KR102557824B1 - 식물 발현 재조합 지카바이러스 외피단백질을 포함하는 백신 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

식물 발현 재조합 지카바이러스 외피단백질을 포함하는 백신 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 지카바이러스 외피단백질(Zika virus envelope protein) 및 애주번트(adjuvant)로서 알럼(alum), MPL(monophosphoryl lipid A) 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물, 상기 재조합 지카바이러스 외피단백질을 식물체에서 생산하기 위한 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 재조합 지카바이러스 외피단백질의 생산 방법 등에 관한 것이다.

Description

식물 발현 재조합 지카바이러스 외피단백질을 포함하는 백신 조성물 및 이의 제조방법 {Vaccine compositions comprising plant expressing recombinant Zika virus envelope proteins and preparation methods thereof}
본 발명은 재조합 지카바이러스 외피단백질(Zika virus envelope protein) 및 애주번트(adjuvant)를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물, 이의 제조방법, 상기 재조합 지카바이러스 외피단백질 생산용 식물발현 재조합 벡터 등에 관한 것이다.
현재 전 세계적으로 지카바이러스에 대한 감염 예방 또는 상기 바이러스 감염증의 치료를 위한 임상적으로 승인된 백신은 존재하지 않는다. 따라서 본 출원에 개시된 본 발명에 대한 종래 기술은 전무하다. 그러나 본 발명의 배경기술 및 목적에 대한 전반적인 이해를 제공하기 위해 다음과 같은 설명을 제시한다.
지카바이러스(Zika virus)는 모기를 매개체로 한 플라비바이러스 과(Flaviviridae family)의 플라비바이러스(flavivirus)로, 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군 및 태아, 신생아의 선천성 기형을 유도하는 전염병이다. 지카바이러스는 2013년 프랑스 폴리네시아에서 발생한 이래 감염력 및 병원성이 증가하여 위험성이 대두되었고, 2015년 5월 브라질에서 첫 보고 후 중남미에서 급격히 확산되었으며 2016년 6월 1일 기준 최근 발생국가(2015년 이후) 53개국, 2015년 브라질에서만 44만-130만 명 감염 추정, 5월 26일 기준 소두증 확진 240여명, 의심 및 진단 진행 중인 사례가 5천여 건에 달하는 등 감염이 지속적으로 확산 추세에 있어 질병의 유행 가능성을 감안한다면 시장 규모가 매우 클 것으로 예측되나 현재까지 지카바이러스 감염 예방 방법에는 질병 매개체의 방제를 위한 에어로졸 살충제(aerosol insecticide) 외에는 특별한 예방 방법이 존재하지 않는다. 최근에는 지카바이러스에 대응할 백신의 개발로서 사백신과 대장균 (E. coli) 발현 시스템을 이용한 재조합 단백질 발현을 통한 백신 개발이 진행 중에 있다. 생백신 또는 사백신으로 대표되는 기존의 백신은 독성을 나타낼 수 있다는 단점이 있고 특히 생백신은 돌연변이에 의한 부작용 등의 우려가 있다. 대장균 재조합 발현 시스템의 경우 저렴한 균주 유지비용과 단순한 배지 조성 및 배양 조건, 생산 공정의 단순화 등의 장점이 있으나 이종 단백질에 대한 면역 반응이 일어나는 등의 부작용을 유발할 우려가 있다. 따라서 상기와 같은 부작용을 최소화함과 동시에 면역원성 및 방어효능이 뛰어난 지카바이러스 백신의 필요성이 요구되고 있는 실정이다.
KR 10-2017-0125484 A
본 발명은 상기와 같은 지카바이러스 백신의 개발 필요성 및 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 도출된 것으로, 식물체를 이용하여 효율적인 생산이 가능할 뿐만 아니라, 높은 면역원성(immunogenicity) 및 바이러스 중화능(neutralization ability)을 나타내는 재조합 지카바이러스 외피단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 지카바이러스(Zika virus) 외피단백질; 및 애주번트(adjuvant)로서 알럼(alum), MPL(monophosphoryl lipid A) 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는, 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 지카바이러스 외피단백질의 유전자 서열을 포함하는, 지카바이러스 외피단백질 발현용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 제조된 재조합 지카바이러스 외피단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 지카바이러스 외피단백질의 생산 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 지카바이러스(Zika virus) 외피단백질; 및 애주번트(adjuvant)로서 알럼(alum), MPL(monophosphoryl lipid A) 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는, 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 지카바이러스 외피단백질; 및 애주번트로서 알럼, MPL 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 지카바이러스 감염증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
더욱이, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 지카바이러스 외피단백질; 및 애주번트로서 알럼, MPL 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 조성물의, 지카바이러스 감염증의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 지카바이러스 외피단백질; 및 애주번트로서 알럼, MPL 또는 이들의 조합의, 지카바이러스 감염증에 이용되는 백신을 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 재조합 지카바이러스 외피단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드가 융합된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 재조합 지카바이러스 외피단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드가 융합된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 재조합 지카바이러스 외피단백질은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드가 융합된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 재조합 지카바이러스 외피단백질은 서열번호 10 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 알럼은 재조합 지카바이러스 외피단백질 중량 대비 1 : 1 내지 50 (외피단백질 : 알럼) 비율로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 MPL은 재조합 지카바이러스 외피단백질 중량 대비 1 : 0.4 내지 2 (외피단백질 : MPL) 비율로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 알럼 및 MPL의 조합은 재조합 지카바이러스 외피단백질 중량 대비 1 : 1 내지 50 : 0.4 내지 2 (외피단백질 : 알럼 : MPL) 비율로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 백신 조성물은 1회 내지 3회 접종될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 접종은 14 내지 28일 간격으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 백신 조성물은 지카바이러스 PRVABC59 스트레인, 지카바이러스 MR766 스트레인 및 뎅기 바이러스(Dengue virus) 타입-2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상에 대한 방어능이 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 백신 조성물은 인터페론-감마(IFN-γ), 인터루킨-12(IL-12) 및 종양괴사인자-알파(TNF-α)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 분비를 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 백신 조성물은 모체 이행 항체(maternal antibody)의 형성을 유도할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 지카바이러스 외피단백질의 유전자 서열을 포함하는, 지카바이러스 외피단백질 발현용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 3의 염기서열을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 5의 염기서열을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 7의 염기서열을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 9의 염기서열을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 11 또는 서열번호 13의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 식물체에서 발현되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 형질전환체는 식물체일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 제조된, 재조합 지카바이러스 외피단백질을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 재조합 지카바이러스 외피단백질은 서열번호 10 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환체 또는 배양액으로부터 재조합 지카바이러스 외피단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 지카바이러스 외피단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 단계 (b)의 정제는 수용성 분획을 사용하여 정제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 지카바이러스 외피단백질은 식물체에서도 효과적으로 발현될 뿐만 아니라, 높은 수용해성(Water solubility)을 가지고 있어 분리 및 정제가 용이하고, 또한, 체내에서 항원으로 작용하여 높은 면역원성 및 바이러스 중화능을 나타내므로 신규한 지카바이러스 백신으로서 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 지카바이러스 외피단백질 함유 백신 조성물을 접종한 마우스의 면역세포는 외부 자극 항원에 대한 특이적 사이토카인(cytokine)인 인터페론-감마(IFN-γ), 인터루킨-12(IL-12) 및 종양괴사인자-알파(TNF-α)의 생산이 특이적으로 증가하는 것으로 나타나, 지카바이러스 감염에 대하여 면역학적 방어/예방 효능이 상승된다는 것이 밝혀졌다. 따라서 본 발명의 백신 조성물은 지카바이러스 감염증의 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명은 식물 세포 유래의 발현 시스템을 활용하여 개발된 재조합 지카바이러스 백신 조성물을 동물 모델에 직접 적용한 결과를 참조하여 면역 효능이 보다 탁월한 발현 시스템을 검증할 수 있고, 이는 인간에 적용 가능한 재조합 지카바이러스 백신의 개발을 촉구함과 동시에 지카바이러스와 유사한 여타의 모기 매개 전염병 백신의 개발에도 활용이 가능하다.
도 1은 식물체에서 두 가지의 재조합 지카바이러스 외피단백질의 발현을 위한 발현 카세트(cassette)의 유전자 배열을 나타낸 개열지도이다(약어, 이하 동일: NB, new chaperone binding protein; Zika Env, Zika envelope protein ectodomain; H, polyhistidine tag; hFc, Fc fragment of human immunoglobulin heavy chain; HDEL, histidine-aspartic acid-glutamic acid-leucine tag; Zika:Env1, NB-zika envelope protein ectodomain-H-HDEL; Zika:Env, NB-zika envelope protein ectodomain-human Fc-HDEL).
도 2는 식물체에서 지카바이러스 외피단백질을 발현시키고, 이를 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도이다(T, 총 분획; S, 수용성 분획; P, 펠릿 분획).
도 3은 식물체로부터 재조합 지카바이러스 외피단백질을 분리정제하는 과정에서 레진(resin)과의 결합 여부를 확인하기 위한 웨스턴 블롯팅 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 식물체로부터 분리정제된 재조합 지카바이러스 외피단백질을 전기영동(SDS-PAGE)한 후 쿠마시 염색법(Coomassie staining)을 통해 확인한 도이다.
도 5는 두 가지 재조합 지카바이러스 외피단백질의 투과전자현미경 사진(상단, Zika:Env1; 하단, Zika:Env)이다.
도 6a 내지 도 6c는 마우스에 본 발명에 따른 백신 조성물을 1-3회 접종하고, 7일에서 14일 후 안와 채혈을 통해 분리한 혈청을 Indirect ELISA를 이용하여 항체가를 측정한 결과를 나타낸 도로서, 도 6a는 접종 및 채혈 일정을 표시한 흐름도이고, 도 6b와 6c는 면역화된 마우스 혈청에서 Zika:Env1 및 Zika:Env를 인식하는 항체의 수준을 접종 회차 및 그룹에 따라 비교한 그래프이다(one-way ANOVA; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
도 7a 및 도 7b는 마우스에 본 발명에 따른 백신 조성물을 1-3회 접종하고, 7일에서 14일 후 분리한 동일한 그룹의 마우스 5 마리의 혈청을 풀링(pooling)하여, indirect ELISA를 통해 Th1/Th2 IgG 아이소타입 비율을 측정한 결과를 나타낸 도로서, 도 7a는 Zika:Env1를 코팅한 플레이트를 사용한 결과이고, 도 7b는 Zika-Env를 코팅한 플레이트를 사용한 결과이다.
도 8은 백신 후보군을 각각 1회 접종하고, 7일 후 동일 그룹 유래의 비장면역세포를 풀링하여 각각의 지카바이러스 외피단백질 항원으로 48시간 동안 자극하여 ELISPOT 분석을 통해 IFN-γ 생산 세포를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 백신 후보군을 각각 1회 접종하고, 7일 후 동일 그룹 유래의 비장면역세포를 풀링하여 각각의 지카바이러스 외피단백질 항원으로 48시간 동안 자극하여 ELISPOT 분석을 통해 IL-12 생산 세포를 측정한 결과를 나타낸 도이다(one-way ANOVA; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
도 10은 백신 후보군을 각각 2회 접종하고, 3일 후 동일 그룹 유래의 비장면역세포를 풀링하여 각각의 지카바이러스 외피단백질 항원으로 48시간 동안 자극하여 ELISPOT 분석을 통해 IFN-γ 생산 세포를 측정한 결과를 나타낸 도이다(one-way ANOVA; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
도 11은 백신 후보군을 각각 2회 접종하고, 3일 후 동일 그룹 유래의 비장면역세포를 풀링하여 각각의 지카바이러스 외피단백질 항원으로 48시간 동안 자극하여 ELISPOT 분석을 통해 IL-12 생산 세포를 측정한 결과를 나타낸 도이다(one-way ANOVA; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
도 12는 백신 후보군을 각각 3회 접종하고, 3일 후 동일 그룹 유래의 비장면역세포를 풀링하여 각각의 지카바이러스 외피단백질 항원으로 48시간 동안 자극하여 ELISPOT 분석을 통해 IFN-γ 생산 세포를 측정한 결과를 나타낸 도이다(one-way ANOVA; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
도 13은 백신 후보군을 각각 3회 접종하고, 3일 후 동일 그룹 유래의 비장면역세포를 풀링하여 각각의 지카바이러스 외피단백질 항원으로 48시간 동안 자극하여 ELISPOT 분석을 통해 IL-12 생산 세포를 측정한 결과를 나타낸 도이다(one-way ANOVA; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
도 14는 백신 후보군을 각각 1회 접종하고, 7일 후 동일 그룹 유래의 비장면역세포를 풀링하여 각각의 지카바이러스 외피단백질 항원으로 48시간 동안 자극하여 ELISA 분석을 통해 IFN-γ(A), IL-12(B), TNF-α(C), IL-4(D) 생산량을 측정한 결과를 나타낸 도이다(one-way ANOVA; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
도 15는 백신 후보군을 각각 2회 접종하고, 3일 후 동일 그룹 유래의 비장면역세포를 풀링하여 각각의 지카바이러스 외피단백질 항원으로 48시간 동안 자극하여 ELISA 분석을 통해 IFN-γ(A), IL-12(B), TNF-α(C), IL-4(D) 생산량을 측정한 결과를 나타낸 도이다(one-way ANOVA; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
도 16은 백신 후보군을 각각 3회 접종하고, 3일 후 동일 그룹 유래의 비장면역세포를 풀링하여 각각의 지카바이러스 외피단백질 항원으로 48시간 동안 자극하여 ELISA 분석을 통해 IFN-γ(A), IL-12(B), TNF-α(C), IL-4(D) 생산량을 측정한 결과를 나타낸 도이다(one-way ANOVA; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
도 17a 및 도 17b는 백신 후보군을 각각 1회 접종하고 7일 후(day 7), 또는 3회 접종하고 3일 후(day 45) 동일 그룹 유래의 비장면역세포를 풀링하여 유세포 분석을 통해 CD4, CD8 T 세포(CD3+, CD4+, CD8+)의 비율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 18a 내지 도 18d는 백신 후보군을 각각 1회 접종하고 7일 후(day 7), 또는 3회 접종하고 3일 후(day 45) 동일 그룹 유래의 비장면역세포를 풀링하여 유세포 분석을 통해 탈진된 T 세포(CD4+PD-1+ 또는 CD8+PD-1+)의 비율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 19a 및 도 19b는 백신 후보군을 각각 1회 접종하고 7일 후(day 7), 또는 3회 접종하고 3일 후(day 45) 동일 그룹 유래의 비장면역세포를 풀링하여 유세포 분석을 통해 조절 T 세포(CD4+, CD25+, Foxp3+)의 비율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 20a 및 도 20b는 백신 후보군(Zika:Env1, Zika:Env)을 3회 접종하고, 7일 후 교배시켜 얻은 새끼 마우스를 동일한 그룹이 되도록 혈청을 풀링하여 indirect ELISA 분석한 결과를 나타낸 도이다(one-way ANOVA; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
도 21은 백신 후보군(Zika:Env1, Zika:Env)을 3회 접종하고, 7일 후 교배시켜 얻은 새끼 마우스에서 비장을 적출하고, 비장면역세포를 각각의 항원으로 48시간 자극하여 ELISPOT 분석를 통해 IFN-γ 생산 세포를 측정하고 스팟의 수를 정량화 한 결과는 나타낸 도이다(one-way ANOVA; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
도 22는 백신 후보군(Zika:Env1, Zika:Env)을 3회 접종하고, 7일 후 교배시켜 얻은 새끼 마우스에서 비장을 적출하고, 비장면역세포를 각각의 항원으로 48시간 자극하여 ELISPOT 분석를 통해 IL-12 생산 세포를 측정하고 스팟의 수를 정량화 한 결과는 나타낸 도이다(one-way ANOVA; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
도 23은 백신 후보군(Zika:Env1, Zika:Env)을 3회 접종하고, 7일 후 교배시켜 얻은 새끼 마우스에서 비장을 적출하고, 비장면역세포를 각각의 항원으로 48시간 자극하여 ELISA 분석을 통해 IFN-γ(A), IL-12(B) 및 TNF-α(C)의 생산량을 측정한 결과를 나타낸 도이다(one-way ANOVA; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
도 24a 및 도 24b는 백신 후보군(Zika:Env1, Zika:Env)을 3회 접종하고, 7일 후 교배시켜 얻은 새끼 마우스에 두 종의 지카바이러스 또는 뎅기 바이러스 타입 2를 공격접종하여 생존율(24a) 및 체중 변화(24b)를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명자들은 생체 내 부작용을 최소화하고 생산 비용을 절감할 수 있는 백신을 개발하고자 식물체에서 지카바이러스 외피단백질을 발현시킨 재조합 지카바이러스 백신 2종(각각 Zika:Env1 및 Zika:Env로 명명)을 개발하였고, 본 발명에 따른 조성물을 접종 시 생체 내 바이러스 침투 시와 유사하게 항원에 대한 항체반응과 함께 병원체를 직접 사멸할 수 있는 다양한 면역분자들을 활성화하는 등의 면역반응을 유도시키는지 확인하였다.
이하, 본 발명에 대해 상세하게 설명한다. 다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 지카바이러스(Zika virus) 외피단백질; 및 애주번트(adjuvant)로서 알럼(alum), MPL(monophosphoryl lipid A) 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 지카바이러스 외피단백질을 함유하는 백신 조성물에 관한 것으로서, 일 실시예에서는 지카바이러스의 주요 면역원성 유발 항원 부위인 지카바이러스 외피단백질을 발현시킬 수 있도록 재조합한 식물 발현 벡터를 제작하여 클로닝(cloning)한 후 이를 아그로박테리아(Agrobacterium) 균주 LBA4404에 도입하고, 벡터가 도입된 아그로박테리아를 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에 침윤시켜, 상기 니코티아나 벤타미아나로부터 재조합 항원 단백질을 생산하였다. 상기 재조합 항원 단백질을 통해 생체 내 바이러스 침투 시와 유사한 항원에 대한 항체 반응 및 병원체를 직접 파괴할 수 있는 다양한 면역 분자들을 활성화하는 등의 면역 반응을 유도함으로써 지카바이러스에 대한 예방 전략을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 지카바이러스 외피단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 즉 폴리히스티딘 및 히스티딘-아스파트산-글루탐산-류신(이하, 'HDEL'이라 함) 태그가 융합된 것(H-HDEL)일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 재조합 지카바이러스 외피단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 즉 인간 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편(이하, 'hFc'라 함)이 융합된 것일 수 있다. 상기 hFc의 결합 위치는 식물세포 내에서 발현 또는 합성을 목적으로 하는 펩티드 또는 단백질의 C-말단에 직접 연결되거나 간접적으로, 즉 다른 펩티드 또는 단백질(들)을 사이에 두고 추가(또는 연결)될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 재조합 지카바이러스 외피단백질은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 즉 HDEL 태그가 더 융합된 것일 수 있다. 상기 HDEL의 결합 위치는 식물세포 내에서 발현 또는 합성을 목적으로 하는 펩티드 또는 단백질의 C-말단에 직접 연결되거나 간접적으로, 즉 다른 펩티드 또는 단백질(들)을 사이에 두고 추가(또는 연결)될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 재조합 지카바이러스 외피단백질은 서열번호 10 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 재조합 지카바이러스 외피단백질은 지카바이러스 외피단백질, 폴리히스티딘 태그 및 HDEL 태그가 순차적으로 융합된 것; 또는 지카바이러스 외피단백질, hFc 및 HDEL 태그가 순차적으로 융합된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “지카바이러스(Zika virus)”는 플라비바이러스과(Flaviviridae)에 속하는 단일 가닥의 길이 약 10-kilobase의 양성-센스(positive-sense) RNA를 게놈(genome)을 갖는 바이러스로서, 상기 RNA 게놈은 7개의 비구조(nonstructural) 단백질 및 3개의 구조(structural) 단백질을 암호화하고 있다. 상기 3개의 주요 바이러스 구조 단백질은 캡시드(capsid, C), 전구체-막(pre-membrane, prM) 및 외피(envelope, E)를, 7개의 비구조 단백질은 NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5를 암호화하는 하나의 긴 개방형 ORF(open reading frame)을 포함한다.
본 발명에서 상기 구조 단백질에 포함되는 “외피단백질(E)”은 지카바이러스의 유입을 담당하며 중화 항체의 주요 표적이 된다. 지금까지, 다수의 강력한 플라비 바이러스 유형을 중화하는 단일클론항체(monoclonal antibody)는 상기 외피단백질의 도메인-Ⅲ(domain-Ⅲ)를 표적으로 함이 밝혀졌다. 따라서 상기 도메인-Ⅲ를 포함하는 지카바이러스 외피단백질은 개체에 투여하였을 경우 면역원성을 나타내며, 지카바이러스 감염에 대항할 수 있는 항체 형성에 크게 기여할 수 있다.
상기 지카바이러스 외피단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 기능적 동등물도 본 발명의 권리범위에 포함되며, 상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 아미노산 서열과 적어도 60 % 이상, 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 가장 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로서, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드(polypeptide)를 의미하며, 식물체를 이용하여 안정적으로 생산될 수 있는 지카바이러스 외피단백질의 아미노산 서열이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 “항원(antigen)”이란 체내에서 면역 반응을 일으키는 모든 물질을 총칭하며, 바람직하게는 바이러스, 화합물, 세균, 꽃가루, 암세포 등 또는 이들의 일부 펩티드 또는 단백질이나, 체내에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 “백신(vaccine)”이란 생체에 면역 반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 인간 또는 비인간 동물로서, 상기 비인간 동물은 돼지, 소, 말, 개, 염소, 양 등을 지칭하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 “애주번트(Adjuvant)”란, 백신 또는 약학적으로 활성 있는 성분들에 첨가되어 면역 반응을 증가시키거나 영향을 주는 물질 또는 조성물을 말한다. 대표적으로 면역원(immunogen)용 캐리어 또는 보조 물질 및/또는 다른 약학적으로 활성이 있는 물질 또는 조성물을 통상적으로 의미한다. 전형적으로, 용어 “애주번트”는 넓은 개념에서 해석되어야 하며, 상기 애주번트에 통합되거나 상기 애주번트와 함께 투여된 항원의 면역원성(immunogenicity)을 증진시킬 수 있는 넓은 범위의 물질 또는 책략(stratagerm)을 의미한다. 또한, 애주번트는, 이에 제한되지 않고, 면역 강화제(immune potentiator), 항원 전달계 또는 이들의 조합으로 나뉘어질 수 있다. 널리 알려진 애주번트의 예로, 알루미늄 하이드록사이드, 프로이드 완전 또는 불완전 애주번트, DEAE 덱스트란, 레바미솔, PCG 및 poly I:C 또는 poly A:U 등을 예시할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 애주번트로서 백반이라고도 불리우는 알럼(alum)과 MPL(monophosphoryl lipid A)을 사용하였다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 알럼은 재조합 지카바이러스 외피단백질 중량 대비 1:1 내지 50 (외피단백질:알럼) 비율로 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, 재조합 지카바이러스 외피단백질의 중량 대 알럼의 중량 비율은 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 또는 1:50일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 MPL은 재조합 지카바이러스 외피단백질 중량 대비 1:0.4 내지 2 (외피단백질:MPL) 비율로 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, 재조합 지카바이러스 외피단백질의 중량 대 MPL의 중량 비율은 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1, 1:1.2, 1:1.4, 1:1.6, 1:1.8 또는 1:2일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 알럼 및 MPL의 조합은 재조합 지카바이러스 외피단백질 중량 대비 1:1 내지 50:0.4 내지 2 (외피단백질:알럼:MPL) 비율로 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, 재조합 지카바이러스 외피단백질의 중량 대 알럼의 중량 대 MPL의 중량 비율은 1:1:0.4, 1:5:0.4, 1:10:0.4, 1:20:0.4, 1:30:0.4, 1:40:0.4, 1:50:0.4, 1:1:0.6, 1:5:0.6, 1:10:0.6, 1:20:0.6, 1:30:0.6, 1:40:0.6, 1:50:0.6, 1:1:1, 1:5:1, 1:10:1, 1:20:1, 1:30:1, 1:40:1, 1:50:1, 1:1:1.4, 1:5:1.4, 1:10:1.4, 1:20:1.4, 1:30:1.4, 1:40:1.4, 1:50:1.4, 1:1:2, 1:5:2, 1:10:2, 1:20:2, 1:30:2, 1:40:2 또는 1:50:2 등으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 본 발명에 따른 백신 조성물에 재조합 지카바이러스 외피단백질이 50 μg 중량으로 포함되는 경우, 알럼은 50 내지 2500 μg 중량이 포함될 수 있으며, MPL은 20 내지 100 μg 중량을 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 본 발명에 따른 백신 조성물에 재조합 지카바이러스 외피단백질이 10 μg 중량으로 포함되는 경우, 알럼은 10 내지 500 μg 중량이 포함될 수 있으며, MPL은 4 내지 20 μg 중량을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 백신 조성물은 14일 내지 28일 간격으로 1회 내지 3회 접종한 경우 가장 높은 중화항체가, 세포성 면역 반응, 모체 이행 항체 형성능 및 방어 효능을 나타낸다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 백신 조성물은 아시아-계통 지카바이러스 스트레인(Asian-lineage Zika virus strain) 또는 아프리카-계통 지카바이러스 스트레인(African-lineage Zika virus strain)에 대한 방어능을 가질 수 있다. 본 발명의 적합한 지카바이러스의 실례는 제한 없이, 아프리카 및/또는 아시아 계통으로부터 바이러스를 포함한다. 지카바이러스의 아프리카 및 아시아 계통 내 여러 계통이 이미 확인되었다. 예를 들면, 계열 Mr 766, ArD 41519, IbH 30656, P6-740, EC Yap, FSS13025, ArD 7117, ArD 9957, ArD 30101, ArD 30156, ArD 30332, HD 78788, ArD 127707, ArD 127710, ArD 127984, ArD 127988, ArD 127994, ArD 128000, ArD 132912, 132915, ArD 141170, ArD 142623, ArD 149917, ArD 149810, ArD 149938, ArD 157995, ArD 158084, ArD 165522, ArD 165531, ArA 1465, ArA 27101, ArA 27290, ArA 27106, ArA 27096, ArA 27407, ArA 27433, ArA 506/96, ArA 975-99, Ara 982-99, ArA 986-99, ArA 2718, ArB 1362, Nigeria68, Malaysia66, Kedougou84, Suriname, MR1429, PRVABC59, ECMN2007, DakAr41524, H/PF/2013, R103451, 103344, 8375, JMB-185, ZIKV/H, sapiens/Brazil/Natal/2015, SPH2015, ZIKV/Hu/Chiba/S36/2016 및/또는 Cuba2017을 포함하는, 당해 분야에서 공지된 지카바이러스의 한 가지 또는 그 이상의 적합한 계열에 대하여, 본 발명의 백신 조성물은 방어능을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 백신 조성물은 지카바이러스 PRVABC59 스트레인, 지카바이러스 MR766 스트레인에 대한 방어능을 가짐을 확인하였다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 백신 조성물은 뎅기 바이러스(Dengue virus) 타입-2 에 대한 방어능을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 백신 조성물은 인터페론-감마(IFN-γ), 인터루킨-12(IL-12) 및 종양괴사인자-알파(TNF-α)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 사이토카인에 대한 분비를 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 백신 조성물은 모체 이행 항체(maternal antibody)의 형성을 유도할 수 있으며, 모체 이행 세포성 면역을 유도할 수 있다.
한편, 본 발명의 “백신 조성물”은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 “비경구”는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 개체에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 지카바이러스 외피단백질의 유전자 서열을 포함하는, 지카바이러스 외피단백질 발현용 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
지카바이러스 감염증을 포함한 바이러스성 질병을 예방하기 위한 백신들은 단백질의 접힘(folding), 당화과정(glycosylation) 등의 문제로 인하여 박테리아를 이용하지 못하고, 주로 동물 세포를 이용하여 생산되고 있다. 그러나 동물 세포를 이용한 백신 생산 방법은 대량 생산을 위한 설비 확충에 큰 비용이 소요되기 때문에 제조가 용이하지 않고, 백신의 가격이 고가인 경우가 대부분이다. 또한, 동물 세포를 이용하여 제조된 비활성 바이러스 백신들은 저장이 용이하지 않을 뿐만 아니라, 동물에게 감염 가능한 바이러스에 오염될 가능성이 높다는 단점을 가지고 있다. 그러나 본 발명은 식물을 이용하여 이러한 단점을 보완하였다. 즉 식물 세포는 동물 세포와 달리 동물에게 감염 가능한 바이러스에 오염될 가능성이 매우 낮고, 경작 면적만 확보되면 언제든지 대량 생산이 가능할 뿐만 아니라, 식물체를 통하여 장기 보관이 가능하기 때문에, 안정적으로 저렴한 백신의 생산이 가능하다.
따라서 본 발명에 따른 지카바이러스 외피단백질 발현용 재조합 벡터는 식물 발현용 재조합 벡터이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 NB(new chaperone binding protein)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 인간의 면역글로불린 중쇄 Fc 단편(Fc fragment of human immunoglobulin heavy chain; hFc)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리히스티딘 태그 또는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 NB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 유전자이고, 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 유전자이나, 서열번호 3의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있으며, 재조합 지카바이러스 외피단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 말단 방향에 위치할 수 있다. 상기 NB는 재조합 단백질이 발현될 때 아미노산 서열의 전부 또는 일부가 잘려나가 본 발명의 재조합 지카바이러스 외피단백질로부터 아미노산 서열 전부가 제거되거나 일부 아미노산만이 남을 수도 있다.
또한, 상기 hFc를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 유전자이고, 바람직하게는 서열번호 7로 표시되는 유전자이나, 서열번호 7의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있으며, 재조합 지카바이러스 외피단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단 방향에 위치할 수 있다.
또한, 상기 HDEL 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 유전자이고, 바람직하게는 서열번호 9로 표시되는 유전자이나, 서열번호 9의 염기서열과 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있으며, 재조합 지카바이러스 외피단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단 방향에 위치할 수 있다.
한편, 상기 폴리히스티딘 태그는 HDEL 태그와 융합될 수 있으며, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 유전자이고, 바람직하게는 서열번호 5로 표시되는 유전자이나, 서열번호 5의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있으며, 재조합 지카바이러스 외피단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단 방향에 위치할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 서열번호 3의 염기서열; 서열번호 2의 염기서열; 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 5의 염기서열이 순차적으로 연결된 것일 수 있다. 상기와 같은 순서에 의해 연결된 경우, 즉 도 1 상단의 개열지도(A)에 나타난 발현 카세트(expression cassette of Zika:Env1)를 포함하는 경우, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 서열번호 11의 염기서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 서열번호 11의 염기서열로 이루어지나, 서열번호 11의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 서열번호 3의 염기서열; 서열번호 2의 염기서열; 서열번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 7의 염기서열; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 9의 염기서열이 순차적으로 연결된 것일 수 있다. 상기와 같은 순서에 의해 연결된 경우, 즉 도 1 하단의 개열지도(B)에 나타난 발현 카세트(expression cassette of Zika:Env)를 포함하는 경우, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 서열번호 13의 염기서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 서열번호 13의 염기서열로 이루어지나, 서열번호 13의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서 “재조합 벡터(recombinant vector)”란, 벡터 내에 삽입된 이종의 핵산에 의해 코딩되는 펩티드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 목적 항원(본 발명에서는, 지카바이러스 외피단백질)을 발현할 수 있도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 “벡터”는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있으며, “복제 단위”란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, NB 유전자, 폴리히스티딘-태그(polyhistidine-tag, 최소 5개 이상의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노산 모티프), 소포체 신호 펩티드(endoplasmic reticulum signal peptide, 소포체 표적화 서열과 같은 의미) 유전자, 클로닝 사이트(cloning site) 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 인간 면역글로불린의 Fc 단편 및 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, “인간 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편(Fc fragment of human immunoglobulin heavy chain; hFc)”이란 면역글로불린이 파파인(papain)에 의해 소화되었을 때, 중쇄(heavy chain; H chain) 부분만이 S-S 결합으로 연결되고, 항원 결합부위를 가지지 않는 부분을 Fc 단편이라고 하며, 본 발명의 Fc 단편은 바람직하게는 인간의 Fc 단편이며, 더욱 바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 인간 Fc 단편 또는 서열번호 7의 염기서열에 의해 코딩되는 인간 Fc 단편이나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 Fc 단편은 서열번호 7로 표시되는 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 7의 염기서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 “클로닝 사이트”란 벡터 내에서 각 유전자를 연결/구분하는 것을 목적으로 삽입된 것을 총칭한다.
상기 “소포체 신호 펩티드(ER 신호 서열)”는 당업자에게 알려진 식물 소포체 신호 펩티드라면 그 종류 및 아미노산 서열이 제한되지 않으며, 예를 들어 US 20130295065, WO2009158716 등의 문헌을 참고로 할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 소포체 신호 펩티드는 서열번호 3의 염기서열(NB; new chaperone binding protein)에 의해 코딩되는 것일 수 있으며, 단백질로 번역된 후 해당 서열은 일부 또는 전부가 제거되는 것일 수 있다.
상기 선별용 마커 유전자에는 일례로 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 포함될 수 있으며, 상기 프로모터에는 일례로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 상기 터미네이터는 일례로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀 라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 투마파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 포함될 수 있으나, 상기 열거한 것들은 예시일 뿐 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 형질전환체는 바람직하게는 대장균, 바실러스, 살모넬라, 효모 등과 같은 미생물, 곤충 세포, 인간을 포함한 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소 등과 같은 동물, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 및 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 및 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 및 유채를 포함하는 특용작물류; 및 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 및 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합, 및 튤립을 포함 하는 화훼류 등일 수 있으나, 본 발명의 벡터로 형질전환될 수 있는 생명체라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “형질전환(transformation)”이란 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, “형질전환체(transgenic organism)”란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 생명체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 생명체이며, 상기 생명체는 미생물, 진핵세포, 곤충, 동물, 식물 등 생명이 있는 생물이라면 제한이 없으며, 바람직하게는 대장균, 살모넬라, 바실러스, 효모, 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소, 아크로박테리움 튜머패시언스, 식물 등이나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “식물체”는 본 발명의 재조합 지카바이러스 외피단백질을 포함하는 단백질을 대량 생산할 수 있는 식물이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 보다 구체적으로는 담배, 애기장대, 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 알팔파, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자, 상추 및 고추로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 담배일 수 있다. 본 발명에서의 담배는 담배 속(Nicotiana genus) 식물로서 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 특별히 종류의 제한을 받지 않으며, 형질전환 방법과 단백질 대량 생산의 목적에 맞게 적절한 품종을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다. 예를 들어 Nicotiana benthamiana L. 또는 Nicotiana tabacum cv. xanthi 등의 품종을 이용할 수 있다.
상기 형질전환체는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기충격법(electroporation) 및 PEG(Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 제조된, 재조합 지카바이러스 외피단백질을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 지카바이러스 외피단백질은 서열번호 10 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 제16항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환체 또는 배양액으로부터 재조합 지카바이러스 외피단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 지카바이러스 외피단백질의 생산 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 단계 (b)의 정제는 수용성 분획을 사용하여 정제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실험 재료 및 방법
1. 항원(antigen)과 애주번트(adjuvant)의 조합 및 소동물 면역시험
재조합 서브유닛 백신은 체내에서 쉽게 분해되어 항원 제시(antigen-presenting)가 지속적으로 이루어지지 않아 역가 지속 문제가 발생하기 쉬우므로 면역증강제 사용이 필수적이다. 이에, 면역증강제 후보 물질로 인간 백신에 사용 승인된 알럼(Alum)과 TLR4 계열의 MPL(Monophosphoryl-lipid A)을 선정하였으며, 가장 효과적인 항원과 면역증강제 조합 및 농도를 선정하기 위해 시험을 진행하였다.
8주령 C57BL/6 암컷 마우스에 각각의 재조합 백신 후보물질 10~50 μg/mouse와 면역증강제 알럼 50~500 μg/mouse 및 MPL 20 μg/mouse을 PBS에 마우스당 총 부피가 140 μl가 되도록 혼합하여 1-3회(Day 0, 14, 42) 근육주사 하였다. 상기 백신 후보물질(지카바이러스 재조합 항원)은 다음과 같다: 폴리히스티딘 및 HDEL이 융합된 지카바이러스 외피단백질(이하 'Zika:Env1') 및 hFc 및 HDEL이 융합된 지카바이러스 외피단백질(이하 'Zika:Env'라 함).
2. 체액성 면역 측정 시험
2.1. 백신 접종에 따른 항체생산 비교
백신 투여 시에 목표하는 수준의 항체의 생산을 평가하기 위해 자체 구축한 Indirect ELISA 방법을 이용하여 백신 후보군 Zika:Env1, Zika:Env를 인지하는 항체를 측정하였다. 마우스(C57BL/6, 암컷, 8주령)에 PBS 또는 백신 후보물질을 근육주사로 접종 후 7일에서 14일 후(Day-1, 7, 28, 49) 마우스로부터 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 백신 후보군(Zika:Env1, Zika:Env)을 각각 0.1 μg/well씩 플레이트(Nunc-Immuno Plates; Thermo Scientific, 영국)에 분주하여 4℃에서 16시간 이상 반응 시킨 후 워시 버퍼(wash buffer; 0.05% Tween20 in PBS)로 세척한 후 블로킹 버퍼(blocking buffer; 1% BSA in PBS)를 well당 200 μl로 분주하여 2시간 동안 37℃에서 반응시켜 비특이적 결합을 완화하였다. 이어서, 워시 버퍼로 세척하고 마우스로부터 얻은 혈청을 희석 버퍼(dilution buffer; 0.1% BSA in PBS)에 1:100부터 이진 희석하여 well에 분주하였다. 37℃에서 2시간 반응 후 혈청 시료를 제거하기 위해 워시 버퍼로 세척 후 1:10,000으로 희석한 Goat anti-Mouse IgG-heavy and light chain Antibody HRP Conjugated(Bethyl Laboratories, 미국)을 각각 100 μl 분주하여 37℃에서 1시간 반응하였다. 워시 버퍼로 세척 후 TMB(Surmodics, 미국) 용액으로 발색하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2.2. 백신 접종에 따른 서브타입 IgG1, IgG2c 생산 비교
백신 투여 시 생산되는 항체의 서브타입(subtype)을 비교하고자 자체 구축한 Indirect ELISA 방법을 이용하여 서브타입 IgG1, IgG2c 비교 실험을 진행하였다. 마우스(C57BL/6, 암컷, 8주령)에 백신 후보군을 1-3회(Day 0, 14, 42) 근육 접종 후 7일에서 14일 후 (Day-1, 7, 28, 49) 마우스로부터 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 백신 후보군(Zika:Env1, Zika:Env)을 각각 0.1 μg/well씩 플레이트(Nunc-Immuno Plates; Thermo Scientific)에 분주하여 4℃에서 16시간 이상 반응 시킨 후 워시 버퍼(0.05% Tween20 in PBS)로 세척 후 블로킹 버퍼(1% BSA in PBS)를 well당 200 μl씩 분주하여 2시간 동안 37℃에서 반응시켜서 비특이적 결합을 완화하였다. 이어서 워시 버퍼로 세척하고 마우스로부터 얻은 혈청을 희석 버퍼(0.1% BSA in PBS)에 1:100 또는 1:400으로 희석하여 well에 분주하였다. 37℃에서 2시간 반응 후 혈청 시료를 제거하기 위해 워시 버퍼로 세척 후 서브타입 IgG1, IgG2c를 검출하고자 1:10,000으로 희석한 Goat anti-mouse IgG1(Bethyl Laboratories, 미국)과 1:8,000으로 희석한 Goat anti-mouse IgG2c HRP(Southern biotech, 미국)을 각각 100 μl씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 워시 버퍼로 세척한 후 TMB(Surmodics, 미국) 용액으로 발색하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
3. 중화항체 평가 시험 - 백신 접종에 따른 중화항체 유도능 평가
백신 투여 시에 생산되는 중화항체는 PRNT(Plaque reduction neutralization test)를 이용하여 측정하였다. 마우스(C57BL/6, 암컷, 8주령)에 백신 후보군 또는 PBS를 3회(Day 0, 14, 42) 근육 주사로 접종하고, 7일 후(Day 49) 마우스로부터 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 동일 그룹의 마우스 5마리의 혈청을 풀링(pooling)하여 사용하였으며, 56℃에서 30분간 비동화한 다음 대조군 혈청과 실험군 혈청을 각각 같은 희석 배율로 희석하였다. 역가(PFU/ml)가 확인된 2종의 지카바이러스(MR766 및 PRVABC59 strain)를 희석하여 바이러스 컨트롤에서 50개 정도의 plaque/well이 나오도록 준비한 다음, 희석된 혈청과 1:1로 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 바이러스 반응 30분 후 혈청과 바이러스 반응액을 베로 세포(Vero cell) 또는 베로 76 세포(Vero 76 cell)에 접종한 다음, 2시간 동안 흡착시킨 후 오버레이 배지(Overlay media; 1% Sea plaque agar 또는 1.4% Methyl cellulose)를 첨가하여 37℃5% CO2 배양기에서 5일 또는 14일간 배양한 다음, 1% 크리스탈 바이올렛(Crystal violet)으로 염색하여 플라크(plaque)의 갯수를 확인하였다. % inhibition을 통하여 PRNT50을 산출하였다.
4. 세포 면역 사이토카인(cytokine) 측정 시험
4.1. 비장세포(splenocyte)의 분리
마우스(C57BL/6, 암컷, 8주령)에 PBS 또는 백신 후보군을 1회 접종한 후(Day 0) 7일에 비장을 적출하거나(Day 7), 2회 또는 3회 접종한 후(Day 14, 42) 3일째 되는 날(Day 17, 45)에 비장을 적출하였다. 적출한 비장을 차가운 RPMI 1640 배지에 넣고, 5 ml 주사기를 이용하여 비장을 파쇄한 뒤 40 μm 나일론 셀 스트레이너(nylon cell strainer; BD Bioscience, 미국)에 흘려보내 비장세포를 분리하였다. 상기 수득한 세포를 2,000 rpm에서 10분간 원심분리 한 후, 적혈구를 제거하기 위하여 RBC 용해 버퍼(lysis buffer)를 2분 동안 처리하였다. 원심분리를 통해 RBC 용해 버퍼를 제거한 뒤, RPMI1640(10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신)으로 세포를 부유시켜 ELISPOT, ELISA 및 유세포분석(Flow cytometry) 실험에 사용하였다.
4.2. 사이토카인 생산 면역세포 분석
백신 투여 시에 세포매개 방어에 필요한 대표적인 사이토카인의 생산을 평가하기 위해 ELISPOT을 이용하여 IFN-γ 및 IL-12를 생산하는 면역세포의 증가여부를 평가하였다. 마우스(C57BL/6, 암컷, 8주령)에 PBS 또는 백신 후보군을 1회 접종한 후(Day 0) 7일에 비장을 적출하거나(Day 7), 2회 또는 3회 접종한 후(Day 14, 42) 3일째 되는 날(Day 17, 45)에 비장을 적출하였다. 비장에서 비장세포를 분리하여 1 μg/ml의 항원(Zika:Env1 또는 Zika:Env)으로 자극하고 ELISPOT 플레이트에서 48시간 배양하였다. IFN-γ 및 IL-12 ELISPOT은 각각 BDTM ELISPOT mouse IFN-γ ELISPOT set(BD Life Sciences, 미국)와 mouse IL-12(p70) ELISpotBASIC(MABTECH, 미국)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
IFN-γ ELISPOT을 수행하기 위하여, IFN-γ 포획 항체(capture antibody)를 1:200으로 희석하여 100 μl/well씩 넣어준 뒤 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 워시 버퍼로 3회 세척한 뒤, 블로킹 시약(RPMI1640, 10% FBS)을 200 μl/well씩 넣어주고, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 워시 버퍼로 3회 세척한 뒤 비장세포를 5 × 105 cells/well로 분주하였고, 항원(백신 후보물질 Zika:Env1, Zika:Env)을 1 μg/ml의 농도로 처리하여 37℃5% CO2 배양기에서 배양하였다. 항원 처리 후 48시간 뒤에 워시 버퍼로 3회 세척하고, 검출 항체(detection antibody)를 희석 버퍼(10% FBS in PBS)로 1:250으로 희석하여 100 μl/well씩 넣어준 뒤, 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 워시 버퍼로 3회 세척한 뒤 스트렙트아비딘(streptavidin)-HRP를 1:100으로 희석하여 100 μl/well씩 넣어준 뒤 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이어서, 워시 버퍼로 3회 세척한 뒤, PBS로 2회 세척하여 BD AEC substrate set(BD Life Sciences, 미국)를 사용하여 발색반응을 관찰하였고, DDW로 well을 세척하여 반응을 정지시킨 다음, 공기 중에서 말린 후 각 well의 스팟(spot)들을 계수하여 분석하였다.
IL-12 ELISPOT을 수행하기 위하여, IL-12 포획 항체를 15 μg/ml로 희석하여 100 μl/well씩 넣어준 뒤 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. PBS로 4회 세척한 뒤, 블로킹 시약(RPMI1640, 10% FBS)을 200 μl/well씩 넣어주고, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 PBS로 4회 세척한 뒤 비장세포를 5 × 105 cells/well로 분주하였고, 항원(백신 후보물질 Zika:Env1, Zika:Env)을 1 μg/ml의 농도로 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. PBS로 4회 세척한 뒤 검출 항체를 1 μg/ml로 희석하여 100 μl/well씩 넣어준 뒤, 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. PBS로 3회 세척한 뒤 스트렙트아비딘-HRP를 1:100으로 희석하여 100 μl/well씩 넣어준 뒤 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이어서, PBS로 5회 세척해 준 후 BD AEC substrate set(BD Life Sciences)를 사용하여 발색반응을 관찰하였고, DDW로 well을 세척하여 반응을 정지시킨 다음, 공기 중에서 말린 후 각 well의 스팟들을 계수하여 분석하였다.
4.3. 사이토카인(cytokine)의 생산량 평가
사이토카인의 생산량 평가는 ELISA 키트을 이용하여 시험을 진행하였다. 마우스(C57BL/6, 암컷, 8주령)에 PBS 또는 백신 후보군을 1회 접종한 후(Day 0) 7일에 비장을 적출하거나(Day 7), 2회 또는 3회 접종한 후(Day 14, 42) 3일째 되는 날(Day 17, 45)에 비장을 적출하였다. 비장에서 비장세포를 분리하여 96-well 세포 배양 플레이트에 5 × 105 cells/well로 분주하였고, 1 μg/ml의 농도에 해당하는 항원(백신 후보물질 Zika:Env1 또는 Zika:Env)으로 재자극한 뒤, 48시간에 세포 배양액을 이용하여 ELISA 분석으로 사이토카인의 생산 분석을 진행하였다. 세포 배양액으로 분비된 사이토카인(IFN-γ, IL-12, IL-4, TNF-α)의 측정은 mouse IFN-γ ELISA MAXTM standard set, mouse IL-12 ELISA MAXTM standard set, mouse IL-4 ELISA MAXTM standard set, mouse TNF-α ELISA MAXTM standard set(바이오레전드, 미국)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
각각의 사이토카인에 해당하는 포획 항체를 1:200으로 희석하여 플레이트(Nunc-Immuno Plates; Thermo Scientific)에 100 μl/well씩 넣어준 뒤 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 워시 버퍼로 4회 세척한 뒤 블로킹 시약인 10% FBS(in PBS)로 1시간 동안 반응시켰다. 워시 버퍼로 4회 세척한 뒤 각각의 세포 배양액을 100μl씩 넣어주고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 워시 버퍼로 4회 세척한 뒤 1:200으로 희석한 검출 항체를 100 μl/well씩 넣어주고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어서, 워시 버퍼로 4회 세척한 뒤, 1:1,000으로 희석한 아비딘(Avidin)-HRP를 100 μl/well씩 넣어주고, 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 워시 버퍼로 5회 세척한 뒤 100 μl의 TMB 용액을 넣고 빛을 차단시킨 상태에서 15분간 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 사이토카인에 해당하는 표준곡선은 연속 희석시킨 각각의 정제된 항원을 사용하여 작성하였고, 각각의 사이토카인 농도는 작성된 표준곡선에 따라 계산하였다.
4.4. 면역세포 반응(immune cell response) 분석
백신 접종 시 활성화되는 면역세포의 분석은 각 백신 후보군을 접종한 마우스로부터 분리한 비장세포에서 이펙터 T 세포(effector T cell; CD3+, CD4+, CD8+), 탈진된 T 세포(exhausted T cell; PD-1+), Treg 세포(CD4+, CD25+, Foxp3+)를 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다.
마우스(C57BL/6, 암컷, 8주령)에 PBS 또는 백신 후보군을 1회 접종한 후(Day 0) 7일에 비장을 적출하거나(Day 7), 3회 접종한 후(Day 42) 3일에 비장을 적출하였다(Day 45). 적출한 비장을 차가운 RPMI 1640 배지에 넣고, 5 ml 주사기를 이용하여 비장을 파쇄한 뒤 40 μm 나일론 셀 스트레이너(BD Bioscience)에 흘려보내 비장 세포를 분리하였다. 수득한 비장 면역세포를 세포의 농도가 1 × 106 cells/ml이 되도록 MACs 버퍼(0.5% BSA + 2 mM EDTA in PBS)로 부유시켰다.
이펙터 T 세포(CD3+, CD4+, CD8+), 탈진된 T 세포(PD-1+)는 하기 표 1에 기재된 항체를 사용하였고, 실험에 사용한 모든 항체는 바이오레전드 사(Biolegend 社)로부터 구입하였다. 세포 부유액을 4℃, 6,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 제거한 후 각각의 그룹에 1:250으로 희석한 항체를 50 μl씩 넣은 뒤, 20분 동안 4℃에서 반응시켰다. 20분 뒤 500 μl의 MACs 버퍼를 넣어 4℃6,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 제거하고 0.4% PFA(in PBS) 400 μl로 고정시킨 후 유세포 분석기로 측정하였다.
Treg 세포(CD4+, CD25+, Foxp3+)는 하기 표 1에 기재된 항체를 사용하였고, 실험에 사용한 모든 항체는 바이오레전드 사로부터 구입하였다. 세포 부유액을 4℃, 6,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 제거한 후 각각의 그룹에 1:250으로 희석한 CD4+, CD25+ 항체를 50 μl씩 넣은 뒤, 20분 동안 4℃에서 반응시켰다. 20분 뒤 500 μl의 MACs 버퍼를 넣어 4℃6,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 제거하고 Foxp3/전사인자 염색 버퍼 세트(transcription factor staining buffer set)와 3:1 비율(diluent:concentrate)로 혼합한 후 각 샘플에 200 μl씩 넣어 세포를 현탁하고, 1시간 동안 4℃에서 반응시켰다. 800 μl의 MACs 버퍼를 넣어주고 4℃6,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 제거하고 Foxp3/전사인자 염색 버퍼 세트, 10X 투과화 버퍼(permeabilization buffer)를 증류수에 1X로 희석한 후 각 샘플에 200 μl씩 첨가하여 세포를 현탁한 후 4℃6,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 제거하고 각 샘플에 Foxp3 항체를 1:500으로 희석한 1X 투과화 버퍼 50 μl를 첨가하여 20분 동안 4℃에서 반응시켰다. 1X 투과화 버퍼 800 μl로 세척한 후 4℃6,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 제거하고 0.4% PFA(in PBS) 400 μl로 고정시킨 후 유세포 분석기로 측정하였다. 유세포 분석기는 FACS Calibur(BD bioscience, 미국)를 사용하였고, 한 샘플 당 10,000개의 세포를 분석하였다.
5. 방어효능 평가 시험
5.1. 모체 이행 항체 평가
마우스(C57BL/6, 암컷, 8주령)에 백신 후보군을 근육주사로 3회(Day 0, 14, 42) 접종한 후 교배시켜 태어난 새끼 마우스 2일령에 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 백신 후보물질(Zika:Env1, 또는 Zika:Env)을 각각 0.1μg/well씩 플레이트(Nunc-Immuno Plates; Thermo Scientific)에 분주하여 4℃에서 12시간 이상 반응 시킨 후 워시 버퍼(0.05% Tween20 in PBS)로 세척하고, 블로킹 버퍼(1% BSA in PBS)를 각 well당 200 μl씩 분주하여 2시간 동안 37℃에서 반응시켜서 비특이적 결합을 완화하였다. 이어서 워시 버퍼로 세척하고 새끼 마우스로부터 얻은 혈청을 희석 버퍼(0.1% BSA in PBS)로 1:100부터 이진 희석하여 각 well에 분주하였다. 37℃에서 2시간 반응 후 혈청 시료를 제거하기 위해 워시 버퍼로 세척 후 1:10,000으로 희석한 Goat anti-Mouse IgG-heavy and light chain Antibody HRP Conjugated(Bethyl Laboratories)를 각각 100 μl씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 워시 버퍼로 세척 후 TMB(Surmodics, 미국) 용액으로 발색하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다
5.2. 새끼 마우스 내 사이토카인 생산 면역세포 분석
마우스(C57BL/6, 암컷, 8주령)에 백신 후보물질을 근육주사로 3회(Day 0, 14, 42) 접종한 후 교배시켜 태어난 새끼 마우스를 30일령에 비장을 적출하였다. 비장에서 비장세포를 분리하여 항원(백신 후보물질 Zika:Env1, 또는 Zika:Env)으로 자극하여 ELISPOT 플레이트에서 48시간 동안 배양하였다. 음성 대조군으로는 PBS를 마우스에 접종하여 얻은 비장 면역세포를 사용하였다. IFN-γ와 IL-12 ELISPOT은 각각 BDTMELISPOT mouse IFN-γ ELISPOT set(BD Life Sciences)와 mouse IL-12(p70) ELISpotBASIC(MABTECH)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
IFN-γ ELISPOT을 수행하기 위하여, IFN-γ 포획 항체를 1:200으로 희석하여 100 μl/well씩 넣어준 뒤 4℃에서 16시간 반응시켰다. 워시 버퍼로 3회 세척한 뒤, 블로킹 시약(RPMI1640, 10% FBS)을 200 μl/well씩 넣어주고, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 워시 버퍼로 3회 세척한 뒤 비장세포를 5 × 105 cells/well로 분주하였고, 항원(백신 후보물질 Zika:Env1, Zika:Env)을 1 μg/ml의 농도로 처리하여 37℃5% CO2 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 항원 처리 후 48시간 뒤에 워시 버퍼로 3회 세척한 뒤 검출 항체를 1:250으로 희석하여 100 μl/well씩 넣어준 뒤 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 다시 워시 버퍼로 3회 세척하고, 스트렙트아비딘(streptavidin)-HRP를 1:100으로 희석하여 100 μl/well씩 넣어준 뒤 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이어서, 워시 버퍼로 3회 세척한 뒤 PBS로 2회 세척하여 BD AEC substrate 세트(BD Life Sciences)를 사용하여 발색반응을 관찰하고, DDW로 well을 세척하여 반응을 정지시킨 다음, 공기 중에서 말린 후 각 well의 스팟들을 계수하여 분석하였다.
IL-12 ELISPOT을 수행하기 위하여, IL-12 포획 항체를 15 μg/ml로 희석하여 100 μl/well씩 넣어준 뒤 4℃에서 16시간 반응시켰다. PBS로 4회 세척한 뒤, 블로킹 시약(RPMI1640, 10% FBS)을 200 μl/well씩 넣어주고, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 워시 버퍼로 4회 세척한 뒤 비장세포를 5 × 105 cells/well로 분주하였고, 항원(백신 후보물질 Zika:Env1, Zika:Env)을 1 μg/ml의 농도로 처리하여 37℃5% CO2 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 다시 PBS로 4회 세척한 뒤 검출 항체를 1 μg/ml으로 희석하여 100 μl/well씩 넣어준 뒤 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이어서, 워시 버퍼로 3회 세척한 뒤 스트렙트아비딘-HRP를 1:100으로 희석하여 100 μl/well씩 넣어주고 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. PBS로 5회 세척한 뒤 BD AEC substrate set(BD Life Sciences)를 사용하여 발색반응을 관찰하고, DDW로 well들을 세척하여 반응을 정지시킨 다음, 공기 중에서 말린 후 각 well의 스팟들을 계수하여 분석하였다.
5.3. 새끼 마우스 내 사이토카인의 생산량 평가
마우스(C57BL/6, 암컷, 8주령)에 백신 후보군을 근육주사로 3회(Day 0, 14, 42) 접종한 후 교배시켜 태어난 새끼 마우스 30일령에 비장을 적출하였다. 비장에서 비장세포를 분리하여 96-well 세포 배양 플레이트에 5 × 105 cells/well로 분주하였고, 1 μg/ml의 농도에 해당하는 항원(백신 후보물질 Zika:Env1, 또는 Zika:Env)으로 재자극한 뒤 48시간 뒤에 ELISA 분석으로 사이토카인 생산 분석을 진행하였다. 세포 배양액으로 분비된 사이토카인(IFN-γ, IL-12, TNF-α)의 측정은 mouse IFN-γ ELISA MAXTM standard set, mouse IL-12 ELISA MAXTM standard set, mouse TNF-α ELISA MAXTM standard set(Biolegend)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
각각의 사이토카인에 해당하는 포획 항체를 1:200으로 희석하여 플레에트(Nunc-Immuno Plates; Thermo Scientific)에 100 μl/well씩 넣어준 뒤 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 워시 버퍼로 4회 세척한 뒤 블로킹 시약인 10% FBS(in PBS)로 1시간 동안 반응시켰다. 다시 워시 버퍼로 4회 세척한 뒤 각각의 세포 배양액을 100 μl씩 넣어주고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 워시 버퍼로 4회 세척한 뒤 1:200으로 희석한 검출 항체를 100 μl/well씩 넣어주고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이어서, 워시 버퍼로 4회 세척한 뒤 1:1,000으로 희석한 아비딘-HRP를 100 μl/well씩 넣어준 뒤 실온에서 30분간 반응시켰다. 워시 버퍼로 5회 세척한 뒤 100 μl의 TMB 용액을 넣고 빛을 차단시킨 상태에서 15분간 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 사이토카인에 해당하는 표준곡선은 연속 희석시킨 각각의 정제된 항원을 사용하여 작성하였고, 각각의 사이토카인 농도는 작성된 표준곡선에 따라 계산하였다.
5.4. 방어효능 평가
마우스(C57BL/6, 암컷, 8주령)에 백신 후보물질(Zika:Env1, 또는 Zika:Env) 10-50 μg/mouse와 면역증강제 알럼(Alum) 50-500 μg/mouse + MPL 20 μg/mouse를 PBS에 각 마우스당 총 부피가 140 μl가 되도록 혼합하여 근육주사로 3회(Day 0, 14, 42) 접종한 후 교배시켜 태어난 새끼 마우스 2일령에 2종의 지카바이러스(Puerto Rico 유래 strain PRVABC59, Uganda 유래 strain MR766)와 교차 방어 효능을 평가하고자 뎅기 바이러스(type 2)를 피하 접종하여 각 바이러스에 따른 임상 증상을 관찰하였다. 접종한 각 바이러스의 양은 하기 표 2에 정리하였으며 피하 접종을 시행하였다.
실시예 1: 재조합 지카바이러스 외피단백질(Zika virus Envelope protein) 식물 발현 벡터 제조
도 1과 같이 식물체에서 지카바이러스 외피단백질을 발현시킬 수 있도록 재조합한 식물 발현 벡터를 제작하였다. 보다 자세하게는, 지카바이러스 외피단백질에 대한 유전자 정보를 확보하고, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에서의 발현에 최적화된 서열로 유전자(서열번호 2)를 합성하였다.
Zika:Env1 재조합 항원을 얻기 위해, pCAMBIA1300 벡터의 CaMV 35S 프로모터와 HSP(heat shock protein) 종결자(terminator) 사이에 NB(new chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 3), 지카바이러스 외피단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2), 폴리히스티딘 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 5)를 순서대로 연결하여 지카바이러스 외피단백질 식물 발현 벡터를 제작하였다. 이와 같이 제작된 벡터는 서열번호 11의 염기서열을 포함한다.
Zika:Env 재조합 항원을 얻기 위해, pCAMBIA1300 벡터의 CaMV 35S 프로모터와 HSP 종결자 사이에 NB(new chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 3), 지카바이러스 외피단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2), 인간 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 7) 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 9)를 순서대로 연결하여 지카바이러스 외피단백질 식물 발현 벡터를 제작하였다. 이와 같이 제작된 벡터는 서열번호 13의 염기서열을 포함한다.
실시예 2: 재조합 지카바이러스 외피단백질의 발현 확인
2.1. 식물 발현 벡터 일과성 발현(transient expression)
상기의 실시예 1에서 준비한 두 가지 식물 발현 벡터를 각각 아그로박테리아 균주 LBA4404에 전기충격법(electroporation)을 이용하여 형질전환 시켰다. 형질 전환된 아그로박테리아를 5 ml의 YEP(Yeast Extract Peptone) 액체 배지(효모 추출물 10 g, 펩톤 10 g, NaCl 5 g, 카나마이신 50 mg/L, 리팜피신 25 mg/L)에서 28℃의 조건에서 16시간 동안 진탕배양 한 후 1차 배양액 1 ml을 50 ml의 새 YEP 배지에 접종하여 28℃의 조건에서 6시간 동안 진탕배양 하였다. 이렇게 배양된 아그로박테리아는 원심분리(7,000 rpm, 4℃, 5분)하여 수집한 후, 인필트레이션(infiltration) 버퍼[10 mM MES (pH 5.7), 10 mM MgCl2, 200 μM 아세토시링곤]에 600 nm의 파장에서 O.D. 1.0의 농도로 다시 현탁시켰다. 아그로박테리아 현탁액은 주사 바늘을 제거한 주사기를 이용하여 니코티아나 벤타미아나 잎의 뒷면에 주입하는 방법으로 아그로-인필트레이션(agro-infiltration)을 수행하였다.
2.2. 식물체에서 재조합 지카바이러스 외피단백질의 발현 확인
상기의 실시예 2.1에서 준비한 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리한 후에, 용액에 포함되어 있는 수용성 분획(S)에 있는 단백질과 펠릿(pellet; P) 분획에 있는 단백질을 원심분리전 전체 추출액(total; T)과 함께 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. 보다 자세하게는, 각 분획 30 μl를 SDS 시료 버퍼와 혼합한 후에 가열하였다. 그리고 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동하여 크기별로 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 PVDF 막으로 이동시킨 후에, 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 블록킹 단계를 거친 후에, hFc와 결합하는 이차항체와 결합시킨 후, ECL 용액을 제조사에서 제공하는 방법대로 처리하여 재조합 Zika:Env 단백질을 확인하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 발현된 재조합 Zika:Env 단백질의 대부분은 수용성 분획에서 확인되었으며, 소량의 재조합 지카바이러스 외피단백질이 펠릿 분획에서 관찰되었다. 이러한 결과는 재조합 Zika:Env1 단백질의 경우도 동일하게 나타났다.
상기 결과를 통하여, 본 발명의 재조합 지카바이러스 외피단백질 발현용 벡터는 식물체에서 재조합 지카바이러스 외피단백질을 효과적으로 발현시킬 수 있으며, 상기 벡터를 이용하여 제조된 재조합 지카바이러스 외피단백질은 높은 수용해성(water solubility)을 가지고 있기 때문에, 분리정제가 용이하고, 재조합 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 효과적인 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 재조합 지카바이러스 외피단백질의 분리 정제
상기의 실시예 2에서 준비된 재조합 지카바이러스 외피단백질이 발현되는 니코티아나 벤타미아나 잎 500 g에 단백질 추출 용액[50 mM Sodium phosphate(pH 8.0), 300 mM NaCl, 100 mM Sodium sulfite, 0.5% Triton X-100, 1.5% PVPP] 1 L를 첨가하고 블렌더로 조직을 파쇄한 후 10,000 rpm으로 4℃에서 40분간 원심분리하여 단백질 추출액을 회수하였다. 상기 단백질 추출액으로부터 재조합 지카바이러스 외피단백질의 분리정제를 위해 Protein A 아가로즈 레진(agarose resin)이 충전된 컬럼으로 친화성 크로마토그래피를 실시하였다. 레진 평형화를 위해 컬럼에 레진을 50 mL 충전한 후 500 mL의 세척용액 2[50 mM Sodium phosphate(pH8.0), 300 mM NaCl]로 평형화 시켰다. 회수한 단백질 추출액은 평형화가 완료된 레진과 결합시킨 후, 250 mL의 세척 용액 1[50 mM Sodium phosphate(pH8.0), 300 mM NaCl, 0.5% Triton X-100]로 세척하고, 250 mL의 세척 용액 2[50 mM Sodium phosphate(pH8.0), 300 mM NaCl]로 세척하였다. 세척이 완료된 후, 용출 용액[100 mM Sodium citrate(pH 3.0), 300 mM NaCl]으로 재조합 Zika:Env 단백질을 용출 하였다. 재조합 Zika:Env 단백질이 포함된 용출용액은 단백질의 안정화를 위해 중화 용액[1.5 M Tris-Cl(pH 8.8)]을 pH 7.4까지 첨가하였다. 재조합 Zika:Env 단백질이 포함된 용출용액은 50 kDa 크기의 멤브레인 필터를 이용한 UF(ultrafiltration) 시스템을 사용하여 보관용액[50 mM Tris-Cl(pH 7.4), 300 mM NaCl]으로 버퍼 교체 및 농축을 실시하였다. 재조합 지카바이러스 외피단백질과 레진의 결합여부는, 웨스턴 블롯팅을 통해 결합이 잘 된 것을 확인하였고(도 3 참조), 분리 정제된 재조합 지카바이러스 외피단백질은 전기영동(SDS-PAGE) 후 쿠마시 염색법(Coomassie staining)을 통해 분리 정제가 성공적으로 된 것을 확인하였다(도 4 참조).
상기 결과들을 통하여, 본 발명의 재조합 지카바이러스 외피단백질은 식물체에서도 효과적으로 발현될 뿐만 아니라, 높은 수용해성을 가지고 있어 분리 및 정제가 용이하고, 또한, 체내에서 항원으로 작용하여 높은 면역원성 및 바이러스 중화능을 나타내므로 신규한 지카바이러스 백신 조성물로 사용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. 이하에서는, 지카바이러스 외피단백질의 두 가지 형태 및 애주번트(adjuvant; 면역증강제) 병용에 따른 효과를 여러 항목으로 평가하여 가장 효과가 좋은 백신 조성물을 탐색하였다.
실시예 4: 재조합 지카바이러스 외피단백질을 함유하는 백신 및 애주번트의 후보 선정
식물체(Nicotiana benthamiana)에서 발현한 지카바이러스 백신 후보군(Zika:Env1 및 Zika:Env)과, 애주번트 후보군으로는 Th2-타입 면역 반응을 유도하고 항원 제시(antigen presentation)를 증진시키는 알럼(Alum), 그리고 TLR(toll-like receptor) 4 작용제(agonist)로서 Th1-타입 면역 반응을 유도한다고 알려진 MPL(Monophosphoryl-lipid A)을 선정하여 하기 표 3에 기재된 조합으로 실험을 진행하였다(각 조합에 따라 그룹 1 내지 그룹 6으로 구분함).
백신 후보군(Zika:Env1, Zika:Env)은 투과전자현미경(TEM; transmission electron microscopy)을 이용하여 VLP(Virus like particle)의 형태를 나타내는지 확인하였으나, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 두 가지 재조합 외피단백질 모두 VLP의 형태를 나타내지는 않았다.
비교예 1: 체액성 면역 평가
1.1. 백신 접종에 따른 항체 생산 비교
백신 투여 시에 목표하는 수준의 항체가 생산되는지 여부를 평가하기 위해, 자체 구축한 Indirect ELISA 방법을 이용하여 백신 후보군 Zika:Env1 및 Zika:Env를 인지하는 항체를 측정하였다. 마우스에 PBS 또는 백신 후보군을 1-3회(Day 0, 14, 42) 근육주사로 접종 후 7일에서 14일 후(Day-1, 7, 28, 49) 마우스로부터 분리한 혈청 내 지카바이러스 항체를 측정하였다(도 6a의 흐름도 참조).
항체가 측정 결과 도 6b 및 도 6c에 나타난 바와 같이, 백신 후보군을 2-3회 반복 접종한 경우 음성대조군(PBS; 그룹 1)을 제외한 모든 그룹 군의 항체가가 유사하게 측정되었으나, 1회 접종 시엔 MPL을 혼합한 그룹(그룹 4-6)의 항체가가 더 높게 나타났다. 이를 토대로 MPL을 혼합하였을 때 체액성 면역은 더 빠른 면역반응이 유도되는 것을 확인하였다.
1.2. 백신 접종에 따른 서브타입 IgG1, IgG2c 생산 비교
백신 후보군을 1-3회(Day 0, 14, 42) 접종하고, 7일에서 14일 후(Day-1, 7, 28, 49) 얻은 혈청을 1:100 또는 1:400 비율로 희석하여 자체 구축한 Indirect ELISA 방법을 통해 항체의 IgG1, IgG2c 서브타입을 비교 분석함으로써 Th1과 Th2 세포 매개 면역 반응 유도를 확인하였다.
그 결과 도 7a 및 7b에 나타난 바와 같이, 백신 후보군 1회 접종 시에는 MPL을 혼합한 그룹(그룹 4-6)에서 IgG2c 비율이 약 1.6-2.5배로 Th1 세포 매개 면역 반응이 높게 나타나다가, 2-3회 반복 접종 시에는 IgG2c/IgG1 비율이 다른 백신 후보군과 유사하게 1로 가까이 나타나 T 세포 반응 스위칭(response switching) 이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 또한, MPL을 혼합하지 않은 다른 백신 후보군(그룹 2, 그룹 3)은 이와는 반대로 1회 접종 시 IgG2c/IgG1 비율이 0.2-0.4로 Th2 세포 매개 면역 반응이 높게 나타나다가 백신 혼합물을 2-3회 반복 접종 시 IgG2c/IgG1 비율이 다른 백신 혼합물 접종 그룹과 유사하게 1에 가까이 나타남을 확인하여 각각의 애주번트에 의한 면역 유도능을 확인하였다.
비교예 2: 백신 접종에 따른 중화항체 유도능 비교
백신 투여 시에 생산되는 중화 항체를 PRNT(Plaque reduction neutralization test)를 이용하여 측정하였다(표 2 참조). 마우스에 PBS 또는 백신 후보군을 1-3회(Day 0, 14, 42) 근육주사로 접종 7일 후(Day 49) 마우스로부터 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 동일 그룹의 마우스 5마리의 혈청을 풀링(pooling)하여 사용하였으며, 56℃에서 30분간 비동화한 후 대조군 혈청과 실험군 혈청을 각각 같은 희석 배율로 희석하였다. 역가(PFU/ml)가 확인된 2종의 지카바이러스(MR766, PRVABC59 strain)를 희석하여 바이러스 컨트롤에서 50개 정도의 plaque/well이 나오도록 준비한 다음, 희석된 혈청과 1:1로 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 바이러스 반응 30분 후 혈청과 바이러스 반응액을 베라 세포(Vero cell) 또는 베라 76 세포(Vero 76 cell)에 접종한 다음 2시간 동안 흡착시킨 후 오버레이 배지(Overlay media; 1% Sea plaque agar 또는 1.4% Methyl cellulose)를 첨가하여 37℃5% CO2 배양기에서 5일 또는 14일간 배양한 다음 1% 크리스탈 바이올렛을 이용하여 염색하여, 형성된 플라크(plaque)의 갯수를 확인하였다. PRNT50은 % inhibition을 통하여 산출하였다.
그 결과 MR766 지카바이러스 스트레인에 대한 중화항체 유도 수준이 Zika:Env1 접종 그룹인 그룹 2, 그룹 4에서 각각 200, 100으로 평가되었고 Zika:Env 접종 그룹인 그룹 3, 그룹 5, 그룹 6은 각각 400, 1600, 3200으로 평가되어 더 많은 중화항체가 유도된 것이 관찰되었다. 마찬가지로, PRVABC59 지카바이러스 스트레인에 대한 중화항체 유도 수준 역시 Zika:Env1 접종 그룹인 그룹 2, 그룹 4는 각각 100, 100 미만으로 평가되었고, Zika:Env 접종 그룹인 그룹 3, 그룹 5, 그룹 6는 각각 400, 800, 3200으로 더 많은 중화항체가 유도된 것이 관찰되었다. 특히 Zika:Env 10 μg 과 Alum 500 μg + MPL 20 μg을 혼합 접종한 그룹 6에서 MR766 스트레인과 PRVABC59 스트레인에 대한 중화항체 유도수준이 3200으로 다른 그룹에 비해 월등히 높은 것을 확인하였다.
비교예 3: 세포성 면역 평가
3.1. IFN-γ, IL-12 생산 면역세포 분석(ELISPOT) 비교
세포매개성 면역반응 분석에 따른 면역능 평가를 수행하기 위하여, IFN-γ 또는 IL-12를 발현하는 림프구를 ELISPOT 분석으로 측정하였다. IFN-γ와 IL-12 ELISPOT은 각각 BDTM ELISPOT mouse IFN-γ ELISPOT set(BD Life Sciences)와 mouse IL-12(p70) ELISpotBASIC(MABTECH)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
먼저, 백신 후보군 1회 접종 시 MPL을 혼합한 그룹인 그룹 4, 5, 6에서 IFN-γ의 분비세포가 가장 높게 관찰될 것이라는 예상과는 달리, 그룹 2(Zika:Env1 50 μg + Alum 50 μg)와 그룹 6(Zika:Env 10 μg + Alum 500 μg + MPL 20 μg)에서 가장 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 8 참조).
백신 후보군 2회 접종 시에는 Zika:Env1 접종 그룹인 그룹 2 및 그룹 4에서 IFN-γ 분비 세포가 각각 45, 90개 내외로 관찰된 반면 Zika:Env 접종 그룹인 그룹 3, 5 및 6에서는 각각 200, 100, 170개 내외로 더 많은 IFN-γ 분비 세포가 관찰되었다(도 10 참조). 백신 후보군을 3회 접종한 경우에도 마찬가지로 Zika:Env1 접종 그룹인 그룹 2 및 그룹 4은 IFN-γ 분비 세포가 각각 280, 200개 내외로 관찰된 반면 Zika:Env 접종 그룹인 그룹 3, 5 및 6는 각각 350, 420, 560개 내외로 더 많은 IFN-γ 분비 세포가 관찰되었고, 특히 그룹 5와 그룹 6은 높은 IFN-γ 분비 세포를 지속적으로 발현하는 것을 관찰할 수 있었다(도 12 참조).
IL-12 분비 세포는 백신 후보군 1회 접종 시 IFN-γ 분비 세포 실험 결과와 유사하게 그룹 2와 그룹 6(도 9 참조), 백신 후보군 2회 접종 시에는 그룹 3과 그룹 6에서 가장 높은 IL-12 분비 세포가 관찰되었다(도 11 참조). 하지만 백신 후보군을 3회 접종 한 경우에는 모든 실험군(그룹 2-6)이 대조군인 그룹 1과 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않았다.
3.2. 사이토카인(cytokine) 생산량 비교
백신 후보군(Zika:Env1, Zika:Env) 접종이 사이토카인 IFN-γ, IL-12, IL-4 및 TNF-α 분비량에 미치는 영향을 분석하고, ELISPOT 실험 결과에 대한 보다 상세한 분석을 진행하기 위하여 각각의 사이토카인에 대해 ELISA 키트를 사용하여 분비량을 평가하였다.
먼저 도 14에 나타난 바와 같이, 백신 후보군 1회 접종 시 IFN-γ와 TNF-α 분비량은 ELISPOT 시험 결과와 유사하게 그룹 2(Zika:Env1 50 μg + Alum 50 μg)와 그룹 6(Zika:Env 10 μg + Alum 500 μg +MPL 20 μg)에서 높게 나타났다. IL-4는 그룹간 차이가 크게 나타나지 않았으나, 그룹 6에서 감작하지 않았을 때, IL-12 분비가 가장 높게 관찰되어 전체적인 면역원성이 증가된 것으로 확인되었다.
또한, 도 15에서 확인할 수 있는 바와 같이, 백신 후보군 2회 접종 시 앞선 시험 결과와 유사하게 IFN-γ의 분비량이 그룹 3에서 가장 높게 나타났다. 백신 후보군 3회 접종 시에도 마찬가지로 IFN-γ의 분비량이 Zika:Env 접종 그룹인 그룹 3, 5, 6 접종군에서 가장 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 3회 접종군에서는 TNF-α 분비량은 감소하였으나, 그룹 5(Zika:Env 50 μg + Alum 50 μg + MPL 20 μg), 및 그룹 6(Zika:Env 10 μg + Alum 500 μg + MPL 20 μg)에서 IFN-γ 분비량이 2회 접종군과 비교하여 약 4배에서 19배가량 증가한 것으로 나타났다(도 16 참조).
3.3. 면역세포 반응 분석
백신 접종 시 활성화되는 면역세포를 분석하기 위하여, 각 백신 후보군을 접종한 마우스로부터 분리한 비장세포에서 CD4+, CD8+ T 세포(CD3+, CD4+, CD8+)를 유세포 분석기를 사용하여 측정하였다.
백신 후보군 1회 및 3회 접종 시 이펙터 T 세포의 비율이 음성대조군(PBS; Group 1)과비교하여 각 그룹간의 차이가 크게 나타나지 않았고, 백신 반복 접종에 따른 T 세포 집단(population)도 변화를 나타내지 않았다(도 17 참조). 이러한 결과는 앞선 세포성 면역 시험 결과를 함께 고려해 보았을 때, 백신 후보군 접종 시 T 세포 집단에는 변화가 없으나, T 세포의 활성이 증가되는 것이라는 사실을 시사하는 것이다.
또한, 도 18a 내지 도 18d에서 나타난 바와 같이, PD-1 마커를 이용하여 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포의 탈진 정도를 관찰하였을 때 백신 후보군 1회 접종 시 모든 그룹에서 PD-1+ T 세포의 비율이 1%도 안되는 것으로 나타났고, 3회 반복 접종 시에도 역시 탈진된 T 세포가 증가하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 모든 백신 후보군 반복 접종 시 이펙터 T 세포의 고갈 현상은 나타나지 않는 것을 알 수 있었다.
마지막으로, 조절 T 세포(Treg cell)를 관찰한 결과 도 19a 및 도 19b에 나타난 바와 같이, 백신 후보군 3회 접종 시, 1회 접종 시에 비해 모든 그룹에서 조절 T 세포의 비율이 약간 증가하였으나, 모두 1-2% 대의 낮은 증가 비율을 나타내어 백신 후보군 반복 접종 시에도 조절 T 세포의 비율이 높아지지 않음을 확인하였다. 이러한 결과는 이펙터 T 세포의 활성화가 억제되지 않음을 시사하는 것이다.
비교예 4: 방어효능 평가
4.1. 모체 이행 항체 비교
백신 후보군을 접종한 어미에게서 태어난 새끼 마우스를 탄생 2일째 채혈하여 얻은 혈액에서 분리한 혈청 내 모체 이행 항체를 자체 구축한 indirect ELISA 방법을 통해 측정하였다.
그 결과 도 20a 및 도 20b에 나타난 바와 같이, 백신 후보군을 접종한 어미에게서 태어난 새끼 마우스의 혈청에서, 음성대조군(PBS; 그룹 1)과 비교하여 높은 수준의 항체가를 나타내는 것을 관찰하여 모체 이행 항체를 측정할 수 있었다. 그 중에서도 특히 Zika:Env 접종군(그룹 3, 5, 6)이 Zika:Env1 접종군(그룹 2, 4)과 비교하여 유의성 있게 모체 이행 항체가 더 증가된 것을 확인하였다.
4.2. 새끼 마우스 내 사이토카인 생산 면역세포 비교 분석
백신 후보군을 접종한 어미에게서 태어난 새끼 마우스를 탄생 30일째 비장을 적출하여 분리한 비장면역세포 내 IFN-γ 또는 IL-12를 발현하는 림프구를 ELISPOT 분석으로 측정하였다. IFN-γ와 IL-12 ELISPOT은 각각 BDTM ELISPOT mouse IFN-γ ELISPOT set(BD Life Sciences)와 mouse IL-12 (p70) ELISpotBASIC(MABTECH)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
그 결과 도 21에 나타난 바와 같이, 음성대조군(PBS; 그룹 1)에서 태어난 새끼 마우스보다 백신 후보 접종군에서 태어난 새끼 마우스에서 IFN-γ 생산 면역세포가 전반적으로 증가한 것이 확인되었다. 그 중 그룹 6의 경우 항원 재자극시 PBS 접종군보다 8배 이상 IFN-γ 생산 면역세포가 증가된 것을 확인하였다.
한편, IL-12 생산 면역세포의 경우 도 22에 나타난 바와 같이, 음성대조군(PBS; 그룹 1)에서 태어난 새끼 마우스에 비해 그룹 3-6에서 IL-12 생산 면역세포의 수가 증가하는 경향성을 나타냈으나, 유의미한 차이를 나타내지는 않았다.
4.3. 새끼 마우스 내 사이토카인의 생산량 비교
백신 후보군 접종이 IFN-γ, IL-12 및 TNF-α 분비량에 미치는 영향을 분석하고 ELISPOT 실험 결과에 대한 자세한 분석을 진행하기 위하여 각 사이토카인에 대해 ELISA 키트 사용하여 생산량을 비교 평가하였다.
그 결과 도 23에 나타난 바와 같이, 음성대조군(PBS; 그룹 1)에서 태어난 새끼 마우스보다 백신 후보 접종군에서 태어난 새끼 마우스에서 IFN-γ 분비량이 전반적으로 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 특히, 그룹 6의 경우 항원 재자극시 PBS 접종군보다 104배 이상 IFN-γ 분비량이 증가되는 것으로 나타났다(도 23의 A 참조).
IL-12 분비량 역시 대조군에서 태어난 새끼 마우스보다 그룹 3, 4 및 5에서 태어난 새끼 마우스에서 항원 재자극시 IL-12 생산량이 유의성있게 증가한 것을 확인할 수 있었고, 특히 그룹 4의 경우 감작하지 않았을 경우 PBS 접종군보다 약 400배 이상 IL-12 분비량이 증가되는 것으로 나타났다(도 23의 B 참조).
TNF-α 분비량의 경우, 대조군에서 태어난 새끼 마우스보다 그룹 2, 4, 5 및 6에서 태어난 새끼 마우스에서 항원 재자극시 TNF-α 분비량이 유의성있게 증가한 것이 확인되었고, 특히 그룹 4의 경우 감작하지 않았을 경우에 IL-12와 유사하게 대조군보다 약 400배 이상 TNF-α 생산량이 증가된 것을 확인하여 전체적인 면역원성이 증가된 것을 확인하였다.
4.4. 방어효능 비교 평가
마우스에 백신 후보군을 근육주사로 3회(Day 0, 14, 42) 접종한 후, 교배시켜 태어난 새끼 마우스 2일령에 2종의 지카바이러스(PRVABC59, MR766 strain)와의 교차 방어 효능을 평가하고자 뎅기 바이러스(DENV type 2)를 피하 접종하여 각 바이러스에 따른 임상 증상을 관찰하였다. 접종한 각각의 바이러스 양은 상기 표 2에서 기술하였으며, 결과는 도 24a 및 도 24b에 나타내었다.
먼저, MR766 스트레인(Uganda strain)을 106.8 TCID50/mouse로 새끼 마우스에게 피하접종 하였을 때 음성대조군(PBS; 그룹 1) 어미에게서 태어난 새끼 마우스 5마리는 6일 이내 모두 폐사하였다(도 24a 참조). Zika:Env1 접종군인 그룹 2, 4 마우스에게서 태어난 새끼 마우스는 공격접종 10일 이내, 그룹 2에서는 5마리 중 4마리, 그룹 4에선 5마리 모두 폐사하였다. 반면, Zika:Env 접종군인 그룹 3 마우스에게서 태어난 새끼 마우스는 5마리 중 2마리가 8일 이내 폐사하였으며, 그룹 5 마우스에게서 태어난 새끼 마우스는 5마리 중 3마리가 10일이내 폐사하였다. 그룹 6 마우스에게서 태어난 새끼 마우스는 5마리 중 1마리만이 6일째 폐사하였다. 상기와 같은 결과는 MR766 스트레인에 대한 방어효능이 Zika:Env1 보다 Zika:Env 접종군에서 더 뛰어남을 보여주는 것이다.
다음으로, PRVABC59 스트레인(Puerto Rico strain)을 106.3 TCID50/mouse로 공격접종 했을 때 음성대조군(PBS; 그룹 1) 어미에게서 태어난 새끼 마우스 5마리 중 2마리는 8일째와 10일째 폐사하였으며, 한 마리는 감염 16일째, 2마리는 감염 16일째부터 체중이 감소되다 18일째 폐사하였다. Zika:Env1 접종군인 그룹 2, 4 마우스에게서 태어난 새끼 마우스는 공격접종 4일 째(그룹 2)와 12일째(그룹 4) 각각 한 마리가 폐사하였고, 그룹 2의 새끼 마우스는 체중 감소가 관찰되지 않았으나, 두 마리가 다리를 저는 임상증상을 나타내었다. 그룹 4의 새끼 마우스 군에서는 한 마리가 18일째부터 체중 감소를 나타내었으며, 두 마리가 다리를 저는 임상증상을 나타내었다. 반면 Zika:Env 접종군인 그룹 3, 6 마우스에게서 태어난 새끼 마우스는 공격접종 후에도 5마리 모두 생존하였으며, 체중 감소 또는 다리를 저는 임상증상을 나타내지 않았다. 그러나 그룹 5 마우스에게서 태어난 새끼 마우스 중 2마리가 7일째부터 체중 감소가 나타나며 10일째 사망하였다. 상기 결과를 종합하면 PRVABC59 스트레인에 대한 방어효능 또한 Zika:Env1 보다 Zika:Env 접종군에서 뛰어난 것으로 나타났다.
마지막으로, 백신 후보물질(Zika:Env1, Zika:Env)이 뎅기 바이러스(DENV)에 대해 교차 방어 효과가 있는지 확인하기 위하여, 백신 후보군을 3회(Day 0, 14, 42) 접종한 어미에게서 태어난 새끼 마우스 2일령에 DENV를 106 TCID50/mouse로 피하 접종하여 증상 완화를 관찰하였다. 그 결과 PBS를 접종한 어미에게서 태어난 새끼 마우스 5마리 중 3마리가 12일 이내 폐사한 반면, 반면 백신 후보 접종군에서는 그룹 4, 5 마우스를 제외한 그룹 2, 3, 6에게서 태어난 새끼마우스는 공격접종 후 모두 생존하였고 체중 감소, 다리를 저는 임상증상이 관찰되지 않았다. 또한, 그룹 4 마우스에게서 태어난 새끼 마우스 5마리 중 2마리가 공격접종 4일째 폐사하였고, 그룹 5 마우스에게서 태어난 새끼마우스 5마리 중 한 마리가 공격 접종 6일째부터 체중이 감소되며 10일째 폐사하였다. 이와 같은 결과를 바탕으로 백신 후보군 접종 시 뎅기 바이러스에 대한 교차 방어효과를 확인할 수 있었다.
4.5. 공격 접종 후 혈액 내 바이러스 양 측정
백신 후보군을 접종한 어미에게서 태어난 새끼 마우스를 탄생 2일령에 2종의 지카바이러스(MR766, PRVABC59 strain) 또는 뎅기 바이러스(DENV type 2)를 공격접종하여 2일 후 얻은 혈청에서 TCID50(Tissue culture infective dose 50)를 측정하여 혈청 내 바이러스 함량을 측정하였다. 동일 그룹의 마우스 5마리의 혈청을 풀링하여 사용하였으며, 56℃에서 30분간 비동화한 다음 대조군 및 실험군 혈청을 101 내지 103까지 각각 십진 희석하였다. 희석된 혈청을 베로 세포(Vero cell) 또는 베로 76 세포(Vero 76 cell)에 접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하면서, CPE 유무를 관찰하여 TCID50 값을 산출하였다. 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
시험 결과, 그룹 6(Zika:Env 10 μg + Alum 500 μg + MPL 20 μg)의 어미에게서 태어난 마우스를 제외한 모든 그룹에서 MR766 스트레인 공격접종 2일 후 얻은 혈청에서 감염력 있는 바이러스가 검출되었다. 그러나 그룹 2(Zika:Env1 50 μg + Alum 50 μg)와 그룹 5(Zika:Env 50 μg + Alum 50 μg + MPL 20 μg)에 속한 어미에게서 태어난 새끼 마우스에서는 대조군(102.5 TCID50/ml)과 비교하여 혈중 바이러스량이 각각 102, 102.3 TCID50/ml까지 감소한 것을 확인하여, 일부 백신 후보군(그룹 2, 5, 6)의 어미로부터 태어난 새끼가 어미의 항체를 넘겨받아 MR766 스트레인에 대한 방어능을 나타내는 것을 확인하였다.
한편, 백신 후보군 및 대조군을 접종한 어미에게서 태어난 생후 2일령 마우스에 PRVABC59 스트레인의 공격접종 2일 후 얻은 혈청 중 대조군인 PBS를 접종한 어미에게서 태어난 새끼 마우스에선 혈중 바이러스량이 102.5 TCID50/ml로 측정되었으며, 그룹 3, 5, 6에 속한 어미에게서 태어난 새끼 마우스에서는 혈중 바이러스량이 각각 102, 102.3 TCID50/ml까지 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 그룹 2 및 4의 어미에게서 태어난 새끼 마우스는 혈중 바이러스가 검출되지 않아 백신후보군 접종 어미로부터 태어난 새끼가 어미의 항체를 넘겨받아 PRVABC59 스트레인에 대한 방어능을 나타내는 것으로 확인되었다.
백신 후보군(Zika:Env1, Zika:Env)이 뎅기 바이러스(DENV)에 대해 교차 방어 효과가 있는지 확인하기 위하여 백신 후보군을 3회(Day 0, 14, 42) 접종한 어미에게서 태어난 새끼 마우스 2일령에 DENV를 106 TCID50/mouse로 피하 접종하여 증상완화 여부를 관찰하였다. DENV 공격접종 2일 후 얻은 혈청 중 대조군인 PBS를 접종한 어미에게서 태어난 새끼 마우스는 혈중 바이러스량이 102.5 TCID50/ml로 측정되었으며, 그룹 3를 접종한 어미에게서 태어난 새끼 마우스는 혈중 바이러스량이 102.3 TCID50/ml까지 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한 그룹 2 및 6에 속한 어미에게서 태어난 새끼 마우스는 혈중 바이러스가 검출되지 않아 백신 후보군 접종 시 뎅기 바이러스에 대한 교차 방어능을 나타내는 것으로 확인되었다.
비교예 결과 종합
상기 비교예의 결과를 종합하여 하기 표 5에 정리하였다. 숫자는 순위를 의미하며 해당 영역에서 1에 가까울수록 효과가 뛰어남을 나타낸다.
종합하면, 각 백신 후보군의 면역원성 및 효능을 평가하기 위해 체액성 면역, 세포성 면역 및 방어 효능 평가 시험을 수행하였고, 먼저 체액성 면역시험에서는 음성대조군(PBS; 그룹 1)과 비교하여 모든 그룹에서 접종 횟수가 증가될수록 접종 항원 인지 항체가 증가하는 것을 확인하였다. 다만 1회 접종 시엔 MPL을 혼합한 그룹(그룹 4-6)이 다른 그룹과 비교하여 항체가가 높게 나타나는 것을 확인하였다.
이어서, 혈청에서 지카바이러스 특이적 IgG 서브클래스를 Indirect ELISA를 통해 측정하였을 때 백신 후보군 1회 접종 시 MPL을 혼합한 그룹(그룹 4-6)에서 IgG2c 비율이 약 1.6-2.5배로 Th1 세포 매개 면역 반응이 높게 나타나다가 백신 후보군 2-3회 반복 접종 시 IgG2c/IgG1 비율이 1로 가까이 관찰되었고, 또한 알럼(Alum)만 혼합한 그룹(그룹 2-3)은 이와 반대로 1회 접종 시 IgG2c/IgG1 비율이 0.2-0.4로 Th2 세포 매개 면역 반응이 높게 나타나다가 백신 혼합물 2-3회 반복 접종 시 IgG2c/IgG1 비율이 1에 가까이 나타남을 확인하였다. 이러한 결과는 백신의 1차 접종 시에는 애주번트에 의해 항체 아이소타입 스위칭이 좌우가 되는 반면 반복 접종 시에는 Th1/Th2 반응의 비율이 거의 동일해짐을 의미하는 것이다.
또한, 백신 후보군을 3회 면역시킨 마우스에서 얻은 혈청에서 2종의 지카바이러스(MR766, PRVABC59 스트레인)와 뎅기 바이러스(type2)에 대한 항체중화능을 PRNT를 통해 확인 하였을 때, MR766과 PRVABC 지카바이러스 스트레인에 대한 중화항체 유도 수준이 Zika:Env 접종 그룹인 그룹 3, 5, 6에서 높게 나타났고, 특히 그룹 6에서 MR766 스트레인과 PRVABC59 스트레인에 대한 중화항체 유도 수준이 3200으로 다른 그룹에 비해 월등히 높은 것을 확인할 수 있었다.
세포성 면역 시험 결과는, 백신 후보군을 1회 접종 결과 MPL을 혼합한 그룹인 그룹 4-6에서 IFN-γ 및 IL-12 분비세포가 가장 많이 관찰될 것이라는 예상과는 달리 MPL이 혼합되지 않은 그룹 2(Zika:Env1 50 μg + Alum 50 μg)와 그룹 6(Zika:Env 10 μg + Alum 500 μg + MPL 20 μg)에서 IFN-γ 및 IL-12의 분비세포가 가장 높게 관찰되었고, ELISA 결과 역시 그룹 2, 6에서 IFN-γ, TNF-α 분비량이 가장 높게 관찰되었다. 반면 백신 후보군 2-3회 접종 시 Zika:Env 접종 그룹인 그룹 3, 5, 6에서는 Zika:Env1 접종 그룹과 비교하여 더 많은 IFN-γ 분비 세포가 관찰되었고 ELISA 결과 역시 그룹 3, 5, 6에서 IFN-γ 분비량이 가장 높게 관찰되었다.
또한, 백신 접종 시 활성화 되는 면역 세포를 분석한 결과 백신 후보군 1회 및 3회 접종 시 이펙터 T 세포의 비율이 각 그룹간의 큰 차이를 나타내지 않았고, 백신의 반복 접종에 따른 T 세포 집단도 변화를 나타내지 않았다. 이는 앞선 세포성 면역시험 결과에 비추어 볼 때 백신 후보군 접종 시 T 세포의 활성이 증가되었을 것으로 생각된다. 탈진된(exhausted) T 세포와 조절 T 세포의 관찰 결과 모든 백신 후보군에서 반복 접종 시 집단이 증가하지 않았고, 따라서 이펙터 T 세포의 고갈 현상이나 활성화 억제가 나타나지 않는 것을 확인하였다.
방어효능 평가 시험에서는 모체 이행 항체를 측정한 결과, 백신 후보군을 3회 접종한 마우스에게서 태어난 새끼 마우스의 모든 그룹에서 모체 이행 항체를 확인하였고, 특히 Zika:Env 접종 그룹인 그룹 3, 5 및 6에서 다른 그룹에 비해 높은 항체가를 나타냄을 확인하였다. 또한, 모체 이행 세포성 면역시험 결과 그룹 6에서 IFN-γ 분비세포와 분비량 모두 가장 높게 관찰되었다. 이어서, 새끼 마우스에 2종의 지카바이러스(MR766, PRVABC59 스트레인)과 뎅기 바이러스(type2)를 공격접종 함으로써 방어효능을 평가한 결과 그룹 6에서 지카바이러스와 뎅기 바이러스에 대한 방어능이 가장 좋게 관찰되었다.
결론적으로, Zika:Env 항원을 접종한 그룹이 Zika:Env1 접종 그룹에 비해 체액성 면역, 세포성 면역 및 방어효능 평가에서 모두 우수한 것으로 확인되었다. 특히, Zika:Env 항원 10 μg에 Alum 500 μg + MPL 20 μg 을 혼합하였을 경우 가장 우수한 백신 효능을 나타내어, 적은 항원의 양으로도 애주번트와의 조합을 통하여 현저히 향상된 백신 효능을 유도할 수 있음을 발견하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> BioApplications Inc. KNU-Industry Cooperation Foundation Innovac <120> Vaccine compositions comprising plant expressing recombinant Zika virus envelope proteins and preparation methods thereof <130> MP19-051 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Zika Env (Zika envelope protein ectodomain) <400> 1 Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met Ser 1 5 10 15 Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr 20 25 30 Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val Thr Thr 35 40 45 Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala Ser 50 55 60 Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly Lys 115 120 125 Ser Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met 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tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 600 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 660 acgcagaaga gcctctccct gtcccctggt aaa 693 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HDEL (histidine-aspartic acid-glutamic acid-leucine tag) <400> 8 His Asp Glu Leu 1 <210> 9 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of HDEL (histidine-aspartic acid-glutamic acid-leucine tag) <400> 9 cacgatgagc tc 12 <210> 10 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Zika:Env1 antigen (zika envelope protein ectodomain-H-HDEL) <400> 10 Gly Ser Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly 1 5 10 15 Met Ser Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys 20 25 30 Val Thr Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val 35 40 45 Thr Thr Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu 50 55 60 Ala Ser Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly 65 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ctctagctcg 1680 ag 1682 <210> 12 <211> 694 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Zika:Env antigen (zika envelope protein ectodomain-human Fc-HDEL) <400> 12 Gly Ser Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly 1 5 10 15 Met Ser Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys 20 25 30 Val Thr Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val 35 40 45 Thr Thr Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu 50 55 60 Ala Ser Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly 65 70 75 80 Glu Ala Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg 85 90 95 Thr Leu Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys 100 105 110 Gly Ser Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr 115 120 125 Gly Lys Ser Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser 130 135 140 Val His Gly Ser Gln His Ser Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His 145 150 155 160 Glu Thr Asp Glu Asn Arg Ala Lys Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser Pro 165 170 175 Arg Ala Glu Ala Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys 180 185 190 Glu Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met 195 200 205 Asn Asn Lys His Trp Leu Val His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro 210 215 220 Leu Pro Trp His Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn 225 230 235 240 Lys Glu Ala Leu Val Glu Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr 245 250 255 Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala 260 265 270 Gly Ala Leu Glu Ala Glu Met Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser 275 280 285 Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly 290 295 300 Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro 305 310 315 320 Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly 325 330 335 Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln 340 345 350 Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr 355 360 365 Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe 370 375 380 Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His 385 390 395 400 His Trp His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr 405 410 415 Val Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp 420 425 430 Phe Gly Ser Val Gly Gly Ala Leu Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His 435 440 445 Gln Ile Phe Gly Ala Ala Phe Lys Ala Arg Glu Pro Lys Ser Cys Asp 450 455 460 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 465 470 475 480 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 485 490 495 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 500 505 510 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 515 520 525 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 530 535 540 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 545 550 555 560 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 565 570 575 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 580 585 590 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 595 600 605 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 610 615 620 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 625 630 635 640 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 645 650 655 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 660 665 670 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 675 680 685 Gly Lys His Asp Glu Leu 690 <210> 13 <211> 2369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Zika:Env expression cassette (NB-zika envelope protein ectodomain-human Fc-HDEL) <400> 13 tctagaatta ttacatcaaa acaaaaaatg gctcgctcgt ttggagctaa cagtaccgtt 60 gtgttggcga tcatcttctt cggtgagtga ttttccgatc ttcttctccg atttagatct 120 cctctacatt gttgcttaat ctcagaacct tttttcgttg ttcctggatc tgaatgtgtt 180 tgtttgcaat ttcacgatct taaaaggtta gatctcgatt ggtattgacg attggaatct 240 ttacgatttc aggatgttta tttgcgttgt cctctgcagg atccatacga tgtattggtg 300 tttcaaatag ggattttgtt gaaggcatga gtggagggac atgggtggac gttgtattgg 360 agcacggcgg ttgcgtaacc gtgatggccc aagataagcc aactgttgac attgaactgg 420 tcacgactac tgtgtcaaat atggctgaag tgcggagcta ttgttatgaa gcatctatta 480 gtgatatggc tagtgattca agatgtccta cacagggaga agcatatctg gataagcagt 540 ccgatacaca atatgtatgc aaacgtactc ttgttgatag gggttggggt aacggttgcg 600 gattattcgg caagggttcc ttggttactt gtgctaaatt cgcgtgtagc aaaaagatga 660 caggtaagtc gatacagcct gagaatcttg agtaccgcat catgttgtct gttcatggta 720 gtcaacattc tgggatgatc gtcaatgaca ctgggcatga gactgatgaa aacagagcaa 780 aggttgagat tactcccaat tcaccaaggg ctgaagctac tctcggagga tttggttctt 840 taggattgga ttgcgagccg agaactggac tagatttttc tgatctttac taccttacta 900 tgaataacaa acattggctc gttcacaaag aatggtttca cgacattcca cttccttggc 960 atgccggagc agacactggt actcctcatt ggaataacaa agaggctctg gtcgaattta 1020 aggacgctca cgcaaaaaga caaacagttg tggttttagg tagccaggag ggggcagttc 1080 atacggcttt ggcaggtgcc ttggaagctg aaatggatgg tgccaagggt cgattgtcca 1140 gtggtcactt gaagtgtaga ttgaagatgg ataaacttcg tcttaagggg gtgtcatatt 1200 ctctgtgcac tgctgctttt actttcacaa aaataccggc agaaacgtta catggtaccg 1260 tgacagtcga ggttcaatat gctggaactg atgggccttg taaggtacca gcccagatgg 1320 ctgtcgatat gcaaacctta acaccagttg gaagacttat aactgctaat cccgttatta 1380 cagagtctac tgaaaattct aaaatgatgc tagagcttga tcctccattt ggagactctt 1440 acattgtgat tggagttggt gaaaaaaaga ttactcatca ttggcatagg tctggtagta 1500 caatcggtaa agcatttgaa gctaccgtaa ggggcgcgag aagaatggct gttcttggag 1560 atacagcttg ggattttgga tcagtaggtg gagccctcaa ctcactcgga aaaggtattc 1620 accagatctt cggtgcagca ttcaaggccc gggagcccaa atcttgtgac aaaactcaca 1680 catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc 1740 caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg 1800 acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc 1860 ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg 1920 tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca 1980 acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag 2040 aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gtgaggagat gaccaagaac caggtcagcc 2100 tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg 2160 ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct 2220 tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat 2280 gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtccc 2340 ctggtaaaca cgatgagctc tagctcgag 2369

Claims (26)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 지카바이러스 외피단백질, 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 인간 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 HDEL 태그를 포함하는 재조합 지카바이러스(Zika virus) 외피단백질; 및 애주번트(adjuvant)로서 알럼(alum) 및 MPL(monophosphoryl lipid A)을 유효성분으로 포함하는, 백신 조성물로서,
    상기 재조합 지카바이러스 외피단백질은 식물체에서 발현된 것이고,
    상기 알럼 및 MPL은 상기 재조합 지카바이러스 외피단백질 중량 대비 1 : 1 내지 50 : 0.4 내지 2 (외피단백질 : 알럼 : MPL) 비율로 포함되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 지카바이러스 외피단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 1회 내지 3회 접종되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 접종은 14 내지 28일 간격으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 지카바이러스 PRVABC59 스트레인, 지카바이러스 MR766 스트레인 및 뎅기 바이러스(Dengue virus) 타입-2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상에 대한 방어능이 있는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 인터페론-감마(IFN-γ), 인터루킨-12(IL-12) 및 종양괴사인자-알파(TNF-α)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 분비를 촉진시키는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 모체 이행 항체(maternal antibody)의 형성을 유도하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  14. 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 지카바이러스 외피단백질의 유전자 서열을 포함하는, 지카바이러스 외피단백질 발현용 재조합 벡터로서,
    상기 벡터는 서열번호 3의 염기서열을 더 포함하고, 식물체에서 발현되는 것을 특징으로 하는, 지카바이러스 외피단백질 발현용 재조합 벡터.
  15. 삭제
  16. 제14항에 있어서,
    상기 벡터는 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 5의 염기서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 지카바이러스 외피단백질 발현용 재조합 벡터.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 벡터는 서열번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 7의 염기서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 지카바이러스 외피단백질 발현용 재조합 벡터.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 벡터는 서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 9의 염기서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 지카바이러스 외피단백질 발현용 재조합 벡터.
  19. 제14항에 있어서,
    상기 벡터는 서열번호 11 또는 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 지카바이러스 외피단백질 발현용 재조합 벡터.
  20. 삭제
  21. 제14항 및 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된, 식물 형질전환체.
  22. 삭제
  23. 제14항 및 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 제조된, 재조합 지카바이러스 외피단백질.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 재조합 지카바이러스 외피단백질은 서열번호 10 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 재조합 지카바이러스 외피단백질.
  25. (a) 제21항의 식물 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 식물 형질전환체 또는 배양액으로부터 재조합 지카바이러스 외피단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 지카바이러스 외피단백질의 생산 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 정제는 수용성 분획을 사용하여 정제하는 것을 특징으로 하는, 재조합 지카바이러스 외피단백질의 생산 방법.
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