BR112019026126A2

BR112019026126A2 - vetores de poxvírus que codificam antígenos do hiv e métodos de uso dos mesmos

Info

Publication number: BR112019026126A2
Application number: BR112019026126-5A
Authority: BR
Inventors: Frank Wegmann; Johannes Petrus Maria Langedijk; Jerome Hubertina Henricus Victor Custers; Viki BOCKSTAL; Markus Kalla
Original assignee: Janssen Vaccines & Prevention B.V.; Bavarian Nordic A/S
Priority date: 2017-06-15
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2020-06-30
Also published as: MA49397A; AU2018283811A1; CO2019014677A2; AU2018283811B2; US11229693B2; EP3638302C0; US20220088172A1; CN110958887B; EP3638302B1; CN110958887A; ES2976495T3; JP7272965B2; US11723970B2; EP3638302A1; EA202090049A1; JP2020527029A; KR20200015759A; WO2018229711A1; US20200138938A1; CA3066573A1

Abstract

A presente invenção refere-se a vetores de poxvírus que codificam um antígeno sintético do envelope do HIV e outros antígenos do HIV, assim como se refere a composições que contêm tais vetores de poxvírus e a usos de tais vetores de poxvírus como vacinas para proporcionar uma melhor imunidade contra HIV. Também são proporcionadas combinações de vacina que contêm os vetores de poxvírus descritos, vetores de adenovírus que codificam um ou mais antígenos de HIV e um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados, e métodos de uso das combinações de vacina para proporcionar melhor imunidade contra HIV.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETO- RES DE POXVÍRUS QUE CODIFICAM ANTÍGENOS DO HIV E MÉ- TODOS DE USO DOS MESMOS".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido tem o direito de prioridade ao abrigo do 35 U.S.C. $ 119(e) para Pedido de Patente Provisório dos Estados Uni- dos Nº 62/520.079, depositado em 15 de junho de 2017, cujo conteú- do é aqui incorporado na íntegra como referência. REFERÊNCIA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELE-

TRONICAMENTE

[0002] Este pedido contém uma listagem de sequências, que é enviada eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de sequên- cias em formato ASCII com um nome de arquivo "688097-33 1WO Lis- tagem de Sequências", data de criação de 7 de Junho de 2017, e ten- do um tamanho de 174,4 KB. A listagem de sequências apresentada via EFS-Web é parte integrante do relatóro e é aqui incorporado na íntegra como referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) afeta milhões de pessoas em todo o mundo, e a prevenção do HIV por meio de uma vacina eficaz permanece uma prioridade muito elevada, mesmo em uma era de tratamento antirretroviral generalizada. HIV-1 é a cepa mais comum e patogênica do vírus, com mais de 90% dos casos de HIV/AIDS resultando da infecção com HIV-1 grupo M. O grupo M é ainda subdividido em clados ou subtipos. Uma vacina eficaz idealmen- te seria capaz de induzir tanto respostas celulares potentes quanto an- ticorpos amplamente neutralizantes, capazes de neutralizar cepas de HIV-1 a partir de diferentes clados.

[0004] A elevada variabilidade genética do HIV-1 faz com que o desenvolvimento de uma vacina contra o HIV-1 seja um desafio sem precedentes. De modo a melhorar a cobertura de epítopos de células T potenciais e melhorar as respostas celulares, antígenos "mosaico" Gag, Pol e Env do HIV-1, derivados do Grupo de Antígenos (Gag) do HIV, proteínas Polimerase (Pol) e do Envelope (Env), foram descritos por outros e desenvolvidos em uma tentativa de proporcionar uma co- bertura máxima de epítopos de células T potenciais (por exemplo, Ba- rouch et al., Nat Med 2010, 16: 319-323). Os antígenos mosaico são similares em comprimento e estrutura de domínio a antígenos do tipo selvagem e que ocorrem naturalmente do HIV-1.

[0005] Por exemplo, os antígenos mosaico do HIV descritos e usados em vacinas incluem aqueles descritos em Barouch et al., su- pra, e WO 2010/059732, tais como: (a) antígenos mosaico Gag, incluindo: (a) () uma primeira sequência do mosaico Gag ("mos1Gag") possuindo a sequência de aminoácidos como estabeleci- da em SEQID NO: 1, e (a) (ii) uma segunda sequência do mosaico Gag ("mos2Gag") possuindo a sequência de aminoácidos como estabeleci- da em SEQ ID NO: 2; (b) antígenos mosaico Pol, incluindo: (b) (i) uma primeira sequência do mosaico Pol ("mos1Pol") possuindo a sequência de aminoácidos como estabelecida em SEQ ID NO:3,e (b) (ii) uma segunda sequência do mosaico Pol (“mos2Pol") possuindo a sequência de aminoácidos como estabelecida em SEQ ID NO: 4; e (c) antígenos mosaico Env, incluindo: (c) (i) uma primeira sequência do mosaico Env ("mos1Env") possuindo a sequência de aminoácidos como estabelecida em SEQ ID NO: 5,e

(c) (ii) uma segunda sequência do mosaico Env ("mos2Env") possuindo a sequência de aminoácidos como estabeleci- da em SEQ ID NO: 6.

[0006] Sequências que codificam esses antígenos foram clonados em vetores, por exemplo, tais como vetores recombinantes adenovi- rais, por exemplo, adenovírus sorotipo recombinante 26 (rAd26), e es- ses vetores recombinantes foram anteriormente usados como vacinas para gerar respostas imunes aos antígenos (ver, por exemplo, Ba- rouch et al., supra; e WO 2010/059732). Por exemplo, as sequências do antígeno mosaico mos 1Gag e mos1Pol são tipicamente combina- das em uma proteína de fusão de Gag e Pol (“mos1GagPol"), e sua sequência de codificação é clonada em um primeiro vetor Ad26 (“rAd26.mos1GagPol"); e as sequências do antígeno mos2Gag e mos2Pol são combinados em outra proteína de fusão de Gag e Pol (“mos2GagPol"), e sua sequência de codificação é clonada em um se- gundo vetor Ad26 (“TAd26.mos2GagPol"). Construtos que codificam mos1Env e mos2Env são tipicamente clonados em vetores Ad26 sepa- rados ("rAd26.mos1Env" e "rAd26.mos2Env", respectivamente).

[0007] Um conjunto de tais antígenos mosaico como descrito aci- ma dá boa cobertura global dos isolados do grupo M de HIV-1, no qual os vetores rAd26 1 que codificam as sequências dos antígenos mosai- co 1 (por exemplo, rAd26.mos1GagPol e rAd26.mos1Env) favorrecem clado B e subtipos CRFO1 HIV-1, e os vetores rAd26 que codificam as sequências do antígeno mosaico 2 (por exemplo, rAd26.mos2GagPol e rAd26.mos2Env) favorecem as cepas do clado C. Os antígenos mo- saico Gag, Pol e Env do HIV-1 expressos em vetores rAd26 podem ser utilizados para melhorar tanto a largura quanto a profundidade de res- postas de linfócitos T específicos a antígeno em macacos rhesus, sem comprometer a magnitude tanto das respostas celulares quanto humo- rais, quando comparados com antígenos de HIV-1 de sequências de consenso ou naturais (Barouch et al., supra; e WO 2010/059732).

[0008] No entanto, após esforços adicionais de desenvolvimento sobre os componentes de vacina acima descritos, verificou-se que rAd26.mos2Env mostrou expressão superficial de células e resposta imune não ótimas em primatas não humanos, mas além disso exibiu uma estabilidade genérica não ótima até agora não declarada, inespe- rada e imprevisível durante o processo de fabricação, em comparação com os outros vetores rAd26, tal como rAd26.mos1Env. Assim, vaci- nas que contêm rAd26.mos2Env podem resultar em respostas imuno- lógicas não ótimas contra subtipos do clado C do HIV-1, uma vez que o antígeno mosaico mos2Env favorece cepas do clado C do HIV-1. Por conseguinte, existe a necessidade de uma alternativa para o antí- geno mos2Env em vacinas contra o HIV que possam ser usadas para induzir respostas imunológicas melhoradas contra clado C do o HIV-1.

[0009] Os vetores de poxvírus (vírus da varíola), como o vírus Va- ccinia Ankara modificado (MVA), podem ser usados para codificar an- tígenos de interesse para fins de vacinação. Existe uma necessidade no estado da técnica de vetores de poxvírus que codificam novas combinações de antígenos do HIV.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00010] A invenção refere-se a proteínas de envelope sintéticas do vírus da imunodeficiência humana (HIV) que têm uma melhor expres- são e estabilidade genética na superfície celular, em comparação com o antígeno mos2Env anteriormente descrito, e a um novo vetor de poxvírus que compreende sequência de ácidos nucleicos que codifica as proteínas sintéticas do envelope do HIV. A invenção também se refere a composições e métodos de uso desses novos vetores de pox- vírus que compreendem sequência de ácidos nucleicos que codifica as proteínas sintéticas do envelope do HIV para induzir aumento de res- postas imunes contra o HIV-1, em particular os clados C e B do HIV-1,

de preferência quando usados em combinação com outros antígenos do HIV.

[00011] Em aspectos particulares, a invenção refere-se a vetores de poxvírus, preferencialmente vetores do vírus Vaccinia Ankara modifi- cado (MVA), que compreendem ácido nucleico que codifica a proteína sintética do envelope do HIV e que compreendem de preferência uma sequência de ácidos nucleicos que codifica outros antígenos do HIV.

[00012] Em um aspecto geral, a invenção refere-se a um ácido nu- cleico que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. A proteí- na sintética do envelope do HIV pode ainda compreender uma se- quência de sinalização, por exemplo, uma sequência de sinalização que possui a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 9-12. Em uma modalidade da presente in- venção, a sequência sinalizadora possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

[00013] Em certas modalidades da presente invenção, a proteína sintética do envelope do HIV compreende ainda um domínio trans- membranar, de preferência um domínio transmembranar que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades da presente invenção, a proteína sintética do envelope do HIV compre- ende ainda um fragmento de um domínio citoplasmático, de preferência um fragmento de um domínio citoplasmático que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou os seus aminoácidos 1- 4 N-terminais (ou seja, NRVR). Em modalidades da presente invenção em que a proteína sintética do envelope do HIV compreende ainda um domínio transmembranar e um fragmento de um domínio citoplasmático, é preferível que a proteína também compreenda a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 37, a qual é fundida com término carboxila (C- terminal) de SEQ ID NO: 8 e o término amino (N-terminal) da região transmembranar.

[00014] Em uma modalidade mais preferida, a invenção refere-se a um vetor de poxvírus que compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 ou aa 1-686 de SEQ ID NO: 19. Mais preferencialmente, a pro- teína sintética do envelope do HIV codificada pelos ácidos nucleicos compreende ou consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

18.

[00015] Em modalidades preferidas da presente invenção, o vetor de poxvírus compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV, como descrito acima, e, pelo menos, um antígeno adicional do HIV. Em uma modalidade preferida da presente invenção, o vetor de poxvírus é um vetor do vírus Vaccinia Ankara modificado (MVA). Mais preferivelmente, o vetor do MVA compreende MVA-BN ou seus derivados.

[00016] Em uma modalidade preferida da presente invenção, o ve- tor de poxvírus vetor compreende (a) ácido nucleico que codifica um primeiro antígeno do envelope (Env) do HIV que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e de preferência compre- ende ainda ácido nucleico que codifica: (b) um segundo antígeno Env do HIV diferente do primeiro antígeno Env do HIV; (c) um terceiro antí- geno e quarto antígeno, sendo dois antígenos diferentes Gag do HIV; e (d) um quinto antígeno e sexto antígeno, sendo dois antígenos dife- rentes Pol do HIV. Em certas modalidades preferidas da presente in- venção, (b) o segundo antígeno Env do HIV compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; (c) o terceiro e quarto antígenos compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente; e (d) o quinto e o sexto antígenos compre- endem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO:

4, respectivamente. Em certas modalidades da presente invenção, o terceiro e quinto antígenos são fundidos em um primeiro antígeno de fusão Gag-Pol, compreendendo de preferência SEQ ID NO: 28; e o quarto e sexto antígenos são fundidos em um segundo antígeno de fu- são Gag-Pol, compreendendo de preferência SEQ ID NO: 29. Em certas modalidades particulares da presente invenção, o primeiro antígeno Env do HIV é codificado por SEQ ID NO: 41. Em uma ou mais modalidades particulares da presente invenção, o segundo antígeno Env do HIV é co- dificado por SEQ ID NO: 39; o primeiro antígeno de fusão Gag-Pol é co- dificado por SEQ ID NO: 38; e o segundo antígeno de fusão Gag-Pol é codificado por SEQ ID NO: 40.

[00017] Em modalidades da presente invenção em que o vetor de poxvírus é um vetor de MVA, tal como um vetor de MVA que compre- ende MVA-BN ou seus derivados, o primeiro antígeno de fusão Gag- Pol e o segundo antígeno Env são de preferência inseridos na região intergênica (IGR) 44/45 do genoma de MVA, e o segundo antígeno de fusão Gag-Pol e o primeiro antígeno Env são de preferência inseridos na IGR 88/89 do genoma de MVA. Mais preferencialmente, o primeiro antígeno de fusão Gag-Pol e o segundo antígeno de fusão Gag-Pol estão cada um sob o controle de um promotor separado, preferencial- mente um promotor Pr13.5, e o primeiro antígeno de Env e o segundo antígeno de Env estão cada um sob o controle de um promotor sepa- rado, de preferência um promotor PrHyb.

[00018] “Outro aspecto geral da presente invenção refere-se a uma composição, de preferência uma composição de vacina, que compre- ende uma quantidade imunogenicamente eficaz de um vetor de poxví- rus que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV de acordo com uma moda- lidade da invenção e preferencialmente que compreende ainda uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um ou mais antígenos adi-

cionais de HIV, e um veículo, em que o ácido nucleico que codifica a proteína sintética do envelope do HIV é operativamente ligada a uma sequência promotora. Em uma modalidade da presente invenção, a composição compreende ainda um vetor de adenovírus, de preferên- cia um vetor de adenovírus 26, que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Em certas modalidades da presente invenção, a com- posição compreende um vetor de poxvírus, de preferência um vetor de MVA, que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e que codifica preferencialmente antígenos do HIV adicionais. Em certas modalidades da presente invenção, as composições da invenção compreendem ainda vetores de expressão adicionais que codificam antígenos do HIV adicionais e/ou polipeptídeo antigênico isolado do HIV.

[00019] Em outro aspecto geral, a invenção refere-se a uma combi- nação de vacina para induzir uma resposta imunitária contra um vírus da imunodeficiência humana (HIV) em um indivíduo que necessite desse tratamento. Em uma modalidade da presente invenção, a com- binação de vacina compreende: (a) uma primeira composição de vacina que compreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de um vetor, preferivelmen- te um vetor de poxvírus, mais preferivelmente um vetor de MVA, que codifica (i) uma primeira proteína do envelope (Env) do HIV que é uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e que compreende ainda de preferên- cia um ácido nucleico que codifica: (ii) um segundo antígeno Env do HIV diferente do primeiro antígeno Env do HIV; (ili) um terceiro antíge- no e um quarto antígeno, sendo dois antígenos diferentes Gag do HIV; e (iv) um quinto antígeno e um sexto antígeno, sendo dois antígenos

Pol do HIV diferentes; e pelo menos um dos seguintes: (b) (1) uma segunda composição de vacina que compreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de um ou mais vetores, de preferência um ou vetores mais adenovírus, mais preferivelmente um ou mais vetores de adenovírus 26, que codifica um ou mais do primei- ro, segundo, terceiro, quarto, quinto e sexto antígenos do HIV, prefe- rencialmente que codifica uma ou mais antígenos do HIV que compre- endem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que con- siste de SEQ ID NOs: 1-5, 18, 28 e 29; e/ou (b) (ii) uma terceira composição de vacina que compreende um ou mais polipeptídeos que compreende uma quantidade imunoge- nicamente eficaz de um polipeptídeo antigênico do HIV isolado, por exemplo, um polipeptídeo que compreende resíduos 30-708 da se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e/ou um polipeptídeo que compreendendo resíduos 30-724 de SEQ ID nO: 36, em que a primei- ra composição e a segunda e/ou terceira composições estão presen- tes na mesma composição ou em uma ou mais composições diferen- tes.

[00020] Em uma modalidade em que a combinação de vacina com- preende uma segunda composição de vacina, a segunda composição de vacina compreende um ou mais vetores de adenovírus 26 recombi- nantes que codificam um ou mais antígenos que compreendem as se- quências de ácidos aminados selecionados do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1- 5, 18, 28 e 29, mais preferencialmente que compre- endem dois, três ou quatro vetores de adenovírus 26 recombinantes que codificam juntamente as SEQ ID NOs: 1,2,3,4,5e18.

[00021] Ainda outro aspecto geral da invenção refere-se a métodos para induzir uma resposta imunitária contra um vírus da imunodefici- ência humana (HIV) em um indivíduo que necessite desse tratamento, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição, tal como uma composição de vacina ou combinação de vacina, de acordo com uma modalidade da invenção. A invenção também se refere a méto- dos para induzir uma resposta imunitária contra o HIV, compreenden- do uma primeira imunização e reforço da resposta imune usando uma composição ou uma combinação de vacina de acordo com uma moda- lidade da invenção.

[00022] Em uma modalidade particular da presente invenção, um método de indução de uma resposta imune contra um HIV em um indi- víduo com necessidade desse tratamento compreende administrar ao indivíduo: (a) uma primeira vacina que compreende um ou mais veto- res de adenovírus recombinantes, de preferência vetores de Ad26, que codificam uma ou mais de SEQ ID NOs: 1,2,3,4, 56 18; e (b) uma segunda vacina que compreende um vetor de pox- vírus, preferencialmente um vetor de MVA, que codifica uma primeira proteína do envelope (Env) do HIV que é uma proteína sintética do en- velope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e que preferencialmente codifica outros antígenos de HIV, preferencialmente um segundo antígeno Env do HIV diferente do pri- meiro antígeno Env do HIV, um terceiro antígeno e um quarto antígeno que são dois antígenos Gag do HIV diferentes, e um quinto antígeno e sexto antígeno que são dois antígenos Pol do HIV diferentes, mais preferivelmente um ou mais antígenos do HIV que codificam as se- quências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-5, 28 e 29, em que a primeira vacina é uma vacina da pri- meira imunização e a segunda vacina é uma vacina de reforço, ou em que a segunda vacina é uma vacina da primeira imunização e a pri- meira vacina é uma vacina de reforço. Em certas modalidades da pre- sente invenção, um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados que compreendem de preferência uma quantidade imunogenicamente eficaz de um polipeptídeo antigênico do HIV isolado, por exemplo, um polipeptídeo que compreende os resíduos 30-708 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e/ou um polipeptídeo que compreende os resíduos 30-724 da SEQ ID NO: 36, são administrados ao indivíduo aproximadamente ao mesmo tempo que a vacina de reforço na mes- ma composição da vacina de reforço ou em uma composição separa- da da vacina de reforço.

[00023] Outro aspecto da invenção refere-se a uma célula, de pre- ferência uma célula isolada, que compreende um vetor de acordo com uma modalidade da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS DIVERSAS VISTAS DOS DESENHOS

[00024] O sumário anterior, bem como a descrição seguinte detalha- da da invenção, serão melhor compreendidos quando lidos em conjunto com os desenhos em anexo. Deve ser entendido que a invenção não está limitada às suas modalidades precisas apresentadas nos dese- nhos.

[00025] Nos desenhos:

[00026] as FIGS.1A-1C são representações esquemáticas da es- trutura de proteínas do envelope do HIV; a FIG. 1A mostra uma prote- ína do envelope do HIV de comprimento total; a FIG. 1B mostra a es- trutura de uma proteína do envelope do HIV de cadeia simples solúvel de acordo com uma modalidade da invenção, em que o domínio trans- membranar (TM) é substituído por um domínio de trimerização GCNA4, e o sítio de clivagem da furina sofreu mutação (sC4); a FIG. 1C€ mostra a estrutura de uma membrana de ligação às proteínas do envelope do HIV de acordo com uma modalidade da invenção, compreendendo um domínio transmembranar e um fragmento de um domínio citoplasmáti- co (C4D7);

[00027] arFliG.2 mostra níveis de expressão de proteína do envelo- pe sC1 do HIV solúvel, que se baseia na sequência do antígeno mo-

saico mos2Env com um domínio de trimerização adicional no C- terminal, e uma proteína sintética do envelope do HIV solúvel (sC4) de acordo com uma modalidade da invenção; expressão foi medida por Western blot quantitativo, utilizando um anticorpo policlonal contra gp120; plasmídeos que codificam sCl ou sC4 foram expressos transi- toriamente duas vezes, e cada transfecção foi quantificada por densi- tometria duas vezes; a proteína SC1 mostrou níveis de expressão mui- to baixos em comparação com a proteína do envelope do HIV sC4 sin- tética, que mostrou níveis de expressão relativamente elevados;

[00028] asFIGS.3Ae3B mostram a ligação de proteínas sintéticas do envelope do HIV com anticorpo monoclonal 17b (mMAb17b) na pre- sença (cinza claro) e ausência (cinza escuro) de CD4 solúvel, como determinado por ensaio de ELISA; a FIG. 3A mostra ligação de sSC1; a FIG. 3B mostra ligação de sC4;

[00029] afFlG.4é uma imagem de um Western blot de uma eletro- forese em gel de poliacrilamida nativa da proteína sSC1 e da proteína do envelope do HIV sC4 sintética;

[00030] A FIG.5 mostra os níveis de expressão na superfície celu- lar relativos das proteínas sintéticas do envelope do HIV ligadas à membrana C1, C1D7, C4 e C4D7 por análise FACS de células que ex- pressam essas proteínas utilizando um anticorpo policlonal anti-gp120 (GP120), e mediante ligação a anticorpos amplamente neutralizantes PG9 (PG9) e PG16 (PG16) que são dependentes de estrutura quaterná- ria e preferencialmente ligam-se a trímeros Env corretamente enovela- dos;

[00031] alFlG.6 é uma representação gráfica da estabilidade de vetores de adenovírus que contêm sequências que codificam proteí- nas sintéticas do envelope do HIV da presente invenção, incluindo C4 (FLC4), C4D7 e sC4 de comprimento completo após múltiplas passa- gens virais; vetores de adenovírus recombinantes 26 foram gerados em células PER.C6; após o período inicial de três passagens para trans- fecção e purificação em placas, cinco placas foram selecionadas e po- tencializadas para 10 passagens em formato T25, resultando em um número total de passagens virais (vpn) de 13; é mostrada a estabilidade após vpn 3, 5, 10 e 13, conforme determinado por reação em cadeia da polimerase (PCR) em cassete do transgene E1; por exemplo, três placas com meio 3/5 de cinco placas testadas mostraram-se estáveis, e cinco placas com meio 5/5 de cinco placas testadas mostraram-se estáveis;

[00032] asFIGS.7Ae7B mostram títulos de neutralização de vírus contra partículas de vírus pseudotipadas do envelope do HIV-1 (EVPs) em um ensaio de neutralização baseado em células TZM-bl em coe- lhos; valores de IC5o transformados por log10 dos grupos que recebe- ram doses elevadas de vetor adenoviral foram medidos contra EVPs VSV-G (controle negativo) e MW965.26 (nível 1A clado C) nas 1º, 8º, 14º e 20º semanas; cada ponto representa um valor IC5o transformado por log10 de um coelho individual, com a média do grupo indicada por uma linha horizontal; HD: diluição mais elevada testada (linha superior sólida); LD: diluição mais baixa testada (linha inferior sólida); LOB: limi- te de fundo, valor percentil de 95 de amostras negativas compiladas (linha pontilhada); valores de IC5o log 10 que excedam o limite de LD ou HD foram fixados na linha correspondente; uma comparação de uma via não paramétrica com controle usando o método de Dunn para classificação conjunta foi realizada para cada ponto de tempo; diferen- ças estatisticamente significativas estão indicadas nos gráficos: * = P<0,05, ** = P<0,01 e *** = P<0,001; a FIG. 7A mostra os resultados com VSV-G (controle negativo); e a FIG. 7B mostra os resultados com MW965.26 (nível 1A clado C);

[00033] alfFlG.8é uma representação gráfica de inserções em lo- cais específicos do genoma do MVA para o vetor MVA-mMBNA414;

Pr13.5 e PrHyb são sequências promotora; IGRs são regiões intergê- nicas;

[00034] as FlIGS.9A,9Be9C mostram respostas imunes produzi- das em coelhos no 85º dia após a imunização com Ad26.Mos.HIV (abreviado como Ad26), sozinho ou combinado com MVA-mBN414 (abreviado nas FIGS. 9A-9C como "MVA'"), clado C gp140 (abreviado como GP140) ou uma combinação dos mesmos; machos (M) e fê- meas (F) são mostrados separadamente; as FIGS. 9A e 9B mostram títulos ELISA específicos a clado C gp140 e mosaico gp140, respecti- vamente; cada ponto representa o valor em potência relativo transfor- mado por log10 (log10 UE/ml) de um coelho individual, com média do grupo indicada como uma linha horizontal; ULOQ, limite superior de quantificação (linha superior sólida), LLOQ, limite inferior de quantifi- cação (linha inferior sólida), LOB, limite de fundo (linha pontilhada); todos os valores abaixo do LOB foram definidos no nível LOB; análise estatística consistiu de um modelo Tobit por sexo; para a comparação dos grupos 1, 2 e 3, foi aplicada uma correção de Tukey; diferenças estatisticamente significativas estão indicadas nos gráficos: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001; a FIG. 9€C mostra títulos de neutralização de ví- rus contra partículas de vírus pseudotipadas do envelope BaL do HIV- 1 em um ensaio de neutralização baseado em células TZM-bI utilizan- do soro de coelho; cada ponto representa o valor de IC5o transformado por log10 de um coelho individual, com a média do grupo indicada por uma linha horizontal; HD: diluição mais elevada testada (linha superior sólida); LD: diluição mais baixa testada (linha inferior sólida); LOB: limi- te de fundo, valor percentil de 95 de amostras negativas compiladas (linha pontilhada); valores de IC5so log10 que excedam o limite de LD ou HD foram fixados na linha correspondente; análise estatística consistiu de um modelo Tobit por sexo; para comparação dos grupos 1, 2 e 3, foi aplicada uma correção de Tukey; diferenças estatisticamente significa-

tivas estão indicadas nos gráficos: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001; e

[00035] as FIGS. 10A4-10E mostram respostas imunes originadas em ratinhos após imunização única (5º semana) ou imunização de re- forço (7º semana) com Ad26.Mos4.HIV (abreviado como Ad26) segui- da de imunização de reforço com MVA-mBN414 ou imunização de re- forço com MVA-mBN414 homólogo (abreviado nas FIGS. 10A-10E como "MVA"); os grupos | e 2 foram preparadas na semana O com 2,5x10º ou 2,5x108 vp de Ad26.Mos4.HIV, respectivamente, e reforça- dos na 5º semana com 2,8x10º ou 2,8x10º de TCIDso de MVA- MBNA414, respectivamente; os grupos 3 e 4 foram imunizados na se- mana O e na 5º semana com 2,8x10º ou 2,8x10º de TCIDso de MVA- MBN414, respectivamente; o grupo 5 (controle) foi preparado com 2,5x10º de Ad26.Vazio e reforçado com 2,8x10º de TCIDso de MVA- BN-vazio; as FIGS. 10A e 10B mostram títulos de ELISA específicos a mosaico gp140; cada ponto representa o título final transformado por log10 de um ratinho individual, com a média do grupo indicada como uma linha horizontal; UD, limite superior da diluição; LD, menor dilui- ção; todos os valores abaixo do LD foram definidos no nível LD; análi- se estatística consistiu de um modelo de Tobit por dose; diferenças estatisticamente significativas estão indicadas nos gráficos: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001; as FIGS. 10C-10E mostram dados de ELISPOT para interferão-gama (IFN-y) na 7º semana do estudo; cada ponto re- presenta a contagem de células formadoras de manchas (SFC) por 10º esplenócitos de um camundongo individual, com a média do grupo indicada como uma linha horizontal; LOD: limite de detecção, valor percentil de 95 de controles não estimulados compilados (linha ponti- lhada); respostas específicas a Env, Gag e Pol foram determinadas por estimulação com peptídeos imunodominantes Env, Gag e Pol IHIGPGRAFYTAGDI (SEQ ID NO: 44), AMQMLKETI (SEQ ID NO: 45) e YYDPSKDLI (SEQ ID NO: 46), respectivamente; diferenças estatisti-

camente significativas estão indicadas nos gráficos: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00036] Várias publicações, patentes e artigos são citados ou des- critos em segundo plano e ao longo de todo o relatório descritivo; cada uma dessas referências é aqui incorporada na íntegra como referên- cia. Discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou similares que tenham sido incluídos no presente relatório tem a finali- dade de proporcionar contexto para a presente invenção. Tal discus- são não é uma admissão de que qualquer uma ou todas essas ques- tões fazem parte do estado da técnica no que diz respeito a quaisquer invenções divulgadas ou reivindicadas.

[00037] A menos que definido de outro modo, todos os termos téc- nicos e científicos aqui empregados têm o mesmo significado normal- mente entendido por aquele versado na técnica à qual esta invenção pertence. Caso contrário, certos termos aqui usados têm os significa- dos como apresentados no relatório descritivo. Todas as patentes, pe- didos de patente publicados e publicações aqui citados são incorpora- das como referência como se fossem totalmente apresentados aqui. Deve-se notar que como usados aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" incluem referência plural a menos que o contexto claramente dite o contrário.

[00038] Ao longo deste relatório e das reivindicações que se se- guem, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra "com- preender" e variações tais como "compreende" e "compreendendo" serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro declarado ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de nú- meros inteiros ou etapas. Quando aqui utilizado, o termo "compreen- dendo" pode ser substituído pelo termo "contendo" ou "incluindo" ou às vezes quando aqui usado com o termo "tendo".

[00039] “Quando aqui usado, "consistindo de” exclui qualquer ele- mento, etapa ou ingrediente não especificado no elemento de acordo com a reivindicação. Quando aqui usado, "consistindo essencialmente de” não exclui materiais ou etapas que não afetem materialmente as características básicas e novas da reivindicação. Qualquer um dos termos "compreendendo", "contendo", "incluindo" e "tendo", sempre que aqui empregados no contexto de um aspecto ou modalidade da inven- ção acima referidos, pode ser substituído pelo termo "conssistindo de” ou "consistindo essencialmente de” para variar escopos da invenção.

[00040] — Como aqui utilizado, o termo conjuntivo "e/ou" entre vários elementos enumerados é entendido como abrangendo ambas as op- ções individuais e combinadas. Por exemplo, quando dois elementos são conjugados por "e/ou", uma primeira opção refere-se à aplicabili- dade do primeiro elemento sem o segundo. Uma segunda opção refe- re-se à aplicabilidade do segundo elemento sem o primeiro. Uma ter- ceira opção refere-se à aplicabilidade do primeiro e segundo elemen- tos juntamente. Qualquer uma dessas opções é entendida enquadrar- se no significado e, portanto, satisfazer a exigência do termo "e/ou" como aqui utilizado. Aplicabilidade simultânea de mais de uma das op- ções também é entendida enquadrar-se no significado e, portanto, sa- tisfazer a exigência do termo "e/ou".

[00041] Como usado aqui, "indivíduo" significa qualquer animal, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um humano, a quem será ou foi administrado um vetor, composição ou combinação de vacina de acordo com modalidades da presente invenção da inven- ção. O termo "mamífero", como aqui utilizado, abrange qualquer mamí- fero. Exemplos de mamíferos incluem, mas sem limitação aos mesmos, vacas, cavalos, ovelhas, porcos, gatos, cães, camundongos, ratos, coe- lhos, cobaias, macacos, humanos etc., mais preferencialmente um hu-

mano.

[00042] A invenção refere-se de modo geral a proteínas sintéticas do envelope do HIV, ácido nucleico e vetores que codificam as proteí- nas sintéticas do envelope do HIV, e a métodos de indução de uma resposta imunitária contra HIV com vetores que codificam as proteínas sintéticas do envelope do HIV e que opcionalmente codificam outros antígenos do HIV, sozinhos ou em combinação com um ou mais veto- res que codificam um ou mais antígenos do HIV e/ou em combinação com um ou mais polipeptídeos antigênicos de HIV isolados.

[00043] O vírusda imunodeficiência humana (HIV) é um membro do gênero Lentivirinae, que é parte da família dos Retroviridae. Duas es- pécies de HIV infectam seres humanos: HIV-1 e HIV-2. HIV-1 é a cepa mais comum de vírus HIV, e é conhecido por ser mais patogênica do que HIV-2. Como aqui empregados, os termos "vírus da imunodefici- ência humana" e "HIV" referem-se, mas sem limitação aos mesmos, a HIV-1 e HIV-2.

[00044] HIV é classificado em vários subtipos, com um elevado grau de divergência genética. Como aqui utilizado, o termo "clado do HIV" ou "subtipo de HIV" refere-se a vírus da imunodeficiência humana relacionado classificados de acordo com seu grau de similaridade ge- nética. Atualmente, existem três grupos de HIV-1 isolados: 6 NE O. O grupo M (cepas principais) consiste de pelo menos dez clados, de A a J. O grupo O (cepas externas) pode consistir de um número semelhan- te de clados. O grupo N é um novo HIV-1 isolado que não foi classifi- cado em ambos os grupos H ou O.

[00045] “Como aqui utilizado, os termos "polipeptídeo antigênico do HIV", "proteína antigênica do HIV", "antígeno do HIV" e "imunógeno do HIV" referem-se a um polipeptídeo capaz de induzir uma resposta imune, por exemplo, uma resposta mediada humoral e/ou celular, con- tra HIV em um indivíduo. O polipeptídeo ou antígeno antigênico pode ser uma proteína do HIV, um fragmento ou epítopo seu, ou uma com- binação de várias proteínas do HIV ou porções destas, que podem in- duzir uma resposta imune ou produzir uma imunidade, por exemplo, imunidade protetora, contra o HIV em um indivíduo.

[00046] Preferencialmente, um polipeptídeo ou antígeno antigênico é capaz de aumentar em um hospedeiro uma resposta imunitária pro- tetora, por exemplo, induzir uma resposta imunitária contra uma doen- ça ou infecção viral, e/ou produzir uma imunidade em (isto é, animais vacinados) um indivíduo contra uma doença ou infecção viral, que pro- tege o indivíduo contra a doença ou infecção viral. Por exemplo, o po- lipeptídeo ou antígeno antigênico pode compreender uma proteína ou fragmentos desta a partir de Vírus da Imunodeficiência Símia (SIV) ou um HIV, tal como a proteína gp160 do envelope do HIV ou SIV, as pro- teínas da matriz/capsídeo do HIV ou SIV, e os produtos gênicos gag, pol e env de HIV ou SIV.

[00047] —Polipeptídeo ou antígeno antigênico de HIV pode ser qual- quer antígeno de HIV-1 ou HIV-2 ou um fragmento seu. Exemplos de antígenos de HIV incluem, mas sem limitação aos mesmos, produtos gênicos de gag, pol e env, que codificam proteínas estruturais e enzi- mas essenciais. Produtos gênicos de gag, pol e env são sintetizados como poliproteínas, que são posteriormente transformados em vários outros produtos de proteínas. O produto proteíco principal do gene gag é a poliproteina gag da proteína estrutural viral, que é subsequente- mente transformada em MA, CA, SP1, NC, SP2 e produtos da proteína P6. O gene pol codifica enzimas virais (Pol, polimerase) e o produto proteico principal é ainda processado em RT, RNase H, IN e produtos de proteína PR. O gene env codifica proteínas estruturais, especifica- mente glicoproteínas do envelope do vírion. O produto proteíco princi- pal do gene env é gp160, que é subsequentemente transformado em gp120 e gp41. Outros exemplos de antígenos do HIV incluem proteí-

nas reguladoras de gene Tat e Rev; proteínas acessórias Nef, Vpr, Vif e Vpu; proteínas de capsídeo, proteínas de nucleocapsídeo e proteína viral p24.

[00048] Em certas modalidades da presente invenção, o polipeptí- deo ou antígeno antigênico de HIV compreende um antígeno Gag, Env ou Pol do HIV, ou qualquer porção antigênica ou epítopo ou combina- ção dos mesmos, de preferência um antígeno Gag, Env ou Pol do HIV- 1, ou qualquer porção antigênica ou epítopo ou combinação dos mes- mos.

[00049] —Polipeptídeos antigênicos do HIV podem também ser antí- genos mosaico de HIV. Como aqui utilizado, "antígeno mosaico" refe- re-se a uma proteína recombinante montada a partir de fragmentos de sequências naturais. Antígenos mosaico assemelham-se a antígenos naturais, mas são otimizados para maximizar a cobertura de epítopos potenciais de células T encontrados nas sequências naturais, o que melhora a amplitude e a cobertura da resposta imune. Antígenos mo- saico do HIV para uso com a invenção são preferencialmente antíge- nos mosaico Gag, Pol e/ou Env, e mais preferencialmente um antíge- no mosaico Gag, Pol e/ou Env do HIV-1. Como aqui utilizado, "um an- tígeno mosaico Gag, Pol e/ou Env do HIV" refere-se especificamente a um antígeno mosaico que compreende múltiplos epítopos derivados de uma ou mais das sequências da poliproteína Gag, Pol e/ou Env do HIV.

[00050] Em uma modalidade da presente invenção, um antígeno mosaico do HIV para utilização com a invenção é um antígeno mosai- co Gag do HIV com epítopos derivados das sequências de produtos do gene gag (exemplos são fornecidas em SEQ ID NOs: 1, 2); um an- tígeno mosaico Pol do HIV com epítopos derivados das sequências de produtos do gene pol (exemplos são fornecidos em SEQ ID NOs: 3, 4); ou um antígeno mosaico Env do HIV com epítopos derivados das se-

quências de produtos do gene env (exemplos são fornecidos em SEQ ID NOs: 5, 6; também os antígenos sintéticos da invenção, por exem- plo, em SEQ ID NOs: 8, 17, 18, 19, podem ser considerados antígenos mosaico Env do HIV). Em certas modalidades da presente invenção, um antígeno mosaico do HIV para uso com a invenção compreende uma combinação de epítopos derivados de sequências de produtos dos genes gag, pol e/ou env. Exemplos ilustrativos e não limitativos incluem antígenos mosaico Env-Pol com epítopos derivados das se- quências dos produtos dos genes env e pol; antígenos mosaico Gag- Pol com epítopos derivados das sequências dos produtos dos genes gag e pol (exemplos são fornecidos em SEQ ID NOs: 28, 29); e antí- genos mosaico Gag-Env com epítopos derivados das sequências de produtos dos genes gag e env. As sequências de produtos dos genes gag, pol e env podem ser derivadas de um ou mais clados.

[00051] Exemplos de antígenos mosaico Gag, Pol e/ou Env do HIV que podem ser usados na invenção incluem aqueles descritos em, por exemplo, US20120076812; Barouch et a/., Nat Med 2010, 16: 319-323; E Barouch et a/., Cell 155: 1-9, 2013, todos os quais são aqui incorpo- rados na íntegra como referência. Preferencialmente, antígenos mo- saico Gag, Pol e/ou Env do HIV para uso com a presente invenção in- cluem, mas sem limitação aos mesmos, mos1Gag (SEQ ID NO: 1), mos2Gag (SEQ ID NO: 2), mos1Pol (SEQ ID NO : 3), mos2Pol (SEQ ID NO: 4), mos1Env (SEQ ID NO: 5), mos2Env (SEQ ID NO: 6), mos1GagPol (SEQ ID NO: 28), mos2GagPol (SEQ ID NO: 29), e suas combinações.

[00052] — Como aqui utilizado, cada um dos termos "proteína do en- velope do HIV", "proteína env" e "Env" refere-se a uma proteína que é expressa no envelope de um vírion do HIV e permite que um HIV dire- cione-se e alcance a membrana plasmática de células infectadas pelo HIV, ou um fragmento ou derivado da mesma que possa induzir uma resposta imune ou produzir uma imunidade contra o HIV, em um indi- víduo com necessidade desse tratamento. O gene env de HIV codifica a proteína precursora gp160, que é clivada proteoliticamente nas duas glicoproteínas do envelope maduras, gp120 e gp41. A reação de cliva- gem é mediada por uma protease de célula hospedeira, furina, em uma sequência altamente conservada em precursores da glicoproteína do envelope retroviral. Mais especificamente, gp160 trimeriza-se em (9p160)3 e em seguida sofre clivagem nas duas glicoproteínas não co- valentemente associadas gp120 e gp41. A entrada do vírus é subse- quentemente mediada por um trímero dos heterodímeros gp120/gp41. Gp120 é o fragmento de ligação ao receptor, e liga-se ao receptor CD4 em uma célula-alvo que possui tal receptor, tal como, por exemplo, uma célula T auxiliares. Gp41, que não se liga covalentemente a gp120, é o fragmento de fusão e proporciona a segunda etapa pela qual HIV entra na célula. Gp41 é originalmente enterrado no envelope viral, mas quando gp120 se liga a um receptor de CDA4, gp120 muda sua conformação levando gp41 a se tornar exposta, quando ela pode auxiliar na fusão com a célula hospedeira. Gp140 é o ectodomínio não clivado de gp160 trimérica, isto é, (9p160)3, que foi utilizada como um substituto para o estado nativo da espícula viral clivada.

[00053] De acordo com modalidades da invenção, uma "proteína do envelope de HIV" pode ser uma proteína gp160, gp140, gp120, gp41, combinações, fusões, truncamentos ou seus derivados. Por exemplo, uma "proteína do envelope de HIV" pode incluir uma proteína gp120 associada de forma não covalente a uma proteína gp41. Ela pode também incluir uma proteína gp140 trimérica estabilizada que pode ter ou ser modificada para incluir um domínio de trimerização que estabili- za trímeros de gp140. Exemplos de domínios de trimerização incluem, mas sem limitação aos mesmos, o domínio de trimerização "foldon" de T4-fibritina; o domínio de trimerização em bobina enrolada derivado de

GCNA4; e a subunidade catalítica de aspartato transcarbamilase de E. coli como um tag de trímero. Uma "proteína do envelope de HIV" tam- bém pode ser uma proteína do envelope do HIV truncada, incluindo, mas sem limitação, proteínas do envelope que compreendem uma truncamento C-terminal no ectodomínio (isto é, o domínio que se es- tende para o espaço extracelular), um truncamento na gp41, tal como um truncamento no domínio transmembranar de gp41, ou um trunca- mento no domínio citoplasmático de gp41. Uma "proteína do envelope de HIV" pode ainda ser um derivado de uma proteína do envelope de HIV de ocorrência natural que possui mutações nas sequências, por exemplo, nos locais de clivagem de furina, e/ou as chamados muta- ções SOSIP.

[00054] De preferência, uma "proteína do envelope do HIV" é uma "proteína sintética do envelope do HIV". Como aqui utilizado, o termo "proteína sintética do envelope do HIV" refere-se a uma proteína do envelope do HIV de ocorrência não natural que é otimizada para indu- zir uma resposta imune ou produzir uma imunidade contra uma ou mais cepas de HIV que ocorrem naturalmente em um indivíduo com necessidade desse tratamento. Proteínas do mosaico Env do HIV são exemplos de proteínas Env do HIV sintéticas, e a invenção proporcio- na antígenos sintéticos Env do HIV, por exemplo, aqueles que com- preendem SEQ ID NOs: 8, 17, 18, ou 19.

[00055] “Como usado aqui, "TCIDs.o" refere-se Dose Infecciosa de Cultura de Tecido 50 administrada como TCIDso. A TCIDso pode ser determinada utilizando vários métodos conhecidos daquele versado na técnica, tal como, por exemplo, um ensaio de Dose Infecciosa de Cul- tura de Tecido 50 (TCIDso). O ensaio TCID5o é um método para titula- ção da infecciosidade de vetores do vírus Vaccinia Ancara Modificado (MVA), usando diluições de 10 vezes em um formato de 96 poços co- mo descrito no Exemplo 2 do documento WO 03/053463. A infecciosi-

dade de um poxvírus tal como MVA pode ser determinada utilizando vários métodos conhecidos daquele versado na técnica tal como, por exemplo, um ensaio baseado em citometria de fluxo ou um ensaio de Dose Infecciosa de Cultura de Tecido 50 (TCID5so). Em um aspecto exemplar, uma titulação de MVA é realizada em um ensaio baseado em TCIDso usando diluições de 10 vezes em um formato de 96 poços. Na conclusão do ensaio, as células infectadas são visualizadas utili- zando um anticorpo antivírus vacínia e uma solução de coloração apropriada. Células CEF primárias são preparadas e cultivadas em RPMI, incluindo soro a 10% e gentamicina a 1% utilizando frascos T durante 2-3 dias sob uma dada densidade após tripsinização e seme- adura em placas de 96 poços sob uma densidade de 1x10º células/mL utilizando meio RPMI com 7% de soro. O título esperado dos ditames da amostra dita o número de 10 diluições em série, que são realizadas por meio de uma placa de poços profundos de coluna 1 a, por exem- plo, 10 usando 100 uL para transferência para o poço seguinte. Após a diluição, 100 ul são semeados por poço de placas de 96 poços. As células são incubadas durante 5 dias a 34-38ºC e 4-6% de CO,» para permitir infecção e replicação viral.

[00056] Cinco dias após infecção, as células são coradas com um anticorpo específico a MVA. Para a detecção do anticorpo específico, é tulizado um anticorpo secundário acoplado a peroxidase de rábano (HRP). O anticorpo específico a MVA pode ser um anticorpo antivírus vacínia, policlonal de coelho, ou uma fração de IgG (Quartett, Berlim, Alemanha, Nº 9503-2057), por exemplo. O anticorpo secundário pode ser um anticorpo anti-lgG de coelho, ou policlonal de cabra acoplado a HRP (Promega, Mannheim, Alemanha, Nº W4011), por exemplo. O anticorpo secundário é visualizado utilizando um substrato de TMB de precipitação. Cada poço com células que são positivas na reação de cor é marcado como positivo para o cálculo do TCIDso. O título é calcu-

lado usando o método de cálculo de Spearman-Kaerber. Os dados também podem ser representados como um log de título do vírus, que é a diferença relativa para qualquer dado ponto de tempo de T = ponto de tempo O.

[00057] Um método alternativo para a quantificação da concentra- ção de vírus é por ensaio de placas virais, que é um método padrão bem conhecido daquele versado na técnica para determinar a concen- tração de vírus em termos de dose infecciosa. Resumidamente, uma monocamada confluente de células hospedeiras é infectada com vírus em várias diluições e coberta com um meio semissólido. Uma placa viral é formada quando um vírus infecta uma célula na monocamada de células e o número de placas pode ser contado em combinação com o fator de diluição para calcular o número de unidades formado- ras de placas por volume de amostra (ufp/mL). A ufp/mL representa o número de partículas infecciosas no na amostra. Devido às diferenças distintas nos métodos de ensaio e princípios, TCID5o e ufp/mL ou ou- tros resultados de ensaio de infecciosidade não são necessariamente equivalentes. Para MVA, ambos os métodos (TCIDso e ensaio de placa viral) podem ser utilizados, e em geral a dosagem de um vetor de MVA para administração clínica em humanos é fornecida em ufp, ou em TCIDso. A dosagem de um vetor de adenovírus também pode ser dada em ufp ou TCIDso. Para administração a humanos, geralmente a dosa- gem de um vetor de adenovírus é dada em partículas virais (vp), e as concentrações são expressas em vp/mL. Proteínas sintéticas do envelope do HIV e suas sequências de codifica- ção

[00058] “Modalidades da presente invenção referem-se a novos ve- tores de poxvírus, preferencialmente vetores de MVA, que compreen- dem sequência de ácidos nucleicos que codifica proteínas sintéticas do envelope do HIV, e de preferência sequência de ácidos nucleicos que codifica outros antígenos do HIV.

[00059] Em uma modalidade da presente invenção, uma proteína sintética do envelope do HIV compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 8 que tem uma ou mais mutações selecionadas do grupo que consiste de (i) I529P, (ii) K480E e (ili) uma combinação de EK479-480RRRR, |529P, A471C e T575C. SEQ ID NO: 8 compreende uma gp120 madura sintética e uma gp41 sintética truncada sem a região transmembranar nem o domínio citoplasmático. SEQ ID NO: 8 é uma sequência de ocorrência não natural composta por uma quimera de sequências do antígeno mosaico mos2Env (SEQ ID NO: 6), e outras sequências de proteínas do envelope do HIV. À sequência do antígeno Env sintético que compreende SEQ ID NO: 8 é otimizada para fornecer uma cobertura ampla e um aumento da res- posta de células T contra HIV clado C (em comparação com o antíge- no mos2Env (SEQ ID NO: 6)). Em certas modalidades da presente in- venção, aminoácidos adicionais podem ser adicionados a SEQ ID NO: 8 ou uma de suas variantes aqui definidas.

[00060] Em certas modalidades da presente invenção, a proteína sintética do envelope do HIV compreende ainda uma sequência de sinalização. A proteína sintética do envelope do HIV é sintetizada com uma sequência de sinalização que é clivada a partir da cadeia de poli- peptídeos nascente durante seu transporte para o lúmen do retículo endoplasmático (RE). Em princípio, qualquer sequência de sinalização conhecida poderia ser usada. De preferência, é usada uma sequência de sinalização de Env do HIV ou uma variante da mesma. Diferentes sequências de sinalização têm sido usadas no estado da técnica para proteínas Env do HIV (ver, por exemplo, WO 2014/107744). Em certas modalidades da presente invenção, a sequência de sinalização com- preende SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12. Em uma modalidade preferida da presente invenção, a se-

quência de sinalização compreende SEQ ID NO: 9.

[00061] Em certas modalidades da presente invenção, a proteína sintética do envelope do HIV compreende ainda um domínio trans- membranar. O domínio transmembranar ancora a proteína sintética do envelope do HIV na membrana do RE e contribui para a montagem da membrana e função do envelope do HIV. De preferência, o domínio transmembranar compreende SEQ ID NO: 13.

[00062] Em outra modalidade da presente invenção, a proteína sin- tética do envelope do HIV compreende uma gp41 que possui um do- mínio citoplasmático truncado. A gp41 tem um domínio citoplasmático incomumente longa em sua extremidade carboxila, tipicamente cerca de 150 aminoácidos (Edwards et al., / Virology, 2002, 76: 2683-2691). O truncamento do domínio citoplasmático foi relatado induzir exposi- ção de regiões conservadas no ectodomínio da proteína Env do HIV-1 (Id.). O domínio citoplasmático truncado em um envelope sintético do HIV da invenção pode variar de um a cerca de 140 aminoácidos, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130 ou 140 aminoácidos de um domínio citoplasmático de comprimento completo. Em certas modalidades da presente invenção, o domínio citoplasmático truncado é derivado dos aminoácidos 704- 862 de SEQ ID NO: 17 (ou seja, a partir do domínio citoplasmático da molécula C4 da invenção), por truncamento após um dado aminoácido até o término C. Em uma modalidade preferida da presente invenção, a proteína sintética do envelope do HIV compreende um domínio cito- plasmático truncado que possui de 1 a 10 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente 4-8 resíduos de aminoácidos, e mais preferen- cialmente sete resíduos de aminoácidos de um domínio citoplasmático de gp41 do HIV. O domínio citoplasmático ou seu fragmento de uma proteína sintética do envelope do HIV localiza-se C-terminal no domí- nio extracelular (ectodominio), e quando a proteína sintética do enve-

lope do HIV também compreende um domínio transmembranar, o do- mínio citoplasmático ou seu fragmento localiza-se C-terminal no domí- nio transmembranar. Ver, por exemplo, FIGS. 1A e 1C. Em uma moda- lidade particular da presente invenção, a proteína sintética do envelo- pe do HIV compreende uma gp41 com um domínio citoplasmático truncado que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 ou um fragmento seu, tais como os resíduos 1-4 da mesma (isto é, NRVR). Outros domínios citoplasmáticos truncados foram descritos e podem ser utilizados (por exemplo, Schiernle et al, PNAS 1997; Abrahamyan et al., / Virol 2005).

[00063] Em modalidades da presente invenção em que a proteína sintética do envelope do HIV compreende ainda um domínio trans- membranar e um fragmento de um domínio citoplasmático, é preferível que a proteína também compreenda a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, que contém os resíduos 655-682 de SEQ ID nO: 18, em que a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 é fundida com o término C de SEQ ID nO: 8 e o término N do domínio transmembra- nar.

[00064] Em uma modalidade particularmente preferida da invenção, a proteína sintética do envelope do HIV compreende ainda um domínio transmembranar, tal como aquele que possui a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 13, e um domínio citoplasmático truncado ou um fragmento de um domínio citoplasmático, tal como aquele que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 ou os resíduos 1-4 de SEQ ID NO: 14 (ou seja, NRVR). Mais preferencialmente, a proteína sintética do envelope do HIV compreende ou consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, com ou sem a sequência de sinaliza- ção (isto é, os resíduos de amino ácidos 1-29 de SEQ ID NO: 18).

[00065] Em outra modalidade, a proteína sintética do envelope do HIV compreende um domínio de trimerização que substitui uma região transmembrana Env. O domínio de trimerização aumenta a estabilida- de de uma estrutura trimérica Env. Preferencialmente, a proteína sinté- tica do envelope do HIV compreende um polipeptídeo gp140 que é modificado para incluir um domínio de trimerização que estabiliza trí- meros de gp140. Exemplos de domínios de trimerização incluem, mas sem limitação aos mesmos, o domínio de trimerização "foldon" de T4- fibritina, tal como aquele que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; o domínio de trimerização em bobina enrolada de- rivado de GCNA4, tal como aquele que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; a subunidade catalítica de aspartato transcarbamilase de E. coli como um tag de trímero; ou motivos de trimerização à base de matrillina. Se estiver presente, o domínio de trimerização tipicamente situa-se C-terminal no domínio extracelular (ver FIG. 1B). Em certas modalidades da preferidas da presente in- venção em que a proteína sintética do envelope do HIV compreende um domínio de trimerização, a proteína sintética do envelope do HIV compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, com ou sem a sequência de sinalização (isto é, os resíduos de aminoácidos 1- 29 de SEQ ID NO: 19). Essas modalidades da presente invenção com domínios de trimerização são principalmente úteis para variantes de ectodomínios solúveis da proteína sintética do envelope do HIV. Em certas modalidades de tais variantes solúveis da presente invenção, é possível submeter a mutação o sítio de clivagem da furina (por exem- plo, mutação de Lys a Glu na posição 480 em SEQ ID NO: 8) para ina- tivar esse sítio de clivagem, de modo que a proteína venha a ser uma cadeia simples; isso combina bem com um domínio de trimerização, especialmente com o domínio de trimerização GCN4 de SEQ ID NO:

19.

[00066] Versões alternativas de tais variantes de ectodomínio solúvel da proteína sintética do envelope do HIV sem uso de domínios de trime-

rização são também modalidades da presente invenção da invenção e podem ser preparadas a partir de SEQ ID NO: 8, combinando mutações que otimizam o sítio de clivagem da furina (por exemplo, substituindo o dipeptídeo Gly-Lys nas posições 479-480 por quatro resíduos Arg), bem como as chamadas mutações SOSIP (por exemplo, mutações | a P na posição 529 e introdução de uma ponte de dissulfeto entre as posições 471 e 575 por substituição dos respectivos Ala e Thr nessas posições em SEQ ID NO: 8, cada uma com um resíduo Cys). Isso produz uma proteí- na que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 com a seguinte combinação de mutações: EK479-480RRRR, 1529P, A471C e T575C.

[00067] Uma possível modificação para aumentar ainda mais o teor de trimeros de uma proteína sintética do envelope do HIV da invenção (que compreende SEQ ID NO: 8), é a modificação de mentira para Pro na posição 529. Isso pode ser eficaz tanto para variantes solúveis quanto para variantes ligadas a membrana. Vetores

[00068] Em um aspecto geral, a invenção refere-se a vetores que compreendem sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteí- na sintética do envelope do HIV, e preferencialmente que compreen- dem sequência de ácidos nucleicos que codifica pelo menos um antí- geno adicional de HIV. De acordo com modalidades da presente in- venção, os vetores podem compreender qualquer uma das proteínas sintéticas do envelope do HIV aqui descritas. Em uma modalidade par- ticular da presente invenção, o vetor é um vetor de poxvírus, de prefe- rência um vetor de MVA, compreendendo sequência de ácidos nuclei- cos que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19, e mais preferencialmente SEQ ID NO: 18 ou os resíduos de aminoácidos 30-711 de SEQ ID NO: 18.

[00069] De acordo com modalidades da presente invenção, a se- quência de ácidos nucleicos que codifica a proteína sintética do enve- lope do HIV está operacionalmente ligada a um promotor, o que signi- fica que o ácido nucleico está sob o controle de um promotor. O pro- motor pode ser um promotor homólogo (isto é, derivado da mesma fonte genética do vetor) ou um promotor heterólogo (isto é, derivado de um vetor ou origem genética diferente). Exemplos não limitativos de promotores adequados para os vetores adenovirais incluem o promo- tor de citomegalovírus (CMV) e o promotor do vírus do Sarcoma de Rous (RSV). De preferência, o promotor está localizado a montante do ácido nucleico em um cassete de expressão. Uma sequência de pro- motor de CMV exemplar que pode ser operacionalmente ligado a se- quência de ácidos nucleicos que codifica a proteína sintética do enve- lope do HIV é mostrada em SEQ ID NO: 24.

[00070] Exemplos não limitativos de promotores adequados para os vetores de poxvírus incluem o promotor 30K, o promotor 13, o promo- tor PrS, o promotor PrS5E, o promotor Pr7.5K, o promotor longo Pr13.5, o promotor PrHyb, o promotor 40K, o promotor de MVA-40K, o promotor FPV 40K, o promotor 30K, o promotor PrSynllm e o promotor PrLEI. Promotores adicionais são ainda descritos nos documentos WO 2010/ 060632, WO 2010/102822, WO 2013/189611 e WO 2014/063832, que são aqui incorporados na íntegra como referência. Em modalidades da presente invenção mais preferidas, os antígenos de HIV, quando incorporados como parte de um vetor de poxvírus de acordo com a invenção, são ligados operativamente ao promotor longo Pr13.51 (SEQ ID NO: 42) e/ou ao promotor PrHyb (SEQ ID NO: 43).

[00071] De acordo com modalidades da presente invenção, um ve- tor pode ser um vetor de expressão. Vetores de expressão incluem, mas sem limitação aos mesmos, vetores para expressão de proteína recombinante e vetores para transporte de ácido nucleico em um indi-

víduo para expressão em um tecido do indivíduo, tal como um vetor viral. Exemplos de vetores virais adequados para uso com a invenção incluem, mas sem limitação aos mesmos, vetores adenovirais, vetores de vírus adenoassociados, vetores de poxvírus, vetores de MVA, veto- res de vírus entéricos, vetores de vírus da Encefalite Equina Venezue- lana, vetores de vírus da floresta de Semliki, vetores de vírus do Mo- saico do Tabaco, vetores lentivirais etc. O vetor pode também ser um vetor não viral. Exemplos de vetores não virais incluem, mas sem limi- tação aos mesmos, plasmídeos, cromossomos artificiais bacterianos, cromossomos artificiais de levedura, bacteriófagos etc.

[00072] Em certas modalidades da presente invenção, o vetor é um vetor de adenovírus. Um adenovírus de acordo com a invenção per- tence à família dos Adenoviridae e de preferência é um adenovírus que pertença ao gênero de vírus Mastadeno. Ele pode ser um adeno- vírus humano, mas também um adenovírus que infecta outras espé- cies, incluindo, mas sem limitação, um adenovírus bovino (por exem- plo, adenovírus bovino 3, BAdV3), um adenovírus canino (por exem- plo, CAdV2), um adenovírus porcino (por exemplo, PAdV3 ou 5), ou um adenovírus de símio (que inclui um adenovírus de macaco e um adenovírus de símio, tal como um adenovírus de chimpanzé ou um adenovírus de gorila). Preferencialmente, o adenovírus é um adenoví- rus humano (HAdV ou AdHu), ou um adenovírus de símio, tal como umm adenovírus de chimpanzé ou de gorila (ChAd, AdCh ou SAdV), ou um adenovírus de macaco rhesus (Rhad). Na invenção, um adeno- vírus humano significa, se referido, Ad sem indicação de espécies, por exemplo, a breve notação "Ad26" significa o mesmo que HAdV26, que é adenovírus humano sorotipo 26. Além disso, tal como aqui utilizado, a notação “rAd” significa adenovírus recombinante, por exemplo, “rAd26” refere-se a ademovírus humano recombinante 26.

[00073] A maioria dos estudos avançados foi realizada utilizando adenovírus humanos, e adenovírus humanos são preferidos de acordo com certos aspectos da invenção. Em certas modalidades preferidas da presente invenção, um adenovírus recombinante de acordo com a invenção baseia-se em um adenovírus humano. Em modalidades pre- feridas da presente invenção, o adenovírus recombinante baseia-se em um adenovírus humano sorotipo 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49, 50, 52 etc. De acordo com uma modalidade particularmente preferida da in- venção, um adenovírus é um adenovírus humano sorotipo 26. As van- tagens desses sorotipos incluem uma baixa soroprevalência e/ou bai- xos títulos preexistentes de anticorpos neutralizantes na população humana, e a experiência com uso em indivíduos humanos em ensaios clínicos.

[00074] —Adenovírus de símios geralmente também tem uma baixa soroprevalência e/ou baixo títulos preexistentes de anticorpos neutrali- zantes na população humana, e uma quantidade significativa de traba- lho tem sido relatada utilizando vetores de adenovírus de chimpanzés (por exemplo, US6083716, WO 2005/071093, WO 2010/086189, WO 2010085984, Farina et al., 2001, / Gen Virol 75: 11603-13; Cohen et al., 2002, / Gen Virol 83: 151-55; Kobinger et al., 2006, Virology 346: 394-401; Tatsis et al., 2007, Molecular Therapy 15: 608-17; ver tam- bém a revisão de Bangari e Mittal, 2006, Vaccine 24: 849-62; e revisão de Lasaro e Ertl, 2009, Mol Ther 17: 1333-1339). Assim, em outras modalidades da presente invenção, os adenovírus recombinantes de acordo com a invenção baseiam-se em um adenovírus de símio, por exemplo, um adenovírus de chimpanzé. Em certas modalidades da presente invenção, o adenovírus recombinante é baseado em adeno- vírus de símio do tipo 1, 7, 8, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,1, 28,1, 29, 30,

31.1, 32, 33, 34, 35.1, 36, 37.2, 39, 40.1, 41.1, 42.1,43, 44,45, 46,48, 49, 50 ou SA7P.

[00075] De preferência, o vetor de adenovírus é um vetor viral re-

combinante deficiente em replicação, tais como rAd26, rAd35, rAd48, rAd5HVR48 etc.

[00076] Em uma modalidade preferida da presente invenção, os vetores adenovirais compreendem proteínas de capsídeo de sorotipos raros, incluindo Ad26. Na modalidade típica da presente invenção, o vetor é um vírus rAd26. Uma "proteína de capsídeo de adenovírus" refere-se a uma proteína de capsídeo de um adenovírus (por exemplo, vetores Ad26, Ad35, rAd48, rAd5HVR48) que está envolvida na de- terminação do sorotipo e/ou tropismo de um adenovírus em particular. Proteínas do capsídeo de adenovírus incluem tipicamente as proteínas de fibra, pênton e/ou héxon. Como aqui utilizada, uma "proteína de capsídeo" para um adenovírus particular, tal como uma "proteína do capsídeo de Ad26", pode ser, por exemplo, uma proteína de capsídeo quimica que inclui pelo menos uma parte de uma proteína do capsídeo de Ad26. Em certas modalidades da presente invenção, a proteína de capsídeo é uma proteína de capsídeo inteira de Ad26. Em certas mo- dalidades da presente invenção, o héxon, pênton e fibra são de Ad26.

[00077] Aquele versado na técnica reconhecerá que os elementos derivados de vários sorotipos podem ser combinados em um único ve- tor de adenovírus recombinante. Assim, pode ser produzido um ade- novírus quimérico que combina as propriedades desejadas de soroti- pos diferentes. Assim, em algumas modalidades da presente inven- ção, um adenovírus quimico da invenção pode combinar a ausência de imunidade preexistente de um primeiro sorotipo com características tais como estabilidade à temperatura, montagem, ancoragem, rendi- mento de produção, infecção redirecionada ou melhorada, estabilidade do DNA na célula-alvo e similares.

[00078] Em certas modalidades da presente invenção, o vetor de adenovírus recombinante útil na invenção é derivado principalmente ou totalmente de Ad26 (isto é, o vetor é rAd26). Em algumas modali-

dades da presente invenção, o adenovírus é de replicação deficiente, por exemplo, porque ele contém uma supressão na região E1 do ge- noma. Para adenovírus que são derivados de adenovírus não do gru- po C, tais como Ad26 ou Ad35, é típico trocar a sequência de codifica- ção de E4-orf6 do adenovírus pela E4-orf6 de um adenovírus do sub- grupo humano C tal como Ad5. Isso permite a propagação desses adenovírus em linhagens de células complementares bem conhecidas que expressam os genes E1 de Ad5, tais como, por exemplo, células 293, células PER.C6 e similares (ver, por exemplo, Havenga et al, 2006, / Gen Virol 87: 2135-43; documento WO 03/104467). Contudo, tais adenovírus não serão capazes de replicação em células não com- plementares que não expressam os genes E1 de Ad5.

[00079] A preparação de vetores adenovirais recombinantes é bem conhecida no estado da técnica. Preparação de vetores rAd26 é des- crita, por exemplo, em WO 2007/104792 e em Abbink et al. (2007) Vi- rol 81 (9): 4654-63. Exemplos de sequências do genoma de Ad26 são encontrados em GenBank Accesso EF 153474 e em SEQ ID NO: 1 do documento WO 2007/104792. Exemplos de vetores úteis para a in- venção incluem, por exemplo, aqueles descritos em WO2012/082918, cujo conteúdo é aqui incorporado na íntegra como referência.

[00080] Tipicamente, um vetor útil na presente invenção é produzi- do utilizando um ácido nucleico que compreende a totalidade do ge- noma adenoviral recombinante (por exemplo, um plasmídeo, cosmídeo ou vetor de baculovírus). Assim, a invenção também proporciona mo- léculas isoladas de ácido nucleico que codificam os vetores adenovi- rais da invenção. As moléculas de ácidos nucleicos da invenção po- dem ser na forma de RNA ou na forma de DNA obtidos por clonagem ou produzidos sinteticamente. O DNA pode ser de cadeia dupla ou de cadeia simples.

[00081] Os vetores de adenovírus úteis na presente invenção são tipicamente deficientes na replicação. Nessas modalidades da presen- te invenção, o vírus é tornado deficiente para replicação por supressão ou inativação de regiões críticas para a replicação do vírus, tal como a região E1. As regiões podem ser substancialmente eliminada ou inati- vada por, por exemplo, inserção de um gene de interesse, tal como um gene que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV (normal- mente ligado a um promotor), ou um gene que codifica um polipeptí- deo antigênico do HIV (normalmente ligado a um promotor) na região. Em algumas modalidades da presente invenção, os vetores da inven- ção podem conter supressões em outras regiões, tais como as regiões E2, E3 ou E4, ou inserções de genes heterólogos ligados a um promo- tor em uma ou mais dessas regiões. Para adenovírus com mutações E2 e/ou E4, geralmente linhagens de células complementares E2 e/ou E4 são usadas para gerar adenovírus recombinantes. Mutações na região E3 do adenovírus não precisam ser complementadas pela |i- nhagem celular, uma vez que E3 não é necessário para a replicação.

[00082] “Uma linhagem celular de empacotamento é normalmente utilizada para produzir quantidades suficientes de vetores de adenoví- rus para uso na presente invenção. Uma célula de empacotamento é uma célula que compreende os genes que tenham sido suprimidos ou inativados em um vetor deficiente em replicação, permitindo assim que o vírus replique na célula. Linhagens celulares de empacotamento adequadas para adenovírus com uma supressão na região E1 inclu- em, por exemplo, PER.C6, 911, 293 e E1 A549.

[00083] Em uma modalidade preferida da invenção, o vetor é um vetor de adenovírus, e mais preferivelmente um vetor rAd26, mais pre- ferivelmente um vetor rAd26 com pelo menos uma supressão na regi- ão E1 do genoma adenoviral, por exemplo, tal como descrito em Ab- bink, / Virol, 2007. 81(9): pp. 4654-63, que é aqui incorporado como referência. Tipicamente, a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína sintética do envelope do HIV e/ou outros antígenos do HIV é clonada na região E1 e/ou na região E3 do genoma adenoviral.

[00084] Em um aspecto preferido da invenção, o vetor que codifica o antígeno sintético do HIV descrito aqui é um vetor de poxvírus. Em um aspecto particularmente preferido, o vetor é um vetor do vírus Vac- cinia Ankara modificado (MVA). Em modalidades adicionais preferidas da presente invenção, o vetor do vírus MVA é MVA-BN ou seus deri- vados.

[00085] MVA foi gerado por mais de 570 passagens em série em fibroblastos de embrião de galinha da cepa de vacínia dérmica Ankara (vírus Chorioallantois vírus vaccinia vírus Ankara, CVA; para revisão, ver Mayr et al. (1975) Infection 3, 6-14) que foi mantido no Instituto de Vacinação, Ancara, Turquia, durante muitos anos e usado como base para vacinação de humanos. O vírus de CVA atenuado MVA (Vírus Vaccinia Ankara Modificado) foi obtido por propagação em série (mais de 570 passagens) do CVA em fibroblastos primários de embrião de galinha (CEF).

[00086] No entanto, devido às complicações pós-vacinação muitas vezes graves associadas a vírus vacínia, houve várias tentativas para gerar uma vacina mais atenuada e mais segura. Como resultado da passagem usada para atenuar MVA, há várias cepas ou isolados dife- rentes, dependendo do número de passagens realizadas em células CEF. Cepas de MVA com perfis de segurança reforçada para o de- senvolvimento de produtos mais seguros, como vacinas ou produtos farmacêuticos, foram desenvolvidas, por exemplo, por Bavarian Nor- dic. MVA foi ainda passado por Bavarian Nordic e é designado MVA- BN. Uma amostra representativa de MVA-BN foi depositada em 30 de agosto de 2000 na European Collection of Cell Cultures (ECACC) sob o Nº de Acesso VOONO83008. MVA-BN é ainda descrito no documento WO 02/42480 (ver também, por exemplo, Pat. U.S. Nº 6.761.893 e

6.913.752 e US 2003/0206926) e WO 03/048184 (US 2006/0159699), os quais são aqui incorporados na íntegra como referência. MVA, bem como o MVA-BN, carecem de aproximadamente 15% (31 kb de seis regiões) do genoma em comparação com o vírus ancestral CVA. As eliminações afetam vários genes quanto a virulência e faixa de hospe- deiros, bem como o gene para inclusão de corpos do tipo A.

[00087] Em várias modalidades da presente invenção, o MVA ou MVA usado para gerar os recombinantes adequados para a presente invenção são MVA-572, MVA-575, MVA-I721, MVA como depositado como ATCCO VR-1508T7Y, MVA como depositado como ATCCO VR- 15667", ACAM3000 MVA, MVA-BN ou qualquer cepa do MVA simi- larmente atenuada. Em modalidades preferidas da presente invenção, o MVA utilizado para gerar os recombinantes são MVA-575, MVA co- mo depositado como ATCCO VR-1508TY, MVA como depositado como ATCCO VR-15667", ACAM3000 MVA e MVA-BN. Mais preferencial- mente, o MVA usado para gerar os recombinantes é MVA-BN.

[00088] MVA-572 foi depositado na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC, Laboratório de Pesquisa e Produção de Vaci- nas, Serviço de Laboratório da Saúde Pública, Centro de Microbiologia Aplicada e Pesquisa, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Rei- no Unido) com o número de depósito ECACC V94012707 em 27 de janeiro de 1994. MVA-575 foi depositado sob ECACC VO0120707 em 7 de dezembro de 2000. Acam3000 MVA foi depositado na American Type Culture Collection (ATCC), sob o Nº de Acesso: PTA 5095 em 27 de março de 2003 (American Type Culture Collection, 10801 Universi- dade Blvd., Manassas, VA 20110-2209, EUA). MVA-I721 foi deposita- do como CNCM 1721 no Collection Nationale de Cultures de Microor- ganisms, Instituto Pasteur. MVA-BN foi depositada em 30 de agosto de 2000 na ECACC com o número VOOO83008. MVA-BN foi descrita em WO 02/042480.

[00089] “Também abrangidos pela invenção são derivados ou vari- antes de qualquer um dos vírus MVA ou MVA-BN descritos aqui. "De- rivados" ou "variantes" de MVA ou MVA-BN referem-se a vírus MVA ou MVA-BN que exibem essencialmente as mesmas características de replicação que MVA ou MVA-BN aos quais se referem, mas exibindo diferenças em uma ou mais partes do seu genoma.

Vírus com as mesmas "características de replicação" dos vírus depositados são ví- rus que se replicam com razões de amplificação similares às da cepa depositada em células CEF e nas linhagens de células HaCat (Bou- kamp et a/. (1988), / Cell Biol 106: 761-771), a linhagem celular de os- teossarcoma óssea humana 143B (ECACC Nº 91112502), a linhagem de células renais de embrião humano 293 (ECACC Nº 85120602) e a linhagem celular de adenocarcinoma humano de colo do útero HeLa (ATCC Nº CCL-2). Testes e ensaios para determinar essas proprieda- des do MVA, seus derivados e variantes são bem conhecidos daquele versado na técnica, tal como o ensaio de permissividade de linhagens celulares como descrito em WO 02/42480. Em um exemplo de ensaio de permissividade de linhagem celular, linhagens celulares de mamiífe- ro são infectadas com o vírus MVA parental e derivado ou variante sob uma baixa multiplicidade de infecção por célula, isto é, 0,05 unidade infecciosa por célula (5 x 10º TCID5o). Após absorção de 1 hora, o ino- culo de vírus foi removido e as células lavadas três vezes para remo- ver quaisquer vírus não absorvidos remanescentes.

Meio fresco su- plementado com FCS a 3% é adicionado e infecções são deixadas ocorrer por um total de quatro dias (a 37ºC, 5% de CO>), onde extrac- tos virais podem ser preparados.

As infecções são interrompidas por congelamento das placas a -80ºC durante três vezes.

Multiplicação do vírus e efeitos citopáticos (CPE), são subsequentemente determinados em células CEF usando métodos bem conhecidos daquele versado na técnica tais como aqueles descritos em Carroll e Moss (1997), Virology

238, 198-211.

[00090] Mais especificamente, MVA-BN ou um derivado ou variante de MVA-BN tem preferencialmente a capacidade de replicação repro- dutiva em fibroblastos de embrião de galinha (CEF), mas sem capaci- dade de replicação reprodutiva na linhagem celular de queratinócitos humanos HaCat (Boukamp et al. (1988), / Cell Biol 106: 761-771), a linhagem celular de osteossarcoma ósseo humano 143B (ECACC, Nº de Depósito 91112502), a linhagem de células de rim embrionário hu- mano 293 (ECACC, Nº de Depósito 85120602), e a linhagem celular de adenocarcinoma humano de colo do útero HeLa (ATCC, N º de De- pósito CCL-2). Além disso, um derivado ou variante de MVA-BN tem uma razão de amplificação do vírus pelo menos duas vezes menor, mais preferivelmente três vezes menor, do que a de MVA-575 em cé- lulas HeLa e linhagens de células HaCaT. Testes e ensaios para es- sas propriedades de variantes de MVA são descritos no documento WO 02/42480 ou no ensaio de exemplo de permissividade de linha- gem celular como descrito acima.

[00091] O termo "não capaz de replicação reprodutiva" ou "sem ca- pacidade de replicação reprodutiva" é, por exemplo, descrito no docu- mento WO 02/42480, que também ensina como obter MVA com as propriedades desejadas como referido acima. O termo aplica-se a um vírus que tem uma razão de amplificação do vírus em quatro dias após infecção menor que 1, utilizando os ensaios descritos no documento WO 02/42480 ou na Patente U.S. Nº 6.761.893.

[00092] O termo "falha em replicar reprodutivamente" refere-se a um vírus que tem uma razão de amplificação do vírus em quatro dias após infecção menor que 1. Os ensaios descritos no documento WO 02/42480 ou na Patente U.S. Nº 6.761.893 são aplicáveis para a de- terminação da razão de amplificação de vírus.

[00093] A amplificação ou a replicação de um vírus é normalmente expressa como a razão de vírus produzido a partir de uma célula infec- tada (saída) para a quantidade originalmente usada para infectar a cé- lula em primeiro lugar (entrada) referida como a "razão de amplifica- ção. Uma razão de amplificação de "1" define um estado de amplifica- ção em que a quantidade de vírus produzido a partir das células infec- tadas é igual à quantidade inicialmente utilizada para infectar as célu- las, o que significa que as células infectadas são permissivas para a infecção e reprodução pelo vírus. Em contraste, uma razão de amplifi- cação inferior a 1, isto é, uma diminuição na produção em comparação com o nível de entrada, indica uma falta de replicação reprodutiva e, por conseguinte, atenuação do vírus.

[00094] Os vetores de poxvírus recombinantes aqui proporcionados podem ser gerados por métodos de rotina conhecidos no estado da técnica. Métodos para obter poxvírus recombinantes ou para inserir sequências de codificação exógenas no genoma de um poxvírus são bem conhecidos daquele versado na técnica. Por exemplo, métodos para técnicas de biologia molecular convencionais, tais como clona- gem de DNA, isolamento de DNA e RNA, análise de Western blot, RT- PCR e técnicas de amplificação por PCR, são descritos em Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2º Ed.) []. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], e técnicas para o manuseio e a ma- nipulação do vírus são descritas em Virology Methods Manual [B.W.J. Mahy et al. (Eds.), Academic Press (1996)]. Similarmente, as técnicas e os conhecimentos para o manuseio, a manipulação e engenharia genética de MVA são descritos em Molecular Virology: A Practical Ap- proach [A.J. Davison & R.M. Elliot (Eds.), The Practical Approach Seri- es, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Reino Unido (1993) (ver, por exemplo, Capítulo 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors)] e Current Protocols in Molecular Biology [John Wiley & Son, Inc. (1998) (ver, por exemplo, Capítulo 16, Seção |V: Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector)].

[00095] Para a geração dos vários poxvírus recombinantes aqui descritos, diferentes métodos são aplicáveis. A sequência de DNA a ser inserida no vírus pode ser colocada em um construto de plasmídeo de E. coli no qual DNA homólogo a uma seção de DNA do vírus da varíola foi inserido. Separadamente, a sequência de DNA a ser inseri- da pode ser ligada a um promotor. A ligação promotor-gene pode ser posicionada no construto de plasmídeo de modo que a ligação promo- tor-gene seja flanqueada em ambas as extremidades por DNA homó- logo a uma sequência de DNA que flanqueia uma região de DNA de poxvírus que contém um locus não-essencial. O construto de plasmí- deo resultante pode ser amplificado por propagação em bactérias e isolados de E. coli. O plasmídeo isolado contendo a sequência gênica de DNA a ser inserida pode ser transfectado em uma cultura de célu- las, por exemplo, fibroblastos de embrião de galinha (CEFs), ao mes- mo tempo que a cultura é infectada com poxvírus. Recombinação en- tre DNA homólogo de poxvírus no plasmídeo e no genoma viral, res- pectivamente, pode gerar um poxvírus modificado pela presença de sequências de DNA estranho.

[00096] De acordo com uma modalidade preferida da presente in- venção, uma célula de uma cultura de células adequada como, por exemplo, células CEF, pode ser infectada com um poxvírus. A célula infectada pode ser, subsequentemente, transfectada com um primeiro vetor de plasmídeo que compreende um gene ou genes estranhos ou heterólogos, tais como um ou mais dos ácidos nucleicos que codificam antígenos do HIV proporcionados na presente invenção, preferencial- mente, sob o controle de transcrição de um elemento de controle de expressão de poxvírus. Como explicado acima, o vetor de plasmídeo também compreende sequências capazes de dirigir a inserção da se- quência exógena para uma parte selecionada do genoma de poxvírus.

Opcionalmente, o vetor de plasmídeo também contém um cassete que compreende um gene marcador e/ou gene de seleção ligado operaci- onalmente a um promotor de poxvírus. Marcadores ou genes de sele- ção adequados são, por exemplo, os genes que codificam a proteína fluorescente verde, B-galactosidase, neomicina-fosforribosiltransferase ou outros marcadores. O uso de cassetes de seleção ou marcadores simplifica a identificação e isolamento do poxvírus recombinante gera- do. No entanto, um poxvírus recombinante pode também ser identifi- cado por tecnologia de PCR. Subsequentemente, outra célula pode ser infectada com os poxvírus recombinantes obtidos como descrito acima e transfectada com um segundo vetor que compreende um se- gundo gene ou genes estranhos ou heterólogos. Nesse caso, esse gene será introduzido em um sítio de inserção diferente do genoma do poxvírus, e o segundo vetor também difere nas sequências de poxví- rus homólogo que dirigem a integração do segundo gene ou genes estranhos no genoma do poxvírus. Após ter ocorrido a recombinação homóloga, o vírus recombinante que compreende dois ou mais genes estranhos ou heterólogos pode ser isolado. Para a introdução de ge- nes estranhos adicionais no vírus recombinante, as etapas de infecção e transfecção podem ser repetidas utilizando para infecção o vírus re- combinante isolado em etapas anteriores e utilizando para a transfec- ção outro vetor que compreende um gene ou genes estranhos adicio- nais.

[00097] Alternativamente, as etapas de infecção e transfecção co- mo descritas acima são permutáveis, ou seja, uma célula adequada pode em primeiro lugar ser transfectada pelo vetor de plasmídeo que compreende o gene estranho e, em seguida, ser infectada com o pox- vírus. Como uma alternativa adicional, é também possível introduzir cada gene estranho em vírus diferentes, coinfectar uma célula com todos os vírus recombinantes obtidos e rastrear um recombinante que inclui todos os genes estranhos. Uma terceira alternativa é ligação de genoma de DNA e sequências estranhas in vitro e reconstituição do DNA do genoma de DNA do vírus vacínia recombinads utilizando um vírus auxiliar. Uma quarta alternativa é recombinação homóloga em E.coli ou outra espécie bacteriana entre um genoma de poxvírus clo- nado como um cromossomo artificial bacteriano (BAC) e uma sequên- cia estranha linear flanqueada com sequências de DNA homólogas a sequências que flanqueiam o sítio desejado de integração no genoma do vírus vacínia.

[00098] “Uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam pelo menos um antígeno do HIV de acordo com modalidades da pre- sente invenção podem ser inseridas em qualquer parte adequada do poxvírus ou vetor de poxvírus. Em um aspecto preferido, o poxvírus utilizado na presente invenção inclui um vírus MVA. Partes adequadas do vírus MVA em que um ou mais ácidos nucleicos da presente inven- ção podem ser inseridos incluem partes não essenciais do vírus MVA.

[00099] “Para vírus MVA, partes não essenciais do genoma do MVA podem ser regiões intergênicas ou os sítios de supressão conhecidos 1-6 do genoma MVA. Alternativa ou ainda, partes não essenciais do MVA recombinante podem ser uma região de codificação do genoma do MVA que é não essencial para crescimento viral. No entanto, os locais de inserção não se restringem a esses locais de inserção prefe- ridos no genoma de MVA, uma vez que está dentro do escopo da pre- sente invenção que os antígenos e os ácidos nucleicos e quaisquer promotores acompanhantes como aqui descritos podem ser inseridos em qualquer parte do genoma viral, contanto que seja possível obter recombinantes que possam ser amplificados e propagados em pelo menos um sistema de cultura de células, tais como fibroblastos de embrião de galinha (células CEF).

[000100] De preferência, os ácidos nucleicos da presente invenção são inseridos em uma ou mais regiões intergênicas (IGR) do MVA. Os termos "região intergênica" e "IGR" referem-se preferencialmente a essas partes do genoma viral localizadas entre duas fases de leitura abertas (ORF) adjacentes do genoma do MVA, preferencialmente en- tre duas ORFs essenciais do genoma do vírus MVA. Para o MVA, em certas modalidades da presente invenção, a IGR é selecionada de IGR 07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137 e IGR 148/149. Em modalidades mais preferidas da presente invenção, os ácidos nu- cleicos da presente invenção são inseridos nas regiões IGR 44/45 e IGR 88/89.

[000101] De acordo com modalidades da presente invenção, e como notado acima, qualquer uma das proteínas sintéticas do envelope do HIV e/ou antígenos de HIV aqui descritos podem ser expressos nos vetores da invenção. Em vista da degenerescência do código genético, aquele versado na técnica está bem ciente de que podem ser conce- bidas várias sequências de ácidos nucleicos que codificam a mesma proteína, de acordo com métodos inteiramente de rotina no estado da técnica. O ácido nucleico que codifica a proteína sintética do envelope do HIV e/ou antígenos do HIV pode ser opcionalmente otimizado com códons para assegurar expressão apropriada no hospedeiro a ser tra- tado (por exemplo, humano). Otimização com códons é uma tecnolo- gia amplamente aplicada no estado da técnica. Alguns exemplos não limitantes de sequências que codificam uma proteína sintética do en- velope do HIV da invenção são proporcionados em SEQ ID NOs: 26 (usada em vetores de adenovírus nos exemplos) e 41 (utilizada em vetores MVA nos exemplos); e alguns exemplos não limitantes de se- quências que codificam ainda antígenos do HIV para uso na invenção são fornecidos em SEQ ID NOs: 20-22 (usadas em vetores de adeno- vírus nos exemplos), e 38-40 (utilizadas em vetores MVA nos exem- plos).

[000102] A invenção também proporciona células, preferencialmente células isoladas, compreendendo qualquer um dos vetores aqui descri- tos. As células podem ser usadas para produção de proteínas recom- binantes, ou para a produção de partículas virais.

[000103] Também descrito é um método de preparação de um poli- peptídeo antigênico sintético do HIV. O método compreende a trans- fecção de uma célula hospedeira com um vetor de expressão que compreende ácido nucleico que codifica o polipeptídeo antigênico sin- tético do HIV operacionalmente ligado a um promotor, crescimento da célula transfectada sob condições adequadas para expressão do poli- peptídeo antigênico sintético do HIV e isolamento do polipeptídeo anti- gênico sintético do HIV da célula. O polipeptídeo antigênico sintético do HIV pode ser isolado ou coletado da célula por meio de qualquer método conhecido no estado da técnica, incluindo cromatografia de afinidade etc. As técnicas utilizadas para expressão de proteína re- combinante são bem conhecidas daquele versado na técnica, tendo em vista a presente descrição.

[000104] A invenção também se refere a um método para a fabrica- ção de um vetor que codifica um polipeptídeo antigênico sintético do HIV da invenção, compreendendo o método cultura de uma célula que compreende o vetor, propagação e multiplicação do vetor durante a referida cultura e isolamento do vetor que codifica o polipeptídeo anti- gênico sintético do HIV da invenção a partir da cultura de células, por exemplo, a partir das células, a partir do meio de cultura ou ambos. O vetor pode ser ainda purificado de acordo com métodos conhecidos no estado da técnica. Em certas modalidades, a invenção proporciona um vetor de poxvírus, de preferência um vetor de MVA, tal como um vetor de MVA-BN, que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um antí- geno sintético doHIV. O vetor de poxvírus compreende sequência de ácidos nucleicos que codifica um antígeno sintético do envelope (Env) do HIV de acordo com a invenção, tal como aquele que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e opcionalmente com- preende ainda a sequência de ácidos nucleicos que codifica pelo me- nos um antígeno adicional do HIV. Em modalidades preferidas da pre- sente invenção, o vetor de poxvírus e mais preferivelmente um vetor MVA compreendem a sequência de ácidos nucleicos que codifica um primeiro antígeno Env do HIV que é um antígeno sintético Env do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e pelo menos um antígeno adicional do HIV, tais como os antígenos Gag, Pol e/ou Env, de preferência um ou mais antígenos adicionais do HIV que compreendem as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-5, 28 e 29.

[000105] Por exemplo, em uma modalidade particular da invenção, um vetor de poxvírus pode compreender ácido nucleico que codifica um primeiro antígeno Env do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; um segundo antígeno Env do HIV di- ferente do primeiro antígeno Env do HIV; um terceiro antígeno e um quarto antígeno, sendo dois antígenos diferentes Gag do HIV; e um quinto antígeno e um sexto antígeno, sendo dois antígenos diferentes Pol do HIV. Os antígenos Gag e Pol podem ser fundidos em um pri- meiro antígeno de fusão Gag-Pol e um segundo antígeno de fusão Gag-Pol, tais como os antígenos de fusão Gag-Pol que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29.

[000106] Em certas modalidades exemplificativas da presente inven- ção, o vetor de poxvírus compreende um ácido nucleico que codifica uma ou mais sequências de ácidos aminados selecionadas do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-5, 18, 28 e 29. Em uma ou mais mo- dalidades da presente invenção específicas, o vetor de poxvírus com- preende ácido nucleico que codifica as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 1-5 e 18, mais preferencialmente SEQ ID NOs: 5, 18,28 e 29.

[000107] Em outras certas modalidades da presente invenção exem- plares, um vetor é um vetor de adenovírus que compreende uma se- quência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 25, 26 e 27, de preferência SEQ ID NO: 26. Outras mo- dalidades exemplificativas da presente invenção incluem vetores de adenovírus que codificam outros antígenos do HIV, tais como vetores de adenovírus que compreendem uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 20,21 e

22. Em outras certas modalidades da presente invenção, o vetor é um vetor de poxvírus, de preferência um vetor de MVA, mais preferenci- almente MVA-BN, compreendendo o vetor uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 38, 39, 40 e 41. Em uma ou mais modalidades da presente invenção específicas, o vetor de poxvírus compreende SEQ ID NOs: 38, 39, 40 e41.

[000108] A sequência de ácidos nucleicos que codifica os um ou mais antígenos do HIV pode ser inserida em qualquer sítio de inserção apropriado do genoma do vetor de poxvírus vetor como aqui descrito. Em modalidades particulares da presente invenção em que o vetor de poxvírus é um vetor de MVA, como MVA-BN ou seus derivados, que codifica um ou mais antígenos de fusão Gag-Pol, sequência de ácidos nucleicos que codifica um primeiro antígeno de fusão Gag-Pol pode ser inserida na região intergênica (IGR ) 44/45 do genoma do MVA, e sequência de ácidos nucleicos que codifica um segundo antígeno de fusão Gag-Pol pode ser inserida em IGR 88/89 do genoma de MVA. Além disso, sequência de ácidos nucleicos que codifica antígenos Env do HIV pode ser inserida em IGR 44/45 e/ou IGR 88/89 do genoma MVA. Em uma ou mais modalidades específicas de realização da pre-

sente invenção, o vetor de poxvírus compreende sequência de ácidos nucleicos que codifica um antígeno de fusão Gag-Pol que compreende SEQ ID NO: 28 e sequência de ácidos nucleicos que codifica um antí- geno Env do HIV que compreende SEQ ID NO: 5 em IGR 44/45 do genoma do MVA, e/ou sequência de ácidos nucleicos que codifica um antígeno de fusão Gag-Pol que compreende SEQ ID NO: 29 e se- quência de ácidos nucleicos que codifica um antígeno Env do HIV que compreende SEQ ID NO: 18 em IGR 88/89 do genoma MVA. De pre- ferência, os antígenos de fusão Gag-Pol estão cada um sob controle de um promotor separado, de preferência um promotor Pri3.5, tal co- mo aquele mostrado em SEQ ID NO: 42, e/ou os antígenos Env estão cada um sob controle de um promotor separado, de preferência um promotor PrHyb, tal como aquele mostrado em SEQ ID NO: 43. Composições

[000109] Em outro aspecto geral, a invenção refere-se a uma com- posição que compreende um vetor composto de um ácido nucleico que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV e de um veícu- lo. De preferência, a composição é uma composição de vacina, a qual é descrito em maiores detalhes abaixo. De acordo com modalidades da presente invenção, qualquer um dos vetores aqui descritos pode ser incluído na composição. Preferencialmente, o vetor é um vetor vi- ral, mais preferivelmente, um vetor de adenovírus ou um vetor de pox- vírus, e ainda mais preferivelmente um vetor de adenovírus 26 ou um vetor de MVA.

[000110] Em uma modalidade da presente invenção, uma composi- ção da invenção compreende um vetor de poxvírus, de preferência um vetor de MVA, com sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19, e mais preferencialmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

18. Em certas modalidades preferidas da presente invenção, o vetor é um vetor de MVA-BN ou seu derivado. Em uma ou mais modalidades específicas, uma composição da invenção compreende um vetor de poxvírus, vetor de MVA ou vetor de MVA-BN, compreendendo ácido nucleico que codifica pelo menos um primeiro antígeno do envelope do HIV que compreende sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Mais preferencialmente, tal vetor compreende ainda sequência de áci- dos nucleicos que codifica: (b) um segundo antígeno Env do HIV dife- rente do primeiro antígeno Env do HIV; (c) um terceiro antígeno e um quarto antígeno, sendo dois antígenos GAG do HIV diferentes; e (d) um quinto antígeno e um sexto antígeno, sendo dois antígenos Pol do HIV diferentes. Em modalidades preferidas da presente invenção, o segundo antígeno Env do HIV compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 5, o terceiro e o quarto antígenos compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respec- tivamente; e o quinto e o sexto antígenos compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente. Em certas modalidades da presente invenção, o terceiro e o quinto an- tígenos são fundidos em um primeiro antígeno de fusão Gag-Pol que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, e o quar- to e o sexto antígenos são fundidos em um segundo antígeno de fusão Gag-Pol que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

29.

[000111] De acordo com modalidades da presente invenção, uma composição que compreende um vetor de poxvírus de acordo com a invenção pode ser usada juntamente com um ou mais vetores adicio- nais que codificam um ou mais antígenos adicionais de HIV, e/ou um ou mais polipeptídeos antigênicos de HIV isolados. Os vetores e/ou polipeptídeos antigênicos adicionais de HIV podem estar presentes na mesma composição ou em uma ou mais composições diferentes. Pre-

ferencialmente, o um ou mais vetores adicionais são vetores virais, tais como vetores de adenovírus, mais preferencialmente vetores de ade- novírus 26 ou vetores de poxvírus, mais preferivelmente vetores de MVA. Os um ou mais vetores podem codificar qualquer antígeno de HIV conhecidos daqueles versados na técnica, tendo em vista a pre- sente descrição. Mais preferencialmente, os um ou mais vetores adici- onais são vetores de adenovírus, de preferência vetores de adenovírus 26, que codificam um ou mais antígenos do HIV que compreendem as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-5, 18, 28 e 29.

[000112] Em um aspecto, a invenção proporciona uma vacina em combinação que compreende um ou mais vetores compostos junta- mente de sequências de ácidos nucleicos que codificam (a) uma prote- ína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; (b) uma segunda proteína do envelo- pe do HIV que compreende preferencialmente a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 5; (c) um terceiro antígeno e um quarto antíge- no, sendo dois antígenos Gag do HIV diferentes, compreendendo de preferência as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 e 2, res- pectivamente; e (d) um quinto antígeno e um sexto antígeno, sendo dois antígenos Pol do HIV diferentes, compreendendo de preferência as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamen- te. Em uma ou mais modalidades específicas da presente invenção, o terceiro e o quinto antígenos são fundidos em um primeiro antígeno de fusão Gag-Pol, de preferência compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 28, e o quarto e o sexto antígenos são fundidos em um segundo antígeno de fusão Gag-Pol que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. Os vetores podem estar cada um em composições separadas, ou podem ser combinados em uma única composição. Pretende-se que os vários ácidos nucleicos no(s) vetor(es) sejam administrados a um indivíduo, de modo a resul- tar em uma resposta imunitária ao HIV que seja mais ampla do que a resposta imune que seria obtida com a administração de um ou outro vetor sozinho. As sequências múltiplas de ácidos nucleicos também poderiam estar presentes em um único vetor.

[000113] De acordo com modalidades da presente invenção, o um ou mais vetores podem ser vetores de adenovírus, de preferência ve- tores de adenovírus 26, e/ou vetores de poxvírus, de preferência veto- res de MVA. As composições que compreendem vetores de adenoví- rus e/ou de poxvírus podem opcionalmente compreender ainda um ou mais polipeptídeos antigênicos de HIV isolados. Qualquer polipeptídeo antigênico de HIV isolado pode ser utilizado nas composições da in- venção, tendo em vista a presente descrição. Em certas modalidades preferidas da presente invenção, o um ou mais polipeptídeos antigêni- cos de HIV isolados compreendem um polipeptídeo composto dos re- síduos 30-708 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, um polipeptídeo composto dos resíduos 30-724 de SEQ ID NO: 36, ou uma combinação dos mesmos.

[000114] Em uma ou mais modalidades específicas da presente in- venção, uma combinação compreende um vetor de adenovírus, de preferência um vetor de adenovírus 26, compreendendo o ácido nu- cleico que codifica um ou mais antígenos do HIV, de preferencia sele- cionado do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-5, 18, 28 e 29, e um vetor de poxvírus, preferencialmente um vetor de MVA, compreenden- do ácido nucleico que codifica ou mais antígenos do HIV, preferenci- almente selecionado do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-5, 18, 28 e 29. Preferencialmente, um ou mais vetores de adenovírus, de preferência vetores de adenovírus 26, codificam juntamente SEQ ID NOs: 1-5 e 18; e o vetor de poxvírus, de preferência vetor MVA, codifi- ca SEQ ID NOs: 1-5 e 18. Os vetores podem estar presentes em uma composição ou em uma ou mais composições diferentes.

[000115] De acordo com certas modalidades da presente invenção, uma composição, tal como uma composição de vacina, compreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de um vetor, tal como um vetor viral. Como aqui utilizada, "uma quantidade imunogenicamente eficaz" ou "quantidade imunologicamente eficaz" significa uma quanti- dade de uma composição suficiente para induzir um efeito desejado imune ou resposta imune em um indivíduo com necessidade desse tratamento. Em uma modalidade da presente invenção, uma quantida- de imunogenicamente eficaz significa uma quantidade suficiente para induzir uma resposta imunitária em um indivíduo que necessite desse tratamento. Em outra modalidade da presente invenção, uma quanti- dade imunogenicamente eficaz significa uma quantidade suficiente pa- ra produzir imunidade em um indivíduo com necessidade da mesma, por exemplo, proporcionar um efeito protetor contra uma doença, tal como uma infecção viral. Uma quantidade imunologicamente eficaz pode variar dependendo de vários fatores, tais como a condição física do indivíduo, idade, peso, saúde etc .; da aplicação particular, quer in- duzir resposta imune ou proporcionar imunidade protetora; do vetor recombinante específico administrado; do imunógeno ou polipeptídeo antigênico codificado pelo vetor recombinante administrado; do poli- peptídeo antigênico específico administrado; e da doença em particu- lar, por exemplo, infecção viral, para a qual se deseja imunidade.

[000116] A título de orientação geral, uma quantidade imunogenica- mente eficaz quando usada com referência a um vetor viral recombi- nante, tal como um vetor adenoviral, pode ser, por exemplo, cerca de 10º partículas virais a cerca de 10"? partículas virais, por exemplo, 108, 10º, 10ºº, 10º? ou 10º? partículas virais. Uma dose única de vetores adenovirais para administração a humanos em certas modalidades da presente invenção situa-se entre 10º e 10*' partulas virais. Uma quan-

tidade imunogenicamente eficaz quando usada com referência a um vetor viral recombinante, tal como um vetor de poxvírus, pode ser, por exemplo, de cerca de 10º a 10** TCIDso, 10º a 10º*º TCIDso, 10º a 10º TCID5o ou 107 a 10º TCIDso, tais como 10º, 105, 1086, 107, 108, 10º, 10º ou 10** TCIDso. Uma dose preferida para os indivíduos (de preferência um humano) compreende 10º a 10*º TCIDs5o, incluindo uma dose de 10º TCID5o, 10º TCID5o, 107 TCIDso, 10º TCIDso, 10º TCIDso ou 10º TCIDso. A quantidade imunogenicamente eficaz de um vetor de poxví- rus, tais como um vetor de MVA, pode alternativamente e convenien- temente ser expressa em unidades formadoras de placas (ufp), e po- de, por exemplo, ser de cerca de 10º a cerca de 10" ufp, por exemplo, de cerca de 105, 106, 107, 108º, 10º, 10º ou 10 ufp, de preferência de cerca de 107 a 10º ufp, e mais preferencialmente de cerca de 10º ufp, tais como, por exemplo, de cerca de 0,5 x 108, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 10º ou 5 x 10º ufp. Em certas modalidades da presente invenção, a quantidade imunogenicamente eficaz de um vetor de MVA de acordo com a invenção, administrada a um indivíduo humano, é de cerca de 1 x 107 a 1 x 10º ufp, de preferência de cerca de 1 x 10º ufp, de prefe- rência, em um volume de 0,1 mL de 1 mL, por exemplo, 0,5 mL.

[000117] Uma quantidade imunogenicamente eficaz de um vetor, tal como um vetor de MVA e/ou um vetor de adenovírus, pode ser admi- nistrada em uma composição única, ou em múltiplas composições, tais como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 composições (por exemplo, compri- midos, cápsulas ou injetáveis), em que a administração das cápsulas ou injeções múltiplas coletivamente fornece a um indivíduo a quanti- dade imunogenicamente eficaz. Também é possível administrar uma quantidade imunologicamente eficaz a um indivíduo e subsequente- mente administrar outra dose de uma quantidade imunologicamente eficaz ao mesmo indivíduo, em um chamado regime de reforço da imunização. Outras administrações de reforço podem opcionalmente ser adicionadas ao regime de tratamento, conforme necessário. Esse conceito geral de um regime de reforço da imunização é bem conheci- do daquele versado no campo das vacinas e é descrito em maiores detalhes abaixo.

[000118] Composições da invenção podem compreender ainda um veículo. Um veículo pode incluir um ou mais excipientes farmaceuti- camente aceitáveis tais como ligantes, desintegrantes, agentes de vo- lume, agentes de suspensão, agentes emulsificantes, agentes de hira- tação, lubrificantes, aromatizantes, edulcorantes, conservantes, coran- tes, solubilizantes e revestimentos. A natureza precisa do veículo ou outro material pode depender da via de administração, por exemplo, intramuscular, subcutânea, oral, intravenosa, cutânea, intramucosa (por exemplo, intestino), intranasal ou intraperitoneal. No caso das preparações líquidas injetáveis, por exemplo, suspensões e soluções, veículos e aditivos adequados incluem água, glicóis, óleos, álcoois, conservantes, agentes corantes e similares. Para preparações sólidas orais, por exemplo, pós, cápsulas, comprimidos ovais, cápsulas de gel e comprimidos, veículos e aditivos adequados incluem amidos, açúca- res, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, ligantes, agentes de desintegração e similares. Para sprays nasais/misturas inalantes, a solução/suspensão aquosa pode compreender água, glicóis, óleos, emolientes, estabilizantes, agentes de hidratação, conservantes, aro- matizantes, aromas e similares, como veículos e aditivos adequados.

[000119] Composições da invenção podem ser formuladas em qual- quer matéria adequada para administração a um indivíduo para facili- tar a administração e melhorar a eficácia, incluindo, mas sem limita- ção, administração oral (entérica) e injeções parenterais. As injeções parentéricas incluem injeção ou infusão intravenosa, injeção intra- arterial, injeção subcutânea, injeção intramuscular e intra-articular. Composições da invenção também podem ser formuladas para outras vias de administração, incluindo por via transmucosa, ocular, implante de ação prolongada retal, sublingual, sob a língua, a partir da mucosa oral contornando o portal de circulação, inalação ou intranasal.

[000120] De acordo com certas modalidades da presente invenção, uma composição compreende uma quantidade imunogenicamente efi- caz de vetor purificado ou parcialmente purificado, por exemplo, vetor de adenovírus, tal como um vetor de adenovírus 26 ou um vetor de poxvírus, como MVA ou MVA-BN, o vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV da invenção e opcionalmente um ou mais antígenos do HIV adicionais. As composições referidas podem ser formuladas como uma vacina (tam- bém referida como uma "composição imunogênica") de acordo com métodos bem conhecidos no estado da técnica. Em certas modalidades da da invenção, uma composição pode ainda compreender um ou mais polipeptídeos que compreendem uma quan- tidade imunogenicamente eficaz de um polipeptídeo antigênico do HIV isolado. Em geral, quando usado com referência a um polipeptídeo, tal como um polipeptídeo antigênico isolado, uma quantidade imunogeni- camente eficaz pode variar de, por exemplo, cerca de 0,3 a cerca de

3.000 microgramas (ug, por exemplo, 1-1.000, por exemplo, 10-500 vg, por exemplo, cerca de 50 ou de 250 ug. Como um exemplo não limitativo, é possível combinar administração de um ou mais vetores que codificam o antígeno sintético Env do HIV da invenção (por exem- plo, com SEQ ID NO: 18) e opcionalmente um ou mais antígenos adi- cionais do HIV (por exemplo, tendo SEQ ID NOs: 1-5, 28 e/ou 29) com a administração de um polipeptídeo de Env do HIV isolado, por exem- plo, por exemplo, 250 ug de proteína do trímero Env do clado C do HIV com os aminoácidos 30-708 de SEQ ID NO: 7 ou 250 ug de proteína do trímero do mosaico Env do HIV com os aminoácidos 30-708 da SEQ ID NO: 36.

[000121] Em algumas modalidades da presente invenção, as com- posições da invenção podem ainda compreender opcionalmente um adjuvante para aumentar as respostas imunitárias. Os termos "adju- vante" e "estimulante imune" são aqui utilizados indiferentemente e são definidos como uma ou mais substâncias que causam estimulação do sistema imunológico. Nesse contexto, um adjuvante é usado para melhorar uma resposta imune para os vetores que codificam proteínas sintéticas do envelope do HIV da invenção e opcionalmente um ou mais antígenos adicionais do HIV e/ou polipeptídeos antigênicos do HIV usados em combinação com os vetores que codificam proteínas sintéticos do envelope do HIV da invenção e opcionalmente um ou mais antígenos adicionais do HIV.

[000122] Os adjuvantes adequados para uso com a invenção devem ser aqueles que são potencialmente seguros, bem tolerados e eficazes em pessoas, tais como, por exemplo, QS-21, Detox-PC, MPL-SE, MOoGM-CSF, TiterMax-G, CRL-1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-l, GcMAF, B-aletina, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectina, sais de alumínio (por exemplo, AdjuPhos), Adjuplex e MF59. As razões ótimas de cada componente na formulação podem ser determinadas por técnicas bem conhecidas daqueles versados na técnica, tendo em vista a presente divulgação.

[000123] Em uma modalidade da presente invenção preferida, o ad- juvante é um sal de alumínio, tal como fosfato de alumínio, por exem- plo, AdjuPhos. Em certas modalidades da presente invenção, o fosfato de alumínio está de preferência presente em ou é administrado com uma composição com polipeptídeo antigênico do HIV isolado, tal como gp140.

[000124] A preparação e uso de composições imunogênicas são bem conhecidos daqueles versados na técnica. As composições far- macêuticas líquidas geralmente incluem um veículo líquido, tais como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintéti- co. Solução salina fisiológica, solução de dextrose ou outra solução de sacarídeo ou glicóis, tais como etilenoglicol, propilenoglicol ou polieti- lenoglicol, podem também ser incluídos.

[000125] Por exemplo, vetor de adenovírus recombinante pode ser armazenado no tampão que também é usado para o Padrão Mundial de Adenovírus (Hoganson et al., 2002, Bioprocessing J 1: 43-8): Tris mM, pH 8, NaCl 25 mM, glicerol a 2,5 %. Outro tampão de formula- ção adenovírus útil adequado para administração a humanos é Tris 20 MM, MGC 2 mM, NaCl 25 mM, sacarose a 10% p/v, polissorbato-80 a 0,02% p/v. Outro tampão de formulação que é adequado para o ade- novírus recombinante compreende tampão de citrato 10-25 mM, pH 5,9-6,2, hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HBCD) a 4-6% (p/p), NaCl 70- 100 mM, polissorbato-80 a 0,018-0,035% (p/p) e opcionalmente etanol a 0,3-0,45% (p/p). Obviamente, muitos outros tampões podem ser usados, e vários exemplos de formulações adequadas para o armaze- namento e para a administração farmacêutica de vetores purificados são conhecidos.

[000126] Um exemplo de preparação e armazenamento de vetores de poxvírus, incluindo MVA e MVA-BN, pode ser baseado na experi- ência da preparação de vacinas de poxvírus usadas para vacinação contra a varíola, como descrito, por exemplo, em Stickl, H. et al. Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 (1974).

[000127] Em uma modalidade exemplar da presente invenção, poxví- rus purificado é armazenado a -80ºC com um título de 5 x 10º TCID5so/ml formulado em Tris 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7,7. Para a preparação de injeções de vacina, por exemplo, 10º -10º partículas do vírus podem ser liofilizados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) na presença de peptona a 2% e albumina humana a 1% em uma ampola, preferivelmente uma ampola de vidro. Alternativamente,

as injeções de vacina podem ser preparadas por etapas, liofilização do vírus em uma formulação. Em certas modalidades da presente inven- ção, a formulação contém aditivos adicionais tais como manitol, dex- trano, açúcar, glicina, lactose, polivinilpirrolidona ou outros aditivos, tais como, incluindo mas sem limitação, antioxidantes ou gás inerte, estabilizantes ou proteínas recombinantes (por exemplo, soroalbumina humano) adequados para administração in vivo. A ampola é então se- lada e pode ser armazenada a uma temperatura adequada, por exem- plo, entre 4ºC e a temperatura ambiente, durante vários meses. No entanto, desde que não exista necessidade, a ampola é armazenada preferivelmente a temperaturas inferiores a -20ºC.

[000128] Em várias modalidades da presente invenção que envol- vem vacinação ou terapia, o liofilizado é dissolvido em 0,1 a 0,5 ml de uma solução aquosa, preferivelmente solução salina fisiológica ou tampão Tris, e administrado sistemicamente ou localmente, isto é, por via parentérica, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intranasal, intradérmica ou qualquer outra via de administração conhecida daque- le versado na técnica. Otimização do modo de administração, dose e número de administrações está dentro da competência e conhecimen- to daquele versado na técnica.

[000129] Uma vantagem das modalidades da presente invenção em que o vetor ou combinação de vetores codifica ambos os antígenos do HIV que compreendem SEQ ID NOs: 18 e 5 é o aumento da ampli- tude da resposta imune (que abrange cepas dos clados B e C).

[000130] Em certas modalidades da presente invenção, uma compo- sição ou uma combinação de vacina da invenção compreende ainda nos mesmos vetores ou outros vetores ácido nucleico que codifica um polipeptídeo antigênico do HIV que compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 28 (mos1GagPol) e/ou SEQ ID NO: 29 (mos2GagPol).

[000131] Em uma modalidade particular, uma composição ou uma combinação de vacina da invenção compreende um primeiro vetor de adenovírus, de preferência um vetor de adenovírus 26, que codifica um antígeno do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e ainda compreende um segundo vetor de adenoví- rus, de preferência um vetor de adenovírus 26, que codifica um antí- geno do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e um ou mais vetores de adenovírus adicionais, de preferência vetores de adenovírus 26, que codificam um ou mais antígenos do HIV que compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID nO: 28 ou SEQ ID nO: 29. Por exemplo, uma composição ou uma combinação de vacina de acordo com uma moda- lidade da invenção pode compreender quatro vetores de adenovírus, de preferência vetores de adenovírus 26, com um primeiro vetor que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID nO: 18; um segundo vetor que codifica um antígeno do HIV que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 5; um terceiro vetor que codifica um antígeno do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; e um quarto vetor que codifica um antígeno do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. De preferência, o vetor de poxvírus da invenção pode ser parte de uma combinação de vacina com esses vetores de adenovírus. Esse vetor de poxvírus, preferenci- almente um vetor de MVA, por exemplo, um vetor de MVA-BN, em uma modalidade preferida, codifica cada uma das SEQ ID NOs: 18, 5, 28e29.

[000132] Em uma modalidade particularmente preferida da invenção, uma composição ou uma combinação de vacina compreende um vetor de poxvírus, de preferência um vetor de MVA, preferivelmente MVA- BN, que compreende sequência de ácidos nucleicos que codifica seis antígenos do HIV diferentes, a saber, os antígenos codificados por SEQ ID NO: 18 (mos28S Env), SEQ ID NO: 5 (mos1 Env), SEQ ID NO: 1 (mos1 Gag), SEQ ID NO: 2 (MoS2 Gag), SEQ ID NO: 3 (mos1 Pol) e SEQ ID NO: 4 (moS2 Pol), em que as SEQ ID NOs: 1 e 3 podem ser opcionalmente fundidas (SEQ ID NO: 28; mos1GagPol) e as SEQ ID NOs: 2 e 4 podem ser opcionalmente fundidas (SEQ ID NO: 29: mos2GagPol). Uma vantagem é que apenas um único vetor precisa ser produzido, purificado, formulado, testado, armazenado, transporta- do e administrado para administração desses seis antígenos do HIV. Além disso, sabe-se que vetores de poxvírus, tal como MVA, incluindo MVA-BN, proporcionam boas respostas imunes contra os antígenos codificados nos mesmos. Além disso, eles podem geralmente ser usa- dos vantajosamente em conjunto com outras plataformas de vetores, tal como com vetores adenovirais, por exemplo, Ad26, em regimes de reforço da imunização para gerar ainda respostas imunes melhoradas. Por exemplo, o vetor de poxvírus com a sequência de ácidos nucleicos que codifica os seis antígenos do HIV diferentes codificados pelas SEQ ID NOs: 1-5 e 18 pode ser usado juntamente com um ou mais vetores de adenovírus, de preferência vetores de adenovírus 26 veto- res, que codificam um ou mais antígenos do HIV, codificados pelas SEQ ID NOs: 1-5 e 18, preferencialmente no caso em que um ou mais vetores de adenovírus codificam juntamente SEQ ID NOs: 1-5 e 18.

[000133] Como mencionado acima, em algumas modalidades da presente invenção, a composição ou uma combinação de vacina com- preende ainda um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados. Qualquer polipeptídeo antigênico do HIV conhecido daqueles versados na técnica, tendo em vista a presente descrição, pode ser ainda incluí- do em uma composição ou uma combinação da vacina da invenção, incluindo, mas sem limitação, uma proteína do envelope do HIV (por exemplo, gpl60, gp140, gp120 ou gp41), de preferência uma proteína trimérica estabilizada gp140, tal como uma proteína gp140 estabilizada clado C ou clado A. Em uma modalidade preferida da presente inven- ção, o polipeptídeo antigênico do HIV isolado é uma proteína trimérica estabilizada gp140 clado C do HIV, tal como aquela que compreende os resíduos 30-708 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (os resíduos 1-29 de SEQ ID NO: 7 estão na sequência de sinaliza- ção). Um polipeptídeo de Env do HIV alternativo ou adicional que po- deria ser usado além da proteína gp140 clado C ou sozinho é uma proteína trimérica do mosaico Env, por exemplo, apresentando uma sequência de aminoácidos como descrito nos aminoácidos 30-724 de SEQ ID NO: 36 (que corresponde à SEQ ID NO: 2 do documento WO 2014/107744, em que os resíduos 1-29 de SEQ ID nO: 36 estão na sequência de sinalização). Em certas modalidades da presente inven- ção, os polipeptídeos antigênicos do HIV compreendem tanto (i) uma proteína gp140 clado C que compreende os resíduos de aminoácidos 30-708 de SEQ ID NO: 7 quanto (ii) uma proteína gp140 do mosaico que compreende os resíduos de aminoácidos 30-724 de SEQ ID NO: 36.

[000134] A invenção também se refere a um método de produção de uma composição ou uma combinação da vacina da invenção. De acordo com modalidades da presente invenção, um método de produ- ção de uma composição ou uma combinação compreende a combina- ção de um vetor que compreende ácido nucleico que codifica a proteí- na sintética do envelope do HIV da invenção com um veículo e opcio- nalmente um ou mais vetores adicionais que codificam um ou mais polipeptídeos antigênico adicionais do HIV e/ou um ou mais polipeptí- deos antigênicos do HIV isolados. Aquele versado na técnica estará familiarizado com técnicas convencionais usadas para preparar essas composições. Vacina e Combinações de Vacina

[000135] Outros aspectos gerais da presente invenção referem-se a vacinas e combinações de vacina. Em certas modalidades da presente invenção, as composições da invenção aqui descritas são vacinas. Como aqui utilizado, o termo "vacina" refere-se a uma composição que compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de um vetor de expressão, de preferência um vetor viral, que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV da invenção e opcionalmente codifica ainda um ou mais antígenos adicionais do HIV que podem proporcio- nar imunidade protetora ou uma resposta imunitária protetora a um indivíduo, ou para vacinar um indivíduo. De acordo com modalidades da presente invenção, após administração da composição a um indiví- duo, o vetor de expressão expressa a proteína sintética codificada do envelope do HIV e opcionalmente antígenos adicionais codificados do HIV, e a proteína sintética expresas do envelope do HIV e opcional- mente antígenos adicionais codificados do HIV são apresentados ao sistema imune do indivíduo, induzindo desse modo a resposta requeri- da para produzir imunidade ou induzir uma resposta imune.

[000136] Deste modo, em outro aspecto geral, a invenção proporcio- na uma vacina para induzir uma resposta imunológica contra um vírus da imunodeficiência humana (HIV) em um indivíduo. De acordo com modalidades da presente invenção, a vacina compreende uma com- posição que contém uma quantidade imunogenicamente eficaz de um vetor de expressão que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV a qual compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

18. De preferência, o vetor de expressão é um vetor viral, mais prefe- rencialmente um vetor de adenovírus, por exemplo, vetor de adenoví- rus 26, e ainda mais preferivelmente, um vetor de poxvírus, por exem- plo, o vetor MVA ou MVA-BN.

[000137] De acordo com modalidades da presente invenção, as composições de vacina podem compreender ainda um ou mais veto- res adicionais, por exemplo, vetores virais, tais como vetores de ade-

novírus, de preferência vetores de adenovírus 26, que codificam um ou mais polipeptídeos antigênicos adicionais do HIV e/ou um ou mais po- lipeptídeos antigênicos do HIV isolados. A proteína sintética do enve- lope do HIV, vetores adicionais e/ou um ou mais polipeptídeos antigê- nicos do HIV isolados podem ser formulados na mesma composição ou em uma ou mais composições diferentes na vacina.

[000138] A invenção refere-se também a combinações de vacina pa- ra primeira imunização e reforço de uma resposta imunitária a um ou mais clados do HIV em um indivíduo que necessite desse tratamento usando um ou mais vetores, opcionalmente em combinação com um polipeptídeo antigênico isolado. Desse modo, em outro aspecto geral, a invenção proporciona uma combinação de vacina para induzir uma resposta imune contra um HIV em um indivíduo, compreendendo: (a) uma primeira composição de vacina que compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de um vetor de poxvírus que compreende sequência de ácidos nucleicos que codifica um primeiro antígeno Env do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e que opcionalmente compreende ainda sequência de ácidos nucleicos que codifica outros antígenos do HIV, de preferência um ou mais antígenos do HIV que compreende as sequências de áci- dos aminados selecionados de SEQ ID NOs: 1-5, 28 e 29; e pelo me- nos um dos seguintes: (b) (1) uma segunda composição de vacina que compreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de um ou mais vetores de adenovírus que codificam um ou mais antígenos do HIV que compre- ende as sequências de ácidos aminados selecionados do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-5, 18, 286 29; e (b) (ii) uma terceira composição de vacina que compreende um ou mais polipeptídeos que compreendem uma quantidade imuno- genicamente eficaz de um polipeptídeo antigênico do HIV isolado, em que a primeira composição e a segunda e/ou terceira composições estão presentes na mesma composição ou em uma ou mais composi- ções diferentes.

[000139] Em certas modalidades da invenção, a primeira composi- ção de vacina compreende um vetor de MVA que codifica um primeiro antígeno Env do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, um segundo antígeno Env do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, terceiro e quarto antíge- nos Gag do HIV que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente, e quinto e sexto an- tígenos Pol do HIV que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente. Em certas modalida- des da presente invenção, os antígenos Gag e Pol de SEQ ID NOs: 1 e 3 são combinados e se apresentam como um antígeno de fusão Gag-Pol que compreende SEQ ID NO: 28, e/ou os antígenos Gag e Pol de SEQ ID NOs: 2 e 4 são combinadas e se apresentam como um antígeno de fusão Gag-Pol que compreende SEQ ID NO: 29.

[000140] Em certas modalidades da presente invenção, a segunda composição de vacina compreende um vetor de Ad26 que codifica um antígeno de HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, um vetor de Ad26 que codifica um antígeno de HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, um vetor de Ad26 que codifica um antígeno de HIV que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID nO: 28, e um vetor de Ad26 que codifica um antígeno de HIV que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID nO: 29.

[000141] Em certas modalidades da presente invenção, uma combi- nação de vacina compreende um ou mais polipeptídeos que compre- endem uma quantidade imunogenicamente eficaz de um polipeptídeo antigênico do HIV isolado. Preferencialmente, um polipeptídeo antigê-

nico de HIV isolado compreende os resíduos 30-708 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou os resíduos 30-724 de SEQ ID NO:

36. Em certas modalidades da presente invenção, dois polipeptídeos antigênicos de HIV isolados são administrados juntamente com uma composição, por exemplo, um primeiro polipeptídeo antigênico de HIV isolado que compreende os resíduos 30-708 da sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 7, e um segundo polipeptídeo antigênico do HIV isolado que compreende os resíduos 30-724 de SEQ ID NO: 36. O po- lipeptídeo antigênico do HIV isolado pode estar presente em uma ter- ceira composição ou na primeira e/ou segunda composições. A primei- ra ou a segunda composição pode ser administrada em conjunto com um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados, preferencial- mente gp140, para as administrações de início de imunização e/ou de reforço.

[000142] Como uusados aqui, os termos "cotransferência", "coadmi- nistração" ou "administrado em conjunto com" referem-se a adminis- tração simultânea de dois ou mais componentes, tais como um vetor de expressão viral e um polipeptídeo antigênico isolado, ou múltiplos vetores de expressão viral. "Administração simultânea" pode ser admi- nistração dos dois ou mais componentes pelo menos no mesmo dia. Quando dois componentes são "administradas em conjunto com", eles podem ser administrados em composições separadas sequencialmen- te dentro de um curto período de tempo, tais como 24, 20, 16, 12, 8 ou 4 horas, ou no prazo de 1 hora ou menos, tal como essencial e simul- taneamente, ou eles podem ser administrados em uma única compo- sição ao mesmo tempo.

[000143] Outro aspecto geral da presente invenção refere-se a um Kit que compreende uma combinação de vacina de acordo com uma mo- dalidade da invenção.

[000144] Outras modalidades da proteína sintética do envelope do

HIV, vetores de expressão, vetores de expressão adicionais, antígenos do HIV codificados pelos vetores de expressão e polipeptídeo antigê- nico do HIV isolado etc. que podem ser usados nas combinações de vacina da invenção são discutidos em detalhes anteriormente e nos exemplos ilustrativos abaixo. Método para indução de imunidade protetora contra infecção por HIV

[000145] A invenção também se refere a um método de indução de uma resposta imune contra um ou mais clados do HIV em um indiví- duo com necessidade desse tratamento. Os métodos aqui descritos incluem métodos de imunização e reforço de uma resposta imunitária utilizando um ou mais vetores de expressão, opcionalmente em com- binação com um ou mais polipeptídeos antigênicos isolados.

[000146] De acordo com modalidades da presente invenção, "indu- ção de uma resposta imune" quando usada com referência a métodos e composições aqui descritos engloba proporcionar imunidade proteto- ra e/ou vacinar um indivíduo contra uma infecção, tal como infecção por HIV, para fins profiláticos, bem como produzir uma resposta ou efeito imunitário desejado em um indivíduo com necessidade desse tratamento contra uma infecção, tal como infecção por HIV, para fins terapêuticos, ou seja, vacinação terapêutica. "Indução de uma respos- ta imunitária" engloba também proporcionar uma imunidade terapêuti- ca para tratamento contra um agente patogênico, ou seja, HIV. Tipi- camente, para vacinação profilática, composições e vacinas são admi- nistradas a indivíduos que não tenham sido anteriormente infectados com HIV, uma vez que para vacinação terapêutica, composições e va- cinas são administradas a um indivíduo já infectado com HIV. A res- posta imune pode ser uma resposta imune celular e/ou uma resposta imune humoral.

[000147] Como aqui utilizado, o termo "imunidade protetora" ou "res- posta imunitária protetora" significa que o indivíduo vacinado é capaz de controlar uma infecção com o agente patogênico contra o qual a vacinação foi efetuada. Geralmente, o indivíduo que desenvolveu uma "resposta imune protetora" desenvolve apenas sintomas clínicos leves a moderados ou de modo algum nenhum sintoma. Geralmente, um indivíduo que apresenta uma "resposta imunitária protetora" ou "imuni- dade protetora" contra um determinado agente não morrerá como re- sultado da infecção com o referido agente.

[000148] Como aqui utilizado, o termo "imunidade terapêutica" ou "resposta imunitária terapêutica" significa que o indivíduo vacinado in- fectado com HIV é capaz de controlar uma infecção com o agente pa- togênico, ou seja, HIV, contra o qual a vacinação foi efetauda. Tipica- mente, a administração das composições de vacina de primeira imuni- zação e de reforço de acordo com modalidades da presente invenção terão o objetivo terapêutico de gerar uma resposta imunitária contra o HIV após a infecção pelo HIV ou o desenvolvimento de sintomas ca- racterísticos de infecção por HIV. De preferência, os métodos da in- venção destinam-se a fins terapêuticos, tal como vacinação terapêuti- ca, em que as composições e vacinas aqui descritas são administra- das a um indivíduo já infectado com HIV. Portanto, a população de pa- cientes para tratamento de acordo com os métodos da invenção aqui descrita são preferencialmente indivíduos infectados pelo HIV, e mais preferencialmente indivíduos humanos infectados com HIV. Os termos "infecção por HIV" e "infectado pelo HIV", como aqui usados, referem- se a invasão de um hospedeiro humano pelo HIV. Como aqui utilizado, "um indivíduo infectado com HIV" refere-se a um indivíduo em quem o HIV penetrou e subsequentemente replicou-se e propagou-se no hos- pedeiro, levando desse modo o hospedeiro a ser infectadas com HIV ou ter uma infecção por HIV ou os seus sintomas.

[000149] Em um aspecto geral, um método de indução de uma res- posta imunológica contra um vírus da imunodeficiência humana (HIV)

em um indivíduo compreende administrar ao indivíduo uma composi- ção que compreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de um vetor de expressão, de preferência um vetor de poxvírus (por exemplo, MVA-BN ou MVA), que compreende uma sequência de ácidos nuclei- cos que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e de prefe- rência codifica ainda antígenos do HIV como aqui descrito. Qualquer uma das composições aqui descritas pode ser usada em um método de indução de uma resposta imunitária contra HIV em um indivíduo. À composição pode ainda compreender um ou mais vetores, por exem- plo, adenovírus, que codifica os mesmos antígenos ou um ou mais an- tígenos adicionais de HIV e/ou um ou mais polipeptídeos antigênicos adicionais do HIV isolados. Também é possível codificar um ou mais antígenos adicionais do HIV no mesmo vetor que o vetor que codifica a proteína do envelope do HIV que compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 18. Isso é particularmente adequado para vetores de poxvírus, como MVA, incluindo MVA -BN, como mostrado aqui.

[000150] Em outro aspecto geral, um método de induçao de uma resposta imunitária contra um vírus da imunodeficiência humana (HIV) em um indivíduo compreende administrar ao indivíduo: (a) uma primeira vacina que compreende um ou mais veto- res de adenovírus recombinantes, de preferência vetores de Ad26, que codificam uma ou mais das SEQ ID NOs: 1, 2, 3,4, 5, 18,286 29; e (b) uma segunda vacina que compreende um vetor de pox- vírus, preferencialmente um vetor de MVA que codifica a SEQ ID NO: 18, e que preferencial e ainda codifica um ou mais antígenos do HIV que compreendem as sequências de ácidos aminados selecionadas do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-5, 28 e 29, em que as etapas (a) e (b) são realizados em qualquer ordem, com uma das etapas des-

tinada à primeira imunização e a outra etapa destinada a reforço da imunização.

[000151] Em algumas modalidades da presente invenção, um méto- do de indução de uma resposta imune compreende ainda a adminis- tração ao indivíduo de ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isola- dos, de preferência um ou mais polipeptídeos antigênicos de HIV compreendendo (i) um polipeptídeo que compreende os resíduos 30- 708 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7, ou (ii) um polipeptí- deo que compreende os resíduos 30-724 de SEQ ID NO: 36, ou (iii) ambos os polipeptídeos (i) e (ii). Os um ou mais polipeptídeos antigê- nicos do HIV isolados podem estar presentes na mesma composição da primeira e/ou segunda composições ou em uma ou mais composi- ções adicionais. Em uma modalidade preferida da presente invenção, os um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados são adminis- trados aproximadamente ao mesmo tempo que a composição usada para a imunização de reforço. Em certos modalidades da presente in- venção, os um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados es- tão presentes na mesma composição da vacina de reforço. Em outras modalidades da presente invenção, os um ou mais polipeptídeos anti- gênicos do HIV isolados estão presentes em uma composição separa- da da vacina de reforço. Em certas modalidades da presente invenção, o polipeptídeo antigênico do HIV isolado está em uma composição que compreende um adjuvante, por exemplo, fosfato de alumínio.

[000152] Em uma modalidade particular de um método de indução de uma resposta imune de acordo com a invenção, a primeira compo- sição compreende um vetor de adenovírus, de preferência um vetor de adenovírus 26, que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e um segundo vetor de adenovírus, de preferência um vetor de adenoví- rus 26, que codifica um antígeno de HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; a segunda composição compreen- de um vetor de poxvírus, preferencialmente um vetor de MVA, tal co- mo um vetor de MVA-BN, de acordo com a invenção, compreendendo ácido nucleico que codifica o antígeno sintético de HIV que compreen- de o aminoácido de SEQ ID NO: 18, e de preferência compreende ainda sequência de ácidos nucleicos que codifica um ou mais antíge- nos do HIV que compreendem as sequências de ácidos aminados de SEQ ID NOs: 1-5, 28 e 29, mais preferencialmente antígenos do HIV que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 5, 28 e 29; em que a primeira composição é administrada ao indivíduo uma ou mais vezes para início de imunização, e a segunda composi- ção é administrada ao indivíduo uma ou mais vezes para aumentar a imunização, ou em que a primeira composição é administrada ao indi- víduo uma ou mais vezes para reforçar a imunização e a segunda composição é administrada ao indivíduo uma ou mais vezes para iní- cio de imunização. Em modalidades preferidas da presente invenção, a primeira composição compreende ainda um terceiro vetor de adeno- vírus, de preferência um vetor de Ad26, que codifica um polipeptídeo antigênico de HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, e um quarto vetor de adenovírus, e um quarto vetor de adenovírus, preferencialmente um vetor de Ad26, que codifica um polipeptídeo antigênico do HIV que compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 29.

[000153] Em outra modalidade particular de um método de indução de uma resposta imune, a primeira composição compreende um pri- meiro vetor de adenovírus, de preferência um vetor de adenovírus 26, que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e um segundo vetor de adenovírus, de preferência um vetor de adenovírus 26, que codifica um polipeptídeo antigênico de HIV que compreende a se-

quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; a segunda composição compreende um vetor de poxvírus, de preferência um vetor MVA, mais preferivelmente MVA-BN, que compreende sequência de ácidos nu- cleicos que codifica os antígenos do HIV que compreendem as se- quências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 1-5 e 18, mais preferenci- almente as SEQ ID NOS: 5, 18, 28 e 29, e suas combinações; em que a primeira composição é administrada ao indivíduo uma ou mais vezes para preparação de imunização, e a segunda composição é adminis- trada ao indivíduo uma ou mais vezes para aumentar a imunização, opcionalmente em conjunto com um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados; ou em que a segunda composição é administrada ao indivíduo uma ou mais vezes para preparação de imunização, e a pri- meira composição é administrada ao indivíduo uma ou mais vezes pa- ra aumentar a imunização, opcionalmente em conjunto com um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados. Em modalidades pre- feridas da presente invenção, a primeira composição compreende ain- da um terceiro vetor de adenovírus, de preferência um vetor de Ad26, que codifica um polipeptídeo antigênico de HIV que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, e um quarto vetor de ade- novírus, de preferência um vetor de Ad26, que codifica um polipeptí- deo antigênico do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

[000154] A administração das composições imunogênicas que com- preendem os vetores de expressão e/ou polipeptídeos antigênicos se dá tipicamente por via intramuscular, intradérmica ou subcutânea. No entanto, outros modos de administração, tal como intravenoso, retal, cutâneo, oral, nasal etc., podem também ser previstos. Administração intramuscular de composições imunogênicas pode ser alcançada por utilização de uma agulha para injetar uma suspensão dos vetores de expressão, por exemplo, vetores de adenovírus e/ou polipeptídeos an-

tigênicos. Uma alternativa é o uso de um dispositivo de injeção sem agulha para administrar a composição (usando, por exemplo, Biojec- tor"") ou um pó liofilizado que contém a vacina.

[000155] Para injeção intramuscular, intravenosa, cutânea ou subcu- tânea, ou injeção no local afetado, o vetor será na forma de uma solu- ção aquosa parentericamente aceitável que é isenta de pirogênios e possui pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Do mesmo modo, o polipeptídeo antigênico isolado será na forma de uma solução paren- tericamente aceitável, com um pH, isotonicidade e estabilidade ade- quados. Aqueles versados na técnica são perfeitamente capazes de preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotó- nicos tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Inje- ção de Ringer lactato. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxi- dantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, conforme requerido. Uma formulação de liberação lenta também pode ser utilizada.

[000156] Tipicamente, administração das composições de vacina de acordo com modalidades da presente invenção terá um objetivo tera- pêutico para gerar uma resposta imune contra um antígeno do HIV após infecção ou o desenvolvimento de sintomas. Em outras modali- dades da presente invenção, os vetores de expressão, por exemplo, vetores de adenovírus e/ou vetores de poxvírus e/ou polipeptídeos an- tigênicos do HIV, podem ser administrados para fins profiláticos antes da infecção ou do desenvolvimento de sintomas.

[000157] As composições imunogênicas que contêm os vetores de expressão, por exemplo, vetores de adenovírus e/ou vetores de poxví- rus e/ou polipeptídeos antigênicos, são administradas a um indivíduo, dando origem a uma resposta imunitária anti-HIV no indivíduo. Uma quantidade de uma composição suficiente para induzir uma resposta imunitária detectável é definida para ser um "dose imunogenicamente eficaz" ou "quantidade imunogenicamente eficaz". Em uma modalida-

de típica da invenção, a resposta imunitária é uma resposta imunitária terapêutica.

[000158] A quantidade real administrada e a taxa e decurso de tem- po da administração dependerão da natureza e gravidade do que está sendo tratado. Prescrição do tratamento, por exemplo, decisões sobre a dosagem etc., está dentro da responsabilidade do clínico geral e ou- tros médicos, ou em um contexto veterinário, um veterinário, e tipica- mente tem em conta o distúrbio a ser tratado, a condição do paciente individual, o local de administração, o método de administração e ou- tros fatores conhecidos dos médicos. Exemplos das técnicas e proto- colos mencionados acima podem ser encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16º edição, Osol, A. ed., 1980.

[000159] Após a produção de vetores de adenovírus e/ou vetores de poxvírus tais como vetores de MVA e formulação opcional de tais par- tículas em composições, os vetores podem ser administrados a um indivíduo, particularmente um humano ou outro primata. Administração a mamífero não humano não precisa ser com objetivo terapêutico, mas pode se destinar a uso em um contexto experimental, por exemplo, na investigação de mecanismos de respostas imunes à proteína sintética do envelope do HIV e outros antígenos do HIV expressos pelos veto- res de adenovírus e/ou vetores de poxvírus da invenção.

[000160] Em uma modalidade dos métodos descritos, um ou mais vetores de adenovírus que codificam um ou mais antígenos do HIV aqui descritos são usados para iniciar a resposta imune. Um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados podem ser utilizados em conjunto com os denominados um ou mais vetores de adenovírus para a imunização de preparação. Em outra modalidade da presente inven- ção, um ou mais vetores de poxvírus, de preferência MVA ou MVA-BN, os vetores de poxvírus que codificam um ou mais antígenos do HIV da presente invenção, são usados para iniciar a resposta imune. Um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados podem ser usados jun- tamente com os denominados um ou mais vetores de poxvírus para a imunização de preparação. A imunização de preparação pode ser ad- ministrada apenas uma vez, mas pode opcionalmente também ser administrada várias vezes, por exemplo, administração inicial de pre- paração no tempo 0, seguida de outra administração de preparação cerca de 1-24 semanas após a administração inicial de preparação. Um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados, opcionalmente em conjunto com um ou mais vetores de adenovírus ou vetores de poxvírus que codificam um ou mais antígenos adicionais de HIV, po- dem ser utilizados para estimular a resposta imune.

[000161] Após a administração de iniciação, um ou mais dos vetores adenovirais da presente invenção ou os vetores de poxvírus da pre- sente invenção pode ser usados em uma ou mais imunizações de re- forço. Uma imunização de reforço também pode ser administrada uma vez ou várias vezes, por exemplo, primeiro cerca de 4-52 semanas após a administração inicial de preparação, opcionalmente seguida de outra administração de reforço, por exemplo, cerca de 8-100 semanas após a administração inicial de preparação. Em certas outras modali- dades da presente invenção, um ou mais vetores de adenovírus da presente invenção são administrados em conjunto com um ou mais vetores de poxvírus da presente invenção para a primeira imunização e/ou para reforçar a imunização. A resposta imune induzida pela imu- nização é monitorada.

[000162] Regimes de preparação-reforço são geralmente preferidos para a geração de respostas imunes fortes. É possível administrar o mesmo vetor várias vezes, referido como preparação-reforço homólo- go. É normalmente preferido de acordo com a invenção aplicar um re- gime de preparação-reforço heterólogo, que neste contexto indica que os vetores de primeira imunização e de reforço são diferentes. Em cer-

tas modalidades, tais como modalidades de regime de preparação- reforço da presente invenção, por exemplo, a ativação se dá com vetor adenoviral, por exemplo, Ad26, e o reforço se dá com o vetor de poxví- rus, por exemplo, MVA, tal como MVA-BN. Em outras modalidades da presente invenção, tais como modalidades de regime de preparação- reforço heterólogo, por exemplo, a ativação se dá com o vetor de pox- vírus, por exemplo, MVA, tal como MVA-BN, e o reforço se dá com ve- tor adenoviral, por exemplo, Ad26. Opcionalmente em regimes de pre- paração-reforço, polipeptídeo antigênico do HIV isolado, tal como gp140, pode ser administrado mais ou menos ao mesmo tempo que a administração de preparação ou de reforço desse vetor de adenovírus ou de poxvírus.

[000163] Em um exemplo e modalidade não limitativa da presente invenção, um indivíduo recebe administração de quatro vetores de adenovírus 26 diferentes, que condificam juntamente antígenos do HIV compreendendo as SEQ ID NOs: 5, 18, 28 e 29, em que os vetores estão presentes em uma razão de 1:1:1:1 e são administrados sob uma dose total de 5x10º partículas virais em 0,5 mL por injeção intra- muscular nas semanas O e 12º, seguidos de administração de um ve- tor de MVA que codifica antígenos do HIV que compreendem as SEQ ID NOs: 5, 18, 28 e 29, sob uma dose de cerca de 10º unidades for- madoras de placas por injeção de 0,5 ml administrada intramuscular- mente nas semanas 24º e 48º.

[000164] É prontamente entendido por aqueles versados na técnica que o regime para as administrações de iniciação e reforço pode ser ajustado com base nas respostas imunes medidas após as adminis- trações. Por exemplo, as composições de reforço são geralmente ad- ministradas semanas ou meses ou mesmo anos depois da administra- ção da composição de preparação.

[000165] De acordo com modalidades da presente invenção, um ad-

juvante pode ser administrado em conjunto com o polipeptídeo antigê- nico do HIV isolado como parte da preparação e/ou imunização de re- forço. Qualquer adjuvante pode ser utilizado em conjunto com o poli- peptídeo antigênico isolado de HIV, tendo em vista a presente descri- ção, e em certas modalidades da presente invenção, o adjuvante é um sal de alumínio, tal como fosfato de alumínio.

[000166] Em uma modalidade preferida da invenção, os vetores adenovirais usados nos métodos aqui descritos incluem um vetor rAd26, e os vetores de poxvírus utilizados nos métodos aqui descritos incluem um vetor de MVA.

[000167] Em uma modalidade exemplificativa da presente invenção, um vetor de rAd26 que codifica uma proteína sintética do envelope de HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 é usado para iniciar a resposta imune em combinação com um vetor de rAd26 que codifica um antígeno do HIV que possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID nO: 5. Um ou mais vetores adicionais rAd26 que codificam um ou mais antígenos adicionais de HIV com as se- quências de ácidos aminados selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID nOs: 1-4, 28 e 29 também podem ser administrados juntamen- te com outros vetores de rAd26 para preparar a resposta imune. Em certas modalidades da presente invenção, a administração de prepa- ração pode ser readministrada antes de qualquer imunização de refor- ço ser administrada. Um vetor MVA que codifica uma proteína sintética do envelope de HIV compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e que ainda codifica as SEQ ID NOs: 5, 28 e 29 é usa- do para reforçar a resposta imunitária nessas modalidades da presen- te invenção. Opcionalmente, um polipeptídeo antigênico de HIV isola- do, tal como aquele que compreende os resíduos 30-708 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou que compreende os resíduos 30- 724 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, ou uma combi-

nação de pelo menos dois desses polipeptídeos antigênicos de HIV isolados, é administrado em conjunto com o vetor MVA para reforçar a resposta imunitária. De preferência, um adjuvante é ainda administra- do com o polipeptídeo antigênico de HIV isolado na imunização de re- forço.

[000168] Em outra modalidade exemplificativa da presente invenção, um vetor de MVA ou MVA-BN que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e ainda codifica as SEQ ID NOs: 5, 28 e 29 é usado para preparar o resposta imune. Em certas modalidades da presente invenção, a administração da preparação é readministrada de qual- quer reforço imunização de reforço ser administrada. Subsequente à uma administração da preparação, uma ou mais imunizações de refor- ço são administradas; a imunização reforço compreende um vetor de rAd26 que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 em com- binação com um vetor de rAd26 que codifica um antígeno do HIV que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Um ou mais ve- tores adicionais de rAd26 que codificam um ou mais polipeptídeos an- tigênicos do HIV adicionais que possuem as sequências de ácidos aminados selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID nOs: 144, 28 e 29, de preferência também são administrados em conjunto com os outros vetores de rAd26 para estimular a resposta imune. Opcio- nalmente, um polipeptídeo antigênico de HIV isolado, tal como aquele que compreende os resíduos 30-708 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou que compreende os resíduos 30-724 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, ou uma combinação de pelo me- nos dois desses polipeptídeos antigênicos do HIV isolados, é adminis- trado juntamente com os vetores de rAd26 para estimular a resposta imune.

[000169] Em uma modalidade da presente invenção particularmente exemplar, uma resposta imune é preparada por administração de qua- tro antígenos do HIV codificados em vetores de adenovirais, de prefe- rência vetores de rAd26, sendo os quatro antígenos que são codifica- dos: (i) uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, (ii) antígeno Env do HIV que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, (iii) antígeno de fusão Gag-Pol do HIV que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID nO: 28, e (iv) antígeno de fusão Gag-Pol do HIV que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID nO: 29. Cada um desses quatro antígenos podem ser codificados em um vetor adenoviral separado, de preferência um vetor de rAd26, administrado sob uma dose total de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 x 10º partículas virais (vp), por exemplo, cerca de 5 x 10º vp (para todos os vetores juntamente). Os vetores podem ser pré-misturados, por exemplo, em uma proporção de 1:1:1:1. A administração de vetores de adenovírus se dá preferen- cialmente por meio de injeção intramuscular.

A administração de pre- paração pode ser readministrada após a administração inicial de pre- paração.

Nesta modalidade, uma resposta imunitária é aumentada mediante administração de um vetor de MVA ou MVA-BN que codifica quatro antígenos de HIV que compreendem a SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 29 sob uma dosagem de 10º a 10" ufp, por exemplo, uma dose de 107 ufp, 10º ufp ou 10º ufp, ou sob uma dosagem de 10º a 10º TCID5o, por exemplo, 107, 108 ou 10º TCIDso.

De preferência, a dosagem é de 2 x 10º a 5 x 10º ufp.

Prefe- rencialmente, a dose para seres humanos compreende pelo menos 5 x 107 ufp, por exemplo, pelo menos 1 x 10º ufp, ou alternativamente pelo menos 2 x 107 TCIDs5o, pelo menos 3 x 10” TCID5o, pelo menos 5 x 107 TCID5o, por exemplo, pelo menos 1 x 10º TCID5o, ou pelo menos 2 x 108 TCID5o.

A administração de MVA ou MVA-BN para reforçar a res-

posta imunitária pode ser realizada a qualquer momento após a admi- nistração inicial de preparação. A administração de reforço pode ser repetida após a administração de reforço inicial. Todas as administra- ções de MVA de acordo com esta modalidade da presente invenção podem ser realizadas, por exemplo, por via intramuscular ou subcutãà- nea.

[000170] Alternativamente, o vetor de MVA pode ser usado para ad- ministração de preparação e para os vetores de Ad26 para administra- ção de reforço, tudo essencialmente como indicado acima, exceto em ordem inversa de administração dos tipos de vetores adenovirais e de poxvírus. Opcionalmente, proteína gp140 isolada pode ser administra- da juntamente com administração de estimulação. Por exemplo, a pro- teína gp140 do Env isolada, por exemplo, proteína gp140 clado C (compreendendo os resíduos 30-708 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7), ou proteína gp140 do mosaico (compreendendo os resíduos 30-724 da sequência de aminoácidos de SEQ ID nO: 36), ou proteína gp140 clado C e proteína gp140 do mosaico, sob uma dose total de cerca de 50-300 ug de proteína, por exemplo, 50 ou 250 mi- crogramas de proteína gp140 clado C, ou, por exemplo, 50 ou 250 mi- crogramas de proteína gp140 do mosaico, ou, por exemplo, 50 ou 250 microgramas de uma combinação de proteína gp140 clado C e prote- ína gp140 do mosaico (por exemplo, na proporção de 1:1, quer admi- nistrada em mistura ou separadamente), pode ser administrada junta- mente com o vetor de poxvírus para a imunização de reforço. De pre- ferência, a proteína gp140 é administrada em conjunto com um adju- vante, por exemplo, fosfato de alumínio.

[000171] Em certas modalidades da presente invenção, um método de indução de uma resposta imune de acordo com a invenção com- preende ainda a administração de um agente de purga do reservatório latente viral. Células latentemente infectadas com HIV transportam ví-

rus que é silencioso em termos de transcrição, tornando difícil erradi- car eficazmente infecção por HIV em indivíduos tratados. Como aqui utilizados, "agente de purga do reservatório" e "agente de purga do reservatório latente viral" referem-se a uma substância que reduz o pool latente de HIV mediante reativação dos reservatórios de HIV, tal como por indução de expressão de HIV quiescente. Exemplos de agentes de purga do reservatório latente viral adequados para uso com a invenção incluem, mas sem limitação aos mesmos, inibidores da histona desacetilase (HDAC) e moduladores de receptores do tipo toll (por exemplo, TLR7), tais como aqueles descritos em WO2016/ 007765 e WO2016/177833, que são aqui incorporados na íntegra co- mo referência. O agente de purga do reservatório latente viral pode ser administrado antes, depois ou coadministrado com um ou mais das imunizações de preparação e ativação descritas aqui. A vacinação com uma combinação de vetores de adenovírus 26 que codificam an- tígenos Gag, Pol e Env como uma preparação, seguida de vetores de MVA que codificam tais antígenos como uma ativação, em combinação com estimulação TLR7 mostrou resultar em melhor controle virológico e ricochete viral retardado após descontinuação de terapia antirretroviral em estudos com modelo do macaco rhesus, demonstrando o potencial de vacinação terapêutica combinada com estimulação imune inata com o objetivo de cura funcional para infecção por HIV (Borducchi, E.N. et a/., 2016, Nature 540: 284-287 (doi: 10/1038/nature20583)).

[000172] Em certas modalidades da presente invenção, as imuniza- ções de preparação e de estimulação aqui descritas para induzir uma resposta imune podem ser combinadas com tratamento padrão, por exemplo, terapia antirretroviral (ART). Indivíduos tratados de acordo com as imunizações de preparação/estimulação da invenção podem também ser submetidos a ART com quaisquer fármacos antirretrovirais conhecidos no estado da técnica, tendo em vista a presente descrição.

ARTs são medicamentos que tratam HIV, embora os fármacos não ma- tem ou curem o vírus. No entanto, quando tomados em combinação eles podem impedir o crescimento do vírus. Quando o vírus é desacele- rado, então é doença de HIV. Medicamentos antirretrovirais são referi- dos como ARVs. Terapia de combinação com ARVs (cARTs) é referido como ARTs altamente ativos (HAART). Aquele versado na técnica será capaz de determinar o tratamento antirretroviral adequado, frequência de administração, dosagem dos ARTs etc., de modo a ser compatível com administração das imunizações de preparação/estimulação da invenção.

[000173] Exemplos de fármacos antirretrovirais utilizados para ARTs incluem, mas sem limitação, inibidores da transcriptase reversa nu- cleosídeo (NRTIs, cujos exemplos não limitativos incluem zidovudina, didanosina, estavudina, lamivudina, abacavir, tenofovir, combivir [com- binação de zidovudina e lamivudinal], trizivir [combinação de zidovudi- na, lamivudina e abacavir], emtricitabina, truvada [combinação de en- tricitabina e tenofovir] e epzicom [combinação de abacavir e lamivudi- na]), inibidores da transcriptase reversa não nucleosídeo (NNRTIs, cu- jos exemplos não limitativos incluem nevirapina, delavirdina, efavirenz, etravirina e rilpivirina), inibidores da protease (Pis, cujos exemplos não limitativos incluem saquinavir, indinavir, ritonavir, nelfinavir, amprena- vir, lopinavir/ritonavir, atazanavir, fosamprenavir, tipranavir, darunavir), inibidores da integrase (INSTIs, exemplos não limitativos incluindo ral- tegravir, elvitegravir e dolutegravir), e inibidores de fusão, inibidores de entrada e/ou antagonistas do receptor da quimiocina (Fls, antagonistas de CCR5; exemplos não limitativos incluindo enfuvirtida, aplaviroc, ma- raviroc, vicriviroc e cnicriviroc).

[000174] Em outras modalidades da presente invenção, indivíduos são submetidos a interrupção (também referida como descontinuação, aqui usada alternadamente) de ART após conclusão de uma imuniza-

ção de preparação/estimulação de acordo com modalidades da pre- sente invenção. Em algumas modalidades da presente invenção, os indivíduos podem ser submetidos a interrupção do tratamento antirre- troviral analítico (ARV ATI) após conclusão de uma imunização de preparação/estimulação de acordo com modalidades da presente in- venção. "Interrupção do tratamento analítico antirretroviral"” e "ARV ATI", como usados na invenção referem-se a descontinuação do tra- tamento com fármacos antirretrovirais, a fim de avaliar supressão viral e controle virêmico na ausência de ART continuado. Tipicamente, os indivíduos podem ser submetidos a ARV ATI, isto é, ART pode ser descontinuado, quando os indivíduos apresentam níveis plasmáticos de RNA de HIV menores que 50 cópias/mL durante pelo menos cerca de 52 semanas, mas um indivíduo pode todavia ser submetido a ARV ATI mesmo que tenha um ou mais ocorrências (isto é, casos) de RNA do HIV no plasma superior a 50 cópias/ml a menos de 200 cópias/ml dentro desse período, desde que a triagem imediatamente antes de ARV ATI mostre menos de 50 cópias/ml de RNA do HIV no plasma.

[000175] De acordo com modalidades da presente invenção, o ART pode ser parado cerca de 4-20 semanas após a última vacina de re- forço ser administrada. Em certas modalidades da presente invenção, para indivíduos sob ART baseado em inibidor da transcriptase reversa não nucleósido (NNRTI), um inibidor da protease potencializado pode ser administrado em vez do NNRTI durante cerca de 1-2 semanas an- tes de parar ART para reduzir o risco de desenvolver resistência a NNRTI. Também é possível administrar um ativador (por exemplo, um inibidor da histona desacetilase ou modulador de TLR7) durante a fase de ATI para ativar qualquer reservatório do HIV (por exemplo, latente) e, assim, melhorar a resposta imune.

[000176] Indivíduos submetidos a ARV ATI podem ser monitorados, por exemplo, medindo os níveis plasmáticos de RNA do HIV. Por exemplo, monitoramento após o início do ARV ATI pode ocorrer até duas vezes por semana durante as primeiras seis semanas, quando viremia ricochete é mais provável de ocorrer. "Viremia ricochete" é de- finida como níveis de plasma de ARN de HIV maior do que 1.000 có- pias/ml após ARV ATI. ART pode ser reiniciado em indivíduos com vi- remia ricochete. Preferencialmente, um indivíduo tratado de acordo com os métodos da invenção manterão controle virêmico após inter- rupção de ART. Como aqui utilizado, "manter o controle virêmico" é definido como pelo menos 24 semanas com RNA plasmático de HIV menor que 50 cópias/ml após ARV ATI. O critério de "controle virêmico mantido" é todavia considerado ser satisfeito se há um ou mais casos de RNA plasmático de HIV superiores a 50 cópias/ml a menos de

1.000 cópias/ml em duas determinações consecutivas pelo menos com uma semana de intervalo.

[000177] Tipicamente (não utilizando os métodos da presente inven- ção) indivíduos humanos infectados por HIV têm um retorno de viremia após 2-3 semanas depois de interrupção do ART. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria, acredita-se que a imunização de prepara- ção/reforço de acordo com modalidades da presente invenção entre indivíduos com HIV totalmente suprimido resultará em uma resposta imunitária mensurável e manterão o controle virêmico após ARV ATI em pelo menos certos indivíduos. Em algumas modalidades da pre- sente invenção, os indivíduos podem sofrer descontinuação do ART depois de terem sido tratados de acordo com um método da invenção. A interrupção do ART pode se dar por longos períodos de tempo (por exemplo, pelo menos 24 semanas, de preferência períodos mais lon- gos, por exemplo, pelo menos cerca de 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52 se- manas, 16 meses, 18, 20, 22, 24 meses ou até mais). Esses períodos de tempo em que a ART está parado ou descontinuado são referidos como um "férias" ou "férias de ART" ou "férias de tratamento". Em ou-

tras modalidades da presente invenção, a terapia de vacina de acordo com os métodos da invenção pode proporcionar remissão do HIV, o que significa que a supressão viral é mantida na ausência de ART.

MODALIDADES

[000178] A modalidade 1 é um vetor de poxvírus que compreende ácido nucleico que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

[000179] A modalidade 2 é um vetor de poxvírus que compreende ácido nucleico que codifica: (a) um primeiro antígeno do envelope (Env) do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; (b) um segundo antígeno Env do HIV diferente do primeiro antígeno Env do HIV; (c) um terceiro antígeno e um quarto antígeno, sendo dois antígenos Gag de HIV diferentes de; e (d) um quinto antígeno e um sexto antígeno, sendo dois an- tígenos Pol de HIV diferentes.

[000180] A modalidade 3 é o vetor de poxvírus da modalidade 2, na qual o segundo antígeno Env do HIV compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, o terceiro e quarto antígenos compre- endem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente; e o quinto e o sexto antígenos compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respec- tivamente.

[000181] A modalidade 4 é o vetor de poxvírus das modalidades da presente invenção 2 ou 3, na qual o terceiro e o quinto antígenos são fundidos em um primeiro antígeno de fusão Gag-Pol que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, e o quarto e o sexto antígenos são fundidos em um segundo antígeno de fusão Gag-Pol que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID nO: 29.

[000182] A modalidade 5 é o vetor de poxvírus de qualquer uma das modalidades da presente invenção 144, na qual o primeiro antígeno Env do HIV é codificado por SEQ ID NO: 41.

[000183] A modalidade 6 é o vetor de poxvírus de qualquer uma das modalidades da presente invenção 4-5, na qual o primeiro antígeno Env do HIV é codificado por SEQ ID NO: 41; o segundo antígeno Env do HIV é codificado por SEQ ID NO: 39; o primeiro antígeno de fusão Gag-Pol é codificado por SEQ ID NO: 38; e o segundo antígeno de fusão Gag-Pol é codificado por SEQ ID NO: 40.

[000184] A modalidade 7 é o vetor de poxvírus de qualquer uma das modalidades da presente invenção 1-6, na qual o ácido nucleico que codifica o(s) antígeno(s) está ligado operativamente a uma sequência promotora.

[000185] A modalidade 8 representa o vetor de poxvírus de qualquer uma das modalidades da presente invenção 1-7, na qual o vetor de pox- vírus é um vetor recombinante de vírus Vaccinia Ankara modificado (MVA).

[000186] A modalidade 9 é o vetor de poxvírus da modalidade da presente invenção 8, na qual o vetor MVA compreende MVA-BN ou seus derivados.

[000187] A modalidade 10 é o vetor de poxvírus da modalidade da presente invenção 8 ou 9, na qual o primeiro antígeno de fusão Gag- Pol e o segundo antígeno Env são inseridos na região intergênica (IGR) 44/45 do genoma do MVA, e o segundo antígeno de fusão Gag- Pol e o primeiro antígeno Env são inseridos em IGR 88/89 do genoma de MVA.

[000188] A modalidade 11 é o vetor de poxvírus de qualquer uma das modalidades da presente invenção 7-10, na qual o primeiro antí- geno de fusão Gag-Pol e o segundo antígenos de fusão Gag-Pol estão cada um sob o controle de um promotor Prl3.5 separado, e o primeiro antígeno Env e o segundo antígeno Env estão cada um sob controle de um promotor PrHyb separado.

[000189] A modalidade 12 é uma célula isolada que compreende o vetor de poxvírus de qualquer uma das modalidades da presente in- venção 1-11.

[000190] A modalidade 13 é uma composição que compreende um vetor de qualquer uma das modalidades da presente invenção 1-11,e um veículo.

[000191] Modalidade 14 é uma vacina que compreende uma quanti- dade imunogenicamente eficaz de um vetor de poxvírus de acordo com qualquer uma das modalidades da presente invenção 1-11, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[000192] A modalidade 15 é uma combinação de vacina que com- preende: (a) uma primeira composição de vacina que compreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de um vetor de poxvírus, de preferência um vetor MVA, de acordo com qualquer uma das modali- dades da presente invenção 1-11; e pelo menos um de (b) (1) uma segunda composição de vacina que compreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de um ou mais vetores de adenovírus, de preferência vetores de adenovírus de 26, que codificam para um ou mais antígenos do HIV, os denominados um ou mais antí- genos do HIV compreendendo preferencialmente uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-5, 18,286 29;e (b) (ii) uma terceira composição de vacina que compreende um ou mais polipeptídeos que compreendem uma quantidade imuno- genicamente eficaz de um polipeptídeo antigênico do HIV isolado que compreende opcionalmente ainda um adjuvante, de preferência fosfato de alumínio, em que a primeira composição e segunda e/ou terceira composições estão presentes na mesma composição ou em uma ou mais composições diferentes.

[000193] A modalidade 16 é a combinação de vacina de acordo com a modalidade da presente invenção 15, na qual os denominados um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados na terceira compo- sição de vacina compreende (i) um polipeptídeo que compreende os resíduos 30-708 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou (ii) um polipeptídeo que compreende os resíduos 30-724 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, ou (iii) ambos os polipeptídeos (i) e (ii).

[000194] A modalidade 17 é a combinação de vacina de qualquer uma das modalidades da presente invenção 15-16, na qual a segunda composição de vacina compreende vetores de adenovírus recombi- nantes 26 que juntamente codificam SEQ ID NOs: 1-5 e 18, de prefe- rência em que SEQ ID NOs: 1 e 3 são fundidas como SEQ ID NO: 28 e/ou SEQ ID NOs: 2 e 4 são fundidas como SEQ ID NO: 29.

[000195] A modalidade 18 é a combinação de vacina da modalidade da presente invenção 17, na qual a segunda composição de vacina compreende quatro vetores recombinantes de Ad26, o primeiro vetor Ad26 recombinante codificando a SEQ ID NO: 5; o segundo vetor Ad26 recombinante codificando SEQ ID NO: 18; o terceiro vetor re- combinante Ad26 codificando SEQ ID NOs: 1 e 3, de preferência SEQ ID NO: 28; e o quarto vetor recombinante Ad26 codificando SEQ ID NOs: 2 e 4, de preferência a SEQ ID NO: 29.

[000196] A modalidade 19 é um método de indução de uma resposta imunológica contra um vírus da imunodeficiência humana (HIV) em um indivíduo com necessidade desse tratamento, compreendendo o mé- todo administrar ao indivíduo a composição da modalidade 13, a vaci- na da modalidade 14, ou a combinação de vacina de qualquer uma das modalidades da presente invenção 15-18.

[000197] A modalidade 20 é uma composição da modalidade 13, uma vacina da modalidade 14, ou uma combinação de vacina de qual- quer uma das modalidades da presente invenção 15-18, para uso na indução de uma resposta imunológica contra um vírus da imunodefici- ência humana (HIV).

[000198] A modalidade 21 é uma composição da modalidade 13 ou uma vacina da modalidade 14, compreendendo ainda um ou mais ve- tores de expressão que codificam um ou mais antígenos adicionais do HIV, e/ou um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados.

[000199] A modalidade 22 é uma composição da modalidade 13 ou uma vacina da modalidade 14, compreendendo ainda um vetor de adenovírus, de preferência um vetor de adenovírus 26, que codifica uma proteína sintética do envelope de HIV que compreende ou consis- te da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

[000200] A modalidade 23 é uma composição ou vacina de acordo com a modalidade 22, compreende ainda um segundo vetor de ade- novírus, de preferência um vetor de adenovírus 26, que codifica um antígeno do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e opcionalmente um ou mais vetores de adenovírus adicionais, preferencialmente vetores de adenovírus 26, que codificam um ou mais antígenos adicionais do HIV que compreendem as se- quências de ácidos aminados das SEQ ID NOs: 1-4, 28 e 29, de prefe- rência as SEQ ID NOs: 28 e 29, mais preferencialmente em que as SEQ ID NOs: 28 e 29 são codificadas separadamente em um terceiro e quarto vetores de adenovírus, de preferência vetores de adenovírus

26.

[000201] A modalidade 24 é um método de produção de uma respos- ta imunitária contra um vírus da imunodeficiência humana (HIV) em um indivíduo que necessite desse trtatamento, compreendendo o método administrar ao indivíduo uma composição ou vacina ou combinação de vacina de acordo com qualquer uma das modalidades da presente in- venção 13-23.

[000202] A modalidade 25 é um método de produção de uma com- posição ou uma combinação de vacina, compreendendo combinar o vetor de poxvírus de qualquer uma das modalidades da presente in- venção 1-11 com um veículo e opcionalmente um ou mais vetores adi- cionais que codificam um ou mais antígenos de HIV e/ou um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados, em uma ou mais composi- ções, juntamente com um veículo.

[000203] A modalidade 26 é um método de indução de uma resposta imunitária contra um vírus da imunodeficiência humana (HIV) em um indivíduo com necessidade desse tratamento, compreendendo o mé- todo administrar ao indivíduo: (i) uma primeira vacina que compreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de um ou mais vetores de adenovírus re- combinantes, de preferência vetores de Ad26, que codificam um ou mais antígenos do HIV que compreendem uma sequência de aminoá- cidos de qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 1-5, 18, 28 e 29, e um veículo; (ii) uma segunda vacina que compreende um vetor de pox- vírus de acordo com qualquer uma das modalidades da presente in- venção 1-11, e um veículo; e (ili) opcionalmente, uma terceira vacina que compreende um ou mais polipeptídeos que compreendem uma quantidade imuno- genicamente eficaz de polipeptídeos antigênicos de HIV isolados e um veículo, e opcionalmente compreendendo ainda um adjuvante, de pre- ferência fosfato de alumínio, em que as etapas (i) e (ii) são realizadas em qualquer ordem, com uma das etapas para a primeira imunização e a outra etapa para aumentar a imunização, e em que a terceira vaci- na opcional é administrada juntamente com a primeira composição ou a segunda composição para a imunização de preparação e/ou de re- forço.

[000204] A modalidade 27 é um método de acordo com a modalida- de da presente invenção 26, no qual a terceira composição é adminis- trada aproximadamente ao mesmo tempo que a composição usada para a vacina de reforço.

[000205] A modalidade 28 é um método de acordo com a modalida- de da presente invenção 26 ou 27, no qual os denominados um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados compreendem (i) um polipeptídeo que compreende os resíduos 30-708 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; ou (ii) um polipeptídeo que compreen- de os resíduos 30-724 de SEQ ID NO: 36; ou (iii) ambos os polipeptí- deos (i) e (li), e no qual os denominados um ou mais polipeptídeos an- tigênicos do HIV isolados estão na mesma composição da vacina de reforço e/ou da vacina de preparação ou em uma composição separa- da da vacina de reforço e/ou da vacina de preparação.

[000206] A modalidade 29 é um método de acordo com qualquer uma das modalidades da presente invenção 26-28, no qual (i) a pri- meira vacina compreende um vetor de adenovírus, de preferência um vetor de adenovírus 26, que codifica uma proteína sintética do envelo- pe do HIV que compreende a sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 18, e um segundo vetor de adenovírus, de preferência um vetor de adenovírus 26, que codifica um antígeno de HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e opcionalmente um ou mais vetores de expressão adicionais, de preferência vetores de ade- novírus, mais preferencialmente vetores de adenovírus 26, que codifi- cam um ou mais antígenos adicionais do HIV; (ii) a segunda vacina compreende um vetor de poxvírus, de preferência um vetor de MVA, que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e preferivelmen-

te que codifica ainda antígenos do HIV que compreendem uma ou mais das sequências de ácidos aminados das SEQ ID NOs: 1-5, 28 e 29; e (iii) a terceira vacina compreende um polipeptídeo antigênico do HIV isolado que possui os resíduos 30-708 da sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 7, ou os resíduos 30-724 de SEQ ID NO: 36; em que a primeira vacina é administrada ao indivíduo uma ou mais vezes para primeira imunização, a segunda vacina é administrada ao indiví- duo uma ou mais vezes para aumentar a imunização, e a terceira va- cina é administrada ao indivíduo em conjunto com a segunda vacina uma ou mais vezes para a imunização de reforço.

[000207] A modalidade 30 é um método de acordo com a modalida- de da presente invenção 29, no qual a primeira vacina compreende um ou mais vetores de adenovírus 26 adicionais que codificam um ou mais antígenos do HIV que compreendem as sequências de ácidos aminados das SEQ ID NOs: 1-4, 28 e 29, de preferência as SEQ ID NOs: 28 e 29.

[000208] A modalidade 31 é um método de acordo com a modalida- de da presente invenção 30, no qual a primeira vacina compreende um terceiro vetor de adenovírus que codifica a SEQ ID NO: 28 e um quar- to vetor de adenovírus que codifica a SEQ ID NO: 29.

[000209] A modalidade 32 é uma combinação de vacina que com- preende os seguintes componentes: (i) um vetor de Ad26 que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; (ii) um vetor de Ad26 que codifica uma proteína do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; (iii) um vetor de Ad26 que codifica uma proteína de fusão Gag-Pol do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28;

(iv) um vetor de Ad26 que codifica uma proteína de fusão Gag-Pol do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, e (v) um vetor de MVA que codifica uma primeira proteína do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, uma segunda proteína do envelope do HIV que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma primeira proteína de fusão Gag-Pol que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 28 e uma segunda proteína de fusão Gag-Pol que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

[000210] A modalidade 33 é uma combinação de vacina de acordo com a modalidade da presente invenção 32, compreendendo ainda o seguinte componente: (vi) (vi, a): polipeptídeo antigênico do HIV isolado que pos- sui os resíduos 30-708 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou (vi, b): resíduos 30-724 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 36, ou (vi, c): ambos (vi, a) e (vi, b), em que (vi, a), (vi, b) ou (vi, c) opcionalmente compreendem ainda um adjuvante.

[000211] A modalidade 34 é um método de indução de uma resposta imunitária contra um vírus da imunodeficiência humana (HIV) em um indivíduo humano necessitado desse tratamento, compreendendo o método: (a) administrar ao indivíduo: (i) um vetor rAd26 que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; (ii) um vetor de rAd26 que co- difica um antígeno que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; (iii) um vetor de rAd26 que codifica um antígeno que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; e (iv) um vetor de rAd26 que codifica um antígeno que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; de preferência em que os vetores de rAd26 são administrados em uma proporção de cerca de 1:1:1:1, sob uma dose total de cerca de 1-10x10º partículas virais (vp), por exemplo, 5x10*º vp; (b) opcionalmente, repetir o passo (a); (c) administrar ao indivíduo: (i) um vetor de MVA ou MVA- BN que compreende ácido nucleico que codifica (i, a) uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 18; (i, b) um antígeno Env do HIV que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; (i, c) um antígeno de fusão Gag-Pol de HIV que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 28; (i, d) um antígeno de fusão Gag-Pol de HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; pre- ferencialmente, em que o MVA é administrado sob uma dose de 10º a 10" ufp, por exemplo, sob uma dose de 107 ufp, 10º ufp, 10º ufp ou 10º ufp, ou sob uma dose de 10º a 10º!º TCIDs5o, por exemplo, entre 107 e 10º TCID50; e (d) opcionalmente, repetir o passo (c).

[000212] A modalidade 35 é um método de indução de uma resposta imunológica contra um vírus da imunodeficiência humana (HIV) em um indivíduo humano necessitado desse tratamento, compreendendo o método: (a) administrar ao indivíduo: (i) um vetor MVA ou MVA-BN que compreende ácido nucleico que codifica (i, a) uma proteína sintéti- ca do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; (i, b) um antígeno Env do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; (li, c) um antígeno de fusão Gag-Pol de HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (i, d) um antígeno de fusão Gag-Pol de HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; de prefe-

rência em que o MVA é administrado sob uma dose de 10º a 10 ufp, por exemplo, sob uma dose de 107 ufp, 10º ufp, 10º ufp ou 10º ufp, ou sob uma dose de 10º a 10º TCIDso, por exemplo, entre 107 e 10º TCIDso; (b) opcionalmente, repetir o passo (a); (c) administrar ao indivíduo: (i) um vetor de MVA ou MVA- BN que compreende ácido nucleico que codifica (i, a) uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 18; (i, b) um antígeno Env do HIV que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; (i, c) um antígeno de fusão Gag-Pol de HIV que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 28; (i, d) um antígeno de fusão Gag-Pol de HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; de preferência em que o MVA é administrado sob uma dose de 10º a 10"! ufp, por exemplo, sob uma dose de 107 ufp, 10º ufp, 10º ufp ou 10º ufp, ou sob uma dose de 10º a 10*º TCIDso, por exemplo, entre 10º e 10º TCID5o ; e opcionalmente um ou mais de (ii, a) proteína gp140 de HIV isolado que possui a sequência de aminoácidos 30-708 de SEQ ID NO: 7; (ii, b), proteína gp140 do HIV isolada que tem a sequência de aminoácidos 30-724 de SEQ ID NO: 36; e (iii) adjuvante de fosfato de alumínio; em que opcionalmente as proteínas gp140 do HIV isola- das são administradas em uma proporção de cerca de 1:1, sob uma dose total de cerca de 50-300 microgramas, por exemplo, 250 micro- gramas; e (d) opcionalmente, repetir o passo (c).

[000213] A modalidade 36 é um método de indução de uma resposta imunitária contra HIV em um indivíduo humano necessitado desse tra- tamento, compreendendo o método: (a) administrar ao indivuo um vetor MVA ou MVA-BN que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 29, em que o vetor MVA ou MVA-BN é adminis- trado sob uma dose de 10º a 10"' ufp, por exemplo, sob uma dose de 107 ufp, 10º ufp, 10º ufp ou 10º ufp, por exemplo, sob uma dose de 2 x 107 a 5x 10º ufp, por exemplo, sob uma dose de cerca de 1x10º ufp, ou sob uma dose de 10º a 10º TCID5o, por exemplo, entre 107 e 10º TCIDso, (b) opcionalmente, repetir o passo (a); (c) administrar ao indivíduo: (1) um vetor rAd26 que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; (ii) um vetor rAd26 que codifica um antígeno que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; (iii) um vetor rAd26 que codifica um antígeno que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (iv) um vetor rAd26 que codifica um antígeno que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; e facultativamente um ou mais de: (v, a) proteína go 140 de HIV isolada que possui a sequência de aminoácidos 30-708 de SEQ ID NO: 7; (v, b), proteína gp 140 do HIV isolada que tem a sequência de aminoácidos 30-724 de SEQ ID NO: 36; (v, c) tanto (v, a) quanto (v, b) e (v, d) adjuvante de fosfato de alumínio; de preferência em que os vetores rAd26 são administrados em uma proporção de cerca de 1:1:1:1, sob uma dose total de cerca de 1-10x10º partículas virais (vp), por exemplo, 5x10"º vp, e em que opcionalmente as proteínas gp140 de HIV isoladas gp são administrados em uma proporção de cerca de 1:1, sob uma dose total de cerca de 50-300 microgramas, por exemplo, 250 microgramas; e (d) opcionalmente, repetir o passo (c).

[000214] A modalidade 37 é um método de indução de uma resposta imunitária contra HIV em um indivíduo humano com necessidade des- se tratamento, compreendendo o método: (a) administrar ao indivíduo: (i) um vetor rAd26 que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; (ii) um vetor rAd26 que codifica um antígeno que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; (iii) um vetor rAd26 que codifica um antígeno que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; e (iv) um vetor rAd26 que codifica um antígeno que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 29; de preferência em que os vetores rAd26 são administrados em uma proporção de cerca de 1:1:1:1, sob uma dose total de cerca de 1-10x10º partículas virais (vp), por exemplo, 5x10º VP;

(b) opcionalmente, repetir o passo (a);

(c) administrar ao indivíduo de (i) um vetor de MVA ou MVA-BN que codifica uma proteína sintética do envelope do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 28 e SEQ ID nO: 29, em que preferencialmente o vetor MVA ou MVA-BN é administrado sob uma dose de 10º a 10"! ufp, por exemplo, sob uma dose de 10” ufp, 10º ufp, 10º ufp ou 10º ufp por exemplo, sob uma dose de 2 x 10º a 5 x 10º ufp, por exemplo, sob uma dose de cerca de 1x10º ufp, ou sob uma dose de 10º a 10º TCIDso, por exemplo, entre 10” e 10º TCIDs5o; e (ii, a) proteína go 140 de HIV isolado que tem a sequência de aminoácidos 30-708 de SEQ ID NO: 7; ou (ii, b) proteína gp140 do HIV isolada que tem a sequência de aminoácidos 30-724 de SEQ ID NO: 36; ou (il, c) duas proteínas gp140 de HIV isoladas, em que uma primeira proteína gp140 de HIV isolada tem a sequência de aminoácidos 30-708 de SEQ ID NO: 7 e uma segunda proteína gp140 de HIV isolada tem a sequência de ami- noácidos 30-724 de SEQ ID NO: 36, de preferência em que essas pro- teínas são administradas em uma proporção de cerca de 1:1; e (iii) ad- juvante de fosfato de alumínio; de preferência em que a proteína gp140 de HIV isolada ou as proteínas gp140 de HIV isoladas são ad-

ministradas sob uma dose total de cerca de 50-300 microgramas, por exemplo, 250 microgramas; e (D) opcionalmente, repetir o passo (c).

[000215] A modalidade 38 é o método de qualquer uma das modali- dades da presente invenção 26-31 ou 34-37, no qual o indivíduo foi infectado com HIV antes da primeira etapa de administração de um vetor ou componente de vacina.

[000216] A modalidade 39 é o método de qualquer uma das modali- dades da presente invenção 26-31 ou 34-38, compreendendo ainda administrar ao indivíduo um agente de purga do reservatório viral la- tente.

[000217] A modalidade 40 é o método da modalidade 39 da presente invenção, em que o agente de purga do reservatório viral latente é um modulador de TLR7.

[000218] A modalidade 41 é o método de qualquer uma das modali- dades da presente invenção 26-31 ou 34-40, em que o indivíduo é ainda submetido a terapia antirretroviral (ART).

[000219] A modalidade 42 é o método da modalidade 41 da presente invenção, em que o indivíduo sofre interrupção da ART após a conclu- são de um imunização de preparação/reforço.

[000220] A modalidade 43 é o método da modalidade 42 da presente invenção, em que a interrupção de ART é iniciada após a conclusão de uma imunização de preparação com Ad26 e imunização de reforço com MVA, opcionalmente em que a imunização de reforço com MVA é administrada juntamente com uma ou mais proteínas gp140 Env do HIV isoladas.

[000221] A modalidade 44 é uma composição de qualquer uma das modalidades da presente invenção 13 ou 21-23, uma combinação de vacina de qualquer uma das modalidades da presente invenção 14 ou 21-23, ou uma combinação de vacina de qualquer uma das modalida- des da presente invenção 15-18 ou 32-33, para uso no tratamento e/ou prevenção de uma infecção e/ou doença pelo vírus da imunodefi- ciência humana (HIV).

[000222] A modalidade 45 é uma composição de qualquer uma das modalidades da presente invenção 13 ou 21-23, uma vacina de qual- quer uma das modalidades da presente invenção 14 ou 21-23, ou uma combinação de vacina de qualquer uma das modalidades da presente invenção 15-18 ou 32-33, para uso na produção de um medicamento para tratamento e/ou prevenção de uma infecção e/ou doença pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV).

[000223] A modalidade 46 é o uso de uma composição de qualquer uma das modalidades da presente invenção 13 ou 21-23, uma vacina de qualquer uma das modalidades da presente invenção 14 ou 21-23, ou uma combinação de vacina de qualquer uma das modalidades da presente invenção 15-18 ou 32-33, para a produção de um medica- mento para tratamento e/ou prevenção de uma infecção e/ou doença pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV).

EXEMPLOS Exemplo 1: Concepção de sequências de antígenos do envelope do

HIV

[000224] Várias sequências de antígenos do envelope do HIV foram concebidas com similaridade de sequências com o mosaico mos2Env do antígeno do HIV (SEQ ID NO: 6; anteriormente também descrito no documento WO 2010/059732). As novas sequências concebidas liga- das a membrana foram baseadas em (uma combinação de) sequên- cias totalmente naturais do tipo selvagem a partir de proteínas do en- velope do HIV, ou uma quimera da sequência mos2Env e sequências da proteína do envelope do HIV do tipo selvagem. Além das sequên- cias de proteína de comprimento completo do envelope (ver FIG. 1A), sequências que apresentam truncamentos no C-terminal do domínio citoplasmático também foram concebidas (ver, por exemplo, FIG. 1C).

Ver também, por exemplo, Schiernle et a/., PNAS, 1997; Abrahamyan et al., J Virol 2005; Edwards et al., / Virology, 2002, 76: 2683-2691. Va- riantes solúveis também foram preparadas por truncamento do C- terminal antes da região transmembranar (TM), que foi substituída por um domínio de trimerização, tal como um domínio de trimerização GCNA4 (ver, por exemplo, FIG. 1B). Essas variantes solúveis foram de- pois convertidas em uma única variante de cadeia simples por muta- ção do sítio de clivagem da furina, inibindo assim o processamento do domínio extracelular da proteína do envelope em subunidades gp120 e gp41.

[000225] De todos os construtos gerados e testados, construtos ba- seados em C4 tinham o maior número de propriedades ótimas, por exemplo, boa capacidade de produção, enovelamento, imunogenici- dade etc., e estes foram selecionados para estudos posteriores. Uma variante solúvel do construto C4 possuindo um domínio de trimeriza- ção GCN4 no lugar do domínio transmembranar (sC4, FIG. 18) e uma variante compreendendo um fragmento de 7 aminoácidos do domínio citoplasmático (C4D7, FIG. 1C) foi também gerada e testada em estu- dos posteriores. As sequências de aminoácidos de C4, sC4 e C4D7 são mostradas em SEQ ID NOs: 17, 19 e 18, respectivamente. As se- quências que codificam estes são apresentadas em SEQ ID NOs: 25, 27 e 26, respectivamente. O construto C1 tem uma sequência de do- mínio extracelular baseada na sequência mos2Env (SEQ ID NO: 6). Uma variante solúvel do construto C1 que possui um domínio de trime- rização GCN4 em lugar do domínio transmembranar (sC1) e uma vari- ante que compreende um fragmento de 7 aminoácidos do domínio ci- toplasmático (C1D7), semelhante a sSC4 e C4D7 como mostrado nas FIGS. 1B e 1C, respectivamente, também foram geradas. Construto C1 e suas variantes foram usados em estudos posteriores para fins de comparação, uma vez que estes são essencialmente baseados na se-

quência mos2Env do estado da técnica. As sequências de aminoáci- dos de C1, sSC1 e C1D7 são mostradas em SEQ ID NOs: 31, 30 e 32, respectivamente. As sequências de ácidos nucleicos que codificam estes são mostradas em SEQ ID NOs: 34, 33 e 35, respectivamente. Outros construtos que foram testadas foram menos ótimos do que aqueles que se baseiam no construto C4, e não foram levados a de- senvolvimento posterior. Exemplo 2: Expressão e enovelamento de proteínas sintéticas do en- velope do HIV

[000226] O nível de expressão, enovelamento e expressão na super- fície celular de proteínas sintéticos do envelope do HIV foi medido. Níveis de Expressão

[000227] Células HEK293F foram transfectadas transitoriamente com um plasmídeo que codifica as proteínas sintéticas solúveis do envelo- pe do HIV sC1 e sC4 como descrito no Exemplo 1. Os níveis de ex- pressão da proteína solúvel foram medidos no sobrenadante utilizando Western blot quantitativo (QWB). Os resultados são mostrados na FIG.

2. Os baixos níveis de expressão para sC1 (o que corresponde essen- cialmente a mos2Env com um domínio transmembranar adicionado) estão em linha com nossas recentes compreensões em relação a mos2Env. Como demonstrado pelos resultados, a variante sC4 da in- venção mostrou níveis de expressão significativamente mais elevados do que a variante sSC1 (controle). Enovelamento de Proteínas

[000228] Enovelamento de proteína foi testado medindo a ligação de proteínas sintéticas solúveis do envelope do HIV com um anticorpo (MAb 17b) que se sabe ligar-se ao sítio de ligação do correceptor da proteína do envelope do HIV, que é exposta apenas depois da ligação com CDA, por ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Em particular, ligação com sC4 purificada foi testada em relação a ligação com MAb 17b com ligação prévia de SC4 com CDA4, e sem ligação prévia de SC4 com CDA4. sC1 purificada foi usada como controle. Liga- ção de MAb 17b com sC4 sem ligação prévia de CD4 com a proteína do envelope é uma indicação de proteína de envelope parcialmente desenovelada ou pré-desencadeada (isto é, um Env instável que adota a conformação "aberta" na ausência de ligação com CD4). Os resulta- dos do ensaio ELISA são mostrados nas FIGS. 3 A e 3B.

[000229] Como mostrado na FIG. 3B, sC4 apresenta forte ligação com MAb 17b com ligação prévia com CDA4, mas nenhuma ligação de- tectável com MAb 17b sem ligação prévia com CD4. Em contraste, como mostrado na FIG. 3A, sC1 apresentou ligação muito menor com MAb 17, tanto com quanto sem ligação prévia com CDA4. Os resultados sugerem que sC4 tem um padrão de enovelamento correto, sem ex- posição do sítio de ligação do correceptor antes da ligação com CDA4.

[000230] Enovelamento de proteínas foi também analisado por ele- troforese nativa em gel de poliacrilamida (PAGE) de sC1 e sC4 para avaliar a estrutura quaternária das variantes de proteínas solúveis, e possível formação incorreta de pontes de dissulfeto entre protômeros. Após eletroforese em um gel nativo, proteína no gel foi detectada por análise de Western blot. Como mostrado pelos resultados na FIG. 4, a maioria das sC4 está presente em um estado trimérico, que é a estru- tura quaternária correta.

[000231] Em conjunto, os resultados dos experimentos de enovela- mento de proteínas demonstram que a proteína sintética solúvel sC4 do envelope do HIV tem o perfil de enovelamento desejado, o qual é melhorado em comparação com o perfil de enovelamento do antígeno mos2Env existente (representado por sC1). Expressão na superfície celular

[000232] Também foi estudada expressão na superfície celular das variantes ligadas a membrana de proteínas C1 do envelope do HIV

(comprimento total), C4 (comprimento total, ver a FIG. 1A), C1D7 e C4D7. Células HEK293T foram transitoriamente transfectadas com apenas plasmídeo que codifica eEGFP (controle negativo, NC), ou com plasmídeo que codifica eEGFP juntamente com um construto de ex- pressão que codifica uma variante da proteína do envelope do HIV. Dois dias após a transfecção, as células foram submetidas a análise de classificação por fluorescência de células ativadas (FACS) após exposição a vários anticorpos poli e monoclionais dirigidos contra gp120, e anticorpos secundários, e em seguida examinadas quanto a aos níveis de expressão da proteína do envelope na superfície celular. Qualidade das variantes do envelope foi avaliada por determinação dos níveis de expressão total utilizando um anticorpo policlonal anti- gp120 e avaliando a ligação relativa dos anticorpos PG9 e PG16 am- plamente neutralizantes, que são dependentes da estrutura quaterná- rio e preferencialmente ligam-se a trímero do envelope enovelado cor- retamente.

[000233] Os resultados das experiências de expressão na superfície celular são mostrados na FIG. 5. Os níveis de expressão na superfície de variantes C1D7 e C4D7 truncadas como medidos utilizando um an- ticorpo anti-gp120 são muito mais elevados do que os níveis de seus homólogos de comprimento total, C1 e C4, respectivamente. Isso con- firma que a supressão de 144 resíduos do término carbóxi de Env au- menta os níveis de expressão na superfície do envelope. O construto de comprimento completo C4 da invenção também mostrou melhor ligação de PG9 e PG16 em comparação com C1 de comprimento total, sugerindo que a sequência do envelope de C4 é enovelada correta- mente dobrado (isto é, um trímero) na superfície da célula.

[000234] Os resultados também demonstram que a variante C1D7, que é essencialmente Mos2Env com um domínio transmembranar adi- cionado e sete aminoácidos do domínio citoplasmático, pode ser ex-

pressa na superfície em células HEK293T. Isso está em contraste com o construto solúvel em Ad26.mos2Env, que não pode ser expresso em níveis detectáveis na superfície quando transfectado em células A549. No entanto, a ligação relativa com PG9 e PG16 é dificilmente detectá- vel acima da base, o que sugere que a sequência do envelope C1D7 é mal enovelada e não está provavelmente presente como um trímero intacto na superfície celular.

[000235] Em geral, a variante do envelope C4D7 tem o perfil de liga- ção com anticorpos mais ótimo, com maior expressão de gp120 do que sua contraparte C4 de comprimento completo, e com aumento su- perior a 15 vezes da ligação de PG9 e PG16 em comparação com C1 e C1D7 (Fig. 5). Exemplo 3: Estabilidade de vetores que codificam sequências do en- velope do HIV

[000236] Trabalho anterior em nossos laboratórios (não publicado) in- dicou que vetores de adenovírus 26 (Ad26) que codificam a sequência do antígeno mos2Env mostraram razões VP/IU relativamente altas (indican- do menor qualidade de lotes de produtos de adenovírus) e, além disso, que esses vetores apresentaram problemas de estabilidade. Desse modo, foi importante testar a estabilidade dos construtos de proteínas sintéticas do envelope do HIV da invenção em um contexto de adeno- vírus.

[000237] Vetores recombinantes Ad26 (rAd26) que codificam se- quências de antígenos de HIV da invenção C4, C4D7 e sC4 como descrito acima no Exemplo 1 foram obtidos em células PER.C6 células (referidas como "rAd26.C4", "rAd26.C4D7" e "rAd26.sC4", respectiva- mente). Clones de vetores (placas) foram colhidos e aumentados para a geração de lotes de investigação. Um máximo de cinco clones virais (placas) foi aumentado até o formato de T25 e passados em série por passagens em formato T25 (as passagens 1-3 sendo as etapas de transfecção e de purificação de placas, seguidas de 10 passagens em formato T25, resultando em um total de 13 passagens). A estabilidade genética foi avaliada pelo número de passagens virais (vpn) 3, 5, 10 e 13 mediante um ensaio de PCR em cassete de transgene E1, seguido de sequenciamento sob vpn 13. Os resultados são mostrados na FIG.

6.

[000238] Os vetores rAd26 que codificam C4 de comprimento com- pleto (rAd26.C4) mostraram características de crescimento pobres, como determinado por qualquer efeito citopatogênico completo (CPE) em 2-3 dias; instabilidade genética, como determinada por supressões da região de cassete do transgene E1; ou uma combinação dos mes- mos (FIG. 6). Devido às baixas características de crescimento e insta- bilidade genética observada, esse vetor codifica que codifica C4 de comprimento completo não foi aprofundado.

[000239] Em contraste, para os vetores rAd26 que codificam C4D7 (rAd26.C4D7) e sC4 (rAd26.sC4), todas as placas propagadas perma- neceram geneticamente estáveis durante o curso do experimento (FIG. 6). Desse modo, os novos construtos de sC4 e C4D7 superam o construto de mos2Env original com relação a estabilidade com base em um vetor adenoviral. A estabilidade genética que testa até von 13 representa várias passagens de propagação além daquela usada na preparação dos vetores em escala industrial. Exemplo 4: Expressão e antigenicidade in vivo de sequências do enve- lope do HIV em vetores de adenovírus

[000240] Expressão e antigenicidade de rAd26.C4D7 e rAd26.sC4 foram avaliadas separadamente ou em combinação com um vetor Ad26 recombinante que codifica mos1Env (SEQ ID NO: 5) (daqui em diante "rAd26.mos1Env") em células A549 transduzidas por vetor (linhagem de células humanas) in vitro (dados não mostrados). Análise de citometria de fluxo demonstrou que todos os antígenos foram expressos em cultu-

ras de células transduzidas com com 2x10º partículas virais (vp) dos antígenos simples do envelope como controle, ou com 1x10º vp dos dois antígenos Env combinados por transdução de adenovírus. Todas as transduções continham ainda doses únicas (1x10º vp) de vetores de adenovírus que codificam mos1GagPol (“rAd26.mos1GagPol") e mos2GagPol (“rAd26.mos2GagPol") (Barouch et al., Nat Med 2010, 16: 319-323), de modo que as combinações de vetores avaliadas apresentaram as mesmas proporções relativas dos diferentes vetores adenovirais como pretendido para uso pré-clínico e clínico. De prefe- rência, os vetores que codificam proteínas sintéticas do envelope do HIV da invenção são combinados com vetores que codificam os antí- genos mos1GagPo!l e os antígenos mos2GagPol para uso clínico.

[000241] A combinação de rAd26.mos1Env e rAd26.C4D7 produziu uma cobertura máxima dos epítopos avaliados como determinado por ligação com o anticorpo monoclional.

[000242] Particularmente, a exposição do epítopo PG16, que foi con- tribuído por transformação com Ad26.C4D7, é promissor para uso co- mo vacina, uma vez que PG16 representa um anticorpo monocional amplamente neutralizante que reconhece a região de loop V1/V2 de Env do HIV-1 (Walker et al., Science 326: 258-9, 2009). Assim, a pro- teína sintética do envelope do HIV da invenção derivada da sequência de C4 aumenta a amplitude da resposta imunitária contra a proteína de envelope do HIV, em comparação com a resposta imune gerada por mos1Env apenas. Respostas de anticorpos induzidas por vacina dirigidas à região da proteína do envelope mostraram correlacionar-se com proteção contra infecção por HIV-1 no estudo de RV144 (Haynes et al., N Engl J Med. 336: 1275-1286, 2012), e, assim, a proteína sinté- tica do envelope do HIV da invenção é uma candidata promissora a incluir em regimes de vacina contra o HIV. Exemplo 5: Imunogenicidade de vetores que codificam proteínas sinté-

ticas do envelope do HIV

[000243] As sequências de proteína sintética do envelope do HIV da invenção com base em vetores de Ad26 foram testadas em coelhos para determinar se esses construtos eram uma alternativa imunogêni- ca para o construto rAd26.mos2Env.

[000244] A imunogenicidade do vetor de adenovírus que codifica mos1Env (rAd26.mos lEnv; SEQ ID NO: 5) foi testada isoladamente e em combinação com vetores de adenovírus que codificam proteínas sintéticas do envelope do HIV da invenção (rAd26.C4D7 e rAd26.sC4, compreendendo SEQ ID NO: 8, em particular SEQ ID NOs: 18 e 19, respectivamente). Em todos os casos, vetores de adenovírus 26 que codificam os antígenos mos 1GagPol e mos2GagPol (rAd26.mos1GagPol [SEQ ID NO: 28] e rAd26.mos2GagPol [SEQ ID NO: 29], respectivamen- te) foram também administrados. Mais especificamente, a imunogenici- dade de rAd26.mos1Env sozinho (vacina trivalente: rAd26.mos1GagPol, rAd26.mos2GagPol e rAd26.mos1Env) foi comparada com a imunoge- nicidade de rAd26.mos1Env em combinação com um de rAd26.C4D7 ou rAd26.sC4 (vacina tetravalente: administração de rAd26.mos1GagPol, rAd26.mos2GagPol, rAd26.mos1Env e rAd26.C4D7; ou administração de rAd26.mos1GagPol, rAd26.mos2GagPol, rAd26.mos1Env e rAd26.sC4). Essa comparação da vacina trivalente, que carece de quaisquer veto- res que codificam as proteínas sintéticos do envelope do HIV da in- venção, com a vacina tetravalente, que contém os vetores que codifi- cam as proteínas sintéticas do envelope do HIV da invenção, permite uma determinação de se as proteínas do envelope do HIV da invenção contribuem para a amplitude de protecção.

[000245] A administração foi realizada em regimes de vacinação, em que esses vetores de Ad26 foram administrados nas semanas O e 6º como uma preparação dupla, e uma proteína gp140 clado C (uma prote- ína trivalente Env gp140 que possui SEQ ID NO: 7 sem a sequência dos peptídeos de sinalização resíduos 1-29, ver também WO 2010/ 042942) nas semanas 12º e 18º, como um reforço duplo (ver, por exemplo, Barouch et al., 2015, Science 349: 320-324). A Tabela 1 descreve os regimes de vacina usados para o presente estudo. rAd26 .Vazio refere-se a um vetor de controle sem qualquer gene que codifica uma sequência de uma proteína antigênica do HIV.

Cada gru- po continha seis coelhos.

ie) o o 2 2 =2 > o o o = o o 6 o a a a Q o o o o = fe) o o E q <c cn Cc o Ss o o x E S 2 2 23 3 = DB BD ie) 2 < < < s e |=

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É

[000246] A comparação da vacina trivalente Ad26 (faltando os novos antígenos Env da invenção) com a vacina tetravalente Ad26 (que compreende os novos antígenos Env de sC4 ou C4D7) permite testar se os novos antígenos da presente invenção contribuem para a ampli- tude de protecção. Um ensaio estabelecido de neutralização baseado em células TZM-bl [Montefiori, D.C. Methods Mol Biol 2009, 485: 395- 405; Sarzotti-Kelsoe M. et al., / Immunol Methods 2014, 409: 131-146] foi usado para medir a atividade de neutralização dos candidatos a va- cina.

[000247] Os resultados são mostrados na FIG. 7 e foram analisados estatisticamente usando a vacina trivalente (grupo 1 na Tabela 1) co- mo grupo de controle e comparando com cada uma das novas vacinas tetravalentes (grupos 2 e 3 na Tabela 1).

[000248] Em geral, os novos construtos de adenovírus (ou seja, que codificam proteínas de Env que compreendem SEQ ID NO: 8, sendo uma alternativa para mos2Env) derivados de C4 revelaram-se imuno- gênicos após duas imunizações intramusculares homólogas em coe- lhos.

[000249] A capacidade de neutralização de soros imunes de coelho contra pseudovíruses Nível 1B estava ausente (dados não mostrados), o que não é inesperado, uma vez que era sabido que tais vírus são mais difíceis de neutralizar.

[000250] Capacidade de neutralização de pseudovírus de soros imu- nes de coelho contra um vírus Nível 1A clado B não foi afetada pela adição de novos componentes (dados não mostrados). Isso demonstra que o antígeno de novo não interfere negativamente na imunogeni- cidade do antígeno clado B existente presente na vacina (embora os novos componentes fossem dirigidos para clado C, tal interferência indesejável não poderia ser excluída, a priori, antes de terem sido tes- tados).

[000251] Capacidade de neutralização de pseudovírus de soros imu- nes de coelho contra um vírus de Nível 1A clado C foi significativamen- te aumentada no novo C4D7 quadrivalente contendo adenovírus (qua- drivalente, grupo 2), em comparação com imunização trivalente (tendo apenas mos1Env) sozinha (grupo 1) (Fig 7, painel B). Além disso, a capacidade de neutralização de pseudovírus de soros imunes de coe- lho contra um vírus de Nível 1A clado C na 8º semana foi significati- vamente aumentada na nova sC4 tetravalente contendo adenovírus (quadrivalente, grupo 3), em comparação com imunização trivalente (tendo apenas mos1Env) sozinha (grupo 1 ) (Figura 7, painel B).

[000252] Em conclusão, os construtos C4D7 e sC4 codificados em Ad26 foram imunogênicos e sua adição expandiu a capacidade ligação e neutralização de uma vacina que tem mos1Env (principalmente cla- do B) como único componente Env codificado por Ad26, no sentido de cepas clado C (Fig 7B).

Exemplo 6: Imunogenicidade dos regimes de vacina que incluem veto- res que codificam proteínas sintéticas do envelope do HIV da invenção

[000253] Um estudo adicional em coelhos avaliou a combinação de vetores tetravalentes Ad26.Mos4.HIV (que consiste de quatro vetores adenovirais: Ad26.Mos1GagPol [que codifica SEQ ID NO: 28], Ad26.Mos2GagPol [que codifica SEQ ID NO: 29], Ad26 Mos1Env [que codifica SEQ ID NO: 5] e Ad26. Mos2SEnv [o nome "C4D7" como utili- zado acima é também referido como "Mos2S"; esse vetor codifica a nova SEQ ID nO: 18 de acordo com a invenção], em um mistura 1:1:1:1 com uma dose total de 5x10º vp) aplicados por via intramuscu- lar como imunizações de preparação duplas na semana O e 6º, em combinação com reforços da proteína Env recombinante do HIV-1 usando gp140 clado C [possuindo a sequência de resíduos de amino- ácidos 30-708 de SEQ ID NO: 7], gp140 do mosaico [possuindo a se- quência de resíduos de aminoácidos 30-724 de SEQ ID NO: 36], ou uma combinação de gp140 clado C e gp140 do mosaico, nas semanas 13º e 19º. Esses reforços de proteína foram aplicados por via intra- muscular com uma dose total de 10 ou 50 microgramas de proteína combinada com 250 microgramas de adjuvante fosfato de alumínio formulado no dia da imunização.

[000254] Os resultados indicam que todos os regimes testados foram imunogênicos em todos os animais, induzindo títulos elevados de anti- corpos e atividade de neutralização moderada contra vírus pseudoti- pados de Env Nível 1A. Se Mosaico gp140 foi usado como antígeno de vacina, isoladamente ou em combinação com gp140 clado C, títu- los de ELISA específicos ao Mosaico gp140 e reconhecimento do pseudovírus clado B foram significativamente aumentados na 15º se- mana em comparação com o grupo de referência potencializado com gp140 clado C sozinho. A dimensão do efeito global da melhoria foi moderada, e maior para o grupo reforçado com a combinação gp140 clado C bivalente - Mosaico gp140 em comparação com Mosaico gp140 sozinho. Na 21º semana do estudo, essas diferenças foram perdidas e respostas imunes medidas para os grupos que receberam os reforços gp140 clado C bivalente - Mosaico gp140 ou os reforços gp140 clado C monovalente foram estatisticamente indistinguíveis.

[000255] Os regimes de proteína bivalente mostraram indução com- parável de títulos de ELISA clado C e reconhecimento de pseudovírus como regime de reforço de gp140 clado C sozinha, indicando que a inclusão do imunógeno Mosaico gp140 relacionado com clado B não teve nenhum efeito negativo na cobertura do antígeno clado C, en- quanto aumentou significativamente a cobertura de clado B na 15º semana do estudo.

[000256] Os dados confirmam que o vetor Ad26.Mos2SEnv que codi- fica um antígeno sintético Env de acordo com a invenção pode ser uti- lizado com sucesso em regimes de vacinação.

Exemplo 7: Construção de vetores de MVA que codificam proteínas sintéticas do envelope do HIV da invenção em combinação com outros antígenos do HIV

[000257] No presente exemplo, foi gerado um vetor de MVA-BN (chamado "MVA-mBN414"), compreendendo um ácido nucleico que codifica o novo antígeno mos2SEnv de HIV aqui descrito como SEQ ID NO: 18 (também referido como C4D7). O vetor MVA-mBN414 ainda compreendido de ácidos nucleicos que codificam os seguintes antíge- nos do HIV: mos1Env (SEQ ID NO: 5); mos1Gag (SEQ ID NO: 1); mos2Gag (SEQ ID NO: 2); mos1Pol (SEQ ID NO: 3); e mos2Pol (SEQ ID NO: 4). Em MVA-mMBNA414, mos1Gag (SEQ ID NO: 1) e mos1Pol (SEQ ID NO: 3) foram codificados como uma proteína de fusão (SEQ ID NO: 28, "mos1GagPol"), e mos2Gag e mos2Pol foram codificados como uma proteína de fusão (SEQ ID NO: 29, "mos2GagPol"). Ver FIG. 8 para uma representação esquemática das inserções em regiões do genoma MVA.

[000258] Desenvolvemos um novo ácido nucleico (SEQ ID NO: 41) que codifica o antígeno de HIV mos2SEnv (SEQ ID NO: 18); um novo ácido nucleico (SEQ ID NO: 39) que codifica o antígeno de HIV mos1Env (SEQ ID NO: 5); um novo ácido nucleico (SEQ ID NO: 38) que codifica o antígeno de HIV mos1GagPol (SEQ ID NO: 28); e um novo ácido nucleico (SEQ ID NO: 40) que codifica o antígeno de HIV mos2GagPol (SEQ ID NO: 29). Os novos ácidos nucleicos foram con- cebidos para expressão humana, uma homologia mínima entre si e reduzidas extensões poli-nt, bem como elementos repetitivos.

[000259] O promotor longo PrMVA13.5 longo (SEQ ID NO: 42) foi incluído em frente do códon de iniciação ATG de ambas as sequências dos antígenos mos1GagPol e mos2GagPol. O promotor PrHyb (SEQ ID NO: 43) foi incluído em frente do códon de iniciação ATG de ambas as sequências dos antígenos mos2SEnv e mos1Env.

[000260] As sequências codificadoras de mos1GagPol e mos1Env foram inseridas via Sacll e Pacl em pBNX208, um vetor de transferên- cia que codifica as regiões homólogas IGR 44/45 de MVA-BN, permi- tindo assim inserção na região-alvo (IGR 44/45) de MVA-BN via re- combinação homóloga. Além disso, pBNX208 codifica heGFP e nptll para seleção positiva, bem como sequências repetitivas da região ho- móloga Flank 2 de IGR 44/45 de MVA-BN ou excisão posterior do cas- sete de seleção via recombinação homóloga na ausência de pressão seletiva. As sequências de codificação mos2GagPol e mos2Env foram inseridos via Notl em pBNX227, um vetor de transferência que codifica regiões homólogas IGR88/89 de MVA-BN, permitindo assim inserção na região-alvo (IGR 88/89) de MVA-BN por meio de recombinação homóloga. Além disso, pBNX227 codifica MRFP1 e ecogpt para sele- ção positiva, que são flanqueados por dois sítios loxP para excisão posterior do cassete de seleção na ausência de pressão seletiva após transfecção com um plasmídeo que codifica a CRE-recombinase, que catalisa a excisão precisa de sequências de ácidos nucleicos flanque- adas por sua sequência-alvo loxP.

[000261] Os vetores baseados em MVA foram gerados em fibroblas- tos de frango primários (CEF) e produzidos como aqui descrito. As cé- lulas CEF foram isoladas semanalmente de embriões de galinha e mantidas em meio VP-SFM sem FBS. Resumidamente, células CEF foram transfectadas com plasmídeo do vetor de MVA, utilizando Fuge- ne de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante (Promega), e uma coinfecção com MVA-BN foi realizada. Células foram colhidas após dois ou três dias, submetidas a ultrassom e ainda passadas. O vírus foi purificado em placas em células CEF cultivadas emuma placa de cultura de tecido de 96 multipoços após amplificação dentro de um único poço de uma placa de cultura de tecido de 12 multipoços. Ampli- ficação adicional foi realizada em células CEF cultivadas em um único poço de uma placa de tecido de 6 poços múltiplos, e subsequentemen- te em um balão de cultura de tecido T175.

[000262] O MVA-mBNA414 é assim um MVA-BN que compreende em sua região IGR 44/45 um ácido nucleico que codifica mos1GagPol (SEQ ID NO: 28) sob o controle de um promotor longo PrMVA13.51 (SEQ ID NO: 42) e um ácido nucleico que codifica mos1Env (SEQ ID NO: 5) sob o controle de um promotor PrHyb (SEQ ID NO: 43). Na re- gião IGR 88/89 há um ácido nucleico que codifica o mos2GagPol (SEQ ID NO: 29) sob o controle de um promotor longo PrMVA13.51 (SEQ ID NO: 42) e um ácido nucleico que codifica mos2SEnv (SEQ ID NO: 18) sob o controle de um promotor PrHyb (SEQ ID NO: 43). O ve- tor de MVA-mBN414 foi usado em experimentos subsequentes em re- gimes de preparação/reforço com vetores de adenovírus que codificam antígenos aqui descritos. Exemplo 8: Imunogenicidade de MVA-mBN414 em coelhos

[000263] A imunogenicidade de MVA-mMBN414 (ver Exemplo 7) em coelhos New Zealand White (NZW) foi avaliada no contexto de inicia- ção com Ad26.Mos.HIV (uma vacina trivalente que possui de três veto- res Ad26 que juntamente codificam antígenos de HIV com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 e 5; sob a forma de antígenos mos1GagPol (SEQ ID nO: 28), mos2GagPol (SEQ ID nO: 29) e mos1Env (SEQ ID nO: 5)) e em comparação com o homólogo preparação-reforço “com Ad26.Mos.HIV. Além disso, foi avaliado o benefício adicional de coa- plicação da proteína gp140 clado C (adjuvada com fosfato de alumí- nio) no 42º dia e 62º dia (injeção na musculatura contralateral (ou seja, em membros diferentes)).

[000264] O esquema de imunização que foi utilizado é fornecido na seguinte Tabela 2:

o a o

S

E = ZlrNr N N N oo — Cv o

E o = Zl€N N N N oo on

O <€ |o o q o o E |+ o o jo fe os 32 > 3 ovo o 2 5 S Bo o o? vo a a S/s 8 8 T 8 tj o 8 = |N > TO! o O + O O = O 9 Ee é —= Djs 2 o = ONO O 5 XL TOWN O 2 lr O 2 H/S O > 6 oaZ E ZE BB oezHEK RE 2emBmHÓr o ie o co SS Cc | Cc = Mm + O o à 2x o à << - 3 q 2 e||E O| E O 3 /E O 3 2 2 EB Ik Or Tor XT O DT — LSFTFE5ExZX E QE XxX < x FTF UT < OX TFT Ex o S&S SG x > <o> o 7 <> 7 <zZo O Dn K< vv E 2 E = + DE BT + DE 0 — o "o > 2 8 o e Sae o + se 6 o

S Go

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É

[000265] Os ensaios de leitura foram ELISA de uma gp140 clado C (resíduos aa 30-708 de SEQ ID NO: 7) e gp140 mosaico (resíduos aa 30-724 de SEQ ID NO: 36) e um ensaio de neutralização de pseudovíi- rus do HIV-1. Capacidade de neutralização de soros de coelhos imuni- zados foi testada contra partículas de vírus pseudotipo ENV do HIV-1 (EPVs) por inibição da entrada em células TZM-bl. Células TZM-bI ex- pressam altos níveis de CD4 e dos correceptores CCR5 e CXCR4 e contêm um gene repórter da luciferase que responde a tat integrado sob o controle de uma sequência de repetição terminal longa do HIV. Um efeito neutralizante de anticorpos Env do HIV-1 contendo soro contra as EPVs resulta na redução da expressão de luciferase e, as- sim, em um sinal reduzido de luminescência em combinação com o substrato que contém luciferina. Soro ou anticorpos foram testados em uma diluição em série de três vezes ao longo de seis etapas, com iní- cio em 1/20. A expressão máxima de luciferase foi medida adicionando apenas células + EPVs em um poço sem soro/anticorpos EPVs. A ex- pressão de fundo da luciferase foi medida pela adição apenas de célu- las a um poço, sem soro/anticorpos e EPVs. Uma curva não linear de quatro parâmetros foi montada entre o sinal máximo e o sinal de fundo da luciferase e valores de ICso transformados com log10 foram deter- minados como valor reportável.

[000266] Os resultados são mostrados na FIG. 9.

[000267] Os resultados mostram que o MVA-mBNA414 era imunogê- nica em todos os coelhos. Não houve diferença óbvia na imunogenici- dade entre machos e fêmeas. O reforço de MVA no contexto de inicia- ção com Ad26 induziu um aumento na resposta imune humoral espe- cífica a HIV (mensurável em ELISA clado C, ELISA do mosaico seme- lhante a clado B e VNA clado B) em comparação com homólogo pre- paração/reforço com Ad26.

[000268] Coadministração de proteína gp140 clado C com MVA co-

mo reforço induziu um aumento nos títulos de ELISA de gp140 clado C (homólogo) e de ELISA do Mosaico gp140 (heterólogo) em compara- ção com um reforço com apenas MVA. Exemplo 9: imunogenicidade de MVA-MBN414 em camundongos

[000269] A imunogenicidade de MVA-mMBN414 também foi avaliada em ratinhos CBF1, com o objetivo de avaliar a imunogenicidade de um Ad26.Mos4.HIV heterólogo (ver Exemplo 6) iniciação e MVA-mBN414 (ver Exemplo 7) reforço, em comparação com uma preparação-reforço com MVA homóloga (ou seja, tanto iniciação quanto reforço com MVA- MBN414).

[000270] O esquema de imunização que foi utilizado é fornecido na seguinte Tabela 3:

CS ORA No o RN eos H oc nO Wo" [UR - " ES 5 o Zz NM IN IN | N | ce ºg3R o O E O o o oO = 20 Çp

O SC s SE QE N 2 89? Silo | > 22? 88 Ss 2 > 2x cd oo El el E + & 382 E Sig : = e 0 Gs o EE x + o |O 3. E És o E Ó zZz N no U + o oo 2 E) & |. & 8 º& o SiB lo = E > / E % o S 5º 8/2 | Z |g/3 538038 : = al a 2 às Ss z E VP 2 3 E 2g É DP << << = < 4 É Dez | ú Oo Ss Ss Es = o 35 = .. = E O ES Ss EEST = = : Ss DE ao | = o NNW E E Y B 2 PS ESTO z S mv laNjdo «e 6 [8 6 TS ê Fr 2uvy 2 GR Z Zz & = & a

É

[000272] Os resultados do ELISPOT são mostrados na FIG. 10. Um ensaio de coloração de citoquina intracelular (ICS) também foi realiza- do, que forneceu resultados similares (não mostrados).

[000273] Os resultados indicam que a iniciação com Ad26 ou MVA induziram respostas imunológicas detectáveis na 5º semana (FIG. 10A), que aumentam ainda por imunização de reforço com MVA na 7º semana (FIG. 10B) tanto para o regime de Ad-MVA heterólogo quanto para o regime de MVA-MVA homólogo. Iniciação-reforço com Ad-MVA heterólogo induziu títulos de ELISA significativamente maiores do que o regime de iniciação-reforço com MVA-MVA homólogo. Isso foi tam- bém observado para respostas imunes celulares medidas por ELIS- POT contra os antígenos Env, Gag e Pol na 7º semana (Figura 10C- E). Imunização de iniciação-reforço com MVA homólogo induziu uma resposta imune celular baixa porém detectável contra os antígenos Gag e Pol que é claramente diferenciável de dados de controle.

[000274] Em suma, os resultados mostram que um MVA com antí- genos do HIV de acordo com a invenção é imunogênico. Além disso, mostra-se que esse vetor pode ser vantajosamente usado em regimes de iniciação-reforço com vetores adenovirais que codificam antígenos de HIV, e/ou com proteínas gp140 do HIV isoladas.

REFERÊNCIAS

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21. Edwards et al., J. Virology, 2002, 76: 2683-2691.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Vetor de poxvírus, caracterizado pelo fato de que com- preende ácido nucleico que codifica: (a) um primeiro antígeno do envelope (Env) do HIV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; (b) um segundo antígeno Env do HIV diferente do primeiro antígeno Env do HIV; (c) um terceiro antígeno e um quarto antígeno, sendo dois antígenos GAG do HIV diferentes; e (d) um quinto antígeno e sexto antígeno, sendo dois antí- genos Pol do HIV diferentes.

2. Vetor de poxvírus, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que: o segundo antígeno Env do HIV compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; o terceiro e quarto antígenos compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente; e o quinto e o sexto antígenos compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente.

3. Vetor de poxvírus, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o terceiro e o quinto antígenos são fun- didos em um primeiro antígeno de fusão Gag-Pol que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, e o quarto e o sexto antígenos são fundidos em um segundo antígeno de fusão Gag-Pol que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

4. Vetor de poxvírus, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o primeiro antígeno Env do HIV é codificado por SEQ ID NO: 41.

5. Vetor de poxvírus, de acordo com a reivindicação 3, ca- racterizado pelo fato de que o primeiro antígeno Env do HIV é codificado por SEQ ID NO: 41; o segundo antígeno Env do HIV é codificado por SEQ ID NO: 39; o primeiro antígeno de fusão Gag-Pol é codificado por SEQ IDNO: 38; e o segundo antígeno de fusão Gag-Pol é codificado por SEQ ID NO: 40.

6. Vetor de poxvírus, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o vetor de poxvírus é um vetor recombinante do vírus Vaccinia Ankara modificado (MVA).

7. Vetor de poxvírus, de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizado pelo fato de que o vetor MVA compreende MVA-BN ou seus derivados.

8. Vetor de poxvírus, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o primeiro antígeno de fusão Gag-Pol e segundo antígeno Env são inseridos na região intergênica (IGR) 44/45 do genoma do MVA, e o segundo antígeno de fusão Gag-Pol e o pri- meiro antígeno Env são inseridos na IGR 88/89 do genoma do MVA.

9. Vetor de poxvírus, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o primeiro antígeno de fusão Gag-Pol e o segundo antígeno de fusão Gag-Pol estão cada um sob o controle de um promotor Prl3.5 separado, e o primeiro antí- geno Env e o segundo antígeno Env estão cada um sob o controle de um promotor PrHyb separado.

10. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor de poxvírus como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

11. Combinação de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma primeira composição de vacina que compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de um vetor de poxvírus como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9; e pelo me- nos um de: b) (1) uma segunda composição de vacina que compreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de um ou mais vetores de adenovírus que codificam um ou mais dos primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto e sexto antígenos; e (b) (ii) uma terceira composição de vacina que compreende um ou mais polipeptídeos que compreendem uma quantidade imuno- genicamente eficaz de um polipeptídeo antigênico do HIV isolado, em que a primeira composição e a segunda e/ou terceira composições estão presentes na mesma composição ou em uma ou mais composi- ções diferentes.

12. Combinação de vacina, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a segunda composição de vacina compreende vetores recombinantes Ad26 que juntamente codificam as SEQ ID NOs: 18, 5, 1,2, 3 e 4.

13. Combinação de vacina, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que os denominados um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados na terceira composição de vacina compreendem: (1) um polipeptídeo que compreende os resíduos 30-708 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou (ii) um polipeptídeo que compreende os resíduos 30-724 de SEQ ID NO: 36; ou (ili) ambos os polipeptídeos (i) e (ii).

14. Método de indução de uma resposta imunológica contra um vírus da imunodeficiência humana (HIV) em um indivíduo com ne-

cessidade desse tratamento, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo a vacina como definida na reivin- dicação 10 ou a combinação de vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 13.

15. Método de indução de uma resposta imunológica contra um vírus da imunodeficiência humana (HIV) em um indivíduo com ne- cessidade desse tratamento, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo: (a) uma primeira vacina que compreende um ou mais veto- res de adenovírus recombinantes, de preferência vetores de Ad26, que codifica uma ou mais das SEQ ID NOs: 1,2,3,4, 56 18; e (b) uma segunda vacina que compreende um vetor de pox- vírus como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a primeira vacina é uma vacina de primeira imunização e a se- gunda vacina é uma vacina de reforço, ou em que a segunda vacina é uma vacina de primeira imunização e a primeira vacina é uma vacina de reforço.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda administrar ao indivíduo um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados, mais ou menos ao mesmo tempo que a vacina de reforço, em que os denominados um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV compreendem preferencial- mente (1) um polipeptídeo que compreende os resíduos 30-708 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou (ii) um polipeptídeo que compreende os resíduos 30-724 de SEQ ID NO: 36; ou (ili) ambos os polipeptídeos (i) e (ii), e em que os denominados um ou mais polipeptídeos antigênicos do HIV isolados estão na mesma composição da vacina de reforço ou em uma composição separada da vacina de reforço.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 14 a 16, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indiví- duo que foi infectado com HIV.