KR102636452B1 - 식물체에서 covid-19 백신용 단백질을 발현하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 백신 조성물의 제조방법 - Google Patents
식물체에서 covid-19 백신용 단백질을 발현하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 백신 조성물의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식물체에서 COVID-19 백신용 단백질을 발현하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 백신 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질, 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 단백질, T4 피브리틴의 Fd(foldon) 폴리펩티드 및 HDEL 펩타이드가 융합된 S1-Fd 재조합 항원 단백질; 및 NB 단백질, 스파이크 당단백질의 RBD 도메인, 인간 면역글로불린 Fc 단편 및 HDEL 펩타이드가 융합된 RBD-Fc 재조합 항원 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 식물세포에서 상기 재조합 항원 단백질의 발현을 위한 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체로부터 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질의 생산 방법 및 COVID-19 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 식물체에서 COVID-19 백신용 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터, 이를 이용한 백신 조성물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 백신 조성물에 관한 것이다.
2019년 중국 우한에서 발생한 신종 코로나바이러스(2019-nCoV)는 2019년 후반기에 처음으로 인체 감염이 확인되었다는 의미에서 COVID-19로 명명되었으며, 사람이나 동물에게 호흡기 질환을 일으키는 바이러스로 감염되면 2~3일에서 최장 2주 정도 잠복기를 거쳤다가 다양한 증상이 나타나는 것으로 알려져 있다. 주 증상으로는 무기력감, 37.5도 이상의 고열, 기침, 인후통, 가래, 근육통, 두통, 호흡곤란 및 폐렴 등의 증상이 발생하며, 폐 손상에 의한 호흡부전 등이 있으며, 심하면 사망에 이를 수 있다.
2020년 2월 28일 현재 전 세계 67개국 누적 확진자는 8만3,276명, 누적 사망자는 2,858명이다. 이 가운데 중국에선 누적 확진자와 사망자가 각각 7만8,961명, 2,791명이 나왔으며, 전체 확진자의 95%, 사망자의 98%는 중국이며, 한국 확진자 2,337명, 사망자 13명, 이탈리아 확진자 653명, 사망자 17명, 이란 확진자 270명, 사망자 26명의 순이다. 유사 질환으로는 메르스와 사스가 있으며, 메르스나 사스보다 치사율은 낮지만, 전염력이 훨씬 높은 것으로 알려져 있다. 현재, 백신이나 치료제가 개발되지 않은 상황에서 전 세계적으로 감염이 폭발적으로 증가하는 추세여서, 세계적으로 심각한 보건 문제로 대두되고 있다.
한편, 상기와 같은 COVID-19 예방을 위한 효율적인 백신 제조와 백신용 항원 단백질의 생산을 위한 의료산업계의 요구는 단기간에 유용 생리활성 물질의 대량생산 시스템의 개발이다. 식물체를 이용한 유용 생리활성 물질의 생산은, 동물세포나 미생물에서 합성하여 단백질을 생산하는 방법에서 발생할 수 있는 여러 가지 오염원을 원천 배제할 수 있으며, 해당 유용물질의 수요가 급증할 때 대량생산에 필요한 설비 기술이나 비용 면에서 기존의 동물세포 시스템과 비교하면 절대적으로 유리하기 때문에, 최단기간에 저비용으로 대량생산이 가능하다는 장점으로 인해 최근 백신 개발 및 치료제 개발 등 의료산업 분야에 널리 사용되고 있다.
현재, 식물을 이용한 생산시스템은 외래 단백질을 합성하기 위하여 상업적으로 이용되고 있으며, 식물세포의 번역 후 변형은 동물세포에서 이루어지는 것과 매우 유사하여 정확하게 복합 단백질(Multimeric protein)을 생성할 수 있다. 식물 시스템을 이용하여 생산한 당단백질의 경우, 당화(Glycosylation)되는 아미노산 잔기는 원래의 단백질에서와 동일하게 일어난다.
따라서, 식물 발현 시스템을 이용하여 유용 생리활성 물질인 단백질을 생산하는 방법이 동물세포나 미생물을 이용하여 생산하는 방법을 대체할 수 있는 잠재적인 가능성이 있어 최근에 큰 주목을 받고 있다. 현재 식물 발현 시스템을 이용하여 개발이 시도되는 백신은 병원성인 경우, 세균이나 바이러스의 점막 감염에 필수적인 부착(Adhesion)기능을 수행하는 단백질과 세균의 독성을 나타내는 독소 단백질, 바이러스의 구조를 이루는 구조 단백질들이 항원으로 주로 이용되고 있으며, 비병원성 질병의 경우에는 질병을 일으키는 물질이나 원인 물질을 생산하는 주된 효소가 항원으로 이용되고 있다. 지금까지의 연구 결과로 식물체에서 유래된 재조합 항원 단백질은 동물 유래 백신과 동일한 기능을 갖는 구조로 되어 있음이 보고되고 있어, 이를 응용한 다양한 연구가 요구되고 있다.
본 발명자들은 당화된 항원 단백질을 생산하기 위해 식물 발현 시스템에 맞게 항원 유전자를 코돈 최적화(codon optimization)하였고, 소포체(ER)로 타겟팅 되도록 NB(New BiP) 신호 펩타이드(signal peptide)가 포함된 벡터에 스파이크 당단백질(spike glycoprotein; S)의 S1 서브유닛(subunit) 또는 RBD(receptor binding domain)의 유전자를 삽입하였다. 또한 추가로 S1 서브유닛 유전자의 C-말단에는 Fd(foldon)를 부착시켜 당화된 스파이크 당단백질이 삼량체화(trimerization) 및 안정적인 단백질로 발현되고 이를 생산할 수 있기 위한 재조합 발현 벡터를 제조하였고, 또한 RBD C-말단에 hFc(human Fc)를 부착시켜 이를 발현 및 생산할 수 있는 재조합 발현벡터를 제조하였다.
본 발명에서는 파지(phage) T4 피브리틴(fibritin)의 27개 아미노산, 즉 Fd(foldon)을 단백질 C-말단에 부착하여 재조합 융합 단백질의 삼량체화(trimerization) 형성을 유도할 수 있고 또한 더 안정적인 단백질 형성을 유도할 수 있다. 한편, RBD 단백질 단독 또는 S 단백질 단독만으로는 백신 효능으로 항원성이 충분치 않으므로 본 발명에서는 더 우수한 COVID-19 백신용 항원 단백질을 생산하기 위해 S1-Fd 재조합 항원 단백질 또는 RBD-Fc 재조합 항원 단백질을 식물체 내에서 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 확립하였고, 제조된 재조합 항원 단백질이 우수한 항체 형성과 세포 면역 형성 능력이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 subunit 단백질; 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 foldon(Fd); 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드;가 융합된, COVID-19 백신용 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질; 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질의 RBD 도메인; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 인간 면역글로불린 Fc 단편; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드;가 융합된, COVID-19 백신용 RBD-Fc 재조합 항원 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 식물세포에서 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질의 발현을 위한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 식물체로부터 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법으로 생산된 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질을 포함하는, COVID-19 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 단백질; 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon) 폴리펩타이드; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드;가 융합된, COVID-19 백신용 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질; 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질의 RBD 도메인; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 인간 면역글로불린 Fc 단편; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드;가 융합된, COVID-19 백신용 RBD-Fc 재조합 항원 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 NB 유전자; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛을 코딩하는 S1 유전자; 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon)을 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드를 코딩하는 유전자;가 순차적으로 연결되어 포함된, 식물세포에서 COVID-19 백신용 S1-Fd 재조합 항원 단백질의 발현을 위한 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NB 유전자는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 것이고; 상기 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛 유전자는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것이고; 상기 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon)을 코딩하는 유전자는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 것이고; 상기 HDEL 펩타이드를 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 S1-Fd 재조합 항원 단백질은 식물세포의 소포체로 표적화되어 발현되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 NB 유전자; 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질의 RBD 도메인을 코딩하는 RBD 유전자; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 인간 면역글로불린 Fc 단편을 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드를 코딩하는 유전자;가 순차적으로 연결되어 포함된, 식물세포에서 COVID-19 백신용 RBD-Fc 재조합 항원 단백질의 발현을 위한 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NB 유전자는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 것이고; 상기 스파이크 당단백질의 RBD 도메인 유전자는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 것이고; 상기 인간 면역글로불린 Fc 단편을 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것이며; 상기 HDEL 펩타이드를 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RBD-Fc 재조합 항원 단백질은 식물세포의 소포체로 표적화되어 발현되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형질전환체는 형질전환 식물체로서, 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은, 본 발명의 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체 또는 이의 배양액으로부터 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 식물체로부터 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질의 생산방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 방법으로 생산된 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질을 포함하는, COVID-19 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 백신 조성물에는 아주번트를 추가로 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 항원 단백질은 세포성 면역반응 유도활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포성 면역반응 유도활성은 INF-γ 또는 TNF-a를 분비하는 CD4+ T세포 또는 CD8+ T세포의 활성 및 증식을 촉진시키는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 COVID-19 백신용 S1-Fd 재조합 항원 단백질은 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛에 T4 피브리틴(fibritin)의 foldon(Fd)을 융합한 형태의 항원 단백질로써 분리 정제된 S1-Fd 재조합 융합 단백질은 삼량체 단백질로서 단량체보다 더 안정적이며, 더 효율적으로 중화항체를 유도할 수 있어 소량의 백신 조성물로도 효과적으로 COVID-19를 예방할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 COVID-19 백신용 RBD-Fc 재조합 항원 단백질은 스파이크 당단백질의 RBD 도메인과 인간의 human Fc 단편이 융합된 형태의 항원 단백질로서, 분리 정제된 RBD-Fc 재조합 융합 단백질은 이량체 단백질(dimeric protein)로 Fc에 의한 자체-면역 증강 효과를 가지기 때문에 추가의 면역 항원 보강제의 사용 없이도 더 효율적으로 면역반응을 유도할 수 있어 소량의 백신 조성물로도 효과적으로 COVID-19를 예방 또는 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 항원 단백질의 용해성 및 안정성을 증가시켜 항원 단백질의 분리 및 보관이 용이하다.
또한, 본 발명의 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질은 식물체로부터 생산된 것으로, 동물세포 사용에 따른 고가의 비용을 절감할 수 있고, 동물세포에서의 번역 후 변형 형태와 동일한 고유 단백질의 형태로 수득할 수 있어 우수한 백신 효과를 유도할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 식물체에서 COVID-19 백신용 S1-Fd 재조합 항원 단백질 발현을 위한 발현카세트(expression cassette)를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 식물체에서 COVID-19 백신용 RBD-Fc 재조합 항원 단백질 발현을 위한 발현카세트(expression cassette)를 나타낸 것이다.
여기서 도 1 및 2에 기재된 약자는 다음을 나타낸다:
NB: new chaperone binding protein 신호 펩타이드;
S1: 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛(subunit);
foldon: T4 fibritin의 27개 아미노산(Fd);
hFc, 면역글로불린 human Fc 단편;
L: GS-linker
8H: 재조합 항원 단백질의 정제를 위한 8개의 히스티딘 태그
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 당화된 스파이크 당단백질의 전체 구조 및 RBD 도메인의 위치를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 재조합 발현벡터를 이용하여 식물체로부터 S1-Fd 및 RBD-Fc 재조합 항원 단백질을 발현 및 분리한 것을 SDS-PAGE 전기영동 후, 웨스턴 블럿 및 코마지에 블루염색을 통해 확인한 것으로, (A)에서 S는 수용성 분획(supernatant), P는 펠렛 분획(pellet), T는 수용성과 펠렛분획을 모두 포함하는 분획을 기재한 것이며, 각 분획에 대한 웨스턴 블럿 결과를 나타낸 것이고, (B)는 분리 및 정제된 각 재조합 항원 단백질을 코마시 블루(Coomassie blue) 염색으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 다른 농도의 GLA-SE아주번트(Adjuvant)(1μg, 3 μg, 5 μg)와 함께 섞어 2번 면역시킨 마우스의 비장세포를 이용하여 2 μg 또는 10 μg의 S1-Fd 재조합 항원 단백질로 자극시킨 후, IFN-γ를 생산하는 CD4+ T 세포를 유세포 분석기로 측정한 결과로서, (A)는 유세포 분석기에 의해 얻은 측정 결과이고, (B)는 각 실험군의 항원 자극에 따른 CD4+IFN-γ+ T 세포수를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 다른 농도의 GLA-SE 아주번트(1μg, 3 μg, 5 μg)와 함께 섞어 2번 면역시킨 마우스의 비장세포를 이용하여 2 μg 또는 10 μg의 항원 단백질로 자극시킨 후, IFN-γ 생산하는 CD8+ T 세포를 유세포 분석기로 측정한 결과로서, (A)는 유세포 분석기에 의해 얻은 측정 결과이고, (B)는 각 실험군의 항원 자극에 따른 CD8+IFN-γ+ T 세포수를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 다른 농도의 GLA-SE 아주번트(1μg, 3 μg, 5 μg)와 함께 섞어 2번 면역시킨 마우스의 비장세포를 이용하여 2 μg 또는 10 μg의 항원 단백질로 자극시킨 후, TNF-α 생산하는 CD4+ T 세포를 유세포 분석기로 측정한 결과로서, (A)는 유세포 분석기에 의해 얻은 측정 결과이고, (B)는 각 실험군의 항원 자극에 따른 CD4+TNF-α+ T 세포수를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 다른 농도의 GLA-SE 아주번트(1μg, 3 μg, 5 μg)와 함께 섞어 2번 면역시킨 마우스의 비장세포를 이용하여 2 μg 또는 10 μg의 항원 단백질로 자극시킨 후, TNF-α 생산하는 CD8+ T 세포를 유세포 분석기로 측정한 결과로서, (A)는 유세포 분석기에 의해 얻은 측정 결과이고, (B)는 각 실험군의 항원 자극에 따른 CD8+TNF-α+ T 세포수를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 식물체에서 COVID-19 백신용 RBD-Fc 재조합 항원 단백질 발현을 위한 발현카세트(expression cassette)를 나타낸 것이다.
여기서 도 1 및 2에 기재된 약자는 다음을 나타낸다:
NB: new chaperone binding protein 신호 펩타이드;
S1: 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛(subunit);
foldon: T4 fibritin의 27개 아미노산(Fd);
hFc, 면역글로불린 human Fc 단편;
L: GS-linker
8H: 재조합 항원 단백질의 정제를 위한 8개의 히스티딘 태그
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 당화된 스파이크 당단백질의 전체 구조 및 RBD 도메인의 위치를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 재조합 발현벡터를 이용하여 식물체로부터 S1-Fd 및 RBD-Fc 재조합 항원 단백질을 발현 및 분리한 것을 SDS-PAGE 전기영동 후, 웨스턴 블럿 및 코마지에 블루염색을 통해 확인한 것으로, (A)에서 S는 수용성 분획(supernatant), P는 펠렛 분획(pellet), T는 수용성과 펠렛분획을 모두 포함하는 분획을 기재한 것이며, 각 분획에 대한 웨스턴 블럿 결과를 나타낸 것이고, (B)는 분리 및 정제된 각 재조합 항원 단백질을 코마시 블루(Coomassie blue) 염색으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 다른 농도의 GLA-SE아주번트(Adjuvant)(1μg, 3 μg, 5 μg)와 함께 섞어 2번 면역시킨 마우스의 비장세포를 이용하여 2 μg 또는 10 μg의 S1-Fd 재조합 항원 단백질로 자극시킨 후, IFN-γ를 생산하는 CD4+ T 세포를 유세포 분석기로 측정한 결과로서, (A)는 유세포 분석기에 의해 얻은 측정 결과이고, (B)는 각 실험군의 항원 자극에 따른 CD4+IFN-γ+ T 세포수를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 다른 농도의 GLA-SE 아주번트(1μg, 3 μg, 5 μg)와 함께 섞어 2번 면역시킨 마우스의 비장세포를 이용하여 2 μg 또는 10 μg의 항원 단백질로 자극시킨 후, IFN-γ 생산하는 CD8+ T 세포를 유세포 분석기로 측정한 결과로서, (A)는 유세포 분석기에 의해 얻은 측정 결과이고, (B)는 각 실험군의 항원 자극에 따른 CD8+IFN-γ+ T 세포수를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 다른 농도의 GLA-SE 아주번트(1μg, 3 μg, 5 μg)와 함께 섞어 2번 면역시킨 마우스의 비장세포를 이용하여 2 μg 또는 10 μg의 항원 단백질로 자극시킨 후, TNF-α 생산하는 CD4+ T 세포를 유세포 분석기로 측정한 결과로서, (A)는 유세포 분석기에 의해 얻은 측정 결과이고, (B)는 각 실험군의 항원 자극에 따른 CD4+TNF-α+ T 세포수를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 다른 농도의 GLA-SE 아주번트(1μg, 3 μg, 5 μg)와 함께 섞어 2번 면역시킨 마우스의 비장세포를 이용하여 2 μg 또는 10 μg의 항원 단백질로 자극시킨 후, TNF-α 생산하는 CD8+ T 세포를 유세포 분석기로 측정한 결과로서, (A)는 유세포 분석기에 의해 얻은 측정 결과이고, (B)는 각 실험군의 항원 자극에 따른 CD8+TNF-α+ T 세포수를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명은 COVID-19의 예방 또는 치료를 위한 효과적인 백신 제조에 사용될 수 있는, COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질을 제공함에 특징이 있다. 구체적으로 본 발명은 COVID-19의 효과적인 예방, 개선 또는 치료를 위한 백신 제조에 사용할 수 있는 재조합 항원 단백질로서 S1-Fd 재조합 항원 단백질 및 RBD-Fc 재조합 항원 단백질을 제공한다.
구체적으로 본 발명에 따른 COVID-19 백신용 S1-Fd 재조합 항원 단백질은, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛(subunit)과 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 Fd(foldon)가 융합된 재조합 항원 단백질일 수 있고, 바람직하게는, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 단백질; 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon) 폴리펩타이드; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드가 융합된 재조합 항원 단백질일 수 있다.
또한 본 발명에 따른 COVID-19 백신용 RBD-Fc 재조합 항원 단백질은, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질의 RBD 도메인과 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 인간 면역글로불린 Fc 단편이 융합된 재조합 항원 단백질일 수 있고, 바람직하게는, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질; 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질의 RBD 도메인; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 인간 면역글로불린 Fc 단편; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드가 융합된 재조합 항원 단백질일 수 있다.
한편, COVID-19(coronavirus disease 2019)는 신종 코로나 바이러스인 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, 일명: 2019-nCoV) 바이러스의 감염에 의해 유발된 신종 감염 질환으로, SARS-CoV-2 바이러스는 RNA 바이러스로서 사스와 메르스의 변종을 나타내며, 사스와 약 77.5%의 서열 동일성을, 메르스와 약 50% 공유한다. 하지만, 사스와 메르스와는 대조적으로, SARS-CoV-2의 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)은 1개의 RBD 도메인이 위로 돌출된 형태의 구조를 형성하며, 이로 인해 타겟 리셉터(receptor)인 ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2)과 100~1,000배 더 강력한 결합력을 나타낸다. 이러한 강력한 결합력은 세포 내로 침투를 더욱더 용이하게 하여 전염력을 높이는 원인으로 작용한다. 그러나, 치사율은 2.3%로 사스나 메르스 보다 낮게 나타난다. 사례 치사율을 살펴보면 80세 이상에서는 14.8%, 70-79세에서는 8%, 그리고 중환자의 경우 치사율이 49%로 높게 나타난다. 이러한 결과는 당뇨, 심혈관질환, 고혈압 등 기저질환을 앓고 있는 경우 상대적으로 치사율이 증가된다.
또한, SARS-CoV-2 바이러스는 30kb의 염기서열을 가지며 4개의 중요한 구조 단백질인 Nucleocapsid(N), Spike(S), M 및 E 단백질을 가지고 있다. 이중 숙주세포 감염 시 SARS-CoV 스파이크(S; spike) 단백질은 바이러스 표면에 삼량체(trimer)로 발현된 envelope glycoprotein이다. S 단백질은 단백질 바이러스 감염 중에 S1과 S2의 서브유닛으로 숙주세포 단백질 분해효소(proteases)에 의해 분리되며, S1은 RBD를 통해 숙주세포의 수용체인 ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2)와 결합하는데 돕는 역할을 한다. 따라서 S 단백질의 RBD 도메인은 중요한 백신 표적이 된다.
최근에는 신종코로나 바이러스와 같은 MERS-CoV와 같은 코로나바이러스의 스파이크(S) 단백질에 대한 삼량체(trimer)의 구조가 보고된 바 있고, 또한 중화능이 뛰어난 항체들은 단량체(monomer)가 아닌 삼량체(trimer) 형태의 항원 단백들에 부착된다는 연구보고들이 발표되고 있다.
따라서 COVID-19의 효과적인 치료를 위해서는 중화항체에 대한 연구가 활발하게 진행되어야 하며 이를 위해서는 중화능이 뛰어난 항체 발현 B세포 유도를 위한 삼량체 형태의 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질이 요구된다.
이에 본 발명자들은 COVID-19에 대한 새로운 백신 제조에 적합한 항원으로, SARS-CoV-2의 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛(subunit) 또는 RBD(receptor binding domain)를 타겟팅하였다.
본 발명에서 사용한 상기 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질을 코딩하는 S1 서브유닛 유전자는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 본 발명에서 사용한 스파이크 당단백질의 RBD 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 RBD 도메인을 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명자들은 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛을 T4 피브리틴(fibritin)의 foldon(Fd)과 융합시켰고, Fd와의 융합에 의해 상기 S1-Fd 재조합 단백질이 삼량체 형태의 단백질(trimeric protein)로 정제할 수 있으며, 이는 단량체보다 더 안정적이며, 중화능이 뛰어난 항체들이 자연적으로 형성되는 삼량체 구조의 항원 단백질에 더 용이하게 부착할 수 있고 백신용 단백질로서 면역 시 중화능이 뛰어난 항체 발현 B세포를 유도할 수 있도록 하였다.
또한, 본 발명자들은 상기 스파이크 당단백질의 RBD 도메인을 인간 면역글로불린 Fc 단편과 융합시켰고, Fc 단편과의 융합에 의해 상기 RBD-Fc 재조합 단백질의 발현 증가와 용해성 및 안정성을 증가시킬 수 있었다.
본 발명에서 상기 Fc 단편(Fc fragment)은, 면역글로불린이 파파인(papain)에 의해 소화되었을 때, 중쇄(heavy chain; H chain) 부분만이 S-S 결합으로 연결되고, 항원 결합부위를 가지지 않는 부분을 Fc 단편이라고 하며, 본 발명의 Fc 단편은 바람직하게는 인간의 Fc 단편이며, 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산으로 이루어진 인간의 Fc 단편을 사용할 수 있고, 상기 서열번호 4의 아미노산으로 이루어진 인간의 Fc 단편을 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 인간 Fc 유전자일 수 있다. 그러나 본 발명에서 사용 가능한 Fc 단편은 목적 항원과 융합되었을 때, 목적 항원의 발현양 및 용해성을 증가시키는 Fc 단편이라면 이에 제한되지 않는다.
뿐만 아니라, 본 발명자들은 본 발명의 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질의 제조를 위해, NB(New Bip; new chaperone binding protein) 펩타이드 및 HDEL 펩타이드를 사용하였다.
본 발명에 따른 상기 NB 펩타이드는, 신규 BiP (NB: new chaperone binding protein) 유전자 단편으로, 기존에 재조합 단백질의 제조 시, 발현된 재조합 단백질을 소포체로 이동시키기 위해 사용되었던 BiP 서열 중 일부로서, 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, NB 펩타이드를 코딩하는 염기서열은 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 HDEL (His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드는 재조합 단백질이 소포체 내에서 안정적으로 유지될 수 있도록 단백질 분해를 최소화하기 위한 것으로, 상기 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리펩티드 서열은 서열번호 6의 염기서열로 표시하였고, HDEL 펩타이드를 코딩하는 염기서열은 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
그러므로 본 발명은 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질로서, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 단백질; 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon) 폴리펩타이드; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드가 융합된 COVID-19 백신용 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질로서, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질; 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질의 RBD 도메인; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 인간 면역글로불린 Fc 단편; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드가 융합된 COVID-19 백신용 RBD-Fc 재조합 항원 단백질을 제공할 수 있다.
나아가 본 발명은 식물세포에서 COVID-19 백신용 S1-Fd 재조합 항원 단백질의 발현을 위한 재조합 발현벡터를 제공할 수 있는데, 상기 발현벡터는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 NB 유전자; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛을 코딩하는 S1 유전자; 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon)을 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드를 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결되어 포함되어 있다.
나아가 본 발명은 식물세포에서 COVID-19 백신용 RBD-Fc 재조합 항원 단백질의 발현을 위한 재조합 발현벡터를 제공할 수 있는데, 상기 발현벡터는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 NB 유전자; 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질의 RBD 도메인을 코딩하는 RBD 유전자; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 인간 면역글로불린 Fc 단편을 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드를 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결되어 포함되어 있다.
본 발명에서 상기 ‘재조합 벡터(recombinant vector)’란, 벡터 내에 삽입된 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 본 발명에 따른 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 "벡터"는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있으며, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 자체의 조절로 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있다.
또한, 재조합 단백질의 생산량을 증가시키기 위한 태그용 유전자, 재조합 단백질의 구조적 안정성을 유지하기 위한 태그용 유전자, 재조합 단백질을 용이하게 분리하기 위한 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있으며, 용이한 분리를 위한 태그로는 이에 제한되지는 않으나, Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있으며, 상기 선별용 마커 유전자에는 대표적으로 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 포함될 수 있으며, 상기 프로모터에는 대표적으로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV (Cytomegalovirus) 프로모터, SV40 (Simian virus 40) 프로모터, RSV (Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α (Elongation factor-1 alpha) 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 상기 터미네이터는 대표적으로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 튜머패시언스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이나, 상기 추가되는 유전자의 종류는 기존에 재조합 단백질의 제조에 사용되고 있는 종류라면 제한이 없다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공할 수 있다.
상기 형질전환체는 식물체일 수 있다.
상기 "식물체"는, 본 발명의 재조합 단백질을 대량 생산할 수 있는 식물이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
구체적으로는 상기 열거한 식물체 군에서 바람직하게는 담배일 수 있다. 본 발명에서의 담배는 담배 속(Nicotiana genus) 식물로서 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 특별히 종류의 제한을 받지 않으며, 형질전환 방법과 단백질 대량생산의 목적에 맞게 적절한 품종을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다. 예를 들어 니코티아나 벤타미아나 L.(Nicotiana benthamiana L.) 또는 니코티아나 타바쿰 cv. 잔티(Nicotiana tabacum cv. Xanthi) 등의 품종을 이용할 수 있다.
상기 “형질전환(transformation)”이란 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, “형질전환체(transgenic organism)”란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 생명체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 생명체이며, 상기 생명체는 미생물, 진핵세포, 곤충, 동물, 식물 등 생명이 있는 생물이라면 제한이 없으며, 바람직하게는 대장균, 살모넬라, 바실러스, 효모, 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등이나 이에 제한되지 않는다. 상기 형질전환체는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation), PEG (Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.
본 발명의 일 실시한 예에서는 상기 본 발명에 따른 재조합 벡터를 아그로박테리아 균주에 전기 충격법을 이용하여 형질전환하였고, 형질전환된 아그로박테리아를 니코티니아 벤타미아나 잎의 뒷면에 주입하여 형질전환된 식물체를 제조하였다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 식물체로부터 본 발명에 따른 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질을 생산하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 바람직하게, 본 발명의 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체 또는 이의 배양액으로부터 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함한다.
특히 본 발명자들은 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질을 식물세포로부터 분리하여 사용하였는데, 식물세포는 단백질로의 번역(translation) 후 변형(modification)이 동물세포에서 이루어지는 것과 매우 유사하며 거의 정확하게 복합 단백질을 생성할 수 있으며, 당단백질의 경우 당화가 되어 있는 형태로 분리할 수 있어 원래의 단백질과 동일한 형태의 변형을 갖는 단백질을 수득할 수 있는 이점이 있다.
이에 본 발명자들은 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질을 식물체로부터 생산함에 따라, 당화된 스파이크 당 단백질을 상기 식물체로부터 수득할 수 있었다. 상기 형질전환체 또는 이의 배양액으로부터 본 발명의 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질을 분리 및 정제하는 방법은, 당업계에 공지된 방법인 식물체로부터 목적 단백질을 분리 및 정제하는 방법이라면 모두 사용 가능하다.
나아가 본 발명은 상기 식물체로부터 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질의 생산방법을 통해 생산된 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질을 포함하는, COVID-19 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 ‘항원(antigen)’은 체내에서 면역 반응을 일으키는 모든 물질을 총칭하며, 바람직하게는 바이러스, 화합물질, 세균, 꽃가루, 암세포, 새우 등 또는 이들의 일부 펩타이드 또는 단백질이나, 체내에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명에 따른 COVID-19 예방 또는 치료용 S1-Fd 항원 단백질은 앞서 기술한 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질, 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛에 foldon(Fd) 및 HDEL 펩타이드가 융합된 재조합 항원 단백질일 수 있다.
본 발명에 따른 COVID-19 예방 또는 치료용 RBD-Fc 항원 단백질은 앞서 기술한 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질, 스파이크 당단백질의 RBD 도메인에 인간 면역글로불린 Fc 단편 및 HDEL 펩타이드가 융합된 재조합 항원 단백질일 수 있다.
특히 본 발명의 S1-Fd 및 RBD-Fc 재조합 항원 단백질은 SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 바이러스 감염에 의한 COVID-19의 예방 또는 치료를 위한 백신의 제조에 각각 사용될 수 있다.
본 발명에서 백신(vaccine)은, 생체에 면역반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 인간 또는 비인간 동물로서, 상기 비인간 동물은 돼지, 소, 말, 개, 염소, 양 등을 지칭하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "백신 조성물"은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 때는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제가 포함된다. 비수용성 제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥 내, 근육 내, 관절 내, 활액낭 내, 흉골 내, 경막 내, 병소 내 및 두개골 내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 개체에 면역반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로써 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다.
본 발명에서, 상기 백신 조성물의 제조방법은 아주번트(Adjuvant)를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "아주번트(Adjuvant)"는 백신 또는 약학적으로 활성 있는 성분들에 첨가되어 면역반응을 증가시키거나 영향을 주는 물질 또는 조성물을 말한다. 대표적으로 면역원(immunogen)용 캐리어(carrier) 또는 보조 물질 및/또는 다른 약학적으로 활성 있는 물질 또는 조성물을 통상적으로 의미한다. 전형적으로, 용어 "아주번트"는 넓은 개념에서 해석되어야 하며, 상기 아주번트에 통합되거나 상기 아주번트와 함께 투여된 항원의 면역원성(immunogenicity)을 증진할 수 있는 넓은 범위의 물질 또는 책략(stratagerm)을 의미한다. 또한, 아주번트는, 이에 제한되지 않고, 면역 강화제(immune potentiator), 항원 전달계 또는 이들의 조합으로 나누어질 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에는 아주번트가 추가로 더 포함될 수 있다. 또한, 상기 아주번트는 알럼(alum)일 수 있으나, 아주번트로 사용하기에 적합한 어떤 종류의 알루미늄 솔트(aluminium salt), 고분자라도 본 발명에 사용될 수 있다. 알루미늄 솔트는 알루미늄 하이드록사이드(Al(OH)3), 알루미늄 포스페이트(AlPO4), 알루미늄 하이드로클로라이드, 알루미늄 설페이트, 암모늄 알럼, 포타슘 알럼 또는 알루미늄 실리케이트 등이 포함된다. 바람직하게는, 알루미늄 솔트 아주번트로서 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트가 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 항원 단백질은 세포성 면역반응을 효과적으로 유도할 수 있는 특징이 있는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, S1-Fd 재조합 항원 단백질을 다른 농도의 GLA-SE 아주번트와 함께 섞어 2번 면역시킨 마우스의 비장 세포를 이용하여 항원 단백질로 자극시킨 후, 세포성 면역반응의 활성화 여부를 분석하였다.
그 결과, INF-γ 또는 TNF-α를 분비하는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 활성 및 증식이 향상되는 것으로 나타났다.
그러므로 이러한 결과를 통해, 본 발명자들은 본 발명의 방법으로 제조된 상기 재조합 항원 단백질이 T 세포 반응에서 우수한 항원 특이 면역원성을 나타내는 것으로 나타났고, 궁극적으로 면역활성의 증진을 통해 SARS-CoV-2 바이러스 감염을 방어할 수 있으며, COVID-19를 예방 또는 치료하기 위한 백신 제조에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 따라 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
재조합 스파이크 당단백질(spike glycoprotein S1) 발현용 식물 발현 벡터 제작
본원의 도 1에 나타낸 바와 같이, 식물체에서 재조합 스파이크 당단백질을 발현시킬 수 있도록, 식물체 발현용 재조합 벡터를 제작하였다. 구체적으로, 스파이크 당단백질에 대한 유전자 정보를 확보하고, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에서의 발현에 최적화된 서열로 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛(subunit) 유전자(서열번호 7)를 합성하였다. 소포체로 표적화되는 재조합 스파이크 당단백질 식물 발현벡터는 pCAMBIA1300 벡터를 기본 벡터로 사용하였으며, CaMV35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 NB 시그널 펩타이드(signal peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 11), 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 7), T4 피브리틴(fibritin)의 27개 아미노산인 foldon(Fd)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 9) 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 12)를 순차적으로 연결하여 S1-Fd 재조합 스파이크 당단백질(spike glycoprotein) 발현용 식물 발현 벡터인 pTEX-NB:S1:L:Foldon:8H 벡터를 제조하였다. 또한, 본 발명의 pTEX-NB:S1:L:Foldon:8H 벡터에 삽입된 도 1의 구조물 즉, NB:S1:L:Foldon:8H:HDEL에 대한 염기서열은 서열번호 13에 나타내었다. 또한 여기서 상기 본 발명의 벡터 구조물에 포함된 L은 GS-링커로서, GS-링커의 염기서열은 서열번호 15에 나타내었고, GS-링커에 대한 아미노산 서열은 서열번호 16에 나타내었다.
<실시예 2>
재조합 RBD 발현용 식물 발현 벡터 제작
본원의 도 2에 나타낸 바와 같이, 식물체에서 재조합 RBD 단백질을 발현시킬 수 있도록 재조합 식물체 발현용 벡터를 제작하였다. 구체적으로, RBD에 대한 유전자 정보를 확보하고, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에서의 발현에 최적화된 서열로 유전자(서열번호 8)를 합성하였다. 소포체로 표적화되는 재조합 RBD 식물 발현 벡터는 pCAMBIA1300 벡터를 기본 벡터로 사용하였으며, CaMV35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 NB 시그널 펩타이드(signal peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 11), RBD 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 8), 면역글로불린 hFc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 10) 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 12)를 순차적으로 연결하여 RBD-Fc 재조합 단백질 발현용 식물 발현 벡터인 pTEX-NB:RBD:hFc 벡터를 제조하였다. 또한, 본 발명의 pTEX-NB:RBD:hFc 벡터에 삽입된 도 1의 구조물 즉, NB:RBD:hFc:HDEL에 대한 염기서열은 서열번호 14에 나타내었다.
<실시예 3>
재조합 스파이크 당단백질과 RBD의 구조 분석
도 3에 나타낸 바와 같이, COVID-19 항원 단백질인 스파이크 당단백질과 상기 단백질의 리셉터 결합(receptor binding) 도메인으로 알려진 RBD에 대한 3차 구조를 분석하였다. 도 3의 A에서 SS는 신호서열을, NTD는 N-터미날 도메인을, RBD는 리셉터 결합 도메인을, SD1은 subdomain 1을, SD2는 subdomain 2를, S1/S2는 프로테아제 절단 사이트를, S2', S2'는 프로테아제 절단 사이트를, FP은 퓨전 펩타이드를, HR1은 heptad repeat 1을, CH는 central helix를, CD는 연결 도메인을, HR2는 heptad repeat 2를, TM은 트렌스 멤브레인 도메인을, CT는 세포 내 꼬리를 각각 나타낸 것이다. 또한, 도 3의 B는 스파이크 당단백질의 전체 구조에 대한 모식도를 나타낸 것으로, N-terminal은 NTD와 RBD로 구성되어 있으며, CTD와 긴 loop을 통해 연결되어 있다. 또한, 스파이크 당단백질이 단량체(monomer)로 존재 시 RBD가 다운(down) 되어 있다가 삼량체(trimer)를 형성하게 되면 1개의 RBD가 위로 돌출된 구조를 형성하는 것으로 확인되었다.
<실시예 4>
식물체 내에서 COVID-19 백신용 재조합 단백질의 발현 및 정제
<4-1> 식물발현 벡터의 일과성 발현(Transient expression)
상기 <실시예 1> 및 <실시예 2>에서 준비한 각각의 식물 발현 벡터(재조합 스파이크 당단백질 S1-Fd 발현용 벡터(pTEX-NB:S1:L:Foldon:8H) 및 재조합 RBD-Fc 발현용 벡터(pTEX-NB:RBD:hFc 벡터))를 아그로박테리아 LBA4404 균주에 전기충격법(Electrophoration)을 이용하여 각각 형질전환시켰다. 형질전환된 아그로박테리아를 5 mL의 YEP 액체배지(효모 추출물 10 g, 펩톤 10 g, NaCl 5 g, 카나마이신 50 mg/L, 리팜피신 25 mg/L)에서 28℃의 조건으로 16시간 동안 진탕 배양한 후 1차 배양액 1 ml을 50 ml의 새 YEP 배지에 접종하여 28℃의 조건에서 6시간 동안 진탕 배양하였다. 배양된 아그로박테리아는 원심분리(7,000 rpm, 4℃, 5분)하여 수집한 후, 600 nm의 파장에서 흡광도(O.D) 값이 1.0이 되도록 인필트레이션(Infiltration) 버퍼[10 mM MES(pH 5.7), 10 mM MgCl2, 200 μM 아세토시린곤]에 현탁시켰다. 아그로박테리아 현탁액은 주사바늘을 제거한 주사기를 이용하여 니코티아나 벤타미아나 잎의 뒷면에 주입하는 방법으로 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)을 수행하였다.
<4-2> 형질전환 식물체에서 S1-Fd 재조합 단백질 및 RBD-Fc 재조합 단백질의 발현 확인
상기 실시예 <4-1>에서 형질전환된 식물체의 잎으로부터 본 발명의 항원성 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위해, 상기 식물 잎을 추출하여 원심분리한 후, 수용성 분획(Supernatant; S), 펠릿(Pellet; P) 분획 및 수용성 분획과 펠릿 분획을 모두 포함하는 분획(Total; T)에 대해 본 발명의 재조합 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블롯을 통해 수행하였다. 보다 자세하게는, 각 분획 30μL를 SDS 시료 버퍼와 혼합한 후에 가열하였다. 그리고 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동 하여 크기별로 분리된 단백질 밴드를 확인하고, 이를 PVDF 막으로 이동시킨 후에, 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 블록킹 단계를 거친 후에, 폴리히스티딘과 반응하는 항체를 결합시키고, ECL 용액을 제조사에서 제공하는 방법대로 처리하여 재조합 S1-Fd 와 RBD-Fc 단백질의 발현을 각각 확인하였다.
그 결과 도 4A에 나타난 바와 같이, 소포체로 표적화되도록 NB(New Bip, chaperone binding protein 신호 펩타이드)를 융합한 S1-Fd 재조합 단백질 및 RBD-Fc 재조합 단백질은 식물체 내에서 높은 효율로 발현되고 있음을 확인할 수 있었고, 특히 발현된 S1-Fd 및 RBD-Fc 재조합 단백질의 95% 이상이 수용성 분획에서 확인되었으며, 약 5%의 S1-Fd 와 RBD-Fc 단백질이 펠릿 분획에서 관찰되었다.
이에 하기 실시예에서는 소포체로 표적화되는 chaperone binding protein 신호 펩타이드를 융합한 재조합 S1-Fd 와 RBD-Fc 단백질(C-term 말단에 His-tag 또는 Fc fragment가 부착된)을 이용하여 진행하였다.
<4-3> 형질전환 식물체로부터 본 발명의 S1-Fd 재조합 항원 단백질의 분리 및 정제
상기 실시예에서 C-말단에 폴리히스티딘-태그(His-tag)가 융합된 pTEX-NB:S1:L:Foldon:8H 발현벡터로 형질전환된 니코티아나 벤타미아 잎 50g에 단백질 추출 용액[20mM Tris-HCl, pH 8.0, 1M NaCl, 50mM imidazole, 0.5% Triton X-100] 100mL을 첨가하고 블렌더로 조직을 파쇄한 후 13,000rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리하여 단백질 추출액을 수득하였다. 상기 단백질 추출액으로부터 본 발명의 S1-Fd 재조합 단백질의 분리정제를 위해 Ni-IDA(Iminodiacetic acid) 아가로스 레진(agarose resin)이 충진된 컬럼으로 친화성 크로마토그래피를 동시에 실시하였다. 상기 컬럼에 레진을 10mL 충진한 후 100mL의 세척용액[20mM Tris-HCl, pH 8.0, 1M NaCl, 50mM Imidazole]으로 평형화시켰다. 회수한 각각의 단백질 추출액을 Ni-IDA 컬럼에 적용하고 평형화시킨 다음, 세척용액 100mL을 흘려보내 레진을 세척하고 용출용액[20mM Tris-HCl, pH 8.0, 1M NaCl, 50mM 또는 100mM 또는 300mM Imidazole]으로 S1-Fd 재조합 단백질을 용출하였다. S1-Fd 재조합 단백질이 포함된 용출용액은 전기영동(SDS-PAGE) 후 코마지에 블루염색법(Coomassie staining)을 통해 분리 및 정제한 단백질을 확인하였다(도 4B 참조).
<4-4> 형질전환 식물체로부터 본 발명의 RBD-Fc 재조합 항원 단백질의 분리 및 정제
상기 실시예에서 C-말단에 Fc 단편이 융합된 pTEX-NB:RBD:hFc 발현벡터로 형질전환된 니코티아나 벤타미아 잎 50g에 단백질 추출 용액[50mM Sodium phosphate, pH 8.0, 200mM NaCl, 0.5% Triton X-100] 100mL을 첨가하고 블렌더로 조직을 파쇄한 후 13,000rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리하여 단백질 추출액을 각각 회수하였다. 상기 단백질 추출액으로부터 RBD-Fc 재조합 단백질의 분리정제를 위해 Protein A 아가로스 레진(agarose resin)이 충진된 컬럼으로 친화성 크로마토그래피를 동시에 실시하였다. 상기 컬럼에 레진을 10mL 충진한 후 100mL의 추출용액으로 평형화시켰다. 회수한 각각의 단백질 추출액을 Protein A 컬럼에 적용하고 평형화시킨 다음, 세척용액 100mL을 흘려보내 레진을 세척하고 용출용액[50mM Sodium citrate, pH 3.0, 335 mM NaCl]로 RBD-Fc 재조합 단백질을 용출하였다. 이후 용출된 단백질은 1M Tris-Cl, pH 9.5를 이용하여 pH 7.3으로 중화를 수행했다. 중화된 RBD-Fc 재조합 단백질이 포함된 용출용액은 전기영동(SDS-PAGE) 후 코마지에 블루염색법(Coomassie staining)을 통해 확인하였다 (도 4B 우).
<실시예 5>
식물체로부터 발현 및 정제한 본 발명의 COVID-19 백신용 재조합 단백질의 백신 용도 확인
상기 실시예 4를 통해 식물체로부터 정제한 S1-Fd 재조합 단백질 및 RBD-Fc 재조합 단백질에 대하여, COVID-19 백신으로서의 사용 가능성에 대한 분석을 수행하였다. 이를 위해 수행한 실험방법은 다음과 같다.
<5-1> 실험방법
① 실험군
총 시험 군은 12개 군으로 하였다(실험동물 4군 × 항원처리조건 각 군당 3가지 방법으로 수행함). 또한 총 분석 샘플은 72개를 사용하였다(12군 × n=3 × cytokine 2종). 구체적인 실험군은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 참고로 하기 표 및 도면에서 “S1 fol 8H”는 본 발명에서 분리한 스파이크 당단백질인 S1-Fd 재조합 단백질을 표기한 것이다.
② 세포 분리(single cell isolation) 및 항원 처리(antigen treatment)
시약은 RPMI-1640 배지(10% FBS) 및 1X PBS 완충액을 사용하였고, 비장세포의 분리는 다음의 방법으로 수행하였다. 마우스에서 비장을 분리한 후 RPMI-1640에서 단일세포로 분리하였다. 분리한 세포를 원심분리하여 상층액을 제거한 후, RBC 용해버퍼(lysis buffer)를 넣고 3분간 반응시켰다. RPMI-1640 배지를 이용하여 중화시킨 후 다시 원심분리를 하여 적혈구를 제거하였다. 적혈구가 제거된 비장세포는 DPBS로 현탁하여 70 μm 세포 스트레이너(cell strainer)로 세포를 한번 거른 뒤 DPBS로 다시 한번 세척하고 상층액을 제거한 후 실험에 사용하였다.
항원의 처리, 즉, 본 발명에서 분리 및 정제한 재조합 단백질의 처리는 96 웰 플레이트(round bottom plate)에 100 μl씩 세포를 깔아준 뒤(final conc.=2 × 107 cell/ml), 100 μl의 항원(첨가량 20μg/ml, 최종 농도 2 μg/웰 및 10μg/웰이 되도록 첨가)을 넣은 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 13 시간 동안 배양하였다. 이후 Golgiplug(최종 농도 1 μl/ml(0.2 μl/웰))을 처리하고 4시간 후 세포를 회수하여 항체 염색 과정을 수행하였다.
③ 항체염색
항체 염색을 위해 사용한 항체들은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.
항체 | conjugate | 제조사 | Cat No. |
CD4 | FITC | Biolegend | 100510 |
CD8 | PerCP | Biolegend | 100732 |
IFN-γ | PE | Biolegend | 505808 |
TNF-α | PE | Biolegend | 506306 |
Fc Blocker | - | eBiosciences | 553142 |
항체 염색 방법은, 세포 분리방법에 따라 분리된 비장세포(splenocyte)에 Fc blocker를 넣고 4℃에서 5분간 전처리하여 블록킹을 한 후, FACS 버퍼 (PBS+1% BSA)에 항체를 희석하여 첨가한 다음, 4℃에서 차광하여 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 세포는 FACS 버퍼를 이용하여 2회 세척하였다. 100 μl의 고정/투과성화 용액을 첨가하고 현탁한 다음, 4 ℃에서 20분간 차광하여 반응시켰다. 반응 후 1X BD Perm/Wash™ 버퍼로 2회 세척하였다. 세척이 완료된 세포는 BD 1X Perm/Wash™ 버퍼에 cytokine 항체를 각각 희석한 후 4℃에서 차광하여 30분간 반응시켰다. 반응 후 1X BD Perm/Wash™ 버퍼로 2회 세척하고 4% 파라포름알데히드(PFA)를 이용하여 고정하였다. 염색이 끝난 세포는 유세포 분석기(FC500, Beckman coulter)를 이용하여 측정하였고 FlowJo™ V10 (Flowjo, LLC)를 이용하여 분석하였다.
<5-2> 분석결과
바이러스 또는 세균에 의한 감염에 대한 방어 기작 중 하나는 T세포의 활성화를 통해 이루어진다. 2종류의 T세포 활성화에 의해 진행되어지는데, CD8+T세포와 CD4+T세포이다. CD8+T세포는 바이러스에 감염된 세포나 종양 세포 등을 죽임으로써 감염을 통제하며 세포성 면역(Cell-mediated immunity)을 매개하며 세포독성 T세포(Cytotoxic T cell 혹은 CTL)라고도 부른다. 또한, CD4+세포는 CD8+세포의 생성 및 유지를 위한 신호화 성장인자를 제공하며 체액성 면역(Humoral immunity)을 촉진하는 세포를 말하며, 보조세포(Helper T cell 혹은 Th)라고 부른다. B세포와 T세포 백신의 면역학적 기초는 서로 배타적이 아니며 대부분의 항병원균 백신들은 체액과 세포면역의 근간이 된다.
본 발명자들은 본 발명에서 제조한 식물로부터 분리한 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 다른 농도의 GLA-SE 어쥬번트(1μg, 3 μg, 5 μg)와 함께 섞어 2번 면역시킨 마우스의 비장세포를 이용하여 항원단백질로 자극 한 후, IFN-γ 와TNF-α를 각각 생산하는 CD8+T세포와 CD4+T세포를 유세포 분석기로 측정 후 분석하였다. 구체적으로 본 발명의 항원 단백질 처리에 따른 마우스의 비장세포에서 IFN-γ 생산하는 CD4+ T세포, IFN-γ 생산하는 CD8+ T세포, TNF-α 생산하는 CD4+ T세포, TNF-α 생산하는 CD8+ T세포를 각각 측정하였다. 분석 결과는 하기 표 3~6 및 도 4~7에 나타내었다.
분석결과, 도 5 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 비장세포에 본 발명의 항원 단백질로 자극한 후, CD4+IFN-γ+ T세포를 확인한 결과, PBS 처리군에 비해 본 발명의 재조합 항원 단백질과 GLA-SE 아주번트를 투여한 군에서 CD4+IFN-γ+ T세포의 수가 증가된 것으로 나타났다. 특히 GLA-SE 1, 3, 5 μg 실험군 모두에서 항원 단백질 10 μg으로 자극하였을 때, 더 뚜렷하게 유의적으로 CD4+IFN-γ+ T 세포가 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 6 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 비장세포에 본 발명의 재조합 항원 단백질로 자극한 후, CD8+IFN-γ+ T세포를 확인한 결과, PBS 처리군에 비해 본 발명의 항원 단백질과 GLA-SE 어주번트를 투여한 군에서 모두 유의성 있게 CD8+IFN-γ+ T세포수가 증가한 것으로 나타났다. 또한, 재조합 항원 단백질 10 μg으로 자극하였을 때, GLA-SE 1μg 실험군의 경우 더욱 CD8+IFN-γ+ T세포수가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 7 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 비장세포에 본 발명의 재조합 항원 단백질로 자극한 후, CD4+TNF-α+ T세포를 확인한 결과, PBS 처리군에 비해 본 발명의 재조합 항원 단백질과 GLA-SE 어주번트를 투여한 군에서 모두 증가하는 양상을 나타내었다. 이러한 결과는 재조합 항원 단백질 10 μg으로 자극하였을 때 더욱 명확하게 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다.
나아가 도 8 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 비장세포에 본 발명의 재조합 항원 단백질로 자극한 후, CD8+TNF-α+ T세포를 확인한 결과, PBS 처리군에 비해 본 발명의 재조합 항원 단백질과 GLA-SE 어주번트를 투여한 군에서 증가하는 양상을 보였다. 또한, 재조합 항원 단백질 10 μg으로 자극하였을 때, 더욱 월등하게 증가하는 것으로 나타났다.
이상의 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 식물 발현용 재조합 벡터를 이용하여 식물체로부터 발현 및 정제된 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질이 항원 특이적으로 T세포의 활성화를 효과적으로 유도할 수 있음을 알 수 있었고, 따라서 COVID-19의 예방 및 치료를 위한 백신 용도로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> BioApplications Inc.
<120> Recombinant vector expressing proteins for COVID-19 vaccine in
plants and Methods of preparing vaccine composition using the
same
<130> NPDC94541.01
<160> 16
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 666
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of Spike glycoprotein S1 subunit
<400> 1
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
100 105 110
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
145 150 155 160
Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
210 215 220
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
290 295 300
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
305 310 315 320
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
325 330 335
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
340 345 350
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
355 360 365
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
370 375 380
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
385 390 395 400
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
405 410 415
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
420 425 430
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
435 440 445
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
450 455 460
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
485 490 495
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
500 505 510
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe
515 520 525
Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe
530 535 540
Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala
545 550 555 560
Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser
565 570 575
Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln
580 585 590
Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala
595 600 605
Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly
610 615 620
Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His
625 630 635 640
Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys
645 650 655
Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro
660 665
<210> 2
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of RBD
<400> 2
Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg
1 5 10 15
Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
20 25 30
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
35 40 45
Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn
50 55 60
Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile
65 70 75 80
Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro
85 90 95
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp
100 105 110
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys
115 120 125
Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
130 135 140
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
165 170 175
Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala
180 185 190
Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys
195 200 205
Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly
210 215 220
<210> 3
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of Foldon (Fd)
<400> 3
Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys
1 5 10 15
Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
20 25
<210> 4
<211> 231
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of hFc
<400> 4
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10 15
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of NB
<400> 5
Met Ala Arg Ser Phe Gly Ala Asn Ser Thr Val Val Leu Ala Ile Ile
1 5 10 15
Phe Phe Gly Glu
20
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of HDEL
<400> 6
His Asp Glu Leu
1
<210> 7
<211> 1998
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of Spike glycoprotein S1 subunit
<400> 7
gttaacctta ccaccagaac tcagttaccc ccagcataca ctaattcttt cacacgtggt 60
gtttactacc ctgacaaagt tttcagaagc agcgttttac acagcactca ggatttattc 120
ctacctttct tttccaacgt gacctggttc catgctatac atgtatctgg gaccaatggt 180
accaagaggt ttgataaccc ggtcctacca tttaatgatg gagtctattt tgcctccact 240
gagaagtcta atataataag aggctggatt tttggaacta ctcttgattc gaagacccag 300
agtctactta ttgttaataa cgctacaaat gttgttatca aagtatgtga atttcaattc 360
tgtaatgatc cattcttggg tgtttactac cacaaaaaca acaaaagttg gatggaaagt 420
gagtttcggg tttatagcag tgcgaataat tgcacttttg agtacgtctc ccaacctttt 480
cttatggacc ttgaaggaaa gcagggaaat ttcaagaatc ttcgcgaatt tgtgtttaag 540
aatatcgatg gttatttcaa gatatattct aagcacacgc ctattaattt agtgcgagat 600
ctccctcagg gtttttcggc gctggaacca ttggtagatt tgccgatagg aatcaatatc 660
actaggttcc agactttact tgctctgcat agaagttact tgacccctgg agatagctca 720
tcaggttgga cagctggtgc ggcagcttat tacgtggggt atcttcagcc taggacgttc 780
ctattaaaat ataatgaaaa tggaaccatt acagatgctg tagactgtgc acttgaccct 840
ctctcagaaa caaagtgtac gttgaaatcc ttcacggtag aaaaagggat ctaccaaacg 900
tctaacttca gagtccagcc aacagaatct attgtgagat ttcccaatat tacaaacttg 960
tgccctttcg gagaagtttt taacgccacc aggtttgcat cggtttatgc ttggaacagg 1020
aaaagaatca gcaactgtgt tgctgattat agtgtcctat ataactccgc atccttttcc 1080
actttcaagt gttacggagt ttctcctact aaattaaatg atctctgctt tactaatgtc 1140
tatgcagatt catttgtaat cagaggtgat gaggtcagac aaatcgctcc agggcagact 1200
ggaaagattg ctgattataa ttataagctt cctgatgatt ttacaggctg cgttatagca 1260
tggaattcta ataatcttga ctctaaggtg gggggaaatt ataattacct gtatagactg 1320
tttaggaaga gcaatctcaa gcctttcgag agagacattt caactgagat ctaccaggcg 1380
ggaagcactc cgtgtaatgg tgttgagggt tttaattgtt actttccttt acagtcatac 1440
ggtttccaac ccacgaatgg ggttggttac caaccgtacc gagtagtagt actttctttc 1500
gagcttctac atgccccagc aactgtttgt ggacctaaga agtctactaa tttggttaaa 1560
aataagtgtg tcaattttaa tttcaatgga cttacgggca caggagttct tactgagtct 1620
aacaagaagt ttctgccttt ccagcagttc ggcagagata ttgctgacac tactgatgct 1680
gtgcgtgatc cacagacact tgaaattctt gacattacac catgttcttt tggtggcgtg 1740
agtgttataa ctcccggaac aaatacctcc aaccaggtgg ctgttctgta tcaggacgtg 1800
aactgtacag aagtccctgt tgcaattcat gcagatcagc ttactcctac ctggcgtgtt 1860
tattctacgg gttccaatgt ttttcaaaca cgtgcaggct gcttgatagg ggctgaacat 1920
gtcaacaact catatgaatg cgacataccc ataggtgcag gtatatgcgc tagttatcag 1980
actcagacca attctccg 1998
<210> 8
<211> 660
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of RBD
<400> 8
aacattacga acttgtgccc tttcggagaa gtgtttaacg ccacccggtt tgcttctgtt 60
tacgcttgga acaggaaacg aataagcaac tgtgtggcag attattctgt actatataac 120
tccgcatcat tttccacttt caagtgttat ggcgtttcgc ctacgaagct gaacgacctc 180
tgcttcacca acgtatacgc agattcattc gtaattcgtg gtgatgaggt ccgccaaatc 240
gctccagggc aaactgggaa gattgctgat tacaactata agcttccaga cgattttact 300
ggctgcgtta tagcttggaa cagtaacaac ttagactcta aggttggagg taactacaac 360
tatctgtaca gattgttcag gaaaagcaac ctcaagccgt tcgaaagaga tattagtaca 420
gagatctatc aggcgggtag tacaccttgt aacggggttg aaggatttaa ctgttacttc 480
cctcttcagt catatggatt tcagcccacc aacggtgtcg gataccaacc atacagagtg 540
gtcgttcttt cttttgagct tttgcatgcc ccagcaactg tttgtggacc taaaaaatct 600
actaacttgg tgaaaaacaa gtgcgtgaac ttcaacttca acggtttaac aggcacaggt 660
660
<210> 9
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of Foldon (Fd)
<400> 9
ggctacattc ctgaggctcc aagagatggt caagcatatg tgaggaagga tggagaatgg 60
gttttgcttt ctactttttt g 81
<210> 10
<211> 693
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of hFc
<400> 10
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 60
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 120
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 180
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 240
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 300
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 360
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgtgag 420
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 480
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 540
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 600
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 660
acgcagaaga gcctctccct gtcccctggt aaa 693
<210> 11
<211> 251
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of NB
<400> 11
atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60
tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120
ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180
ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240
tgtcctctgc a 251
<210> 12
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of HDEL
<400> 12
cacgatgagc tc 12
<210> 13
<211> 2480
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of NB:S1:L:Foldon:8H:HDEL construct
<400> 13
tctagaatta ttacatcaaa acaaaaaatg gctcgctcgt ttggagctaa cagtaccgtt 60
gtgttggcga tcatcttctt cggtgagtga ttttccgatc ttcttctccg atttagatct 120
cctctacatt gttgcttaat ctcagaacct tttttcgttg ttcctggatc tgaatgtgtt 180
tgtttgcaat ttcacgatct taaaaggtta gatctcgatt ggtattgacg attggaatct 240
ttacgatttc aggatgttta tttgcgttgt cctctgcagg atccgttaac cttaccacca 300
gaactcagtt acccccagca tacactaatt ctttcacacg tggtgtttac taccctgaca 360
aagttttcag aagcagcgtt ttacacagca ctcaggattt attcctacct ttcttttcca 420
acgtgacctg gttccatgct atacatgtat ctgggaccaa tggtaccaag aggtttgata 480
acccggtcct accatttaat gatggagtct attttgcctc cactgagaag tctaatataa 540
taagaggctg gatttttgga actactcttg attcgaagac ccagagtcta cttattgtta 600
ataacgctac aaatgttgtt atcaaagtat gtgaatttca attctgtaat gatccattct 660
tgggtgttta ctaccacaaa aacaacaaaa gttggatgga aagtgagttt cgggtttata 720
gcagtgcgaa taattgcact tttgagtacg tctcccaacc ttttcttatg gaccttgaag 780
gaaagcaggg aaatttcaag aatcttcgcg aatttgtgtt taagaatatc gatggttatt 840
tcaagatata ttctaagcac acgcctatta atttagtgcg agatctccct cagggttttt 900
cggcgctgga accattggta gatttgccga taggaatcaa tatcactagg ttccagactt 960
tacttgctct gcatagaagt tacttgaccc ctggagatag ctcatcaggt tggacagctg 1020
gtgcggcagc ttattacgtg gggtatcttc agcctaggac gttcctatta aaatataatg 1080
aaaatggaac cattacagat gctgtagact gtgcacttga ccctctctca gaaacaaagt 1140
gtacgttgaa atccttcacg gtagaaaaag ggatctacca aacgtctaac ttcagagtcc 1200
agccaacaga atctattgtg agatttccca atattacaaa cttgtgccct ttcggagaag 1260
tttttaacgc caccaggttt gcatcggttt atgcttggaa caggaaaaga atcagcaact 1320
gtgttgctga ttatagtgtc ctatataact ccgcatcctt ttccactttc aagtgttacg 1380
gagtttctcc tactaaatta aatgatctct gctttactaa tgtctatgca gattcatttg 1440
taatcagagg tgatgaggtc agacaaatcg ctccagggca gactggaaag attgctgatt 1500
ataattataa gcttcctgat gattttacag gctgcgttat agcatggaat tctaataatc 1560
ttgactctaa ggtgggggga aattataatt acctgtatag actgtttagg aagagcaatc 1620
tcaagccttt cgagagagac atttcaactg agatctacca ggcgggaagc actccgtgta 1680
atggtgttga gggttttaat tgttactttc ctttacagtc atacggtttc caacccacga 1740
atggggttgg ttaccaaccg taccgagtag tagtactttc tttcgagctt ctacatgccc 1800
cagcaactgt ttgtggacct aagaagtcta ctaatttggt taaaaataag tgtgtcaatt 1860
ttaatttcaa tggacttacg ggcacaggag ttcttactga gtctaacaag aagtttctgc 1920
ctttccagca gttcggcaga gatattgctg acactactga tgctgtgcgt gatccacaga 1980
cacttgaaat tcttgacatt acaccatgtt cttttggtgg cgtgagtgtt ataactcccg 2040
gaacaaatac ctccaaccag gtggctgttc tgtatcagga cgtgaactgt acagaagtcc 2100
ctgttgcaat tcatgcagat cagcttactc ctacctggcg tgtttattct acgggttcca 2160
atgtttttca aacacgtgca ggctgcttga taggggctga acatgtcaac aactcatatg 2220
aatgcgacat acccataggt gcaggtatat gcgctagtta tcagactcag accaattctc 2280
cgggaggttc aggaggttca ggaggttcag gaggttcaac tagtggaacc cggggttctg 2340
gatcaggcta cattcctgag gctccaagag atggtcaagc atatgtgagg aaggatggag 2400
aatgggtttt gctttctact tttttgggat ctggttcaca ccaccatcac caccatcacc 2460
atgatgagct ctagctcgag 2480
<210> 14
<211> 1667
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of NB:RBD:hFc:HDEL construct
<400> 14
tctagaatta ttacatcaaa acaaaaaatg gctcgctcgt ttggagctaa cagtaccgtt 60
gtgttggcga tcatcttctt cggtgagtga ttttccgatc ttcttctccg atttagatct 120
cctctacatt gttgcttaat ctcagaacct tttttcgttg ttcctggatc tgaatgtgtt 180
tgtttgcaat ttcacgatct taaaaggtta gatctcgatt ggtattgacg attggaatct 240
ttacgatttc aggatgttta tttgcgttgt cctctgcagg atccaacatt acgaacttgt 300
gccctttcgg agaagtgttt aacgccaccc ggtttgcttc tgtttacgct tggaacagga 360
aacgaataag caactgtgtg gcagattatt ctgtactata taactccgca tcattttcca 420
ctttcaagtg ttatggcgtt tcgcctacga agctgaacga cctctgcttc accaacgtat 480
acgcagattc attcgtaatt cgtggtgatg aggtccgcca aatcgctcca gggcaaactg 540
ggaagattgc tgattacaac tataagcttc cagacgattt tactggctgc gttatagctt 600
ggaacagtaa caacttagac tctaaggttg gaggtaacta caactatctg tacagattgt 660
tcaggaaaag caacctcaag ccgttcgaaa gagatattag tacagagatc tatcaggcgg 720
gtagtacacc ttgtaacggg gttgaaggat ttaactgtta cttccctctt cagtcatatg 780
gatttcagcc caccaacggt gtcggatacc aaccatacag agtggtcgtt ctttcttttg 840
agcttttgca tgccccagca actgtttgtg gacctaaaaa atctactaac ttggtgaaaa 900
acaagtgcgt gaacttcaac ttcaacggtt taacaggcac aggtccccgg gagcccaaat 960
cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt 1020
cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg 1080
tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg 1140
tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca 1200
cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt 1260
acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag 1320
ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgt gaggagatga 1380
ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg 1440
tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg 1500
actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc 1560
aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga 1620
agagcctctc cctgtcccct ggtaaacacg atgagctcta gctcgag 1667
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of GS-linker
<400> 15
ggaggttcag gaggttcagg aggttcagga ggttca 36
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of GS-linker
<400> 16
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
Claims (15)
- 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 단백질; 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon) 폴리펩타이드; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드;가 융합된,
COVID-19 백신용 S1-Fd 재조합 항원 단백질. - 삭제
- 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 NB 유전자; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛을 코딩하는 S1 유전자; 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon)을 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 펩타이드를 코딩하는 유전자;가 순차적으로 연결되어 포함된,
식물세포에서 COVID-19 백신용 S1-Fd 재조합 항원 단백질의 발현을 위한 재조합 발현벡터. - 제3항에 있어서,
상기 NB 유전자는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 것이고;
상기 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛 유전자는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것이고;
상기 T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon)을 코딩하는 유전자는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 것이고;
상기 HDEL 펩타이드를 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 식물세포에서 COVID-19 백신용 S1-Fd 재조합 항원 단백질의 발현을 위한 재조합 발현벡터. - 제3항에 있어서,
상기 S1-Fd 재조합 항원 단백질은 식물세포의 소포체로 표적화되어 발현되는 것을 특징으로 하는, 식물세포에서 COVID-19 백신용 S1-Fd 재조합 항원 단백질의 발현을 위한 재조합 발현벡터. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제3항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
- 제9항에 있어서,
상기 형질전환체는 형질전환 식물체로서,
애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 형질전환체. - 제9항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
상기 형질전환체 또는 이의 배양액으로부터 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는,
식물체로부터 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질의 생산방법. - 제11항의 방법으로 생산된 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질을 포함하는, COVID-19 예방 또는 치료용 백신 조성물.
- 제12항에 있어서,
상기 백신 조성물에는 아주번트를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는, COVID-19 예방 또는 치료용 백신 조성물. - 제12항에 있어서
상기 재조합 항원 단백질은 세포성 면역반응 유도활성을 갖는 것을 특징으로 하는, COVID-19 예방 또는 치료용 백신 조성물. - 제14항에 있어서,
상기 세포성 면역반응 유도활성은 INF-γ 또는 TNF-a를 분비하는 CD4+ T세포 또는 CD8+ T세포의 활성 및 증식을 촉진시키는 것을 특징으로 하는, COVID-19 예방 또는 치료용 백신 조성물.
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Chunyun Sun 등. bioRxiv preprint(2020.02.20.) |
Jie Li 등. VIRAL IMMUNOLOGY. Vol. 26, No. 2, 페이지 126-132 (2013.) |
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