CN110958887A - 编码hiv抗原的痘病毒载体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了编码合成HIV包膜抗原和其他HIV抗原的痘病毒载体，以及包含此类痘病毒载体的组合物，以及此类痘病毒载体作为疫苗用于诱导针对HIV的改善的免疫力的用途。本发明还提供了疫苗组合，以及使用其诱导针对HIV的改善的免疫力的方法，所述疫苗组合包含所公开的痘病毒载体、编码一种或多种HIV抗原的腺病毒载体和一种或多种分离的HIV抗原多肽。

Description

编码HIV抗原的痘病毒载体及其使用方法
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请享有2017年6月15日提交的美国临时专利申请号62/520,079的优先权，其全部内容整体援引加入本文。
电子提交的序列表的引用
本申请包含序列表，以ASCII格式的序列表通过EFS-Web电子提交，其文件名为“688097-331WO序列表”，创建日期为2017年6月7日，大小为174.4KB。通过EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分，并在此整体援引加入本文。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(HIV)影响全世界数以百万计的人，并且即使在当今广泛的抗逆转录病毒治疗时代，通过有效的疫苗预防HIV仍然是高度优先的工作。HIV-1是最常见的致病毒株，超过90％的HIV/AIDS病例源于感染HIV-1的M组。M组进一步分为进化支或亚型。有效的疫苗理想地将能够引发有效的细胞应答和广谱中和抗体的产生，广谱中和抗体可中和来自不同进化支的HIV-1毒株。
HIV-1的高遗传变异性使得HIV-1疫苗的开发成为前所未有的挑战。为了改善潜在T细胞表位的覆盖范围并改善细胞应答，其他人描述并开发了衍生自HIV的组抗原(Gag)、聚合酶(Pol)和包膜蛋白(Env)的“镶嵌(mosaic)”HIV-1Gag、Pol和Env抗原，目的在于提供潜在T细胞表位的最广覆盖(例如，Barouch et al,Nat Med 2010,16:319-323)。镶嵌抗原的长度和结构域的结构与野生型、天然存在的HIV-1抗原相似。
例如，在疫苗中描述和使用的镶嵌HIV抗原包括Barouch等人(同上)和WO 2010/059732中描述的那些，例如：
(a)Gag镶嵌抗原，其包括：
(a)(i)第一镶嵌Gag序列(“mos1Gag”)，其具有如本文SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，和
(a)(ii)第二镶嵌Gag序列(“mos2Gag”)，其具有如本文SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；
(b)Pol镶嵌抗原，其包括：
(b)(i)第一镶嵌Pol序列(“mos1Pol”)，其具有如本文SEQ ID NO:3所示氨基酸序列，和
(b)(ii)第二镶嵌Pol序列(“mos2Pol”)，具有如本文SEQ ID NO:4所示氨基酸序列；以及
(c)Env镶嵌抗原，其包括：
(c)(i)第一镶嵌Env序列(“mos1Env”)，其具有如本文SEQ ID NO:5所示氨基酸序列，和
(c)(ii)第二镶嵌Env序列(“mos2Env”)，其具有如本文SEQ ID NO:6所示氨基酸序列。
已将编码这些抗原的序列克隆到载体(vector)中，例如重组腺病毒载体(例如重组腺病毒血清型26(rAd26))，并且之前将这些重组载体用作疫苗以产生针对这些抗原的免疫应答(参见例如Barouch等，同上；和WO 2010/059732)。例如，通常将mos1Gag和mos1Pol镶嵌抗原序列组合成Gag和Pol的融合蛋白(“mos1GagPol”)，并将其编码序列克隆到第一Ad26载体(“rAd26.mos1GagPol”)中；以及将mos2Gag和mos2Pol抗原序列组合成Gag和Pol的另一融合蛋白(“mos2GagPol”)，并将其编码序列克隆到第二Ad26载体(“rAd26.mos2GagPol”)中。通常将编码mos1Env和mos2Env的构建体克隆到单独的Ad26载体中(分别为“rAd26.mos1Env”和“rAd26.mos2Env”)。
如上所述的这类镶嵌抗原的集合对M组HIV-1分离株的整体覆盖范围具有良好效果，其中编码镶嵌1抗原序列的rAd26载体(例如，rAd26.mos1GagPol和rAd26.mos1Env)倾向于针对进化支B和CRF01HIV-1亚型，编码镶嵌2抗原序列的rAd26载体(例如rAd26.mos2GagPol和rAd26.mos2Env)倾向于针对进化支C的毒株。与共有序列或天然序列HIV-1抗原相比，在rAd26载体中表达的镶嵌HIV-1Gag、Pol和Env抗原可用于改善恒河猴中抗原特异性T淋巴细胞应答的广度和深度，而不会影响细胞和体液应答的强度(Barouch等，同上；和WO 2010/059732)。
然而，在对上述疫苗组分的进一步开发努力中，发现rAd26.mos2Env在非人灵长类动物中的细胞表面表达和免疫应答并非最理想，与其他rAd26载体(例如rAd26.mos1Env)相比，其在生产过程中还表现出迄今未报道、预料不到和不可预测的非最理想的遗传稳定性。因此，由于mos2Env镶嵌抗原偏向HIV-1进化支C毒株，含有rAd26.mos2Env的疫苗诱导的针对HIV-1进化支C亚型的免疫应答可能非最理想。因此，需要HIV疫苗中的mos2Env抗原的替代物，其可用于诱导针对HIV-1进化支C的改善的免疫应答。
痘病毒载体，例如改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)，可用于编码目的抗原以进行疫苗接种。本领域需要编码新型HIV抗原组合的痘病毒载体。
发明内容
本发明涉及合成人免疫缺陷病毒(HIV)包膜蛋白与新型痘病毒载体，所述合成HIV包膜蛋白与先前描述的mos2Env抗原相比，具有改善的细胞表面表达和遗传稳定性，所述新型痘病毒载体包含编码所述合成HIV包膜蛋白的核酸序列。本发明还涉及组合物和使用新型痘病毒载体(优选地，当与其他HIV抗原组合使用时)诱导针对HIV-1，特别是针对HIV-1进化支C和B的增强的免疫应答的方法，所述载体包含编码合成HIV包膜蛋白的核酸序列。
在特定方面，本发明涉及痘苗病毒载体，优选改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)载体，其包含编码合成HIV包膜蛋白的核酸，并且优选包含编码额外的HIV抗原的核酸序列。
在一总的方面，本发明涉及编码合成HIV包膜蛋白的核酸，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。所述合成HIV包膜蛋白可进一步包含信号序列，例如具有选自SEQ ID NO:9-12的氨基酸序列的信号序列。在一实施方案中，所述信号序列具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述合成HIV包膜蛋白进一步包含跨膜结构域，优选具有SEQID NO:13的氨基酸序列的跨膜结构域。在某些实施方案中，所述合成HIV包膜蛋白进一步包含胞质结构域的片段，优选包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其N末端的1-4位氨基酸(即，NRVR)的胞质结构域的片段。在其中合成HIV包膜蛋白还包含跨膜结构域并且还包含胞质结构域片段的实施方案中，优选的是，该蛋白还包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8的羧基末端(C末端)和跨膜区的氨基末端(N末端)融合。
在最优选的实施方案中，本发明涉及痘病毒载体，其包含编码合成HIV包膜蛋白的核酸序列，所述合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18的氨基酸序列或SEQ IDNO:19的第1-686位氨基酸。最优选地，所述核酸编码的合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，所述痘病毒载体包含编码如上所述的合成HIV包膜蛋白和至少一种额外的HIV抗原的核酸。在一优选实施方案中，所述痘病毒载体是改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)载体。最优选地，所述MVA载体包含MVA-BN或其衍生物。
在一优选实施方案中，所述痘病毒载体包含：(a)编码第一HIV包膜(Env)抗原的核酸，所述第一HIV包膜抗原包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且优选地进一步包含编码以下的核酸：(b)第二HIV Env抗原，其不同于第一HIV Env抗原；(c)第三抗原和第四抗原，其为两种不同HIV Gag抗原；(d)第五抗原和第六抗原，其为两种不同HIV Pol抗原的。在某些优选的实施方案中，(b)第二HIV Env抗原包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(c)第三抗原和第四抗原分别包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(d)第五抗原和第六抗原分别包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在某些实施方案中，将所述第三抗原和第五抗原融合为第一Gag-Pol融合抗原，所述第一Gag-Pol融合抗原优选地包含SEQ IDNO:28；并将所述第四抗原和第六抗原融合为第二Gag-Pol融合抗原，所述第二Gag-Pol融合抗原优选包含SEQ ID NO:29。在某些特定的实施方案中，所述第一HIV Env抗原由SEQ IDNO:41编码。在一个或多个特定的实施方案中，所述第二HIV Env抗原由SEQ ID NO:39编码；所述第一Gag-Pol融合抗原由SEQ ID NO:38编码；并且所述第二Gag-Pol融合抗原由SEQ IDNO:40编码。
在痘病毒载体为MVA载体的实施方案中，例如包含MVA-BN或其衍生物的MVA载体，优选将所述第一Gag-Pol融合抗原和所述第二Env抗原插入MVA基因组的基因间区域(IGR)44/45中，并将所述第二Gag-Pol融合抗原和所述第一Env抗原插入MVA基因组的IGR 88/89中。更优选地，所述第一Gag-Pol融合抗原和所述第二Gag-Pol融合抗原各自在单独的启动子的控制下，优选在Pr13.5启动子的控制下，并且所述第一Env抗原和所述第二Env抗原各自在单独的启动子的控制下，优选在PrHyb启动子的控制下。
本发明的另一总的方面涉及一种组合物，优选疫苗组合物(vaccinecomposition)，其包含免疫原性有效量的痘病毒载体，并优选地进一步包含编码一种或多种额外的HIV抗原的核酸序列和载剂(carrier)，所述痘病毒载体包含编码根据本发明一实施方案的合成HIV包膜蛋白的核酸序列，其中编码所述合成HIV包膜蛋白的核酸可操作地连接至启动子序列。在一实施方案中，所述组合物还包含腺病毒载体，优选腺病毒26载体，其编码合成HIV包膜蛋白，所述合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述组合物包含痘病毒载体，优选MVA载体，其编码合成HIV包膜蛋白，并优选地编码额外的HIV抗原，所述合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的组合物进一步包含额外的表达载体和/或分离的HIV抗原多肽，所述额外的表达载体编码额外的HIV抗原。
在另一总的方面，本发明涉及一种疫苗组合(vaccine combination)，用于在有需要的受试者中诱导针对人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答。在一实施方案中，所述疫苗组合包括：
(a)第一疫苗组合物，其包含免疫原性有效量的载体，优选痘病毒载体，更优选MVA载体，所述载体编码(i)第一HIV包膜(Env)蛋白，所述第一HIV包膜(Env)蛋白为合成HIV包膜蛋白，其包含SEQ ID NO:18氨基酸序列，并且所述载体优选地进一步包含编码以下的核酸：(ii)第二HIV Env抗原，其不同于第一HIV Env抗原；(iii)第三抗原和第四抗原，其为两种不同HIV Gag抗原；(iv)第五抗原和第六抗原，其为两种不同HIV Pol抗原；以及以下至少之一：
(b)(i)第二疫苗组合物，其包含免疫原性有效量的一种或多种载体，优选一种或多种腺病毒载体，更优选一种或多种腺病毒26载体，其编码第一抗原、第二抗原、第三抗原、第四抗原、第五抗原、第六HIV抗原中的一个或多个，优选编码一种或多种HIV抗原，所述HIV抗原包含选自SEQ ID NO:1-5、18、28和29的氨基酸序列；和/或
(b)(ii)包含一种或多种多肽的第三疫苗组合物，所述多肽包含免疫原性有效量的分离的HIV抗原多肽，例如，包含SEQ ID NO:7氨基酸序列的第30-708位残基的多肽，和/或包含SEQ ID NO:36氨基酸序列的第30-724位残基的多肽，其中所述第一组合物以及所述第二和/或第三组合物存在于相同组合物中或者一种或多种不同的组合物中。
在一实施方案中，其中所述疫苗组合包含第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含一种或多种重组腺病毒26载体，其编码一种或多种抗原，所述抗原包含选自SEQ IDNO:1-5、18、28和29的氨基酸序列，更优选包含两种、三种或四种重组腺病毒26载体，其一起编码SEQ ID NO:1、2、3、4、5和18。
本发明的又一总的方面涉及在有需要的受试者中诱导针对人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答的方法，其包括向所述受试者给药组合物，例如疫苗组合物，或根据本发明实施方案的疫苗组合。本发明还涉及诱导针对HIV的免疫应答的方法，其包括使用根据本发明实施方案的组合物或疫苗组合来启动和加强免疫应答。
在一特定实施方案中，一种在有需要的受试者中诱导针对HIV的免疫应答的方法包括向所述受试者给药：
(a)第一疫苗，其包含一种或多种重组腺病毒载体，优选Ad26载体，所述重组腺病毒载体编码SEQ ID NO:1、2、3、4、5和18中的一个或多个；和
(b)第二疫苗，其包含痘病毒载体，优选为MVA载体，其编码第一HIV包膜(Env)蛋白，所述第一HIV包膜(Env)蛋白为合成HIV包膜蛋白，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并优选编码额外的HIV抗原，所述额外的HIV抗原优选为不同于第一HIV Env抗原的第二HIVEnv抗原、为两种不同HIV Gag抗原的第三抗原和第四抗原、为两种不同HIV Pol抗原的第五抗原和第六抗原，更优选为编码选自SEQ ID NO:1-5、28和29氨基酸序列的一种或多种HIV抗原，
其中所述第一疫苗为初免疫苗并且所述第二疫苗为加强疫苗，或者其中所述第二疫苗为初免疫苗并且所述第一疫苗为加强疫苗。在某些实施方案中，将一种或多种分离的HIV抗原多肽与加强疫苗大约同时，与加强疫苗以同一组合物或不同组合物的形式给药于受试者，所述分离的HIV抗原多肽优选包含免疫原性有效量的分离的HIV抗原多肽，例如，包含SEQ ID NO:7氨基酸序列的第30-708位残基的多肽，和/或包含SEQ ID NO:36的第30-724位残基的多肽。
本发明的另一方面涉及细胞，优选分离的细胞，其包含根据本发明实施方案的载体。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及以下对本发明的详细描述。应当理解，本发明不限于附图中所示的确切实施例。
在附图中：
图1A-1C为HIV包膜蛋白结构的示意图；图1A显示了全长HIV包膜蛋白；图1B显示了根据本发明一实施方案的可溶性单链HIV包膜蛋白的结构，其中跨膜结构域(TM)被GCN4三聚结构域替代，且弗林蛋白酶(furin)切割位点被突变(sC4)；图1C显示了根据本发明一实施方案的膜结合的HIV包膜蛋白的结构，其包含跨膜结构域和胞质结构域的一个片段(C4D7)。
图2显示了根据本发明一实施方案的可溶性sC1HIV包膜蛋白和可溶性合成HIV包膜蛋白(sC4)的表达水平，所述可溶性sC1HIV包膜蛋白基于具有额外的C末端三聚结构域的mos2Env镶嵌抗原序列；使用抗gp120的多克隆抗体通过定量蛋白质印迹法测量表达；编码sC1或sC4的质粒瞬时表达两次，每次转染通过光密度法定量两次；与sC4合成HIV包膜蛋白相比，sC1蛋白的表达水平非常低，而sC4合成HIV包膜蛋白的表达水平却较高。
图3A和3B显示了在可溶性CD4存在(浅灰色)和不存在(深灰色)的情况下，通过ELISA测定的合成HIV包膜蛋白与单克隆抗体17b(mAb17b)的结合；图3A显示了sC1的结合；图3B显示了sC4的结合。
图4是来自sC1蛋白和sC4合成HIV包膜蛋白的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白质印迹的图像。
图5通过使用抗gp120多克隆抗体(GP120)对表达这些蛋白的细胞的FACS分析，以及与广谱中和抗体PG9(PG9)和PG16(PG16)的结合，显示了膜结合的C1、C1D7、C4和C4D7合成HIV包膜蛋白的相对细胞表面表达水平，PG9(PG9)和PG16(PG16)依赖于四级结构，优先结合正确折叠的Env三聚体。
图6为在多次病毒传代后，含有编码本发明的合成HIV包膜蛋白的序列的腺病毒载体的稳定性的图示，所述合成HIV包膜蛋白包括全长C4(FLC4)、C4D7和sC4；在PER.C6细胞中产生了重组腺病毒26载体；在最初的3代转染和空斑纯化后，选择了5个空斑并按T25形式扩增了10代，从而使总病毒传代数(vpn)为13；显示了利用E1转基因盒聚合酶链式反应(PCR)确定的vpn 3、5、10和13后的稳定性；例如，3/5表示测试的5个空斑中有3个是稳定的，5/5表示测试的5个空斑中有5个是稳定的。
图7A和7B显示了兔体内，在基于TZM-bl细胞的中和测定中针对HIV-1包膜假型病毒颗粒(EVP)的病毒中和效价；在第1、8、14和20周时，针对EVPs VSV-G(阴性对照)和MW965.26(进化支C的1A级)测量了高腺病毒载体剂量给药组的log10转化的IC50值；每个点代表单只兔子的log10转化的IC50值，组平均值由水平线表示；HD：测试的最高稀释度(上实线)；LD：测试的最低稀释度(下实线)；LOB：背景限，汇总的(compiled)阴性样本的95％值(虚线)；在相应的线上设置了超过LD或HD阈值的Log10IC50值；对于每个时间点，使用Dunn方法与对照进行单因素非参数比较，以进行联合排名；图中标示了统计学上的显著差异：*＝P<0.05，**＝P<0.01，和***＝P<0.001；图7A显示了VSV-G(阴性对照)的结果；图7B显示了MW965.26(进化支C的1A级)的结果。
图8为对于MVA-mBN414载体而言，插入片段在MVA基因组中指定位置的图示；Pr13.5和PrHyb为启动子序列；IGR为基因间区域。
图9A、9B和9C显示了用Ad26.Mos.HIV(缩写为Ad26)单独或者将其连同MVA-mBN414(在图9A-9C中缩写为“MVA”)、进化支C gp140(缩写为GP140)或其组合免疫后第85天，在兔体内产生的免疫应答；男性(M)和女性(F)分开显示；图9A和9B分别显示进化支C gp140和镶嵌gp140特异性ELISA效价；每个点代表单只兔子的log10转化的相对效力值(log10EU/ml)，组均值表示为水平线；ULOQ，定量上限(上实线)，LLOQ定量下限(下实线)，LOB，背景限(虚线)；低于LOB的所有值均设置在LOB水平；统计分析由跨性别的Tobit模型组成；为了比较第1、2和3组，应用了Tukey校正；在图中标示了统计学上的显著差异：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；图9C显示在使用兔血清的基于TZM-b1细胞的中和测定中针对HIV-1BaL包膜假型病毒颗粒的病毒中和效价；每个点代表单只兔子的log10转化的IC50值，组平均值由水平线表示；HD：测试的最高稀释度(上实线)；LD：测试的最低稀释度(下实线)；LOB：背景限，汇总的(compiled)阴性样本的95％值(虚线)；在相应的线上设置了超过LD或HD阈值的log10IC50值；统计分析由跨性别的Tobit模型组成；为了比较第1、2和3组，应用了Tukey校正；图中标示了统计学上的显著差异：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图10A-10E显示了用Ad26.Mos4.HIV(缩写为Ad26)随后为MVA-mBN414的初免-加强免疫，或同源MVA-mBN414(在图10A-10E中缩写为“MVA”)的初免-加强免疫进行免疫接种，仅初免(第5周)或初免-加强免疫(第7周)后在小鼠体内产生的免疫应答；第1组和第2组在第0周分别用2.5×109或2.5×108vp的Ad26.Mos4.HIV初免，在第5周中分别用2.8×106或2.8×105TCID50的MVA-mBN414加强免疫；第3组和第4组在第0周和第5周分别用2.8×106或2.8×105TCID50的MVA-mBN414免疫；第5组(对照组)用2.5×109Ad26.Empty初免，并用2.8×106TCID50的MVA-BN-empty加强免疫；图10A和10B显示了镶嵌gp140特异性ELISA效价；每个点代表单只小鼠的log10转化的终点效价，组均值由水平线表示；UD，稀释上限；LD，最低稀释度；低于LD的所有值均设置为LD水平；统计分析由跨剂量Tobit模型组成；图中标示了统计学上的显著差异：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；图10C-10E显示了研究第7周的干扰素-γ(IFN-γ)ELISPOT数据；每个点代表单只小鼠的每106个脾细胞的斑点形成细胞(SFC)的计数，组均值由水平线表示；LOD：检测限，汇总的未刺激对照的95％值(虚线)；通过利用Env、Gag和Pol的免疫优势肽刺激，分别测定Env、Gag和Pol特异性的应答，所述免疫优势肽分别为IHIGPGRAFYTAGDI(SEQ ID NO:44)、AMQMLKETI(SEQ ID NO:45)和YYDPSKDLI(SEQ IDID：46)；图中标示了统计学上的显著差异：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
具体实施方式
在背景技术和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献的全部内容援引加入本文。本说明书中已包括的对文件、行为、材料、装置、物品等的讨论是为了提供本发明的背景。对于所公开或要求保护的任何发明，这种讨论并非承认所有或任何这些问题构成现有技术的一部分。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。否则，本文中使用的某些术语具有说明书中阐述的含义。本文引用的所有专利、公开的专利申请和出版物均援引加入本文，如同在本文中完全阐明。必须注意的是，除非上下文另外明确指出，否则本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。
在整个本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“comprise(包含)”一词及其变化如“comprises”和“comprising”将被理解为意为包括所述整数或步骤或一组整数或步骤，而不排除任何其他整数或步骤或一组整数或步骤。在本文中，术语“包含(comprising)”可用术语“含有”或“包括”代替，或者有时在本文中使用术语“具有”时代替。
在本文中，“由...组成”不包括在权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。在本文中，“基本上由...组成”不排除不会实质性影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。在本文中，每当在本发明的一个方面或实施方案的上下文中使用时，任何上述术语“包含”、“含有”、“包括”和“具有”可被术语“由...组成”或“基本上由...组成”代替以变化本发明的范围。
如本文所用，多个所列举的元件之间的连接术语“和/或”应理解为包括单独的和组合的选项。例如，在两个元素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个元素的情况下第一个元素的适用性。第二种选项是指第二个元素在没有第一个元素的情况下的适用性。第三种选项是指第一和第二元素一起适用。这些选项中的任何一个都应理解为落入该含义内，并因此满足本文所用术语“和/或”的要求。多个选项中的一个以上的并存适用性也应理解为在其含义之内，因此满足术语“和/或”的要求。
如本文所用，“受试者”是指将要或已经给予根据本发明的实施方案的载体、组合物或疫苗组合的任何动物，优选为哺乳动物，最优选为人。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴子、人等，但更优选人。
本发明总体涉及合成HIV包膜蛋白、编码合成HIV包膜蛋白的核酸和载体，以及诱导针对HIV的免疫应答的方法，所述方法可使用单独的载体或与一种或多种额外的载体的组合和/或与一种或多种额外的分离的HIV抗原多肽的组合，所述载体编码合成HIV包膜蛋白并任选地编码额外的HIV抗原，所述一种或多种额外的载体编码一种或多种额外的HIV抗原。
人免疫缺陷病毒(HIV)为慢病毒属的成员，慢病毒属为逆转录病毒科的组成部分。HIV的两个种感染人类：HIV-1和HIV-2。HIV-1为最常见的HIV病毒株，并且已知比HIV-2更具致病性。如本文所用，术语“人类免疫缺陷病毒”和“HIV”是指HIV-1和HIV-2，但不限于此。
HIV被分类为具有高度遗传差异的多个进化支。如本文所用，术语“HIV进化支”或“HIV亚型”是指根据遗传相似度分类的相关的人类免疫缺陷病毒。目前有三组HIV-1分离株：M、N和O。M组(主要毒株(major strains))由至少十个进化支组成，A至J进化支。O组(离群毒株(outer strains))可由相似数目的进化支组成。N组是新的HIV-1分离株，尚未归入M组或O组。
如本文所用，术语“HIV抗原多肽”、“HIV抗原蛋白”、“HIV抗原”和“HIV免疫原”是指能够在受试者体内诱导针对HIV的免疫应答的多肽，例如由体液和/或细胞介导的应答。抗原多肽或抗原可为HIV的蛋白质、其片段或表位，或多种HIV蛋白质或其部分的组合，其可在受试者体内针对HIV诱导免疫应答或产生免疫，例如保护性免疫。
优选地，抗原多肽或抗原能够在宿主中产生保护性免疫应答，例如，诱导针对病毒性疾病或感染的免疫应答，和/或在受试者体内产生抗病毒性疾病或感染的免疫力(即接种疫苗)以保护受试者免于病毒性疾病或感染。例如，抗原多肽或抗原可包含来自猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或HIV的蛋白或其片段，例如HIV或SIV包膜gp160蛋白，HIV或SIV基质/衣壳蛋白，以及HIV或SIV gag、pol和env基因产物。
HIV抗原多肽或抗原可为任何HIV-1或HIV-2抗原或其片段。HIV抗原的例子包括但不限于gag、pol和env的基因产物，其编码结构蛋白和必需酶。Gag、pol和env基因产物合成为多聚蛋白，并可进一步加工成多种其他蛋白产物。gag基因的初级蛋白产物是病毒结构蛋白gag多聚蛋白，其可进一步加工成MA、CA、SP1、NC、SP2和P6蛋白产物。pol基因编码病毒酶(Pol，聚合酶)，并且该初级蛋白产物进一步加工成RT、RNase H、IN和PR蛋白产物。env基因编码结构蛋白，特别是病毒体包膜的糖蛋白。env基因的初级蛋白产物是gp160，可进一步加工成gp120和gp41。HIV抗原的其他例子包括基因调节蛋白Tat和Rev；辅助蛋白Nef、Vpr、Vif和Vpu；衣壳蛋白、核衣壳蛋白和p24病毒蛋白。
在某些实施方案中，HIV抗原多肽或抗原包含HIV Gag、Env或Pol抗原，或任何抗原部分或表位或其组合，优选HIV-1Gag、Env或Pol抗原或任何抗原部分或表位或其组合。
HIV抗原多肽也可为镶嵌HIV抗原。如本文所用，“镶嵌抗原”是指由天然序列的片段组装成的重组蛋白。镶嵌抗原类似于天然抗原，但是经过优化以将天然序列中发现的潜在T细胞表位的覆盖范围最大化，从而提高免疫应答的广度和覆盖范围。用于本发明的镶嵌HIV抗原优选为镶嵌Gag、Pol和/或Env抗原，更优选为镶嵌HIV-1Gag、Pol和/或Env抗原。如本文所用，“镶嵌HIV Gag、Pol和/或Env抗原”具体是指包含源自HIV的一个或多个Gag、Pol和/或Env多聚蛋白序列的多个表位的镶嵌抗原。
在一实施方案中，用于本发明的镶嵌HIV抗原是镶嵌HIV Gag抗原，其表位衍生自gag基因产物序列(SEQ ID NO:1、2中提供了实例)；镶嵌HIV Pol抗原，其表位衍生自pol基因产物序列(SEQ ID NO:3、4中提供了实例)；或镶嵌HIV Env抗原，其表位衍生自env基因产物序列(SEQ ID NO:5、6中提供了实例；例如SEQ ID NO:8、17、18、19中的本发明合成抗原，也可认为是镶嵌HIV Env抗原)。在某些实施方案中，用于本发明的镶嵌HIV抗原包含衍生自gag、pol和/或env基因产物序列的表位的组合。说明性和非限制性实例包括镶嵌Env-Pol抗原，其表位衍生自env和pol基因产物序列；镶嵌Gag-Pol抗原，其表位衍生自gag和pol基因产物序列(SEQ ID NO:28、29中提供了实例)；以及Gag-Env抗原，其表位衍生自gag和env基因产物序列。gag、pol和env基因产物序列可衍生自一个或多个进化支。
可用于本发明中的镶嵌HIV Gag、Pol和/或Env抗原的实例包括例如在US20120076812；Barouch et al.,Nat Med 2010,16:319-323；和Barouch et al.,Cell155:1-9,2013中描述的那些，其内容整体援引加入本文。优选地，用于本发明的镶嵌HIVGag、Pol和/或Env抗原包括但不限于mos1Gag(SEQ ID NO:1)、mos2Gag(SEQ ID NO:2)、mos1Pol(SEQ ID NO:3)、mos2Pol(SEQ ID NO:4)、mos1Env(SEQ ID NO:5)、mos2Env(SEQ IDNO:6)、mos1GagPol(SEQ ID NO:28)、mos2GagPol(SEQ ID NO:29)和其组合。
如本文所用，术语“HIV包膜蛋白”，“env蛋白”和“Env”中的都是指在HIV病毒体的包膜上表达并使得HIV能够靶向并附着于HIV感染的细胞的质膜的蛋白，或其片段或衍生物，其可在有需要的受试者中针对HIV诱导的免疫应答或产生免疫。HIV env基因编码前体蛋白gp160，其被蛋白水解切割成两个成熟的包膜糖蛋白gp120和gp41。在逆转录病毒包膜糖蛋白前体中高度保守的序列上由宿主细胞蛋白酶弗林蛋白酶介导切割反应。更具体地说，gp160三聚化为(gp160)3，然后切割为两个非共价结合的gp120和gp41。随后由gp120/gp41异二聚体的三聚体介导病毒进入。Gp120是受体结合片段，并与具有CD4受体的靶细胞(例如T-辅助细胞)上的CD4受体结合。与gp120非共价结合的Gp41是融合片段，提供了HIV进入细胞的第二步。Gp41最初被掩埋在病毒包膜中，但当gp120与CD4受体结合时，gp120会改变其构象，从而使gp41暴露出来，从而能够协助与宿主细胞的融合。Gp140是三聚体gp160(即(gp160)3)的未切割的胞外域，已被用作已切割的天然状态(病毒刺突)的替代物。
根据本发明的实施方案，“HIV包膜蛋白”可为gp160、gp140、gp120、gp41蛋白，其组合、融合、截短或衍生物。例如，“HIV包膜蛋白”可包括与gp41蛋白非共价结合的gp120蛋白。它还可包含稳定的三聚体gp140蛋白，其可具有或可被修饰为包含使gp140三聚体稳定的三聚结构域。三聚结构域的实例包括但不限于T4次要纤维蛋白(T4-fibritin)“foldon”三聚结构域、衍生自GCN4的卷曲螺旋三聚结构域和大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶(aspartatetranscarbamoylase)的催化亚基作为三聚体标签。“HIV包膜蛋白”也可以是截短的HIV包膜蛋白，包括但不限于在胞外域(即延伸到细胞外空间的结构域)的C端截短、在gp41中截短(例如在gp41的跨膜结构域中截短)或在gp41的胞质结构域中截短的包膜蛋白。“HIV包膜蛋白”可进一步为天然存在的HIV包膜蛋白的衍生物，其具有序列突变，例如在弗林蛋白酶切割位点中的和/或所谓的SOSIP突变。
优选地，“HIV包膜蛋白”是“合成HIV包膜蛋白”。如本文所用，术语“合成HIV包膜蛋白”是指非天然存在的HIV包膜蛋白，其被优化以在有需要的受试者中针对一种或多种天然存在的HIV毒株诱导免疫应答或产生免疫。镶嵌HIV Env蛋白是合成HIV Env蛋白的实例，并且本发明提供了合成HIV Env抗原，例如，包含SEQ ID NO:8、17、18或19的那些。
如本文所用，“TCID50”是指以组织培养物感染剂量50给出的TCID50。可使用技术人员已知的各种方法来确定TCID50，例如组织培养感染剂量50(TCID50)测定法。如WO 03/053463的实施例2中所述的，TCID50测定法是一种以96孔形式用10倍稀释液来滴定改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的感染力的方法。可使用技术人员已知的多种方法来确定痘病毒(例如MVA)的感染性，例如通过基于流式细胞术的测定法或组织培养感染剂量50(TCID50)测定法。在一示例性方面，使用96孔形式的10倍稀释液，在基于TCID50的测定中进行MVA的滴定。在测定的终点，使用抗痘苗病毒抗体和适当的染色溶液观察感染的细胞。制备原代CEF细胞，并以给定密度用T瓶在含有10％血清和1％庆大霉素的RPMI中培养2-3天，在胰蛋白酶消化后用含有7％血清的RPMI以1×105细胞/mL的密度接种到96孔板中。样品的预期效价决定了连续10倍稀释的数量，其通过在一个深孔板的范围从第1列到例如第10列用100μL转移到下一个孔中实现。稀释后，96孔板的每个孔接种100μL。将细胞在34-38℃和4-6％CO2下孵育5天以允许感染和病毒复制。
感染后五天，用MVA特异性抗体对细胞染色。为了检测特异性抗体，使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗。MVA特异性抗体可为例如抗痘苗病毒抗体，兔多克隆抗体或IgG级分(德国柏林，Quartett，#9503-2057)。第二抗体可为例如抗兔IgG抗体或HRP偶联的山羊多克隆抗体(德国曼海姆，Promega，#W4011)。使用沉淀的TMB底物使二抗可视化。含颜色反应呈阳性的细胞的每个孔都标记为阳性以计算TCID50。通过使用Spearman-Kaerber计算方法来计算效价。数据也可表示为病毒效价的对数，它是任何给定时间点与T＝0时间点的相对差。
另一种定量病毒浓度的方法是通过病毒空斑测定，其根据感染剂量确定病毒浓度，这是技术人员众所周知的标准方法。简而言之，以各种稀释度的病毒感染汇合的单层宿主细胞，并用半固体培养基覆盖。当病毒感染细胞单层中的细胞时，会形成病毒空斑，并且可结合稀释因子对空斑数量进行计数，来计算每样品体积的空斑形成单位数量(pfu/mL)。pfu/mL代表样品中感染性颗粒的数量。由于测定方法和原理截然不同，TCID50和pfu/mL或其他感染性测定的结果不一定等同。对于MVA，两种方法(TCID50和病毒空斑测定)均可使用，通常以pfu或TCID50给出用于临床对人给药的MVA载体剂量。腺病毒载体的剂量也可用pfu或TCID50给出。对于对人给药，通常以病毒颗粒(vp)给出腺病毒载体的剂量，并用vp/mL表示浓度。
合成HIV包膜蛋白及其编码序列
本发明的实施方案涉及新型痘病毒载体，优选MVA载体，其包含编码合成HIV包膜蛋白的核酸序列，并且优选包含编码额外的HIV抗原的核酸序列。
在一实施方案中，合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或包含具有一个或多个以下突变的SEQ ID NO:8的氨基酸序列：(i)I529P，(ii)K480E，以及(iii)EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的组合。SEQ ID NO:8包含合成的成熟gp120和合成的截短的gp41，其既无跨膜区也无胞质结构域。SEQ ID NO:8是由来自mos2Env镶嵌抗原的序列(SEQ ID NO:6)和额外的HIV包膜蛋白序列的嵌合体组成的非天然存在的序列。包含SEQID NO:8的合成Env抗原序列经优化以提供广谱的覆盖范围和针对HIV进化支C的增强的T细胞应答(与mos2Env抗原(SEQ ID NO:6)相比)。在某些实施方案中，可将其他氨基酸添加至本文定义的SEQ ID NO:8或其变体之一。
在某些实施方案中，合成HIV包膜蛋白还包含信号序列。合成HIV包膜蛋白在合成时具有信号序列，所述信号序列在其进入内质网(ER)内腔的过程中会从新生的多肽链上切割下来。原则上，可使用任何已知的信号序列。优选地，使用HIV Env信号序列或其变体。对于HIV Env蛋白来说，本领域已使用了不同的信号序列(参见例如WO 2014/107744)。在某些实施方案中，所述信号序列包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。在一优选的实施方案中，所述信号序列包含SEQ ID NO:9。
在某些实施方案中，合成HIV包膜蛋白还包含跨膜结构域。跨膜结构域将所述合成HIV包膜蛋白锚定到ER膜上，并有助于HIV包膜的膜组装和功能。优选地，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:13。
在另一实施方案中，合成HIV包膜蛋白包含具有截短的胞质结构域的gp41。所述gp41在其羧基末端具有异常长的胞质结构域，通常约150个氨基酸(Edwards et al.,J.Virology,2002,76:2683-2691)。据报道，胞质结构域的截短诱导HIV-1Env蛋白(同上)的胞外域中保守区的暴露。本发明的合成HIV包膜的截短胞质结构域的范围可为1至约140个氨基酸，例如全长胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130或140个氨基酸。在某些实施方案中，通过在给定氨基酸之后直至C末端的截短，所述截短的胞质结构域衍生自SEQ ID NO:17的氨基酸704-862(即，本发明的C4分子的胞质结构域)。在一优选实施方案中，合成HIV包膜蛋白包含截短的胞质结构域，所述截短的胞质结构域具有HIV gp41胞质结构域的1至10个氨基酸残基，更优选4至8个氨基酸残基，最优选7个氨基酸残基。合成HIV包膜蛋白的胞质结构域或其片段位于胞外结构域(胞外域)的C端，当所述合成HIV包膜蛋白还包含跨膜结构域时，胞质结构域或其片段位于跨膜结构域的C端。参见例如，图1A和图1C。在一特定实施方案中，合成HIV包膜蛋白包含具有截短的胞质结构域的gp41，所述截短的胞质结构域具有SEQ ID NO:14或其片段的氨基酸序列，例如其残基1-4(即NRVR)。已经描述了并可使用其他截短的胞质结构域(例如，Schiernle etal.,PNAS 1997；Abrahamyan et al.,J Virol 2005)。
在某些实施方案中，其中合成HIV包膜蛋白进一步包含跨膜结构域以及胞质结构域的片段，优选地，该蛋白还包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，其包含SEQ ID NO:18的残基655-682，其中SEQ ID NO:37的氨基酸序列与SEQ ID NO:8的C末端和跨膜结构域的N末端融合。
在本发明的一特别优选的实施方案中，合成HIV包膜蛋白进一步包含跨膜结构域，例如具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，以及截短的胞质结构域或胞质结构域的片段，例如具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列或SEQ ID NO:14的残基1-4(即NRVR)。最优选地，合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或由其组成，具有或不具有信号序列(即，SEQ IDNO:18的第1-29位氨基酸残基)。
在另一实施方案中，合成HIV包膜蛋白包含代替Env跨膜区的三聚结构域。三聚结构域增加了Env三聚体结构的稳定性。优选地，合成HIV包膜蛋白包含gp140多肽，所述gp140多肽经修饰以包括使gp140三聚体稳定的三聚结构域。三聚化结构域的实例包括但不限于T4次要纤维蛋白“foldon”三聚化结构域，例如包含SEQ ID NO:16氨基酸序列的三聚化结构域；衍生自GCN4的卷曲螺旋三聚结构域，例如包含SEQ ID NO:15氨基酸序列的结构域；大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶的催化亚基作为三聚体标签；或基于Matrillin的三聚体基序。如果存在，则三聚化结构域通常位于胞外结构域的C末端(参见图1B)。在某些优选实施方案中，其中合成HIV包膜蛋白包含三聚化结构域，所述合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，其具有或不具有信号序列(即，SEQ ID NO:19的第1-29位氨基酸残基)。具有三聚化结构域的这些实施方案主要有利于合成HIV包膜蛋白的可溶性胞外域变体。在本发明的此类可溶性变体的某些实施方案中，可使弗林蛋白酶切割位点突变(例如，在SEQ ID NO:8的第480位将Lys突变为Glu)以使该切割位点失活，从而使该蛋白为单链；这与三聚化结构域很好地结合，尤其是与SEQ ID NO:19的GCN4三聚化结构域很好地结合。
本发明的实施方案也包括不使用三聚化结构域的合成HIV包膜蛋白的此类可溶性胞外域变体的替代形式，并且可由SEQ ID NO:8制备，通过组合优化弗林蛋白酶切割位点的突变(例如，用四个Arg残基替换第479-480位的Gly-Lys二肽)，以及所谓的SOSIP突变(例如，在第529位的I至P突变，并通过将SEQ ID NO:8的第471位和第575位的Ala和Thr均替换为Cys残基而在这两个位置之间引入二硫键)。这产生具有SEQ ID NO:8氨基酸序列的蛋白，其具有以下突变组合：EK479-480RRRR、I529P，A471C和T575C。
进一步增加本发明的合成HIV包膜蛋白(包含SEQ ID NO:8)的三聚体含量，一种可能的修饰是将第529位的Ile修饰为Pro。这种修饰对于可溶性和膜结合变体均有效。
载体
在一总的方面，本发明涉及载体，其包含编码合成HIV包膜蛋白的核酸序列，并且优选地包含编码至少一种额外的HIV抗原的核酸序列。根据本发明的实施方案，所述载体可包含本文所述的任何合成HIV包膜蛋白。在本发明的一具体实施方案中，所述载体是痘病毒载体，优选为MVA载体，其包含编码合成HIV包膜蛋白的核酸序列，所述合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，更优选地包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:18的氨基酸残基30-711。
根据本发明的实施方案，编码合成HIV包膜蛋白的核酸序列与启动子可操作地连接，意味着所述核酸在启动子的控制下。启动子可为同源启动子(即，与载体来自相同的遗传来源)或异源启动子(即，来自不同的载体或遗传来源)。腺病毒载体的合适启动子的非限制性实例包括巨细胞病毒(CMV)启动子和Rous肉瘤病毒(RSV)启动子。优选地，启动子在表达盒内位于所述核酸的上游。可以与编码合成HIV包膜蛋白的核酸序列可操作地连接的示例性CMV启动子序列示于SEQ ID NO:24。
痘病毒载体的合适启动子的非限制性例子包括30K启动子、I3启动子、PrS启动子、PrS5E启动子、Pr7.5K、Pr13.5长启动子、PrHyb启动子、40K启动子、MVA-40K启动子、FPV 40K启动子、30k启动子、PrSynIIm启动子和PrLE1启动子。在WO 2010/060632、WO 2010/102822、WO 2013/189611和WO 2014/063832中进一步描述了另外的启动子，将其全部引入本文作为参考。在更优选的实施方案中，当作为根据本发明的痘病毒载体的一部分纳入时，HIV抗原可操作地与Pr13.5long启动子(SEQ ID NO:42)和/或PrHyb启动子(SEQ ID NO:43)连接。
根据本发明的实施方案，载体可为表达载体。表达载体包括但不限于用于重组蛋白表达的载体和用于将核酸递送到受试者体内以在受试者的组织中表达的载体，例如病毒载体。适用于本发明的病毒载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、痘病毒载体、MVA载体、肠病毒载体、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitisvirus)载体、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)载体、烟草花叶病毒载体、慢病毒载体等。载体也可为非病毒载体。非病毒载体的实例包括但不限于质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体等。
在本发明的某些实施方案中，所述载体为腺病毒载体。本发明的腺病毒属于腺病毒科，并且优选地是属于哺乳类腺病毒属(Mastadenovirus)的病毒。它可为人腺病毒，也可为感染其他物种的腺病毒，包括但不限于牛腺病毒(例如牛腺病毒3，BAdV3)、犬腺病毒(例如CAdV2)、猪腺病毒(例如PAdV3或5)。或猿猴腺病毒(包括猴腺病毒和猿腺病毒，例如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒)。优选地，所述腺病毒是人腺病毒(HAdV或AdHu)，或猿猴腺病毒，例如黑猩猩或大猩猩腺病毒(ChAd、AdCh或SAdV)或恒河猴腺病毒(RhAd)。在本发明中，当被称为Ad而没有指明物种的情况下是指人腺病毒，例如缩写符号“Ad26”是指与HAdV26相同，后者是人腺病毒血清型26。同样，如本文所用，符号“rAd”是指重组腺病毒，例如“rAd26”是指重组人腺病毒26。
已经使用人腺病毒进行了大多数先进的研究，并且根据本发明的某些方面，优选人腺病毒。在某些优选的实施方案中，本发明的重组腺病毒基于人腺病毒。在优选的实施方案中，所述重组腺病毒基于人腺病毒血清型5、11、26、34、35、48、49、50、52等。根据本发明的一特别优选的实施方案，所述腺病毒为人腺病毒血清型26。这些血清型的优点包括在人群中具有较低的血清阳性率和/或较低的预存中和抗体效价，并且具有在临床试验中用于人类受试者的经验。
猿猴腺病毒在人群中通常也具有较低的血清阳性率和/或较低预存中和抗体效价，并且已经报道了使用黑猩猩腺病毒载体的大量工作(例如US6083716；WO 2005/071093；WO 2010/086189；WO 2010085984；Farina et al,2001,J Virol 75:11603-13；Cohen etal,2002,J Gen Virol 83:151-55；Kobinger et al,2006,Virology 346:394-401；Tatsiset al.,2007,Molecular Therapy 15:608-17；参见综述Bangari and Mittal,2006,Vaccine 24:849-62；与综述Lasaro and Ertl,2009,Mol Ther 17:1333-39)。因此，在其他实施方案中，根据本发明的重组腺病毒基于猿猴腺病毒，例如黑猩猩腺病毒。在某些实施方案中，所述重组腺病毒基于：1、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50或SA7P型猿猴腺病毒。
优选地，所述腺病毒载体是复制缺陷型重组病毒载体，例如rAd26、rAd35、rAd48、rAd5HVR48等。
在本发明的一优选实施方案中，所述腺病毒载体包含来自罕见血清型(包括Ad26)的衣壳蛋白。在典型的实施方案中，载体是rAd26病毒。“腺病毒衣壳蛋白”是指腺病毒衣壳上的蛋白(例如，Ad26、Ad35、rAd48、rAd5HVR48载体)，其参与决定特定腺病毒的血清型和/或嗜性。腺病毒衣壳蛋白通常包括纤维蛋白、五邻体和/或六邻体蛋白。如本文所用，用于特定腺病毒的“衣壳蛋白”，例如“Ad26衣壳蛋白”可为例如包括Ad26衣壳蛋白的至少一部分的嵌合衣壳蛋白。在某些实施方案中，所述衣壳蛋白是Ad26的完整衣壳蛋白。在某些实施方案中，所述六邻体、五邻体和纤维蛋白是Ad26的。
本领域普通技术人员将认识到，可将源自多种血清型的元件组合在单个重组腺病毒载体中。因此，可产生结合了来自不同血清型的期望特性的嵌合腺病毒。因此，在一些实施方案中，本发明的嵌合腺病毒可将第一血清型的无预存免疫与诸如以下的特征相组合：温度稳定性、装配、锚定、产量、重定向或改善的感染、DNA在靶细胞中的稳定性等。
在某些实施方案中，可用于本发明的重组腺病毒载体主要或完全衍生自Ad26(即，载体是rAd26)。在一些实施方案中，腺病毒是复制缺陷的，例如由于腺病毒在基因组的E1区域中包含缺失。对于衍生自非C组腺病毒的腺病毒，例如Ad26或Ad35，通常将腺病毒的E4-orf6编码序列换为人亚组C的腺病毒(例如Ad5)的E4-orf6。这使得这类腺病毒在众所周知的表达Ad5的E1基因的互补细胞系中繁殖，例如293细胞，PER.C6细胞等(参见，例如，Havenga,et al.,2006,J Gen Virol 87:2135-43；WO 03/104467)。然而，这类腺病毒将不能在不表达Ad5的E1基因的非互补细胞中复制。
重组腺病毒载体的制备是本领域众所周知的。rAd26载体的制备于以下中有描述：例如WO 2007/104792和Abbink et al.,(2007)Virol 81(9):4654-63。Ad26的示例性基因组序列在GenBank登记号EF 153474和WO 2007/104792的SEQ ID NO:1中找到。可用于本发明的载体的实例例如包括在WO2012/082918中描述的载体，其公开内容整体援引加入本文。
通常，使用包含整个重组腺病毒基因组的核酸(例如，质粒、粘粒或杆状病毒载体)生产可用于本发明的载体。因此，本发明还提供了编码本发明的腺病毒载体的分离的核酸分子。本发明的核酸分子可为RNA的形式，也可以是通过克隆获得或合成产生的DNA的形式。DNA可为双链或单链。
可用于本发明的腺病毒载体通常是复制缺陷的。在这些实施方案中，通过缺失或灭活对于病毒复制至关重要的区域，例如E1区域，使病毒复制缺陷。例如，可通过在此区域插入目的基因，基本上删除或失活该区域，目的基因例如，编码合成HIV包膜蛋白的基因(通常连接至启动子)或编码HIV抗原多肽的基因(通常连接至启动子)。在一些实施方案中，本发明的载体可在其他区域(例如E2、E3或E4区域)中含有缺失，或在这些区域中的一个或多个内含有连接至启动子的异源基因的插入。对于E2和/或E4突变的腺病毒，通常使用E2和/或E4互补细胞系产生重组腺病毒。腺病毒E3区的突变不需要细胞系的补充，因为复制不需要E3。
包装细胞系通常用于产生足够量的用于本发明的腺病毒载体。包装细胞是包含已在复制缺陷型载体中缺失或失活的那些基因的细胞，从而使病毒在细胞中复制。用于在E1区域中缺失的腺病毒的合适包装细胞系包括，例如，PER.C6、911、293和E1A549。
在本发明的一优选的实施方案中，载体是腺病毒载体，更优选是rAd26载体，最优选是在腺病毒基因组的E1区域具有至少一个缺失的rAd26载体，例如在Abbink,J Virol,2007.81(9):p.4654-63中描述的，其内容援引加入本文。通常，将编码合成HIV包膜蛋白和/或额外的HIV抗原的核酸序列克隆到腺病毒基因组的E1和/或E3区域中。
在本发明的优选方面，编码本文所述的合成HIV抗原的载体是痘病毒载体。在特别优选的方面，所述载体是改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)载体。在另外的优选实施方案中，所述MVA病毒载体是MVA-BN或其衍生物。
MVA是通过将皮肤痘苗株安卡拉(Chorioallantois痘苗病毒安卡拉病毒，CVA；其综述参见Mayr et al.(1975)Infection 3,6-14)在鸡胚成纤维细胞上连续570多次传代而产生的，其在土耳其安卡拉的疫苗接种研究所保持了多年，并被用作人类疫苗接种的基础。减毒的CVA病毒MVA(改良型痘苗病毒安卡拉)是通过将CVA在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续繁殖(超过570代)而获得的。
然而，由于通常与痘苗病毒相关的严重的疫苗接种后并发症，人们进行了数种尝试以产生更减毒、更安全的疫苗。由于使用了传代来减弱MVA，因此存在许多不同的毒株或分离株，具体取决于在CEF细胞中进行传代的次数。已经(例如，由Bavarian Nordic)开发出具有增强的安全性的MVA毒株，用于开发更安全的产品，例如疫苗或药物。MVA由BavarianNordic进一步传代并命名为MVA-BN。MVA-BN的代表性样品于2000年8月30日保藏在欧洲细胞保藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)，保藏号为V00083008。在WO02/42480(也参见例如美国专利号6,761,893和6,913,752以及US 2003/0206926)和WO 03/048184(US 2006/0159699)中进一步描述了MVA-BN，其内容整体援引加入本文。与祖先的CVA病毒相比，MVA和MVA-BN缺少基因组的约15％(来自六个区域31 kb)。此类缺失影响许多毒力和宿主范围基因，以及A型包涵体的基因。
在各种实施方案中，MVA或用于产生适于本发明的重组体的MVA是MVA-572、MVA-575、MVA-I721、保藏为
Figure BDA0002383315010000211
的MVA、保藏为
Figure BDA0002383315010000212
的MVA、ACAM3000 MVA、MVA-BN或任何类似的减毒MVA毒株。在优选的实施方案中，用于产生重组体的MVA为MVA-575、保藏为
Figure BDA0002383315010000213
的MVA、保藏为
Figure BDA0002383315010000214
的MVA、ACAM3000 MVA和MVA-BN。更优选地，用于产生重组体的MVA是MVA-BN。
MVA-572于1994年1月27日保藏在欧洲动物细胞保藏中心(ECACC，疫苗研究和生产实验室，公共卫生实验室服务，应用微生物学和研究中心，波顿唐，威尔特郡SP4 0JG，英国)，保藏号为ECACC V94012707。MVA-575于2000年12月7日保藏在ECACC V00120707下。Acam3000 MVA于2003年3月27日保藏在美国国家典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)，保藏号为PTA-5095(美国国家典型培养物保藏中心，10801大学道，马纳萨斯，弗吉尼亚州20110-2209，美国)。MVA-I721保藏于巴斯德研究所的法国微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganisms)，保藏号为CNCMI721。MVA-BN于2000年8月30日保藏于ECACC，保藏号为V00083008。MVA-BN已在WO 02/042480中描述。
本发明还包括本文所述的任何MVA病毒或MVA-BN的衍生物或变体。MVA或MVA-BN的“衍生物”或“变体”是指这样的MVA或MVA-BN病毒，其表现出与其所指的MVA或MVA-BN基本上相同的复制特性，但在其基因组的一个或多个部分表现出差异。具有与保藏病毒相同的“复制特性”的病毒是这样的病毒，其在CEF细胞和以下细胞系中以与保藏毒株相似的扩增率复制的病毒：HaCat细胞系(Boukamp et al.(1988),J Cell Biol 106:761-771)、人骨肉瘤细胞系143B(ECACC编号91112502)、人胚胎肾细胞系293(ECACC编号85120602)和人宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCC编号CCL-2)。确定MVA、其衍生物和变体的这些性质的测试和测定是技术人员众所周知的，例如WO 02/42480中所述的细胞系容许性测定法(cell linepermissivity assay)。在示例性细胞系容许性测定中，用亲代和衍生或变体MVA病毒以较低的每细胞感染复数，即每细胞0.05个感染单位(5×104TCID50)感染哺乳动物细胞系。吸附1小时后，除去病毒接种物，并将细胞洗涤3次以除去任何残留的未被吸附的病毒。添加补充有3％FCS的新鲜培养基，并将感染物放置总共4天(在37℃，5％CO2下)，可从中制备病毒提取物。通过将平板在-80℃下冷冻3次来停止感染。随后使用本领域技术人员众所周知的方法，例如在Carroll and Moss(1997),Virology 238,198-211中描述的那些方法，在CEF细胞上测定病毒的增殖和细胞病变效应(CPE)。
更具体地，MVA-BN或MVA-BN的衍生物或变体优选地在鸡胚成纤维细胞(CEF)中具有繁殖复制的能力，但在以下中无繁殖复制的能力：人角质形成细胞系HaCat(Boukamp etal(1988),J.Cell Biol.106:761-771)、人骨肉瘤细胞系143B(ECACC保藏号91112502)、人胚胎肾细胞系293(ECACC保藏号85120602)和人宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCC保藏号CCL-2)。另外，在Hela细胞和HaCaT细胞系中，MVA-BN的衍生物或变体的病毒扩增率比MVA-575小至少两倍，更优选小三倍。在WO 02/42480中或如上所述的示例性细胞系容许性测定法中描述了MVA变体的这些性质的测试和测定法。
术语“不能够繁殖复制”或“无繁殖复制能力”，例如，在WO 02/42480中描述的，其还教导了如何获得具有如上所述的所需特性的MVA。该术语适用于使用如WO 02/42480或美国专利号6,761,893中所述的测定法，在感染后4天病毒扩增率小于1的病毒。
术语“未能繁殖复制”是指在感染后4天病毒扩增率小于1的病毒。WO 02/42480或美国专利号6,761,893中描述的测定可用于确定病毒扩增率。
病毒的扩增或复制通常表示为从受感染细胞产生的病毒(输出)与最初用于感染细胞的量(输入)之比，称为“扩增率”。“扩增率为“1”定义了一种扩增状态，其中从被感染细胞产生的病毒数量与最初用于感染细胞的数量相同，这意味着被感染细胞容许病毒感染和繁殖。相反，小于1的扩增率，即，与输入水平相比，输出降低，表明繁殖复制的缺乏以及因此病毒的减弱。
本文提供的重组痘病毒载体可通过本领域已知的常规方法产生。获得重组痘病毒或将外源编码序列插入痘病毒基因组的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，在Molecular Cloning,A laboratory Manual(2nd Ed.)[J.Sambrook et al.,Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)])中描述了用于标准分子生物学技术的方法，例如DNA的克隆、DNA和RNA的分离、蛋白质印迹分析、RT-PCR和PCR扩增技术，处理和操纵病毒的技术在Virology Methods Manual[B.W.J.Mahy et al.(eds.),Academic Press(1996)]中有所描述。类似地，在以下文献中描述了用于MVA的处理、操纵和基因工程的技术和专门知识(know-how)，Molecular Virology:A Practical Approach[A.J.Davison&R.M.Elliott(Eds.)，The Practical Approach Series,IRL Press at Oxford University Press,Oxford,UK(1993)(参见例如，Chapter 9:Expression of genes by Vaccinia virusvectors)]以及Current Protocols in Molecular Biology[John Wiley&Son,Inc.(1998)(参见例如，Chapter 16,Section IV:Expression of proteins in mammalian cellsusing vaccinia viral vector)]。
可应用不同的方法生成本文公开的各种重组痘病毒。可将打算插入病毒中的DNA序列放入大肠杆菌质粒构建体中，所述大肠杆菌质粒构建体中已插入与痘病毒DNA片段同源的DNA。另外，可将待插入的DNA序列连接至启动子。可将启动子-基因连接在质粒构建体中的定位使得启动子-基因连接两端侧翼的DNA均与痘病毒DNA中含非必需基因座的区域侧翼的DNA序列同源。可通过在大肠杆菌中扩繁而扩增并分离所得质粒构建体。可将分离的质粒转染到例如鸡胚成纤维细胞(CEF)的细胞培养物中，同时用痘病毒感染培养物，所述分离的质粒含有要插入的DNA基因序列。质粒中的同源痘病毒DNA与病毒基因组之间的重组分别可产生经外源DNA序列修饰的痘病毒。
根据优选的实施方案，可用痘病毒感染合适的细胞培养物的细胞，例如CEF细胞。随后可用包含外源或异源基因(例如一种或多种本发明提供的编码HIV抗原的核酸)的第一质粒载体转染被感染的细胞；优选在痘病毒表达控制元件的转录控制下。如上所述，质粒载体还包含能够指导将外源序列插入痘病毒基因组的选定部分中的序列。任选地，所述质粒载体还包含盒(cassette)，其包含与痘病毒启动子可操作地连接的标记和/或选择基因。合适的标记或选择基因为例如编码绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、新霉素-磷酸核糖基转移酶(neomycin-phosphoribosyltransferase)或其他标记的基因。选择盒或标记盒的使用简化了所产生的重组痘病毒的鉴定和分离。然而，也可通过PCR技术鉴定重组痘病毒。随后，可用如上所述获得的重组痘病毒感染另一细胞，并用包含第二种或多种外源或异源基因的第二载体转染。在此情况下，应将该基因引入痘病毒基因组的不同插入位点，并且第二载体在痘病毒同源序列上也有所不同，该序列指导第二种或多种外源基因整合到痘病毒基因组中。发生同源重组后，可分离出包含两个或多个外源或异源基因的重组病毒。为了将其他外源基因引入重组病毒中，通过使用先前步骤中分离的重组病毒感染和包含额外的一个或多个外源基因的其他载体转染，可重复感染和转染的步骤。
或者，如上所述的感染和转染步骤是可互换的，即，合适的细胞可首先被包含外源基因的质粒载体转染，然后被痘病毒感染。作为另一替代方案，也可将每个外源基因引入不同的病毒，用获得的所有重组病毒共同感染细胞，并筛选包括所有外源基因的重组体。第三种选择是在体外连接DNA基因组和外来序列，并使用辅助病毒重建重组痘苗病毒DNA基因组。第四种选择是在大肠杆菌或另一细菌物种中克隆的痘病毒基因组(作为细菌人工染色体(BAC))与线性外源序列之间的同源重组，所述线性外源序列侧翼的DNA序列与痘苗病毒基因组中的目标整合位点侧翼的序列同源。
可将根据本发明的实施方案的编码至少一种HIV抗原的一种或多种核酸序列插入痘病毒或痘病毒载体的任何合适的部分。在一优选的方面，用于本发明的痘病毒包括MVA病毒。可插入本发明的一种或多种核酸的MVA病毒的合适部分包括MVA病毒的非必需部分。
对于MVA病毒，MVA基因组的非必需部分可为MVA基因组的基因间区域或已知的缺失位点1-6。替代地或附加地，重组MVA的非必需部分可为MVA基因组的对于病毒生长非必需的编码区。然而，插入位点不限于MVA基因组中的这些优选的插入位点，因为在本发明的范围之内，如本文所述的抗原和核酸以及任何伴随的启动子可在病毒基因组中的任何位置插入，只要可以获得能够在至少一种细胞培养系统(例如鸡胚成纤维细胞(CEF细胞))中扩增和繁殖的重组体即可。
优选地，将本发明的核酸插入MVA的一个或多个基因间区域(IGR)。术语“基因间区域”和“IGR”优选是指位于MVA基因组的两个相邻的开放阅读框(ORF)之间的病毒基因组部分，优选地在MVA病毒基因组的两个必需ORF之间的那些部分。对于MVA，在某些实施方案中，IGR选自IGR 07/08、IGR 44/45、IGR 64/65、IGR 88/89、IGR 136/137和IGR 148/149。在更优选的实施方案中，将本发明的核酸插入IGR 44/45和IGR 88/89区域。
根据本发明的实施方案，并且如上所述，本文所述的任何合成HIV包膜蛋白和/或HIV抗原均可在本发明的载体中表达。考虑到遗传密码的简并性，技术人员充分意识到，根据本领域完全常规的方法，可设计几个编码相同蛋白质的核酸序列。可任选地对编码合成HIV包膜蛋白和/或HIV抗原的核酸进行密码子优化，以确保在治疗的宿主(例如人)中正确表达。密码子优化是本领域中广泛应用的技术。SEQ ID NO:26(在实施例中用于腺病毒载体中)和41(在实施例中用于MVA载体中)提供了编码本发明的合成HIV包膜蛋白的序列的一些非限制性实例；SEQ ID NO:20-22(用于实施例中的腺病毒载体)和38-40(用于实施例中的MVA载体)中提供了编码本发明中使用的额外的HIV抗原的序列的一些非限制性实例。
本发明还提供了细胞，优选分离的细胞，其包含本文所述的任何载体。所述细胞可用于重组蛋白生产或病毒颗粒的生产。
本发明还公开了一种制备合成HIV抗原多肽的方法。所述方法包括用表达载体转染宿主细胞，在适合于表达合成HIV抗原多肽的条件下培养转染的细胞，并从细胞中分离合成HIV抗原多肽，所述表达载体包含与启动子可操作连接的编码合成HIV抗原多肽的核酸。可通过本领域已知的任何方法，包括亲和色谱法等，从细胞中分离或收集合成HIV抗原多肽。鉴于本发明，用于重组蛋白表达的技术是本领域普通技术人员众所周知的。
本发明还涉及用于制备编码本发明的合成HIV抗原多肽的载体的方法，该方法包括培养包含所述载体的细胞，以在所述培养过程中繁殖和扩增所述载体，以及从细胞培养物(例如从细胞、培养基或者细胞和培养基)中分离编码本发明的合成HIV抗原多肽的载体。可根据本领域已知的方法进一步纯化载体。
在某些实施方案中，本发明提供了痘病毒载体，优选为MVA载体，例如MVA-BN载体，其包含编码合成HIV抗原的核酸序列。所述痘病毒载体包含编码根据本发明的合成HIV包膜(Env)抗原的核酸序列，例如包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的核酸序列，并且任选地还包含编码至少一种额外的HIV抗原的核酸序列。在优选的实施方案中，痘病毒载体，更优选地，MVA载体，包含编码第一HIV Env抗原的核酸序列，所述第一HIV抗原是合成HIV Env抗原，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列以及至少一种额外的HIV抗原，例如Gag、Pol和/或Env抗原，优选一种或多种额外的HIV抗原，其包含选自SEQ ID NO:1-5、28和29的氨基酸序列。
例如，在特定的实施方案中，痘病毒载体可包含编码第一HIV Env抗原的核酸，所述第一HIV Env抗原包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；不同于第一HIV Env抗原的第二HIVEnv抗原；为两种不同HIV Gag抗原的第三抗原和第四抗原；为两种不同HIV Pol抗原的第五抗原和第六抗原。可将Gag和Pol抗原融合为第一Gag-Pol融合抗原和第二Gag-Pol融合抗原，例如包含氨基酸序列SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的那些Gag-Pol融合抗原。
在某些示例性实施方案中，痘病毒载体包含编码选自SEQ ID NO:1-5、18、28和29的一个或多个氨基酸序列的核酸。在一个或多个具体实施方案中，痘病毒载体包含这样的核酸：其编码SEQ ID NO:1-5和18的氨基酸序列，更优选地编码SEQ ID NO:5、18、28和29的氨基酸序列。
在其他某些示例性实施方案中，载体是腺病毒载体，其包含选自SEQ ID NO:25、26和27，优选SEQ ID NO:26的核酸序列。其他示例性实施方案包括编码额外的HIV抗原的腺病毒载体，此类腺病毒载体包含一种或多种选自SEQ ID NO:20、21和22的核酸序列。在其他某些实施方案中，载体是痘病毒载体，优选为MVA载体，更优选为MVA-BN，所述载体包含一种或多种选自SEQ ID NO:38、39、40和41的核酸序列。在一个或多个具体实施方案中，所述痘病毒载体包含SEQ ID NO:38、39、40和41。
如本文所述，可将编码一种或多种HIV抗原的核酸序列插入痘病毒载体基因组的任何合适的插入位点。在特定的实施方案中，其中痘病毒载体是MVA载体，例如MVA-BN或其衍生物，其编码一种或多种Gag-Pol融合抗原，可将编码第一Gag-Pol融合抗原的核酸序列插入MVA基因组的基因间区域(IGR)44/45中，并且可将编码第二Gag-Pol融合抗原的核酸序列插入MVA基因组的IGR 88/89中。此外，可将编码HIV Env抗原的核酸序列插入MVA基因组的IGR 44/45和/或IGR 88/89。在一个或多个具体实施方案中，痘病毒载体包含编码以下的核酸序列：包含SEQ ID NO:28的Gag-Pol融合抗原，MVA基因组的IGR 44/45中的包含SEQ IDNO:5的HIV Env抗原和/或包含SEQ ID NO:29的Gag-Pol融合抗原以及MVA基因组的IGR 88/89中的包含SEQ ID NO:18的HIV Env抗原。优选地，Gag-Pol融合抗原各自由单独的启动子控制，优选Pr13.5启动子，如SEQ ID NO:42所示，和/或Env抗原各自由单独的启动子控制，优选PrHyb启动子，如SEQ ID NO:43所示。
组合物
在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含载体(vector)和载剂(carrier)，所述载体包含编码合成HIV包膜蛋白的核酸。优选地，该组合物是疫苗组合物，下面对其进行更加详细地描述。根据本发明的实施方案，本文所述的任何载体可包括在所述组合物内。优选地，所述载体为病毒载体，更优选地为腺病毒载体或痘病毒载体，甚至更优选地为腺病毒26载体或MVA载体。
在一实施方案中，本发明的组合物包含痘病毒载体，优选MVA载体，其包含编码合成HIV包膜蛋白的核酸序列，所述合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18或SEQID NO:19的氨基酸序列，更优选为SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，所述载体为MVA-BN载体或其衍生物。在一个或多个具体实施方案中，本发明的组合物包含痘病毒载体、MVA载体或MVA-BN载体，其包含编码至少一种第一HIV包膜抗原的核酸，所述第一HIV包膜抗原包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。更优选地，此载体还包含编码以下序列的核酸序列：(b)第二HIV Env抗原，其不同于第一HIV Env抗原；(c)第三抗原和第四抗原，其为两种不同HIV Gag抗原；(d)第五抗原和第六抗原，其为两种不同HIV Pol抗原。在优选的实施方案中，第二HIV Env抗原包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，第三抗原和第四抗原分别包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列；第五抗原和第六抗原分别包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在某些实施方案中，将第三抗原和第五抗原融合为包含SEQID NO:28氨基酸序列的第一Gag-Pol融合抗原，并将第四抗原和第六抗原融合为包含SEQID NO:29氨基酸序列的第二Gag-Pol融合抗原。
根据本发明的实施方案，可将包含根据本发明的痘病毒载体的组合物与一种或多种额外的载体和/或一种或多种分离的HIV抗原多肽一起使用，所述一种或多种额外的载体编码一种或多种额外的HIV抗原。所述额外的载体和/或HIV抗原多肽可存在于同一组合物或者一种或多种不同的组合物。优选地，所述一种或多种额外的载体为病毒载体，例如腺病毒载体，更优选为腺病毒26载体，或痘病毒载体，更优选为MVA载体。鉴于本发明，所述一种或多种额外的载体可编码本领域技术人员已知的任何HIV抗原。最优选地，所述一种或多种其他载体是腺病毒载体，优选腺病毒26载体，其编码一种或多种HIV抗原，所述一种或多种HIV抗原包含选自SEQ ID NO:1-5、18、28和29的氨基酸序列。
在一方面，本发明提供了一种组合疫苗，其包含一种或多种载体，所述一种或多种载体一起包含编码以下的核酸序列：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的合成HIV包膜蛋白；(b)第二HIV包膜蛋白，其优选包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(c)为两种不同HIV Gag抗原的第三抗原和第四抗原，优选分别包含SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列；(d)为两种不同HIV Pol抗原的第五抗原和第六抗原，优选分别包含SEQ ID NO:3和4的氨基酸序列。在一个或多个具体实施方案中，将第三抗原和第五抗原融合为第一Gag-Pol融合抗原，所述第一Gag-Pol融合抗原优选包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，并将第四抗原和第六抗原融合为第二Gag-Pol融合抗原，所述第二Gag-Pol融合抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。所述载体可各自在单独的组合物中，或者它们可组合在单一组合物中。意图将载体中的多种核酸给药于一个受试者，这将使获得的针对HIV的免疫应答比单独给药任一载体时更加广泛。多种核酸序列也可存在于单一载体上。
根据本发明的实施方案，所述一种或多种载体可为腺病毒载体和/或痘病毒载体，所述腺病毒载体优选腺病毒26载体，所述痘病毒载体优选MVA载体。包含腺病毒和/或痘病毒载体的组合物可任选地进一步包含一种或多种分离的HIV抗原多肽。鉴于本发明，任何分离的HIV抗原多肽都可用于本发明的组合物中。在某些优选的实施方案中，所述一种或多种分离的HIV抗原多肽包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的第30-708位残基的多肽、包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的第30-724位残基的多肽，或其组合。
在一个或多个具体实施方案中，组合物包含腺病毒载体和痘病毒载体，所述腺病毒载体优选为腺病毒26载体，其包含编码一种或多种HIV抗原的核酸，所述痘病毒载体优选为MVA载体，其包含编码一种或多种HIV抗原的核酸，优选地，所述一种或多种HIV抗原选自SEQ ID NO:1-5、18、28和29。优选地，一种或多种腺病毒载体，优选腺病毒26载体，一起编码SEQ ID NO:1-5和18；并且痘病毒载体，优选MVA载体，编码SEQ ID NO:1-5和18。所述载体可以一种组合物或者一种或多种不同的组合物存在。
根据本发明的某些实施方案，组合物(例如疫苗组合物)包含免疫原性有效量的载体，例如病毒载体。如本文所用，“免疫原性有效量”或“免疫学有效量”是指足以在有需要的受试者中诱导期望的免疫效果或免疫应答的组合物的量。在一实施方案中，免疫原性有效量是指足以在有需要的受试者中诱导免疫应答的量。在另一实施方案中，免疫原性有效量是指足以有需要的受试者中产生免疫的量，例如，提供针对疾病(例如病毒感染)的保护作用。免疫原性有效量可根据多种因素而变化，例如受试者的身体状况、年龄、体重、健康状况等；特定的应用，是诱导免疫应答还是提供保护性免疫；给药的特定重组载体；给药的重组载体编码的免疫原或抗原多肽；给药的特定抗原多肽；以及需要免疫力的特定疾病，例如病毒感染。鉴于本发明，本领域普通技术人员可以容易地确定免疫原性有效量。
作为一般指导，当参考重组病毒载体例如腺病毒载体使用时，免疫原性有效量可为例如约108个病毒颗粒至约1012个病毒颗粒，例如108、109、1010、1011或1012个病毒颗粒。在某些实施方案中，用于向人给药的单剂量腺病毒载体在109至1011个病毒颗粒之间。当参考重组病毒载体例如痘病毒载体使用时，免疫原性有效量可为例如约104至1011TCID50、105至1010TCID50、106至109TCID50或107至108TCID50，例如104、105、106、107、108、109、1010或1011TCID50。受试者的优选剂量包括105TCID50、106TCID50、107TCID50、108TCID50、109TCID50或1010TCID50，所述受试者优选人。痘病毒载体(例如MVA载体)的免疫原性有效量可以替代地和方便地以空斑形成单位(pfu)表达，并且可以例如为约105至约1011pfu，例如约105、106、107、108、109、1010或1011pfu，优选约107至109pfu，更优选约108pfu，例如约0.5×108、1×108、2×108、3×108、4×108或5×108pfu。在某些实施方案中，向人受试者给药的根据本发明的MVA载体的免疫原性有效量为约1×107至1×109pfu，优选为约1×108pfu，优选为0.1mL至1mL，例如0.5mL。
可将免疫原性有效量的载体(例如MVA载体和/或腺病毒载体)以单一组合物或以多种组合物的形式给药，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种组合物(例如，片剂、胶囊或注射剂)，其中多次胶囊或注射剂的给药共同为受试者提供免疫原性有效量。还可向受试者给药一剂量的免疫原性有效量，随后向同一受试者给药另一剂量的免疫原性有效量，即所谓的初免-加强免疫方案。如需要，方案中的加强给药可以任选地增加。初免-加强免疫方案的一般概念是疫苗领域技术人员众所周知的，并在下文中更详细地描述。
本发明的组合物可进一步包含载剂。所述载剂可包括一种或多种药学上可接受的赋形剂，例如粘合剂、崩解剂、溶胀剂、助悬剂、乳化剂、湿润剂、润滑剂、调味剂、甜味剂、防腐剂、染料、增溶剂和包衣。载剂或其他材料的确切性质可取决于给药途径，例如，肌内、皮下、口服、静脉内、皮肤、粘膜内(例如肠)、鼻内或腹膜内途径。对于液体注射制剂，例如混悬剂和溶液剂，合适的载剂和添加剂包括水、二醇、油、醇、防腐剂、着色剂等。对于固体口服制剂，例如散剂、胶囊剂、囊片、软胶囊和片剂，合适的载剂和添加剂包括淀粉、糖、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。对于鼻喷雾剂/吸入剂混合物，水溶液/悬浮液可包含水、二醇、油、润肤剂、稳定剂、湿润剂、防腐剂、芳香剂、调味剂等作为合适的载剂和添加剂。
可将本发明的组合物配制成适合于向受试者给药以促进给药和改善功效的任何物质，包括但不限于口服(肠胃)给药和肠胃外注射。肠胃外注射包括静脉内注射或输注、动脉内注射、皮下注射、肌内注射和关节内注射。还可将本发明的组合物配制成用于其他给药途径，包括经粘膜、眼、直肠、长效植入、舌下给药、舌下含服、绕过门脉循环从口腔粘膜给药、吸入或鼻内给药。
根据本发明的某些实施方案，组合物包含免疫有效量的纯化或部分纯化的载体，例如腺病毒载体(例如腺病毒26载体)或痘病毒载体(例如MVA或MVA-BN)，所述载体包含编码本发明的合成HIV包膜蛋白，并任选地包含一种或多种额外的HIV抗原的核酸。可根据本领域熟知的方法将所述组合物配制成疫苗(也称为“免疫原性组合物”)。
在本发明的某些实施方案中，组合物可进一步包含一种或多种多肽，所述多肽包含免疫有效量的分离的HIV抗原多肽。通常，当参考多肽(例如分离的抗原多肽)使用时，免疫原性有效量的范围可以是，例如约0.3至约3000微克(μg)，例如1-1000μg，例如10-500μg，例如约50或250μg。作为非限制性实例，可将一种或多种载体和分离的HIV Env多肽组合给药，例如250μg含有SEQ ID NO:7的第30-708位氨基酸的HIV进化支C Env三聚体蛋白或250μg含有SEQ ID NO:36的第30-708位氨基酸的HIV镶嵌Env三聚体蛋白，所述一种或多种载体编码本发明的合成HIV Env抗原(例如，含有SEQ ID NO:18)并任选地编码一种或多种额外的HIV抗原(例如，含有SEQ ID NO:1-5、28和/或29)。
在一些实施方案中，本发明的组合物可进一步任选地包含佐剂以增强免疫应答。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文可互换使用，并且定义为引起免疫系统的激活的一种或多种物质。在这种情况下，将佐剂用于增强免疫应答，所述免疫应答为针对载体和/或与载体组合使用的HIV抗原多肽的免疫应答，所述载体编码本发明的合成HIV包膜蛋白并任选地编码一种或多种额外的HIV抗原。
适用于本发明的佐剂应该是在人体内可能是安全的、耐受性良好和有效的佐剂，例如QS-21、Detox-PC、MPL-SE、MoGM-CSF、TiterMax-G、CRL-1005、GERBU、TERamide、PSC97B、Adjumer、PG-026、GSK-1、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax、CpG ODN、Betafectin、铝盐(例如AdjuPhos)、Adjuplex和MF59。鉴于本发明，可通过本领域技术人员众所周知的技术来确定制剂中各组分的最佳比例。
在优选的实施方案中，佐剂是铝盐，例如磷酸铝(例如AdjuPhos)。在某些实施方案中，磷酸铝优选存在于含有分离的HIV抗原多肽(例如gp140)的组合物中或与之一起给药。
免疫原性组合物的制备和使用是本领域普通技术人员众所周知的。液体药物组合物通常包括液体载剂，例如水、石油、动物油或植物油、矿物油或者合成油。生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇(例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)也可包括在内。
例如，重组腺病毒载体可存储在也用于腺病毒世界标准(Adenovirus WorldStandard)的缓冲液中(Hoganson et al.,2002,Bioprocessing J 1:43-8)：20mM Tris pH8、25mM NaCl、2.5％甘油。适用于对人给药的另一种有用的腺病毒制剂缓冲液是20mMTris、2mM MgCl2、25mM NaCl、10％w/v蔗糖、0.02％w/v聚山梨酯80。适用于重组腺病毒的另一种制剂缓冲液包含10-25mM柠檬酸盐缓冲液pH 5.9-6.2、4-6％(w/w)羟丙基-β-环糊精(HBCD)、70-100mM NaCl、0.018-0.035％(w/w)聚山梨酯80，并任选地包含0.3-0.45％(w/w)乙醇。显然，可使用许多其他缓冲剂，并且已知合适制剂的几个实例，所述合适制剂用于纯化的载体的储存和药物施用。
痘病毒载体(包括MVA和MVA-BN)的示例性制备和储存可基于制备用于抗天花的疫苗接种的痘病毒疫苗的经验，例如在Stickl,H.et al.,Dtsch.med.Wschr.99,2386-2392(1974)中描述的那些。
在一示例性的实施方案中，纯化的痘病毒在-80℃保存，以5×108TCID50/ml的效价配制于10mM Tris、140mM NaCl、pH 7.7中。为了制备疫苗注射剂，在2％蛋白胨和1％人白蛋白存在的情况下，在磷酸盐缓冲液(PBS)中将102-108个病毒颗粒冻干于安瓿瓶中，优选玻璃安瓿瓶中。或者，可通过逐步将制剂中的病毒冷冻干燥来制备疫苗注射剂。在某些实施方案中，制剂包含适用于体内给药的另外的添加剂，例如甘露醇、右旋糖酐、糖、甘氨酸、乳糖、聚乙烯吡咯烷酮或其他添加剂，例如包括但不限于抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白(例如人血清白蛋白)。然后将安瓿瓶密封，并可在合适的温度(例如4℃至室温)下保存几个月。然而，只要不需要，优选在-20℃以下的温度下保存安瓿瓶。
在涉及疫苗接种或治疗的各种实施方案中，将冻干物溶解在0.1至0.5ml的水溶液中，优选地在生理盐水或Tris缓冲液中，并全身或局部给药，即通过肠胃外、皮下、静脉内、肌内、鼻内、皮内或本领域技术人员已知的任何其他给药途径。给药方式、剂量和给药次数的优化在本领域技术人员的技术和知识范围内。
其中载体或载体组合编码包含SEQ ID NO:18和5的两种HIV抗原的实施方案的一个优点是免疫应答的广度增加(覆盖进化支B和C的毒株)。
在某些实施方案中，本发明的组合物或疫苗组合还包含在相同或其他载体上的核酸，所述核酸编码HIV抗原多肽，其包含SEQ ID NO:28(mos1GagPol)和/或SEQ ID NO:29(mos2GagPol)的氨基酸序列。
在一特定实施方案中，本发明的组合物或疫苗组合包含第一腺病毒载体并且还包含第二腺病毒载体和一种或多种额外的腺病毒载体，所述第一腺病毒载体优选腺病毒26载体，其编码包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的HIV抗原，所述第二腺病毒载体优选腺病毒26载体，其编码包含SEQ ID NO:5氨基酸序列的HIV抗原，所述一种或多种额外的腺病毒载体优选腺病毒26载体，其编码选自SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29氨基酸序列的一种或多种HIV抗原。例如，根据本发明的一实施方案的组合物或疫苗组合可包含四种腺病毒载体，优选腺病毒26载体，其中第一载体编码包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的合成HIV包膜蛋白；第二载体编码包含SEQ ID NO:5氨基酸序列的HIV抗原；第三载体编码包含SEQ ID NO:28氨基酸序列的HIV抗原；第四载体编码包含SEQ ID NO:29氨基酸序列的HIV抗原。优选地，本发明的痘病毒载体可以是含有那些腺病毒载体的疫苗组合的一部分。在优选的实施方案中，此类痘病毒载体，优选MVA载体(例如MVA-BN载体)，编码SEQ ID NO:18、5、28和29中的每一个。
在本发明特别优选的实施方案中，组合物或疫苗组合包含痘病毒载体，优选MVA载体，优选MVA-BN，其包含编码六种不同HIV抗原的核酸序列，即由以下序列编码的抗原：SEQID NO:18(mos2S Env)、SEQ ID NO:5(mos1Env)、SEQ ID NO:1(mos1Gag)、SEQ ID NO:2(mos2Gag)、SEQ ID NO:3(mos1Pol)和SEQ ID NO:4(mos2Pol)，其中可任选地将SEQ ID NO:1和3融合(SEQ ID NO:28：mos1GagPol)，并且可任选地将SEQ ID NO:2和4融合(SEQ ID NO:29：mos2GagPol)。优点在于，仅需生产、纯化、配制、测试、储存、运输和给药单一载体即可给药这六种HIV抗原。同样，已知痘病毒载体，例如MVA(包括MVA-BN)，可提供针对其中编码的抗原的良好免疫应答。此外，通常可将它们有利地与其他载体平台一起使用，例如在初免-加强免疫方案中与腺病毒(例如Ad26)载体一起使用，来产生进一步改善的免疫应答。例如，可将痘病毒载体与一种或多种腺病毒载体一起使用，所述痘病毒载体包含核酸序列，其编码由SEQ ID NO:1-5和18编码的六种不同HIV抗原，所述腺病毒载体优选腺病毒26载体，其编码由SEQ ID NO:1-5和18编码的一种或多种HIV抗原，优选其中一种或多种腺病毒载体一起编码SEQ ID NO:1-5和18。
如上所述，在一些实施方案中，所述组合物或疫苗组合还包含一种或多种分离的HIV抗原多肽。鉴于本发明，本发明的组合物或疫苗组合可进一步包括本领域技术人员已知的任何HIV抗原多肽，包括但不限于HIV包膜蛋白(例如gp160、gp140、gp120或gp41)，优选稳定的三聚体gp140蛋白，例如稳定的进化支C或进化支Agp140蛋白。在优选的实施方案中，所述分离的HIV抗原多肽是稳定的HIV进化支C三聚体gp140蛋白，例如包含SEQ ID NO:7氨基酸序列的第30-708位残基(SEQ ID NO:7的第1-29位残基在信号序列中)的蛋白。除了进化支C gp140蛋白，可以替代地或附加地使用HIV Env多肽，其可以单独使用或与进化支Cgp140蛋白一起使用，所述HIV Env多肽为镶嵌Env三聚体蛋白，例如具有如SEQ ID NO:36的30-724氨基酸所公开的氨基酸序列(对应于WO 2014/107744的SEQ ID NO:2，其中SEQ IDNO:36的第1-29位残基在信号序列中)。在某些实施方案中，所述HIV抗原多肽同时包含(i)进化支C gp140蛋白，其包含SEQ ID NO:7的第30-708位氨基酸残基，和(ii)镶嵌gp140蛋白，其包含SEQ ID NO:36的第30-724位氨基酸残基。
本发明还涉及产生本发明的组合物或疫苗组合的方法。根据本发明的实施方案，产生组合物或组合的方法包括将包含核酸的载体与载剂组合，并且任选地与一种或多种额外的载体和/或一种或多种分离的HIV抗原多肽组合，所述核酸编码本发明的合成HIV包膜蛋白，所述一种或多种额外的载体编码一种或多种额外的HIV抗原多肽。本领域普通技术人员熟悉用于制备此类组合物的常规技术。
疫苗和疫苗组合
本发明的其他的总体方面涉及疫苗和疫苗组合。在某些实施方案中，本文所述本发明的组合物是疫苗。如本文所用，术语“疫苗”是指包含免疫有效量的表达载体的组合物，其可为受试者提供保护性免疫或保护性免疫应答或者对受试者进行疫苗接种，所述表达载体优选病毒载体，其编码本发明的合成HIV包膜蛋白并任选地进一步编码一种或多种额外的HIV抗原。根据本发明的实施方案，在向受试者给药所述组合物时，所述表达载体表达编码的合成HIV包膜蛋白和任选地进一步编码的HIV抗原，并且将表达的合成HIV包膜蛋白和任选地进一步编码的HIV抗原呈递给受试者的免疫系统，从而诱导产生免疫力所需的反应或诱导免疫应答。
因此，在另一总体方面，本发明提供了一种疫苗，其用于在受试者中诱导针对人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答。根据本发明的实施方案，所述疫苗包含组合物，所述组合物包含免疫原性有效量的表达载体，所述表达载体编码包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的合成HIV包膜蛋白。优选地，所述表达载体为病毒载体，更多优选地为腺病毒载体，例如，腺病毒26载体，并且最优选地为痘病毒载体，例如，MVA或MVA-BN载体。
根据本发明的实施方案，疫苗组合物可进一步包含一种或多种额外的载体和/或一种或多种分离的HIV抗原多肽，所述一种或多种额外的载体(例如腺病毒载体，优选腺病毒26载体)编码一种或多种额外的HIV抗原多肽的病毒载体。可在疫苗中将合成HIV包膜蛋白、额外的载体和/或一种或多种分离的HIV抗原多肽配制为同一组合物或一种或多种不同的组合物。
本发明还涉及疫苗组合，其使用一种或多种载体，并任选地与分离的抗原多肽组合，用于在有需要的受试者中启动和加强对一种或多种HIV进化支的免疫应答。因此，在另一总的方面，本发明提供了疫苗组合，用于在受试者体内诱导针对HIV的免疫应答，其包括：
(a)第一疫苗组合物，其包含免疫有效量的痘病毒载体，所述痘病毒载体包含编码第一HIV Env抗原的核酸序列，并且任选地还包含编码额外的HIV抗原的核酸序列，所述额外的HIV抗原优选为包含选自SEQ ID NO:1-5、28和29氨基酸序列的一种或多种HIV抗原，所述第一HIV Env抗原包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；以及以下至少之一：
(b)(i)第二疫苗组合物，其包含免疫原性有效量的一种或多种腺病毒载体，所述一种或多种腺病毒载体编码一种或多种HIV抗原，所述一种或多种HIV抗原包含选自SEQ IDNO:1-5、18、28，和29的氨基酸序列；和
(b)(ii)第三疫苗组合物，其包含一种或多种多肽，所述一种或多种多肽包含免疫原性有效量的分离的HIV抗原多肽，其中第一组合物以及第二组合物和/或第三组合物存在于相同组合物中或者一种或多种不同的组合物中。
在其中某些实施方案中，第一疫苗组合物包含MVA载体，所述MVA载体编码第一HIVEnv抗原、第二HIV Env抗原、第三HIV Gag抗原和第四HIV Gag抗原以及第五HIV Pol抗原和第六HIV Pol抗原，所述第一HIV Env抗原包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，所述第二HIVEnv抗原包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述第三HIV Gag抗原和第四HIV Gag抗原分别包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述第五HIV Pol抗原和第六HIV Pol抗原分别包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在某些实施方案中，将SEQ ID NO:1和3的Gag和Pol抗原组合并作为包含SEQ ID NO:28的Gag-Pol融合抗原存在，和/或将SEQ IDNO:2和4的Gag和Pol抗原组合并作为包含SEQ ID NO:29的Gag-Pol融合抗原存在。
在其中某些实施方案中，所述第二疫苗组合物包含下列Ad26载体：编码包含SEQID NO:18氨基酸序列的HIV抗原的Ad26载体、编码包含SEQ ID NO:5氨基酸序列的HIV抗原的Ad26载体、编码包含SEQ ID NO:28氨基酸序列的HIV抗原的Ad26载体，以及编码包含SEQID NO:29氨基酸序列的HIV抗原的Ad26载体。
在本发明的某些实施方案中，疫苗组合包含一种或多种多肽，所述多肽包含免疫原性有效量的分离的HIV抗原多肽。优选地，分离的HIV抗原多肽包含SEQ ID NO:7氨基酸序列的第30-708位残基或SEQ ID NO:36的第30-724位残基。在某些实施方案中，两种分离的HIV抗原多肽在一种组合物中一起给药，例如，第一分离的HIV抗原多肽，其包含SEQ ID NO:7氨基酸序列的第30-708位残基，第二分离的HIV抗原多肽，其包含SEQ ID NO:36氨基酸序列的第30-724位残基。分离的抗原多肽可存在于第三组合物中或者第一组合物和/或第二组合物中。可将第一组合物或第二组合物与一种或多种分离的HIV抗原多肽一起给药，用于初免和/或加强给药，所述分离的HIV抗原多肽优选gp140。
如本文所用，术语“共同递送”、“共同给药”或“与……一起给药”是指同时给药两种或更多种组分，例如病毒表达载体和分离的抗原多肽，或多种病毒表达载体。“同时给药”可以是至少在同一天内给药两种或更多种组分。当将两种组分“一起给药”时，可将它们在短的时间内在不同的组合物中依次给药，例如在24、20、16、12、8或4小时内，或在1小时内或更短的时间内，例如基本上同时，也可同时以单一组合物的形式给药。
本发明的另一总的方面涉及一种试剂盒，其包含根据本发明的实施方案的疫苗组合。
在上文与下文的说明性示例中详细讨论了可在本发明的疫苗组合中使用的合成HIV包膜蛋白、表达载体、额外的表达载体、由表达载体编码的HIV抗原和分离的HIV抗原多肽等的其他实施方案。
诱导针对HIV感染的保护性免疫的方法
本发明还涉及一种在有需要的受试者中诱导针对一种或多种HIV进化支的免疫应答的方法。本文所述的方法包括使用一种或多种表达载体任选地与一种或多种分离的抗原多肽组合来启动和加强免疫应答的方法。
根据本发明的实施方案，当参考本文所述的方法和组合物使用时，“诱导免疫反应”包括出于预防目的提供保护性免疫和/或对受试者进行疫苗接种以抵抗感染(例如HIV感染)，以及出于治疗目的在有需要的受试者中诱导针对感染(例如HIV感染)的所需的免疫应答或效应，即治疗性疫苗接种。“诱导免疫应答”还包括提供针对病原体即HIV的治疗性免疫。通常，对于预防性疫苗接种，将组合物和疫苗给药于先前未感染过HIV的受试者，而对于治疗性疫苗接种，将组合物和疫苗给药于已感染HIV的受试者。免疫应答可为细胞免疫应答和/或体液免疫应答。
如本文所用，术语“保护性免疫”或“保护性免疫应答”是指接种的受试者能够控制疫苗接种所针对的病原体的感染。通常，已发展出“保护性免疫应答”的受试者仅出现轻度至中度的临床症状或完全没有症状。通常，对某种物质具有“保护性免疫应答”或“保护性免疫”的受试者不会因所述物质的感染而死亡。
如本文所用，术语“治疗性免疫”或“治疗性免疫应答”是指HIV感染的疫苗接种的受试者能够控制疫苗接种所针对的病原体的感染，即HIV的感染。通常，根据本发明实施方案的初免和加强疫苗组合物的给药将具有治疗目的，以在HIV感染或发展出HIV感染特征性症状后产生针对HIV的免疫应答。优选地，本发明的方法用于治疗目的，例如用于治疗性疫苗接种，其中将本文所述的组合物和疫苗给药于已感染HIV的受试者。因此，根据本文所述的本发明的方法进行治疗的患者人群优选为感染HIV的受试者，更优选为感染HIV的人类受试者。如本文所用，术语“HIV感染”和“感染HIV”是指HIV侵染人类宿主。如本文所用，“感染HIV的受试者”是指这样的受试者，HIV已侵入其中并随后在宿主体内复制和增殖，从而导致宿主感染HIV或具有HIV感染或其症状。
在一总的方面，一种在受试者中诱导针对人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答的方法，包括向受试者给药包含免疫原性有效量的表达载体，其包含编码合成HIV包膜蛋白的核酸序列，并且优选地包含编码如本文所述的额外的HIV抗原的核酸序列，所述表达载体优选痘病毒载体(例如，MVA或MVA-BN)，所述合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。本文所述的任何组合物均可用于在受试者中诱导针对HIV的免疫应答的方法。所述组合物可进一步包含一种或多种额外的载体和/或一种或多种其他分离的HIV抗原多肽，所述一种或多种额外的载体例如腺病毒，其编码相同或者一种或多种额外的HIV抗原。还可在编码HIV包膜蛋白的同一载体中编码一种或多种额外的HIV抗原，所述HIV包膜蛋白包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列。如本文所示，这特别适用于痘病毒载体，例如MVA，包括MVA-BN。
在另一总的方面，在受试者中诱导针对人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答的方法，包括向受试者给药：
(a)第一疫苗，其包含一种或多种重组腺病毒载体，其编码SEQ ID NO:1、2、3、4、5、18、28和29中的一个或多个，所述重组腺病毒载体优选Ad26载体；和
(b)第二疫苗，其包含痘病毒载体，优选为编码SEQ ID NO:18的MVA载体，并且优选进一步编码一种或多种HIV抗原，所述一种或多种HIV抗原包含选自SEQ ID NO:1-5、28和29的氨基酸序列，
其中步骤(a)和(b)以任一种顺序进行，其中一个步骤用于初免，另一个步骤用于加强免疫。
在一些实施方案中，诱导免疫应答的方法进一步包含向受试者给药一种或多种分离的HIV抗原多肽，优选地，所述一种或多种HIV抗原多肽包含：(i)多肽，其包含SEQ ID NO:7氨基酸序列的第30-708位残基，或(ii)多肽，其包含SEQ ID NO:36的第30-724位残基，或(iii)(i)和(ii)的多肽。所述一种或多种分离的HIV抗原多肽可与第一组合物和/或第二组合物存在于相同组合物中或一种或多种其他的组合物中。在一优选的实施方案中，将一种或多种分离的HIV抗原多肽与用于加强免疫的组合物大约同时给药。在某些实施方案中，所述一种或多种分离的HIV抗原多肽与加强疫苗存在于同一组合物。在其他实施方案中，所述一种或多种分离的HIV抗原多肽与加强疫苗存在于不同的组合物中。在某些实施方案中，所述分离的HIV抗原多肽在包含佐剂(例如磷酸铝)的组合物中。
在根据本发明的诱导免疫应答的方法的一特定实施方案中，第一组合物包含一种编码合成HIV包膜蛋白的腺病毒载体和编码HIV抗原的第二腺病毒载体，所述合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，所述HIV抗原包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述腺病毒载体优选腺病毒26载体；第二组合物包含痘病毒载体，并且优选进一步包含编码一种或多种HIV抗原的核酸序列，根据本发明的痘病毒载体优选MVA载体，例如MVA-BN载体，其包含编码合成HIV抗原的核酸，所述合成HIV抗原包含SEQ ID NO:18的氨基酸，所述HIV抗原包含SEQ ID NO:1-5、28和29的氨基酸序列，更优选包含SEQ ID NO:5、28和29的氨基酸序列；其中将第一组合物一次或多次给药于受试者以初免，并将第二组合物一次或多次给药于受试者以加强免疫，或其中将第一组合物一次或多次给药于受试者以加强免疫，并将第二组合物一次或多次给药于受试者以初免。在优选的实施方案中，第一组合物还包含第三腺病毒载体和第四腺病毒载体，所述第三腺病毒载体优选Ad26载体，其编码包含SEQ IDNO:28氨基酸序列的HIV抗原多肽，所述第四腺病毒载体优选Ad26载体，其编码包含SEQ IDNO:29氨基酸序列的HIV抗原多肽。
在诱导免疫应答的方法的另一特定实施方案中，第一组合物包含第一腺病毒载体和第二腺病毒载体，所述第一腺病毒载体优选腺病毒26载体，其编码包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的合成HIV包膜蛋白，所述第二腺病毒载体优选为腺病毒26载体，其编码包含SEQID NO:5氨基酸序列的HIV抗原多肽；第二组合物包含痘病毒载体，优选为MVA载体，更优选为MVA-BN，其包含编码HIV抗原的核酸序列，所述HIV抗原包含SEQ ID NO:1-5和18的氨基酸序列，更优选SEQ ID NO:5、18、28和29，及其组合；其中将第一组合物一次或多次给药于受试者以初免，并将第二组合物一次或多次给药于受试者以加强免疫，任选地与一种或多种分离的HIV抗原多肽一起；或其中将第二组合物一次或多次给药于受试者以初免，并将第一组合物一次或多次给药于受试者以加强免疫，任选地与一种或多种分离的HIV抗原多肽一起。在优选的实施方案中，第一组合物还包含第三腺病毒载体和第四腺病毒载体，所述第三腺病毒载体优选Ad26载体，其编码包含SEQ ID NO:28氨基酸序列的HIV抗原多肽，所述第四腺病毒载体优选Ad26载体，其编码包含SEQ ID NO:29氨基酸序列的HIV抗原多肽。
包含表达载体和/或抗原多肽的免疫原性组合物的给药通常是肌内、皮内或皮下的。但是，也可设想其他给药方式，例如静脉内、直肠、皮肤、口服、经鼻等。可通过使用针头注射表达载体的悬液来实现免疫原性组合物的肌肉注射，所述表达载体例如腺病毒载体和/或抗原多肽。备选为使用无针注射装置来给药组合物(使用，例如BiojectorTM)或含有疫苗的冻干粉末。
对于肌内、静脉内、皮肤或皮下注射或在患处注射，载体将为肠胃外可接受的水溶液形式，其无热原且具有合适的pH、等渗性和稳定性。同样，分离的抗原多肽将为具有合适的pH、等渗性和稳定性的肠胃外可接受溶液的形式。本领域普通技术人员能够使用例如等渗媒介物(例如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液)来制备合适的溶液。如需要，可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。也可使用缓释制剂。
通常，根据本发明实施方案的疫苗组合物的给药将具有治疗目的，以在感染或症状发展后产生针对HIV抗原的免疫应答。在其他实施方案中，可在感染或症状发展之前给药表达载体(例如腺病毒载体和/或痘病毒载体)和/或HIV抗原多肽以用于预防目的。
将包含表达载体(例如腺病毒载体和/或痘病毒载体)和/或抗原多肽的免疫原性组合物给药于受试者，在受试者体内引起抗HIV免疫应答。“免疫原有效剂量”或“免疫原性有效量”定义为足以诱导可检测的免疫应答的组合物的量。在本发明的典型实施方案中，所述免疫应答是治疗性免疫应答。
实际给药量以及给药速度和时程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗的处方，例如剂量的决定等，是全科医生和其他医生的责任，或者在兽医的背景下是兽医的责任，通常要考虑要治疗的疾病、个体患者的状况、递送位点、给药方法和从业人员已知的其他因素。上面提到的技术和方案的例子可在Remington's Pharmaceutical Sciences,16thedition,Osol,A.ed.,1980中找到。
在腺病毒载体和/或痘病毒载体(例如MVA载体)的生产以及将此类颗粒任选地配制为组合物之后，可将所述载体给药于受试者，特别是人或其他灵长类动物。非人类哺乳动物的递送不必出于治疗目的，而是可用于实验性背景，例如用来研究对于合成HIV包膜蛋白和其他HIV抗原的免疫应答机制，所述合成HIV包膜蛋白和其他HIV抗原是由本发明的腺病毒载体和/或痘病毒载体表达的。
在公开的方法的一实施方案中，使用一种或多种腺病毒载体启动免疫应答，所述一种或多种腺病毒载体编码本文公开的一种或多种HIV抗原。可将一种或多种分离的HIV抗原多肽与所述一种或多种腺病毒载体一起用于初免。在另一实施方案中，使用一种或多种痘病毒载体引发免疫应答，所述痘病毒载体编码本发明的一种或多种HIV抗原，所述痘病毒载体优选MVA或MVA-BN。可将一种或多种分离的HIV抗原多肽与一种或多种痘病毒载体一起用于初免。初免可仅给药一次，也可选择多次给药，例如，在0时间点开始初免给药，然后在首次初免给药后约1-24周进行另一次初免给药。可任选地将一种或多种分离的HIV抗原多肽与一种或多种额外的腺病毒或痘病毒载体一起用于加强免疫应答，所述一种或多种额外的腺病毒或痘病毒载体编码一种或多种额外的HIV抗原。
在初免给药后，可将本发明的一种或多种腺病毒载体或本发明的痘病毒载体用于一次或多次加强免疫。加强免疫也可一次或多次给药，例如首先在首次初免给药后约4-52周加强免疫，任选地随后再进行一次加强免疫，例如在首次初免给药后约8-100周加强给药。在某些其他实施方案中，将一种或多种本发明的腺病毒载体与一种或多种本发明的痘病毒载体一起给药，用于初免和/或加强免疫。监测由免疫诱导的免疫应答。
通常优选初免-加强免疫方案以产生较强的免疫应答。可多次给药相同的载体，称为同源初免-加强免疫。根据本发明，通常优选地应用异源初免-加强免疫方案，在这种情况下，其表明初免和加强免疫的载体是不同的。在这样的异源初免-加强免疫方案的某些实施方案中，例如，用腺病毒载体(例如Ad26)进行初免，并用痘病毒载体(例如MVA，例如MVA-BN)进行加强免疫。在这样的异源初免-加强免疫方案的其他实施方案中，例如，用痘病毒载体(例如MVA，例如MVA-BN)进行初免，用腺病毒载体(例如Ad26)进行加强免疫。任选地，在初免-加强免疫方案中，可在所述腺病毒或痘病毒载体的初免或加强免疫给药的同时给药分离的HIV抗原多肽，例如gp140。
在一示例性且非限制性的实施方案中，向受试者给药四种不同的腺病毒26种载体，其一起编码包含SEQ ID NO:5、18、28和29的HIV抗原，其中所述载体以1：1：1：1的比例存在，并在第0周和第12周通过肌肉注射给药，总剂量为5×1010的病毒颗粒0.5mL，然后在第24和48周时给药编码HIV抗原的MVA载体，以每0.5mL约108个空斑形成单位肌肉注射给药，所述HIV抗原包含SEQ ID NO:5、18、28和29。
本领域技术人员容易理解，可基于给药后测得的免疫应答来调整初免和加强免疫给药的方案。例如，通常在给药初免组合物数周或数月甚至数年后给药加强组合物。
根据本发明的实施方案，作为初免和/或加强免疫的一部分，可将佐剂与分离的HIV抗原多肽一起给药。鉴于本发明，可将任何佐剂与分离的HIV抗原多肽一起使用，并且在某些实施方案中，佐剂为铝盐，例如磷酸铝。
在本发明的一优选实施方案中，本文公开的方法中使用的腺病毒载体包括rAd26载体，本文公开的方法中使用的痘病毒载体包括MVA载体。
在一示例性的实施方案中，将编码合成HIV包膜蛋白的rAd26载体与编码具有HIV抗原的rAd26载体一起用于启动免疫应答，所述合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，所述HIV抗原包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。也可将编码一种或多种额外的HIV抗原的一种或多种额外的rAd26载体与其他rAd26载体一起给药以启动免疫应答，所述一种或多种额外的HIV抗原具有选自SEQ ID NO:1-4、28和29的氨基酸序列。在某些实施方案中，可在任何加强免疫给药之前再次初免给药。在这些实施方案中，MVA载体用于加强免疫应答，所述MVA载体编码包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的合成HIV包膜蛋白，并进一步编码SEQ IDNO:5、28和29。任选地，将分离的HIV抗原多肽与MVA载体一起给药以加强免疫应答，例如包含SEQ ID NO:7氨基酸序列的第30-708位残基的多肽，或包含SEQ ID NO:36氨基酸序列的第30-724位残基的多肽，或至少两种这样的分离的HIV抗原多肽的组合。优选地，在加强免疫中，还可将佐剂与分离的HIV抗原多肽一起给药。
在另一示例性的实施方案中，使用MVA或MVA-BN载体启动免疫应答，所述MVA或MVA-BN载体编码包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的合成HIV包膜蛋白，并进一步编码SEQ IDNO:5、28和29。在某些实施方案中，在任何加强免疫给药之前再次初免给药。初免给药后，进行一次或多次加强免疫给药，所述加强免疫包含编码合成HIV包膜蛋白的rAd26载体和编码HIV抗原的rAd26载体，所述合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，所述HIV抗原具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。优选地，将编码一种或多种额外的HIV抗原多肽的一种或多种额外的rAd26载体与其他rAd26载体一起给药以加强免疫应答，所述一种或多种额外的HIV抗原多肽具有选自SEQ ID NO:1-4、28和29的氨基酸序列。任选地，将分离的HIV抗原多肽与rAd26载体一起给药以加强免疫应答，例如包含SEQ ID NO:7氨基酸序列的第30-708位残基的多肽，或包含SEQ ID NO:36氨基酸序列的第30-724位残基的多肽，或至少两种这样的分离的HIV抗原多肽的组合。
在一特别的示例性实施方案中，通过给药四种HIV抗原来启动免疫应答，所述四种HIV抗原在腺病毒载体上编码，优选rAd26载体，所编码的四种抗原是：(i)包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的合成HIV包膜蛋白，(ii)具有SEQ ID NO:5氨基酸序列的HIV Env抗原，(iii)具有SEQ ID NO:28氨基酸序列的HIV Gag-Pol融合抗原，和(iv)具有SEQ ID NO:29氨基酸序列的HIV Gag-Pol融合抗原。这四种抗原可各自在单独的腺病毒载体上编码，优选rAd26载体，以总剂量约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10×1010病毒颗粒(vp)给药，例如以约5×1010vp(所有载体一起)给药。可将载体预混合，例如将其以1：1：1：1的比例预混合。腺病毒载体的给药优选通过肌内注射。首次初免给药后可再次初免给药。在该实施方案中，通过给药编码四种HIV抗原的MVA或MVA-BN载体来增强免疫应答，以105至1011pfu的剂量给药，例如以107pfu、108pfu、或109pfu、或以105至1010TCID50的剂量，例如以107、108或109TCID50的剂量给药，所述四种HIV抗原包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29。优选地，剂量为2×105至5×108pfu。优选地，用于人的剂量包括至少5×107pfu，例如至少1×108pfu，或替代地至少2×107TCID50、至少3×107TCID50、至少5×107TCID50，例如至少1×108TCID50，或至少2×108TCID50。首次初免给药后的任何时间均可进行MVA或MVA-BN给药以加强免疫应答。首次加强给药后可重复加强给药。根据该实施方案的MVA的所有给药可通过例如肌内或皮下途径进行。
或者，可用MVA载体初免给药，而用Ad26载体加强免疫给药，均已基本在上文表明，只是腺病毒和痘病毒载体类型的给药顺序相反。任选地，分离的gp140蛋白可与加强给药一起给药。例如，分离的Env gp140蛋白可与痘病毒载体一起给药以加强免疫，以总剂量约50-300μg蛋白给药，例如50或250微克进化支C gp140蛋白，或例如50或250微克镶嵌gp140蛋白，例如进化支C gp140蛋白与镶嵌gp140蛋白的组合50或250微克(例如以1：1的比例混合或分开给药)，所述分离的Env gp140蛋白为例如进化支C gp140蛋白(包含SEQ ID NO:7氨基酸序列的第30-708位残基)，或镶嵌gp140蛋白(包含SEQ ID NO:36氨基酸序列的第30-724位残基)，或进化支C gp140蛋白和镶嵌gp140蛋白。优选地，将gp140蛋白与佐剂一起给药，所述佐剂例如磷酸铝。
在某些实施方案中，根据本发明的诱导免疫应答的方法还包括给药潜伏病毒储库清除剂(latent viral reservoir purging agent)。HIV潜伏感染的细胞携带转录沉默的整合病毒，因此很难有效根除治疗对象体内的HIV感染。如本文所用，“储库清除剂(reservoir purging agent)”和“潜伏病毒储库清除剂(latent viral reservoirpurging agent)”是指通过重新活化HIV储库(例如通过诱导静止的HIV的表达)来减少HIV潜伏库的物质。适用于本发明的潜伏病毒储库清除剂的实例包括但不限于组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂和toll样受体(例如TLR7)调节剂，例如WO2016/007765和WO2016/177833中所述的那些，其内容整体援引加入本文。可在与本文所述的一次或多次初免和加强免疫之前、之后或共同给药潜伏病毒储库清除剂。用编码Gag、Pol和Env抗原的腺病毒26载体组合初免，随后用编码相同抗原的MVA载体加强免疫，结合TLR7刺激进行疫苗接种，在恒河猴模型研究中，抗逆转录病毒治疗中止后，这种疫苗接种显示出了改善的病毒学控制和病毒反弹延迟，证明了治疗性疫苗接种联合先天性免疫刺激在以HIV感染功能性治愈为目标中的潜力(Borducchi E.N.,et al,2016,Nature 540:284-287(doi:10/1038/nature20583))。
在本发明的某些实施方案中，可将本文所述的用于诱导免疫应答的初免和加强免疫与标准治疗(例如抗逆转录病毒治疗(ART))组合。鉴于本发明，根据本发明的初免/加强免疫治疗的受试者也可使用本领域已知的任何抗逆转录病毒药物进行ART。ART是治疗HIV的药物，尽管这些药物不能杀死或治愈该病毒。但是，当组合使用时，它们可以阻止病毒的生长。当病毒减慢时，HIV疾病也会减慢。抗逆转录病毒药物称为ARV。联合抗逆转录病毒治疗(cART)被称为高效抗逆转录病毒治疗(HAART)。本领域普通技术人员将能够确定适当的抗逆转录病毒治疗、给药频率、ART的剂量等，以便与本发明的初免/加强免疫的给药相容。
用于ART的抗逆转录病毒药物的实例包括但不限于核苷逆转录酶抑制剂(NRTI，其非限制性实例包括齐多夫定(zidovudine)、去羟肌苷(didanosine)、司他夫定(stavudine)、拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、替诺福韦(tenofovir)、双汰芝(combivir)[齐多夫定和拉米夫定的组合]、trizivir(三协唯)[齐多夫定、拉米夫定和阿巴卡韦的组合]、恩曲他滨(emtricitabine)、特鲁瓦达(truvada)[恩曲他滨和替诺福韦的组合]和epzicom[阿巴卡韦和拉米夫定的组合])、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs，非限制性实例包括奈韦拉平(nevirapine)、地拉韦啶(delavirdine)、依非韦伦(efavirenz)、依曲韦林(etravirine)和利匹韦林(rilpivirine))、蛋白酶抑制剂(PIs，其非限制性实例包括沙奎那韦(saquinavir)、茚地那韦(indinavir)、利托那韦(ritonavir)、奈非那韦(nelfinavir)、安普那韦(amprenavir)、洛匹那韦(lopinavir)/利托那韦、阿扎那韦(atazanavir)、膦沙那韦(fosamprenavir)、替拉那韦(tipranavir)、地瑞那韦(darunavir))、整合酶抑制剂(INSTIs，非限制性实例包括雷特格韦(raltegravir)、埃替格韦(elvitegravir)和度鲁特韦(dolutegravir))以及融合抑制剂、进入抑制剂和/或趋化因子受体拮抗剂(FIs，CCR5拮抗剂；非限制性实例包括恩夫韦地(enfuvirtide)、aplaviroc、马拉维若(maraviroc)、vicriviroc和cnicriviroc。
在其他实施方案中，受试者在完成本发明实施方案的初免/加强免疫后经历ART的中断(也称为中止，在本文中也可互换使用)。在一些实施方案中，受试者在完成本发明实施方案的初免加强免疫后可经历抗逆转录病毒分析治疗中断(ARV ATI)。本发明中使用的“抗逆转录病毒分析治疗中断”和“ARV ATI”是指抗逆转录病毒药物治疗的中止，以便在无持续ART的情况下，评估病毒抑制和病毒血症控制。通常，当受试者的血浆HIV RNA水平低于50拷贝/mL持续至少约52周时，受试者可经历ARV ATI(即可中止ART)，但即使受试者在此期间有一次或多次血浆HIV RNA高于50拷贝/ml至低于200拷贝/ml的跳点(blip)(即，情况)，受试者还是可以经历ARV ATI，前提是临ARV ATI前的筛查显示血浆HIV RNA小于50拷贝/ml。
根据本发明的实施方案，可在最后的加强疫苗给药后约4-20周停止ART。在某些实施方案中，对于处于基于非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)的ART的受试者，可在停止ART之前代替NNRTI给药增强的蛋白酶抑制剂约1-2周，以降低发展NNRTI抗性的风险。也可在ATI阶段给药活化剂(例如组蛋白去乙酰化酶抑制剂或TLR7调节剂)来活化任何(例如潜伏的)HIV储库，从而改善免疫应答。
可例如通过测量血浆HIV RNA水平来监测经历ARV ATI的受试者。例如，在最有可能发生反弹性病毒血症的前六周内，在开始ARV ATI后每周最多可进行两次监测。“反弹性病毒血症”定义为ARV ATI后血浆HIV RNA水平高于1,000拷贝/ml。患有反弹性病毒血症的受试者可重新开始ART。优选地，根据本发明的方法治疗的受试者将在ART中断后维持病毒血症控制。如本文所用，“维持病毒血症控制”定义为在ARV ATI后至少24周血浆HIV RNA小于50拷贝/mL。如果存在一次或多次血浆HIV RNA高于50拷贝/ml至低于1000拷贝/ml的情况，只要在至少相隔一周的两次连续测定中，受试者的血浆HIV RNA水平不超过1000拷贝/ml，亦视为满足“维持病毒血症控制”的标准。
通常(当不使用本发明的方法时)感染HIV的人类受试者在ART中断2-3周后出现病毒血症反弹。不希望受缚于任何理论，据认为在HIV完全被抑制的个体中，本发明的实施方案的初免/加强免疫至少在某些个体中将带来可测量的免疫应答并在ARV ATI后维持病毒血症控制。在一些实施方案中，受试者可在经本发明的方法治疗后中止ART。ART的中止可为较长的时间段(例如至少24周，优选更长，例如至少约28、32、36、40、44、48、52周，16、18、20、22、24个月甚至更长的时间)。停止或中止ART的此类时间段称为“假期”或“ART假期”或“治疗假期”。在其他实施方案中，根据本发明的方法的疫苗疗法可提供HIV缓解，这意味着在不存在ART的情况下维持病毒抑制。
实施方案
实施方案1为痘病毒载体，其包含编码合成HIV包膜蛋白的核酸，所述HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
实施方案2为痘病毒载体，其包含编码以下的核酸：
(a)第一HIV包膜(Env)抗原，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(b)第二HIV Env抗原，其不同于第一HIV Env抗原；
(c)第三抗原和第四抗原，其为两种不同HIV Gag抗原；和
(d)第五抗原和第六抗原，其为两种不同HIV Pol抗原。
实施方案3为实施方案2的痘病毒载体，其中所述第二HIV Env抗原包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列，所述第三抗原和第四抗原分别包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列；所述第五抗原和第六抗原分别包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
实施方案4为实施方案2或3的痘病毒载体，其中所述第三抗原和第五抗原融合为第一Gag-Pol融合抗原，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，所述第四抗原和第六抗原融合为第二Gag-Pol融合抗原，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
实施方案5为实施方案1-4中任一项的痘病毒载体，其中所述第一HIV Env抗原由SEQ ID NO:41编码。
实施方案6为实施方案4-5中任一项的痘病毒载体，其中所述第一HIV Env抗原由SEQ ID NO:41编码；所述第二HIV Env抗原由SEQ ID NO:39编码；所述第一Gag-Pol融合抗原由SEQ ID NO:38编码；和所述第二Gag-Pol融合抗原由SEQ ID NO:40编码。
实施方案7为实施方案1-6中任一项的痘病毒载体，其中编码所述抗原的核酸与启动子序列可操作地连接。
实施方案8为实施方案1-7中任一项的痘病毒载体，其中所述痘病毒载体是重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)载体。
实施方案9为实施方案8的痘病毒载体，其中所述MVA载体包含MVA-BN或其衍生物。
实施方案10为实施方案8或9的痘病毒载体，其中所述第一Gag-Pol融合抗原和第二Env抗原插入MVA基因组的基因间区域(IGR)44/45中，所述第二Gag-Pol融合抗原和第一Env抗原插入MVA基因组的IGR 88/89。
实施方案11为实施方案7-10中任一项的痘病毒载体，其中所述第一Gag-Pol融合抗原和第二Gag-Pol融合抗原各自在单独的Pr13.5启动子控制之下，且所述第一Env和第二Env抗原各自在单独的PrHyb启动子控制之下。
实施方案12为分离的细胞，其包含实施方案1-11中任一项的痘病毒载体。
实施方案13为一种组合物，其包含实施方案1-11中任一项的载体和载剂。
实施方案14为一种疫苗，其包含免疫原性有效量的根据实施方案1-11中任一项的痘病毒载体和药学上可接受的载剂。
实施方案15为一种疫苗组合，其包括：
(a)第一疫苗组合物，其包含免疫原性有效量的根据实施方案1-11中任一项的痘病毒载体，优选MVA载体；以及以下至少之一：
(b)(i)第二疫苗组合物，其包含免疫有效量的一种或多种腺病毒载体，优选腺病毒26种载体，其编码一种或多种HIV抗原，所述一种或多种HIV抗原优选地包含选自SEQ IDNO:1-5、18、28和29的氨基酸序列；和
(b)(ii)第三疫苗组合物，其包含一种或多种多肽，任选地，还包含佐剂，所述一种或多种多肽包含免疫原性有效量的分离的HIV抗原多肽，所述佐剂优选磷酸铝，其中所述第一组合物以及第二组合物和/或第三组合物存在于相同组合物中或者一种或多种不同的组合物中。
实施方案16为根据实施方案15的疫苗组合，其中所述第三疫苗组合物中的一种或多种分离的HIV抗原多肽包含：(i)多肽，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的第30-708位残基，或(ii)多肽，其包含SEQ ID NO:36氨基酸序列的第30-724位残基，或(iii)(i)和(ii)的多肽。
实施方案17为实施方案15-16中任一项的疫苗组合，其中所述第二疫苗组合物包含重组腺病毒26载体，其一起编码SEQ ID NO:1-5和18，优选其中SEQ ID NO:1和3融合为SEQ ID NO:28，和/或SEQ ID NO:2和4融合为SEQ ID NO:29。
实施方案18为实施方案17的疫苗组合，其中所述第二疫苗组合物包含四种重组Ad26载体：第一重组Ad26载体，其编码SEQ ID NO:5；第二重组Ad26载体，其编码SEQ ID NO:18；第三重组Ad26载体，其编码SEQ ID NO:1和3，优选SEQ ID NO:28；以及第四重组Ad26载体，其编码SEQ ID NO:2和4，优选SEQ ID NO:29。
实施方案19为一种方法，用于在有需要的受试者中诱导针对人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答，所述方法包括向受试者给药实施方案13的组合物、实施方案14的疫苗或疫苗实施方案15-18中任一项的疫苗组合。
实施方案20为将实施方案13的组合物、实施方案14的疫苗或实施方案15-18中任一项的疫苗组合用于诱导针对人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答的用途。
实施方案21为实施方案13的组合物或实施方案14的疫苗，其还包含编码一种或多种额外的表达载体和/或一种或多种分离的HIV抗原多肽，所述一种或多种额外的表达载体包含一种或多种额外的HIV抗原。
实施方案22为实施方案13的组合物或实施方案14的疫苗，其还包含腺病毒载体，优选腺病毒26载体，其编码合成HIV包膜蛋白，所述合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或由其组成。
实施方案23为根据实施方案22的组合物或疫苗，其进一步包含第二腺病毒载体，其编码包含SEQ ID NO:5氨基酸序列的HIV抗原，并任选地包含一种或多种额外的腺病毒载体，其编码一种或多种额外的HIV抗原，所述一种或多种额外的HIV抗原包含SEQ ID NO:1-4、28和29的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:28和29的氨基酸序列，更优选地，其中SEQ ID NO:28和29分别在第三腺病毒载体和第四腺病毒载体上编码，其中所述腺病毒载体优选腺病毒26载体。
实施方案24为一种方法，用于在有需要的受试者中产生针对人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答，所述方法包括向受试者给药根据实施方案13-23任一项的组合物或疫苗或疫苗组合。
实施方案25为产生组合物或疫苗组合的方法，其包括将实施方案1-11中任一项的痘病毒载体与载剂组合，并任选地包括将一种或多种载体和/或一种或多种组合物中的一种或多种分离的HIV抗原多肽与载剂组合，所述一种或多种载体编码一种或多种额外的HIV抗原。
实施方案26为一种方法，用于在有需要的受试者中诱导针对人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答，所述方法包括向受试者给药：
(i)第一疫苗，其包含免疫原性有效量的一种或多种重组腺病毒载体以及载剂，所述一种或多种重组腺病毒载体优选Ad26载体，其编码一种或多种HIV抗原，其包含SEQ IDNO:1-5、18、28和29中的任意一个或多个氨基酸序列；
(ii)第二疫苗，其包含实施方案1-11中任一项的痘病毒载体，和载剂；和
(iii)任选地，第三疫苗，其包含一种或多种多肽以及载剂，并且任选地还包含佐剂，所述一种或多种多肽包含免疫原性有效量的分离的HIV抗原多肽，所述佐剂优选磷酸铝，
其中步骤(i)和(ii)以任一顺序进行，其中一个步骤用于初免，另一个步骤用于加强免疫，并且其中将所述可选的第三疫苗与所述第一组合物或第二组合物一起给药，用于初免和/或加强免疫。
实施方案27为根据实施方案26的方法，其中将第三组合物与用于加强疫苗的组合物大约同时给药。
实施方案28为根据实施方案26或27的方法，其中所述一种或多种分离的HIV抗原多肽包含(i)多肽，其包含SEQ ID NO:7氨基酸序列第30-708位残基；(ii)多肽，其包含SEQID NO:36的第30-724位残基；或(iii)(i)和(ii)的多肽，并且其中所述一种或多种分离的HIV抗原多肽与加强疫苗和/或初免疫苗在同一组合物中，或与加强疫苗和/或初免疫苗在不同的组合物中。
实施方案29为根据实施方案26-28中任一项的方法，其中(i)所述第一疫苗包含一种编码合成HIV包膜蛋白的腺病毒载体和编码HIV抗原的第二腺病毒载体，并任选地包含一种或多种额外的表达载体，所述腺病毒载体优选为腺病毒26载体，所述合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，所述HIV抗原包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述一种或多种额外的表达载体优选为腺病毒载体，更优选为腺病毒26载体，其编码一种或多种额外的HIV抗原；(ii)所述第二疫苗包含痘病毒载体，优选MVA载体，其编码合成HIV包膜蛋白，并优选编码更多的HIV抗原，所述合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，所述HIV抗原包含SEQ ID NO:1-5、28和29中的一个或多个氨基酸序列；并且(iii)第三疫苗包含分离的HIV抗原多肽，其具有SEQ ID NO:7氨基酸序列的第30-708位残基或SEQ ID NO:36氨基酸序列的第30-724位残基；其中将所述第一疫苗一次或多次给药于受试者以进行初免，将第二疫苗一次或多次给药于受试者以加强免疫，并且将第三疫苗与第二疫苗一起一次或多次给药于受试者以加强免疫。
实施方案30为根据实施方案29的方法，其中所述第一疫苗包含一种或多种额外的腺病毒26载体，其编码一种或多种HIV抗原，所述一种或多种HIV抗原包含SEQ ID NO:1-4、28和29的氨基酸序列，优选包含SEQ ID NO:28和29的氨基酸序列。
实施方案31为根据实施方案30的方法，其中所述第一疫苗包含编码SEQ ID NO:28的第三腺病毒载体和编码SEQ ID NO:29的第四腺病毒载体。
实施方案32为一种疫苗组合，其包含以下组分：
(i)Ad26载体，其编码包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的合成HIV包膜蛋白；
(ii)Ad26载体，其编码包含SEQ ID NO:5氨基酸序列的HIV包膜蛋白；
(iii)Ad26载体，其编码包含SEQ ID NO:28氨基酸序列的HIV Gag-Pol融合蛋白；
(iv)Ad26载体，其编码包含SEQ ID NO:29氨基酸序列的HIV Gag-Pol融合蛋白，和
(v)MVA载体，其编码包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的第一HIV包膜蛋白，包含SEQID NO:5氨基酸序列的第二HIV包膜蛋白，包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的第一Gag-Pol融合蛋白，以及包含SEQ ID NO:29氨基酸序列的第二Gag-Pol融合蛋白。
实施方案33为根据实施方案32的疫苗组合，其还包含以下组分：(vi)(vi,a)：分离的HIV抗原多肽，其具有SEQ ID NO:7氨基酸序列的第30-708位残基，或(vi,b)：SEQ ID NO:36氨基酸序列的第30-724位残基，或(vi,c)：(vi,a)和(vi,b)两者，其中(vi,a)、(vi,b)或(vi,c)任选地进一步包含佐剂。
实施方案34一种方法，用于在有需要的人类受试者中诱导针对人类免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答，所述方法包括：
(a)向受试者给药：(i)rAd26载体，其编码包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的合成HIV包膜蛋白；(ii)rAd26载体，其编码包含SEQ ID NO:5氨基酸序列的抗原；(iii)rAd26载体，其编码包含SEQ ID NO:28氨基酸序列的抗原；(iv)rAd26载体，其编码包含SEQ ID NO:29氨基酸序列的抗原；优选地，其中将所述rAd26载体以约1：1：1：1的比例、以约1-10×1010的病毒颗粒(vp)的总剂量给药，例如以5×1010vp的总剂量给药；
(b)任选地重复步骤(a)；
(c)向受试者给药：(i)MVA或MVA-BN载体，其包含编码以下的核酸：(i,a)合成HIV包膜蛋白，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；(i,b)HIV Env抗原，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(i,c)HIV Gag-Pol融合抗原，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；(i,d)HIVGag-Pol融合抗原，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；优选地，其中将所述MVA以105至1011pfu的剂量(例如以107pfu、108pfu、109pfu或1010pfu的剂量)或106-1010TCID50的剂量(例如以107TCID50至109TCID50的剂量)给药；和
(d)任选地重复步骤(c)。
实施方案35为一种方法，用于在有需要的人类受试者中诱导针对人类免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答，所述方法包括：
(a)向受试者给药：(i)MVA或MVA-BN载体，其包含编码以下的核酸：(i,a)合成HIV包膜蛋白，其包含SEQ ID NO:18氨基酸序列；(i,b)HIV Env抗原，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(i,c)HIV Gag-Pol融合抗原，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；(i,d)HIVGag-Pol融合抗原，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；优选地，其中将所述MVA以105至1011pfu的剂量(例如107pfu、108pfu、109pfu或1010pfu的剂量)或以106-1010TCID50的剂量(例如以107TCID50至109TCID50的剂量)给药于受试者；
(b)任选地重复步骤(a)；
(c)向受试者给药：(i)MVA或MVA-BN载体，其包含编码以下的核酸：(i,a)合成HIV包膜蛋白，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；(i,b)HIV Env抗原，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(i,c)HIV Gag-Pol融合抗原，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；(i,d)HIVGag-Pol融合抗原，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；优选地，其中将所述MVA以105至1011pfu的剂量(例如以107pfu、108pfu、109pfu或1010pfu的剂量)或以106-1010TCID50的剂量(例如以107TCID50至109TCID50的剂量)给药；以及任选地，以下的一种或多种：(ii,a)分离的HIV gp140蛋白，其具有SEQ ID NO:7的第30-708位氨基酸的序列；(ii,b)分离的HIV gp140蛋白，其具有SEQ ID NO:36的第30-724位氨基酸的序列；和(iii)磷酸铝佐剂；其中任选地，将所述分离的HIV gp140蛋白以约1：1的比例以约50-300微克的总剂量给药，例如以250微克的总剂量给药；和
(d)任选地重复步骤(c)。
实施方案36为一种方法，用于在有需要的人类受试者中诱导针对HIV的免疫应答，所述方法包括：
(a)向受试者给药编码合成HIV包膜蛋白的MVA或MVA-BN载体，所述合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的氨基酸序列，其中将所述MVA或MVA-BN载体以105至1011pfu的剂量，例如以107pfu、108pfu、109pfu或1010pfu的剂量，例如以2×107至5×108pfu的剂量，例如以约1×108pfu的剂量，或以106至1010TCID50的剂量，例如以107TCID50至109TCID50的剂量给药；
(b)任选地重复步骤(a)；
(c)向受试者给药：(i)rAd26载体，其编码包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的合成HIV包膜蛋白；(ii)rAd26载体，其编码包含SEQ ID NO:5氨基酸序列的抗原；(iii)rAd26载体，其编码包含SEQ ID NO:28氨基酸序列的抗原；(iv)rAd26载体，其编码包含SEQ ID NO:29氨基酸序列的抗原；以及任选地，以下一种或多种：(v,a)分离的HIV gp140蛋白，其具有SEQ ID NO:7的第30-708位氨基酸的序列；(v,b)分离的HIV gp140蛋白，其具有SEQ ID NO:36的第30-724位氨基酸的序列；(v,c)所述(v,a)和(v,b)；(v,d)磷酸铝佐剂；优选地，其中将rAd26载体以约1：1：1：1的比例以约1-10×1010的病毒颗粒(vp)的总剂量给药，例如以5×1010vp的总剂量给药，并且其中任选地将分离的HIV gp140蛋白以约1：1的比例以约50-300微克的总剂量给药，例如以250微克的总剂量给药，和
(d)任选地重复步骤(c)。
实施方式37为一种方法，用于在有需要的人类受试者中诱导针对HIV的免疫应答，所述方法包括：
(a)向受试者给药：(i)rAd26载体，其编码包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的合成HIV包膜蛋白；(ii)rAd26载体，其编码包含SEQ ID NO:5氨基酸序列的抗原；(iii)rAd26载体，其编码包含SEQ ID NO:28氨基酸序列的抗原；以及(iv)rAd26载体，其编码包含SEQ IDNO:29氨基酸序列的抗原；优选地，其中将所述rAd26载体以约1：1：1：1的比例，约1-10×1010的病毒颗粒(vp)的总剂量给药，例如以5×1010vp的总剂量给药；
(b)任选地重复步骤(a)；
(c)向受试者给药：(i)编码合成HIV包膜蛋白的MVA或MVA-BN载体，所述合成HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的氨基酸序列，其中优选地将所述MVA或MVA-BN载体以105至1011pfu的剂量给药，例如以107pfu、108pfu、109pfu或1010pfu的剂量给药，例如以2×107至5×108pfu的剂量给药，例如以1×108pfu的剂量给药，或以106至1010TCID50的剂量给药，例如以107TCID50至109TCID50的剂量给药；以及(ii,a)分离的HIV gp140蛋白，其具有SEQ ID NO:7的第30-708位氨基酸的序列；或(ii,b)分离的HIV gp140蛋白，其具有SEQ ID NO:36的第30-724位氨基酸的序列；或(ii,c)两种分离的HIV gp140蛋白，其中第一分离的HIV gp140蛋白具有SEQ ID NO:7的第30-708位氨基酸的序列，且第二分离的HIV gp140蛋白具有SEQ ID NO:36的第30-724位氨基酸的序列，优选地，其中将这些蛋白以约1:1的比例给药；与(iii)磷酸铝佐剂；优选地，其中将所述分离的HIV gp140蛋白或分离的HIV gp140蛋白以约50-300微克的总剂量给药，例如以250微克的总剂量给药；和
(d)任选地重复步骤(c)。
实施方案38为实施方案26-31或34-37中任一项的方法，其中在给药载体或疫苗组分的第一步之前，受试者已感染HIV。
实施方案39为实施方案26-31或34-38中任一项的方法，其还包括将潜伏病毒储库清除剂给药于受试者。
实施方案40为实施方案39的方法，其中所述潜伏病毒储库清除剂为TLR7调节剂。
实施方案41为实施方案26-31或34-40中任一项的方法，其中所述受试者进一步接受抗逆转录病毒治疗(ART)。
实施方案42为实施方案41的方法，其中所述受试者在完成初免/加强免疫后经历ART中断。
实施方案43为实施方案42的方法，其中在完成Ad26初免和MVA加强免疫后开始ART中断，任选地，其中将所述MVA加强免疫与一种或多种分离的HIV Env gp140蛋白一起给药。
实施方案44为实施方案13或21-23中任一项的组合物、实施方案14或21-23中任一项的疫苗或实施方案15-18或32-33中任一项的疫苗组合，其用于治疗和/或预防人类免疫缺陷病毒(HIV)感染和/或疾病。
实施方案45为实施方案13或21-23中任一项的组合物、实施方案14或21-23中任一项的疫苗或实施方案15-18或32-33中任一项的疫苗组合，其用于药物生产，其中所述药物用于治疗和/或预防人免疫缺陷病毒(HIV)感染和/或疾病。
实施方案46为将实施方案13或21-23中任一项的组合物、实施方案14或21-23中任一项的疫苗或实施方案15-18或32-33中任一项的疫苗组合用于生产药物的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防人免疫缺陷病毒(HIV)感染和/或疾病的药物。
实施例
实施例1：HIV包膜抗原序列的设计
设计几个HIV包膜抗原序列，使其与镶嵌HIV抗原mos2Env(SEQ IDNO:6；在WO2010/059732中也有在先描述)具有序列相似性。新设计的膜结合序列基于来自HIV包膜蛋白的全天然野生型序列(的组合)，或基于mos2Env序列和野生型HIV包膜蛋白序列的嵌合体。除了全长包膜蛋白序列(参见图1A)以外，还设计了具有胞质结构域的C末端截短的序列(参见例如图1C)。还参见，例如，Schiernle et al.,PNAS 1997；Abrahamyan et al.,JVirol 2005；Edwards et al.,J.Virology,2002,76:2683-2691。还通过在跨膜(TM)区之前的C末端截短制备了可溶性变体，该跨膜(TM)区被三聚化结构域例如GCN4三聚化结构域替代(参见，例如，图1B)。通过弗林蛋白酶切割位点的突变，将这些可溶性变体进一步转化为单链变体，从而抑制了包膜蛋白的胞外域加工成gp120和gp41亚基。
在所有产生和测试的构建体中，基于C4的构建体具有最佳的性能，例如，良好的可制造性、折叠性、免疫原性等，并选择这些进行进一步研究。还产生了并在进一步的研究中测试了C4构建体的可溶性变体(sC4，图1B)(具有代替跨膜结构域的GCN4三聚结构域)以及包含胞质结构域的7个氨基酸片段的变体(C4D7，图1C)。C4、sC4和C4D7的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:17、19和18。编码它们的序列分别示于SEQ ID NO:25、27和26。构建体C1具有基于mos2Env序列的胞外域序列(SEQ ID NO:6)。与sC4和C4D7类似，还产生了分别如图1B和图1C所示的构建体C1的可溶性变体(sC1)(具有代替跨膜结构域的GCN4三聚结构域)和包含胞质结构域的7个氨基酸片段的变体(C1D7)。构建体C1及其变体在进一步研究中用于比较目的，因为它们基本上基于现有技术的mos2Env序列。C1、sC1和C1D7的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:31、30和32。编码它们的核酸序列分别示于SEQ ID NO:34、33和35。测试的其他构建体的性能不及基于构建体C4的构建体，因此未进行进一步开发。
实施例2：合成HIV包膜蛋白的表达和折叠
测定了合成HIV包膜蛋白的表达水平、折叠和细胞表面表达。
表达水平
用编码如实施例1中所述可溶性合成HIV包膜蛋白sC1和sC4的质粒瞬时转染HEK293F细胞。使用定量蛋白质印迹法(QWB)测量上清液中可溶性蛋白的表达水平。结果在图2中示出。sC1(基本上对应于添加了跨膜结构域的mos2Env)的低表达水平与我们目前对mos2Env的了解相符。结果表明，本发明的sC4变体的表达水平明显高于sC1变体(对照)的表达水平。
蛋白质折叠
利用酶联免疫吸附测定(ELISA)，通过测定可溶性合成HIV包膜蛋白对抗体(MAb17b)的结合来测试蛋白的折叠，所述抗体已知与HIV包膜蛋白的共受体结合位点结合，所述共受体结合位点仅在结合CD4后才被暴露出来。具体地，在sC4预先以及未预先与CD4结合的情况下，测试了纯化的sC4对MAb 17b的结合。纯化的sC1用作对照。在包膜蛋白未预先与CD4结合的情况下，MAb 17b对sC4的结合表明了包膜蛋白部分去折叠或预触发(即不稳定的Env，其在没有CD4结合的情况下采用“开放”构象)。ELISA测定的结果在图3A和3B中示出。
如图3B所示，sC4在预先与CD4结合的情况下，其对MAb 17b的结合很强，但是在未预先与CD4结合的情况下，检测不到其对MAb 17b的结合。相反，如图3A所示，无论是否预先与CD4结合，sC1对MAb 17的结合都低得多。结果表明，sC4具有正确的折叠模式，其在CD4结合之前未暴露共受体结合位点。
还通过sC1和sC4的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析了蛋白质折叠，以评估可溶性蛋白质变体的四级结构，以及在原聚体之间可能形成的不正确的二硫键。在非变性凝胶上电泳后，通过蛋白质印迹分析检测凝胶中的蛋白质。如图4所示，大多数sC4以三聚体状态存在，这是正确的四级结构。
综上所述，蛋白质折叠实验的结果表明，sC4可溶性合成HIV包膜蛋白具有所需的折叠特性，与现有mos2Env抗原(sC1为代表)的折叠特性相比有所改善。
细胞表面表达
还研究了HIV包膜蛋白的膜结合变体C1(全长)、C4(全长，见图1A)、C1D7以及C4D7的细胞表面表达。仅用编码eGFP的质粒(阴性对照，NC)，或用编码eGFP的质粒和编码HIV包膜蛋白变体的表达构建体共同瞬时转染HEK293T细胞。转染后两天，将细胞暴露于几种针对gp120的多克隆和单克隆抗体以及二抗后，进行荧光激活细胞分选(FACS)分析，然后检查包膜蛋白的细胞表面表达水平。通过使用抗gp120多克隆抗体确定总体表达水平并评估广谱中和抗体PG9和PG16的相对结合来评估包膜变体的质量，所述广谱中和抗体依赖于四级结构，且优先结合正确折叠的包膜三聚体。
细胞表面表达实验的结果在图5中示出。使用抗gp120抗体测得的截短变体C1D7和C4D7的表面表达水平分别比其对应的全长蛋白C1和C4的表面表达水平高得多。这证实了从Env的羧基末端缺失144个残基会增加包膜的表面表达水平。与全长C1相比，本发明的全长C4构建体还显示出改善的PG9和PG16结合，这表明C4包膜序列在细胞表面上的折叠正确(即三聚体)。
结果还证明，C1D7变体可在HEK293T细胞表面表达，所述变体本质上是添加了跨膜结构域并添加了胞质结构域的7个氨基酸的Mos2Env。这与Ad26.mos2Env中的可溶构建体相反，后者在转染到A549细胞后在表面的表达不能达到可检测的水平。然而，与PG9和PG16的相对结合几乎无法在背景以上检测到，这表明C1D7包膜序列折叠较差，并可能不能以完整的三聚体存在于细胞表面。
总体而言，C4D7包膜变体具有最佳的抗体结合性能，其gp120表达高于其对应的全长蛋白C4，并且与C1和C1D7相比，其与PG9和PG16的结合增加了15倍以上(图5))。
实施例3：编码HIV包膜序列的载体的稳定性
我们实验室的先前工作(未发表)表明，编码mos2Env抗原序列的腺病毒26(Ad26)载体显示出相对较高的VP/IU比(表明腺病毒产品批次的质量较低)，而且这种载体还显示出稳定性问题。因此，在腺病毒背景下测试本发明的合成HIV包膜蛋白构建体的稳定性是重要的。
在PER.C6细胞中产生了Ad26(rAd26)重组载体(称为“rAd26.C4”、“rAd26.C4D7”和“rAd26.sC4”)，其编码如上文实施例1所述本发明的HIV抗原序列C4、C4D7和sC4。挑选载体克隆(空斑)并扩大规模，以产生研究批次。最多将5个病毒克隆(空斑)扩大至T25形式，并以T25形式连续传代10代(1-3传代为转染和空斑纯化的步骤，然后以T25形式传10代，总共13代)。在病毒传代数(vpn)3、5、10和13，利用E1转基因盒PCR测定评估遗传稳定性，随后在vpn13测序。结果在图6中示出。
编码全长C4的rAd26载体(rAd26.C4)显示出不良的生长特性(由2-3天内没有完全细胞病变效应(CPE)确定)、遗传不稳定性(由E1转基因盒区域的缺失确定)或其组合(图6)。由于不良的生长特性和观察到的遗传不稳定性，因此不再继续研究编码全长C4的此载体。
相反，对于编码C4D7(rAd26.C4D7)和sC4(rAd26.sC4)的rAd26载体，在实验过程中所有繁殖的空斑保持了遗传稳定性(图6)。因此，就在腺病毒载体背景中的稳定性而言，新型sC4和C4D7构建体优于原始mos2Env构建体。遗传稳定性测试高达vpn 13，代表除了载体的工业规模制备中所用的传代以外，还传了数代。
实施例4：HIV包膜序列在腺病毒载体中的表达和体内抗原性
在经载体转导的A549细胞(人细胞系)中，在体外单独评估或与编码mos1Env(SEQID NO:5)的重组Ad26载体(下文称为“rAd26.mos1Env”)组合评估rAd26.C4D7和rAd26.sC4的表达和抗原性(数据未显示)。流式细胞仪分析表明，通过腺病毒转导，无论在转导了单个包膜抗原2×104病毒颗粒(vp)作为对照的细胞培养物中，还是在转导了2种组合的Env抗原1×104vp的细胞培养物中，均表达了所有抗原。所有转导还额外包含单剂量的(1×104vp)编码mos1GagPol(“rAd26.mos1GagPol”)和mos2GagPol(“rAd26.mos2GagPol”)的腺病毒载体(Barouch et al,Nat Med 2010,16:319-323)，以使被评估的载体组合表现出与预期用于临床前和临床的不同腺病毒载体相同的相对比率。优选地，将编码本发明的合成HIV包膜蛋白的载体与编码mos1GagPol和mos2GagPol抗原的载体组合用于临床。
通过单克隆抗体结合，确定了rAd26.mos1Env和rAd26.C4D7的组合产生了被评估表位的最大覆盖。尤其是，由于利用Ad26.C4D7转化而引起的PG16表位的暴露有望用于疫苗，因为PG16代表了可识别HIV-1Env的V1/V2环区的广谱中和性单克隆抗体(Walker etal,Science 326:258-9,2009)。因此，与仅由mos1Env产生的免疫应答相比，衍生自C4序列的本发明的合成HIV包膜蛋白增加了针对HIV包膜蛋白的免疫应答的广度。在RV144研究中，疫苗诱导的针对包膜蛋白区域的抗体反应已证明与免于HIV-1感染相关(Haynes et al,NEngl J Med.336:1275-86,2012)，因此本发明的合成HIV包膜蛋白为可包括在HIV疫苗方案中的有前途的候选。
实施例5：编码合成HIV包膜蛋白的载体的免疫原性
在兔子中测试了在Ad26载体背景下的本发明的合成HIV包膜蛋白序列，以测定这些构建体是否为rAd26.mos2Env构建体的免疫原性替代物。
单独测试和与编码本发明的合成HIV包膜蛋白(rAd26.C4D7和rAd26.sC4；包含SEQID NO:8，特别是分别包含SEQ ID NO:18和19)结合测试了编码mos1Env(rAd26.mos1Env；SEQ ID NO:5)的腺病毒载体的免疫原性。在所有情况下，还给药了编码mos1GagPol和mos2GagPol抗原的腺病毒26载体(分别为rAd26.mos1GagPol[SEQ ID NO:28]和rAd26.mos2GagPol[SEQ ID NO:29])。更具体地，将单独rAd26.mos1Env的免疫原性(三价疫苗：rAd26.mos1GagPol、rAd26.mos2GagPol和rAd26.mos1Env)同rAd26.mos1Env与rAd26.C4D7或rAd26.sC4中之一的组合(四价疫苗：给药rAd26.mos1GagPol、rAd26.mos2GagPol、rAd26.mos1Env和rAd26.C4D7；或给药rAd26.mos1GagPol、rAd26.mos2GagPol、rAd26.mos1Env和rAd26.sC4)的免疫原性进行了比较。将三价疫苗(其缺乏编码本发明的合成HIV包膜蛋白的任何载体)与四价疫苗(其含有编码本发明的合成HIV包膜蛋白的载体)进行比较，可以确定本发明的HIV包膜蛋白是否有助于保护的广度。
根据疫苗方案给药，其中在第0和第6周将这些Ad26载体作为双重初免给药，并在第12周和第18周将进化支C gp140蛋白(三价Env gp140蛋白，其具有不含第1-29位残基的信号肽序列的SEQ ID NO:7，还参见WO 2010/042942)作为双重加强免疫给药(参见例如Barouch et al,2015,Science 349:320-324)。表1描述了用于当前研究的疫苗方案。rAd26.Empty是指对照载体，其缺少编码HIV抗原蛋白序列的任何基因。每组包含六只兔子。
表1 兔免疫原性研究中测试的疫苗方案
Figure BDA0002383315010000591
将三价Ad26疫苗(缺少本发明的新型Env抗原)与四价Ad26疫苗(其包含新型sC4或C4D7Env抗原)进行比较，可以测试本发明的新型抗原是否有助于其保护广度。利用公认的基于TZM-bl细胞的中和测定法[Montefiori DC.Methods Mol Biol 2009,485:395-405；Sarzotti-Kelsoe M et al.,J Immunol Methods 2014,409:131-146]测量候选疫苗的中和活性。
结果在图7中示出，并通过将三价疫苗(表1中的组1)用作对照组并与每种新型四价疫苗(表1中的组2和3)比较，进行了统计学分析。
总体而言，在兔中进行两次同源肌内免疫后，衍生自C4的(即编码包含SEQ ID NO:8的Env蛋白，是mos2Env的替代物)新型腺病毒构建体具有免疫原性。
兔免疫血清缺乏针对1B级伪病毒的中和能力(数据未显示)，这并不出乎意料，因为已知此类病毒更难以中和。
兔免疫血清对进化支B 1A级病毒的伪病毒中和能力不受添加新成分的影响(数据未显示)。这证明新抗原不会对疫苗中现有的进化支B抗原的免疫原性产生负面影响(尽管新成分针对的是进化支C，但在进行测试之前不能用先验排除这种不良干扰)。
与单独的三价(仅具有mos1Env)(组1)免疫接种相比，在含有腺病毒的四价新型C4D7中(四价，组2)，兔免疫血清对进化支C 1A级病毒的伪病毒中和能力显著增强(图7B)。此外，与单独的三价(仅mos1Env)免疫接种(组1)相比，含有四价新型sC4的腺病毒(四价，组3)在第8周时，兔免疫血清对进化支C 1A级病毒的伪病毒中和能力显著增强(图7B)。
总之，在Ad26中编码的C4D7和sC4构建体具有免疫原性，并且其添加扩展了疫苗对进化支C毒株的结合与中和能力，所述疫苗以mos1Env(主要为进化支B)为唯一由Ad26编码的Env成分(图7B)。
实施例6：包含编码本发明合成HIV包膜蛋白的载体的疫苗方案的免疫原性
另一项兔子研究评估了四价载体组合Ad26.Mos4.HIV(由四种腺病毒载体组成的总剂量为5×109vp的1：1：1：1的混合物，所述四种腺病毒载体为：Ad26.Mos1GagPol[编码SEQ ID NO:28]、Ad26.Mos2GagPol[编码SEQ ID NO:29]、Ad26.Mos1Env[编码SEQ ID NO:5]和Ad26.Mos2SEnv[如上所用，名称“C4D7”也称为“Mos2S”；此载体编码本发明的新SEQ IDNO:18])，在第0周和第6周肌内施用作为双重初免接种，并在第13周和第19周时结合重组HIV-1Env蛋白加强免疫，所述重组HIV-1Env蛋白加强免疫可使用进化支C gp140[具有SEQID NO:7的第30-708位氨基酸残基的序列]、镶嵌gp140[具有SEQ ID NO:36的第30-724位氨基酸残基的序列]，或进化支C gp140和镶嵌gp140的组合。将所述蛋白加强免疫以10或50微克蛋白的总剂量与在免疫接种当天配制的250微克磷酸铝佐剂联合肌内给药。
结果表明，所有测试的方案在所有动物中都具有免疫原性，诱导出针对1级Env假型病毒的高抗体效价和中等中和活性。如果将镶嵌gp140用作疫苗抗原，无论是单独还是与进化支C gp140结合使用，与单独使用进化支C gp140加强免疫的参照组相比，镶嵌gp140特异性的ELISA效价和进化支B假病毒的识别在第15周时均显著增强。改善的总体效应量中等，与单独使用镶嵌gp140相比，经二价的进化支C gp140-镶嵌gp140组合加强免疫的组其改善的总体效果更大。在研究的第21周，这些差异消失了，经由二价的进化支C gp140-镶嵌gp140加强免疫或进化支C gp140的单价加强免疫的队列(cohort)的免疫反应无统计学差异。
二价蛋白质方案在诱导进化支C ELISA效价和识别假病毒方面与进化支C gp140单独加强方案相当，表明引入镶嵌gp140(其为与进化支B相关的免疫原)对进化支C抗原的覆盖没有负面影响，同时在研究的第15周显著增强了进化支B的覆盖。
数据证实，编码本发明的合成Env抗原的Ad26.Mos2SEnv载体可成功用于疫苗接种方案。
实施例7：编码本发明合成HIV包膜蛋白和其他HIV抗原组合的MVA载体的构建
在本实施例中，产生了MVA-BN载体(称为“MVA-mBN414”)，其包含编码本文描述为SEQ ID NO:18的新型HIV mos2SEnv抗原的核酸(也称为C4D7)。所述MVA-mBN414载体还包含编码以下HIV抗原的核酸：mos1Env(SEQ ID NO:5)；mos1Gag(SEQ ID NO:1)；mos2Gag(SEQID NO:2)；mos1Pol(SEQ ID NO:3)；和mos2Pol(SEQ ID NO:4)。在MVA-mBN414中，mos1Gag(SEQ ID NO:1)和mos1Pol(SEQ ID NO:3)被编码为融合蛋白(SEQ ID NO:28，“mos1GagPol”)，且mos2Gag和mos2Pol被编码为融合蛋白(SEQ ID NO:29，“mos2GagPol”)。MVA基因组区域中插入片段的示意图见图8。
我们设计了编码HIV抗原mos2SEnv(SEQ ID NO:18)的新型核酸(SEQ ID NO:41)；编码HIV抗原mos1Env(SEQ ID NO:5)的新型核酸(SEQ ID NO:39)；编码HIV抗原mos1GagPol(SEQ ID NO:28)的新型核酸(SEQ ID NO:38)；以及编码HIV抗原mos2GagPol(SEQ ID NO:29)的新型核酸(SEQ ID NO:40)。新型核酸设计为用于人类表达，彼此之间的同源性最小并减少了多核苷酸拉伸(poly-nt stretch)和重复元件。
在mos1GagPol和mos2GagPol抗原序列的ATG起始密码子之前引入PrMVA13.5long启动子(SEQ ID NO:42)。在mos2SEnv和mos1Env抗原序列的ATG起始密码子之前引入PrHyb启动子(SEQ ID NO:43)。
经由SacII和PacI将mos1GagPol和mos1Env的编码序列插入pBNX208中，pBNX208是编码IGR 44/45MVA-BN同源区域的转移载体，从而允许通过同源重组插入MVA-BN的靶区域(IGR 44/45)中。此外，pBNX208编码用于正选择的heGFP和nptII以及IGR 44/45MVA-BN同源区域Flank 2的重复序列，或之后在没有选择压力的情况下通过同源重组切除选择盒。经由NotI将mos2GagPol和mos2Env编码序列插入pBNX227，pBNX227是编码IGR 88/89MVA-BN同源区域的转移载体，从而允许通过同源重组插入MVA-BN的靶区域(IGR 88/89)。此外，pBNX227编码用于正向选择的mRFP1和ecogpt，其侧翼是两个loxP位点，以便在随后使用编码CRE重组酶的质粒转染后在没有选择压力的情况下切除选择盒，CRE重组酶催化侧翼为其靶序列loxP的核酸的精确切除。
在原代鸡成纤维细胞(CEF)中产生并如本文所述生成基于MVA的载体。每周从鸡胚中分离出CEF细胞，并维持在无FBS的VP-SFM培养基中。简而言之，根据制造商(Promega)提供的说明使用Fugene用MVA载体质粒转染CEF细胞，并用MVA-BN进行共转染。两三天后收获细胞，进行超声处理并进一步传代。在12孔组织培养板的单孔中扩增后，将培养于96孔组织培养板中的CEF细胞中的病毒空斑纯化。在培养于6孔组织板单孔中的CEF细胞中进一步扩增，然后在T175组织培养瓶中进一步扩增。
因此，MVA-mBN414为这样的MVA-BN，在其IGR 44/45区域包含编码mos1GagPol(SEQID NO:28)的核酸和编码mos1Env(SEQ ID NO:5)的核酸，其中mos1GagPol(SEQ ID NO:28)在PrMVA13.5long启动子(SEQ ID NO:42)控制之下，mos1Env(SEQ ID NO:5)在PrHyb启动子(SEQ ID NO:43)控制之下。在IGR 88/89区域中有编码mos2GagPol(SEQ ID NO:29)的核酸和编码mos2SEnv(SEQ ID NO:18)的核酸，其中mos2GagPol(SEQ ID NO:29)在PrMVA13.5long启动子(SEQ ID NO:42)控制之下，mos2SEnv(SEQ ID NO:18)在PrHyb启动子(SEQ ID NO:43)控制之下。所述MVA-mBN414载体与编码本文所述抗原的腺病毒载体一起用于初免-加强免疫方案的后续实验中。
实施例8：MVA-mBN414在兔中的免疫原性
在用Ad26.Mos.HIV(三价疫苗，其具有3个Ad26载体，所述3个Ad26载体一起编码具有SEQ ID NO:1、2、3、4和5的HIV抗原；以抗原mos1GagPol(SEQ ID NO:28)、mos2GagPol(SEQID NO:29)和mos1Env(SEQ ID NO:5)的形式)进行初免的情况下，与同源的Ad26.Mos.HIV初免-加强免疫相比较，评估了MVA-mBN414(参见实施例7)在新西兰白(NZW)兔中的免疫原性。另外，评估了在第42天和第62天共同给药进化支C gp140蛋白(以磷酸铝为佐剂)的附加益处(注射入对侧肌肉(即，不同的肢体))。
在下表2中提供了所使用的免疫接种时间表：
表2：用于研究在兔中免疫原性的免疫接种时间表
Figure BDA0002383315010000631
读出测定为是进化支C(SEQ ID NO:7的第30-708位氨基酸残基)和镶嵌gp140(SEQID NO:36的第30-724位氨基酸残基)ELISA，以及HIV-1假病毒中和测定法。通过测试对于TZM-b1细胞的进入的抑制，测试免疫后兔血清针对HIV-1ENV假型病毒颗粒(EPV)的中和能力。TZM-b1细胞表达高水平的CD4和共受体CCR5和CXCR4，并包含在HIV长末端重复序列控制之下的整合的tat应答荧光素酶报告基因。含血清的HIV-1Env抗体对EPV的中和作用会导致荧光素酶表达降低，从而导致与含荧光素的底物结合的荧光信号降低。从1/20开始，以6步的三倍系列稀释测试血清或抗体。通过在不加血清或抗体的一个孔中仅添加细胞+EPV，来测量荧光素酶的最大表达。通过仅向孔中添加细胞而无血清/抗体与EPV，来测量荧光素酶的背景表达。在荧光素酶的最大信号和背景信号之间拟合非线性4参数曲线，并将log10转换的IC50值确定为可报告值。
结果在图9中示出。
结果显示MVA-mBN414在所有兔子中均具有免疫原性。在雄性和雌性动物中的免疫原性没有明显差异。与同源Ad26初免-加强免疫相比，在用Ad26初免的情况下，用MVA加强免疫增强了HIV特异性体液免疫应答(在进化支C ELISA、进化支B样镶嵌ELISA和进化支B VNA中可测量)。
与仅利用MVA加强免疫相比，将进化支C gp140蛋白与MVA共同给药作为加强免疫，提高了(同源)进化支C gp140ELISA和(异源)镶嵌gp140ELISA的效价。
实施例9：MVA-mBN414在小鼠中的免疫原性
还在CBF1小鼠中评估了MVA-mBN414的免疫原性，目的在于与同源的MVA初免-加强免疫(即用MVA-mBN414初免和加强免疫)相比较，来评估异源的Ad26.Mos4.HIV(参见实施例6)初免和MVA-mBN414(参见实施例7)加强免疫的免疫原性。
在下表3中提供了所使用的免疫接种时间表：
表3：用于研究在兔中免疫原性的免疫接种时间表
Figure BDA0002383315010000641
体液免疫应答的读出测定(在第5和第7周测量抗原特异性IgG)为镶嵌gp140(SEQID NO:36的第30-724位氨基酸残基)ELISA(参见实施例8)。细胞免疫应答的读出测定(第7周)为IFN-γELISPOT(测定方法见Khan et al,Int J Cancer,2017,Mar 6,doi:10.1002/ijc.30679.[Epub ahead of print]；2017,Jul 14,141(2),393-404)，使用Env、Gag和Pol免疫优势肽作为刺激物。
ELISPOT的结果在图10中示出。还进行了细胞内细胞因子染色(ICS)测定，得到相似的结果(未显示)。
结果表明，在第5周，用Ad26或MVA初免诱导了可检测的免疫应答(图10A)，对于异源的Ad-MVA方案和同源的MVA-MVA方案，在第7周用MVA加强免疫进一步增强了免疫应答(图10B)。异源Ad-MVA初免-加强免疫诱导的ELISA效价明显高于同源MVA-MVA初免-加强免疫方案。在第7周，通过ELISPOT测量的针对抗原Env、Gag和Pol的细胞免疫应答也观察到了这一点(图10C-E)。同源的MVA初免-加强免疫诱导了针对抗原Gag和Pol的较低的但可检测的细胞免疫应答，这明显不同于对照数据。
总而言之，结果表明，本发明的MVA具有免疫原性，所述MVA具有HIV抗原。另外，显示出可将这种载体有利地与编码HIV抗原的腺病毒载体和/或分离的HIV gp140蛋白一起用于初免-加强免疫方案中。
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<223> mos1Gag mosaic antigen sequence
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Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp
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35 40 45
Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu
50 55 60
Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn
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Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp
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100 105 110
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Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu
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Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser
165 170 175
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Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu
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Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala
210 215 220
Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
225 230 235 240
Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile
245 250 255
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Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly
275 280 285
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu
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Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala
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Leu Trp Asp Ala Ser Leu Glu Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys
85 90 95
Val Thr Leu Asn Cys Arg Asn Val Arg Asn Val Ser Ser Asn Gly Thr
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Tyr Asn Ile Ile His Asn Glu Thr Tyr Lys Glu Met Lys Asn Cys Ser
115 120 125
Phe Asn Ala Thr Thr Val Val Glu Asp Arg Lys Gln Lys Val His Ala
130 135 140
Leu Phe Tyr Arg Leu Asp Ile Val Pro Leu Asp Glu Asn Asn Ser Ser
145 150 155 160
Glu Lys Ser Ser Glu Asn Ser Ser Glu Tyr Tyr Arg Leu Ile Asn Cys
165 170 175
Asn Thr Ser Ala Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Asp Pro
180 185 190
Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Tyr Ala Ile Leu Lys Cys
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Asn Asn Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Asn Asn Val Ser Thr
210 215 220
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Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Ile Ile Ile Arg Ser Glu Asn
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Asn Ile Thr Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg
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Ile Arg Gln Ala His Cys Asn Leu Ser Arg Asp Gly Trp Asn Lys Thr
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Asn Asp Thr Glu Thr Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asn Asn
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450 455 460
Gly Val Ala Pro Thr Glu Ala Lys Arg Arg Val Val Glu Arg Glu Lys
465 470 475 480
Arg Ala Val Gly Ile Gly Ala Val Phe Leu Gly Ile Leu Gly Ala Ala
485 490 495
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565 570 575
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Lys
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<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> signal sequence
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<210> 10
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> signal sequence
<400> 10
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1 5 10 15
Gly Thr Met Leu Leu Gly Ile Leu Met Ile Cys Ser Ala
20 25
<210> 11
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> signal sequence
<400> 11
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1 5 10 15
Gly Ile Leu Gly Phe Trp Met Ile Ile Ile Cys Arg Val
20 25
<210> 12
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> signal sequence
<400> 12
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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100 105 110
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115 120 125
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260 265 270
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340 345 350
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435 440 445
Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Ser Asn Asn Gly Val Pro Asn Asp Thr
450 455 460
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500 505 510
Gly Ile Gly Ala Val Phe Leu Gly Ile Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr
515 520 525
Met Gly Ala Ala Ser Ile Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu
530 535 540
Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Ser Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala
545 550 555 560
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435 440 445
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<220>
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<400> 20
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ctggaacggt ttgccgtgaa ccctggcctg ctggaaacca gcgagggctg taggcagatt 180
ctgggacagc tgcagcccag cctgcagaca ggcagcgagg aactgcggag cctgtacaac 240
accgtggcca ccctgtactg cgtgcaccag cggatcgaga tcaaggacac caaagaagcc 300
ctggaaaaga tcgaggaaga gcagaacaag agcaagaaga aagcccagca ggctgccgct 360
gacacaggca acagcagcca ggtgtcccag aactacccca tcgtgcagaa catccaggga 420
cagatggtgc accaggccat cagccctcgg accctgaacg cctgggtgaa ggtggtggag 480
gaaaaggcct tcagccctga ggtgatcccc atgttctctg ccctgagcga gggagccaca 540
ccccaggacc tgaacaccat gctgaacacc gtgggagggc accaggctgc catgcagatg 600
ctgaaagaga caatcaacga ggaagctgcc gagtgggaca gggtccaccc agtgcacgct 660
ggacctatcg ctcctggcca gatgagagag cccagaggca gcgatattgc tggcaccacc 720
tccacactgc aggaacagat cggctggatg accaacaacc ctcccatccc tgtgggagag 780
atctacaagc ggtggatcat tctgggactg aacaagatcg tgcggatgta cagccctgtg 840
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tacaagaccc tgagagccga gcaggccagc caggacgtga agaactggat gaccgagaca 960
ctgctggtgc agaacgccaa ccctgactgc aagaccatcc tgaaagccct gggacctgct 1020
gccaccctgg aagagatgat gacagcctgc cagggagtgg gaggacctgg ccacaaggcc 1080
agggtgctgg ccgaggccat gagccaggtg accaactctg ccaccatcat gatgcagaga 1140
ggcaacttcc ggaaccagag aaagaccgtg aagtgcttca actgtggcaa agagggacac 1200
attgccaaga actgcagggc tcccaggaag aaaggctgct ggaagtgcgg aaaagaaggc 1260
caccagatga aggactgcac cgagaggcag gccaacttcc tgggcaagat ctggcctagc 1320
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gaaagcttcc ggtttggcga ggaaaccacc acccctagcc agaagcagga acccatcgac 1440
aaagagatgt accctctggc cagcctgaag agcctgttcg gcaacgaccc cagcagccag 1500
atggctccca tcagcccaat cgagacagtg cctgtgaagc tgaagcctgg catggacgga 1560
cccagggtga agcagtggcc tctgaccgag gaaaagatca aagccctgac agccatctgc 1620
gaggaaatgg aaaaagaggg caagatcacc aagatcggac ccgagaaccc ctacaacacc 1680
cctgtgttcg ccatcaagaa gaaagacagc accaagtgga ggaaactggt ggacttcaga 1740
gagctgaaca agcggaccca ggacttctgg gaggtgcagc tgggcatccc tcaccctgct 1800
ggcctgaaga aaaagaaaag cgtgaccgtg ctggctgtgg gagatgccta cttcagcgtg 1860
cctctggacg agggcttccg gaagtacaca gccttcacca tccccagcac caacaacgag 1920
acacctggca tcagatacca gtacaacgtg ctgcctcagg gctggaaagg cagccctgcc 1980
atcttccagt gcagcatgac cagaatcctg gaacccttca gagccaagaa ccctgagatc 2040
gtgatctacc agtatatggc tgccctctac gtgggcagcg acctggaaat cggacagcac 2100
agagccaaaa tcgaagaact ccgcgagcac ctgctgaagt ggggattcac cacccctgac 2160
aagaagcacc agaaagagcc tcccttcctg tggatgggct acgagctgca ccctgacaag 2220
tggaccgtgc agcccatcca gctgccagag aaggactcct ggaccgtgaa cgacatccag 2280
aaactggtcg gcaagctgaa ctgggccagc cagatctacc ctggcatcaa agtcagacag 2340
ctgtgtaagc tgctgagggg agccaaagca ctgaccgaca tcgtgcctct gacagaagaa 2400
gccgagctgg aactggccga gaacagagag atcctgaaag aacccgtgca cggagtgtac 2460
tacgacccct ccaaggacct gattgccgag atccagaaac agggacacga ccagtggacc 2520
taccagatct atcaggaacc tttcaagaac ctgaaaacag gcaagtacgc caagatgcgg 2580
acagcccaca ccaacgacgt gaagcagctg accgaagccg tgcagaaaat cgccatggaa 2640
agcatcgtga tctggggaaa gacacccaag ttcaggctgc ccatccagaa agagacatgg 2700
gaaacctggt ggaccgacta ctggcaggcc acctggattc ccgagtggga gttcgtgaac 2760
accccacccc tggtgaagct gtggtatcag ctggaaaagg accctatcgc tggcgtggag 2820
acattctacg tggctggagc tgccaacaga gagacaaagc tgggcaaggc tggctacgtg 2880
accgacagag gcagacagaa aatcgtgagc ctgaccgaaa ccaccaacca gaaaacagcc 2940
ctgcaggcca tctatctggc actgcaggac agcggaagcg aggtgaacat cgtgacagcc 3000
agccagtatg ccctgggcat catccaggcc cagcctgaca agagcgagag cgagctggtg 3060
aaccagatca tcgagcagct gatcaagaaa gaacgggtgt acctgagctg ggtgccagcc 3120
cacaagggca tcggagggaa cgagcaggtg gacaagctgg tgtccagcgg aatccggaag 3180
gtgctgttcc tggacggcat cgataaagcc caggaagagc acgagaagta ccacagcaat 3240
tggagagcca tggccagcga cttcaacctg cctcccgtgg tggccaaaga aatcgtggcc 3300
agctgcgacc agtgccagct gaaaggcgag gccatgcacg gacaggtgga ctgctcccct 3360
ggcatctggc agctggcatg cacccacctg gaaggcaaga tcattctggt ggccgtgcac 3420
gtggccagcg gatacatcga agccgaagtg atccctgccg agacagggca ggaaacagcc 3480
tacttcatcc tgaagctggc tggcagatgg cctgtgaagg tgatccacac agccaacggc 3540
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tttggcatcc cctacaatcc ccagtctcag ggagtggtgg ccagcatgaa caaagagctg 3660
aagaagatca tcggacaggt cagggatcag gccgagcacc tgaaaactgc cgtccagatg 3720
gccgtgttca tccacaactt caagcggaag ggagggatcg gagggtactc tgctggcgag 3780
cggatcatcg acatcattgc caccgatatc cagaccaaag agctgcagaa acagatcatc 3840
aagatccaga acttcagggt gtactacagg gacagcaggg accccatctg gaagggacct 3900
gccaagctgc tgtggaaagg cgaaggagcc gtcgtcatcc aggacaacag cgacatcaag 3960
gtggtgccca gacggaaggt gaaaatcatc aaggactacg gcaaacagat ggctggagcc 4020
gactgtgtcg ctggcaggca ggacgaggac 4050
<210> 21
<211> 4023
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding mos2GagPol
<400> 21
atgggagcca gagccagcat cctgcgagga gggaagctgg acaagtggga gaagatcagg 60
ctgaggcctg gagggaagaa acactacatg ctgaagcacc tggtctgggc cagcagagag 120
ctggaacggt ttgccctcaa tcctggcctg ctggaaacca gcgagggctg caagcagatc 180
atcaagcagc tgcagcctgc cctgcagaca ggcaccgagg aactgcggag cctgttcaac 240
accgtggcca ccctgtactg cgtgcatgcc gagatcgaag tgagggacac caaagaagcc 300
ctggacaaga tcgaggaaga gcagaacaag agccagcaga aaacccagca ggccaaagaa 360
gccgacggca aggtctccca gaactacccc atcgtgcaga acctgcaggg acagatggtg 420
caccagccca tcagccctcg gacactgaat gcctgggtga aggtgatcga ggaaaaggcc 480
ttcagccctg aggtgatccc catgttcaca gccctgagcg agggagccac accccaggac 540
ctgaacacca tgctgaacac cgtgggaggg caccaggctg ccatgcagat gctgaaggac 600
accatcaacg aggaagctgc cgagtgggac aggctgcacc ctgtgcacgc tggacctgtg 660
gctcctggcc agatgagaga gcccagaggc agcgatattg ctggcaccac ctccaatctg 720
caggaacaga tcgcctggat gaccagcaac cctcccatcc ctgtgggaga catctacaag 780
cggtggatca tcctgggact gaacaagatc gtgcggatgt acagccctac ctccatcctg 840
gacatcaagc agggacccaa agagcctttc agggactacg tggaccggtt cttcaagacc 900
ctgagagccg agcaggccac ccaggacgtg aagaactgga tgaccgacac cctgctggtg 960
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gaagagatga tgacagcctg ccagggagtg ggaggaccct ctcacaaggc tagggtgctg 1080
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agcaagcgga tcgtgaagtg cttcaactgt ggcaaagagg gacacattgc cagaaactgt 1200
agggcaccca ggaagaaagg ctgctggaag tgcggaaaag aaggccacca gatgaaggac 1260
tgcaccgaga ggcaggccaa cttcctgggc aagatctggc ctagccacaa gggcagacct 1320
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gaggaaaaga tcaaagccct ggtggagatc tgtaccgaga tggaaaaaga gggcaagatc 1620
agcaagatcg gacccgagaa cccctacaac acccctatct tcgccatcaa gaagaaagac 1680
agcaccaagt ggaggaaact ggtggacttc agagagctga acaagcggac ccaggacttc 1740
tgggaggtgc agctgggcat ccctcaccct gctggcctga agaaaaagaa aagcgtgacc 1800
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ctggaaccct tccggaagca gaaccctgac atcgtgatct accagtacat ggcagccctg 2040
tacgtcggca gcgacctgga aatcggacag caccggacca agatcgaaga actcaggcag 2100
cacctgctgc ggtggggatt caccacccct gacaagaagc accagaaaga gcctcccttc 2160
ctgtggatgg gctacgagct gcacccagac aagtggaccg tgcagcccat cgtgctgcct 2220
gagaaggact cctggaccgt gaacgacatc cagaaactgg tcggcaagct gaactgggcc 2280
agccagatct acgctggcat caaagtgaag cagctgtgta agctcctgag aggcaccaaa 2340
gccctgaccg aggtggtgcc actgacagag gaagccgagc tggaactggc cgagaacaga 2400
gagatcctga aagaacccgt gcacggagtg tactacgacc ccagcaagga cctgattgcc 2460
gagatccaga agcagggaca gggacagtgg acctaccaga tctaccagga acccttcaag 2520
aacctgaaaa caggcaagta cgccaggatg aggggagccc acaccaacga cgtcaaacag 2580
ctgaccgaag ccgtgcagaa gatcgccacc gagagcatcg tgatttgggg aaagacaccc 2640
aagttcaagc tgcccatcca gaaagagaca tgggaggcct ggtggaccga gtactggcag 2700
gccacctgga ttcccgagtg ggagttcgtg aacaccccac ccctggtgaa gctgtggtat 2760
cagctggaaa aagaacccat cgtgggagcc gagacattct acgtggctgg agctgccaac 2820
agagagacaa agctgggcaa ggctggctac gtgaccgaca gaggcaggca gaaagtggtg 2880
tccctgaccg ataccaccaa ccagaaaaca gccctgcagg ccatccacct ggctctgcag 2940
gactctggcc tggaagtgaa catcgtgaca gccagccagt atgccctggg catcattcag 3000
gcacagcctg acaagagcga gagcgagctg gtgtctcaga tcattgagca gctgatcaag 3060
aaagaaaagg tgtacctggc ctgggtgcca gcccacaagg ggatcggagg gaacgagcag 3120
gtggacaagc tggtgtccag gggcatccgg aaggtgctgt ttctggacgg catcgacaaa 3180
gcccaggaag agcacgagaa gtaccacagc aattggagag ccatggccag cgagttcaac 3240
ctgcctccca tcgtggccaa agaaatcgtg gcctcttgcg acaagtgcca gctgaaaggc 3300
gaggccattc acggacaggt ggactgcagc ccaggcatct ggcagctggc ctgcacccac 3360
ctggaaggca aggtgatcct ggtggccgtg cacgtggcct ctggatacat cgaagccgaa 3420
gtgatccctg ccgagacagg ccaggaaaca gcctacttcc tgctgaagct ggctggcagg 3480
tggcctgtga aaaccatcca cacagccaac ggcagcaact tcacctctgc caccgtgaag 3540
gctgcctgtt ggtgggctgg cattaagcag gaatttggca tcccctacaa ccctcagtct 3600
cagggagtgg tggcctccat caacaaagag ctgaagaaga tcatcggaca ggtcagggat 3660
caggccgagc atctgaaaac agccgtccag atggccgtgt tcatccacaa cttcaagcgg 3720
aagggaggga tcggagagta ctctgctggc gagaggatcg tggacattat cgccagcgat 3780
atccagacca aagaactgca gaagcagatc acaaagatcc agaacttcag ggtgtactac 3840
agggacagca gagatcccct gtggaaggga cctgccaagc tgctgtggaa aggcgaagga 3900
gccgtcgtca tccaggacaa cagcgacatc aaggtggtgc ccagacggaa ggccaagatc 3960
atcagagact acggcaaaca gatggctggc gacgactgcg tcgcctctag gcaggacgag 4020
gac 4023
<210> 22
<211> 2055
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding mos1Env
<400> 22
atgcgggtga ccggcatccg gaagaactac cagcacctgt ggcggtgggg caccatgctg 60
ctgggcatcc tgatgatttg ctctgccgcc ggaaagctgt gggtgaccgt gtactacggc 120
gtgcccgtgt ggaaagaggc caccaccacc ctgttctgcg ccagcgacgc caaggcctac 180
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caggaagtgg tcctggaaaa cgtgaccgag aacttcaaca tgtggaagaa caacatggtg 300
gagcagatgc acgaggacat catcagcctg tgggaccaga gcctgaagcc ctgcgtgaag 360
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accggcccct gcaccaacgt gagcaccgtg cagtgcaccc acggcatccg gcccgtggtg 780
tccacccagc tgctgctgaa cggcagcctg gccgaggaag aggtggtgat cagaagcgag 840
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gcccctccca tccggggcca gatccggtgc agcagcaaca tcaccggcct gctgctgacc 1380
cgggacggcg gcaacgatac cagcggcacc gagatcttcc ggcctggcgg cggagatatg 1440
cgggacaact ggcggagcga gctgtacaag tacaaggtgg tgaagatcga gcccctgggc 1500
gtggctccca ccaaggccaa gcggcgggtg gtgcagagcg agaagagcgc cgtgggcatc 1560
ggcgccgtgt ttctgggctt cctgggagcc gccggaagca ccatgggagc cgccagcatg 1620
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ctccgggcca tcgaggccca gcagcacctg ctgcagctga ccgtgtgggg catcaagcag 1740
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agcaactggc tgtgg 2055
<210> 23
<211> 2052
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding mos2Env
<400> 23
atgagagtgc ggggcatcca gcggaactgg ccccagtggt ggatctgggg catcctgggc 60
ttttggatga tcatcatctg ccgggtgatg ggcaacctgt gggtgaccgt gtactacggc 120
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acctacaaca tcatccacaa cgagacctac aaagagatga agaactgcag cttcaacgcc 480
accaccgtgg tggaggaccg gaagcagaag gtgcacgccc tgttctaccg gctggacatc 540
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agcaacaacg gcgtgcctaa cgacaccgag accttccggc ctggcggcgg agatatgcgg 1440
aacaactggc ggagcgagct gtacaagtac aaggtggtgg aggtgaagcc cctgggcgtg 1500
gctcctaccg aggccaagcg gcgggtggtg gagagcgaga agagcgccgt gggcatcggc 1560
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aagagccaga ccgacatctg ggacaacatg acctggatgc agtgggacaa agagatcggc 1920
aactacaccg gcgagatcta caggctgctg gaagagagcc agaaccagca ggaaaagaac 1980
gagaaggacc tgctggccct ggacagctgg aagaacctgt ggaactggtt cgacatcacc 2040
aactggctgt gg 2052
<210> 24
<211> 829
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMV promoter used for expression of antigens in Ad26 vectors
<400> 24
tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60
ttggccattg catacgttgt atccatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120
aacattaccg ccatgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat 540
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 660
cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720
tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag 780
aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg ccgggaacgg tgcattgga 829
<210> 25
<211> 2586
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding c4
<400> 25
atgagagtgc ggggcatgct gagaaactgg cagcagtggt ggatctggtc cagcctgggc 60
ttctggatgc tgatgatcta cagcgtgatg ggcaacctgt gggtcaccgt gtactacggc 120
gtgcccgtgt ggaaggacgc caagaccacc ctgttttgcg cctccgatgc caaggcctac 180
gagaaagagg tgcacaacgt ctgggccacc cacgcctgtg tgcccaccga ccccaatccc 240
caggaaatcg tcctgggcaa cgtgaccgag aacttcaaca tgtggaagaa cgacatggtc 300
gatcagatgc acgaggacat catctccctg tgggacgcct ccctggaacc ctgcgtgaag 360
ctgacccctc tgtgcgtgac cctgaactgc cggaacgtgc gcaacgtgtc cagcaacggc 420
acctacaaca tcatccacaa cgagacatac aaagagatga agaactgcag cttcaacgct 480
accaccgtgg tcgaggaccg gaagcagaag gtgcacgccc tgttctaccg gctggacatc 540
gtgcccctgg acgagaacaa cagcagcgag aagtcctccg agaacagctc cgagtactac 600
agactgatca actgcaacac cagcgccatc acccaggcct gccccaaggt gtccttcgac 660
cctatcccca tccactactg cgcccctgcc ggctacgcca tcctgaagtg caacaacaag 720
accttcaatg gcaccggccc ctgcaacaat gtgtccaccg tgcagtgcac ccacggcatc 780
aagcccgtgg tgtctaccca gctgctgctg aacggcagcc tggccgagga agagatcatt 840
atcagaagcg agaacctgac caacaacgcc aaaaccatca tcgtccacct gaacgaaacc 900
gtgaacatca cctgtacccg gcctaacaac aacacccgga agtccatccg gatcggccct 960
ggccagacct tttacgccac cggcgatatt atcggcgaca tccggcaggc ccactgcaat 1020
ctgagccggg acggctggaa caagacactg cagggcgtca agaagaagct ggccgaacac 1080
ttccctaaca agactatcaa gttcgcccct cactctggcg gcgacctgga aatcaccacc 1140
cacaccttca actgtcgggg cgagttcttc tactgcaata cctccaacct gttcaacgag 1200
agcaacatcg agcggaacga cagcatcatc acactgcctt gccggatcaa gcagattatc 1260
aatatgtggc aggaagtggg cagagccatc tacgcccctc caatcgccgg caacatcaca 1320
tgccggtcca atatcaccgg cctgctgctc accagagatg gcggctccaa caatggcgtg 1380
ccaaacgaca ccgagacatt cagacccggc ggaggcgaca tgcggaacaa ttggcggagc 1440
gagctgtaca agtacaaggt ggtggaagtg aagcccctgg gcgtggcccc taccgaggcc 1500
aagagaagag tggtcgaacg cgagaagcgg gccgtgggaa tcggagccgt gtttctggga 1560
atcctgggag ccgctggctc taccatgggc gctgcctcta tcaccctgac agtgcaggcc 1620
agacagctgc tcagcggcat cgtgcagcag cagagcaacc tgctgagagc cattgaggcc 1680
cagcagcaca tgctgcagct gaccgtgtgg ggcattaagc agctccagac acgggtgctg 1740
gccatcgaga gatacctgca ggatcagcag ctcctgggcc tgtggggctg tagcggcaag 1800
ctgatctgta ccaccgccgt gccctggaat acctcttgga gcaacaagag ccagaccgac 1860
atctgggaca acatgacctg gatgcagtgg gacaaagaaa tcggcaacta taccggcgag 1920
atctatagac tgctggaaga gtcccagaac cagcaggaaa agaacgagaa ggacctgctg 1980
gccctggatt cttggaacaa tctgtggaac tggttcagca tctccaagtg gctgtggtac 2040
atcaagatct tcatcatgat cgtgggcggc ctgatcggcc tgcggatcat ctttgccgtg 2100
ctgagcatcg tgaaccgcgt gcggcaggga tacagccctc tgagcctgca gaccctgact 2160
cagaaccctg gcggactgga cagactgggc cggattgagg aagaaggcgg cgagcaggac 2220
aaggatcgga gcatcaggct ggtcaacggc ttcttcgctc tgttttggga cgacctgcgg 2280
agcctgtgcc tgttcagcta ccacagactg cgggacttta tcctgattgt ggccagagcc 2340
gtcgaactgc tggggagaag ctctctgaga ggcctgcagc ggggctggga gattctgaag 2400
tacctgggct ccctgctgca gtactggggc ctggaactga agaagtctgc catcaatctg 2460
ctcgacacaa tcgctattgc cgtggccgaa ggcaccgata gaatcatcga gctgatccag 2520
cggatctgcc gggccatctg caacatcccc agacggatca gacagggctt cgaggccgct 2580
ctgcag 2586
<210> 26
<211> 2133
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding C4D7
<400> 26
atgagagtgc ggggcatgct gagaaactgg cagcagtggt ggatctggtc cagcctgggc 60
ttctggatgc tgatgatcta cagcgtgatg ggcaacctgt gggtcaccgt gtactacggc 120
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<210> 35
<211> 2148
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding C1D7
<400> 35
atgagagtgc ggggcattca gagaaactgg ccccagtggt ggatctgggg catcctgggc 60
ttttggatga tcattatctg ccgcgtgatg ggcaacctgt gggtcaccgt gtactacggc 120
gtgcccgtgt ggaaagaggc caagaccacc ctgttctgcg ccagcgacgc caaggcctac 180
gagaaagagg tgcacaacgt ctgggccacc cacgcctgtg tgcccaccga ccccaatccc 240
caggaaatgg tcctggaaaa cgtgaccgag aacttcaaca tgtggaagaa cgacatggtg 300
gaccagatgc acgaggacat catccggctg tgggaccaga gcctgaagcc ctgcgtgaag 360
ctgacccctc tgtgcgtgac cctggaatgc cggaacgtgc gcaacgtgtc cagcaacggc 420
acctacaata tcatccacaa cgagacatac aaagagatga agaactgcag cttcaacgct 480
accaccgtgg tcgaggaccg gaagcagaag gtgcacgccc tgttttaccg gctggacatc 540
gtgcccctgg acgagaacaa cagcagcgag aagtcctccg agaacagctc cgagtactac 600
agactgatca actgcaacac cagcgccatc acccaggcct gccccaaggt gtccttcgac 660
cctatcccca tccactactg cgcccctgcc ggctacgcca tcctgaagtg caacaacaag 720
accttcaatg gcaccggccc ctgcaacaat gtgtccaccg tgcagtgcac ccacggcatc 780
aagcccgtgg tgtctaccca gctgctgctg aacggcagcc tggccgagga agagatcatc 840
atcagaagcg agaacctgac caacaacgcc aagacaatca tcgtccacct gaacgaaacc 900
gtgaacatca cctgtacccg gcctaacaac aacacccgga agtccatccg gatcggccct 960
ggccagacct tttacgccac cggcgatatt atcggcgaca tccggcaggc ccactgcaat 1020
ctgagccggg acggctggaa caagacactg cagggcgtca agaagaagct ggccgaacac 1080
ttccccaaca aaaccatcaa cttcaccagc tcctctggcg gcgacctgga aatcaccacc 1140
cacagcttta actgcagagg cgagttcttc tactgcaata cctccggcct gttcaatgga 1200
acctacatgc ccaacgggac caacagcaac tccagcagca atatcaccct gccttgccgg 1260
atcaagcaga ttatcaatat gtggcaggaa gtgggcagag ctatgtacgc ccctccaatc 1320
gccggcaaca tcacatgcag aagcaacatt accggcctgc tgctcaccag ggacggcggc 1380
tctaacaatg gcgtgccaaa cgacaccgag acattcagac ccggcggagg cgacatgcgg 1440
aacaattggc ggagcgagct gtacaagtac aaggtggtgg aagtgaagcc cctgggcgtg 1500
gcccctaccg aagccaagag aagagtggtc gaacgcgaga agcgggccgt gggcattgga 1560
gccgtgtttc tgggaatcct gggagccgct ggcagcacca tgggcgctgc ctctatcaca 1620
ctgacagtgc aggccagaca gctcctgagc ggcatcgtgc agcagcagag caacctgctg 1680
agagccatcg aggcacagca gcacatgctg cagctgaccg tgtggggcat taagcagctc 1740
cagacacggg tgctggccat tgagagatac ctgcaggatc agcagctgct cggcctgtgg 1800
ggctgtagcg gcaagctgat ctgtaccacc gccgtgcctt ggaacacctc ctggtccaac 1860
aagagccaga ccgacatctg ggacaacatg acctggatgc agtgggacaa agaaatcggc 1920
aactataccg gcgagatcta ccgactgctg gaagagtccc agaaccagca ggaaaagaac 1980
gagaaggacc tgctggccct ggacagctgg aaaaatctgt ggaattggtt cgacatcacc 2040
aactggctgt ggtacatcaa gatcttcatc atgatcgtgg gcggcctgat cggcctgcgg 2100
atcatctttg ccgtgctgag catcgtgaac cgcgtgcggc agggctac 2148
<210> 36
<211> 724
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mosaic Env trimer sequence
<400> 36
Met Arg Val Arg Gly Ile Gln Arg Asn Cys Gln His Leu Trp Arg Trp
1 5 10 15
Gly Thr Leu Ile Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala Ala Gly Lys
20 25 30
Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala Thr
35 40 45
Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu Val
50 55 60
His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro
65 70 75 80
Gln Glu Val Val Leu Glu Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys
85 90 95
Asn Asn Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp
100 105 110
Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu
115 120 125
Asn Cys Thr Asp Asp Val Arg Asn Val Thr Asn Asn Ala Thr Asn Thr
130 135 140
Asn Ser Ser Trp Gly Glu Pro Met Glu Lys Gly Glu Ile Lys Asn Cys
145 150 155 160
Ser Phe Asn Ile Thr Thr Ser Ile Arg Asn Lys Val Gln Lys Gln Tyr
165 170 175
Ala Leu Phe Tyr Lys Leu Asp Val Val Pro Ile Asp Asn Asp Ser Asn
180 185 190
Asn Thr Asn Tyr Arg Leu Ile Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln
195 200 205
Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala
210 215 220
Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asp Lys Lys Phe Asn Gly
225 230 235 240
Thr Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile
245 250 255
Arg Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu
260 265 270
Glu Glu Val Val Ile Arg Ser Glu Asn Phe Thr Asn Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Ile Met Val Gln Leu Asn Val Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro
290 295 300
Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe
305 310 315 320
Tyr Thr Ala Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cys Asn
325 330 335
Ile Ser Arg Ala Asn Trp Asn Asn Thr Leu Arg Gln Ile Val Glu Lys
340 345 350
Leu Gly Lys Gln Phe Gly Asn Asn Lys Thr Ile Val Phe Asn His Ser
355 360 365
Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile Val Met His Ser Phe Asn Cys Gly Gly
370 375 380
Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Ser Thr Lys Leu Phe Asn Ser Thr Trp Thr
385 390 395 400
Trp Asn Asn Ser Thr Trp Asn Asn Thr Lys Arg Ser Asn Asp Thr Glu
405 410 415
Glu His Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp
420 425 430
Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Arg Gly Gln Ile
435 440 445
Arg Cys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly
450 455 460
Asn Asp Thr Ser Gly Thr Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met
465 470 475 480
Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile
485 490 495
Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Glu Arg Val Val Gln
500 505 510
Arg Glu Glu Arg Ala Val Gly Ile Gly Ala Val Phe Leu Gly Phe Leu
515 520 525
Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val
530 535 540
Gln Ala Arg Leu Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu
545 550 555 560
Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp
565 570 575
Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu
580 585 590
Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile
595 600 605
Cys Thr Thr Thr Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu
610 615 620
Asp Lys Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Glu Ile
625 630 635 640
Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile Tyr Thr Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn
645 650 655
Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala
660 665 670
Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asp Ile Ser Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys
675 680 685
Ser Arg Ile Glu Gly Arg Gly Ser Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro
690 695 700
Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu
705 710 715 720
Ser Thr Phe Leu
<210> 37
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Residues 655-682 of SEQ ID NO:18
<400> 37
Asn Glu Lys Asp Leu Leu Ala Leu Asp Ser Trp Asn Asn Leu Trp Asn
1 5 10 15
Trp Phe Ser Ile Ser Lys Trp Leu Trp Tyr Ile Lys
20 25
<210> 38
<211> 4056
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of Mos1Gag-Pol antigen
<400> 38
atgggagcta gagccagtgt gctgagcggc ggagagctgg atagatggga gaaaattcgg 60
ctgcggccag gcggcaaaaa gaagtatcgc ctgaaacata ttgtgtgggc ctctcgcgag 120
ctggaaagat ttgctgtgaa tcctggactg ctcgagacat ctgaaggctg ccgccagatc 180
ctcggtcaac tgcagccatc tctgcagacc ggctcagaag agctgagatc tctgtataat 240
actgtcgcca cactctattg cgtccaccag cgcattgaaa tcaaagatac aaaggaggct 300
ctggagaaga tagaagagga acagaataag tctaaaaaga aggctcagca ggccgctgcc 360
gataccggca acagctctca ggtctcacaa aattacccta tcgttcagaa tattcaaggt 420
caaatggtcc atcaggctat cagccctcgc acactgaatg cttgggtgaa agtggtcgag 480
gaaaaagcct ttagtccaga ggttatacct atgtttagcg cactgtctga aggagccact 540
cctcaggacc tcaataccat gctgaatact gtcggaggcc atcaggccgc tatgcaaatg 600
ctgaaagaaa ccattaacga ggaagccgcc gaatgggatc gagtgcatcc agtccatgca 660
ggaccaatcg ctccaggcca gatgagagaa cctcgaggct ctgatatcgc cggaaccaca 720
agcacactgc aggaacagat tggatggatg acaaacaatc ctcctatccc tgtcggcgag 780
atctataaga gatggattat cctcggcctc aacaagattg tcagaatgta ttcacctgtg 840
tccattctgg atatccgcca aggacctaaa gagccattcc gcgattacgt cgaccgcttt 900
tacaaaaccc tgagagctga gcaggcatct caggatgtca aaaattggat gacagaaact 960
ctcctggtcc agaacgctaa tcctgattgc aagacaattc tgaaggctct gggaccagcc 1020
gccactctcg aggaaatgat gaccgcttgt cagggagtcg gaggacctgg acacaaggca 1080
agagtgctcg ctgaagccat gtctcaggtc acaaacagcg ccacaattat gatgcagcgc 1140
ggtaacttca gaaaccagcg gaaaaccgtc aagtgtttta attgcggtaa agagggccat 1200
attgccaaaa attgcagagc tcctcggaaa aagggctgct ggaaatgtgg aaaagaaggt 1260
catcaaatga aggattgcac agaacgccag gccaatttcc ttgggaagat ttggccttcc 1320
aacaaaggcc gaccaggaaa ctttctgcag aatcggcctg agcctaccgc tccacctgaa 1380
gagagcttta gattcggcga ggaaacaacc acaccatctc agaaacaaga gcctattgat 1440
aaggaaatgt atcctctggc ttctctgaag tctctgttcg gcaatgatcc tagctcacaa 1500
atggctccca ttagtcctat tgaaacagtg cctgtgaaac tgaaacctgg aatggacggt 1560
cctagagtca agcagtggcc tctcacagaa gagaagatta aggcactcac cgctatttgc 1620
gaagagatgg agaaagaagg caagattaca aagattggac ctgagaatcc atacaataca 1680
cctgtctttg ccatcaaaaa gaaagattct accaaatggc gcaagctcgt ggatttcaga 1740
gaactcaaca aacgcacaca ggatttttgg gaggtccagc tcggaattcc tcatccagcc 1800
ggactgaaaa agaagaagtc cgtcacagtc ctggcagtcg gcgacgccta tttctccgtg 1860
cctctcgatg aaggttttag gaagtatacc gcctttacaa ttccatccac aaacaacgaa 1920
acaccaggca tccggtacca gtataatgtc ctgccacaag gatggaaggg atctcctgcc 1980
atctttcagt gttccatgac acggatcctt gaacctttca gagccaagaa tccagagatt 2040
gtgatctatc aatacatggc cgcactctat gtcggatctg acctcgagat tggacagcac 2100
cgcgccaaga tcgaagagct gagagaacat ctgctgaaat ggggctttac aacaccagat 2160
aagaaacatc agaaagaacc tccttttctt tggatgggat atgaactgca tcccgacaaa 2220
tggacagtcc agcctatcca gctgccagag aaggatagct ggaccgttaa tgatattcag 2280
aagctcgttg gtaaactgaa ttgggccagt caaatctatc ctggaatcaa agtccgacag 2340
ctgtgcaagc tgctcagagg cgccaaggct ctcaccgata ttgtgcctct gaccgaagag 2400
gctgaactgg agctggccga gaatagagaa atcctcaagg agcctgtcca cggcgtctac 2460
tacgatcctt ctaaagacct gatcgctgaa atccaaaagc aaggacatga tcaatggaca 2520
tatcagatct accaggagcc ttttaagaat cttaagaccg gcaagtatgc caaaatgcgc 2580
accgctcata caaatgacgt gaaacagctc accgaggctg tccagaaaat tgctatggaa 2640
tctatcgtca tttggggcaa aacacctaaa ttccggcttc ctattcagaa agaaacctgg 2700
gagacatggt ggacagatta ctggcaagct acatggatcc ctgaatggga atttgtgaat 2760
acacctcctc tcgtcaaact gtggtaccag ttggagaagg atccaatcgc cggcgtggaa 2820
acattctatg tggcaggcgc cgctaacaga gaaactaagc tcggcaaggc cggatatgtg 2880
acagacagag gtagacagaa gattgtatct ctgacagaga caacaaatca gaaaaccgct 2940
ctccaggcta tctacctcgc actgcaggat tccggcagcg aagtgaatat tgtgaccgcc 3000
tctcagtatg cactcggaat tattcaggca cagcctgata agtccgagtc cgagctggtc 3060
aatcagatca tcgaacagct gattaagaag gaaagagtct acctgtcttg ggtgccagca 3120
cacaagggaa tcggcggcaa tgaacaggtg gacaaacttg tgtcctccgg tattagaaag 3180
gtcctgttcc tcgatggaat tgacaaggct caggaagaac acgagaaata tcactccaac 3240
tggagagcta tggcctccga tttcaatctg ccacctgttg tggctaagga aattgtcgct 3300
tcctgcgatc agtgtcaact caaaggcgaa gctatgcatg gacaggtcga ctgttctcct 3360
ggaatatggc aactcgcttg tacacacctc gaaggcaaaa tcatcctcgt ggctgtccat 3420
gtggcctccg gctatattga agccgaagtg attcctgctg aaaccggcca ggaaaccgct 3480
tactttattc tgaaactcgc tggacggtgg cctgtgaaag tgattcatac cgccaatggc 3540
tccaacttca ccagcgccgc tgtgaaagcc gcttgctggt gggccggaat ccagcaggag 3600
ttcggaatac cgtataaccc tcagtcacaa ggagtggtcg cctctatgaa caaggaattg 3660
aagaaaatca taggtcaagt ccgagaccaa gccgaacacc tcaagaccgc tgtccagatg 3720
gcagtcttta tccacaattt caagcgcaaa ggcggcattg gcggctacag tgccggcgag 3780
agaattatcg acataatcgc cacagacatt cagacaaagg agctccagaa gcagataatc 3840
aagatacaga atttccgcgt gtactaccgc gactctagag accctatatg gaagggtcca 3900
gctaagctct tgtggaaggg cgaaggcgct gtggtcattc aggacaattc cgatatcaag 3960
gtcgttcctc ggcggaaagt caagatcatt aaggattatg gtaaacaaat ggccggagct 4020
gattgcgtgg caggccggca ggacgaagat tgataa 4056
<210> 39
<211> 2061
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of Mos1Env antigen
<400> 39
atgcgcgtga ccggcatcag gaaaaactat cagcatctgt ggagatgggg tacaatgctc 60
ctcggaattc tcatgatctg tagcgccgct ggcaaactgt gggttacagt ctattatggc 120
gttccagtgt ggaaagaagc tacaacaaca ctgttctgtg cctccgatgc caaggcctat 180
gatacagaag tgcataacgt ctgggctaca catgcttgtg tgcctaccga tcctaatcct 240
caggaggtcg tcctcgaaaa cgtcacagaa aactttaata tgtggaaaaa caatatggtc 300
gaacagatgc acgaagatat catttctctg tgggatcaga gtctcaagcc ttgtgtgaaa 360
ctgacacctc tgtgcgtcac actcaattgc acagatgatg tccggaacgt cacaaacaat 420
gctacaaata ccaactcctc ctggggtgaa cctatggaaa aaggcgaaat caaaaattgt 480
tcctttaata tcacaaccag catccgcaac aaagtccaga aacagtatgc tctcttttac 540
aaactcgacg tcgtgcctat cgataatgac tccaacaata caaattaccg cctcatctcc 600
tgtaacacct ccgtgattac tcaggcctgt cctaaagtct cttttgagcc tatcccaatt 660
cactattgtg cacctgctgg atttgccatc ctcaagtgta atgacaagaa gtttaacggt 720
accggtcctt gtaccaacgt gtccacagtg cagtgtacac acggaattag acctgtggtg 780
tctactcagc tgctcctgaa tggctctctg gccgaagagg aagtcgtgat tcggagcgag 840
aactttacaa ataacgctaa aacaatcatg gtccagctca atgtctccgt cgagattaac 900
tgtaccagac ctaacaataa cactcgcaag tccatccaca ttggaccagg acgcgccttt 960
tacaccgctg gtgacattat cggagatatc aggcaggcac actgtaatat ctctcgcgcc 1020
aactggaaca acactctcag acagattgtc gagaagctcg gtaaacagtt tggtaacaac 1080
aaaacaatcg tctttaatca cagctctggc ggcgatcctg agatcgtcat gcattccttc 1140
aattgcggag gggagttctt ttattgcaac tctaccaagc tctttaactc cacatggact 1200
tggaataaca gcacatggaa caataccaaa cgctccaacg atacagagga acacatcact 1260
ttgccatgca gaatcaagca aatcattaac atgtggcaag aggtgggtaa agccatgtat 1320
gctcctccta tcagaggaca gatcagatgc agctccaaca ttacaggcct gctcctgaca 1380
agagatggcg gaaacgacac ctccggaaca gagatcttca gaccaggcgg aggagacatg 1440
agagacaact ggagaagcga actctataag tataaggtcg tcaagattga gccacttgga 1500
gtggctccca caaaggccaa gagacgcgtg gtgcagtccg aaaagtccgc cgtcggaatt 1560
ggagctgtgt ttctcggatt tctgggagct gccggctcta ccatgggagc agcctccatg 1620
acactgacag tccaggctag actgctgctg agtggcattg tccagcaaca gaacaatctc 1680
ctgagagcca ttgaagctca gcaacatctc ctccagctca cagtctgggg catcaaacag 1740
ctccaggcaa gagtgctcgc cgtcgagcgg tacctgaaag accagcaact cctcggcatt 1800
tggggctgtt ccggaaaact gatctgcacc acaacagttc cctggaatgc ctcttggagc 1860
aacaaatctc tcgataagat ttggaataac atgacttgga tggagtggga aagagaaatc 1920
aacaactaca cctctctcat ctacacactc atcgaagagt ctcaaaatca gcaagaaaag 1980
aatgaacagg agctcctcga gctggataag tgggcttctc tctggaattg gttcgatatc 2040
tctaactggc tctggtgata a 2061
<210> 40
<211> 4029
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of Mos2 Gag-Pol antigen
<400> 40
atgggcgcca gagcctctat cctgcgcgga ggcaaactgg ataagtggga aaagattaga 60
ctccgacctg gcggtaaaaa gcattatatg ctcaaacacc tcgtctgggc tagcagagaa 120
ctcgagagat tcgctctgaa ccctggtctc ctggaaacat ccgaagggtg taaacagatt 180
atcaaacagc tccagcctgc actccagact ggaacagagg aacttcgctc tctgtttaat 240
accgtggcta cactgtattg tgtgcacgct gaaatcgaag tccgcgacac aaaagaagct 300
ctcgacaaaa ttgaggaaga gcagaacaaa tctcagcaga agacacagca ggctaaggaa 360
gccgacggaa aagtgagcca gaattatccc attgtccaaa atctccaagg acagatggtg 420
catcagccaa tctctccaag aacactcaac gcctgggtca aggtcataga agagaaggca 480
ttctcacctg aagtcattcc aatgttcacc gctctgtccg aaggcgcaac accacaggat 540
ctgaacacta tgctcaatac cgtcggcgga caccaggcag caatgcagat gctcaaggat 600
acaatcaatg aagaggcagc tgagtgggat agactccatc ctgtgcatgc cggtccagtc 660
gcacctggac agatgcgcga gcctagaggc tccgacattg ctggcacaac cagtaacctc 720
caggagcaga tcgcttggat gacttccaat ccacctattc cagtcggaga tatctacaaa 780
cgctggatca ttctcggtct gaacaaaatc gtgcggatgt actctcctac cagcatcctc 840
gatattaagc aaggtccaaa agaacctttt cgagactatg tcgacagatt ctttaaaaca 900
ctgcgcgcag aacaggctac acaggacgtg aagaactgga tgactgatac actcctcgtg 960
cagaatgcaa atccagactg taaaacaatc ctgagagctc tcggtccagg cgctacactg 1020
gaagagatga tgactgcatg tcaaggtgtc ggtggaccta gccacaaagc tcgcgtgctg 1080
gcagaggcta tgtcacagac caattccaca atcctcatgc aacgctccaa tttcaaaggc 1140
tccaagcgca ttgtcaaatg ctttaactgt ggcaaagaag gacatatcgc tcggaattgc 1200
cgcgcaccac gcaagaaagg atgttggaag tgcggcaagg aaggacatca gatgaaagac 1260
tgtactgaga gacaagctaa ttttctcggc aaaatctggc catctcacaa aggacgacct 1320
ggaaatttcc tgcagtctcg gccagaacct acagctcctc ctgccgagtc cttcagattc 1380
gaagagacta caccagctcc taaacaggaa cctaaggata gagaacctct gacctctctg 1440
cgcagcctgt ttggctccga tcctctgtcc cagatggcac caatttctcc aatcgaaacc 1500
gttcctgtca agctcaagcc aggcatggat ggaccaaaag tcaaacaatg gccactcact 1560
gaggagaaaa tcaaggctct ggtcgaaatc tgcacagaaa tggaaaagga aggaaagatt 1620
tccaaaatcg gaccagaaaa tccttacaac acacctatct ttgctattaa gaagaaggac 1680
tccacaaagt ggcgaaagct ggtcgacttt cgcgagctga acaagagaac tcaggacttc 1740
tgggaagtgc aactcggtat tccacatcct gcaggactca agaaaaagaa atctgtcact 1800
gtgctcgccg tcggtgacgc ttacttttct gtgccactgg atgaagattt tcgcaagtac 1860
accgcattca caatcccttc cattaacaat gagacacctg gtattcgcta tcagtacaat 1920
gtgcttcctc aaggctggaa aggtagtcct gctattttcc agtcctctat gacaaagatt 1980
cttgagcctt ttcgcaaaca gaatcctgat atcgtcatct accagtatat ggcagctctg 2040
tacgtcggct ctgatctgga aatcggccag catagaacta agattgagga actccgacag 2100
cacctgctcc gctggggttt tactactcct gacaagaagc accagaagga accaccattc 2160
ctctggatgg gttacgaact tcatcctgat aagtggactg tgcagccaat tgtcctgcct 2220
gaaaaggatt cttggacagt caatgacatc cagaaactcg tcggaaaact caactgggct 2280
tctcagatct atgccggcat taaggtcaag cagctctgca aactcctgag aggcacaaag 2340
gcactgacag aagtggttcc tctcactgaa gaagcagaac tcgaactcgc tgagaaccgc 2400
gaaattctca aagaaccagt gcatggtgtc tattatgatc caagcaaaga tctcattgca 2460
gagattcaga aacaaggcca aggccagtgg acttaccaaa tctatcagga acctttcaaa 2520
aatctcaaga caggcaaata cgctcggatg cgaggcgctc acaccaatga tgtcaagcaa 2580
ctcacagagg cagtgcagaa gattgccaca gagtctattg tgatctgggg aaagactcca 2640
aagtttaagc ttccaatcca aaaggagact tgggaagctt ggtggactga atattggcag 2700
gcaacttgga ttccagagtg ggagtttgtc aatactccac cactcgtgaa gctctggtat 2760
cagctcgaga aagagcctat cgtcggcgcc gaaacctttt atgtcgctgg tgccgcaaac 2820
cgcgagacaa aactcggaaa agcaggatac gtcaccgata gaggacggca gaaggtcgtc 2880
agcctgaccg acactactaa ccagaagact gcacttcagg caattcatct ggctctccag 2940
gatagcggtc tggaagtcaa tatcgtcacc gctagtcagt acgctctggg tattatccag 3000
gctcagccag acaaaagcga atccgaactc gtgtctcaga ttattgagca gctcatcaag 3060
aaagagaaag tctatctcgc ctgggttccg gctcacaaag gcattggtgg aaatgagcaa 3120
gtcgataagc tcgtcagcag aggaatcagg aaagtcctct tcctggacgg tatcgataag 3180
gcacaggagg aacatgagaa gtaccacagt aactggcgcg ccatggcttc tgagtttaac 3240
ctgcctccaa tcgtcgccaa agagatcgtg gcaagctgtg acaaatgtca gctgaaagga 3300
gaggcaatcc atggccaggt tgactgctca ccaggaattt ggcagctcgc ctgcactcat 3360
ctggaaggaa aagtgattct ggtcgctgtg catgtcgcta gtggctacat cgaggctgag 3420
gtcatacctg cagagacagg acaggagact gcttattttc tgctcaagct cgccggaaga 3480
tggccagtca agaccattca caccgctaac ggctctaatt tcacaagcgc cacagtcaaa 3540
gcagcatgtt ggtgggctgg tatcaaacag gaattcggca ttccttataa tccacagtct 3600
caaggcgtcg tggctagtat caacaaagaa ctcaaaaaga tcattggcca agtcagagac 3660
caggctgagc atctcaaaac tgcagtgcaa atggctgtgt ttattcataa ctttaagaga 3720
aaaggtggca tcggcgagta cagcgctggc gagcgcatcg tggatattat tgcttcagat 3780
atacagacta aggaactgca gaaacaaatt accaagatcc agaactttag agtctactac 3840
agagattctc gagatcctct ctggaaagga ccagcaaaac ttctgtggaa aggagaaggt 3900
gcagtcgtga tccaggataa ctctgacatc aaagtggtgc ctcggagaaa ggccaaaatc 3960
attagagatt acggaaagca gatggcaggc gatgattgtg tcgctagtag acaggatgag 4020
gattgataa 4029
<210> 41
<211> 2139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of Env Mos2-C4D7 antigen
<400> 41
atgcgagtca gaggtatgct gagaaattgg cagcagtggt ggatttggtc cagcctcgga 60
ttctggatgc tgatgatcta cagcgtcatg ggtaatctct gggtcacagt gtattacgga 120
gttcctgtct ggaaggacgc caagactaca ctcttttgcg cctctgacgc caaagcttac 180
gaaaaggaag tccacaatgt gtgggcaact catgcctgtg ttcctacaga tccaaatcca 240
caggagatcg tgctcggcaa tgtcaccgag aatttcaaca tgtggaagaa tgatatggtg 300
gatcaaatgc atgaggacat catttccctc tgggacgcct ctctggaacc atgtgtcaag 360
ctcactccac tgtgtgtgac cctcaactgc agaaacgtgc gcaacgtgtc ctccaatggc 420
acatacaata tcattcataa tgagacttat aaggaaatga agaattgctc tttcaatgcc 480
accacagtcg tcgaggatcg caaacagaaa gtccatgctc tgttttaccg gctggatatc 540
gttcctctcg atgagaacaa ttcctccgag aagtcctctg agaactctag cgagtactac 600
aggctcatta attgtaatac ctctgccatc acacaggctt gtccaaaggt ctccttcgat 660
cctattccta tccattactg tgctcctgcc ggatacgcta ttctcaaatg taacaacaag 720
acattcaatg gtactggtcc atgcaacaat gtgtctaccg tccagtgcac tcatggtatt 780
aagcctgtcg tcagtacaca gctcctgctc aatggatctc tcgctgagga agaaatcatt 840
atcagaagtg aaaacctcac taacaacgcc aaaaccatta ttgtccatct gaacgagaca 900
gtcaatatca catgcacacg acctaataac aataccagaa agtctatcag aatcggacct 960
ggccagacat tctatgccac aggcgatatc attggtgaca ttagacaggc tcattgcaat 1020
ctgtccagag atggttggaa taagacactc caaggtgtca agaagaaact cgccgaacac 1080
tttcctaaca agaccattaa gtttgcccct cactcaggcg gtgacctcga gattacaaca 1140
cacaccttta actgtagagg cgaattcttc tactgtaaca caagcaacct cttcaacgag 1200
agcaacatcg agcggaacga cagcatcatt acacttccat gtcgcatcaa gcagatcatt 1260
aatatgtggc aggaagtcgg acgcgctatc tacgctccac ctattgccgg aaacatcaca 1320
tgtcggagca atattaccgg actcctgctc acacgcgacg gtggctctaa caatggcgtg 1380
ccaaatgata ccgaaacctt tagacctggt ggaggcgaca tgcgcaacaa ttggcgctct 1440
gaactgtaca agtacaaagt cgtcgaagtc aaacctctcg gagtcgctcc taccgaggct 1500
aaacgcagag tggtggaacg cgagaagcgg gctgtcggta tcggtgcagt gttcctaggc 1560
atcctcggcg cagccggcag cacaatgggc gctgcttcta ttacactcac tgtgcaggcc 1620
agacagctcc tgagcggaat tgtgcagcag caatcaaatc tgctgcgcgc tatcgaagca 1680
cagcagcata tgctccaact gactgtttgg ggtattaagc aactgcagac tagagtcctg 1740
gccattgaac ggtatctcca ggatcagcag ctgctcggac tctggggatg ctctggcaag 1800
ctcatctgta caacagctgt gccttggaac acttcctggt ctaacaagtc tcagaccgat 1860
atttgggata atatgacatg gatgcagtgg gataaggaaa tcggtaatta tacaggcgag 1920
atctaccgac tgctcgagga atctcagaat caacaggaga agaacgaaaa ggatctcctg 1980
gctctcgact cctggaacaa tctgtggaac tggtttagca tttccaagtg gctgtggtac 2040
atcaagatct tcatcatgat cgtgggcggc ctgatcggcc tgcggatcat ctttgccgtg 2100
ctgagcatcg tgaaccgcgt gcggcagggc tactgataa 2139
<210> 42
<211> 124
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pr13.5 Long Promoter Sequence
<400> 42
taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt agtattgctc ttgtgactag 60
agactttagt taaggtactg taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt 120
agta 124
<210> 43
<211> 227
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PrHyb Promoter Sequence
<400> 43
gttttgaaaa tttttttata ataaatatcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 60
tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt 120
gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 180
tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacgg 227
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Env peptide
<400> 44
Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Ala Gly Asp Ile
1 5 10 15
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gag peptide
<400> 45
Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pol peptide
<400> 46
Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys Asp Leu Ile
1 5

Claims (17)

1.一种痘病毒载体，其包含编码以下的核酸：
(a)第一HIV包膜(Env)抗原，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(b)第二HIV Env抗原，其不同于所述第一HIV Env抗原；
(c)第三抗原和第四抗原，其为两种不同HIV Gag抗原；以及
(d)第五抗原和第六抗原，其为两种不同HIV Pol抗原。
2.权利要求1的痘病毒载体，其中，
所述第二HIV Env抗原包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
所述第三抗原和第四抗原分别包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列；并且
所述第五抗原和第六抗原分别包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的痘病毒载体，其中，
将所述第三抗原和所述第五抗原融合为第一Gag-Pol融合抗原，所述第一Gag-Pol融合抗原包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，并且
将所述第四抗原和所述第六抗原融合为第二Gag-Pol融合抗原，所述第二Gag-Pol融合抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
4.前述权利要求中任一项的痘病毒载体，其中，
所述第一HIV Env抗原由SEQ ID NO:41编码。
5.权利要求3的痘病毒载体，其中，
所述第一HIV Env抗原由SEQ ID NO:41编码；
所述第二HIV Env抗原由SEQ ID NO:39编码；
所述第一Gag-Pol融合抗原由SEQ ID NO:38编码；并且
所述第二Gag-Pol融合抗原由SEQ ID NO:40编码。
6.前述权利要求中任一项的痘病毒载体，其中，
所述痘病毒载体为重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)载体。
7.权利要求6的痘病毒载体，其中，
所述MVA载体包含MVA-BN或其衍生物。
8.权利要求6或7的痘病毒载体，其中，
将所述第一Gag-Pol融合抗原和所述第二Env抗原插入MVA基因组的基因间区域(IGR)44/45中，并且
将所述第二Gag-Pol融合抗原和所述第一Env抗原插入MVA基因组的IGR 88/89中。
9.权利要求6至8中任一项的痘病毒载体，其中，
所述第一Gag-Pol融合抗原和所述第二Gag-Pol融合抗原各自在单独的Pr13.5启动子控制之下，并且
所述第一Env抗原和所述第二Env抗原各自在单独的PrHyb启动子控制之下。
10.一种疫苗，其包含权利要求1-9中任一项的痘病毒载体和药学上可接受的载剂。
11.一种疫苗组合，其包含：
(a)第一疫苗组合物，其包含免疫原性有效量的权利要求1-9中任一项的痘病毒载体；以及以下至少之一：
(b)(i)第二疫苗组合物，其包含免疫原性有效量的一种或多种腺病毒载体，所述腺病毒载体编码第一抗原、第二抗原、第三抗原、第四抗原、第五抗原和第六抗原中的一个或多个；和
(b)(ii)第三疫苗组合物，其包含一种或多种多肽，所述多肽包含免疫原性有效量的分离的HIV抗原多肽，
其中所述第一组合物以及第二组合物和/或第三组合物存在于相同组合物中或者一种或多种不同的组合物中。
12.权利要求11的疫苗组合，其中，
所述第二疫苗组合物包含重组Ad26载体，所述重组Ad26载体一起编码SEQ ID NO:18、5、1、2、3和4。
13.权利要求11或12的疫苗组合，其中所述第三疫苗组合物中的一种或多种分离的HIV抗原多肽包括：
(i)多肽，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的第30-708位残基，或
(ii)多肽，其包含SEQ ID NO:36的第30-724位残基；或
(iii)(i)和(ii)的多肽。
14.一种在有需要的受试者中诱导针对人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给药权利要求10的疫苗或权利要求11-13中任一项的疫苗组合。
15.一种在有需要的受试者中诱导针对人免疫缺陷病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给药：
(a)第一疫苗，其包含一种或多种重组腺病毒载体，优选Ad26载体，所述重组腺病毒载体编码SEQ ID NO:1、2、3、4、5和18中的一个或多个；和
(b)第二疫苗，其包含权利要求1-9中任一项的痘病毒载体，
其中所述第一疫苗是初免疫苗并且所述第二疫苗是加强疫苗；或者
其中所述第二疫苗是初免疫苗并且所述第一疫苗是加强疫苗。
16.权利要求15的方法，其还包括，在所述加强疫苗的大约同时，向所述受试者给药一种或多种分离的HIV抗原多肽，其中
所述一种或多种HIV抗原多肽优选包含
(i)多肽，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的第30-708位残基，或
(ii)多肽，其包含SEQ ID NO:36的第30-724位残基；或
(iii)(i)和(ii)的多肽，
并且其中所述一种或多种分离的HIV抗原多肽与所述加强疫苗在相同组合物中，或与所述加强疫苗在不同组合物中。
17.权利要求14-16中任一项的方法，其中所述受试者为已感染HIV的受试者。
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