acordo com a reivindicação 23, caracterizadofa) pelo fato de que os polipeptídeos imunogênicos contêm antígenos derivados de Plasmodium falciparum e/ou Plasmodium vivax que são selecionados da proteína circunsporozoíta (CS), MSP-1, MSP-3, AMA-1, LSA-1, LSA-3 e derivados imunogênicos destes ou fragmentos imunogênicos destes.
25. Método ou composição de vacina de acordo com a reivindicação 24, caracterizadofa) pelo fato de que um/o polipeptídeo imunogênico é a proteína híbrida RTS.
26. Método ou composição de vacina de acordo com a reivindicação 25, caracterizadofa) pelo fato de que RTS é apresentada na forma de uma partícula mista conhecida como RTS,S.
27. Método ou composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24 a 26, caracterizado(a) pelo fato de que um/o polipeptídeo imunogênico codificado por um polinucleotídeo é a proteína CS de Plasmodium falciparum ou fragmento imunogênico deste.
28. Método ou composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, caracterizado(a) pelo fato de que o patógeno é Mycobacterium tuberculosis.
29. Método ou composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 28, caracterizado(a) pelo fato de que o adjuvante compreende um estimulador preferencial de respostas Thl.
30. Método ou composição de vacina de acordo com a reivindicação 29, caracterizadofa) pelo fato de que o adjuvante compreende QS21 e/ou 3D-MPL e/ou CpG.
31. Método ou composição de vacina de acordo com a reivindicação 30, caracterizadoía) pelo fato de que o adjuvante compreende QS21 e 3D-MPL.
32. Método ou composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 31, caracterizadofa) pelo fato de que o adjuvante contém uma emulsão de óleo em água.
33. Método ou composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 31, caracterizadofa) pelo fato de que o adjuvante contém lipossomas.
34. Método para estimular uma resposta imune em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição de vacina como definida em qualquer uma das reivindicações de 8 a 33.
35. Uso de uma composição de vacina como definida em qualquer uma das reivindicações de 8 a 33, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para estimular uma resposta imune em um mamífero.
36. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 33, caracterizada pelo fato de que é para o uso na estimulação de uma resposta imune em um mamífero.
37. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários derivados de um patógeno; (ii) um ou mais vetores adenovirais que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos secundários derivados do dito patógeno; e (iii) um adjuvante.
38. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos primários derivados de um patógeno e um adjuvante; e (ii) um ou mais vetores adenovirais secundários que compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos derivados do dito patógeno.
39. Método, ou vacina, ou kit, ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de precedentes, caracterizados pelo fato de que os polipeptídeos imunogênicos primários compreendem p24-RT-Nef-pl7, o adjuvante compreende 3D-MPL e QS21 em um lipossoma tal como o adjuvante B aqui contido, e o vetor adenoviral compreende um vetor do sorotipo Pan 7 do adenovírus de chimpanzé que compreendem um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo imunogênico Gag-RT-Nef, opcionalmente otimizado no códon.
40. Método, ou vacina, ou kit, ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de precedentes, caracterizados pelo fato de que um, ou dois, ou todos dos componentes de polipeptídeo, vetor adenoviral e adjuvante são combinados com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
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