CN113234165A - EpCAM的改造的结合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种EpCAM的改造的结合蛋白及其应用。该改造的结合蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的改造的结合蛋白、如SEQ ID NO.2所示的改造的结合蛋白、如SEQ ID NO.3所示的改造的结合蛋白和如SEQ ID NO.4所示的改造的结合蛋白中的至少一种。本发明还公开了上述EpCAM的改造的结合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的结合蛋白结构稳定性高，组织渗透力强，并且是人源性的，在人体中无免疫原性，可更好地应用于抗肿瘤药物的开发。

Description

EpCAM的改造的结合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于结合蛋白领域，特别涉及一种EpCAM的改造的结合蛋白及其应用。
背景技术
肿瘤细胞具有自我更新、无限增殖、耐药性等特点，目前治疗肿瘤的主要途径包括手术切除，放疗或者化疗，但这些治疗方法对患者副作用较大，因此临床迫切需要开发新型的治疗手段。上皮细胞粘附分子(EpCAM)是最早发现的肿瘤标志物之一，EpCAM是一种由314个氨基酸组成的I型跨膜糖蛋白，其在正常组织中表达水平较低，但在人类肿瘤细胞系，尤其是鳞状细胞癌和腺癌中表达广泛,例如EpCAM在大肠癌，肺癌，胃癌，胰腺癌，卵巢癌，乳腺癌及子宫内膜癌中均过表达，研究表明EpCAM的异常过表达与肿瘤细胞增殖，转移及不良预后密切相关，因此以EpCAM作为肿瘤治疗的靶点，拥有广阔的应用前景。
抗体用于肿瘤靶向治疗已经经过了几十年的发展了，目前已经有多种靶向EpCAM的抗体，应用于肿瘤治疗，它们主要包括单克隆抗体，单链抗体，单域抗体等。单克隆抗体具有副作用小，针对性强等优势，其可以特异的靶向肿瘤细胞表面抗原，并激活经典的ADCC和CDC活性，但其较大的分子量(约150kDa)，极大地限制了其对肿瘤组织的渗透，进而严重影响了治疗效果。单链抗体和单域抗体具有免疫原性低，不易产生免疫排斥反应，分子量小，易渗透到肿瘤组织等优势，但在临床应用的过程中也暴露出了在体内循环的半衰期短，易被清除的缺陷，因此临床迫切需要既能特异性靶向肿瘤细胞又能较易渗透到肿瘤组织且半衰期长的抗体药物。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种EpCAM的改造的结合蛋白。
本发明的另一目的在于提供上述EpCAM的改造的结合蛋白的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种EpCAM的改造的结合蛋白，是名称为pET22b-aEP3D4-aEP4G2的改造的结合蛋白、名称为pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2的改造的结合蛋白、名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4的改造的结合蛋白和名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc的改造的结合蛋白中的至少一种。
所述的名称为pET22b-aEP3D4-aEP4G2的改造的结合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；
所述的名称为pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2的改造的结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4的改造的结合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.3所示；
所述的名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc的改造的结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
上述EpCAM的改造的结合蛋白的编码核苷酸序列，是编码所述的名称为pET22b-aEP3D4-aEP4G2的改造的结合蛋白的核苷酸序列、编码所述的名称为pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2的改造的结合蛋白的核苷酸序列、编码所述的名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4的改造的结合蛋白的核苷酸序列和编码所述的名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc的改造的结合蛋白的核苷酸序列中的至少一种。
编码所述的名称为pET22b-aEP3D4-aEP4G2的改造的结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.9所示。
编码所述的名称为pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2的改造的结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.10所示。
编码所述的名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4的改造的结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.11所示。
编码所述的名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc的改造的结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.12所示。
所述的EpCAM的改造的结合蛋白的氨基酸序列如下所示：
pET22b-aEP3D4-aEP4G2:MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVKFSNHDMTWVRQAPGKGLEWVSAINSGGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGRQARVPHHMRFWGQGTLVTVSSAAAGGGGSGGGGSGGGGSMAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYNNMAWVRQAPGKGLEWVSAIEGKDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRKGRTEKLSYWGQGTLVTVSSAAA；
pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2:MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVKFSNHDMTWVRQAPGKGLEWVSAINSGGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGRQARVPHHMRFWGQGTLVTVSSAAAGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSMAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYNNMAWVRQAPGKGLEWVSAIEGKDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRKGRTEKLSYWGQGTLVTVSSAAA；
pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4:MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVKFSNHDMTWVRQAPGKGLEWVSAINSGGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGRQARVPHHMRFWGQGTLVTVSSAAAGGGGSGGGGSGGGGSMAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVKFSNHDMTWVRQAPGKGLEWVSAINSGGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGRQARVPHHMRFWGQGTLVTVSSAAA；
pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc:MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVKFSNHDMTWVRQAPGKGLEWVSAINSGGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGRQARVPHHMRFWGQGTLVTVSSAAAGGGGSGGGGSGGGGSMAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVKFSNHDMTWVRQAPGKGLEWVSAINSGGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGRQARVPHHMRFWGQGTLVTVSSAAAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
所述的EpCAM的改造的结合蛋白的核苷酸序列如下所示：
pET22b-aEP3D4-aEP4G2:ATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAGTTAAGTTTAGCAATCACGATATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAGCCATTAATAGCGGAGGCGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGAGAATGGGTCGTCAGGCGCGTGTTCCGCACCACATGCGGTTTTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCGCCGCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTTACGTTTAGCTATAACAATATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAGCCATTGAGGGGAAAGACGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGAGACGTAAGGGGCGTACGGAGAAGCTGTCGTATTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGGCCGCA；
pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2:ATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAGTTAAGTTTAGCAATCACGATATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAGCCATTAATAGCGGAGGCGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGAGAATGGGTCGTCAGGCGCGTGTTCCGCACCACATGCGGTTTTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCGCCGCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGAAGCTTTGGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCCTGAGTGGGTCTCATCCATTAGTGGTAGTGGTTCCGACACACTGTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCCGTATATTACTGTACCATTGGTGGGTCCCTGTCCAGATCCTCCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTTACGTTTAGCTATAACAATATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAGCCATTGAGGGGAAAGACGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGAGACGTAAGGGGCGTACGGAGAAGCTGTCGTATTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCGCCGCA；
pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4:ATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAGTTAAGTTTAGCAATCACGATATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTATCAGCCATTAATAGCGGAGGCGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGAGAATGGGTCGTCAGGCGCGTGTTCCGCACCACATGCGGTTTTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGCGCGGCCGCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAGTTAAGTTTAGCAATCACGATATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTATCAGCCATTAATAGCGGAGGCGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGAGAATGGGTCGTCAGGCGCGTGTTCCGCACCACATGCGGTTTTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGCGCGGCCGCA；
pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc:ATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAGTTAAGTTTAGCAATCACGATATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTATCAGCCATTAATAGCGGAGGCGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGAGAATGGGTCGTCAGGCGCGTGTTCCGCACCACATGCGGTTTTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGCGCGGCCGCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAGTTAAGTTTAGCAATCACGATATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTATCAGCCATTAATAGCGGAGGCGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGAGAATGGGTCGTCAGGCGCGTGTTCCGCACCACATGCGGTTTTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGCGCGGCCGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。
从上可见，编码名称为pET22b-aEP3D4-aEP4G2的改造的结合蛋白、名称为pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2的改造的结合蛋白、名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4的改造的结合蛋白和名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc的改造的结合蛋白的核苷酸序列分别为798、1188、807和1503个碱基；对应的氨基酸分别为266、396、269和501个。
名称为pET22b-aEP3D4-aEP4G2的改造的结合蛋白包含2个EpCAM的结合蛋白pET22b-aEP3D4和pET22b-aEP4G2以及1个(G4S)3linker，其中pET22b-aEP3D4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，pET22b-aEP4G2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，(G4S)3linker的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2的改造的结合蛋白包含2个EpCAM的结合蛋白pET22b-aEP3D4和pET22b-aEP4G2，1个anti-HSA蛋白及2个(G4S)3linker，pET22b-aEP3D4、pET22b-aEP4G2和(G4S)3linker的氨基酸序列同以上pET22b-aEP3D4-aEP4G2饰的修结合蛋白，anti-HSA蛋白的氨基酸序列为EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS。pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4的改造的结合蛋白包含2个EpCAM的结合蛋白pET22b-aEP3D4和1个(G4S)3linker，pET22b-aEP3D4和(G4S)3linker的氨基酸序列同以上pET22b-aEP3D4-aEP4G2的改造的结合蛋白。pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc的改造的结合蛋白包含2个EpCAM的结合蛋白pET22b-aEP3D4,1个hinge-Fc片段及1个(G4S)3linker，pET22b-aEP3D4和(G4S)3linker的氨基酸序列同以上pET22b-aEP3D4-aEP4G2改造的结合蛋白，hinge-Fc片段的氨基酸序列为EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
所述的EpCAM的改造的结合蛋白的制备方法，包括以下步骤：通过基因合成所述的EpCAM的改造的结合蛋白的编码核苷酸序列，将其克隆至表达载体，再将重组后的表达载体转入宿主细胞进行表达、纯化，得到EpCAM的改造的结合蛋白；或是通过蛋白合成的方法，得到EpCAM的改造的结合蛋白。
所述的表达载体包括原核表达载体和真核表达载体。
所述的原核表达载体优选为pET22b。
所述的真核表达载体优选为pcDNA3.1。
所述的EpCAM的改造的结合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的肿瘤为EpCAM高表达肿瘤，包括但不限于胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌、卵巢瘤、鼻咽癌、头颈癌、宫颈癌、子宫癌、肝癌、脾脏癌、肾脏癌和脑肿瘤。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明通过基因工程技术，对实验室前期筛选人源噬箘体结合蛋白文库得到的2个EpCAM结合蛋白进行改造的，构建了4个EpCAM的改造的结合蛋白的质粒，并在原核及真核表达系统大量表达并纯化了4个EpCAM的改造的结合蛋白，这些蛋白具有高度亲和力、高特异性和低的免疫源性，并且，改造的结合蛋白能在高表达的原核宿主及真核宿主进行表达，能显著降低改造的结合蛋白的生产成本，促进改造的结合蛋白的应用。
2.本发明提供的改造的结合蛋白，具有稳定性好、组织渗透能力强等优点。
3.本发明提供的改造的结合蛋白是人源性的，在人体中无免疫原性，可更好地应用于抗肿瘤药物的开发。
4.本发明提供的改造的结合蛋白能在高表达的原核宿主及真核宿主进行表达，能显著降低结合蛋白的生产成本，促进结合蛋白的应用。
附图说明
图1是改造的结合蛋白表达纯化后的SDS-PAGE电泳图；其中，A为EpCAM结合蛋白对照pET22b-aEP3D4的电泳图，B为EpCAM结合蛋白对照pET22b-aEP4G2的电泳图，C为pET22b-aEP3D4-aEP4G2改造的结合蛋白的电泳图，D为pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2改造的结合蛋白的电泳图，E为EpCAM结合蛋白对照pcDNA3.1-aEP3D4的电泳图，F为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4改造的结合蛋白的电泳图，G为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc的电泳图；A～D中，泳道M为蛋白Marker，泳道1为未诱导大肠杆菌全蛋白样品，泳道2为诱导后的大肠杆菌全蛋白，泳道3为破碎上清，泳道4为破碎沉淀，泳道5为过柱液，泳道6为洗杂液，泳道7-11为目的蛋白洗脱液1-5；E～G中，泳道M为蛋白Marker，泳道1为未转染质粒的细胞培养上清液，泳道2为转染质粒后的细胞培养上清液，泳道3为过柱液，泳道4为过柱洗杂液，泳道5-9为过柱洗脱液1-5。结果表明：从SDS-PAGE电泳图可看出，在箭头指出的目的蛋白的位置，诱导后全蛋白比未诱导全蛋白目的条带颜色更深，说明改造的结合蛋白被成功诱导表达。每幅SDS-PAGE电泳图最后5条是经Ni-NTA纯化柱纯化后收集的目的蛋白洗脱液电泳条带，从图中可看出，目的条带单一且颜色较深，说明在过柱纯化时已将大部分杂蛋白洗掉，洗脱液中主要含有我们所需的目的蛋白。
图2是采用ELISA方法检测改造的结合蛋白与EpCAM的结合的结果图；**P<0.01相对于PBS；#P<0.05，##P<0.01(N＝3)。结果表明：4个改造的结合蛋白均能与EpCAM特异性结合；与EpCAM结合蛋白对照pET22b-aEP4G2相比，pET22b-aEP3D4-aEP4G2和pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2与EpCAM抗原的结合有显著提高；与EpCAM结合蛋白对照pcDNA3.1-aEP3D4相比，pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4与EpCAM抗原的结合有显著提高。
图3是采用LDH释放法检测改造的结合蛋白介导的抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)结果图；其中，A～D分别是DU145细胞、PC-3细胞、MCF-7细胞和293T细胞的结果图；*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001相对于阴性对照结合蛋白pET22b-aHER2-13C1；####P<0.0001相对于EpCAM结合蛋白对照pcDNA3.1-aEP3D4；++++P<0.0001相对于pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4(N＝3)。结果表明：在3种肿瘤细胞中，随着结合蛋白浓度的增加，与阴性对照结合蛋白相比(pET22b-aHER2-13C1)，2个改造的结合蛋白(pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4，pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc)，对于细胞毒性作用逐渐增加；在所有3种肿瘤细胞以及所有3个结合蛋白浓度的实验中，与EpCAM结合蛋白对照pcDNA3.1-aEP3D4相比，pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc对于细胞毒性作用显著增加。2个改造的结合蛋白对293T未产生毒性作用。
图4是采用LDH释放法检测改造的结合蛋白pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc介导的补体依赖的细胞毒性作用(CDC)结果图；其中，A～D分别是DU145细胞、PC-3细胞、MCF-7细胞细胞和293T细胞的结果图；*P<0.05、***P<0.001、****P<0.0001相对于pET22b-aHER2-13C1；####P<0.0001相对于EpCAM结合蛋白对照pcDNA3.1-aEP3D4；++++P<0.0001相对于pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4(N＝3)。结果表明：在3种肿瘤细胞中，随着结合蛋白浓度的增加，与阴性对照结合蛋白相比(pET22b-aHER2-13C1)，2个改造的结合蛋白(pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4，pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc)，对于细胞毒性作用逐渐增加；在所有3种肿瘤细胞以及所有3个结合蛋白浓度的实验中，与EpCAM结合蛋白对照pcDNA3.1-aEP3D4相比，pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc对于细胞毒性作用显著增加。2个改造的结合蛋白对293T未产生毒性作用。
图5是采用MTT法检测改造的结合蛋白对肿瘤细胞增殖的影响结果图；其中，A为改造的合蛋白对DU145增殖能力的影响结果图，B为改造的结合蛋白对PC-3增殖能力的影响结果图，C为改造的结合蛋白对MCF-7增殖能力的影响结果图；*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001相对于0μg/mL；#P<0.05、##P<0.01；(N＝3)。结果表明：与0μg/mL相比，2个改造的结合蛋白(pET22b-aEP3D4-aEP4G2和pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2)均能够显著抑制DU145、PC-3和MCF-7细胞的增殖，并且随着蛋白浓度的增加，抑制作用不断增强；在3种肿瘤细胞中，抗体终浓度为100μg/mL时，与EpCAM结合蛋白对照pET22b-aEP4G2相比，pET22b-aEP3D4-aEP4G2对肿瘤细胞增殖的抑制作用显著增强；在MCF-7细胞中，抗体终浓度为100μg/mL时，与EpCAM结合蛋白对照pET22b-aEP3D4相比，pET22b-aEP3D4-aEP4G2对肿瘤细胞增殖的抑制作用也显著增强。
具体实施例
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1获得阴性对照结合蛋白
本实验室前期实验通过噬菌体展示技术，采用人表皮生长因子受体2(Her2)和血管内皮生长因子(VEGF)合成多肽为抗原，采用以上方法筛选人源结合蛋白噬菌体文库，通过ELISA挑选2个不与对应抗原结合的克隆，分别获得阴性对照结合蛋白pET22b-aHER2-13C1和pET22b-aVE201。阴性对照结合蛋白pET22b-aHER2-13C1和pET22b-aVE201分别如SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示氨基酸序列；编码pET22b-aHER2-13C1和pET22b-aVE201的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
实施例2改造的结合蛋白质粒的构建
本实验室前期已经通过筛选噬箘体文库筛选出了2个全人源EpCAM结合蛋白pET22b-aEP3D4和pET22b-aEP4G2，并通过基因测序得到它们的核苷酸序列，本实施例通过使用(G4S)3linker将以上2个人源EpCAM结合蛋白的核苷酸序列进行连接，并交给金唯智公司合成pET22b-aEP3D4-aEP4G2改造的结合蛋白的核苷酸序列；通过使用(G4S)3linker将以上2个人源EpCAM结合蛋白的核苷酸序列与anti-HSA蛋白的核苷酸序列进行连接，并交给金唯智公司合成pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2改造的结合蛋白的核苷酸序列。并将以上2条核苷酸序列通过酶切连接到原核表达质粒pET22b(+)构建了改造的结合蛋白的原核表达质粒(酶切位点为：Nco I，Not I)。本实施例通过使用(G4S)3linker将以上pET22b-aEP3D4人源EpCAM结合蛋白的核苷酸序列进行连接，并交给金唯智公司合成了pET22b-aEP3D4-aEP3D4改造的结合蛋白的核苷酸序列；通过使用(G4S)3linker将2个pET22b-aEP3D4人源EpCAM结合蛋白的核苷酸序列连接，并通过铰链(hinge)与人类抗体lgG1的Fc片段的的核苷酸序列进行连接，并交给金唯智公司合成pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc改造的结合蛋白的核苷酸序列。并将以上2条核苷酸序列通过酶切连接到真核表达质粒pcDNA3.1(+)，构建了这2个改造的结合蛋白的真核表达质粒(酶切位点为：Xho I，Xba I)。
实施例3改造的结合蛋白的原核表达
1.质粒的抽提：根据实验室购买的
Figure BDA0003053337730000051
Plasmid Mini Kit的内附说明书进行操作。
2.将原核表达质粒转化到BL21(DE3)
(1)将-80℃超低温冰箱中，制备好的BL21(DE3)感受态细胞取出，并置于冰上以解冻。
(2)待感受态细胞解冻完成后，加入0.1μg上述构建的原核表达质粒，用手指轻弹EP管，使其充分混匀后，再次置于冰上半小时。
(3)置入42℃水浴锅，热激2min后，迅速置于冰上2min。
(4)加入900μL已高压灭菌的LB培养基，置于37℃恒温摇床，摇菌1个小时后离心，弃去900μL上清液后混匀细菌沉淀。
(5)使用无菌涂布棒，将上述剩余菌液均匀涂布于加有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养基平板上，置于37℃恒温培养箱，并培养过夜。
3.抗体蛋白的原核表达
(1)取出平板并观察单克隆生长情况，然后使用接种环挑取1个合适大小的单克隆，接种到5mL加有氨苄青霉素(100μg/mL)的无菌LB培养基中，并放入37℃恒温震荡摇床，并培养过夜。
(2)将以上3mL菌液，加入到300mL加有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基，并放入37℃恒温摇床中，震荡培养直到OD 600≥0.5时，使用移液枪吸取1mL菌液放入EP管中，作为没有诱导的菌液样品以用于后续的SDS-PAGE。
(3)向以上菌液中加入IPTG(终浓度：0.5mM)，于25℃的恒温摇床震荡培养约6h，以诱导蛋白质表达。
(4)诱导表达完成后，吸取1mL上述以诱导表达的菌液，作为已诱导的菌液样品以用于后续的SDS-PAGE。
(5)将上述剩余菌液置于低温冷冻离心机中，4℃、5000g高速离心5min，弃去上清，并保留离心下来的菌体沉淀。
(6)向以上菌体沉淀中加入20mL于4℃冰箱中预冷过的破菌缓冲液，使用移液枪将菌体沉淀充分混匀，并将混匀后的菌体悬液加入到50mL小烧杯中。
(7)将小烧杯放置于冰上，并使用超声破碎仪破碎菌体，破碎仪工作功率设定为40％。工作4s、停8s，工作时间设定为40min。
(8)将破碎完成后的液体倒出，放入离心管，4℃、15000g高速离心30min后，收集上清液，并分别取上清1mL作为破碎菌体上清液样品，取沉淀若干作为破碎菌体沉淀样品，用于后续的SDS-PAGE。
实施例4改造的结合蛋白的真核表达
1.抗体蛋白质粒的抽提：根据Endo-Free Plasmid Maxi Kit说明书进行操作。
2.抗体蛋白的真核表达
(1)取处于指数生长期的293f细胞(珠海恺瑞生物科技有限公司)悬液100mL置于新的细胞培养瓶中，使用KOP293培养液(珠海恺瑞生物科技有限公司)调整细胞密度为3×106个/mL，并取样1mL作为未转染样品。
(2)将上述细胞悬液置于37℃、含5％CO2的恒温震荡培养箱中，120rpm恒温震荡培养10min后开始转染质粒。
(3)取两支无菌的15mL的离心管，编号为1和2。
(4)在离心管1中依次加入5mL转染缓冲液KPM(珠海恺瑞生物科技有限公司)、100μg上述抽提的无菌质粒DNA，使用移液枪轻轻吹打混匀；在离心管2中，依次加入5mL KPM和500μL转染试剂TA-293(来源于珠海恺瑞生物科技有限公司)，轻轻吹打并充分混匀；
(5)将离心管2中所有液体转移到离心管1中，轻轻吹打并充分混匀；
(6)室温下静置10min，制备出质粒-载体复合物。
(7)将①中细胞从恒温震荡培养箱中取出，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，加入完毕后，置入CO2恒温震荡培养箱中震荡培养。
(8)震荡培养24h后加入600μL 293细胞蛋白表达增强剂KE-293(来源于珠海恺瑞的单独购买试剂，用量是根据试剂说明书进行，即100ml培养液加入600μL KE-293)，以增加产物表达量。
(9)继续置入37℃、含5％CO2恒温震荡培养箱中震荡培养5天，离心并保留上清，取样1mL作为转染样品。
实施例5改造的结合蛋白的纯化及SDS-PAGE
1.改造的结合蛋白的纯化
(1)从4℃冰箱中取出Ni-NTA纯化柱，向柱内注入10倍柱体积的超纯水清洗柱子，然后向柱内注入10倍柱体积的破菌缓冲液，以平衡柱子。
(2)将实施例2收集的破碎菌体上清液(原核表达)或者实施例3收集的细胞转染培养后的上清液，过柱过程中收集1mL过柱液，作为过柱液样品。
(3)过柱完成后，向柱内注入10倍柱体积的洗杂液，充分冲洗纯化柱，收集1mL过柱液，作为过柱洗杂液样品。
(4)向柱内注入10倍柱体积的洗脱液，将目的蛋白洗脱，并立即使用EP管收集5管流出的洗脱液，使用Nanodrop2000检测每管的其蛋白浓度。
(5)向柱内注入5倍柱体积的尿素溶液(浓度为8M)，充分冲洗纯化柱，超纯水充分洗涤柱子后，4℃冰箱保存以备后续使用。
(6)将步骤(4)收集的5管蛋白洗脱液注入透析袋中，并密封好透析袋两端，随后置于冷的PBS缓冲液中，使用磁力搅拌器在4℃下低速搅拌过夜，透析完成后将目的蛋白液注入超滤管中离心浓缩蛋白(设定离心温度4℃，离心力4000g，离心时间40min)，浓缩完成后置于-80℃冰箱保存。
2.SDS-PAGE检测改造的结合蛋白
(1)取以上收集的样品各20μL于EP管中，并向每个样品中加入5μL配制好的5倍浓度的上样缓冲液(5×Loading buffer)。
(2)置于加热器上，95℃、加热10min。
(3)在蛋白胶的第1泳道加入4μL的26616蛋白Marker，其余泳道依次加入5μL上述加热后的样品。
(4)调节电泳仪电压：70V，待蛋白样品跑至浓缩胶时，调节电压：110V，直至蛋白样品跑至凝胶合适位置，关闭电泳仪，切断电源，停止跑胶。
(5)使用胶铲取出凝胶并弃去多余部分，考马斯亮蓝室温染色20min后取出凝胶，并加入脱色液，放到脱色摇床上脱色，脱色完成后，拍照并保存。结果如图1所示：从SDS-PAGE电泳图可看出，在箭头指出的目的蛋白的位置，诱导后全蛋白比未诱导全蛋白目的条带颜色更深，说明改造的结合蛋白被成功诱导表达。每幅SDS-PAGE电泳图最后5条是经Ni-NTA纯化柱纯化后收集的目的蛋白洗脱液电泳条带，从图中可看出，目的条带单一且颜色较深，说明在过柱纯化时已将大部分杂蛋白洗掉，洗脱液中主要含有我们所需的目的蛋白。
实施例6 ELISA检测改造的结合蛋白与EpCAM抗原的结合
(1)在96孔酶标板中分别包被抗原IFN、NGF、CD28、CD31、CSF1R、ICAM-1、EGFR、EpCAM抗原完整胞外段、EpCAM抗原片段(以上蛋白均由北京义翘神州科技股份有限公司提供，片段由上海波泰生物公司提供)，包被体积为100μL，包被浓度为0.2μg/mL)，PBS作为空白对照。
(2)弃除所有的液体，并向以上每孔中注入200μL、2％BSA溶液，置于室温两小时后，再次弃除所有的液体。
(3)向每孔注入纯化的浓度为20μg/mL的改造的结合蛋白100μL，置于室温一小时后，再次弃除所有的液体。其中使用的结合蛋白包括4个改造的结合蛋白(pET22b-aEP3D4-aEP4G2、pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2、pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4和pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc)，3个EpCAM的结合蛋白对照(pET22b-aEP3D4、pET22b-aEP4G2和pcDNA3.1-aEP3D4)以及2个阴性对照结合蛋白(pET22b-aHER2-13C1和pET22b-aVE201)。
(4)向每孔注入100μL二抗(Protein A-HRP)，置于室温一小时后，再次弃除所有的液体。
(5)向每孔注入100μL TMB显色液，置于室温并避光处理10min。
(6)向每孔注入50μL的配制好的稀硫酸(浓度：1M)，测定OD450。结果如图2所示：4个改造的结合蛋白均能与EpCAM特异性结合；与EpCAM结合蛋白对照pET22b-aEP4G2相比，pET22b-aEP3D4-aEP4G2和pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2与EpCAM抗原的结合有显著提高；与EpCAM结合蛋白对照pcDNA3.1-aEP3D4相比，pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4与EpCAM抗原的结合有显著提高。
实施例7细胞培养及传代
1.贴壁细胞培养传代
(1)从培养箱中取出细胞并置于倒置显微镜下观察细胞，当细胞密度≥90％时，进行细胞传代。
(2)用75％酒精喷洒细胞培养皿表面，然后置于超净工作台内，弃去皿内的培养基。
(3)加入2mL无菌PBS，洗去残留培养基。
(4)弃去皿内PBS，并加入2mL温度为37℃的胰酶溶液消化细胞。
(5)将培养皿置于倒置显微镜下，观察细胞状态，直到细胞变圆，向皿内加入2mL含10％(v/v)FBS的培养基(DU145、PC-3细胞使用RPMI-1640培养基；MCF-7、293T细胞使用DMEM培养基)以终止胰酶消化。
(6)轻轻吹打细胞直到细胞从皿上脱落，收集细胞悬液到离心管中，设置离心力1000g，离心5min，弃除上清。
(7)向细胞沉淀中加入1mL细胞培养基(含10％FBS)，充分重悬细胞。
(8)去上述1/3细胞悬液至培养皿中，并加入8mL细胞培养基(含10％FBS)，轻轻摇晃培养皿，充分均匀细胞，置于含5％CO2、37℃的细胞培养箱培养。
2.悬浮细胞293f的培养传代
(1)细胞培养在5％CO2、37℃湿润的细胞震荡培养箱中。
(2)使用计数板在显微镜进行细胞计数，当细胞密度达到3.0×106个/mL以上，并且活率在95％以上时可以进行细胞传代。
(3)将细胞悬液摇晃均匀，使用移液管吸取40mL细胞悬液到无菌的培养瓶中，然后加入360mL专用的细胞培养基KOP293。
(4)将三角培养瓶置于37℃、5％CO2湿润的恒温震荡培养箱中培养，设置转速110rpm。
实施例8人外周血单个核细胞(PBMC)的提取
(1)取健康人的新鲜的抗凝全血2.5mL于离心管中，注入等体积的无菌PBS进行稀释。
(2)在新的离心管中，加入5mL人外周血淋巴细胞分离液，使用巴氏德吸管，将上述稀释好的血液轻轻加入到分离液上方，此时可以看到液体分为上下两层。
(3)设置离心力1000g，离心25min。
(4)离心结束后，可看到液体共分4层：从下往上依次是：粒细胞和红细胞层、分离液层、PBMC层(一层白膜)以及稀释后的血浆层。
(5)使用巴氏德吸管，吸取PBMC到无菌的15mL的离心管中，加入10mL的PBS，设置离心力250g，离心10min。
(6)弃除上清，再次加入5mL无菌PBS重悬细胞，设置离心力250g，离心10min。。
(7)重复步骤(6)后，使用细胞培养基重悬PBMC备用。
实施例9抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)
(1)使用CytoTox 96
Figure BDA0003053337730000081
Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒检测改造的结合蛋白介导的ADCC活性，本实验均使用含5％FBS的培养基(DU145、PC-3细胞使用RPMI-1640培养基；MCF-7、293T细胞使用DMEM培养基)以降低实验误差。
(2)分别设置以下对照孔及实验孔(使用96孔板)：
效应细胞自发LDH释放孔：向孔中加入2.5×105个PBMC(体积为100μL)。
靶细胞自发LDH释放孔：向孔中加入1×104个肿瘤细胞或293T细胞(体积为100μL)。
靶细胞最大LDH释放孔：向孔中加入1×104个肿瘤细胞或293T细胞(体积为100μL)，在收集上清前加入10μL 10倍浓度的裂解溶液。
培养基背景自发LDH释放孔：加入100μL对应的培养基。
体积校正对照孔：加入100μL对应的细胞培养基，在收集上清前加入10μL 10倍浓度的裂解溶液。
实验孔：向每孔中加入1×104个肿瘤细胞或293T细胞后(体积为50μL)，并加入2.5×105个PBMC(体积为50μL)
(3)设置离心力250g，将96孔板离心4分钟，保证PBMC和靶细胞充分接触。
(4)向每个实验孔中分别加入终浓度为0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL的结合蛋白，其中使用的结合蛋白包括4个改造的结合蛋白(pET22b-aEP3D4-aEP4G2、pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2、pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4和pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc)，3个EpCAM的结合蛋白对照(pET22b-aEP3D4、pET22b-aEP4G2和pcDNA3.1-aEP3D4)以及2个阴性对照结合蛋白(pET22b-aHER2-13C1和pET22b-aVE201)。
(5)将96孔板置于湿润的、37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育检测板4小时。
(6)在放入培养箱孵育3小时15分钟时，向靶细胞最大释放孔加入10μL 10倍浓度的裂解溶液(10×Lysis Solution)已充分裂解靶细胞。
(7)培养4小时后，设置离心力250g，将96孔板离心4分钟。
(8)收集上清液，并每孔取出50μL至新的96孔板。
(9)按照CytoTox 96
Figure BDA0003053337730000091
非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书要求使用AssayBuffer充分溶解底物。
(10)向以上每孔中加入50μL终止液后，1h内检测OD490。
(11)使用公式计算细胞裂解率：％细胞裂解率＝100×(实验孔OD值-效应细胞自发LDH释放孔OD值-靶细胞自发LDH释放孔OD值)/(靶细胞最大LDH释放孔OD值-靶细胞自发释放孔OD值)结果如图3所示，在3种肿瘤细胞中，随着结合蛋白浓度的增加，与阴性对照结合蛋白相比(pET22b-aHER2-13C1)，2个改造的结合蛋白(pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4，pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc)，对于细胞毒性作用逐渐增加；在所有3种肿瘤细胞以及所有3个结合蛋白浓度的实验中，与EpCAM结合蛋白对照pcDNA3.1-aEP3D4相比，pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc对于细胞毒性作用显著增加。2个改造的结合蛋白对293T未产生毒性作用。
实施例10补体依赖的细胞毒性作用(CDC)
(1)使用CytoTox 96
Figure BDA0003053337730000092
Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒，通过检测细胞培养上清液中LDH的释放来检测改造的结合蛋白介导的CDC活性，本实验均使用含20％人血清的培养基以提供补体。
(2)分别设置以下对照孔及实验孔(使用96孔板)：
培养基背景自发LDH释放孔：加入100μL对应的培养基。
靶细胞自发LDH释放孔：向孔中加入1×104个肿瘤细胞或293T细胞(体积为100μL)。
靶细胞最大LDH释放孔：向孔中加入1×104个肿瘤细胞或293T细胞(体积为100μL)，在收集上清前加入10μL 10倍浓度的裂解溶液。
实验孔：向每孔中加入1×104个肿瘤细胞或293T细胞，加入体积为100μL。
(3)向每个实验孔中分别加入终浓度为0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL的抗体蛋白。
(4)后续步骤同以上实施例8的步骤(5)-(10)。
(5)使用以下计算公式计算细胞裂解率：细胞裂解率＝100×(实验组LDH释放孔OD490/靶细胞最大LDH释放孔OD 490)。结果如图4所示，在3种肿瘤细胞中，随着结合蛋白浓度的增加，与阴性对照结合蛋白相比(pET22b-aHER2-13C1)，2个改造的结合蛋白(pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4，pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc)，对于细胞毒性作用逐渐增加；在所有3种肿瘤细胞以及所有3个结合蛋白浓度的实验中，与EpCAM结合蛋白对照pcDNA3.1-aEP3D4相比，pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc对于细胞毒性作用显著增加。2个改造的结合蛋白对293T未产生毒性作用。
实验例11 MTT法检测改造的结合蛋白对人DU145、PC-3和MCF-7细胞增殖能力的影响
(1)96孔细胞培养板中，每孔接种处于对数生长期细胞5000个，加入100μL含10％FBS的培养基(DU145、PC-3细胞使用RPMI-1640培养基；MCF-7细胞使用DMEM培养基)，37℃、5％CO2培养箱培养过夜。
(2)待细胞贴壁后，将每孔中培养基移除，加入100μL含1％FBS的培养基饥饿处理4h。
(3)将旧的培养基移除，采用4个改造的结合蛋白(pET22b-aEP3D4-aEP4G2、pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2、pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4和pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc)，3个EpCAM的结合蛋白对照(pET22b-aEP3D4、pET22b-aEP4G2和pcDNA3.1-aEP3D4)以及2个阴性对照结合蛋白(pET22b-aHER2-13C1和pET22b-aVE201)，在蛋白浓度不同(0、25、50、100μg/mL)的含1％FBS的对应培养基(100μL/孔)中培养DU145、PC-3和MCF-7(37℃，5％CO2培养箱中培养72h)。
(4)去除细胞培养板中培养基，每孔加入100μL无血清的对应培养基和20μL MTT溶液，放置在细胞培养箱中孵育4h。
(5)去除培养液，每孔加入150μL DMSO，将细胞培养板置于摇床快速震荡10min，使沉淀充分溶解。
(6)酶标仪570nm处测量每个孔的吸光值OD。结果如图5所示，与0μg/mL相比，2个改造的结合蛋白(pET22b-aEP3D4-aEP4G2和pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2)均能够显著抑制DU145、PC-3和MCF-7细胞的增殖，并且随着蛋白浓度的增加，抑制作用不断增强；在3种肿瘤细胞中，抗体终浓度为100μg/mL时，与EpCAM结合蛋白对照pET22b-aEP4G2相比，pET22b-aEP3D4-aEP4G2对肿瘤细胞增殖的抑制作用显著增强；在MCF-7细胞中，抗体终浓度为100μg/mL时，与EpCAM结合蛋白对照pET22b-aEP3D4相比，pET22b-aEP3D4-aEP4G2对肿瘤细胞增殖的抑制作用也显著增强。
实施例中所用到的试剂的配置方法如下：
(1)PBS缓冲液(pH＝7.4)：KH2PO4 0.24g、NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O9.07g。
将试剂溶解于800mL去离子水中，调节pH值至7.4，再定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min，室温保存。
(2)PBST溶液：在1L PBS缓冲液中加入1mL吐温-20，充分混匀后可配制成PBST溶液。
(3)LB液体培养基：NaCl 2g、胰蛋白胨2g、酵母提取物1g。
将试剂溶解于200mL去离子水中，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。
(4)LB固体培养基：NaCl 2g、胰蛋白胨2g、酵母提取物1g、琼脂粉4g。
将试剂溶解于200mL去离子水中，121℃高压蒸汽灭菌30min。使用时待培养基冷却至大约60℃，加入氨苄青霉素和葡萄糖，氨苄青霉素的终浓度为100μg/mL，葡萄糖的终浓度为1％，混匀后倒板，4℃保存。
(5)5×SDS-PAGE电泳缓冲液：甘氨酸47g、Tris-碱15.1g、SDS 2.5g。
将试剂溶解于400mL去离子水中，再定容至500mL，使用时稀释成1×SDS-PAGE电泳缓冲液，室温保存。
(6)5×SDS-PAGE上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)1.25mL、甘油2.5mL、溴酚蓝25mg、SDS0.5g。
将试剂定容至5mL，小份(500μL/份)分装，使用前将25μLβ-巯基乙醇加入每小份中，室温保存。
(7)考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-250 1g、异丙醇250mL、乙酸100mL、ddH2O650mL。
将试剂混匀后充分溶解，室温保存。
(8)考马斯亮蓝染色脱色液：乙酸100mL、乙醇50mL、ddH2O850mL。
将溶剂混匀后使用，室温保存。
(9)破菌缓冲液：Tris碱2.42g、NaCl14.6g。
先将试剂混匀后充分溶解，使用前加入适量100×PMSF储液(工作浓度为1×)，-4℃保存。
上样缓冲液：同破菌缓冲液。
洗杂缓冲液：量取9.9mL上样缓冲液，加入2M咪唑100μL，充分混匀，现配现用。
洗脱缓冲液：量取9mL上样缓冲液，加入2M咪唑1mL，充分混匀，现配现用。
(10)氨苄青霉素溶液(100mg/mL)：称取1g氨苄青霉素粉末充分溶解于10mL去离子水中，使用0.2μM的滤器过滤除菌，分装成1mL每管，-20℃保存。
(11)2％BSA-PBS溶液：称取1g牛血清白蛋白粉末溶解于50mL PBS缓冲液中，使用0.2μM的滤器过滤除菌，现配现用或-20℃保存。
(12)胰蛋白酶溶液(1mg/mL)：称取10mg胰蛋白酶粉末溶解于10mL PBS缓冲液中，-20℃保存。
(13)1M硫酸溶液：量取9.8mL浓硫酸缓慢加入187mL去离子水中，充分混匀，室温保存。
(14)10％过硫酸铵(APS)：称取0.1g过硫酸铵粉末溶解于1mL去离子水中，分装成200μL每管，-20℃保存。
(15)IPTG溶液(500mM)：称取IPTG粉末11.915g溶解于100mL去离子水中，使用0.2μM滤器过滤除菌，分装成1mL每管，-20℃保存。
(16)30％甘油水溶液：量取15mL甘油加入35mL去离子水中，充分混匀，使用0.22μM滤器过滤除菌，-4℃保存。
(17)100×PMSF储液：称取1.74g PMSF粉末溶解于100mL异丙醇，-20℃保存。
(18)2M咪唑：称取1.14g咪唑粉末溶解于10mL破菌缓冲液，-4℃保存。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、改造的、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> EpCAM的改造的结合蛋白及其应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 266
<223> pET22b-aEP3D4-aEP4G2改造的结合蛋白的氨基酸序列
Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Lys Phe Ser
20 25 30
Asn His Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Met Gly Arg Gln Ala Arg Val Pro His His Met Arg
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala
130 135 140
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
145 150 155 160
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Asn
165 170 175
Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
180 185 190
Ser Ala Ile Glu Gly Lys Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
195 200 205
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Arg Arg Lys Gly Arg Thr Glu Lys Leu Ser Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
260 265
<210> 2
<211> 396
<223> pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2改造的结合蛋白的氨基酸序列
Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Lys Phe Ser
20 25 30
Asn His Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Met Gly Arg Gln Ala Arg Val Pro His His Met Arg
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
130 135 140
Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
145 150 155 160
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met
165 170 175
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Ser
180 185 190
Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
195 200 205
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
210 215 220
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile
225 230 235 240
Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
275 280 285
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
290 295 300
Tyr Asn Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
305 310 315 320
Trp Val Ser Ala Ile Glu Gly Lys Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
325 330 335
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
340 345 350
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
355 360 365
Tyr Cys Ala Arg Arg Lys Gly Arg Thr Glu Lys Leu Ser Tyr Trp Gly
370 375 380
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
385 390 395
<210> 3
<211> 269
<223> pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4改造的结合蛋白的氨基酸序列
Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Lys Phe Ser
20 25 30
Asn His Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Met Gly Arg Gln Ala Arg Val Pro His His Met Arg
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala
130 135 140
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
145 150 155 160
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Lys Phe Ser Asn His
165 170 175
Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
180 185 190
Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
195 200 205
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Arg Met Gly Arg Gln Ala Arg Val Pro His His Met Arg Phe Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
260 265
<210> 4
<211> 501
<223> pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc改造的结合蛋白的氨基酸序列
Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Lys Phe Ser
20 25 30
Asn His Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Met Gly Arg Gln Ala Arg Val Pro His His Met Arg
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala
130 135 140
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
145 150 155 160
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Lys Phe Ser Asn His
165 170 175
Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
180 185 190
Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
195 200 205
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Arg Met Gly Arg Gln Ala Arg Val Pro His His Met Arg Phe Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Pro Lys
260 265 270
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
275 280 285
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
290 295 300
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
305 310 315 320
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
325 330 335
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
340 345 350
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
355 360 365
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
370 375 380
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
385 390 395 400
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
405 410 415
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
420 425 430
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
435 440 445
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
450 455 460
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
465 470 475 480
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
485 490 495
Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210> 5
<211> 127
<223> pET22b-aEP3D4结合蛋白对照的氨基酸序列
Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Lys Phe Ser
20 25 30
Asn His Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Met Gly Arg Gln Ala Arg Val Pro His His Met Arg
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
115 120 125
<210> 6
<211> 124
<212> PRT
<223> pET22b-aEP4G2结合蛋白对照的氨基酸序列
Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Tyr Asn Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Ala Ile Glu Gly Lys Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Arg Lys Gly Arg Thr Glu Lys Leu Ser Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
115 120
<210> 7
<211> 129
<223> pET22b-aHER2-13C1阴性对照结合蛋白的氨基酸序列
Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Val Ser
20 25 30
Ser Glu Asn Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Gly Ile Leu Ala Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Phe Thr Ser Gly Gln Gly Ser Leu Arg Ser Asp Pro
100 105 110
Ile Arg Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
115 120 125
Ala
<210> 8
<211> 128
<223> pET22b-aVE201阴性对照结合蛋白的氨基酸序列
Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ser Val Ser
20 25 30
Asn Glu Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Ser Ile Thr Asp Gln Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Gly Gln Arg Arg Arg Gln Met His Ser Tyr Lys Val
100 105 110
Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
115 120 125
<210> 9
<211> 798
<223> 编码pET22b-aEP3D4-aEP4G2改造的结合蛋白的核苷酸序列
atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60
cgtctctcct gtgcagcctc cggagttaag tttagcaatc acgatatgac ctgggtccgc 120
caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcagccatta atagcggagg cggtagcaca 180
tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgaga 300
atgggtcgtc aggcgcgtgt tccgcaccac atgcggtttt ggggtcaggg aaccctggtc 360
accgtctcga gcgccgccgc aggtggaggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc 420
ggatcgatgg cccaggtgca gctgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg 480
tccctgcgtc tctcctgtgc agcctccgga tttacgttta gctataacaa tatggcctgg 540
gtccgccagg ctccagggaa gggtctagag tgggtatcag ccattgaggg gaaagacggt 600
agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctcccgtga caattccaag 660
aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg cgtgccgagg acaccgcggt atattattgc 720
gcgagacgta aggggcgtac ggagaagctg tcgtattggg gtcagggaac cctggtcacc 780
gtctcgagcg cggccgca 798
<210> 10
<211> 1188
<223> 编码pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2改造的结合蛋白的核苷酸序列
atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60
cgtctctcct gtgcagcctc cggagttaag tttagcaatc acgatatgac ctgggtccgc 120
caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcagccatta atagcggagg cggtagcaca 180
tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgaga 300
atgggtcgtc aggcgcgtgt tccgcaccac atgcggtttt ggggtcaggg aaccctggtc 360
accgtctcga gcgccgccgc aggtggaggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc 420
ggatcggagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 480
agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttagaagct ttgggatgag ctgggtccgc 540
caggctccag ggaaggggcc tgagtgggtc tcatccatta gtggtagtgg ttccgacaca 600
ctgtacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg 660
ctgtatctgc aaatgaacag cctgagacct gaggacacgg ccgtatatta ctgtaccatt 720
ggtgggtccc tgtccagatc ctcccaggga accctggtca ccgtctcctc aggtggaggc 780
ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc ggatcgatgg cccaggtgca gctgttggag 840
tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg tccctgcgtc tctcctgtgc agcctccgga 900
tttacgttta gctataacaa tatggcctgg gtccgccagg ctccagggaa gggtctagag 960
tgggtatcag ccattgaggg gaaagacggt agcacatact acgcagactc cgtgaagggc 1020
cggttcacca tctcccgtga caattccaag aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg 1080
cgtgccgagg acaccgcggt atattattgc gcgagacgta aggggcgtac ggagaagctg 1140
tcgtattggg gtcagggaac cctggtcacc gtctcgagcg ccgccgca 1188
<210> 11
<211> 807
<223> 编码pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4改造的结合蛋白的核苷酸序列
atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60
cgtctctcct gtgcagcctc cggagttaag tttagcaatc acgatatgac ctgggtccgc 120
caggctccag ggaagggtct ggagtgggta tcagccatta atagcggagg cggtagcaca 180
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accgtctcca gcgcggccgc aggtggaggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc 420
ggatcgatgg cccaggtgca gctgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg 480
tccctgcgtc tctcctgtgc agcctccgga gttaagttta gcaatcacga tatgacctgg 540
gtccgccagg ctccagggaa gggtctggag tgggtatcag ccattaatag cggaggcggt 600
agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctcccgtga caattccaag 660
aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg cgtgccgagg acaccgcggt atattattgc 720
gcgagaatgg gtcgtcaggc gcgtgttccg caccacatgc ggttttgggg tcagggaacc 780
ctggtcaccg tctccagcgc ggccgca 807
<210> 12
<211> 1503
<223> 编码pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc改造的结合蛋白的核苷酸序列
atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60
cgtctctcct gtgcagcctc cggagttaag tttagcaatc acgatatgac ctgggtccgc 120
caggctccag ggaagggtct ggagtgggta tcagccatta atagcggagg cggtagcaca 180
tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgaga 300
atgggtcgtc aggcgcgtgt tccgcaccac atgcggtttt ggggtcaggg aaccctggtc 360
accgtctcca gcgcggccgc aggtggaggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc 420
ggatcgatgg cccaggtgca gctgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg 480
tccctgcgtc tctcctgtgc agcctccgga gttaagttta gcaatcacga tatgacctgg 540
gtccgccagg ctccagggaa gggtctggag tgggtatcag ccattaatag cggaggcggt 600
agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctcccgtga caattccaag 660
aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg cgtgccgagg acaccgcggt atattattgc 720
gcgagaatgg gtcgtcaggc gcgtgttccg caccacatgc ggttttgggg tcagggaacc 780
ctggtcaccg tctccagcgc ggccgcagag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 840
ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 900
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 960
agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 1020
gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 1080
accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1140
gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1200
caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1260
tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1320
ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1380
tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1440
gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1500
aaa 1503
<210> 13
<211> 381
<223> 编码pET22b-aEP3D4结合蛋白对照的核苷酸序列
atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60
cgtctctcct gtgcagcctc cggagttaag tttagcaatc acgatatgac ctgggtccgc 120
caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcagccatta atagcggagg cggtagcaca 180
tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgaga 300
atgggtcgtc aggcgcgtgt tccgcaccac atgcggtttt ggggtcaggg aaccctggtc 360
accgtctcga gcgcggccgc a 381
<210> 14
<211> 372
<223> 编码pET22b-aEP4G2结合蛋白对照的核苷酸序列
atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60
cgtctctcct gtgcagcctc cggatttacg tttagctata acaatatggc ctgggtccgc 120
caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcagccattg aggggaaaga cggtagcaca 180
tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgaga 300
cgtaaggggc gtacggagaa gctgtcgtat tggggtcagg gaaccctggt caccgtctcg 360
agcgcggccg ca 372
<210> 15
<211> 387
<223> 编码pET22b-aHER2-13C1阴性对照结合蛋白的核苷酸序列
atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60
cgtctctcct gtgcagcctc cggatatagc gttagctctg agaatatggg ctgggtccgc 120
caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaggcattt tggcgggaga cggtagcaca 180
tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgaga 300
tttacgtcgg gtcaggggtc gttgcggtcc gaccccatcc ggtcttgggg tcagggaacc 360
ctggtcaccg tctcgagcgc ggccgca 387
<210> 16
<211> 384
<223> 编码pET22b-aVE201阴性对照结合蛋白的核苷酸序列
atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60
cgtctctcct gtgcagcctc cggagttagc gttagcaatg aggctatggg ctgggtccgc 120
caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaagcatta ctgaccaaag cggtagcaca 180
tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgaga 300
gggcagcgtc gtaggcagat gcattcgtac aaggtcagct cttggggtca gggaaccctg 360
gtcaccgtct cgagcgcggc cgca 384
<210> 17
<211> 115
<223> anti-HSA蛋白的氨基酸序列
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 232
<223> hinge-Fc片段的氨基酸序列
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230

Claims (8)

1.一种EpCAM的改造的结合蛋白，其特征在于：所述的EpCAM的改造的结合蛋白是名称为pET22b-aEP3D4-aEP4G2的改造的结合蛋白、名称为pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2的改造的结合蛋白、名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4的改造的结合蛋白和名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc的改造的结合蛋白中的至少一种；
所述的名称为pET22b-aEP3D4-aEP4G2的改造的结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的名称为pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2的改造的结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4的改造的结合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；
所述的名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc的改造的结合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
2.权利要求1所述的改造的EpCAM的结合蛋白的编码核苷酸序列，其特征在于：所述的核苷酸序列是编码所述的名称为pET22b-aEP3D4-aEP4G2的改造的结合蛋白的核苷酸序列、或是编码所述的名称为pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2的改造的结合蛋白的核苷酸序列、编码所述的名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4的改造的结合蛋白的核苷酸序列和编码所述的名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc的改造的结合蛋白的核苷酸序列中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的EpCAM的改造的结合蛋白的核苷酸序列，其特征在于：
编码所述的名称为pET22b-aEP3D4-aEP4G2的改造的结合蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；
编码所述的名称为pET22b-aEP3D4-anti-HSA-aEP4G2改造的结合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
编码所述的名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4改造的结合蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示；
编码所述的名称为pcDNA3.1-aEP3D4-aEP3D4-Fc改造的结合蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.12所示。
4.权利要求1所述的EpCAM的改造的结合蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：通过基因合成方法合成权利要求1所述的EpCAM的改造的结合蛋白的编码核苷酸序列，将其克隆至表达载体，再将重组后的表达载体转入宿主细胞进行表达、纯化，得到所述的EpCAM的改造的结合蛋白，或是通过蛋白合成的方法，得到所述的EpCAM的改造的结合蛋白。
5.权利要求1所述的EpCAM的改造的结合蛋白在制备用于治疗EpCAM高表达为特征疾病的抗体药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的EpCAM的改造的结合蛋白在用于制备治疗EpCAM高表达为特征疾病的抗体药物中的应用，其特征在于：所述的EpCAM高表达为特征疾病是癌症。
7.根据权利要求6所述的EpCAM的改造的结合蛋白在制备用于治疗EpCAM高表达为特征疾病的抗体药物中的应用，其特征在于：所述的癌症为EpCAM高表达肿瘤。
8.根据权利要求7所述的EpCAM的改造的结合蛋白在制备用于治疗EpCAM高表达为特征疾病的抗体药物中的应用，其特征在于：所述的EpCAM高表达肿瘤包括胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、食管癌、鼻咽癌、头颈癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌、卵巢瘤、宫颈癌、子宫癌、肝癌、脾脏癌、肾脏癌和脑肿瘤。
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