KR20180052124A - 개선된 안정성 및 면역원성을 갖는 백신 조성물 - Google Patents

개선된 안정성 및 면역원성을 갖는 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명에는 백신에 사용하기 적합한 나노입자가 개시되어있다. 나노입자는 세제 코어에 둘러싸이고 결합되어 향상된 안정성과 우수한 면역원성을 제공하는 병원체의 항원을 제공한다. 백신 및 나노입자를 제조하기 위한 투여량, 제제 및 방법이 또한 개시된다.

Description

개선된 안정성 및 면역원성을 갖는 백신 조성물
본 발명은 일반적으로 면역 반응을 자극하는데 유용한 나노입자에 관한 것이다. 나노입자는 세제 코어와 결합된 항원, 예를 들어, 당단백질 항원을 제공하며 전형적으로 재조합 접근법을 사용하여 생산된다. 나노입자는 개선된 안정성 및 향상된 에피토프 제시를 갖는다. 본 발명은 또한 나노입자를 함유하는 조성물, 이의 생산 방법 및 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
전염병은 전 세계적으로 문제가 되고 있다. 일부 병원체에 대한 백신 개발에 대한 진전이 있었지만, 여러 병원체는 인체 건강에 위협이 되고 있다. 가장 악명 높은 HIV에 대한 백신은 파악하기 힘들다. 특정 병원체에 대한 백신을 생산하려는 시도가 있었으나 추가적인 병변을 유발하여 실패하였다. 특히 아프리카에서 전염병으로 산발적으로 발생하는 에볼라를 비롯한 다른 병원체이 문제가 되며 생명의 손실과 세계적 경제 충격을 초래한다. 인플루엔자 바이러스는 기존의 백신이 일부 보호를 제공하나 바이러스를 생산하는데 있어서 기술적인 문제를 제공하는 또 다른 바이러스이며 계절성 인플루엔자 백신이 부적절한 보호를 제공할 수 있다는 것을 의미한다.
효과적인 백신의 사용은 성취의 조합에 달려 있다. 백신은 유익한 충분한 양만큼 감염 또는 질병을 감소시키는 효과적인 면역 반응을 자극해야 한다. 백신은 냉장이 가능하지 않은 까다로운 환경에서 사용하기에 충분히 안정해야 한다.
따라서, 전 세계적으로 공중 보건 문제를 제기하는 바이러스에 대한 백신 생산에 지속적인 관심이 있고 우수한 안정성을 갖는 효과적인 백신을 생산할 필요가있다.
본 발명은 병원체에 대한 면역 반응을 유도하는데 적합한 나노입자를 제공한다. 나노입자는 효과적인 개선된 안정성뿐만 아니라 면역원성을 제공한다. 특정 양태에서, 병원체는 바이러스이고, 전형적으로 바이러스 나노입자를 생산하는데 사용되는 항원은 바이러스 당단백질이다.
한 양태에서, 본 발명은 강화된 안정성을 갖는 바이러스 단백질을 함유하는 나노입자를 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 비이온성 세제, 바이러스 당단백질 및 약학적 버퍼를 포함하는 나노입자를 포함하는 백신 조성물을 포함한다. 전형적인 실시태양에서, 비이온성 세제는 PS20, PS40, PS60, PS65 및 PS80으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시태양에서, 조성물은 임의의 유리 비이온성 세제를 포함하지 않는다. 하나 이상의 당단백질 항원 분자가 비이온성 세제를 함유하는 세제 코어를 둘러싸고 있으며, 이는 면역원성을 촉진하고 항원의 분해를 억제하는 나노입자 구조를 제공한다.
일부 실시태양에서, 항원은 RSV F 단백질, 인플루엔자 HA 단백질, 인플루엔자 NA 단백질 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 에볼라를 포함하여 다른 항원이 사용될 수 있다. 통상적으로, 항원은 당단백질이다.
선택적으로, RSV F 단백질은 삼량체 RSV F 단백질이다. RSV F 단백질은 중화 항체의 생산을 유도한다. 추가의 실시태양에서, 중화 항체는 융합 후 상태 및/또는 융합 전 상태에서 RSV F 단백질을 인식한다. 추가 양태에서, 각각의 PS80 입자는 4 내지 7개의 RSV F 단백질을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, RSV F 조성물은 15 mM 내지 25 mM의 농도의 인산 나트륨; 125 mM 내지 175 mM 사이의 농도의 NaCl; 0.25% 내지 2% w/v의 히스티딘을 포함할 수 있고; 조성물의 pH는 5.8 내지 7.2이다.
일부 실시태양에서, HA 또는 NA 인플루엔자 조성물은 15 mM 내지 25 mM의 농도의 인산 나트륨; 125 mM 내지 300 mM의 농도의 NaCl; 0.25% 내지 2% w/v의 히스티딘을 포함할 수 있고; 조성물 pH는 pH 6.8 초과이고 전형적으로 약 pH 8.0 미만이다.
일부 실시태양에서, 조성물은 항원보강제를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 항원보강제는 명반 또는 Martrix M™이다. 일부 실시태양에서, 조성물은 항원보강제를 포함하지 않는다.
일부 실시태양에서, 감염을 예방하는 방법은 1회 이상의 투여량의 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 방법의 일부 실시태양에서, 조성물의 단일 투여량의 조성물이 투여되고 보호 면역 반응을 유도한다. 본 방법의 일부 실시태양에서, 각각의 투여량은 약 100㎍ 내지 약 150㎍의 단백질 항원으로 구성된다. 본 방법의 추가 실시태양에서, 1회 이상의 투여량은 피하 투여된다. 본 방법의 일부 실시태양에서, 조성물은 항원보강제를 포함한다. 본 방법의 또 다른 실시태양에서, 항원보강제는 명반이다. 본 방법의 일부 실시태양에서, 조성물은 항원보강제가 없다.
본 방법의 일부 실시태양에서, 1회 이상의 투여량의 조성물이 성인에게 투여된다. 본 방법의 추가 실시태양에서, 성인은 여성이고 여성은 임신일 수 있다. 본 방법의 추가의 실시태양에서, 성인은 65세 초과 또는 60세 초과이다. 본 방법의 일부 실시태양에서, 1회 이상의 투여량의 조성물이 어린이에게 투여된다. 본 방법의 추가 실시태양에서, 어린이는 신생아 또는 유아이다.
RSV 백신의 경우, 일부 실시태양에서, 조성물은 적어도 3개의 RSV F 나노입자 유형의 이종 집단을 포함하며, 여기서 각 나노입자는 PS80을 포함하는 세제 함유 코어를 둘러싸는 적어도 하나의 RSV F 단백질 삼량체를 포함하며, 제 1 RSV F 나노입자 유형은 이방성 막대를 포함하며, 제 2 RSV F 나노입자 유형은 구형 올리고머를 포함하며, 제 3 RSV F 나노입자 유형은 이방성 막대 및 구형 올리고머의 중간체를 포함한다.
일부 실시태양에서, RSV F 단백질 나노입자를 제조하는 방법은 제 1 세제를 사용하여 숙주 세포로부터 RSV F 단백질 추출물을 제조하고 제 1 세제를 제 2 세제로 교환하는 단계를 포함하며, 여기서 제 2 세제는 PS80이고 나노입자는 향상된 안정성을 나타낸다. 본 방법의 추가 실시태양에서, 제 1 세제는 NP-9이다. 본 방법의 일부 실시태양에서, 향상된 안정성은 프로테아제 내성, 산화 스트레스 내성, 열 스트레스 내성 및 교반 내성으로부터 선택된다. 본 방법의 일부 실시태양에서, PS80:RSV F 단백질의 몰비는 약 35 내지 약 65이다.
일부 실시태양에서, RSV F 나노입자는 PS80 세제 코어와 결합된 하나 이상의 RSV F 단백질 삼량체를 포함한다. RSV F 나노입자는 동적 광 산란으로 측정한 약 20 nm 내지 약 60 nm의 평균 직경을 가진다. RSV F 나노입자의 일부 실시태양에서, 각각의 RSV F 단백질 삼량체는 SEQ ID NO: 2의 잔기 137-146에 상응하는 1 내지 10개의 아미노산이 결실된 RSV F 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 RSV F 단백질을 함유한다. RSV F 나노입자의 일부 실시태양에서, 각각의 RSV F 단백질 삼량체는 SEQ ID NO: 2의 137-146의 잔기에 상응하는 1 내지 10개의 아미노산이 결실된 RSV F 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 RSV F 단백질 및 불활성화된 1차 융합 절단 위치를 함유한다.
RSV F 나노입자의 일부 실시태양에서, RSV F 단백질은 잔기 137-146 또는 SEQ ID NO: 2에 상응하는 10개의 아미노산의 결실 및 133, 135 및 136번 위치에서 아르기닌 잔기의 글루타민으로의 돌연변이에 의한 1차 퓨린 절단 위치의 불활성화를 포함한다. RSV F 나노입자의 추가의 실시태양에서, RSV F 단백질은 성숙한 펩타이드인 SEQ ID NO: 19를 포함하거나 SEQ ID NO: 19로 이루어진다. RSV F 나노입자의 특정 실시태양에서, RSV F 단백질은 SEQ ID NO: 8을 포함하거나 SEQ ID NO: 8로 이루어진다. RSV F 나노입자를 함유하는 백신 제제는 일부 전장 펩타이드(SEQ ID NO: 8)를 갖는 성숙한 펩타이드를 실질적으로 포함한다. 시간이 지남에 따라, 단백질 분해로 인해 소량의 절단된 RSV F 펩타이드가 소량 발생할 수 있다. 그러나, 유리하게는, 본 발명에 개시된 RSV F 나노입자는 이러한 분해를 최소화하고 연장된 안정성을 제공한다.
또한, 본 출원은 향상된 열안정성 인플루엔자 나노입자를 개시한다. 종래의 인플루엔자 나노입자와는 달리, 본 발명에서 제공된 방법 및 조성물은 트립신에 대한 저항성 및 향상된 열안정성 및 면역원성을 나타낸다.
에볼라의 경우, 에볼라 바이러스 나노입자는 비이온성 세제 코어에 부착된 에볼라 바이러스 당단백질(GP) 삼량체뿐만 아니라 선택적으로 매트릭스 M 사포닌 항원보강제와 조합된 나노입자를 함유하는 백신 조성물을 포함한다. 또한, 본 발명은 에볼라 바이러스 나노입자 및 사포닌 항원보강제를 함유하는 조성물을 투여함으로써 인간의 에볼라 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 에볼라 감염으로부터 보호하는 방법도 제공된다.
유사하게, HA, NA 또는 둘다의 인플루엔자 단백질을 함유하는 나노입자가 제공된다. 적절한 접힘의 지표인 트립신 내성을 나타내는 HA 나노입자가 제공된다. 백신 제제에서 인플루엔자 나노입자를 사용하여 인플루엔자 감염으로부터 보호하는 방법도 제공된다.
본 발명의 내용 중에 포함된다.
도 1a 및 1b는 폴리펩타이드 서열을 수반하는 RSV F 단백질의 주요 단백질 구조를 도시한다. 도 1a는 야생형 RSV A2 균주 대 변형된 RSV F 단백질의 주요 단백질 구조를 도시한다. 퓨린 절단 위치는 삼각형으로 표시한다. 도 1b는 변형된 RSV F 단백질(SEQ ID NO: 19)의 아미노산 서열을 도시한다; F1 도메인(잔기 1-84)은 약하게 음영진 문자이고, F2 도메인(잔기 85-539)은 짙게 음영진 문자이며, 검은선은 이황화 결합을 형성하는 시스테인을 연결하며, 밑줄이 그어진 아스파라긴은 N-연결된 글리코실화 위치를 나타내며, 약하게 음염진 수직 점선은 퓨린 절단 위치를 나타내고, 짙게 음영진 수직 점선은 주요 절단 위치를 나타낸다.
도 2는 역상 HPLC에 의한 RSV F 단백질의 분리 피크를 도시하며, 여기서 4개의 주요 종이 확인되고 4개의 주요 피크에 상응한다. 최저 분자량 종(~51.2kDa - ~51.3kDa)을 포함하는 피크는 가용성 삼량체이다; 다음 피크는 지방산이 결여된 전장 삼량체(~64.5 kDa)를 포함하고, 최종 두 개의 주요 피크는 전장 삼량체이며 여기서 삼량체는 각각 팔미트올레산(~64.7kDa) 및 팔미트산(64.788kDa)을 각각 포함한다.
도 3은 환원성 SDS-PAGE에서 RSV F 단백질의 분리를 도시한다. 최대 분자량 단백질은 고 분자량 종, 이어서 F1 및 F2 도메인을 포함하는 변이체, 그런 후에, F1 도메인 및 이의 변이체, F2 도메인을 포함한다.
도 4는 RSV F 단백질의 1차 단백질 구조를 포함하는 아미노산의 90%를 커버하는 LC-UV 펩타이드 맵핑의 크로마토그램 출력을 도시한다. 조기 용출 펩타이드를 포함하는 결합된 서열 범위는 98%로 밝혀졌서, RSV F 단백질의 아미노산 서열을 확인하였다.
도 5는 형광 검출(FLD)과 조합된 HPLC를 사용하여 정제된 RSV F 단백질의 당 분석을 도시한다. 검출된 주요 글리칸 구조는 푸코실화된 Man3 글리칸이다.
도 6은 PS80의 코어와 결합된 RSV F 단백질 삼량체를 갖는 RSV F 나노입자의 전자 현미경사진을 특징으로 한다. 이 도면은 F1 및 F2 도메인의 배향, 팔리비주맙 항체에 의해 인식되는 항원 위치 II 및 팔미트산과 팔미톨레산과 같은 지방산을 추가로 포함하는 F1 도메인의 C- 및 N-말단을 특징으로 하는 단일 RSV F 단백질 삼량체의 특성을 추가로 도시한다.
도 7은 RSV F 나노입자의 입자 크기의 동적 광산란(DLS) 측정을 도시한다. DLS 측정은 나노입자의 크기가 사용 가능한 PS80과 RSV F 농도에 의해 조절된다는 것을 보여준다. 고정된 농도의 RSV F 농도에서 PS80의 증가는 평균 나노입자 크기(Z-ave)를 감소시킨다.
도 8은 샘플 농도 대 나노입자의 분자량의 이산 분자량 분포를 도시하며, 여기서 RSV F의 농도 및 PS80의 백분율은 변하다. 나노입자의 최대 신호 강도는 0.2% PS80과 1mg mL RSV F로 달성되며, 나노입자의 더 큰 균일성을 암시하고 PS80과 RSV의 농도 조합으로 입자 크기의 조절을 확인할 수 있다.
도 9a 및 9b는 다양한 PS80 백분율 및 RSV F 농도로 제조된 RSV F 나노입자 형태의 형상을 도시한다. 도 9a는 0.2% PS80 및 0.22mg/mL RSV F를 사용하는 조성물이 단량체/이량체 이방성 막대, 구형 올리고머 및 이들의 중간체의 3가지 주요 유형을 생산한다는 것을 나타낸다. 도 9b는 0.05% PS80 및 0.22mg/mL RSV를 사용하는 조성물은 단량체/이량체 이방성 막대에 의해 지배되는 집단을 생성하는 반면, 0.05% PS80 및 1.0mg/mL를 사용하는 조성물은 구형 올리고머에 의해 지배되는 집단을 생성한다는 것을 나타낸다.
도 10은 대조군과 비교된 상대적 풍부함으로 환원된 Lys-C 펩타이드 맵에서 제시된 바와 같이, 나노입자에서 RSV F 단백질의 특정 서브섹션에 대한 스트레스 인자의 영향을 도시한다. 스트레스 요인은 2주 동안 50℃, 1주 동안 25℃에서 pH 3.7, 1주 동안 25℃에서 pH 10, 1주 동안 25℃에서 과산화수소에 의한 단백질의 산화 및 1주 동안 25℃에서 교반이다.
도 11은 다양한 스트레스 조건에 노출된 항원 위치 2(팔리비주맙 위치)의 안정성을 예시한다. 백분율은 대조군과 비교된 상대적 풍부함으로 표시된다. 100% 이상에 가까울수록, 스트레스 조건에 비추어 탄력성이 더 커진다. 데이터는 나노입자가 우수한 항원 위치 일관성을 유지하여 안정한 면역 반응을 유지함을 예시한다. NSELLSLINDMPITNDQK/K; SEQ ID NO: 20 및 LMSNN(SEQ ID NO: 21)은 항원 위치 II의 일부이다.
도 12a, 12b, 12c 및 12d는 나노입자 조성물이 환경 스트레스에 노출된 후 뮤린 면역원성을 나타내는 것으로 RSV F 나노입자 조성물의 안정성을 도시한다. 마우스는 21일에 항-RSV F IgG에 대해, 35일에 PCA 역가에 대해, 35일에 RSV/A 중화 역가에 대해 샘플을 채취하였다. 도 12a는 -70℃ 제어에 대한 결과를 도시한다. 도 12b는 2주 동안 50℃에 노출된 조성물의 결과를 보여준다. 도 12c는 2주 동안 25℃에서 10의 pH에 노출된 조성물에 대한 결과를 도시한다. 도 12d는 1주 동안 25℃에서 0.5% 과산화수소에 노출된 조성물에 대한 결과를 도시한다.
도 13은 더 높은 PS80을 갖는 나노입자의 강화된 프로테아제 내성을 도시한다. 18개월의 기간 동안, 더 높은 PS80 백분율(0.03%)의 존재하에서 제제화된 RSV F 나노입자는 SDS-PAGE에 의해 평가된 바와 같이, 더 낮은 PS80 백분율(0.015%)의 존재하에서 제제화된 RSV F 나노입자에 비해 적은 프로테아제 분해를 나타내었다. 또한, 더 적은 고 분자량(HMW) 구조가 더 높은 PS80 양으로 관찰되었다.
도 14는 RSV F 나노입자 대 RSV F A 균주 바이러스 단백질에 결합하는 mAb의 비교를 도시하며, 여기서 위치 I, II 및 IV 항체에 대한 평형 해리 상수는 각 위치에서의 mAb 항체 결합이 필적할만하다는 것을 나타낸다.
도 15는 위약 조건, RSV/A 감염, 포름알데하이드 불활성화 RSV, RSV F 나노입자 및 명반을 갖는 RSV F 나노입자에 노출된 코튼 래트의 혈청에 존재하는 항체가 위치 I, II 및 IV에 대한 결합시에 서로에 대해 비교되는 경쟁 결합 분석의 결과를 나타낸다.
도 16은 본 발명에 개시된 나노입자 제조 방법에 대한 공정 흐름도를 예시한다.
도 17은 본 발명에 개시된 HA 나노입자 제조 방법에 대한 흐름도를 예시한다. 바큘로바이러스-발현된 HA를 함유하는 Sf9 세포가 성장된 후 HA는 비-이온성 세제 NP9를 사용하여 추출된다. 추출물은 렉틴 친화성 칼럼에 대한 연속 정제 및 세제 교환 단계를 거쳐 여과되고 벌크 약물 물질로 제제화된다.
도 18a 내지 도 18f는 일례로서 HA 당단백질을 사용하여 인플루엔자 나노입자를 생산하는 방법을 사용하여 얻어진 단계 및 결과를 예시한다. 도 18a는 세포 용해 및 정제된 나노입자를 제공하기 위해 사용된 3개의 칼럼(TMAE(트라이메틸아미노에틸), 이후 렌틸 렉틴, 이후 황산염(SO3-) 칼럼)을 통한 세포 감염으로부터의 순차적 정제 단계를 나타낸다. 도 18b는 TMAE 컬럼을 사용하여 얻어진 크로마토그램을 예시한다. 도 18c는 렌틸 렉틴 컬럼 정제 단계를 사용하여 얻어진 크로마토그램을 예시한다. 도 18d는 황산염 칼럼 정제 단계를 사용하여 얻어진 크로마토그램을 예시한다. 도 18e는 TMAE 및 LL 칼럼 스테이지의 겔(우측 상부 패널)을 도시한다. 하부 패널은 겔의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 레인은 왼쪽 상부 패널에 표시된 바와 같다. 도 18f는 S03-컬럼으로부터의 용출물을 갖는 겔을 나타낸다.
도 19a 내지 19j는 상이한 아형을 사용하고 상이한 곤충 세포주에서 생산된 HA 나노입자의 순도 분석을 예시한다. 도 19a는 겔, HA에 대한 웨스턴 블럿 및 A/뉴햄프셔/1/2015 HA를 함유하는 HA 나노입자에 대한 gp64를 나타낸다. 도 19b는 HA 밴드의 정량화를 도시하며, HA는 농도계에 의해 99.1% 순수하다는 것을 나타낸다. 도 19c는 겔, HA에 대한 웨스턴 블럿, 및 A/스위스/9715293/2013 HA를 함유하는 HA 나노입자에 대한 gp64를 나타낸다. 도 19d는 HA 밴드의 정량화를 도시하며, HA는 농도계에 의해 94.5% 순수하다는 것을 나타낸다. 도 19e는 겔, HA에 대한 웨스턴 블럿 및 A/홍콩/4801/2014 HA를 함유하는 HA 나노입자에 대한 gp64를 도시한다. 도 19f는 HA 밴드의 정량화를 도시하고, HA가 농도계에 의해 93.3% 순수하다는 것을 나타낸다. 도 19g는 겔, HA에 대한 웨스턴 블럿 및 Sf9 및 Sf22a 세포에서 B/푸켓/3073/2013 HA를 함유하는 HA 나노입자에 대한 gp64를 나타낸다. 오른쪽 패널은 HA 밴드의 정량화를 나타내며 HA는 농도계에 의해 95.4% 순수하다는 것을 나타낸다. 도 19h는 겔, HA에 대한 웨스턴 블럿, 및 Sf9 세포에서 B/브리스번/60/2008HA를 함유하는 HA 나노입자에 대한 gp64를 나타낸다. 오른쪽 패널은 HA 밴드의 정량화를 나타내며 HA는 농도계에 의해 96.7% 순수하다는 것을 나타낸다. 도 19i는 RP-HPLC를 사용하여 HA 순도를 측정한다. 도 19j는 3개의 인플루엔자 A 아형과 2개의 인플루엔자 B 아형을 사용하는 HA 나노입자에 대한 데이터를 요약한다.
도 20은 전자 현미경 사진에서 HA 나노입자를 나타낸다.
도 21a 및 21b는 HA 나노입자에 대한 cryoEM 구조 상의 HA 삼량체(도 21a) 및 HA 및 NA 단백질 모두를 함유하는 인플루엔자 VLP에 대한 HA 삼량체(도 21b)의 도킹의 비교를 나타낸다.
도 22는 RSV F 나노입자 및 대표적인 HA 나노입자를 함유하는 조합 나노입자 조성물을 사용한 연구를 예시한다.
도 23a 내지 23f는 도 22의 연구에 따라 얻은 결과를 도시한다. 도 23a는 동종 균주에 대한 HAI 역가를 나타낸다. 도 23b는 이종성 균주에 대한 이종성 HAI 역가를 나타낸다. 도 23c는 팔리비주맙 경쟁 항체를 나타낸다. 도 23d는 RSV A 균주에 대한 중화 항체를 나타낸다. 도 23e는 RSV F 단백질에 대한 T 세포 반응을 나타낸다. 기질-항원보강 나노입자로 얻을 수 있는 반응은 두드러진다. 도 23f는 인플루엔자 단백질에 대한 T 세포 반응을 나타낸다.
도 24a-24c는 향상된 안정성을 갖는 HA 나노입자를 얻는 방법 및 결과를 예시한다. 특히, 이 정제 과정에서의 pH 범위는 pH 7.0 내지 pH 7.4의 중성 범위이다. 도 24a는 HA 단백질을 발현하는 해동된 세포를 대량 약물 물질(BDS) 생성물을 사용하여 정제하는 단계를 도시한다. 도 24b는 A/뉴 햄프셔/1/2015 변형을 사용하여 대표적인 나노입자로부터의 크로마토그램 궤적을 나타낸다. 칼럼으로부터의 유출물은 세척액과 같이 버려진다. 도 24c는 렌틸 렉틴 컬럼 상의 세제 교환 단계에 대한 크로마토그램 궤적을 나타내다. 용출은 0.01% PS80으로 수행된다. 버퍼는 A1: 25mM 인산 나트륨, pH 7.2, 150mM NaCl, 0.01% PS80, A2: 25mM 인산 나트륨, pH 7.2, 500mM NaCl, 0.5% NP9, A3: 25mM 인산 나트륨, pH 7.2, 150mM NaCl, 0.1% PS80, B1: 25mM 인산 나트륨, pH 7.2, 150mM. 그런 후에, HA 나노입자를 농축시키고 도 24a에 도시된 바와 같이 0.05% PS80 버퍼에 저장된다.
도 25a 내지 25d는 몇몇 균주로부터의 트립신-내성 나노입자의 정제 결과를 나타낸다. 도 25a는 H1N1 아형 A/뉴 햄프셔/1/ 2015에 대한 대표적인 균주를 나타낸다. 도 25b는 B형 인플루엔자, B/브리스번/60/08 HA에 대한 대표적인 균주를 나타낸다. 도 25c는 H1N1 아형 A/뉴 햄프셔/1/2015에 대한 대표적인 균주를 나타낸다. 각각의 경우에 데이터는 높은 수준의 생산 및 우수한 순도를 나타낸다. 도 25d는 저 pH, 약 pH 6.0에 노출시키는 공정을 사용하여 제조된 트립신 내성 나노입자 대 나노입자의 시차 주사 열량계(DSC) 비교를 제공한다. DSC 데이터는 중성 pH 공정을 통해 열 안정성을 나타내어 나노입자의 HA 단백질이 적절하게 접혀 있음을 입증한다.
도 26a-26c는 Sf9 세포에서 발현된 여러 균주로부터의 트립신 내성 나노입자의 향상된 트립신 내성 결과를 나타낸다. Sf9 곤충 세포에서 제조된 정제 HA 나노입자는 HA0이다. 트립신에 노출되면 HA0은 H1의 Arg AA344에서 HA1 및 HA2로 절단된다. 올바르게 접힌 HA 삼량체는 증가하는 농도의 트립신과 함께 배양될 때 추가 분열에 저항할 것이다. 도 26a는 중성 pH 정제된 B/브리스번/60/08이 트립신에 내성이므로 올바르게 접혀진 상태(왼쪽 패널)이고 산성 pH 정제된 B/브리스번/60/08 HA1은 트립신 민감성이므로 잘못 접혀있다(오른쪽 패널). 도 26b는 A/홍콩/4801/2014의 산 정제되나 중성 정제되지 않은 HA 나노입자가 잘못 접혀진 것을 나타낸다. 도 26c는 중성 pH A/뉴햄프셔/1/2015(H1N) HA 나노입자의 트립신 내성을 나타낸다. 상응하는 산 pH 정제된 나노입자는 트립신 민감성이었다(미 도시).
도 27은 상업적 계란 정제된 인플루엔자 백신(왼쪽 패널) 및 상업 재조합 인플루엔자(오른쪽 패널)의 트립신 민감성을 나타낸다. HA0은 왼쪽 패널에서 HA1 및 HA2로 분할된다. 제대로 접힌 HA1은 그러나 추가 트립신에 내성이 있다. 대조적으로, 상업적 재조합 백신은 HA1이 트립신에 의해 분해되어, 잘못 접힌 단백질이 백신에 존재함을 나타낸다.
도 28a-28c는 항체의 유도 및 감염으로부터의 보호를 나타낸다. 5㎍의 EBOV/Mak GP, 50㎍의 AlPO4로 항원보강된 5㎍의 EBOV GP, 또는 5㎍의 매트릭스-M으로 항원보강된 5㎍의 EBOV/Mak GP로 0, 14, 28일에 마우스에게 면역화시켰다. 혈청을 28일에 수득하고 항-EBOV/Mak GP IgG(도 28a) 또는 항-에볼라 바이러스 중화 항체(도 28b)에 대해 ELISA로 평가하였다. 검정 막대는 GMT 그룹을 나타내며 오차 막대는 GMT의 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 42일에, 마우스를 1,000 pfu 마우스에 적응시킨 자이르 에볼라(Zaire Ebola) 바이러스 1976 마인가(Mayinga) 균주에 감염시켰다. 면역성 검사 후에, 마우스를 21일 동안 이환율 및 사망률에 대해 매일 관찰하였다. 도 28c는 감염된 마우스에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다.
도 29a-29c는 매트릭스-M 향상된 EBOV/Mak GP-특이적 IgG 및 IgG 서브 클래스 반응을 나타낸다. 마우스를 5일에 0 및 21일에 5㎍의 EBOV/Mak GP 단독으로 또는 2.5 또는 5㎍ 매트릭스-M 또는 50μg AlPO4와 함께 IM으로 면역화시켰다. 마우스는 PBS를 위약 대조군으로 투여 받았다. 첫 번째 주사 후 21일, 28일 및 60일에 혈청 샘플을 수집하고 EBOV/Mak GP-IgG(도 29a), IgG1(도 29b) 및 IgG2a(도 29c)에 대해 테스트하였다. 결과는 두 가지 별도의 실험을 나타낸다. 검정 막대는 GMT 그룹을 나타내며 오차 막대는 GMT의 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 30a-30d는 매트릭-M 유도된 강한 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 반응 및 다기능 T 세포를 갖는 에볼라 나노입자를 나타낸다. 비장 세포는 전체 GP 서열을 포함하는 에볼라/Mak GP 펩타이드 풀로 자극하였다. 배양액 또는 PMA(50ng/ml)와 아이오노마이신(200ng/ml)을 음성 및 양성 대조군으로 사용하였다. 28일(도 30a) 및 60일(도 30b)의 IFN-γ 양성 반점을 ELISPOT 판독기 및 관련 소프트웨어로 계수하고 분석하였다. 배지 대조군의 백그라운드 수는 펩타이드-자극된 웰의 수로부터 감산되었고, 평균은 3회로부터 유도되었다. 28일에 동일한 그룹의 총 5 마리 쥐의 세포를 풀링하고 BD Golgi-stop/Golgi-plug의 존재하에 37℃에서 6시간 동안 배지 단독 또는 GP 펩타이드 풀 또는 PMA와 아이오노마이신으로 배양하였다. 이어서, 세포를 수확하고 세포 표면 마커 및 세포내 사이토카인을 염색하였다. 사이토카인의 빈도는 라이브 CD3+CD44+CD62-CD4+이펙터 메모리 T 세포 또는 라이브 CD3+CD44+CD62-CD8+이펙터 메모리 T 세포에 개폐함으로써 플로우조(Flowjo) 소프트웨어 및 플로우조 부리안(Boolean) 기능을 사용하여 분석하였다. (도 30c 및 30d) 단일 사이토카인, 이중 사이토카인 또는 삼중 사이토카인에 대한 값은 3개의 사이토카인(IFN-γ, TNFα 및 IL-2) 중 임의의 하나, 세 개의 사이토카인 중 임의의 둘 또는 모든 세 개의 사이토카인을 발현하는 세포의 빈도의 합을 나타낸다. 결과는 두 개의 별도 실험을 나타낸다. 검은 막대는 그룹 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 31a-31e는 매트릭스-M 향상된 종자 중심(GC) 세포 반응을 나타낸다. GC B 세포에 대해 신선한 비장세포를 염색하고 재료 및 방법에 설명된 바와 같이 데이터를 수집하였다. 데이터는 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 죽은 세포는 인비트로겐 LIVE/DEADTM 고정 노란색 염료에 의한 분석에서 제외하였다. (도 31a), GC 세포는 B220+ B 세포 게이트 상에 CD95+ GL-7+로 정의되었고, 대표적인 마우스의 도트 플롯에서의 수는 28일에 동일한 그룹에서 모든 5 마리 마우스 모두로부터의 GC 빈도의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 각각의 마우스로부터의 GC 세포 빈도는 28일(도 31b) 및 60일(도 31c) 동안 나타난다. 28일(도 31d) 및 60일(도 31e)로부터 비장 당 절대 GC 세포 수는 비장에서 비장세포의 총 수 내의 GC 세포의 빈도를 곱하여 계산하였다. 검은 막대는 그룹 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 32a 내지 32e: 매트릭스-M은 비장에서 TFH 세포의 빈도 및 절대 수를 향상시켰다. B220-CD49b-CD3+CD4+ T 세포 게이트 내의 CXCR5+PD-1+ T 세포로 정의된 TFH 세포는 28일 및 60일에 비장에서 동정되었다. 각 그룹으로부터의 TFH 세포 분석의 대표적인 도트 플롯이 도시되어 있다(도 32a). 도트 플롯의 숫자는 28일로부터의 평균 빈도 및 표준 편차이다. 28일(도 32b) 및 60일(도 32d)로부터 CD4+ T 세포 집단 내의 TFH 세포의 빈도가 도시된다. 28일(도 32c) 및 60일(도 32e)의 비장 당 절대 TFH 세포 수는 비장에서 비장세포의 총 수 내의 TFH 세포의 빈도를 곱하여 계산하였다. 검은 막대는 그룹 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 33a-33b는 골수에서 매트릭스-M 유도된 장수명 플라즈마 세포를 나타낸다. 비장과 골수 세포를 EBOV/Mak GP 코팅된 ELISPOT 플레이트에서 밤새 배양하였다. 염소-항-마우스 IgG-HRP와 함께 배양한 후, 반점(spot) 발달에 의해 EBOV/Mak GP-특이적 IgG 반점을 검출하였다. 반점 수는 ELISPOT 판독기를 사용하여 계수하고 분석하였다. 백만 세포 당 항체 분비 세포(ASC)의 수가 나타내어진다. (도 33a) 비장에서 60일 EBOV/Mak GP-IgG ASC; (도 33b) 골수에서 60일 EBOV/Mak GP-IgG 골수 내 ASC 수. 검은 막대는 그룹 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 34a-34b는 에볼라 당단백질의 특징을 나타낸다. 도 34a는 도메인 구조를 나타낸다. 도 34b는 절단 신호 펩타이드 및 성숙 단백질의 N- 및 C-말단, 및 퓨린 절단 서열(SEQ ID NO: 22)을 갖는 GP의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 35a 내지 35c는 본 발명의 나노입자의 전자 현미경 사진을 나타낸다. 도 35b는 코어에 부착된 삼량체의 5개 복제물까지의 비 이온성 세제 코어를 예시한다. 일부 경우에, 추가 삼량체가 평면을 벗어났다. 도 35c는 현미경 사진으로부터 나노입자 상에 GP 삼량체가 중첩된 도킹 연구를 나타낸다.
도 36은 에볼라 나노입자를 검출하기 위한 3개의 단일 클론 항-에볼라 항체의 능력을 예시한다.
도 37은 에볼라 GP 나노입자(SEQ ID NOs: 23-25)의 에피토프에 대한 항체의 결합에 대한 표면 플라스몬 공명(SPR) 데이터를 나타낸다.
도 38은 본 발명의 나노입자에 대한 13C6 항체의 높은 잠재성을 예시한다.
도 39는 개코원숭이 면역원성 연구 설계를 예시한다. 그룹 1은 항원보강제가 없는 60㎍ GP 나노입자이었다. 그룹 2는 60μg의 GP 나노입자와 800μg의 AlPO4 항원보강제이었다. 그룹 3은 60μg의 GP 나노입자와 50μg의 매트릭스-M 항원보강제이었다. 그룹 4는 5μg GP 나노입자와 50μg의 매트릭스-M 항원보강제이었다.
40a-40b는 도 39의 개코원숭이 면역원성 연구 결과를 예시한다. 21일에, EC90 역가는 그룹 2 및 3에 대해 증가되었다. 도 40a 역가는 두 그룹에서 거의 동일하고 마코나(Makona) 에볼라 바이러스와 에볼라 자이레 균주의 프로토타입 변형 인 마인가 균주로부터의 당단백질을 함유하는 나노입자에 대해 동일하였다. 31일에, 면역 반응은 모든 경우에, 특히 GP 및 매트릭스 M 항원보강제를 함유하는 조성물에 대해 뚜렷하였다. 특히, GP(5μg)의 낮은 투여량이 실행되었을 뿐만 아니라 더 높은 투여량(60μg)은 매트릭스-M의 용량 절약 효과를 강조한다.
도 41은 나노입자 조성물에 의해 성취된 내구성 면역 반응을 예시한다. 0일 및 21일 투여 후 IgG에 대한 EC50 GMT 반응에 도시된 데이터. GP 및 매트릭스-M을 갖는 나노입자는 명반 항원보강제보다 우수한 반응을 나타내며 반응은 시간이 지남에 따라 높게 유지된다.
도 42는 IFNγ 방출 세포를 포함하는 면역 반응의 자극을 예시한다. 5㎍ GP 나노입자와 결합된 매트릭스 M은 최대 반응을 나타내었고 그 다음으로 더 높은 투여량의 GP 나노입자(60㎍)가 이어진다. 명반을 사용하면 IFN-γ을 분비하는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 낮지만 검출 가능한 증가가 나타났다.
도 43은 본 발명에 개시된 GP 나노입자를 함유하는 백신 조성물을 투여한 개코원숭이로부터 분리된 CD4+ 및 CD8+ T-세포로부터의 IFN-γ 및 TNF-α 방출 프로파일을 예시한다.
도 44는 본 발명에 개시된 GP 나노입자를 함유하는 백신 조성물을 투여한 개코원숭이로부터 분리된 T-세포로부터의 사이토카인 방출 프로파일을 예시한다. 상기 데이터는 매트릭스 M-항원보강된 GP 나노입자 조성물이 광범위한 사이토카인 방출 프로파일을 갖는 면역 반응을 자극함을 보여준다.
도 45는 필리핀 원숭이에서 수행된 백신 시험 디자인을 나타낸다. 동물에게 0일 및 21일에 5μg의 GP + 50μg의 매트릭스-M의 백신 조성물을 투여하고 42일에 면역성 검사를 하였다. 동물 33360, 33362 및 33355은 백신 조성물로 치료되었다. 위약은 동물 33356에 투여되었다.
도 46은 필리핀 원숭이 실험에서 얻어진 IgG 역가를 나타낸다. 28일까지, EC50 역가는 105를 초과하였다.
도 47은 치료된 필리핀 원숭이로부터 분리된 IFN-γ 분비 PBMC 세포의 유도를 나타낸다. 에볼라 자이레 GP로부터 유래된 펩타이드를 풀하고 분석에 사용하였다. 자이레와 수단 균주에서 유래된 컨센서스 펩타이드도 테스트되었다. 도시된 데이터는 0주(상부 패널), 3주(중간 패널) 및 5주(하부 패널)에 이들 펩타이드에 반응하는 세포를 예시한다. 위약으로 주사한 대조군 동물은 본질적으로 반응이 없었다. 대조적으로, 백신-치료 동물은 테스트된 다양한 펩타이드에 반응하여 IFN-γ를 방출하는 세포에서 강한 증가를 나타내었다
도 48은 필리핀 원숭이의 바이러스 부하 및 생존을 나타낸다. 면역성 검사 후 7일에 위약 동물은 에볼라 감염을 나타내는 바이러스 핵산의 실질적인 증가를 나타내었다. 9일에 동물을 안락사시켰다. 모든 예방 접종된 동물은 살아 남았다. 단지 동물 33360이 바이러스 핵산의 검출 가능한 증가를 나타내었고, 이는 검출 한계에 관한 것이었다. 10일에, 한 동물에서조차, 바이러스 RNA 수준이 이를 탐지하는 RT-PCR의 능력 아래로 떨어졌다.
도 49는 추가적인 필리핀 원숭이 연구를 위한 백신 테스트 디자인을 나타낸다. 동물에게 식염수 또는 5 μg GP + 50 μg 매트릭스-M을 투여하였다. 그룹 F는 0주 및 6주에 백신 접종을 받았다. 그룹 G는 0주 및 3주에 백신 접종을 받았다. 두 그룹 모두는 부스트 백신의 투여 6주 후에 면역성 검사를 받았다.
도 50은 두 번째 연구 결과를 나타낸다. 두 그룹 모두에서, 항-에볼라 GP에 실질적인 증가가 얻어졌다. 생 바이러스에 의한 면역성 검사 18일에, 생리 식염수 대조군 동물에 대한 생존율은 0%이었다. 반대로 그룹 F 과 G의 각각의 두 동물은 생존하여 백신 조성물이 보호 효과가 있었다는 것을 입증하였다.
본 발명은 면역 반응을 유도하기 위한 나노입자, 이의 제조 및 투여 방법 및이를 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다. 나노입자는 세제 코어를 둘러싸고 결합된 항원을 제공하여 수많은 측정을 통해 안정성이 향상된 구조를 초래한다. 세제 코어 및 항원은 항원 및 세제의 특성에 의해 매개되는 물리 화학적 상호작용을 통해 결합된다. 또한, 나노입자는 이론에 구애됨이 없이 세제 코어 주위의 항원 배향으로 인한 것으로 생각되는 면역계에 특히 우수한 항원 제시를 제공한다.
한 태양에서, 본 발명은 재조합 바이러스 당단백질 나노입자를 함유하는 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, 당단백질은 적합한 숙주 세포에서 재조합적으로 발현된다. 한 실시태양에서, 숙주 세포는 곤충 세포이다. 예시적인 실시태양에서, 곤충 세포는 Sf9 세포이다.
특별한 양태에서, 본 발명은 당단백질이 삼량체의 형태이고 각 나노입자가 비이온성 세제 코어와 결합된 적어도 하나의 삼량체를 함유하는 나노입자 구조에서 하나 이상의 바이러스 당단백질 종을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, 나노입자는 단지 하나의 병원체으로부터의 바이러스 당단백질과 같은 항원으로 구성된다.
나노입자는 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상에게 나노입자를 함유하는 조성물의 면역학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 나노입자를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 조성물은 다중 병원체으로부터의 항원을 갖는 나노입자를 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 백신 조성물은 동일한 종의 바이러스로부터의 하나 이상의 바이러스 균주로부터의 항원을 갖는 나노입자를 함유할 수 있다. 양태에서, 백신 조성물은 상이한 바이러스 종으로부터의 항원을 갖는 나노입자를 함유할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 백신 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 나노입자를 조성물에 첨가하는 단계를 포함하여 포유 동물에게 감염 또는 적어도 하나의 질병 증상에 대한 면역을 유도하는 백신 조성물을 제제화하는 방법을 제공한다. 개시된 나노입자는 감염 물질에 대해 면역성 또는 실질적인 면역을 제공하는 면역 반응을 자극하는 조성물을 제조하는데 유용하다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 유효량의 나노입자를 투여하는 단계를 포함하여, 대상에서 감염 또는 적어도 하나의 질병 증상에 대한 면역을 유도하는 방법을 제공한다.
일부 실시태양에서, 나노입자는 항원보강제와 함께 투여된다. 다른 양태에서, 나노입자는 항원보강제 없이 투여된다. 일부 양태에서, 항원보강제는 비공유 상호작용에 의해 나노입자에 결합될 수 있다. 다른 양태에서, 항원보강제는 나노입자와 함께 투여되지만 항원보강제 및 나노입자는 실질적으로 상호작용하지 않는다.
또한, 나노입자 및 백신 조성물을 제조하는 방법이 본 발명에 제공된다. 유리하게는, 상기 방법은 바큘로바이러스/Sf9 시스템에서 단백질의 재조합 발현과 관련된 단백질과 같은 다른 단백질에 의한 오염이 실질적으로 없는 나노입자를 제공한다.
정의
본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에 명백하게 달리 지시되어 있지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "단백질"에 대한 언급은 하나의 단백질 또는 이러한 단백질의 혼합물을 의미할 수 있고, "방법"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 등가 단계 및/또는 방법에 대한 언급을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "항원보강제"는 면역원과 조합하여 사용될 때, 면역원에 대해 유도된 면역 반응을 증가시키거나 변경시키거나 변형시키는 화합물을 의미한다. 면역 반응의 변형은 항체 및 세포 면역 반응의 하나 또는 모두의 특이성을 강화시키거나 확대시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 수치에 선행할 때 용어 "약" 또는 "대략"은 ±10%의 범위 값을 나타낸다. 예를 들어, "약 100"은 90과 110을 포함한다.
본 발명에 사용된 용어 "면역원", "항원" 및 "에피토프"는 당단백질을 비롯한 단백질 및 면역 반응을 유도할 수 있는 펩타이드와 같은 물질을 의미한다.
본 발명에 사용된 "면역원성 조성물"은 대상에 대한 조성물의 투여가 항원에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 대상에서 발현을 초래하는 항원을 포함하는 조성물이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "아형" 조성물, 예를 들어 백신은 하나 이상의 선택된 항원을 포함하나 병원체의 모든 항원을 포함하지 않는다. 이러한 조성물은 손상되지 않은 바이러스 또는 이러한 세포 또는 입자의 용해물을 실질적으로 함유하지 않고 전형적으로 병원체로부터의 적어도 부분적으로 정제된, 종종 실질적으로 정제된 면역원성 폴리펩타이드로부터 제조된다. 본 발명에 개시된 아형 조성물에서 항원은 종종 바큘로바이러스 시스템을 사용하여 통상적으로 재조합적으로 제조된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "실질적으로"는 물질이 이것이 함유된 샘플의 큰 백분율을 구성하는 물질(예를 들어, 화합물, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드)의 분리를 의미한다. 예를 들어, 한 샘플에서, 실질적으로 정제된 성분은 샘플의 85%, 바람직하게는 85%-90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%-99.5% 및 가장 바람직하게는 99%를 포함한다. 성분이 실질적으로 대체되는 경우, 샘플에 남아있는 양은 약 0.5% 내지 약 10% 이하, 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 1.0% 이하이다.
본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"는 유익한 또는 바람직한 결과, 예를 들어 임상 결과를 얻는 접근법을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 유익한 또는 바람직한 결과는 감염 또는 질병의 개시 또는 진행을 억제 또는 억압; 감염 또는 질병의 증상의 발현을 개선 또는 감소; 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 "예방(prevention)"은 "예방(prophylaxis)"과 상호교환적으로 사용되며 감염 또는 질병의 완전한 예방 또는 그 감염 또는 질병의 증상의 발현의 예방; 감염 또는 질병 또는 증상의 개시 지연; 또는 이후에 발현된 감염 또는 질병 또는 이의 증상의 심각성의 감소를 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 "유효 투여량" 또는 "유효량"은 병원체 감염의 적어도 하나의 증상을 감소시키는 면역 반응을 유도하기에 충분한 면역원의 양을 의미한다. 유효 투여량 또는 유효량은 예를 들어 중화 분비물 및/또는 혈청 항체의 양을, 예를 들어 플라크 중화, 보체 고정, 효소-결합 면역 흡착제(ELISA) 또는 미세중화 분석에 의해 측정함으로써 결정될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "백신"은 보호 면역(예를 들어, 병원체에 의한 감염에 대항하여 대상을 보호 및/또는 병원체에 의한 감염에 의해 유발된 질병 또는 상태의 심각성을 감소시키는 면역)을 제공하는 병원체에 대항하는 면역 반응을 유도하는데 사용되는 병원체로부터 유래된 면역원과 같은 면역원성 조성물을 의미한다. 보호 면역 반응은 항체의 형성 및/또는 세포-매개 반응의 형성을 포함할 수 있다. 문맥에 따라, 용어 "백신"은 보호 면역을 만들기 위해 척추 동물에게 투여되는 면역원의 현탁액 또는 용액을 의미할 수도 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "대상"은 인간 및 다른 동물을 포함한다. 통상적으로, 대상은 인간이다. 예를 들어, 대상은 성인, 십대, 어린이(2세 내지 14세), 유아(1개월 내지 24개월) 또는 신생아(1개월까지)일 수 있다. 일부 양태에서, 성인은 65세 이상, 또는 약 60세 이상의 노인이다. 일부 양태에서, 대상은 임산부 또는 임신하려고 하는 여성이다. 다른 양태에서, 대상은 인간이 아니며; 예를 들어, 비인간 영장류; 예를 들어, 개코원숭이, 침팬지, 고릴라 또는 필리핀 원숭이이다. 특정 양태에서, 대상은 개 또는 고양이와 같은 애완 동물일 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 포유류 및 더욱 구체적으로 인간에서의 사용을 위해 미국 연방 정부 또는 주정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전, 유럽 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 것을 의미한다. 이러한 조성물은 척추 동물에서 보호 면역 반응을 유도하기위한 백신 및/또는 항원 조성물로서 유용할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "약"은 표시된 수치의 ±10%를 의미한다.
개요
병원체로부터 유래된 항원은 개선된 안정성 및 우수한 면역원성을 갖는 세제 코어를 둘러싸는 나노입자를 제공하기 위해 비이온성 세제와 결합된다. 본 발명은 또한 병원체에 대항하여 대상에게 백신접종하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, 병원체는 바이러스이다. 항원은 전형적으로 단백질, 종종 당단백질이다. 또한, 백신 조성물로서 사용되는 나노입자를 함유하는 조성물이 본 발명에 개시된다. 나노입자를 생산하는 방법 및 백신 조성물을 생산하는 방법도 개시된다.
나노입자의 구조와 형태
본 발명의 나노입자는 비이온성 세제 코어와 결합된 항원을 포함한다. 도 6 상단 패널은 세제 코어와 결합된 여러 RSV F 항원의 한 예를 예시한다. 도 35는 에볼라 나노입자를 나타낸다. 유리하게는, 나노입자는 향상된 안정성을 제공하도록 환경 응력에 대한 개선된 내성을 갖는다.
특정 실시태양에서, 나노입자는 비이온성 세제 코어를 둘러싸는 다수의 단백질 삼량체로 구성된다. 예를 들어, 각각의 나노입자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 15개 삼량체를 함유할 수 있다. 전형적으로, 각각의 나노입자는 2 내지 9개 삼량체를 함유한다. 특정 실시태양에서, 각각의 나노입자는 2 내지 6개 삼량체를 함유한다. 본 발명에 개시된 조성물은 상이한 수의 삼량체를 갖는 나노입자를 함유할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 삼량체의 수가 2 내지 9인 나노입자를 함유할 수 있으며; 다른 실시태양에서, 조성물 중의 나노입자는 2 내지 6개 삼량체를 함유할 수 있다. 특정 실시태양에서, 조성물은 나노입자 당 2 내지 6개 삼량체 또는 나노입자 당 2 내지 9개 삼량체를 갖는 나노입자의 이종 집단을 함유한다. 다른 실시태양에서, 조성물은 나노입자의 실질적으로 동종 집단을 함유할 수 있다. 예를 들어, 집단은 5개 삼량체를 갖는 약 95%의 나노입자를 함유할 수 있다.
항원은 나노입자의 비이온성 세제-함유 코어와 결합된다. 전형적으로, 세제는 폴리소르베이트-20(PS20), 폴리소르베이트-40(PS40), 폴리소르베이트-60(PS60), 폴리소르베이트-65(PS65) 및 폴리소르베이트-80(PS80)에서 선택된다. 세제의 존재는 항원을 조직하고 제시하는 코어를 형성함으로써 나노입자의 형성을 용이하게 한다. 따라서, 특정 실시태양에서, 나노입자는 외측 및 소수성 영역으로 돌출된 머리 영역 및 항원에 의해 둘러싸인 중심 코어를 형성하는 PS80 세제를 갖는 다중 올리고머 당단백질-PS80 단백질-세제 나노입자로 조립된 항원을 함유할 수 있다.
본 발명에 개시된 나노입자는 약 20 nm 내지 약 60 nm, 약 20 nm 내지 약 50 nm, 약 20 nm 내지 약 45 nm 또는 약 25 nm 내지 약 45 nm 범위의 Z-ave 크기 범위를 갖는다. 입자 크기(Z-ave)는 달리 명시되지 않는 한 말번 제타사이저(Malvern Zetasizer)를 사용하여 동적 광산란(DLS)으로 측정된다.
몇몇 나노입자 유형이 본 발명에 개시된 백신 조성물에 포함될 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 유형은 이량체 또는 단량체일 수 있는 이방성 막대의 형태이다. 다른 양태에서, 나노입자 유형은 구형 올리고머이다. 또 다른 양태에서, 나노입자는 중간 나노입자로 기술될 수 있으며, 처음 두 가지 유형의 침강 특성 중간을 갖는다. 나노입자 유형의 형성은 생산 과정에서 세제 및 단백질 농도를 제어하여 조절될 수 있다. 나노입자 유형은 침강 계수를 측정함으로써 결정될 수 있다. RSV F 나노입자를 보여주는 예는 도 9a 및 9b를 참조한다. 또한 세제 및 단백질 농도를 조정하여 나노입자 크기에 대한 제어를 예시하는 도 8을 참조한다.
나노입자 생산
본 발명의 나노입자는 천연적으로 발생하지 않는 생성물이며, 그 성분은 자연에서 함께 존재하지 않는다. 일반적으로, 본 발명에 개시된 방법은 제 1 세제를 사용하여 단백질을 분리시킨 후 제 1 세제를 제 2 세제와 교환하여 나노입자를 형성시키는 세제 교환 접근법을 사용한다.
나노입자에 함유된 항원은 전형적으로 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 생성된다. 표준 재조합 기술이 사용될 수 있다. 전형적으로, 단백질은 곤충 숙주 세포에서 바큘로바이러스 시스템을 사용하여 발현된다. 바람직한 실시태양에서, 바큘로바이러스는 카텝신-L 낙아웃 바큘로바이러스이다. 다른 바람직한 실시태양에서, 바큘로바이러스는 키티나제 낙아웃 바큘로바이러스이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 바큘로바이러스는 카텝신-L 및 키티나제 모두에 대한 이중 낙아웃이다. 높은 수준의 발현은 곤충 세포 발현 시스템에서 얻을 수 있다. 곤충 세포의 비 제한적인 예는 담배거세미나방종(Spodoptera frugiperda)(Sf) 세포, 예를 들어, Sf9, Sf21, 무늬밤나방(Trichoplusia ni) 세포, 예를 들면, 하이 파이브(High Five) 세포, 드로소필라(Drosophila) S2 세포이다.
전형적인 형질 감염 및 세포 성장 방법이 세포를 배양하는데 사용될 수 있다. 벡터, 예컨대 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 당업계에 공지된 방법에 따라 숙주 세포 내로 형질감염될 수 있다. 예를 들어, 핵산을 진핵 세포에 도입하는 것은 칼슘 포스페이트 공-침전, 전기천공, 마이크로인젝션, 리포펙션 및 폴리아민 형질감염 시약을 이용한 형질감염에 의해 달성될 수 있다. 한 실시태양에서, 벡터는 재조합 바큘로바이러스이다.
숙주 세포를 성장시키는 방법은 배치, 배치-공급, 연속 및 관류 세포 배양 기술을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 세포 배양은 세포가 증식 및 분리를 위해 단백질(예를 들어, 재조합 단백질)을 증식 및 발현하는 생물 반응기(발효 챔버)에서 세포의 성장 및 증식을 의미한다. 전형적으로, 세포 배양은 생물 반응기에서 무균, 제어된 온도 및 대기 조건하에 수행된다. 생물 반응기는 온도, 대기, 교반 및/또는 pH와 같은 환경 조건을 모니터할 수 있는 세포 배양에 사용되는 챔버이다. 한 실시태양에서, 생물 반응기는 스테인리스 강 챔버이다. 다른 실시태양에서, 생물 반응기는 사전 멸균된 비닐 백(예를 들어, Cellbag®, Wave Biotech, Bridgewater, NJ)이다. 다른 실시태양에서, 사전 멸균된 비닐 백은 약 50 L 내지 3500 L 백이다.
세제 추출 및 나노입자의 정제
숙주 세포의 성장 후, 단백질은 세제 및 정제 프로토콜을 사용하여 숙주 세포로부터 수확될 수 있다. 일단 숙주 세포가 48 내지 96 시간 동안 성장하면, 배양액으로부터 세포를 분리하고 세제 함유 용액을 첨가하여 세포막을 용해시켜 세제 추출물 중에 단백질을 방출시킨다. 트리톤 X-100과 터지톨(NP-9으로도 알려짐)은 추출을 위해 각각 선호되는 세제이다. 세제는 약 0.1% 내지 약 1.0%의 최종 농도로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 농도는 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.5%, 약 0.7%, 약 0.8% 또는 약 1.0%일 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 범위는 약 0.1% 내지 약 0.3%일 수 있다. 바람직하게는, 농도는 약 0.5%이다.
다른 양태에서, 상이한 제 1 세제는 단백질을 숙주 세포로부터 분리하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제 1 세제는 비스(폴리에틸렌 글리콜 비스[이미다조 일카본일]), 노녹시놀-9, 비스(폴리에틸렌 글리콜 비스[이미다조일 카본일]), Brij® 35, Brij®56, Brij®72, Brij®76, Brij® 92V, Brij® 97, Brij® 58P, Cremophor® EL, 데카에틸렌글리콜 모노도데실 에터, N-데카노일-N-메틸글루카민, n-데실 알파-D-글루코피라노시드, 데실 베타-D-말토피라노시드, n-도데카노일-N-메틸글루카미드, n-도데실 알파-D-말토사이드, n-도데실 베타-D-말토사이드, n-도데실 베타-D-말토사이드, 헵타 에틸렌 글리콜 모노데실 에터, 헵타 에틸렌 글리콜 모노도데실 에터, 헵타 에틸렌 글리콜 모노테트라 데실 에터, n-헥사데실 베타-D-말토사이드, 헥사 에틸렌 글리콜 모노도데실 에터, 헥사에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에터, 헥사에틸렌 글리콜 모노옥타데실 에터, 헥사에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에터, Igepal CA-630, Igepal CA-630, 메틸-6-0-(N-헵틸 카바모일)-α-D-글루코피라노사이드, 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에터, N-노마노일-N-메틸글루카민, N-노나노일-N-메틸글루카민, 옥타에틸렌 글리콜 모노데실 에터, 옥타에틸렌 글리콜모노도데실 에터, 옥타에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에터, 옥타에틸렌 글리콜 모노옥타데실 에터, 옥타에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에터, 옥틸-β-D-글루코피라노사이드, 펜타에틸렌 글리콜 모노데실 에터, 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에터, 펜타에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에터, 펜타에틸렌 글리콜 모노헥실 에터, 펜타에틸렌 글리콜 모노옥타데실 에터, 펜타에틸렌 글리콜 모노옥틸 에터, 폴리에틸렌 글리콜 다이글리시딜 에터, 폴리에틸렌 글리콜 에터 W-1, 폴리옥시에틸렌 10 트라이데실 에터, 폴리옥시에틸렌 100 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 20 아이소헥사데실 에터, 폴리옥시에틸렌 20 올레일 에터, 폴리옥시에틸렌 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 50 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 8 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 비스(이미 다졸일 카본일), 폴리옥시에틸렌 25 프로필렌 글리콜 스테아레이트, 킬라자 껍질의 사포닌, Span® 20, Span® 40, Span® 60, Span® 65, Span® 80, Span® 85, 터지톨 유형 15-S-12, 터지톨 유형 15-S-30, 터지톨 유형 15-S-5, 터지톨 유형 NP-4, 터지톨 유형 NP-40, 터지톨 유형 NP-7, 터지톨 유형 NP-9, 터지톨 유형 TMN-10, 터지톨 유형 TMN-6, 트리톤 X-100 또는 이들의 조합일 수 있다.
그런 후에 나노입자는 원심 분리를 사용하여 세포 파편으로부터 분리될 수 있다. 일부 실시태양에서, 염화 세슘, 수크로오스 및 아이딕사놀을 사용하는 구배 원심분리가 사용될 수 있다. 예를 들어 이온 교환, 친화성 및 겔 여과 크로마토그래피를 포함하는 표준 정제 기술과 같은 다른 기술이 대안으로서 또는 부가적으로 사용될 수 있다.
예를 들어, 제 1 컬럼은 Fractogel® EMD TMAE(EMD Millipore)와 같은 이온 교환 크로마토그래피 수지일 수 있고, 제 2 컬럼은 렌틸(Lens culinaris) 렉틴 친 화성 수지일 수 있으며, 제 3 컬럼은 Fractogel® EMD SO3(EMD Millipore) 수지와 같은 양이온 교환 컬럼일 수 있다. 다른 양태에서, 양이온 교환 컬럼은 MMC 컬럼 또는 누비아 C 프라임 컬럼(Bio-Rad Laboratories, Inc)일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 개시된 방법은 세제 추출 컬럼; 예를 들어 소수성 상호작용 컬럼을 사용하지 않는다. 이러한 컬럼은 정제 과정에서 세제를 제거하는데 종종 사용되지만 여기에 공개된 방법에 부정적인 영향을 줄 수 있다.
세제 교환
나노입자를 형성하기 위해, 숙주 세포로부터 단백질을 추출하는데 사용되는 제 1 세제는 실질적으로 제 2 세제로 대체되어 나노입자 구조에 도달한다. NP-9는 바람직한 추출 세제이다. 전형적으로, 나노입자는 HPLC로 측정했을 때 검출 가능한 NP-9를 함유하지 않는다. 제 2 세제는 전형적으로 PS20, PS40, PS60, PS65 및 PS80으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 제 2 세제는 PS80이다. 나노입자 제제의 안정성을 유지하기 위해, 제 2 세제 및 단백질의 비율은 특정 범위 내에서 유지된다.
특정 양태에서, 세제 교환은 그들의 탄수화물 잔기를 통해 당단백질을 결합시키는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 수행된다. 예를 들어, 친화성 크로마토그래피는 레귐 렉틴 컬럼을 사용할 수 있다. 레귐 렉틴은 식물에서 처음 발견된 단백질로 탄수화물 잔여물과 특이적으로 가역적으로 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, Sharon and Lis, "Legume lectins--a large family of homologous proteins," FASEB J. 1990 Nov;4(14):3198-208; Liener, "The Lectins: Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine," Elsevier, 2012 참조. 적절한 렉틴은 콘카나발린(concanavalin) A(con A), 완두 렉틴, 세인포린(sainfoin) 렉팀 및 렌즈 렉틴을 포함한다. 렉틸 렉틴은 이의 결합 특성 때문에 세제 교환을 위한 바람직한 컬럼이다. 예를 들어, 실시예 10을 참조한다. 렉틴 컬럼은 시판되고 있다; 예를 들어, 캅토 렌틸 렉틴은 GE 헬스케어에서 구입할 수 있다. 특정 양태에서, 렌틸 렉틴 컬럼은 재조합 렉틴을 사용할 수 있다. 분자 수준에서, 탄수화물 모이어티는 렌틸 렉틴에 결합하여 단백질의 아미노산을 유리시켜 세제 주위에 결합시켜 항원, 예를 들어, 세제에 고정된 이량체, 삼량체 또는 사량체일 수 있는 당단백질 올리고머의 여러 복제물을 갖는 나노입자를 제공하는 것으로 생각된다.
세제 교환 동안 나노입자를 형성하기 위해 단백질과 함께 배양될 때, 세제는 조기 정제 단계 동안 약 0.1%(w/v)까지 존재할 수 있고, 이 양은 최적 안정성을 갖는 최종 나노입자를 얻기 위해 낮아진다. 예를 들어, 비이온성 세제(예를 들어, PS80)는 약 0.03% 내지 약 0.1% 일 수 있다. 바람직하게는, 개선된 안정성을 위해, 나노입자는 약 0.03% 내지 약 0.05% PS80을 함유한다. 제제에서 약 0.03% 미만의 양은 우수한 안정성으로 나타나지 않는다. 또한, PS80이 약 0.05% 이상으로 존재하면 응집체가 형성된다. 따라서, 약 0.03% 내지 약 0.05%의 PS80은 감소된 분해와 함께 나노입자의 장기 안정성을 허용하는 구조적 및 안정성 이점을 제공한다.
세제 교환은 위에서 논의된 바와 같이 정제된 단백질로 수행되어 정제되고, 저장을 위해 냉동되고, 이어서 세제 교환을 위해 해동될 수 있다.
나노입자의 향상된 안정성 및 향상된 면역원성
이론에 구애됨이 없이, 항원을 비이온성 세제 코어와 결합시키는 것이 우수한 안정성 및 항원 제시를 제공하는 것으로 생각된다. 본 발명에 개시된 나노입자는 놀라울 정도로 우수한 안정성 및 면역원성을 제공한다. 유익한 안정성은 적절한 저장이 부족한 국가에서 사용되는 백신에 특히 유용하다; 예를 들어, 아프리카의 특정 지역은 냉장 시설이 부족할 수 있으므로 에볼라 바이러스 및 RSV와 같이 어려운 저장 조건에 직면해 있는 질병에 대한 백신은 특히 개선된 안정성으로 이익을 얻는다. 또한, 중성 pH 접근법을 사용하여 제조된 HA 인플루엔자 나노입자는 공지된 재조합 독감 백신보다 우수한 접힘을 나타낸다.
특히, 콜라우(Colau) 등의 US 2004/0028698에 기술된 바와 같은 분할 백신을 포함하는 RSV 백신을 생산하기 위해 세제를 사용하기 위한 종래의 접근법은 효과적인 구조를 만들지 못했다. 본 발명에 개시된 바와 같은 세제 코어를 둘러싸고 있는 단백질을 갖는 나노입자보다, 콜라우 등의 조성물은 확인 가능한 바이러스 구조가 결핍된 무정형 물질을 함유하고 있어서, 아마도 면역계에 효과적으로 에피토프를 제시하지 못하게 된다. 또한, 세제 코어 주위의 항원, 종종 당단백질의 배향이 효소 및 단백질 분해를 유발하는 다른 화학물질의 접근을 입체적으로 방해하기 때문에 개시된 나노입자는 특히 향상된 안정성을 갖는다.
나노입자는 다양한 스트레스에 노출된 후에도 면역원성을 유지하는 능력에 의해 결정되는 바와 같이 향상된 안정성을 갖는다. 안정성은 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 하나의 접근법에서, 가혹한 저장 조건을 모방함으로써 나노입자에 스트레스를 가하도록 디자인된 다양한 처리 후에 항원 단백질의 무결성을 결정하기 위해 펩타이드 맵이 제조될 수 있다. 따라서, 안정성의 척도는 대조군 샘플과 비교하여 스트레스 받은 샘플에서의 항원 펩타이드의 상대적 존재량이다. 도 12는 RSV F 나노입자 조성물에 다양한 스트레스를 가한 후에도, 견고한 면역 반응이 얻어짐을 나타낸다. 도 13은 0.015% 이상의 PS80 수준을 사용하여 나노입자에 의해 제공되는 개선된 프로테아제 내성을 예시한다. 특히, 18개월 후에 0.03%의 PS80은 0.015% PS80에 비해 절단된 종의 형성이 50% 감소함을 나타낸다. 본 발명에 개시된 나노입자는 2-8℃에서 안정하다. 그러나 유리하게도, 이들은 적어도 2개월 동안 25℃에서 안정적이다. 일부 실시태양에서, 조성물은 25℃에서 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월 또는 적어도 24개월 동안 안정하다. RSV-F 나노입자의 경우, 안정성은 도 13에 나타낸 바와 같이 절단된 F1 단백질의 형성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 유리하게는, 본 발명에 개시된 RSV-F 나노입자는 유리하게는 도 12에 도시된 바와 같이 pH(pH3.7), 고 pH (pH10), 상승된 온도(2 주 동안 50℃), 및 과산화물에 의한 산화를 포함하는 다양한 스트레스에 반응하여 대조군 RSV-F 단백질에 비해 펩타이드 맵핑에 의해 측정된 90 내지 100%의 존재량으로 손상되지 않은 항원 위치 II를 유지한다.
세제 코어에 고정된 당단백질의 위치는 바람직하지 않은 상호작용을 감소시킴으로써 향상된 안정성을 제공하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 프로테아제-기반 분해에 대한 개선된 보호는 본 발명에 개시된 몰비로 당단백질을 코어에 고정시킴으로써 프로테아제 접근을 차단하는 입체 장애를 초래하는 차폐 효과를 통해 달성될 수 있다.
따라서, 50℃에서 2주간 배양, pH 3.7에서 25℃에서 1주간 배양, pH 10에서 25℃에서 1주간 배양, 25℃에서 1주간 교반 및 과산화수소와 같은 산화제와의 25℃에서 1주간 배양으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 처리에 반응하여, 치료되지 않은 대조군과 비교하여, 90% 내지 100%의 손상되지 않은 위치 II 펩타이드를 보유하는 RSV-F 나노입자 및 이를 함유하는 조성물이 본 발명에 개시되어 있다. 또한, 이러한 처리 후에, 조성물의 기능성은 유지된다. 도 12a-12d를 참조한다. 예를 들어, 중화 항체, 항-RSV IgG 및 PCA 역가는 대조군과 비교하여 보존된다.
향상된 면역원성은 인플루엔자 나노입자에 의해 달성된 교차 중화에 의해 예시된다. 코어에서 돌출하는 인플루엔자 항원의 배향은 면역계에 에피토프의 더 효과적인 제시를 제공한다고 생각된다.
나노입자 항원
전형적인 실시태양에서, 나노입자를 제조하는데 사용되는 항원은 바이러스 단백질이다. 일부 양태에서, 단백질은 변형될 수 있지만 천연 펩타이드에 대한 면역 반응을 자극하는 능력을 보유한다. 일부 양태에서, 단백질은 본질적으로 단백질의 세제 코어 내로의 결합을 촉진시키기 위해 막 횡단 도메인을 함유하거나 함유하도록 만들어진다. 종종 단백질은 자연적으로 당단백질입니다.
RSV 항원
한 양태에서, 바이러스는 호흡기 합병증 바이러스(RSV)이고 바이러스 항원은 융합(F) 당단백질이다. RSV F 단백질의 구조 및 기능은 잘 특성화되어 있다. 야생형 구조의 예는 도 1을 참조한다. 본 발명에 기재된 조성물에 사용하기에 적합한 RSV-F 단백질은 A2, Long, ATCC VR-26, 19, 6265, E49, E65, B65, RSB89-6256, RSB89-5857, RSB89-6190, 및 RSB89-6614과 같은 RSV 균주로부터 유래될 수 있다. 특정 실시태양에서, RSV F 단백질은 그들의 천연 변이체에 비해 돌연변이된다. 이러한 돌연변이는 개선된 단백질 발현, 향상된 면역원성 등과 같은 바람직한 특징을 부여한다. RSV-F 단백질 구조를 기술하는 추가 정보는 Swanson et al. A Monomeric Uncleaved Respiratory Syncytial Virus F Antigen Retains Prefusion-Specific Neutralizing Epitopes. Journal of Virology, 2014, 88, 11802-11810. Jason S. McLellan et al. Structure of RSV Fusion Glycoprotein Trimer Bound to a Prefusion-Specific Neutralizing Antibody. Science, 2013, 340, 1113-1117에서 발견할 수 있다.
Swanson et al. Monomeric Uncleaved Respiratory Syncytial Virus F 항원은 식출 특이성 중화 epitopes를 유지합니다. Journal of Virology, 2014, 88, 11802-11810. Jason S. McLellan et al. Prefusion 특이적인 중화 항체에 결합 된 RSV 융합 글리코 단백질 트라이머의 구조 Science, 2013, 340, 1113-1117.
1차 융합 절단은 SEQ ID NO: 2에 상응하는 잔기 131 내지 136에 위치한다. 1차 융합 절단 부위의 불활성화는 위치의 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있으며, 그 결과 퓨린은 더 이상 일치 위치를 인식할 수 없다. 예를 들어, 1차 퓨린 절단 위치의 불활성화는 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO: 2)의 아르기닌 133, 아르기닌 135 및 아르기닌 136에 상응하는 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 특정 양태에서, 하나, 둘 또는 세 개의 아르기닌이 글루타민으로 돌연변이된다. 다른 양태에서, 불활성화는 야생형 부위를 다음 서열: KKQKQQ (SEQ ID NO: 14), QKQKQQ (SEQ ID NO: 15), KKQKRQ (SEQ ID NO: 16), 및 GRRQQR (SEQ ID NO: 17) 중 하나로 돌연변이시킴으로써 성취된다.
특정 양태에서, 하기에 나타낸 적합한 RSV F 단백질의 특정 예를 포함하여, SEQ ID NO: 2의 산 137 내지 145에 상응하는 1 내지 10개의 아미노산이 결실될 수 있다. SEQ ID NO: 3-13의 각각은 선택적으로 활성 1차 융합 절단 위치 KKRKRR(SEQ ID NO: 18)으로 제조될 수 있다. SEQ ID NO: 2의 야생형 균주는 SEQ ID NO: 3-13에서 보정된 서열화 오차(A 내지 P, V 내지 I 및 V 내지 M)를 갖는다. 숙주 세포에서 RSV-F 단백질의 발현 후, N-말단 신호 펩타이드는 절단되어 최종 서열을 제공한다. 전형적으로, 신호 펩타이드는 숙주 세포 프로테아제에 의해 절단된다. 그러나, 다른 양태에서, 전장 단백질은 숙주 세포로부터 분리될 수 있고 신호 펩티드는 이어서 절단될 수 있다. N-말단 RSV F 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 26의 아미노산(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)으로 이루어진다. 따라서, 예를 들어, 발현 및 정제 동안 SEQ ID NO: 8로부터의 신호 펩타이드의 절단 후, SEQ ID NO: 19의 서열을 갖는 성숙 단백질이 얻어져서 RSV F 나노입자 백신을 생산하는데 사용된다. 도 1b를 참조한다. 선택적으로, RSV F 신호 펩타이드 아미노산의 하나 또는 전체가 결실, 돌연변이될 수 있거나 전체 신호 펩타이드가 결실되고 발현을 증진시키기 위해 상이한 신호 펩타이드로 대체될 수 있다. 개시하는 메티오닌 잔기는 발현을 개시하도록 유지된다.
발현된 단백질
SEQ ID NO:		 융합 도메인 결실 1차 융합 절단 위치 서열
1 야생형 균주 A2 (핵산) KKRKRR (활성)
2 야생형 균주 A2 (단백질) KKRKRR (불활성)
3 137의 결실 (Δ1) KKQKQQ (불활성)
4 137-138의 결실 (Δ2) KKQKQQ (불활성)
5 137-139의 결실 (Δ3) KKQKQQ (불활성)
6 137-140의 결실 (Δ4) KKQKQQ (불활성)
7 137-141의 결실 (Δ5) KKQKQQ (불활성)
8 137-146의 결실 (Δ10) KKQKQQ (불활성)
9 137-142의 결실 (Δ6) KKQKQQ (불활성)
10 137-143의 결실 (Δ7) KKQKQQ (불활성)
11 137-144의 결실 (Δ8) KKQKQQ (불활성)
12 137-145의 결실 (Δ9) KKQKQQ (불활성)
13 137-145의 결실 (Δ9) KKRKRR (활성)
일부 양태에서, 본 발명에 개시된 RSV F 단백질은 융합 도메인에서의 결실, 선택적으로 1차 분해 위치의 불활성화에 의해 야생형 균주로부터만 변형된다. 다른 양태에서, RSV F 단백질에 대한 추가 변경이 이루어질 수 있다. 전형적으로, 시스테인 잔기는 돌연변이된다. 전형적으로, N-결합 글리코실실화 위치는 돌연변이되지 않는다. 도 1b를 참조한다. 또한, 팔리비주맙 항체가 그 부위에 결합하는 능력 때문에 본 발명에서 팔리비주맙 위치로도 불리는 항원 위치 II는 보존된다. 모타비주맙 항체는 또한 위치 II에 결합한다. 참조로 포함된 추가의 적합한 RSV-F 단백질은 미국 특허 공개공보 제2011/0305727호에서 발견되며, 특히 도 1c에 개시된 잔기 100 내지 150에 걸친 서열을 함유하는 RSV-F 단백질을 포함한다.
특정 다른 양태에서, RSV F1 또는 F2 도메인은 SEQ ID NO: 2에 나타낸 바와 같은 야생형 균주에 대한 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, F1 도메인은 돌연변이 또는 결실일 수 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형을 가질 수 있다. 유사하게, F2 도메인은 돌연변이 또는 결실일 수 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형을 가질 수 있다. F1 및 F2 도메인은 야생형 서열에 대해 각각 독립적으로 적어도 90%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 보유할 수 있다.
특정 실시예에서, RSV 나노입자 약품은 약 270 ㎍/mL 내지 약 300 ㎍/mL의 범위, 또는 약 60 ㎍/mL 내지 약 300 ㎍/mL의 범위로 RSV F를 갖는 약 0.025% 내지 약 0.03% PS80을 함유할 수 있다. 다른 양태에서, 나노입자 약품은 300 ㎍/mL 내지 약 500 ㎍/mL의 RSV F를 갖는 조성물에서 약 0.035% 내지 약 0.04% PS80을 함유할 수 있다. 또 다른 양태에서, 나노입자 약품은 350-500 ㎍/mL의 RSV F를 갖는 조성물에서 약 0.035% 내지 약 0.04% PS80을 함유할 수 있다.
항원 및 세제의 농도가 달라질 수 있기 때문에, 각각의 양은 비이온성 세제:단백질의 몰비로 불릴 수 있다. 예를 들어, 단백질 대 PS80의 몰비는 ELISA/A280에 의해 측정된 항원의 PS80 농도 및 단백질 농도 및 각각의 분자량을 사용하여 계산된다. 계산에 사용된 PS80의 분자량은 1310이며, 예를 들어 RSV F를 사용하면 RSV F의 분자량은 65kD이다. 몰비는 다음과 같이 계산된다:(PS80 농도x10x65000)÷ (1310x RSV F 농도(mg/mL)). 예를 들어 도 13에서 볼 수 있듯이 단백질로 측정한 나노입자 농도는 270㎍/mL이며 PS80 농도는 0.015%와 0.03%이다. 이들은 각각 27:1 (즉, 0.015 x 10 x 65000/(1310 x 0.27)) 및 55:1의 PS80 대 RSV F 단백질의 몰비를 갖는다.
특정 양태에서, 몰비는 약 30:1 내지 약 80:1, 약 30:1 내지 약 70:1, 약 30:1 내지 약 60:1, 약 40:1 내지 약 70:1, 또는 약 40:1 내지 약 50:1의 범위이다. 흔히, 대체 비이온성 세제는 PS80이고 몰비는 약 30:1 내지 약 50:1, PS80:단백질이다. RSV-F 당단백질의 경우, 35:1 내지 65:1의 범위, 특히 약 45:1의 비율의 몰비를 갖는 나노입자는 특히 안정하다.
인플루엔자 항원
나노입자 플랫폼은 인플루엔자 항원을 대상의 면역계에 제시하는데 특히 유용하다. 인플루엔자 나노입자 백신 생산에 대한 이전의 접근법은 소수성 상호작용 컬럼을 사용하여 세제를 제거하거나 약품 정제 중에 발생하는 비특이적 상호작용을 줄이기 위해 최소량의 세제만을 함유한다. 그러나, 세제 교환 단계를 수행함으로써 우수한 특성을 갖는 비이온성 세제 코어를 갖는 나노입자가 생산될 수 있음이 밝혀졌다. 나노입자는 환경적 스트레스에 의한 분해에 대한 내성으로 입증된 우수한 안정성을 나타내며, 백신에 특히 유용한 보관 기간 연장을 허용한다. 또한, 나노입자 구조는 특히 유익한 방식으로 항원을 제공하는 것이다.
인플루엔자 나노입자는 그들이 유도하는 항체가 광범위하게 중화 항체를 함유하기 때문에 백신으로서 특히 유용하다. 따라서, 1년 내에 투여된 나노입자에 의해 유도된 항체는 이후의 "표류(drift)" 과정에서 유래하는 인플루엔자 바이러스 균주를 중화시킬 수 있다. 이러한 광범위하게 중화하는 항체를 유도하는 이러한 에피토프는 이전 인플루엔자 백신에서 전혀 노출되지 않았거나 효과적으로 노출되지 않았거나 에피토프가 이전 제제에서 불충분하게 안정한 것으로 생각된다. 본 발명에 개시된 나노입자는 향상된 안정성을 갖는 비이온성 세제 코어 주위에 고정된 교차 보호 에피토프를 제시함으로써 상기 문제점을 해결한다.
마지막으로, 본 발명에 개시된 방법은 일반적으로 경제적으로 유익하고 대유행 인플루엔자 바이러스와 같은 다량의 신속한 생산을 필요로 하는 바이러스에 특히 가치 있는 우수한 순도를 가진 특히 고 수율 인플루엔자 나노입자를 제공한다.
특정 실시태양에서, 나노입자는 HA 또는 NA 단백질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 나노입자는 아형 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 및 H16으로부터 선택된 HA 단백질을 함유할 수 있다. 나노입자는 아형 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 및 N9로부터 선택된 NA 단백질을 함유할 수 있다. 계통발생학적으로, HA와 NA 단백질은 그룹으로 나뉘어져 있다. HA의 경우, 그룹 1은 H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 및 H16을 포함하고 그룹 2는 H3, H4, H7, H10, H14 및 H15를 포함한다. NA는 또한 두 그룹을 형성한다: 그룹 1은 N1, N4, N5 및 N8을 포함하고 그룹 2는 N2, N3, N6, N7 및 N9를 포함한다. 특정 양태에서, 항원은 천연 인플루엔자 HA 단백질 또는 NA 단백질과 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 97% 동일성, 또는 적어도 99% 동일성을 가질 수 있다.
나노입자에 사용되는 HA 및 NA 단백질은 전형적으로 전장 서열이다. 특정 양태에서, C-말단 부분은 제거될 수 있다.
유리하게, 인플루엔자를 갖는 조성물은 본 발명에 개시된 추가의 병원체 나노입자가 함께 투여되는 경우에도 이종 인플루엔자 균주에 대한 반응을 유도할 수 있다. 이종 인플루엔자 균주에 대한 반응을 유도함으로써, 광범위한 보호가 달성된다. 따라서, 특정 양태에서, 매트릭스 M-보강 조성물로 유도된 동종 HAI 역가는 약 800 내지 약 2000이다. 특정 양태에서, 이종 HAI 역가는 약 1300이다. 특정 양태에서, 매트릭스 M-보강된 조성물로 유도된 이종 HAI 역가는 약 200 내지 약 400이고; 예를 들어, 이종 HAI 역가는 약 300일 수 있다.
특정 양태에서, 인플루엔자 나노입자는 중성 pH 정제를 사용하여 제조된 트립신 내성 나노입자이다. 트립신 내성은 HA 나노입자의 정제 및 제제화 중에 6.8 내지 8.5 초과의 중성 pH 범위에 의해 달성된다. 특정 양태에서, HA 나노입자의 정제 및 제제화 동안 pH 범위는 7.0 내지 8.5, 7.0 내지 7.5, 또는 7.2 내지 7.5이다. HA 나노입자 안정성은 시차 주사 열량계(DSC)에 의해 측정될 수 있다. DSC는, 구체적으로, 제어된 방식으로 온도를 변화시킴으로써 시료 용액과 적절한 기준(버퍼/용매) 사이의 열 에너지 흡수의 차이를 측정함으로써 용액에서 거대 분자의 열역학적 프로파일을 측정한다. DSC는 단백질의 절반이 변성/펼쳐지고 절반이 원래/접힌 상태인 온도로 정의되는 전이 중점(Tm)으로 데이터를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명의 트립신 내성 HA 나노입자는 약 60℃ 내지 75℃ 범위의 Tm 피크를 가지며; 예를 들어, Tm은 60℃, 65℃, 70℃ 또는 75℃일 수 있다.
트립신 내성은 HA 단백질이 적절히 접혀서 더 우수한 안정성 및 면역원성을 갖는 백신 제품을 제공한다는 것을 나타낸다. HA 단백질의 민감성은 균주에 따라 다양하고 본 발명에 개시된 중성 pH 생성은 모든 균주, 특히 pH 민감성 균주에 대한 면역원성을 최대화하는 방법을 제공한다. 이론에 구애됨이 없이, 세제 교환 및 중성 pH 수준의 조합은 단백질 분해 효소, 특히 트립신에 내성을 주는 구조로 HA 단백질을 보존한다고 생각된다. 따라서, 중성 pH 정제와 조합된 비이온성 세제 코어 주위에 결합된 HA 단백질을 가짐으로써, 특히 우수한 안정성 및 면역원성을 갖는 HA 단백질이 얻어진다. 또한, 나노입자를 생산하는 방법은 백신에 사용하기에 우수한 수준의 단백질을 제공한다. 특정 양태에서, HA 나노입자는 A280으로 측정된 바와 같이, 약 10 mg/L의 세포 배양 내지 약 30 mg/L 이상, 약 20 mg/L 내지 약 30 mg/L로 생산된다.
트립신 내성 HA 나노입자는 도 24에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 간단히 말해, 세제 교환을 포함하는 다양한 단계는 pH 7.0 초과; 종종 약 pH 7.2 내지 약 pH 7.4의 범위의 버퍼으로 수행된다. 도 25d는 트립신 내성 나노입자로 달성된 더 나은 열안정성의 예를 제공한다. TFF 및 MMC 생산 롯트는 중성 pH를 사용하여 얻어졌지만, 잘못 접힌 낮은 pH 롯트는 실질적으로 분해 및/또는 잘못 접힌다.
에볼라 항원
본 발명은 또한 에볼라 바이러스 감염 및/또는 질병을 치료, 개선 또는 예방하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 조성물은 백신 조성물이다. 유리하게는, 본 발명에 개시된 백신 조성물은 동물 모델에서 치명적인 면역성 검사에 대해 100% 생존을 제공한다. 조성물은 또한 바이러스 핵산을 검출하기 위해 RT-PCR을 사용하는 경우 검출 가능한 한계 근처 또는 그 이하의 바이러스 부하를 유지한다.
한 양태에서, 본 발명은 사포닌-기반 항원보강제와 조합된 재조합 에볼라 바이러스 당단백질(GP) 나노입자를 함유하는 조성물을 제공한다.
특정 양태에서, 본 발명은 GP 단백질이 삼량체의 형태이고 각 나노입자가 비이온성 세제 코어에 부착된 적어도 하나의 삼량체를 함유하는 나노입자 구조에서 하나 또는 에볼라 바이러스 GP 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
에볼라 GP 나노입자는 에볼라 감염의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명은 에볼라 GP 나노입자를 포함하는 약학적으로 허용 가능한 백신 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 균주로부터의 나노입자가 백신에 존재한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 백신 제제의 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다.
에볼라 당단백질
나노입자를 제조하기 위한 에볼라 항원의 사용은 전형적으로 에볼라 당단백질(GP) 항원이다. 항원은 다양한 균주로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 개시된 조성물은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 분리 된 에볼라 균주로부터의 나노입자를 함유할 수 있다. 예를 들어, 그 균주는 마코나, 수단, 자이레, 레스톤일 수 있다. 다른 양태에서, 에볼라 GP는 하나 이상의 이들 균주와 아미노산 또는 핵산 동일성을 공유할 수 있다. 예를 들어, GP는 마코나, 수단, 자이레 또는 레스톤 바이러스로부터의 하나 이상의 GP와 약 80% 동일, 약 85% 동일, 약 90% 동일, 약 95% 동일, 약 97% 동일, 약 98% 동일 또는 약 99% 동일할 수 있으며, 여기서 동일성은 단백질 또는 핵산의 전체 길이에 걸쳐 측정된다. 일부 양태에서, 에볼라 GP는 SEQ ID NO: 27 또는 28, 또는 이들에 대해 동일성을 갖는 단백질을 포함하거나 이 단백질로 이루어질 수 있다.
대표적인 자이레 균주 서열은 진뱅크 수탁 번호 AAB81004(SEQ ID NO:27)에서 제공된다. 첫번째 밑줄 친 부분은 GP1 단백질의 N-말단을 나타낸다. 선행 신호 펩타이드는 정제 및 백신으로 제제화되기 전에 세포에서의 발현 후 가공하는 동안 절단된다. 굵게 표시된 것은 퓨린 분열 위치이다. 굵은 텍스트 다음에, GP2 단백질에 대한 N 말단이 나타내어진다. 도 7a는 단백질 구조의 그림을 나타낸다.
MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSIPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGQSPARTSSDPGTNTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREAAVSHLTTLATISTSPQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHRRTDNDSTASDTPSATTAAGPPKAENTNTSKSTDFLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRR EAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQWIPAGIGVTGVIIAVIALFCICKFVF
마코나 분리 서열은 진뱅크 수탁 번호 AJG44192(SEQ ID NO: 28)에서 제공된다. 상기와 같이, 첫 번째 밑줄 친 부분은 GP1 단백질의 N-말단을 나타낸다. 선행 신호 펩타이드는 가공 중에 절단된다. 굵게 표시된 것은 퓨린 분열 위CL이다. 굵은 텍스트 다음에, GP2 단백질의 N 말단이 나타내어진다. 또한 도 7b를 참조한다.
MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSIPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSVTKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYASGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNGPKNISGQSPARTSSDPETNTTNEDHKIMASENSSAMVQVHSQGRKAAVSHLTTLATISTSPQPPTTKTGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVGQHHRRADNDSTASDTPPATTAAGPLKAENTNTSKSADSLDLATTTSPQNYSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTR REVIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYTEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQWIPAGIGVTGVIIAVIALFCICKFVF
면역 반응을 자극하는 백신 조성물의 능력은 세 동물 모델에서 확인되었다. 먼저 마우스 모델을 사용하였다. 매트릭스-M, AlPO4 또는 식염수로 제제화된 재조합 EBOV/Mak 전장 GP 나노입자 백신을 평가하였다. 비-항원보강되거나 AlPO4 항원보강된 EBOV/Mak GP에 의한 마우스의 면역화는 적당한 항체와 세포 반응을 유도하였다; 그러나, 매트릭스-M으로 항원보강된 경우, 정제된 EBOV/Mak GP 나노입자는 마우스 챌린지 모델에서 면역원성이 높았고 보호 효과가 있었다. 매트릭스-M으로 항원보강된 EBOV/Mak GP에 의한 마우스의 면역화는 항 EBOV/Mak GP IgG와 에볼라 바이러스 중화 항체의 유의한 증가를 초래하였다. 매트릭스-M 항원보강된 EBOV/Mak GP에 의한 면역화는 치명적인 에볼라 바이러스 면역성 검사로부터 100% 보호를 제공하는 반면 항원보강되지 않은 EBOV/Mak GP는 10%만 보호 효과가 있고 EBOV/Mak GP와 AlPO4로 면역화된 마우스에서 보호가 관찰되지 않았다. 따라서, 특정 양태에서, 본 발명에 개시된 조성물은 에볼라 감염을 예방한다.
EBOV/Mak GP와 매트릭스-M의 동시 투여는 균형 잡힌 IgG1 및 IgG2a 서브클래스 반응의 생성을 유도하였다. 항원보강제가 없거나 AlPO4에 의해, 최소 IgG2a 항체가 검출되었다. Blaney et al. Antibody quality and protection from lethal Ebola virus challenge in nonhuman primates immunized with rabies virus based bivalent vaccine. PLoS Pathog. 2013;9(5)은 비인간 영장류(NHP)의 광견병/EBOV 키메라 백신 모델에서 항체 아이소타입이 바이러스 중화 및 에볼라 바이러스 공격에 대한 보호 역할을 한다는 것을 나타내었다. 뮤린 IgG2a 항체는 IgG-Fc 수용체 (FcγR) 및 보체(C1q)에 효율적으로 결합하는 인간 IgG1 항체와 동등하며(Bruhns, P. Properties of mouse and human IgG receptors and their contribution to disease models Blood. 2012;119: 5640-5649; Vidarsson G, Dekkers G, Rispens T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Front. Immunol. 2014;5:520), 예를 들어, 항체 의존성 세포독성을 통한 바이러스 감염의 해소에 도움이 될 수 있다. 생체 내에서 완전하게 보호된 모든 항체는 IgG2a 서브클래스이었다; 즉 인간 IgG1과 동일하다. 따라서, 본 발명에 개시된 조성물은 보호 면역 반응의 일부로서 IgG1 항체의 생산을 자극한다.
매트릭스-M 항원보강제의 사용은 CD4+ 및 CD8+ 사이토카인 분비 T 세포의 빈도뿐만 아니라 하나 이상의 사이토카인을 생성하는 다기능 T 세포의 수에 용량 의존적성 증가를 제공하였다. 치명적인 에볼라 바이러스 면역성 검사로부터의 보호가 매트릭스-M 항원보강된 EBOV/Mak GP 그룹에서만 관찰되었다는 관찰은 다기능 T 세포의 생산 증대와 관련이 있었다.
매트릭스-M의 사용은 비장에서 GC B 세포 및 골수 내 장수명 플라즈마 세포의 빈도를 증가시켰다. GC는 B 세포 분화, 체세포 과다 돌연변이, 항체 종류 전환 및 기억 B 세포 형성을 위한 미세 해부학적 위치이다. EBOV/Mak GP와 사포닌 항원보강제 매트릭스-M의 동시 투여는 GC B 세포분화 및 발달을 촉진하는 TFH 세포의 수의 증가를 초래하였다. 매트릭스-M 항원보강화에 의해 유도된 GC 및 TFH 세포의 증가된 빈도는 항체 반응의 증가된 크기 및 더 큰 수의 장수명 플라스마 세포의 유도와 상관 관계가 있어, 매트릭스-M 항원보강된 EBOV/Mak GP 백신이 특히 내구력이 있는 항체 반응을 유도할 수 있다.
에볼라 GP의 각 투여량은 항원보강제와 조합될 수 있다. 정제된 EBOV/Mak GP 나노입자로 매트릭스-M 항원보강제를 투여하면 항-EBOV/Mak GP 면역 반응의 강한 자극을 제공하여 마우스 모델에서 100% 보호 효능을 초래한다. 본 발명에 개시된 조성물 및 방법은 항-EBOV/Mak GP IgG 및 에볼라 바이러스 중화 항체의보다 신속한 개시, IgG2a의 증가된 농도뿐만 아니라 다기능 CD4+ 및 CD8+ T 세포, TFH 세포, 종자 중심 B 세포의 증가된 빈도 및 골수 내 EBOV/Mak GP-특이적 혈장 B 세포의 지속성을 제공한다.
따라서, 마우스 연구의 분석은 본 발명에 개시된 조성물이 완전한 보호를 제공함을 확인한다. 보호 효과를 더욱 높이기 위해, 두 별개의 비인간 영장류 모델인 개코원숭이와 필리핀 원숭이에서 연구를 수행하였다. Perry et al., "The Baboon (Papio spp.) as a model of human Ebola virus infection," Viruses. 2012 Oct 23;4(10):2400-16; Geisbert et al., "Pathogenesis of Ebola hemorrhagic fever in cynomolgus macaques: evidence that dendritic cells are early and sustained targets of infection," Am J Pathol. 2003 Dec;163(6):2347-70 참조. 따라서, 본 발명의 일부 양태에서, 보호 효과는 바이러스 노출 후 약 7일, 약 10일, 약 14일 또는 약 21일 후에 검출하는 RT-PCR의 능력 이하로 바이러스 부하의 감소를 포함한다.
비인간 영장류 연구는 본 발명에 개시된 조성물이 보호성임을 추가로 확인하였다. 에볼라 GP 나노입자는 항원보강제 없이 그리고 명반 또는 매트릭스 M 항원보강제로 평가되었다. 실시예 23를 참조한다. 개코원숭이에서 면역 반응은 매우 견고하고 지속되었다. 특히, 매트릭스 M의 포함은 명반보다 더 큰 면역 반응을 유도하였다. 필리핀 원숭이 모델에 의한 결과는 특히 예상하지 못했다. 실시예 24 및 24를 참조한다. 조성물은 살아있는 에볼라 백신에 의한 면역성 감사에 대해 보호 될뿐만 아니라 에볼라 RNA의 양은 살아있는 바이러스에 의한 면역섬 검사 후 10일에 검출할 수 없었다. 도 48을 참조한다. 특히, 한 마리의 필리핀 원숭이 대상에서, 7일에 작은 신호가 있었다; 그러나, 10일까지, 수준은 검출 한계 이하로 돌아갔다. 대조적으로, 살아있는 에볼라 바이러스에 대한 치료되지 않은 동물의 노출은 감염 및 질병을 초래하였고 대상은 9일에 안락시켰다.
변형된 항원
본 발명에 개시된 항원은 이들 항원의 변이체 및 변이체를 포함한다. 특정 양태에서, 항원은 개시된 항원과 동일성을 공유할 수 있다. 일반적으로, 및 확인된 항원의 문맥에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 동일성 비율은 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 98%일 수 있다. 백분율 동일성은 www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/에 있는 정렬 프로그램 ClustalW2를 사용하여 계산될 수 있다. 쌍을 이룬 정렬을 위해 다음 기본 매개변수가 사용될 수 있다: 단백질 중량 매트릭스 = Gonnet; 갭 오픈 = 10; 갭 연장 = 0.1.
특정 태양에서, 나노입자에 함유된 단백질은 그 단백질로 이루어진다. 다른 양태에서, 나노입자에 함유된 단백질은 그 단백질을 포함한다. 단백질 자체에 대한 첨가는 다양한 목적을 위한 것일 수 있다. 일부 양태에서, 항원은 N-말단, C-말단, 또는 모두에서 연장될 수 있다. 일부 양태에서, 연장은 정제 또는 검출과 같은 기능에 유용한 태그이다. 일부 양태에서, 태그는 에피토프를 함유한다. 예를 들어, 태그는 폴리글루타메이트 태그, FLAG-태그, HA-태그, 폴리히스-태그(약 5-10 히스티딘을 가짐), Myc-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제-태그, 그린 형광 단백질-태그, 말토오스 결합 단백질-태그, 티오레독신-태그 또는 Fc-태그일 수 있다. 다른 양태에서, 연장은 발현을 향상시키기 위해 단백질에 융합된 N-말단 신호 펩타이드일 수 있다. 이러한 신호 펩타이드는 세포에서 발현되는 동안 종종 절단되는 반면, 일부 나노입자는 손상되지 않은 신호 펩타이드를 가진 항원을 포함할 수 있다. 따라서, 나노입자가 항원을 포함할 때, 항원은 연장을 함유할 수 있으며, 따라서 나노입자에 혼입될 때 융합 단백질일 수 있다. 서열에 대한 동일성을 계산하기 위해서, 연장은 포함되지 않는다.
일부 양태에서, 항원은 절단될 수 있다. 예를 들어, N-말단은 약 10개의 아미노산, 약 30개의 아미노산, 약 50개의 아미노산, 약 75개의 아미노산, 약 100개의 아미노산 또는 약 200개의 아미노산으로 절단될 수 있다. C-말단은 N-말단 대신 또는 N-말단에 부가하여 절단될 수 있다. 예를 들어, C-말단은 약 10개의 아미노산, 약 30개의 아미노산, 약 50개의 아미노산, 약 75개의 아미노산, 약 100개의 아미노산 또는 약 200개의 아미노산으로 절단될 수 있다. 절단을 갖는 단백질에 대한 동일성을 계산하기 위해, 동일성은 단백질의 나머지 부분에 대해 측정된다.
조합 나노입자
본 발명에 사용된 조합 나노입자는 둘 이상의 상이한 병원체에 대한 면역 반응을 유도하는 나노입자를 의미한다. 특정 조합에 따라, 병원체는 동일한 종의 상이한 균주 또는 아형일 수 있거나 병원체는 상이한 종일 수 있다. 조합 나노입자를 제조하기 위해, 여러 병원체로부터의 당단백질을 세제 교환 단계에서 결합시켜 단일 나노입자로 조합될 수 있다. 당단백질을 컬럼에 결합시킨 후 세제를 교환하면 세제 코어 주위에 여러 당단백질 유형이 형성되어 조합 나노입자를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 각각 상이한 병원체에 대한 반응을 유도하는 둘 이상의 나노입자를 조합함으로써 둘 이상의 상이한 병원체에 대한 면역 반응을 유도하는 백신 조성물을 제공한다. 선택적으로, 백신 조성물은 대상에 투여되는 백신 조성물의 수를 감소시키면서 다수의 병원체에 대한 면역 반응을 최대화하는 목적으로, 하나 이상의 복합 나노입자를 단독으로 또는 추가의 나노입자와 조합하여 함유할 수 있다.
이러한 조성물은 병원체가 어떤 양태로 연결될 때 특히 바람직하다. 한 예에서, 조성물은 특정 연도의 계절 인플루엔자를 형성하는 것으로 당국에 의해 매년 확인된 균주에 대한 나노입자를 함유할 수 있다. 통상적으로, 계절성 인플루엔자 백신의 경우, 백신 조성물은 3, 4 또는 5개의 인플루엔자 아형의 균주에 대한 면역 반응을 유도하는 HA 및/또는 NA 나노입자를 함유한다. 따라서, 인플루엔자의 상이한 균주가 백신 조성물에 조합될 수 있다. 일부 양태에서, 조합 나노입자는 제 1 균주의 HA 단백질 및 제 2 균주의 NA 단백질을 함유할 수 있다. 다른 양태에서, 나노입자는 동일하거나 상이한 아형으로부터의 하나 이상의 HA 및 하나 이상의 NA 단백질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 나노입자는 아형 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 및 H16으로부터 선택된 하나 이상의 HA 나노입자 및/또는 아형 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 및 N9로부터 선택된 하나 이상의 NA 나노입자를 함유할 수 있다. 계통발생학적으로, HA와 NA 단백질은 그룹으로 나뉘어진다. HA의 경우, 그룹 1은 H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 및 H16을 함유하고 그룹 2는 H3, H4, H7, H10, H14 및 H15를 함유한다. NA 단백질은 또한 두 그룹을 형성한다: 그룹 1은 N1, N4, N5 및 N8을 함유하고 그룹 2는 N2, N3, N6, N7 및 N9를 함유한다. 특정 양태에서, 항원은 천연 인플루엔자 HA 단백질 및/또는 NA 단백질과 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 97% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 인플루엔자 및 RSV는 모두 호흡기 질환을 일으키고, 따라서 HA, NA 및/또는 RSV F는 조합 나노입자로 혼합될 수 있거나 또는 다수의 나노입자는 백신 조성물에서 조합되어 RSV 및 하나 이상의 인플루엔자 균주에 대한 반응을 유도할 수 있다.
백신 조성물
본 발명에 개시된 조성물은 예방적으로 또는 치료적으로 사용될 수 있지만, 전형적으로 예방적이다. 따라서, 본 발명은 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 본 발명의 면역원성 조성물의 치료적 또는 예방적 양을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 보호 효과를 제공하는 백신 조성물이다. 다른 양태에서, 보호 효과는 노출된 집단의 비율에서 감염과 관련된 증상의 개선을 포함할 수 있다. 예를 들어, 병원체에 따라, 조성물은 치료되지 않은 대상과 비교하여 발열 피로, 근육통, 두통, 인후통, 구토, 설사, 발진, 신장 및 간 기능 장애 증상, 내부 출혈 및 외부 출혈로부터 선택된 하나 이상의 바이러스 질병 증상을 예방 또는 감소시킬 수 있다.
나노입자는 다양한 부형제, 버퍼 등의 존재하에 백신으로서 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 예를 들어, 백신 조성물은 인산나트륨, 염화나트륨 및/또는 히스티딘을 함유할 수 있다. 인산나트륨은 약 10mM 내지 약 50mM, 약 15mM 내지 약 25mM, 또는 약 25mM; 특별한 경우에, 약 22mM 인산 나트륨이 존재한다. 히스티딘은 약 0.1%(w/v), 약 0.5%(w/v), 약 0.7%(w/v), 약 1%(w/v), 약 1.5%(w/v), 약 2%(w/v), 또는 약 2.5%(w/v)로 존재할 수 있다. 염화나트륨은 존재할 때 약 150mM일 수 있다. 특정 조성물에서, 예를 들어 인플루엔자 백신의 경우, 염화나트륨은 약 200mM, 약 300mM 또는 약 350mM을 포함하는 더 많은 양으로 존재할 수 있다.
특정 나노입자, 특히 RSV F 나노입자는 약 산성 pH 수준에서 개선된 안정성을 갖는다. 예를 들어, 나노입자를 함유하는 조성물의 pH 범위는 약 5.8 내지 약 7.0, 약 pH 5.9 내지 약 6.8, 약 pH 6.0 내지 약 6.5, 약 pH 6.1 내지 약 6.4, 약 pH 6.1 내지 약 pH 6.3, 또는 약 pH 6.2일 수 있다. 전형적으로, RSV F 단백질 나노입자의 조성물은 약 pH 6.2이다. 다른 나노입자에서, 조성물은 거의 중성일 수 있다; 예를 들어, 인플루엔자 나노입자는 약 pH 7.0 내지 pH 7.4; 종종 pH 약 7.2일 수 있다.
항원보강제
특정 실시태양에서, 본 발명에 개시된 조성물은 면역 반응을 향상시키기 위해 하나 이상의 항원보강제와 조합될 수 있다. 다른 실시태양에서, 조성물은 항원보강제 없이 제조되며, 따라서 항원보강제 없는 조성물로서 투여되도록 이용될 수 있다. 유리하게는, 본 발명에 개시된 항원보강제 없는 조성물은 단일 투여량으로 투여될 때 보호 면역 반응을 제공할 수 있다. 견고한 면역 반응을 유도하는 명반이없는 조성물은 성인 약 60세 이상에서 특히 유용하다.
알루미늄 기반 항원보강제
일부 실시태양에서, 항원보강제는 명반(예를 들어, AlPO4 또는 Al(OH)3)일 수 있다. 전형적으로, 나노입자는 실질적으로 명반에 결합된다. 예를 들어, 나노입자는 명반에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 결합될 수 있다. 종종, 나노입자는 조성물에서 명반에 92% 내지 97% 결합된다. 투여량 당 존재하는 명반의 양은 전형적으로 약 400㎍ 내지 약 1250㎍의 범위이다. 예를 들어, 명반은 약 300㎍ 내지 약 900㎍, 약 400㎍ 내지 약 800㎍, 약 500㎍ 내지 약 700㎍, 약 400㎍ 내지 약 600㎍, 또는 약 400㎍ 내지 약 500㎍의 투여량 당 존재할 수 있다. 전형적으로, 명반은 120㎍의 단백질 나노입자의 투여량에 대해 약 400㎍으로 존재한다.
사포닌 항원보강제
사포닌을 함유하는 항원보강제는 또한 본 발명에 개시된 면역원과 조합될 수 있다. 사포닌은 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina) 나무의 껍질에서 추출한 글리코사이드이다. 전형적으로, 사포닌은 다단계 정제 공정을 사용하여 여러 분획으로 제조된다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "퀼라야 사포나리아 몰리나로부터의 사포닌 분획"은 퀼라야 시포나리아의 반정제 또는 정의된 사포닌 분획 또는 이의 실질적으로 순수한 분획을 기술하기 위해 일반적으로 사용된다.
사포닌 분획
사포닌 분획을 생산하기 위한 몇 가지 접근법이 적합하다. 분획 A, B 및 C는 미국 특허 제6,352,697호에 기술되어 있으며 다음과 같이 제조될 수 있다. 미생물 인 퀼라야 사포나리아 몰리나 추출물인 Quil A의 친유성 분획을 크로마토그래피로 분리하고 물 속 70% 아세토나이트릴로 용출시켜 친유성 분획을 회수하였다. 그런 후에 이 친유성 분획은 산성수 속 25% 내지 60% 아세토나이트릴 구배를 사용하는 용출에 의한 반-분취용 HPLC에 의해 분리된다. 본 발명에서 "분획 A" 또는 "QH-A"로 불리는 분획은 약 39% 아세토나이트릴에서 용출되는 분획이거나, 분획에 상응한다. 본 발명에서 "분획물 B" 또는 "QH-B"로 불리는 분획은 약 47% 아세토나이트릴에서 용출되는 분획이거나, 분획에 상응한다. 본 발명에서 "분획 C" 또는 "QH-C"로 불리는 분획은 약 49% 아세토나이트릴에서 용출되는 분획이거나, 분획에 상응한다. 분획의 정제에 관한 추가 정보는 미국 특허 제5,057,540호에서 발견된다. 본 발명에 기술된 바와 같이 제조 될 때, 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A, B 및 C는 각각 정의 가능한 특성을 갖는 화학적으로 밀접하게 관련된 분자의 그룹 또는 패밀리를 나타낸다. 이들이 얻어지는 크로마토그래피 조건은 용출 프로파일 및 생물학적 활성의 면에서 배치-투-배치(batch-to-batch) 재현성이 매우 일정한 것dl다.
다른 사포닌 분획이 기술되어 있다. 분획 B3, B4 및 B4b가 EP 0436620에 기술된다. 분획 QA1-QA22는 EP 03632279 B2, Q-VAC(Nor-Feed, AS 덴마크), Quillaja saponaria Molina Spikoside (lsconova AB, Ultunaallen 2B, 756 51 Uppsala, Sweden)에 기술되어 있다. EP 03632279 B2의 분획 QA-1, QA-2, QA-3, QA-4, QA-5, QA-6, QA-7, QA-8, QA-9, QA-10, QA-11, QA-12, QA-13, QA-14, QA-15, QA-16, QA-17, QA-18, QA-19, QA-20, QA-21 및 QA-22, 특히 QA-7, QA-17, QA-18 및 QA-21이 사용될 수 있다. 이들은 EP 0 3632 279 B2, 특히 6 페이지 및 8 페이지 및 9 페이지의 실시예 1에 기술된 바와 같이 얻어진다.
본 발명에 기술되고 항원보강제를 형성하기 위해 사용되는 사포닌 분획은 종종 실질적으로 순수한 분획이다; 즉, 분획은 다른 물질로부터의 오염의 존재가 실질적으로 없다. 특정 양태에서, 실질적으로 순수한 사포닌 분획은 40중량% 이하, 30중량% 이하, 25중량% 이하, 20중량% 이하, 15중량% 이하, 10중량% 이하, 7 중량% 이항, 5중량% 이하, 2중량% 이하, 1중량% 이하, 0.5중량% 이하 또는 0.1중량% 이하의 다른 사포닌 또는 다른 항원보강제 물질과 같은 다른 화합물을 함유할 수 있다.
ISCOM 구조
사포닌 분획은 ISCOM(Immune Stimulating COMplex)이라 불리는 우리-유사(cage-like) 입자의 형태로 투여될 수 있다. ISCOM은 EP0109942B1, EP0242380B1 및 EP0180546B1에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 특정 실시태양에서, EP 9600647-3(PCT/SE97/00289)에 기술된 바와 같이 트랜스포트 및/또는 패신저 항원이 사용될 수 있다.
매트릭스 항원보강제
일부 양태에서, ISCOM은 ISCOM 매트릭스 복합체이다. ISCOM 매트릭스 복합체는 적어도 하나의 사포닌 분획 및 지질을 포함한다. 지질은 적어도 콜레스테롤과 같은 스테롤이다. 특정 양태에서, ISCOM 매트릭스 복합체는 또한 인지질을 함유한다. ISCOM 매트릭스 복합체는 또한 반드시 글리코사이드가 아닌 하나 이상의 다른 면역조절(항원보강제-활성) 물질을 함유할 수 있으며 EP0436620B1에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
다른 양태에서, ISCOM은 ISCOM 콤플렉스이다. ISCOM 복합체는 적어도 하나의 사포닌, 적어도 하나의 지질 및 적어도 하나의 항원 또는 에피토프를 함유한다. ISCOM 복합체는 항원의 일부가 입자 내로 통합되도록 세제 처리에 의해 결합된 항원을 함유한다. 대조적으로, ISCOM 매트릭스는 항원과의 혼합물로서 제제화되며, ISCOM 매트릭스 입자와 항원 사이의 결합은 정전기 및/또는 소수성 상호작용에 의해 매개된다.
하나의 실시태양에 따르면, ISCOM 매트릭스 복합체 또는 ISCOM 복합체에 통합된 사포닌 분획 또는 ISCOM 또는 ISCOM 매트릭스 복합체에 통합되거나 이와 혼합 된 적어도 하나의 추가 항원보강제는 퀼라야 사포나리아, 퀼라야 사포나리아의 반정제 제제, 퀼라야 사포나리아의 정제 제제의 분획 A, 분획 B 또는 분획 C 또는 임의의 정제된 서브-분획, 예를 들어, QA 1-21로부터 선택된다.
특정 태양에서, 각각의 ISCOM 입자는 적어도 2개의 사포닌 분획을 함유할 수 있다. 상이한 사포닌 분획의 중량%의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 임의의 두 분획의 중량%의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 예를 들어, 입자는 분획 A의 임의의 중량% 및 미정제 사포닌 분획 또는 분획 C와 같은 다른 사포닌 분획의 임의의 중량%를 함유할 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 각각의 ISCOM 매트릭스 입자 또는 각각의 ISCOM 복합체 입자는 0.1 내지 99.9중량%, 5 내지 95중량%, 10 내지 90중량%, 15 내지 85중량%, 20 내지 80중량%, 25 내지 75중량%, 30 내지 70중량%, 35 내지 65중량%, 40 내지 60중량%, 45 내지 55중량%, 40 내지 60중량% 또는 50중량% 사포닌 분획, 예를 들어, 분획 A 및 각각의 경우 나머지 100%까지의 다른 사포닌, 예를 들어, 임의의 미정제 분획 또는 임의의 다른 분획, 예를 들어, 분획 C를 함유할 수 있다. 중량은 사포닌 분획의 총 중량으로 계산된다. ISCOM 매트릭스 복합체 및 ISCOM 복합체 항원보강제의 예는 미국 공개 출원 제2013/0129770호에 개시되어 있다.
특정 실시태양에서, ISCOM 매트릭스 또는 ISCOM 복합체는 5 내지 99중량%의 한 분획, 예를 들어, 분획 A 및 나머지 100중량%까지의 다른 분획, 예를 들어, 미정제 사포닌 분획 또는 분획 C을 포함한다. 중량은 사포닌 분획의 총 중량으로 계산된다.
또 다른 실시태양에서, ISCOM 매트릭스 또는 ISCOM 복합체는 40중량% 내지 99중량%의 한 분획, 예를 들어, 분획 A 및 1중량% 내지 60중량%의 다른 분획, 미정제 사포닌 분획 또는 분획 C를 포함한다. 중량은 사포닌 분획의 총 중량으로 계산된다.
또 다른 실시태양에서, ISCOM 매트릭스 또는 ISCOM 복합체는 70중량% 내지 95중량%의 한 분획, 예를 들어, 분획 A 및 30중량% 내지 5중량%의 다른 분획, 미정제 사포닌 분획 또는 분획 C를 포함한다. 중량은 사포닌 분획의 총 중량으로 계산된다. 다른 실시태양에서, 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터의 사포닌 분획은 QA 1-21의 임의의 하나로부터 선택된다.
사포닌 분획의 혼합물을 함유하는 입자 이외에, ISCOM 매트릭스 입자 및 ISCOM 복합체 입자는 단지 하나의 사포닌 분획을 사용하여 형성될 수 있다. 본 발명에 개시된 조성물은 다수의 입자를 함유할 수 있으며, 여기서 각각의 입자는 단 하나의 사포닌 분획을 함유한다. 즉, 특정 조성물은 하나 이상의 상이한 유형의 ISCOM-매트릭스 복합체 입자 및/또는 하나 이상의 상이한 유형의 ISCOM 복합체 입자를 함유할 수 있으며, 각각의 개별 입자는 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터의 하나의 사포닌 분획을 함유하며, 여기서 한 복합체의 하나의 사포닌 분획은 다른 복합체 입자의 사포닌 분획과는 상이하다.
특정 양태에서, 하나의 유형의 사포닌 분획 또는 미정제 사포닌 분획은 하나의 ISCOM 매트릭스 복합체 또는 입자로 통합될 수 있고 다른 유형의 실질적으로 순수한 사포닌 분획 또는 미정제 사포닌 분획은 다른 ISCOM 매트릭스 복합체 또는 입자 A로 통합될 수 있다. 조성물 또는 백신은 적어도 두 유형의 복합체 또는 입자를 포함할 수 있으며 각 유형은 물리적으로 상이한 입자로 통합된 하나의 유형의 사포닌을 갖는다.
조성물에서, ISCOM 매트릭스 복합체 입자 및/또는 ISCOM 복합체 입자의 혼합물이 사용될 수 있고 여기서 하나의 사포닌 분획 퀼라야 사포나리아 몰리나 및 다른 사포닌 퀼라야 사포나리아 몰리나는 상이한 ISCOM 매트릭스 복합체 입자 및/또는 ISCOM 복합체 입자에 개별적으로 혼입된다.
하나의 사포닌 분획을 각각 갖는 ISCOM 매트릭스 또는 ISCOM 복합체 입자는 중량%의 임의의 조합으로 조성물에 존재할 수 있다. 특정 양태에서, 조성물은 0.1중량% 내지 99.9중량%, 5중량% 내지 95중량%, 10중량% 내지 90중량%, 15중량% 내지 85중량%, 20중량% 내지 80중량%, 25중량% 내지 75중량%, 30중량% 내지 70중량%, 35중량% 내지 65중량%, 40중량% 내지 60중량%, 45중량% 내지 55중량%, 40중량% 내지 60중량% 또는 50중량%의 제 1 사포닌 분획을 함유하는 ISCOM 매트릭스 또는 복합체를 함유할 수 있고 나머지 부분은 상이한 사포닌 분획을 함유하는 ISCOM 매트릭스 또는 복합체로 구성되었다. 일부 양태에서, 나머지 부분은 하나 이상의 ISCOM 매트릭스 또는 각 매트릭스 또는 복합 입자가 오직 하나의 사포닌 분획만을 함유하는 복합체이다. 다른 측면에서, ISCOM 매트릭스 또는 복합체 입자는 하나 이상의 사포닌 분획을 함유 할 수 있다.
특정 조성물에서, 제 1 ISCOM 매트릭스 또는 ISCOM 복합 입자의 사포닌 분획은 분획 A이고, 제 2 ISCOM 매트릭스 또는 ISCOM 복합 입자의 사포닌 분획은 분획 C이다.
바람직한 조성물은 분획 A를 함유하는 제 1 ISCOM 매트릭스 및 분획 C를 함유하는 제 2 ISCOM 매트릭스를 포함하며, 여기서 분획 A ISCOM 매트릭스는 총 사포닌 항원보강제의 중량 당 약 70%를 구성하고, 분획 C ISCOM 매트릭스는 총 사포닌 항원보강제의 중량 당 약 30%를 구성한다. 또 다른 바람직한 조성물에서, 분획 A ISCOM 매트릭스는 총 사포닌 항원보강제의 중량 당 약 85%를 구성하고, 분획 C ISCOM 매트릭스는 총 사포닌 항원보강제의 중량 당 약 15%를 구성한다. 따라서, 특정 조성물에서, 분획 A ISCOM 매트릭스는 약 70% 내지 약 85%의 범위로 존재하고, 분획 C ISCOM 매트릭스는 조성물에서 사포닌 항원보강제의 총 중량의 약 15% 내지 약 30%의 범위로 존재한다. 예시적인 QS-7 및 QS-21 분획, 이들의 생산 및 이들의 용도는 미국 특허 제5,057,540호; 제6,231,859호; 제6,352,697호; 제6,524,584호; 제6,846,489호; 제7,776,343호 및 제8,173,141호에 개시되며, 이들은 본 발명에 참고로 포함된다.
다른 항원보강제
일부 조성물에서, 다른 항원보강제가 추가로 또는 대안으로서 사용될 수 있다. 본 발명에 전문이 참조로 포함된 Vogel et al., "A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2nd Edition),"에 기술된 임의의 항원보강제의 포함은 본 발명의 범위 내에서 구상된다. 다른 항원보강제는 완전 프로인트 항원보강제(살상균 결핵균이 함유된 면역 반응의 비특이적 자극제), 불완전 프로인트 항원보강제 및 수산화 알루미늄 항원보강제를 포하한다. 다른 항원보강제는 GMCSP, BCG, thur-MDP 및 nor-MDP와 같은 MDP 화합물, CGP(MTP-PE), 지질 A 및 모노포스포릴 지질 A(MPL), MF-59, 박테리아, MPL, 트레할로스 다이미콜레이트(TDM)으로부터 추출된 3개 구성요소를 함유하는 RIBI 및 2% 스쿠알렌/tween® 80 에멀젼 속 세포벽 골격성분을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항원보강제는 소수층상 지질 소포일 수 있다; 예를 들어, 노바좀(Novasomes)®. 노바좀(Novasomes)®은 약 100nm 내지 약 500nm 범위의 소수층상 비인지질 소포이다. 이들은 Brij 72, 콜레스테롤, 올레산 및 스쿠알렌을 포함한다. 노바좀은 효과적인 항원보강제인 것으로 나타났다(미국 특허 제5,629,021호, 제6,387,373호 및 제4,911,928호 참조).
투여 및 투여량
본 발명에 개시된 조성물은 전신 경로 또는 점막 경로 또는 경피 경로를 통해 또는 특정 조직 내로 직접 투여될 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이 용어 "전신 투여"는 비경구 투여 경로를 포함한다. 특히, 비경구 투여는 피하, 복강내, 정맥내, 동맥내, 근육내 또는 흉골내 주사, 정맥내 또는 신장 투석 주입 기술을 포함한다. 전형적으로, 전신 비경구 투여는 근육내 주사이다. 본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "점막 투여"는 경구, 비강내, 질내, 직장내, 기관내, 장 및 안과 투여를 포함한다. 바람직하게는, 투여는 근육내 투여이다.
조성물은 단일 투여량 계획 또는 다중 투여량 계획으로 투여될 수 있다. 다중 투여량은 1차 접종 일정이나 부스터 예방 접종 일정에 사용될 수 있다. 다중 투여량 계획에서, 다양한 투여량은 동일한 또는 상이한 경로, 예를 들어 비경구 프라임 및 점막 부스트, 점막 프라임 및 비경구 부스트 등에 의해 제공될 수 있다. 일부 양태에서, 후속 부스트 투여량은 사전 투여 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주 또는 약 6 주 후에 투여될 수 있다. 그러나, 전형적으로, 본 발명에 개시된 조성물은 단지 한번만 투여되나 여전히 보호 면역 반응을 제공한다.
일부 실시태양에서, ㎍ 단위로 측정된 투여량은 용질을 포함하는 투여량의 총 중량, 또는 RSV F 나노입자의 중량, 또는 RSV F 단백질의 중량일 수 있다. 투여량은 A280 또는 ELISA의 단백질 농도 분석을 사용하여 측정된다.
소아 투여를 포함하는 항원의 투여량은 약 30㎍ 내지 약 300㎍, 약 90㎍ 내지 약 270㎍, 약 100㎍ 내지 약 160㎍, 약 110㎍ 내지 약 150㎍, 약 120㎍ 내지 약 140㎍, 또는 약 140㎍ 내지 약 160㎍의 범위일 수 있다. 특정 실시태양에서, 투여 량은 명반과 함께 투여된 약 120㎍이다. 일부 양태에서, 소아 투여량은 약 30㎍ 내지 약 90㎍의 범위일 수 있다. 특정 집단은 항원보강제와 함께 또는 항원보강제 없이 투여될 수 있다. 예를 들어, 노인들에게 투여될 때, 바람직하게는 명반이 없다. 특정 양태에서, 조성물은 첨가된 항원보강제가 없을 수 있다. 그러한 상황에서 투여량은 약 10% 증가될 수 있다.
일부 실시태양에서, 투여량은 약 0.1mL 내지 약 1.5mL, 약 0.3mL 내지 약 1.0mL, 약 0.4mL 내지 약 0.6mL 또는 약 0.5mL의 부피로 투여될 수 있으며, 이는 통상적인 양이다.
RSV 백신에 대한 특정 실시태양에서, 투여량은 약 175㎍/mL 내지 약 325㎍/mL, 약 200㎍/mL 내지 약 300㎍/mL, 약 220㎍/mL 내지 약 280㎍/ mL, 또는 약 240㎍/mL 내지 약 260㎍/mL의 RSV F 단백질 농도를 포함할 수 있다.
본 발명에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 참고 문헌 및 저널 기사는 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 본 발명에 명백히 포함된다.
실시예
실시예 1
RSV F 단백질 발현 및 정제
SEQ ID NO: 8을 갖는 RSV F 단백질을 바큘로바이러스 발현 시스템에서 발현시키고 RSV F 단백질을 발현하는 재조합 플라크를 채취하여 확인하였다. 그런 후에 재조합 바이러스를 Sf9 곤충 세포의 감염에 의해 증폭하였다. 곤충 세포의 배양물은 바큘로바이러스에 의해 ~3 MOI(감염의 다중도 = 바이러스 ffu 또는 pfu/세포)로 감염시켰다. 배양물과 상등액을 감염 후 48-72시간에 수확하였다. 약 30 mL의 미정제 세포 수확물을 약 800 x g에서 15분 동안 원심 분리하여 정화시켰다. RSV F 단백질을 함유하는 결과적인 미정제 세포 수확물을 아래 기술된 바와 같이 정제하였다.
비이온 계면활성제 Tergitol® NP-9(논일페놀 에톡실레이트)를 막 단백질 추출 프로토콜에 사용하였다. NP-9 미정제 추출물을 음이온 교환 크로마토그래피, 렌틸 렉틴 친화성/HIC 및 양이온 교환 크로마토그래피를 통과시켜 추가로 정제하였다. 세정된 세포를 세제 처리에 의해 용해시킨 후, BV 및 Sf9 숙주 세포 DNA 및 단백질의 침전을 유도하는 저 pH 처리를 수행하였다. 중화된 저 pH 처리 용해물을 정화하고 제 2의 저 pH 처리를 수행하기 전에 음이온 교환 및 친화성 크로마토그래피로 추가로 정제한다.
친화성 크로마토 그래피를 사용하여 Sf9 / BV 단백질, DNA 및 NP-9를 제거할 뿐만 아니라 RSV F 단백질을 농축시켰다. 간략하게, 렌틸 렉틴은 칼슘과 망간을 함유하는 금속 단백질이며, 글루코오스 또는 만노오스를 함유하는 폴리사카라이드 및 글리코실화 단백질에 가역적으로 결합한다. RSV F 함유 음이온 교환 플로우 스루(flow through) 분획을 렌틸 렉틴 친화성 크로마토 그래피 수지(Capto Lentil Lectin, GE Healthcare) 상에 적재하였다. 글리코실화 RSV F 단백질은 선택적으로 수지에 결합하는 반면 비글리코실화 단백질 및 DNA는 컬럼 플루오 스루에서 제거된다. 고 염 및 저 몰 농도의 메틸 알파 D-만노피라노사이드(MMP)를 함유하는 버퍼에 의해 약하게 결합된 당단백질을 제거하였다.
또한, 칼럼 세정제를 사용하여 NP-9 세제를 계면 활성제 폴리소르베이트 80(PS80)와 세제 교환하였다. 세제 교환을 수행하기 위해, RSV F 당단백질을 렌틸 렉틴 컬럼에 결합시킨 후 컬럼을 0.1% PS80으로 배양하였다. RSV F 단백질은 고 농도의 MMP를 가진 렌틸 렉틴 컬럼으로부터 용출되었다. 용출 후, RSV F 단백질 삼량 체는 세제 코어에 함유된 RSV F 단백질 삼량체와 PS80로 구성된 미셀 나노입자로 모인다. 세제 교환 후 낮은 pH 불활화 단계가 있었고 0.1%의 PS80을 함유한 버퍼의 존재하에서 황산염 컬럼 상의 배양이 이어졌다.
용출된 물질을 약 50의 PS80:RSV F 단백질의 몰비로 벌크 저장을 위한 약물 물질(DS)을 제공하기에 적합한 PS80을 함유하는 용액에서 희석시켰다. DS의 적절한 조성물은 RSV F 나노입자를 22 mM 인산 나트륨, 0.03% PS80 및 6.2의 pH에서 인산염 버퍼를 포함하는 용액에 결합하여 달성하였다. 세제 교환 동안 및 이후의 각 단계에서, 조성물에서 항원 대 PS80 비율은 35 내지 60의 몰비로 유지되었다. 몰비는 ELISA/A280에 의해 측정된 PS80 농도와 RSV F 농도 및 이들의 각각의 분자량를 사용하여 계산하였다. PS80의 분자량은 1310이고 RSV는 65kD이다.
실시예 2
백신 조성물의 제조
투여된 백신 제품에 대한 나노입자를 제공하기 위해, 약물 물질을 약 50의 PS80 : RSV 단백질 몰비로 약품로 희석시켰다. 약물 물질을 해동하고, 희석하고 투여 전에 2~8℃에서 보관을 위해 유리 바이알 또는 미리 충전된 주사기에 충전시켰다. 나노입자는 명반 항원보강제와 결합한다. 명반 항원보강제를 첨가하고 혼합하여 약 95%의 나노입자가 명반에 결합되게 하였으며, 이는 0.5mL 부피에 RSV F 나노입자의 120㎍ 투여량 당 약 0.4 mg을 의미한다.
실시예 3
나노입자 내 RSV F 당단백질의 특징 묘사
본 발명자들은 다양한 분석 기술을 이용하여 나노입자의 단백질 구조를 분석하였다. 도 3은 생산된 RSV F 단백질의 최고 피크가 팔미톨레산(피크 2A)을 포함하고 있음을 나타낸다. 두 번째로 큰 피크는 팔미틴산(피크 2B)을 함유한다. 잔여 피크는 지방산이 없고(피크 5) 가용성 형태(피크 1)로 얻었다. SDS-PAGE 겔에 대한 분석은 F1+2 단백질, F1, F1A, F1B 및 F1C 부분뿐만 아니라 F2를 포함하는 추가 변이체를 분리시켰다. 도 4를 참조한다. 펩타이드 구조 분석은 펩타이드 맵핑을 사용하여 수행하였다. 도 5를 참조한다. RSV F 당단백질에 대한 글리칸 구조를 평가하기 위해 HPLC-FLD를 수행하였다. 결과는 중요한 글리칸 구조가 푸코시레이트되었다는 것을 입증하였다.
실시예 4
전자 현미경에 의한 RSV F 나노입자의 검사
실시예 1에서 제조된 나노입자를 전자 현미경으로 가시화하였다. 결과는 세제 코어를 둘러싸는 RSV F 당단백질을 함유하는 나노입자의 형성을 확인하였다. 세제 중핵의 정확한 조성물은 불분명하게 남아 있다. 도 6은 얻은 나노입자의 유형을 예시한다. RSV F 단백질은 세제 교환 후에도 삼량체 구조를 유지하였다. 삼량체/나노입자의 수와 형태학에 따라 여러 유형의 나노입자가 얻어졌다. 도 6은 여러 삼량체가 세제 코어 주변에 발견될 수 있는 것을 나타낸다. 강조 표시된 부분에서 7개 삼량체가 세제를 둘러싸는 것으로 보인다. 도 6의 주요 패널은 생산되는 세제 코어 주변의 삼량체 범위를 예시한다. 아래 왼쪽 패널의 RSV F 단백질 삼량체의 그림 구조는 각 RSV F 당단백질에 부착된 지방산에 의해 촉진되는 세제 코어와 결합된 바닥 부분을 갖는 삼량체의 방향을 예시한다.
실시예 5
RSV F 나노입자의 입자 특징 묘사
동적 광산란(DLS)을 이용하여 브라운 운동에서 입자의 광산란 패턴의 변화를 측정함으로써 나노입자의 크기 분포 프로파일을 결정하였다. 나노입자 크기는 이온 성 세제의 농도 대 RSV F 나노입자의 농도의 선형 함수로 결정될 수 있었다(도 7과 8 참조).
분석 초원심분리(AUC)를 사용하여 인가된 원심장의 결과로서 샘플 농도의 진행 대 회전축 프로파일을 측정하였다. 도 8은 존재하는 나노입자의 농도에 따라 두 가지 모양의 나노입자가 우세하게 나타나는 것을 보여준다. 얻어된 나노입자 유형은 단량체 및 이량체 이방성 막대 및 구형 올리고머를 포함한다. 이들 2개의 나노입자 유형 사이의 구조 중간체는 이방성 막대 및 구형 올리고머를 생성하는 것 사이의 농도로 형성된다. 도 9는 나노입자 형태는 RSV F 단백질의 농도를 조절함으로써 제어될 수 있고, 더 높은 농도(1mg/mL)가 우세한 집단의 구형 올리고머를 생성하는 반면, 더 낮은 농도(0.22mg/mL)가 우세한 집단의 단량체/이량체 이방성 막대를 생성하였다. 이들 데이터는 세제 양 및 RSV F 농도가 20nm 내지 60nm의 특정 직경(z-ave)을 갖는 나노입자에 도달하도록 제어될 수 있음을 예시한다.
실시예 6
나노입자의 향상된 안정성: 분자 특징 묘사
사용된 5개 스트레스원은 48시간, 1주 및 2주 시점으로 50℃에서 열 스트레스; 48시간, 4일 및 1주 시점으로 낮은 pH(25℃에서 3.7); 24시간, 48시간 및 1주 시점으로 높은 pH(25℃에서 10); 12시간, 48시간 및 1주 시점으로 25℃에서 과산화수소 산화; 및 4시간, 24시간 및 1주 시점으로 25℃에서 물리적 교반이었다.
다양한 스트레스 처리 후 1차 구조의 차이를 평가하였다. 도 10은 어떻게 특정 영역이 대조군에 비해 스트레스에서 살아남았는지의 비교를 나타낸다. 데이터는 나노입자가 전체 단백질에 걸쳐 우수한 안정성을 가지고 있으며 과산화수소를 사용하는 특히 혹독한 산화 테스트만이 단백질을 특정 정도로 분해할 수 있음을 나타낸다. 그러나, 그 치료조차도 팔리비주맙의 표적인 항원 위치 II의 구조적 완전성을 감소시키지 못했다. 실제로, 가혹한 산화에 의해서도 RSV-F 단백질은 63-82, 237-258 및 360-364 위치에서만 구조적으로 열화되었다. 따라서, 가혹한 스트레스를 받은 후에도, 나노입자는 실질적으로 손상되지 않았다.
도 11은 항원 위치 II에 관한 나노입자 안정성을 추가로 정량화한다. 데이터는 각각의 열 응력, 낮은 pH, 높은 pH 및 교반에 반응하여 항원 위치 II가 각각의 샘플에서 90% 정도로 손상되지 않은 것을 나타낸다.
실시예 7
나노입자의 향상된 안정성: 유지된 면역원성
실시예 6에 기술된 스트레스 받은 백신 조성물을 뮤린 모델에서 면역원성에 대해 평가하였다. 백신은 RSV F 단백질 0.15, 0.45, 1.3, 4 및 12㎍/mL로 구성된 RSV F 투여량의 범위에 걸쳐 두 번의 근육내 주사를 통해 마우스에게 투여하였다. 대조군(-70℃에서 저장 후 해동)과 함께 다음 조건에서 스트레스를 받은 RSV F 조성물을 투여하였다: 2주 동안 50℃, 1주 동안 25℃에서 pH 10, 1주 동안 0.5% 과산화수소.
면역 반응을 항-RSV F IgG, PCA 역가 및 RSV A 중화 항체의 존재와 관련하여 평가하였다. 물리적 및 화학적 스트레스원은 생체 내에서 RSV F 단백질의 면역원성에 유의한 영향을 미치지 않았다. 스트레스 받은 샘플은 스트레스 받지 않은 RSV F 나노입자 백신 조성물 대조군과 유사한 항-RSV F IgG 항체 역가 및 필적할만한 기능성 PCA 및 RSV A 중화 역가를 유도하였다. (도 12a-12d 참조). 총체적으로, 이러한 강제 분해 연구는 심각한 환경 스트레스에 노출된 경우에도 나노입자가 강력한 면역 반응을 유도함을 나타낸다.
실시예 8
나노입자의 프로테아제 내성
개선된 안정성을 갖는 나노입자의 형성은 나노입자를 제조하는데 사용된 PS80의 양에 의존한다. 도 13은 나노입자가 0.015%(즉, 27의 몰비)와 비교하여 0.03% PS80(즉, 몰비 55)으로 형성될 때 18개월까지 안정성의 극적인 개선을 예시한다. 왼쪽 패널은 시간 0에서 두 농도에서 생산된 나노입자의 SDS-PAGE를 나타낸다. 데이터는 나노입자 제조를 위한 기준 제제와 유사한 결과가 두 나노입자 제제에 대해 얻어짐을 나타낸다. 특히 F1 및 F1+2에 대한 견고한 신호는 본질적으로 분해가 없음을 예시한다. 각 제제의 분취량을 18개월 동안 4℃에서 배양한 다음 SDS-PAGE에 다시 작동시켰다. 오른쪽 패널 및 표의 데이터는 입자에 0.015%만 함유하는 나노입자가 절단된 F1을 생성함을 나타낸다. 대조적으로, 입자에 0.03%로 제조된 나노입자는 우수한 프로테아제 내성을 나타내었다. 본 발명자는 세제와 단백질의 정확한 비율을 유지하는 것이 일부 입체 장애 메커니즘을 통해 프로테아제에 민감한 부분을 보호하는 당단백질의 배향을 갖는 나노입자를 생성한다고 생각한다. 본 발명자는 또한 0.06% 이상에서 PS80의 농도가 응집체 형성을 증가시키는 것을 관찰했다. 함께 취한 데이터는 최적의 PS80 수준이 나노입자 안정성에 대해 약 0.03% 내지 약 0.05%라는 것을 나타낸다.
실시예 9
HA 나노입자의 정제
TMAE 칼럼을 버퍼 A1(25mM Tris pH7.5, 70mM NaCl, 0.02% NP9, 유속: 91.7cm 30mL/min)으로 선 평형화시켰다. 샘플을 20mL/min(25분 잔류 시간)로 적재한 후 EQ 버퍼 A1(25mM Tris pH7.5, 70mM NaCl, 0.02% NP-9)로 세척하였다. 그런 후에 정제된 샘플을 1.25 CV 15% 버퍼 B(25 mM Tris pH8, 1M NaCl, 0.02% NP9)를 사용한 후 1.1cv 100% B를 사용하여 용출하였다. 대표적인 크로마토그램을 도 18b에 나타내었다. TMAE 칼럼으로부터의 생성물을 버퍼 A11: 25mM 인산 나트륨 pH6.0, 10mM NaCl, 3CV에 대해 0.05% PS80(유속: 147cm/h 13mL/min)로 선 평형화된 렌틸 렉틴 친화성 크로마토그래피 컬럼 샘플을 인가하였다. 샘플을 9.4분 잔류 시간-6.5mL/min-73.5cm/h에 적재하였다. 적재 후, 3CV 버퍼 A12(25 mM 인산 나트륨 pH6.0, 500mM NaCl, 0.5% NP-9)로 고염 세척을 수행하였다. 1차 세척 후, 6CV의 버퍼 A11(25mM 인산 나트륨 pH6.0, 10mM NaCl, 0.05% PS80)로 컬럼을 세척하여 세제 교환을 수행하였다. PS80을 함유하는 나노입자를 3CV에 대해 100% B, B1:버퍼 B:25mM 인산 나트륨 pH6.0, 10mM NaCl, 0.05% PS80, 500mM 메틸-α-D-만노피로노사이드로 용출시켰다. 대표적인 크로마토그램 트레이스가 도 18c에 도시되어 있다. 렌즈 렉틴 컬럼으로부터의 생성물을 3CV 버퍼 A1(25mM 인산 나트륨 pH6.0, 10mM NaCl, 0.05% PS80)을 갖는 황산염 컬럼에 인가하고 2CV 버퍼 A1로 세척한 후 100% 버퍼 B1(25mM 인산 나트륨 pH 7.5, 500mM NaCl, 0.05% PS80)으로 용출하였다. 그런 후에 용출된 생성물을 50mM 인산 나트륨 pH 9로 1:1로 조합하고 살균 여과하였다. 최종 생성물은 pH 7.2이었다. 크로마토그램은 도 18d에 도시된다. 도 18e는 겔 및 TMAE 및 LL 칼럼으로부터 정제 공정 동안 수득된 다양한 생성물의 웨스턴 블럿을 제공한다. 도 18f는 S03-컬럼으로부터의 용출물을 나타낸다.
실시예 10
HA 나노입자 순도 분석
HA 나노입자는 도 17 및 도 18에 개략적으로 나타낸 바와 같이 제조하였다. 본 발명자는 다양한 균주(A/뉴햄프셔/1/2015, A/스위스/9715293/2013, A/홍콩/4801/2014, B/푸켓/3073/2013, 및 B/브리스번/60/2008)에서 유래된 HA 서열을 사용하여 다중 HA 나노입자 제제의 순도를 측정하였다. 데이터는 모든 경우에 고순도 제제가 얻어짐을 나타내었다. 겔 밀도 측정법에 의한 분석은 93% 이상 및 93% 내지 97%의 범위의 순도를 나타내었다. 도 19a 내지 19h를 참조한다. 본 발명자는 또한 RP-HPLC에 의한 3개 A 아형 균주의 순도를 분석하여 순도가 83% 내지 85%인 것을 발견하였다. 도 19i를 참조한다. 또한 나노입자 크기를 측정하였다. 나노입자는 22.0 nm 내지 29.9 nm의 지름을 나타내었다. 도 19를 참조한다.
실시예 11
HA 초미세 구조의 분석
전자 현미경 검사를 수행하여 HA 나노입자의 구조를 평가하였다. 본 발명자는 다른 당단백질과 마찬가지로 HA 당단백질이 PS80 세제 코어와 결합된 삼량체를 형성한다는 것을 발견하였다. 각각의 세제 코어는 다수의 삼량체를 함유하였다. 도 20을 참조한다. cryo-EM 2D 클래스 평균을 사용하여 HA 삼량체를 나노입자에 도킹하였다. 도 21a는 이들 인 실리코 도킹 실험의 결과를 나타낸다. 상부 패널은 HA 삼량체가 첫 번째 나노입자에 맞는 것을 나타낸다. 아래쪽 패널은 나노입자의 다른 줄기에 맞는 것을 나타낸다.
비교를 위해, VLP 상의 도킹을 수행하였다. VLP는 HA 단백질이 고정되어 있는 지질 이중층을 함유한다. 도 21b를 참조한다. 센터 패널은 이중층으로부터 나오는 줄기 상에 중첩된 HA 단백질 구조를 나타낸다. 오른쪽 위쪽과 아래쪽 패널은 HA 삼량체 단독(상부 패널) 및 EM 구조 상에 중첩된 상응하는 HA 구조(하부 패널)를 똑바로 바라보는 유리 HA EM 현미경 사진을 나타낸다.
실시예 12
RSV F 나노입자로 공동 투여된 HA 나노입자의 면역원성 분석
마우스 모델에서 백신에 있는 나노입자의 면역원성을 평가하였다. 2개의 항원(A/스위스 H3 아형의 인플루엔자 HA 단백질 및 RSV F 단백질)을 함유하는 나노입자의 조합을 투여하였다. 각 나노입자는 또한 별도로 투여되었다. 백신을 단독으로 또는 항원보강제 AlPO4 또는 매트릭스 M 사포닌 항원보강제와 함께 투여하였다. 도 22는 그룹 1-10에 실시된 치료를 나타낸다. 대조군인 그룹 10은 치료를 받지 않았다. 치료는 0일과 21일에 실시되었다. 본 발명자는 이종 및 동종 면역성 검사에 대한 HAI를 측정하였다. 도 23a 및 도 23b을 참조한다. 도 23a는 매트릭스-항원보강된 HA 나노입자가 동종 면역성 검사에 대해 특히 견고한 반응을 자극한다는 것을 나타낸다. 도 23b는 매트릭스 M과 함께 투여된 경우 이종 인플루엔자 A/텍사스/50/2012에 대해 견고한 HAI 반응이 또한 얻어졌으며,이 반응은 RSV F 나노입자와의 공동 투여에 의해 영향을 받지 않았음을 나타낸다.
본 발명자는 또한 팔리비주맙과 경쟁하는 항체 형성을 유도하는 RSV F 나노입자 성분의 능력을 측정하였다. 도 23c. 이 데이터는 단독으로 및 AlPO4 또는 매트릭스 M과 함께 투여된 RSV F 나노입자가 80㎍/mL 내지 약 700㎍/mL의 실질적인 항체 역가를 유발함을 나타낸다. RSV F와 인플루엔자 나노입자 모두가 유도되었을 때, 약 20㎍/mL 내지 40㎍/mL의 저하된 반응이 항원보강제가 없거나 AlPO4로 얻어졌다. 그러나, 매트릭스 M을 사용하여, 단독 투여하거나 HA 나노입자와 함께 투여했을 때 RSV F 반응이 강했다. RSV 중화 항체의 측정은 PCA 항체와 유사한 패턴을 나타내었다. 도 23d 참조.
또한, 항체 반응에 대하여, 본 발명자는 RSV에 대한 백신 및 인플루엔자 A/스위스/9715293/2013에 대한 백신에 의해 유도된 T 세포 반응을 측정하였다. 도 2 도 23e 및 도 23f. 데이터는 매트릭스 M이 항원보강제로 사용되었을 때 두 표적에 대한 IFNγ의 강력한 유도를 나타낸다.
실시예 13
트립신 내성 나노입자 생산
인플루엔자를 생산하기 위한 특정 접근법은 HA 단백질의 트립신 민감성을 초래할 수 있으며, 이는 접힘을 변경하여 백신 제제의 면역원성 및 안정성을 감소시킨다. 트립신 내성 HA 나노입자를 생산하기 위해, 본 발명자는 중성 pH 버퍼를 사용하는 세제 교환 접근법을 사용하였다. 도 24a-c를 참조한다.
Sf9 세포를 HA 나노입자 BV 벡터 MOI = 0.1; 3E6 cells/ml로 감염시켰다. 세포를 3일에 수확하고 완충된 0.5 % NP9; pH 7.5로 용해시켰다. 본 발명자는 다음으로 음이온 교환 크로마토그래피(Fractogel TMAE, EMD)를 수행하였다. 도 24b는 예시적인 크로마토그램을 나타낸다. 플로우 스루는 HA를 함유한다. 음이온 교환 컬럼 이후에, 0.01% PS80; pH 7.2를 함유하는 고염/세제 세척을 사용하여 캅토 렌틸 렉틴 컬럼(GE)을 사용하여 세제 교환을 수행하고 0.01% PS80에서 용출하였다. 도 24c는 세제 교환 공정을 위한 예시적인 크로마토그램을 나타낸다. 마지막으로, 본 발명자는 횡류 여과(TFF): 50kD MWCO 필터; pH 7.2를 사용하여 생성물을 저장하는데 사용된 벌크 약물 물질(BDS)을 생산한다. TFF 단계 이후에 PS80은 pH 7.2의 버퍼에서 0.05%로 유지되었다.
실시예 14
트립신 내성 나노입자 분석
실시예 13에 기술된 공정 및 생산을 사용하여 다양한 균주로부터 HA 나노입자를 평가하였다. 도 25a는 A/뉴 햄프셔/1/2015(H1N1) 균주의 수율이 약 20mg/L임을 나타낸다. B 균주 인플루엔자 나노입자는 생산성과 순도가 탁월하였다. 도 25b는 대량의 약물 물질로 평가된 B 균주, B/브리시번/60/08 HA의 수율 및 순도를 나타낸다. 수율은 약 30 mg/L이었다. 도 25c는 공정이 약 96%의 순도 및 약 20mg/L의 수율을 나타내는 H3N2 균주의 수율을 나타낸다.
열역학 안정성 분석
도 25d는 실시예 13의 트립신-내성 중성 pH 접근법 대 도 18에 나타낸 바와 같은 낮은 pH 정제 단계를 사용하는 접근법을 사용하여 생산된 HA 나노입자 사이의 열역학적 프로파일 비교를 제공한다. 시차 주사 열량계(DSC) 방법은 제어된 방식으로 온도를 조절하면서 구체적으로, 시료 용액과 적절한 기준(버퍼/용매) 사이의 열 에너지 흡수의 차를 측정함으로써 용액에서 거대분자의 열역학적 프로파일을 결정하는데 사용될 수 있다. Flu HA 샘플과 관련하여, DSC는 DSC는 단백질의 절반이 변성/펼쳐지고 절반이 원래/접힌 상태인 온도로 정의되는 전이 중점(Tm)을 시각화하게 하였다.
또한, DSC는 단백질 형상에 관한 정보를 제공하고 추정된 안정성 프로파일은 상이한 공정 조건을 거치는 각각의 HA 균주에 대해 대략 외삽될 수 있다. 정제 과정에서 HA를 pH 6.0으로 노출시키는 공정 단계에 의해 정제된 HA 대 대안적 단계(예를 들어, MMC 수지 또는 TFF 막)를 통해 정제된 HA 사이의 차는 한 예로서 B/브리스번 HA를 사용하여 나타내어진다. 데이터는 Tm 값이 강도가 더 높고, 주 피크 및 더 날카로운 피크에 대한 Tm의 더 높은 개시로의 이동을 나타내어 대안적 단계에 의해 정제될 때 HA의 적절한 접힘을 암시한다. 그러나 pH 6.0에 노출된 HA에 대한 데이터는 강도가 크게 감소하고, 주 피크의 Tm에 대한 초기 개시를 나타내고, 느린 비대칭 펼쳐짐을 나타내는 피크를 현저히 넓히고 및/또는 더 높은 온도에서 잘못 접혀진 단백질 및 응집체를 함유하는 Tm 값을 나타낸다. 유사한 프로파일이 다른 균주(A/Cal, A/홍콩, A/뉴햄프셔)에서도 관찰되었다. 위에서 언급한 바와 같이 낮은 pH는 나노입자를 발생시키고 DSC 데이터의 세 가지 관찰 결과를 토대로 특정 응용을 가질 수 있지만, 본 발명자는 중성 pH를 사용하는 대안적 공정 단계/조건은 현저하게 나은 열역학적 프로파일 및 잠재적으로 개선된 안정성 프로파일을 가진 HA 단백질을 생성한다는 결론을 내렸다.
트립신 내성
도 26은 나노입자를 실시예 13에 기재된 바와 같이 제조할 때 얻어진 개선 된 트립신 내성을 예시한다. 트립신 민감성을 테스트하기 위해, HA 샘플을 0.24mg/mL로 희석하고, 37℃에서 60분 동안 트립신을 감소시키면서 배양하고, 트립신 억제제를 첨가하여 분해를 정지시킨 후에, SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 도 26의 좌측 패널과 우측 패널의 비교는 향상된 트립신 내성을 예시한다. Sf9 곤충 세포에서 제조된 정제 HA 나노입자는 HA0이다. 트립신에 노출되면 HA0은 H1의 Arg AA344에서 HA1 및 HA2로 절단된다. 정확하게 접힌 HA 삼량체는 증가하는 농도의 트립신과 함께 배양될 때 추가 분열에 저항할 것이다. 중성 pH 정제 B/브리스번/60/08은 트립신에 내성이며 정확하게 접힌다(왼쪽 패널). 산성 pH 정제 B/브리스번/60/08 HA1은 트립신 민감성이며 잘못 접힌다(오른쪽 패널). 도 26b 및 26c는 트립신 내성이 다양한 균주에 대해 달성됨을 예시한다. 도 26b는 균주 A/홍콩/4801/2014를 나타낸다. 중성 pH 정제 A/홍콩/4801/2014(H3N2)는 트립신에 내성이 있어서 정확하게 접힌다(왼쪽 패널). 산성 pH 정제 A/홍콩/4801/2014(H3N2) HA1은 트립신 민감성이며 정확하게 접히지 않는다(오른쪽 패널).
A/뉴 햄프셔/1/2015 및 H1N1 아형으로 유사한 데이터를 얻었다. 다른 균주와 마찬가지로, 산성 정제 H1N1은 잘못 접히는 반면(데이터는 표시되지 않음), 중성 pH로 정제 단백질은 트립신 내성이며 정확하게 접힌다.
상업용 독감 백신과의 비교
재조합 인플루엔자 백신 제조에 대한 이전의 접근법은 널리 성공하지 못했다. 계란 생산 또는 재조합 생산 독감 백신이 트립신 내성을 보였는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자는 계란 생산 백신과 재조합 백신(각각 Fluzone® 및 Flublok®)에서 위와 동일한 프로토콜을 사용하여 트립신-민감성을 비교하였다. 구체적으로, 희석되지 않은 백신을 37℃에서 60분 동안 다양한 양의 트립신으로 배양한 다음, 트립신 억제제를 첨가하고, 2x 샘플 버퍼를 첨가하고, SDS 페이지 전에 70℃에서 10분 동안 가열하였다.
본 발명자들은 계란 생성 변이체가 트립신 내성을 나타냄을 발견하였다. 특히, HA1과 HA2 및 HA1로 절단되는 상업적 3가 계란-유도 고 투여량 플루존 백신은 트립신 분해에 내성이 있다. 반대로, 상업적 3가 재조합 HA 플루블록 백신은 트립신에 노출될 때 HA1과 HA2 및 HA1 폴리펩타이드로 전환되고 트립신에 민감하다. 도 27(우측 패널). 이러한 결과는 균주의 적어도 하나가 pH 5.89에서의 정제로 인해 변성될 수 있음을 나타낸다(예를 들어, Wang et al. Vaccine. 24 (2006), 2176 참조).
따라서, 상업적으로 입수 가능한 재조합 인플루엔자 백신은 저 pH 조건에서의 생산으로부터 발생할 수 있는 잘못 접힘을 겪고, 적어도 부분적으로는 이들의 빈약한 면역원성 및 현재까지 광범위한 채택의 결여를 설명한다.
대조적으로, 본 발명에 개시된 방법은 적어도 pH 7.0의 버퍼를 사용하여 HA 나노입자를 정제하는 것이 HA 단백질이 정제 동안 산 조건에 노출될 때 발생하는 HA 단백질의 잘못 접힘을 감소시키거나 제거함을 확인한다.
실시예 15
에볼라 바이러스 당단백질 나노입자의 제조
2014 Makona 에볼라 바이러스로부터의 야생형 전장 비변형 EBOV 당단백질(GP) 유전자를 재조합 바큘로바이러스에 클로닝하고 담배거세미나방종 Sf9 곤충 세포에서 발현시켰다. 발현 후, N-말단 신호 펩타이드가 절단되고, 성숙한 단백질이 정제되어 나노입자로 형성된다. 정제된 에볼라 바이러스 GP(EBOV/Mak GP) 나노입자는 36±4nm(동적 광산란으로 측정)의 구형 입자로 조립된 여러 GP 삼량체로 구성된다. 재조합 GP 나노입자는 2-9 또는 최대 15개의 "칼리스-유사" 당단백질 1(GP1) 삼량체의 '부착 서브유닛'이 외측으로 연장되는 당단백질 2(GP2) '융합 서브유닛'을 함유하는 코어 영역을 갖는다.
매트릭스-M을 공동 투여하기 위해, 개별적으로 형성된 40nm 크기의 매트릭스 입자의 2개의 집단으로 이루어진 사포닌-기반 항원보강제를 사용하였다. 사용된 매트릭스-M은 85% 매트릭스-A 및 15% 매트릭스-C 이었다. 매트릭스 입자는 콜레스테롤과 인지질로 퀼라자 사포나리아 모닐라로부터의 정제된 사포닌을 제제화함으로써 형성하였다.
실시예 16
면역화 및 프로토콜
Balb/c 마우스(6-8 주령, Harlan Laboratories Inc., Frederick, MD)를 10 마리의 그룹으로 수용하고, 피하(SC) 또는 근육내(IM) 투여에 의해 면역화시켰다. 인산염 완충 식염수(PBS)를 위약으로 사용하였다. 혈청을 위한 혈액 표본을 역-궤도를 통해 수집하였다. 채혈하기 전에, 동물을 아이소플루란으로 마취시켰다.
EBOV/Mak GP 단독으로 또는 AlPO4(50μg) 또는 매트릭스-M 항원보강제(2.5μg 또는 5μg)와 혼합하여 0일 및 21일에 마우스(그룹 당 n = 10)를 IM 투여(50㎕ 주사 용량)로 면역화하였다. 0일, 14일, 21일, 28일 및 60일에 혈액 샘플을 수집하였다. 28일 및 60일에 비장 및 골수 샘플을 수집하였다. 비장 및 골수 샘플을 2% 소 태아 혈청(FBS)를 함유하는 PBS에 현탁하여 추가 준비를 하였다.
28일의 혈청 샘플을 유사비리온 비중화 리포터 검정을 사용하여 MD의 프레드릭에 있는 미국 육군 의학 연구소(USA Army Medical Research Institute of Infectious Diseases)에서 항-EBOV/Mak 중화 항체 반응에 대해 평가하였다. 스프링 구동 제트 주사기를 사용하여 전달된 한타바이러스 폐 증후군(HPS) DNA 백신은 토끼 및 비인간 영장류에서 강력한 중화 항체 반응을 유도한다. Curr Gene Ther. 2014;14: 200-210. 이 분석을 위해, 수포 구내염 바이러스 G 단백질을 제거하고 루시퍼라제 리포터로 대체하였다. 자이레 에볼라 바이러스 1976(Mayinga) GP를 발현하는 플라스미드 pWRG/EBOV-Z76(opt)을 사용하여 이런 VSV 루시퍼라제 발현 코어를 슈도타이프했다. 슈도타이핑 에볼라 GP를 제공하는데 사용된 플라스미드는 자이레 에볼라 바이러스 1976(Mayinga) GP를 발현하는 pWRG/EBOV/Mak-Z76(opt)이었다. PsV는 293T 세포에서 제조하였다. 마우스 혈청을 56℃에서 30분 동안 열 불활성화시킨 다음, 초기 1:20 희석액을 제조한 다음 10%(vol/vol) 열 불활성화 FBS, 100IU/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신(cEMEM)로 보충된 이글스 최소 필수 배지(EMEM)(Life Technologies)에서 5배 연속 희석하였다. 에볼라 GP PsV를 cEMEM으로 희석시켰다. 4x103 초점 형성 단위 및 10% 기니피그 보체(Cedarlane)를 함유하는 동일 부피의 PsVs 용액을 1:40의 최종 개시 희석을 위해 혈청 희석액에 첨가한 다음 4℃에서 밤새 배양하였다. 맑은 바닥의 검정색 96-웰 플레이트(Corning)에 뿌린 베로 세포 단층을 각 PsVs-혈청 혼합물 50μl에 감염시킨 다음 37℃에서 18-24시간 추가로 배양하였다. 배지를 버리고, 세포를 용해시키고, 루시퍼라제 기질을 레닐라 루시퍼라제 분석 시스템 프로토콜(Promega # E2820)에 따라 첨가하였다. 플래시 루시페라제 신호는 Tecan M200 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 원시 값은 GraphPad Prism 버전 6.04로 내보내졌고, 여기서 데이터는 처리되지 않은 PsV 신호로 기준선 보정되었다. 데이터는 GraphPad Prism을 사용하여 4개 파라미터 로지스틱 비선형 회귀 모델에 일치시킨 다음 PsVNA 50%(PsVNA50) 중화 역가를 각 샘플에 대한 곡선으로부터 보간하였다. 각 샘플을 삼중으로 분석하였다. 분석 양성 대조군은 자이레 에볼라 바이러스 1976 Mayinga GP DNA 백신인 pWRG/EBOV-Z76 (opt)으로 3회 접종한 토끼의 혈청이었다.
EBOV/Mak GP 특이적 혈청 항체를 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)으로 정량하였다. 간단히 말하면, NUNC MaxiSorp 미세적정 플레이트를 2-8℃에서 밤새 2㎍/mL의 EBOV/Mak GP(Novavax)로 코팅하였다. 반응하지 않은 표면을 스타팅블럭 블러킹 버퍼(StartingBlock Blocking Buffer(Pierce))로 실온(RT)에서 1시간 동안 차단하였다. 플레이트를 1:100(2 시간)으로 시작하는 혈청 샘플의 5배 연속 희석 희석액, 호오스래디쉬 퍼옥시다아제(HRP) (Southern Biotech)에 접합된 염소 항-마우스 IgG(또는 IgG1 및 IgG2a)(1시간), 퍼 옥시다제 기질인 3,3,5,5-테트라메틸벤지딘(TMB)(시그마)(10분) 및 TMB 정지 버퍼(Scy Tek Laboratories)와 실온에서 연속적으로 반응시켰다. 플레이트를 HRP 접합체 및 TMB 시약을 첨가하기 전에 PBS/Tween(Quality Biologicals)으로 3회 세척하였다.
플레이트를 SpectraMax Plus 플레이트 판독기(Molecular Devices)로 450nm에서 판독하였다. SoftMax pro 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 4-매개 변수 적합 곡선에 농도-응답을 맞추었다. 항체 역가는 50% 최대 항체 결합(EC50) 응답이 있는 가장 높은 희석의 역수로 정의되었다. 혈청 IgG 역가가 더 낮은 검출 범위를 벗어나면 <100(시작 희석)의 역가를 보고하고 그룹 기하 평균 역가(GMT)를 계산하기 위해 50의 값을 표본에 지정하였다. IBT Bioservices(Gaithersburg, MD)의 마우스 항-EBOV/Mak GP 단클론 항체(mAb)(4F3)를 양성 대조군으로 사용하였다.
IFN-γ와 EBOV/Mak GP 특이적인 IgG 분비 세포를 분석하는 ELISPOT 분석법
단일 세포 현탁액을 주사기의 플런저를 사용하여 조직을 부드럽게 연삭함으로써 개별 비장으로부터 준비하였다. 단일 골수 세포 현탁액은 21 게이지 바늘이 달린 주사기를 사용하여 2% FBS를 함유하는 PBS를 뼈를 통해 흘려서 준비하였다. 세포를 2% FBS를 함유하는 PBS로 2회 세척하고 계수하였다. IFN-γ ELISPOT 분석은 제조사의 절차에 따라 마우스 IFN-γ ELISPOT 키트(eBioscience, San Diego, CA)를 사용하여 수행하였다. 간단히 말하면, 항-IFN-γ 항체(PBS 중 15μg/ml)를 사용하여 ELISPOT 플레이트(Millipore, Darmstadt, Germany)를 100μl/well로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS로 4회 세척하고 RPMI1640 배지 + 5% FBS로 실온에서 1-2시간 동안 차단시켰다. 전체 EBOV GP 서열을 커버하는 11개의 중첩 아미노산 (2.5μg/ml)을 갖는 15-mer EBOV GP 펩타이드의 풀로 200㎕ 부피의 총 3x105개의 비장 세포를 자극하였다. 포르볼 미리스티 아세테이트(PMA)(50ng/ml)와 아이오노마이신(200ng/ml)을 양성 대조군과 음성 대조군으로 사용하였다. 각각의 자극 조건은 삼중으로 수행되었다. 분석 플레이트를 5% CO2 배양기에서 37℃에서 밤새 배양하고 신호를 제조업체의 지침에 따라 전개시켰다. ELISPOT 판독기 및 Immunospot 소프트웨어(Cellular Technology, Ltd., Shaker Heights, OH)를 사용하여 반점을 계수하고 분석하였다. 에볼라-GP 특이적인 반점 수는 GP-펩타이드 자극된 웰로부터 중간 컨트롤에서 배경 번호를 빼서 얻었다. 그래프에 표시된 데이터는 삼중 웰의 평균이다. GP 특이적 IgG 분비 세포를 측정하기 위해 ELISPOT 플레이트를 EBOV/Mak GP(PBS 중 2.5μg/ml)로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 상기한 바와 같이 세척하고 차단하였다. 웰당 3-5x105개의 비장 세포 또는 골수 세포를 3회씩 플레이트하고 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하였다. 두 번째 날에 플레이트를 세척하고 염소 항-마우스 IgG-HRP를 첨가하고 1.5시간 동안 배양하였다. 반점은 위에 설명된 대로 전개되고 계산된다. 삼중 웰의 평균 반점 수를 계산하고 제시하였다.
세포 표현형을 위한 표면 염색 및 사이토카인을 위한 세포내 염색
표면 염색을 위해, 세포를 먼저 항-CD16/32 항체(클론 2.4 G2)와 함께 배양하여 Fc 수용체를 차단하였다. 종자 중심 세포를 특성화하기 위해 1x106의 신선한 비장 세포를 다음 항체: B220-PerCP, CD19-APC, GL7-BV421, CD95-PE-Cy7(BD Biosciences, CA) 및 노란색 LIVE/DEAD® 염료(Life Technologies, NY)의 혼합물로 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 2회 세척하고, 분석을 위해 2% FBS를 함유하는 PBS에 현탁시켰다. T 소포 헬퍼 세포를 염색하기 위해 1x106개의 신선한 비장 세포를 CD3-BV650, B220-PerCP, CD4-PE-Cy7, 스트렙타비딘-BV421, PD-1-APC, CD69-FITC, CD49b-PE(BD Biosciences, CA) 및 노란색 LIVE/DEAD® 염료(Life Technologies)의 혼합물로 배양하였다. 세포를 2회 세척하고, 분석을 위해 2% FBS를 함유하는 PBS에 현탁시켰다.
사이토카인에 대한 세포내 염색을 위해, 96 웰 U-바닥 플레이트에서 웰당 1x106 세포로 비장 세포를 배양하였다. 펩타이드 자극은 ELISPOT 배양액에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. 플레이트를 BD GolgiPlug ™ 및 BD GolgiStop ™(BD Biosciences)의 존재하에 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 세포를 두 번 씻고 CD3-BV 650, CD4-PerCP, CD8-FITC, CD44-APC-Cy7 및 CD62L-PE-Cy7(BD Pharmingen, CA) 및 노란색 LIVE/DEAD® 염료(Life Technologies, NY)를 포함하는 세포 표면 마커에 대한 항체의 혼합물과 함께 4℃에서 20분 동안 배양하였다. 두 번 세척한 후, 세포를 사이토픽스/사이토펌(Cytofix/Cytoperm)으로 30분 동안 4℃에서 고정시킨 후 BD Perm/Wash™(BD Biosciences)로 2회 세척하였다. 세포를 IFN-γ-APC, IL-2-BV 421 및 TNFα-PE(BD Biosciences)에 대한 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 세포를 세척하고 데이터 수집을 위해 1xBD Perm/Wash 버퍼에 재현탁시켰다. 모든 염색 샘플은 LSR-Fortessa 유동 세포 계측기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 수집하고 데이터는 Flowjo 소프트웨어 버전 Xv10(Tree Star Inc., Ashland, OR)으로 분석하였다.
SAS 소프트웨어 버전 9.4를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. ANOVA로부터의 투키 조정에 의한 쌍 비교는 그룹을 독립 변수로 사용하였고, 그룹간에 유의성을 결정하기 위해 종속 변수로 로그-변환된 역가 결과를 사용하였다.
실시예 17
EBOV/Mak GP 유도된 항체 반응 및 보호 효능.
EBOV/Mak GP 나노입자 백신의 면역원성을 마우스 모델에서 항원보강제의 유무에 따라 평가하였다. 마우스는 매트릭스-M 또는 AlPO4 항원보강제로 제제화화된 EBOV/Mak GP 단독 또는 EBOV/Mak GP 5㎍을 SC 주사하여 0일, 14일 및 28일에 백신 접종을 받았다. 28일(2차 면역 후 14일)에 얻은 혈청 분석 결과는 매트릭스-M 항원보강된 EBOV/Mak GP는 마인가 GP에 대한 항원 특이적 IgG 항체를 26,991의 기하 평균 역가(GMT)로 유도하였다. 매트릭스-M을 이용한 EBOV/Mak GP 면역 접종 후 얻은 반응은 EBOV/Mak GP 단독(GMT = 266, p = 0.001) 또는 AlPO4로 항원보강된 EBOV/Mak GP(GMT = 436, p = 0.0001)로 유도된 것보다 현저하게 높았다(도 28a). AlPO4 항원보강제는 EBOV/Mak GP 단독에 비해 항-EBOV/Mak GP IgG의 미미한 증가만을 나타냈다.
28일의 혈청의 중화 활성을 에볼라 GP 의사 바이러스(PsVs)를 사용하여 분석하였다(도 28b). EBUV/Mak GP 단독으로 면역화된 마우스의 혈청 중화 GMT 역가는 197이었고 EBOV/Mak GP를 AlPO4로 항원보강되었을 때, 낮은 역가가 관찰되었다(GMT = 49, p = 0.1). 매트릭스-M을 갖는 EBOV/Mak GP로 면역화된 마우스의 혈청에서 관찰 된 중화 역가는 GMO가 6,463으로 EBOV/Mak GP 단독으로 얻은 것보다 32배 높았다. 이 분석에서, EBOV 1976 마인가 균주 GP를 발현하는 PsV는 EBOV/Mak 2014 균주 GP를 발현하는 PsV가 이용 가능하지 않았기 때문에 사용되었다. 따라서, 이 분석은 마인가 GP에 대한 항-EBOV/Mak GP의 교차 중화 활성을 측정하는 것이다.
28일에 주어진 세 번째 백신 접종 2주 후 42일에, 마우스를 1,000 pfu 마우스 적응 자이레 에볼라 바이러스 1976 마인가의 복강내 접종에 의해 면역성 검사하였다. 대조군 마우스는 3일 후 감염된 반면 EBOV/Mak GP 단독 또는 AlPO4로 항원보강된 EBOB/Mak GP로 접종된 마우는 각각 5일 또는 6일에 감염되었다. 면역성 검사 감염 21일 후, 매트릭스-M 항원보강된 EBOV/Mak GP 접종된 모든 마우스와 EBOV/Mak GP 단독으로 접종된 한 마우스가 살아서 건강하였다. 대조적으로, 다른 모든 마우스는 에볼라 바이러스 감염으로 인해 8일에 죽거나 안락사시켰다(도 28c).
실시예 18
에볼라-GP IgG, IgG1 및 IgG2a 반응의 동역학
매트릭스-M-항원보강된 EBOV/Mak GP에 대한 면역 반응을 보다 상세하게 특징을 묘사하기 위해, 두 그룹의 Balb/c 마우스(10 마리/그룹)에게 2.5 또는 5μg 매트릭스-M으로 항원보강된 5μg EBOV/Mak GP를 주사하였다. PBS, EBOV/Mak GP 단독 또는 AlPO4를 갖는 EBOV/Mak GP가 주사된 마우스 그룹을 대조군으로 사용하였다. 14, 21, 28 및 60일에, EBOV/Mak GP-특이적 IgG 및 IgG 서브 클래스(IgG1 및 IgG2a)를 ELISA로 측정하였다.
첫 번째 주사 후 14일에, EBOV/Mak GP를 매트릭스-M(2.5 또는 5μg)으로 주사 한 모든 마우스는 EBOV/Mak GP-특이적 IgG(GMT = 755 및 1,499, 데이터는 나타내지 않았다)에 의해 반응하였다. EBOV/Mak GP 그룹 및 AlPO4를 갖는 EBOV/Mak GP에서 10 마리 마우스는 모두 EBOV/Mak GP 특이적 IgG를 생성하지 않았다(데이터는 나타내지 않았다). 21일까지, EBOV/Mak GP에 대한 IgG 반응은 매트릭스-M-항원보강된 그룹에서 더 증가하였다(도 29a). EBOV/Mak GP 단독 또는 AlPO4를 갖는 EBOV/Mak GP이 투여된 그룹에서 아직 응답이 없었다. 모든 마우스는 21 일에 제 2 차 주사를 받았다. 28일에, 매트릭스-M(2.5 또는 5㎍)을 투여한 마우스에서 IgG 반응이 3.0x105 및 4.9x105의 ELISA GMT 역가로 강하게 증가하였다(도 29a). EBOV/Mak GP 단독 및 AlPO4 갖는 그룹에서 28일 및 60일에, 특정 IgG 반응이 일부 마우스에서 검출되었지만, 매트릭스-M을 갖는 EBOV/Mak GP로 면역화된 마우스에서 보다 현저하게 낮았다(도 29a). 60일까지, 2.5 또는 5μg의 매트릭스-M을 갖는 EBOV/Mak GP에 의해 유도된 항-GP IgG 역가는 28일에 비해 현저하게 감소하지 않았고, AlPO4 그룹을 갖는 EBOV/Mak에서 보다 각각 67배 및 139배 더 높았다 (도 29a).
EBOV/Mak GP-특이적 IgG1 및 IgG2a 반응도 또한 결정되었다. 총 IgG와 유사하게, 매트릭스-M 항원보강된 EBOV/Mak GP 백신은 28일과 60일에 높은 항-GP IgG1 및 IgG2a 수준을 유도하였다(도 29b 및 29c). 대조적으로, EBOV/Mak GP 단독을 투여 한 마우스 10 마리 중 한 마리와 AlPO4를 갖는 EBOV/Mak GP를 투여한 마우스 10 마리 중 4 마리는 28일에 IgG1의 수준이 낮았다(도 29b). 60일에, AlPO4를 갖는 EBOV/Mak GP가 투여된 그룹에서 나머지 5 마리 모두의 혈청에서 항원-특이적 IgG1이 검출되었지만, 평균 역가는 각각 2.5 또는 5.0㎍ 매트릭스-M를 갖는 EBOV/Mak GP가 투여된 그룹에 비해 51배 및 41배 낮았다(도 29b). 또한, EBOV/Mak GP 단독은 28일과 60일에 검출 가능한 IgG2a 항체를 유도하지 않았다.
실시예 19
CD4+, CD8+ 및 다기능 T 세포 반응
ELISPOT 분석에서 EBOV/Mak GP 펩티드로 비장 세포를 생체외 자극한 후 IFN-γ 분비 T 세포의 수를 측정함으로써 상이한 EBOV/Mak GP 제제에 대한 T 세포 반응을 평가하였다. 28일에, 매트릭스-M을 갖는 EBOV/Mak GP로 면역화된 마우스로부터의 비장에서 IFN-γ 분비 세포가 매트릭스-M 투여량-의존적 방식으로 증가하였다 (도 30a, 30b). EBOV/Mak GP가 투여된 그룹에서의 평균 IFN-γ 분비 세포 수는 각각 5.0 및 2.5μg이었고 EBOV/Mak GP가 단독 투여된 그룹에서 각각 17배 및 10배 높았고 AlPO4를 갖는 EBOV/Mak GP가 투여된 그룹에서 각각 8배 및 5배 더 높았다(도 30a).
60일까지, EBOV/Mak GP로 면역화된 마우스의 비장에서 5-㎍의 매트릭스-M으로 면역화된 IFN-γ 분비 세포의 수는 여전히 EBOV/Mak GP 단독으로 면역화된 마우스의 비장에서 12배 더 높았고 AlPO4를 갖는 EBOV/Mak GP로 면역화된 마우스의 비장에서보다 3배 더 높았다(도 30b). 2.5㎍의 매트릭스-M를 갖는 EBOV/Mak GP로 면역화된 마우스로부터의 비장에서 IFN-γ 분비 세포의 증가된 수는 또한 60일에 유지되었지만 5㎍ 매트릭스-M에 의한 것보다 낮은 수준으로 유지되었다.
본 발명자는 또한 세포 표면 마커와 결합된 사이토카인의 세포내 염색에 의해 매트릭스-M 유도된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 평가하였다. 28일에 유동 세포 계측 염색에 의한 비장 세포의 분석은 매트릭스-M 그룹을 갖는 EBOV/Mak GP로부터의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두가 IFN-γ, TNFα 및 IL-2를 분비한다는 것을 보여주었다 (도 30c 및 30d). 사이토카인-분비 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 빈도는 대조군 마우스, EBOV/Mak GP 단독 또는 AlPO4와 함께 EBOV/Mak GP를 투여받은 마우스에서 관찰된 기저선 또는 최소 반응보다 매트릭스-M 그룹를 갖는 EBOV/Mak GP의 비장에서 훨씬 더 높았다(도 30c 및 30d). 2개 또는 그 이상의 사이토카인(IFN-γ, TNFα 및 IL-2)을 동시에 생성하는 T 세포의 빈도도 28일에 평가하였다. 2개 또는 3개의 사이토카인을 생성하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두는 매트릭스-M를 갖는 EBOV/Mak GP로 면역화된 마우스로부터의 비장에서 현저한 수준으로 검출되었다.
실시예 20
종자 센터와 T 소포 헬퍼 세포 반응
비장에서의 GC B 세포의 빈도 및 절대 수를 유동 세포 계측 염색으로 분석하였다(도 31a). 분석 결과는 28일(2차 백신 접종 후 7 일)에 2.5와 5㎍ 매트릭스-M 항원보강된 EBOV/Mak GP는 위약, EBOV/Mak GP 단독 또는 AlPO4를 갖는 EBOV/Mak GP(각각 0.38, 0.41 및 0.44%)과 비교하여 GC 빈도가 각각 1.22와 2.12%로 증가한 것으로 나타내었다(도 31b). 따라서, 비장에서 절대 GC 세포 수는 매트릭스-M을 투여받은 그룹에서 증가하였다(도 31c). 60일까지, 빈도 및 절대 수는 배경 수준으로 되돌아갔다(도 31d 및 31e)
28일의 TFH 세포 분석 결과, 2.5 또는 5μg의 매트릭스-M을 갖는 EBOV/Mak GP는 EBOV/Mak GP 단독 또는 AlPO4를 갖는 EBOV/Mak GP보다 TFH 세포의 빈도가 더 높았다(도 32a 및 32b). 따라서, TFH 세포의 절대 수는 EBOV/Mak GP 단독 또는 AlPO4를 갖는 EBOV/Mak GP(도 32C)와 비교하여 매트릭스-M를 갖는 EBOV/Mak GP에 의해 또한 증가되었다. 60일까지, TFH 세포의 빈도 및 절대 수는 배경 수준 근처로 후퇴하였다(도 32d 및 32e).
실시예 21
EBOV/Mak GP-특이적 혈장 세포
EBOV/Mak GP-특이적 혈장 세포에 대한 매트릭스-M의 영향을 평가하기 위해, 면역화 후 60일에 비장 및 골수 내 IgG 생성 세포의 수를 분석하였다. 60일에서의 분석은 매트릭스-M 항원보강된 EBOV/Mak GP 백신(도 33a)으로 면역화된 마우스로부터의 비장에서 단지 몇 개의 EBOV/Mak GP-특이적 IgG 분비 세포(< 6/106개의 비장 세포)를 입증하였다. EBOV/Mak GP 단독 및 AlPO4를 갖는 EBOV/Mak GP(도 33a)로 면역화된 마우스로부터의 비장에서 IgG-분비 세포가 검출되지 않았다. 대조적으로, 많은 수의 EBOV/Mak GP-특이적 IgG-분비 세포가 매트릭스-M 항원보강된 EBOV/Mak GP(도 33b)를 투여받은 마우스로부터의 골수에 나타나서, 수명이 긴 혈장 B 세포의 형성을 입증하였다.
실시예 22
나노입자에 결합하는 항체의 특징 묘사
본 발명자들은 나노입자에 결합하기 위한 몇몇 항-에볼라 항체의 능력을 테스트하였다. 항체는 13C6, 13F6, 6D8 및 KZ52이다. EC50 곡선 및 값을 도 36에 나타내었고 추가의 결합 동역학 데이터를 도 37에 나타내었다. 도 38은 13C6을 참조로 사용하는 효능 데이터를 나타낸다. 4개의 항체 중 3개의 항체가 GP에 우수한 결합을 나타내었다.
실시예 23
비인간 영장류 연구: 개코원숭이
비인간 영장류 모델에서 마우스에서 얻어진 결과를 확인하기 위해, 개코원숭이 연구를 수행하였다. 이 연구는 도 39와 같이 설계되었다. 네 그룹이 형성되었다. 그룹 1이 대조군이었다. 그룹 2는 AlPO4를 갖는 항원을 투여받았다. 그룹 2와 3은 50㎍의 매트릭스-M를 갖는 60㎍과 5㎍의 항원을 투여받았다. 개코원숭이는 0일과 21일에 예방 접종을 받았다. 마코나 GP와 마인가 GP 모두에 대해 강력한 반응을 보였다. 도 40을 참조한다. 추가 분석 결과 응답이 오래 지속되는 것으로 확인되었다. 도 41은 나중 시점에서 마코나에 대한 IgG의 EC50 값을 나타낸다. 응답을 확립하는 데이터가 유지된다.
추가의 연구는 IFN-γ 수준이 면역화 후에 실질적으로 증가하는 것을 확인한다. 도 42는 GP와 병용 투여된 매트릭스 M이 명반 항원보강제보다 증가함을 보여준다. 흥미롭게도 GP의 저용량인 5㎍은 IFN-γ의 증가를 나타냈다. T 세포에서의 TNF-α 및 IFN-γ 반응은 도 43에 나타나 있으며, 도 44에 나타낸 사이토카인 반응을 나타낸다. 다시, 반응은 명반보다 각각의 경우에서 GP 및 매트릭스 M으로 더 두드러진다. 이들 데이터는 개코원숭이 모델에서 개시된 제제의 견고한 면역 반응을 강조한다.
실시예 24
비인간 영장류 연구: 필리핀 원숭이 연구 1
나노입자의 보호 효과를 추가로 확인하기 위해, 도 45에 나타낸 바와 같은 필리핀 원숭이 연구를 수행하였다. 0일과 21일에 필리핀 원숭이를 백신으로 근육내 면역화하고, 42일에 접종하였다. 항-GP 반응은 0일과 28일에 측정하였다. 도 46에서 보듯이, 면역화된 필리핀 원숭이는 항 IgG 항체의 극적인 유도를 나타내었다. 면역 반응은 도 47에 나타낸 바와 같이 특징지워진다. 다양한 펩타이드 풀에 대한 반응으로 IFN-γ 분비 세포를 0, 3, 5주에서 측정하였다. 결과는 면역화된 필리핀 원숭이가 면역화된 필리핀 원숭이에서 IFN-γ-분비 세포를 유도한다는 것을 입증한다.
동물의 생존은 현저했다. 도 48. 7일까지, 위약으로 치료한 원숭이의 에볼라 바이러스 부하는 107이었고, 9일까지, 위약 동물을 안락사시켰다. 대조적으로, 치료된 동물의 100%는 생존했다. 놀랍게도, 면역 반응은 거의 모든 시점에서 거의 모든 동물에서 바이러스 부하가 RT-PCR에 의해 감지되지 못하게 할 수 있었다. 동물 33362는 7일에 검출 가능한 한계보다 약 10% 높은 바이러스 부하를 나타내었다. 그러나 10일에, 수준을 검출하는 분석 능력 아래로 수준이 떨어졌다.
실시예 25
비인간 영장류 연구: 필리핀 원숭이 연구 2
두 번째 연구를 필리핀 원숭이에서 수행하였다. 동물에게 0주에 5μg GP + 50μg 매트릭스-M을 투여하고, 3주 또는 6주 후속 부스트(follow-on boost)를 투여했다. 이후 면역화된 동물에게 야생형 에볼라 바이러스를 9주 및 12주에 각각 투여하였다. 도 49.
IgG에 대한 ELISA 데이터를 도 50에 나타내었다. 왼쪽 패널은 첫 번째 주사 3주 후에 높은 역가가 발달하여 유지되었다는 것을 나타낸다. 오른쪽 패널은 주간 투여 간격이 6주인 동물의 결과를 나타낸다. 이 동물들은 두 번째 부스터 투여 2주 후에 상당한 증가를 나타냈으며 프라임-부스트(prime-boost) 접근법의 유익한 효과를 나타내었다.
백신 조성물은 필리핀 원숭이에서 완전히 보호되었다. 살아있는 바이러스로 감염시킨 지 18일 후, 생리 식염수 대조군 치료 마우스는 모두 죽었다. 대조적으로, 백신 조성물로 면역화된 필리핀 원숭이의 100%는 면역성 검사에서 살아남았다. 종합적으로, 이들 데이터는 부스터 투여가 3주내 또는 6주 이내에 발생하던지 조성물에 의해 자극된 면역 반응이 보호성이라는 것을 확인한다.
SEQUENCE LISTING <110> Novavax, Inc. Smith, Gale Liu, Ye Tian, Jing-Hui Massare, Michael J. Boddapati, Sarathi Shane, Erica Oliver, Cynthia <120> VACCINE COMPOSITIONS HAVING IMPROVED STABILITY AND IMMUNOGENICITY <130> NOVV-060/03US 305047-2730 <150> US 62/350,973 <151> 2016-06-16 <150> US 62/309,216 <151> 2016-03-16 <150> US 62/255,786 <151> 2015-11-16 <150> US 62/213,947 <151> 2015-09-03 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1725 <212> DNA <213> Respiratory syncytial virus <400> 1 atggagttgc taatcctcaa agcaaatgca attaccacaa tcctcactgc agtcacattt 60 tgttttgctt ctggtcaaaa catcactgaa gaattttatc aatcaacatg cagtgcagtt 120 agcaaaggct atcttagtgc tctgagaact ggttggtata ccagtgttat aactatagaa 180 ttaagtaata tcaaggaaaa taagtgtaat ggaacagatg ctaaggtaaa attgataaaa 240 caagaattag ataaatataa aaatgctgta acagaattgc agttgctcat gcaaagcaca 300 ccaccaacaa acaatcgagc cagaagagaa ctaccaaggt ttatgaatta tacactcaac 360 aatgccaaaa aaaccaatgt aacattaagc aagaaaagga aaagaagatt tcttggtttt 420 ttgttaggtg ttggatctgc aatcgccagt ggcgttgctg tatctaaggt cctgcaccta 480 gaaggggaag tgaacaagat caaaagtgct 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acacattata ttatgtaaat 1380 aagcaagaag gtaaaagtct ctatgtaaaa ggtgaaccaa taataaattt ctatgaccca 1440 ttagtattcc cctctgatga atttgatgca tcaatatctc aagtcaacga gaagattaac 1500 cagagcctag catttattcg taaatccgat gaattattac ataatgtaaa tgctggtaaa 1560 tccaccacaa atatcatgat aactactata attatagtga ttatagtaat attgttatca 1620 ttaattgctg ttggactgct cttatactgt aaggccagaa gcacaccagt cacactaagc 1680 aaagatcaac tgagtggtat aaataatatt gcatttagta actaa 1725 <210> 2 <211> 574 <212> PRT <213> Respiratory syncytial virus <400> 2 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg 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Ser Ala Ser Ser Gly Lys Leu Gly 465 470 475 480 Leu Ile Thr Asn Thr Ile Ala Gly Val Ala Gly Leu Ile Thr Gly Gly 485 490 495 Arg Arg Thr Arg Arg Glu Ala Ile Val Asn Ala Gln Pro Lys Cys Asn 500 505 510 Pro Asn Leu His Tyr Trp Thr Thr Gln Asp Glu Gly Ala Ala Ile Gly 515 520 525 Leu Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Ala Glu Gly Ile Tyr Ile 530 535 540 Glu Gly Leu Met His Asn Gln Asp Gly Leu Ile Cys Gly Leu Arg Gln 545 550 555 560 Leu Ala Asn Glu Thr Thr Gln Ala Leu Gln Leu Phe Leu Arg Ala Thr 565 570 575 Thr Glu Leu Arg Thr Phe Ser Ile Leu Asn Arg Lys Ala Ile Asp Phe 580 585 590 Leu Leu Gln Arg Trp Gly Gly Thr Cys His Ile Leu Gly Pro Asp Cys 595 600 605 Cys Ile Glu Pro His Asp Trp Thr Lys Asn Ile Thr Asp Lys Ile Asp 610 615 620 Gln Ile Ile His Asp Phe Val Asp Lys Thr Leu Pro Asp Gln Gly Asp 625 630 635 640 Asn Asp Asn Trp Trp Thr Gly Trp Arg Gln Trp Ile Pro Ala Gly Ile 645 650 655 Gly Val Thr Gly Val Ile Ile Ala Val Ile Ala Leu Phe Cys Ile Cys 660 665 670 Lys Phe Val Phe 675 <210> 28 <211> 676 <212> PRT <213> Ebola virus <400> 28 Met Gly Val Thr Gly Ile Leu Gln Leu Pro Arg Asp Arg Phe Lys Arg 1 5 10 15 Thr Ser Phe Phe Leu Trp Val Ile Ile Leu Phe Gln Arg Thr Phe Ser 20 25 30 Ile Pro Leu Gly Val Ile His Asn Ser Thr Leu Gln Val Ser Asp Val 35 40 45 Asp Lys Leu Val Cys Arg Asp Lys Leu Ser Ser Thr Asn Gln Leu Arg 50 55 60 Ser Val Gly Leu Asn Leu Glu Gly Asn Gly Val Ala Thr Asp Val Pro 65 70 75 80 Ser Val Thr Lys Arg Trp Gly Phe Arg Ser Gly Val Pro Pro Lys Val 85 90 95 Val Asn Tyr Glu Ala Gly Glu Trp Ala Glu Asn Cys Tyr Asn Leu Glu 100 105 110 Ile Lys Lys Pro Asp Gly Ser Glu Cys Leu Pro Ala Ala Pro Asp Gly 115 120 125 Ile Arg Gly Phe Pro Arg Cys Arg Tyr Val His Lys Val Ser Gly Thr 130 135 140 Gly Pro Cys Ala Gly Asp Phe Ala Phe His Lys Glu Gly Ala Phe Phe 145 150 155 160 Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Ser Thr Val Ile Tyr Arg Gly Thr Thr Phe 165 170 175 Ala Glu Gly Val Val Ala Phe Leu Ile Leu Pro Gln Ala Lys Lys Asp 180 185 190 Phe Phe Ser Ser His Pro Leu Arg Glu Pro Val Asn Ala 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Leu Leu Gln Arg Trp Gly Gly Thr Cys His Ile Leu Gly Pro Asp Cys 565 570 575 Cys Ile Glu Pro His Asp Trp Thr Lys Asn Ile Thr Asp Lys Ile Asp 580 585 590 Gln Ile Ile His Asp Phe Val Asp Lys Thr Leu Pro Asp Gln Gly Asp 595 600 605 Asn Asp Asn Trp Trp Thr Gly Trp Arg Gln Trp Ile Pro Ala Gly Ile 610 615 620 Gly Val Thr Gly Val Ile Ile Ala Val Ile Ala Leu Phe Cys Ile Cys 625 630 635 640 Lys Phe Val Phe

Claims (93)

  1. (i) 비이온성 세제 코어 및 바이러스 당단백질를 포함하는 나노입자; 및
    (ii) 약학적으로 허용가능한 완충제를 포함하며,
    여기서 바이러스 당단백질은 코어와 결합하고 세제는 약 0.03% 내지 약 0.05%로 존재하며, 비이온성 세제는 PS20, PS40, PS60, PS65 및 PS80으로 이루어진그룹으로부터 선택되는 백신 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    바이러스 당단백질은 RSV F 단백질, 에볼라 당단백질, 광견병 바이러스 G 단백질, 인플루엔자 HA 단백질, 인플루엔자 NA 단백질 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 백신 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    바이러스 당단백질은 RSV F 단백질이고 비이온성 세제 대 바이러스 당단백질의 몰비가 약 30 : 1 내지 약 60 : 1인 백신 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    RSV F 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 137-146에 상응하는 10개 아미노산의 결실 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 131 내지 136에 상응하는 불활성화 1차 퓨린 분해 위치를 포함하며, 여기서 1차 퓨린 절단 위치가 돌연변이에 의해 불활성화되는 백신 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    조성물은 임의의 다른 세제를 실질적으로 함유하지 않는 백신 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서,
    RSV-F 단백질은 SEQ ID NOS: 1-13 및 N-말단 신호 펩타이드의 일부 또는 전부를 갖지 않는 SEQ ID NOS:1-13의 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 백신 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    RSV F 단백질은 SEQ ID NO: 19를 포함하는 백신 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서,
    RSV F 단백질은 SEQ ID NO: 19로 이루어진 백신 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    비이온성 세제는 PS80인 백신 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    몰비는 약 50인 백신 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 완충액은
    (i) 15mM 내지 25mM의 인산 나트륨;
    (ii) 약 150mM의 NaCl;
    (iii) 0.25% 내지 2% w/v의 히스티딘;
    을 포함하며, 여기서 조성물의 pH는 5.8 내지 6.4인 백신 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 완충액은
    (i) 약 22mM의 인산 나트륨;
    (ii) 약 150mM의 NaCl;
    (iii) 약 1%의 히스티딘;
    을 포함하며, 여기서 조성물의 pH는 약 6.2인 백신 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    RSV F 단백질은 단백질에 연결된 지방산을 추가로 포함하는 백신 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서,
    나노입자는 약 20nm 내지 약 60nm의 입자 크기(Z-ave) 직경을 갖는 백신 조성물.
  15. 제 2 항에 있어서,
    백신 조성물은 약 60㎍/mL 내지 약 290㎍/mL의 농도의 RSV F 단백질을 포함하는 백신 조성물.
  16. 제 1 항에 있어서,
    나노입자의 형상은 구형 올리고머 또는 이방성 막대인 백신 조성물.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    백신 조성물은 분석적 초원심 분리에 의해 결정된 바와 같이 임의의 다른 세제가 실질적으로 존재하지 않는 백신 조성물.
  18. 제 10 항에 있어서,
    각각의 나노입자는 4 내지 7개의 RSV F 단백질 삼량체를 포함하는 백신 조성물.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염을 예방하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    조성물은 근육내 투여되는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서,
    각각의 투여량은 RSV F 단백질 약 30㎍ 내지 약 150㎍로 이루어지는 방법.
  22. 제 19 항에 있어서,
    단일 투여량의 조성물이 투여되는 방법.
  23. 제 19 항에 있어서,
    대상은 성인, 고령자, 임산부 성인, 아동, 신생아 및 유아로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  24. 제 19 항에 있어서,
    조성물은 항원보강제를 포함하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    항원보강제는 명반 항원보강제이고, 항원보강제의 80% 이상이 나노입자에 결합되어있는 방법.
  26. 제 19 항에 있어서,
    조성물은 첨가된 항원보강제를 함유하지 않는 방법.
  27. 제 22 항에 있어서,
    투여량은 약 0.5mL의 부피인 방법.
  28. 적어도 3개의 RSV F 나노입자 유형의 이종 집단을 포함하는 조성물로서, 여기서 각각의 나노입자는 PS80을 포함하는 세제 함유 코어를 둘러싸는 적어도 하나의 RSV F 단백질 삼량체를 포함하며,
    여기서 제 1 RSV F 나노입자 유형은 비등방성 막대를 포함하고,
    여기서 제 2 RSV F 나노입자 유형은 구형 올리고머를 포함하고,
    여기서 제 3 RSV F 나노입자 유형은 이방성 막대 및 구형 올리고머의 중간체를 포함하는 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서,
    각각의 RSV F 삼량체는 SEQ ID NO: 2의 137-146의 잔기에 상응하는 1 내지 10개의 아미노산이 결실된 RSV F 단백질 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
  30. 제 28 항에 있어서,
    각각의 RSV F 삼량체는 (i) SEQ ID NO: 2의 잔기 137-146에 상응하는 1 내지 10개의 아미노산의 결실 및 (ii) 불활성화된 1차 융합 절단 위치를 갖는 RSV F 단백질 및 이들의 혼합물을 포함하는 조성물.
  31. 제 29 항에 있어서,
    RSV F 단백질은 SEQ ID NOS: 1-13 및 N-말단 신호 펩타이드의 일부 또는 전부를 갖지 않는 SEQ ID NOS:1-13의 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
  32. 제 31 항에 있어서,
    RSV F 단백질은 SEQ ID NO: 19를 포함하는 조성물.
  33. 제 31 항에 있어서,
    RSV F 단백질은 SEQ ID NO: 19로 이루어진 조성물.
  34. 제 1 세제를 사용하여 숙주 세포로부터 RSV F 단백질 추출물을 제조하고 제 1 세제와 PS80인 제 2 세제를 교환하는 단계를 포함하며, 나노입자는 PS80의 양이 약 0.03% 내지 약 0.05%로 유지될 때 향상된 안정성을 나타내는 RSV F 단백질 나노입자의 제조 방법.
  35. 제 34 항에 있어서,
    제 1 세제는 NP-9인 방법.
  36. 제 34 항에 있어서,
    향상된 안정성은 프로테아제 내성, 산화 스트레스 저항성, 열 스트레스 저항성 및 교반 내성 중 하나 이상으로부터 선택되는 방법.
  37. 제 34 항에 있어서,
    PS80은 약 30 내지 약 60의 RSV F 단백질에 대한 몰비로 존재하는 방법.
  38. PS80 세제 코어와 결합된 바이러스 단백질 삼량체를 포함하며 PS80:바이러스 단백질 삼량체의 몰비가 약 30 내지 약 60, 바람직하게는 약 50인 나노입자.
  39. 제 38 항에 있어서,
    바이러스 단백질 삼량체는 RSV F 단백질 삼량체인 나노입자.
  40. 제 38 항에 있어서,
    나노입자는 동적 광산란에 의해 측정했을 때 약 20 내지 약 60nm의 평균 직경(Z-ave)을 갖는 나노입자.
  41. 제 38 항에 있어서,
    각각의 RSV F 단백질 삼량체는 SEQ ID NO: 2의 잔기 137-146에 상응하는 1 내지 10개의 아미노산이 결실된 RSV F 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 RSV F 단백질을 함유하는 나노입자.
  42. 제 41 항에있어서,
    불활성화된 1차 융합 절단 위치를 추가로 포함하는 나노입자.
  43. 제 39 항에 있어서,
    RSV F 단백질은 SEQ ID NOS: 1-13 또는 N-말단 신호 펩타이드의 일부 또는 전부를 갖지 않는 SEQ ID NOS: 1-13 중 어느 하나의 서열을 갖는 나노입자.
  44. 제 39 항에 있어서,
    RSV F 단백질은 SEQ ID NO: 2의 137-146의 잔기에 상응하는 10개의 아미노산의 결실 및 133, 135 및 136 위치에서의 아르기닌 잔기의 글루타민으로의 돌연변이에 의한 1차 퓨린 절단 위치의 불활성화를 포함하는 나노입자.
  45. 제 44 항에 있어서,
    RSV F 단백질은 SEQ ID NO: 19를 포함하는 나노입자.
  46. 제 44 항에 있어서,
    RSV F 단백질은 SEQ ID NO: 19로 이루어진 나노입자.
  47. (i) 제 1 세제를 포함하는 단백질 추출물을 단백질 정제 컬럼에 결합시키는 단계;
    (ii) 제 1 세제를 실질적으로 제 2 세제로 대체하여 세제 교환을 수행하는 단계; 및
    (iii) 제 2 세제의 존재하에 컬럼으로부터 단백질 추출물을 용리시켜 나노입자를 제공하는 단계를 포함하는 비이온성 세제 코어를 둘러싸고 있는 단백질 항원을 포함하는 나노입자의 제조 방법으로서,
    제 2 세제:단백질의 몰비가 약 30 내지 약 60이고; 제 2 세제는 PS20, PS40, PS60, PS65 및 PS80으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  48. 제 47 항에 있어서,
    단백질 항원은 바이러스 당단백질인 방법.
  49. 제 48 항에 있어서,
    비이온성 세제는 PS80인 방법.
  50. 제 47 항에 있어서,
    제 1 세제는 NP-9인 방법.
  51. 제 47 항에 있어서,
    단백질 항원은 RSV-F 당단백질인 방법.
  52. 제 47 항에 있어서,
    몰비는 약 45 내지 약 60인 방법.
  53. 제 52 항에 있어서,
    몰비는 약 45인 방법.
  54. 제 47 항에 있어서,
    명반에 결합된 조성물에서 나노입자의 80% 이상을 갖는 나노입자를 포함하는 조성물을 제공하기 위해 나노입자와 명반 항원보강제를 조합하는 단계(iv)를 추가로 포함하는 방법.
  55. 제 54 항에 있어서,
    나노입자의 90% 이상이 명반에 결합되는 방법.
  56. 제 47 항에 있어서,
    단백질 추출물은 Sf9 숙주 세포에서 단백질을 재조합적으로 발현시키고 단백질 추출물을 제공하기 위해 숙주 세포를 제 1 세제로 처리하는 것을 포함하는 단계에 의해 제조되고, Sf9 세포는 카텝신 L 또는 키티나아제에 대한 단일 녹아웃, 또는 카텝신 L 및 키티나아제 모두에 대한 이중 녹아웃 세포인 방법.
  57. 제 47 항에 있어서,
    단백질 정제 칼럼이 렌틸 렉틴 칼럼인 방법.
  58. 비이온성 세제 코어 및 적어도 두 개의 바이러스 단백질을 포함하며 각각의 바이러스 단백질은 코어와 결합하고 비이온성 세제: 적어도 하나의 바이러스 단백질의 몰비는 약 30 내지 약 60인 조합 나노입자 .
  59. 제 58 항에 있어서,
    나노입자는 인플루엔자 HA 단백질 및 RSV F 단백질을 포함하는 조합 나노입자.
  60. 제 58 항에 있어서,
    나노입자는 인플루엔자 HA 단백질 및 인플루엔자 NA 단백질을 포함하는 조합 나노입자.
  61. 제 60 항에 있어서,
    HA 및 NA 단백질은 동일한 인플루엔자 서브 타입으로부터 유래되는 조합 나노입자.
  62. 제 60 항에 있어서,
    HA 및 NA 단백질이 상이한 인플루엔자 서브 타입들로부터 유래되는 조합 나노입자.
  63. 제 60 항에 있어서,
    HA 및 NA 단백질 중 적어도 하나는 그룹 1 또는 그룹 2 인플루엔자로부터 유래되는 조합 나노입자.
  64. 제 60 항에 있어서,
    HA 및 NA 단백질 중 적어도 하나는 B형 인플루엔자로부터 유래되는 조합 나노입자.
  65. 제 1 항의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응을 유도하는 방법.
  66. 제 65 항에 있어서,
    대상은 인간 여성인 방법.
  67. 제 66 항에 있어서,
    인간 여성은 임신 중인 방법.
  68. 항-RSV F 항체를 보유하는 유아에게 제 1 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 유아에서 면역 반응을 증가시키는 방법.
  69. (i) 제 1 세제를 포함하는 단백질 추출물을 단백질 정제 컬럼에 결합시키는 단계;
    (ii) 제 1 세제를 실질적으로 제 2 세제로 대체하여 세제 교환을 수행하는 단계; 및
    (iii) 제 2 세제의 존재하에 컬럼으로부터 단백질 추출물을 용리시켜 나노입자를 제공하는 단계;
    를 포함하며
    여기서 시차 주사 열량계로 측정한 나노입자의 전이 중점(Tm)은 적어도 약 60이고, 제조 중에 사용된 완충액은 7.0 미만의 pH를 갖지 않는 재조합 트립신 내성 인플루엔자 HA 나노입자의 제조 방법.
  70. 제 69 항의 방법에 따라 제조된 재조합 트립신 내성 HA 나노입자.
  71. 제 70 항의 나노입자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신 조성물.
  72. 항원보강제를 포함하는 제 71 항의 나노입자를 포함하는 백신 조성물.
  73. 제 35 항에 있어서,
    제 1 세제의 교환은 HPLC에 의해 검출된 NP-9의 양이 약 0.1% 미만, 약 0.01% 미만, 약 0.001% 미만 또는 검출 불가능한 정도로 완료되는 방법.
  74. 비이온성 세제 코어와 결합된 에볼라 바이러스 GP 삼량체를 포함하는 에볼라 바이러스 당단백질(GP) 나노입자.
  75. 제 74 항에 있어서,
    코어 내의 비이온성 세제는 폴리소르베이트-80(PS80)을 포함하는 나노입자.
  76. 제 74 항에 있어서,
    나노입자는 약 20 내지 약 40nm의 평균 직경을 갖는 나노입자.
  77. 제 74 항에 있어서,
    나노입자는 에볼라 바이러스 GP 삼량체의 다중 복제물을 함유하는 나노입자.
  78. 제 77 항에 있어서,
    나노입자는 15개 이하의 삼량체를 함유하는 나노입자.
  79. 제 74 항에 있어서,
    나노입자는 Sf9 세포에서 생성되는 나노입자.
  80. 제 74 항에 있어서,
    에볼라 바이러스 GP 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 29와 약 85% 동일하거나 약 90% 동일하거나 약 95% 동일하거나 약 97% 동일하거나 또는 약 98% 동일한 나노입자.
  81. 제 74 항에 있어서,
    에볼라 바이러스 GP 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 29를 포함하는 나노입자.
  82. 제 74 항에 있어서,
    에볼라 바이러스 GP 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 29로 이루어진 나노입자.
  83. 제 74 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항의 나노입자 및 사포닌 항원보강제를 포함하며, 여기서 사포닌 항원보강제는 매트릭스 A 및 매트릭스 C로 이루어진 백신 조성물.
  84. 제 83 항에 있어서,
    매트릭스 A 및 매트릭스 C는 85:15의 비율로 존재하는 백신 조성물.
  85. 에볼라 바이러스 당단백질(GP) 나노입자 및 사포닌 항원보강제를 포함하는 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 인간에서 에볼라 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    여기서 사포닌 항원보강제는 매트릭스 A 및 매트릭스 C로 구성되고,
    여기서 나노입자는 비이온성 세제 코어에 부착된 에볼라 바이러스 GP 삼량체를 포함하는 방법.
  86. 제 85 항에 있어서,
    매트릭스 A 및 매트릭스 C 사포닌 항원보강제는 85:15의 비율로 존재하는 방법.
  87. 제 85 항에 있어서,
    에볼라 바이러스 GP의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 29와 약 85% 동일하거나 약 90% 동일하거나 약 95% 동일하거나 약 97% 동일하거나 또는 약 98% 동일한 방법.
  88. 제 85 항에 있어서,
    조성물은 근육내 투여되는 방법.
  89. 제 85 항에 있어서,
    면역 반응은 IgG1 항체의 유도, IgG2a 항체의 유도, 수명이 긴 혈장 B 세포의 형성, 소낭 모양 보조기 T 세포(TFH) 반응, CD4+ T-세포 반응, 및 CD8+ T 세포 반응의 하나 이상을 포함하는 방법.
  90. 제 85 항에있어서,
    조성물은 나노입자 당 2 내지 6 삼량체를 갖는 GP 나노입자의 이종 집단을 포함하는 방법.
  91. 제 83 항의 백신 조성물을 인간에게 근육내 투여하는 단계를 포함하는 인간의 에볼라 바이러스 감염 또는 질병을 예방하는 방법.
  92. SEQ ID NO: 29를 포함하는 또는 SEQ ID NO: 29로 이루어진 에볼라 단백질을 암호화하는 핵산.
  93. 제 92 항의 핵산을 포함하는 Sf9 숙주 세포.
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