CN111148754A

CN111148754A - 疟疾疫苗

Info

Publication number: CN111148754A
Application number: CN201880062527.3A
Authority: CN
Inventors: A·V·S·希尔; K·尤尔
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 2017-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2020-05-12
Also published as: KR20200032169A; WO2019021013A1; MX2020001055A; PH12020500194A1; EP3658575A1; BR112020001586A2; US20200207811A1

Abstract

本发明涉及一种包含多肽的组合物，所述多肽包含SEQ ID NO：1(R21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列或者由其组成，其中所述多肽呈病毒样颗粒(VLP)的形式，其中所述颗粒包含少于10％的游离乙型肝炎表面抗原蛋白，其用于免疫对恶性疟原虫感染敏感的人类受试者，其特征在于，所述组合物以每次施用至少一个1μg至20μg R21的剂量的给药方案施用给至少18岁的受试者，或以每次施用至少一个0.5μg至10μg R21的剂量的给药方案施用给小于18岁的受试者。本发明还涉及试剂盒、方法和用途。

Description

疟疾疫苗

技术领域

本发明涉及用于治疗或预防疟疾病原体如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的免疫原性组合物。特别地，本发明涉及所述组合物在以特定给药方案免疫人类受试者中的用途。

背景技术

青蒿素抗性和载体对杀虫剂抗性的出现和传播威胁到了过去15年中与疟疾有关的死亡率的显著降低。开发持久且高效的疟疾疫苗仍然是全球健康优先考虑的事。最先进的疟疾疫苗候选物RTS,S/AS01已经在跨越若干非洲场所的多中心研究中完成了III期测试，并且在一个三剂给药的方案后在5-17个月的儿童中显示出针对临床疟疾的低水平(约30％)效力[1-4]。这种效力在最初的12个月后随时间迅速下降[5]，并且这种疫苗方案还存在安全性问题，这需要在2018年在非洲开始的计划试点配置试验中进行解决[6，7]。因此，非常需要对RTS,S/AS01进行改进以实现疟疾疫苗技术路线图(Malaria VaccineTechnology Roadmap)设定的目标-到2030年开发出对临床疟疾具有至少75％持久效力的适当疫苗[8]。

牛津大学詹纳研究所已经开发了R21。这是一种改进的RTS,S构建体，其包含表达融合到HBsAg的环子孢子蛋白(CSP)的中心重复序列和C-末端的重组颗粒，但在RTS,S[9]中没有发现过量的未融合的HBsAg蛋白。我们最近证明，用Matrix-M佐剂化的R21在低得多的剂量下引起与RTS,S/AS01相当的体液免疫原性，并且与RTS,S/AS01相比，用R21/MM的反应原性显著提高(Venkatraman等人)。这些令人鼓舞的结果为我们提供基础去评估未接触疟疾的成年人的疟疾子孢子攻毒研究中的效力。

然而，现有技术方法存在一些问题，例如RTS,S/AS01的部分短暂场效力(partialshort-lived field efficacy)。此外，本领域广泛认为有效的疟疾疫苗可能是作用于涉及其复杂生命周期的不同阶段的多种抗原的不同方法的组合[11]。在这方面，主要的备选性潜在补充性策略是异源初免-加强免疫，其依次施用病毒载体化疫苗黑猩猩腺病毒血清型63(ChAd63)和修饰的牛痘Ankara(MVA)，两者都编码ME-TRAP(融合到血小板反应蛋白相关粘附蛋白的多表位串)。除了引发抗体应答，该方法还在UK的成年人以及疟疾流行区的成年人和婴儿中引发有效的T细胞应答，并且在这些群体中具有安全性和耐受性的极好的追踪记录[12-16]。ChAd63-MVA ME-TRAP疟疾疫苗策略已经在UK中的受控人疟疾感染(CHMI)研究中证明了持久的部分效力[17]，并且部分效力在随后的用Pf感染的子孢子的CHMI研究中再次显现[18]。此外，在肯尼亚男性成年人中进行的随机对照单盲试验显示，免疫接种将疟疾感染的风险降低67％[19]。最近的临床试验首次将RTS,S/AS01与ChAd63-MVA ME-TRAP在同一个方案中组合，并测试了对抗子孢子攻毒的效力。该研究证明，在将这些疫苗组合在同一方案中不仅是安全和可耐受的，而且是高度免疫原性和有效的[20]。因此，相信这些组合方法在本领域中代表了用以持续研究工作的最有前景的起点。

Collins等人2017(Scientific Reports，第7卷，第46621篇)公开了临床前小鼠模型研究，该研究焦点是用高度免疫原性病毒样颗粒疫苗增强对疟疾的保护性免疫。作者公开了由单一CSP-乙型肝炎表面抗原(HBsAg)融合蛋白形成的R21颗粒，与充分研究的来自GSK疫苗的RTS,S疫苗形成对照，GSK疫苗除了CSP-HBsAg融合蛋白之外还包含四倍过量的HBsAg单体(图1)。当与佐剂Abisco-100和Matrix-M一起施用时，BALB/c小鼠中的免疫原性在'非常低'的剂量下被证实。证明了针对转基因子孢子攻毒的无菌保护。所述研究限于小鼠。教导了一次给药：每只小鼠0.5μg R21，分布到每只小鼠的两只后肢的胫骨肌中，用12μgMatrix-M配制，100μl总注射量。(第12页，Collins等人的第一段)。这是1:24的R21：Matrix-M比例。

Collins等人得出的关键结论是R21与其它组分的组合是合乎需要的。例如，在第2页第五段结尾(就在"结果"部分之前)，陈述了"此外，当评价R21作为多组分免疫接种策略一部分的潜力时，通过将MF59中的R21与基于PbTRAP的病毒载体组合，保护效力得到增强"。在第11页第一段强调了这个结论，其中表明"此外，将R21+MF59与基于PbTRAP的病毒载体混合并共同施用，导致了效力的增强。该结果支持了利用两种不同抗原以细胞和体液应答靶向子孢子和肝期寄生虫可能能够克服子孢子疫苗的任何泄漏的假说"。

WO2014/111733公开了包含至少一个NANP(SEQ ID NO：6)重复序列、来自恶性疟原虫的CS蛋白的一些或全部C-末端以及乙型肝炎表面抗原的融合蛋白的颗粒。该公开涉及免疫原性组合物用于引发免疫应答，特别是用于预防疟疾。更具体地说，描述了R21融合蛋白。在整个文献中给予小鼠的唯一一个剂量是0.5μg R21。WO2014/111733的第9页第16-21行提到特定组合物可具有包含约1-约1000μg融合蛋白的剂量。没有提及该剂量是针对什么生物体的。可预期单剂量或多剂量，例如WO2014/111733第10页的第一段、WO2014/111733第10页的第三段。佐剂在WO2014/111733中有提及。例如，第7页第28-29行提到组合物可包含佐剂，并且佐剂可以是Abisco或Matrix-M。在WO2014/111733的第8页第10至14行重复本了该公开内容。在该文献中没有公开或指导有多少佐剂有效。该文献中的实施例没有公开所用的佐剂的量。要使用的佐剂如Matrix-M的唯一公开的量是用于小鼠的12μg Matrix-M的经常性单次量，其出现在图13、15和16的图例中。当使用多剂量时，公开了可以使用剂量之间2周至4个月的间隔(第10页，第15行)。例如在WO2014/111733的图10中，证明了公开的Matrix-M和R21的特定组合在小鼠中的保护功效。

本发明试图克服与现有技术相关的问题。

发明概述

本发明的优点是，教导了每次施用的极低剂量，例如每次施用的抗原R21和/或佐剂Matrix-M的剂量。令人惊奇的是，用如此特别低的剂量可以获得如此优异的效力结果。

因此，本发明基于这种令人惊奇地有效的给药方案。

因此，在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含

多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：1(R21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或由其组成，

其用于治疗或免疫接种易受恶性疟原虫感染的人类受试者，优选免疫接种，

其特征在于

所述组合物以每次施用至少一个1μg至20μg R21的剂量的给药方案施用给至少18岁的受试者，或以每次施用至少一个0.5μg至10μg R21的剂量的给药方案施用给小于18岁的受试者。

合适地，所述组合物以每次施用至少一个5μg至20μg R21的剂量的给药方案施用给至少18岁的受试者，或以每次施用至少一个2.5μg至10μg R21的剂量的给药方案施用给小于18岁的受试者。

合适地，所述组合物以每次施用至少一个10μg R21的剂量的给药方案施用给至少18岁的受试者，或以每次施用至少一个5μg R21的剂量的给药方案施用给小于18岁的受试者。

合适地，给药方案包括两个剂量。

合适地，给药方案包括三个剂量。

当给药方案包括两个或更多个剂量时，合适地，最终剂量含有第一剂量的R21量的100％。在一些实施方案中，合适地，最终剂量含有第一剂量的R21量的10％至50％。更合适地，最终剂量含有第一剂量的R21量的20％。

合适地，组合物还包含佐剂。合适地，所述佐剂是Matrix-M。合适地，所述佐剂以R21：Matrix-M为1:1至1:50的比例存在。更合适地，所述佐剂以R21：Matrix-M为1:2至1:25的比例存在。更合适地，所述佐剂以R21：Matrix-M为1:2至1:20的比例存在。更合适地，所述佐剂以R21：Matrix-M为1:10至1:20的比例存在。

最合适地，所述佐剂以R21：Matrix-M为1:5至1:10的比例存在。

合适地，所述剂量用于至少18岁的受试者时包含10至500μg佐剂，或用于小于18岁的受试者时包含5至250μg佐剂，最合适地，其中所述佐剂是Matrix-M。

合适地，所述剂量用于至少18岁的受试者时包含20至200μg佐剂，或用于小于18岁的受试者时包含10至100μg佐剂，最合适地，其中所述佐剂是Matrix-M。

合适地，所述剂量用于至少18岁的受试者时包含100至200μg佐剂，或用于小于18岁的受试者时包含50至100μg佐剂，最合适地，其中所述佐剂是Matrix-M。

最合适地，所述剂量用于至少18岁的受试者时包含25至50μg佐剂，或用于小于18岁的受试者时包含5至50μg佐剂，最合适地，其中所述佐剂是Matrix-M。

合适地，所述剂量对于至少18岁的受试者包含约10μg R21和约50μg佐剂，或者对于小于18岁的受试者包含约5μg R21和约25μg佐剂，最合适地，其中所述佐剂是Matrix-M。

合适地，所述剂量对于小于18岁的受试者包含约5μg至10μg R21，最合适地约5μgR21，和约50μg佐剂，最合适地，其中所述佐剂是Matrix-M。

合适地，所述剂量对于至少18岁的受试者包含约2μg R21和约50μg佐剂，最合适地，其中所述佐剂是Matrix-M。我们已经产生了临床数据(在成人中)，表明该剂量效果良好。

当给药方案包括两个或更多个剂量时，合适地，所述剂量以1周至12周、更合适地3周至12周的间隔施用至所述受试者。在一个实施方案中，合适地，所述剂量以1至2周的间隔施用给所述受试者。最合适地，所述剂量以4周的间隔施用给所述受试者。

一方面，本发明涉及如上所述的组合物，其进一步包含多肽，所述多肽包含SEQ IDNO：3(Rv21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：3具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或由其组成。

一方面，本发明涉及如上所述的组合物，其进一步包含病毒载体，所述病毒载体包含编码至少一个来自疟疾抗原的表位的核酸，所述表位优选来自恶性疟原虫或间日疟原虫(P.vivax)抗原。

在一个方面，本发明涉及如上所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

在一个方面，本发明涉及如上所述的组合物，其中所述组合物是疫苗组合物。

在一个方面，本发明涉及一种如上所述的组合物，其中所述组合物能够在人体中诱导针对恶性疟原虫的保护性免疫应答。

在一个方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含至少第一组合物和最终组合物，

所述第一组合物包含用于至少18岁的受试者的每次施用的1μg至20μg R21，或用于小于18岁的受试者的每次施用的0.5μg至10μg R21，所述组合物还包含佐剂，其中所述佐剂是Matrix-M，其中所述佐剂以R21：Matrix-M为1:1至1:50的比例存在；

所述最终组合物包含每次施用的第一组合物的R21量的10％至100％、优选10％至50％、最优选20％，所述最终组合物还包含佐剂，其中所述佐剂是Matrix-M，其中所述佐剂以R21：Matrix-M为1:1至1:50的比例存在；以及

用于向人类受试者施用的说明书。

为了避免疑义，包含至少第一组合物和最终组合物的试剂盒必须含有至少两种组合物(一种是第一组合物，一种是最终组合物)。

合适地，所述试剂盒进一步包括第二组合物，

所述第二组合物与所述第一组合物相同。

为了避免疑义，在此上下文中，还包含第二组合物的试剂盒必须含有至少三种组合物(一种第一组合物、一种第二组合物和一种最后组合物)。换句话说，合适地，所述试剂盒包含三种组合物，即如上所述的第一组合物和最终组合物，以及第二组合物，

所述第二组合物与所述第一组合物相同。

在一个方面，本发明涉及一种组合物在制备用于治疗/免疫接种易受恶性疟原虫感染的人类受试者的药物中的用途，所述组合物包含多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：1(R21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或由其组成，

其特征在于

所述组合物包含用于至少18岁的受试者的每次施用的至少一个1μg至20μg R21的剂量，或用于小于18岁的受试者的每次施用的至少一个0.5μg至10μg R21的剂量。

合适地，所述组合物还包含佐剂，其中所述佐剂是Matrix-M，并且其中所述佐剂以R21：Matrix-M为1:1至1:50的比例存在。

在一个方面，本发明涉及一种免疫接种易受恶性疟原虫感染的人类受试者的方法，包括向所述受试者施用包含多肽的组合物，所述多肽包含SEQID NO：1(R21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或由其组成，其中所述组合物以每次施用至少一个1μg至20μg R21的剂量的给药方案施用给至少18岁的受试者，或以每次施用至少一个0.5μg至10μg R21的剂量的给药方案施用给小于18岁的受试者。合适地，所述组合物还包含佐剂，其中所述佐剂是Matrix-M，并且其中所述佐剂以R21：Matrix-M为1:1至1:50的比例存在。

在一个方面，本发明涉及一种方法，其包括向所述受试者施用包含多肽的组合物，所述多肽包含SEQ ID NO：1(R21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或由其组成，其中所述组合物以每次施用至少一个1μg至20μg R21的剂量的给药方案施用给至少18岁的受试者，或以每次施用至少一个0.5μg至10μg R21的剂量的给药方案施用给小于18岁的受试者。合适地，所述组合物还包含佐剂，其中所述佐剂是Matrix-M，并且其中所述佐剂以R21：Matrix-M为1:1至1:50的比例存在。合适地，所述方法是免疫受试者的方法，例如易受恶性疟原虫感染的人类受试者；合适地，所述方法是治疗易受恶性疟原虫感染的受试者如人类受试者的方法；合适地，所述方法是免疫受试者例如人类受试者以抵抗疟疾/恶性疟原虫感染的方法；合适地，所述方法是治疗受试者例如人类受试者抵抗疟疾/恶性疟原虫感染的方法。

在一个方面，本发明涉及如上所述的组合物、试剂盒、用途或方法，其中所述给药方案包括向所述人类受试者施用所述多肽，针对至少18岁的受试者的量为0.0000125至0.0003333mg/Kg，或针对小于18岁的受试者的量为0.00000625至0.0001667mg/Kg，所述多肽包含SEQ ID NO：1(R21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或由其组成。

合适地，所述施用是肌内、皮下或皮内给药。最合适地，所述施用是肌内给药。

合适地，所述施用是通过注射。

在一个广泛的方面，本发明提供了一种组合物，其包含

其特征在于

所述组合物以每次施用至少一个1μg至20μg R21的剂量施用给至少18岁的受试者而提供，或以每次施用至少一个0.5μg至10μg R21的剂量施用给小于18岁的受试者而提供。

合适地，组合物还包含佐剂。合适地，所述佐剂是Matrix-M。合适地，所述佐剂以R21：Matrix-M为1:1至1:50的比例存在。更合适地，所述佐剂以R21：Matrix-M为1:2至1:20的比例存在。更合适地，所述佐剂以R21：Matrix-M为1:5至1:10的比例存在。

合适地，所述组合物以每剂量针对至少18岁的受试者为0.0000125至0.0003333mg/Kg的量提供，或以针对小于18岁的受试者为0.00000625至0.0001667mg/Kg的量提供。

在优选的实施方案中，多次给药方案中的剂量含有相同量的抗原，例如R21。当剂量含有相同量的R21时，这有时被称为"非部分给药方案"。最合适地，本发明包括试剂盒、组合物或方法，其施用具有(或更合适地由以下组成)用于成人(至少18岁的受试者)的10、10、10mcg的三剂或用于儿童/婴儿(小于18岁的受试者)的5、5、5mcg的三剂。

发明详述

本发明人提供了在人体中具有高效力水平的在Matrix-M^TM佐剂中的下一代恶性疟原虫抗子孢子疫苗：R21。

应当注意，Matrix-M佐剂中没有TLR4配体(MPA)。相反，现有技术的佐剂如ASO1确实包含TLR4配体。

在一个实施方案中，给予3个剂量，一个剂量在0周给予，一个剂量在4周给予，并且一个剂量在8周给予。这种给药方案的优点是，婴儿通常在这些时间点被送至临床进行免疫，特别是在非洲乡村，并且因此通过设计与可能获得的免疫对象相容的给药方案，可以提高正确免疫接种的可能性。

在一个实施方案中，合适地，给药方案包括三个剂量，一个剂量在0周给予，并且一个剂量在4周给予，并且一个剂量在8周给予。

在一个实施方案中，合适地，给药方案包括两个剂量，一个剂量在0周给予，并且一个剂量在4周给予。该给药方案具有将给药次数减至最少两次的优点。

在一个实施方案中，合适地，给药方案包括两个剂量，一个剂量在0周给予，并且一个剂量在1周给予。这种给药方案的优点是理想地适合旅行者，特别是那些临时通知前往疟疾区域的旅行者。

耐久性(例如保护性响应随时间的持续性)是本领域中的一个问题。例如，诸如盖茨基金会的组织正投资以试图找到新的佐剂来提高耐久性。本发明在耐久性方面提供了技术益处。例如，本发明的组合物在颗粒表面提供了更高浓度的抗原。这是通过使用本发明组合物中的R21多肽/颗粒实现的。

本发明人已经惊奇地发现，在成年人中使用10μg的较低剂量R21比使用50μg的较高剂量在免疫后3-6个月诱导的免疫应答更持久(参见图6)。这种更好的持久性与Tfh2亚型的T滤泡辅助细胞的更好诱导以及与增加的转换的记忆B细胞相关，表明较低剂量如何提供导致更高持久性的不同质量的免疫应答的潜在机制(参见图7)。这种通过使用较低剂量而不是标准高剂量的R21的关键保护性抗CSP抗体应答对中央NANP重复序列的更高持久性的证据补充了我们的主要发现，即Matrix-M中的低剂量R21可以提供高水平的效力。总之，效力数据加上耐久性数据构成了使用较低剂量R21例如10μg(在此适合与50μg Matrix-M一起使用)的令人信服的理由。

本发明可以提供诱导抗体的增强的亲合力。

应当注意，在疟疾领域，高抗体滴度是有益的。例如，可以认为超过100μg/ml的滴度对疟疾是有益的(与诸如Men B.的疾病对比，在Men B.中，仅2-3μg/ml的滴度被认为是有效的)。

本发明的一个优点是本文教导的给药方案减少或消除了HEP.B应答。在这方面，如从本文提供的数据可以看出的，本发明几乎没有诱导HEP.B应答。这是有利的。此外，进一步的益处是，HEP.B应答的降低意味着所述相关应答占总免疫应答的较高比例。这是本发明提供的进一步的益处。

在一个实施方案中，对于成人施用，可以使用1:5的抗原(例如R21)与佐剂(例如Matrix-M)比例；合适的剂量包含10μg R21和50μg Matrix-M。

在一个实施方案中，对于小于18岁的个体施用，可以使用1:10的抗原(如R21)与佐剂(如Matrix-M)比例；适合地，用于向小于18年的受试者施用的剂量包含5μg R21和50μgMatrix-M。

在一个实施方案中，使用包含2μg抗原(例如R21)和50μg佐剂(例如Matrix-M)的组合物(合适地，抗原：佐剂的比例为1:25)。本发明人发现，该剂量和比例在I期研究中既安全又具有高度免疫原性(参见图4和8)。

本领域的观点是佐剂引起反应原性。因此，本领域的教导是使用大量的佐剂以降低反应原性。与之相反，本发明中教导的低量佐剂仍然有利地产生优异的免疫应答和效力。

不希望受理论的束缚，认为与现有技术制剂如RTS,S相比，本发明中使用的组合物每μg递送更多的抗原(例如每μg的免疫原性表位)。例如，现有技术方案教导使用50μg RTS,S；有时使用三剂RTS,S，每剂包含50μg RTS,S。与之相反，本发明有利地教导了较低抗原量，例如10μg。然而，即使计算组合物中每μg蛋白质/颗粒的"等价"抗原递送，50μg RTS.S的剂量可能具有大约15μg R21的"等价"抗原递送值-有利地，发明人教导使用甚至更少量的R21，例如每剂量10μg R21。在一些实施方案中，本发明每剂量适宜地仅包含2μg R21。

在一个实施方案中，给药方案包括2个剂量，每个剂量包括2μg R21。

在一个实施方案中，给药方案包括3个剂量，每个剂量包含2μg R21。

抗原的量

教导了抗原的量，所述抗原例如为多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：1(R21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或由其组成；例如，教导了对于至少18岁的受试者每次施用至少一个1μg至20μg R21的剂量，或对于小于18岁的受试者每次施用至少一个0.5μg至10μg R21的剂量。

关于欧洲专利局的案例法，(例如T198/84和T279/89)：

(a)与已知范围相比，所选择的子范围窄；

WO2014/111733包含在第9页第16至21行的公开内容，其提及特定组合物可具有包含约1至约1000μg融合蛋白的剂量。没有提及这些剂量是针对什么生物体。WO2014/111733中仅有的实例是小鼠。此外，WO2014/111733中没有给出年龄限制-仅有的实例是小鼠(其仅能是数周龄)。

在任何情况下，本文教导的剂量比WO2014/111733的都窄-对于至少18岁的受试者每次施用1μg至20μg R21，或对于小于18岁的受试者每次施用至少一个0.5μg至10μg R21的剂量，与之比较，在WO2014/111733中公开的是"约1至约1000μg"。

更重要的是，对于人类，以mg/Kg教导的剂量根本没有重叠-剂量相隔2-3个数量级(见下文)。

(b)所选择的子范围与现有技术中公开的任何具体示例以及与已知范围的端点足够远；

合适地，认为小鼠例如成年小鼠重20g。因此，现有技术所述的剂量/组合物中的组分量可以用相同的"mg/Kg"表示以进行比较。例如，用于小鼠例如成年小鼠给药的包含0.5μg R21的剂量等于(0.0005mg/(20/1000Kg)＝)0.025mg/Kg的剂量(如WO2014/111733中)。

合适地，认为成年人体重为60-80Kg。因此，如果需要，所述剂量/组合物中的组分量可以转化为"mg/Kg"或其它单位。例如，用于成人给药的包含10μg R21的剂量等同于(0.01mg/60Kg至0.01mg/80Kg＝)0.000167至0.000125mg/Kg的剂量。

因此，本发明的范围与现有技术的范围相隔2-3个数量级。

(c)所选范围不是现有技术的任意样本，即，不是现有技术的纯粹实施例，而是另一发明(有目的的选择，新的技术教导)；

如本文所解释的，本文教导的令人难以置信且出乎意料的低剂量是惊人有效的，并且带来如本文所解释的和如所包括的数据所证明的其它技术益处。

小鼠通常重约20克；人通常体重为约60至80kg。因此，人比小鼠大3000至4000倍。将Collins等人2017(Scientific Reports，第7卷，第46621篇)公开的小鼠对人的0.5μgR21/小鼠的剂量按比例扩大至人，将产生在300,000μl(300ml)体积中具有大约1500至2000μg R21和36,000至48,000μg Matrix-M的剂量。与之形成鲜明对比的是，本发明教导了成人每次施用仅使用1至20μg R21(或婴儿或儿童每次施用使用0.5至10μg R21)。因此，本发明人令人惊奇地教导了比从考虑现有技术如Collins等人可以预期的剂量低2-3个数量级的有效剂量。

因此，显然，本发明公开了一种新、小、窄且特定的R21有效量的范围，可用于针对疟疾免疫的组合物中。该范围极小。技术效果特别地与这个新公开的范围相关。该范围仅占WO2014/111733中公开的范围的约2％(1至20μg，相比于1至1000μg)。本文公开的量是针对人类教导的，而本领域集中于小鼠研究。此外，还公开了Matrix-M的特定量，其也不同于现有技术中公开的那些，并且与现有技术相比也有助于技术效果。这些令人惊讶的益处在本文中更详细地讨论。此外，尽管WO2014/111733公开了可能被认为与本发明的范围重叠的大范围，但是在该文献中实际上仅证明了单个值(0.5μg R21)。无论该文献是否提供了针对1-1000μg范围的全部宽度的R21量的可行性公开内容，该范围对本领域技术人员来说都是不显而易见的。

R21抗原

抗原合适地是多肽。

图1A示出RTS,S。在啤酒酵母(S.cerevisiae)中生产；对CSP重复序列和HBsAg两者的高度免疫原性；完成III期试验；现场试验的效力＜50％。

图1B显示R21。在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中生产；对CSP重复序列的非常高的免疫原性；HBsAg的非免疫原性；在小鼠中转基因寄生虫攻毒的100％效力；I/II期试验(Matrix-M，AS01)。

多肽合适地为R21。除非本文另有说明，制备和制造R21的技术细节如WO2014/111733中所述。制备和生产的方法可以由本领域技术人员对毕赤酵母生产病毒样颗粒疫苗进行修改。

R21多肽被适当地组装成病毒样颗粒(VLP)。R21多肽自组装-不需要额外的辅助蛋白。因此，有时多肽可以被称为病毒样颗粒(VLP)或"颗粒"。

更详细地，抗原可以是包含融合蛋白的颗粒，所述融合蛋白包含至少一个NANP重复序列、来自恶性疟原虫的CS蛋白的C-末端的一些或全部和乙型肝炎表面抗原。优选地，乙型肝炎表面抗原是S抗原。NANP重复序列是天然存在于恶性疟原虫CS蛋白中的四种氨基酸天冬酰胺、丙氨酸、天冬酰胺、脯氨酸的重复序列。可以有NANP的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或更多个重复序列。优选地，存在至少3个重复序列，更优选地，存在至少10个重复序列。在一个实施方案中，融合蛋白可以包含NANP的18个重复序列。

"CS蛋白的C末端的一些或全部"具有其天然含义；合适地，融合蛋白包含来自恶性疟原虫的CS蛋白的C-末端的至少部分。

CS蛋白的C末端通常被称为含有C末端的T细胞表位。本发明的融合蛋白中包含的CS蛋白的C末端可包含序列(SEQ ID NO：7)：

NKNNQGNGQGHNMPNDPNRNVDENANANSAVKNNNNEEPSDKHIKEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTCGNGIQVRIKPGSANKPKDELDYANDIEKKICKMEKCSSVFNVVNSSIGI

其中一些C-末端氨基酸缺失。优选缺失至多15个氨基酸，更优选缺失至多10个氨基酸、9个氨基酸、8个氨基酸、7个氨基酸、6个氨基酸、5个氨基酸、4个氨基酸、3个氨基酸。

融合蛋白中CS蛋白的C-末端可具有序列(SEQ ID NO：8)：

NKN QGNGQGHNMPNDPNRNVDENANANSAVKN NEEPSDKHIKEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTCGNGIQVRIKPGSANKPKDELDYANDIEKKICKMEKCSSV。

抗原颗粒有时被称为病毒样颗粒。这种颗粒被认为比单体蛋白更具免疫原性。合适地，所述颗粒可以不包含或基本上不包含其它蛋白质物质。合适地，所述颗粒可以不包含或基本上不包含游离乙型肝炎表面抗原蛋白：即没有或基本上没有不是融合蛋白的一部分的乙型肝炎表面抗原蛋白。本发明的颗粒可以不包含或基本上不包含游离CS蛋白：即没有或基本上没有不是融合蛋白的一部分的CS蛋白。

本文提及的"基本上没有"适当地要求颗粒包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或约1％的所提及的特定物质。优选地，所述颗粒含有低于5％，更优选低于1％的游离乙肝表面抗原蛋白。

比率；与RTS的差异

R21和RTS,S都是VLP。这些VLP是由多肽自组装的。

R21和RTS中使用的融合蛋白的序列非常相似。在CS蛋白的N-末端区域处或重复序列中或HBsAg序列中没有变化。与RTS相比，R21中CSP的C-末端的端点处具有截短。

R21和RTS,S之间的主要差别在于RTS,S具有1:5范围内的CSP：HBsAg比率(即RTS融合蛋白的每个分子为1:1，但RTS融合蛋白的每个分子伴随大约4个未融合的HBsAg分子，从而在RTS,S中总体上形成CSP：HBsAg为1:5)。重要的是注意到，R21的VLP中的每个多肽分子都具有CSP序列，而相比之下，RTS,S的VLP中的五个分子中仅有一个具有CSP序列。换句话说，R21中CSP序列与HBsAg序列的比例是1:1，而RTS,S中CSP序列与HBsAg序列的比例是1:5。这导致CSP序列在R21上的暴露水平比RTS,S高得多。

关于序列差异，下面是R21和RTS的序列的比较。

Seq ID No：1-R21(410aa的)

MDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNKNNQGNGQGHNMPNDPNRNVDENANANSAVKNNNNEEPSDKHIKEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTCGNGIQ VRIKPGSANKPKDELDYANDIEKKICKMEKCSSVPVTNMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI

Seq ID No：5-RTSS(多11个C末端氨基酸和N末端的3个额外的氨基酸)(424aa的)

MMAPDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNKNNQGNGQGHNMPNDPNRNVDENANANSAVKNNNNEEPSDKHIKEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTC GNGIQVRIKPGSANKPKDELDYANDIEKKICKMEKCSSVFNVVNSSIGLGPVTNMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTlPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI

R21的410aa与RTSS的424aa相比＝96.7％同一

在上述序列中下划线表示环子孢子蛋白的C端区域

R21＝105个氨基酸

RTS,S＝116个氨基酸

因此，跨CSP序列具有90.5％的同一性。

R21与RTSS的总序列同一性＝96.7％同一。

仅考虑CSP序列(环子孢子的C端区域)(环子孢子蛋白C端区域)，R21与RTSS的序列同一性＝90.5％同一。

合适地，本发明的组合物、试剂盒、用途或方法包含与SEQ ID NO：1具有至少97％序列同一性的多肽。

合适地，本发明的组合物、试剂盒、用途或方法包括具有CSP序列的多肽，所述CSP序列与SEQ ID NO：1的CSP序列具有至少91％的序列同一性。

在任何情况下，R21相对于RTS,S的关键优势源于R21 VLP有利地避免了(即不存在)在RTS,S VLP中发现的乙型肝炎表面抗原("S")的四倍过量的事实。换句话说，合适地，R21中CSP：HsBAg的比例为1:1，从而R21疫苗通过对乙型肝炎产生真正强的免疫应答而不"浪费"其免疫原性，这与疟疾预防无关。因此，R21相对于RTS,S的优点是免疫应答更完全地集中在疟疾表位上，而不是被RTS,S中发现的过量HsBAg表位"稀释"。

合适地，本发明的组合物包含多肽，所述多肽以VLP存在，并且所述VLP包含CSP序列和HsBAg序列，其中VLP中的CSP：HsBAg为1:1。

在优选的实施方案中，合适地，多肽以病毒样颗粒(VLP)的形式存在，并且VLP作为融合蛋白包含环子孢子蛋白(CSP)序列的中央重复序列的部分和C-末端以及乙肝表面抗原(HBsAg)序列，但在VLP中没有任何未融合的乙肝表面蛋白分子。在VLP中不存在未融合HBsAg具有进一步的优点，这是与RTS,S的惊人差异。短语"的部分"是指R21不具有完整的中心重复序列或C-末端序列的事实。R21具有的NANP中心重复序列是普通疟疾株中的约一半数量，即19而不是40个，并且R21在其末端具有截短了20个氨基酸的C-末端区。

合适地，本发明的组合物包含多肽，其中所述多肽以病毒样颗粒(VLP)的形式存在，且其中VLP包含比例为1:1的环子孢子蛋白(CSP)序列和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)序列。

合适地，本发明的组合物包含多肽，其中所述多肽以病毒样颗粒(VLP)的形式存在，且其中VLP包含比例为1:1的环子孢子蛋白(CSP)序列的C-末端和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)序列。

合适地，本发明的组合物包含多肽，其中所述多肽以病毒样颗粒(VLP)的形式存在，且其中VLP包含比例为1:1的环子孢子蛋白(CSP)序列的中心重复序列和C-末端以及乙型肝炎表面抗原(HBsAg)序列。

因此，在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含

多肽，

其中所述多肽包含SEQ ID NO：1(R21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或由其组成，

其中所述多肽是病毒样颗粒(VLP)的形式，并且其中所述VLP包含比例为1:1的环子孢子蛋白(CSP)序列和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)序列，

其用于免疫对恶性疟原虫感染敏感的人类受试者，

其特征在于

所述组合物以每次施用至少一个1μg至20μg R21的剂量的给药方案给至少18岁的受试者，或以每次施用至少一个0.5μg至10μg R21的剂量的给药方案给小于18岁的受试者。

因此，在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含

其中所述多肽是病毒样颗粒(VLP)的形式，其中所述颗粒包含少于10％的游离乙型肝炎表面抗原蛋白，

其用于免疫对恶性疟原虫感染敏感的人类受试者，

其特征在于

因此，本发明的一个方面提供了一种免疫易受恶性疟原虫感染的人类受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用一种组合物，该组合物包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO：1(R21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或由其组成，其中所述多肽是病毒样颗粒(VLP)的形式，其中所述颗粒包含少于10％的游离乙型肝炎表面抗原蛋白，

其中所述组合物以每次施用至少一个1μg至20μg R21的剂量的给药方案施用给至少18岁的受试者，或以每次施用至少一个0.5μg至10μg R21的剂量的给药方案施用给小于18岁的受试者。

因此，在一个方面，本发明提供了根据前述权利要求中任一项的组合物、试剂盒、用途或方法，其中所述给药方案包括向所述人类受试者施用所述多肽，所述多肽包含SEQID NO：1(R21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或由其组成，其中所述多肽为病毒样颗粒(VLP)的形式，其中所述颗粒包含少于10％的游离乙型肝炎表面抗原蛋白，

对于至少18岁的受试者，其用量为0.0000125-0.0003333mg/Kg，对于小于18岁的受试者，其用量为0.00000625-0.001667mg/Kg。

因此，在一个方面，本发明提供了对易患恶性疟原虫感染的人类受试者进行免疫的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含多肽的组合物，所述多肽包含SEQ ID NO：1(R21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或由其组成，其中所述多肽是病毒样颗粒(VLP)的形式，并且其中所述VLP包含比例为1:1的环子孢子蛋白(CSP)序列和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)序列，

因此，在一个方面，本发明提供了根据前述权利要求中任一项的组合物、试剂盒、用途或方法，其中所述给药方案包括向所述人类受试者施用所述多肽，所述多肽包含SEQID NO：1(R21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或由其组成，其中所述多肽为病毒样颗粒(VLP)的形式，并且其中所述VLP包含比例为1:1的环子孢子蛋白(CSP)序列和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)序列，

优选地，所述颗粒的蛋白质物质的至少约40质量％或更多源自恶性疟原虫。在颗粒中具有如此高水平的恶性疟原虫物质的能力允许对疟疾更有利的抗体应答，更具体是对恶性疟原虫的显著抗体应答和对乙型肝炎表面抗原的较小抗体应答。

颗粒中乙型肝炎表面抗原相对量的减少也具有颗粒在婴儿早期具有改善的效力的优点。如果存在太多的乙肝表面抗原，那么担心存在于幼小婴儿中的母体抗体可能使颗粒作为免疫原的有效性降低。

优选地，在本发明的融合蛋白中，乙型肝炎表面抗原在任何恶性疟原虫物质的C-末端。

所述颗粒可包含融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：1(R21)的序列或与SEQID NO：1的序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高序列同一性的序列，或由其组成。

序列同一性百分比定义为，在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大序列同一性百分比之后，序列中与所提供序列中氨基酸相同的氨基酸的百分比。用于确定序列同一性百分比的比对可以以本领域技术人员熟知的许多方式实现，包括例如使用BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment SearchTool，BLAST)。

同一性百分比的变化可能是由于例如氨基酸取代、插入或缺失。氨基酸取代在性质上可以是保守的，因为取代的氨基酸具有相似的结构和/或化学性质，例如用异亮氨酸取代亮氨酸是保守取代。

优选地，多肽包括具有对所得融合蛋白的免疫原性没有任何显著影响的保守取代的序列。例如，可根据下表进行保守性取代。第二列中相同区段且适当地第三列中相同行内的氨基酸可以彼此取代：

也可引入取代以更好地匹配其它恶性疟原虫株的CS序列。在此报道的R21实施例中使用的序列是3D7菌株。

优选地，颗粒包含融合蛋白的许多单体。颗粒可以包含至少10个融合蛋白单体，优选20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、60个或更多个、70个或更多个、80个或更多个、90个或更多个、100个或更多个融合蛋白单体。在一个实施方案中，颗粒包含约96个融合蛋白单体。

优选地，颗粒是免疫原性的。适当地，颗粒能够引发针对引起疟疾的寄生虫恶性疟原虫的免疫应答。免疫应答可以是治疗性的和/或预防性的。免疫应答可以足以减少或预防由恶性疟原虫引起的感染或疾病。当施用于受试者，优选人类受试者时，所述颗粒可引发/产生保护性免疫应答。

优选地，由本发明的组合物引发的免疫应答影响恶性疟原虫感染免疫的人的能力。优选地，阻止或防止了恶性疟原虫感染用本发明的组合物免疫的人的能力。这可以以多种方式实现。引发的免疫应答可以识别和破坏恶性疟原虫。或者，或另外，引发的免疫应答可以阻止或防止恶性疟原虫的复制。或者，或另外，引发的免疫应答可以阻止或预防受试者如人中由恶性疟原虫引起的疾病。优选地，引发的免疫应答是抗体应答。

合适地，受试者是人。

组合物可以液体制剂提供。或者，组合物可以冻干形式提供。或者，组合物可以以在膜上干燥的糖基制剂提供，如Alcock等人(Sci Transl Med.2010Feb 17；2(19)：19ral2)所述。

可以生产颗粒形式的多肽如R21，在酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母或另一种甲基营养酵母如多形汉逊酵母中表达融合蛋白，并回收融合蛋白，优选以颗粒形式。

如果融合蛋白在巴斯德毕赤酵母或另一种甲基营养型酵母中表达，则蛋白的表达可以由AOXl启动子或GAP启动子或另一种强启动子驱动(Vogl&Glieder，NewBiotechnology.2012 Nov 16.pii：S1871-6784(12)00867-9)。

如果融合蛋白在酿酒酵母中表达，则该蛋白的表达可由TDH3启动子或另一强启动子驱动。

优选地，融合蛋白以足够高的水平表达，使得在酵母裂解时，融合蛋白自发地多聚化以形成颗粒，有时称为病毒样颗粒(VLP)。

编码融合蛋白的核酸，如DNA，可以由酵母瞬时或组成型表达。编码融合蛋白的核酸可以整合到宿主基因组中，或者可以携带在细胞外组分如质粒上。酵母可以含有1、2、3、4、5或更多个拷贝的编码融合蛋白的核酸。

编码融合蛋白的核酸可以是密码子优化的，用于在酵母中表达。

本领域技术人员能够容易地制备合适的宿主以表达编码融合蛋白的核酸。

优选地，本发明方法中使用的酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母或另一种甲基营养酵母不表达任何或任何显著的不是融合蛋白的一部分的乙型肝炎表面抗原蛋白。

优选地，本发明方法中使用的酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母或另一种甲基营养酵母不表达任何或任何显著的来自恶性疟原虫的不是融合蛋白的一部分的CS蛋白。

在高产酵母菌株，例如巴斯德毕赤氏酵母中表达本发明颗粒的能力，可以简化和增强多肽的生物制造，使得生产成本降低。这种成本上的节省对于主要针对需要低成本疫苗的低收入国家的人群，尤其是儿童和婴儿的疟疾疫苗特别重要。

可以合成编码多肽的核酸序列。可以构建含有核酸序列的载体，其中核酸序列可以与转录控制元件有效地连接。

所述组合物可以是药物组合物。

所述组合物可以是疫苗组合物。

该组合物适合用于预防疟疾。

组合物可以包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

合适的可接受的赋形剂和载体是本领域技术人员公知的。这些载体可以包括固体或液体载体。合适的液体载体包括水和盐水。组合物的多肽可以配制成乳液，或者可以配制成生物可降解的微球或脂质体。

组合物还可以包含聚合物或其它试剂以控制组合物的稠度，和/或控制抗原/多肽从组合物的释放。

稀释剂可以包括水、盐水、甘油或其它合适的醇等。

组合物可以包含其它成分，例如润湿剂或乳化剂；缓冲剂；增稠剂，例如纤维素或纤维素衍生物；防腐剂；去污剂、抗微生物剂；等等。

优选地，组合物中的活性成分的纯度大于50％，通常大于80％，经常大于90％，更优选大于95％、98％或99％。其中活性成分的纯度接近100％，例如约99.5％纯度或约99.9％纯度是最合适的。

本发明的组合物还可以包括一种或多种其它抗原的混合物。所述一种或多种其它抗原可以源自恶性疟原虫或其他疟原虫种类，例如间日疟原虫或三日疟原虫(Plasmodiummalariae)。

药物组合物或疫苗组合物可以液体形式或冻干形式提供。

优选地，药物组合物或疫苗组合物能够产生针对恶性疟原虫的保护性免疫应答。

本文所用的短语"产生保护性免疫应答"是指组合物能够在其所施用的宿主生物体如人哺乳动物中产生保护性应答。优选地，保护性免疫应答保护免受由恶性疟原虫引起的后续感染或疾病。保护性免疫应答可通过减少恶性疟原虫的复制或通过影响恶性疟原虫的作用模式来消除或减少感染水平，从而减少疾病。

优选地，如果组合物用作疫苗，则组合物包含免疫有效量的本发明的多肽。抗原的"免疫有效量"是当根据本文教导的方案施用于个体时，有效治疗或预防恶性疟原虫感染的量。该量将根据待治疗个体的健康和身体状况以及抗原而变化。精确的量作为本文讨论的方案的一部分公开。

组合物可以用于口服、全身、肠胃外、局部、粘膜、肌内、静脉内、腹膜内、皮内、皮下、鼻内、阴道内、直肠内、经皮、舌下、吸入或气雾剂施用。

更合适地，组合物用于肌内、皮下或皮内施用。

最合适地，所述组合物用于肌内施用。

最合适地，组合物用于注射。

因此，合适地，施用是肌内、皮下或皮内。

最合适地，施用是肌内。

最合适地，施用是通过注射。

本发明的组合物在施用于受试者后能够诱导介导恶性疟原虫的破坏或失活的血清抗体应答。本发明的组合物还可以，或可选地能够引发中和恶性疟原虫的免疫应答，从而防止它们具有正常功能，并防止或减少疾病进展，而不必破坏恶性疟原虫。

本发明的组合物可以单独使用，或者可以与一种或多种其它免疫原性或疫苗组合物和/或与一种或多种其它治疗方案组合使用。

合适地，如WO2014/111733中那样使用R21融合蛋白。最优选的实例在SEQ ID NO：1中给出，对于本文的一些支持数据，使用该R21，但具有小的4个氨基酸的C-末端延伸，称为"C-标签"，其允许蛋白质颗粒更容易的免疫层析纯化。因此，R21可以任选地在C-末端具有C-标签(EPEA)序列。这有时称为"R21c"-参见SEQ ID NO：2。R21C具有4个氨基酸的C-末端延伸：EPEA(谷氨酸-脯氨酸-谷氨酸-丙氨酸)。合适地，对于人使用，使用R21的非C-标签形式(SEQ ID NO：1)或如下所述与其具有高序列同一性的多肽。

佐剂

组合物可进一步包含佐剂。佐剂可以含有皂苷。佐剂可以是Abisco或Matrix M。

佐剂可以是基于角鲨烯的佐剂和/或基于ISCOM的佐剂，例如Abisco/Matrix M(来自Isconova，Uppsala-现为'Novavax AB')。

Abisco-100(当制成GMP标准时被称为Matrix-M)具有以下化学内容物：从植物皂树(Quillaja saponaria Molina)的粗提取物中得到的纯化的皂苷；来自羊毛脂的胆固醇和来自新鲜蛋黄的磷脂酰胆碱(磷脂)；在PBS中的由上述成分组成的纳米尺寸(40nm)的笼形颗粒的悬浮液中。

Matrix-M(或Abisco-100)由Matrix A和Matrix C以80:20至95:5，优选85：15的比例组成。Matrix A导致T细胞诱导并且具有低毒性，Matrix C诱导抗体并具有一定毒性。Matrix C含有QS分离的C级分，其对应于QS21。级分A(在Matrix A中)对应于QS7。

Abisco-100和Matrix-M分别是来自Novavax AB的相同佐剂的临床前和临床形式。Abisco-100当制成GMP标准品时被称为Matrix-M。合适地，本发明的佐剂是Abisco-100或Matrix-M。

最合适地，本发明的佐剂是Matrix-M，其具有临床上可接受用于人类的优点。

最合适地，Matrix-M来自Novavax AB，Kungsgatan，109，SE-753 18 Uppsala，瑞典。

成分的比例

合适地，抗原(如R21)和佐剂(如Matrix-M)以本文公开的比例施用或存在于组合物中。

除非从上下文中另有说明，本文提及的剂量是用于人。

除非从上下文中另有说明，本文提及的组合物的组分的量以"每剂量"给出。当然，可能需要制备更大批所述组合物，并在之后例如在施用之前或在分配/运输之前将其分成或等分成剂量。

剂量(DOSES)

剂量是用于单次施用于人类受试者的组合物的量。

因此，可以理解，本发明的组合物可以以包含多剂量的量提供。这对于例如最小化包装和分配的成本是有用的-包含多个剂量的单个药瓶可以以比每个药瓶一个剂量更低的成本运输/冷藏。剂量可以简单地在给药时取出。单个药瓶可以含有用于待施用的剂量数目的组合物的量。组合物的量可以是"过量包装"的，以提供误差的余地，例如，如果由于表面张力或在给药过程中引入气泡或气塞的风险，组合物的量不能从小药瓶中取出。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种小药瓶，其含有至少两个剂量(两剂)本发明的组合物，更合适地至少三个剂量(三剂)本发明的组合物，更合适地至少两剂加10％的本发明的组合物，更合适地至少三剂加10％的本发明的组合物。

在一些实施方案中，提供或施用的剂量可具有不同的抗原量，例如不同的R21量。在这方面，"最终"组合物应具有其正常含义，即在单次免疫方案(免疫过程)中向受试者施用的最后组合物。

例如，对于第一剂量，R21的量如上所述，例如对于至少18岁的患者每次施用1μg至20μg R21，或对于小于18岁的患者每次施用0.5μg至10μg R21。对于最终剂量(即，两剂方案中的第二剂量和三剂方案中的第三剂量)，R21量可以减少2-10倍，最合适地减少5倍。换句话说，对于最终剂量(即，两剂方案中的第二剂量或三剂方案中的第三剂量)，R21的量可以是第一剂量中的10-50％的量，最合适地是第一剂量中20％的量。

在其它实施方案中，最终剂量具有第一剂量100％量的R21量。

在其它实施方案中，各剂量具有相同的R21量。

显然，尽管第一剂量中的量方便地以范围表示，但实际给药量将具有绝对值，这取决于例如操作者的选择，或取决于受试者的体重，或取决于受试者的年龄等。因此，最终剂量中的量也将具有以第一剂量中施用的实际量为基准的绝对值。合适地，记录第一个剂量中施用的实际量。合适地，通过参考所记录的第一剂量中施用的实际量来计算最终剂量中的量。例如，如果用于至少18岁的患者的第一剂量包含10μg R21，在一个实施方案中，合适地，最终剂量包含1至5μg R21，最适宜地为2μg R21。

在一个实施方案中，给药方案可包含2个剂量-第一剂量为10μg R21，且最终剂量为1至5μg R21，最合适地为2μg R21。

在一个实施方式中，给药方案可包含3个剂量-第一个剂量为10μg R21，第二剂量与第一个剂量相同(即，第二剂量为10μg R21)，最终剂量为1至5μg R21，最合适为2μg R21。

合适地，根据本发明的试剂盒包含用于向人类受试者施用的说明书。合适地，所述说明书说明了以下中的一个或多个：抗原的给药量、佐剂的给药量、剂量的数量、剂量之间的间隔和施用途径，各自如本文所述。

合适地，所述说明书是印刷说明书。合适地，所述说明书可以印刷在标签上。所述标签可以附在包含组合物的容器上。

在一个实施方案中，使用10μg R21/50μg Matrix-M1免疫接种。

在一个实施方案中，使用10μg R21/50μg Matrix-M1的3次免疫接种(包括第8周的第三次免疫)。在一个实施方案中，在第8周使用10μg R21/50μg Matrix-M1的免疫接种，最终(例如第三)剂量从50mcg降至10mcg。

在一个实施方案中，优选3剂量方案。3剂量方案(有时称为"标准方案")非常有效，提供82％的效力。最合适的是，以四周的间隔给予三个剂量。

本发明人已经从免疫应答中获得证据，两个剂量可能是足够的。两剂量方案在实践中将是非常有益的，并且证明用两剂量的良好效力代表了突破。仅给予2个剂量节省了施用的成本和劳力，并且另外促进更高比例的受试者完成其剂量过程。

*小于18岁的不同年龄的受试者可能具有不同的体重，并且医生在确定剂量时通常将考虑这一点。特别是，2到12个月大的婴儿的体重可能低于上述值-本文提供的以mg/Kg计的剂量可简单地用于计算考虑了将给予该剂量的受试者体重的相应剂量。

间隔

除非从上下文中明显看出，否则间隔是剂量之间的时间。给予的第一剂量是"第0天/第零天"。间隔是直到下一剂量的时间。

合适地，可以使用2天至12个月的间隔。

更合适地，使用1周至12周的间隔。

更合适地，使用3周至12周的间隔。

最合适地，使用4周的间隔。

例如，可以使用以下疫苗方案：

第1组免疫接种-在第0、4和8周

第2组免疫接种-在第0、4和8周

第3组免疫接种-第0、4和8周，以及第1和9周(或其它方便的时间点)免疫接种病毒载体化疫苗。

更合适地，第3组免疫接种-第0、4和8周，以及第1和9周免疫接种病毒载体化疫苗。

干扰

进一步的优点可以是减少或避免干扰问题。

希望提供对恶性疟原虫(例如通过使用R21)和间日疟原虫疟疾二者的保护。因此，在一些实施方案中，本发明涉及用于免疫对抗两种病原体的组合物。本发明有利地避免或减少了利用这种方法可能预期的干扰问题。

合适地，通过施用Rv21来实现对抗间日疟原虫的保护。合适地，Rv21如Salman等2017(Rational development of a protective P.vivax vaccine evaluated withtransgenic rodent parasite challenge models.Sci.Rep.7,46482)中所述，其特别用于构建Rv21 VLP，在此引入作为参考。

更详细地，Rv21是病毒样颗粒(VLP)，其由嵌合PvCSP VK210/VK247中心重复序列和与乙型肝炎表面抗原(HepB-S)基因融合的CSP C-末端序列组成，任选地具有C-末端放置的四个氨基酸C-标签序列(Glu-Pro-Glu-Ala)。所述标签可以被省略或包括用于人类使用-例如在实施例部分中描述的临床试验中包括标签。最合适的是，标签被省略以供人使用。优化融合基因的密码子使用以在巴斯德毕赤氏酵母中表达，并使用时程研究表达，在三种蛋白酶敲除菌株和蛋白酶野生型巴斯德毕赤酵母菌株中评估胞内融合蛋白(PvCSP-HepB-S)的生产。针对prb1和pep4蛋白酶的双敲除巴斯德毕赤酵母菌株在甲醇诱导108小时后具有最佳的蛋白表达水平。使用针对PvCSP VK210、PvCSP VK247和HepB S的抗体通过Western印迹分析证实融合蛋白PvCSP-HepB S的存在。使用灵敏的银染技术进行Rv21蛋白的存在、大小和纯度。

用于纯化融合蛋白VLP的方案已经用于R21，并且包括两个步骤(Collins，Brod等人，Scientific Reports，2017)。第一步由亲和纯化组成，其使用在中性条件下与融合蛋白结合的捕获选择C-标签基质。除了收集对应于PvCSP-HepB S蛋白的预期蛋白条带之外，样品还含有其它蛋白质。使用透射电子显微镜(TEM)检测VLP颗粒组装体。通过大小排阻层析进行随后的纯化步骤，以从样品中清除具有不同分子大小的其它蛋白质，并除去高浓度的盐(洗脱缓冲液)。使用银染技术显现出PvCSP-HepB S蛋白(75kDa)的预期大小的单个蛋白质条带，TEM显示具有球形形状的VLP的更均一群体，在表面上有一些突起或尖峰，可能归因于存在于表面上的PvCSP蛋白。纯化的Rv21用于免疫小鼠，使用0.5μg/小鼠的低剂量，并使用同源初免-加强免疫方案，在免疫之间间隔一周。不是施用通常用于RTS,S免疫接种的ASO1佐剂，而是使用Matrix-M佐剂(Novavax AB，Uppsala，瑞典)来增强Rv21的免疫原性和保护效力。Matrix-M适合人类使用，由基于皂苷的40nm颗粒组成，其可以激活免疫细胞并将其募集到引流淋巴结和脾。

本发明的方案以混合物的形式(例如，以2-3个上述剂量)施用这些R21和Rv21。

有利地，这种方案具有(彼此)不干扰的优点。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了如上所述的组合物，其还包含Rv21。

当本发明的组合物还含有Rv21时，合适地，所用Rv21的量应与R21的大约相同，最合适地，与R21的正好相同。

其他实施方案

在一个实施方案中，所述剂量包含50mcg Matrix-M中的10mcg R21(对于成人)(即比率R21：Matrix-M＝1:5)和/或50mcg Matrix-M中的5mcg R21(对于儿童)(即比率R21：Matrix-M＝1:10)，或由其组成。

在一个实施方案中，剂量包含恒定量的佐剂，例如Matrix-M。该恒定量可以是50mcg Matrix-M。因此，本发明提供了一种或多种剂量，其包含或由在50mcg Matrix-M中的10mcg R21组成；或包含或由在50mcg Matrix-M中的5mcg R21组成；或包含或由在50mcgMatrix-M中的2mcg R21组成。50mcg Matrix-M量可以用于成人(至少18岁的受试者)和/或儿童(小于18岁的受试者)。显然，抗原如R21的量仍然应该根据本文给出的指导仔细选择。

优点

诸如Salman等2017(Rational development of a protective P.vivax vaccineevaluated with transgenic rodent parasite challenge models.Sci.Rep.7,46482)的文献，以及如上文背景技术部分中引用的涉及恶性疟原虫/R21的更相关的文献，都集中于小鼠。小鼠对于人类疫苗所需剂量的指导非常差，这必须例如在临床试验中确定。小鼠通常为20克，成人通常重60-80千克，相差3000-4000倍。因此，简单外推在小鼠中作用的1mcg剂量在人中则需要3000-4000mcg。然而，更好的指导是用于人的其它类似疫苗的剂量。与R21最密切相关的疫苗是RTS,S，其标准成人剂量为50mcg。这就是为什么本发明人最初在他们的前两个临床试验(Vac053和Vac056)中测试了50mcg。然而，在随后的免疫中，令人惊奇地发现1-20mcg，尤其是10mcg，甚至2mcg的成人剂量是R21的合适剂量。这些剂量比用RTS,S产生相同免疫应答所需的剂量小2.5倍、5倍和25倍-这是一个非常令人惊讶的发现。Salman等(同上)对Rv21显示，在20克小鼠中发挥功效所需的剂量为每剂5mcg或0.5mcg，表明在人中的剂量至少为50mcg，很可能更大，因为人的大于3000的体重。

应注意Collins等2017最终推荐R21与基于病毒的载体如基于PbTRAP的病毒载体的组合。相反，本发明涉及施用R21，特别是施用极低剂量(比Collins等教导的那些低2-3个数量级)的R21以获得保护功效。这本身是令人惊讶的，因为使用了特别低的剂量。此外，鉴于Collins等人的教导，其更令人惊奇，因为本发明显示特定的剂量和给药方案产生这些效果，而不需要与其它载体如基于PbTRAP的病毒载体组合，这是本发明的另一个优点。

仅从现有技术外推是不可能的，并且本发明人真正惊奇地发现，本文教导的低剂量的非常高的免疫原性和效力。此外，低剂量下显著改善的安全性是另一个令人惊讶的技术益处，并且是发明人本身没有预料到的。因此，对本领域的关键贡献是本文教导的低剂量方法(组合物/方案)。该方法具有制造(低成本)、安全性(显示较少的副作用)以及响应的持久性的实用性：低剂量(1-20mcg，最合适的是10mcg)比全剂量(50mcg)明显更好。

此外，包含二给药方案的实施方案具有特定益处；用两个剂量而不是三个剂量保护人类受试者例如婴儿对于发展中国家部署可能是巨大的益处-因此物流益处以及对于降低的商品成本(即，降低的较少剂量的成本)以及改进的安全性和耐久性(这也是较低剂量提供的优点)的益处。

如上所述，对组合的干扰是本领域中的挑战。在小鼠中，我们已经对此进行了测试。本发明人认为，有足够的证据表明经常存在对混合的亚单位疫苗的干扰；这里描述的方法具有无干扰的附加益处。在本文中，组合是R21与Rv21的组合。

在所附的独立和从属权利要求中阐述了进一步的特定的和优选的方面。从属权利要求的特征可以与独立权利要求的特征适当地组合，并且可以与除了在权利要求中明确阐述的那些组合之外的组合进行组合。

在设备特征被描述为可操作以提供功能的情况下，将理解，这包括提供该功能或者被适配或配置成提供该功能的设备特征。

附图简要说明

现在将参考附图进一步描述本发明的实施例，其中：

图1示出了图表。比较R21和RTS,S疫苗病毒样颗粒的一些特征。与RTS,S颗粒相比，R21 VLP表面上更大密度的CSP序列可能与R21疫苗的有利特征有关，例如没有诱导显著水平的HBsAg序列抗体。

图2示出了流程图。在UK进行的R21疫苗的Vac053 I期临床试验，以牛津作为主要临床中心(Venkatmans等)。筛选75名受试者的合格性，并登记31名受试者。注意，第2组中的受试者不接受含有R21的佐剂。R21的剂量如图所示。在第1、3和4组中，Matrix-M的剂量在所有受试者中均为50μg。

图3示出了条形图。R21/Matrix-M的安全性更好，50μg RTS,S/AS01 vs 10μg R21/Matrix-M。与RTS,S/AS01(50mcg的RTS,S)mcg相比，在Matrix-M佐剂(50mcg)中R21(10mcg)的安全性特征。局部和全身性不良事件在1(最小)至3(最严重)的标准严重程度等级上分级。在第二次剂量后(数据显示)以及也在第一次剂量后(数据未显示)，R21/Matrix-M的反应原性特征在统计学上显著优于RTS,S/AS01。在第三次给药后，R21/Matrix-M的安全性特征再次更好，但不显著。

图4A和4B示出了条形图。显示了低剂量2μg R21/Matrix-M的优异安全性。通过将R21(但不是Matrix-M)的剂量进一步降低到仅2μg，R21/Matrix-M的安全性曲线进一步提高(图4B)。

图5示出了曲线图。R21临床免疫原性数据；图5A显示依赖于Matrix-M的免疫原性；图5B显示与50μg RTS,S/AS01B相当的10μg R21/MM。

图5A：在VAC53中IgG对抗CSP的NANP重复序列区域的时间中值进程。所示的时间进程是第1组(＝"G1")(在Matrix-M(此处缩写为MM)中10ug R21)、G2(没有佐剂的50ug(＝50微克)R21)和G3(MM中50ug R21)的中值，并且使用完成随访的所有志愿者的数据计算：G1 n＝10，G2 n＝3，G3 n＝8。佐剂化组中第二次和第三次免疫接种后的NANP特异性IgG水平的中值显著高于接受未佐剂化的R21的组。第三次免疫接种后再次加强NANP特异性IgG，但仅在接受MM中的R21的组中。在第三次免疫接种后2周，在10ug R21/MM组中观察到最高的对NANP的抗体应答中值。

图5B：在VAC53中显示了G1和G3的NANP特异性IgG的平均时程，并将其与在第0、4和8周接受50μG RTS,S/AS01B的志愿者中的VAC55试验(NCT：01883609)中观察到的应答进行比较。每次免疫接种后，平均NANP特异性IgG水平在10μg R21/MM和50μg RTS,S/AS01B组之间相当。

使用酶联免疫吸附测定(ELISA)分析针对NANP的抗体应答，并如Rampling等(JInfect Dis(2016)214(5)：772-781DOI：https：//DOI org/10.1093/infdis/jiw244)所公开的进行。用NANP特异性IgG阳性的血清库在每个平板上形成标准曲线。基于样品的光密度(OD405)和标准曲线的参数，计算每种样品的任意ELISA单位(EU)。

图6示出了图表。抗体应答的持久性；在6个月时，10μg R21产生的抗体滴度明显高于50μg R21。

利用图5中使用的标准化ELISA方法测量的NANP特异性IgG应答的持久性。在第238天(D238)测定VAC53 G1和G3志愿者的NANP特异性IgG。在这个晚期时间点，与50ug R21/MM组相比，10ug R21/MM组中的抗体水平显著更高(Mann-Whitney分析，P＝0.02，线表示中位数)，表明使用较低剂量的疫苗的令人惊讶的更好的持久性。

图7示出了图表。较低给药方案诱导性质上不同的Tfh应答和增加的B细胞。

在疟疾攻毒前一天的时间点，表示为C-1天(D76)，对来自VAC65志愿者的外周血单核细胞(PBMC)中的总循环T滤泡辅助细胞(cTfh)和B细胞进行表型分型。比较10ug R21/MM和50ug R21/MM。cTfh的表型通过用针对特定标记的荧光标记抗体染色细胞来实现并通过流式细胞术分析。循环Tfh被定义为单个活淋巴细胞，其是PD1+CXCR5+CD45RA-CD4+ T细胞，并根据趋化因子受体CXCR3和CCR6的表达被进一步分成如下亚群：Tfh17(CXCR3-CCR6+)、双阳性/dp(CXCR3+CCR6+)、Tfh1(CXCR3+CCR6-)和Tfh2(CXCR3-CCR6-)，如先前公布的(Schmitt,Bentebibel和Ueno,Trends in Immunology,2014.DOI:http://dx.doi.org/10.1016/j.it.2014.06.002)。使用针对CD19、CD20、CD21、CD27、IgD、IgG和IgM的标记，以相同的方式对B细胞进行表型分析。如先前公开的(Sanz等人，Semin Immunol 2008 DOI:10.1016/j.smim.2007.12.006)，根据IgD和CD27的表达将CD19+CD20+B细胞分类为"转换的记忆"(IgD-CD27+)、"非转换的记忆"(IgD+CD27+)、"双阴"(IgD-CD27-)或"原初"(IgD+CD27+)。

↑总B细胞；↑转换的记忆B细胞(IgD-CD27+)；↑IgG+MBC；↑IgG:IgM。

图7A：总cTfh内子集的百分比。G1(10、10、10ug R21/MM)具有比G2(50、50、10ugR21/MM)显著更高比例的Tfh2 cTfh(Mann-Whitney分析，P＝0.0018)。这种较低剂量R21/MM的较高Tfh2应答可以说明更低剂量疫苗的更好性能。

方框部分(带箭头)表明CXCR3-CCR6-cTfh在为B细胞提供帮助方面更好(Locci等，Immunity 2013)

图7B：淋巴细胞内CD19+CD20+B细胞的百分比。10、10、10μgR21/MM组中淋巴细胞内CD19+CD20+B细胞的百分比显著高于50、50、10μg R21/MM组(Mann-Whitney分析，P＝0.0104)。

图7C：淋巴细胞内转换的记忆B细胞(CD19+CD20+IgD-CD27+)的百分比。在10、10、10μg R21/MM组的淋巴细胞中，有显著更高百分比的转换的记忆B细胞(Mann-Whitney分析，P＝0.0004)，这又可能与更低剂量疫苗的更好性能有关。

图8示出了图表。非常低的2μg剂量R21/Matrix-M；在这种非常低的剂量下仍然具有高免疫原性；发现反应原性在该非常低的剂量下是最小的。

如图5和6中，通过ELISA测定NANP特异性IgG应答。比较免疫接种了MM中2、10或50μg R21的志愿者中VAC53中第28天(D28)、D56和D84的NANP特异性抗体应答。对测试时可获得的所有样品完成测定-一些志愿者还没有通过这些时间点。在每个时间点针对多个比较利用Dunn's检验的Kruskal-Wallis分析显示，在D28和D56时2μg组中滴度显著较低，但在第84天并非如此(在D28、D56和D84时Kruskal-Wallis分别为P＝0.022、P＝0.050和P＝0.212)。线表示在每个时间点每组中的中值。在第84天，剂量组之间的类似滴度表明，即使这种非常低剂量的R21也能很好地起保护作用。

图9示出了一个表。VAC065-I/IIa期子孢子攻毒研究；31名免疫接种者(第1、2和3组中分别为11、11、9)和6名对照在2017年1月30日和31日经历CHMI。

Vac065中的设计和组的概述，其是2016-2017年在牛津进行的IIa期受控人类疟疾感染(CHMI)试验。

图10示出了图表。低剂量R21/Matrix-M的82％效力。

Vac065 CHMI试验中1-3组中的三种疫苗方案的效力总结。令人惊奇的是，用第1组的简单低给药方案观察到最高的效力，其中使用50μg Matrix-M中的10μg R21的三个4周剂量，疫苗与佐剂的比例为1:5。在其它组中观察到较低的效力。疟疾诊断时间的Kaplan-Meier曲线表明，在第1组中发展为疟疾的两个免疫接种者(十一个中)确实比对照受试者晚几天。这表明疫苗减少了寄生虫的数量，导致血液阶段感染，使得寄生虫在以后被检测。因此，在这两个受试者中，存在部分疫苗效力的清楚证据。

图11示出了图表。三剂10μg R21/Matrix-M相比于50μg RTS,S/AS01的效力。

Matrix-M疫苗中R21的效力与RTS,S/AS01疫苗的效力相比较，后者在英国和美国以前的CHMI试验中，在利用AS01中的50mcg RTS,S的标准0、4、8周方案中使用，并与相同试验中的未免疫接种疫苗的对照相比较。R21疫苗的效力为82％，高于RTS,S疫苗的58％，这种差异接近统计学显著性(双尾P值＝0.16；单尾P值＝0.08)。，

图12示出了图表。两个剂量的R21/Matrix-M后的免疫原性可能高于三个剂量(第0、28、56天方案)后的免疫原性。

几何平均NANP IgG时程(使用与先前图相同的ELISA方法测量)。显示了VAC55 G2和VAC59 G1中10μg R21/MM(VAC53 G1)和50μG RTS,S/AS01B的时程。10μg R21/MM组的第二次免疫接种后的抗体应答显著高于50μg RTS,S/AS01B组。尽管这些滴度通过第三次免疫接种再次增强，但它们增强至与第二次免疫接种后的峰值相当的水平，并且比第二次免疫接种后更快地下降。这种在仅两次剂量后的高水平免疫原性(在滴度上与三次剂量后观察到的水平相当)强烈表明，R21的两剂量方案出人意料地可以提供显著的效力(如三剂量方案那样)。

图13示出了图表。

图14示出了图表。

图15示出了图表。

图16示出了图表。

实施例

实施例1：R21+/-ChAd63/MVA ME-TRAP的安全性和有效性研究

赞助商：

牛津大学

信息提者供(负责方)：

牛津大学

ClinicalTrials.GOV标识符：

NCT02905019

目的

本研究的目的是评估佐剂化的R21单独和与病毒载体化疫苗方案组合(由佐剂化的R21+ChAd63和编码ME-TRAP的MVA组成)在健康的无疟疾志愿者中对抗疟疾子孢子攻毒的安全性和效力。

健康的成年志愿者将在伦敦、牛津和南安普顿招募。

所有免疫接种都将肌内施用。该研究包括两次、三次或五次免疫接种并且然后经历疟疾的攻毒感染，或者不接受免疫接种然后经历疟疾的攻毒感染。

研究类型：介入

研究设计：配置：随机

介入模型：平行分配

掩蔽(masking)：结果评估员

主要目的：预防

官方题目：I/IIa期子孢子攻毒研究，用以评估佐剂化R21在两个不同剂量下以及佐剂化R21+ChAd63和编码ME-TRAP的MVA的组合疟疾疫苗候选方案的安全性和保护效力。

NLM提供的资源链接：

MedlinePlus相关主题：疟疾

遗传和罕见疾病信息中心资源：疟疾

U.S.FDA资源

由牛津大学提供的进一步研究细节：

初步结果测量：

·根据完全受保护个体的数目评估的两种不同剂量的佐剂化R21以及佐剂化R21+ChAd63和编码ME-TRAP的MVA在健康的未患疟疾志愿者中的效力。[时间范围：6个月]

使用统计分析来比较疫苗组中完全受保护个体(通过血液载片评估，利用恶性疟原虫寄生虫血症的发生测量的，到子孢子攻毒后第21天未发生血液阶段感染的个体)的数目与对照组的数目。

·通过不良事件的频率评估的两种不同剂量的佐剂化R21以及佐剂化R21+ChAd63和编码ME-TRAP的MVA在健康的无疟疾志愿者中的安全性。[时间范围：6个月]

在每次临床就诊时，将从日记卡、临床复查、临床检查(包括观察)和实验室结果收集征求的和未征求的不良事件数据。将该AE数据制表，并比较组间AE的频率、持续性和严重性。

次级结果测量：

·利用两种不同剂量的佐剂化R21，在未患疟疾的个体中产生的体液免疫原性[时间范围：6个月]

通过用佐剂化的R21免疫接种产生的对环子孢子蛋白的抗体应答。

·利用ChAd63和编码ME-TRAP的MVA，在未患疟疾个体中产生的细胞介导的免疫原性[时间范围：6个月]

通过用ChAd63和编码ME-TRAP的MVA免疫接种产生的对疟原虫的TRAP抗原的T细胞应答。

·在健康的未患疟疾的志愿者中，针对疟疾子孢子攻毒通过PCR评估的恶性疟原虫寄生虫血症的时间测定的效力。[时间范围：6个月]

利用血液阶段感染(定义为通过定量PCR外周血中每ml有500个或更多个寄生虫)进行的统计学分析。

·在健康的未患疟疾的志愿者中，针对疟疾子孢子攻毒通过血玻片评估的恶性疟原虫寄生虫血症的时间测定的效力。[时间范围：6个月]

使用由症状、血膜结果和寄生虫血症的组合定义的血液阶段感染进行的统计分析。

·在健康的未患疟疾的志愿者中，针对疟疾子孢子攻毒通过利用PCR评估的寄生虫密度动力学而评估的恶性疟原虫寄生虫血症的时间测定的效力。[时间范围：6个月]

利用血液阶段疟疾感染(定义为通过定量PCR外周血中每ml有20个或更多个恶性疟原虫寄生虫)进行的统计学分析。

其它结果测量：

·佐剂化R21在两个不同剂量以及佐剂化R21+ChAd63和编码ME-TRAP的MVA的长期保护效力[时间范围：12个月]

通过在第一子孢子攻毒后5-7个月(研究开始后约12个月)再攻毒任何受无菌保护的个体，并将发展为血液阶段感染的再攻毒者的数目与未免疫接种的对照比较，来评估免疫接种方案的长期效力。

估测的登记数：70

详细描述：

将免疫接种阶段和攻毒过程在试验期间上错开成两部分：攻毒A和B。

攻毒A：

·1-3组由接受R21单独或者R21+ChAd63-MVA ME-TRAP之后是第12周通过子孢子攻毒(蚊子叮咬)的CHMI的志愿者组成。12位志愿者将被募集至每组。

·4a组将作为感染性对照，这些志愿者将不免疫接种。

攻毒B：

·在最初的攻毒后5-12个月，可以再次攻毒1-3组中的无菌保护的志愿者以评估效力的持久性。

·5-7组也将登记参加攻毒B。

·5组(8名志愿者)将测试标准剂量R21的效力，部分第三剂量之后为在第12周的CHMI。

·6组将测试标准剂量R21免疫接种方案的长期效力(该组中的志愿者将已经接受其免疫接种，同时参加2015年开始的VAC053 I期疟疾试验，因此在免疫后约两年进行攻毒前将不接受任何额外的免疫接种)。

·7组(8名志愿者)将测试两剂量R21免疫接种方案以及随后在第8周进行CHMI的效力。

·4b组将用作5-7组和无菌保护的1-3组志愿者的感染性对照。如果对5和7组的任何志愿者再次攻毒，则将4C组志愿者用作感染性对照。

资格

有资格用于研究的年龄： 18至45岁的(成人)

有资格用于研究的性别：所有

接受健康志愿者：是

标准

纳入标准：

·年龄18-45岁的健康成人

·能够并愿意(以研究者的观点)遵守所有研究要求。

·愿意允许研究者与他们的全科医生讨论志愿者的病史。

·仅女性：必须在研究期间实施持续有效的避孕

·研究过程中和在他们参与研究结束后至少3年内同意不献血。

·参与试验的书面知情同意书。

·在CHMI和抗疟治疗完成之间的时间段内，可通过移动电话联系(24/7)。

·愿意在CHMI后采取治愈性抗疟疾方案。

·对于未生活在其指定的疟疾攻毒随访场所附近的志愿者(牛津或南安普顿)：同意在研究的一部分期间(从蚊子叮咬后至少第6.5天直到抗疟疾治疗完成)停留在靠近试验中心的旅馆房间中。

·正确回答知情同意测验中的所有问题。

排除标准：

·临床疟疾(任何种类)的历史。

·在研究期间或在前六个月内旅行到明显疟疾流行的地方。

·在CHMI的30天内使用具有已知抗疟活性的系统性抗生素(例如甲氧苄啶-磺胺甲恶唑、多西环素、四环素、克林霉素、红霉素、氟喹诺酮和阿奇霉素)。

·在登记前30天接受调查产品，或在研究期间计划接受。

·在接受研究性疫苗之前，可能影响研究者评估的试验数据的解释。如果第1-3组中的任何志愿者经历再次攻毒，则该排除标准不扩展到VAC065试验中先前接受的疫苗。

·仅对于第3组志愿者：预先接受非疟疾MVA或非疟疾腺病毒载体化实验疫苗

·任何确认的或怀疑的免疫抑制或免疫缺陷状态，包括HIV感染；无脾；在过去6个月内复发性严重感染和慢性(超过14天)免疫抑制药物(允许吸入和局部用类固醇)。

·登记前3个月内使用免疫球蛋白或血液制品。

·可能被疫苗的任何组分(例如蛋制品、Kathon)或疟疾感染加剧的过敏性疾病或反应的历史。

·免疫接种后过敏反应的任何历史。

·临床显著的接触性皮炎的历史。

·镰状细胞贫血、镰状细胞性状、地中海贫血或地中海贫血性状或任何可能影响疟疾感染易感性的血液学病症的历史。

·在研究期间怀孕、哺乳或意欲怀孕。

·使用已知引起QT间期延长和现有对使用Malarone^TM的禁忌症的药物。

·使用已知与Riamet^TM和Malarone^TM具有潜在临床显著相互作用的药物。

·已知延长QT间期的任何临床病症。

·心律失常的历史，包括临床相关的心动过缓。

·电解质平衡紊乱，例如低血钾或低镁血症。

·先天性QT延长或猝死的家族史。

·使用所有三种建议的抗疟药物的禁忌症：Riamet^TM、Malarone^TM和氯喹。

·癌症的历史(除了皮肤基底细胞癌和原位宫颈癌)。

·可能影响参与研究的严重精神病症的历史。

·需要医院专家监督的任何其它严重慢性疾病。

·怀疑或已知的当前酒精滥用，定义为每周酒精摄入量大于42个标准UK单位。

·在登记前5年中怀疑或已知注射药物滥用。

·在血清中检测到的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。

·在筛选时对丙型肝炎病毒(HCV抗体)呈血清阳性(除非已参与了在前的丙型肝炎疫苗研究，并且在参与该研究之前HCV抗体确认为阴性，并且在本研究的筛选时HCV RNAPCR阴性)。

·如系统冠状动脉风险评估(SCORE)系统所评估，致命性心血管疾病的估计十年风险≥5％。60

·在年龄＜50岁的第1和2代亲属中呈阳性家族史。

·由于社会、地理或心理原因，志愿者不能被密切关注。

·生物化学或血液学血液测试、尿分析或临床检查的任何临床显著异常发现。

·任何其他可能显著增加志愿者风险，影响志愿者参与研究的能力或损害研究数据的解释的显著疾病、病症或发现。

ClinicalTrials.GOV标识符：NCT02905019

地点-英国

NIHR Wellcome Trust临床研究机构,汉默斯密斯医院

伦敦，英国

联系：Reshma Sultan+44(0)20 331 31086

CCVTM,牛津大学，

牛津,英国,OX3 7LE

联系:志愿者协调人员 vaccinetrials@ndm.ox.ac.uk

南安普顿国家健康研究所

南安普顿,英国

联系 02381 204989 UHS.RecruitmentCRF@nhs.net

赞助商和合作伙伴：牛津大学

责任方: 牛津大学

ClinicalTrials.gov标示符: NCT02905019

其他研究ID号: VAC065

个人参与数据(IPD)共享声明：

计划共享IPD: 未定

实施例2

参考临床试验概要，有良好的理由相信第2组或第3组本应更好，然而它们却令人惊讶地不是。令人印象深刻的是，利用低剂量R21的第1组结果(82％效力)比测试的其它两种方案(第2和3组)更好。第2组本应更好，因为其中给予了更大量的R21：剂量1和2为50mcg而不是10mcg，但剂量3为相同剂量：在RTS,S的文献中有证据表明，这种"部分(即减少的)第三剂量"方案可能优于标准方案(如在第1组中)(参考Regules等人J Infect Dis.2016；214:762-71.)。第3组本应是最好的组，因为额外施用部分有效的载体化疫苗，如Rampling等人(J Infect Dis.2016 Sep 1；214(5):772-81)所报道的，但引人注意的是第3组中的效力不如第1组中的高。

实施例3

概述：R21是一种新型疟疾疫苗候选物，是最先进疟疾疫苗候选物RTS,S/AS01的生物类似物，由疟疾环子孢子蛋白与乙肝表面抗原的融合蛋白组成。我们使用受控的人疟疾感染(CHMI)，评价了在健康UK志愿者中，以两种不同的给药方案与单独给予的Matrix-M一起施用R21(R21/MM)，以及与病毒载体化疫苗组合施用R21的效力。

我们在健康UK志愿者中进行了该IIa期研究，以评价在不同给药方案中以及与ChAd63-MVA ME-TRAP组合的R21/MM对疟疾子孢子攻毒的效力。

方法在英国的三个试验中心招募志愿者进入该IIa期研究，在伦敦皇家学院进行CHMI。给31个健康志愿者免疫接种3个剂量10/10/10μg R21/MM(第1组；n＝11)，或3个剂量50/50/10μg R21/MM(第2组；n＝11)，或3个剂量10/10/10μg R21/MM(第1组；n＝11)，与表达ME-TRAP的ChAd63-MVA一起给予。

参考图2，我们描述了Ia期研究；开放标签；非随机化；年龄为18至50岁的健康成年人；牛津；伦敦(皇家学院)；总共31名志愿者。

如在I期试验(Vac053，试验图见图2)中观察到的，Matrix-M(50微克)中R21(10μg)的安全特性(见图3)明显好于RTS,S/AS01疫苗。如I期试验，vac053-见图5，在所有方案中都观察到针对CSP的抗体的良好免疫原性。

在第一次免疫接种后第12周通过蚊子叮咬递送CHMI，包括6个未免疫接种的对照。该试验用ClinicalTrials.GOV(NCT02905019)登记。

发现该试验在2016年11月7日至2017年5月15日之间进行。在筛选的超过70名志愿者中，37名志愿者(图9)在2017年1月30日和31日经历疟疾子孢子攻毒。免疫接种整体被良好耐受，与公开的RTS,S/AS01数据相比，大多数局部和全身性不良事件本质上是轻度的并且具有改善的安全特性-参见图3。在第1组的9/11(81.8％)受试者、第2组的7/11(63.6％)受试者和第3组的6/9(66.7％)受试者中观察到无菌保护(参见图10)。与对照志愿者相比，所有免疫接种的志愿者都显示通畅强度(patency)显著延迟。5/6对照受试者被诊断为血液阶段疟疾。在所有志愿者中，对环子孢子蛋白的NANP重复序列区域的抗体应答在第2次免疫接种后14天显著增强，并且与RTS,S/AS01相当。

证明在较低剂量组中观察到的高水平效力是本发明的益处。

实验细节

研究设计和参与者

我们在年龄18至45岁之间的未患疟疾的健康成年男性和未孕女性中进行了IIa期研究。招募和免疫接种在英国牛津大学的临床疫苗学和热带医学中心(Centre forClinical Vaccinology and Tropical Medicine)以及南安普顿的Wellcome Trust临床研究机构和英国皇家学院进行。这个IIa期开放标记疟疾子孢子攻毒试验由4个队列组成。样品大小反映了对志愿者募集的实际限制，限制应接受疫苗方案而没有先前效力证据的志愿者数量的伦理考虑，以及描述免疫方案功效的愿望。在登记之前，研究人员根据受试者的偏好进行向研究组的分配。第1组(n＝11)接受3次免疫接种(在0、4和8周接受R21/MM 10μg)；第2组(n＝11)接受3次免疫接种(在0和4周接受R21/MM 50μg，在8周接受R21/MM 10μg)；第3组(n＝9)接受5次免疫接种(在0、4和8周接受R21/MM 10μg，在1周接受ChAd63 ME-TRAP5x10¹⁰病毒颗粒(vp)，以及在9周接受MVA ME-TRAP2x10⁸噬斑形成单位(pfu))，第4组(n＝6)不接受免疫接种。所有受试者同时通过蚊子叮咬经历初始CHMI(免疫接种受试者第一次免疫接种后第12周)。

在伦敦皇家学院，使用来自恶性疟原虫3D7株感染的斯氏按蚊(AnophelesStephensi)的五次感染性叮咬，使志愿者被感染。所有受试者都感染了一批蚊子，蚊子由美国华盛顿特区Walter Reed Army Institute of Research的昆虫系提供。纳入和排除标准列在补充附件中。在参与前都给予书面知情同意书，并且根据赫尔辛基宣言(Declarationof Helsinki)的原则和根据良好临床实践(Good Clinical Practice,GCP)进行研究。

该研究得到英国伯克希尔中南部国家研究伦理服务委员会(UK NationalResearch Ethics Service,Committee South Central-Berkshire)(Ref:16/SC/0261)、英国药品与保健品管理局(Medicine and Healthcare Products Regulatory Agency)(Ref:21584/0360/001-0001)以及牛津大学临床试验和研究管理团队(Oxford UniversityClinical Trials and Research Governance team)的批准，他们独立地外部监控对良好临床实践指南的依从性。病毒载体化疫苗的使用是由牛津大学医院NHS Trust(参考号GM462.16.88)的遗传修饰生物安全委员会(Genetically Modified Organisms SafetyCommittee,GMSC)批准的。该试验以ClinicalTrials.gov(Ref：NCT02905019)注册，并且由一个独立的本地安全监控机构提供安全监督。

程序

R21(批号：01015-01)在良好生产实践(Good Manufacture Practice)条件下在牛津大学临床生物生产厂(Clinical Biomanufacturing Facility)生产和培养：该产品的生产、制造和储存已经在WO2014/111733中有所描述；还参见Venkatraman等人。Matrix-M(批号：M1-103)是由Novavax开发的专利佐剂技术：该产品的生产、制造和储存已经在前面描述过[21]。ChAd63 ME-TRAP(批号：01S11-01)和MVA ME-TRAP(批号：0091013)疫苗的产生、制造和储存以前已有描述[12，22]。在免疫接种当天，将R21在从冰箱取出1小时内解冻至室温并与Matrix-M混合肌内施用给非优势臂的三角肌。在解冻1小时内将病毒载体化疫苗肌内施用至优势臂的三角肌(对R21给药的对侧臂)。免疫接种后1小时观察病房中的所有志愿者。给志愿者提供电子日记卡以记录他们的体温和免疫接种后7天的任何请求的局部和全身性不良事件以及免疫接种后28天的未经请求的不良事件。不良事件的严重性分级和不良事件的因果关系的分配根据方法中规定的预定指南进行。独立安全性监控委员会(SafetyMonitoring Committee)在试验过程中提供安全性监督。在第0、7、28、35、56、63和83天(CHMI前一天)的访问中，在第1组和第2组志愿者中进行安全性血液(safety blood)，其包括全血计数、肾功能和肝功能测试。在第14天和第70天对第3组中的志愿者进行另外的安全性血液。在第0、7、14、28、35、42、56、63、70和83天的样品上，进行通过抗NANP IgG ELISA测量的抗体应答。在第0、42和83天的样品上评估对CSP的离体IFN-ELISpot应答。此外，在第3组志愿者中，在第0、28、70和83天的样品上评价对TRAP的IFN-ELISpot应答。用于这些免疫学测定的完整方法先前已有描述[23]。CHMI方法如Rampling等人J Infect Dis.2016Sep1；214(5):772-81。CHMI后，在具有疟疾提示性症状和阳性厚膜显微镜检查或者如果厚膜为阴性或症状不存在则qPCR结果＞500个寄生虫/ml的受试者中，进行血液阶段疟疾感染的诊断[12]。将在CHMI后第21天未发生血液阶段疟疾的免疫接种受试者视为表现出无菌保护。

输出

主要结果测量是评估不同疫苗方案对抗疟疾子孢子攻毒的效力(恶性疟原虫寄生虫血症的发生，通过血玻片评估)，以及评估疫苗在健康的未患疟疾志愿者中的安全性。第二个结果测量是评估免疫原性和评估健康未患疟疾的志愿者中的效力(测定为通过血玻片、通过PCR评估的恶性疟原虫寄生虫血症的时间，以及通过PCR评估的寄生虫密度动力学)。

统计分析

使用用于Windows的5.03版GraphPad Prism(GraphPad Software Inc，California，USA)和Stata 10.0(Statacorp LP，Texas，USA)分析数据。描述了每组的具有四分位距的几何平均数或中值。Kruskal-Wallis分析和Friedman检验用于比较峰免疫应答与基线。两组之间差异的显著性检测使用Mann-Whitney分析。使用Wilcoxon配对分析对组内的时间点之间进行比较。使用卡方检验来比较不同组之间的安全数据。通过KaplanMeier曲线的对数秩分析，使用在不同终点的单尾对数秩检验，评估免疫接种方案和对照之间效力的统计学显著差异。p＜0.05的值被认为是显著的。

结果

研究群体

从2016年11月7日至2017年1月31日，在经资格性筛查的75位志愿者中有总共43位被纳入本研究。第1组中的一个志愿者由于个人环境的变化在他们第一次免疫接种疫苗后而退出并被替代。第1组的另一个志愿者由于个人环境的变化在他们第二次免疫接种疫苗后退出。第2组的一个志愿者因为不再能够履行参加时间表而在他们第一次免疫接种疫苗后退出。第3组中的两个志愿者由于个人环境的变化而在他们的第三次免疫接种疫苗后退出。第3组另一个志愿者由于担心经历CHMI而在他们第五次免疫接种疫苗后退出。没有一个退出与免疫接种相关，没有进行中的AE，并且安全性血液是正常的。37名志愿者(1组有11名志愿者，第2组有11名志愿者，第3组有9名志愿者，以及6名未免疫接种的对照)在2017年1月30日和31日经历CHMI。所有这37名志愿者完成随访直到CHMI后90天。参与流程和研究设计总结在图9的表中。

效力

第1组有9/11志愿者、第2组有7/11志愿者和第3组有6/9志愿者在CHMI后21天没有发展为疟疾，无菌效力分别为81.8％(p＝0.0009)、63.6％(p＝0.004)和66.7％(p＝0.006)。六个对照志愿者中的五个发展为疟疾，平均诊断时间为11.3天(中位数11，范围11-12，SD 0.45)。在所有三组中观察到通畅的显著延迟，在第1、2和3组中，平均诊断时间分别为15.3天(中值15.3，范围14.5-16，SD 1.1)、16.4天(中值16.5，范围14.5-16，SD 1.5)和15.3天(中值16，范围14-16，SD 1.2)。

不良事件

没有发生严重的不良反应(SAR)或怀疑性的意外的严重不良反应(SUSAR)。没有归因于安全考虑的退出，并且没有激活预定义的研究停止或保持规则。所报道的大多数不良事件(AE)是自限性的并且在严重性方面是轻度的，所观察的反应原性谱与先前对R21/MM(Ref：VAC053，图2；Venkatraman等)和ChAd63_MVA ME-TRAP的研究相似[23]。在每次免疫接种后的前7天中，请求的局部和全身性不良事件是轻度至中度的，并且总体上所有免疫接种方案都是良好耐受的。疫苗部位疼痛是最常见的局部不良事件，严重程度主要是轻度的。与我们中心使用RTS,S/AS01(免疫接种1-p＝0.003；免疫接种2-p＝0；免疫接种3-p＝0.125)的两个先前试验的数据相比，10/10/10/10μg R21/MM剂量组的反应原性谱(其也在先前的I期试验(Venkatraman等)中测试)显著改善。与RTS,S/AS01相比，疫苗部位疼痛在第一次(p＝0.02)和第二次(p＝0.02)免疫接种后显著减轻。在每次免疫接种后28天收集的未经请求的不良事件被认为是明确地可能与免疫接种相关的，其本质上主要是轻微的。实验室不良事件主要为1级。免疫原性谱显示了对环子孢子蛋白中心NANP重复序列区域的有效抗体诱导，如Vac053 I期试验中所观察到的(图5)。

讨论

我们在此首次报道了新的疟疾疫苗候选物-用Matrix-M作为佐剂的R21，以最先进的疟疾疫苗候选物RTS,S/AS01的五分之一剂量产生的高水平效力。如果证明所述疫苗在疟疾流行区生活的受试者中是有效的，则大规模生产该疫苗将具有显著的节省剂量和节约成本的优点。我们的数据证实，这种疫苗方法在健康UK志愿者中是安全的和良好耐受的，其不利事件本质上主要是轻度的。使用50μg剂量和部分(1/5th)第三剂量没有提高效力，与Regules等最近公开的研究相反，该研究中显示延迟的部分第三剂量RTS,S/AS01提高了疟疾子孢子攻毒研究中的效力[10]。在1-3组之间对疫苗的体液应答没有变化，并且在第3组的方案中加入病毒载体化疫苗没有导致CS抗体免疫原性降低。反应的强度不能预测效力，这表明抗体应答的质量或其它方面也可能与效力相关。存在R21/MM诱导的对CSP的最小IFN-γELISpot应答，这与先前用RTS,S/AS01的经历相似，仅诱导低水平的CD4+而没有CD8+T细胞应答[24]。

一个对照志愿者没有发展为临床疟疾，这是非常不寻常的，并且以前在牛津中心的CHMI试验中从未发生过。然而，在Sanaria公司进行的许多其它用以测试静脉内全子孢子疫苗的CHMI试验中[25，26]，已经报道了一个对照不能发展为疟疾。在对照组中通畅的平均时间为11.3天，表明这不是一个非常弱的攻毒，并且在该试验中使用的免疫接种和CHMI方法与其它CHMI研究在很大程度上是相当的[23]。

总之，该IIa期疟疾子孢子攻毒研究证实了使用新型低成本疟疾疫苗R21/MM的高水平效力。这种高效力至少与在一个类似的0、4、8周时间表中使用更高(50μg)剂量的RTS,S/AS01疫苗的方案一样高或更高(图11)。

基于在仅两次免疫后观察到的抗CSP抗体的高免疫原性，两剂量方案也足以保护该初免群体(图12)。鉴于此，在健康UK志愿者的CHMI研究中，使用利用10μg R21/MM的两剂量方案。如果这被证明也具有高水平的效力，则这将具有显著的成本节约益处，并且潜在地将更容易与EPI程序协调部署。

实施例4-攻毒研究

在此我们显示了R21/Matrix-M疫苗的进一步攻毒研究。我们提供了来自我们用Matrix-M中的低剂量R21完成的攻毒研究的数据。总之，我们在以下组中显示了效力：-、

·在免疫后8.5个月再攻毒的志愿者：3/5保护＝60％

·两剂量组(10、10mcg)：在3周4/7保护＝57％

·三剂量组(10、10、2mcg)：在三周5/7保护＝71％

利用两剂量方案获得的57％在整个疟疾疫苗领域是前所未有的，这证明了本发明的显著技术效果。在8.5个月时60％的再攻毒效力也是优异的。

研究详情

进行了R21/Matrix-M疫苗的进一步攻毒研究。下面描述两个关键目的。

第一个目的是评价以四周间隔在50mcg Matrix-M中给药三次的10μg(mcg)R21剂量的保护作用的持久性。在第2017年1月底的最初的攻毒研究中，施用该方案的11位免疫接种者中有9位被无菌保护。这9位受保护的受试者全部被邀请参加2017年9月中期的再攻毒，并且5位同意参加。在这5位再攻毒者中，3位再次被无菌保护，2位没有保护，相当于60％的无菌效力。在再次攻毒前没有施用加强疫苗剂量，使得这些受试者的再次攻毒在他们1月开始的最后一次疫苗剂量后约8.5个月发生。

在最后一次免疫后8.5个月内大多数受保护的受试者中无菌保护的持久性的这一证据是非常积极的，并且与RTS,S/AS01保护的效力相比是有利的，后者通常在最后一次给药后约6个月测量。R21在8.5个月的效力为49％，相比之下RTS,S/AS疫苗在5-8个月报道的效力为26％(见表)。

第二个目的是评价使用在Matrix-M中的优选低剂量R21的两种新的R21免疫方案。在一个组中，七名受试者仅用两剂在50mcg Matrix-M佐剂中的10mcg R21免疫。最后一次给药后3至4周进行攻毒。在这七个个体中，4个个体是无菌保护的，总计达57％的疫苗效力，这显然是用两剂量疟疾疫苗曾经报道的最高效力(根据详细的文献综述的评估)。

另一组免疫接种组以四周的间隔使用两剂10mcg R21/Matrix-M，接着在另外四周后使用在50mcg Matrix-M中的一个剂量2mcg R21。3-4周后攻毒如此免疫的七个受试者，5个受试者被无菌保护，效力比率为71％。这与用三剂在50mcg Matrix-M中的10mcg R21保护的9/11略有不同。利用三个低剂量R21/Matrix-M的这些数据提供了其高水平效力的进一步证据。

示例性数据提供如下：

R21(发明)

在0、1、2月3×10mcg剂量在4周攻毒

9/11＝82％

5位(在9位中)在最后一次剂量后8.5个月再攻毒

3/5＝60％

最后一次剂量后8.5个月的总R21功效＝49％

RTS,S

Regules等J Infect Dis 2016 在最后一次剂量后3周攻毒

10/16＝62.5％

5/10在最后一次剂量后8个月再攻毒

1/5＝20％

最后一次剂量后8.5个月的总效力＝12.5％

Kester等人J Infect Dis 2009，0、1、2个月：在2-3周攻毒：

18/36受保护＝50％

在最后一次剂量后5.5个月再攻毒：

4/9受保护＝44％

RTS,S/AS01在最后一次剂量后5.5个月的总效力＝22％

(对于RTS,S/AS020，0、1、2：14/44受保护＝32％和再攻毒的4/9(44％)。

总体＝14％)

Rampling等人J Infect Dis 2016，0、1、2个月：

在4周12/16受保护＝75％

在第一次CHMI后6个月再攻毒：

5/6受保护＝83％

最后一次剂量后7个月的总效力＝62％

以重量/平均值：12.5x5、22x9、14x9、62x6：总和＝758.5/29

总RTS,S 5-8个月的平均效力：＝26％

表格说明：用R21和RTS,S疟疾疫苗免疫后的保护的持久性。最后一次剂量后5-8个月的总效力通过将在最初攻毒中保护的比例乘以在晚期攻毒中保护的比例来计算，以百分比表示。只有那些在初始攻毒中受保护的才被再攻毒。R21持久效力为RTS,S报道的比率的约两倍。

总之，本实施例显示了关于R21保护作用持久性的其它有用的临床数据，也显示了两剂量方案在人体中有用。

实施例5-R21低剂量进一步攻毒研究

在该实施例中，我们在进一步的攻毒研究中证明了良好的效力。更具体地说，我们报道了R21/Matrix-M疫苗的进一步攻毒研究。关键的发现是免疫接种后8.5个月的良好的效力持久性，其比已知的RTS,S表现更好，以及在两剂低剂量方案下也具有良好的效力。

实验：

R21/Matrix-M疫苗的进一步攻毒研究在2017年9月进行，具有两个目的。

第一个目的是评价以四周间隔施用三次在50mcg Matrix-M中的10μg(mcg)R21剂量的保护作用的持久性。在最初的攻毒研究中(参见上述实施例-2017年1月)，施用该方案的11名免疫接种者中有9人被无菌保护。这9位受保护的受试者全部被邀请参加2017年9月中期的再攻毒，并且有5位同意参加。在5位再攻毒者中，3位再攻毒者再次被无菌保护，2位再攻毒者未被保护，对应于60％的无菌功效(参见图13中的第1组)。

图13显示了2017年9月的受控人疟疾感染(CHMI)试验的结果。在对照组中，几乎所有未免疫接种疫苗的受试者全部感染，在该例下为6名中有5名。在第6组中，有两名免疫接种者在CHMI前20个月用Matrix-M中的损失剂量(10μg)R21免疫，它们都没有受到保护。然而，在第5组中，在2017年1月晚期初始经历CHMI(在2016年11月至2017年1月早期免疫后)的五个个体中有三个个体在它们最后一次免疫之后的8.5个月仍然被无菌保护，表明非常有用的疫苗效力的持久性。此外，在2017年9月CHMI前一个月和两个月接受两个低剂量10μgR21的七名免疫接种者中有四名被无菌保护，表明仅使用两个剂量的在Matrix-M中的R21的良好疫苗效力。第5组也显示了三剂10、10和2μg的疫苗产生72％的无菌效力(5/6受试者受保护)，再次显示了低剂量R21在Matrix-M中的效力。在所有免疫接种者中，使用的Matrix-M的剂量都是50μg。

在再次攻毒前没有施用加强疫苗剂量，使得这些受试者的再次攻毒在他们一月开始时的最后一次疫苗剂量后约8.5个月发生。

在最后一次免疫后8.5个月内大多数受保护的受试者中的无菌保护的持久性的这一证据是非常积极的，并且与RTS,S/AS01保护的效力相比是有利的，后者通常在最后一次给药后约6个月测量。R21在8.5个月的效力为49％，相比之下，RTS,S/AS疫苗在5-8个月的效力为26％(见下表)。

第二个目的是评价使用在Matrix-M中的低剂量的R21的两种新R21免疫方案。在一组(图中的第7组)中，仅用两剂在50mcg Matrix-M佐剂中的10mcg R21免疫七名受试者。最后一次剂量后3至4周进行攻毒。在这七个个体中，4个个体被无菌保护，总计57％的疫苗效力，这显然是用两剂量疟疾疫苗(根据详细的文献综述评估)曾经报道的最高效力，显示了本发明的技术益处。

另一组免疫接种组以四周的间隔接受两剂10mcg R21/Matrix-M，接着在另外四周后接受在50mcg Matrix-M中的2mcg R21。3-4周后攻毒如此免疫的七个受试者，5个受试者被无菌保护，效力比率为71％(图中的第5组)。这与用三剂在50mcg Matrix-M中的10mcgR21保护的9/11略有不同。利用R21/Matrix-M的三个低剂量的这些数据提供了其高水平效力的进一步证据。

最后一组(图中的第6组)仅是两个20个月前接受R21的免疫接种者：两者都不被无菌保护。该组中的样品量非常低。

数据表：显示了用R21和RTS,S疟疾疫苗免疫后的保护的持久性。最后一次剂量后5-8个月的总效力通过将在最初攻毒中保护的比例乘以在晚期攻毒中保护的比例来计算，以百分比表示。只有那些在初始攻毒中受保护的才进行再攻毒。R21持久效力(49％)显示为报道的RTS,S(26％)比率的约两倍。

数据：

R21(本研究)

在0、1、2月3×10mcg剂量在4周攻毒 9/11＝82％

5位(在9位中)在最后一次剂量后8.5个月再攻毒 3/5＝60％

最后一次剂量后8.5个月的总R21功效＝49％

RTS,S(已知/先前公开的研究)

Regules等J Infect Dis 2016 在最后一次剂量后3周攻毒 10/16＝62.5％

5/10在最后一次剂量后8个月再攻毒 1/5＝20％

最后一次剂量后8.5个月的总效力＝12.5％

Kester等人J Infect Dis 2009，0、1、2个月：在2-3周攻毒：18/36保护＝50％

在最后一次剂量后5.5个月再攻毒：4/9保护＝44％

RTS,S/AS01在最后一次剂量后5.5个月的总效力＝22％

(对于RTS,S/AS020，0、1、2：14/44受保护＝32％和再攻毒的4/9(44％)。总体＝14％)

Rampling等人J Infect Dis 2016，0、1、2个月：在4周12/16受保护＝75％

在第一次CHMI后6个月再攻毒：5/6受保护＝83％

最后一次剂量后7个月的总效力＝62％

以重量/平均值：12.5x5、22x9、14x9、62x6：总和＝758.5/29

总RTS,S 5-8个月的平均值效力：＝26％

实施例6：R21低剂量免疫接种在西非以及英国受试者中具有免疫原性在本实施例中，我们首次显示了低剂量方案在西非的良好免疫原性。

我们参考图14。

该数据表明R21低剂量免疫接种在西非以及英国受试者中具有免疫原性。将50μgMatrix-M中的10μg剂量的R21给予UK受试者(VAC53试验)和布基纳法索(Banfora)的西非受试者(Vac060试验)。在每个试验中，在第0、1和2个月时以三剂量方案施用免疫接种。两次剂量后的免疫原性在两个群体中是相似的，并且仅在三次剂量后在布基纳法索成年人中略低。这些数据显示，即使在具有高水平地方性疟疾传播的区域，低剂量R21疫苗也具有良好的免疫原性。

实施例7：2μg以及10μg R21的低剂量免疫原性

在本实施例中我们证明2μg R21也是具有免疫原性的剂量。

这证明了低剂量的应用-在较早的实施例中的数据是10μg。

我们参考图15。

UK健康成年受试者在三剂量0、1、2个月免疫方案中用不同剂量的R21免疫。使用2μg、10μg和50μg R21(每种情况下均在50μg Matrix-M佐剂中)，在三次剂量R21后第84天诱导的抗体滴度非常相似。与用10μg或50μg剂量观察到的相比，2μg给药方案的局部和全身反应原性更好(即降低)。因此，我们证实了本发明中教导的低剂量的益处-如通过减少的反应原性所说明的减少的副作用-仍然实现与高得多的剂量例如50μg剂量相似的抗体滴度。

实施例8：用R21低剂量免疫接种产生更好的疫苗应答持久性

在此处，我们惊奇地发现，在第238天，10μg与50μg R21相比具有更好的免疫应答：即我们证明较低剂量更好。

我们参考图16。

数据证明用R21低剂量免疫接种产生了更好的疫苗应答持久性。在0、1、2个月用10μg或50μg剂量的R21(总是用50μg Matrix-M佐剂)免疫UK受试者。在第一次剂量后第238天，与高剂量50μg方案相比，低剂量10μg方案中抗环子孢子蛋白中央重复序列区的抗体水平(与疫苗效力关联)较高，即我们证明了较低剂量更好。

参考文献

1.Efficacy and safety of the RTS,S/AS01 malaria vaccine during 18months after vaccination:a phase 3 randomized,controlled trial in childrenand young infants at 11 African sites.PLoS Med,2014.11(7):p.e1001685.

2.Efficacy and safety of RTS,S/AS01 malaria vaccine with or without abooster dose in infants and children in Africa:final results of a phase 3,individually randomised,controlled trial.Lancet,2015.386(9988):p.31-45.

3.Agnandji,S.T.,et al.,A phase 3 trial of RTS,S/AS01 malaria vaccinein African infants.N Engl J Med,2012.367(24):p.2284-95.

4.Agnandji,S.T.,et al.,First results of phase 3 trial of RTS,S/AS01malaria vaccine in African children.N Engl J Med,2011.365(20):p.1863-75.

5.Olotu,A.,et al.,Seven-Year Efficacy of RTS,S/AS01 Malaria Vaccineamong Young African Children.N Engl J Med,2016.374(26):p.2519-29.

6.Gessner,B.D.,D.C.Wraith,and A.Finn,CNS infection safety signal ofRTS,S/AS01 and possible association with rabies vaccine.Lancet,2016.387(10026):p.1376.

7.Klein,S.L.,et al.,RTS,S Malaria Vaccine and Increased Mortality inGirls.MBio,2016.7(2):p.e00514-16.

8.Malaria Vaccine Funders Group.Malaria Vaccine TechnologyRoadmap.2013 20/3/13]；Available from:http://www.who.int/immunization/topics/malaria/vaccine_roadmap/TRM_update_nov13.pdf？ua＝1.

9.Collins,K.A.,et al.,Enhancing protective immunity to malaria with ahighly immunogenic virus-like particle vaccine.Sci Rep,2017.7:p.46621.

10.Regules,J.A.,et al.,Fractional Third and Fourth Dose of RTS,S/AS01Malaria Candidate Vaccine:A Phase 2a Controlled Human Malaria ParasiteInfection and Immunogenicity Study.J Infect Dis,2016.214(5):p.762-71.

11.Long,C.A.and F.Zavala,Malaria vaccines and human immuneresponses.Curr Opin Microbiol,2016.32:p.96-102.

12.O'Hara,G.A.,et al.,Clinical assessment of a recombinant simianadenovirus ChAd63:a potent new vaccine vector.J Infect Dis,2012.205(5):p.772-81.

13.Kimani,D.,et al.,Translating the immunogenicity of prime-boostimmunization with ChAd63 and MVA ME-TRAP from malaria naive to malaria-endemic populations.Mol Ther,2014.22(11):p.1992-2003.

14.Ogwang,C.,et al.,Safety and immunogenicity of heterologous prime-boost immunisation with Plasmodium falciparum malaria candidate vaccines,ChAd63 ME-TRAP and MVA ME-TRAP,in healthy Gambian and Kenyan adults.PLoS One,2013.8(3):p.e57726.

15.Afolabi,M.O.,et al.,Safety and Immunogenicity of ChAd63 and MVAME-TRAP in West African Children and Infants.Mol Ther,2016.

16.Bliss,Viral Vector Malaria Vaccines Induce High-Level T Cell andAntibody Responses in West African Children and Infants.Mol Ther,2016.

17.Ewer,K.J.,et al.,Protective CD8+ T-cell immunity to human malariainduced by chimpanzee adenovirus-MVA immunisation.Nat Commun,2013.4:p.2836.

18.Hodgson,S.H.,et al.,Evaluation of the efficacy of ChAd63-MVAvectored vaccines expressing circumsporozoite protein and ME-TRAP againstcontrolled human malaria infection in malaria-naive individuals.J Infect Dis,2015.211(7):p.1076-86.

19.Ogwang,C.,et al.,Prime-boost vaccination with chimpanzeeadenovirus and modified vaccinia Ankara encoding TRAP provides partialprotection against Plasmodium falciparum infection in Kenyan adults.SciTransl Med,2015.7(286):p.286re5.

20.Rampling,T.,et al.,Safety and High Level Efficacy of theCombination Malaria Vaccine Regimen of RTS,S/AS01B With Chimpanzee Adenovirus63 and Modified Vaccinia Ankara Vectored Vaccines Expressing ME-TRAP.J InfectDis,2016.214(5):p.772-81.

21.Hahn,T.,Rapid manufacture and release of a GMP batch of Zaireebolavirus glycoprotein vaccine made using recombinant baculovirus-Sf9 insectcell culture technology.BioProcess J,2015.14(1):p.6.

22.Bejon,P.,et al.,A phase 2b randomised trial of the candidatemalaria vaccines FP9 ME-TRAP and MVA ME-TRAP among children in Kenya.PLoSClin Trials,2006.1(6):p.e29.

23.Rampling,T.,et al.,Safety and High Level Efficacy of theCombination Malaria Vaccine Regimen of RTS,S/AS01B with ChAd-MVA VectoredVaccines Expressing ME-TRAP.J Infect Dis,2016.

24.Lalvani,A.,et al.,Potent induction of focused Th1-type cellularand humoral immune responses by RTS,S/SBAS2,a recombinant Plasmodiumfalciparum malaria vaccine.J Infect Dis,1999.180(5):p.1656-64.

25.Seder,R.A.,et al.,Protection against malaria by intravenousimmunization with a nonreplicating sporozoite vaccine.Science,2013.341(6152):p.1359-65.

26.Ishizuka,A.S.,et al.,Protection against malaria at 1year andimmune correlates following PfSPZ vaccination.Nat Med,2016.22(6):p.614-23.

尽管在此参考附图详细公开了本发明的说明性实施例，但是应当理解，本发明不限于精确的实施例，并且本领域技术人员可以在其中实现各种改变和修改，而不脱离由所附权利要求及其等同物限定的本发明的范围。

Claims

1.一种组合物，其包含

多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：1(R21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或者由其组成，

其用于免疫对恶性疟原虫感染敏感的人类受试者，

其特征在于

2.一种组合物，包含

多肽，

其中所述多肽包含SEQ ID NO：1(R21)的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或者由其组成，

其用于免疫对恶性疟原虫感染敏感的人类受试者，

其特征在于

3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述组合物以每次施用至少一个5μg至20μg R21的剂量的给药方案施用给至少18岁的受试者，或以每次施用至少一个2.5μg至10μg R21的剂量的给药方案施用给小于18岁的受试者。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述组合物以每次施用至少一个10μg R21的剂量的给药方案施用给至少18岁的受试者，或以每次施用至少一个5μg R21的剂量的给药方案施用给小于18岁的受试者。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述给药方案包括两个剂量。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述给药方案包括三个剂量。

7.根据权利要求5或权利要求6所述的组合物，其中最终剂量含有第一剂量的R21量的10％-50％。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中最终剂量含有第一剂量的R21量的20％。

9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含佐剂，其中所述佐剂是Matrix-M，其中所述佐剂以R21：Matrix-M为1:1至1:50的比例存在。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述佐剂以R21：Matrix-M为1:2至1:25的比例存在。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述佐剂以R21：Matrix-M为1:5至1:10的比例存在。

12.根据权利要求4所述的组合物，其中所述剂量用于至少18岁的受试者时包含10至500μg佐剂，或用于小于18岁的受试者时包含5至250μg佐剂，其中所述佐剂是Matrix-M。

13.根据权利要求4所述的组合物，其中所述剂量用于至少18岁的受试者时包含20至200μg佐剂，或用于小于18岁的受试者时包含10至100μg佐剂，其中所述佐剂是Matrix-M。

14.根据权利要求4所述的组合物，其中所述剂量用于至少18岁的受试者时包含25至50μg佐剂，或用于小于18岁的受试者时包含5至50μg佐剂，其中所述佐剂是Matrix-M。

15.根据权利要求4或权利要求5所述的组合物，其中所述剂量用于至少18岁的受试者时包含约10μg R21和约50μg佐剂，或用于小于18岁的受试者时包含约5μg R21和约25μg佐剂，其中所述佐剂是Matrix-M。

16.根据权利要求5至15中任一项所述的组合物，其中所述剂量以1周至12周的间隔施用于所述受试者。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述剂量以4周的间隔施用给所述受试者。

18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含多肽，所述多肽包含SEQ IDNO：3(Rv21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：3具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或由其组成。

19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含病毒载体，所述病毒载体包含编码来自疟疾抗原的至少一个表位的核酸，所述疟疾抗原优选来自恶性疟原虫或间日疟原虫抗原。

20.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

21.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物是疫苗组合物。

22.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物能够在人体中诱导针对恶性疟原虫的保护性免疫应答。

23.一种试剂盒，其包含至少第一组合物和最终组合物，

所述第一组合物包含用于至少18岁的受试者时每次施用的1μg至20μg R21，或用于小于18岁的受试者时每次施用的0.5μg至10μg R21，所述组合物还包含佐剂，其中所述佐剂是Matrix-M，其中所述佐剂以R21：Matrix-M为1:1至1:50的比例存在；

所述最终组合物包含每次施用的10％-50％、优选20％的所述第一组合物的R21量，所述最终组合物还包含佐剂，其中所述佐剂是Matrix-M，其中所述佐剂以R21：Matrix-M为1:1至1:50的比例存在；以及

用于向人类受试者施用的说明书。

24.根据权利要求23所述的试剂盒，其还包含第二组合物，所述第二组合物与所述第一组合物相同。

25.包含R21的组合物在制备用于治疗/免疫易受恶性疟原虫感染的人类受试者的药物中的用途，

其特征在于

所述组合物用于至少18岁的受试者时包含每次施用至少一个1μg至20μg R21的剂量，或用于小于18岁的受试者时包含每次施用至少一个0.5μg至10μg R21的剂量。

26.根据权利要求25所述的用途，其中所述组合物还包含佐剂，其中所述佐剂是Matrix-M，并且其中所述佐剂以R21：Matrix-M为1:1至1:50的比例存在。

27.一种免疫易受恶性疟原虫感染的人类受试者的方法，包括向所述受试者施用包含多肽的组合物，所述多肽包含SEQ ID NO：1(R21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或者由其组成，其中所述多肽是病毒样颗粒(VLP)的形式，其中所述颗粒包含少于10％的游离乙型肝炎表面抗原蛋白，其中所述组合物以每次施用至少一个1μg至20μg R21的剂量的给药方案施用给至少18岁的受试者，或以每次施用至少一个0.5μg至10μg R21的剂量的给药方案施用给小于18岁的受试者。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述组合物还包含佐剂，其中所述佐剂是Matrix-M，并且其中所述佐剂以R21：Matrix-M为1:1至1:50的比例存在。

29.如前述任一项权利要求所述的组合物、试剂盒、用途或方法，其中所述给药方案包括向所述人类受试者施用所述多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：1(R21)的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或由其组成，其中所述多肽为病毒样颗粒(VLP)的形式，其中所述颗粒包含小于10％的游离乙型肝炎表面抗原蛋白，对于至少18岁的受试者，所述颗粒的量在0.0000125至0.0003333mg/Kg范围内，对于小于18岁的受试者，所述颗粒的量在0.00000625至0.001667mg/Kg范围内。

30.如前述任一项权利要求所述的组合物、试剂盒、用途或方法，其中所述施用为肌内施用。