KR102657261B1 - Ｃｏｖｉｄ－１９ 진단을 위한 재조합 코로나－１９ 바이러스 스파이크 단백질의 생산 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 COVID-19 진단을 위한 재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질의 생산 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 단백질; 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon) 폴리펩타이드가 융합된 COVID-19 진단용 S1-Fd 재조합 항원 단백질, 상기 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 포함하는 COVID-19 진단용 조성물, 진단키트 및 COVID-19 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 COVID-19 진단을 위한 재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질의 생산 및 이의 용도에 관한 것이다.
2019년 12월 중국 우한에서 발생한 코로나바이러스 19 감염증(COVID-19)은 신종 코로나바이러스(2019-nCoV)에 의해 바이러스성 호흡기 감염을 일으키는 전염성 바이러스로 유전적 배열(DNA sequencing)에서 능동 전사(positive-sense) 외가닥 RNA(single-stranded RNA) 코로나바이러스로 밝혀졌다. 이 바이러스는 현미경으로 관찰했을 때 코로나(원 둘레에 방사형으로 빛이 퍼지는 형태) 모양이라 붙여진 이름이며, 감염 시 2~3일에서 최장 2주 정도 잠복기를 거쳤다가 다양한 증상이 나타난다. 주로, 무기력감, 37.5도 이상의 고열, 기침, 인후통, 가래, 근육통, 두통, 호흡곤란, 폐렴 등의 증상이 발생하며, 폐 손상에 따른 호흡부전으로 심하면 사망에 이를 수 있다.
현재 국내의 경우에는 확진자의 증가폭이 정체 또는 감소 추세에 있으나, 북미, 유럽, 남미 등 전 세계적으로 폭발적인 증가 추세에 있어 WHO가 판데믹(Pandemic)을 선언했으며, 각 국가들은 국경을 폐쇄하거나 외출을 통제하는 등 바이러스의 전파를 차단하기 위해 가능한 모든 수단을 동원해 방역에 집중하고 있다. 이러한 방역의 방법은 사회·경제적으로 큰 손실을 유도하기 때문에 감염자와 비감염자를 구별하는 신속한 진단 방역이 필요한 상황이다.
신속 진단 방법으로는 분자진단(real time RT-PCR 검사)과 면역·화학적 진단법이 가장 많이 사용되고 있으며, 국내의 경우, 진단에 분자진단법이 주로 사용되고 있다. 분자진단법의 경우, 정확도 면에서는 우수한 평가를 받고 있으나, 값비싼 유전자 증폭 장비, 실험자의 숙련도, 검사 시간(최소 6시간) 등 여러 측면에서 효율성이 떨어지는 문제점을 안고 있다.
면역·화학적 진단법은 분자진단에 비해 정확도 측면에서 미진한 부분이 있으나, 진단 속도 측면에서 장점을 가지고 있어 1차 진단방역에 사용될 가능성이 충분하여 최근 FDA가 권고사항으로 면역·화학적 진단법(Rapid 진단키트)의 활용 가능성을 제안했다.
따라서 COVID-19 예방 및 진단을 위한 신속한 진단키트 제조와 진단용 항원 단백질을 생산하기 위한 의료산업계의 요구는 단기간에 유용 생리활성 물질을 대량생산할 수 있는 시스템의 개발이다.
한편, 식물체를 이용하여 유용 생리활성 물질을 생산하는 것은, 동물세포나 미생물에서 합성하여 단백질을 생산하는 방법에서 발생할 수 있는 여러 가지 오염원을 원천 배제할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 해당 유용물질의 수요가 급증할 경우, 대량생산에 필요한 설비 기술이나 비용 면에서 기존의 동물세포 시스템과 비교하면 절대적으로 유리하기 때문에, 최단기간에 저비용으로 대량생산이 가능하다는 장점이 있다. 식물세포의 번역 후 변형은 동물세포에서 이루어지는 것과 매우 유사하여 정확하게 복합 단백질(Multimeric protein)을 생성할 수 있다. 또한, 식물 시스템을 이용하여 생산한 당단백질의 경우, 당화(glycosylation)되는 아미노산 잔기가 원래의 단백질과 동일하게 당화가 일어남이 알려져 있다. 따라서, 상술한 이러한 장점들로 인해, 최근에 식물 발현 시스템을 이용하여 유용 생리활성 물질인 단백질을 생산하는 방법이 동물세포나 미생물을 이용하여 생산하는 방법을 대체할 수 있는 잠재적인 가능성이 있어 최근에 큰 주목을 받고 있으며, 백신 및 치료제 개발과 진단 키트 등의 의료산업분야에 널리 사용되고 있다.
현재, 식물 발현 시스템을 이용하여 개발이 시도되는 백신은 병원성인 경우, 세균이나 바이러스의 점막 감염에 필수적인 부착(Adhesion)기능을 수행하는 단백질과 세균의 독성을 나타내는 독소 단백질, 바이러스의 구조를 이루는 구조 단백질들이 항원으로 주로 이용되고 있으며, 비병원성의 경우 질병을 야기하는 물질이나 원인 물질을 생산하는 주된 효소가 항원으로 이용되고 있다. 따라서 백신뿐만 아니라 진단용 항원의 개발에 있어서도 식물 발현 시스템으로 생산된 단백질의 경우, 당화에 의한 반응성이 증가되는 것으로 알려져 있어, 최근 들어 사용 빈도가 증가하는 추세에 있다.
이에 본 발명자들은 COVID-19의 신속하고 정확한 진단을 위한 방법으로서, 식물체로부터 재조합 코로나-19 바이러스의 스파이크 단백질을 대량생산할 수 있는 방법을 구축하였고, 식물체로부터 생산된 본 발명의 재조합 코로나-19 바이러스의 스파이크 단백질을 이용할 경우, COVID-19를 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 COVID-19 진단용 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 COVID-19 진단용 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는, COVID-19 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 진단용 조성물을 포함하는, COVID-19 진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 검체로부터 수득한 혈청에 본 발명의 COVID-19 진단용 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 처리한 후, 항원-항체 반응을 검출하는 단계를 포함하는, COVID-19 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 단백질; 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon) 폴리펩타이드가 융합된, COVID-19 진단용 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 COVID-19 진단용 S1-Fd 재조합 항원 단백질은, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질; 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 단백질; 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 GS-링커 펩타이드; 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon) 폴리펩타이드; 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 8개의 히스티딘 폴리펩타이드; 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드;가 융합된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 COVID-19 진단용 S1-Fd 재조합 항원 단백질은 식물체에서 발현 및 정제된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발현은 식물세포의 소포체로 표적화되어 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발현은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 유전자; 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon)을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 식물체를 형질전환시켜 상기 식물체 내에서 발현을 유도하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 유전자; 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 유전자; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 GS-링커 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin) 유전자; 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 8개 히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 HDEL 펩타이드 코딩 유전자가 순차적으로 연결되어 포함된 재조합 발현벡터로 식물체를 형질전환시켜 상기 식물체 내에서 발현을 유도하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 식물체에서 발현 및 정제된 S1-Fd 재조합 항원 단백질은 삼중 복합체 구조(trimeric complex structure)를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식물체는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 COVID-19 진단용 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는, COVID-19 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 진단용 조성물을 포함하는, COVID-19 진단키트를 제공한다.
또한 본 발명은, 검체로부터 수득한 혈청에 본 발명의 COVID-19 진단용 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 처리한 후, 항원-항체 반응을 검출하는 단계를 포함하는, COVID-19 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항원-항체 반응은 면역블롯법, 효소면역법, 면역침강법, 형광면역법, 효소기질발색법 및 항원-항체 응집법으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 COVID-19 진단용 재조합 스파이크 항원 단백질은 식물 발현 시스템을 이용하여 식물체로부터 분리 및 정제한 재조합 항원 단백질로서, 당화된 형태의 삼중 복합체 구조(trimeric complex structure)를 갖는 재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질이며, 상기 재조합 항원 단백질을 이용할 경우, 검체 시료와의 항원-항체 면역반응 여부를 통해 간편하고 신속하며 정확하게 COVID-19 감염증을 진단할 수 있는 효과가 있다. 또한 본 발명에 따른 COVID-19 진단용 재조합 스파이크 항원 단백질은 식물체로부터 분리 및 정제할 수 있어 COVID-19 진단 항원 단백질을 저비용으로 대량 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 식물체에서 COVID-19 진단용 S1-Fd 재조합 단백질 발현을 위한 발현카세트(expression cassette)를 나타낸 것으로, NB: new chaperone binding protein 신호 펩타이드, S1: 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛(subunit), foldon: T4 fibritin의 27개 아미노산(Fd); L: GS-linker, 8H: 재조합 항원 단백질의 정제를 위한 8개의 히스티딘 태그를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 재조합 발현벡터를 이용하여 식물체로부터 S1-Fd 재조합 단백질을 발현 및 분리한 것을 SDS-PAGE 전기영동 후, 웨스턴 블럿 및 코마지에 블루염색을 통해 확인한 것으로, 왼쪽 도면에서 S는 수용성 분획(supernatant), P는 펠렛 분획(pellet), T는 수용성과 펠렛분획을 모두 포함하는 분획을 기재한 것이며, 각 분획에 대한 웨스턴 블럿 결과를 나타낸 것이고, 오른쪽 도면은 분리 및 정제된 재조합 단백질을 코마시 블루(Coomassie blue) 염색으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 대장균 및 식물체로부터 각각 분리한 S1-Fd 재조합 단백질을 COVID-19 양성 및 음성으로 진단된 검진 대상자로부터 분리한 혈청에 각각 처리한 후, 검출 민감성 및 특이성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 대장균에서 발현 및 분리 정제한 S1-Fd 재조합 단백질을 COVID-19 양성 및 음성으로 진단된 검진 대상자로부터 분리한 혈청에 각각 처리한 후, 검출 민감성 및 특이성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 식물체에서 발현 및 분리 정제한 S1-Fd 재조합 단백질을 COVID-19 양성 및 음성으로 진단된 검진 대상자로부터 분리한 혈청에 각각 처리한 후, 검출 민감성 및 특이성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에서 식물체로부터 분리 및 정제한 S1-Fd 재조합 단백질의 구조 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 재조합 발현벡터를 이용하여 식물체로부터 S1-Fd 재조합 단백질을 발현 및 분리한 것을 SDS-PAGE 전기영동 후, 웨스턴 블럿 및 코마지에 블루염색을 통해 확인한 것으로, 왼쪽 도면에서 S는 수용성 분획(supernatant), P는 펠렛 분획(pellet), T는 수용성과 펠렛분획을 모두 포함하는 분획을 기재한 것이며, 각 분획에 대한 웨스턴 블럿 결과를 나타낸 것이고, 오른쪽 도면은 분리 및 정제된 재조합 단백질을 코마시 블루(Coomassie blue) 염색으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 대장균 및 식물체로부터 각각 분리한 S1-Fd 재조합 단백질을 COVID-19 양성 및 음성으로 진단된 검진 대상자로부터 분리한 혈청에 각각 처리한 후, 검출 민감성 및 특이성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 대장균에서 발현 및 분리 정제한 S1-Fd 재조합 단백질을 COVID-19 양성 및 음성으로 진단된 검진 대상자로부터 분리한 혈청에 각각 처리한 후, 검출 민감성 및 특이성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 식물체에서 발현 및 분리 정제한 S1-Fd 재조합 단백질을 COVID-19 양성 및 음성으로 진단된 검진 대상자로부터 분리한 혈청에 각각 처리한 후, 검출 민감성 및 특이성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에서 식물체로부터 분리 및 정제한 S1-Fd 재조합 단백질의 구조 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 COVID-19의 신속하고 정확한 진단을 재조합 항원 단백질로서, 식물체로부터 분리 및 정제한 재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질을 사용할 수 있음을 규명하였다.
구체적으로, 본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 단백질; 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon) 폴리펩타이드가 융합된, COVID-19 진단용 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 상기 COVID-19 진단용 S1-Fd 재조합 항원 단백질은, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질; 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 단백질; 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 GS-링커 펩타이드; 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon) 폴리펩타이드; 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 8개의 히스티딘 폴리펩타이드; 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드가 융합된 융합 단백질이다.
COVID-19 감염증을 유발시키는 SARS-CoV-2 바이러스는 30kb의 염기서열을 가지며 4개의 중요한 구조 단백질인 Nucleocapsid(N), Spike(S), M 및 E 단백질을 가지고 있다. 이중 숙주세포 감염 시 SARS-CoV 스파이크(S; spike) 단백질은 바이러스 표면에 삼량체(trimer)로 발현된 envelope glycoprotein이다. S 단백질은 단백질 바이러스 감염 중에 S1과 S2의 서브유닛으로 숙주세포 단백질 분해효소(proteases)에 의해 분리되며, S1은 RBD를 통해 숙주세포의 수용체인 ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2)와 결합하는데 돕는 역할을 한다.
최근에는 신종코로나 바이러스와 같은 MERS-CoV와 같은 코로나바이러스의 스파이크(S) 단백질에 대한 삼량체(trimer)의 구조가 보고된 바 있고, 또한 중화능이 뛰어난 항체들은 단량체(monomer)가 아닌 삼량체(trimer) 형태의 항원 단백들에 부착된다는 연구보고들이 발표되고 있다.
따라서 COVID-19의 효과적인 진단 및 치료를 위해서는 항체들의 부착능이 더 높은 삼량체(trimer) 형태의 항원 단백들을 이용하는 것이 필요하다.
이에 본 발명자들은 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛을 T4 피브리틴(fibritin)의 foldon(Fd)과 융합시켰고, Fd와의 융합에 의해 상기 S1-Fd 재조합 단백질이 삼량체 형태의 단백질(trimeric protein)로 정제할 수 있으며, 이는 단량체보다 더 안정적이며, 삼량체 구조의 항원 단백질에 항체들이 더 용이하게 부착할 수 있도록 하여 진단의 효율 및 정확성을 증진시킬 수 있도록 하였다.
뿐만 아니라, 본 발명자들은 본 발명의 COVID-19 진단용 재조합 항원 단백질의 제조를 위해, NB(New Bip; new chaperone binding protein) 펩타이드 및 HDEL 펩타이드를 사용하였다.
상기 NB 펩타이드는, 신규 BiP (NB: new chaperone binding protein) 유전자 단편으로, 기존에 재조합 단백질의 제조 시, 발현된 재조합 단백질을 소포체로 이동시키기 위해 사용되었던 BiP 서열 중 일부로서, 바람직하게는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, NB 펩타이드를 코딩하는 염기서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드는 재조합 단백질이 소포체 내에서 안정적으로 유지될 수 있도록 단백질 분해를 최소화하기 위한 것으로, 상기 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리펩티드 서열은 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시하였고, HDEL 펩타이드를 코딩하는 염기서열은 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 GS-링커 펩타이드는 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛 단백질과 T4 피브리틴의 Fd(foldon)을 연결시키기 위한 링커 펩타이드로서, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 서열번호 11의 GS-링커 펩타이드를 코딩하는 염기서열은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
나아가 본 발명의 상기 COVID-19 진단용 재조합 S1-Fd 재조합 항원 단백질은 식물체로부터 분리 및 정제된 것일 수 있는데, 식물체로부터 상기 재조합 S1-Fd 재조합 항원 단백질의 발현 및 정제를 위해, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 유전자; 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon)을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 식물체를 형질전환시켜 상기 식물체 내에서 발현을 유도하도록 하였다.
바람직하게 상기 발현백터는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 유전자; 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 유전자; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 GS-링커 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin) 유전자; 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 8개 히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 HDEL 펩타이드 코딩 유전자가 순차적으로 연결되어 포함된 재조합 발현벡터일 수 있다.
본 발명에서 COVID-19 진단을 위한 재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질을 식물체로부터 발현 및 분리하기 위해 발현벡터에 삽입된 도 1의 핵산 구조물, 즉 NB:S1:L:Foldon:8H:HDEL에 대한 염기서열은 서열번호 7에 나타내었고, 본 발명의 재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질은 상기 서열번호 7의 염기서열로부터 발현된 폴리펩티드로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 ‘재조합 발현벡터(recombinant expression vector)'란, 벡터 내에 삽입된 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 본 발명에 따른 COVID-19 진단용 재조합 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 제조된 벡터를 의미한다.
상기 "벡터"는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있으며, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 자체의 조절로 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있다.
또한, 재조합 단백질의 생산량을 증가시키기 위한 태그용 유전자, 재조합 단백질의 구조적 안정성을 유지하기 위한 태그용 유전자, 재조합 단백질을 용이하게 분리하기 위한 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있으며, 용이한 분리를 위한 태그로는 이에 제한되지는 않으나, Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있으며, 상기 선별용 마커 유전자에는 대표적으로 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 포함될 수 있으며, 상기 프로모터에는 대표적으로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV (Cytomegalovirus) 프로모터, SV40 (Simian virus 40) 프로모터, RSV (Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α (Elongation factor-1 alpha) 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 상기 터미네이터는 대표적으로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 튜머패시언스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이나, 상기 추가되는 유전자의 종류는 기존에 재조합 단백질의 제조에 사용되고 있는 종류라면 제한이 없다.
이러한 재조합 발현벡터를 식물체에 도입하여 형질전환된 식물체로부터 본 발명의 COVID-19 진단용 재조합 항원 단백질을 발현 및 분리정제할 수 있는데, 여기서 상기 식물체는 이에 제한되지는 않으나, 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
상기 "형질전환(transformation)"이란 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, "형질전환체(transgenic organism)"란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 생명체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 생명체이며, 상기 생명체는 미생물, 진핵세포, 곤충, 동물, 식물 등 생명이 있는 생물이라면 제한이 없으며, 바람직하게는 대장균, 살모넬라, 바실러스, 효모, 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등이나 이에 제한되지 않는다. 상기 형질전환체는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation), PEG (Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 재조합 벡터를 아그로박테리아 균주에 전기 충격법을 이용하여 형질전환하였고, 형질전환된 아그로박테리아를 니코티니아 벤타미아나 잎의 뒷면에 주입하여 형질전환된 식물체를 제조하였다.
또한, 상기 형질전환된 식물체로부터 본 발명에 따른 COVID-19 진단용 재조합 항원 단백질은, 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체 또는 이의 배양액으로부터 COVID-19 진단용 재조합 항원 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 통해 생산할 수 있다.
특히 본 발명자들은 COVID-19 진단용 재조합 항원 단백질을 식물 소포체에서 발현시키고 식물세포로부터 분리하여 사용하였는데, 식물세포는 단백질로의 번역(translation) 후 변형(modification)이 동물세포에서 이루어지는 것과 매우 유사하며 거의 정확하게 복합 단백질을 생성할 수 있으며, 당단백질의 경우 당화가 되어 있는 형태로 분리할 수 있어 원래의 단백질과 동일한 형태의 변형을 갖는 단백질을 수득할 수 있는 잇점이 있다.
이에 본 발명자들은 COVID-19 진단용 재조합 항원 단백질을 식물체로부터 생산함에 따라, 삼중 복합체 구조(trimeric complex structure)를 갖는 당화된 스파이크 당 단백질을 상기 식물체로부터 수득할 수 있었다. 또한, 상기 형질전환체 또는 이의 배양액으로부터 본 발명의 COVID-19 진단용 재조합 항원 단백질을 분리 및 정제하는 방법은, 당업계에 공지된 방법인 식물체로부터 목적 단백질을 분리 및 정제하는 방법이라면 모두 사용 가능하다.
나아가 본 발명은 상기 본 발명의 COVID-19 진단용 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는, COVID-19 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명자들은 식물체로부터 분리 및 정제한 COVID-19 진단용 재조합 항원 단백질, 즉 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 이용하여 SARS-CoV-2 바이러스의 검출을 통해 COVID-19 감염증을 진단할 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, COVID-19 양성 및 음성으로 진단받은 검사자들로부터 혈청 시료를 수득하였고, 각 혈청시료에 본 발명의 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 처리한 후, 항원-항체 반응 여부를 확인하였다.
그 결과, 양성 혈청 시료에서는 본 발명의 S1-Fd 재조합 항원 단백질 처리 군에서 항원-항체 면역반응이 일어남을 통해 COVID-19의 진단이 가능함을 알 수 있었다. 또한, 음성 혈청 시료에서는 본 발명의 S1-Fd 재조합 항원 단백질 처리 군에서 항원-항체 면역반응이 일어나지 않음을 확인함으로써, 본 발명의 S1-Fd 재조합 항원 단백질이 COVID-19 감염증을 정확하게 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
뿐만 아니라, 본 발명자들은 COVID-19의 진단에 있어서, 식물체 및 대장균으로부터 정제한 S1-Fd 재조합 항원 단백질 각각에 대하여, COVID-19 양성 및 음성으로 진단받은 검사자들의 혈청 시료에 처리한 후, 검출 특이성 및 민감성을 분석하였다.
그 결과, 대장균으로부터 정제한 재조합 항원 단백질로 진단하는 경우, 특이성 85%, 민감성 63%인 결과를 얻은 반면, 식물체로부터 정제한 재조합 항원 단백질을 이용한 경우에는 검출 특이성 88%, 민감성 86%로 나타나, 대장균 보다 식물체로부터 분리한 재조합 항원 단백질이 더 높은 정확도로 COVID-19를 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 본 발명에 따른 상기 COVID-19 진단용 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 COVID-19 진단용 조성물을 제공할 수 있고, 상기 진단용 조성물을 포함하는 COVID-19 진단키트를 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 "항원(antigen)"은 체내에서 면역 반응을 일으키는 모든 물질을 총칭하며, 바람직하게는 바이러스, 화합물질, 세균, 꽃가루, 암세포, 새우 등 또는 이들의 일부 펩타이드 또는 단백질이나, 체내에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명에서 상기 ‘진단’은, 넓은 의미로는 환자의 질환 내지 감염의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 합병증의 유무, 및 예후 등이다. 본 발명에서 진단은 코로나 바이러스 감염 여부 및 감염의 수준 등을 판단하는 것이다.
본 발명의 키트는 진단 및 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
바람직하게는 본 발명의 키트는 효소면역측정법(ELISA)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 상기 ELISA 키트는 항원 단백질을 포함하며, 상기 ELISA 키트는 “항원-항체 복합체”를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소(예: 항체와 접합) 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 진단 키트는 기존의 COVID-19 진단 키트보다 신속하고 간편하며 높은 민감도 및 특이도를 가지고 있으며, 검체 시료와 본 발명에서 제공하는 재조합 항원 단백질간의 항원-항체의 간단한 면역반응 여부의 확인을 통해 편리하게 COVID-19 감염증을 높은 정확도로 진단할 수 있다.
또한, 본 발명은 검체로부터 수득한 혈청에 상기 본 발명의 COVID-19 진단용 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 처리한 후, 항원-항체 반응을 검출하는 단계를 포함하는, COVID-19 진단 방법 또는 COVID-19 진단을 위한 정보제공 방법을 제공할 수 있다.
구체적으로, 상기 검체로부터 수득한 혈청에 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 처리한 후, 항원-항체 면역반응이 검출되는 경우, 상기 검체는 COVID-19 감염증 검체로 진단할 수 있고, 반면, 항원-항체 면역반응이 검출되지 않는 경우, 상기 검체는 COVID-19 감염증에 걸리지 않은 검체로 진단할 수 있다.
본 발명에 따른 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 이용한 COVID-19 감염증 진단방법은, 바이러스 자체를 검출하는 대신 바이러스에 반응하여 인간을 포함하는 개체의 면역 체계가 생성한 항체를 검출하는 방법으로, COVID-19 감염증 의심이 되는 개체로부터 혈청을 수득한 후, 상기 혈청을 본 발명의 재조합 항원 단백질과 반응시켜 항원-항체 반응여부를 통해, COVID-19 감염증을 진단할 수 있다.
만일 항원-항체 반응이 검출되는 경우, 상기 개체의 혈청에는 SARS-CoV-2 바이러스의 감염에 의해 체내 면역 체계로부터 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항체가 존재하고 있음을 의미하는 것으로, 상기 개체는 SARS-CoV-2 바이러스에 감염된 COVID-19 감염증 개체라고 판단할 수 있다.
이러한 본 발명의 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 이용한 COVID-19 감염증 진단방법은, 개체로부터 핵산을 분리하고 SARS-CoV-2 바이러스 특이적인 핵산을 증폭 및 분석하는 복잡한 일련의 과정을 수반하지 않아도 되며, 고가의 분석장비가 필요하지 않는 장점이 있고, 특히, 개체로부터 수득한 혈청을 대상으로 항원-항체 반응 여부만을 확인함으로써 신속하고 간편하며 정확하게 COVID-19 감염증을 진단할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 당단백질(spike glycoprotein S1) 발현용 식물 발현벡터 제작
본원의 도 1에 나타낸 바와 같이, 식물체에서 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 스파이크 당단백질을 발현시킬 수 있도록, 식물체 발현용 재조합 벡터를 제작하였다. 구체적으로, SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 당단백질에 대한 유전자 정보를 확보하고, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에서의 발현에 최적화된 서열로 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛(subunit) 유전자(서열번호 2)를 합성하였다. 소포체로 표적화되는 재조합 스파이크 당단백질 식물 발현벡터는 pCAMBIA1300 벡터를 기본 벡터로 사용하였으며, CaMV35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 NB 시그널 펩타이드(signal peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 1), 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2), GS-링커 염기서열(서열번호 3), T4 피브리틴(fibritin)의 27개 아미노산인 foldon(Fd)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 4), 히스티딘 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 5) 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 6)을 순차적으로 연결하여 S1-Fd 재조합 스파이크 당단백질(spike glycoprotein) 발현용 식물 발현 벡터인 pTEX-NB:S1:L:Foldon:8H 벡터를 제조하였다. 또한, 본 발명의 pTEX-NB:S1:L:Foldon:8H 벡터에 삽입된 도 1의 핵산 구조물 즉, NB:S1:L:Foldon:8H:HDEL에 대한 염기서열은 서열번호 7에 나타내었다.
<실시예 2>
식물체로부터 재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질의 발현 및 정제
<2-1> 식물발현 벡터의 일과성 발현(Transient expression)
상기 <실시예 1>에서 준비한 식물 발현 벡터(재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질 발현용 벡터(pTEX-NB:S1:L:Foldon:8H))를 아그로박테리아 LBA4404 균주에 전기충격법(Electrophoration)을 이용하여 각각 형질전환시켰다. 형질전환된 아그로박테리아를 5 mL의 YEP 액체배지(효모 추출물 10 g, 펩톤 10 g, NaCl 5 g, 카나마이신 50 mg/L, 리팜피신 25 mg/L)에서 28℃의 조건으로 16시간 동안 진탕 배양한 후 1차 배양액 1 ml을 50 ml의 새 YEP 배지에 접종하여 28℃의 조건에서 6시간 동안 진탕 배양하였다. 배양된 아그로박테리아는 원심분리(7,000 rpm, 4℃, 5분)하여 수집한 후, 600 nm의 파장에서 흡광도(O.D) 값이 1.0이 되도록 인필트레이션(Infiltration) 버퍼[10 mM MES(pH 5.7), 10 mM MgCl2, 200 μM 아세토시린곤]에 현탁시켰다. 아그로박테리아 현탁액은 주사바늘을 제거한 주사기를 이용하여 니코티아나 벤타미아나 잎의 뒷면에 주입하는 방법으로 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)을 수행하였다.
<2-2> 형질전환 식물체에서 S1-Fd 재조합 단백질의 발현 확인
상기 실시예 <2-1>에서 형질전환된 식물체의 잎으로부터 본 발명의 COVID-19 진단용 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위해, 상기 식물 잎을 추출하여 원심분리한 후, 수용성 분획(Supernatant; S), 펠릿(Pellet; P) 분획 및 수용성 분획과 펠릿 분획을 모두 포함하는 분획(Total; T)에 대해 본 발명의 재조합 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블롯을 통해 수행하였다. 보다 자세하게는, 각 분획 30μL를 SDS 시료 버퍼와 혼합한 후에 가열하였다. 그리고 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동 하여 크기별로 분리된 단백질 밴드를 확인하고, 이를 PVDF 막으로 이동시킨 후에, 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 블록킹 단계를 거친 후에, 폴리히스티딘과 반응하는 항체를 결합시키고, ECL 용액을 제조사에서 제공하는 방법대로 처리하여 재조합 S1-Fd 단백질의 발현을 확인하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 소포체로 표적화되도록 NB(New Bip, chaperone binding protein 신호 펩타이드)를 융합한 S1-Fd 재조합 단백질이 식물체 내에서 높은 효율로 발현되고 있음을 확인할 수 있었고, 특히 발현된 S1-Fd 재조합 단백질의 95% 이상이 수용성 분획에서 확인되었으며, 약 5%의 S1-Fd 재조합 단백질이 펠릿 분획에서 관찰되었다(도 2 왼쪽 도면 참조).
<2-3> 형질전환 식물체로부터 본 발명의 S1-Fd 재조합 단백질의 분리 및 정제
상기 실시예에서 C-말단에 폴리히스티딘-태그(His-tag)가 융합된 pTEX-NB:S1:L:Foldon:8H 발현벡터로 형질전환된 니코티아나 벤타미아 잎 50g에 단백질 추출 용액[20mM Tris-HCl, pH 8.0, 1M NaCl, 50mM imidazole, 0.5% Triton X-100] 100mL을 첨가하고 블렌더로 조직을 파쇄한 후 13,000rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리하여 단백질 추출액을 수득하였다. 상기 단백질 추출액으로부터 본 발명의 S1-Fd 재조합 단백질의 분리정제를 위해 Ni-IDA(Iminodiacetic acid) 아가로스 레진(agarose resin)이 충진된 컬럼으로 친화성 크로마토그래피를 동시에 실시하였다. 상기 컬럼에 레진을 10mL 충진한 후 100mL의 세척용액[20mM Tris-HCl, pH 8.0, 1M NaCl, 50mM Imidazole]으로 평형화시켰다. 회수한 각각의 단백질 추출액을 Ni-IDA 컬럼에 적용하고 평형화시킨 다음, 세척용액 100mL을 흘려보내 레진을 세척하고 용출용액[20mM Tris-HCl, pH 8.0, 1M NaCl, 50mM 또는 100mM 또는 300mM Imidazole]으로 S1-Fd 재조합 단백질을 용출하였다. S1-Fd 재조합 단백질이 포함된 용출용액은 전기영동(SDS-PAGE) 후 코마지에 블루염색법(Coomassie staining)을 통해 분리 및 정제한 단백질을 확인하였다(도 2 오른쪽 도면 참조).
<비교예 1>
대장균으로부터 재조합 스파이크 당단백질(spike glycoprotein S1)의 발현 및 정제
본 발명자들은 상기 실시예 1 및 2와 같이 식물체로부터 COVID-19 진단용 재조합 단백질인 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 스파이크 당단백질을 정제하였는데, 진단 효과에 대한 비교를 위한 비교군으로 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 스파이크 당단백질을 다음과 같이 대장균으로부터 발현 및 분리하여 사용하였다.
구체적으로, 코로나바이러스 감염증-19를 진단하기 위하여 본 연구자는 SARS-CoV-2 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein; NP)의 유전자 서열을 히스티딘이 표지된 T7 프로모터를 포함하는 발현 벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제조한 다음, 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환하고 배양하여 상기 대장균으로부터 본 발명의 항원성 단백질인 뉴클레오캡시드 재조합 단백질을 분리 및 정제하였다.
보다 구체적으로, SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 재조합 단백질을 대장균으로부터 대량으로 생산할 수 있는 발현벡터를 위해, NB:S1:L:Foldon:8H:HDEL에 대한 염기서열인 서열번호 7의 DNA를 pET21a의 T7 프로모터 하류에 삽입하도록 클로닝하여 pET21a-NB:S1:L:Foldon:8H 벡터를 제작하였다. 이후 pET21a 벡터에는 lac l 유전자가 존재하기 때문에, IPTG(Isopropyl thio-beta-D-galscoside) 첨가하여 T7 프로모터로부터 스파이크 재조합 단백질(S1-Fd)의 발현을 유도하였다.
이후, 대장균에서 발현벡터의 도입에 의해 발현된 스파이크 재조합 단백질은 히스티딘 잔기가 C-말단에 융합된 상태로 발현되므로, 히스티딘 친화 수지를 이용하여 용이하게 정제하였다.
<실시예 3>
식물체로부터 분리한 본 발명의 재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질의 구조분석
본 발명자들은 상기 실시예를 통해 식물체로부터 분리 및 정제한 재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질(즉, S1-Fd 재조합 단백질)에 대한 구조분석을 수행하였다. 이때, 상기 구조분석은 RBD databank의 PDB 모델과 Modeller 10.1을 이용한 예측모델(predicted model)을 Pymol을 이용하여 구조 비교분석을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 방법으로 분리 및 정제한 코로나-19 바이러스 스파이크 당단백질의 전체 구조를 도 6에 나타내었는데, N-terminal은 NTD와 RBD로 구성되어 있으며, CTD와 긴 loop을 통해 연결되어 있음을 확인하였고, 스파이크 당단백질이 단량체(monomer)로 존재 시 RBD가 다운(down)되어 있다가 삼량체(trimer)를 형성하게 되면 1개의 RBD가 위로 돌출된 구조를 형성하는 것으로 확인되었다. 또한, 도 6에서 SS는 신호서열을, NTD는 N-터미날 도메인을, RBD는 리셉터 결합 도메인을, SD1은 subdomain 1을, SD2는 subdomain 2를, S1/S2는 프로테아제 절단 사이트를, S2', S2'는 프로테아제 절단 사이트를, FP은 퓨전 펩타이드를, HR1은 heptad repeat 1을, CH는 central helix를, CD는 연결 도메인을, HR2는 heptad repeat 2를, TM은 트렌스 멤브레인 도메인을, CT는 세포 내 꼬리를 각각 나타낸 것이다.
이러한 구조분석 결과를 통해, 본 발명자들은 본 발명의 방법에 따라 식물체로부터 분리 및 정제한 COVID-19 진단용 재조합 스파이크 단백질은 삼량체(trimer), 즉, 삼중 복합체 구조(trimeric complex structure)를 갖는 당화된 단백질임을 알 수 있었다. 상기 식물체로부터 분리한 본 발명의 COVID-19 진단용 재조합 스파이크 단백질이 삼량체 구조를 갖는다는 것은, 정제된 재조합 스파이크 단백질을 크기-배재 크로마토그래피(Size-exclusion chromatography)로 분석하여 용출된 단백질의 분자량을 분석한 결과, 삼량체 위치에서 피크가 나타남을 통해 확인할 수 있었다.
<실시예 4>
본 발명의 재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질을 이용한 COVID-19 진단 가능성 확인
나아가 본 발명자들은 상기 실시예 2와 같이 식물체로부터 정제한 재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질 및 상기 비교예 1과 같이 대장균으로부터 정제한 재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질에 대해, COVID-19 진단 효능을 비교 분석하였다.
이를 위해, COVID-19 검진에서 양성을 보인 55명 및 음성을 보인 40명으로부터 혈청을 채취하여 본 발명의 재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질에 대한 항원성 여부, 즉 COVID-19 진단 가능성 여부를 분석하였다.
본 연구는 조선대학교 병원(IRB 2020-02-011-003)의 승인을 받아 수행하였고, 모든 참가자로부터 서면 동의를 얻었으며, 모든 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행하였다. 여기서 SARS-CoV-2에 감염된 양성 환자의 정의는 다음과 같다.
양성 사례는 환자로부터 수득한 시료에서 바이러스를 분리하고 2개 유전자를 표적으로 하는 rRT-PCR을 포함하는 진단방법에 의해 COVID-19 감염증으로 확진된 환자로 정의하였다. 또한 음성 혈청은 COVID-19 대유행 이전에 수득한 시료들을 사용하였다. 이들은 하기 표에 언급된 두 가지 컷오프 값을 기준으로 실제 SARS-CoV-2 진단과의 적합성을 평가하여 총 Ab ELISA 분석에 대한 양성 및 음성을 확인하였다. 결과적으로 환자 샘플의 OD 값이 SARS-CoV-2 샘플로부터 계산된 컷오프 값보다 큰 경우, 총 Ab ELISA 결과는 참 양성으로 간주하였다.
또한, COVID-19 확진 환자를 모집하고 COVID-19 관련 증상의 존재 여부에 따라 추가 분류를 수행하였으며, 상기 환자들은 조선대학교 병원에 입원한 환자들이다. SARS-CoV-2에 대한 IgG 항체 반응은 식물 및 대장균 유래의 재조합 스파이크 단백질을 기반으로 하는 간접 ELISA로 분석하였고, 각 시점에서 450nm(OD450)에서 평균 OD를 측정하였다. 음성 대조군은 2015년~2017년까지 COVID-19 대유행 이전에 조선대학교 병원에서 정기 건강검진을 받은 건강한 개인으로부터 얻은 40명의 혈청 샘플을 사용하였다.
그 결과, 도 3 내지 도 5에 나타낸 바와 같이, SARS-CoV-2 바이러스의 검출 특이성 및 민감성 모두 식물체로부터 정제한 재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질을 이용할 경우, 대장균으로부터 정제한 재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질을 이용한 경우에 비해 월등히 우수한 것으로 나타났다.
구체적으로, 대장균으로부터 정제한 재조합 단백질로 진단하는 경우, SARS-CoV-2 바이러스의 검출에 대한 특이성은 85%이고 민감성은 63%인 것으로 나타난 반면(도 4 참조), 식물체로부터 정제한 재조합 단백질을 이용한 경우, 검출 특이성은 88%이고 민감성은 86%인 것으로 나타나(도 5 참조), 대장균 보다 식물체로부터 재조합 코로나-19 바이러스 스파이크 단백질(즉, S1-Fd 재조합 단백질)이 COVID-19를 더 우수한 정확도로 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60
tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120
ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180
ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240
tgtcctctgc a 251
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gttaacctta ccaccagaac tcagttaccc ccagcataca ctaattcttt cacacgtggt 60
gtttactacc ctgacaaagt tttcagaagc agcgttttac acagcactca ggatttattc 120
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ctccctcagg gtttttcggc gctggaacca ttggtagatt tgccgatagg aatcaatatc 660
actaggttcc agactttact tgctctgcat agaagttact tgacccctgg agatagctca 720
tcaggttgga cagctggtgc ggcagcttat tacgtggggt atcttcagcc taggacgttc 780
ctattaaaat ataatgaaaa tggaaccatt acagatgctg tagactgtgc acttgaccct 840
ctctcagaaa caaagtgtac gttgaaatcc ttcacggtag aaaaagggat ctaccaaacg 900
tctaacttca gagtccagcc aacagaatct attgtgagat ttcccaatat tacaaacttg 960
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tggaattcta ataatcttga ctctaaggtg gggggaaatt ataattacct gtatagactg 1320
tttaggaaga gcaatctcaa gcctttcgag agagacattt caactgagat ctaccaggcg 1380
ggaagcactc cgtgtaatgg tgttgagggt tttaattgtt actttccttt acagtcatac 1440
ggtttccaac ccacgaatgg ggttggttac caaccgtacc gagtagtagt actttctttc 1500
gagcttctac atgccccagc aactgtttgt ggacctaaga agtctactaa tttggttaaa 1560
aataagtgtg tcaattttaa tttcaatgga cttacgggca caggagttct tactgagtct 1620
aacaagaagt ttctgccttt ccagcagttc ggcagagata ttgctgacac tactgatgct 1680
gtgcgtgatc cacagacact tgaaattctt gacattacac catgttcttt tggtggcgtg 1740
agtgttataa ctcccggaac aaatacctcc aaccaggtgg ctgttctgta tcaggacgtg 1800
aactgtacag aagtccctgt tgcaattcat gcagatcagc ttactcctac ctggcgtgtt 1860
tattctacgg gttccaatgt ttttcaaaca cgtgcaggct gcttgatagg ggctgaacat 1920
gtcaacaact catatgaatg cgacataccc ataggtgcag gtatatgcgc tagttatcag 1980
actcagacca attctccg 1998
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of GS-linker
<400> 3
ggaggttcag gaggttcagg aggttcagga ggttca 36
<210> 4
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of Foldon (Fd)
<400> 4
ggctacattc ctgaggctcc aagagatggt caagcatatg tgaggaagga tggagaatgg 60
gttttgcttt ctactttttt g 81
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 8xHis DNA sequence
<400> 5
caccaccacc accaccacca ccac 24
<210> 6
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of HDEL
<400> 6
cacgatgagc tc 12
<210> 7
<211> 2480
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of NB:S1:L:Foldon:8H:HDEL construct
<400> 7
tctagaatta ttacatcaaa acaaaaaatg gctcgctcgt ttggagctaa cagtaccgtt 60
gtgttggcga tcatcttctt cggtgagtga ttttccgatc ttcttctccg atttagatct 120
cctctacatt gttgcttaat ctcagaacct tttttcgttg ttcctggatc tgaatgtgtt 180
tgtttgcaat ttcacgatct taaaaggtta gatctcgatt ggtattgacg attggaatct 240
ttacgatttc aggatgttta tttgcgttgt cctctgcagg atccgttaac cttaccacca 300
gaactcagtt acccccagca tacactaatt ctttcacacg tggtgtttac taccctgaca 360
aagttttcag aagcagcgtt ttacacagca ctcaggattt attcctacct ttcttttcca 420
acgtgacctg gttccatgct atacatgtat ctgggaccaa tggtaccaag aggtttgata 480
acccggtcct accatttaat gatggagtct attttgcctc cactgagaag tctaatataa 540
taagaggctg gatttttgga actactcttg attcgaagac ccagagtcta cttattgtta 600
ataacgctac aaatgttgtt atcaaagtat gtgaatttca attctgtaat gatccattct 660
tgggtgttta ctaccacaaa aacaacaaaa gttggatgga aagtgagttt cgggtttata 720
gcagtgcgaa taattgcact tttgagtacg tctcccaacc ttttcttatg gaccttgaag 780
gaaagcaggg aaatttcaag aatcttcgcg aatttgtgtt taagaatatc gatggttatt 840
tcaagatata ttctaagcac acgcctatta atttagtgcg agatctccct cagggttttt 900
cggcgctgga accattggta gatttgccga taggaatcaa tatcactagg ttccagactt 960
tacttgctct gcatagaagt tacttgaccc ctggagatag ctcatcaggt tggacagctg 1020
gtgcggcagc ttattacgtg gggtatcttc agcctaggac gttcctatta aaatataatg 1080
aaaatggaac cattacagat gctgtagact gtgcacttga ccctctctca gaaacaaagt 1140
gtacgttgaa atccttcacg gtagaaaaag ggatctacca aacgtctaac ttcagagtcc 1200
agccaacaga atctattgtg agatttccca atattacaaa cttgtgccct ttcggagaag 1260
tttttaacgc caccaggttt gcatcggttt atgcttggaa caggaaaaga atcagcaact 1320
gtgttgctga ttatagtgtc ctatataact ccgcatcctt ttccactttc aagtgttacg 1380
gagtttctcc tactaaatta aatgatctct gctttactaa tgtctatgca gattcatttg 1440
taatcagagg tgatgaggtc agacaaatcg ctccagggca gactggaaag attgctgatt 1500
ataattataa gcttcctgat gattttacag gctgcgttat agcatggaat tctaataatc 1560
ttgactctaa ggtgggggga aattataatt acctgtatag actgtttagg aagagcaatc 1620
tcaagccttt cgagagagac atttcaactg agatctacca ggcgggaagc actccgtgta 1680
atggtgttga gggttttaat tgttactttc ctttacagtc atacggtttc caacccacga 1740
atggggttgg ttaccaaccg taccgagtag tagtactttc tttcgagctt ctacatgccc 1800
cagcaactgt ttgtggacct aagaagtcta ctaatttggt taaaaataag tgtgtcaatt 1860
ttaatttcaa tggacttacg ggcacaggag ttcttactga gtctaacaag aagtttctgc 1920
ctttccagca gttcggcaga gatattgctg acactactga tgctgtgcgt gatccacaga 1980
cacttgaaat tcttgacatt acaccatgtt cttttggtgg cgtgagtgtt ataactcccg 2040
gaacaaatac ctccaaccag gtggctgttc tgtatcagga cgtgaactgt acagaagtcc 2100
ctgttgcaat tcatgcagat cagcttactc ctacctggcg tgtttattct acgggttcca 2160
atgtttttca aacacgtgca ggctgcttga taggggctga acatgtcaac aactcatatg 2220
aatgcgacat acccataggt gcaggtatat gcgctagtta tcagactcag accaattctc 2280
cgggaggttc aggaggttca ggaggttcag gaggttcaac tagtggaacc cggggttctg 2340
gatcaggcta cattcctgag gctccaagag atggtcaagc atatgtgagg aaggatggag 2400
aatgggtttt gctttctact tttttgggat ctggttcaca ccaccatcac caccatcacc 2460
atgatgagct ctagctcgag 2480
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of NB
<400> 8
Met Ala Arg Ser Phe Gly Ala Asn Ser Thr Val Val Leu Ala Ile Ile
1 5 10 15
Phe Phe Gly Glu
20
<210> 9
<211> 666
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of Spike glycoprotein S1 subunit
<400> 9
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
100 105 110
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
145 150 155 160
Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
210 215 220
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
290 295 300
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
305 310 315 320
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
325 330 335
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
340 345 350
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
355 360 365
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
370 375 380
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
385 390 395 400
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
405 410 415
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
420 425 430
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
435 440 445
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
450 455 460
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
485 490 495
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
500 505 510
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe
515 520 525
Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe
530 535 540
Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala
545 550 555 560
Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser
565 570 575
Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln
580 585 590
Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala
595 600 605
Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly
610 615 620
Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His
625 630 635 640
Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys
645 650 655
Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro
660 665
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of GS-linker
<400> 10
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 11
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of Foldon (Fd)
<400> 11
Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys
1 5 10 15
Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
20 25
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 8x His
<400> 12
His His His His His His His His
1 5
<210> 13
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of HDEL
<400> 13
His Asp Glu Leu
1
Claims (12)
- 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질; 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 단백질; 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 GS-링커 펩타이드; 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon) 폴리펩타이드; 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 8개의 히스티딘 폴리펩타이드; 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드가 융합된 재조합 단백질을 포함하는, COVID-19 진단용 항원 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 식물체에서 발현 및 정제된 것을 특징으로 하는, COVID-19 진단용 항원 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 발현은 식물세포의 소포체로 표적화되어 발현되는 것을 특징으로 하는, COVID-19 진단용 항원 조성물. - 삭제
- 제3항에 있어서,
상기 발현은,
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 유전자; 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 유전자; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 GS-링커 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin) 유전자; 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 8개 히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 HDEL 펩타이드 코딩 유전자가 순차적으로 연결되어 포함된 재조합 발현벡터로 식물체를 형질전환시켜 상기 식물체 내에서 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는, COVID-19 진단용 항원 조성물. - 제3항에 있어서,
식물체에서 발현 및 정제된 재조합 단백질은 삼중 복합체 구조(trimeric complex structure)를 갖는 것을 특징으로 하는, COVID-19 진단용 항원 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 식물체는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, COVID-19 진단용 항원 조성물. - 삭제
- 제1항의 조성물을 포함하는, COVID-19 진단키트.
- 검체로부터 수득한 혈청에 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질; 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 단백질; 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 GS-링커 펩타이드; 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon) 폴리펩타이드; 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 8개의 히스티딘 폴리펩타이드; 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드가 융합된 재조합 단백질을 처리한 후, 항원-항체 반응을 검출하는 단계를 포함하는,
COVID-19 진단을 위한 정보제공방법. - 제11항에 있어서,
상기 항원-항체 반응은 면역블롯법, 효소면역법, 면역침강법, 형광면역법, 효소기질발색법 및 항원-항체 응집법으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는, COVID-19 진단을 위한 정보제공방법.
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| EP4007597A2 (en) * | 2019-08-01 | 2022-06-08 | ACM Biolabs Pte Ltd | A method of eliciting an immune response by administering a population of polymersomes having an associated antigen together with a population of polymersomes having an associated adjuvant as well as compositions comprising the two populations of polymersomes |
| US10906944B2 (en) * | 2020-06-29 | 2021-02-02 | The Scripps Research Institute | Stabilized coronavirus spike (S) protein immunogens and related vaccines |
-
2021
- 2021-04-02 KR KR1020210043091A patent/KR102657261B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Alexandra C. Walls et al., ‘Structure, function and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein’, Cell, Vol. 181, No. 2, pp. 281-292, 2020.02.20.* |
| 국제공개공보 WO2021/019102(2021.02.04.) 1부.* |
| 미국 특허출원공개공보 US2020/0407402호(2020.12.31.) 1부.* |
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| Publication number | Publication date |
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| KR20210124066A (ko) | 2021-10-14 |
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