TW202309086A - 雙特異性ｐｄ—１和ｔｉｇｉｔ結合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本揭露關於結合蛋白，包括抗體，該等結合蛋白結合計劃性死亡-1（「PD-1」）和具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體（「TIGIT」）。本揭露還提供了包含這種結合蛋白的組成物和編碼這種結合蛋白的核酸分子。本揭露進一步關於使用這種結合蛋白治療障礙或病症之方法。

Description

雙特異性PD-1和TIGIT結合蛋白及其用途
本揭露關於結合蛋白，包括抗體，該等結合蛋白特異性結合計劃性死亡-1（「PD-1」）和具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體（「TIGIT」）。本揭露還提供了包含這種結合蛋白的組成物和編碼這種結合蛋白的核酸分子。本揭露進一步關於使用這種結合蛋白治療障礙或病症之方法。
計劃性死亡-1（「PD-1」）係大約31 kD I型膜蛋白，該膜蛋白係T細胞調節子的擴展的CD28/CTLA4家族的成員（參見Ishida等人「Induced Expression of PD-1, A Novel Member of the Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death [計劃性細胞死亡誘導的PD-1（免疫球蛋白基因超家族的新成員）的表現]」 EMBO J.[歐洲分子生物學組織雜誌] 11: 3887-95 (1992)）。PD-1在活化的T細胞、B細胞和單核細胞上表現，並且在自然殺傷（NK）T細胞中以低水平表現。PD-1係用於腫瘤學中免疫介導療法的經充分驗證的靶點。拮抗性抑制PD-1/PD-L1相互作用增加T細胞活化，從而增強宿主免疫系統對腫瘤細胞之識別和消除。
TIGIT（也稱為具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體）係存在於一些T細胞和自然殺手細胞（NK）上的免疫受體。TIGIT由免疫細胞上調，該等免疫細胞包括活化的T細胞、自然殺手細胞和調節性T細胞。
本文提供特異性結合PD-1和TIGIT的雙特異性結合蛋白，該雙特異性結合蛋白包含：a) 特異性結合PD-1的第一結合結構域，其中該第一結合結構域包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3；以及b) 特異性結合TIGIT的第二結合結構域，其中該第二結合結構域包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的LCDR3。
本文還提供了治療患有腫瘤的受試者之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的本文所揭露的雙特異性結合蛋白。本文還提供了在受試者中治療或預防癌症之方法，該方法包括投與本文所揭露的雙特異性結合蛋白。
相關申請的交叉引用
本申請要求2021年4月30日提交的美國臨時專利申請案號63/182,156之優先權，將其內容藉由引用併入本文。 以電子方式提交的材料藉由引用而併入
藉由引用以其全文併入本文的電腦可讀的核苷酸/胺基酸序列表，該序列表在此同時提交，並確定如下：名為「TIGIT-101-WO-PCT_SL_ST25.TXT」、創建於2022年4月26日、28,168位元組的ASCII（文本）檔。
本揭露關於結合PD-1和TIGIT的結合蛋白，包括抗體。本揭露還提供了包含這種結合蛋白的組成物和編碼這種結合蛋白的核酸分子。本揭露進一步關於使用這種結合蛋白治療障礙或病症之方法。
如根據本揭露所使用的，除非另外指出，否則所有技術和科學術語應被理解為具有與熟悉該項技術者通常理解的相同含義。除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數形式，並且複數術語應包括單數形式。
如本文所用，術語「抗體」係指能夠識別並特異性結合抗原的蛋白質。普通的或常規的哺乳動物抗體包含四聚體，其通常由兩對相同的多肽鏈構成，每對由一條「輕」鏈（通常具有約25 kDa的分子量）和一條「重」鏈（通常具有約50-70 kDa的分子量）組成。如本文所用，術語「重鏈」和「輕鏈」係指具有足夠的可變結構域序列以賦予對靶抗原的特異性的任何免疫球蛋白多肽。每條輕鏈和重鏈的胺基末端部分典型地包括通常負責抗原識別的約100個至110個或更多個胺基酸的可變結構域。每條鏈的羧基末端部分典型地定義負責效應子功能的恒定結構域。因此，在天然存在的抗體中，全長重鏈免疫球蛋白多肽包括可變結構域（V H）和三個恒定結構域（C H1、C H2和C H3）以及C H1和C H2之間的鉸鏈區，其中該V H結構域位於多肽的胺基末端且該C H3結構域位於羧基末端，並且全長輕鏈免疫球蛋白多肽包括可變結構域（V L）和恒定結構域（C L），其中該V L結構域位於多肽的胺基末端且該C L結構域位於羧基末端。然而，熟悉該項技術者應認識到，天然存在的抗體中的結構域的位置可以以某種抗體樣結合蛋白形式進行修飾，而不損失抗原結合能力。人輕鏈的類別被稱為κ和λ輕鏈。
在一些方面，輕鏈恒定區係κ鏈。在一些方面，輕鏈恒定區係λ鏈。
在全長輕鏈和重鏈內，可變結構域和恒定結構域通常由約12個或更多個胺基酸的「J」區域連接，重鏈還包括約10個以上胺基酸的「D」區域。每個輕/重鏈對的可變區通常形成抗原結合位點。天然存在的抗體的可變結構域通常表現出由三個高變區（也稱為互補決定區或CDR）連接的相對保守的框架區（FR）的相同的一般結構。來自每對的兩條鏈的CDR通常藉由框架區比對，這可以使得能夠結合至特定表位。從胺基末端到羧基末端，輕鏈和重鏈可變結構域通常都包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
術語「抗體片段」係指完整或全長鏈或抗體的一部分，通常是指靶結合區或可變區。抗體片段的實例包括但不限於F ab、F ab'、F (ab')2和F v片段。如本文所用，術語「功能片段」通常與「抗體片段」同義，並且就抗體而言，可以指抗體片段，例如F v、F ab、F (ab')2。
本文所述之胺基酸殘基的編號參考係根據EU編號系統進行的（也描述於Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學感興趣的蛋白質的序列], 第5版 Public Health Service [公共衛生服務], National Institutes of Health [國立衛生研究院], 馬里蘭州貝塞斯達 (1991) 中）。
術語「載體」係指用於將編碼資訊轉移到宿主細胞的任何分子（例如核酸、質體或病毒）。一種類型的載體係「質體」，其係指可以向其中插入另外的DNA片段的環狀雙股DNA分子。另一類型的載體係病毒載體，其中可以將另外的DNA片段插入病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製（例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體）。其他載體（例如，非附加型哺乳動物載體）可以在引入宿主細胞中後整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導與它們可操作地連接的基因表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。
如本文所用的術語「人抗體」包括具有實質上對應於人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區的抗體。在一些方面，人抗體在非人哺乳動物中產生，該等非人哺乳動物包括但不限於齧齒動物，例如小鼠和大鼠，以及兔形目動物，例如兔。在其他方面，人抗體在雜交瘤細胞中產生。在仍其他方面，重組產生人抗體。在一些方面，雙特異性結合蛋白係人抗體或人源化抗體。
如本文所用的術語「抗原」或「靶抗原」係指能夠被本揭露之結合蛋白識別並結合的分子或分子的一部分。靶抗原能夠在動物中使用以產生能夠與抗原的表位結合的抗體。靶抗原可以具有一個或多個表位。
如本文所用的術語「表位」係指抗原的由本揭露之結合蛋白識別和結合的區域或結構元件。更精確地，表位係由結合蛋白的CDR結合的特定結構。表位可以包含蛋白質結構元件、碳水化合物，或甚至是膜中的脂質結構的一部分。當結合蛋白在蛋白質和/或大分子的複雜混合物中優先識別其抗原靶標時，稱其與抗原特異性結合。術語「特異性結合」係指與分子或其片段（例如抗原）特異性結合的結合蛋白。如藉由例如免疫測定法（BIAcore）或本領域已知的其他測定法所確定，與分子或其片段特異性結合的結合蛋白可以以較低親和力與其他分子結合。特別地，與至少一個分子或其片段特異性結合的抗體或片段可以競爭過非特異性結合的分子。本揭露特別涵蓋具有多種特異性的抗體（例如，對兩種或更多種離散抗原具有特異性的抗體）。例如，雙特異性抗體可以結合單個靶抗原上的兩個相鄰表位，或者可以結合兩個不同的抗原。
如本文所用的術語「抗原結合位點」係指在本揭露之結合蛋白的表面上產生的位點，在該位點結合抗原或抗原上的表位。結合蛋白的抗原結合位點典型地藉由參考由結合蛋白的互補決定區（CDR）產生的環結構來描述。
在一些方面，本文提供的結合蛋白係雙特異性的。如本文所用，雙特異性結合蛋白對至少兩個獨立的抗原（或靶標）或同一抗原內的不同表位具有結合特異性。示例性雙特異性結合蛋白可以結合至一個靶標的兩個不同的表位，或者可以結合兩個不同的靶標。其他此類結合蛋白可以將另一個靶標的第一靶結合位點與第二結合位點相組合。在一些方面，結合蛋白係雙特異性抗體。
在一些方面，在投與單個製成的分子的情況下，雙特異性抗體提供由同時靶向兩個抗原而獲得的累加的和/或協同的治療效果。
在一些方面，本文提供的抗體係單價雙特異性抗體（MBab）。本文描述的單價雙特異性抗體支架提供優異的平臺用於產生雙特異性抗體，該等雙特異性抗體實現與雙特異性抗體相關聯的所有益處，而同時降低上文提及的因它們的單價性質所致的潛在的治療風險。另外，本文提供的MBab係容易表現的、穩定的並且可能具有低免疫原性。如本文所用的術語「單價雙特異性」（其可能是縮略的「MBab」）係指雙特異性抗體，其中每個臂可以特異性地結合至不同的靶抗原，並且針對給定的一對不同靶抗原（A和B），MBab可以結合至其中的每一個。在某些方面，單價雙特異性抗體可以特異性結合至兩個獨立的抗原（或靶標）或同一抗原上的兩個獨立的表位。典型地，單價雙特異性抗體包含兩個不同的可變區。在一些方面，對兩個獨立的抗原的結合親和力大約係相同的。在一些方面，對兩個獨立的抗原的結合親和力係不同的。
在一些方面，本文提供了特異性結合PD-1和TIGIT的雙特異性結合蛋白，該雙特異性結合蛋白包含：a) 特異性結合PD-1的第一結合結構域，其中該第一結合結構域包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3；以及b) 特異性結合TIGIT的第二結合結構域，其中該第二結合結構域包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的LCDR3。
在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的輕鏈。
在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO: 7的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO: 9的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含重鏈，該重鏈具有與SEQ ID NO: 8的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含輕鏈，該輕鏈具有與SEQ ID NO: 10的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有SEQ ID NO: 19的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含具有SEQ ID NO: 18的胺基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO: 20的胺基酸序列的輕鏈。
在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO: 17的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO: 19的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含重鏈，該重鏈具有與SEQ ID NO: 18的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含輕鏈，該輕鏈具有與SEQ ID NO: 20的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含由SEQ ID NO: 21的核酸序列編碼的重鏈可變結構域和由SEQ ID NO: 23的核酸序列編碼的輕鏈可變結構域。在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含由SEQ ID NO: 22的核酸序列編碼的重鏈和由SEQ ID NO: 24的核酸序列編碼的輕鏈。
在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含由與SEQ ID NO: 21至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列編碼的重鏈可變結構域和由與SEQ ID NO: 23至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列編碼的輕鏈可變結構域。
在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含由與SEQ ID NO: 22至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列編碼的重鏈和由與SEQ ID NO: 24至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列編碼的輕鏈。
在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含由SEQ ID NO: 25的核酸序列編碼的重鏈可變結構域和由SEQ ID NO: 27的核酸序列編碼的輕鏈可變結構域。在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含由SEQ ID NO: 26的核酸序列編碼的重鏈和由SEQ ID NO: 28的核酸序列編碼的輕鏈。
在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含由與SEQ ID NO: 25至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列編碼的重鏈可變結構域和由與ID NO: 27至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列編碼的輕鏈可變結構域。
在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含由與SEQ ID NO: 26至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列編碼的重鏈和由與SEQ ID NO: 28至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列編碼的輕鏈。
在一個方面，有用的雙特異性結合蛋白與本文所含的任何雙特異性結合蛋白競爭結合PD-1和TIGIT兩者。在一個方面，有用的結合蛋白與包含SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 17、和SEQ ID NO: 19的抗體競爭結合PD-1和TIGIT兩者。在另一個方面，有用的結合蛋白與包含SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 18、和SEQ ID NO: 20的抗體競爭結合PD-1和TIGIT兩者。
在一個方面，本揭露提供了核酸，該核酸包含編碼如本文所述之雙特異性結合蛋白的核苷酸序列。
在一個方面，本揭露提供了編碼如本文所述之雙特異性結合蛋白的核酸序列，其中該核酸序列包括以下中的一個或多個：與SEQ ID NO: 21至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列，與SEQ ID NO: 23至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列，與SEQ ID NO: 25至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列，或與SEQ ID NO: 27至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列。在一個方面，核酸序列包含與SEQ ID NO: 21至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列，與SEQ ID NO: 23至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列，與SEQ ID NO: 25至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列，和與SEQ ID NO: 27至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列。
在一個方面，編碼如本文所述之雙特異性結合蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 27。
在一個方面，本揭露提供了編碼如本文所述之雙特異性結合蛋白的核酸序列，其中該核酸序列包括以下中的一個或多個：與SEQ ID NO: 22至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列，與SEQ ID NO: 24至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列，與SEQ ID NO: 26至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列，或與SEQ ID NO: 28至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列。在一個方面，核酸序列包含與SEQ ID NO: 22至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列，與SEQ ID NO: 24至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列，與SEQ ID NO: 26至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列，和與SEQ ID NO: 28至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列。
在一個方面，編碼如本文所述之雙特異性結合蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26和SEQ ID NO: 28。
在一個方面，本揭露提供了包含如本文所述之核酸的宿主細胞。在一個方面，本揭露提供了包含載體的宿主細胞，該載體包含如本文所述之核酸。在一個方面，本揭露提供了宿主細胞，該宿主細胞具有整合到其基因組中的如本文所述之核酸。
在一個方面，本揭露提供了包含載體的宿主細胞，該載體包含以下：與SEQ ID NO: 21至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列，與SEQ ID NO: 23至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列，與SEQ ID NO: 25至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列，和/或與SEQ ID NO: 27至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列。
在一個方面，本揭露提供了包含載體的宿主細胞，該載體包含以下：與SEQ ID NO: 22至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列，與SEQ ID NO: 24至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列，與SEQ ID NO: 26至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列，和/或與SEQ ID NO: 28至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列。
在一個方面，本揭露提供了由如本文所述之宿主細胞產生的雙特異性結合蛋白。
如本文所用的術語「天然Fc」係指包含由抗體消化造成的或藉由其他方式產生的非抗原結合片段的序列的分子，其處於單體或多聚體形式，並且可以含有鉸鏈區。天然Fc的原始免疫球蛋白來源較佳的是人來源，並且可以是任何免疫球蛋白。天然Fc分子由可以藉由共價（即二硫鍵）和非共價締合連接成二聚體或多聚體形式的單體多肽組成。天然Fc分子的單體亞基之間的分子間二硫鍵的數量範圍係從1到4，其取決於類別（例如IgG、IgA和IgE）或亞類（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2）。天然Fc的一個實例係由IgG的木瓜蛋白酶消化造成的二硫鍵鍵合的二聚體。如本文所用的術語「天然Fc」對於單體、二聚體和多聚體形式係通用的。
在一些方面，Fc區係或包括如下結構域，該結構域係來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、或IgD的Fc區中的一種或多種。在一些方面，抗體係IgG1抗體。
如本文所用的術語「Fc變體」係指從天然Fc修飾但仍包含補救受體FcRn（新生兒Fc受體）的結合位點的分子或序列。示例性Fc變體及其與補救受體的相互作用係本領域已知的。因此，術語「Fc變體」可以包含來自非人天然Fc的人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可被去除或突變以產生Fc變體從而改變某些殘基的區域，該等殘基提供本揭露之結合蛋白不需要的結構特徵或生物活性。因此，術語「Fc變體」包含缺乏一個或多個天然Fc位點或殘基、或其中一個或多個Fc位點或殘基已經被修飾的分子或序列，該等Fc位點或殘基影響或參與：(1) 二硫鍵形成，(2) 與選擇的宿主細胞不相容，(3) 在選擇的宿主細胞中表現後的N末端異質性，(4) 糖基化，(5) 與補體的相互作用，(6) 與除補救受體之外的Fc受體結合，或 (7) 抗體依賴性細胞毒性（ADCC）。
在一些方面，雙特異性結合蛋白包含變體Fc區，該變體Fc區包含選自以下的至少一個取代：221K、221Y、225E、225K、225W、228P、234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235E、235F、236E、237L、237M、237P、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、250E、250Q、251F、252L、252Y、254S、254T、255L、256E、256F、256M、257C、257M、257N、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265A、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、296G、297S、297D、297E、298A、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、305I、308F、313F、316D、318A、318S、320A、320S、322A、322S、325Q、325L、3251、325D、325E、325A、325T、325V、325H、326A、326D、326E、326G、326M、326V、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、3281、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、3301、330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、3311、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、333A、333D、333G、333Q、333S、333V、334A、334E、334H、334L、334M、334Q、334V、334Y、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、428L、428F、433K、433L、434A、434W、434Y、436H、440Y和443W，如由Kabat中所示的EU索引進行編號。
在一些方面，變體Fc區在選自428和434的位置處包含一個或多個修飾，該等位置如由Kabat中所示的EU索引進行編號。在一些方面，變體Fc區在選自428和434的位置處包含一個或多個胺基酸取代，該等位置如由Kabat中所示的EU索引進行編號。在一些方面，變體Fc區包含選自428L、428F、434A、434W和434Y的一個或多個胺基酸取代。
Fc區工程化在本領域中被廣泛用於延長治療性抗體的半衰期並避免體內降解。在一些方面，可以修飾IgG抗體或抗原結合片段的Fc區，以便增加IgG分子對新生兒Fc受體（FcRn）的親和力，從而介導IgG分解代謝並避免IgG分子降解。
其他適合的Fc區胺基酸取代或修飾係本領域已知的並且包括例如三重取代：位置252處的甲硫胺酸（M）到酪胺酸（Y）取代、位置254處的絲胺酸（S）到蘇胺酸（T）取代、以及位置256處的蘇胺酸（T）到麩胺酸（E）取代，如由Kabat中所示的EU索引進行編號（M252Y/S254T/T256E；稱為「YTE」或「YTE突變」）（參見例如，美國專利7,658,921；美國專利申請公開2014/0302058；和Yu等人, Antimicrob. Agents Chemother. [抗微生物藥劑與化學療法], 61 (1): e01020-16 (2017)，將其中的每一個藉由援引以其全文併入本文）。
在一些方面，抗體或其抗原結合片段包含已經被工程化以改善半衰期的Fc區。在一些方面，抗體或其抗原結合片段包含具有YTE突變的Fc區。
在一些方面，Fc區係非糖基化的。在一些方面，Fc區係去糖基化的。在一些方面，Fc區具有減少的岩藻糖基化或係非岩藻糖基化的。
在一些方面，Fc變體抗體或其結合片段對FcRn具有增加的結合親和力。
重鏈恒定區中的三重突變（TM）L234F/L235E/P331S（根據歐盟編號慣例；Sazinsky等人Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊], 105: 20167-20172 (2008)）可以顯著降低IgG效應子功能。在一些方面，抗體或其抗原結合片段包含具有L234F/L235E/P331S三重突變（TM）的Fc區。
在一些方面，Fc變體抗體或其結合片段在體內投與時具有降低的補體依賴性細胞毒性（CDC）。在一些方面，與含有野生型Fc區的抗體或其結合變體相比，Fc變體抗體或其結合片段具有降低的CDC。在一些方面，Fc變體抗體或其結合片段在體內投與時不觸發CDC。在一些方面，Fc變體抗體或其結合片段在體內投與時導致CDC降低。在一些方面，具有降低的CDC活性或無CDC活性的Fc變體抗體或其結合片段包含變體Fc區中的三重突變（L234F/L235E/P331S）。
在一些方面，Fc變體抗體或其結合片段在體內投與時具有降低的抗體依賴性細胞毒性（ADCC）。在一些方面，與含有野生型Fc區的抗體或其結合變體相比，Fc變體抗體或其結合片段具有降低的ADCC。在一些方面，Fc變體抗體或其結合片段在體內投與時不觸發ADCC。在一些方面，Fc變體抗體或其結合片段在體內投與時導致ADCC降低。在一些方面，具有降低的ADCC活性或無ADCC活性的Fc變體抗體或其結合片段包含變體Fc區中的三重突變（L234F/L235E/P331S）。
在一些方面，具有降低的CDC活性的抗體或其結合片段向受試者投與時具有降低的毒性。在一些方面，具有降低的ADCC活性的抗體或其結合片段向受試者投與時具有降低的毒性。
如本文所用的術語「Fc結構域」涵蓋了如上所定義的天然Fc和Fc變體及序列。與Fc變體和天然Fc分子一樣，術語「Fc結構域」包括從完整抗體消化或藉由其他方式產生的處於單體或多聚體形式的分子。
為了提高結合蛋白的產量，C H3結構域可以藉由「杵臼（knob-into-hole）」技術改變，該技術與幾種示例性分子一起詳細描述於例如國際公開號WO 96/027011，Ridgway等人, 1996, Protein Eng.[蛋白質工程] 9: 617-21；和Merchant等人, 1998, Nat. Biotechnol.[自然生物技術]16: 677-81中。特別地，改變兩個C H3結構域的相互作用表面以增加含有這兩個C H3結構域的兩條重鏈的異二聚化。（兩條重鏈的）兩個C H3結構域中的每一個都可以是「杵（knob）」，而另一個係「臼（hole）」。二硫橋的引入進一步穩定了異二聚體（Merchant等人, 1998; Atwell等人 ,1997, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌] 270: 26-35），並且提高了產量。
在一些方面，結合蛋白具有「DuetMab」形式。DuetMab具有以下基本結構：具有修飾的重鏈的Fc區，其中該修飾的重鏈的C H1區具有天然半胱胺酸至非半胱胺酸胺基酸的取代，和天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代；修飾的對應的輕鏈，其中該修飾的輕鏈的C L區還具有天然半胱胺酸至非半胱胺酸胺基酸的取代，和天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代；具有第二重鏈的第二Fc區；和第二對應的修飾輕鏈，其中該修飾的重鏈與對應的修飾的輕鏈直接連接，並且在單獨的靶標結合臂上，該第二重鏈與第二對應的輕鏈直接連接，並且其中因該天然非半胱胺酸胺基酸被取代為半胱胺酸胺基酸而產生的修飾的重鏈中的取代的半胱胺酸、以及因該天然非半胱胺酸胺基酸被取代為半胱胺酸胺基酸而產生的修飾的相應輕鏈中的取代的半胱胺酸可以形成二硫鍵。與DuetMab相關的揭露可以在例如美國專利號9,527,927中找到，其藉由引用以其全文併入本文。
如本文所用的術語「K D」係指本揭露之結合蛋白與抗原靶點之間相互作用的解離常數（K D= [A] x [B]/[AB]），其單位為莫耳/升。本揭露之結合蛋白典型地具有以下解離常數（K D）：l0 -5至10 -12莫耳/升或更小、或10 -7至10 -12莫耳/升或更小、或10 -3至10 -12莫耳/升，和/或具有以下結合親和力：至少10 7M -1、或至少10 8M -1、或至少10 9M -1、或至少10 12M -1。任何大於10 -4莫耳/升的K D值通常被認為係指非特異性結合。因此，K D值越低，親和力越大。在一些方面，本揭露之結合蛋白將以小於500 nM、小於200 nM、小於10 nM或小於500 pM的親和力結合所需抗原。高親和力或非常強的結合通常與更大的療效相關，但並不總是親和力越大，療效越大的情況。
可以例如藉由表面電漿共振（SPR）確定解離常數（K D）。通常，表面電漿共振分析藉由使用例如BIAcore ®系統（瑪西亞生物感測器公司（Pharmacia Biosensor）；皮斯卡塔韋（Piscataway），新澤西）的表面電漿共振測量配位基（生物感測器基質上的靶抗原）與分析物之間的即時結合相互作用（結合速率和解離速率兩者）。表面電漿分析也可以藉由固定分析物和呈遞配位基來進行。本揭露之結合蛋白與抗原或抗原決定簇的特異性結合也可以以本領域已知的任何適合的方式確定，包括例如斯卡查德分析和/或競爭性結合測定，例如放射免疫測定（RIA）、酶聯免疫吸附測定（ELISA）、酶免疫測定（EIA）和夾心競爭測定。
在一個方面，如本文所述之雙特異性結合蛋白與人TIGIT相互作用的平衡解離常數（K D）小於或等於約15 pM。在一個方面，如本文所述之雙特異性結合蛋白與人TIGIT相互作用的K D小於或等於約9 pM。在一個方面，如本文所述之雙特異性結合蛋白與人TIGIT相互作用的K D小於或等於約15、14、13、12、11、10、9、或8 pM。
在一個方面，如本文所述之雙特異性結合蛋白與人TIGIT相互作用的K D係從約9 pM至約15 pM。在一個方面，如本文所述之雙特異性結合蛋白與人TIGIT相互作用的K D係從約10 pM至約15 pM。在一個方面，如本文所述之雙特異性結合蛋白與人TIGIT相互作用的K D係從約11 pM至約15 pM。在一個方面，如本文所述之雙特異性結合蛋白與人TIGIT相互作用的K D係從約12 pM至約15 pM。在一個方面，如本文所述之雙特異性結合蛋白與人TIGIT相互作用的K D係從約13 pM至約15 pM。在一個方面，如本文所述之雙特異性結合蛋白與人TIGIT相互作用的K D係從約14 pM至約15 pM。
在一個方面，如本文所述之雙特異性結合蛋白與人PD-L1相互作用的K D小於或等於約0.4 nM。在一個方面，如本文所述之雙特異性結合蛋白與人PD-L1相互作用的K D係從約0.2 nM至約0.5 nM。在一個方面，如本文所述之雙特異性結合蛋白與人PD-L1相互作用的K D係從約0.3 nM至約0.5 nM。在一個方面，如本文所述之雙特異性結合蛋白與人PD-L1相互作用的K D係從約0.4 nM至約0.5 nM。
在特定方面，本文提供了治療患有疾病或病症的受試者之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的本文所揭露的結合蛋白。本揭露提供了在受試者中誘導免疫反應之方法，以及藉由向該受試者投與蛋白、核酸分子和/或組成物用於治療或預防受試者中的腫瘤和/或癌症之方法。
在特定方面，本文提供了在受試者中誘導免疫反應之方法，該方法包括向該受試者投與如本文所述之雙特異性蛋白。在一個方面，本文提供了在受試者中誘導免疫反應之方法，該方法包括向該受試者投與如本文所述之核酸。在一個方面，本文提供了在受試者中誘導免疫反應之方法，該方法包括向該受試者投與如本文所述之藥物組成物。
在一個方面，本文提供了如本文所定義的用於在療法中使用的雙特異性蛋白。在一個方面，本文提供了如本文所定義的用於在治療癌症中使用的雙特異性蛋白。在一個方面，本文提供了如本文所定義的雙特異性蛋白在製造用於治療癌症的藥物中之用途。在一個方面，本文提供了如本文所定義的用於在療法中使用的核酸。在一個方面，本文提供了如本文所定義的用於在治療癌症中使用的核酸。在一個方面，本文提供了如本文所定義的核酸在製造用於治療癌症的藥物中之用途。
在一個方面，治療之方法包括向受試者投與治療有效量的本文所揭露的結合蛋白與額外的抗癌化合物的組合。在一些方面，抗癌化合物係小分子藥物。在一些方面，抗癌化合物係培美曲塞（pemetrexed）、卡鉑（carboplatin）、吉西他濱（gemcitabine）、順鉑（cisplatin）、紫杉醇（paclitaxel）或其組合。在一些方面，結合蛋白和額外的抗癌治療同時投與。在一些方面，結合蛋白和額外的抗癌治療不同時投與，而在同一治療過程期間投與。
「疾病」或「病症」係指將從使用本揭露之方法進行的治療中受益的任何病症。「疾病」和「病症」在本文中可互換使用，並且包括慢性和急性障礙或疾病，包括使患者易患所討論的障礙的那些病理狀況。在一些方面，疾病係腫瘤。在一些方面，疾病係實性瘤。在一些方面，疾病係癌症。在一些方面，該癌症係卵巢癌、乳癌、大腸直腸癌、前列腺癌、子宮頸癌、子宮癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸癌、黑色素瘤、胰臟癌、腎細胞癌、和肺癌中的一種或多種。在一些方面，疾病係非小細胞肺癌（NSCLC）。在一些方面，NSCLC係晚期的或轉移性的。在一些方面，晚期NSCLC係III期或IV期NSCLC。
術語「受試者」旨在包括人和非人動物，特別是哺乳動物。在某些方面，受試者係人患者。
如本文所用的術語「治療（treatment或treat）」係指治療性治療和預防性（prophylactic或preventative）措施兩者。需要治療的那些包括患有疾病或病症的受試者，以及易於患上疾病或病症的那些或應預防疾病或病症的那些。
如本文所用的術語「投與（administration或administering）」係指藉由任何適當的途徑提供、接觸和/或遞送一種或多種化合物以實現所需效果。投與可以包括但不限於口服、舌下、腸胃外（例如，靜脈內、皮下、皮內、肌內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病灶內或顱內注射）、透皮、局部、頰、直腸、陰道、鼻、眼、經由吸入以及植入物。
如本文所用，術語「共同投與」或「組合」係指同時或順序投與多種化合物或藥劑。第一化合物或藥劑可以在投與第二化合物或藥劑之前、與其同時或之後投與。第一化合物或藥劑和第二化合物或藥劑可以在同一天同時或順序投與，或者可以在1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週或1個月內彼此順序投與。在一些方面，化合物或藥劑在每種化合物或藥劑發揮至少某種生理作用和/或具有剩餘功效的期間共同投與。
如本文所用，術語「藥物組成物」或「治療性組成物」係指當適當地向受試者投與時能夠誘導所需治療效果的化合物或組成物。在一些方面，本揭露提供了藥物組成物，該藥物組成物包含藥學上可接受的載劑和治療有效量的本揭露之結合蛋白。
「治療有效劑量」或「治療劑量」係足以影響期望的臨床結果（即實現治療效果）的量。可以以一次或多次投與，投與治療有效劑量。
如本文所用，術語「藥學上可接受的載劑」或「生理上可接受的載劑」係指適合於完成或增強本揭露之一種或多種結合蛋白的遞送的一種或多種配製物材料。
在一些方面，本文所揭露的結合蛋白可以與藥學上可接受的載劑、賦形劑或穩定劑一起配製成藥物組成物。在某些方面，此類藥物組成物適於使用本領域中已知之方法經由任何一個或多個投與途徑向人或非人動物投與。術語「藥學上可接受的載劑」係指不干擾活性成分的生物活性的有效性的一種或多種無毒材料。此類製劑常規地可以含有鹽、緩衝劑、防腐劑、相容的載劑以及視需要其他治療劑。此類藥學上可接受的製劑還可以含有適合於投與人的相容的固體或液體填料、稀釋劑或包封物質。可以用於在本文所描述的配製物中的其他設想的載劑、賦形劑、和/或添加劑包括：例如，調味劑、抗微生物劑、甜味劑、抗氧化劑、抗靜電劑、脂質、蛋白質賦形劑（如血清白蛋白、明膠、酪蛋白）、成鹽平衡離子（如鈉）等。適合用於在本文所描述的配製物中使用的該等和額外已知的藥物載劑、賦形劑和/或添加劑係本領域中已知的，例如，如「Remington: The Science & Practice of Pharmacy [雷明頓：藥學科學與實踐]」, 第21版, Lippincott Williams & Wilkins [利平科特•威廉斯•威爾金斯出版公司], (2005) 以及「Physician's Desk Reference [醫師案頭參考]」, 第60版, Medical Economics [醫學經濟學公司], 蒙特維爾（Montvale）, 新澤西州 (2005) 中所列出。可以選擇對於所希望或所要求的投與方式、溶解度和/或穩定性來說適合的藥學上可接受的載劑。
在一些方面，本揭露之藥物組成物包括額外的抗癌化合物。在一些方面，抗癌化合物係小分子藥物。在一些方面，抗癌化合物係培美曲塞、卡鉑、吉西他濱、順鉑、紫杉醇或其組合。在一些方面，抗癌化合物係培美曲塞。在一些方面，抗癌化合物係卡鉑。在一些方面，抗癌化合物係吉西他濱。在一些方面，抗癌化合物係順鉑。在一些方面，抗癌化合物係紫杉醇。
在一個方面，本揭露之配製物係基本上不含內毒素和/或相關熱原物質的無熱原配製物。內毒素包括限制在微生物體內並且僅當微生物破壞或死亡時才釋放出來的毒素。熱原物質還包括來自細菌和其他微生物外膜的誘導發熱的熱穩定的物質（糖蛋白類）。如果向人投與這兩種物質，會引起發熱、低血壓和休克。由於潛在的有害影響，即使低量的內毒素也必須從靜脈投與的藥物溶液中去除。食品與藥物管理局（「FDA」）已經針對靜脈藥物投與，設置了在單個一小時內每公斤體重每劑量的5個內毒素單位（EU）的上限（The United States Pharmacopeial Convention，Pharmacopeial Forum [美國藥典委員會，藥典論壇] 26 (1): 223 (2000)）。在某些方面，組成物中的內毒素和熱原水平小於10 EU/mg、或小於5 EU/mg、或小於1 EU/mg、或小於0.1 EU/mg、或小於0.01 EU/mg、或小於0.001 EU/mg。
當用於體內投與時，本揭露之配製物應係無菌的。本揭露之配製物可以藉由各種滅菌方法（包括例如無菌過濾或輻射）滅菌。在一個方面，將配製物用預先滅菌的0.22微米過濾器進行過濾滅菌。注射用無菌組成物可以按照如在「Remington: The Science & Practice of Pharmacy [雷明頓：藥學科學與實踐],」 第21版, Lippincott Williams & Wilkins [利平科特•威廉斯•威爾金斯出版公司], (2005) 中描述的常規製藥實踐來配製。
在一些方面，可以將治療組成物配製用於特定投與途徑，如口服、鼻、肺、局部（包括頰和舌下）、直腸、陰道和/或腸胃外投與。如本文所用的術語「腸胃外投與」和「腸胃外投與的」係指除了腸道和局部投與以外的投與方式（通常藉由注射），並且包括但不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眼眶內、心臟內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射和輸注。本揭露之適合於局部或經皮投與的配製物包括粉劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳劑、洗劑、凝膠劑、溶液、貼劑以及吸入劑。該等抗體和其他活性物可以在無菌條件下與藥學上可接受的載劑混合、並且與可能要求的任何防腐劑、緩衝劑、或推進劑混合（參見，例如，美國專利號7,378,110；7,258,873；以及7,135,180；美國專利申請公開號2004/0042972和2004/0042971）。
該等配製物可以以單位劑型呈現，並且可以藉由藥學領域已知的任何方法製備。本揭露之藥物組成物中的活性成分的實際劑量水平可以變化以便於獲得有效實現對於特定患者、組成物和投與方式所需的治療緩解而對該患者無毒的活性成分的量（例如，「治療有效量」）。所選擇的劑量水平將取決於多種藥物動力學因素，包括所採用的特定組成物的活性、投與途徑、投與時間、所採用的特定化合物的排泄速率、治療持續時間，與所採用的特定組成物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料、所治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀況和先前病史、以及在醫學領域中熟知的類似因素。該等劑量可以每天、每週、每兩週、每月或不頻繁地投與，例如一年兩次，這取決於劑量、投與方法、待治療的障礙或症狀以及個體受試者特徵。還可以將劑量經由連續輸注（如通過泵）投與。投與的劑量還可能取決於投與途徑。例如，皮下投與可能需要比靜脈內投與更高的劑量。如上所述，任何常用的給藥方案（例如，藉由每天或每週兩次注射或輸注來投與1-10 mg/kg）可以適配和適合於與治療人癌症患者有關之方法。
本文引用的所有參考文獻，包括專利、專利申請、論文、教科書等以及其中引用的參考文獻（如同它們還未曾引用過的程度）藉由引用以其全文併入本文。
在不限制本揭露之情況下，本文出於說明目的描述了本揭露之多個方面。 實例
以下實例說明了本揭露之特定方面及其各種用途。闡述它們僅出於解釋目的並且不應以任何方式解釋為限制本揭露之範圍。 實例 1 ：雙特異性抗體的抗 TIGIT 部分的產生和表徵
開發並表徵一系列單株TIGIT抗體。綜述了親本VAR1（P-VAR1）WT可變重鏈和輕鏈（VL WT + VH WT）中的序列。在可變重鏈中，在CDRH3區中鑒定了甲硫胺酸氧化的潛在風險，並且在CDRH3區中鑒定了DP片段化的潛在風險（圖1）。在可變輕鏈中，在CDRL1區中鑒定了甲硫胺酸氧化的潛在風險（圖2）。產生了五種變體單株抗體，以消除這種潛在的氧化，並與種系（GL）序列匹配：
VL WT + VH WT；
VL GL + VH WT;
VL WT + VH GL；
VL GL + VH GL；
VL GL (CDRL1 M-I) + VH GL
特別地，在可變重區，第一個E胺基酸突變為Q以匹配種系序列。在可變重區，CDRL1中的甲硫胺酸殘基在一種變體中如在種系序列中一樣突變為異白胺酸，以減輕潛在的氧化。P-VAR1 VH和VL結構域被成功修飾，而不影響變體的生產力和動力學。（表1，圖5和6）。此外，在加速熱穩定性測定中，該等變體沒有表現出顯著的單體損失、聚集或片段化（表2）。 [ 表 1] ：DuetMab變體的表現和配對特性
樣本ID 培養體積 第10/12天 滴定度*（mg/L） %正確配對的LC %單體MabSelect Sure κ/λ層析法 最終單體百分比 %最終正確配對的LC 內毒素水平 最終產量
VL WT + VH WT 500 ml 72.2 92 82 κ 100 99 ＜ 0.1 EU/mg 4 mg
VL GL + VH WT 500 ml 60.8 98 82 Na 100 98 ＜ 0.3 EU/mg 5 mg
VL WT + VH GL 500 ml 60.5 97 86.5 na 100 97 ＜ 0.5 EU/mg 5 mg
VL GL + VH GL 500 ml 66.7 96 84 na 100 96 ＜ 0.1 EU/mg 7 mg
VL GL (CDRL1 M-I) + VH GL 500 ml 65.2 96 83 na 100 96 ＜ 0.5 EU/mg 8 mg
所有變體在1 mg/mL PBS緩衝液中在45°C下進行2週的加速熱穩定性測定。使用標準技術測量高溫儲存前後的單體損失、聚集和片段化，其中結果提供在表2中。 [ 表 2] ：PD1/TIGIT DuetMab變體的加速熱穩定性測定中的單體損失、聚集或片段化
植株名稱 單體保留（min） 蛋白A後的起始純度 45°C後，2週，1 mg/ml PBS 變化
單體% 聚集體% 片段% 單體% 聚集體% 片段% 單體損失% 聚集體的增加% 片段的增加%
P-VAR1 w.t. DuetMab 9.2 100.0 0.0 0.0 97.6 0.0 2.4 2.4 0.0 2.4
VAR1 VL GL (CDRL1 M-I) + VH GL DuetMab 9.2 100.0 0.0 0.0 97.8 0.0 2.2 2.2 0.0 2.2
VL GL + VH GL DuetMab 9.2 100.0 0.0 0.0 98.0 0.2 1.8 2.0 0.2 1.8
根據製造商的說明，經由BiaCore評估PD1-TIGIT duetMab LO115/P-VAR1（VHWT-VLWT）和VAR1（LO115/VHGL-VLGL（M-I））的內在動力學。使用BIAcore T200儀器（BIAcore）進行結合實驗。結合結果示於表3。 [ 表 3] ：藉由BiaCore的PD-1/TIGIT DuetMabs的內在動力學
配位基 樣本 ka （ 1/Ms ） kd （ 1/s ） KD （ M ） Chi² （ RU² ）
huTIGIT P-VAR1 4.67E + 06 4.64E-05 9.9E-12 0.0119
huTIGIT VAR1 4.37E + 06 6.57E-05 15.0E-12 0.0150
cyTIGIT P-VAR1 1.03E + 06 3.29E-02 32.1E-9 0.7350
cyTIGIT VAR1 9.99E + 05 4.11E-02 41.1E-9 1.3400
muTIGIT P-VAR1 1.66E + 06 3.78E-03 2.3E-9 0.1350
muTIGIT VAR1 2.17E + 06 6.31E-03 2.9E-9 0.0285
實例 2 ： PD-1/TIGIT 雙特異性結合蛋白及結合蛋白的表徵
使用下表4中的序列創建了結合PD-1和TIGIT的呈DuetMab形式的雙特異性結合蛋白。基於Kabat定義系統突出顯示表4中的CDR。 [ 表 4] ：AZD2936的序列
PD1 LO115 HCDR1    SEQ ID NO: 1 DYGMH
PD1 LO115 HCDR2    SEQ ID NO: 2 YISSGSYTIYSADSVKG
PD1 LO115 HCDR3    SEQ ID NO: 3 RAPNSFYEYYFDY
PD1 LO115 LCDR1    SEQ ID NO: 4 SASSKHTNLYWSRHMY
PD1 LO115 LCDR2    SEQ ID NO: 5 LTSNRAT
PD1 LO115 LCDR3    SEQ ID NO: 6 QQWSSNPFT
PD1 LO115可變重鏈    SEQ ID NO: 7 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYSADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAPNSFYEYYFDYWGQGTTVTVSS
PD1 LO115臼重鏈    SEQ ID NO: 8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYSADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAPNSFYEYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK   
PD1 LO115可變輕鏈    SEQ ID NO: 9 QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSKHTNLYWSRHMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK
PD1 LO115 WTκ輕鏈    SEQ ID NO: 10 QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSKHTNLYWSRHMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC   
TIGIT VAR1 HCDR1    SEQ ID NO: 11 SYAMH
TIGIT VAR1 HCDR2    SEQ ID NO: 12 VISYAGEVKYYADSVKG
TIGIT VAR1 HCDR3    SEQ ID NO: 13 DPLPLHYYGMDV
TIGIT VAR1 LCDR1    SEQ ID NO: 14 SGSSSNIGRRPVN
TIGIT VAR1 LCDR2    SEQ ID NO: 15 SQNQRPS
TIGIT VAR1 LCDR3    SEQ ID NO: 16 AVWDDIGRVLQ
TIGIT VAR1可變重鏈    SEQ ID NO: 17 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYAGEVKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPLPLHYYGMDVWGQGTTVTVSS
TIGIT VAR1杵重鏈 SEQ ID NO: 18 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYAGEVKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPLPLHYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVCPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSVDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
TIGIT VAR1可變輕鏈    SEQ ID NO: 19 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGRRPVNWYQQLPGTAPKLLIYSQNQRPSGVPDRFSGSQSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAVWDDIGRVLQLGGGTQLTVL   
TIGIT VAR1工程化λ輕鏈    SEQ ID NO: 20 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGRRPVNWYQQLPGTAPKLLIYSQNQRPSGVPDRFSGSQSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAVWDDIGRVLQLGGGTQLTVLGQPKAAPSVTLFPPCSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEVS   
PD1 LO115可變重鏈    SEQ ID NO: 21 GAGGTGCAGCTGGTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACATTCTCCGACTACGGCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCTACATCTCCTCCGGCTCCTACACCATCTACTCCGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGTGCCAGACGGGCCCCTAACTCCTTCTACGAGTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCT
PD1 LO115臼重鏈    SEQ ID NO: 22 GAGGTGCAGCTGGTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACATTCTCCGACTACGGCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCTACATCTCCTCCGGCTCCTACACCATCTACTCCGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGTGCCAGACGGGCCCCTAACTCCTTCTACGAGTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCTGCTAGCACCAAAGGTCCGAGCGTTTTTCCGCTGGCACCGAGCAGCAAAAGCACCTCTGGTGGCACCGCAGCACTGGGTTGTCTGGTGAAAGATTATTTTCCGGAACCGGTTACCGTTTCTTGGAATAGCGGTGCACTGACCAGCGGTGTTCATACCTTTCCGGCAGTTCTGCAGAGCAGCGGTCTGTATAGCCTGTCTAGCGTTGTTACCGTTCCGAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTATATTTGCAATGTGAATCATAAACCGAGCAATACAAAAGTTGATAAACGCGTTGAACCGAAAAGCTGTGACAAAACTCACACGTGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAGTTCGAGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCAGCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTCTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAGCTGCGCGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTTAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
PD1 LO115可變輕鏈    SEQ ID NO: 23 CAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACCCTGTCCCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGCTCCGCCTCCTCCAAGCACACCAACCTGTACTGGTCCCGGCACATGTACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACCTGACCTCTAACCGGGCCACCGGCATCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
PD1 LO115 WTκ輕鏈    SEQ ID NO: 24 CAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACCCTGTCCCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGCTCCGCCTCCTCCAAGCACACCAACCTGTACTGGTCCCGGCACATGTACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACCTGACCTCTAACCGGGCCACCGGCATCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
TIGIT VAR1可變重鏈    SEQ ID NO: 25 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGCGGGGGAGGTGAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACCCGCTACCGCTACATTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
TIGIT VAR1杵重鏈    SEQ ID NO: 26 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGCGGGGGAGGTGAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACCCGCTACCGCTACATTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAAGGTCCGAGCGTGTGCCCGCTGGCACCGAGCAGCAAAAGCACCTCTGGTGGCACCGCAGCACTGGGTTGTCTGGTGAAAGATTATTTTCCGGAACCGGTTACCGTTTCTTGGAATAGCGGTGCACTGACCAGCGGTGTTCATACCTTTCCGGCAGTCCTGCAGAGCAGCGGTCTGTATAGCCTGTCTAGCGTTGTTACCGTTCCGAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTATATTTGCAATGTGAATCATAAACCGAGCAATACCAAAGTTGATAAACGCGTTGAACCGAAAAGCGTGGACAAAACTCACACGTGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAGTTCGAGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCAGCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTCTACACCCTGCCCCCATGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCTTAAGCCTGTCTCCGGGTAAATGA
TIGIT VAR1可變輕鏈    SEQ ID NO: 27 CAGTCTGTGCTGACTCAGCCTCCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAATATCGGAAGGAGGCCTGTAAACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGTCAGAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCCAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTTCTGTGCAGTTTGGGATGACATCGGCCGCGTCCTGCAGTTAGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTA
TIGIT VAR1工程化λ輕鏈    SEQ ID NO: 28 CAGTCTGTGCTGACTCAGCCTCCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAATATCGGAAGGAGGCCTGTAAACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGTCAGAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCCAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTTCTGTGCAGTTTGGGATGACATCGGCCGCGTCCTGCAGTTAGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCGGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTGCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAAGTGTCATGA
同時結合研究
在Octet384儀器（福特生物公司（ForteBio），弗里蒙特（Fremont），加利福尼亞州）上，藉由生物膜層干涉技術測量重組人PD-1和TIGIT蛋白的同時結合研究。如圖8A所示，將在測定緩衝液[PBS pH 7.2，3 mg/mL牛血清白蛋白（BSA），0.05%（v/v）吐溫20]中以0.5 µg/mL的生物素化人TIGIT蛋白捕獲到鏈黴親和素（SA）生物感測器（福特生物公司，弗里蒙特，加利福尼亞州）上。如圖8B所示，將在測定緩衝液中以5 µg/mL的人PD-1蛋白捕獲到鎳胺三乙酸（Ni-NTA）生物感測器（福特生物公司，弗里蒙特，加利福尼亞州）上。在洗滌步驟去除任何未結合的蛋白後，分別載入的生物感測器經受連續的締合和解離相互作用，首先與133 nM的AZD2936相互作用，然後與300 nM的人PD-1或人TIGIT抗原相互作用。使用Octet384軟體v.9.0對數據進行非線性擬合，由此計算締合和解離曲線。藉由Octet分析確定AZD2936同時結合重組人PD-1和TIGIT蛋白的能力。如圖8A和8B所示，AZD2936展現出與人TIGIT和人PD-1抗原的同時結合。 實例 3 ：細胞結合測定
如圖9A-9C所示，針對單特異性抗PD1（LO115）、單特異性抗TIGIT（VAR1）和同種型對照，測試AZD2936對細胞表面上表現的PD1和TIGIT的結合。特別地，進行了基於細胞的平衡結合測定，以測量AZD2936與工程化細胞系的細胞表面上表現的人PD-1和TIGIT受體結合的表觀親和力。處於該目的，將Jurkat細胞系工程化以表現人PD-1和/或TIGIT受體。為了確定該等細胞亞組是否與AZD2936結合的評估相關，對人PD-1和TIGIT的細胞表面受體密度進行定量。如表5所示，單陽性Jurkat PD-1+TIGIT-細胞上的PD-1受體密度被確定為11700（SD ± 6690）個受體/細胞，並且單陽性Jurkat PD-1-TIGIT+細胞上的TIGIT受體密度被確定為147000（SD ± 91500）個受體/細胞。雙陽性Jurkat PD 1+TIGIT+細胞上的PD-1和TIGIT受體密度係621000（SD ± 210000）和149000（SD ± 89100），表現出PD-1受體比TIGIT受體的4.17 : 1的過量。 [ 表 5] ：工程化Jurkat細胞系上的PD-1和TIGIT受體密度，n = 4
細胞系 PD-1 （受體 / 細胞，平均值 ± SD ） TIGIT （受體 / 細胞，平均值 ± SD ） PD-1/TIGIT （比率）
Jurkat PD-1 +TIGIT - 11700（± 6690） ND ND
Jurkat PD-1 -TIGIT + ND 147000（± 91500） ND
Jurkat PD-1 +TIGIT + 621000（± 210000） 149000（± 89100） 4.17
ND = 未確定； PD-1 = 計劃性細胞死亡蛋白 1 ； TIGIT = 具有 Ig 和基於免疫受體酪胺酸的抑制模體結構域的 T 細胞免疫受體。 SD = 標準差。
AZD2936的結合與二價mAb一起進行評估，並且在3個工程化以表現人PD-1和/或人TIGIT受體的Jurkat細胞系上進行檢測。AZD2936以濃度依賴的方式與Jurkat PD-1 -TIGIT +細胞結合，並且保持抗TIGIT mAb與TIGIT受體的細胞結合特性（圖9A）。與二價抗TIGIT抗體相比，AZD2936展現出增加的（2.85倍）結合EC 50值（表6）和增加的最大結合（圖9A）。AZD2936以濃度依賴性方式與Jurkat PD-1 +TIGIT -細胞結合。與用於結合在PD-1 +TIGIT -Jurkat細胞上的二價抗PD-1抗體相比，AZD2936展現出增加的（4.82倍）結合EC 50值（表7）和增加的最大結合（圖9B）。該等結果展現出單價結合對於Jurkat細胞上TIGIT或PD-1的接合係足夠的。 [ 表 6] ： AZD2936 和抗 TIGIT 對 TIGIT +Jurkat 細胞的結合活性
實驗 #1 實驗 #2 平均 EC 50 （ nM ） 倍數變化相比於抗 TIGIT
EC 50 （ nM ） EC 50 （ nM ）
AZD2936 0.303 0.375 0.339 2.85
抗TIGIT 0.092 0.147 0.119 1.00
[ 表 7] ： AZD2936 和抗 PD-1 對 PD-1 +Jurkat 細胞的結合活性
實驗 #1 實驗 #2 平均 EC 50 （ nM ） 倍數變化相比於抗 PD-1
EC 50 （ nM ） EC 50 （ nM ）
AZD2936 0.944 5.490 3.217 4.82
抗PD-1 0.349 0.985 0.667 1.00
[ 表 8] ：AZD2936對PD-1 +TIGIT -、PD-1 -TIGIT +和PD-1 +TIGIT +Jurkat細胞的結合活性
實驗 #1 實驗 #2 平均 EC 50 （ nM ）
EC 50 （ nM ） EC 50 （ nM ）
PD-1 +TIGIT +Jurkat 0.495 0.769 0.632
PD-1 -TIGIT +Jurkat 0.282 0.346 0.314
PD-1 +TIGIT -Jurkat 0.584 1.01 0.797
藉由流動式細胞測量術結合測定確定AZD2936與表現PD-1（PD-1 +TIGIT -）或TIGIT（PD-1 -TIGIT +）或兩種受體（PD-1 +TIGIT +）的Jurkat細胞系的細胞結合特性。如圖9C所示，AZD2936與具有類似細胞結合特性的所有三種類型的Jurkat細胞結合。為了評估三種細胞系之間AZD2936結合親和力的差異，確定了EC 50值（表8）。AZD2936對PD-1單表現細胞系的平均EC 50係0.797 nM。AZD2936對TIGIT +PD-1 +雙表現細胞系的平均EC 50係0.632 nM。與工程化以僅表現TIGIT受體的細胞系結合產生0.314 nM的最低平均EC 50值。 NFAT 螢光素酶報告基因雙細胞共培養測定
如圖10A-10C所示，針對單特異性抗PD1（LO115）、單特異性抗TIGIT（VAR1）和同種型對照，測試了AZD2936。與單特異性抗體相比，AZD2936對PD-1和TIGIT兩者均顯示出活性並且具有更強的配位基阻斷活性。特別地，為了評估AZD2936阻斷PD-1/PD-L1和/或TIGIT/CD155相互作用的能力，使用基因工程化以表現OKT3、PD-L1和CD155的抗CD3 scFv的CHO-K1細胞，和基因工程化以表現人PD-1、人TIGIT或兩種抗原的Jurkat NFAT螢光素酶報告基因T細胞，進行雙細胞共培養生物活性測定。在測定中，在NFAT回應元件的控制下，測量回應於由OKT3刺激的螢光素酶活性。NFAT傳訊發生在TCR傳訊的下游，並且據報導與T細胞活化的其他測量例如增殖和細胞介素釋放相關。完全阻斷PD-1/PD-L1和/或TIGIT/CD155相互作用有助於最大的TCR激動作用和隨後的螢光素酶活性。
在與CHO-K1 OKT3 PD-L1 CD155細胞和PD-1 +TIGIT -Jurkat T細胞NFAT螢光素酶報告基因細胞的雙細胞共培養測定中測試了AZD2936阻斷PD-1/PD-L1相互作用的活性。AZD2936在兩個重複實驗中顯示出濃度依賴性活性，其中平均EC50係4.26 nM（來自實驗#1和#2的EC50分別是4.70和3.83 nM）（圖10A和表9）。在同一測定中，抗PD-1的平均EC50係3.03 nM（來自實驗#1和#2的EC50分別是1.93和4.14 nM）。在此測定中，抗TIGIT抗體和同種型對照抗體均未顯示出活性。
測試了AZD2936阻斷TIGIT/CD155相互作用的活性。在此測定中，將CD155 aAPC/CHO-K1細胞與Jurkat PD-1 -TIGIT +NFAT螢光素酶報告基因細胞共培養，並且比較AZD2936、抗TIGIT mAb和同種型對照mAb治療後誘導的螢光素酶活性。在此測定中，AZD2936顯示出了與同種型對照抗體相比增加的活性，來自兩個實驗的平均EC50係15.3 nM（實驗#1和#2中的EC50分別是17.0 nM和13.7 nM）（圖10B和表10）。在同一實驗中，抗TIGIT治療導致來自兩個實驗的平均EC50係2.22 nM（實驗#1和#2中的EC50分別是1.59和2.85 nM）。
在測定中，用CHO-K1 OKT3 PD-L1 CD155細胞和PD-1 +TIGIT +Jurkat T細胞NFAT螢光素酶報告基因細胞測試AZD2936阻斷PD-1/PD-L1和TIGIT/CD155相互作用的活性。AZD2936在兩個重複實驗中顯示出活性，其中平均EC50係5.82 nM（在兩個單獨的實驗中，EC50係5.57和6.07 nM）（圖10C和表11）。 [ 表 9] ： AZD2936 和抗 PD-1 抗體在人 PD-1 +TIGIT -Jurkat T 細胞 NFAT 螢光素酶報告基因雙細胞共培養測定中的生物活性
   實驗 #1 實驗 #2 平均 EC 50 （ nM ） 平均 EC 50 的倍數變化相比於抗 PD-1
EC 50 （ nM ） EC 50 （ nM ）
AZD2936 4.70 3.83 4.26 1.40
抗PD-1 1.93 4.14 3.03 1.00
EC 50= 半最大有效濃度； NFAT = 活化的 T 細胞的核因子； PD-1 = 計劃性細胞死亡蛋白 1 ； TIGIT = 具有 Ig 和基於免疫受體酪胺酸的抑制模體結構域的 T 細胞免疫受體。 EC 50 源自由 3 個重複取得的平均值。[ 表 10] ：AZD2936和抗TIGIT抗體在人PD-1 -TIGIT +Jurkat T細胞NFAT螢光素酶報告基因雙細胞共培養測定中的生物活性
實驗 #1 實驗 #2 平均 EC 50 （ nM ） 平均 EC 50 的倍數變化相比於抗 TIGIT
EC 50 （ nM ） EC 50 （ nM ）
AZD2936 17.0 13.7 15.3 6.89
抗TIGIT 1.59 2.85 2.22 1.00
EC 50= 半最大有效濃度；NFAT = 活化的T細胞的核因子；PD-1 = 計劃性細胞死亡蛋白1；TIGIT = 具有Ig和基於免疫受體酪胺酸的抑制模體結構域的T細胞免疫受體。 EC 50源自由3個重複取得的平均值。 [ 表 11] ：AZD2936和抗PD-1與抗TIGIT抗體的組合在人PD-1 +TIGIT +Jurkat T細胞NFAT螢光素酶報告基因雙細胞共培養測定中的生物活性
   實驗 #1 實驗 #2 平均 EC 50 （ nM ） 平均 EC 50 的倍數變化相比於抗 TIGIT 與抗 PD-1 組合
EC 50 （ nM ） EC 50 （ nM ）
AZD2936 5.57 6.07 5.82 0.93
抗TIGIT與抗PD-1抗體的組合 6.09 6.45 6.27 1.00
EC 50= 半最大有效濃度；NFAT = 活化的T細胞的核因子；PD-1 = 計劃性細胞死亡蛋白1；TIGIT = 具有Ig和基於免疫受體酪胺酸的抑制模體結構域的T細胞免疫受體。EC50源自由3個重複取得的平均值。 實例 4 ： OE21 腫瘤細胞殺傷測定
在體外檢測系統中評估了AZD2936殺傷OE21腫瘤細胞的能力。此節中使用的縮寫係：ANOVA = 方差分析；CMV = 巨細胞病毒；EBV = EB病毒；ELISA = 酶聯免疫吸附測定；IFN-γ = 干擾素-γ；ns = 不顯著；OE21-VP = 工程化以表現病毒肽（VP）的人高加索食管鱗狀細胞癌細胞系；PBMC = 外周血單核細胞；PD-1 = 計劃性細胞死亡蛋白1；TIGIT = 具有Ig和基於免疫受體酪胺酸的抑制模體結構域的T細胞免疫受體。 HLA 匹配的、抗原特異性 T 細胞和腫瘤細胞共培養系統以及穩定表現病毒肽抗原的 OE21 腫瘤細胞系的產生
產生HLA匹配的、抗原特異性T細胞和腫瘤細胞共培養模型以評估AZD2936對T細胞介導的腫瘤細胞殺傷的體外活性和效力。將HLA-A*02:01陽性的人食管鱗狀細胞癌細胞系OE21工程化以表現已知與HLA-A*02:01（OE21-VP）結合的六種病毒抗原肽。所利用的六種病毒肽係人EB病毒LMP2 356-364肽（FLYALALLL的胺基酸序列；SEQ ID NO: 29）、LMP2 426-434（CLGGLLTMV的胺基酸序列；SEQ ID NO: 30）、BMLF1 280-288（胺基酸序列GLCTLVAML；SEQ ID NO: 31）；流感M1 58-66（胺基酸序列GILGFVFTL；SEQ ID NO: 32），甲型流感PA46-54（胺基酸序列FMYSDFHFI；SEQ ID NO: 33）；以及巨細胞病毒pp65 495-503（胺基酸序列NLVPMVATV；SEQ ID NO: 34）。藉由基因合成（GeneArt™，普萊森頓（Pleasanton），加利福尼亞州）產生由組成型人泛素C啟動子驅動的編碼病毒肽和GFP報告基因盒的轉基因。使用標準分子生物學技術將轉基因插入慢病毒表現載體中。然後，根據製造商的說明，使用pPACKH1 HIV慢病毒載體包裝套組（Kit）（系統生物科學公司（Systems Bioscience），帕洛阿爾托（Palo Alto），加利福尼亞州），將經序列驗證的轉基因構建體用於從HEK293FT（生命技術公司（Life Technologies），格蘭德艾蘭，紐約州）生產細胞系產生慢病毒顆粒。藉由螢光活化細胞分選法（FACS）選擇單細胞轉基因過表現選殖系以分離GFP+細胞，並且將表現均勻轉基因表現譜的細胞系貯藏並進一步表徵。 從 HLA-A*02:01 陽性健康供體擴增 GLCTLVAML （ SEQ ID NO: 31 ）和 NLVPMVATV （ SEQ ID NO: 34 ）肽特異性 T 細胞
使用流動式細胞測量術，針對活化標誌物，篩選來自HLA-A*02:01陽性健康供體的外周血單核細胞（PBMC）對EBV BMLF1 280-288肽（GLCTLVAML）和CMV pp65 495-503肽（NLVPMVATV）的反應性。簡而言之，將PBMC用1 µg/mL肽和55國際單位（IU）/mL IL-2處理七天，隨後用螢光軛合的CD3、CD8、CD25和TIM3抗體染色，並且藉由流動式細胞測量術評估結合。如果 ＞ 10%的CD3+CD8+ T細胞染色對CD25和TIM-3均呈陽性，則供體被鑒定為EBV或CMV反應性。
根據製造商的說明，使用RoboSep™-S自動細胞分離器（幹細胞技術公司（StemCell Technologies），劍橋，麻塞諸塞州）與EasySep™直接人PBMC分離套組（幹細胞技術公司）組合，從健康供體（HLA A*02:01陽性）血液中分離出對EBV BMLF1 280-288肽或CMV pp65 495-503肽有反應性的PBMC。如圖1B所示，然後在1 µg/mL肽（MBL國際公司（MBL International Corporation））和55 IU/mL重組人IL-2（派普泰克公司（PeproTech））存在下，將分離的PBMC以1.5 x 10 7個細胞/mL重懸於含有RPMI-1640™（Gibco公司）的完全RPMI培養基和AIM-V™培養基（Gibco公司）、5% HI人血清（西格瑪奧德里奇公司（Sigma Aldrich））、100 U/mL青黴素（Gibco公司）和100 µg/mL鏈黴素（Gibco公司）的1 : 1混合物中持續半小時，隨後在G-Rex6 ®孔板（威爾遜-沃爾夫公司（Wilson Wolf Corporation））中以40 mL IL-2培養基/孔，在37°C，5% CO2下培養7天，然後進行分析。 GLCTLVAML （ SEQ ID NO: 31 ）和 NLVPMVATV （ SEQ ID NO: 34 ）肽特異性 CD8+ T 細胞的分析
使用LSR II ®儀器（BD生物科學公司（BD Biosciences））藉由流動式細胞測量術分析擴增的PBMC以定量抗原特異性CD8+ T細胞。擴增後，將PBMC用FACS緩衝液（PBS pH 7.2（Gibco公司）、2% FBS（Gibco公司）和2 mM EDTA（Gibco公司））洗滌，並且在室溫下與經螢光標記的HLA-A*02:01/GLCTLVAML或HLA-A*02:01/NLVPMVATV dextramer（ImmuDex™）一起孵育30分鐘。另外將PBMC與經螢光標記的抗CD3（植株HIT3a，生物傳奇公司（Biolegend））、抗CD8（植株HIT8A，生物傳奇公司）、抗PD-1（植株EH12.2H7，生物傳奇公司）和抗TIGIT（植株A15153G，Biolegend™）一起共同染色以區分不同的細胞群體。在用FACS緩衝液洗滌兩次後，藉由流動式細胞測量術分析細胞以檢測結合的抗體。使用FACSDiva™軟體（BD生物科學公司）檢測結合到細胞表面的抗體的數量。使用FlowJo™軟體（BD生物科學公司）進行數據分析。擴增後，使用下式確定抗原特異性CD8+ T細胞的百分比（基於單峰、無碎片、CD3+、CD8+和針對GLCTLVAML或NLVPMVATV dextramer陽性的閘控）： 抗原特異性CD8+ T細胞的總數 = A x (B/100)；
其中A係收集的細胞總數，B係dextramer陽性的、單峰的、減碎片（Minus Debris）的CD3+CD8+ T細胞的百分比。 T 細胞殺傷測定
開發共培養測定系統以測量AZD2936修飾抗原特異性CD8+ T細胞殺傷腫瘤細胞的能力。利用安捷倫xCELLigence RTCA ®平臺評估腫瘤細胞裂解，其中細胞阻抗的損失被用作腫瘤細胞死亡的替代物（Oberg等人, Front Immunol. [免疫學前沿] 2014; 5: 643）。簡而言之，使用胰蛋白酶從細胞培養瓶中收穫OE21-VP細胞，將其用完全RPMI™培養基洗滌一次，重懸於完全RPMI™培養基中，並且以10,000個細胞每/孔添加到96孔RTCA E-Plates®的每個孔中。根據製造商的說明，將腫瘤細胞在37°C、5% CO2下在E-Plates ®中培養24小時。將供測試物品和對照物品添加到孔中，然後立即以最佳效應子比靶標（E : T）比率添加肽特異性CD8+ T細胞，該比率為此研究中利用的每個供體CD8+ T細胞群體預先確定的（以2 : 1的效應子T細胞比腫瘤靶標比率）。在添加T細胞後的3-8天的範圍內監測腫瘤細胞死亡和細胞溶解百分比（供體依賴性），並且根據製造商的說明使用RTCA Pro ®軟體計算值。 EC50 值的分析
在RTCA PRO ®軟體（安捷倫公司（Agilent））上計算細胞阻抗的損失，該軟體測量即時細胞阻抗做為腫瘤細胞殺傷的標誌物。確定並且繪製即時細胞溶解（細胞溶解*小時）的曲線下面積以在Prism Software ®（GraphPad軟體公司（GraphPad Software），聖地牙哥，加利福尼亞州）中計算與不單獨包含供測試物品或對照物品的T細胞共培養物相比較（基線效應），濃度範圍從0.0001 nM至10 nM的供測試物品和對照物品共培養物的EC50值。每10分鐘連續測量阻抗一次，直到研究完成，該研究發生在T細胞添加6天以後。 共培養上清液中 IFN-γ 濃度的測量
為了評估在含有OE21-VP腫瘤細胞和腫瘤反應性CD8+ T細胞的共培養物的上清液內檢測到的IFN-γ的量，在Nunc 96孔板（西格瑪奧德里奇公司）和xCELLigence ®RTCA E-Plates ®中建立了單獨的平行共培養物。為了評估IFN-γ的釋放，二十四小時後從Nunc 96孔板中的共培養物中收穫上清液。在供測試物品和對照物品的200 pM濃度評估IFN-γ水平的比較。根據製造商的說明，使用人IFN-γ的Mesoscale Discovery多點ELISA測量IFN-γ。 統計方法
對於細胞溶解和IFN-γ釋放，在Prism ®，Windows ®8.0.1版（GraphPad軟體公司，聖地牙哥，加利福尼亞州）中進行統計分析。進行單向ANOVA、假設球形（差異的等變化性）、Tukey多重比較檢驗。使用對數劑量相比於標準化反應的非線性擬合曲線對EC50值進行建模。為了評估AZD2936與抗PD-1治療組之間EC50值的差異，對EC50值進行對數轉換，使用雙尾未配對學生t檢驗比較組平均值，並且假設兩組的方差不相等評估該組平均值。每個圖中的p值呈現為非顯著性（ns）p ＞ 0.05、* p ＜ 0.05、** p ＜ 0.01、*** p ＜ 0.001、**** p ＜ 0.0001。
從五名健康人供體中收集並且合併CD8陽性T細胞。將用EBV或CMV肽擴增的原代人PBMC與供測試物品和對照物品（0.2 nM同種型對照、0.2 nM抗PD-1、0.2 nM抗TIGIT、0.1 nM抗PD-1+0.1 nM抗TIGIT或0.2 nM AZD2936）和OE21-VP腫瘤細胞共培養。
圖11A示出了在此CD8 T細胞介導的體外細胞殺傷測定中，AZD2936具有比抗PD-1增加的活性。如圖11A所示，與單獨投與抗PD1抗體相比，AZD2936顯示出在OE21-VP腫瘤細胞殺傷中的顯著改善。
[00134]抗原識別後，CD8+ T細胞分泌IFN-γ，該IFN-γ係進一步促進抗腫瘤免疫和CD8+ T細胞毒性效應的細胞介素（Bhat等人, Cell Death Dis. [細胞死亡和疾病], 2017年6月1日; 8（6）: e2836）。因此，在肽特異性CD8+ T細胞與OE21-VP細胞共培養後評估IFN-γ釋放。
將用EBV或CMV肽擴增的原代人PBMC與供測試物品和對照物品（0.2 nM同種型對照、0.2 nM抗PD-1、0.2 nM抗TIGIT、0.1 nM抗PD-1+0.1 nM抗TIGIT或0.2 nM AZD2936）和OE21-VP腫瘤細胞共培養。從添加T細胞二十四小時後收集的上清液中測量T細胞和腫瘤細胞共培養測定的IFN-γ濃度。結果顯示於圖11B中。使用人IFN-γ的Mesoscale Discover多點ELISA確定IFN-γ的濃度。報導了與同種型對照的平均值相比，所有值的倍數變化。數據表示4個不同的供體。使用單向ANOVA和Tukey多重比較檢驗來計算統計顯著性。水平線表示組內算術平均值。***，p ＜ 0.001，****，p ＜ 0.0001。
如圖11B所示，在從四名健康供體的PBMC分離和擴增的T細胞的共培養物中，與同種型對照和抗PD-1相比，AZD2936在與腫瘤細胞共培養的上清液中誘導IFN-γ的量在統計學上顯著增加。
還將體外細胞殺傷測定用於確定AZD2936與抗PD-1抗體之間的細胞毒性的差異。從10 nM到0.1 pM的抗體的濃度滴定示出，AZD2936的算術平均EC50係21.9 ± 3.4 pM（SD），並且抗PD 1的平均EC50係163 ± 70.6 pM（SD）（圖11D），導致與抗PD-1相比，AZD2936的效力增加了6.44倍（圖11C）。 實例 5 ： OE21 和 PC9-MART1 人異種移植腫瘤小鼠模型
將OE21腫瘤模型和PC9-MART1腫瘤模型（分別為圖12A-12D和13A-13D）用於研究AZD2936抑制腫瘤生長的能力。使用免疫缺陷非肥胖糖尿病/重度聯合免疫缺陷（NOD-scid）IL-2受體γ-無效（NSG）小鼠，在人腫瘤異種移植小鼠模型中研究AZD2936的活性。將被工程化以表現由HLA-A*2:01呈遞的肽抗原的人癌細胞系皮下接種於動物。其中一個模型利用OE21-VP，這係被工程化以表現病毒肽的食管癌細胞系。另一個模型利用PC9-MART1，這係被工程化以表現黑色素瘤抗原-1的肺腺癌細胞系。
藉由皮下（SC）注射將腫瘤細胞系注射到小鼠側腹，並且在腫瘤體積增長至大約200 mm 3後，每隻小鼠接受IV注射對腫瘤細胞系表現的抗原具有特異性的人T細胞。在隨機化後24小時內，動物接受了第一劑量的供測試物品和對照物品，並且隨後皮下投與了三個額外劑量的供測試物品和對照物品。
如圖12A-12D和13A-13D所示，與AZD2936的親本二價抗PD-1抗體（抗PD-1）、抗TIGIT和抗PD-1組合以及靶向無關抗原的二價同種型對照抗體R347（同種型對照）的活性相比，向動物腹膜內投與AZD2936顯著抑制腫瘤的生長。AZD2936治療在整個研究期間以及在利用具有不同抗原特異性的T細胞的兩個異種移植小鼠模型中抑制腫瘤生長。AZD2936的抗腫瘤活性係利用源自兩個獨立健康供體的腫瘤特異性T細胞產生的，這兩個供體各自用於OE21-VP和PC9-MART-1模型。 實例 6 ： AZD2936 的效應子功能的表徵
治療性抗體依賴於兩種類型的功能性來發揮臨床功效：藉由Fab結構域的靶標特異性結合和經由Fc結構域相互作用的免疫介導效應子功能。當IgG抗體經由其Fab結構域與細胞表面抗原結合時，抗體的Fc部分可以與補體組分1q（C1q）（抗體觸發的經典補體途徑的第一個成員）結合，或可以與自然殺手細胞和其他骨髓細胞上表現的Fcγ受體（FcγRs）接合。
與C1q的相互作用啟動補體級聯，導致膜攻擊複合物的形成，該膜攻擊複合物藉由破壞靶細胞膜殺傷靶細胞，這一過程被描述為補體依賴性細胞毒性（CDC）。抗體的Fc結構域與FcγRIIIa的相互作用誘導FcγR的交聯，從而觸發含有穿孔素和顆粒酶的細胞毒性顆粒的釋放，導致與抗體的抗原結合結構域結合的靶細胞的死亡，這一過程稱為抗體依賴性細胞毒性（ADCC）（Nimmerjahn和Ravetch, Nature Reviews Immunology [免疫學自然綜述], 8: 34-47, 2008）。AZD2936係單價、雙特異性、人源化的IgG1單株抗體，被工程化為在其Fc結構域內具有突變，從而減小Fc介導的效應子功能性。該等Fc突變係三重突變L234F/L235E/P331S。利用工程化以表現TIGIT和PD-1的Jurkat細胞系評估AZD2936啟動CDC和ADCC活性的潛力。
在與AZD2936、IgG1-TM同種型對照、利妥昔單抗、或IgG1同種型對照以及含有補體的人血清或熱滅活的人血清一起孵育後，藉由添加Cell-Titer Glo ®估計活的、表現PD-1和TIGIT的Jurkat細胞（圖14A）或Daudi細胞（圖14B）的百分比。Cell-Titer Glo ®產生的發光信號與每個孔中的活細胞數成正比。該等結果示出，AZD2936不會在PD-1 +TIGIT +細胞中觸發CDC（圖14A）。相反地，利妥昔單抗（已知具有CDC活性的抗CD20抗體）在與AZD2936的測定中使用的相同人血清存在下，對表現CD20的Daudi細胞展現出濃度依賴性效應，但是在熱滅活的血清對照存在下，則沒有展現出濃度依賴性效應（圖14B）。IgG1同種型對照對任一種細胞類型的活細胞的百分比均無任何影響。使用熱滅活的血清的樣本沒有導致活性的濃度依賴性降低，證實觀察到的細胞死亡係由CDC介導的。
利用來自健康供體的PBMC作為效應細胞，並且以表現PD-1和TIGIT的Jurkat細胞系作為靶細胞，評估抗體依賴性細胞毒性（ADCC）活性。在此測定中，在所有匹配濃度高於0.061 ng/mL的情況下，使用表現CD20的Daudi細胞作為靶細胞，AZD2936展現出與同種型對照樣本類似的活性，並且與陽性對照利妥昔單抗相比，產生了ADCC活性的統計學顯著降低（圖15）。這項研究的結果示出，AZD2936對表現PD-1和TIGIT的Jurkat細胞系沒有觸發ADCC或CDC。
無
[圖1]示出了在親本VAR1可變重鏈中鑒定的殘基之序列分析。
[圖2]示出了在親本VAR1可變輕鏈中鑒定的殘基之序列分析。
[圖3A和3B]示出了親本VAR1的可變重鏈與種系序列之比對。圖3A中的CDR根據Chothia編號系統突出顯示。圖3B中的CDR根據IMGT編號系統突出顯示。比對說明，親本VAR1具有不是種系並且不是維尼爾殘基的在FR1中的四個胺基酸。
[圖4A和4B]示出了親本VAR1的可變輕鏈與種系序列之比對。比對說明，親本VAR1的VL具有十個不是種系的胺基酸、在FR3中具有維尼爾殘基Q（Q-K）、在CDRL3之前具有鏈包裝殘基F（F-Y）、並且在CDRL3之後具有鏈包裝殘基L（L-F）。
[圖5]示出VAR1變體保持了有效的表現和配對特性。
[圖6A和6B]示出VAR1變體保留了親本mAb對人和食蟹猴（cynomolgus）TIGIT OE 293s的細胞結合特性。數據表示為中位數螢光強度（MFI）。
[圖7]示出了本文所揭露的結合蛋白的特定方面之特徵和形式。
[圖8A-8B]。圖8A示出了使用抗原捕獲形式之同時結合。負載人TIGIT抗原的感測器首先與AZD2936、然後與人PD-1進行連續的締合和解離相互作用。Asso：締合；Disso：解離；SA：鏈黴親和素。圖8B示出了使用抗原捕獲形式的同時結合。負載人PD-1抗原的感測器首先與AZD2936、然後與人TIGIT進行連續的締合和解離相互作用。Asso：締合；Disso：解離；Ni-NTA：鎳胺三乙酸。
[圖9A-9C]示出與單特異性抗體相比，AZD2936展現出PD-1和TIGIT結合活性。圖9A示出了AZD2936與工程化Jurkat PD-1 -TIGIT +細胞上的人TIGIT受體之細胞結合。圖9B示出了AZD2936與工程化Jurkat PD-1 +TIGIT -細胞上的人PD-1受體之細胞結合。圖9C示出了AZD2936與Jurkat PD-1 -TIGIT +、Jurkat PD-1 +TIGIT -、或雙表現Jurkat PD-1 +TIGIT +上的人PD-1和TIGIT受體之細胞結合。MFI = 幾何平均螢光強度；PD-1 = 計劃性細胞死亡蛋白1；TIGIT = 具有Ig和基於免疫受體酪胺酸的抑制模體結構域的T細胞免疫受體。與人單表現細胞系：Jurkat PD-1 -TIGIT +和Jurkat PD-1 +TIGIT -或人雙表現Jurkat PD-1 +TIGIT +的細胞結合。用螢光軛合的山羊抗人IgG第二抗體檢測測試品和對照品抗體，並且藉由流動式細胞測量術進行評估。
[圖10A-10C]示出與單特異性抗體相比，使用Jurkat報告基因測定，AZD2936展現出PD-1和TIGIT配位基阻斷活性，以增強TCR介導的傳訊。圖10A示出了AZD2936和抗PD-1抗體在人PD 1 +TIGIT -Jurkat T細胞NFAT螢光素酶報告基因雙細胞共培養測定中的生物活性。圖10B示出了AZD2936在人PD-1 -TIGIT +Jurkat T細胞NFAT螢光素酶報告基因雙細胞共培養測定中的生物活性。圖10C示出了AZD2936在人PD-1 +TIGIT +Jurkat T細胞NFAT螢光素酶報告基因雙細胞共培養測定中的生物活性。CD155 = 分化簇155；CHO = 中國倉鼠卵巢；NFAT = 活化的T細胞的核因子；PD-1 = 計劃性細胞死亡蛋白1；RLU = 相對光單位；SD = 標準差；TCR = T細胞受體；TIGIT = 具有Ig和基於免疫受體酪胺酸的抑制模體結構域的T細胞免疫受體。
[圖11A-11D]示出了在如實例4所述之細胞殺傷測定中AZD2936的細胞殺傷活性和IFN-γ釋放的刺激。圖11A示出了來自五個供體的PBMC的數據。圖11B示出了響應於AZD2936和其他抗體的從T細胞和人腫瘤細胞共培養測定中釋放的人IFN-γ的倍數增加。圖11C示出了從10 nM到0.1 pM的抗體之濃度滴定。圖11D示出了在與圖11C類似進行的測定中AZD2936（n = 6）之算術平均細胞毒性EC50。
[圖12A-12D]示出了在OE21腫瘤模型中，AZD2936具有比抗PD-1更強的抗腫瘤活性。12A和12B中的垂直虛線示出了腹膜內注射（IP）藥物給藥。
[圖13A-13D]示出了在PC9-MART1腫瘤模型中，AZD2936具有比抗PD-1更大的抗腫瘤活性。13A和13B中的垂直虛線示出了腹膜內注射（IP）藥物給藥。
[圖14A-14B]示出在與AZD2936、IgG1-TM同種型對照、利妥昔單抗、或IgG1同種型對照以及含有補體的人血清或熱滅活的人血清一起孵育後，活的、表現PD-1和TIGIT的Jurkat細胞（圖14A）或Daudi細胞（圖14B）之百分比，如實例6所述。誤差棒表示SD（n = 2）。
[圖15]示出了原代人PBMC對表現PD-1和TIGIT的Jurkat細胞或對Daudi細胞的特異性殺傷。如實例6所述，濃度依賴性ADCC由利妥昔單抗介導，而不是由IgG1同種型對照、AZD2936、或IgG1 TM同種型對照介導。誤差棒表示SD（n = 2）。
無
 

          <![CDATA[<110>  美商麥迪紐有限責任公司(MEDIMMUNE, LLC)]]>
          <![CDATA[<120>  雙特異性PD-1和TIGIT結合蛋白及其用途]]>
          <![CDATA[<130>  TIGIT-101-US-NP]]>
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          <![CDATA[<141>  2022-04-29]]>
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          Asp Tyr Gly Met His 
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          Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Ser Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
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          Arg Ala Pro Asn Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr 
          1               5                   10              
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          Ser Ala Ser Ser Lys His Thr Asn Leu Tyr Trp Ser Arg His Met Tyr 
          1               5                   10                  15      
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          Leu Thr Ser Asn Arg Ala Thr 
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Ser Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Arg Ala Pro Asn Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
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          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Ser Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Arg Ala Pro Asn Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                      260                 265                 270         
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                  275                 280                 285             
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 
              290                 295                 300                 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                      340                 345                 350         
          Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
              370                 375                 380                 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro Gly Lys 
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          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
          Tyr Trp Ser Arg His Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 
                  35                  40                  45              
          Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro 
              50                  55                  60                  
          Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 
                          85                  90                  95      
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          <![CDATA[<223>  合成肽]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Lys His Thr Asn Leu 
                      20                  25                  30          
          Tyr Trp Ser Arg His Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 
                  35                  40                  45              
          Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro 
              50                  55                  60                  
          Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 
                          85                  90                  95      
          Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 
              130                 135                 140                 
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 
                          165                 170                 175     
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
                      180                 185                 190         
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 
                  195                 200                 205             
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215                 
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成肽]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Ser Tyr Ala Met His 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成肽]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Val Ile Ser Tyr Ala Gly Glu Val Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成肽]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Asp Pro Leu Pro Leu His Tyr Tyr Gly Met Asp Val 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  13]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成肽]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg Arg Pro Val Asn 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成肽]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Ser Gln Asn Gln Arg Pro Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成肽]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Ala Val Trp Asp Asp Ile Gly Arg Val Leu Gln 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成肽]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Ile Ser Tyr Ala Gly Glu Val Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Pro Leu Pro Leu His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  451]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成肽]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Ile Ser Tyr Ala Gly Glu Val Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Pro Leu Pro Leu His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Cys Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 
                  195                 200                 205             
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Val 
              210                 215                 220                 
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                          245                 250                 255     
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                      260                 265                 270         
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                  275                 280                 285             
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
              290                 295                 300                 
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                      340                 345                 350         
          Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                  355                 360                 365             
          Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
              370                 375                 380                 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
                          405                 410                 415     
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                      420                 425                 430         
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Gly Lys 
              450     
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  110]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成肽]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg Arg 
                      20                  25                  30          
          Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Ser Gln Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gln Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Val Trp Asp Asp Ile Gly 
                          85                  90                  95      
          Arg Val Leu Gln Leu Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
          <![CDATA[<210>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  20]]>
          Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg Arg 
                      20                  25                  30          
          Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Ser Gln Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gln Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Val Trp Asp Asp Ile Gly 
                          85                  90                  95      
          Arg Val Leu Gln Leu Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Cys Ser Glu Glu 
                  115                 120                 125             
          Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 
              130                 135                 140                 
          Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 
                          165                 170                 175     
          Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 
                      180                 185                 190         
          Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 
                  195                 200                 205             
          Thr Val Ala Pro Thr Glu Val Ser 
              210                 215     
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  366]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          gaggtgcagc tggtggaatc cggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg       60
          tcttgcgccg cctccggctt cacattctcc gactacggca tgcactgggt ccgacaggcc      120
          cctggaaagg gcctggaatg ggtggcctac atctcctccg gctcctacac catctactcc      180
          gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac      240
          ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac acagccgtgt actactgtgc cagacgggcc      300
          cctaactcct tctacgagta ctacttcgac tactggggcc agggcaccac cgtgaccgtg      360
          tcctct                                                                 366
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  1359]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          gaggtgcagc tggtggaatc cggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg       60
          tcttgcgccg cctccggctt cacattctcc gactacggca tgcactgggt ccgacaggcc      120
          cctggaaagg gcctggaatg ggtggcctac atctcctccg gctcctacac catctactcc      180
          gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac      240
          ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac acagccgtgt actactgtgc cagacgggcc      300
          cctaactcct tctacgagta ctacttcgac tactggggcc agggcaccac cgtgaccgtg      360
          tcctctgcta gcaccaaagg tccgagcgtt tttccgctgg caccgagcag caaaagcacc      420
          tctggtggca ccgcagcact gggttgtctg gtgaaagatt attttccgga accggttacc      480
          gtttcttgga atagcggtgc actgaccagc ggtgttcata cctttccggc agttctgcag      540
          agcagcggtc tgtatagcct gtctagcgtt gttaccgttc cgagcagcag cctgggcacc      600
          cagacctata tttgcaatgt gaatcataaa ccgagcaata caaaagttga taaacgcgtt      660
          gaaccgaaaa gctgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgagttcgag      720
          gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg      780
          acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc      840
          aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag      900
          tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat      960
          ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagccagcat cgagaaaacc     1020
          atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtct gcaccctgcc cccatcccgg     1080
          gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg agctgcgcgg tcaaaggctt ctatcccagc     1140
          gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct     1200
          cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctcgttagca agctcaccgt ggacaagagc     1260
          aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac     1320
          tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga                            1359
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  336]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          cagatcgtgc tgacccagtc ccctgccacc ctgtccctga gccctggcga gagagccacc       60
          ctgagctgct ccgcctcctc caagcacacc aacctgtact ggtcccggca catgtactgg      120
          tatcagcaga agcccggcca ggcccctcgg ctgctgatct acctgacctc taaccgggcc      180
          accggcatcc ctgccagatt ctccggctct ggctccggca ccgacttcac cctgaccatc      240
          tccagcctgg aacccgagga cttcgccgtg tactactgcc agcagtggtc ctccaacccc      300
          ttcaccttcg gccagggcac caagctggaa atcaag                                336
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  660]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人]]>工序列
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          cagatcgtgc tgacccagtc ccctgccacc ctgtccctga gccctggcga gagagccacc       60
          ctgagctgct ccgcctcctc caagcacacc aacctgtact ggtcccggca catgtactgg      120
          tatcagcaga agcccggcca ggcccctcgg ctgctgatct acctgacctc taaccgggcc      180
          accggcatcc ctgccagatt ctccggctct ggctccggca ccgacttcac cctgaccatc      240
          tccagcctgg aacccgagga cttcgccgtg tactactgcc agcagtggtc ctccaacccc      300
          ttcaccttcg gccagggcac caagctggaa atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc      360
          ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg      420
          ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa      480
          tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc      540
          agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa      600
          gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag      660
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  363]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          caggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc       60
          tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct      120
          ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg cgggggaggt gaaatactac      180
          gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat      240
          ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagacccg      300
          ctaccgctac attactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc      360
          tca                                                                    363
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  1356]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          caggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc       60
          tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct      120
          ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg cgggggaggt gaaatactac      180
          gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat      240
          ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagacccg      300
          ctaccgctac attactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc      360
          tcagcgtcga ccaaaggtcc gagcgtgtgc ccgctggcac cgagcagcaa aagcacctct      420
          ggtggcaccg cagcactggg ttgtctggtg aaagattatt ttccggaacc ggttaccgtt      480
          tcttggaata gcggtgcact gaccagcggt gttcatacct ttccggcagt cctgcagagc      540
          agcggtctgt atagcctgtc tagcgttgtt accgttccga gcagcagcct gggcacccag      600
          acctatattt gcaatgtgaa tcataaaccg agcaatacca aagttgataa acgcgttgaa      660
          ccgaaaagcg tggacaaaac tcacacgtgc ccaccgtgcc cagcacctga gttcgagggg      720
          ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc      780
          cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac      840
          tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac      900
          aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc      960
          aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag ccagcatcga gaaaaccatc     1020
          tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtctaca ccctgccccc atgccgggag     1080
          gagatgacca agaaccaggt cagcctgtgg tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac     1140
          atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc     1200
          gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg     1260
          tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac     1320
          acgcagaaga gcttaagcct gtctccgggt aaatga                               1356
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  330]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          cagtctgtgc tgactcagcc tccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc       60
          tcttgttctg gaagcagctc caatatcgga aggaggcctg taaactggta ccagcagctc      120
          ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtcagaatc agcggccctc aggggtccct      180
          gaccgattct ctggctccca gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag      240
          tctgaggatg aggctgatta tttctgtgca gtttgggatg acatcggccg cgtcctgcag      300
          ttaggcggag gcacccagct gaccgtccta                                       330
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  651]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          cagtctgtgc tgactcagcc tccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc       60
          tcttgttctg gaagcagctc caatatcgga aggaggcctg taaactggta ccagcagctc      120
          ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtcagaatc agcggccctc aggggtccct      180
          gaccgattct ctggctccca gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag      240
          tctgaggatg aggctgatta tttctgtgca gtttgggatg acatcggccg cgtcctgcag      300
          ttaggcggag gcacccagct gaccgtccta ggtcagccca aggcggcccc ctcggtcact      360
          ctgttcccgc cctgctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata      420
          agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag      480
          gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc      540
          tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg      600
          catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg gcccctacag aagtgtcatg a               651
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  EB病毒]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  EB病毒]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  EB病毒]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu 
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Claims (60)

  1. 一種特異性結合PD-1和TIGIT的雙特異性結合蛋白，該雙特異性結合蛋白包含： a)     特異性結合PD-1的第一結合結構域，其中該第一結合結構域包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3；以及 b)     特異性結合TIGIT的第二結合結構域，其中該第二結合結構域包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的LCDR3。
  2. 如請求項1所述之雙特異性結合蛋白，其中特異性結合PD-1的該第一結合結構域包含具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
  3. 如請求項1所述之雙特異性結合蛋白，其中特異性結合PD-1的第一結合結構域包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO: 7的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO: 9的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列。
  4. 如請求項1-3中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中特異性結合PD-1的該第一結合結構域包含具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的輕鏈。
  5. 如請求項1-3中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中特異性結合PD-1的第一結合結構域包含重鏈和輕鏈，該重鏈具有與SEQ ID NO: 8的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列，該輕鏈具有與SEQ ID NO: 10的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列。
  6. 如請求項1-5中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中特異性結合TIGIT的該第二結合結構域包含具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有SEQ ID NO: 19的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
  7. 如請求項1-5中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中特異性結合TIGIT的該第二結合結構域包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO: 17的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO: 19的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列。
  8. 如請求項1-7中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中特異性結合TIGIT的該第二結合結構域包含具有SEQ ID NO: 18的胺基序列的重鏈和具有SEQ ID NO: 20的胺基酸序列的輕鏈。
  9. 如請求項1-7中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中特異性結合TIGIT的該第二結合結構域包含重鏈和輕鏈，該重鏈具有與SEQ ID NO: 18的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列，該輕鏈具有與SEQ ID NO: 20的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列。
  10. 如請求項4所述之雙特異性結合蛋白，其中該輕鏈恒定區係κ鏈。
  11. 如請求項8所述之雙特異性結合蛋白，其中該輕鏈恒定區係λ鏈。
  12. 如請求項1-11中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中該結合蛋白係抗體。
  13. 如請求項12所述之雙特異性結合蛋白，其中該抗體係IgG抗體。
  14. 如請求項13所述之雙特異性結合蛋白，其中該抗體係IgG1抗體。
  15. 如請求項13或14所述之雙特異性結合蛋白，其中該抗體係人抗體或人源化抗體。
  16. 如請求項1-15中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中該雙特異性結合蛋白-人TIGIT相互作用的平衡解離常數（K D）小於或等於約15 pM。
  17. 如請求項1-15中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中該雙特異性結合蛋白-人TIGIT相互作用的平衡解離常數（K D）小於或等於約9 pM。
  18. 如請求項1-14中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中該雙特異性結合蛋白-人TIGIT相互作用的平衡解離常數（K D）係從約9 pM至約15 pM。
  19. 如請求項1-18中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中該雙特異性結合蛋白-人PD-L1相互作用的平衡解離常數（K D）小於或等於約0.4 nM。
  20. 如請求項1-19中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中該雙特異性結合蛋白-人PD-L1相互作用的平衡解離常數（K D）係從約0.3 nM至約0.5 nM。
  21. 如請求項1-20中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其包含變體Fc區。
  22. 如請求項21所述之雙特異性結合蛋白，其中該雙特異性結合蛋白在體內不觸發補體依賴性細胞毒性。
  23. 如請求項21所述之雙特異性結合蛋白，其中與具有野生型Fc區的雙特異性結合蛋白相比，該雙特異性結合蛋白具有降低的補體依賴性細胞毒性。
  24. 如請求項21所述之雙特異性結合蛋白，其中該雙特異性結合蛋白在體內不觸發抗體依賴性細胞毒性。
  25. 如請求項21所述之雙特異性結合蛋白，其中與具有野生型Fc區的雙特異性結合蛋白相比，該雙特異性結合蛋白具有降低的抗體依賴性細胞毒性。
  26. 如請求項21所述之雙特異性結合蛋白，其中該變體Fc區包含選自以下的至少一個取代：221K、221Y、225E、225K、225W、228P、234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235E、235F、236E、237L、237M、237P、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、250E、250Q、251F、252L、252Y、254S、254T、255L、256E、256F、256M、257C、257M、257N、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265A、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、296G、297S、297D、297E、298A、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、305I、308F、313F、316D、318A、318S、320A、320S、322A、322S、325Q、325L、3251、325D、325E、325A、325T、325V、325H、326A、326D、326E、326G、326M、326V、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、3281、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、3301、330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、3311、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、333A、333D、333G、333Q、333S、333V、334A、334E、334H、334L、334M、334Q、334V、334Y、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、428L、428F、433K、433L、434A、434W、434Y、436H、440Y和443W，如由Kabat中所示的EU索引進行編號。
  27. 如請求項21所述之雙特異性結合蛋白，其中該變體Fc區在選自428和434的位置處包含一個或多個胺基酸取代，該等位置如由Kabat中所示的EU索引進行編號。
  28. 如請求項21-27中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中該變體Fc區包含選自428L、428F、434A、434W和434Y的一個或多個胺基酸取代。
  29. 如請求項21-28中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中該變體Fc區包含YTE突變。
  30. 如請求項21-29中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中該Fc變體區對FcRn具有增加的結合親和力。
  31. 如請求項21-30中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其中該Fc變體區包含L234F/L235E/P331S三重突變（TM）。
  32. 如請求項12-31中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其包含Fc區，其中該Fc區係非糖基化的。
  33. 如請求項12-31中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其包含Fc區，其中該Fc區係去糖基化的。
  34. 如請求項12-31中任一項所述之雙特異性結合蛋白，其包含Fc區，其中該Fc區具有減少的岩藻糖基化或係非岩藻糖基化的。
  35. 一種藥物組成物，其包含如請求項1-34中任一項所述之雙特異性結合蛋白、和藥學上可接受的載劑。
  36. 如請求項35所述之藥物組成物，其進一步包含抗癌化合物，該抗癌化合物選自培美曲塞、卡鉑、吉西他濱、順鉑、紫杉醇或其組合。
  37. 一種核酸，其包含編碼如請求項1-34中任一項所述之雙特異性結合蛋白的核苷酸序列。
  38. 如請求項37所述之核酸，其中該核酸序列包含與SEQ ID NO: 21至少95%相同的序列、與SEQ ID NO: 23至少95%相同的序列、與SEQ ID NO: 25至少95%相同的序列和/或與SEQ ID NO: 27至少95%相同的序列。
  39. 如請求項37所述之核酸，其中該核酸序列包含SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25和/或SEQ ID NO: 27。
  40. 如請求項37所述之核酸，其中該核酸序列包含與SEQ ID NO: 22至少95%相同的序列、與SEQ ID NO: 24至少95%相同的序列、與SEQ ID NO: 26至少95%相同的序列和/或與SEQ ID NO: 28至少95%相同的序列。
  41. 如請求項37所述之核酸，其中該核酸序列包含SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26和/或SEQ ID NO: 28。
  42. 一種載體，其包含如請求項37-41中任一項所述之核酸。
  43. 一種宿主細胞，其包含如請求項42所述之載體。
  44. 一種宿主細胞，其包含載體，該載體包含與SEQ ID NO: 21至少95%相同的核酸序列、與SEQ ID NO: 23至少95%相同的核酸序列、與SEQ ID NO: 25至少95%相同的核酸序列和與SEQ ID NO: 27至少95%相同的核酸序列。
  45. 如請求項44所述之宿主細胞，其包含：載體，該載體包含與SEQ ID NO: 22至少95%相同的核酸序列、與SEQ ID NO: 24至少95%相同的核酸序列、與SEQ ID NO: 26至少95%相同的核酸序列和與SEQ ID NO: 28至少95%相同的核酸序列。
  46. 一種雙特異性抗體，其由如請求項43-45中任一項所述之宿主細胞表現。
  47. 一種治療患有腫瘤的受試者之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的如請求項1-34中任一項所述之雙特異性結合蛋白、如請求項35或36所述之藥物組成物或如請求項37-41中任一項所述之核酸。
  48. 一種在受試者中治療或預防癌症之方法，該方法包括向該受試者投與如請求項1-34中任一項所述之雙特異性結合蛋白、如請求項35或36所述之藥物組成物或如請求項37-41中任一項所述之核酸。
  49. 如請求項48所述之方法，其中該癌症係卵巢癌、乳癌、大腸直腸癌、前列腺癌、子宮頸癌、子宮癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸癌、黑色素瘤、胰臟癌、腎細胞癌、和肺癌中的一種或多種。
  50. 如請求項48或請求項49所述之方法，其中該癌症係非小細胞肺癌（NSCLC）。
  51. 如請求項50所述之方法，其中該NSCLC係晚期的或轉移性的。
  52. 一種增強受試者中的免疫反應之方法，該方法包括向該受試者投與如請求項1-34中任一項所述之雙特異性結合蛋白、如請求項35或36所述之藥物組成物或如請求項37-41中任一項所述之核酸。
  53. 如請求項1-34中任一項所定義的雙特異性結合蛋白，用於在療法中使用。
  54. 如請求項1-34中任一項所定義的雙特異性結合蛋白，用於在治療癌症中使用。
  55. 如請求項1-34中任一項所定義的雙特異性結合蛋白在製造用於治療癌症的藥物中之用途。
  56. 如請求項37-41中任一項所定義的核酸，用於在療法中使用。
  57. 如請求項37-41中任一項所定義的核酸，用於在治療癌症中使用。
  58. 如請求項37-41中任一項所定義的核酸在製造用於治療癌症的藥物中之用途。
  59. 一種治療患有腫瘤的受試者之方法，該方法包括與選自培美曲塞、卡鉑、吉西他濱、順鉑、紫杉醇或其組合的抗癌化合物組合地向該受試者投與治療有效量的如請求項1-34中任一項所述之雙特異性結合蛋白、如請求項35或36所述之藥物組成物或如請求項37-41中任一項所述之核酸。
  60. 一種在受試者中治療或預防癌症之方法，該方法包括與選自培美曲塞、卡鉑、吉西他濱、順鉑、紫杉醇或其組合的抗癌化合物組合地投與如請求項1-34中任一項所述之雙特異性結合蛋白、如請求項35或36所述之藥物組成物或如請求項37-41中任一項所述之核酸。
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