CN114395046B - 一种抗pd-1的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗PD‑1的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用，涉及生物医药技术领域。本发明所述抗PD‑1纳米抗体和重组纳米抗体，可以特异性识别并结合PD‑1抗原，从而阻断PD‑1/PD‑L1的结合，具有体外肿瘤细胞杀伤作用，杀伤强度与作用时间和效靶比及药物浓度有关，同时还具有体内抗肿瘤作用。

Description

一种抗PD-1的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、 重组菌株和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗PD-1的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用。
背景技术
程序性细胞死亡蛋白质-1(programmed cell deathprotein 1，PD-1)是一种重要的免疫抑制分子，属于免疫球蛋白超家族CD28，由人细胞程序性死亡蛋白1基因编码，主要表达在活化T细胞、B细胞和自然杀伤细胞表面，通过与其配体PD-L1相互作用使T细胞活性下调和诱导抗原耐受从而终止或抑制免疫应答，利用PD-1抗体可阻断PD-1/PD-L1信号通路，从而解除T细胞抑制，杀伤肿瘤细胞。
目前使用靶向PD-1/PD-L1的特异性单克隆抗体治疗性地阻断肿瘤细胞与T淋巴细胞表面受体相结合，利用单一或联合疗法激活宿主自身免疫系统，通过T细胞介导的免疫应答清除肿瘤细胞在非小细胞肺癌、肾细胞癌、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、尿路上皮细胞癌以及难治性霍奇金淋巴瘤等肿瘤治疗中已经取得可观的成绩。基于对癌症治疗的有效性，美国食品药品管理局(FDA)和欧洲药品管理局对几种免疫检查点抑制剂进行了快速的批准，先后有6种PD-1/PD-L1单抗先后上市。2018年底PD-1抑制剂Nivolumab(纳武利尤单抗)和Pembrolizumab(帕博利珠单抗)获批在中国上市。但上述单抗存在组织渗透性弱、免疫原性较强和成本高的缺陷。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗PD-1的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用，所述抗PD-1的纳米抗体和重组纳米抗体能够稳定表达，并能够特异性识别PD-1抗原，表现出强大的体外和体内抗肿瘤作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种抗PD-1纳米抗体，所述抗PD-1纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
本发明还提供了一种编码上述抗PD-1纳米抗体的核酸，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种抗PD-1的重组纳米抗体，所述重组纳米抗体的结构包括上述抗PD-1纳米抗体和人IgG Fc段。
优选的，所述抗PD-1纳米抗体和人IgG Fc段通过连接肽连接。
优选的，编码所述连接肽的基因核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
本发明还提供了编码上述重组纳米抗体的融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
本发明还提供了一种包含上述融合基因的重组表达载体，所述重组表达载体的基础载体包括原核表达载体。
本发明还提供了一种表达上述重组纳米抗体的重组菌株，所述重组菌株的基础菌包括大肠杆菌。
本发明还提供了上述抗PD-1纳米抗体、上述重组纳米抗体或利用上述重组菌株生产得到的重组纳米抗体在制备抗肿瘤药物或肿瘤诊断试剂中的应用。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述药物以上述抗PD-1纳米抗体、上述重组纳米抗体或利用上述重组菌株生产得到的重组纳米抗体为有效成分。
有益效果：本发明提供了一种驼源的抗PD-1纳米抗体，可以特异性识别并结合PD-1抗原，从而阻断PD-1/PD-L1的结合。本发明实施例中，利用所述重组纳米抗体与PD-1蛋白结合，测得重组纳米抗体的亲和力可达到3.88nM。利用细胞模型和动物模型实验，分别证实了所述重组纳米抗体具有体外肿瘤细胞杀伤作用，杀伤强度与作用时间和效靶比及药物浓度有关，同时还具有体内抗肿瘤作用。
附图说明
图1为纳米抗体的第一轮DNA电泳图，最右侧泳道为1000bp的Marker(条带大小依次为：1000、700、500、400、300、200、100bp)；
图2为纳米抗体的第二轮DNA电泳图，最左侧为1000bp的Marker；
图3为用噬菌体的酶联免疫方法(phage-ELISA)筛选特异性单个阳性克隆的模式图：其中1是将PD-1抗原包被在酶标板上，2是噬菌体上清，3是鼠抗km13107抗体，4是山羊抗鼠IgG(AP)的抗体，5是TMB显色液；
图4为纯化的重组纳米抗体，其中，左图为纯化的重组纳米抗体的SDS-PAGE电泳染色图(M：蛋白质分子质量标准，1：破碎后处理蛋白，2：流出蛋白，3-5：洗脱纯化后的重组纳米抗体)；右图为纯化的重组纳米抗体的westernblot图(M：蛋白质分子质量标准1：纯化后重组纳米抗体)；
图5为PD-1抗原及人活化T细胞的全蛋白western blot(M：蛋白质分子质量标准，1：人活化T细胞全蛋白，2：293T细胞全蛋白，3：PD-1抗原)；
图6为重组纳米抗体与PD-1蛋白亲和力测定结果；
图7为共培养24h时RKO细胞杀伤作用情况；
图8为共培养48h时RKO细胞杀伤作用情况；
图9为共培养72h时RKO细胞杀伤作用情况；
图10为皮下注射肿瘤细胞后第9天、18天、27天小动物活体成像情况；
图11为肿瘤大小变化。
具体实施方式
本发明提供了一种抗PD-1纳米抗体，所述抗PD-1纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示：QVQLQELGETRCRHGGSLRLSCKVSGYTQRSYCLGWLRQAPGNEREAVAVLQHSGNFRHYADSVQGRFVISQDYTDNTVYLAMNNLKSEDAAMYYCAAALGTCVGLRVSQFNYWGQGTQVTVSS。
本发明所述抗PD-1纳米抗体来源于骆驼，且所述抗PD-1的纳米抗体优选包括框架区FR和抗原决定簇互补区CDR，其中所述框架区FR优选包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述抗原决定簇互补区CDR优选包括CDR1、CDR2和CDR3，具体序列如表1所示。
表1抗PD-1的纳米抗体的组成序列
Figure BDA0003461890500000031
Figure BDA0003461890500000041
本发明对所述抗PD-1的纳米抗体的筛选方法并没有特殊限定，优选利用噬菌体表面展示技术构建天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库，然后以生物素化的PD-1抗原为基础进行筛选，获得PD-1特异性的纳米抗体基因序列。本发明所述抗PD-1的纳米抗体可特异性的识别并结合PD-1，并表现出体外和体内抗肿瘤效果。
本发明还提供了一种编码上述抗PD-1纳米抗体的核酸，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：caggtccaactgcaggagctgggggagactcggtgcaggcacggagggtctctgagactctcctgcaaagtctctggatatacccagagatcgtactgcctgggctggctccgccaggctccaggcaacgagcgcgaggcggtggcagttctacaacatagtggcaatttccgtcactatgccgactccgtgcagggccgattcgtcatctcccaagactacaccgacaataccgtgtatctggccatgaacaacctgaaatctgaggacgctgccatgtactattgtgcggctgcgttgggcacctgtgtcggtcttagggtgtctcagtttaactattggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca。
本发明还提供了一种抗PD-1的重组纳米抗体，所述重组纳米抗体的结构包括上述抗PD-1纳米抗体和人IgG Fc段。
本发明所述抗PD-1纳米抗体和人IgG Fc段优选通过连接肽连接，编码所述连接肽的基因核苷酸序列优选如SEQ ID No.4所示：GGTGGTGGTGGTAGT。
在本发明中，编码所述人IgG Fc段的基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.24所示：GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGGGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。
本发明利用上述抗PD-1纳米抗体和人IgG Fc段通过连接肽进行连接，得到所述重组抗体，所述重组抗体的氨基酸序列优选如SEQ ID No.3所示：QVQLQELGETRCRHGGSLRLSCKVSGYTQRSYCLGWLRQAPGNEREAVAVLQHSGNFRHYADSVQGRFVISQDYTDNTVYLAMNNLKSEDAAMYYCAAALGTCVGLRVSQFNYWGQGTQVTVSSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPGVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
本发明还提供了编码上述重组纳米抗体的融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示：CAGGTCCAACTGCAGGAGCTGGGGGAGACTCGGTGCAGGCACGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGCAAAGTCTCTGGATATACCCAGAGATCGTACTGCCTGGGCTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGCAACGAGCGCGAGGCGGTGGCAGTTCTACAACATAGTGGCAATTTCCGTCACTATGCCGACTCCGTGCAGGGCCGATTCGTCATCTCCCAAGACTACACCGACAATACCGTGTATCTGGCCATGAACAACCTGAAATCTGAGGACGCTGCCATGTACTATTGTGCGGCTGCGTTGGGCACCTGTGTCGGTCTTAGGGTGTCTCAGTTTAACTATTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTAGTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGGGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。
本发明对所述融合基因的制备方法并没有特殊限定，可通过人工合成的方法进行制备，实施例中基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基合成目标基因。
本发明还提供了一种包含上述融合基因的重组表达载体，所述重组表达载体的基础载体包括原核表达载体。
本发明所述原核表达载体优选包括pCZN1。在本发明实施例中，优选将上述SEQ IDNo.5所示的核苷酸序列插入所述pCZN1质粒载体的NdeI和XbaI位点之间。本发明对所述重组表达载体的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的重组载体制备方法即可。
本发明还提供了一种表达上述重组纳米抗体的重组菌株，所述重组菌株的基础菌包括大肠杆菌。
本发明所述大肠杆菌优选包括大肠杆菌Arctic Express。本发明优选通过将上述重组表达载体转入所述大肠杆菌Arctic Express中获得所述重组菌株。本发明对所述转入的方法并没有特殊限定，采用本领域常规的转化方法即可。
本发明还提供了利用所述重组菌株生产所述重组纳米抗体的方法，优选包括将上述重组菌株接种于含有Amp的LB培养基中，摇床培养至菌体OD600为0.6～0.8时，利用IPTG诱导所述重组纳米抗体的表达。本发明所述方法可稳定表达所述重组纳米抗体。
本发明还提供了上述抗PD-1纳米抗体、上述重组纳米抗体或利用上述重组菌株生产得到的重组纳米抗体在制备抗肿瘤药物或肿瘤诊断试剂中的应用。
本发明所述重组纳米抗体可与人活化T细胞上PD-1受体特异性结合，阻断PD-1/PD-L1信号通路从而解除肿瘤细胞对T细胞的抑制作用，增强T细胞活化、增殖，从而发挥杀伤肿瘤细胞的作用。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述药物以上述抗PD-1纳米抗体、上述重组纳米抗体或利用上述重组菌株生产得到的重组纳米抗体为有效成分。
下面结合实施例对本发明提供的一种抗PD-1的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
针对于天然驼源纳米抗体基因库的构建：
(1)Trizol法提取骆驼脾脏组织总RNA，利用TIANGEN公司提供的RNA纯化试剂盒纯化，按照Thermo Scientific ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kits试剂盒反转录得到cDNA。
(2)以cDNA为模板，用巢式PCR扩增得到重链抗体的可变区片段；
①第一轮PCR：
上游引物：5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAAG-3’(SEQ ID No.20)
下游引物：5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’(SEQ ID No.21)
第一轮PCR的20μl反应体系：cDNA 2μl、Mix 10μl、上游引物1μl、下游引物1μl和余量的ddH2O。
第一轮PCR扩增反应条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，32个循环；72℃10min。
扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，结果显示该片段的大小约为700bp，即纳米抗体基因电泳条带约为700bp(图1)。
②第二轮PCR：
以第一轮PCR产物为模板，重新设计引物，进行第二轮PCR
上游引物：
5'-TCGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTCCAACTGCAGGAGTCTGGGG-3'(SEQ ID No.22)
下游引物：
5'-ATAAGAATGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCCCC-3'(SEQ ID No.23)
第二轮PCR反应体系(50μl)：第一轮PCR产物2μl、Mix 25μl、上游引物1μl、下游引物1μl和余量的ddH2O。
第二轮PCR扩增反应条件为：94℃5min；94℃40s，55℃40s，72℃40s，25个循环；72℃10min。扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段(长片段和短片段)结果显示该片段的大小约为400bp，即纳米抗体基因电泳条带约为400bp(图2)。
使用限制性内切酶(购自Takara公司)SifI和Not I酶切pcantab5e噬菌体载体及VHH片段(纳米抗体片段)，并用T4 DNA连接酶(购自Takara公司)连接两个片段。
将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1中，构建天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库，经辅助噬菌体救援后，其库容量达9.0×1013。
其中辅助噬菌体救援步骤如下：
①取100μL的文库，接种于50ml的2×YT/Amp/Glu培养基中，37℃，200rpm，震荡培养至对数期OD600为0.4～0.5。
②向培养液中加入感染复数为20:1的辅助噬菌体M13KO7，混匀后37℃静置30min。
③将培养液在室温，9000rpm，离心10min，弃上清沉淀菌体，用200mL的2×YT/Amp/Kana培养液重悬，37℃200rpm，培养过夜。
④将培养液于4℃，9000rpm，离心10min取上清，加入1/5体积的PEG/NaCl，4℃静置6h。
⑤9000rpm离心20min弃上清，用PBS(1mL)重悬沉淀，得到重组噬菌体抗体库，分装到1.5ml Ep管中，4℃保存。
与此同时，通过菌落PCR检测文库的插入率，引物使用第二轮PCR引物，退火温度55℃，结果显示插入率达到95％以上(目的片段插入率＝含目的片段的菌落数/所有菌落数)。
针对抗PD-1纳米抗体的筛选过程：
将噬菌体文库(1×1012个噬菌体)与50μl链霉亲和素磁珠在转动台上室温孵育1h后，收集噬菌体抗体；在2个已用2％PBSM封闭过的1ml离心管中，分别加入500μl预先削减的噬菌体抗体，再向一个离心管中加入500μl用PBS稀释的5μg生物素化的PD-1抗原，另一个离心管中加入500μl的PBS缓冲液作为阴性对照，在转动台上室温孵育1h，后加入预先封闭的50μl的链霉亲和素磁珠，在转动台上室温孵育30min，收集磁珠。用PBST洗涤磁珠7次，PBSM洗涤2次，PBS洗涤1次。加入pH2.7的Glycine进行洗脱，pH9.1的1mol/L Tris-HCl进行中和。将上述中和液加入到5ml处于对数生长期的TG1(OD为0.5)中，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，经过4轮筛选，阳性克隆将不断得到富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛选抗体库中PD-1特异性抗体的目的。
噬菌体的酶联免疫方法(phage-ELISA)筛选特异性单个阳性克隆：
筛选原理模式图如图3所示，具体方法如下：
首先制备VHH噬菌体单克隆上清：从3～4轮筛选后的固体平板上，各挑取90个单个菌落并接种于含有100μg/ml的氨苄青霉素及2％的葡萄糖的2×YT培养基中，220rpm 37℃培养过夜，次日取50μl菌液至新的96深孔板中，每孔加入800μl含有100μg/ml的氨苄青霉素及2％的葡萄糖的2×YT培养基，生长至对数期后，加入感染复数为20:1的辅助噬菌体M13K07，37℃侵染30min，10000rpm离心5min，弃上清，用800μl含有100ug/ml的氨苄青霉素及50ug/ml的卡那青霉素的新鲜2×YT培养基重悬菌体，37℃，220rpm培养12h，次日，将菌液10000rpm，离心5min，其上清即为VHH噬菌体单克隆上清。
用包被液将PD-1抗原稀释至10μg/ml，每孔加入100μl，4℃包被过夜，并设立阴性和阳性对照。次日，用PBST洗涤三次，用2％PBSM于37℃封闭2h，用PBST洗涤三次，加入200μl预处理的VHH噬菌体单克隆上清，37℃孵育1h。加入1:5000的用0.1％的PBST稀释的鼠源性抗M13KO7/HRP的二抗，37℃孵育1h，洗去未结合的抗体，加入TMB显色液，于酶标仪上在450nm波长处读取吸光度值。当样品孔OD值大于对照孔OD两倍以上时判定为阳性对照孔，取阳性菌液进行基因测序。
使用DNAMAN软件进行序列分析及blast比对，把CDR1、CDR2、CDR3序列相同的菌株视为同一克隆株。最终采用氨基酸序列SEQ ID No.1所示的纳米抗体序列做后续实验。
实施例2
重组纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中的表达及纯化：
(1)将测序分析所获得的的纳米抗体序列(SEQ ID No.1)连接人源性IgG Fc段并亚克隆pCZN1质粒载体中，并转化至大肠杆菌Arctic Express，挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/mL Amp的3mL LB培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜；(2)次日按1:100接种于50μg/mL Amp的30mL LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mM，20℃220rpm振摇过夜，诱导融合蛋白表达；(3)收集菌体并进行超声破碎，得到包涵体蛋白粗体液，后经Ni柱亲和纯化得到融合蛋白。图4是纯化的重组纳米抗体，其中左图为纯化的重组纳米抗体的SDS-PAGE电泳染色图：其中泳道1为蛋白分子标准，泳道3-5是纯化的重组纳米抗体；右图为纯化的重组纳米抗体的western blot图：其中泳道1为蛋白分子标准，泳道2是纯化的重组纳米抗体(其中一抗用鼠源his-tag标签抗体，二抗为羊抗鼠IgG/HRP)。
实施例3
重组纳米抗体的特异性验证：
将PD-1抗原及经CD3/CD28活化的人CD3+T细胞的全蛋白做western blot(其中一抗用实施例2得到的纯化的重组纳米抗体，二抗为抗人IgG Fc/HRP)。图5为T细胞的全蛋白、PD-1表达阴性的293T细胞全蛋白及PD-1抗原的western blot图：其中泳道1是蛋白分子标准，泳道2是T细胞的全蛋白，泳道3是PD-1抗原。由此说明，说明本发明提供的重组纳米抗体可以特异性识别PD-1抗原。
实施例4
重组纳米抗体与PD-1蛋白亲和力检测：
采用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技术检测本发明重组纳米抗体与PD-1蛋白亲和力。将重组纳米抗体从浓度100nM起始2倍倍比稀释至0.391nM。将稀释后的重组纳米抗体以30μL/min的流速注入到实验通道与参比通道，结合时间为120s，解离时间为300s。结合解离步骤均在运行试剂中进行。每一个浓度分析后，芯片需要用3M氯化镁以20μL/min的流速冲洗30s。使用Biacore 8K分析软件Biacore Insight EvaluationSoftware计算抗体的KD值。检测结果如图6所示，重组纳米抗体的亲和力可达到3.88nM。
实施例5
重组纳米抗体的体外肿瘤细胞杀伤作用验证：
为进行杀伤功能检测，采用含有萤火虫荧光素酶基因的慢病毒侵染高表达PD-L1蛋白的RKO细胞，嘌呤霉素筛选法筛选出稳定表达萤火虫荧光素酶的RKO细胞用于体外肿瘤杀伤功能试验。将RKO细胞与人单个核细胞(PBMC)共培养，加入不同浓度的重组纳米抗体，抗PD-1单抗组为阳性对照组，无关纳米抗体组为同型对照组，PBMC组为对照组，设置不同效靶比(E:T)，分别作用24h，48h，72h，检测共培养96孔板孔内荧光强度，杀伤率计算公式：[1-(实验孔荧光强度÷RKO细胞孔荧光强度)×100％]。图7～9为不同作用时间下RKO细胞杀伤作用情况。图7显示，共培养24小时，E:T为40：1时，3个浓度的重组纳米抗体组杀伤作用较对照组均明显增强(P<0.05)，最高可达到60％；E:T为20:1和10:1时，中、高浓度重组纳米抗体组较对照组杀伤作用增强(P<0.05)；而E:T为5:1时，各浓度的重组纳米抗体组与对照组相比无差异。图8显示，共培养48小时，E:T为40：1和20:1时，3个浓度的重组纳米抗体组杀伤作用较对照组均明显增强(P<0.05)；E:T为10:1和5:1时，仅高浓度重组纳米抗体组杀伤作用较对照组增强(P<0.05)。图9显示，共培养48小时，E:T为40：1和20:1时，3个浓度的重组纳米抗体组杀伤作用较对照组均明显增强(P<0.05)；E:T为10:1时，高浓度重组纳米抗体组杀伤作用较对照组增强(P<0.05)；E:T为5:1时，中、高浓度组重组纳米抗体杀伤作用较对照组增强(P<0.05)。综上，本发明重组纳米抗体具有体外肿瘤细胞杀伤作用，杀伤强度与作用时间和效靶比及药物浓度有关。
实施例6
重组纳米抗体的体内肿瘤细胞杀伤作用验证：
应用人结直肠细胞癌异种移植动物模型进行重组纳米抗体体内抗肿瘤作用研究。选取6-8周龄大雌性SCID-NOD小鼠，按2:1比例混合RKO细胞与人PBMC，于小鼠右侧腹皮下注射。设空白对照组(仅注射RKO细胞)，重组纳米抗体治疗组(设5mg/kg，3mg/kg，1mg/kg浓度)，无关纳米抗体组及抗PD-1单克隆抗体组(3mg/kg)。每隔3天测量小鼠肿瘤大小变化，每9天进行小动物活体成像评估肿瘤变化。第28天麻醉后颈椎脱臼法处死小鼠，剥离肿瘤体外观察。图10为皮下注射肿瘤细胞后第9天、18天、27天小动物活体成像情况。图11为肿瘤大小变化。
实验结果显示，与未治疗组相比，PBMC组、不同浓度的重组纳米抗体治疗组及无关抗体组小鼠肿瘤体积较小(P<0.01)；PBMC组与无关抗体组相比肿瘤大小无变化，提示本发明中合成抗体的Fc段不发挥作用；中、高剂量重组纳米抗体治疗组肿瘤体积较PBMC组小，高剂量重组纳米抗体组肿瘤大小与抗PD-1单克隆抗体组无明显差异。综上，重组纳米抗体具有体内抗肿瘤作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁夏医科大学
广东医科大学
<120> 一种抗PD-1的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Leu Gly Glu Thr Arg Cys Arg His Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Gln Arg Ser Tyr
20 25 30
Cys Leu Gly Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ala Val Leu Gln His Ser Gly Asn Phe Arg His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Val Ile Ser Gln Asp Tyr Thr Asp Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Ala Met Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Ala Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Gly Thr Cys Val Gly Leu Arg Val Ser Gln Phe Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggtccaac tgcaggagct gggggagact cggtgcaggc acggagggtc tctgagactc 60
tcctgcaaag tctctggata tacccagaga tcgtactgcc tgggctggct ccgccaggct 120
ccaggcaacg agcgcgaggc ggtggcagtt ctacaacata gtggcaattt ccgtcactat 180
gccgactccg tgcagggccg attcgtcatc tcccaagact acaccgacaa taccgtgtat 240
ctggccatga acaacctgaa atctgaggac gctgccatgt actattgtgc ggctgcgttg 300
ggcacctgtg tcggtcttag ggtgtctcag tttaactatt ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 3
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Glu Leu Gly Glu Thr Arg Cys Arg His Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Gln Arg Ser Tyr
20 25 30
Cys Leu Gly Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ala Val Leu Gln His Ser Gly Asn Phe Arg His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Val Ile Ser Gln Asp Tyr Thr Asp Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Ala Met Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Ala Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Gly Thr Cys Val Gly Leu Arg Val Ser Gln Phe Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
130 135 140
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
145 150 155 160
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Gly Val Thr Cys Val
165 170 175
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
180 185 190
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
195 200 205
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
210 215 220
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
225 230 235 240
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
245 250 255
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
260 265 270
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
275 280 285
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
290 295 300
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
305 310 315 320
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
325 330 335
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
340 345 350
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtggtggtg gtagt 15
<210> 5
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caggtccaac tgcaggagct gggggagact cggtgcaggc acggagggtc tctgagactc 60
tcctgcaaag tctctggata tacccagaga tcgtactgcc tgggctggct ccgccaggct 120
ccaggcaacg agcgcgaggc ggtggcagtt ctacaacata gtggcaattt ccgtcactat 180
gccgactccg tgcagggccg attcgtcatc tcccaagact acaccgacaa taccgtgtat 240
ctggccatga acaacctgaa atctgaggac gctgccatgt actattgtgc ggctgcgttg 300
ggcacctgtg tcggtcttag ggtgtctcag tttaactatt ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct caggtggtgg tggtagtgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 420
ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 480
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctggggtca catgcgtggt ggtggacgtg 540
agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 600
gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 660
accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 720
gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 780
caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 840
tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 900
ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 960
tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1020
gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1080
aaa 1083
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Glu Leu Gly Glu Thr Arg Cys Arg His Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Val Ser
20 25
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Arg Glu Ala Val Ala Val
1 5 10 15
<210> 8
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Arg His Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Val Ile Ser Gln Asp
1 5 10 15
Tyr Thr Asp Asn Thr Val Tyr Leu Ala Met Asn Asn Leu Lys Ser Glu
20 25 30
Asp Ala Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caggtccaac tgcaggagct gggggagact cggtgcaggc acggagggtc tctgagactc 60
tcctgcaaag tctct 75
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggctccgcc aggctccagg caacgagcgc gaggcggtgg cagtt 45
<210> 12
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgtcactatg ccgactccgt gcagggccga ttcgtcatct cccaagacta caccgacaat 60
accgt 65
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc tca 33
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gly Tyr Thr Gln Arg Ser Tyr Cys Leu Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Leu Gln His Ser Gly Asn Phe
1 5
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Ala Ala Ala Leu Gly Thr Cys Val Gly Leu Arg Val Ser Gln Phe Asn
1 5 10 15
Tyr
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggatataccc agagatcgta ctgcctgggc 30
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctacaacata gtggcaattt c 21
<210> 19
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcggctgcgt tgggcacctg tgtcggtctt agggtgtctc agtttaacta t 51
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtcctggctg ctcttctaca aag 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 22
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcgcggccca gccggcccag gtccaactgc aggagtctgg gg 42
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ataagaatgc ggccgctgag gagacggtga cctgggtccc c 41

Claims (10)

1.一种抗PD-1纳米抗体，所述抗PD-1纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种编码权利要求1所述抗PD-1纳米抗体的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种抗PD-1的重组纳米抗体，其特征在于，所述重组纳米抗体的结构包括权利要求1所述抗PD-1纳米抗体和人IgG Fc段。
4.根据权利要求3所述重组纳米抗体，其特征在于，所述抗PD-1纳米抗体和人IgG Fc段通过连接肽连接。
5.根据权利要求4所述重组纳米抗体，其特征在于，编码所述连接肽的基因核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
6.编码权利要求3～5任一项所述重组纳米抗体的融合基因，其特征在于，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
7.一种包含权利要求6所述融合基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的基础载体包括原核表达载体。
8.一种表达权利要求3～5任一项所述重组纳米抗体的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的基础菌包括大肠杆菌。
9.权利要求1所述抗PD-1纳米抗体、权利要求3～5任一项所述重组纳米抗体或利用权利要求8所述重组菌株生产得到的重组纳米抗体在制备抗肿瘤药物或肿瘤诊断试剂中的应用。
10.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述药物以权利要求1所述抗PD-1纳米抗体、权利要求3～5任一项所述重组纳米抗体或利用权利要求8所述重组菌株生产得到的重组纳米抗体为有效成分。
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