CN105399833B - 用于疫苗和诊断学的Dps融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

提供了新型纳米颗粒融合蛋白，其包含与Dps蛋白(来自饥饿细胞的DNA‑结合蛋白)融合的蛋白或肽，其对开发新型和改良的疫苗、诊断测试和其他生物医学产品带来独特的优势。

Description

用于疫苗和诊断学的Dps融合蛋白
本申请是申请日为2010年12月22日，申请号为201080060432.1，发明名称为“用于疫苗和诊断学的Dps融合蛋白”的申请的分案申请。
技术领域
本发明总体上涉及医药领域，并且具体地涉及微生物学、免疫学、诊断学和疫苗，并且更具体地涉及通过使用Dps融合蛋白诊断、治疗和预防疾病。
背景技术
Dps蛋白
来自饥饿细胞的DNA结合蛋白(Dps)是在细菌和古细菌中发现的一个充分保守蛋白的家族，但其不存在于动物或人中。它们在应激条件下负责保护细胞DNA免受自由基的损害。Dps是由以2:3对称排列的12个相同的亚基组成的十二聚体纳米颗粒。其具有9nm的直径，内腔直径为4.5nm(Grant等人,自然结构与分子生物学(Nat Struct.Biol.)5:294–303,1998)。大肠杆菌(E.Coli)的Dps是Dps的原型，其于1992年首先被Almiron等人发现(基因与发育(Genes Dev)6:2646–2654,1992)。当细胞处于应激或饥饿条件下时，Dps的表达增加(Almiron等人,基因与发育(Genes Dev)6:2646–2654,1992)。
每个Dps亚基的分子量为～20kDa并且折叠成在相对的端部处具有游离的N-和C-末端的紧密的四螺旋束(Grant等人,自然结构与分子生物学(Nat Struct.Biol.)5:294–303,1998；Roy等人,分子生物学(J Mol Biol.)370:752-67,2007；Haikarainen和Papageorgiou.细胞分子生命科学(Cell Mol Life Sci.)67:341-51,2010)。四个螺旋通过三个具有可变长度的环序列相互连接在一起。在游离的N-末端中也可以形成短的螺旋。12个拷贝的Dps亚基依照2:3的对称性组装成9nm纳米颗粒，游离的N-和C-末端序列都暴露在表面上(Grant等人,自然结构与分子生物学(Nat Struct.Biol.)5:294–303,1998；Stillman等人,分子微生物学(Mol Microbiol.)57:1101-12,2005；Roy等人,分子生物学(JMol Biol.)370:752-67,2007；Haikarainen和Papageorgiou.细胞分子生命科学(Cell MolLife Sci.)67:341-51,2010)。来自几种细菌和古细菌的Dps的晶体结构已经被确定，包括大肠杆菌(Grant等人,自然结构与分子生物学(Nat Struct.Biol.)5:294–303,1998)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)(Gauss等人,生物化学(Biochemistry),45:10815-10827,2006)、耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)(Roy等人,分子生物学(JMol Biol.)370:752-67,2007)、耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)(Kim等人,分子生物学(J.Mol.Biol),361:105-114,2006)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(Stillman等人,分子微生物学(Mol Microbiol.)57:1101-12,2005)和无害李斯特菌(Listeriainnocua)(Ilari等人,自然结构与分子生物学(Nat Struct.Biol.).7:38-43,2000)。从这些结构分析理解，Dps的游离N-和C-末端序列，尤其是这些末端序列的远端处的氨基酸经常在电子密度图上观察不到或仅部分被观察到。因此，尽管总的末端序列可能存在于表面上，但末端序列的远端可能延伸至Dps结构的内部中。这在硫磺矿硫化叶菌Dps(SsDps)的情况中得到证明，其中在密度图中观察到的在远端处未被观察到的氨基酸前的少数C-末端氨基酸被发现指向纳米颗粒结构的内部(Gauss等人,生物化学(Biochemistry),45:10815-10827,2006)。
Dps通过铁结合和DNA结合来保护DNA免受氧化应激(Zhao等人,生物化学(J BiolChem)277:27689–27696,2002；Haikarainen和Papageorgiou.细胞分子生命科学(Cell MolLife Sci.)67:341-51,2010)。结合Fe2+离子防止通过芬顿反应生成毒性羟基自由基，这些羟基自由基会损害DNA。铁结合由位于亚基之间的界面处的独特的双-铁金属结合位点介导，所述亚基包含保守氨基酸：组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)。DNA结合提供对DNA的物理保护。在Dps的许多成员中Dps的N-或C-末端富含碱性氨基酸并通过离子相互作用参与到DNA结合中(Ceci等人,核酸研究(Acids Res.)32:5935-5944,2004；Roy等人分子生物学(J Mol Biol.)470:752-67,2007)。
尽管十二聚体纳米颗粒结构在所有Dps之间非常保守，但在细菌或古细菌的不同家族之间Dps一级氨基酸序列变化非常大。例如，大肠杆菌的Dps(Swiss-Prot登记号P0ABT2)与来自嗜超高温古细菌硫磺矿硫化叶菌(Swiss-Prot登记号P95855)、嗜极端细菌耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)(Swiss-Prot登记号Q9RS64)、无害李斯特菌(Listeria innocua)(Swiss-Prot登记号P80725)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)(Swiss-Prot登记号P43313)或链球菌性肺炎(Streptococcus pneumonia)(Swiss-Prot登记号B1S132)的Dps仅共有<30％氨基酸序列同一性。考虑到已经在检查的几乎所有细菌中都发现了Dps，显然存在这些遗传上多种多样来源的Dps。另一方面，Dps氨基酸序列在细菌家族内非常保守。例如，在肠杆菌科的成员，诸如痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)(Swiss-Prot登记号Q32I91)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(Swiss-Prot登记号Q7CQV9)、大肠杆菌(Swiss-Prot登记号P0ABT2)和肺炎克雷白杆菌(Klebsiellapneumonia)(Swiss-Prot登记号Q84FI02)之间，Dps的氨基酸同源性为90％以上。
病原菌的Dps也可能参与到它们的致病性中。因此，幽门螺杆菌的Dps也已知为中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)，对中性粒细胞有趋化性，并且参与炎症反应(Teneberg等人,生物化学(J Biol Chem.)272:19067–19071,1997)。空肠弯曲杆菌的Dps与HP-NAP共享很高的同源性，已经显示与硫苷脂结合，并且可能参与引起轴突损害(Piao等人,神经科学(JNeurol Sci.)288:54-62,2010)。
疫苗
疫苗是用于预防和治疗感染性疾病、癌症和其他疾病状态的生物产品。在大多数情况下，疫苗针对可能由细菌、病毒或其他微生物导致的感染性疾病而开发。抗原是疫苗的活性组分，并由微生物的整体或一部分制成。微生物的表面上的蛋白经常是能够针对该微生物产生保护性免疫应答的最重要的抗原。来自微生物的内部蛋白也能够诱导保护性效应，尤其是通过诱导细胞免疫。蛋白抗原可以从微生物直接分离，或在表达宿主中作为重组蛋白产生。蛋白抗原诱导保护性免疫的关键部分经常表现为蛋白序列中的氨基酸或肽的短链。它们可以通过其功能诸如细胞结合、细胞融合和中和，通过沿全部蛋白序列系统性测试单个肽和比较序列分析来鉴定。这样的抗原肽，通常长度小于100个氨基酸，与复合蛋白抗原相比较好地被确定，并且还可以被化学合成。在微生物的不同血清型和菌株之间这些肽抗原中经常高度保守，因此能够产生交叉保护效应。因此，在鉴定这些肽抗原和使用这些肽抗原来制备可能提供通用保护作用的疫苗方面做出了极大的努力。这些努力特别地与已知经历频繁的遗传改变和/或由多种血清型组成的微生物相关，包括流感病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)和人乳头瘤病毒(HPV)。高度保守的肽的实例包括，但不限于，流感病毒的M2e(Neirynck等人,自然医学(Nat.Med.),5,1157-1163,1999)、HPV的L2蛋白肽(aa17-36和aa108-120)(Karanam等人,免疫细胞生物学(Immunol.Cell Bio.)87:287-299,2009)、人免疫缺陷病毒(HIV)的gp41肽(Shi等人,生物化学(J Biol Chem.)285:24290-24298,2010)和来自有包膜病毒的表面糖蛋白的各种长度的融合肽(14–30aa)(例如流感病毒、HIV和呼吸道合胞病毒)。融合肽的C-末端经常没有统一的截止点。这样，在已发表的文献里所描述或用的融合肽的长短差异很大。以流感病毒为例，其融合肽可由主要包膜蛋白HA的HA2部分的前1-13aa(Horvath等人,免疫学快报(Immunol.Letters)60:127-136,1998)、1-14aa(Chun等人,疫苗(Vaccine)26:6068-6076,2008)、1-21aa(Sui等人,自然结构与分子生物学(Nat.Struct.Mol.Biol.)16:265–273,2009)、1-23aa(Cross等人,蛋白质和肽快报(Protein and Peptides Letters)16:766-778,2009)、1-24aa(Tamm and Han,生物科学报告(Bioscience Reports)20:501-518,2000)、或1-38aa(Vareckova等人,单克隆抗体研究趋势(Trends in Monoclonal Antibody Research)(Simmons MA,ed),pp 123-142,2005)组成。在其他流感病毒蛋白中还已经鉴定了许多其他高度保守的肽序列作为潜在的疫苗靶标(Heiny等人,PLoS One.2:e1190,2007；Ekiert等人科学(Science).324:246-251,2009)。
还存在具有有限数目的血清型但拥有免疫显性表位的病原体，诸如结核分枝杆菌(TB)(Mycobacterium tuberculosis)的ESAT-6蛋白(95aa)和Ag85A(Brandt等人,免疫学(J.Immunol.)157:3527–3533,1996；Santosuosso,M.等人传染与免疫(Infect.Immun).74:4634,2006)。肽抗原的其他实例包括来自口蹄疫病毒(Beignon等人,Vet ImmunolImmunopathol.104::273-80,2005)、疟疾(Mahajan等人,传染与免疫(Infect.Immun).Sep,2010)、肠道病毒71(Foo等人,病毒研究(Virus Res.)125:61–68,2007)、炭疽的保护性抗原(Oscherwitz等人,免疫学(J.Immunol.)185:3661-3668,2010)和细菌粘附蛋白(Yakubovics,N.等人分子生物学(Mol.Biol.)55:1591,2005)的那些。
除了感染性疾病以外，还正在对癌症和其他疾病状态开发基于肽的疫苗。来源于肿瘤相关抗原(TAA)的小肽已经被鉴定为针对肿瘤或癌症的疫苗候选物(Kanodia和Kast,疫苗专家述评(Expert Rev Vaccines).7:1533-1545,2008；Cheever等人，临床癌症研究(Clin Cancer Res.)15:5323-37,2009；Oka等人,免疫学新见(Curr.Opinion inImmunol.)20:211-220)。它们包括来自各种癌症的WT1蛋白的肽，来自乳腺癌相关HER2/neu蛋白的GP2肽，来自前列腺癌的NY-ESO1和来自黑色素瘤的多种肽。另外，β-淀粉样肽用作阿尔兹海默病的候选疫苗(Lemere,脑研究进展(Prog Brain Res.)175:83-93,2009；Verdoliva等人,人类免疫(Human Vaccines).6:1-2,2010)。
然而，肽抗原自身经常是诱导免疫应答的弱免疫原。为了克服这一缺陷，肽抗原可以与载体蛋白化学连接或使用重组DNA技术作为融合蛋白来增强针对它们的免疫应答。
诊断学
诊断剂是在用于诊断感染性或非感染性疾病的诊断测试中使用的试剂。其可以是用于检测特异性抗体的抗原，或结合或检测受体的配体，或反之亦然。诊断剂还包括用于检测特异性抗原或与特异性抗原相关的组织或病原体的特异性抗体。该特异性抗体为单克隆或多克隆的，其可以用抗原在哺乳动物中产生。通过将来自被免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞诸如SP2/0融合来获得单克隆抗体。
来自病原体或疾病状态的保守蛋白或肽抗原作为诊断剂可以非常有用。如果它们与载体蛋白连接或融合，则它们在诊断测试中的应用可以被极大地改善。这对于肽抗原来说更是如此，因为载体蛋白可以促进肽抗原与测试表面的连接或针对它们的特异性抗体的生成。如果来自同一病原体或疾病的两种不同的肽抗原与相同的载体蛋白连接，这是特别有利的，因为这可以极大地增加检测灵敏度以及特异性。
诊断测试可以是检测抗原或抗体的免疫测定，或检测配体-受体结合的测试。ELISA(酶联免疫吸附测定)是免疫测定的实例。免疫测定还可以是浸渍片形式(Paek等人,方法(Methods.)1:53-60,2000)。诊断剂经常与信号剂或发射体连接，如果测试结果为阳性则所述信号剂或发射体给出可测量到的信号。信号剂可以是酶诸如碱性磷酸酶、金颗粒、以及小分子诸如生物素和荧光染料。信号剂可以与诊断剂通过化学结合作用连接或通过重组DNA技术融合。
用于融合蛋白的载体蛋白
与载体蛋白的共价连接是增强疫苗抗原的免疫原性的有效方式，尤其是用自身免疫原性差的肽制成的那些疫苗抗原。因此，小蛋白或肽与钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)(KLH)的化学结合已经是产生针对它们的免疫应答的常用方式。将肽与载体蛋白的连接还可以通过使用重组DNA技术的融合或直接DNA合成以将编码抗原的DNA序列与编码载体蛋白的DNA序列连接来实现。多种蛋白已经用作用于与蛋白或肽抗原的融合或化学结合的载体蛋白，包括KLH、补体、霍乱毒素、破伤风类毒素、OMPC(脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)的外膜蛋白复合物)、硫氧还蛋白、鞭毛蛋白(Huleatt等人,疫苗(Vaccine)26:201-14,2007)、各种有包膜和无包膜的病毒的病毒样颗粒(VLP)以及纳米颗粒蛋白诸如热休克蛋白(Kim等人，自然(Nature).394:595-9,1998)和铁蛋白(美国专利号7608268)。这些载体蛋白中的一些还充当佐剂起作用，诸如补体和鞭毛蛋白，鞭毛蛋白是Toll-样受体5的配体。
VLP已经被广泛地作为载体蛋白测试。它们可以来源于许多种不同的有包膜和无包膜的病毒(Chackerian,Expert Rev Vaccines.6:381-90.,2007)，包括乳头瘤病毒(HPV；Ionescu等人,药物科学(J.Phamr.Sci.)95,70-79,2006)、乙型肝炎核心抗原(Hbc；Pumpens和Grens,1998.FEBS letters 442,1-6)、番木瓜花叶病毒(Denis等人,疫苗(Vaccine),26:3395-3403,2008)和噬菌体(Caldeira等人,疫苗(Vaccine),28:4384-4393)。它们主要由病毒衣壳蛋白制成，所述病毒衣壳蛋白组成病毒衣壳结构。这些VLP中的大多数通过使用真核表达系统诸如杆状病毒和酵母制备(Grgacic和Anderson,方法(Methods).40:60-65,2006)。这些VLP中的大多数也是纳米颗粒(≤100nm)。因此，本文使用的术语纳米颗粒载体蛋白指VLP和其他非病毒纳米颗粒载体蛋白两者。
纳米颗粒载体蛋白由多个亚基制成，并且这些亚基一旦在表达宿主中表达就自组装成纳米颗粒。作为具有多个亚基的纳米颗粒，它们对于抗原递呈和免疫应答的诱导是高度有效的。这是因为每个颗粒上存在的多个拷贝的蛋白或肽抗原增强了抗原递呈。另外，颗粒形式的抗原的免疫原性大于游离抗原，因为其可以有效地被抗原递呈细胞吞噬或摄取。
Hbc已经被广泛地用作用于融合蛋白疫苗的载体蛋白。例如，来自流感病毒M2蛋白的M2e肽(24aa)已经与Hbc融合(Fiers等人,疫苗(Vaccine)27:6280-6283,2010)，并且得到的融合蛋白能够诱导针对该肽的免疫应答。在大多数情况下，蛋白或肽抗原与HBc的表面环连接，所述表面环充分地暴露在表面上，并且可以容纳插入的蛋白或肽而不会破坏颗粒形成(Pumpens和Grens,1998.FEBS letters 442,1-6)。与Dps一样，铁蛋白是结合铁的纳米颗粒蛋白，但由24个不同同种型(H和L链)的亚基组成。美国专利号7608268记述了蛋白或肽与铁蛋白在N-和/或C-末端处的融合，并且得到的融合蛋白保留了组装成聚合的聚集体或衣壳组装体的能力。尽管铁蛋白的N-末端暴露在表面上，但其C-末端位于内部核心中。因此，N-末端处的融合蛋白或肽暴露在表面上(衣壳外融合(exocapsid fusion))，而C-末端处的融合蛋白或肽则包埋在铁蛋白颗粒内(衣壳内融合(endocapsid fusion))。因此，铁蛋白的C-末端处的融合因此不适于融合抗原的表面递呈以诱导直接和间接的免疫应答。
使用完善的重组DNA技术和直接DNA或基因合成，任何蛋白或肽可以被融合至另一蛋白的任何位点。然而，不知道的是得到的融合蛋白是否可以达到所需的融合效果。因此，为采用纳米颗粒载体蛋白生成融合蛋白的重要要求是融合蛋白保留组装成纳米颗粒的能力和载体蛋白可能具有的其他有益性质。另外，融合的蛋白或肽需要存在于融合蛋白的外表面上。由于通常存在有来自于任何指定的病原体或疾病状态的多于一个的保守肽抗原，因此强烈地诱发多于一个的肽抗原在不同的位点处同时融合至载体蛋白，所有融合的肽抗原暴露在表面上以拓宽免疫应答并增加疫苗功效，或在诊断测试的情况下增加检测灵敏度。另外，形成的融合蛋白需要是可溶的，并且足够稳定以承受纯化工艺和作为最终产品的储存。融合蛋白还优选是热稳定的，其可以用来制备在室温或更高温度下稳定的疫苗。此外，融合蛋白优选在细菌表达中制备，细菌表达高度有效且成本低。
因此，对于可以获得用于制备更有效的疫苗和诊断产品的这些有益属性的新型和改良的蛋白载体系统存在极大的需求。之前还没有人致力于生成具有Dps的融合蛋白，也没有任何人建立两种蛋白或肽同时融合于Dps的不同位点的Dps融合蛋白。
发明内容
因此，本发明提供了一种Dps融合蛋白，其包含与Dps融合的至少一种蛋白或肽，其中所述Dps融合蛋白能够自组装成纳米颗粒，并且所述蛋白或肽存在于所述Dps融合蛋白的外表面上。
在一些实施方案中，所述Dps可来源于细菌或古细菌。
在一些实施方案中，所述蛋白或肽可与Dps的N-末端、C-末端或内部位点融合。
在一些实施方案中，所述Dps可通过一个或多个氨基酸的缺失、置换或插入而修饰。
在一些实施方案中，所述蛋白或肽可来源于包括细菌、病毒、真菌、寄生虫、癌症和细胞的组。
在一些实施方案中，所述蛋白或肽可以是病毒融合肽(权6)。优选地，所述Dps融合蛋白可以是可溶的。
在一些实施方案中，所述蛋白或肽可以是三聚体形成蛋白或肽。
在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可以是热稳定的。优选地，所述Dps可来源于嗜温生物。
在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可与αGal表位或其类似物共价结合。
在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可以是疫苗。
在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可以是诊断剂。
本发明进一步提供了一种Dps融合蛋白，其包含同时与Dps的N-末端和C-末端分别融合的两种蛋白或肽，其中所述Dps融合蛋白能够自组装成纳米颗粒，并且所述蛋白或肽存在于所述Dps融合蛋白的外表面上。
在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白还可包含与Dps的内部位点融合的一种蛋白或肽。
在一些实施方案中，所述蛋白或肽可来源于包括流感病毒的M2e和HA2、乳头瘤病毒的L2、人免疫缺陷病毒的gp41、和癌症的WT1蛋白的蛋白或肽的组。
在一些实施方案中，所述蛋白或肽可包括病毒融合肽。优选地，所述Dps融合蛋白可以是可溶的。
在一些实施方案中，所述蛋白或肽可包括三聚体形成蛋白或肽。
在一些实施方案中，所述蛋白或肽可以是流感病毒的M2e和融合肽。
在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可包括SEQ ID No：3、6或7的氨基酸序列，其中所述Dps任选地被来自不同细菌或古细菌的Dps置换。
在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可以是热稳定的。优选地，所述Dps可来源于嗜温生物。
在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可与αGal表位或其类似物共价结合。
在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可以是疫苗。
在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可以是诊断剂。
本发明进一步提供了一种Dps融合蛋白，其包含与Dps融合的一种蛋白或肽，其中所述Dps融合蛋白能够自组装成纳米颗粒并与寡糖或多糖共价结合。
在一些实施方案中，所述蛋白或肽可包含至少两种氨基酸，这些氨基酸选自包含赖氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的一个组。
在一些实施方案中，所述蛋白或肽可与Dps的N-末端和C-末端的任一端或两端融合并且存在于所述Dps融合蛋白的外表面上。
在一些实施方案中，所述寡糖或多糖可来源于包括细菌、病毒、真菌、寄生虫和癌症的组。优选地，所述寡糖或多糖和所述Dps可来源于相同的细菌。
在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可以是疫苗。
在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可以是诊断剂。
本发明进一步提供了热稳定的Dps融合蛋白。
本发明的一个实施方案提供了一种包含病毒融合肽的Dps融合蛋白，并且所述Dps融合蛋白是可溶的，尽管病毒融合肽的溶解度差。
本发明的另一个实施方案提供了包含三聚体形成蛋白或肽的Dps融合蛋白。
本发明的另一个实施方案提供了一种包含两种蛋白或肽的Dps融合蛋白，所述蛋白或肽来源于包括流感病毒的M2e和HA2、乳头瘤病毒的L2蛋白、HIV的gp41和癌症的WT1蛋白的蛋白或肽的组。本发明进一步为这个实施方案提供了包括SEQ ID No：3、6或7的氨基酸序列所代表的Dps融合蛋白的实例。
本发明的另一个实施方案提供了一种Dps融合蛋白，其包含流感病毒的M2e和融合肽。本发明的另一个实施方案提供了一种流感病毒疫苗，所述疫苗包含与Dps融合的M2e肽和至少一个来源于HA2的肽。所述来源于HA2的肽包括融合肽和螺旋A、B、C和D。本发明进一步为这个实施方案提供了包括SEQ ID No:3和6的氨基酸序列所代表的Dps融合蛋白的实例。以前没有人将流感病毒的这两种肽作为融合蛋白加在一起，并将所得融合蛋白用于疫苗。除了Dps以外，这个实施方案也可将与其它载体蛋白融合的流感病毒的这两种肽加在一起。
本发明的另一个实施方案提供了一种Dps融合蛋白，其与αGal表位或其类似物共价结合。
本发明进一步提供了一种包含蛋白或肽的Dps融合蛋白，所述蛋白或肽含有适合于与碳水化合物结合的氨基酸，其中所述Dps融合蛋白与来源于细菌、真菌、寄生虫或癌症的寡糖或多糖结合作为糖结合疫苗或诊断剂。使用Dps融合蛋白作为细菌糖结合疫苗的载体的一个独特优势是Dps和寡糖或多糖抗原两者均可以来源于同一细菌。所述蛋白或肽含有的适合于与碳水化合物结合的氨基酸可进一步促进与寡糖或多糖结合。
本发明进一步提供了一种引起免疫应答的方法，所述方法包括向人或动物施用有效量的Dps融合蛋白，所述Dps融合蛋白配制在药学可接受的媒介物、载体、赋形剂、佐剂或控释制剂中。
本发明进一步提供了免疫原性组合物，其包含多种Dps融合蛋白，所述Dps融合蛋白任选地包含来源于不同的细菌或古细菌的Dps。
在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可包含SEQ ID No:1和SEQ ID No:2的氨基酸序列，其中所述Dps可任选地被来自不同细菌或古细菌的Dps置换。
本发明进一步提供了一种在动物或人中引起免疫应答的方法，所述方法包括向所述动物或人施用有效量的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物配制在药学可接受的媒介物、载体、赋形剂、佐剂或控释制剂中。
本发明及其各个实施方案为开发新型和改良的疫苗、诊断测试和其他生物医学产品提供了巨大的优势。两种或以上的蛋白或肽与Dps在不同的位点处的融合对于拓宽和增强免疫应答并且因此疫苗的有效性是非常有用的。其还使Dps融合蛋白成为高度有效的诊断剂以用于诊断感染性或非感染性疾病的诊断测试中。此外，Dps融合蛋白独特地是热稳定的，能够承受高温下的处理。热稳定性对于疫苗和其他产品的制备和使用是高度优选的特征，因为其允许疫苗产品在室温或更高温度下储存和装运，由此有利于疫苗在全世界的分销和使用，尤其是在紧急情况下。本发明还提供了一种通过使用促进与碳水化合物结合的Dps融合蛋白开发糖结合疫苗的新方法。
本发明对于开发基于高度保守的肽抗原以提供广谱或通用保护作用的疫苗是非常有用的。包含保守肽抗原诸如与Dps融合的融合肽和M2e的通用流感病毒疫苗是一种这样的疫苗候选物，其是提供针对潜在的未来流感流行以及季节性流行病的有效对策所迫切需要的。可以从本发明极大受益的此类疫苗的其他实例包括针对HIV、HPV、TB和癌症的那些疫苗，所有这些疫苗均是公众卫生最关心的。
附图说明
图1显示Dps融合蛋白的实例。P，肽。A，融合在Dps的N-末端处的一种蛋白或肽；B，融合在Dps的C-末端处的一种蛋白或肽；C，融合在Dps的内部位点处的一种蛋白或肽；D，融合在Dps的N-和C-末端两端处的两种蛋白或肽；E，融合在Dps的N-末端和内部位点处的两种蛋白或肽；F，融合在Dps的C-末端和内部位点处的两种蛋白或肽；G，分别融合在Dps的N-末端、C-末端和内部位点处的三种蛋白或肽。当一种以上的蛋白或肽与Dps融合时，蛋白或肽可以相同或不同。
图2显示下述的示意性图示：来自天然Dps的单体(A)，与蛋白或肽在Dps的N-和C-末端两端处融合的Dps融合蛋白(B)，以及与蛋白或肽在Dps的N-和C-末端两端处融合的Dps融合蛋白，寡糖或多糖通过所述蛋白或肽中包含的氨基酸连接到Dps，所述氨基酸适合于这种连接(C)。尽管在图C中没有显示，寡糖或多糖还可以在存在有合适的氨基酸的位点处与Dps连接。
图3显示了在用于表达Dps融合蛋白的表达载体质粒中Dps融合蛋白基因的示意性图示。
图4显示了具有流感病毒肽的Dps融合蛋白的表达和纯化。图A显示了双-肽融合蛋白M2e-SsDps-FP的表达。泳道1，分子量标记；泳道2和3，分别为未诱导和诱导的大肠杆菌；泳道4和5，分别为来自诱导的大肠杆菌的细胞溶胞产物的上清液和沉淀物；泳道6和7，细胞溶胞产物上清液和沉淀物(泳道4)，在65℃处理10min。箭头指示融合蛋白并且箭头头部指示用于细胞溶解的溶菌酶。图B显示了与SsDps比较的两种纯化的SsDps融合蛋白。泳道1，分子量标记；泳道2，SsDps；泳道3，单-肽融合蛋白M2e-SsDps；泳道4，双-肽融合蛋白M2e-SsDps-FP。
图5显示了SsDps和融合蛋白M2e-SsDps-FP在Bio-gel A1.5柱上的色谱图。
图6显示了双-肽Dps融合蛋白M2e-SsDps-FP在电子显微镜下的图像。标尺表示20nm。
图7显示具有HPV肽的Dps融合蛋白的表达和纯化。图A显示了两种双-肽融合蛋白的表达。泳道1，分子量标记；泳道2和3，未诱导和用融合蛋白L2(12-36)-SsDps-L2(108-120)诱导的大肠杆菌；泳道4和：未诱导和用融合蛋白L2(17-36)-SsDps-L2(108-120)诱导的大肠杆菌。图B显示了纯化的融合蛋白，泳道1，分子量标记；泳道2，SsDps；泳道3，L2(12-36)-SsDps-L2(108-120，泳道4，L2(17-36)-SsDps-L2(108-120)。
图8显示了Dps融合蛋白的抗原性。图A显示了具有流感病毒肽的Dps融合蛋白与特异性抗体通过免疫印迹和斑点印迹的反应。泳道1，SsDps；泳道2，M2e-SsDps；泳道3，M2e-Dps-FP。Dps融合蛋白用抗-M2e单克隆抗体(16C2)或羊抗-H1N1HA血清探测。图B显示具有HPV L2肽的Dps融合蛋白与兔抗HPV L2蛋白抗体的反应。泳道1，SsDps；泳道2，L2(12-36)-SsDps-L2(108-120)；泳道3，L2(17-36)-SsDps-L2(108-120)。一片SDS-PAGE凝胶或斑点印迹膜用考马斯蓝(CB)染色以确认蛋白的存在。
图9显示Dps融合蛋白M2e-SsDps-FP(A)、L2(12-36)-SsDps-L2(108-120)(B)和M2e-EcDps(C)的热稳定性。具有融合蛋白的细胞溶胞产物在60℃处理各种时间(分钟)，然后以12,000g离心10min。上清液(Spt)和沉淀物(Pt)通过SDS-PAGE分离。箭头指示Dps融合蛋白并且箭头头部指示用于细胞溶解的溶菌酶。
图10显示了SsDps和融合蛋白M2e-SsDps-FP与甘露聚糖、蜜二糖和乳糖的结合。反应在37℃下进行3天。反应混合物通过在1％琼脂糖凝胶中电泳来分离。
图11显示了在斑点印迹中，与蜜二糖结合的SsDps和融合蛋白M2e-SsDps-FP与天然鸡抗-αGal抗体的反应。使用与蜜二糖结合的或未结合的SsDps和融合蛋白M2e-SsDps-FP。
图12显示在小鼠中针对融合蛋白M2e-SsDps-FP产生的特异性血清与流感病毒的M2和HA2蛋白通过免疫印迹(A)的反应和与M2e肽通过ELISA(B)的反应。在图A中，a)考马斯蓝染色的凝胶；b)免疫印迹；M，预染色的分子量标记，泳道1，灭活的流感病毒全病毒粒子(A/New Caledonia/20/99,H1N1)；泳道2，A/New Caledonia/20/99(H1N1)株的HA蛋白。白色箭头头部指示灭活的全病毒粒子中的M1/HA2。
具体实施方式
定义
字“抗原”和“免疫原”在本文中可互换使用，并且代表可以诱导特异性免疫应答的分子或物质。
在本文中使用的字“抗原性”是指与特异性抗体的反应能力。在本文中使用的字“免疫原性”是指诱导特异性免疫应答的能力。
术语“免疫应答”是指抗体介导的或细胞介导的免疫应答或两者。
字“疫苗”是指用于治疗性治疗或主动或被动预防针对感染或非感染性疾病的免疫接种的抗原组合物。
在本文中使用的字“蛋白”是指通过肽键连接在一起的>100个氨基酸残基的链。“肽”是指通过肽键连接在一起的≤100个氨基酸残基的链。蛋白或肽中的氨基酸序列以标准形式显示，即，从氨基端(N-末端)至羧基端(C-末端)。
术语“融合蛋白”表示一蛋白或肽与另一蛋白或肽通过它们各自的N-和C-末端氨基酸残基之间的肽键而连接在一起或反之亦然，或通过将第一蛋白或肽通过插入的蛋白或肽的N-和C-末端处的两个肽键插入至第二蛋白或肽的内部区域中而连接在一起。肽键是一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基之间形成的共价化学键。在本文中使用的“融合蛋白”通过在表达宿主中表达融合蛋白基因来产生，其中第一蛋白或肽的编码序列与第二蛋白或肽的编码序列连接。
术语“融合位点”是指与另一蛋白或肽通过肽键连接的蛋白或肽的位点或氨基酸残基。
字“纳米颗粒”是指尺寸在100nm以下的颗粒。
字“碳水化合物(carbohydrate)”与“糖类”可互换使用，并且具有Cm(H2O)n的经验公式。碳水化合物可以是单糖、二糖、三糖、寡糖或多糖。单糖也称为简单糖。
字“多糖”是指通过糖苷键连接在一起的>10个简单糖残基的链。“寡糖”是指通过糖苷键连接在一起的≤10个简单糖残基的链。
术语“重组DNA技术”是指操作并将两个或以上的DNA序列合并在一起的技术，其包括重组、PCR(聚合酶链式反应)、体外诱变和直接DNA合成。这些技术记述在大量的已发表的书籍和手册中，包括“分子生物学实验室指南(Current protocols in molecularbiology)”(Ausubel编辑2008.John Wiley&Son)。
术语“疾病状态”是指在动物或人中的任何异常改变，其可以由传染源或其他发生机制导致。
术语“传染原”和“病原体”可互换使用，并且是指传染原以及导致疾病的因子诸如各种来源的毒素。
字“一个(a)”或“一个(an)”意指“一个或多个”。
术语“控释制剂”是指提供制剂中的活性成分的持续或控制释放的制剂。
字“癌症”和“肿瘤”在本文中可互换使用。
详细描述
使用纳米颗粒蛋白如Dps作为用于疫苗、诊断学和其他生物医学应用的载体蛋白存在许多挑战。与外来蛋白或肽的融合可能破坏纳米颗粒形成，由此消除了作为纳米颗粒的载体效应。融合的蛋白或肽抗原可能不存在于纳米颗粒的表面上或保留其抗原性。因此，本发明显示当一种蛋白或肽与Dps的N-或C-末端融合时Dps保留了形成纳米颗粒的能力。本发明进一步显示当两种蛋白或肽同时与Dps的N-和C-末端两端分别融合时Dps仍保留了形成纳米颗粒的能力。其进一步显示单独地融合在Dps的N-或C-末端处或同时融合在Dps的两个末端处的蛋白或肽存在于纳米颗粒的外表面上并且具有抗原性。如用结合了来自流感病毒的两种肽抗原的Dps融合蛋白所证明的那样，它们也具有免疫原性。通过色谱法以及电子显微术证明了纳米颗粒的形成。在斑点印迹(非变性)和免疫印迹(变性)中采用针对肽抗原的已知特异性抗体均显示了表面呈现和抗原性。以前没有证明一种或多种蛋白或肽抗原与Dps的融合和表面呈现。
考虑到蛋白的氨基酸序列中的任何变化，包括外来蛋白或肽与其末端的融合，可以潜在地破坏蛋白结构，对于Dps与众不同的是在N-末端以及C-末端处的融合能够发生保留纳米颗粒的形成以及融合的外来蛋白或肽的表面呈现。尤其与众不同的是，当两种不同的蛋白或肽同时与Dps的N-和C-末端分别融合时这也能够发生。这明显地将Dps与铁蛋白区分开，铁蛋白仅允许与其N-末端融合的蛋白或肽的表面呈现(美国专利号7608268)。如上所述，Dps的N-和/或C-末端序列的远端的位置未知并且可能充分地延伸到纳米颗粒结构的内部中，如用SsDps的C-末端所观察到的那样(Gauss等人,生物化学(Biochemistry),45:10815-10827,2006)。Dps是相对小的纳米颗粒。因此，尽管不希望受理论的约束，其可能是由于有限的内部空间引起，与Dps末端序列融合的外来蛋白或肽不可能被容纳在纳米颗粒的内部中，并且因此留在它们的表面上，即使末端序列的远端可能最初位于内部中。
Dps融合蛋白可以以许多不同的方式产生，包括图1以及SEQ ID No:1-7中呈现的那些方式。对于在末端序列处的融合，蛋白或肽可以分别紧邻N-或C-末端的第一个或最后一个氨基酸融合,或可选地用于代替一部分或整个游离的N-或C-末端序列。蛋白或肽还可以在三个环序列或四个螺旋中的一个或多个中插入至Dps的内部位点中。两个蛋白或肽可以在两个末端处同时与Dps融合，每个在一个单独的末端处或一个在一个末端处而另一个在内部位点处。两个蛋白或肽的位置可以交换。此外，三个蛋白或肽可以与Dps同时融合，每个在一个单独的位点处–N-末端、C-末端和内部位点。在融合位点处，在蛋白或肽和Dps蛋白之间可以引入间隔序列或连接序列。例如，一个或多个已知为螺旋断开物(breaker)的甘氨酸或脯氨酸氨基酸可以用作此类间隔区，以允许蛋白或肽与融合蛋白的Dps部分分开折叠。
如上面指出和实施例中描述的那样，通过电子显微镜术和色谱法证明了纳米颗粒形成。要理解的是这些方法不能确定纳米颗粒中亚基的确切数目。尽管有可能Dps融合蛋白也由12个亚基组成，但有可能亚基的数目可以多于或少于12个，并且纳米颗粒的尺寸也可以变化，这取决于融合的蛋白或肽。因此，亚基数目不是12个的Dps融合蛋白也在本发明的范围内。
来自病毒、细菌、真菌、寄生虫、癌症和其他疾病状态的任何蛋白或肽可以用于与Dps融合以产生疫苗或诊断剂。然而，肽或肽抗原(≤100aa)可能是优选的，因为它们较小并且可以容易地与Dps融合，而没有干扰纳米颗粒形成的可能性。肽抗原也更好地被确定并且通常代表用于诱导保护性免疫的蛋白抗原的关键或保守抗体或T细胞表位。肽抗原的一些实例已经在上面进行了描述。
Dps广泛地来源于原核生物并且没有在动物或人中被发现。因此，其相对于其他载体蛋白诸如铁蛋白和热休克蛋白是有利的，所述其他载体蛋白也在动物和人中被发现，并且当用于疫苗中时可能有导致不希望的自体免疫性的可能性。采用Dps融合蛋白疫苗的另一个独特的优势是Dps可获自细菌或古细菌的许多不同的家族。任何指定来源的Dps可以具有其自身独特的和新的特征，这些特征可以更好地适于给定的融合蛋白疫苗或诊断剂。例如，一些Dps蛋白诸如大肠杆菌的Dps(EcDps)(Swiss-Prot登记号P0ABT2)具有相对长的N-末端，而其他的诸如耻垢分枝杆菌Dps(MsDps)(Swiss-Prot登记号P0C558)具有相对长的C-末端。因此，对于给定的融合蛋白，可以评价来自不同来源的Dps以基于结构、生化和免疫学性质选择最合适的一种。此外，可以形成包含两种或以上融合蛋白的组合物以用于疫苗和其他生物医学应用，所述两种或以上融合蛋白具有来自细菌或古细菌的不同家族的Dps。此类组合物可以为给定的蛋白或肽利用最佳的Dps融合蛋白并且因此使每个蛋白或肽的效应最大化。此类组合物也可以有助于消除干扰，当与同一个载体蛋白分别地连接的两个抗原一起使用时可能发生干扰。
因此，Dps可以来自于通常与人和动物相关的细菌，诸如埃希氏菌属(Escherichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)和拟杆菌属(Bacteroides)的成员。Dps还可以来自于嗜极端或嗜超高温细菌或古细菌，诸如硫磺矿硫化叶菌和耐辐射球菌。Dps还可以来自于致病菌。致病菌的实例可以包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、幽门螺杆菌、空肠弯曲杆菌和伤寒沙门氏菌。来自这些细菌的Dps本身可以提供针对由这些细菌引起的疾病的保护效应。因此，除了充当载体以外，Dps还可以针对其来源的细菌提供保护作用。不像来自幽门螺杆菌(HpDps)的其他Dps，也已知为HP-NAP，具有免疫刺激效应(de Bernard和D'Elios,Toxicon.56:1186-1192,2010)。因此，用HpDps制成的融合蛋白可能具有佐剂作用，其增强针对融合的蛋白或肽抗原的免疫应答。
两种蛋白或肽抗原在N-和C-末端两端处分别的融合以及两种抗原的表面呈现可特别地可用于增强和拓宽免疫应答。即，同一抗原的两个拷贝可以与N-和C-末端两端分别地融合从而将呈现的蛋白或肽的数目加倍并且由此增强免疫应答。另一方面，两种不同的抗原可以与N-和C-末端两端分别地融合从而拓宽免疫应答，这可以特别地用于开发意在提供广谱或通用保护作用的疫苗。包含两种不同的蛋白或肽抗原的疫苗可以用其中两种蛋白或肽在Dps的不同的位点处同时融合的一种Dps融合蛋白或用两种Dps融合蛋白(每种融合蛋白含有在一个或多个位点处与Dps融合的一种蛋白或多肽)来制成。还要理解，各种肽可以作为单个拷贝或串联的多个拷贝与Dps融合。
Dps同时融合和表面呈现一种以上的蛋白或肽抗原的能力对基于保守肽抗原的疫苗带来了极大的优点，因为经常存在来自于病原体、癌症或其他疾病状态的一种以上的此类保守抗原。流感病毒经历恒定的抗原性改变，这些改变对开发用于控制流感流行和大范围流行的疫苗提出了极大的挑战。迫切需要一种通用的流感疫苗，其可以用来控制季节性流行以及大范围流行，无需每年改变疫苗抗原。其中，流感病毒的M2e和融合肽(FP)是最高度保守的表位或肽抗原并且因此非常适合于通用型流感疫苗。因此，在实施例2和3中，M2e和融合肽两者独特地与Dps的N-和C-末端分别地融合(M2e-SsDps-FP和M2e-EcDps-FP)，并且得到的融合蛋白具有免疫原性，如实施例12中用M2e-SsDps-FP所示的那样。M2e是次要包膜蛋白M2的24个aa胞外结构域，并且融合肽按Chun等人(疫苗(Vaccine)26:6068-6076,2008)所述的例子由主要包膜蛋白HA的HA2部分的前14个aa组成。另外，还可以以与实施例4中所述的相同方式掺入或加入其他保守的肽，诸如HA2的螺旋A、B、C和D。以前没有人将流感病毒的两种独立的保守肽与Dps或其他纳米颗粒蛋白载体融合使得两种肽都暴露在表面上。
另一疫苗候选物是基于两种或更多种高度保守的HPV L2蛋白肽的通用型HPV疫苗。因此，这两种肽L2(aa12-36)和L2(aa108-120)分别融合于Dps的N-和C-末端。来自HPVL2蛋白的L2(12-36)和L2(108-120)肽构成关键性的细胞结合位点，并且每种肽还带有中和性表位(Karanam等人,2009)。通过掺入这两种高度保守的肽，可以拓宽针对不同致癌HPV类型的保护作用。还可以使用来自L2和其他蛋白的可选的或另外的保守肽。以前没有人将HPVL2蛋白的两种独立的保守肽与Dps或其他纳米颗粒蛋白载体融合，使得得到的融合蛋白是可溶的以及热稳定的。
还有另一种Dps融合蛋白疫苗候选物是包含与Dps融合的一种或多种保守的蛋白或肽抗原的HIV疫苗，包括被中和性单克隆抗体广泛识别的那些。这些保守的HIV蛋白或肽抗原包括被中和性单克隆抗体(包括2F5、4E10、Z13e1、VRC01和PG16)广泛识别的表位(Shi等人,生物化学(J Biol Chem.)285:24290-24298,2010；Burton和Weiss,科学(Science),329:770-773,2010)。它们中的许多见于gp41的不同区域中(FP、HR1、HR2和MPER)，包括融合肽。如图1和实施例6中所述，它们可以容易地与Dps融合为可以提供较宽的保护效应的疫苗。
还有另一个疫苗候选物实例是用于治疗和预防癌症的包含肿瘤相关抗原的疫苗。肿瘤相关抗原经常由肽制成，包括来自WT1蛋白的那些。已经发现来自WT1的几种肽作为针对癌症的免疫治疗性疫苗是有效的，包括RMFPNAPYL和SLGEQQYSV(Oka等人,Curr.Opinionin Immunol.20:211-220)。它们可以容易地与Dpa融合为疫苗候选物。由于T-细胞免疫在清除癌症中是至关重要的，来自幽门螺杆菌(HpDps)的Dps可能是优选的，因为其已知具有免疫调节效应，该免疫调节效应将免疫应答转变为Th1或细胞介导的免疫应答。可以对针对结核分枝杆菌(TB)的疫苗采用相同的策略，因为TB是细胞内病原体。对于此疫苗可以与HpDps一起使用的抗原可以包括来自TB的ESAT-6、Ag85A和其他抗原的那些免疫显性表位。
对于天然形成三聚体结构的蛋白或肽，本发明还表现为由融合在Dps的N-或C-末端处的蛋白或肽形成三聚体结构。对于这种应用，与C-末端的融合可能是优选的，因为来自三个亚基的C-末端在C-末端3次折叠界面处紧靠在一起。三聚体形成蛋白或肽的实例包括流感病毒的HA2和HIV的gp41。要理解的是，可以通过这种蛋白或肽的恰好三聚体形成区诸如HA2的螺旋A和gp41的HR1形成三聚体。可以引入连接序列诸如来自酵母亮氨酸拉链GCN4的连接序列以促进三聚体形成。另外，蛋白或肽或Dps的末端序列的长度可以延长或缩短以促进三聚体形成。三聚体形成将允许呈现不仅线性表位而且仅见于三聚体结构中的构象表位。通过电子显微术、晶体学的结构分析，和/或使用识别特异性构象表位的抗体来证明三聚体形成。
病毒融合肽见于所有包膜病毒中，包膜病毒依赖于细胞融合以引发感染。此类包膜病毒包括流感病毒、HIV、登革热病毒、呼吸道合胞病毒和西尼罗病毒。众所周知，病毒融合肽自身是不溶的并且由于其疏水性而难以处置(Chun等人,疫苗(Vaccine)26:6068-6076,2008)，并且在其N-末端处具有融合肽的流感病毒HA2蛋白自身作为重组蛋白不能表达(Swalley等人，生物化学(Biochemistry)43:5902-5911,2004)。本发明显示，可以产生具有病毒融合肽的可溶性Dps融合蛋白，尤其是当该融合肽与Dps的C-末端融合时，如实施例2、3和7中所示。由于融合肽是包膜病毒中最保守的序列，这种Dps融合蛋白作为疫苗抗原以及作为检测这些病原体的诊断试剂将非常有用，所述诊断试剂通过测量动物或人中针对所述融合肽的特异性抗体来检测。
热稳定性对于疫苗产品是非常需要的特性，因为其可以显著地减少疫苗的储存、分销和使用的物流需求。在远高于75℃的温度下最适生长的嗜超高温细菌或古细菌的Dps可以承受高温下的处理，如采用硫磺矿硫化叶菌的Dps(SsDps)所观察到的那样(Wiedenheft等人,美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)102:10551–10556,2005)。我们进一步显示SsDps是稳定的或在高温(≥60℃)下处理1hr后仍然是可溶的纳米颗粒。然而，与蛋白或肽的融合可能彻底地消除这种承受热的能力。因此，本发明显示SsDps融合蛋白当在相同条件下处理时保持稳定，即使采用融合在Dps的两个末端处的蛋白或肽。在处理后融合蛋白保持为纳米颗粒，并且与Dps融合的蛋白或肽保持抗原性。本发明进一步显示，与具有来自大肠杆菌的Dps(EcDps)的融合蛋白在这种条件下也是稳定的。这也是非常出人意料的，因为大肠杆菌是中温生物——在适中的温度(25–40℃)下最佳生长的一种生物体或微生物。然而，当在不同温度(60,70,80或90℃)下测试时，Dps融合蛋白不能承受与天然Dps一样高的温度，例外是M2e-SsDps-FP，如实施例9和10中所示。尽管如此，值得注意的是，融合蛋白实际上保留了很大程度的初始热稳定性，这使得它们远比大多数其他蛋白稳定得多。然而，由于其中EcDps的游离N-末端的前22个氨基酸缺失并用M2e替代的M2e-ΔN22EcDps是对热不稳定的，因此所有融合蛋白没有保留热稳定性，提示热稳定性依靠末端序列的保留和/或蛋白或肽的融合方式。
除了疫苗以外，Dps融合蛋白可以用作用于诊断感染性或非感染性疾病的诊断剂。例如，它们可以用作免疫测定诸如ELISA(酶联免疫吸附测定)和用于检测对与Dps融合的蛋白或肽特异的抗体的免疫印迹中的抗原。在微阵列形式中，具有不同蛋白或肽的Dps融合蛋白可以一起用于检测一定范围的特异性抗体。肽适体也可以与Dps融合用于诊断。它们是10-20个氨基酸的短可变肽结构域，其与特异性靶标或受体结合。Dps融合蛋白可以进一步与酶或荧光染料结合或负载有铁或其他金属作为检测量度或信号发射体。此外，Dps融合蛋白可以用来产生针对与Dps融合的蛋白或肽的特异性多克隆或单克隆抗体，后者又可以用作诊断剂以检测蛋白或肽，或与其相关的病原体或细胞。来自嗜超高温生物或其他嗜极端生物的Dps，诸如SsDps，对于诊断应用是优选的，因为嗜超高温生物或其他嗜极端生物很少与动物或人接触，并且因此没有或具有很少的交叉反应性机会。
可以使用本领域中熟知的重组DNA技术通过一个或多个氨基酸的置换、插入或缺失来修饰Dps或Dps融合蛋白。一种这样的修饰是修饰Dps的末端和内部序列以优化融合蛋白的颗粒形成和抗原递呈。例如，附加的氨基酸残基可以添加至N-或C-末端以延长游离的末端序列以确保末端和与它们融合的蛋白或肽的全部表面暴露，并且为同一目的，在一些情况下可以从N-或C-末端将氨基酸剔除。一种另外的修饰是制备嵌合Dps蛋白，诸如具有来自一个Dps的一个或两个末端序列以及来自另一Dps的内部序列从而确保N-和C-末端两端均适宜地在表面上延伸的一种嵌合Dps蛋白。另一种修饰是通过改变参与铁结合的氨基酸来消除铁结合活性。然而，此功能可以不去处理，因为通过铁结合阻止自由基生成可能对疫苗和其他产品是有益的。
Dps融合蛋白可以进一步通过与碳水化合物分子结合或共价连接来修饰。一种这样的碳水化合物分子是αGal表位(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc)或其类似物。人和灵长类动物天然地具有非常高的抗αGal抗体效价。因此，将此αGal表位与融合蛋白连接允许形成抗原-抗体复合物，该复合物又可以促进抗原递呈并增强针对与Dps融合的蛋白或肽的免疫应答。尽管人抗αGal抗体与Galα1-3Galβ1-4GlcNAc结构反应反应最强，但它们也与蜜二糖(Galα1-6Glc)强烈地反应。结果，蜜二糖已经被用作这些人抗体的亲和纯化的配体(Galili等人实验医学(J.Exp.Med.)160:1519-1531)。在实施例11中，通过还原胺化将蜜二糖成功地与双-肽Dps融合蛋白M2e-SsDps-FP和SsDps连接。还原胺化将碳水化合物分子与蛋白上赖氨酸残基的ε-氨基连接并且是被最广泛使用和最温和的碳水化合物结合方法之一。M2e或FP均不含有任何赖氨酸残基，并且因此采用此方法它们的结构不受结合的影响。除了αGal表位以外，其它和αGal表位结构或功能类似的能促进抗原递呈并增强免疫应答的碳水化合物分子也可以按照本发明来和Dps融合蛋白结合或共价连接。
此外，Dps融合蛋白可以用作寡糖或多糖抗原的载体蛋白以产生糖结合疫苗，其由与蛋白载体共价连接的碳水化合物抗原组成。糖结合疫苗是一大类针对细菌感染性疾病的疫苗，并且正在针对其他感染性和非感染性疾病(包括真菌和癌症)进行开发。通过与蛋白载体连接，碳水化合物抗原成为T细胞依赖性的，即，它们显示出在反复免疫或免疫记忆时的强化效应。细菌和真菌多糖抗原可以来自于各种细菌和真菌病原体，包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、B组链球菌(group BStreptococcus)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、炭疽芽胞杆菌(Bacillusanthracis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和白色念珠菌(Candida albican)。实施例11证明了酵母甘露聚糖多糖与Dps融合蛋白M2e-SsDps-FP通过还原胺化的成功结合。富含赖氨酸或其他合适的氨基酸的肽可以融合于或插入至Dps的N-和C-末端之一或两者，以进一步促进结合，如图2中所述。因此，除了Dps内现有的结合位点以外，为与Dps融合的肽提供固定数目的附加结合位点。富含赖氨酸的肽的实例可以容易地在病毒和细菌蛋白中找到，诸如水疱性口炎病毒的基质蛋白的N-末端前20个氨基酸(Swiss Prot登记号P03519)。与Dps融合的肽可以包含其他的氨基酸，诸如半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和酪氨酸，它们均适合于采用其他方法的结合(Pozsgay和Kubler-Kielb,碳水化合物基疫苗(Carbohydrate-based vaccines),Rene Roy(编辑).第36-70页.ACS,WashingtonDC.2008)。优选该肽含有至少两个适合于与碳水化合物结合的氨基酸。使用Dps融合蛋白作为细菌糖结合疫苗的载体的一个独特优势是Dps和多糖抗原两者均可以来源于同一细菌。当使用来自细菌的不同家族的Dps时，含有合适的氨基酸的肽与Dps的融合因此提供了用于连接碳水化合物抗原的合适氨基酸残基的一致的碱基数目。这相对于使用天然Dps作为用于糖结合疫苗的载体蛋白提供了明显的优势。除了疫苗以外，Dps融合蛋白糖结合物还可以用作诊断剂。
Dps融合蛋白在细菌表达系统中以高收率制备，细菌表达系统是高效的且成本低。它们可以使用标准的纯化技术纯化，包括沉淀、离子交换和尺寸排阻色谱法。在细菌表达系统中表达后纯化的Dps融合蛋白可以不包含铁或包含可变量的铁。因此，融合蛋白可以通过将它们与外来铁源诸如Fe(NH4)2(SO4)混合而完全负载铁。除了铁以外，它们还可以负载有其他金属离子，诸如锌、银、镍、铜和钴。可以想象铁或其他金属离子的结合可以为融合蛋白提供稳定作用。它们还可以充当诊断测试的信号发射体。融合蛋白还可以用通常用来处理疫苗抗原的剂处理，诸如甲醛,、戊二醛、乙烯亚胺和β-丙内酯，它们可以进一步稳定融合蛋白。
具有Dps融合蛋白的疫苗可以在盐水、缓冲盐水、干粉、控释制剂或其他药学上可接受的载体或赋形剂中制备，用于通过肌内、皮内、皮下、透皮、经鼻、经肺、局部或口服途径施用于人或动物的。疫苗还可以与佐剂诸如铝盐、磷酸钙、水包油乳液、CpG、MPL(单磷酰脂质A)、toll-样受体配体、细胞因子、趋化因子和/或能够增加免疫应答的生长因子一起配制。
实施例
下列是用来举例说明各种实施方案的实施例，但它们不限制本发明的范围。
实施例1
Dps融合蛋白的构建、表达、纯化和表征
蛋白或肽可以使用标准的重组DNA技术以不同的方式与Dps融合(图1)。Dps和Dps融合蛋白的示意图在图2中给出。在此实施例中，蛋白或肽与Dps的N-和C-末端之一或两者融合。与Dps融合的蛋白或肽的实施例和产生的所得到的融合蛋白列举在表1和2中。在这些实施例中使用两种不同的Dps：大肠杆菌的EcDps(Genebank ID X69337.1；Swiss-Prot登记号P0ABT2)和硫磺矿硫化叶菌的SsDps(Genebank ID AE006642.1；Swiss-Prot IDP95855)。
1.融合蛋白基因的构建
编码蛋白或肽的DNA序列与编码Dps的DNA序列融合，从而通过PCR(聚合酶链式反应)扩增或DNA合成来产生融合蛋白基因。编码蛋白或肽的DNA序列通过逆翻译或从GenBank数据库中的相应基因获得。因此，流感病毒M2e和融合肽的DNA编码序列可以分别从Genebank ID CY033623.1和CY033622.1的已公开序列获得，并且编码HPV L2肽的那些序列可以从Genebank ID AF536179.1获得。
表1.用于Dps融合蛋白的蛋白或肽
表2.Dps融合蛋白的实施
对于Dps融合蛋白基因，在5’端处框内引入NdeI位点并且BamH1位点放置在3’端处用于克隆入表达载体中(图3)。用于PCR的引物将与Dps末端的编码序列(～15个核苷酸)框内连接的编码蛋白或肽的DNA序列整合在5’或3’端处。对于较长的肽诸如M2e,覆盖～15个核苷酸的重叠引物用来整合肽的整个编码序列。含有SsDps或EcDps基因(它们是合成的或从细菌DNA克隆的)的DNA质粒用作PCR中的模板。融合蛋白基因通过PCR扩增并克隆进TA克隆载体(Invitrogen)中。在通过小型制备(mini-prep)分离载体质粒后，使用用于表达且不含任何标记序列的NdeI和BamH1位点将融合蛋白基因克隆进表达载体诸如pJexpress(DNA2.0)和pET 11或25(Novagen)中。可选地，使用DNA合成服务提供商诸如DNA2.0(CA)合成整个融合蛋白基因。在DNA合成前，可以为在大肠杆菌中的增强表达优化密码子。
2.Dps融合蛋白的表达和纯化
使用由表达载体和表达宿主细胞提供商概述的标准重组蛋白表达实验方案进行表达。表达载体或质粒被转化至大肠杆菌表达宿主(BL21)中。细菌在37℃下在LB培养基中生长过夜，并且以1:3的比率转移至新鲜的LB培养基中，最终OD 600nm为0.6–1.2。加入IPTG至0.1–0.5mM以诱导蛋白表达。IPTG添加后，细菌在37℃下培养4小时，然后收获用于蛋白纯化。
为了纯化融合蛋白，细菌通过以3,000g离心30min而沉淀，并悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS；20mM磷酸盐、150mM NaCl,pH 7.4)或TN缓冲液(25mM Tris、150mM NaCl,pH 8.0)中。任选地加入溶菌酶至1mg/ml，然后在室温下温育30min。将悬浮液超声处理以裂解细菌细胞。将溶胞产物以15,000g离心15min。收集上清液并通过0.2μm滤器过滤。通过凝胶过滤使用Bio-gel A1.5m或Sepharose CL-6B柱纯化上清液中的Dps融合蛋白。任选地，在凝胶过滤前融合蛋白首先通过DEAE-Sepharose CL-6B柱纯化。融合蛋白用不连续NaCl梯度(0.2–0.5M)从DEAE-Sepharose柱被洗脱掉。利用Dps融合蛋白的热稳定性的优势(参见实施例9和10)，纯化过程采用简单的热处理步骤(60℃持续10分钟)简化许多，所述热处理步骤使大多数宿主蛋白变性，从而容易通过离心去除。
使用蛋白浓缩仪以10kDa的截止值将纯化的融合蛋白浓缩至～10mg/ml。通过二金鸡宁酸(BCA)分析方法来确定蛋白浓度。
3.融合蛋白的表征
在变性条件下进行的SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)用来检查Dps融合蛋白的单体的大小或分子量。
利用Bio-Gel-A1.5m柱(1.8×85cm)的凝胶过滤用来检查Dps融合蛋白相对于天然Dps的大小或颗粒形成。检查的所有融合蛋白的峰的洗脱始终比天然Dps早1–5个级分(每个2.5ml)。这些结果显示，Dps融合蛋白展示的尺寸大于天然Dps，这与肽的加入有关，因此其类似天然Dps是复合物或纳米颗粒。
进行透射电子显微术以通过负染色可视化颗粒形成。在检查前采用磷钨酸钠染色蛋白。
实施例2
具有SsDps和流感病毒肽的Dps融合蛋白的生成
采用两种高度保守的流感病毒肽，M2e和融合肽，生成几种Dps融合蛋白(表1和2)。它们包括M2e-SsDps(SEQ ID No:1)，其具有与SsDps的N-末端融合的M2e；SsDps-FP(SEQ IDNo:2)，其具有与SsDps的C-末端融合的融合肽；以及通过将M2e和Fp分别融合至N-和C-末端制成的双肽融合蛋白M2e-SsDps-FP(SEQ ID No:3)。
所有这三种融合蛋白以高水平表达，是可溶的，并容易纯化。SDS-PAGE显示与天然Dps相比，Dps融合蛋白的单体表现出稍稍增加的分子量，其与肽的添加相一致。M2e-SsDps和M2e-SsDps-FP的结果显示在图4中。
在Bio-gel A1.5柱上，所有融合蛋白始终在与天然Dps相同的位置处或比天然Dps早1-5个级分被洗脱出来(图5)。这些结果显示Dps融合蛋白表现出与天然Dps相似的尺寸或比天然Dps大的尺寸，这与肽抗原的加入有关，因此类似天然Dps是复合物或纳米颗粒。颗粒形成进一步通过EM确认。双-肽融合蛋白M2e-SsDps-FP的图像显示在图6中。
实施例3
具有EcDps和流感病毒肽的Dps融合蛋白的生成
为了证明融合蛋白可以用不同的Dps产生，以相同的方式用EcDps生成三个融合蛋白，M2e-EcDps(SEQ ID No:4)、M2e-ΔN22EcDps(SEQ ID No:5)和M2e-EcDps-FP(SEQ IDNo:6)。基于SDS-PAGE和利用Bio-gel A1.5柱的凝胶过滤，它们的表现与上述具有SsDps的融合蛋白类似。它们所有三种均在与天然EcDps相同的位置处或比天然EcDps早1-5个级分从Bio-Gel A1.5柱被洗脱出来。在M2e-ΔN22EcDps中，EcDps的前22个N-末端氨基酸被剔除，并被M2e替代。
实施例4
具有附加的流感病毒肽的Dps融合蛋白的生成
除了M2e和融合肽以外，来自流感病毒的其他保守的蛋白或肽也可以与Dps融合作为疫苗候选物或疫苗候选物的一部分，它们均提供通用的或广谱的保护作用。另外，相同的肽可以融合至N-和C-末端两端，诸如M2e-SsDps-M2e。在此实施例中，使用来自流感病毒的HA2的其他肽，包括依照以前所述的命名法命名的螺旋A、B、C和D(Bullough等人,自然(Nature),371:37-43,1994)或它们的任意组合。螺旋A紧邻融合肽定位。由于在中性和/或酸性pH下这些螺旋是HA2三聚体结构的一部分，它们可以适于利用Dps的C-末端3次折叠界面(其中三个Dps亚基的C-末端紧靠在一起)在Dps融合蛋白的表面上形成三聚体。一个实施例是在Dps的C-末端处整合了螺旋A的SsDps-螺旋A。可以加入融合肽以产生融合蛋白SsDps-FP-螺旋A或螺旋A-SsDps-FP。螺旋B、C和D可以以相同的方式与Dps融合。这些HA2螺旋和邻近序列或Dps的C-末端的长度可以延长或缩短以促进三聚体形成。SsDps用作上述融合蛋白的实施例，并且也可以使用来自其他细菌或古细菌的Dps。
实施例5
具有来自HPV L2蛋白的保守肽的Dps融合蛋白的生成
在此实施例中，来自HPV L2蛋白的两种高度保守的肽(aa17-36和aa108-120)(表1)与SsDps融合，所述两种保守的肽构成中和性表位以及HPV细胞结合位点。还使用第一种肽的较长形式，aa12-36,其构成此区域处的完整细胞结合位点。因此，采用SsDps，L2(17-36)-SsDps-L2(108-120)和L2(12-36)-SsDps-L2(108-120)(SEQ ID No:7)生成两种双肽融合蛋白。
这两种融合蛋白的表达和纯化显示在图7中。如具有流感病毒肽的Dps融合蛋白那样，这两种HPV融合蛋白通过SDS-PAGE表现出增加的分子量，它们从Bio-Gel A1.5柱比天然SsDps较早地被洗脱掉，并且在EM下表现为纳米颗粒。
实施例6
具有其他蛋白或肽的Dps融合蛋白的生成
除了前述实施例中所述的蛋白或肽以外，许多其他的蛋白或肽可以与Dps融合以产生疫苗、免疫治疗剂以及诊断剂。这些包括来自人免疫缺陷病毒(HIV)和癌症的那些。
HIV gp41蛋白比gp120更为保守，并且由独特的结构组分-融合肽(～16aa)、融合肽近端区(FPPR；～13aa)、N-末端七残基重复序列(HR1；～20aa)、C-末端七残基重复序列(HR2；～32aa)和膜近端外部区(MPER，～20aa)组成。被广谱中和性单克隆抗体2F5和4E10识别的保守肽序列位于MPER中。MPER以及其他组分诸如融合肽可以如图1中所述与Dps融合，以产生可以提供广谱保护效应的疫苗。MPER可以融合至Dps的两个末端(MPER-EcDps-MPER)。另外，融合肽、HR1和/或HR2还可以单独使用或与MPER组合使用以产生融合蛋白，诸如MPER-EcDps-FP、EcDps-FP和EcDps-HR2-MPER。由于HR1和HR2天然地形成三聚体，它们可以以促进三聚体形成的方式与Dps融合，这可以允许递呈不仅线性肽表位，而且递呈仅在三聚体结构中发现的构象表位。鉴于HIV高度可变的事实，可以通过将两种以上的这些融合蛋白组合而制成疫苗以便包含尽可能多的这些保守肽，并且因此增加了疫苗的功效。
肾胚细胞瘤蛋白WT1见于各种癌症中，并且是癌症免疫治疗的主要靶标。在WT1中已经鉴定了几种T细胞肽表位，并且它们显示在癌症患者的治疗中作为免疫治疗剂是有效的，包括RMFPNAPYL(RL9)和CMTWNQMNL(CL9)。它们可以单独地或一起与Dps融合以产生融合蛋白，诸如RL9-EcDps-RL9、CL9-EcDps-CL9和RL9-EcDps-CL9以增强它们的效应。
EcDps用作上述融合蛋白的实例，并且还可以使用来自其他细菌或古细菌的Dps。对于在其中T细胞免疫至关重要的癌症免疫治疗中的应用，来自幽门螺杆菌或HP-NAP的Dps可能是优选的，因为其已知具有免疫调节效应，该免疫调节效应将免疫应答转变为Th1或细胞介导的免疫应答。因此，融合蛋白如RL9-HpDps-CL9可能是优选的。
实施例7
Dps融合蛋白的可溶性
在裂解细胞的高速离心后，细菌系统中表达的蛋白可以通过存在于上清液中而是可溶的，或通过存在于沉淀物或包涵体中而是不溶的。优选Dps融合蛋白是完全可溶的或至少部分可溶的，使得它们可以容易地被纯化。不溶的融合蛋白如果在变性条件下被增溶后可以再复原为纳米颗粒，则仍然可以是有用的。上述实施例中描述的Dps融合蛋白所有均是完全可溶的，并且容易地通过色谱法纯化，0.2μm过滤并浓缩。然而，产生的所有Dps融合体不都是完全可溶的。因此，FP-EcDps是不溶的，而FP-SsDps是部分可溶的。因此Dps融合蛋白的溶解度依赖于蛋白或肽、Dps以及它们融合在一起的方式。融合肽本身是高度疏水的和不溶的，这是来自所有有包膜的病毒的融合肽的共同特征。因此，值得注意的是实际上可以产生完全和部分可溶的具有融合肽的Dps融合蛋白，如用SsDps-FP、FP-SsDps、M2e-SsDps-FP和M2e-EcDps-FP(表2)所显示的那样。
实施例8
与Dps融合的肽抗原的抗原性和表面暴露
具有流感病毒的M2e和/或融合肽的Dps融合蛋白的抗原性在免疫印迹和斑点印迹实验中使用抗M2e单克隆抗体(16C2,Abcam)或羊抗HA血清进行评价。16C2抗体已经广泛地用来评价M2e结构域。羊抗-HA血清是对H1N1(A/New Caledonia/20/99(H1N1)的有效试剂，其针对纯化的HA蛋白产生。对于免疫印迹，蛋白在变性条件下通过SDS-PAGE分离，然后印迹在尼龙膜上。16C2抗体与带有M2e的融合蛋白(M2e-SsDps和M2e-SsDps-FP)反应，但不与天然SsDps蛋白反应(图8A)，和类似地，抗-HA血清仅与M2e-SsDps-FP反应，但不与M2e-SsDps或SsDps反应(图8A)，这指示M2e和融合肽两者均与Dps合适地融合并具有抗原性。
在斑点印迹中，Dps融合蛋白在非变性条件下直接点样在纤维素膜上，即，测试未处理的Dps融合蛋白纳米颗粒。获得类似的结果，即，特异性抗体仅与带有相应肽的融合蛋白反应(图8A)。这些结果指示融合在N-末端和C-末端两端处的肽存在于Dps融合蛋白的表面上并且具有抗原性。如期望的那样，与抗-HA血清的反应较弱，因为其针对整个HA分子产生，而非针对融合肽产生。
还测试了在C-末端处具有融合肽的Dps融合蛋白(SsDps-FP)。在免疫印迹和斑点印迹中，其均仅与抗-HA血清反应。另外，在免疫印迹和斑点印迹中具有EcDps的Dps融合蛋白(M2e-EcDps和M2e-EcDps-FP)以与具有SsDps的融合蛋白相似的方式表现，不同之处在于与抗-HA血清的反应似乎比M2e-EcDps-FP更强。
这些结果一起清楚地指示，在N-和/或C-末端处与Dps融合的M2e和融合肽具有抗原性并且存在于融合蛋白纳米颗粒的外表面上。
类似地，在斑点印迹和免疫印迹中使用针对整个L2蛋白的兔抗血清评价具有HPV肽抗原的融合蛋白的抗原性。结果显示，在免疫印迹和斑点印迹中抗体与Dps融合蛋白(L2(12-36)-SsDps-L2(108-120)和L2(17-36)-SsDps-L2(108-120))两者均反应，但不与SsDps反应(图8B)。这指示，融合的肽具有抗原性并且展示在Dps融合蛋白纳米颗粒的表面上。
实施例9
具有SsDps的Dps融合蛋白的热稳定性
为了评价Dps融合蛋白的热稳定性，在PBS中制备的具有融合蛋白的澄清的细胞溶胞产物在60℃处理不同的时间段。在应激条件诸如热和强酸或强碱下，蛋白通常丧失溶解度并形成沉淀物。结果显示，直至处理结束(60min)SsDps和SsDps融合蛋白均保持可溶或保持在上清液中，没有明显的降解，包括在两端处分别地融合两种肽的融合蛋白。另一方面，当蛋白溶液开始变浑浊时，大多数宿主细胞蛋白在刚2分钟后就形成聚集体并且沉淀。通过以12,000g离心10min去除沉淀物。
采用双-肽融合蛋白M2e-SsDps-FP和L2(12-36)-SsDps-L2(108-120)的结果显示图9A和9B中。显然在热处理结束时远超过50％的融合蛋白明显地仍然是稳定的。这通过密度测量来确认。在热处理结束时或热处理期间的任何时间点时的损失量实际上是零或极小。
重要的是，在60℃下处理1hr后纯化的SsDps融合蛋白，包括M2e-SsDps-FP和L2(12-36)-SsDps-L2(108-120)，通过色谱法和EM确认仍然为纳米颗粒，并且在斑点印迹和免疫印迹测试中均与特异性抗体反应。这些结果证明，具有SsDps的Dps融合蛋白在使用的条件下是热稳定的。
还通过在不同的温度(60、70、80或90℃)下处理融合蛋白10min来检验热稳定性。发现SsDps可以承受在80℃下的处理10min，损失小于50％。值得注意的是，发现融合蛋白M2e-SsDps-FP与SsDps一样稳定，而其他的融合蛋白，包括L2(12-36)-SsDps-L2(108-120)可以承受在70℃的处理10min。因此这些结果显示，SsDps融合蛋白保留了天然SsDps的至少很大程度的热稳定性。考虑到这些融合蛋白中的一些在两个末端处同时融合两种肽，值得注意的是实际上保留了如此高程度的耐热性，使得这些融合蛋白远比大多数其他蛋白更稳定。
实施例10
具有EcDps的Dps融合蛋白的热稳定性
大肠杆菌是中温生物。EcDps和EcDps融合蛋白不预期是热稳定的。因此，发现天然EcDps和两种EcDps融合蛋白(M2e-Dps和M2e-EcDps-FP)当在60℃处理1hr时均同样稳定。采用M2e-EcDps的结果显示在图9C中。还在上述的不同温度下进行处理。EcDps可以承受在70℃下的处理10min，损失小于50％。M2e-Dps和M2e-EcDps-FP融合蛋白两者在该条件(70℃，10min)下与EcDps相比稍稍不太稳定，损失稍稍多一些，然而，仍然远低于50％。
然而，实施例3中产生的M2e-ΔN22EcDps在使用的相同条件下不是热稳定的，即，在60℃下处理刚好10分钟后发生多于50％的损失，指示并不是所有融合蛋白均保持热稳定性，并且热稳定性的保留取决于Dps的末端序列的保留。
实施例11
Dps融合蛋白与碳水化合物的结合
乳糖、蜜二糖和酵母甘露聚糖用作用于通过还原胺化与Dps或Dps融合蛋白结合的碳水化合物或糖实例。甘露聚糖用10mM醋酸钠(pH 6.0)中的10mM NaIO3在室温下氧化1hr，然后在添加甘油(0.1％，v/v)后在水中透析。二糖蜜二糖和乳糖在不氧化的情况使用。对于结合，糖类与蛋白在200mM NaCl和50mM磷酸盐(pH 8.0)中混合，然后任选地添加氰基硼氢化钠(5mg/ml)。甘露聚糖和蛋白以2-5mg/ml使用，二糖以30–150mg/ml使用。混合物在室温下或37℃下保持不同的时间。结合物通过琼脂糖凝胶分析。使用Bio-gel A1.5柱纯化具有甘露聚糖的结合物，并且通过在PBS中透析回收具有二糖的那些结合物。
用所有测试的糖类获得与SsDps和SsDps融合蛋白的结合。在1％琼脂糖和10mMTris-boric-EDTA缓冲液(89mM,pH 8.3；Sigma Chemical Co)中的琼脂糖凝胶电泳是一种评价结合过程的非常有效的方法，其中通过与未结合的Dps或Dps融合蛋白相比改变的结合物迁移模式来指示结合。分子在琼脂糖凝胶中的迁移受到尺寸以及电荷的影响。因此，取决于使用的糖类，蛋白可能更快或更慢地移动，并且连接的糖分子越多，这种迁移的变化变得越大。
图10显示SsDps和M2e-SsDps-FP与甘露聚糖、蜜二糖和乳糖的结合。融合蛋白明显地与甘露聚糖、蜜二糖或乳糖结合，如SsDps那样，如与未结合的对照相比结合物较快的迁移所示。通过SDS-PAGE，SsDps和融合蛋白与甘露聚糖的结合物由于它们的大尺寸导致大多数被积层凝胶俘获。
具有蜜二糖的结合物在斑点印迹中与天然鸡抗-αGal抗体反应(图11)。抗-αGal抗体使用蜜二糖-琼脂糖柱分离自正常的鸡血清。鸡，象人一样，也已知具有天然的抗-αGal抗体。采用未结合的Dps或Dps融合蛋白对照，没有观察到反应。融合蛋白结合物的反应比Dps结合物更强(图11)。如果向抗体溶液中加入蜜二糖，则反应大幅度减弱或被阻断。这些结果因此进一步确认糖类与Dps融合蛋白的结合，并且显示结合的糖类与特异性抗体具有反应性。
实施例12
Dps融合蛋白的免疫原性
一组Balb/c小鼠(n＝5)通过以50μg/小鼠与不完全弗氏佐剂联合肌内注射M2e-SsDps-FP融合蛋白而接种三次(第0、14和28天)。在免疫接种前1周和第二次或第三次免疫接种后2周或3周采集血清样品。每个时间点的汇集血清样品使用来自每只小鼠的相同部分产生，并用于免疫印迹和ELISA中以检测特异性抗体。使用从感染的MDCK细胞纯化的灭活的H1N1全病毒粒子(A/New Caledonia/20/99)以及同一菌株的HA蛋白进行免疫印迹，所述HA蛋白使用凝集素(RCA 120)亲和色谱法从感染的MDCK细胞纯化，然后进行Triton X-100处理。
全病毒粒子抗原含有所有病毒蛋白，包括M2和HA2。结果显示，免疫血清与M1/HA2和M2蛋白两者均反应(图12A)，指示融合蛋白M2e-SsDps-FP诱导针对M2e和融合肽的特异性抗体，M2e和融合肽分别与M2和HA2蛋白相关。在H1N1病毒中，HA2蛋白与M1蛋白共同迁移(图12A)。抗-M2e抗体也可能与M1在一定程度上反应，因为在M1和M2之间的前9个N-末端氨基酸是相同的。因此，通过使用纯化的HA蛋白证明诱导的抗-融合肽抗体与HA2的反应(图12A)。
测量抗-M2e抗体的ELISA程序已经被完全确立。因此，由融合蛋白生成的抗-M2e抗体也通过ELISA进行测量。96孔板(Nunc)用1μg/ml合成的M2e肽(MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD)在4℃以100μl/孔在10mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)中包被过夜。板用PBS-T(PBS+0.05％Tween 20)洗涤，并用PBS-T中的3％BSA在37℃封闭2小时。血清样品在PBS-T/1％BSA中连续稀释两倍，起始稀释度为1:400，并一式两份地加入至板中。在37℃温育1hr后，洗涤板并加入抗小鼠IgG碱性磷酸酶结合物(Sigma Chemical Co)，然后在37℃温育1hr。加入底物pNPP(Pierce Chemical Co)，并且测定OD 410nm。终点抗体效价确定为得到空白孔的本底之上2倍的OD值的最高稀释度。在第二次和第三次免疫接种后的汇集血清样品的结果在图12B中给出。它们显示，诱导了抗-M2e IgG抗体并在第三次免疫接种后大为增加。
这些结果综合在一起显示，Dps融合蛋白具有免疫原性并且能够诱导针对与Dps融合的蛋白或肽的特异性免疫应答。

Claims (33)

1.一种Dps融合蛋白，其包含与Dps融合的两种蛋白或肽，其中所述Dps融合蛋白能够自组装成纳米颗粒，并且所述蛋白或肽分开并同时融合在Dps的N末端和C-末端处并且存在于所述Dps融合蛋白的外表面上；其中所述Dps融合蛋白与αGal表位共价结合。
2.权利要求1所述的Dps融合蛋白，其中所述Dps来源于致病菌。
3.权利要求1所述的Dps融合蛋白，其中所述蛋白或肽来源于包括细菌、病毒、真菌、寄生虫、癌症和细胞的组。
4.权利要求1所述的Dps融合蛋白，其中所述Dps融合蛋白是热稳定的。
5.权利要求4所述的Dps融合蛋白，其中所述Dps来源于嗜温生物。
6.权利要求1所述的Dps融合蛋白用于制备用于在动物或人中引起免疫应答的药物的用途，其中所述药物以有效量向所述动物或人施用，并且所述Dps融合蛋白配制在药学可接受的媒介物、载体、赋形剂、佐剂或控释制剂中。
7.一种Dps融合蛋白，其包含与Dps融合的两种病毒融合肽，其中所述Dps融合蛋白能够自组装成纳米颗粒，并且所述病毒融合肽分开并同时融合在Dps的N-末端和C-末端处并且存在于所述Dps融合蛋白的外表面上。
8.权利要求7所述的Dps融合蛋白，其中所述Dps融合蛋白是可溶的。
9.权利要求7所述的Dps融合蛋白，其中所述Dps融合蛋白与αGal表位共价结合。
10.权利要求7所述的Dps融合蛋白用于制备用于在动物或人中引起免疫应答的药物的用途，其中所述药物以有效量向所述动物或人施用，并且所述Dps融合蛋白配制在药学可接受的媒介物、载体、赋形剂、佐剂或控释制剂中。
11.一种Dps融合蛋白，其包含与Dps的N-末端和C-末端分开并同时融合的两种蛋白或肽，其中所述Dps融合蛋白能够自组装成纳米颗粒，并且所述蛋白或肽存在于所述Dps融合蛋白的外表面上。
12.权利要求11所述的Dps融合蛋白，其中所述Dps融合蛋白还包含与Dps的内部位点融合的一种蛋白或肽。
13.权利要求11所述的Dps融合蛋白，其中所述蛋白或肽来源于包括流感病毒的M2e和HA2、乳头瘤病毒的L2、人免疫缺陷病毒的gp41、和癌症的WT1蛋白的蛋白或肽的组。
14.权利要求11所述的Dps融合蛋白，其中所述蛋白或肽包括病毒融合肽。
15.权利要求14所述的Dps融合蛋白，其中所述Dps融合蛋白是可溶的。
16.权利要求11所述的Dps融合蛋白，其中所述Dps来源于致病菌。
17.权利要求11所述的Dps融合蛋白，其中所述蛋白或肽是流感病毒的M2e和融合肽。
18.权利要求11所述的Dps融合蛋白，其中所述Dps融合蛋白包括SEQ ID No：3、6或7的氨基酸序列，其中所述Dps任选地被来自不同细菌或古细菌的Dps置换。
19.权利要求11所述的Dps融合蛋白，其中所述Dps融合蛋白是热稳定的。
20.权利要求19所述的Dps融合蛋白，其中所述Dps来源于嗜温生物。
21.权利要求11所述的Dps融合蛋白，其中所述Dps融合蛋白与αGal表位共价结合。
22.权利要求11所述的Dps融合蛋白，其是疫苗。
23.权利要求11所述的Dps融合蛋白，其是诊断剂。
24.权利要求11所述的Dps融合蛋白用于制备用于在动物或人中引起免疫应答的药物的用途，其中所述药物以有效量向所述动物或人施用，并且所述Dps融合蛋白配制在药学可接受的媒介物、载体、赋形剂、佐剂或控释制剂中。
25.一种Dps融合蛋白，其包含与Dps融合的两种蛋白或肽，其中所述蛋白或肽含有适合于与碳水化合物结合的氨基酸；其中所述Dps融合蛋白能够自组装成纳米颗粒并与寡糖或多糖共价结合，并且所述蛋白或肽分开且同时融合在Dps的N-末端和C-末端处。
26.权利要求25所述的Dps融合蛋白，其中所述蛋白或肽包含至少两个适合于与碳水化合物结合的氨基酸，这些氨基酸选自包含赖氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的组。
27.权利要求25所述的Dps融合蛋白，其中所述蛋白或肽存在于所述Dps融合蛋白的外表面上。
28.权利要求25所述的Dps融合蛋白，其中所述寡糖或多糖来源于包括细菌、病毒、真菌、寄生虫和癌症的组。
29.权利要求28所述的Dps融合蛋白，其中所述寡糖或多糖和所述Dps来源于相同的细菌。
30.权利要求25所述的Dps融合蛋白，其是疫苗。
31.权利要求25所述的Dps融合蛋白，其是诊断剂。
32.权利要求25所述的Dps融合蛋白用于制备用于在动物或人中引起免疫应答的药物的用途，其中所述药物以有效量向所述动物或人施用，并且所述Dps融合蛋白配制在药学可接受的媒介物、载体、赋形剂、佐剂或控释制剂中。
33.一种药物，包含有效量的流感病毒的M2e和融合肽，所述药物用于针对流感病毒引起免疫应答，其中所述M2e和融合肽分开且独立地融合在Dps的N-末端或C-末端处作为融合蛋白，其中所述药物配制在药学可接受的媒介物、载体、赋形剂、佐剂或控释制剂中。
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